KR101294959B1 - 조혈을 촉진하기 위한 ｂｖ８ 및(또는) ｅｇ-ｖｅｇｆ의 용도 - Google Patents

조혈을 촉진하기 위한 ｂｖ８ 및(또는) ｅｇ-ｖｅｇｆ의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101294959B1
KR101294959B1 KR1020117016764A KR20117016764A KR101294959B1 KR 101294959 B1 KR101294959 B1 KR 101294959B1 KR 1020117016764 A KR1020117016764 A KR 1020117016764A KR 20117016764 A KR20117016764 A KR 20117016764A KR 101294959 B1 KR101294959 B1 KR 101294959B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
vegf
cells
sequence
cell
human
Prior art date
Application number
KR1020117016764A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20110097965A (ko
Inventor
나폴레옹 페르라라
제니퍼 레코우터
Original Assignee
제넨테크, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 제넨테크, 인크. filed Critical 제넨테크, 인크.
Publication of KR20110097965A publication Critical patent/KR20110097965A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101294959B1 publication Critical patent/KR101294959B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/02—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1858—Platelet-derived growth factor [PDGF]
    • A61K38/1866—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1891—Angiogenesic factors; Angiogenin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0669—Bone marrow stromal cells; Whole bone marrow

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)

Abstract

본 발명은 조혈을 촉진하기 위하여 Bv8 및 EG-VEGF 폴리펩티드와 핵산을 사용하는 방법을 제공한다. 또한 여기에서는 Bv8 및 EG-VEGF 활성의 조절제를 스크리닝하는 방법이 제공된다. 더욱이, Bv8 및 EG-VEGF 폴리펩티드나 Bv8 및 EG-VEGF 길항제를 이용하는 치료 방법이 제공된다.

Description

조혈을 촉진하기 위한 ＢＶ８ 및(또는) ＥＧ-ＶＥＧＦ의 용도{USE OF BV8 AND/OR EG-VEGF TO PROMOTE HEMATOPOIESIS}
미국 국적 및 소재의 제넨테크, 인크. 등은 이 출원을 2003년 3월 12일에 출원된 US 가출원 제60/454,462호 및 2003년 10월 14일에 출원된 US 가출원 제60/511,390호에 대해 우선권을 주장하면서, PCT 출원으로 출원하고 있다.
Bv8은 개구리 봄비나 바리에가타(Bombina variegata)의 피부 분비물로부터 처음으로 분리된 소형 단백질이다 [Mollay 등, Eur. J. Pharmacol., 374:189-196(1999)]. Bv8은 내분비선 유래된 혈관 내피 성장 인자(EG-VEGF)를 포함하는 구조적으로 관련된 클래스의 단백질에 속한다 [LeCouter 등, Nature, 412:877-884(2001)]. 이들 분자의 구별되는 구조 모티프는 보존된 영역 내에서 10개의 시스테인 잔기가 5개의 디설파이드 브릿지를 형성하는, 콜리파제-폴드(colipase-fold)이다.
Bv8과 EG-VEGF는 종양 성장과 생존에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 혈관신생 인자, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 동족체이다. Bv8과 EG-VEGF 모두 특정 조직의 내피 세포에 대해 선별적인 활성을 갖는 혈관신생 인자로 동정되어 있다. EG-VEGF는 배양된 부신 모세혈관 내피 세포에서 증식, 이동, 생존 및 개창(fenestration)을 촉진하였고 난소와 고환에서 혈관신생을 유도하였다. 문헌 [LeCouter 등, 2001, Nature, 412:877-884; LeCouter 등, 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:2685-2690] 참조.
EG-VEGF와 같이, Bv8은 부신 피질 모세혈관 내피 세포의 증식, 생존 및 이동을 촉진하였고 고환에서 혈관신생을 유도하였다. 문헌 [LeCouter 등, 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:2685-2690] 참조. 고환은 상대적으로 높은 내피 세포 전환율을 나타낸다. 따라서, VEGF와 같은 다른 인자와 함께, Bv8과 EG-VEGF는 고환에서 혈관의 완전성을 유지하고 증식을 조절하는데 중요한 것으로 여겨지고 있다.
VEGF는 종양 성장과 생존에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 혈관신생 인자이다. Bv8과 EG-VEGF는 특정 조직에 대해 선별적 활성을 갖는 혈관신생 인자이기 때문에, 이 분자들의 특성을 더 규명하는 것이 바람직하다.
발명의 요약
본 발명은 조혈 줄기 세포(HSC), 계통-수임된(lineage-committed) 혈액 선조 세포와 림프구에서 Bv8과 EG-VEGF의 새로운 발현과 활성의 동정에 기초한 것이다. 특히, 여기에 상세히 설명되어 있는 바와 같이, Bv8, EG-VEGF 및 그들의 수용체는 많은 혈액 악성 세포주 뿐만 아니라, 골수 HSC, 말초혈액 백혈구(PBL)에서 발현된다. 시험관 내와 생체 내 실험 모두 Bv8과 EG-VEGF가 골수 단핵 세포와 지라-유래된 선조 세포의 콜로니 형성을 촉진하고, 백혈구 집단을 증가시키고, B 림프구와 T 림프구의 활성화를 촉진할 수 있음을 보여주었다. 따라서, Bv8 핵산과 폴리펩티드, EG-VEGF 핵산과 폴리펩티드, 또는 그들의 배합물은 많은 어세이와 조혈, 호중구감소증, 면역결핍 장애 및 자가면역 장애와 관련된 상태의 진단과 치료에 사용될 수 있다.
BV8과 EG-VEGF에 대한 수용체는 이제 골수 조혈 줄기 세포(CD34+)와 계통 수임된 선조 세포(CD34+) 상에서 발견되었다. BV8 및(또는) EG-VEGF는 CD34+ 골수성 및 림프성 선조 세포의 증식을 유도한다. 이 증식은 B 세포, T 세포 및 특히 호중구를 포함하는, 백혈구 수의 증가에 이르게 한다. BV8, EG-VEGF 및 그들의 작용제는 예를 들어, 림프구감소증, 호중구감소증 및 기타와 같은, 면역결핍 장애의 치료에 치료학적으로 유용하다. 이들 분자는 또한 예를 들어 화학요법에 의해 유도되는 바와 같은, 골수억제 후 조혈 회복을 촉진하는데 유용하다.
ALL, AML, MPD, CML 및 MDS 세포와 같은 다양한 백혈병 세포는 이제 BV8과 EF-VEGF에 대한 수용체를 발현하는 것으로 밝혀졌다. 성장 인자 EG-VEGF 및(또는) BV8의 길항제는 이들 백혈병 세포의 증식을 저해하는데 유용하다.
BV8 및(또는) EG-VEGF는 또한 놀랍게도 B 및 T 활성화를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 이들 분자의 작용제와 길항제는 면역 반응을 조절하는데 치료적으로 유용하다. BV8, EG-VEGF 및 그들의 작용제는 면역저하된(immunocompromised) 개체, 예를 들어, HIV 환자에서 T 세포의 증식과 활성화를 유도하는데 유용하다. 이들 분자의 길항제는 면역 반응, 예를 들어 자가면역 장애와 관련된 것들을 저해하는데 치료적으로 유용하다.
골수 세포의 증식
일 측면에서, 본 발명은 골수 세포 증식을 유도하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 방법은 BM 세포를 세포의 증식을 유도하는데 유효한 양의 Bv8, EG-VEGF 또는 그들의 배합물과 접촉시키는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 방법은 BM 세포에 Bv8, EG-VEGF 또는 그들의 배합물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 BM 세포 증식을 유도하는데 유효한 양으로 도입하는 것을 포함한다.
일 구체예에서, Bv8 및(또는) EG-VEGF는 천연 서열 폴리펩티드이다. 바람직하게는, 천연 서열 Bv8 폴리펩티드는 천연 인간 Bv8 폴리펩티드이다. 천연 인간 Bv8 폴리펩티드는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 천연 서열 Bv8 폴리펩티드는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, Bv8 폴리펩티드는 헤파린에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 천연 서열 EG-VEGF 폴리펩티드는 천연 인간 EG-VEGF 폴리펩티드이다. 천연 인간 EG-VEGF 폴리펩티드는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 천연 서열 EG-VEGF는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구체예에서, Bv8 및(또는) EG-VEGF는 면역부착소(immunoadhesin)이다. 추가 구체예에서, Bv8 및(또는) EG-VEGF는 키메라성이다.
일 구체예에서, Bv8/EG-VEGF는 BM 조혈 줄기 세포 및(또는) 계통 수임된 선조 세포의 증식을 촉진한다. 계통 수임된 선조 세포는 일반적으로 골수 및(또는) 림프 계통의 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 특정 혈액 세포 집단을 그러한 세포를 필요로 하는 환자에서 유지하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 이 방법은 세포를 Bv8, EG-VEGF 또는 그들의 배합물과, 상기 세포의 증식을 촉진하는데 유효한 양으로 접촉시켜, 그 집단을 유지하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 이 방법은 Bv8, EG-VEGF 또는 그들의 배합물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 세포에 세포 생존을 증진시키는데 유효한 양으로 도입하는 것을 포함한다. 이 방법은 추가로 VEGF를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 세포로 도입하는 것을 포함한다. 일 측면에서, 필요로 하는 특정 세포 유형은 백혈구, 바람직하게는 호중구, B 림프구, CD4+ T 림프구 및(또는) CD8+ T 림프구이다. 다른 측면에서, 환자는 호중구감소증, 림프구감소증 또는 면역결핍 장애를 앓고 있으며, 따라서 호중구, B 림프구, CD4+ T 림프구 및(또는) CD8+ T 림프구를 필요로 한다.
비정상적 조혈의 치료
추가 측면에서, 본 발명은 비정상적 조혈과 관련된 상태에 대해 포유류를 치료하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 방법은 바람직하게는 포유류에게 Bv8, EG-VEGF 또는 그들의 배합물, 또는 그의 작용제 또는 길항제를 포함하는 조성물을 상태를 치료하는데 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 포유류는 바람직하게는 인간이다.
일 측면에서, 본 발명의 방법 중 어느 것에 사용되는, Bv8, EG-VEGF 또는 그들의 배합물을 포함하는 조성물은 천연 서열 Bv8 폴리펩티드 및(또는) 천연 서열 EG-VEGF 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 천연 서열 Bv8 폴리펩티드는 천연 인간 Bv8 폴리펩티드이다. 천연 인간 Bv8 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 천연 서열 Bv8은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, Bv8 폴리펩티드는 헤파린에 결합한다. 바람직하게는, 천연 서열 EG-VEGF 폴리펩티드는 천연 인간 EG-VEGF 폴리펩티드이다. 천연 인간 EG-VEGF 폴리펩티드는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 천연 서열 EG-VEGF는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함한다.
조혈 장애의 치료
또 추가의 측면에서 본 발명은 포유류, 바람직하게는 인간에서 조혈 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서 방법은 포유류에게 Bv8 길항제, EG-VEGF 길항제 또는 그들의 배합물을 세포 증식을 저해하는데 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명의 방법으로 치료가능한 조혈 장애는 다양한 백혈병, 골수증식성 장애, 골수이형성 장애, 림프증식성 장애 및 림프이형성 장애를 포함한다. 바람직하게는, 조혈 장애는 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 다발성 골수종, T-세포 림프종, 진성 적혈구증가증(PV), 본태성 혈소판증가증(ET) 및 골수 섬유화증(골수섬유증) 등으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
면역 장애의 치료
본 발명의 추가 측면은 Bv8, EG-VEGF 또는 그들의 배합물을 투여하여, 포유류, 바람직하게는 인간에서 면역결핍 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 면역결핍 장애를 앓고 있는 환자는 B 및 T 림프구를 결여하고 있으며 증진된 B 림프구 및(또는) T 림프구 집단을 필요로 한다. Bv8, EG-VEGF 또는 그들의 배합물은 B 및 T 세포 집단을 증가시키는데 제공될 수 있다. 면역결핍 장애는 원발성 또는 이차성일 수 있다. 일 구체예에서, 이차성 면역결핍 장애는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 간염을 포함하는 감염성 질환과 관련된 상태이다. 다른 구체예에서, 면역결핍 장애는 이차성 면역억제 효과를 갖는 5-플루오로우라실, 빈크리스틴, 시스플라틴, 옥소플라틴, 메토트렉세이트, 3'-아지도-3'-데옥시티미딘, 파클리탁셀, 도세탁셀, 안트라사이클린 항생제, 또는 그들의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 치료제와 같은, 면역억제제의 투여와 관련된 상태이다.
본 발명의 추가 측면은 포유류, 바람직하게는 인간에서 자가면역 장애를 치료하는 방법을 제공한다. Bv8 길항제, EG-VEGF 길항제 또는 그들의 배합물은 활성화 B 세포, CD4+ T 세포 및(또는) CD8+ T 세포 수의 감소가 바람직한 자가면역 장애를 치료하는데 유용할 수 있다. 특정 구체예는 여기에 제공되는 제제와 조성물을 자가면역 장애와 관련된 Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ형 과민성 반응을 치료하는데 사용하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 방법은 포유류에게 Bv8 길항제, EG-VEGF 길항제 또는 그들의 배합물을 자가면역 장애를 저해하는데 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 방법은 환자에게 Bv8 길항제, EG-VEGF 길항제 또는 그들의 배합물을 CD4+ 림프구 및(또는) CD8+ T 림프구의 증식을 저해하는데 유효한 양으로 투여하는 것을 포함한다.
면역 반응의 조절
본 발명의 추가 측면은 면역 반응을 조절하는 방법을 제공한다. Bv8, EG-VEGF 또는 그들의 배합물, 또는 그의 작용제는 B 림프구, CD4+ T 림프구 및(또는) CD8+ T 림프구를 활성화하기 위해 투여될 수 있다. 일 구체예에서, Bv8, EG-VEGF, 또는 그들의 배합물, 또는 그의 작용제는 CD4+ T 림프구 및(또는) CD8+ T 림프구의 증식을 선별적으로 촉진하거나 저해하기 위해 투여될 수 있다.
Bv8 및 EG-VEGF는 CD4+ 림프구 및 CD8+ T 림프구에서 사이토킨 생산을 유도한다. 일 구체예에서, CD4+ T 림프구에서 IL-2 합성을 유도하는, Bv8, EG-VEGF, 그의 작용제, 또는 그들의 배합물은 CD4+ 림프구의 증식을 유도하는데 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, CD4+ T 림프구에서 IFN-γ를 유도하는 Bv8, EG-VEGF, 그의 작용제, 또는 그들의 배합물은 CD4+ T 림프구의 증식을 저해하기 위해 투여될 수 있다.
길항제
본 발명에 유용한 Bv8 길항제와 EG-VEGF 길항제는 Bv8 및(또는) EG-VEGF 활성을 차단, 방해, 또는 최소화할 수 있는 어떠한 조성물일 수도 있다. 이들 길항제는 항-Bv8 및(또는) 항-EG-VEGF 항체 또는 그의 단편, 신호 전달 활성을 유발하지 않으면서 Bv8 및(또는) EG-VEGF 수용체에 결합할 수 있는 말단절단 펩티드, Bv8 및(또는) EG-VEGF 펩티드를 봉쇄할 수 있는 가용성 Bv8 및(또는) EG-VEGF 수용체, 항-Bv8 및(또는) 항-EG-VEGF 수용체 항체 또는 Bv8 또는 EG-VEGF 수용체 활성을 방해할 수 있는 소분자를 포함한다. 일 구체예에서, Bv8 또는 EG-VEGF 수용체는 Bv8/EG-VEGF 수용체-1 및(또는) Bv8/EG-VEGF 수용체-2이다. Bv8과 EG-VEGF 둘다 상세한 설명에서 보다 충분히 설명되는 바와 같이 수용체 1과 수용체 2에 결합한다.
제품
또 추가의 측면에서, 본 발명은 용기, Bv8 및(또는) EG-VEGF, 및 Bv8 및(또는)EG-VEGF의 사용지침을 포함하는 제품을 제공한다. 일 구체예에서 지침은 Bv8 및(또는) EG-VEGF를 비정상적 조혈과 관련된 상태를 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 다른 구체예에서, 지침은 Bv8 및(또는) EG-VEGF를 면역결핍 장애와 관련된 상태를 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 다른 측면에서 본 발명은 용기, Bv8 길항제 및(또는) EG-VEGF 길항제, 및 Bv8 길항제 및(또는) EG-VEGF 길항제의 사용지침을 포함하는 제품을 제공한다. 일 구체예에서 지침은 Bv8 길항제 및(또는) EG-VEGF 길항제를 조혈 장애를 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 다른 구체예에서, 지침은 Bv8 길항제 및(또는) EG-VEGF 길항제를 면역결핍 장애를 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 다른 구체예에서, 지침은 Bv8 길항제 및(또는) EG-VEGF 길항제를 자가면역 장애를 치료하는데 사용하기 위한 것이다.
길항제의 동정 방법
본 발명의 다른 측면은 후보 화합물을 Bv8 또는 EG-VEGF와 접촉시키고, Bv8 또는 EG-VEGF 생물학적 활성에 대한 화합물의 영향을 결정하고, Bv8 또는 EG-VEGF 생물학적 활성이 저해되는 길항제를 동정하여, Bv8 또는 EG-VEGF 길항제를 동정하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, Bv8 길항제는 내피 세포 증식을 자극하는 Bv8 능력의 그의 저해에 의해 동정된다. 다른 구체예에서, Bv8 또는 EG-VEGF 길항제는 내피 세포 생존을 촉진하는 Bv8 또는 EG-VEGF 능력의 그의 저해에 의해 동정된다.
발명의 상세한 설명
Ⅰ. 정의
다르게 정의하지 않으면, 여기에 사용된 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 보편적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌 [Singleton 등, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2판, J. Wiley & Sons(New York, NY 1994); Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor, NY 1989)]를 참조한다. 본 발명의 목적을 위하여, 아래 용어가 이하 정의된다.
용어 "Bv8"과 "Bv8 폴리펩티드"는 여기에서 상호교환적으로 사용되며, 각각 여기에 정의된, 천연 서열 Bv8, Bv8 변이체와 키메라 Bv8을 말한다. 임의로, Bv8은 천연 글리코실화와 결합되어 있지 않다. "천연 글리코실화"는 Bv8이 포유류 세포, 특히 자연에서 생산되는 세포에서 생산될 때 Bv8에 공유적으로 부착되는 탄수화물 부위를 말한다. 따라서, 비-인간 세포에서 생산된 인간 Bv8은 "천연 글리코실화와 관련되지 않을" 수 있는 Bv8의 예이다. Bv8은 그것이 원핵세포, 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)에서 생산되는 경우와 같이, 전혀 글리코실화되지 않을 수 있다.
Bv8 폴리뉴클레오티드는 상기한 바와 같은, Bv8 폴리펩티드를 코딩하는 RNA나 DNA나, 엄격한 조건 하에서 그러한 DNA나 RNA에 혼성화하고 그것에 안정하게 결합된 채로 남아있고 길이가 약 10 뉴클레오티드 초과인 RNA나 DNA이다. 엄격한 조건은 (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도와 높은 온도, 예를 들어, 50 ℃에서 0.15 M NaCl/0.015 M 시트르산나트륨/O.1% NaDodS04를 사용하거나, (2) 혼성화 도중 포름아미드, 예를 들어, 42 ℃에서 0.1% 우혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/750 mM NaCl, 75 mM 시트르산나트륨을 갖는 pH 6.5의 50 mM 인산나트륨 완충액을 갖는 50%(부피/부피) 포름아미드와 같은 변성화제를 사용하는 것들이다.
폴리뉴클레오티드는 그것이 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 위치될 때 작동가능하게 연결된다. Bv8 폴리뉴클레오티드는 그것이 특정 숙주 유기체에서 발현될 수 있도록 벡터의 다른 핵산 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이것은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 프리서열 또는 분비 리더의 DNA는 그것이 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리단백질로서 발현되면 폴리펩티드의 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터나 인핸서는 그것이 서열의 전사에 영향을 미치면 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며; 리보솜 결합 위치는 그것이 번역을 용이하게 하도록 위치되면 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 연속적이고, 분비 리더의 경우, 연속적이고 판독에 일치함을 의미한다. 그러나, 인핸서는 연속적일 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 위치에서의 결찰에 의해 달성된다. 그러한 위치가 존재하지 않으면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터나 링커가 통상적인 관행에 따라 사용된다.
"천연 서열 Bv8"은 그의 제조 방식을 불문하고, 자연으로부터 유래된 Bv8과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 천연 서열 Bv8은 자연적으로 발생하는 인간 Bv8, 쥐 Bv8, 또는 어느 다른 포유류 종으로부터의 Bv8의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 전장 천연 서열 인간 Bv8 아미노산 서열은 도 2(서열번호 2)에 나타내어져 있다. 제2 전장 천연 서열 인간 Bv8은 도 4(서열번호 4)에 나타내어져 있다. 이들 두 서열은 정규의 헤파린 결합 영역을 코딩하는 엑손의 대체 스플라이싱의 결과이다. 따라서 도 4(서열번호 4)에 도시된 천연 서열 Bv8이 그러하지 않은 반면, 아미노산 서열이 도 2(서열번호 2)에 나타내어진 천연 서열 인간 Bv8은 헤파린 결합 영역을 포함한다. 천연 서열 마우스 Bv8 아미노산 서열은 도 6(서열번호 6)에 나타내어져 있다. 인간과 쥐 Bv8 서열은 또한 예를 들어, 문헌 [Wechselberger 등, 1999, FEBS Lett., 462:177-181과 Li 등, 2001, Mol. Pharm., 59:692-698]에 개시되어 있다. 그러한 천연 서열 Bv8은 자연으로부터 분리될 수 있거나 재조합 및(또는) 합성 수단에 의해 생산될 수 있다. 용어 "천연 서열 Bv8"은 자연적으로 발생하는 프리프로, 프로 및 성숙 형태와 말단절단 형태의 Bv8, 자연적으로 발생하는 변이체 형태(예를 들어, 도 4(서열번호 4)에 나타낸 것과 같은, 대체 스플라이싱된 형태), 및 자연 발생 대립형질 변이체를 포함한다. 바람직한 천연 서열 Bv8은 도 2(서열번호 2)에 나타낸 바와 같은 전장 천연 서열 인간 Bv8이다.
"Bv8 변이체"는 인간 및 쥐 Bv8에 대한 도 2, 4 및 6(서열번호 2, 4 및 6)에 나타낸 것들과 같은, 천연 서열 Bv8 폴리펩티드의 서열과, 천연 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입, 결실, 수식 및(또는) 치환에 의해, 상이한 아미노산 서열을 갖는 생물학적으로 활성인 Bv8 폴리펩티드이다. Bv8 변이체는 일반적으로 도 2(서열번호 2)의 인간 Bv8과 같은, 천연 서열 Bv8과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 그러나, 통상적으로, 생물학적으로 활성인 Bv8 변이체는 도 2(서열번호 2)의 인간 Bv8과 같은 자연적으로 발생하는 Bv8의 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 더 바람직하게는 적어도 약 80%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 90%의 아미노산 서열 동일성을 가지며, 적어도 약 95%에서 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성까지 1% 증가분씩 선호도가 증가한다. Bv8 변이체는 상응하는 천연 서열 Bv8 폴리펩티드의 생물학적 활성을 보유하는 적어도 5개 아미노산의 펩티드 단편을 포함한다. Bv8 변이체는 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 천연 Bv8 서열의 N- 또는 C-말단, 또는 내부에 첨가되는 Bv8 폴리펩티드를 포함한다. Bv8 변이체는 또한 많은 아미노산 잔기가 결실되고 임의로 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 치환된 Bv8 폴리펩티드를 포함한다. Bv8 변이체는 또한 예를 들어 자연적으로 발생하는 아미노산 이외의 잔기로 치환하거나 아미노산 잔기를 수식하여 비-자연적 발생 아미노산을 생산함으로써, 공유적으로 수식될 수 있다. Bv8 변이체는 헤파린 결합 영역을 포함할 수 있다.
여기에 사용된 바, 상호교환적으로 사용되는, 용어 "EG-VEGF"와 "EG-VEGF 폴리펩티드"는 각각 여기에 정의된, 천연 서열 EG-VEGF, EG-VEGF 변이체 및 키메라 EG-VEGF를 말한다. 임의로, EG-VEGF는 천연 글리코실화와 결합되어 있지 않다. "천연 글리코실화"는 EG-VEGF가 포유류 세포, 특히 그것이 자연적으로 생산되는 세포에서 생산될 때 EG-VEGF에 공유적으로 부착되는 탄수화물 부위를 말한다. 따라서, 비인간 세포에서 생산된 인간 EG-VEGF는 "글리코실화와 결합되어 있지 않을" 수 있는 EG-VEGF의 예이다. 때때로 EG-VEGF는 원핵세포, 예를 들어, 이. 콜라이에서 생산되는 경우와 같이, 전혀 글리코실화되지 않을 수 있다.
EG-VEGF 폴리뉴클레오티드는 상기한 바와 같은, EG-VEGF 폴리펩티드를 코딩하는 RNA나 DNA나, 엄격한 조건 하에서 그러한 DNA나 RNA에 혼성화하고 그것에 안정하게 결합된 채로 남아있고 길이가 약 10 뉴클레오티드 초과인 RNA나 DNA이다. 엄격한 조건은 (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도와 높은 온도, 예를 들어, 50 ℃에서 0.15 M NaCl/0.015 M 시트르산나트륨/O.1% NaDodS04를 사용하거나, (2) 혼성화 도중 포름아미드, 예를 들어, 42 ℃에서 0.1% 우혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/750 mM NaCl, 75 mM 시트르산나트륨을 갖는 pH 6.5의 50 mM 인산나트륨 완충액을 갖는 50%(부피/부피) 포름아미드와 같은 변성화제를 사용하는 것들이다.
폴리뉴클레오티드는 그것이 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 위치될 때 작동가능하게 연결된다. EG-VEGF 폴리뉴클레오티드는 그것이 특정 숙주 유기체에서 발현될 수 있도록 벡터의 다른 핵산 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이것은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 프리서열 또는 분비 리더의 DNA는 그것이 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리단백질로서 발현되면 폴리펩티드의 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터나 인핸서는 그것이 서열의 전사에 영향을 미치면 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며; 리보솜 결합 위치는 그것이 번역을 용이하게 하도록 위치되면 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 연속적이고, 분비 리더의 경우, 연속적이고 판독에 일치함을 의미한다. 그러나, 인핸서는 연속적일 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 위치에서의 결찰에 의해 달성된다. 그러한 위치가 존재하지 않으면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터나 링커가 통상적인 관행에 따라 사용된다.
"천연 서열 EG-VEGF"는 그의 제조 방식을 불문하고, 자연으로부터 유래된 EG-VEGF와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 천연 서열 EG-VEGF는 자연적으로 발생하는 인간 EG-VEGF, 쥐 EG-VEGF, 또는 어느 다른 포유류 종으로부터의 EG-VEGF의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일 구체예에서, 전장 천연 서열 인간 EG-VEGF는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 천연 서열 마우스 EG-VEGF는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함한다. 인간과 쥐 EG-VEGF 서열은 또한 예를 들어, 문헌 [LeCouter 등, 2001, Nature, 412:877-884]에 개시되어 있다.
그러한 천연 서열 EG-VEGF는 자연으로부터 분리될 수 있거나 재조합 및(또는) 합성 수단에 의해 생산될 수 있다. 용어 "천연 서열 EG-VEGF"는 자연적으로 발생하는 프리프로, 프로 및 성숙 형태와 절단 형태의 EG-VEGF, 자연적으로 발생하는 변이체 형태(예를 들어, 대체 스플라이싱된 형태), 및 자연적으로 발생하는 대립형질 변이체를 포함한다. 바람직한 천연 서열 EG-VEGF는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 전장 천연 서열 인간 EG-VEGF이다.
"EG-VEGF 변이체"는 인간 및 쥐 EG-VEGF에 대해서와 같은, 천연 서열 EG-VEGF 폴리펩티드의 서열(서열번호 8 및 10)과, 천연 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입, 결실, 수식 및(또는) 치환에 의해, 상이한 아미노산 서열을 갖는 생물학적으로 활성인 EG-VEGF 폴리펩티드이다. EG-VEGF 변이체는 일반적으로 천연 서열 EG-VEGF와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 그러나, 통상적으로, 생물학적으로 활성인 EG-VEGF 변이체는 자연적으로 발생하는 EG-VEGF의 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 더 바람직하게는 적어도 약 80%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 90%의 아미노산 서열 동일성을 갖고, 적어도 약 95%에서 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성까지 1% 증가분씩 선호도가 증가한다. EG-VEGF 변이체는 상응하는 천연 서열 EG-VEGF 폴리펩티드의 생물학적 활성을 보유하는 적어도 5개 아미노산의 펩티드 단편을 포함한다. EG-VEGF 변이체는 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 천연 EG-VEGF 서열의 N- 또는 C-말단, 또는 내부에 첨가되는 EG-VEGF 폴리펩티드를 포함한다. EG-VEGF 변이체는 또한 많은 아미노산 잔기가 결실되거나 임의로 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 치환된 EG-VEGF 폴리펩티드를 포함한다. EG-VEGF 변이체는 또한 예를 들어 자연적으로 발생하는 아미노산 이외의 부위로 치환하거나 아미노산 잔기를 수식하여 비-자연적 발생 아미노산을 생산함으로써, 공유적으로 수식될 수 있다.
Bv8 또는 EG-VEGF 서열에 관한 "퍼센트 아미노산 서열 동일성"은 여기에서 최대 퍼센트 서열 동일성을 얻기 위하여, 서열을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입하고, 어느 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않은 후, Bv8 또는 EG-VEGF 서열의 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 퍼센티지로 정의된다. 후보 Bv8 또는 EG-VEGF 서열로의 N-말단, C-말단, 또는 내부 연장, 결실 또는 삽입의 어느 것도 서열 동일성 또는 상동성에 영향을 미치는 것으로 해석되지 않는다. 정렬을 위한 방법과 컴퓨터 프로그램은 당업계에 잘 알려져 있다. 하나의 그러한 컴퓨터 프로그램은 U.S. 저작권 등록번호 TXU510087 하에 등록된, 워싱턴 디. 씨. 20559, 미국 저작권청에 사용 설명서와 함께 제출된, 제넨테크, 인크.에 의해 저술된 "ALIGN-2"이다.
"키메라 EG-VEGF" 분자는 이종 폴리펩티드에 융합되거나 결합된 전장 EG-VEGF 또는 그의 하나 이상의 영역을 포함하는 폴리펩티드이다. 키메라 EG-VEGF 분자는 일반적으로 자연적으로 발생하는 EG-VEGF와 적어도 하나의 생물학적 성질을 공통으로 공유할 것이다. 키메라 EG-VEGF 분자의 예는 정제 목적을 위해 에피토프 태그된 것이다. 다른 키메라 EG-VEGF 분자는 EG-VEGF 면역부착소이다.
여기에서 사용될 때 용어 "에피토프-태그된"은 "태그 폴리펩티드"에 융합된 Bv8 또는 EG-VEGF를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 말한다. 태그 폴리펩티드는 항체가 만들어질 수 있는 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 갖지만, 그것이 Bv8의 생물학적 활성을 방해하지 않도록 충분히 짧다. 태그 폴리펩티드는 바람직하게는 그에 대한 항체가 다른 에피토프와 실질적으로 교차-반응하지 않도록 상당히 독특하다. 적당한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 적어도 6 아미노산 잔기, 보통 약 8-50 아미노산 잔기(바람직하게는 약 9-30 잔기)를 갖는다. 기재된 바와 같이 니켈에 결합하여, Ni-NTA 크로마토그래피에 의한 태그된 단백질의 분리를 허용하는, 폴리-히스티딘 서열이 바람직하다 (예를 들어, 문헌 [Lindsay 등, 1996, Neuron, 17: 571-574] 참조).
"분리된"은 Bv8 또는 EG-VEGF 출처로부터 정제되거나, 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조되고 정제된 Bv8 또는 EG-VEGF를 의미한다. 정제된 Bv8 또는 EG-VEGF는 다른 폴리펩티드 또는 펩티드를 실질적으로 함유하지 않는다. 여기에서 "실질적으로 함유하지 않는"은 다른 출처 단백질로의 약 5% 미만, 바람직하게는 약 2% 미만, 더 바람직하게는 약 1% 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 0.5% 미만, 가장 바람직하게는 약 0.1% 미만의 오염을 의미한다.
"실질적으로 순수한" 단백질은 조성물의 총 중량에 기초하여, 적어도 약 90중량%, 바람직하게는 적어도 약 95중량%, 더 바람직하게는 적어도 약 90중량%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 95중량%의 단백질을 포함하는 조성물을 의미한다. "필수적으로 균질한" 단백질은 조성물의 총 중량에 기초하여, 적어도 약 99중량%의 단백질을 포함하는 조성물을 의미한다.
"작용제"는 천연 서열 Bv8 또는 EG-VEGF의 하나 이상의 생물학적 성질을 갖는 분자 또는 화합물이다. 이들은 소형 유기 분자, 펩티드 및 작용제 항-Bv8 또는 항-EG-VEGF 항체를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
용어 "길항제"는 최광의로 사용되고, 천연 Bv8 또는 EG-VEGF 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 저해, 또는 중화하는 어떠한 분자도 포함한다. 적당한 길항제 분자는 구체적으로 천연 Bv8 또는 EG-VEGF 폴리펩티드의 길항제 항체 또는 항체 단편, 단편 또는 아미노산 서열 변이체, 가용성 Bv8 또는 EG-VEGF 수용체 또는 그의 단편, 펩티드, 소형 유기 분자 등을 포함한다. Bv8 및(또는) EG-VEGF 폴리펩티드의 작용제나 길항제를 동정하는 방법은 Bv8 또는 EG-VEGF 폴리펩티드를 후보 작용제나 길항제와 접촉시키고 Bv8 또는 EG-VEGF 폴리펩티드와 정상적으로 관련된 하나 이상의 생물학적 활성에서 검출가능한 변화를 측정하는 것을 포함할 수 있다.
여기에서의 목적을 위한 "활성인" 또는 "활성"은 "생물학적" 활성이 천연 또는 자연-발생 Bv8 또는 EG-VEGF가 소유하는 항원성 에피토프에 대한 항체의 생산을 유도하는 능력 이외의 천연 또는 자연-발생 Bv8 또는 EG-VEGF에 의해 유발되는 생물학적 기능(저해 또는 자극)을 말하고, "면역학적" 활성이 천연 또는 자연-발생 Bv8 또는 EG-VEGF가 소유하는 항원성 에피토프에 대한 항체의 생산을 유도하는 능력을 말하는, 천연 또는 자연-발생 Bv8 또는 EG-VEGF의 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 보유하는 Bv8 또는 EG-VEGF의 형태(들)를 말한다.
따라서, "Bv8", "분리된 Bv8", Bv8의 작용제, "EG-VEGF", "분리된 EG-VEGF", 또는 EG-VEGF의 작용제와 결합하여 사용될 때 "생물학적으로 활성인"은 각각 천연 서열 Bv8 또는 EG-VEGF의 효과기 기능을 나타내거나 공유하는 Bv8 또는 EG-VEGF 폴리펩티드를 의미한다. Bv8 또는 EG-VEGF의 주요한 효과기 기능은 내피 세포의 증식을 자극하는 그의 능력이다. 더욱 더 바람직하게는, 생물학적 활성은 조혈을 조절하는 능력이다.
"Bv8" 또는 "분리된 Bv8" 또는 Bv8의 "작용제"와 결합하여 사용될 때 "생물학적 성질"은 천연 서열 Bv8(그의 천연 또는 변성된 형태의)에 의해 직접 또는 간접적으로 유발되거나 수행되는 효과기 또는 항원성 기능 또는 활성을 갖는 것을 의미한다. 효과기 기능은 내피 세포의 증식 증진, 혈관신생의 유도 및(또는) 조혈 조절을 포함한다.
"EG-VEGF", "분리된 EG-VEGF" 또는 EG-VEGF의 "작용제"와 결합하여 사용될 때 "생물학적 성질"은 각각 천연 서열 EG-VEGF(그의 천연 또는 변성된 형태의)에 의해 직접 또는 간접적으로 유발되거나 수행되는 효과기 또는 항원성 기능 또는 활성을 갖는 것을 의미한다. 효과기 기능은 내피 세포의 증식 증진, 혈관신생의 유도 및(또는) 조혈 조절을 포함한다.
"Bv8 수용체"는 Bv8이 결합하고 Bv8의 생물학적 성질을 매개하는 분자이다. Bv8 수용체는 또한 EG-VEGF에 결합하고 그의 생물학적 성질을 매개할 수 있다. 따라서, 용어 "Bv8 수용체"는 그 의미 내에 Bv8/EG-VEGF 수용체-1 및 Bv8/EG-VEGF 수용체-2를 포함한다 [LeCouter 등, 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:2685-2690; Lin 등, 2002, J. Biol. Chem., 277:19276-19280; Masuda 등, 2002, Biochem. Biophys. Res. Commun., 293:396-402].
"EG-VEGF 수용체"는 EG-VEGF가 결합하고 EG-VEGF의 생물학적 성질을 매개하는 분자이다. EG-VEGF 수용체는 또한 Bv8에 결합하고 그의 생물학적 성질을 매개할 수 있다. 따라서, 용어 "EG-VEGF 수용체"는 그 의미 내에 Bv8/EG-VEGF 수용체-1 및 Bv8/EG-VEGF 수용체-2를 포함한다 [LeCouter 등, 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:2685-2690; Lin 등, 2002, J. Biol. Chem., 277:19276-19280; Masuda 등, 2002, Biochem. Biophys. Res. Commun., 293:396-402].
여기에서 용어 "항체"는 최광의로 사용되고 구체적으로 원하는 생물학적 성질을 나타내는 한 인간, 비-인간(예를 들어, 쥐) 및 인간화된 모노클로날 항체(전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체), 및 항체 단편을 포함한다.
"항체"(Ab)와 "면역글로불린"(Ig)은 동일한 구조적 특성을 갖는 당단백질이다. 항체가 특정 항원에 대한 결합 특이성을 나타냄에 비해, 면역글로불린은 항체와 항원 특이성이 결여된 다른 항체-유사 분자를 모두 포함한다. 후자 종류의 폴리펩티드는 예를 들어, 림프계에 의해 낮은 수준으로 골수종에 의해 증가된 수준으로 생산된다.
"천연 항체"와 "천연 면역글로불린"은 보통 두개의 동일한 경(L)쇄와 두개의 동일한 중(H)쇄로 구성된, 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머성 당단백질이다. 디설파이드 결합의 수는 상이한 면역글로불린 이소타입의 중쇄 간에 변화하는 반면, 각 경쇄는 중쇄에 하나의 공유적 디설파이드 결합에 의해 연결된다. 각각의 중쇄와 경쇄는 또한 규칙적으로 간격을 두고 배치된 쇄-내 디설파이드 브릿지를 갖는다. 각각의 중쇄는 일 말단에 하나의 가변영역(VH)에 이어서 많은 불변영역을 갖는다. 각각의 경쇄는 일 말단에 하나의 가변영역(VL)과 그의 다른 말단에 하나의 불변영역을 갖는다; 경쇄의 불변영역은 중쇄의 제1 불변영역과 정렬되고, 경쇄 가변 영역은 중쇄의 가변영역과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄와 중쇄 가변영역 간의 경계를 형성하는 것으로 믿어진다.
용어 "가변"은 가변영역의 어느 부분이 항체 간 서열에서 크게 상이하고 각각의 특정 항체의 그의 특정 항원에 대한 결합 및 특이성에 사용되는 사실을 말한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변영역 전체에 균일하게 분포되어 있지 않다. 그것은 경쇄와 중쇄 가변영역 둘다에서 고가변 부위라 불리는 세 단편에 집중되어 있다. 가변영역의 보다 더 보존된 부분은 프레임워크 부위(FR)라 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변영역은 각각 β-쉬트 구조를 연결하고, 일부 경우 그의 일부를 형성하는 루프를 형성하는, 세 고가변 부위에 의해 연결되는, 대개 β-쉬트 배열을 채택하는, 네 FR(각각 FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 포함한다. 각 쇄의 고가변 부위는 FR에 의해 가까운 근위부에 함께 유지되고, 다른 쇄로부터의 고가변 부위와 함께 항체의 항원-결합 위치의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5판, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991), 647-669면] 참조). 불변 영역은 항원에 대한 항체의 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 항체-의존적 세포 독성에서 항체의 참여와 같은, 다양한 효과기 기능을 나타낸다.
여기에서 사용될 때 용어 "고가변 부위"는 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 고가변 부위는 "상보성 결정 부위" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(즉, 경쇄 가변영역의 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3)과 중쇄 가변영역의 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3); [Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5판, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)]) 및(또는) "고가변 루프"로부터의 그들 잔기(즉, 경쇄 가변영역의 잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3)과 중쇄 가변영역의 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101; [Chothia 및 Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917])를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 여기에 정의된 바와 같은 고가변 부위 잔기 이외의 그들 가변영역 잔기이다.
항체의 파파인 분해는 각각 단일 항원-결합 위치를 갖는, "Fab" 단편이라 불리는, 두 동일한 항원-결합 단편과, 그 이름이 용이하게 결정화하는 그의 능력을 반영하는, 잔여 "Fc" 단편을 생산한다. 펩신 처리는 두 항원-결합 위치를 갖고 여전히 항원을 교차-결합할 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 -결합 위치를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 부위는 견고한, 비-공유적 결합의 한 중쇄와 한 경쇄의 다이머로 구성된다. 그것은 각 가변영역의 세 고가변 부위가 상호작용하여 VH-VL 다이머의 표면 상에 항원-결합 위치를 결정하는 이 배열로 있다. 총괄적으로, 6개의 고가변 부위는 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일의 가변영역(또는 단지 항원에 특이적인 세 고가변 부위만을 포함하는 Fv의 절반) 조차도 비록 전체 결합 위치 보다 낮은 친화도일지라도, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변영역과 중쇄의 제1 불변영역(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 경첩부로부터의 하나 이상의 시스테인(들)을 포함하는 중쇄 CH1 영역의 카르복실 말단에서 소수 잔기의 첨가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 여기에서 불변영역의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 그룹을 갖는 Fab'에 대한 명명이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 그들 사이에 경첩 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링 또한 알려져 있다.
어느 척추동물 종으로부터의 항체(면역글로불린)의 "경쇄"는 그들 불변영역의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ)와 람다(λ)로 불리는, 두개의 분명하게 구별되는 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
그들 중쇄의 불변영역의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클래스로 지정될 수 있다. 5개의 주요 클래스의 면역글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있고, 이들의 몇몇은 서브클래스(이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 나뉘어질 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변영역은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 불린다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조와 삼차원 배열은 잘 알려져 있다.
"항체 단편"은 전장 항체의 일부, 일반적으로 그의 항원 결합 또는 가변영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중-특이성 항체를 포함한다.
여기에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체, 즉, 그 집단을 구성하는 개개의 항체가 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 말한다.
모노클로날 항체는 매우 특이적이며, 단일의 항원 위치에 대해 지향되어 있다. 더욱이, 상이한 결정기(에피토프)에 대해 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 통상적(폴리클로날) 항체 제제와 반대로, 각 모노클로날 항체는 단일의 항원 상 결정기에 대해 지향되어 있다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 얻어지는 항체의 특성을 가리키고 어느 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler 등, 1975, Nature 256:495]에 의해 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조되거나, 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국특허 제4,816,567호 참조). "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어 문헌 [Clackson 등, 1991, Nature 352:624-628 및 Marks 등, 1991, J. Mol. Biol. 222:581-597]에 기재된 방법을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리될 수 있다.
여기에서의 모노클로날 항체는 구체적으로, 쇄(들)의 나머지가 또다른 종으로부터 유래되거나 또다른 항체 클래스나 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이면서, 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스나 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체(면역글로불린)와, 그러한 항체의 단편을, 그들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 포함한다 (미국특허 제4,816,567호; 및 [Morrison 등, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855]).
비-인간(예를 들어, 쥐) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 부분에 대해, 인간화된 항체는 인간 면역글로불린(수혜자 항체)이고 여기에서 수혜자의 고가변 부위 잔기는 원하는 특이성, 친화도 및 용량을 갖는 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은, 비-인간 종(공여자 항체)으로부터의 고가변 부위에 의해 대체된다. 일부 경우, 인간 면역글로불린의 프레임워크 부위(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 더욱이, 인간화된 항체는 수혜자 항체나 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 수식은 항체 성능을 더 정련하기 위하여 가해진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 고가변 부위가 비-인간 면역글로불린의 것들에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR이 인간 면역글로불린 서열의 것들인, 실질적으로 모든 적어도 하나, 전형적으로 두개의, 가변영역을 포함할 것이다. FR은 임의로 예를 들어, Carter 등, 미국특허 제6,054,297호에 기재된 바와 같이, 공통(consensus) 또는 수식된 공통 서열의 것들일 수 있다. 인간화된 항체는 임의로 또한 면역글로불린 불변영역(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부를 포함할 것이다. 더 상세한 것에 대해, 문헌 [Jones 등, 1986, Nature, 321:522-525; Reichmann 등, 1988, Nature, 332:323-329; 및 Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596]을 참조한다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 영역으로서, 이들 영역이 단일의 폴리펩티드 쇄에 존재하는 것을 포함한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성하도록 할 수 있는 VH와 VL 영역 간의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. sFv의 검토를 위해 문헌 [The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113권, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, 269-315면(1994)]에 있는 Pluckthun을 참조한다.
용어 "디아바디"는 단편이 동일한 폴리펩티드 쇄에 경쇄 가변영역(VL)에 연결된 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는(VH-VL), 두 항원-결합 위치를 갖는 소형 항체 단편을 말한다. 너무 짧아서 동일한 쇄 상의 두 영역 간의 쌍형성을 허용하지 못하는 링커를 사용함으로써, 영역은 다른 쇄의 상보적인 영역과 쌍을 형성하도록 강제되며 두 항원-결합 위치를 창출한다. 디아바디는 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger 등, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448]에 더 상세히 기재되어 있다.
본 출원 전체에서 사용될 때 표현 "선형 항체"는 문헌 [Zapata 등, 1995, Protein Eng, 8(10):1057-1062]에 기재된 항체를 말한다. 간략하게, 이들 항체는 한 쌍의 항원 결합 부위를 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fd 단편(VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이성 또는 단일특이성일 수 있다.
용어 "에피토프"는 단백질 항원 상의 (모노클로날 또는 폴리클로날) 항체에 대한 결합 위치를 언급하는데 사용된다.
"작용제 항체"는 Bv8 또는 EG-VEGF 작용제이고 따라서 천연 서열 Bv8 또는 EG-VEGF의 하나 이상의 생물학적 성질을 소유하는 항체를 의미한다.
용어 "Bv8 면역부착소"와 "EG-VEGF 면역부착소"는 각각 용어 "Bv8 면역글로불린 키메라"와 "EG-VEGF 면역글로불린 키메라"와 상호교환적으로 사용되고, 면역글로불린 서열과 적어도 일부의 Bv8 또는 EG-VEGF 분자(천연 또는 변이체)를 결합한 키메라 분자를 말한다. 면역글로불린 서열은 바람직하게는 면역글로불린 불변영역이지만, 반드시 그러한 것은 아니다. 면역부착소는 인간 항체의 많은 가치있는 화학적 및 생물학적 성질을 소유할 수 있다. 면역부착소는 적절한 인간 면역글로불린 경첩 및 불변영역(Fc) 서열에 연결된 원하는 특이성을 갖는 인간 단백질 서열로부터 제작될 수 있으므로, 관심있는 결합 특이성은 완전한 인간 성분을 이용하여 얻어질 수 있다. 그러한 면역부착소는 환자에 최소한으로 면역원적이며, 만성 또는 반복 사용에 안전하다.
치료 용도를 위해 기재된 호모멀티머성 면역부착소의 예는 세포-표면 CD4에 대한 HIV의 결합을 차단하기 위한 CD4-IgG 면역부착소를 포함한다. CD4-IgG를 분만 직전 임신한 여성에게 투여한 Ⅰ상 임상 시험으로부터 얻은 데이터는 이 면역부착소가 HIV의 모-태아 전이의 예방에 유용할 수 있음을 암시한다 [Ashkenazi 등, 1993, Intern. Rev. Immunol., 10:219-227]. 종양 괴사 인자(TNF)에 결합하는 면역부착소도 개발되었다. TNF는 패혈성 쇼크의 주요 매개체인 것으로 나타난 프로염증성 사이토킨이다. 패혈성 쇼크의 마우스 모델에 기초하여, TNF 수용체 면역부착소는 패혈성 쇼크를 치료하는데 임상적 사용을 위한 후보로서 유망성을 나타내었다 [Ashkenazi 등, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:10535-10539]. IgG Fc 부위에 융합된 TNF 수용체 서열을 포함하는 면역부착소인 엔브렐(ENBREL)(등록상표)(에타네르셉트)이 류마티스성 관절염의 치료를 위해 미국식품의약국(FDA)에 의해 1998년 11월 2일에 허가되었다. 류마티스성 관절염의 치료에 있어서 엔브렐(등록상표)의 새로운 확장된 용도가 FDA에 의해 2000년 6월 6일에 허가되었다. 엔브렐(등록상표)을 포함하는 TNF 차단제에 대한 최근 정보에 대해서는, 문헌 [Lovell 등, 2000, N. Engl. J. Med. 342:763-169와, 810-811면]에 함께 실린 사설; 및 문헌 [Maini 및 Taylor, 2000, Annu. Rev. Med. 51:207-229]에서 검토됨; 문헌 [Weinblatt 등, 1999, N. Engl. J. Med. 340:253-259]를 참조한다.
면역부착소 구조의 두 아암이 상이한 특이성을 갖는 경우, 면역부착소는 이중특이성 항체와 유사하게 "이중특이성 면역부착소"라 불린다. 문헌 [Dietsch 등, 1993, J. Immunol. Methods, 162:123]은 각각의 셀렉틴이 자연에서 상이한 세포 유형에서 발현되는, 부착소 분자의 세포 외 영역, E-셀렉틴 및 P-셀렉틴을 결합한 그러한 이중특이성 면역부착소를 기재하고 있다. 결합 연구는 그렇게 형성된 이중특이성 면역글로불린 융합 단백질이 그것이 유래된 단일특이성 면역부착소에 비해 골수 세포주에 대한 결합 능력이 증진되었음을 보여주었다.
용어 "헤테로부착소"는 표현 "키메라 헤테로멀티머 부착소"와 상호교환적으로 사용되며 각 키메라 분자가 각각의 헤테로멀티머 수용체 모노머의 세포 외 영역과 같은, 생물학적으로 활성인 부분을 멀티머화 영역과 결합한 키메라 분자(아미노산 서열)의 복합체를 말한다. "멀티머화 영역"은 헤테로멀티머 복합체 내에 키메라 분자의 안정한 상호작용을 촉진한다. 멀티머화 영역은 키메라 헤테로멀티머의 키메라 분자 간에 분자간 디설파이드 결합을 형성하는 면역글로불린 서열, 류신 지퍼, 소수성 부위, 친수성 부위, 또는 유리 티올을 통해 상호작용할 수 있다. 멀티머화 영역은 면역글로불린 불변영역을 포함할 수 있다. 부가적으로 멀티머화 부위는 입체적 상호작용이 안정한 상호작용을 촉진할 뿐 아니라, 모노머의 혼합물로부터 호모다이머에 비해 헤테로다이머의 형성을 더욱 촉진하도록 조작될 수 있다. "돌기(Protuberance)"는 제1 폴리펩티드의 경계면으로부터 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체함으로써 제작된다. 돌기와 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "강"(cavity)이 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 것들(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 제2 폴리펩티드의 경계면에 임의로 창출된다. 면역글로불린 서열은 바람직하게는 면역글로불린 불변영역이지만, 반드시 그러한 것은 아니다. 본 발명의 키메라에 있는 면역글로불린 부위는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브타입, IgA, IgE, IgD 또는 IgM, 그러나 바람직하게는 IgG1 또는 IgG3로부터 얻어질 수 있다.
여기에서 사용된 바, "치료"는 유익하거나 원하는 임상적 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위해, 유익하거나 원하는 임상적 결과는 검출가능하거나 검출불가능한, 증상의 경감, 질병 정도의 감소, 질병의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질병 진행의 지연 또는 늦춤, 질병 상태의 완화 또는 경감 및 진정(부분적이든 전체적이든)을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. "치료"는 또한 치료를 받지 않으면 예상되는 생존에 비해 지속된 생존을 의미할 수 있다. "치료"는 장애의 발병을 방지하거나 병리를 변화시키는 의도로 수행되는 중재이다. 따라서, "치료"는 치료적 치료와 예방적 또는 보존적 치료 둘다를 말한다. 치료를 필요로 하는 사람들은 이미 장애를 갖는 사람들과 장애가 예방되어야 하는 사람들을 포함한다. 구체적으로는, 치료는 암 치료에서 종양 세포의 병리와 같은, 세포 퇴화나 손상의 병리를 직접 방지하거나, 늦추거나, 다르게는 감소시킬 수 있거나, 다른 치료제에 의한 치료에 세포를 더욱 민감성으로 만들 수 있다.
"만성" 투여는 연장된 기간 동안 최초 치료 효과(활성)를 유지하기 위하여, 급성 모드에 반대로 연속적 모드로의 제제(들)의 투여를 말한다. "간헐적" 투여는 중단 없이 연속적으로 행해지지 않지만, 대신 사실상 주기적인 치료이다.
치료 목적을 위한 "포유류"는 인간, 다른 고등 영장류, 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 토끼 등과 같은, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물을 포함하는, 포유류로 분류되는 어느 동물을 말한다. 바람직하게는, 포유류는 인간이다.
여기에 사용된 바, "종양"은 악성이든 양성이든 모든 신생 세포 성장 및 증식, 및 모든 전-암성 및 암성 세포 및 조직을 말한다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유류에서의 생리적 조건을 말하거나 기술한다. 암의 예는 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 그러한 암의 더욱 특별한 예는 편평세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평 암종, 복막암, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 헤파토마, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암 또는 자궁체부암, 타액선관 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 및 다양한 유형의 두부 및 경부 암을 포함한다.
"혈액학적 장애"는 혈액 세포에서 이형성 변화와 혈액 암에 이르게 할 수 있는 혈액 세포의 비정상적 증식 및(또는) 분화를 특징으로 하는 장애를 말한다. 많은 혈액학적 장애는 백혈병, 골수증식성 장애(MPD), 골수이형성 장애, 림프증식성 장애 및 림프이형성 장애로 분류될 수 있다. 많은 이들 장애는 성인과 어린이에서 발생할 수 있다. 혈액학적 장애의 예는 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 다발성 골수종, T-세포 림프종, 림프이형성 백혈병, 진성 적혈구증가증(PV), 본태성 혈소판증가증(ET) 및 골수 섬유화증(골수섬유증)을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
용어 "호중구감소증"은 비정상적으로 낮거나 감소된 수의 순환 호중구를 특징으로 하는 장애나 상태를 말한다. 호중구감소증은 질병, 유전적 장애, 약물, 독소, 방사선조사와, 고용량 화학요법과 통상적인 종양 요법과 같은, 많은 치료적 치료의 결과일 수 있다. 호중구감소증과 관련된 장애나 상태의 예는 혈액학적 장애, 결핵, 장티푸스, 간염, 패혈증, 급성 세균성 질환, 중증 마이코박테리아 또는 진균 질환, 및 단핵세포증을 포함하는 감염성 질환, 방사선, 면역억제 약물, 및 코르티코스테로이드를 포함하는 골수독성 및 면역억제제의 투여, 세포독성 화학요법 또는 방사선 요법, 백혈병, 골수종, 호치킨병 및 림프종, 무과립구증 및 재생불량성 빈혈, 조직구증식증 및 유육종증을 포함하는 침윤성 및 혈액학적 장애, 화상, 지라절제 및 마취를 포함하는 수술 및 외상, 알콜성 경변, 노화, 항경련 약물, 요독증, 당뇨병, 비타민 및 무기질 결핍, 및 영양실조를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 호중구감소증을 앓고 있는 환자는, 혈액에 순환하는 감소된 수의 호중구가 환자가 어떠한 침입 미생물과 싸우는 능력을 손상시키므로, 감염과 질병의 실질적인 위험에 놓여있다.
용어 "면역결핍 장애"는 감소되거나 존재하지 않는 면역반응을 특징으로 하는 장애나 상태를 말한다. B 세포, T 세포, 식균 세포, 또는 보체가 결핍될 수 있다. 면역결핍 장애는 원발성 또는 이차성일 수 있다. 림프구감소증, 호중구감소증, 단핵구감소증 및 과립구감소증 포함하는, 백혈구감소증은 원발성 또는 이차성 면역결핍 장애와 관련될 수 있다. 원발성 면역결핍 장애의 예는 무감마글로불린혈증 및 고-IgM을 갖는 면역글로불린 결핍(Ig)을 포함하는 B-세포 결핍, 디죠지 이상(DiGeorge anomaly), 만성 점막피부 캔디다증, Ig, 뉴클레오사이드 포스포릴라제와의 복합 면역결핍, 및 특발성 CD4 림프구감소증을 포함하는 T 세포 결핍, 및 중증 복합 면역결핍, 비스코트-알드리치(Wiskott-Aldrich) 증후군, 및 X-연관 림프증식성 증후군을 포함하는 복합 T 및 B 세포 결핍을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이차성 면역결핍 장애의 예는 인간 후천성 면역결핍 바이러스(HIV), 간염, 독감, 결핵, 장티푸스, 패혈증, 사이토메갈로바이러스, 급성 세균성 질환, 중증 마이코박테리아 또는 진균 질환, 선천성 풍진, 감염성 단핵세포증, 및 바이러스성 돌발진을 포함하는 감염성 질환, 방사선, 면역억제 약물 및 코르티코스테로이드를 포함하는 골수독성 및 면역억제제의 투여, 세포독성 화학요법 및 방사선 요법, 백혈병, 골수종, 호치킨병 및 림프종, 무과립구증 및 재생불량성 빈혈, 조직구증식증 및 유육종증을 포함하는 침윤성 및 혈액학적 장애, 화상, 지라절제, 및 마취를 포함하는 수술 및 외상, 알콜성 경변, 노화, 항경련 약물, 이식편 대 숙주 질환, 요독증, 당뇨병, 비타민 및 무기질 결핍, 및 영양실조를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
용어 "자가면역 장애"는 특정 자가 항원에 대한 지속된 적응성 면역 반응에 의해 매개되는 장애를 말한다. 자가면역 장애는 장애와 관련된 과민성 반응의 클래스에 의해 카테고리화될 수 있다. Ⅰ-Ⅲ형은 항체-매개된다. Ⅰ형 반응은 비만세포 활성화를 유도하는, IgE에 의해 매개된다. Ⅱ 및 Ⅲ형은 보체-매개되거나 식균성 효과기 기작을 활성화할 수 있는, IgG에 의해 매개된다. Ⅱ형 반응은 조직 손상에 이르게 하는 세포-표면 또는 매트릭스 결합 항원에 대해 지향된다. Ⅲ형 반응은 가용성 항원에 대해 지향되며 조직 손상이 면역 복합체에 의해 촉발되는 하류 반응에 의해 유발된다. Ⅳ형 반응은 T 림프구 매개되고 두 클래스로 세분될 수 있다. 제1 클래스에서, 조직 손상은 주로 대식세포에 의해 매개되는 염증성 T 세포(TH1 세포)에 의해 유발된다. 제2 클래스에서, 조직 손상은 세포독성 T 세포에 의해 직접 유발된다. 자가면역 장애의 예는 이식편 대 숙주 질환, 크론병과 결장염을 포함하는 염증성 대장 질환, 귈레인-바레 증후군, 루푸스, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 시신경병증, 건선, 류마티스성 관절염, 그레이브스병, 자가면역 간염, Ⅰ형 당뇨병, 재생불량성 빈혈, 간질성 방광염, 경피증, 외음부통증증후군, 신경근긴장증 및 백반증을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
질환의 "병리 상태"는 환자의 건강을 저하시키는 모든 현상을 포함한다. 암에 대해, 이것은 비정상적 또는 제어불능성 세포 성장, 전이, 이웃 세포의 정상적 기능 방해, 비정상적 수준의 사이토킨 또는 다른 분비성 산물의 방출, 염증성 또는 면역학적 반응의 억제 또는 악화 등을 제한없이 포함한다.
하나 이상의 추가 치료제와 "병용" 투여는 동시적(동시발생의) 및 어느 순서로든지의 연속적 투여를 포함한다.
여기에 사용된 "담체"는 사용되는 용량 및 농도에서 그에 노출되는 세포나 포유류에 비독성인 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 자주 생리학적으로 허용되는 담체는 수성 pH 완충 용액이다. 생리학적으로 허용되는 담체의 예는 인산염, 시트르산염, 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 만니톨 또는 솔비톨과 같은 당 알콜; 나트륨과 같은 염-형성 반대이온; 및(또는) 트윈(TWEEN)™, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 플루로닉스(PLURONICS)™와 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
"리포좀"은 약물(Bv8 폴리펩티드 또는 그에 대한 항체, EG-VEGF 폴리펩티드 또는 그에 대한 항체, 또는 그들의 배합물)의 포유류로의 전달에 유용한 다양한 유형의 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 구성된 작은 액포이다. 리포좀의 성분은 보편적으로 생물학적 막의 지질 배열과 유사한, 이층 형으로 배열된다.
"소분자"는 여기에서 약 500 달톤 미만의 분자량을 갖는 것으로 정의된다.
여기에서 사용될 때 용어 "혈관 내피 성장 인자", "VEGF", "VEGF 폴리펩티드" 및 "VEGF 단백질"은 천연 서열 VEGF와 VEGF 변이체(여기에서 추가로 정의되는)를 포함한다. VEGF 폴리펩티드는 인간 조직 유형이나 또다른 출처와 같은, 다양한 출처로부터 분리되거나, 재조합 및(또는) 합성 방법에 의해 제조될 수 있다.
"천연 서열 VEGF"는 자연으로부터 유래된 VEGF와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 그러한 천연 서열 VEGF는 자연으로부터 분리되거나 재조합 및(또는) 합성 수단에 의해 제조될 수 있다. 용어 "천연 서열 VEGF"는 구체적으로 VEGF의 자연-발생 절단 또는 분비 형태(예를 들어, 세포 외 영역 서열), 자연-발생 변이체 형태(예를 들어, 대체 스플라이싱된 형태) 및 자연-발생 대립형질 변이체를 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, 천연 서열 VEGF는 예를 들어, 미국특허 제5,332,671호 및 제5,240,848호; PCT 공개번호 WO 98/1007; 문헌 [Leung 등, 1989, Science 246:1306-1309; 및 Keck 등, 1989, Science 246:1309-1312]에 기재된 바와 같이, 각각 121, 145, 165, 189 및 206 아미노산 잔기로 구성된 5개의 알려진 이소폼 중 하나이다.
"VEGF 변이체 폴리펩티드"는 천연 서열 VEGF의 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 더 바람직하게는 적어도 약 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 95%, 가장 바람직하게는 적어도 약 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아래 정의된 바와 같은 활성 VEGF 폴리펩티드를 의미한다. 그러한 VEGF 변이체 폴리펩티드는 예를 들어, 하나 이상의 아미노산이 천연 서열의 N- 및(또는) C-말단, 및 하나 이상의 내부 영역 내에 첨가 또는 결실된 VEGF 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, VEGF는 예를 들어, PCT 공개번호 WO 97/08313 및 WO 00/63380 및 미국특허 제6,020,473호에 기재된 바와 같은, 천연 VEGF의 수용체 특이적 변이체이다.
VEGF에 대한 서열 동일성(아미노산 또는 핵산)은 Bv8 또는 EG-VEGF에 관하여 구체적으로 설명된 것과 동일한 접근법을 이용하여 결정된다. 유사하게, 항체를 포함하지만, 그로 제한되지 않는, Bv8이나 EG-VEGF의 작용제와 길항제에 대해 제공된 정의가 VEGF 작용제와 길항제에 적용될 것이다.
Ⅱ. 발명을 실시하기 위한 방법
본 발명은 조혈 줄기 세포(HSC), 계통-수임된 혈액 선조 세포 및 림프구에서 Bv8과 EG-VEGF의 새로운 발현과 활성의 확인에 기초한 것이다. 특히, 여기에 상세히 설명되어 있는 바와 같이, Bv8, EG-VEGF 및 그들의 수용체는 많은 혈액학적 악성 세포주 뿐만 아니라 골수의 HSC, 말초혈액 백혈구(PBL)에서 발현된다. 시험관 내 및 생체 내 실험 둘다 Bv8과 EG-VEGF가 골수 단핵 세포와 지라-유래된 수임 단핵 선조 세포의 콜로니 형성을 촉진하고, 백혈구 집단을 증가시키고, B 림프구와 T 림프구의 활성화를 촉진할 수 있음을 보여주었다. 따라서, Bv8 핵산 및 폴리펩티드, EG-VEGF 핵산 및 폴리펩티드, 또는 그들의 배합물은 많은 어세이와 조혈과 관련된 상태, 호중구감소증, 면역결핍 장애 및 자가면역 장애의 진단 및 치료에 사용될 수 있다.
A. 조혈
조혈은 상이한 유형의 혈액 세포가 증식하고 분화하는 능력을 갖는 다분화능 줄기 세포로부터 발생하는, 증식 및 분화 과정을 말한다. 혈액에서 대부분의 혈액 세포는 짧게 생존하고 따라서 일생을 통해 끊임없이 대체될 필요가 있다. 순환하는 성숙 혈액 세포의 수준은 혈액 유실, 감염 등의 범위에 걸친 상이한 환경적 스트레스에 반응하여 신속하게 변화할 수 있다. 약 20 주의 태아기 후, 인간에서 조혈의 주요 위치는 조혈 줄기 세포(HSC), 내피 세포(EC), 및 다른 기질 세포나 파연골세포와 조골세포를 포함하는, 뼈 항상성에 관여하는 세포를 포함하는 이질적 세포 집단으로 구성된 조직인, 골수(BM)이다. 문헌 [Gerber 및 Ferrara, 2003, J. Mol. Med., 81:20-31] 참조.
정상적인 조혈은 다분화능 세포의 이중 기능에 기초한다. 분화가 세 주요 혈액 세포 계통: 림프, 골수 및 적혈구 세포 계통으로 그룹화되는 다양한 형태의 성숙 혈액 세포의 형성을 일으키는 반면, 강력한 자가-재생은 미분화 줄기 세포 집단을 유지시킨다. 림프 계통은 항체 생산과 항원 탐지에 총괄적으로 기능하여, 세포성 및 체액성 면역 체계로서 기능하는, B 세포와 T 세포로 구성된다. 골수 계통은 단핵구(대식세포), 과립구(호중구 포함) 및 거핵구로 구성되고, 항원에 대해 혈류를 모니터하고 혈류로부터 항원을 청소하고, 감염성 물질과 싸우고, 혈액 응고에 관여하는 혈소판을 생산한다. 적혈구 계통은 신체 전체에 산소를 운반하는 적혈구로 구성된다.
조혈 줄기 세포와 호중구, 적혈구, 혈소판 등이 되도록 운명지워진 수임 선조 세포는 이들 줄기/선조 세포의 표면 상에 존재하는 특정 선조 "마커" 항원의 존재에 의해 대부분의 다른 세포로부터 구별될 수 있다. 이 특정 마커 항원을 인식할 수 있는 일 군의 항체는 "분화 클러스터 34" 또는 "CD34"로 언급된다. 명명 "CD34+"는 항체의 CD34 그룹에 의해 인식되는 특정 세포 표면 항원을 갖는 것과 같은 세포를 설명하는데 사용된다. 그러면, 줄기 세포는 CD34+이다. 그러나, CD34+인 대부분의 골수 세포는 B 림프구 선조 세포와 골수 선조 세포이다.
1. 조혈 인자
초기 및 분화된 조혈 세포의 발생은 BM 미세환경 내의 주변 세포와 다양한 비-조혈 기관(예를 들어, 간, 신장) 및 정상 T 림프구에 의해 분비되는 많은 조혈 성장 인자, 사이토킨 및 케모킨에 의해 조절된다. 모든 이들 인자는 함께 BM에 존재하는 조혈 세포의 생물학적 기능과 운명을 조절한다. 문헌 [Janowska-Wieczorka 등, 2001, Stem Cells, 19:99-107] 참조.
적어도 네 콜로니-자극 인자(CSF)가 호중구 생산의 조절에 협조하는 것으로 알려져 있다. GM-CSF(과립구 및 대식세포), IL-3(인터류킨-3), G-CSF(과립구) 및 CSF-1으로도 알려져 있는 M-CSF(대식세포)로 언급되는, 이들 네 인자는 대식세포, T 세포, 내피세포 및 다른 유형의 세포에 의해 합성된다. CSF에 대해 반응하는 선조 세포의 잠재력은 부분적으로 그 특정 CSF에 대한 세포 표면 상의 수용체의 존재와, 부분적으로 특정 CSF의 농도에 의해 결정된다. 부속 세포를 통해서든지 다른 c-kit 리간드, IL-6(인터류킨-6), IL-11(인터류킨-11), IL-4(인터류킨-4) 및 IL-1(인터류킨-1)과 같은, 필연적인 성장 인자와 상승적 작용에 의해서든지, 간접적 자극에 대한 일부 표시도 있다.
2. 호중구
인간 면역 체계의 주요 감염 및 질환-전투 세포는 골수 계통으로부터 기원하고 혈액 체계를 통해 순환하는 백혈구(류코사이트)이다. 많은 유형의 백혈구 중, 기이한 형상의 핵과 고도로 과립화된 세포질을 함유하는 서브타입의 과립구인, 호중구는 가장 보편적인 세포 유형이고 인간에서 전체 백혈구 집단의 약 2/3를 차지한다. 호중구는 이동성이고, 감염 시 생성되는 화학주성 자극에 반응성이며, 감염 조직으로 이동하여 침범 미생물을 사멸시킬 수 있다. 사멸은 미생물을 빨아들이고 산소 라디칼과 살미생물 효소를 방출하는 호중구의 능력에 의존한다. 문헌 [Baggiolini, 1984, Experientia, 40:906-909] 참조.
호중구는 그들 핵의 크기, 그들 핵의 형상, 세포 크기, 핵/세포질 비율, 과립의 존재/부재, 및 염색 특성과 같은 특성을 포함하는, 그들의 현미경적 형태학적 외관에 의해 구별될 수 있는, 일련의 중간 전구 세포를 통해 줄기 세포로부터 분화한다. 처음에, 시험관 내에서 직접적으로 측정될 수 없는, 다분화능 줄기 세포는 모든 골수 세포주에 대한 전구체를 생성하는 골수 "선조" 세포를 생성시킨다. 제1 골수 선조는 "콜로니 형성 단위--과립구, 적혈구, 대식세포 및 거핵세포"에 대한 CFU-GEMM으로 명명된다. CFU-GEMM 선조는 다음으로 다르게는 "콜로니 형성 단위--과립구 및 대식세포"로 알려져 있는, CFU-GM 선조 세포를 생성시킨다. 모든 이들 기술적 용어에서, "콜로니"는 본 명세서의 실시예 5에 기재된 바와 같은 조건 하에서, 클론 성장에 대해 시험관 내 어세이에서 측정된 바 50 초과 세포를 생성할 수 있는 세포를 말한다. 이들 세포는 적어도 6회 분열할 것이다.
CFU-GM은 수임된 선조이다; 그것은 과립구와 대식세포만으로 분화하도록 수임된다. 그것은 다른 유형의 세포로 분화할 수 없고 더 이른 단계의 선조 세포로 탈분화할 수도 없다. CFU-GM 선조 세포는 그 후 골수아세포로 분화할 수 있다. CFU-GEMM으로부터 골수아세포로의 분화에 요구되는 시간은 약 1-4일인 것으로 믿어진다. 골수아세포는, 일단 완전히 발생(분화)되도록 하면, 그러한 세포는 단지 호중구를 형성할 수 있으므로, 호중구에 대한 "전구체"로 언급될 수 있는 세포 시리즈의 첫번째이다. 호중구는 단지 6회 미만의 세포 분열을 수행할 수 있을 뿐이며, 따라서, 이전에 기재된 바와 같은 시험관 내 콜로니 어세이에서 콜로니를 형성하지 못한다.
일단 분화가 골수아세포 단계까지 진행되면, 골수아세포는 다음에 약 4-6일의 과정에 걸쳐 골수세포로 분화하는, 전골수세포로의 최종 분화를 수행한다. 추가 5일 정도 안에, 골수세포는 다음에 밴드를 갖는 호중구로 분화하는, 후골수세포로 분화한다. 이들 밴드를 갖는 호중구는 최종적으로 약 0.3 내지 2일의 반감기를 갖는, 성숙한, 분절된 호중구로 분화한다. 용어 "선조"는 줄기 세포와, 콜로니를 형성할 수 있는 세포를 언급하는데 사용될 것이다. "전구"는 골수아세포, 전골수세포 및 골수세포 및, 일부 경우, 후골수세포 및 밴드를 갖는 호중구를 언급하는데 사용될 것이다.
이 진행성의, 형태학적 분화 동안, 전구 세포의 표면 항원에서의 변화가 관찰될 수 있다. 예를 들어, 줄기 세포, CFU-GEMM 및 CFU-GM은 CD34+이다. CFU-GM 단계를 넘어 분화하는 조혈 세포는 더 이상 CD34+가 아니다. 유사한 발현의 진행이 세포-표면 항원 CD33 및 CD45RA에 대해 관찰된다. 전골수세포 전구 세포에 이은 모든 호중구 전구 세포는 CD34-, CD33+, CD38+, CD13+, CD45RA- 및 CD15+를 특징으로 할 수 있다. 보다 성숙한 세포는 또한 CD11+ 및 CD16+를 특징으로 할 수 있다 [Terstappen 등, 1990, Leukemia, 4:657]. 그러나, 세포-표면 항원 발현에서의 그러한 전이는 급격하기 보다 점진적이며, 특정 세포-표면 항원에 대해 특정 전구 세포 유형의 일부 세포는 양성일 수 있고 동일한 유형의 다른 세포는 음성일 수 있음을 이해해야만 한다. 더욱이, 특정 세포 유형이 특정 세포-표면 항원에 대해 양성인지 음성인지의 결정은 부분적으로 그 결정을 하는데 사용되는 특정 방법에 의존할 것이다. 세포-표면 항원 발현에 의한 세포 분화의 특성규명은 세포 형태와 같은, 세포 분화를 특징짓는 다른 수단에 의해 확인될 수 있다.
"호중구감소증"은 비정상적으로 낮은 수의 순환 호중구를 특징으로 하는 상태이다. 호중구감소증을 앓는 환자는 혈액 중에 순환하는 감소된 수의 호중구가 환자가 어떠한 침범 미생물과 싸우는 능력을 손상시키므로, 감염과 질병의 실질적인 위험에 놓여있다. 호중구감소증 자체는 병, 유전적 장애, 약물, 독소, 및 방사선조사와 고용량 화학요법(HDC)과 통상적인 종양 요법과 같은, 많은 치료적 치료의 결과일 수 있다. 예를 들어, 많은 암이 매우 높은 용량의 방사선 또는 항신생물(항암) 약물에 대해 감수성인 것으로 밝혀져 있을지라도, 그러한 강력한 HDC는 그것이 암성 세포를 사멸시킬 뿐 아니라, 빈번하게 기능적 면역 체계를 유지하는데 필요한 호중구 군대를 생성시키는 역할을 하는 조혈 체계의 세포를 파괴하기 때문에 널리 사용되지 않는다. 호중구 선조 및 전구 세포의 완전한 파괴는 성숙 호중구를 생성하는 환자의 단기 능력을 제거하여, 감염과 싸우는 환자의 능력을 심각하게 저하시킨다. 그러면 환자는 "면역저하"되며 기회 감염의 대상이 된다. 그러한 상태는 궁극적으로 병적 상태와 죽음을 가져올 수 있다. 호중구와 그에 대한 전구체의 실질적 감소를 일으키는, 조혈 체계에 심각한 손상이 있는 다른 상황도 접할 수 있다.
3. 혈액학적 장애
혈액학적 장애는 혈액 세포에서 이형성적 변화와 혈액 종양에 이르게 할 수 있는, 혈액 세포의 비정상적 증식과 분화를 특징으로 한다. 많은 혈액학적 장애의 발생은 하나의 세포 유형이 우세한, 클론성 과정이다. 일부 경우, 다른 세포 유형 또한 비정상적으로 발생한다. 더욱이, 특정 장애의 비정상적 세포는 미분화된 조혈 선조, 다분화능 줄기 세포 또는 계통-수임된 전구 세포의 클론성 유도체를 나타낸다. 문헌 [Gerber 및 Ferrara, 2003, J. Mol. Med., 81:20-31; Raskind 등, 199S, Leukemia, 12:108-116] 참조. 많은 혈액학적 장애는 백혈병, 골수증식성 장애(MPD) 및 골수이형성적 장애로 분류된다. 많은 이들 장애는 성인에서도 어린이에서도 발생할 수 있다.
급성 골수성 백혈병(AML)은 성인에서 발생하는 가장 보편적인 유형의 급성 백혈병이다. 몇몇 유전성 유전적 장애와 면역결핍 상태는 AML의 증가된 위험과 관련되어 있다. 이들은 블룸 증후군, 판코니 빈혈, 리-프라우메니 유사증, 모세혈관확장성 운동실조증 및 X-연관 무감마글로불린혈증과 같은, 무작위적 염색체 파괴에 이르게 하는, DNA 안정성에서의 결함을 갖는 장애를 포함한다. 사이토아라빈(Ara-C)이 AML을 치료하기 위해 단독으로나 안트라사이클린이나 다우노루비신과 병용하여 사용되어 왔다.
급성 림프모구성 백혈병(ALL)은 다양한 서브타입에 의해 나타내어지는 구별되는 임상적 특징을 갖는 이질적 질환이다. 재발하는 세포유전적 상태가 ALL에서 입증되었다. 가장 보편적인 세포유전적 상태는 염색체 9와 22의 전좌를 포함한다. 결과로서 생성되는 필라델피아 염색체는 환자에 대해 빈약한 전조를 나타낸다. 빈크리스틴, 안트라사이클린 및 프레드니손이 ALL을 치료하는데 사용되었다.
골수증식성 장애(MPD)는 조혈 세포의 비정상적 증식을 특징으로 한다. 각각의 특정 MPD에서, 하나의 특정 세포 유형이 우세하지만, 일부 또는 모든 다른 BM 세포 유형 또한 더 작은 정도로 비정상적으로 증식하고 있다는 증거가 있다. 예를 들어, 만성 골수성 백혈병(CML)은 다분화능 줄기 세포의 클론성 MPD이다. CML은 필라델피아 염색체를 창출하는, 염색체 9와 22의 전좌를 포함하는 특정 염색체 이상으로 인해, 혈액에 순환하는, 다수의 비정상적 성숙 과립구의 존재를 특징으로 한다. 이온화 조사는 CML의 발병과 연관되어 있다. 하이드록시우레아, 인터페론(INF) 및 Ara-C가 CML에 걸린 환자를 치료하는데 사용되어 왔다. 다른 전형적인 MPD들은 진성 적혈구증가증(PV; 적혈구의 과잉증식), 본태성 혈소판증가증(ET; 혈소판의 과잉발현) 및 골수 섬유화증(골수섬유증으로도 알려져 있음)을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
골수이형성 증후군(MDS)은 골수, 적혈구 및 거핵구 시리즈에서 이형성적 변화를 포함하는 하나 이상의 조혈 계통의 이형성적 변화의 존재 때문에 함께 그룹화되는 이질적 클론성 조혈 줄기 세포 장애이다. 이들 변화는 세 계통 중 하나 이상에서 세포감소증을 일으킨다. MDS를 앓고 있는 환자는 전형적으로 빈혈, 호중구감소증(감염), 또는 혈소판증가증(출혈)과 관련된 합병증을 나타낸다. 일반적으로, 약 10% 내지 약 70%의 MDS 환자가 급성 백혈병을 발병한다.
B. Bv8 및 EG - VEGF
Bv8은 개구리 봄비나 바리에가타(Bombina variegata)의 피부 분비물로부터 처음으로 분리된 소형 단백질이다 [Mollay 등, 1999, Eur. J. Pharmacol., 374:189- 196]. Bv8은 소화 효소 콜리파제, 제노푸스 두부-조직체, 딕코프(Dickkopf)[Glinka 등, 1998, Nature, 391:357-362], 독 단백질 A(VPRA)[Joubert 및 Strydom, 1980, Hopper-Seyler's Z. Physiol. Chem., 361:1787-1794] 또는 MIT-1[Schweitz 등, 1999, FEBS Lett., 461:183-188], 덴드로아스피스 폴리레피스(Dendroaspis polylepis) 독의 비독성 성분, 및 최근에 동정된 내분비-선-유래된 혈관 내피 성장 인자(EG-VEGF)[LeCouter 등, Nature, 412:877-884(2001)]를 포함하는 구조적으로 관련된 클래스의 펩티드에 속한다. 구별되는 구조적 모티프는 보존된 영역 내에서 10개 시스테인 잔기가 5개 디설파이드 브릿지를 형성하는, 콜리파제-폴드이다. EG-VEGF(VPRA에 80% 동일) 및 VPRA는 각각 83% 및 79% 동일성으로, Bv8 펩티드에 가장 밀접하게 관련되어 있다. 프로키네티신-2(PK2)[Li 등, 2001, Mol. Pharm., 59: 692-698]로도 알려져 있는, Bv8의 마우스 및 인간 오르쏘로그(orthologue)가 최근에 동정되었고, 뉴우런 생존, 위장 평활근 수축 및 일주기성 이동 리듬을 포함하는, 이들에 대한 다양한 활성이 보고되어 있다. 문헌 [Li 등, 2001; Melchiorri 등, 2001, Eur. J. Neurosci. 13:1694-1702; Cheng 등, 2002, Nature 417:405-410] 참조.
EG-VEGF와 Bv8은 둘다 특정 조직의 내피 세포에 대한 선별적 활성을 갖는 혈관신생 인자로 동정되어 있다. 내피 세포의 다양한 구조적 및 기능적 성질과, 다양한 생체 내 및 생체 외 시스템으로부터의 증거는 내피 세포 표현형과 성장의 국소적, 조직-특이적 조절자의 존재를 암시한다. 인간 (h)EG-VEGF mRNA의 발현이 스테로이드합성 선: 난소, 고환, 부신 및 태반에 주로 제한되어 있는 것으로 밝혀졌다. EG-VEGF는 배양된 부신 모세혈관 내피 세포에서 증식, 이동, 생존 및 개창을 촉진하였다. 그것은 또한 난소로 전달될 때 강력한 혈관신생을 유도하였지만, 다른 조직에서는 그렇지 않았다 [LeCouter 등, 2001, Nature, 412:877-884].
Bv8은 고환에서 우세하게 발현되는 것으로 밝혀졌으며 대개 제1 정모세포에 제한된다 [LeCouter 등, 2003, PNAS 5:2685-2690]. EG-VEGF와 유사하게, Bv8은 부신 피질 모세혈관 내피세포의 증식, 생존 및 이동을 유도할 수 있다. Bv8 유전자 발현은 저산소 스트레스에 의해 유도된다. 마우스 고환으로의 Bv8 또는 EG-VEGF의 아데노바이러스 전달은 강력한 혈관신생 반응을 일으켰다. 더욱이, Bv8/EG-VEGF의 두 G 단백질-커플링된 수용체, Bv8/EG-VEGF 수용체-1과 Bv8/EG-VEGF 수용체-2의 고환 내의 발현은 혈관 내피 세포에 국소화되어 있었다 [LeCouter 등, 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:2685-2690; Lin 등, 2002, J. Biol. Chem. 277:19276-19280; Masuda 등, 2002, Biochem. Biophys. Res. Commun. 293:396-402]. 고환은 내피 세포의 상대적으로 높은 전환율을 나타낸다. 따라서, VEGF와 같은 다른 인자와 함께, Bv8과 EG-VEGF는 고환에서 혈관의 완전한 상태를 유지하고 증식을 조절하는데 중요한 것으로 여겨진다.
C. Bv8 및 EG - VEGF 변이체의 동정
여기에 기재된 전장 천연 서열 Bv8 및 EG-VEGF 폴리펩티드에 더하여, Bv8 및 EG-VEGF 변이체가 본 발명에서 동정, 제조되고 사용될 수 있음이 착안된다. Bv8 및 EG-VEGF 변이체는 Bv8 또는 EG-VEGF DNA로 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입하고/거나, 원하는 Bv8 또는 EG-VEGF 폴리펩티드를 합성함으로써 제조될 수 있다. 당업자는 아미노산 변화가 글리코실화 위치의 수나 위치를 변화시키는 것과 같은, Bv8 또는 EG-VEGF의 번역-후 과정을 변형시킬 수 있음을 이해할 것이다. Bv8 또는 EG-VEGF 변이체의 제조방법은 바람직하게는 천연 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 치환하여, 이하 상세히 설명되는 바와 같은 천연 서열 Bv8 및 EG-VEGF를 제조하기 위한 것과 동일하다.
Bv8 또는 EG-VEGF를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자가 본 발명의 방법에 사용된다. 인간 Bv8의 두 전장 변이체를 코딩하는 cDNA들이 도 1과 3(서열번호 1과 3)에 제공되어 있고, 상응하는 추론된 아미노산 서열이 도 2와 4(서열번호 2와 4)에 제공되어 있다. 마우스 Bv8을 코딩하는 cDNA가 도 5(서열번호 5)에 제공되어 있고 상응하는 추론된 아미노산 서열이 도 6(서열번호 6)에 제공되어 있다. 두 전장 천연 EG-VEGF들을 코딩하는 cDNA들(서열번호 7과 9)과 상응하는 추론된 아미노산 서열(서열번호 8과 10)은 본 발명의 방법에 유용하다. 본 발명에 사용되는 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 혼성화 스크리닝과 PCR 방법론과 같은, 당업자에게 잘 알려져 있는 표준 기술을 이용하여 얻어질 수 있다.
Bv8 또는 EG-VEGF의 아미노산 서열을 코딩하는 어떠한 뉴클레오티드 서열도 각각 Bv8 또는 EG-VEGF의 발현을 지시하는 재조합 분자를 생성하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 Bv8 또는 EG-VEGF 코딩 서열과 제2의 이종 단백질의 코딩 서열 간의 융합 폴리뉴클레오티드를 사용할 수 있다.
전체 Bv8 또는 EG-VEGF cDNA를 코딩하는 어느 종으로부터의 전장의 상동적 cDNA 서열을 클로닝하거나, 훼밀리 구성원이나 대립형질 변이체와 같은 변이체 형태를 클로닝하기 위하여, 여기에 개시된 cDNA 서열의 어느 일부에 상응하는 단편으로부터 제조된 표지된 DNA 프로브가 Bv8 또는 EG-VEGF를 발현하는 것으로 믿어지는 세포나 조직 유형으로부터 유래된 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 코딩 서열의 5' 또는 3' 말단에 상응하는, 올리고뉴레오티드가 더 긴 뉴클레오티드 서열을 얻는데 사용될 수 있다.
전장 cDNA를 얻기 위하여 상이한 조직으로부터 여러 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 것이 필요할 수 있다. cDNA 클로닝에서 자주 접하는 상황인, 완전한 5' 말단 코딩 부위를 코딩하는 cDNA 클론을 동정하는 것이 어려운 경우, RACE(cDNA 말단의 신속한 증폭) 기술이 사용될 수 있다. RACE는 불완전 cDNA들의 5' 말단을 증폭하기 위한 입증된 PCR-기초 전략이다. 독특한 앵커 서열을 함유하는 인간 태반으로부터 합성된 5'-RACE-레디 RNA(5'-RACE-Ready RNA)가 상업적으로 이용가능하다 (클론테크). cDNA의 5' 말단을 얻기 위하여, PCR이 제공된 앵커 프라이머와 3' 프라이머를 이용하여 5'-RACE-레디 cDNA 상에서 수행된다. 그런 다음 이차 PCR이 제조자의 지시에 따라 앵커 프라이머와 네스트된(nested) 3' 프라이머를 이용하여 수행된다. 일단 얻어지면, 전장 cDNA 서열은 아미노산 서열로 번역되고 번역 개시 및 종결 위치에 의해 연결되는 연속적인 오픈 리딩 프레임, 잠재적 신호 서열 및 최종적으로 여기에 개시된 Bv8 및(또는) EG-VEGF 서열에 대한 전체 구조적 동일성과 같은 어느 특색에 대해 조사될 수 있다.
다르게는, 표지된 프로브가 내부에 설명된 바와 같은 적절한 엄격한 조건을 이용하여 관심있는 어느 유기체로부터 유래된 게놈 라이브러리를 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
Bv8 또는 EG-VEGF 코딩 서열 또는 상동적 서열의 분리는 여기에 개시된 Bv8 또는 EG-VEGF 코딩 서열에 기초하여 설계된 두 축퇴 올리고뉴클레오티드 프라이머 풀을 이용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 수행될 수 있다. 반응을 위한 주형은 예를 들어, Bv8 유전자 대립형질이나 EG-VEGF 유전자 대립형질을 발현하는 것으로 알려지거나 추정되는 인간 또는 비인간 세포주 또는 조직으로부터 제조된 mRNA의 역전사(RT)에 의해 얻어지는 cDNA일 수 있다.
PCR 산물은 증폭 서열이 Bv8 또는 EG-VEGF 코딩 서열의 서열을 나타내는 것을 보장하기 위하여 서브클로닝되고 서열결정될 수 있다. 그런 다음 PCR 단편이 다양한 방법에 의해 전장 cDNA 클론을 분리하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 증폭 단편은 표지되고 박테리오파지 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 다르게는, 표지된 단편이 게놈 라이브러리의 스크리닝을 통해 게놈 클론을 분리하는데 사용될 수 있다.
PCR 기술이 또한 전장 cDNA 서열을 분리하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, RNA가 적절한 세포 또는 조직 출처로부터, 표준 과정에 따라, 분리될 수 있다. RT 반응이 제1 쇄 합성의 프라이밍을 위해 증폭 단편의 가장 5' 말단에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 RNA 상에서 수행될 수 있다. 그런 다음 결과적인 RNA/DNA 하이브리드는 표준 말단 전이효소 반응을 이용하여 구아닌으로 "테일링"될 수 있고, 하이브리드는 RNase H로 분해될 수 있으며, 그런 다음 제2 쇄 합성이 폴리-C 프라이머로 프라이밍될 수 있다. 따라서, 증폭 단편의 상류 cDNA 서열이 쉽게 분리될 수 있다.
Bv8 또는 EG-VEGF 유전자의 돌연변이 또는 대립형질 변이체의 cDNA 클론은 예를 들어, PCR을 이용하여, 분리될 수 있다. 이 경우, 제1 cDNA 쇄는 올리고-dT 올리고뉴클레오티드를 돌연변이 Bv8 대립형질, 돌연변이 EG-VEGF 대립형질, 또는 그들의 배합물을 추정적으로 운반하는 개체에서 Bv8, EG-VEGF 또는 그들의 배합물을 발현하는 것으로 알려지거나 추정되는 조직으로부터 분리된 mRNA에 혼성화시키고, 새로운 쇄를 역전사효소로 신장시킴으로써 합성될 수 있다. 그런 다음 cDNA의 제2 쇄는 정상 유전자의 5' 말단에 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 합성된다. 그런 다음 이들 두 프라이머를 이용하여, 산물은 PCR을 통해 증폭되고, 적당한 벡터로 클로닝되고, 당업자에게 잘 알려진 방법을 통해 DNA 서열결정된다. 돌연변이 Bv8 또는 EG-VEGF 대립형질의 DNA 서열을 정상 Bv8 또는 EG-VEGF 대립형질의 것과 비교하여, 돌연변이 Bv8 또는 EG-VEGF 유전자 산물의 기능의 상실이나 변형을 담당하는 돌연변이(들)가 확인될 수 있다.
다르게는, 게놈 라이브러리를 돌연변이 Bv8 대립형질 또는 돌연변이 EG-VEGF 대립형질을 운반하는 것으로 추정되거나 알려진 개체로부터 얻어진 DNA를 이용하여 제작될 수 있거나, cDNA 라이브러리가 돌연변이 Bv8 대립형질 또는 돌연변이 EG-VEGF 대립형질 라이브러리를 발현하는 것으로 알려지거나, 추측되는 조직으로부터의 RNA를 이용하여 제작될 수 있다. 그런 다음 손상되지 않은 Bv8 또는 EG-VEGF 유전자나 그의 어느 적당한 단편이 표지되고 그러한 라이브러리에서 상응하는 돌연변이 Bv8 또는 EG-VEGF 대립형질을 동정하는 프로브로서 사용될 수 있다. 그런 다음 돌연변이 Bv8 유전자 서열이나 돌연변이 EG-VEGF 유전자 서열을 함유하는 클론이 당업자에게 잘 알려져 있는 방법에 따라 정제되고 서열분석될 수 있다.
부가적으로, 발현 라이브러리는 예를 들어, 돌연변이 Bv8 대립형질 또는 돌연변이 EG-VEGF 대립형질을 그러한 돌연변이 대립형질을 운반하는 것으로 알려지거나 추측되는 개체에서 발현하는 것으로 알려지거나, 추측되는 조직으로부터 분리된 RNA로부터 합성된 cDNA를 이용하여 제작될 수 있다. 이 방식으로, 추정되는 돌연변이 조직에 의해 제조되는 유전자 산물이 발현되고 아래 기재되는 바와 같은, 정상적 Bv8 또는 EG-VEGF 유전자 산물에 대해 생성된 항체와 결합하여 표준 항체 스크리닝 기술을 이용하여 스크리닝될 수 있다.
여기에 사용된 바, 용어 핵산, 폴리뉴클레오티드 및 뉴클레오티드는 상호교환가능하며, 데옥시리보뉴클레오사이드나 리보뉴클레오사이드로 구성되든지, 또한 포스포디에스테르 결합이나 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 실록산, 카보네이트, 카르복시메틸에스테르, 아세트아미데이트, 카바메이트, 티오에테르, 브릿지된 포스포르아미데이트, 브릿지된 메틸렌 포스포네이트, 포스포로티오네이트, 메틸포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 브릿지된 포스포로티오에이트 또는 설폰 결합, 및 그러한 결합의 배합과 같은 수식된 결합으로 구성되든지, 어떠한 핵산도 가리킨다.
용어 핵산, 폴리뉴클레오티드 및 뉴클레오티드는 또한 구체적으로 다섯개의 생물학적으로 발생하는 염기(아데닌, 구아닌, 티민, 사이토신 및 우라실) 이외의 염기로 구성된 핵산을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포잔틴, 잔틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시하이드록실메틸)우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸-우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실큐에오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실큐에신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 와이부톡소신, 슈도우라실, 큐에신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필)우라실, (acp3)w, 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 수식된 염기를 함유할 수 있다.
더욱이, 본 발명에 사용되는 폴리뉴클레오티드는 아라비노스, 2-플루오로아라비노스, 자일룰로스 및 헥소스를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 수식된 부위를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법이 폴리뉴클레오티드의 출처에 의해 제한되는 것은 의도되지 않는다. 폴리뉴클레오티드는 시험관 내 또는 화학적 합성에 의해 합성된, 어느 재조합 출처로부터 유래된, 인간 또는 비-인간 포유류로부터일 수 있다. 뉴클레오티드는 DNA나 RNA일 수 있고 이본쇄, 일본쇄 또는 부분적 이본쇄 형태로 존재할 수 있다.
본 발명에서 유용한 핵산은, 제한이 아닌 예로써, 안티센스 DNA 및(또는) RNA와 같은 올리고뉴클레오티드; 리보자임; 유전자 요법을 위한 DNA; DNA 및(또는) RNA 키메라; 일본쇄 DNA, 이본쇄 DNA, 슈퍼코일 DNA 및(또는) 삼중-나선 DNA를 포함하는 다양한 구조적 형태의 DNA; Z-DNA 등를 포함한다. 핵산은 대량으로 핵산을 제조하는데 전형적으로 사용되는 어느 통상적 수단에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, DNA들과 RNA들은 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 의해 상업적으로 이용가능한 시약과 합성제를 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gait, 1985, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, England] 참조). RNA들은 SP65(프로메가 코포레이션, WI, 매디슨)와 같은 플라스미드를 이용하여 시험관 내 전사를 통해 고수율로 생산될 수 있다.
특히 mRNA 전구체의 대체 스플라이싱이나 가공으로부터 기인하는 mRNA 전사체를 포함하는, Bv8 또는 EG-VEGF 핵산 서열에 의해 코딩되는 어떠한 mRNA 전사체도 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
증가된 뉴클레아제 안정성을 원하는 경우와 같은, 일부 상황에서, 수식된 뉴클레오사이드간 결합을 갖는 핵산이 바람직할 수 있다. 수식된 뉴클레오사이드간 결합을 함유하는 핵산은 또한 당업계에 잘 알려져 있는 시약과 방법을 이용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 포스포네이트 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트 메톡시에틸 포스포르아미데이트, 포름아세탈, 티오포름아세탈, 디이소프로필실릴, 아세트아미데이트, 카바메이트, 디메틸렌-설파이드(-CH2-S-CH2), 디메틸렌-설폭사이드(-CH2-SO-CH2), 디메틸렌-설폰(-CH2-SO2-CH2), 2'-O-알킬 및 2'-데옥시-2'-플루오로 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 결합이 당업계에 잘 알려져 있다 (문헌 [Uhlmann 등, 1990, Chem. Rev., 90:543-584; Schneider 등, 1990, Tetrahedron Lett., 31:335] 및 그에 인용된 참조문헌 참조).
본 발명의 일부 구체예에서, 사용되는 뉴클레오티드는 α-아노머 뉴클레오티드이다. α-아노머 뉴클레오티드는 보통의 β-단위와 반대로, 쇄가 서로 평행하는 상보적 RNA와의 특이적 이본쇄 하이브리드를 형성한다 [Gautier 등, 1987, Nucl. Acids Res. 15:6625-6641]. 뉴클레오티드는 2'-O-메틸리보뉴클레오티드[Inoue 등, 1987, Nucl. Acids Res. 15:6131-6148]나, 키메라 RNA-DNA 유사체[Inoue 등, 1987, FEBS Lett. 215:327-330]이다.
핵산은 당업계에 잘 알려진 어느 적당한 수단에 의해 정제될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 역상 또는 이온 교환 HPLC, 크기 배제 크로마토그래피, 또는 겔 전기영동에 의해 정제될 수 있다. 물론, 당업자는 정제방법이 부분적으로 정제하고자 하는 DNA의 크기에 의존할 것임을 인식할 것이다.
Bv8 코딩 서열, EG-VEGF 코딩 서열, 그들의 배합물, 또는 그의 상보물의 적어도 10 뉴클레오티드(즉, 혼성화가능한 일부)를 갖는 분리되거나 정제된 폴리뉴클레오티드 또한 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 Bv8 코딩 서열, EG-VEGF 코딩 서열, 또는 그들의 배합물의 적어도 25(연속적) 뉴클레오티드, 50 뉴클레오티드, 100 뉴클레오티드, 150 뉴클레오티드, 또는 200 뉴클레오티드, 또는 전장 Bv8 코딩 서열, EG-VEGF 코딩 서열, 또는 그들의 배합물을 함유한다. 핵산은 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있다. 부가적으로, 본 발명은 상기 코딩 서열의 상보물에 선별적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 적어도 10, 25, 50, 100, 150 또는 200 뉴클레오티드, 또는 전체 길이의 Bv8 코딩 서열, EG-VEGF 코딩 서열, 또는 그들의 배합물을 함유한다.
Bv8 또는 EG-VEGF의 돌연변이, Bv8 또는 EG-VEGF의 펩티드 단편, Bv8 또는 EG-VEGF의 절단 형태, 및 Bv8 융합 단백질 또는 EG-VEGF 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또한 본 발명의 방법에 유용할 수 있다. 융합단백질을 코딩하는 뉴클레오티드는 예를 들어, 혈류에서 결과적인 융합 단백질(예를 들어, Bv8-Ig 또는 EG-VEGF-Ig)의 안정성과 반감기를 증가시키는 Ig Fc 영역; 또는 마커로 사용될 수 있는 형광 단백질 또는 발광 단백질과 같은 효소에 융합된 영역과 같은, 관련되지 않은 단백질 또는 펩티드에 융합된 전장 Bv8 서열 또는 EG-VEGF 서열, Bv8 또는 EG-VEGF의 절단 형태 또는 Bv8 또는 EG-VEGF의 펩티드 단편을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
더욱이, 적어도 부분적으로 일부 형태의 지향된 진화, 예를 들어, 여기에 그 전체로 참조로서 도입되는, 미국특허 제5,605,793호 및 제5,837,458호에 기재된 유전자 셔플링 및(또는) 반복 서열 재조합에 의해 생성된 Bv8 및 EG-VEGF 폴리뉴클레오티드 변이체가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 그러한 기술을 이용하여, Bv8 코딩 서열 및(또는) EG-VEGF 코딩 서열, 또는 복수의 Bv8 및(또는) EG-VEGF 코딩 서열이 변형된 기능적 및(또는) 구조적 특성을 갖는 기능적 및(또는) 구조적으로 유사한 단백질을 코딩하는 신규 서열의 생성을 위한 출발점으로 사용될 수 있다.
상기한 Bv8 및(또는) EG-VEGF 코딩 폴리뉴클레오티드 서열의 고도로 관련된 유전자 동족체 또한 본 발명에서 유용할 수 있다. 고도로 관련된 유전자 동족체는 도 2 또는 도 4(서열번호 2 및 4)의 성숙 인간 Bv8, 및 성숙 인간 EG-VEGF(서열번호 8)와 같은 자연 발생 Bv8 또는 EG-VEGF의 아미노산 서열과 적어도 약 60% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 65%, 70%, 75%, 또는 80% 아미노산 서열 동일성을 갖고, 적어도 약 85% 내지 적어도 약 99%의 아미노산 서열 동일성까지 1% 증가분씩 선호도가 증가하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명의 방법은 또한 (a) 상기 Bv8 또는 EG-VEGF 코딩 서열 및(또는) 그들의 보체(즉, 안티센스) 중 어느 것을 함유하는 DNA 벡터; (b) 코딩 서열의 발현을 지시하는 조절 요소와 작동가능하게 연결된 상기 Bv8 또는 EG-VEGF 코딩 서열 중 어느 것을 함유하는 발현 벡터; (c) 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현을 지시하는 조절 요소와 작동가능하게 연결된 상기 Bv8 및(또는) EG-VEGF 코딩 서열 중 어느 것, 또는 그들의 배합물을 함유하는 유전적으로 조작된 숙주 세포; 및 (d) 외생적으로 도입된 조절 요소의 제어 하에(예를 들어, 유전자 활성화) 내생적 Bv8 유전자나 EG-VEGF 유전자를 발현하는 유전적으로 조작된 숙주 세포의 사용에 의해 유익하다.
예를 들어, 천연 서열 Bv8 또는 EG-VEGF 또는 여기에 기재된 Bv8 또는 EG-VEGF의 다양한 영역에서의 변이는 예를 들어, 미국특허 제5,364,934호에 기재된 보존적 및 비보존적 돌연변이에 대한 기술과 가이드라인 중 어느 것을 이용하여 만들어질 수 있다. 변이는 천연 서열 Bv8 또는 EG-VEGF와 비교하여 Bv8 또는 EG-VEGF의 아미노산 서열에서의 변화를 일으키는 Bv8 또는 EG-VEGF를 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 임의로 변이는 Bv8 또는 EG-VEGF의 하나 이상의 영역에서 적어도 하나의 아미노산의 어느 다른 아미노산으로의 치환에 의한다. 어느 아미노산 잔기가 원하는 활성에 부정적으로 영향을 미치지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는지를 결정하는데 있어서의 지침은 Bv8 또는 EG-VEGF의 서열을 상동적인 공지 단백질 분자의 것과 비교하고 높은 상동성 부위에서 만들어지는 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 밝혀질 수 있다. 아미노산 치환은 류신의 세린으로의 대체와 같은, 하나의 아미노산을 유사한 구조적 및(또는) 화학적 성질을 갖는 다른 아미노산으로 대체한 결과, 즉 보존적 아미노산 대체일 수 있다. 삽입이나 결실은 임의로 약 1 내지 5개 아미노산 범위일 수 있다. 허용되는 변이는 서열에 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 체계적으로 만들고 결과 변이체를 전장 또는 성숙 천연 서열에 의해 나타내어지는 활성에 대해 시험함으로써 결정될 수 있다.
Bv8 폴리펩티드 단편과 EG-VEGF 폴리펩티드 단편 또한 본 발명의 방법에 유용하다. 그러한 단편은 예를 들어, 전장 천연 단백질과 비교하여, N-말단이나 C-말단에서 절단되거나, 내부 잔기를 결여할 수 있다. 어느 단편은 Bv8 폴리펩티드나 EG-VEGF 폴리펩티드의 원하는 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기를 결여한다.
Bv8 단편 및 EG-VEGF 단편은 많은 통상적인 기술 중 어느 것에 의해 제조될 수 있다. 원하는 펩티드 단편은 화학적으로 합성될 수 있다. 대체 접근법은 예를 들어, 단백질을 특정 아미노산 잔기에 의해 결정되는 위치에서 단백질을 절단하는 것으로 알려진 효소로 처리하거나, DNA를 적당한 제한효소로 분해하고 원하는 단편을 분리함으로써, 효소 분해에 의해 Bv8 또는 EG-VEGF 단편을 생성하는 것을 포함한다. 또다른 적당한 기술은 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 원하는 폴리펩티드 단편을 코딩하는 DNA를 분리하고 증폭하는 것을 포함한다. DNA 단편의 원하는 말단을 결정하는 올리고뉴클레오티드가 PCR에서 5' 및 3' 프라이머에 사용된다. 바람직하게는, Bv8 또는 EG-VEGF 폴리펩티드 단편은 각각 천연 Bv8 폴리펩티드 및(또는) 천연 EG-VEGF 폴리펩티드와 적어도 하나의 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 공유한다.
특정 구체예에서, 관심있는 보존적 치환이 바람직한 치환이라는 제목 하에 표 1에 나타내어져 있다. 그러한 치환이 생물학적 활성의 변화를 일으키면, 표 1에서 예시적 치환으로 명명되거나, 아미노산 클래스에 관하여 아래에서 더 설명되는 바와 같은 보다 실질적인 변화가 도입되고 산물이 스크리닝된다.
원래 잔기 예시적 치환 바람직한 치환
Ala(A)
Arg(R)
Asn(N)
Asp(D)
Cys(C)
Gln(Q)
Glu(E)
Gly(G)
His(H)
Ile(I)
Leu(L)
Lys(K)
Met(M)
Phe(F)
Pro(P)
Ser(S)
Thr(T)
Trp(W)
Tyr(Y)
Val(V)		 val; leu; ile
lys; gln; asn
gln; his; lys; arg
glu
ser
asn
asp
pro; ala
asn; gln; lys; arg
leu; val; met; ala; phe; 노르류신
노르류신; ile; val; met; ala; phe
arg; gln; asn
leu; phe; ile
leu; val; ile; ala; tyr
ala
thr
ser
tyr; phe
trp; phe; thr; ser
ile; leu; met; phe; ala; 노르류신		 val
lys
gln
glu
ser
asn
asp
ala
arg
leu
ile
arg
leu
leu
ala
thr
ser
tyr
phe
leu
Bv8 폴리펩티드 또는 EG-VEGF 폴리펩티드의 기능이나 면역학적 동일성의 실질적 변형은 (a) 예를 들어, 쉬트나 나선 형태와 같은, 치환 영역에 있는 폴리펩티드 백본의 구조, (b) 표적 위치에 있는 분자의 전하나 소수성, 또는 (c) 측쇄의 부피를 유지하는데 대한 그들의 영향에서 유의하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다. 자연 발생 잔기는 공통적 측쇄 성질에 기초하여 그룹들로 나뉜다:
(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비보존적 치환은 이들 클래스 중 하나의 구성원을 다른 클래스로 바꾸는 것을 필요로 할 것이다. 그러한 치환된 잔기는 또한 보존적 치환 위치로, 또는 더 바람직하게는, 나머지(비-보존) 위치로 도입될 수 있다.
변이가 올리고뉴클레오티드-매개(부위-지시적) 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝 및 PCR 돌연변이유발과 같은 당업계에 알려진 방법을 이용하여 만들어질 수 있다. Bv8 변이체 DNA 및(또는) EG-VEGF 변이체 DNA를 제조하기 위하여 부위-지시적 돌연변이유발[Carter 등, 1986, Nucl. Acids Res., 13:4331; Zoller 등, 1987, Nucl. Acids Res., 10:6487], 카세트 돌연변이유발[Wells 등, 1985, Gene, 34:315], 제한 선별 돌연변이유발[Wells 등, 1986, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415] 또는 기타 공지 기술이 클론된 DNA에 대해 수행될 수 있다.
스캐닝 아미노산 분석은 또한 연속적 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 동정하는데 사용될 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산은 상대적으로 작은, 중성 아미노산이다. 그러한 아미노산은 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인을 포함한다. 알라닌은 전형적으로 그것이 베타-탄소를 넘는 측쇄를 제거하고 변이체의 주요-쇄 형태를 덜 변형시키기 때문에 이 그룹 중 바람직한 스캐닝 아미노산이다 [Cunningham 및 Wells, 1989, Science, 244:1081-1085]. 알라닌은 또한 그것이 가장 보편적인 아미노산이므로 전형적으로 바람직하다. 더욱이, 그것은 파묻힌 위치와 노출된 위치 둘다에서 빈번하게 발견된다 [Creighton, The Proteins(W. H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, 1976, J. Mol. Biol., 150:1]. 알라닌 치환이 적절한 양의 변이체를 생성시키지 못하면, 등입체성 아미노산이 사용될 수 있다.
D. Bv8 , EG - VEGF 및 그의 변이체의 제조
Bv8, EG-VEGF 및 그의 변이체의 생산을 위해 적당한 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 바람직한 기술은 천연 폴리펩티드와 변이체에 대한 것과 동일하므로, 아래 설명되는 기술이 각각 천연 서열 Bv8 및 EG-VEGF 뿐만 아니라 Bv8 및 EG-VEGF 변이체에 적용된다.
바람직한 제조방법은 폴리펩티드의 내생적 출처로부터 Bv8 또는 EG-VEGF의 분리, 펩티드 합성(펩티드 합성기 이용), 재조합 기술 또는 이들 기술의 어느 조합을 포함한다.
아래 논의의 대부분은 Bv8 핵산, EG-VEGF 핵산, 또는 그들의 배합물을 함유하는 벡터로 형질전환된 세포를 배양하고 세포 배양물로부터 폴리펩티드를 회수하는 것에 의한 Bv8 또는 EG-VEGF의 재조합적 생산에 관한 것이다. 그러나, 당업자는 Bvv8 및 EG-VEGF를 생산하는 많은 방법이 있음을 인식할 것이다.
간략하게는, 이 방법은 Bv8-코딩 유전자나 EG-VEGF 코딩 유전자를 함유하는 일차 인간 세포를 증폭가능한 유전자(디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 또는 아래 논의되는 기타)와 Bv8 유전자나 EG-VEGF 유전자의 코딩 부위 위치의 DNA 서열과 상동적인 적어도 약 150 bp 길이의 적어도 하나의 연결 부위를 포함하는 제작물(즉, 벡터)로 형질전환시켜 Bv8 유전자나 EG-VEGF의 증폭을 제공하는 것을 포함한다. 증폭가능 유전자는 Bv8 또는 EG-VEGF 유전자의 발현을 방해하지 않는 위치에 있어야만 한다. 증폭가능 부위를 결정하기 위하여 형질전환은 제작물이 일차 세포의 게놈에 상동적으로 통합되도록 수행된다.
제작물을 포함하는 일차 세포는 그런 다음 제작물에 존재하는 증폭가능 유전자나 다른 마커에 의해 선별된다. 마커 유전자의 존재는 제작물의 존재와 숙주 게놈으로의 통합을 확립한다. 선별이 제2 숙주에서 행해질 것이므로, 일차 세포의 어떠한 추가 선별도 행해질 필요가 없다. 원하는 경우, 상동적 재조합 현상의 발생은 정확한 상동적 통합체로부터의 DNA가 존재할 때 PCR을 사용하고 결과적인 증폭된 DNA 서열을 서열결정하거나 적절한 길이의 PCR 단편을 결정하고 그러한 단편을 함유하는 그들 세포만을 확장하여 결정될 수 있다. 또한 원하는 경우, 선별된 세포는 이 점에서 여러 카피의 표적 유전자가 얻어지도록, 세포를 적절한 증폭제(증폭가능 유전자가 DHFR이면 메토트렉세이트와 같은)로 압박하여 증폭될 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 증폭 단계는 아래 설명하는 제2 형질전환 후까지 수행되지 않는다.
선별 단계 후, 전체 증폭가능 부위를 포함하기에 충분히 큰, 게놈의 DNA 부분이 선별된 일차 세포로부터 분리된다. 그런 다음 이차 포유류 발현 숙주 세포는 이들 게놈 DNA 부분으로 형질전환되고 클로닝되며, 증폭가능 부위를 함유하는 클론이 선별된다. 그런 다음 증폭가능 부위는 일차 세포에서 이미 증폭되지 않은 경우 증폭제에 의해 증폭된다. 최종적으로, 이제 Bv8 또는 EG-VEGF를 함유하는 여러 카피의 증폭가능 부위를 포함하는 이차 발현 숙주 세포는 유전자를 발현하고 단백질을 생산하도록 성장된다.
Bv8 또는 EG-VEGF를 코딩하는 DNA는 각각 Bv8 mRNA 또는 EG-VEGF mRNA를 소유하고, 그것을 검출가능한 수준으로 발현하는 것으로 믿어지는 조직으로부터 제조된 어느 cDNA 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 따라서, Bv8 또는 EG-VEGF DNA는 제조된 cDNA 라이브러리, 예를 들어 여러 인간 조직으로부터 편리하게 수득될 수 있다. Bv8-코딩 유전자 또는 EG-VEGF-코딩 유전자는 또한 게놈 라이브러리로부터 또는 올리고뉴클레오티드 합성에 의해 수득될 수 있다.
라이브러리는 관심있는 유전자나 그에 의해 생산된 단백질을 동정하기 위해 설계된 프로브(Bv8 또는 EG-VEGF에 대한 항체나 약 20-80 염기의 올리고뉴클레오티드)로 스크리닝될 수 있다. 선별된 프로브로 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하는 것은 문헌 [Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratoy Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]의 10-12장에 기재된 바와 같은 표준 과정을 이용하여 수행될 수 있다. Bv8 코딩 유전자나 EG-VEGF 코딩 유전자를 분리하는 대체 수단은 상기 Sambrook 등의 14란에 기재된 바와 같은 PCR 방법론을 이용하는 것이다.
Bv8 및(또는) EG-VEGF cDNA의 바람직한 분리방법은 주의깊게 선별된 올리고뉴클레오티드 서열을 사용하여 다양한 인간 조직으로부터 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 것이다. 프로브로 선별된 올리고뉴클레오티드 서열은 위양성이 최소화되도록 충분한 길이의 것이고 충분히 명확한 것이어야 한다. 바람직한 서열은 여기에 개시된 자연 발생 Bv8 또는 EG-VEGF로부터 수득된다.
올리고뉴클레오티드는 그것이 스크리닝되는 라이브러리에 있는 DNA와 혼성화 시 검출될 수 있도록 표지되어야 한다. 바람직한 표지방법은 당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드 키나제와 함께 32P-표지된 ATP를 사용하여, 올리고뉴클레오티드를 방사성표지하는 것이다. 그러나, 바이오티닐화 또는 효소 표지화를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다른 방법이 올리고뉴클레오티드를 표지하는데 사용될 수 있다.
Bv8 또는 EG-VEGF를 코딩하는 핵산(예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)이 추가 클로닝(DNA의 증폭)이나 발현을 위해 복제가능한 벡터로 삽입된다. 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 아래 것의 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열.
본 발명에 유용한 Bv8 또는 EG-VEGF는 직접적으로 뿐만 아니라, 이종 폴리펩티드와의 융합 단백질로서 재조합적으로 생산될 수 있다. 이종 폴리펩티드는 바람직하게는 신호 서열이나 성숙 단백질이나 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 위치를 갖는 기타 폴리펩티드이다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 구성원이거나, 벡터로 삽입되는 Bv8 DNA 또는 EG-VEGF DNA의 일부일 수 있다. 선택되는 이종 신호 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 인식되고 가공(즉, 신호 펩티다제에 의해 절단)되는 것이다. 천연 Bv8 신호 서열 또는 EG-VEGF 신호 서열을 인식하고 가공하지 못하는 원핵 숙주 세포를 위해, 신호 서열은 예를 들어, 알칼라인 포스파타제, 페니실리나제, lpp 및 열-안정성 엔테로톡신 Ⅱ 리더로 구성된 그룹으로부터 선택되는 원핵 신호 서열에 의해 치환된다. 효모 분비를 위해 천연 신호 서열은 예를 들어, 효모 인버타제 리더, α 인자 리더(사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 α-인자 리더 포함, 후자는 1991년 4월 23일에 등록된 미국특허 제5,010,182호), 또는 산 포스파타제 리더, C. 알비칸스 글루코아밀라제 리더(1990년 4월 4일에 공개된 EP 362,179), 또는 1990년 11월 15일에 공개된 WO 90/13646에 기재된 신호에 의해 치환될 수 있다. 포유류 세포 발현을 위해, 천연 신호 서열(예를 들어, 생체 내에서 인간 세포로부터 Bv8 또는 EG-VEGF의 분비를 정상적으로 지시하는 Bv8 또는 EG-VEGF 프리서열)이, 다른 동물 Bv8 또는 EG-VEGF 폴리펩티드로부터의 신호 서열 및 동일하거나 관련된 종의 분비되는 폴리펩티드로부터의 신호 서열, 및 바이러스 분비 리더, 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 gD의 신호와 같은, 다른 포유류 신호 서열이 적당할 수 있을지라도, 만족스럽다.
그러한 전구체 부위의 DNA는 리딩 프레임에서 성숙 Bv8 또는 EG-VEGF, 또는 그의 가용성 변이체를 코딩하는 DNA에 결찰된다.
발현 및 클로닝 벡터는 둘다 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제할 수 있도록 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 이 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 복제하도록 하고, 복제 기원이나 자가 복제 서열을 포함하는 것이다. 그러한 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 잘 알려져 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기원이 대부분의 그램-음성 세균에 적당하고, 2μ 플라스미드 기원이 효모에 적당하며, 다양한 바이러스 기원(SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)이 포유류 세포에서 클로닝 벡터를 위해 적당하다. 일반적으로, 복제 기원 성분은 포유류 발현 벡터를 위해 필요하지 않다 (SV40 기원은 단지 그것이 초기 프로모터를 함유하기 때문에 전형적으로 사용될 수 있다).
대부분의 발현 벡터는 "셔틀" 벡터이고, 즉 그들은 적어도 한 클래스의 유기체에서 복제할 수 있지만 발현을 위해 다른 유기체로 형질감염될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 이. 콜라이에서 클로닝된 후 동일한 벡터가 비록 그것이 숙주 세포 염색체와 독립적으로 복제할 수 없을지라도 발현을 위해 효모나 포유류 세포로 형질감염된다.
DNA는 또한 숙주 게놈으로의 삽입에 의해 증폭될 수 있다. 이것은 숙주로 바실러스 종을 이용하여, 예를 들어, 벡터에 바실러스 게놈 DNA에서 발견되는 서열에 상보적인 DNA 서열을 포함시킴으로써, 쉽게 달성된다. 이 벡터로의 바실러스의 형질감염은 게놈과의 상동적 재조합과 Bv8 DNA 및(또는) EG-VEGF DNA의 삽입을 일으킨다. 그러나, Bv8 또는 EG-VEGF를 코딩하는 게놈 DNA의 회수는 제한 효소 분해가 Bv8 및(또는) EG-VEGF DNA를 절제하는데 요구되므로 외생적으로 복제된 벡터의 것 보다 더 복잡하다.
발현 및 클로닝 벡터는 선별 마커로도 명명되는, 선별 유전자를 함유하여야 한다. 이 유전자는 선별 배양 배지에서 성장된 형질전환된 숙주 세포의 생존이나 성장에 필요한 단백질을 코딩한다. 선별 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환되지 않은 숙주 세포는 배양 배지에서 생존하지 못할 것이다. 전형적인 선별 유전자, 예를 들어, 바실러스를 위해 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자는 (a) 항생제나 다른 독소, 예를 들어, 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영영요구성 결핍을 보충하거나, (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 결정적 영양분을 공급하는 단백질을 코딩한다.
선별 계획의 일례는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 그들 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하고 따라서 선별 섭생에서 살아남는다. 그러한 우성 선별의 예는 약물 네오마이신, 마이코페놀산 및 하이그로마이신을 사용한다.
포유류 세포를 위한 적당한 선별 마커의 다른 예는 DHFR 또는 티미딘 키나제와 같은, Bv8 또는 EG-VEGF 핵산을 획득하는 세포 성분을 동정할 수 있도록 하는 것들이다. 포유류 세포 형질전환체는 형질전환체만이 마커를 획득한 것에 의해 생존하도록 독특하게 적응되도록 선별 압력 하에 위치된다. 선별 압력은 형질전환체를 배지 중 선별제의 농도가 연속적으로 변화하여, 선별 유전자와 Bv8 및(또는) EG-VEGF를 코딩하는 DNA 둘다의 증폭에 이르게 하는 조건 하에서 형질전환체를 배양함으로써 부과된다. 증폭은 성장에 결정적인 단백질 생산에 대한 더 큰 요구가 있는 유전자가 재조합 세포의 후손 세대의 염색체 내에 반복되게 하는 방법이다. 증가된 양의 Bv8 및(또는) EG-VEGF가 증폭된 DNA로부터 합성된다. 증폭가능 유전자의 다른 예는 메탈로티오네인-Ⅰ 및 -Ⅱ, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 디아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등을 포함한다. 바람직한 벡터 시스템은 미국특허 제5,561,053호에 제공된다.
예를 들어, DHFR 선별 유전자로 형질전환된 세포는 먼저 모든 형질전환체를 DHFR의 경쟁적 길항제인, 메토트렉세이트(Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 배양하여 동정된다. 야생형 DHFR이 사용될 때 적절한 숙주 세포는 문헌 [Urlaub 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216(1980)]에 기재된 바와 같이 제조되고 증식된 DHFR 활성이 결핍된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주이다. 그런 다음 형질전환된 세포는 증가된 수준의 메토트렉세이트에 노출된다. 이것은 여러 카피의 DHFR 유전자와 동시에, Bv8 및(또는) EG-VEGF를 코딩하는 DNA와 같은, 발현 벡터를 구성하는 여러 카피의 다른 DNA의 합성에 이르게 한다. 이 증폭 기술은 예를 들어, Mtx에 고도로 내성인 돌연변이 DHFR 유전자가 사용되면, 내생 DHFR의 존재에도 불구하고, 어느 다르게 적당한 숙주 세포, 예를 들어, ATCC 번호 CCL61 CHO-K1과 함께 사용될 수 있다 (EP 117,060).
다르게는, Bv8 및(또는) EG-VEGF 야생형 DHFR 단백질, 및 아미노글리코사이드 3'-포스포트랜스퍼라제(APH)와 같은 다른 선별 마커를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환되거나 공동-형질전환된 숙주 세포(특히 내생 DHFR을 함유하는 야생형 숙주 세포)가 아미노글리코사이드 항생제, 예를 들어, 카나마이신, 네오마이신 또는 G418과 같은 선별 마커를 위한 선별제를 함유하는 배지에서의 세포 성장에 의해 선별될 수 있다. 예를 들어, 미국특허 제4,965,199호 참조.
효모에서 사용하기 위해 적당한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7 [Stinchcomb 등, 1979, Nature, 282:39]에 존재하는 trpⅠ 유전자이다. trpⅠ 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력을 결여한 효모의 돌연변이주, 예를 들어, ATCC 번호 44076 또는 PEP4-1을 위한 선별 마커를 제공한다. 문헌 [Jones, 1977, Genetics, 85:12] 참조. 그러면 효모 숙주 세포 게놈에서 trpⅠ 기능장애의 존재는 트립토판 부재 하에서의 성장에 의해 형질전환을 검출함으로써 형질전환을 검출하기 위해 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결핍 효모 균주(ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 갖는 공지의 플라스미드에 의해 보충된다.
부가적으로, 1.6 ㎛ 환상 플라스미드 pKD1으로부터 유래된 벡터가 클루이베로마이세스 효모의 형질전환에 사용될 수 있다 [Bianchi 등, 1987, Curr. Genet., 12:185]. 더 최근에, 재조합 송아지 키모신의 대규모 생산을 위한 발현 시스템이 케이. 락티스(K. lactis)에 대해 보고되었다 [Van den Berg, 1990, Bio/Technology, 8:135]. 클루이베로마이세스의 산업적 균주에 의한 성숙 재조합 인간 혈청 알부민의 분비를 위한 안정한 다중-카피 발현 벡터 또한 개시되었다 [Fleer 등, 1991, Bio/Technology, 9:968-975].
발현 및 클로닝 벡터는 보통 숙주 유기체에 의해 인식되고 Bv8 및(또는) EG-VEGF 핵산에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 함유한다. 프로모터는, 그들이 작동가능하게 연결된, Bv8및(또는) EG-VEGF 핵산 서열과 같은, 특정 핵산 서열의 전사와 번역을 제어하는 구조 유전자(일반적으로 약 100 내지 1000 bp 내)의 개시 코돈의 상류(5')에 위치하는 비번역 서열이다. 그러한 프로모터는 전형적으로 두 클래스, 유도성 및 구성적에 속한다. 유도성 프로모터는 배양 조건의 일부 변화, 예를 들어, 영양소의 존재나 부재 또는 온도 변화에 반응하는 그들의 제어 하에, DNA로부터 증가된 수준의 전사를 개시하는 프로모터이다. 이 때 다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 잘 알려져 있다. 이들 프로모터는 제한 효소 분해에 의해 출처 DNA로부터 프로모터를 제거하고 분리된 프로모터 서열을 벡터로 삽입하여 Bv8-코딩 DNA 및(또는) EG-VEGF 코딩 DNA에 작동가능하게 연결된다. 천연 Bv8 프로모터 서열, 천연 EG-VEGF 프로모터 서열, 및 많은 이종 프로모터가 각각 Bv8 DNA 또는 EG-VEGF DNA의 증폭 및(또는) 발현을 지시하는데 사용될 수 있다. 그러나, 이종 프로모터가, 그들이 일반적으로 천연 프로모터에 비해 더 높은 전사와 더 높은 수율의 Bv8 및(또는) EG-VEGF를 허용하므로, 바람직하다.
원핵 숙주와 사용하기에 적당한 프로모터는 β-락타마제와 락토스 프로모터 시스템[Chang 등, 1978, Nature, 275:615; Goeddel 등, Nature, 281:544(1979)], 알칼라인 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템[Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057(1980); EP 36,776], 및 tac 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터를 포함한다. 문헌 [deBoer 등, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25] 참조. 그러나, 다른 공지의 세균 프로모터가 적당하다. 그들의 뉴클레오티드 서열은 공개되어, 당업자가 어느 요구되는 제한 위치를 제공하는 링커나 어댑터를 이용하여 그들을 Bv8 및(또는) EG-VEGF를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 결찰시킬 수 있도록 한다 [Siebenlist 등, Cell, 20:269(1980)]. 세균 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 또한 Bv8 및(또는) EG-VEGF를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결되는 샤인-달가르노(S.D.) 서열을 함유할 것이다.
프로모터 서열이 진핵세포에 대해서 알려져 있다. 거의 모든 진핵세포 유전자가 전사가 개시되는 위치로부터 대략 25 내지 30 염기 상류에 위치된 AT-풍부 부위를 갖는다. 많은 유전자의 전사 개시로부터 70 내지 80 염기 상류에서 발견되는 다른 서열은 X가 어느 뉴클레오티드일 수도 있는 CXCAAT 부위이다. 대부분의 진핵세포 유전자의 3' 말단에 코딩 서열의 3' 말단에 폴리-A 테일의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 있다. 모든 이들 서열은 진핵세포 발현 벡터로 적당하게 삽입된다.
효모 숙주와 사용하기에 적당한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제[Hitzeman 등, 1980, J. Biol. Chem., 255:2073]나 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포-프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제와 같은, 다른 해당 효소[Hess 등, 1968, J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149; Holland, 1978, Biochemistry, 17: 4900]의 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 제어되는 전사의 부가적인 장점을 갖는 유도성 프로모터인, 다른 효모 프로모터는 알콜 데하이드로게나제 2, 이소사이토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제와 말토스와 갈락토스 이용을 담당하는 효소를 위한 프로모터 부위이다. 효모 발현에서 사용하기에 적당한 벡터와 프로모터는 예를 들어, EP 73,657에 추가로 기재되어 있다. 효모 인핸서 또한 효모 프로모터와 함께 우수하게 사용된다.
포유류 숙주 세포에서 벡터로부터의 Bv8 전사 및(또는) EG-VEGF 전사는 예를 들어, 폴리오마 바이러스, 가금 폭스 바이러스(1989년 7월 5일에 공개된 UK 2,211,504), 아데노바이러스(아데노바이러스 5와 같은), 소 파필로마 바이러스, 조류 사르코마 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, 간염-B 바이러스, 가장 바람직하게는 원숭이 바이러스 40(SV40)과 같은 바이러스의 게놈, 이종 포유류 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터, 열-쇼크 프로모터, Bv8 또는 EG-VEGF 서열과 정상적으로 관련된 프로모터로부터 얻어진 프로모터에 의해, 그러한 프로모터가 숙주 세포 체계와 양립가능한 한, 제어된다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터가 SV40 바이러스 복제 기원도 함유하는 SV40 제한 단편으로 편리하게 수득된다 [Fiers 등, 1978, Nature, 273:113; Mulligan 등, 1980, Science, 209:1422-1427; Pavlakis 등, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7398-7402]. 인간 사이토메갈로바이러스의 즉각적 초기 프로모터가 HindⅢ E 제한 단편으로 편리하게 수득된다 [Greenaway 등, 1982, Gene, 18:355-360]. 벡터로서 소 파필로마 바이러스를 사용하는 포유류 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템이 미국특허 제4,419,446호에 개시되어 있다. 이 시스템의 변형이 미국특허 제4,601,978호에 기재되어 있다. 원숭이 세포에서 면역 인터페론을 코딩하는 cDNA를 발현하는 것에 관한 문헌 [Gray 등, 1982, Nature, 295:503-508]; 헤르페스 심플렉스 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 제어 하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA의 발현에 관한 문헌 [Reyes 등, 1982, Nature, 297:598-601]; 배양된 마우스 및 토끼 세포에서 인간 인터페론 β1 유전자의 발현에 대한 문헌 [Canaani 등, Proc. 1982, Natl. Acad Sci. USA, 79:5166-5170]; 및 프로모터로 라우스 사르코마 바이러스 긴 말단 반복을 이용하는 CV-1 원숭이 신장 세포, 닭 배아 섬유아세포, 중국 햄스터 난소 세포, HeLa 세포 및 마우스 NIH-3T3 세포에서 세균 CAT 서열의 발현에 관한 문헌 [German 등, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6777-6781] 참조.
고등 진핵세포에 의한 Bv8 및(또는) EG-VEGF를 코딩하는 DNA의 전사는 자주 벡터로 인핸서 서열을 삽입하여 증가된다. 인핸서는 전사를 증가시키도록 프로모터에 작용하는, 보통 약 10 내지 300 bp의 DNA의 시스-작용성 요소이다. 인핸서는 상대적으로 배향 및 위치 독립적이어서, 전사 단위의 5'[Laimins 등, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:993] 및 3'[Lusky 등, 1983, Mol. Cell Bio., 3:1108], 인트론 내부[Banelji 등, 1983, Cell, 33:729], 및 코딩 서열 자체에서 발견된다 [Osborne 등, 1984, Mol. Cell Bio., 4: 1293]. 이제 많은 인핸서 서열이 포유류 유전자(글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린)로부터 알려져 있다. 전형적으로, 그러나, 진핵생물 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 예는 복제 기원의 후기 측 SV40 인핸서(bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 후기 측 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 진핵생물 프로모터의 활성화를 위한 인핸싱 요소에 관한 문헌 [Yaniv, 1982, Nature, 297:17-18] 참조. 인핸서는 Bv8-코딩 서열 또는 EG-VEGF 코딩 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5' 위치에 위치된다.
진핵생물 숙주 세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 유기체로부터의 핵을 갖는 세포)에서 사용되는 발현 벡터는 또한 전사 종결과 mRNA를 안정화하는데 필요한 서열을 함유할 것이다. 그러한 서열은 진핵생물 또는 바이러스 DNA들 또는 cDNA들의 5' 및 종종 3', 비번역 부위로부터 보편적으로 이용가능하다. 이들 부위는 Bv8 및(또는) EG-VEGF를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화된 단편으로 전사되는 뉴클레오티드 단편을 함유한다.
하나 이상의 위 수록된 성분을 함유하는 적당한 벡터의 제작은 쇄 결찰 기술을 이용한다. 분리된 플라스미드나 DNA 단편은 요구되는 플라스미드를 생성하기 위하여 원하는 형태로 절단, 재단되고 재-결찰된다.
제작된 플라스미드에서 정확한 서열을 확인하기 위한 분석을 위해, 결찰 혼합물이 E. coli K12 균주 294(ATCC 31,446)를 형질전환하는데 사용되고 성공적인 형질전환체가 적당하게 앰피실린 또는 테트라사이클린 내성에 의해 선별된다. 형질전환체로부터 플라스미드가 제조되고, 제한 엔도뉴클라제 분해에 의해 분석되고/거나, 문헌 [Messing 등, 1981, Nucleic Acids Res., 9:309]의 방법이나 문헌 [Maxam 등, 1980, Methods in Enzymology, 65:499]의 방법에 의해 서열결정된다.
Bv8 및(또는) EG-VEGF를 코딩하는 DNA의 포유류 세포에서의 일시적 발현을 제공하는 발현벡터가 Bv8, EG-VEGF 및 그의 변이체의 제조에 특히 유용하다. 일반적으로, 일시적 발현은 숙주 세포가 많은 카피의 발현 벡터를 축적하고, 다음에, 발현 벡터에 의해 코딩되는 높은 수준의 원하는 폴리펩티드를 합성하도록, 숙주 세포에서 효율적으로 복제할 수 있는 발현 벡터의 사용을 포함한다. 상기 문헌 [Sambrook 등, 16.17-16.22면] 참조. 적당한 발현 벡터와 숙주 세포를 포함하는 일시적 발현 시스템은 클로닝된 DNA들에 코딩되는 폴리펩티드의 편리한 양성 동정, 및 원하는 생물학적 또는 생리학적 성질에 대한 그러한 폴리펩티드의 신속한 스크리닝을 허용한다. 따라서, 일시적 발현 시스템은 생물학적으로 활성인 Bv8 및(또는) EG-VEGF의 유사체와 변이체를 동정하기 위한 목적으로 본 발명에서 특히 유용하다.
재조합 척추동물 세포 배양물에서 Bv8, EG-VEGF 또는 그들의 배합물의 합성에 대한 적응에 적당한 다른 방법, 벡터 및 숙주 세포가 문헌 [Gething 등, 1981, Nature, 293:620-625; Mantei 등, 1979, Nature, 281:40-46]; EP 117,060; 및 EP 117,058에 기재되어 있다. Bv8 및(또는) EG-VEGF의 포유류 세포 배양물 발현을 위해 특히 유용한 플라스미드는 pRK5(EP 307,247) 또는 pSVI6B이다. 1991년 6월 13일 공개된 WO 91/08291 참조.
여기에서의 벡터 중 DNA를 클로닝하거나 발현하기 위해 적당한 숙주 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포이다. 이 목적을 위한 적당한 원핵생물은 그램-음성 또는 그램-양성 유기체, 예를 들어, 에스케리키아(Escherichia), 예를 들어, 이. 콜라이, 엔테로박터(Enterobacter), 어위니아(Erwinia), 크렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 및 시겔라(Shigella)와 같은 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 및 비. 서브틸리스(B. subtilis)와 비. 리케니포르미스(B. licheniformis)(예를 들어, 1989년 4월 12일 공개된 DD 266,710에 개시된 비. 리케니포르미스 41P)와 같은 바실러스, 피. 아에루기노사(P. aeruginosa)와 같은 슈도모나스(Pseudomonas), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776(ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 W3110(ATCC 27,325)과 같은 다른 균주가 적당할지라도, 하나의 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294(ATCC 31,446)이다. 이들 예는 제한적이기 보다 예시적이다. 균주 W3110은 그것이 재조합 DNA 산물 발효를 위해 보편적인 숙주 균주이므로 특히 바람직한 숙주 또는 모 숙주이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백분해 효소를 분비해야만 한다. 예를 들어, 균주 W3110은 단백질을 코딩하는 유전자에 유전적 돌연변이를 수행하도록 변형될 수 있으며, 그러한 숙주의 예는 이. 콜라이 W3110 균주 27C7을 포함한다. 27C7의 완전한 유전형은 tonA Δ ptr3 phoA Δ E15 Δ( argF - lac )19 ompT Δ degP41kan r 이다. 균주 27C7은 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 ATCC 번호 55,244로 1991년 10월 30일에 기탁되었다. 다르게는, 1990년 8월 7일에 등록된 미국특허 제4,946,783호에 개시된 돌연변이 세포질주변 프로테아제를 갖는 이. 콜라이의 균주가 사용될 수 있다.
원핵생물에 더하여, 필라멘트상 진균이나 효모와 같은 진핵 미생물이 Bv8-코딩 벡터 및(또는) EG-VEGF 코딩 벡터의 적당한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 또는 보편적 제빵 효모가 하등 진핵생물 숙주 미생물 중 가장 보편적으로 사용된다. 그러나, 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)[Beach 등, 1981, Nature, 290:140]; 1985년 5월 2일 공개된 EP 139,383); 예를 들어, 케이. 락티스(K. lactis)(MW98-8C, CBS683, CBS4574; [Louvencourt 등, 1983, J. Bacteriol., 737]), 케이. 프라길리스(K. fragilis)(ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 케이. 위커라미(K. wickeramii)(ATCC 24,178), 케이. 왈티(K. waltii)(ATCC 56,500), 케이. 트로소필라럼(K. drosophilarum)(ATCC 36,906; 상기 Van den Berg 등), 케이. 써모톨러란스(K. thermotolerans) 및 케이. 막시아누스(K. marxianus)와 같은 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주(미국특허 제4,943,529호; 상기 Fleer 등); 야로이아(yarrowia)(EP 402,226); 피치아 패스토리스(Pichia pastoris)(EP 183,070; [Sreekrishna 등, 1988, J. Basic Microbiol., 28:265-278]); 캔디다(Candida); 트리코더마 레에시아(Trichoderma reesia)(EP 244,234); 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa)[Case 등, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263]; 스와니오마이세스 옥시덴달리스(Schwanniomyces occidentalis)(1990년 10월 31일에 공개된 EP 394,538)와 같은 스와니오마이세스(Schwanniomyces); 및 예를 들어, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium)(1991년 1월 10일 공개된 WO 91/00357)과 같은 필라멘트상 진균 및 에이. 니듈란스(A. nidulans)[Ballance 등, 1983, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289; Tilburn 등, 1983, Gene, 26:205-221; Yelton 등, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474] 및 에이. 나이거(A. niger)[Kelly 등, 1985, EMBO J., 4:475-479]와 같은 아스퍼질러스(Aspergillus) 숙주와 같은, 많은 다른 속, 종과 균주가 보편적으로 이용가능하고 여기에서 유용하다.
글리코실화된 Bv8 및(또는) 글리코실화된 EG-VEGF의 발현에 적당한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 그러한 숙주 세포는 복잡한 가공과 글리코실화 활성을 갖는다. 원칙적으로, 척추동물이나 무척추동물 배양물로부터이든지, 어떠한 고등 진핵생물 세포 배양물이 사용가능하다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 수많은 바큘로바이러스 균주와 변이체와 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(애벌레), 아에데스 아에집티(Aedes aegypti)(모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus)(모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)(초파리) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주로부터의 상응하는 허용가능한 곤충 숙주 세포가 동정되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Luckow 등, Bio/Technology, 6:47-55(l988); Genetic Engineering, Setlow 등, eds., 8권(Plenum Publishing, 1986), 277-279면]에 있는 Miller 등; 및 문헌 [Maeda 등, 1985, Nature, 315:592-594] 참조. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어, 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체와 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 입수가능하며, 그러한 바이러스는 특히, 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해, 본 발명에 따라 여기에서 바이러스로서 사용될 수 있다.
면, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토와 담배의 식물 세포 배양물이 숙주로서 사용될 수 있다. 전형적으로, 식물 세포는 Bv8-코딩 DNA, EG-VEGF 코딩 DNA 또는 그들의 배합물을 함유하도록 이미 조작된 세균 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 어느 균주로의 인큐베이션에 의해 형질감염된다. 식물 세포 배양물의 에이. 튜메파시엔스로의 인큐베이션 동안, Bv8 및(또는) EG-VEGF를 코딩하는 DNA는 그것이 형질감염되고, 적절한 조건 하에서, Bv8-코딩 DNA 및(또는) EG-VEGF 코딩 DNA를 발현하도록 식물 세포 숙주로 전달된다. 부가적으로, 노팔린 신타제 프로모터와 폴리아데닐화 신호 서열과 같은 식물 세포와 양립가능한 조절 및 신호 서열이 이용가능하다 [Depicker 등, 1982, J. Mol. Appl. Gen., 1:561]. 부가적으로, T-DNA 780 유전자의 상류 부위로부터 분리된 DNA 절편은 재조합 DNA-함유 식물 조직에서 식물-발현가능 유전자의 전사 수준을 활성화하거나 증가시킬 수 있다. 1989년 6월 21일에 공개된 EP 321,196.
그러나, 관심은 척추동물 세포에 가장 컸고, 배양(조직 배양)에서 척추동물 세포의 증식이 일상적인 과정이 되었다. 예를 들어, [Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors(1973)] 참조. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 SV40(COS-7, ATCC CRL 1651)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주; 인간 배아 신장 주(293 또는 현탁 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, [Graham 등, J. Gen Virol., 36:59(1977)]; 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, [Urlaub 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216(1980)]); 마우스 세르톨리 세포(TM4, [Mather, Biol. Reprod., 23:243-251(1980)]); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부암 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포(BRL3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방암(MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI 세포[Mather 등, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68(1982)]; MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 헤파토마 주(Hep G2)를 포함한다.
숙주 세포는 형질감염되고 바람직하게는 상기 Bv8 생산 및(또는) EG-VEGF 생산을 위한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭하기 위하여 적당하게 통상적인 영양 배지에서 배양된다.
형질감염은 어느 코딩 서열이 사실상 발현되든지 안되든지 숙주 세포에 의한 발현 벡터의 획득을 말한다. 수많은 형질감염 방법, 예를 들어, CaP04 및 전기천공이 당업자에게 알려져 있다. 이 벡터 작동의 어느 표시가 숙주 세포 내에서 발생할 때 성공적인 형질감염이 일반적으로 인식되다.
형질전환은 DNA가 염색체 외 요소로서 또는 염색체 통합체에 의해 복제가능하도록 DNA를 유기체로 도입하는 것을 의미한다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 그러한 세포에 적절한 표준 기술을 이용하여 행해진다. 상기 Sambrook 등의 1.82란에 설명된 바와 같은, 염화칼슘을 이용하는 칼슘 처리나 전기천공이 실질적인 세포벽 장벽을 함유하는 원핵세포나 다른 세포에 일반적으로 사용된다. 문헌 [Shaw 등, 1983, Gene, 23:315]과 1989년 6월 29일 공개된 WO 89/05859에 기재된 바와 같은, 아그로박테리움 튜메파시엔스로의 감염이 어느 식물 세포의 형질전환을 위해 사용된다. 부가적으로, 식물은 1991년 1월 10일 공개된 WO 91/00358에 기재된 바와 같은 초음파 처리를 이용하여 형질감염될 수 있다.
그러한 세포벽이 없는 포유류 세포를 위해, 문헌 [Graham 등, 1978, Virology, 52:456-457]의 인산칼슘 침전 방법이 바람직하다. 포유류 세포 숙주-시스템 형질전환의 일반적인 측면은 1983년 8월 16일 등록된 미국특허 제4,399,216호에 기재되어 있다. 효모로의 형질전환은 전형적으로 문헌 [Van Solingen 등, 1977, J. Bact.,130:946 및 Hsiao 등, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829]의 방법에 따라 수행된다. 그러나, 핵 미세주사, 전기천공, 완전한 세포와의 세균 원형질 융합, 또는 폴리양이온, 예를 들어, 폴리브렌, 폴리오르니틴 등에 의한 것과 같은, 세포로 DNA를 도입하는 다른 방법도 사용될 수 있다. 포유류 세포를 형질전환하는 다양한 기술에 대해, 문헌 [Keown 등, 1990, Methods in Enzymology, 185: 527-537 및 Mansour 등, 1988, A Mre, 336:348-352] 참조.
Bv8 폴리펩티드, EG-VEGF 폴리펩티드 또는 그들의 배합물을 생산하는데 사용되는 원핵생물 세포는 상기 문헌 [Sambrook 등]에 일반적으로 기재된 바와 같은 적당한 배지에서 배양된다.
본 발명의 Bv8, EG-VEGF 또는 그들의 배합물을 생산하는데 사용되는 포유류 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 햄스(Ham's) F10(시그마), 최소 필수 배지((MEM), 시그마), RPMI-1640(시그마) 및 둘베코즈 변형 이글즈 배지((DMEM), 시그마)와 같은 상업적으로 이용가능한 배지가 숙주 세포를 배양하는데 적당하다. 또한, 문헌 [Ham 등, 1979, Meth. Enz., 58:44, Barnes 등, 1980, Anal. Biochem., 102: 255], 미국특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국재등록특허 제30,985호에 기재된 배지 중 어느 것이 숙주 세포를 위한 배양 배지로 사용될 수 있다. 이들 배지 중 어느 것은 호르몬 및(또는) 다른 성장 인자(예컨대, 인슐린, 트랜스페린, 또는 상피 성장 인자), 염(예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충제(예컨대, HEPES), 뉴클레오사이드(예컨대, 아데닌과 티미딘), 항생제(예컨대, 겐타마이신(GENTAMYCIN)™ 약물), 미량원소(마이크로몰 범위의 최종 농도로 보통 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 및 글루코스나 균등한 에너지원으로 필요한 바대로 보충될 수 있다. 어느 다른 필요한 보충성분도 당업자에게 알려진 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주와 이미 사용된 것들이고, 당업자에게 명백할 것이다.
일반적으로, 포유류 세포 배양의 생산성을 최대화하기 위한 원리, 프로토콜 및 실제적 기술은 문헌 [Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed.(IRL Press, 1991)]에서 발견될 수 있다.
이 개시내용에 언급된 숙주 세포는 숙주 동물 내에 있는 세포뿐 아니라 배양물에 있는 세포를 포함한다.
유전자 증폭 및(또는) 발현은 여기에 제공된 서열에 기초하여, 예를 들어, 통상적인 서던 블롯팅, mRNA의 전사를 정량화하기 위한 노던 블롯팅[Thomas, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205], 도트 블롯팅(DNA 분석), 또는 동일계내 혼성화에 의해, 적절하게 표지된 프로브를 이용하여, 샘플에서 직접 측정될 수 있다. 다양한 표지, 가장 보편적으로 방사성동위원소, 특히 32P가 사용될 수 있다. 그러나, 폴리뉴클레오티드로의 도입을 위해 바이오틴-수식된 뉴클레오티드를 사용하는 것과 같은, 다른 기술도 사용될 수 있다. 바이오틴은 그러면 방사성핵종, 형광제, 효소 등과 같은, 매우 다양한 표지로 표지될 수 있는, 아비딘이나 항체에 결합하기 위한 위치로서 역할한다. 다르게는, DNA 이합체, RNA 이합체 및 DNA-RNA 하이브리드 이합체 또는 DNA-단백질 이합체를 포함하는, 특정 이합체를 인식할 수 있는 항체가 사용될 수 있다. 항체는 다음에 표지될 수 있고 이합체가 표면에 결합하여, 표면 상에서 이합체 형성 시, 이합체에 결합된 항체의 존재가 검출될 수 있는 어세이가 수행될 수 있다.
다르게는, 유전자 발현은 유전자 산물의 발현을 직접적으로 정량하기 위하여, 조직 단편의 면역조직화학적 염색과 세포 배양물 또는 체액의 어세이와 같은, 면역학적 방법에 의해 측정될 수 있다. 면역조직화학 염색 기술과 함께, 세포 샘플이 전형적으로 탈수와 고정화에 이어서, 효소 표지, 형광 표지, 발광 표지 등과 같은 표지가 보통 가시적으로 검출가능한, 커플링된 유전자 산물에 특이적인 표지된 항체와의 반응에 의해 제조된다. 본 발명에서 사용하기에 적당한 특히 민감한 염색 기술은 문헌 [Hsu 등, 1980, Am. J. Clin. Path., 75:734-738]에 의해 설명되어 있다.
면역조직화학적 염색 및(또는) 샘플 유체의 어세이에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있으며, 여기에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
Bv8 및(또는) EG-VEGF는, 비록 그것이 숙주 세포 용균물로부터 회수될 수도 있을지라도, 바람직하게는 분비된 폴리펩티드로서 배양 배지로부터 회수된다. Bv8 또는 EG-VEGF가 막-결합되어 있으면, 그것은 적당한 계면활성제 용액(예를 들어, 트리톤-X 100)을 이용하여 막으로부터 방출될 수 있다.
Bv8, EG-VEGF 또는 그의 배합물이 인간 기원의 것 이외의 재조합 세포에서 생산될 때, Bv8 및(또는) EG-VEGF는 인간 기원의 단백질이나 폴리펩티드가 완전히 결여되어 있다. 그러나, Bv8 및(또는) EG-VEGF에 관하여 실질적으로 균질한 제제를 얻기 위하여 재조합 세포 단백질이나 폴리펩티드로부터 Bv8 및(또는) EG-VEGF를 정제하는 것이 필요하다. 제1 단계로서, 배양 배지 또는 용균물을 원심분리하여 입자성 세포 찌꺼기를 제거한다. 그런 다음 Bv8 및(또는) EG-VEGF는 적당한 정제 과정의 예시인, 아래 과정으로 오염 가용성 단백질과 폴리펩티드로부터 정제될 수 있다: 이온-교환 칼럼 상에서의 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; 면역친화성; 에피토프-태그 결합 수지; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어, 세파덱스 G-75를 이용하는 겔 여과; 및 IgG와 같은 오염물을 제거하는 단백질 A 세파로스 칼럼.
E. Bv8 및 EG - VEGF 의 수식
Bv8, EG-VEGF 및 그의 변이체의 공유적 수식은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 한 유형의 공유적 수식은 Bv8 폴리펩티드 및(또는) EG-VEGF 폴리펩티드의 표적화된 아미노산 잔기를 Bv8 또는 EG-VEGF의 선별된 측쇄나 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시키는 것을 포함한다. 이관능성 시약으로의 유도체화가 예를 들어, 각각 항-Bv8 항체 또는 EG-VEGF 항체를 정제하는 방법에 사용하기 위해, Bv8 또는 EG-VEGF를 수-불용성 지지체 매트릭스나 표면에 가교결합하는데, 또는 그 반대에 유용하다. 보편적으로 사용되는 가교결합제는 예를 들어, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-하이드록시석신이미드 에스테르, 예를 들어, 4-아지도살리실산과의 에스테르, 3,3'-디티오비스(석신이미딜프로피오네이트와 같은 디석신이미딜 에스테르를 포함하는, 호모이관능성 이미도에스테르, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이관능성 말레이미드, 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 시약을 포함한다.
다른 수식은 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파틸 잔기에 대한 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 하이드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화[T.E. Creighton, 1983, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 79-86면], N-말단 아민의 아세틸화 및 어느 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.
본 발명의 범위 내에 포함되는 Bv8 폴리펩티드 및(또는) EG-VEGF 폴리펩티드의 다른 유형의 공유적 수식은 폴리펩티드의 천연 글리코실화 양상을 변화시키는 것을 포함한다. "천연 글리코실화 양상을 변화시키는 것"은 여기에서 천연 서열 Bv8에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 부위를 제거하고/거나(내재하는 글리코실화 위치를 제거하거나 화학적 및(또는) 효소적 수단에 의해 글리코실화를 제거하여) 천연 서열 Bv8 또는 EG-VEGF 천연 서열에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 위치를 첨가하는 것을 의미하는 목적을 위해 의도된다. 또한, 어구는 존재하는 다양한 탄수화물 부위의 성질이나 비율에서의 변화를 포함하는, 천연 단백질의 글리코실화에서의 질적 변화를 포함한다.
Bv8 폴리펩티드나 EG-VEGF 폴리펩티드로의 글리코실화 위치의 부가는 아미노산 서열을 변화시킴으로써 달성될 수 있다. 변화는 예를 들어 천연 서열 Bv8 또는 천연 서열 EG-VEGF로의 하나 이상의 세린이나 트레오닌 잔기의 첨가나 그에 의한 치환에 의해 행해질 수 있다 (O-연결된 글리코실화 위치를 위해). Bv8 아미노산 서열 또는 EG-VEGF 아미노산 서열은 임의로, 특히 원하는 아미노산으로 번역될 코돈이 생성되도록 Bv8 폴리펩티드 또는 EG-VEGF 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 미리 선별된 염기에서 돌연변이시킴으로써, DNA 수준에서의 변화를 통해 변화될 수 있다.
Bv8 폴리펩티드나 EG-VEGF 폴리펩티드 상의 탄수화물 부위의 수를 증가시키는 다른 수단은 폴리펩티드에 대한 글리코사이드의 화학적 또는 효소적 커플링에 의한다. 그러한 방법은 예를 들어, 1987년 9월 11일 공개된 WO 87/05330과, 문헌 [Aplin 및 Writson, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., 259-306면]에서, 당업계에 기재되어 있다.
Bv8 폴리펩티드나 EG-VEGF 폴리펩티드 상에 존재하는 탄수화물 부위의 제거는 화학적 또는 효소적으로 또는 글리코실화의 표적이 되는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이 치환에 의해 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, 문헌 [Hakimuddin 등, 1987, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 및 Edge 등, 1981, Anal. Biochem., 118:131]에 의해 기재되어 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 부위의 효소적 절단은 문헌 [Thotakura 등, 1987, Meth. Enzymol., 138:350]에 의해 기재된 바와 같은 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제의 사용에 의해 달성될 수 있다.
Bv8 또는 EG-VEGF의 다른 유형의 공유적 수식은 각각 Bv8 폴리펩티드나 EG-VEGF 폴리펩티드를 다양한 비단백질성 폴리머, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리프로필렌글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나에, 예를 들어, 미국특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 4,791,192호; 또는 제4,179,337호에 기재된 방식으로 연결하는 것을 포함한다.
본 발명의 Bv8 및 EG-VEGF는 또한 다른, 이종 폴리펩티드나 아미노산 서열에 융합된 Bv8 또는 EG-VEGF를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 수식될 수 있다.
일 구체예에서, 그러한 키메라 분자는 항-태그 항체가 선별적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 Bv8 또는 EG-VEGF의 융합을 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 Bv8 또는 EG-VEGF의 아미노- 또는 카르복실-말단에 위치한다. Bv8 및(또는) EG-VEGF의 그러한 에피토프-태그된 형태의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 이용하여 검출될 수 있다. 또한, 에피토프 태그의 제공은 Bv8 및(또는) EG-VEGF가 항-태그 항체나 에피토프 태그에 결합하는 다른 유형의 친화성 매트릭스를 이용하는 친화성 정제에 의해 용이하게 정제될 수 있도록 한다. 다양한 태그 폴리펩티드와 그들 각각의 항체는 당업계에 잘 알려져 있다. 예는 폴리-히스티딘(폴리-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신(폴리-his-gly) 태그; 플루 HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5[Field 등, 1988, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165]; c-myc 태그 및 그에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체[Evan 등, 1985, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616]; 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D(gD) 태그 및 그의 항체[Paborsky 등, 1990, Protein Engineering, 3(6):547-553]를 포함한다. 다른 태그 폴리펩티드는 플래그-펩티드[Hopp 등, 1988, BioTechnology, 6:1204-1210]; KT3 에피토프 펩티드[Martin 등, 1992, Science, 255: 192-194]; α-튜뷸린 에피토프 펩티드[Skinner 등, 1991, J. Biol. Chem., 266:15163-15166]; 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그[Lutz-Freyermuth 등, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397]를 포함한다.
대체 구체예에서, 키메라 분자는 Bv8 및(또는) EG-VEGF의 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정 부위와의 융합을 포함할 수 있다. 이가 형태의 키메라 분자("면역부착소"로도 언급되는)에 대해, 그러한 융합은 IgG 분자의 Fc 부위에 대한 것일 수 있다.
가장 간단하고 가장 직접적인 면역부착소 설계는 "부착소" 단백질의 결합 부위(들)를 면역글로불린 중쇄의 경첩 및 Fc 부위와 결합하는 것이다. 통상적으로, 본 발명에서 사용하기 위한 Bv8-면역글로불린 키메라나 EG-VEGF-면역글로불린 키메라를 제조할 때, Bv8 및(또는) EG-VEGF를 코딩하는 핵산은 면역글로불린 불변영역 서열의 N-말단을 코딩하는 핵산에 C-말단으로 융합되지만, N-말단 융합도 가능하다.
전형적으로, 그러한 융합에서 코딩되는 키메라 폴리펩티드는 면역글로불린 중쇄의 적어도 기능적으로 활성인 경첩 및 CH2 및 CH3 영역을 보유할 것이다. 융합은 또한 불변영역의 Fc 부분의 C-말단, 또는 중쇄의 CH1 또는 경쇄의 상응하는 부위의 바로 N-말단에 대해 만들어진다.
융합이 만들어지는 정확한 위치는 결정적이지 않다; 특정 위치가 잘 알려져 있고 Bv8 및(또는) EG-VEGF 면역글로불린 키메라의 생물학적 활성을 최적화하기 위하여 선별될 수 있다.
일부 구체예에서, Bv8-면역글로불린 키메라 및(또는) EG-VEGF 면역글로불린 키메라는 모노머, 또는 헤테로- 또는 호모-멀티머, 특히 필수적으로 WO 91/08298에 예시된 바와 같은 다이머나 테트라머로 조립된다.
바람직한 구체예에서, Bv8 및(또는) EG-VEGF 서열은 면역글로불린, 예를 들어 면역글로불린 G1(IgG1)의 효과기 기능을 갖는, 항체의 C-말단 부분의 N-말단(특히 Fc 영역)에 융합된다. 전체 중쇄 불변영역을 Bv8 및(또는) EG-VEGF 서열에 융합하는 것이 가능하다. 그러나, 더 바람직하게는, 파파인 절단 위치의 바로 상류에 있는 경첩부에서 시작하는 서열(화학적으로 IgG Fc 부위를 결정하는; 중쇄 불변영역의 첫번째 잔기를 114로 하여, 잔기 216, 또는 다른 면역글로불린의 유사 위치)이 융합에 사용된다. 특히 바람직한 구체예에서, Bv8 아미노산 서열 및(또는) EG-VEGF 아미노산 서열은 IgG1, IgG2 또는 IgG3 중쇄의 경첩부와 CH2 및 CH3, 또는 CH1, 경첩, CH2 및 CH3 영역에 융합된다. 융합이 만들어지는 정확한 위치는 결정적이지 않고, 최적의 위치가 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있다.
일부 구체예에서, Bv8 및(또는) EG-VEGF 면역글로불린 키메라는 멀티머, 특히 호모-다이머 또는 테트라머로 조립된다. 일반적으로, 이들 조립된 면역글로불린은 공지의 단위 구조를 갖는다. 기본적인 네 쇄 구조 단위는 IgG, IgD 및 IgE가 존재하는 형태이다. 네-단위는 고분자량 면역글로불린에서 반복된다; IgM은 일반적으로 디설파이드 결합에 의해 함께 유지되는 기본 네-단위의 펜타머로 존재한다. IgA 글로빈 및 종종 IgG 글로빈은 혈청에서 멀티머 형태로 존재할 수도 있다. 멀티머의 경우, 각각의 네-단위는 동일하거나 상이할 수 있다.
다르게는, Bv8 서열 또는 EG-VEGF 서열은 키메라 중쇄를 포함하는 면역글로불린이 얻어지도록, 면역글로불린 중쇄와 경쇄 서열 사이에 삽입된다. 이 구체예에서, Bv8 서열이나 EG-VEGF 서열은 면역글로불린의 각 암에 있는 면역글로불린 중쇄의 3' 말단에, 경첩과 CH2 영역 사이나, CH2와 CH3 영역 사이에서 융합된다. 유사한 제작물이 문헌 [Hoogenboom 등, Mol. Immunol., 28:1027-1037(1991)]에 의해 보고되어 있다.
면역글로불린 경쇄의 존재가 본 발명의 면역부착소에 요구되지는 않을지라도, 면역글로불린 경쇄는 Bv8 또는 EG-VEGF 면역글로불린 중쇄 융합 폴리펩티드에 공유적으로 연결되거나, Bv8 또는 EG-VEGF에 직접 융합되어 존재할 수 있다. 전자의 경우, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA는 전형적으로 Bv8 또는 EG-VEGF 면역글로불린 중쇄 융합 단백질을 코딩하는 DNA와 공동발현된다. 분비 시, 하이브리드 중쇄와 경쇄는 공유적으로 결합되어 두 디설파이드-결합된 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하는 면역글로불린-유사 구조를 제공할 것이다. 그러한 구조의 적당한 제조방법은 예를 들어, 1989년 3월 28일 등록된 미국특허 제4,816,567호에 개시되어 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 면역부착소의 제작에 사용되는 면역글로불린 서열은 IgG 면역글로불린 중쇄 불변영역으로부터의 것이다. 인간 면역부착소에 대해, 인간 IgG1 및 IgG3 면역글로불린 서열의 사용이 바람직하다. IgG1을 이용하는 주요 장점은 IgG1 면역부착소가 고정화 단백질 A 상에서 효율적으로 정제될 수 있다는 것이다. 반대로, IgG3의 정제는 상당히 덜 통용되는 매질인 단백질 G를 요구한다. 그러나, 특정 면역부착소 제작을 위한 Ig 융합 상대를 선택할 때 면역글로불린의 다른 구조적 및 기능적 성질이 고려되어야 한다. 예를 들어, IgG3 경첩은 더 길고 더 유연하여, IgG1에 융합될 때 적당하게 접히거나 기능하지 못할 수 있는 더 큰 부착소 영역을 수용할 수 있다. 다른 고려사항은 결합가이다; IgA와 IgM과 같은 Ig 서브타입이 각각 기본 IgG 호모다이머 단위의 다이머 또는 펜타머 구조를 생성시킬 수 있는 반면, IgG 면역부착소는 이가의 호모다이머이다. 생체 내 적용을 위해 설계된 Bv8 및(또는) EG-VEGF 면역부착소에 대해, 약동력학 성질과 Fc 부위에 의해 정해지는 효과기 기능이 또한 중요하다. IgG1, IgG2 및 IgG4가 모두 21일의 생체 내 반감기를 갖지만, 보체 체계를 활성화하는데 있어서 그들의 상대적 강도는 상이하다. IgG4는 보체를 활성화하지 못하고, IgG2는 IgG1 보다 보체 활성화에서 유의하게 더 약하다. 더욱이, IgG1과 달리, IgG2는 단핵 세포나 호중구 상의 Fc 수용체에 결합하지 못한다. IgG3가 보체 활성화를 위해 최적인 반면, 그의 생체 내 반감기는 대략 다른 IgG 이소타입의 1/3이다. 인간 치료제로서 사용되도록 설계되는 면역부착소를 위한 다른 중요한 고려사항은 특정 이소타입의 알로타입 변이체의 수이다. 일반적으로, 더 적은 혈청학적-정의된 알로타입을 갖는 IgG 이소타입이 바람직하다. 예를 들어, IgG1은, 두개(G1m1과 2)가 Fc 부위에 위치하는, 단지 네개의 혈청학적-정의된 알로타입 위치를 갖고; 이들 위치 중 하나 G1m1은 비-면역원성이다. 반대로, IgG3에는, 모두 Fc 부위에 있는, 12개의 혈청학적-정의된 알로타입이 있다; 이들 위치의 단지 세개(G3m5, 11 및 21)만이 비면역원성인 하나의 알로타입을 갖는다. 따라서, γ3 면역부착소의 잠재적인 면역원성은 γ1 면역부착소의 것 보다 크다.
모 면역글로불린에 관하여, 유용한 결합점은 두 중쇄 간에 디설파이드 결합을 형성하는 경첩의 시스테인의 바로 상류이다. 빈번하게 사용되는 설계에서, 분자의 Bv8 또는 EG-VEGF 부분의 C-말단 잔기의 코돈은 IgG1 경첩부의 서열 DKTHTCPPCP의 코돈의 상류에 직접 위치된다.
면역부착소의 제작과 발현에 적당한 일반적 방법은 Bv8 및 EG-VEGF에 관하여 여기에서 위에 개시된 것들과 동일하다. Bv8 면역부착소와 EG-VEGF 면역부착소는 각각 Bv8 부분이나 EG-VEGF 부분을 코딩하는 cDNA 서열을 Ig cDNA 서열에 프레임에 맞게 융합함으로써 가장 편리하게 제작된다. 그러나, 게놈 Ig 단편에 대한 융합도 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gascoigne 등, 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84:2936-2940; Aruffo 등, 1990, Cell, 61:1303-1313; Stamenkovic 등, 1991, Cell, 66:1133-1144] 참조). 후자 유형의 융합은 발현을 위해 Ig 조절 서열의 존재를 요구한다. IgG 중쇄 불변영역을 코딩하는 cDNA들이 혼성화나 중합효소 연쇄반응(PCR) 기술에 의해, 지라나 말초혈액 림프구로부터 유래된 cDNA 라이브러리로부터 공개된 서열에 기초하여 분리될 수 있다. 면역부착소의 Bv8 또는 EG-VEGF를 코딩하는 cDNA와 Ig 부분은 선택된 숙주 세포에서 효율적인 발현을 지시하는 플라스미드 벡터로 탠덤으로 삽입된다. 포유류 세포에서의 발현을 위해, pRK5-기초 벡터[Schall 등, 1990, Cell, 61:361-370]와 CDM8-기초 벡터[Seed, 1989, Nature, 329:840]가 사용될 수 있다. 정확한 연결은 올리고뉴클레오티드-지시 결실 돌연변이유발[Zoller 등, 1982, Nucleic Acids Res., 10:6487; Capon 등, 1989, Nature, 337:525-531]을 이용하여 설계된 연결 코돈 사이의 초과 서열을 제거하여 창출될 수 있다. 각 절반이 원하는 연결의 어느 한 쪽에 있는 서열에 상보적인, 합성 올리고뉴클레오티드가 사용될 수 있다: 이상적으로, 이들은 36 내지 48-머이다. 다르게는, PCR 기술이 적절한 벡터로 프레임에 맞게 분자의 두 부분을 연결하는데 사용될 수 있다.
Bv8 또는 EG-VEGF 면역부착소의 발현을 위한 숙주 세포주의 선택은 주로 발현 벡터에 의존한다. 다른 고려사항은 요구되는 단백질의 양이다. 밀리그램 양은 자주 일시적 형질감염에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 EIA-형질전환된 293 인간 배아 신장 세포주가 인산칼슘 방법을 변형시켜 pRK5-기초 벡터로 일시적으로 형질감염되어 효율적인 면역부착소 발현을 허용할 수 있다. CDM8-기초 벡터가 DEAE-덱스트란 방법에 의해 COS 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있다 [Aruffo 등, 1990, Cell, 61:1303-1313; Zettmeissl 등, 1990, DNA Cell Biol. US, 9:347-353]. 더 많은 양의 단백질을 원하면, 면역부착소는 숙주 세포주의 안정한 형질감염 후 발현될 수 있다. 예를 들어, pRK5-기초 벡터가 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)를 코딩하고 G418에 대한 내성을 부여하는 부가적인 플라스미드의 존재 하에 중국 햄스터 난소(CHO) 세포로 도입될 수 있다. G418에 내성인 클론은 배양물 중 선별될 수 있다; 이들 클론은 증가하는 농도의 DHFR 저해제 메토트렉세이트 존재 하에서 성장된다; DHFR 및 면역부착소 서열을 코딩하는 유전자 카피의 수가 공동-증폭된 클론이 선별된다. 면역부착소가 그의 N-말단에 소수성 리더 서열을 함유하면, 그것은 형질감염된 세포에 의해 가공되고 분비되기 쉽다. 보다 복잡한 구조를 갖는 면역부착소의 발현은 독특하게 적합화된 숙주 세포를 요구할 수 있다; 예를 들어, 경쇄나 J 쇄와 같은 성분은 어느 골수종 또는 하이브리도마 세포 숙주에 의해 제공될 수 있다 [상기 Gascoigne 등, 1987, Martin 등, 1993, J. Virol., 67:3561-3568].
면역부착소는 친화성 크로마토그래피에 의해 편리하게 정제될 수 있다. 친화성 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 키메라에 사용되는 면역글로불린 Fc 영역의 종과 이소타입에 의존한다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄에 기초한 면역부착소를 정제하는데 사용될 수 있다 [Lindmark 등, J. Immunol. Meth., 62:1-13(1983)]. 단백질 G가 모든 마우스 이소타입과 인간 γ3를 위해 추천된다 [Guss 등, 1986, EMBO. J., 5:1567-1575]. 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 자주 아가로스이지만, 다른 매트릭스가 이용가능하다. 제어된 공극을 갖는 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로스로 얻을 수 있는 것 보다 더 빠른 유속과 더 짧은 가공시간을 허용한다. 단백질 A 또는 G 친화성 칼럼에 면역부착소를 결합시키는 조건은 Fc 영역의 특성; 즉, 그의 종과 이소타입에 의해 완전히 결정된다. 일반적으로, 적당한 리간드가 선택될 때, 효율적인 결합이 미조정된 배양액으로부터 직접 일어난다. 면역부착소의 하나의 구별되는 특징은 인간 γ1 분자에 대해, 단백질 A에 대한 결합 능력이 동일한 Fc 유형의 항체에 대해 상대적으로 약간 감소된다는 것이다. 결합된 면역부착소는 산성 pH(3.0 이상), 또는 중간 무질서유발 염을 함유하는 중성 pH 완충액에서 효율적으로 용출될 수 있다. 이 친화성 크로마토그래피 단계는 >95% 순수한 면역부착소 제제를 만들 수 있다.
당업계에 알려진 다른 방법이 면역부착소를 정제하기 위하여 단백질 A 또는 G 상의 친화성 크로마토그래피 대신 또는 그에 부가하여 사용될 수 있다. 면역부착소는 친황성(thiophilic) 겔 크로마토그래피[Hutchens 등, 1986, Anal. Biochem., 159:217-226]와 고정화 금속 킬레이트 크로마토그래피[Al-Mashikhi 등, 1988, J. Dairy Sci., 71:1756-1763]에서 항체와 유사하게 행동한다. 그러나, 항체와 반대로, 이온 교환 칼럼 상의 그들의 행동은 그들의 등전점뿐 아니라, 그들의 키메라성으로 인해 분자에 존재할 수 있는 전하 양극성(dipole)에 의해서 결정된다.
원하는 경우, 면역부착소는 이중특이성으로 만들어질 수 있다. 따라서, 본 발명의 면역부착소는 Bv8 또는 EG-VEGF 영역과 VEGF, Bv8 및 EG-VEGF 영역을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다른 성장 인자로부터의 영역과 같은 영역을 결합시킬 수 있다. 이중특이성 분자를 위해, 그들의 항체-유사 구조의 한 암에 키메라 항체 중쇄와 나머지 암에 키메라 항체 중쇄-경쇄 쌍으로 이루어진 트라이머 분자가, 정제의 용이성으로 인해, 우수하다. 10개의 테트라머의 혼합물을 생산하는, 이중특이성 면역부착소의 생산에 전통적으로 사용되는 항체-생산 쿼드로마(quadroma)와 반대로, 트라이머 면역부착소 구조의 세 쇄를 코딩하는 핵산으로 형질감염된 세포는 단지 세 분자만의 혼합물을 생산하고, 이 혼합물로부터 원하는 산물의 정제는 상응하게 용이하다.
F. Bv8 활성 및 EG - VEGF 활성의 조절제
본 발명은 또한 Bv8 및(또는) EG-VEGF의 하나 이상의 생물학적 활성을 모사하거나 증진하는 것들(작용제) 또는 Bv8 및(또는) EG-VEGF의 효과를 방지하는 것들(길항제)을 동정하기 위한 화합물의 스크리닝 방법을 포함한다. Bv8과 EG-VEGF 작용제와 길항제는 각각 Bv8 및 EG-VEGF 조절제라고도 한다. 길항제 약물 후보에 대한 스크리닝 어세이가 Bv8 폴리펩티드 및(또는) EG-VEGF 폴리펩티드와 결합하거나 복합체를 이루거나, 다르게는 Bv8 및(또는) EG-VEGF의 다른 세포 단백질과의 상호작용을 방해하는 화합물을 동정하기 위하여 설계된다.
1. 소분자 스크리닝
소분자는 Bv8 작용제 또는 길항제 및(또는) EG-VEGF 작용제 또는 길항제로 작용하고 따라서 치료적으로 유용한 능력을 가질 수 있다. 그러한 소분자는 자연 발생 소분자, 합성, 유기 또는 무기 화합물과 펩티드를 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명에서 소분자는 이들 형태로 제한되지 않는다. 소분자의 광범위한 라이브러리가 상업적으로 이용가능하고 이들 분자를 원하는 활성에 대해 스크리닝하는 매우 다양한 어세이가 당업계에 잘 알려져 있다.
후보 Bv8 작용제 또는 길항제 및(또는) EG-VEGF 작용제 또는 길항제 소분자는 바람직하게는 Bv8 및(또는) EG-VEGF 활성의 잠재적인 조절제의 신속한 동정을 허용하는 어세이에서 먼저 동정된다. 그러한 어세이의 예는 Bv8 또는 EG-VEGF 수용체에 결합하는 후보 분자의 능력이 측정되는 단백질-단백질 결합 어세이이다. 다른 예에서, Bv8 수용체에 대한 Bv8 결합이나 EG-VEGF 수용체에 대한 EG-VEGF 결합을 방해하는 후보 분자의 능력이 측정된다. 일 구체예에서, 각각의 Bv8 수용체나 EG-VEGF 수용체는 Bv8/EG-VEGF 수용체-1 및(또는) Bv8/EG-VEGF 수용체-2이다.
바람직한 구체예에서, 소분자 Bv8 작용제와 EG-VEGF는 각각 Bv8이나 EG-VEGF의 생물학적 활성 중 하나 이상을 모사하는 그들의 능력에 의해 동정된다. 예를 들어, 후보 화합물은 아래 기재된 바와 같이, 내피 세포의 증식을 유도하거나, 내피 세포 생존을 촉진하거나, 혈관신생을 유도하는 그들의 능력에 대해 스크리닝된다. Bv8 또는 EG-VEGF의 원하는 생물학적 활성 중 하나 이상을 유도하는 후보 화합물은 작용제로 동정된다.
다른 구체예에서, 소분자 Bv8 길항제 및(또는) EG-VEGF 길항제는 각각 Bv8 및(또는) EG-VEGF의 생물학적 활성 중 하나 이상을 저해하는 그들의 능력에 의해 동정된다. 예를 들어, 후보 화합물은 아래 기재된 바와 같이, 내피 세포의 증식, 내피 세포 생존, 또는 혈관신생을 저해하는 그들의 능력에 대해 스크리닝된다. Bv8 또는 EG-VEGF의 원하는 생물학적 활성 중 하나 이상을 저해하는 후보 화합물은 길항제로 동정된다.
혈관신생을 유도하거나 저해하는 후보 화합물의 능력은 예를 들어, WO 02/00711 및 WO 03/020892에 기재된 바와 같은 마우스 시험에서 결정된다.
내피 세포 증식은 예를 들어, WO 02/00711 및 WO 03/020892에 기재된 바와 같이, 결정된다. 간략하게, 내피 세포는 후보 작용제 화합물 또는 후보 길항제 화합물과 접촉된 Bv8 및(또는) EG-VEGF를 함유하는 10% 우혈청 알부민으로 보충된 저 글루코스 DMEM에서 성장된다. 내피 세포는 6 또는 12 웰 디쉬에서 4000 내지 6000 세포/㎖의 밀도로 플레이팅된다. 어세이 5 내지 7일에, 내피 세포는 트립신처리되고 세포 수가 코울터 계수기를 이용하여 정량된다.
내피 세포 성장은 예를 들어, WO 02/00711 및 WO 03/020892에 기재된 바와 같이 결정된다. 간략하게, 대략 2×105 소 뇌 모세혈관 세포가 10% 우혈청 알부민으로 보충된 저 글루코스 DMEM에 플레이팅되고 24 시간 인큐베이션된다. 그런 다음 배지는 교반되고 후보 작용제 화합물 또는 후보 길항제 화합물과 접촉된 Bv8 및(또는) EG-VEGF를 함유하는 배지로 교체된다. 세포는 48 시간 인큐베이션되고, 트립신처리되며, 70% 에탄올에서 고정된다. 고정된 세포는 프로피디움 요오드와 RNase로 염색되고 세포의 서브-G1 프로파일이 FACs 분석에 의해 결정된다.
Bv8 및(또는) EG-VEGF 작용제나 길항제로 동정된 화합물은 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, Bv8 및(또는) EG-VEGF 길항제는 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
2. 항체의 제조 및 동정
Bv8 및(또는) EG-VEGF의 생물학적 성질을 모사한, 작용제 인간 및 비인간 폴리클로날 및 모노클로날 항체(비인간 모노클로날 항체의 인간화된 형태 포함)와 Bv8 및(또는) EG-VEGF의 생물학적 활성을 저해하는 길항제 인간 및 비인간 폴리클로날 및 모노클로날 항체(비인간 모노클로날 항체의 인간화된 형태 포함)가 또한 본 발명에서 착상된다. 이들은 항체의 아미노산 서열 변이체, 글리코실화 변이체 및 단편을 포함한다. 그러한 항체의 제조와 작용제 항체의 선별을 위한 일반적 기술은 당업계에 알려져 있고 아래에 간략하게 기재된다.
(ⅰ) 폴리클로날 항체
폴리클로날 항체의 제조방법은 당업계에 알려져 있다. 폴리클로날 항체는 포유류에서 예를 들어, 면역화제와 원하는 경우, 애쥬번트의 하나 이상의 주사에 의해 유발될 수 있다. 전형적으로, 면역화제 및(또는) 애쥬번트는 포유류에 여러 피하 또는 복강내 주사에 의해 주사될 것이다. 면역화제를 혈청 알부민, 또는 대두 트립신 저해제와 같은, 면역화되는 포유류에서 면역원적인 것으로 알려져 있는 단백질에 포접하는 것이 유용할 수 있다. 사용될 수 있는 애쥬번트의 예는 프로인트 완전 애쥬번트와 MPL-TDM을 포함한다.
(ⅱ) 모노클로날 항체
모노클로날 항체는 문헌 [Kohler 등, 1975, Nature, 256:495]에 의해 최초로 기재된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조되거나, 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다 (미국특허 제4,816,567호).
하이브리도마 방법에서, 마우스나 햄스터나 마카크 원숭이와 같은 다른 적절한 숙주 동물은 면역화를 위해 사용되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유발하기 위하여 여기에서 위에 기재된 바와 같이 면역화된다. 다르게는, 림프구는 시험관 내에서 면역화될 수 있다. 그런 다음 림프구는 폴리에틸렌글리콜과 같은 적절한 융합제를 이용하여 골수종 세포와 융합되어, 하이브리도마 세포를 형성한다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103면(Academic Press, 1986)].
그렇게 제조된 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은, 모 골수종 세포의 성장이나 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적당한 배양 배지에 접종되고 성장된다. 예를 들어, 모 골수종 세포가 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)를 결여하면, 하이브리도마의 배양 배지는 전형적으로 HGPRT-결핍 세포의 성장이 방지되는 조건인, 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT 배지)을 포함할 것이다.
바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선별된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 고-수준 생산을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 것들이다. 이들 중, 바람직한 골수종 세포주는 USA 캘리포니아, 샌디에고, 샐크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center)로부터 입수가능한 MOP-21 및 M.C.-11 마우스 종양으로부터 유래된 것들, 및 USA 메릴랜드, 록크빌, 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포와 같은, 쥐 골수종 주이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주 또한 인간 모노클로날 항체의 생산을 위해 기재되어 있다 [Kozbor, 1984, J. Immunol., 133:3001; Brodeur 등, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63면, Marcel Dekker, Inc., New York(1987)].
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 항원에 대한 모노클로날 항체의 생산에 대해 어세이된다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전이나 방사성면역어세이(RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 어세이(ELISA)와 같은 시험관 내 결합 어세이에 의해 결정된다.
모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어, 문헌 [Munson 등, 1980, Anal. Biochem., 107:220]의 스캣챠드 분석에 의해 결정될 수 있다.
원하는 특이성, 친화도 및(또는) 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 동정된 후, 세포는 희석 과정을 제한함으로써 서브클로닝되고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103면(Academic Press, 1986)]. 이 목적을 위해 적당한 배양 배지는 예를 들어, DMEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로 생체 내에서 성장될 수 있다.
서브클론에 의해 분비되는 모노클로날 항체는 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제과정에 의해 배양 배지, 복수 액, 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 쉽게 분리되고 통상적인 과정을 이용하여 서열결정된다 (예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여). 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 출처로 역할한다. 일단 분리되면, DNA는 발현 벡터로 위치되어, 그런 다음 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포로 형질감염되어, 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 얻는다. DNA는 또한 예를 들어, 상동적 쥐 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변영역의 코딩 서열을 치환하거나[Morrison, 등, 1984, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 81:6851], 면역글로불린 코딩 서열에 비-면역글로불린 폴리펩티드의 코딩 서열의 전체 또는 일부를 공유적으로 결합시킴으로써, 수식될 수 있다. 그 방식으로, 여기에 기재된 Bv8 또는 EG-VEGF 작용제 모노클로날 항체 또는 Bv8 또는 EG-VEGF 길항제 모노클로날 항체"의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체가 제조된다.
키메라 또는 하이브리드 항체는 또한 가교결합제를 포함하는 것들을 포함하는, 합성 단백질 화학에서 알려진 방법을 이용하여 시험관 내에서 제조될 수 있다. 예를 들어, 면역독소는 디설파이드 교환 반응을 이용하거나 티오에테르 결합을 형성함으로써 제작될 수 있다. 이 목적을 위해 적당한 시약의 예는 이미노티올레이트와 메틸-4-머캅토부티르이미데이트를 포함한다.
항체의 재조합적 생산은 아래에서 더 상세히 설명될 것이다.
(ⅲ) 인간화된 항체
일반적으로, 인간화된 항체는 비인간 출처로부터 그로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 자주 전형적으로 "이입(import)" 가변영역으로부터 취해지는, "이입" 잔기로 언급된다. 인간화는 윈터 (Winter)와 공동작업자의 방법에 따라 설치류 CDR들이나 CDR 서열을 인간 항체의 상응하는 서열 대신 치환함으로써, 필수적으로 수행될 수 있다 [Jones 등, 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann 등, 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen 등, 1988, Science, 239: 1534-1536].
따라서, 그러한 "인간화된" 항체는 실질적으로 완전한 인간 가변영역 미만이 비인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된, 키메라 항체(상기, Cabilly)이다. 실제로, 인간화된 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기와 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 위치로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다.
항체가 항원에 대한 친화도와 다른 바람직한 생물학적 성질을 보유하면서 인간화되는 것이 중요하다. 이 목적을 달성하기 위하여, 바람직한 방법에 따르면, 인간화된 항체는 모 서열과 인간화된 서열의 삼차원 모델을 이용하여 모 서열과 다양한 개념적인 인간화 산물의 분석 과정에 의해 제조된다. 삼차원 면역글로불린 모델은 상업적으로 이용가능하고 당업자에게 익숙하다. 선별된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 삼차원 형태 구조를 보여주고 배치하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 배치의 조사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 개연성있는 역할의 분석, 즉 후보 면역글로불린의 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이 방법으로, FR 잔기는 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도와 같은, 원하는 항체 특성이 얻어지도록 공통 및 이입 서열로부터 선별되고 결합될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다. 더 상세한 것에 대해서는 미국특허 제5,821,337호와 제6,054,297호를 참조한다.
(ⅳ) 인간 항체
인간 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주가 예를 들어, 문헌 [Kozbor, 1984, J. Immunol. 133, 3001 및 Brodeur 등, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63면(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]에 기재되어 있다.
이제 면역화 시, 내생적 면역글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 레파토리를 생산할 수 있는 형질전환 동물(예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 배아계 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 결합 부위(JH)의 동형접합적 결실이 내생적 항체 생산의 완전한 저해를 일으키는 것이 기재되어 있다. 그러한 배아계 돌연변이 마우스에서 인간 배아계 면역글로불린 유전자 어레이의 전이는 항원 공격 시 인간 항체의 생산을 일으킬 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits 등, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255; Jakobovits 등, 1993, Nature 362, 255-258] 참조.
문헌 [Mendez 등, 1997, Nature Genetics 15:146-156]은 그 기술을 더욱 개선시키고 항원으로 공격 시, 고 친화도의 완전한 인간 항체를 생성하는, "제노마우스(Xenomouse)Ⅱ"로 명명된 형질전환 마우스 주를 생성하였다. 이것은 상기한 바와 같이 내생적 JH 단편이 결실된 마우스로의 메가염기 인간 중쇄와 경쇄 위치의 배아계 통합에 의해 성취되었다. 제노마우스Ⅱ는 대략 66 VH 유전자, 완전한 DH 및 JH 부위 및 세 상이한 불변영역(μ, δ 및 χ)을 함유하는 1,020 kb의 인간 중쇄 위치를 갖고, 또한 32 Vκ 유전자, Jκ 단편과 Cκ 유전자를 함유하는 800 kb의 인간 κ 위치를 갖는다. 이들 마우스에서 생산된 항체는 유전자 재배열, 조립 및 레파토리를 포함하는, 모든 측면에서 인간에서 보여지는 것과 밀접하게 닮는다. 인간 항체는 쥐 위치에서 유전자 재배열을 방지하는 내생적 JH 단편에서의 결실로 인해 내생적 항체에 비해 우선적으로 발현된다.
다르게는, 파지 디스플레이 기술[McCafferty 등, 1990, Nature 348:552-553]이 비면역화된 공여체로부터의 면역글로불린 가변(V) 영역 유전자 레파토리로부터, 시험관 내에서 인간 항체와 항체 단편을 생산하는데 사용될 수 있다. 이 기술에 따르면, 항체 V 영역 유전자는 M13이나 fd와 같은 필라멘트상 박테리오파지의 주 또는 부 외피 단백질 유전자로 프레임에 맞게 클로닝되고, 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로서 배치된다. 필라멘트상 입자는 일본쇄 DNA 카피의 파지 게놈을 함유하므로, 항체의 기능적 성질에 기초한 선별은 또한 그들 성질을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자의 선별을 낳는다. 따라서, 파지는 B-세포의 성질 중 일부를 모사한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있다; 그들의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌 [Johnson, Kevin S. 및 Chiswell, David J., 1993, Current Opinion in Structural Biology 3:564-571] 참조. V-유전자 단편의 몇몇 출처가 파지 디스플레이를 위해 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson 등, 1991, Nature 352:624-628]에서는 면역화된 마우스의 지라로부터 유래된 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 다양한 어레이의 항-옥사졸론 항체를 분리하였다. 비면역화된 인간 공여자로부터의 V 유전자의 레파토리가 제작될 수 있고 다양한 어레이의 항원(자가-항원 포함)에 대한 항체가 필수적으로 문헌 [Marks 등, 1991, J. Mol. Biol. 222:581-597이나, Griffith 등, 1993, EMBO J. 12:725-734]에 의해 기재된 기술에 따라 분리될 수 있다. 자연적인 면역 반응에서, 항체 유전자는 높은 속도로 돌연변이를 축적한다 (체세포 과돌연변이). 도입된 일부 변화는 더 높은 친화도를 부여하고, 고-친화도 표면 면역글로불린을 나타내는 B 세포가 추후 항원 공격 동안 우선적으로 복제되고 분화된다. 이 자연적인 과정은 "쇄 셔플링"으로 알려진 기술을 사용하여 모방될 수 있다 [Marks 등, 1992, BioTechnol, 10:779-783]. 이 방법에서, 파지 디스플레이에 의해 수득된 "일차" 인간 항체의 친화도는 중쇄 및 경쇄 V 부위 유전자를 비면역화된 공여자로부터 수득된 V 영역 유전자의 자연 발생 변이체(레파토리)로 순차적으로 대체하여 향상될 수 있다. 이 기술은 nM 범위의 친화도를 갖는 항체와 항체 단편의 생산을 허용한다. 매우 큰 파지 항체 레파토리("마더-오브-올(mother-of-all) 라이브러리"로도 알려진)를 제조하기 위한 전략이 문헌 [Waterhouse 등, 1993, Nucl. Acids Res. 21:2265-2266]에 의해 기재되어 있고, 그러한 큰 파지 라이브러리로부터 고친화도 인간 항체를 직접 분리하는 것이 문헌 [Griffith 등, 1993, EMBO J. 12:725-734]에 의해 보고되어 있다. 유전자 셔플링은 또한 인간 항체가 출발 설치류 항체와 유사한 친화도와 특이성을 갖는, 설치류 항체로부터 인간 항체를 도출하는데 사용될 수 있다. "에피토프 임프린팅(imprinting)"으로도 언급되는, 이 방법에 따르면, 파지 디스플레이 기술에 의해 수득된 설치류 항체의 중쇄 또는 경쇄 V 영역 유전자가 인간 V 영역 유전자의 레파토리로 대체되어, 설치류-인간 키메라를 창출한다. 항원에 대한 선별은 기능적 항원-결합 위치를 회복시킬 수 있는 인간 가변영역의 분리를 낳고, 즉 에피토프는 상대의 선택을 지배(임프린트)한다. 이 방법이 나머지 설치류 V 영역을 교체하기 위해 반복될 때, 인간 항체가 얻어진다 (1993년 4월 1일 공개된 PCT 특허출원 WO 93/06213). CDR 그래프팅에 의한 설치류 항체의 전통적 인간화와 달리, 이 기술은 설치류 기원의 프레임워크나 CDR 잔기를 갖지 않는, 완전히 인간 항체를 제공한다.
(ⅴ) 이중특이성 항체
이중특이성 항체는 적어도 두 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는, 모노클로날, 바람직하게는 인간 또는 인간화된 항체이다. 이중특이성 항체를 제조하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 전통적으로, 이중특이성 항체의 재조합적 생산은 두 중쇄가 상이한 특이성을 갖는, 두 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현에 기초한다 [Millstein 및 Cuello, Nature 305, 537-539(1983)]. 면역글로불린 중쇄와 경쇄의 무작위적 분류로 인해, 이들 하이브리도마(쿼드로마)는 단지 하나만이 정확한 이중특이성 구조를 갖는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산한다. 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 보통 행해지는, 정확한 분자의 정제는 다소 부담스럽고 산물 수율이 낮다. 유사한 과정이 PCT 출원 공개번호 WO93/08829(1993년 5월 13일 공개)와, 문헌 [Traunecker 등, 1991, EMBO 10, 3655-3659]에 개시되어 있다.
상이하고 더 바람직한 접근법에 따르면, 원하는 결합 특이성(항체-항원 결합 위치)을 갖는 항체 가변영역이 면역글로불린 불변영역 서열에 융합된다. 융합은 바람직하게는 경첩, CH2 및 CH3 부위의 적어도 일부를 포함하는, 면역글로불린 중쇄 불변영역과이다. 융합 중 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 위치를 함유하는 제1 중쇄 불변영역(CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합 및 원하는 경우, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA가 별도 발현 벡터에 삽입되고, 적당한 숙주 유기체에 공동형질감염된다. 이것은 제작에 사용되는 동일하지 않은 비율의 세 폴리펩티드 쇄가 최적의 수율을 제공하는 구체예에서 세 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정할 때 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율의 적어도 두 폴리펩티드 쇄의 발현이 높은 수율을 낳거나 비율이 특별한 의미를 갖지 않을 때 하나의 발현 벡터에 두개 또는 모든 세개의 폴리펩티드 쇄의 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다. 이 접근법의 바람직한 구체예에서, 이중특이성 항체는 한 암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄와, 나머지 암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(제2 결합 특이성을 제공하는)으로 이루어진다. 이중특이성 분자의 단지 절반에서만의 면역글로불린 경쇄의 존재는 용이한 분리방법을 제공하므로, 이 비대칭적 구조는 원치않는 면역글로불린 쇄 조합들로부터 원하는 이중특이성 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이 접근법은 1994년 3월 3일에 공개된, PCT 공개번호 WO 94/04690에 개시되어 있다.
이중특이성 항체를 생성하는 추가 상세사항에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Suresh 등, 1986, Methods in Enzymology 121, 210] 참조.
(ⅵ) 헤테로컨쥬게이트 항체
헤테로컨쥬게이트 항체는 두 공유적으로 결합된 항체로 이루어진다. 그러한 항체는 예를 들어, 원치않는 세포에 대해 면역 체계 세포를 표적화하기 위해(미국특허 제4,676,980호), 또한 HIV 감염의 치료를 위해(PCT 출원 공개번호 WO 91/00360 및 WO 92/200373; EP 03089) 제안되어 있다. 헤테로컨쥬게이트 항체는 어느 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 적당한 가교결합제는 당업계에 잘 알려져 있고 많은 가교결합 기술과 함께, 미국특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.
(ⅶ) 항체 단편
어느 구체예에서, 작용제 및(또는) 길항제 항체(쥐, 인간 및 인간화된 항체 및 항체 변이체 포함)는 항체 단편이다. 다양한 기술이 항체 단편의 생산을 위해 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 완전한 항체의 단백분해적 분해를 통해 유래되었다 (참조예: [Morimoto 등, 1992, J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 및 Brennan 등, 1985, Science 229:81]). 그러나, 이들 단편은 이제 재조합 숙주 세포로부터 직접 생산될 수 있다. 예를 들어, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성한다 [Carter 등, 1992, Bio/Technology 10:163-167]. 다른 구체예에서, F(ab')2는 F(ab')2 분자의 조립을 촉진하기 위하여 류신 지퍼 GCN4를 이용하여 형성된다. 다른 접근법에 따르면, Fv, Fab 또는 F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 분리될 수 있다. 항체 단편의 다른 생산기술은 당업자에게 명백할 것이다.
(ⅷ) 작용제 항체의 동정
Bv8 작용제 항체와 EG-VEGF 작용제 항체는 내피 세포의 증식, 내피 세포의 생존 및 혈관신생을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, Bv8 또는 EG-VEGF의 생물학적 활성을 유도하는 그들의 능력에 기초하여 동정된다. 내피 세포의 증식, 내피 세포의 생존 및 혈관신생을 결정하는 어세이는 당업계에 알려져 있다. 내피 세포 증식의 유도는 소분자 아래에 위에 기재된 바와 같이 어세이될 수 있다. Bv8 작용제 항체 및 EG-VEGF 작용제 항체는 예를 들어, WO 02/00711 및 WO 03/020892에 기재된 바와 같은, 마우스 고환에서, 혈관신생을 유도하는 그들의 능력에 의해 동정될 수 있다.
(ⅸ) 길항제 항체의 동정
Bv8 길항제 항체와 EG-VEGF 길항제 항체는 내피 세포의 증식, 내피 세포의 생존 및 혈관신생을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, Bv8 또는 EG-VEGF의 생물학적 활성을 저해하는 그들의 능력에 기초하여, 예를 들어, 상기 어세이 중 하나를 이용하여, 동정된다.
G. Bv8 및(또는) EG - VEGF 와 상호작용하는 단백질의 스크리닝
단백질-단백질 상호작용을 검출하는데 적당한 어느 방법이 Bv8 및(또는) EG-VEGF와 상호작용하는, 막횡단 또는 세포내 단백질을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 단백질이나 다른 분자를 동정하기 위해 사용될 수 있다. Bv8 및(또는) EG-VEGF와 상호작용하는 단백질을 동정하기 위하여 사용될 수 있는 전통적 방법은 공동-면역침전, 가교결합 및 구배나 크로마토그래피 칼럼을 통한 공동-정제이다. 그러한 어세이를 위해, Bv8 성분이나 EG-VEGF 성분은 전장 단백질, 그의 가용성 유도체, 관심있는 영역에 상응하는 펩티드, 또는 Bv8 또는 EG-VEGF의 일부 부위를 함유하는 융합 단백질일 수 있다.
Bv8 또는 EG-VEGF와 상호작용할 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자의 동시 동정을 일으키는 방법이 사용될 수 있다. 이들 방법은 예를 들어, 표지된 Bv8, 표지된 EG-VEGF, 또는 그의 표지된 변이체를 이용하여, λgt11 라이브러리의 항체 프로빙의 잘 알려진 기술과 유사한 방법으로, 발현 라이브러리를 프로빙하는 것을 포함한다.
생체 내에서 단백질 상호작용을 검출하는 방법, 2-하이브리드 시스템이 설명 만을 위해 제한으로써가 아니라 상세히 설명된다. 이 시스템의 한 버전이 기재되어 있고[Chien 등, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582] 클론테크(팔로 알토, CA)로부터 상업적으로 입수가능하다.
간략하게, 그러한 시스템을 이용하여, 두 하이브리드 단백질을 코딩하는 플라스미드가 제작된다: 하나의 플라스미드는 Bv8 또는 EG-VEGF, 또는 그의 폴리펩티드, 펩티드 또는 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 융합된 전사 활성화제 단백질의 DNA-결합 영역을 코딩하는 뉴클레오티드로 구성되고, 나머지 플라스미드는 cDNA 라이브러리의 일부로 이 플라스미드에 재조합된 미지의 단백질을 코딩하는 cDNA에 융합된 전사 활성화제 단백질의 활성화 영역을 코딩하는 뉴클레오티드로 구성된다. DNA-결합 영역 융합 플라스미드와 cDNA 라이브러리는 조절 부위가 전사 활성화제의 결합 위치를 함유하는 리포터 유전자(예를 들어, HBS 또는 lacZ)를 함유하는 효모 사카로마이세스 세레비지애의 한 균주로 형질전환된다. 어느 하이브리드 단백질 단독은 리포터 유전자의 전사를 활성화시키지 못한다: DNA-결합 영역 하이브리드는 그것이 활성화제의 결합 위치에 위치할 수 없으므로 할 수 없다. 2 하이브리드 단백질의 상호작용은 기능적 활성화제 단백질을 재구성하고 리포터 유전잔 산물의 어세이에 의해 검출되는 리포터 유전자의 발현을 일으키다.
2-하이브리드 시스템이나 관련된 방법론이 "미끼" 유전자 산물과 상호작용하는 단백질의 활성화 영역 라이브러리를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 예로써, 제한으로써가 아니라, Bv8 또는 EG-VEGF가 미끼 유전자 산물로 사용될 수 있다. 총 게놈 또는 cDNA 서열이 활성화 영역을 코딩하는 DNA에 융합된다. 이 라이브러리와 DNA-결합 영역에 융합된 미끼 Bv8 유전자 산물이나 미끼 EG-VEGF 유전자 산물의 하이브리드를 코딩하는 플라스미드는 효모 리포터 균주로 공동형질전환되고, 생성된 형질전환체는 리포터 유전자를 발현하는 것들에 대해 스크리닝된다. 예를 들어, 제한으로써가 아니라, 미끼 Bv8 유전자 서열이나 미끼 EG-VEGF 유전자 서열, 예를 들어, 유전자의 유전자 오픈 리딩 프레임은 그것이 GAL4 단백질의 DNA-결합 영역을 코딩하는 DNA에 번역적으로 융합되도록 벡터로 클로닝될 수 있다. 이들 콜로니는 정제되고 리포터 유전자 발현을 담당하는 라이브러리 플라스미드가 분리된다. 그런 다음 DNA 서열결정이 라이브러리 플라스미드에 의해 코딩되는 단백질을 동정하는데 사용된다.
미끼 Bv8 유전자 산물이나 미끼 EG-VEGF 유전자 산물과 상호작용하는 단백질이 검출되고자 하는 세포주의 cDNA 라이브러리가 당업계에 일상적으로 실시되는 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 여기에 기재된 특정 시스템에 따라, 예를 들어, cDNA 단편은 그들이 GAL4의 전사 활성화 영역에 번역적으로 융합되도록 벡터로 삽입될 수 있다. 이 라이브러리는 GAL4 활성화 서열을 함유하는 프로모터에 의해 유도되는 lacZ 유전자를 함유하는, 효모 균주로 미끼 Bv8 유전자-GAL4 융합 플라스미드나 미끼 EG-VEGF 유전자-GAL4 융합 플라스미드와 함께 공동-형질전환될 수 있다. 미끼 Bv8 유전자 산물이나 미끼 EG-VEGF 유전자 산물과 상호작용하는, GAL4 전사 활성화 영역에 융합된, cDNA 코딩된 단백질은 활성 GAL4 단백을 재구성하여 발현을 유도할 것이다. 발현을 유도하는 콜로니는 당업계에 일상적인 방법에 의해 검출될 수 있다. 그런 다음 cDNA는 이들 균주로부터 정제되고, 당업계에서 일상적으로 수행되는 기술을 이용하여 미끼 Bv8 유전자-상호작용 단백질 또는 미끼 EG-VEGF 유전자-상호작용 단백질을 제조하고 분리하는데 사용될 수 있다.
1. Bv8 및(또는) EG - VEGF 발현 또는 활성을 조절하는 화합물
아래 어세이가 Bv8 또는 EG-VEGF의 그들의 결합 상대, 동족 수용체와의 상호작용을 방해하는 Bv8 또는 EG-VEGF 화합물, 및 상호작용(예를 들어, 결합)하는 화합물을 동정하고 Bv8 유전자 발현 및(또는) EG-VEGF 유전자 발현의 활성을 조절하거나(즉, Bv8 유전자 발현 및(또는) EG-VEGF 유전자 발현의 수준을 조절하는) 체내에서 Bv8 및(또는) EG-VEGF의 수준을 조절하는 화합물을 동정하기 위하여 설계된다. 어세이는 또한 Bv8 및(또는) EG-VEGF 유전자 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)에 결합하고, 결과적으로, Bv8 및(또는) EG-VEGF 유전자 발현을 조절하는 화합물을 동정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 여기에 그 전체로 참조로 도입되는, 문헌 [Platt, K. A., 1994, J. Biol. Chem. 269:28558-28562]을 참조한다.
본 발명에 따라 스크리닝될 수 있는 화합물은 Bv8 또는 EG-VEGF, 또는 Bv8/EG-VEGF 수용체에 결합하고 자연적 리간드에 의해 촉발되는 활성을 모방하거나(작용제) 자연적 리간드에 의해 촉발되는 활성을 저해하는(길항제) 펩티드, 가용성 수용체 또는 그의 단편, 항체와 그의 단편, 및 기타 유기 화합물(예를 들어, 펩티도미메틱스)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
그러한 화합물은 무작위 펩티드 라이브러리(예를 들어, [Lam, K. S. 등, 1991, Nature 354:82-84; Houghten, R. 등, 1991, Nature 354:84-86]), 및 D- 및(또는) L-배열 아미노산, 포스포펩티드로 제조된 조합 화학-유래된 분자 라이브러리(무작위 또는 부분적으로 축퇴된, 특이적 포스포펩티드 라이브러리의 구성원을 포함하지만, 이들로 제한되지 않음: 참조예: [Songyang, Z. 등, 1993, Cell 72:767-778])를 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 예를 들어, 가용성 펩티드와 같은 펩티드, 항체(폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 항-이디오타입, 키메라 또는 단일 쇄 항체, 및 FAb, F(ab')2, 및 FAb 발현 라이브러리 단편, 및 그의 에피토프-결합 단편을 포함하지만, 이들로 제한되지 않음), 및 소형 유기 또는 무기 분자를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명에 따라 스크리닝될 수 있는 기타 화합물은 적절한 세포(예를 들어, 내피 세포)로의 진입을 획득하고 Bv8 유전자 또는 EG-VEGF 유전자나, Bv8 및(또는) EG-VEGF 매개된 경로에 관여하는 어느 다른 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있는(예를 들어, 유전자 발현에 관여하는 조절 부위나 전사 인자와 상호작용함으로써) 소형 유기 분자; 또는 Bv8 또는 EG-VEGF의 활성이나 Bv8 및(또는) EG-VEGF 신호 전달, 이화 또는 대사 경로에 관여하는 어느 다른 세포내 인자의 활성에 영향을 미치거나 그를 치환하는 그러한 화합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
컴퓨터 모델링과 검색 기술은 Bv8 또는 EG-VEGF 발현이나 활성을 조절할 수 있는, 화합물이나, 이미 동정된 화합물의 개량을 허용한다. 그러한 화합물이나 조성물을 동정하면, 활성 위치나 부위가 동정된다. 그러한 활성 위치는 전형적으로 리간드 결합 위치일 수 있다. 활성 위치는 예를 들어, 펩티드의 아미노산 서열로부터, 핵산의 뉴클레오티드 서열로부터, 또는 관련 화합물이나 조성물의 그의 자연적 리간드와의 복합체의 연구로부터를 포함하는, 당업계에 알려진 방법을 이용하여 동정될 수 있다. 후자의 경우, 화학적 또는 X-선 결정학적 방법이 인자 상에서 결합된 리간드가 발견되는 곳을 찾아냄으로써 활성 위치를 찾는데 사용될 수 있다.
다음으로, 활성 위치의 삼차원 기하 구조가 결정된다. 이것은 완전한 분자 구조를 결정할 수 있는, X-선 결정학을 포함하는, 공지의 방법에 의해 행해질 수 있다. 한편, 고상 또는 액상 NMR이 어느 세포내 거리를 결정하는데 사용될 수 있다. 구조 결정의 어느 다른 실험적 방법이 부분 또는 완전한 기하 구조를 얻는데 사용될 수 있다. 기하 구조는 결정된 활성 위치 구조의 정확성을 증가시킬 수 있는, 천연 또는 인공의 결합된 리간드와 함께 측정될 수 있다.
불완전하거나 불충분하게 정확한 구조가 결정되면, 컴퓨터 기초 계산 모델링 방법이 구조를 완성하거나 그의 정확성을 향상시키기 위하여 사용될 수 있다. 단백질 또는 핵산과 같은 특정 생체고분자에 특이적인 지수화된 모델, 분자 운동을 계산하는데 기초한 분자 동력학 모델, 열적 앙상블에 기초한 통계학적 기계 모델, 또는 결합된 모델을 포함한, 어느 인식된 모델링 방법이 사용될 수 있다. 대부분 유형의 모델에 대해, 구성 원자와 그룹 간의 힘을 나타내는, 표준 분자력장이 필요하고, 물리화학에 알려져 있는 역장으로부터 선택될 수 있다. 불완전하거나 덜 정확한 실험적 구조는 이들 모델링 방법에 의해 계산된 완전하고 더 정확한 구조에 대한 강제로 역할할 수 있다.
최종적으로, 실험적으로, 모델링에 의해, 또는 결합에 의해 활성 위치(또는 결합 위치)의 구조를 결정하면, 후보 조절 화합물은 그들의 분자 구조에 대한 정보로 화합물을 함유하는 데이터베이스를 검색하여 동정될 수 있다. 그러한 검색은 결정된 활성 위치 구조에 일치하고 활성 위치를 결정하는 그룹과 상호작용하는 구조를 갖는 화합물을 구한다. 그러한 검색은 수작업일 수 있지만, 바람직하게는 컴퓨터 보조된다. 이 검색으로부터 발견된 이들 화합물은 Bv8 활성 및(또는) EG-VEGF 활성의 잠재적 조절제이다.
다르게는, 이들 방법은 이미 알려진 조절 화합물이나 리간드로부터 개선된 조절 화합물을 동정하는데 사용될 수 있다. 공지 화합물의 조성물은 변형되고 변형의 구조적 영향이 새로운 조성물에 적용되는 상기 실험적 및 컴퓨터 모델링 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 그런 다음 변형된 구조는 화합물의 활성 위치 구조와 비교되어 향상된 맞춤이나 상호작용이 일어나는지를 결정한다. 이 방법으로 측쇄를 변화시키는 것에 의해서와 같은, 향상된 특이성이나 활성의 변형된 조절 화합물이나 리간드를 얻기 위하여 조성물에서 체계적 변화가 신속하게 평가될 수 있다.
Bv8 또는 EG-VEGF와, 관련된 전달 및 전사 인자의 활성 위치(또는 결합 위치)의 동정에 기초하여 조절 화합물을 동정하는데 유용한 추가의 실험적 및 컴퓨터 모델링 방법은 당업자에게 명백할 것이다.
분자 모델링 시스템의 예는 CHARMm 및 QUANTA 프로그램(MA, 월샘, 폴리젠 코포레이션)이다. CHARMm은 에너지 최소화와 분자 동력학 기능을 수행한다. QUANTA는 분자 구조의 제작, 그래픽 모델링과 분석을 수행한다. QUANTA는 분자들 상호간의 상호작용적 제작, 변형, 가시화 및 행동 분석을 허용한다.
문헌 [Rotivinen 등, 1988, Acta Pharmaceutical Fennica 97:159-166; Ripka, 1988년 6월 16일, New Scientist 54-57; McKinaly 및 Rossmann, 1989, Annu. Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29:111-122; Perry 및 Davies, OSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design 189-193면(Alan R. Liss, Inc. 1989); Lewis 및 Dean, 1989 Proc. R. Soc. Lond. 236:125-140 및 141-162]; 및, 핵산 성분에 대한 모델 수용체에 관한, 문헌 [Askew 등, 1989, J. Am. Chem. Soc. 111:1082-1090]과 같은, 많은 논문이 특정 단백질과 상호작용하는 약물의 컴퓨터 모델링을 검토하고 있다. 화학물질을 스크리닝하고 그래픽으로 도시하는 다른 컴퓨터 프로그램이 BioDesign, Inc.(Pasadena, CA.), Allelix, Inc.(Mississauga, Ontario, Canada) 및 Hypercube, Inc.(Cambridge, Ontario)로부터 이용가능하다. 이들은 주로 특정 단백질에 특이적인 약물에 대한 적용을 위해 설계되었지만, 일단 그 부위가 동정되면, DNA나 RNA의 부위에 특이적인 약물의 설계에 적합화될 수 있다.
결합을 변화시킬 수 있는 화합물의 설계와 생성에 관하여 위에서 기재하였지만, 자연적 산물 또는 합성 화학물질 및 단백질을 포함하는 생물학적 활성 물질을 포함하는, 공지 화합물의 라이브러리를 저해제나 활성화제인 화합물에 대해 스크리닝할 수 있다.
여기에 기재된 것들과 같은 어세이를 통해 동정된 화합물은 예를 들어, Bv8 유전자 산물 및(또는) EG-VEGF 유전자 산물의 생물학적 기능을 규명하는데 유용할 수 있다. 그러한 화합물은 다양한 생리적 장애 중 어느 것을 치료하기 위하여 치료 유효용량으로 환자에게 투여될 수 있다. 치료 유효용량은 어느 생물학적 증상의 어느 경감, 방해, 방지 또는 변형을 일으키기에 충분한 화합물의 양을 말한다.
b. Bv8 및(또는) EG - VEGF 에 결합하는 화합물
Bv8 및(또는) EG-VEGF와 상호작용(예를 들어, 결합)하거나 모사할 수 있거나, 동족의 수용체, 결합 상대 또는 기질에 대한 Bv8 및(또는) EG-VEGF의 결합을 방해할 수 있는 화합물을 동정하기 위한 시스템이 설계될 수 있다. 동정된 화합물은 예를 들어, 야생형 및(또는) 돌연변이 Bv8 유전자 산물, EG-VEGF 유전자 산물, 또는 그들의 배합물의 활성을 조절하는데 유용할 수 있거나; Bv8 및(또는) EG-VEGF의 생물학적 기능을 탐구하는데 유용할 수 있거나; 정상적 Bv8 상호작용 및(또는) EG-VEGF 상호작용을 파괴하는 화합물을 동정하기 위한 스크린에 사용될 수 있거나; 그 자체로 그러한 상호작용을 파괴하거나 활성화할 수 있다.
Bv8 및(또는) EG-VEGF에 결합하는 화합물, 또는 Bv8 및(또는) EG-VEGF 동족 수용체 또는 기질을 동정하는데 사용되는 어세이의 원리는 Bv8 및(또는) EG-VEGF와 시험 화합물이나 기질의 반응 혼합물을 두 성분이 상호작용하고 결합하는 것을 허용하기에 충분한 조건 하 및 시간 동안 제조하여, 반응 혼합물에서 제거되고/거나 검출될 수 있는 복합체를 형성하는 것을 포함한다. 사용되는 Bv8 및(또는) EG-VEGF 종은 스크리닝 어세이의 목적에 따라 변화할 수 있다. 예를 들어, 자연적 수용체의 작용제가 원해지는 경우, 전장 Bv8 또는 EG-VEGF, 또는 가용성 절단 Bv8 또는 EG-VEGF, 펩티드, 또는 어세이 시스템에서 장점을 제공하는(예를 들어, 생성된 복합체의 표지, 분리 등) 단백질이나 폴리펩티드에 융합된 하나 이상의 Bv8 또는 EG-VEGF 영역을 함유하는 융합 단백질이 사용될 수 있다. Bv8 및(또는) EG-VEGF와 직접 상호작용하는 화합물이 추구될 때, Bv8 또는 EG-VEGF에 상응하는 펩티드와 Bv8 또는 EG-VEGF를 함유하는 융합 단백질이 사용될 수 있다.
스크리닝 어세이는 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 그러한 어세이를 수행하는 하나의 방법은 Bv8 또는 EG-VEGF 폴리펩티드, 펩티드 또는 그의 융합 단백질이나, 시험 물질을 고상에 앵커링시키고 반응의 말기에 고상에 앵커링된 Bv8/시험 화합물 복합체나 EG-VEGF/시험 화합물 복합체를 검출하는 것을 포함한다. 그러한 방법의 일 구체예에서, Bv8 반응물이나 EG-VEGF 반응물은 고체 표면으로 앵커링될 수 있고, 앵커링되지 않은 시험 화합물은 직접 또는 간접적으로 표지될 수 있다.
실제로, 마이크로타이터 플레이트가 고상으로 편리하게 이용될 수 있다. 앵커링된 성분은 비공유 또는 공유 부착에 의해 고정화될 수 있다. 비공유적 부착은 간단히 고체 표면을 단백질 용액으로 코팅하고 건조하여 달성될 수 있다. 다르게는, 고정화될 단백질에 특이적인 고정화된 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체가 고체 표면에 단백질을 앵커링하는데 사용될 수 있다. 표면은 미리 제조되어 저장될 수 있다.
어세이를 수행하기 위하여, 비고정화된 성분이 앵커링된 성분을 함유하는 코팅된 표면에 가해진다. 반응이 완료된 후, 어느 형성된 복합체가 고체 표면 상에 고정화된 채 남아있도록 조건 하에서 미반응된 성분이 제거된다 (예를 들어, 세척에 의해). 고체 표면 상에 앵커링된 복합체의 검출은 많은 방법으로 달성될 수 있다. 미리 비고정화된 성분이 예비-표지되는 경우, 표면 상에 고정화된 표지의 검출은 복합체가 형성되었음을 가리킨다. 이전에 비고정화된 성분이 예비-표지되지 않는 경우, 간접적 표지가 표면 상에 앵커링된 복합체를 검출하는데 사용될 수 있다; 예를 들어, 이전에 비고정화된 성분에 특이적인 표지된 항체를 이용하여(항체는, 다음에, 직접 표지되거나 표지된 항-Ig 항체로 간접적으로 표지될 수 있다).
다르게는, 반응은 액상에서 수행되고, 반응 산물은 미반응 성분으로부터 분리되며, 복합체가 검출된다; 예를 들어, 용액 중에 형성된 어느 복합체를 앵커링하기 위하여 Bv8 또는 EG-VEGF 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 융합 단백질 또는 시험 화합물에 특이적인 고정화된 항체와, 앵커링된 복합체를 검출하기 위하여 가능한 복합체의 다른 성분에 특이적인 표지된 항체를 이용함.
c. Bv8 및(또는) EG - VEGF 상호작용을 방해하는 화합물
Bv8 및(또는) EG-VEGF와 상호작용하는 거대분자는 이 논의의 목적을 위해, "결합 상대"로 언급된다. 이들 결합 상대는 Bv8 및(또는) EG-VEGF 매개된 생물학적 경로에 관여하기 쉽다. 따라서, 체내에서 Bv8 활성 및(또는) EG-VEGF 활성을 조절하거나 강화하고/거나 이 활성(또는 그의 결핍)과 관련된 장애를 제어하는데 유용할 수 있는 그러한 결합 상대의 상호작용을 방해하거나 파괴하는 화합물을 동정하는 것이 바람직하다.
Bv8 또는 EG-VEGF와 결합 상대 또는 상대들 간의 상호작용을 방해하는 화합물을 동정하는데 사용되는 어세이 시스템의 기본적인 원리는 Bv8 및(또는) EG-VEGF, 또는 그의 일부 변이체와 결합 상대를 함유하는 반응 혼합물을, 둘이 상호작용하고 결합하여, 복합체를 형성하는 것을 허용하기에 충분한 조건 하 및 시간 동안, 제조하는 것을 포함한다. 화합물을 저해 활성에 대해 시험하기 위하여, 반응 혼합물은 시험 화합물의 존재 및 부재 하에 제조된다. 시험 화합물은 처음에 반응 혼합물에 포함되거나, Bv8 또는 EG-VEGF와 그의 결합 상대의 첨가 이후의 시간에 첨가될 수 있다. 대조 반응 혼합물은 시험 화합물 없이 또는 위약과 함께 인큐베이션된다. 그런 다음 Bv8 또는 EG-VEGF와 결합 상대 간의 어느 복합체의 형성이 검출된다. 대조 반응에서는 복합체를 형성하지만, 시험 화합물을 함유하는 반응 혼합물에서는 그렇지 않은 것은 화합물이 Bv8이나 EG-VEGF와 상호작용성 결합 상대의 상호작용을 방해함을 가리킨다. 부가적으로, 시험 화합물과 정상적 Bv8 단백질이나 정상적 EG-VEGF 단백질을 함유하는 반응 혼합물 내에서의 복합체 형성은 또한 각각 시험 화합물과 돌연변이 Bv8이나 돌연변이 EG-VEGF를 함유하는 반응 혼합물 내에서의 복합체 형성과 비교될 수 있다. 이 비교는 돌연변이, 또는 돌연변이된 Bv8이나 EG-VEGF의 상호작용을 특이적으로 파괴하지만, 정상적 단백질은 그러하지 않은 화합물을 동정하는 것이 바람직한 경우에 중요할 수 있다.
Bv8 및(또는) EG-VEGF와 그들의 결합 상대 간의 상호작용을 방해하는 화합물에 대한 어세이는 이질적 또는 균질적 포맷으로 수행될 수 있다. 이질적 어세이는 Bv8이나 EG-VEGF, 또는 그의 결합 상대를 고상으로 앵커링하고 반응 말기에 고상에 앵커링된 복합체를 검출하는 것을 포함한다. 균질적 어세이에서, 전체 반응은 액상에 수행된다. 어느 하나의 접근법에서, 반응물 첨가 순서는 시험되는 화합물에 관한 상이한 정보를 얻기 위하여 변화될 수 있다. 예를 들어, 경쟁에 의해 상호작용을 방해하는 시험 화합물은 반응을 시험 물질 존재 하에 수행함으로써 동정될 수 있다; 예를 들어, 시험 물질을 Bv8 또는 EG-VEGF와 상호작용성 결합 상대 이전에 또는 그와 동시에 첨가하는 것에 의해. 다르게는, 미리 형성된 복합체를 파괴하는 시험 화합물, 예를 들어, 복합체로부터 성분 중 하나를 제거하는 더 높은 결합 상수를 갖는 화합물은 시험 화합물을 복합체가 형성된 후 반응 혼합물에 첨가함으로써 시험될 수 있다. 다양한 포맷이 아래 간략하게 설명된다.
이질적 어세이 시스템에서, 앵커링되지 않은 종은 직접 또는 간접적으로 표지되면서, 폴리펩티드(Bv8 또는 EG-VEGF)나 폴리펩티드의 상호작용성 결합 상대는 고체 표면 상에 앵커링된다. 실제로, 마이크로타이터 플레이트가 편리하게 이용된다. 앵커링된 된 종은 비공유 또는 공유적 부착에 의해 고정화될 수 있다. 비공유적 부착은 고체 표면을 폴리펩티드나 결합 상대의 용액으로 코팅하고 건조하여 간단하게 달성될 수 있다. 다르게는, 앵커링된 종에 특이적인 고정된 항체는 고체 표면에 종을 앵커링시키는데 사용될 수 있다. 표면은 미리 제조되어 저장될 수 있다.
어세이를 수행하기 위하여, 고정화된 종의 상대는 시험 화합물과 함께 또는 없이 코팅된 표면에 노출된다. 반응이 완료된 후, 미반응된 성분은 제거되고(예를 들어, 세척에 의해) 어느 형성된 복합체가 고체 표면 상에 고정화된 채 남아있을 것이다. 고체 표면 상에 앵커링된 복합체의 검출은 많은 방법으로 달성될 수 있다. 비고정화된 성분이 예비-표지되는 경우, 표면 상에 고정화된 표지의 검출은 복합체가 형성되었음을 가리킨다. 비고정화된 성분이 예비-표지되지 않는 경우, 간접적 표지가 표면 상에 앵커링된 복합체를 검출하는데 사용될 수 있다; 예를 들어, 처음에 비고정화된 종에 특이적인 표지된 항체를 이용하여(항체는, 다음에, 직접 표지되거나 표지된 항-Ig 항체와 간접적으로 표지될 수 있다). 반응 성분의 첨가 순서에 따라, 복합체 형성을 저해하거나 미리 형성된 복합체를 파괴하는 시험 화합물이 검출될 수 있다.
다르게는, 반응은 시험 화합물의 존재 또는 부재 하에서 액상에서 수행되고, 반응 산물은 미반응 성분으로부터 분리되며, 복합체가 검출될 수 있다; 예를 들어, 용액 중에 형성된 어느 복합체를 고정하기 위하여 결합 성분 중 하나에 특이적인 고정화된 항체와, 고정된 복합체를 검출하기 위하여 다른 상대에 특이적인 표지된 항체를 이용하여. 다시, 액상으로의 반응 성분의 첨가 순서에 따라, 복합체 형성을 저해하거나 미리 형성된 복합체를 파괴하는 시험 화합물이 동정될 수 있다.
본 발명의 대체 구체예에서, 균질적 어세이가 사용될 수 있다. 이 접근법에서, 폴리펩티드나 결합 상대가 표지된 폴리펩티드(Bv8 또는 EG-VEGF)와 상호작용성 결합 상대의 미리 형성된 복합체가 제조되지만, 표지에 의해 발생되는 신호는 복합체의 형성으로 인해 상쇄된다 (예를 들어, 면역어세이를 위해 이 접근법을 이용하는 루벤스타인 (Rubenstein)에 의한 미국특허 제4,109,496호). 미리 형성된 복합체로부터의 종 중 하나와 경쟁하고 그를 대체하는 시험 물질의 첨가는 배경 위에 신호 발생을 일으킬 것이다. 이 방법으로, 상호작용을 파괴하는 시험 물질이 동정될 수 있다.
특정 구체예에서, Bv8(또는 EG-VEGF) 융합물이 고정화를 위해 제조될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드(Bv8 또는 EG-VEGF)나 그의 펩티드 단편은 pGEX-5X-1과 같은, 융합 벡터를 이용하여 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 유전자에, 그의 결합 활성이 결과적인 융합 단백질에서 유지되는 방식으로, 융합될 수 있다. 상호작용성 결합 상대는 당업계에 일상적으로 실시되고 위에 기재된 방법을 사용하여, 정제되고 모노클로날 항체를 유발하는데 사용될 수 있다. 이 항체는 예를 들어, 당업계에서 일상적으로 실시되는 방법에 의해, 방사성 동위원소 125I로 표지될 수 있다. 이질적 어세이에서, 융합 단백질은 글루타티온-아가로스 비드에 앵커링될 수 있다. 그런 다음 상호작용성 결합 상대는 상호작용과 결합이 일어나도록 허용하는 방식으로 시험 화합물의 존재 또는 부재 하에 첨가될 수 있다. 반응 기간의 말기에, 결합되지 않은 물질은 세척해내고, 표지된 모노클로날 항체가 시스템에 첨가되어 복합체화된 성분에 결합하도록 할 수 있다. 폴리펩티드(Bv8 또는 EG-VEGF)와 상호작용성 결합 상대 간의 상호작용은 글루타티온-아가로스 비드와 결합되어 남아있는 방사성의 양을 측정하여 검출될 수 있다. 시험 화합물에 의한 성공적인 상호작용의 저해는 측정된 방사성에서 감소를 가져올 것이다.
다르게는, GST 융합 단백질과 상호작용성 결합 상대가 고체 글루타티온-아가로스 비드 부재 하에 액체에서 함께 혼합될 수 있다. 시험 화합물은 종들이 상호작용하도록 허용되는 동안이나 그 후에 첨가될 수 있다. 그런 다음 이 혼합물은 글라타티온-아가로스 비드에 첨가될 수 있고 결합되지 않는 물질은 세척된다. 다시 Bv8과 결합 상대 또는 EG-VEGF와 결합 상대 간의 상호작용의 저해 정도는 표지된 항체를 첨가하고 비드와 결합된 방사성을 측정함으로써 검출될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 이들 동일한 기술이 전장 단백질의 하나 또는 둘다 대신, 폴리펩티드(Bv8 또는 EG-VEGF) 및(또는) 상호작용성 결합 상대(결합 상대가 단백질인 경우)의 결합 영역에 상응하는 펩티드 단편을 이용하여 사용될 수 있다. 당업계에 일상적으로 실시되는 상당히 많은 수의 방법이 결합 위치를 동정하고 분리하는데 사용될 수 있다. 이들 방법은 공동-면역침전 어세이에서 단백질 중 하나를 코딩하는 유전자의 돌연변이유발과 결합 파괴의 스크리닝을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 그런 다음 복합체에서 제2 종을 코딩하는 유전자의 보상적 돌연변이가 선별될 수 있다. 각각의 단백질을 코딩하는 유전자의 서열분석이 상호작용성 결합에 관여하는 단백질 부위에 상응하는 돌연변이를 밝힐 것이다. 다르게는, 한 단백질은 상기한 방법을 이용하여 고체 표면에 앵커링되고, 트립신과 같은 단백분해 효소로 처리된, 그의 표지된 결합 상대와 상호작용하고 결합하도록 허용될 수 있다. 세척 후, 결합 영역을 포함하는 상대적으로 짧은, 표지된 펩티드가 고체 물질과 결합된 채 남아있을 수 있고, 이는 분리되고 아미노산 서열결정에 의해 동정될 수 있다. 또한, 일단 세포 내 결합 상대를 코딩하는 유전자가 얻어지면, 짧은 유전자 단편이 단백질의 펩티드 단편을 발현하도록 조작된 후, 결합 활성에 대해 시험되고 정제되거나 합성될 수 있다.
예를 들어, 제한으로써가 아니라, Bv8 및(또는) EG-VEGF는 GST 융합 단백질을 제조하고 그것이 글루타티온 아가로스 비드에 결합하도록 함으로써, 상기한 바와 같이 고체 물질에 앵커링될 수 있다. 상호작용성 결합 상대는 35S와 같은 방사성 동위원소로 표지되고, 트립신과 같은 단백분해 효소로 절단될 수 있다. 그런 다음 절단 산물은 앵커링된 융합 단백질에 첨가되고 결합하도록 허용될 수 있다. 결합되지 않은 펩티드를 세척해낸 후, 표지된 결합 물질은 주지의 방법에 의해 용출, 정제 및 아미노산 서열에 대해 분석될 수 있다. 그렇게 동정된 펩티드는 합성에 의해 제조되거나 재조합 DNA 기술을 이용하여 적절한 촉진성 단백질에 융합될 수 있다.
H. 약제학적 조성물
Bv8 또는 EG-VEGF의 작용제와 길항제를 포함하는, 여기에 기재된 Bv8 폴리펩티드, EG-VEGF 폴리펩티드 및 그의 조절제는 치료제로서 사용될 수 있다. 본 발명의 이들 폴리펩티드와 조절제는 약제학적으로 유용한 조성물을 제조하는 공지의 방법에 따라 제제화될 수 있고, 이로써 Bv8 및(또는) EG-VEGF 산물은 약제학적으로 허용되는 담체 비히클과의 혼합물로 배합된다. Bv8, EG-VEGF, 또는 그들의 배합물의 치료 제제는 원하는 정도의 순도를 갖는, 바람직하게는 필수적으로 순수한, Bv8 및(또는) EG-VEGF를 임의의 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합하여(상기, Remington's Pharmaceutical Sciences), 동결건조된 케이크나 수용액의 형태로 제조될 수 있다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 용량과 농도에서 노출되는 세포나 포유류에 비독성이다. 예는 인산염, 시트르산염 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 만니톨이나 솔비톨과 같은 당 알콜; 나트륨과 같은 염-형성 반대이온; 및(또는) 트윈, 플루로닉 또는 PEG와 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
생체 내 투여에 사용되는 Bv8 및(또는) EG-VEGF는 멸균이어야 한다. 이것은 동결건조와 재구성 전이나 후에, 멸균 여과 막을 통한 여과와 같은, 당업계에 알려진 어느 방법에 의해 쉽게 달성된다. Bv8은 동결건조 형태로 저장될 수 있다. Bv8, EG-VEGF, 및 그들의 배합물의 치료 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어, 피하 주사바늘에 의해 천공가능한 뚜껑을 갖는 정맥 내 용액 백이나 바이알에 위치된다.
Bv8은 임의로 다른 성장 인자와 배합되거나 동시에 투여된다. 예를 들어 그것은 EG-VEGF 또는 VEGF와 배합될 수 있다. EG-VEGF는 임의로 다른 성장 인자와 배합되거나 동시에 투여된다. 예를 들어 그것은 Bv8 또는 VEGF와 배합될 수 있다.
Bv8, EG-VEGF 또는 그의 조절제는 암, 기타 혈액학적 장애, 호중구감소증, 면역결핍 장애, 자가면역 장애 등을 치료하기 위한 다른 통상적인 요법과 함께 사용될 수 있다.
투여 경로는 공지의 방법, 예를 들어, 정맥내, 복강내, 뇌내, 근육내, 안구내, 동맥내 또는 병변내 경로에 의한 주사나 주입, 국소 투여, 또는 서방성 시스템에 따른다.
본 발명의 약제학적 조성물의 용량과 원하는 약물 농도는 예상되는 특정 용도에 따라 변화할 수 있다. 적절한 용량이나 투여경로의 결정은 당연히 통상적인 내과의사의 기술 내에 있다. 동물 실험은 인간 요법을 위한 유효용량의 결정을 위한 믿을 수 있는 가이드를 제공한다. 유효용량의 종간 스케일링은 문헌 [Mordenti, J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi 등, Eds., Pergamon Press, New York 1989, 42-96면]에 의해 제기된 원리에 따라 수행될 수 있다.
Bv8 및(또는) EG-VEGF 폴리펩티드 또는 조절제의 서방성 투여가 Bv8 및(또는) EG-VEGF 폴리펩티드 또는 조절제의 투여를 요구하는 어느 질환이나 장애의 치료에 적당한 방출 특성을 갖는 제제에서 바람직한 경우, Bv8 및(또는) EG-VEGF 폴리펩티드 또는 조절제, 또는 그들의 배합물의 마이크로캡슐화가 착상된다. 예를 들어, 정제된 형태의 Bv8, EG-VEGF 또는 그들의 배합물은 예를 들어, 코아세르베이트화 기술이나 경계면 중합체화에 의해 제조된 마이크로캡슐(예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타아크릴레이트) 마이크로캡슐), 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마이크로에멀젼에 봉입될 수 있다. 그러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16판, 1980(A. Osol, Ed)]에 개시되어 있다.
Bv8, EG-VEGF 또는 그들의 배합물은 치료 용도를 위해 서방성 제제로 도입될 수 있다. 서방성 제제의 적당한 예는 성형 물품, 예를 들어, 필름 형태의 반투성 폴리머 매트릭스나, 마이크로캡슐을 포함한다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로젤(예를 들어, 문헌 [Langer 등, 1981, J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 및 Langer, 1982, Chem. Tech., 12:98-105]에 의해 기재된 바와 같은 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트)나 폴리(비닐알콜)), 폴리락타이드(미국특허 제3,773,919호, EP 58,481), L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체[Sidman, 등, 1983, Biopolymers 22:547], 비분해성 에틸렌 비닐 아세테이트(상기 Langer 등) 또는 루프론 데포(Lupron Depot)™(락트산-글리콜산 공중합체와 루프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사용 마이크로스피어)와 같은 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산(EP 133,988)을 포함한다.
에틸렌-비닐 아세테이트와 락트산-글리콜산과 같은 폴리머가 100 일 이상 동안 분자의 방출을 가능하게 하는 반면, 어느 하이드로젤은 더 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 단백질이 장시간 체내에 남아있을 때, 그들은 37 ℃에서 수분에 대한 노출의 결과로 변성하거나 응집하여, 생물학적 활성의 상실이나 면역원성의 가능한 변화를 일으킨다. 합리적인 전략이 관여되는 기작에 따라 단백질 안정화를 위해 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 기작이 티오-디설파이드 상호교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 안정화는 설프하이드릴 잔기를 수식하고, 산성 용액으로부터 동결건조하고, 수분 함량을 제어하고, 적절한 첨가제를 사용하고, 특정 폴리머 매트릭스 조성물을 개발함으로써 달성될 수 있다.
서방성 Bv8 및(또는) EG-VEGF 조성물은 또한 리포좀에 봉입된 Bv8 및(또는) EG-VEGF를 포함한다. Bv8 및(또는) EG-VEGF를 함유하는 리포좀은 당업계에 알려진 방법에 의해 제조된다 [Epstein 등, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:3688; Hwang,등, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030]; DE 3218121A; EP 52322A; EP 36676A; EP 88046A; EP 143949A; EP 142641A; 일본 특허출원 제83-118008호; 미국특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 EP 102,324A). 통상적으로 리포좀은 지질 함량이 약 30몰% 콜레스테롤 보다 큰 작은(약 200-800 옹스트롬) 단일라멜라 형태이고, 선택되는 비율은 최적의 Bv8 요법을 위해 조정된다.
국소로 적용될 때, Bv8, EG-VEGF 또는 그들의 배합물은 담체 및(또는) 애쥬번트와 같은 기타 성분과 적당하게 배합된다. 그러한 다른 성분의 성질에 대해서는, 그들이 생리학적으로 허용가능하고 그들의 의도된 투여를 위해 효과적이어야만 하고, 조성물의 활성성분의 활성을 분해할 수 없다는 것을 제외하고는, 아무런 제한도 없다. 적당한 비히클의 예는 정제 콜라겐을 갖거나 갖지 않는, 연고, 크림, 겔, 또는 현탁액을 포함한다. 조성물은 또한 경피 패치, 플라스터와 밴드로 바람직하게는 액체 또는 반액체 형태로 주입될 수 있다.
겔 제제를 얻기 위하여, 액상 조성물로 제제화된 Bv8, EG-VEGF 또는 그들의 배합물은 유효량의 수용성 다당류 또는 PEG와 같은 합성 폴리머와 혼합되어 국소적으로 적용되기 위해 적당한 점도의 겔을 형성할 수 있다. 사용될 수 있는 다당류는 예를 들어, 알킬 셀룰로스, 하이드록시알킬 셀룰로스, 및 알킬하이드록시알킬 셀룰로스, 예를 들어, 메틸셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 및 하이드록시프로필 셀룰로스를 포함하는, 에테르화된 셀룰로스 유도체와 같은 셀룰로스 유도체; 전분 및 분획화된 전분; 아가; 알긴산 및 알기네이트; 아라비아검; 풀룰란; 아가로스; 카라기난; 덱스트란; 덱스트린; 프럭탄; 이눌린; 만난; 자일란; 아라비난; 키토산; 글리코겐; 글루칸; 및 합성 생체고분자; 및 잔탄 검; 구아검; 로커스트빈 검; 아라비아검; 트라가칸트 검; 및 카라야 검과 같은 검; 및 그들의 유도체와 혼합물을 포함한다. 여기에서 바람직한 겔화제는 생물학적 시스템에 불활성이고, 비독성이며, 제조하기 간단하고, 너무 흐르거나 끈적이지 않으며, 겔 내에 유지되는 Bv8 및(또는) EG-VEGF를 탈안정화하지 않는 것이다.
바람직하게는 다당류는 에테르화된 셀룰로스 유도체, 더 바람직하게는 잘 정의되고, 정제되고 USP에 수록된 것, 예를 들어, 메틸셀룰로스 및 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스 및 하이드록시프로필 메틸셀룰로스와 같은 하이드록시알킬 셀룰로스 유도체이다. 여기에서 가장 바람직한 것은 메틸셀룰로스이다.
겔화를 위해 유용한 폴리에틸렌 글리콜은 전형적으로 적절한 점도를 얻기 위하여 저분자량 및 고분자량 PEG들의 혼합물이다. 예를 들어, 분자량 400-600의 PEG의 분자량 1500의 것과의 혼합물이 페이스트를 얻기 위하여 적당한 비율로 혼합될 때 이 목적을 위해 효과적인 것일 것이다.
다당류와 PEG들에 적용되는 바 용어 "수용성"은 콜로이드성 용액과 분산액을 포함하는 것으로 의미된다. 일반적으로, 셀룰로스 유도체의 용해도는 에테르 그룹의 치환 정도에 의해 결정되고, 여기에서 유용한 안정화 유도체는 유도체가 수용성이 되게 하기 위하여 셀룰로스 쇄 중의 무수글루코스 단위 당 충분한 양의 그러한 에테르 그룹을 가져야만 한다. 무수글루코스 단위 당 적어도 0.35 에테르 그룹의 에테르 치환정도가 일반적으로 충분하다. 부가적으로, 셀룰로스 유도체는 알칼리 금속 염, 예를 들어, Li, Na, K 또는 Cs 염 형태이다.
메틸셀룰로스가 겔에 사용되면, 바람직하게는 그것은 겔의 약 2-5%, 더 바람직하게는 약 3%를 구성하고 Bv8 및(또는) EG-VEGF는 겔 ㎖ 당 약 300-1000 ㎎의 양으로 존재한다.
반투과성의, 이식가능한 막 장치가 어느 상황에서 약물을 전달하기 위한 수단으로 유용하다. 예를 들어, Bv8 및(또는) EG-VEGF, Bv8 및(또는) EG-VEGF 변이체, Bv8 및(또는) EG-VEGF 키메라, 또는 Bv8 및(또는) EG-VEGF의 작용제 또는 길항제를 분비하는 세포는 캡슐화될 수 있고, 그러한 장치는 환자에게 이식될 수 있다. 따라서, Bv8 및(또는) EG-VEGF, 또는 특정 상태에 요구될 수 있는 바와 같은 그의 작용제 또는 길항제를 분비하는 세포를 그를 필요로 하는 환자의 체내로 이식하는 것을 포함하는, 암, 기타 혈액학적 장애, 호중구감소증, 면역학적 장애, 자가면역 장애 등의 예방 또는 치료 방법이 또한 포함된다. 마지막으로, 본 발명은 환자에게 반투막과, 상기 막 내에 캡슐화된 Bv8 및(또는) EG-VEGF(또는 특정 상태를 위해 요구될 수 있는 바와 같은 그의 작용제 또는 길항제)를 분비하는 세포를 포함하고, 상기 막이 Bv8 및(또는) EG-VEGF(또는 그의 작용제 또는 길항제)에 대해 투과성이고 세포에 치명적인 환자로부터의 인자에 대해 불투과성인, 이식물을 환자에게 이식하는 것에 의한, 암, 기타 혈액학적 장애, 호중구감소증, 면역학적 장애, 자가면역 장애 등을 예방하거나 치료하기 위한 장치를 포함한다. 생체 외에서 Bv8 및(또는) EG-VEGF를 생산하기 위하여 형질전환된 환자 자신의 세포는 임의로 그러한 캡슐화 없이, 환자에게 직접 이식될 수 있다. 살아있는 세포의 막 캡슐화의 방법론은 당업자에게 익숙하며, 캡슐화된 세포의 제조와 그들의 환자로의 이식은 과도한 실험 없이 성취될 수 있다.
Bv8, EG-VEGF, 또는 그들의 배합물, 또는 그의 작용제 또는 길항제를 포함하는 약제학적 조성물은 바람직하게는 적당한 용기에 배치된다. 용기는 바람직하게는 약제학적 조성물의 적절한 용도와 용량을 상세히 기재한 지침을 수반한다. 당업자는 이들 지침이 치료 방법에 따라 변화함을 인식할 것이다.
I. 치료 방법
여기에 제공된 Bv8, EG-VEGF, 및 그들의 작용제 및 길항제는 많은 어세이와 치료에 사용될 수 있다. Bv8 및(또는) EG-VEGF는 조혈 줄기 세포, CD34+ 골수 선조 세포, CD34+ 림프계 선조 세포, 골수 전구 세포, 림프계 전구 세포, 단핵구와 림프구를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 골수 세포와 그들의 자손의 증식을 유도한다. 이 증식은 B 세포, T세포, 대식세포와 특히 호중구를 포함하는 백혈구 수의 증가에 이른다.
Bv8, EG-VEGF, 및 그들의 작용제는 예를 들어, 조혈 줄기 세포, CD34+ 골수 선조 세포, 골수 전구 세포, 호중구, 림프계 선조 세포, 림프계 전구 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 골수 세포와 그들의 자손의 증식을 증가시키거나 호중구, B 세포 또는 T 세포와 같은 특정 유형의 혈액 세포의 생존을 증진시키는 것이 바람직한 장애나 상태의 치료에 치료적으로 유용하다. 일 구체예에서, Bv8, EG-VEGF, 또는 그의 작용제는 포유류에게 질환이나 장애를 치료하는데 유효한 양으로 투여된다. 바람직하게는, 포유류는 인간이다. Bv8, EG-VEGF, 또는 그들의 배합물은 폴리펩티드나 핵산 형태로 투여될 수 있다.
예를 들어, Bv8, EG-VEGF, 및 그들의 작용제는 호중구감소증, 림프구감소증 또는 원발성 또는 이차성 면역결핍 장애일 수 있는 면역결핍 장애와 관련된 상태와 장애를 치료하는데 치료적으로 유용하다. 이들 상태와상태 예를 들어, 유전적 장애, B 세포 결핍, T 세포 결핍, 세균 및 바이러스 감염을 포함하는 감염성 질환, 침윤성 및 혈액학적 장애, 수술 및 외상, 이차성 면역억제 효과를 갖는 치료제의 투여와 관련될 수 있다.
일부 경우 이차성 면역억제 효과는 면역결핍 장애를 낳는다. Bv8, EG-VEGF, 또는 그들의 배합물은 골수억제로부터, 예를 들어, 치료제가 순환 백혈구의 수준을 심각하게 저하시키고 환자의 면역 체계를 저하시키는 치료적 치료를 받은 암 환자에서, 조혈 회복을 촉진하는데 사용될 수 있다. Bv8, EG-VEGF, 또는 그들의 배합물은 조혈 회복을 촉진시키고/거나 순환 호중구, B 세포 및 T 세포의 수를 증가시키기 위하여 방사선조사, 고용량 화학요법, 또는 기타 항암 약물 이전에, 그에 결합하여, 또는 그에 이어서 투여될 수 있다.
Bv8, EG-VEGF, 또는 그들의 배합물은 다른 화합물이나 조성물과 함께 투여될 수 있다. Bv8 및(또는) EG-VEGF는 Bv8, EG-VEGF, 및(또는) 화합물 또는 조성물의 치료 효능이 증가되도록 화합물이나 조성물로의 치료 전, 동안 또는 후에 투여될 수 있다. 상기한 바와 같이, 화합물이나 조성물은 화학요법제일 수 있다. 바람직한 화학요법제는 빈크리스틴, 시스플라틴, 옥사플라틴, 메토트렉세이트, 3'-아지도-3'-데옥시티미딘, 탁산(예를 들어, 파클리탁셀(NJ, 프린스톤, 브리스톨-마이어스 스퀴브 온콜로지, 탁솔(TAXOL)(등록상표)), 및 도세탁셀(프랑스, 안토니, 롱프랑 로라, 탁소티어(TAXOTERE)(등록상표)) 및(또는) 안트라사이클린 항생제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 그러한 화학요법제의 제제와 복용 일정을 결정하는데 제조자에 지시에 따를 수 있거나, 그들은 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 그러한 화학요법의 제제와 복용 일정은 또한 문헌 [Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD(1992)]에 설명되어 있다.
다른 구체예에서, Bv8, EG-VEGF 또는 그들의 배합물은 VEGF나 그의 작용제와 함께 투여된다. VEGF는 VEGF의 수용체 선택적 돌연변이일 수 있다. 일 구체예에서 화합물은 VEGF의 FLT1 수용체 선택적 돌연변이 또는 그의 작용제이다. 다른 구체예에서, 화합물은 VEGF의 KDR 수용체 선택적 돌연변이 또는 그의 작용제이다.
Bv8 및 EG-VEGF의 길항제와 그들의 배합물이 혈액의 비정상적 증식이나 분화에 관련된 혈액학적 장애를 치료하는데 치료적으로 유용할 수 있다. 비정상적 증식이나 분화는 혈액 세포에서 이형성적 변화와 혈액 종양을 일으킬 수 있다. 특정 구체예는 환자에서 백혈병, 골수증식성 장애, 골수이형성 증후군, 림프증식성 장애 및 림프이형성 장애를 치료하는 것을 포함한다. ALL, AML, MPD, CML 및 MDS 세포와 같은, 다양한 백혈병 장애의 세포는 Bv8과 EG-VEGF에 대한 수용체를 발현하는 것으로 밝혀졌다. Bv8와 EG-VEGF의 길항제는 이들 백혈병 세포의 증식을 저해하는데 유용하다.
Bv8과 EG-VEGF는 B 및 T 세포 활성화를 유도한다. 이들 분자의 작용제와 길항제는 면역반응을 조절하는데 치료적으로 유용하다. Bv8, EG-VEGF 또는 그들의 배합물이나 그의 작용제는 B 림프구, CD4+ T 림프구, 및(또는) CD8+ T 림프구의 증식 및(또는) 활성화를 유도하기 위하여 투여될 수 있다. Bv8과 EG-VEGF의 길항제는 B 림프구, CD4+ T 림프구, 및(또는) CD8+ T 림프구의 증식 및(또는) 활성화를 저해하기 위하여 투여될 수 있다.
Bv8 및(또는) EG-VEGF는 CD4+ T 림프구의 증식과 활성화를 촉진하거나 저해할 수 있다. Bv8과 EG-VEGF는 CD4+ T 림프구에서 사이토킨 생산을 유도한다. 일 구체예에서, 사이토킨은 IL-2 및(또는) IFN-γ이다. CD4+ T 림프구에서 IL-2 합성을 선택적으로 유도하는 Bv8 또는 EG-VEGF 작용제는 CD4+ T 세포의 증식을 유도하는데 유용할 수 있다. CD4+ T 림프구에서 IFN-γ 합성을 선택적으로 유도하는 Bv8 또는 EG-VEGF 작용제는 CD4+ T 세포의 증식을 저해하는데 유용할 수 있다.
Bv8 길항제, EG-VEGF 길항제와 그들의 배합물은 활성화된 B 세포, CD4+ T 세포, 및(또는) CD8+ T 세포 수의 감소가 바람직한 자가면역 장애를 치료하는데 유용할 수 있다. 특정 구체예는 자가면역 장애와 관련된 Ⅱ, Ⅲ 및 Ⅳ형 과민 반응을 치료하는데 여기에 제공된 제제와 조성물을 이용하는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 자가면역 장애는 염증성 대장 질환, 크론병, 결장염 또는 이식편 대 숙주 질환이다.
위 섹션 4와 5의 스크리닝 어세이에 의해 동정된 것들과 같은 화합물은 Bv8 및(또는) EG-VEGF 활성이나 발현의 수준을 조절하는데 사용될 수 있다. 구체적으로는, Bv8 작용제 및(또는) EG-VEGF인 것으로 동정되거나 Bv8 및(또는) EG-VEGF의 그의 수용체에 대한 결합을 자극할 수 있는 화합물은 Bv8 및(또는) EG-VEGF 활성의 증가된 수준이 원해지는 치료를 위해 유용할 수 있다. 유사하게, Bv8 유전자 발현, EG-VEGF 유전자 발현, 또는 그들의 결합을 증가시킬 수 있는 것으로 동정된 화합물은 이 유형의 치료에 유용할 수 있다. Bv8 작용제 및(또는) EG-VEGF 작용제와 Bv8 및(또는) EG-VEGF 유전자 발현을 증가시키는 화합물은 호중구, B 림프구, 및(또는) T 림프구 수의 증가가 바람직한 호중구감소증, 림프구감소증과 면역결핍 장애를 치료하는데 유용할 수 있다.
위 섹션 4와 5의 스크리닝 어세이에 의해 동정된 Bv8 길항제 및(또는) EG-VEGF 길항제와 같은 화합물은 여기에 기재된 바와 같이, 각각, Bv8 및(또는) EG-VEGF 활성 또는 발현의 수준을 조절하는데 사용될 수 있다. 위 섹션 4와 5의 스크리닝 어세이에 의해 동정된 Bv8 길항제 및(또는) EG-VEGF 길항제와 같은 화합물은 여기에 기재된 바와 같이 면역 반응을 조절하는데 유용할 수 있다.
골수 세포 증식을 증가시키는 방법과 골수 증식을 저해하는 방법은 생체 내 또는 시험관 내에서 수행될 수 있음이 이해된다. 일부 경우, 특정 세포 형태의 증식을 자극하기 위해 시험관 내에서 세포 샘플에 Bv8, EG-VEGF, 또는 그들의 배합물을 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 그런 다음, Bv8, EG-VEGF, 또는 그들의 배합물로 처리된 샘플은 스크리닝 어세이에 사용되거나 치료를 필요로 하는 개체나 동물 모델로 이식될 수 있다.
치료적으로 사용되는 Bv8 또는 Bv8 작용제 또는 길항제, EG-VEGF 또는 그의 작용제 또는 길항제의 유효량은 예를 들어, 치료 목적, 투여 경로 및 환자의 상태에 의존할 것이다. 따라서, 최적의 치료 효과를 얻기 위하여 치료전문가가 요구되는대로 용량을 적정하고 투여 경로를 변형하는 것이 필요할 것이다. 전형적으로, 임상의는 원하는 효과를 달성하는 용량에 도달할 때까지 Bv8 및(또는) EG-VEGF를 투여할 것이다. 전신 치료를 위한 전형적인 일일 용량은 투여 경로에 따라, 일일 당 약 10 ng/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 포유류 체중 이상, 바람직하게는 약 1 ㎍/㎏/일 내지 10 ㎎/㎏/일에서 변화할 수 있다. 상이한 제제가 상이한 치료 화합물과 상이한 장애에 효과적일 것이며, 예를 들어, 하나의 기관이나 조직을 표적으로 하는 투여는 다른 기관이나 조직에 대한 것과 다른 방식으로의 전달을 필요로 할 수 있음이 예상된다.
다르게는, Bv8 및(또는) EG-VEGF는 효과적이지만 과도하게 독성이지 않은 Bv8 및(또는) EG-VEGF의 수준을 조직에서 확립할 수 있는 용량으로 제제화되고 표적 위치나 조직으로 전달된다. 이 조직내 농도는 가능하면 연속적 주입, 서방출, 국소 적용, Bv8 및(또는) EG-VEGF를 발현하는 세포 이식물, 또는 경험적으로 결정된 빈도의 주사에 의해 유지되어야 한다. 이 치료법의 진행은 통상적인 어세이에 의해 쉽게 모니터링된다.
용량 투여계획은 개개의 상황에 기초하여 결정되어야 한다. 그러나, 바람직한 구체예에서, Bv8 및(또는) EG-VEGF, 또는 그의 작용제 또는 길항제는 매일, 더 바람직하게는 격일로, 더욱 더 바람직하게는 일주일에 적어도 두번 투여된다. 치료는 바람직하게는 6개월, 더 바람직하게는 1개월 및 더욱 더 바람직하게는 적어도 2주간 계속된다. 당업자는 정확한 용량 투여계획은 개개의 상황에 기초하여 치료전문가에 의해 결정되어야만 함을 이해할 것이다.
Bv8 및(또는) EG-VEGF 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 유전자 요법에 사용될 수 있다. 유전자 요법 적용에 있어서, 유전자는 치료적으로 유효한 유전적 산물의 생체 내 합성을 성취하기 위하여, 예를 들어 결함 유전자의 교체를 위해, 세포로 도입된다. "유전자 요법"은 지속적인 효과가 단일의 치료에 의해 달성되는 통상적인 유전자 요법과 치료적으로 유효한 DNA나 mRNA의 1회 또는 반복된 투여를 포함하는 유전자 치료제의 투여 둘다를 포함한다. 안티센스 RNA와 DNA는 생체 내에서 어느 유전자의 발현의 차단제로 사용될 수 있다. 짧은 안티센스 올리고뉴클레오티드가 세포막에 의한 그들의 제한된 획득에 의해 유발되는 낮은 세포내 농도에도 불구하고, 그들이 저해제로서 작용하는 세포로 이입될 수 있음이 이미 밝혀져 있다 [Zamecnik 등, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146]. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 그들의 음으로 하전된 포스포디에스테르 그룹을 비하전된 그룹으로 치환함으로써, 그들의 획득을 증진시키도록 변형될 수 있다.
핵산을 살아있는 세포로 도입하기 위하여 이용가능한 다양한 기술이 있다. 기술은 핵산이 시험관 내에서 배양 세포로, 또는 의도된 숙주의 세포에 생체 내에서 전달되는지에 따라 변화한다. 시험관 내에서 포유류 세포로의 핵산의 전달을 위해 적당한 기술은 리포좀, 전기천공, 마이크로주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전 방법 등의 사용을 포함한다. 현재 바람직한 생체 내 유전자 전달 기술은 바이러스(전형적으로 레트로바이러스) 벡터로의 형질감염과 바이러스 외피 단백질-리포좀 매개된 형질감염[Dzau 등, 1993, Trends in Biotechnology 11, 205-210]을 포함한다. 일부 상황에서 핵산 출처에 세포 표면 막 단백질이나 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등과 같은, 표적 세포를 표적화하는 제제를 제공하는 것이 바람직하다. 리포좀이 사용되는 경우, 엔토시토시스와 관련된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질, 예를 들어, 특정 세포 유형에 대해 지향성인 캡시드 단백질이나 그의 단편, 순환에서 내재화를 수행하는 단백질, 세포 내 배치를 표적화하고 세포 내 반감기를 증진시키는 단백질에 대한 항체가 표적화를 위하고/거나 획득을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 수용체-매개된 엔도시토시스의 기술은 예를 들어, 문헌 [Wu 등, 1987, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432; 및 Wagner 등, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414]에 의해 기재되어 있다. 유전자 마킹과 유전자 요법 프로토콜의 검토를 위해서는 문헌 [Anderson 등, 1992, Science 256, 808-813]을 참조한다.
Bv8 및(또는) EG-VEGF 서열을 코딩하는 펩티드 또는 핵산 서열은 또한 진단방법에 사용될 수 있다. Bv8 및(또는) EG-VEGF의 비정상적 발현은 조혈의 이상, 혈액학적 장애의 발병, 호중구감소증의 발병, 면역결핍 장애의 발병, 또는 자가면역 장애의 발병을 표시할 수 있다. 더욱이, 환자로부터의 샘플은 돌연변이되거나 기능부전의 Bv8 및(또는) EG-VEGF에 대해 분석될 수 있다. 일반적으로, 그러한 방법은 환자로부터의 샘플에서의 Bv8 발현 및(또는) EG-VEGF 발현을 대조의 것과 비교하는 것을 포함한다.
J. 제품
다른 측면에서 본 발명은 질환이나 장애의 치료나 예방을 위해 유용한 물질을 포함하는 제품을 착안한다. 제품은 바람직하게는 용기와 용기 상의 또는 그와 결합된 라벨이나 포장 삽지를 포함한다. 적당한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리나 플라스틱과 같은 다양한 재료로부터 형성될 수 있다. 용기는 Bv8 및(또는) EG-VEGF, 또는 그의 작용제나 길항제를 함유하는 조성물을 보유하고, 라벨이나 포장 삽지는 바람직하게는 Bv8 및(또는) EG-VEGF, 또는 그의 작용제나 길항제를 사용하기 위한 지침을 제공한다. 일 구체예에서, 제품은 Bv8 길항제 및(또는) EG-VEGF 길항제와, 길항제를 백혈병, 골수증식성 장애, 골수이형성 장애 등과 같은 혈액학적 장애를 치료하거나 예방하는데 사용하기 위한 지침을 포함한다. 다른 구체예에서, 제품은 Bv8 및(또는) EG-VEGF와 비정상적 조혈과 관련된 상태를 치료하거나 예방하는데 폴리펩티드를 사용하기 위한 지침을 포함한다. 또다른 구체예에서, 제조물품은 Bv8 및(또는) EG-VEGF와 폴리펩티드를 면역결핍 장애를 치료하는데 사용하기 위한 지침을 포함한다. 포장 삽지는 또한 적절한 용량 투여계획을 표시할 수 있다. 일 구체예에서 삽지는 조성물이 약 0.01 ㎍/㎏ 내지 50 ㎎/㎏의 용량으로 투여되어야 함을 표시할 수 있다.
실시예에서 언급되는 상업적으로 이용가능한 시약은 다르게 표시되지 않으면 제조자의 지시에 따라 사용하였다. ATCC 수탁번호에 의한, 아래 실시예와 명세서 전체에서 동정된 그들 세포의 출처는 VA, 매나싸스, 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션이다.
여기에 인용된 모든 참조문헌은 이로써 참조로 도입된다.
도 1은 인간 Bv8 동족체를 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(서열번호 1)을 보여준다. 각각의 개시 코돈(핵산 위치 11에서 시작하는 "atg")과 중지 코돈(핵산 위치 398에서 시작하는 "taa")의 위치는 굵은 체로 제시되어 있고 밑줄쳐져 있다.
도 2는 서열번호 1의 코딩 서열로부터 유래된 바와 같은 인간 Bv8 동족체 폴리펩티드의 아미노산 서열(서열번호 2)을 보여준다. 추정 신호 서열은 아미노산 1 내지 21을 포함한다.
도 3은 인간 Bv8 동족체의 대체 스플라이싱된 버전을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(서열번호 3)을 보여준다. 각각의 개시 코돈(핵산 위치 11에서 시작하는 "atg")과 중지 코돈(핵산 위치 394에서 시작하는 "taa")의 위치는 굵은 체로 제시되어 있고 밑줄쳐져 있다.
도 4는 서열번호 3의 코딩 서열로부터 유래된 인간 Bv8 동족체 폴리펩티드의 아미노산 서열(서열번호 4)을 보여준다.
도 5는 마우스 Bv8 동족체의 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 5)을 보여준다. 각각의 개시 코돈(핵산 위치 46에서 시작하는 "atg")과 중지 코돈(핵산 위치 382에서 시작하는 "tag")의 위치는 굵은 체로 제공되어 있고 밑줄쳐져 있다.
도 6은 서열번호 5의 코딩 서열로부터 유래된 마우스 Bv8 동족체 폴리펩티드의 아미노산 서열(서열번호 6)을 보여준다.
도 7은 마우스와 인간 Bv8 동족체의 정렬을 보여준다. 잠재적인 헤파린-결합 영역은 박스에 넣어져 있다. 이 영역은 대체 스플라이싱된 전사체에는 존재하지 않는다. 추정 신호 서열은 밑줄쳐져 있다. 마우스와 인간 Bv8 동족체는 대략 96% 동일하다.
도 8은 인간 천연 서열 EG-VEGF를 코딩하는 cDNA의 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 7)을 보여준다.
도 9는 서열번호 7의 코딩 서열로부터 유래된 인간 천연 서열 EG-VEGF 폴리펩티드의 아미노산 서열(서열번호 8)을 보여준다.
도 10은 천연 마우스 EG-VEGF 폴리펩티드(서열번호 10)를 코딩하는 cDNA의 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 9)을 보여준다.
도 11은 인간 천연 EG-VEGF 폴리펩티드(서열번호 8)와 천연 마우스 EG-VEGF 폴리펩티드(서열번호 10)의 정렬을 보여준다.
도 12는 인간 Bv8 동족체(서열번호 4의 아미노산 28-108)와 인간 EG-VEGF(서열번호 8의 아미노산 20-105)의 아미노산 서열의 정렬을 보여준다. 신호 서열은 어느 하나의 분자에 대해 나타내어져 있지 않다. 인간 Bv8은 인간 EG-VEGF와 대략 60% 동일하다.
도 13은 골수, PBL, 및 고환에서 hBv8 신호를 밝히는 RNA 어세이의 도트 블롯 혼성화 결과를 보여준다.
도 14A-D는 호중구 및 관련 침윤 세포에서 Bv8의 제한된 발현을 밝히는 동일계내 혼성화 연구의 결과를 보여주는 사진이다. 도 14A와 B는 편도염에서 Bv8 발현을 보여주는 것으로서, 도 14A는 조직의 헤마톡실린-에오신 염색을 보여주고, 도 14B는 33P-표지된 프로브를 이용한 동일한 조직 샘플에서의 Bv8 발현을 보여준다. 도 14C와 D는 충수염에서 Bv8 발현을 보여주는 것으로서, 도 14C는 조직의 헤마톡실린-에오신 염색을 보여주고 도 14D는 33P-표지된 프로브를 이용한 동일한 조직 샘플에서의 Bv8 발현을 보여준다.
도 15a-d는 다양한 조직과 세포에서 Bv8과 그 수용체의 실시간 정량적 PCR 발현 분석의 결과를 보여주는 그래프이다. 도 15a는 Bv8이 고환 뿐 아니라 골수에서 강력하게 발현됨을 보여주고; 도 15b는 다양한 유형의 조혈 세포에서 Bv8의 차등적 발현을 보여주며; 도 15c와 d는 Bv8/EG-VEGF 수용체-1(도 15c)과 Bv8/EG-VEGF 수용체-2(도 15d)의 조혈 세포 발현을 보여준다.
도 16은 다양한 백혈병 세포주 (A) HL60 CML; (B) K562CML; (C) Hel-92 적백혈병; (D) TF-1 범혈구감소증; (E) KG-1 AML에서 Bv8 및 Bv8/EG-VEGF 수용체-1 및 Bv8/EG-VEGF 수용체-2의 실시간 정량적 PCR 발현 분석의 결과를 보여주는 막대 그래프이다.
도 17a-b는 다양한 성장 인자 존재 하에서, 시험관 내에서 골수 단핵 배양물에서 콜로니 형성을 보여주는 그래프이다. 도 17a는 Bv8(5 nM 및 50 mM 모두에서)이 마우스 골수 단핵 세포에서 콜로니 형성을 증가시킴을 보여준다. 도 17b는 EG-VEGF와 유사한 Bv8이 인간 골수 단핵 세포 배양물에서 어느 유형의 골수 선조 세포의 콜로니 형성을 증가시킴을 보여준다. ct는 실시예 2에 기재된 바와 같은 완전 배지를 가리킨다. 기초는 실시예 2에 기재된 바와 같은 기초 배지를 가리킨다.
도 18은 EG-VEGF와 유사한 Bv8이 생체 내에서 백혈구 계수를 증가시킴을 보여준다. 세포 계수는 Bv8-발현 아데노바이러스 벡터의 생체 내 도입 후 3 일(담회색), 6 일(진회색) 또는 12 일(빈 막대)에 측정되었다.
도 19a-d는 인간 및 마우스 유래된 B 림프구, CD4+ T 림프구, CD8+ T 림프구 및 자연 킬러 세포에서 Bv8/EG-VEGF 수용체-1 및 Bv8/EG-VEGF 수용체-2의 실시간 정량적 PCR 발현 분석의 결과를 보여주는 그래프이다. 도 19a와 b는 인간(도 19a) 및 마우스(도 19b) 유래된 B 림프구, CD4+ T 림프구, CD8+ T 림프구 및 자연 킬러 세포에서 Bv8/EG-VEGF 수용체-1의 상대적 전사체 수준을 보여준다. 도 19c와 d는 인간(도 19c) 및 마우스(도 19d) 유래된 B 림프구, CD4+ T 림프구, CD8+ T 림프구 및 자연 킬러 세포에서 Bv8/EG-VEGF 수용체-2의 상대적 전사체 수준을 보여준다.
도 20은 Bv8과 EG-VEGF가 생체 외 마우스 B 림프구에서 3H-티미딘 도입을 증가시킴을 보여주는 그래프이다.
도 21은 Bv8과 EG-VEGF가 생체 외 마우스 CD4+ T 림프구에서 3H-티미딘 도입을 증가시킴을 보여주는 그래프이다. 삽지는 증가하는 농도의 EG-VEGF 또는 Bv8 존재 하에서 CD4+ T 세포의 3H-티미딘 도입을 보여준다.
도 22a-d는 EG-VEGF가 CD4+ T 세포에서 사이토킨 생산을 유도함을 보주는 그래프이다. EG-VEGF는 CD4+ T 세포에서 IL-2와 IFN-γ의 생산을 유도하였다.
도 23a-e는 Bv8이 5-FU로의 골수억제 후 생체 내에서 조혈 회복을 촉진함을 보여주는 그래프이다. 세포 계수는 Bv8-발현 아데노바이러스 벡터의 생체 내 도입 후 5 일, 11 일 및 14 일에 측정된다. Fltsel은 FLT1 수용체에 선별적으로 결합하는 VEGF 돌연변이를 가리킨다, KDRsel은 KDR 수용체에 선별적으로 결합하는 VEGF 돌연변이를 가리킨다. Bv8은 5-FU로의 골수억제 후 백혈구 수, 과립구 수, 단핵구 수와 혈소판 수를 증가시켰다.
도 24는 5-FU로의 골수억제 후 다양한 성장 인자 존재 하에 시험관 내에서 지라-유래된 수임된 단핵 세포 콜로니 형성을 보여주는 그래프이다. Bv8으로 처리된 동물로부터 분리된 지라 세포는 비-바이러스 또는 LacZ 처리된 대조 마우스 보다 유의하게 높은 수의 골수 선조 세포(CFU-GM)를 함유하였다.
실시예 1
Bv8 과 그 수용체의 발현 분석
Bv8의 발현 양상을 규명하기 위하여, 도트 블랏 분석을 매우 다양한 인간, 마우스 및 랫트 조직으로부터의, 조직과 세포주 패널을 나타내는 RNA 어레이 상에서 수행하였다. 조직/세포 RNA 어레이와 블랏은 클론테크로부터 구입하였다. 이미 기재된 방법[LeCouter 등, 2001, Nature]으로 50 ng의 인간 또는 마우스 Bv8 코딩 서열을 이용하여 cDNA 프로브를 제조하였다. 도 13에 나타낸 바와 같이, Bv8 발현은 말초 혈액 백혈구, 골수 조직 및 이미 특성이 밝혀진 고환[LeCouter 등, 2003, PNAS]에 제한되어 나타났다.
hBV8을 발현하는 세포 타입을 동정하기 위하여, 동일계내 혼성화(ISH)를 증가된 수준의 백혈구가 존재하는 일련의 염증성 조직 표본을 이용하여 수행하였다. 조직을 ISH를 위해 가공하고 [33P]UTP-표지된 RNA 프로브를 표준 방법과 재료를 이용하여 생성하였다. hBv8에 대한 센스 및 안티센스 프로브를 뉴클레오티드 533-1132에 상응하는 cDNA 단편으로부터 합성하였다; mBv8, 뉴클레오티드 886-1611; 및 mR-1, 뉴클레오티드 220-946. 이 프로브는 mR-2와 81.2% 동일하다. 염증성 편도와 염증성 충수 둘다 안에서, Bv8의 강력한 혼성화 신호가 호중구와 관련된 침윤 세포에서 주로 검출되었다 (도 14).
Bv8과 그 수용체의 세포 발현 양상을 확인하기 위하여, 실시간 정량적 PCR 분석[Heid 등, 1996, Genome Res., 6:986-994]을 조혈 세포와 백혈병 세포주에서 수행하였다. RNeasy 키트를 이용하고 제조자의 지시에 따라 총 RNA를 인간과 마우스 조혈 줄기 세포, 계통-수임된 선조 세포나 백혈병 세포주로부터 제조하였다. 인간 세포 제제를 올셀 아이엔씨(CA, 버클리)로부터 구입하고, 계통-수임된 마우스 세포와 줄기 세포(Sca+c-Kit+)를 28 대퇴부 풀로부터 제조하고 이미 기재된 바와 같이 분류하였다 [Gerber, 2002, Nature]. 인간 세포주(HL-60, K562, Hel-92, TF-1 및 KG-1)를 ATCC로부터 입수하였다. 실시간 RT-PCR 분석을 위해, 100 ng의 총 RNA를 사용하였다. 마우스와 인간 샘플 둘다를 위해, 표준 곡선을 고환 RNA를 이용하여 생성하였다.
분석에 사용된 프라이머와 프로브는 아래와 같았다:
Figure 112011055195135-pat00001
Figure 112011055195135-pat00002
도 15a-D에 나타낸 바와 같이, hBv8 mRNA는 태반이 고환에서의 수준의 약 10%를 발현하는 반면, 골수와 고환에서 가장 우세하게 발현된다 (도 15a). 상이한 조혈 세포 타입 중, hBv8 mRNA는 호중구에서 우세하게 발현되고, 단핵구와 골수-단핵 세포에서도 중간으로 발현된다 (도15b). 이에 비해, Bv8/EG-VEGF 수용체 1과 수용체 2는 둘다 CD34+ 세포, AC133 및 BM-MNC에서 높은 수준으로 발현되지만, 호중구나 단핵구에서는 그렇지 않다 (도 15c, d).
hBv8 및 hBv8/EG-VEGF 수용체의 발현을 또한 실시간 정량적 PCR 분석을 이용하여 다양한 백혈병 세포주에서 연구하였다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 어느 백혈병 세포주(HL60 CML, K562 CML 및 KG-1 AML과 같은)는 유의한 수준의 Bv8과 그 수용체 둘다를 발현한다.
실시예 2
콜로니 형성 어세이
마우스와 인간 조혈 세포에서 Bv8의 생물학적 기능을 메틸셀룰로스 콜로니 형성 어세이를 이용하여 연구하였다. 마우스 골수 단핵 세포를 마우스 대퇴골을 20% FCS를 함유하는 3 ㎖의 냉(4 ℃) 이스코브즈(Iscove's) MDM으로 흘러나오게 하여 모았다. 적혈구를 얼음 상에서 pH 7.2 10 mM 트리스 중 10 mM NH4Cl로 10 분간 용균하였다. 남아있는 단핵 세포를 배지에서 세척하고 원심분리로 침전시켰다. 메틸셀룰로스 배양물에 대해, 70,000 세포를 모두 스템셀 테크놀로지 인크.로부터 구입한 배지 제제(메쏘컬트(MethoCult) M3434, SCF, IL-3, IL-6 및 Epo를 함유하는 완전 배지 및 M3334, Epo만을 함유하는 기초 배지) 중 35 ㎜ 격자-플레이트 상에 제조자의 지시에 따라 플레이팅하였다. 마우스 IL-3, IL-6 및 SCF는 스템셀 테크놀로지 인크.로부터 구입하였고 VEGF, EG-VEGF 및 Bv8은 이미 기재된 바와 같이 제넨테크에서 생산되었다 [LeCouter 등, 2001, Nature, 412:877-884; LeCouter 등, 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:2685-2690]. 외생성 인자의 최종 농도는 아래와 같았다: 10 ng/㎖ 마우스 IL-3, 10 ng/㎖ 마우스 IL-6, 50 ng/㎖ 마우스 SCF, 10 ng/㎖ VEGF, 5 또는 50 nM EG-VEGF 또는 50 nM 마우스 Bv8. 37 ℃ 5% CO2의 배양에서 12 일 후, 조혈 콜로니를 광학현미경을 이용하여 삼중 샘플에 대해 계산하였다.
도 17a에 나타낸 바와 같이, 5 nM 또는 50 nM의 Bv8의 첨가가 마우스 BM-MNC에서 형성된 콜로니의 수를 유의하게 증가시켰다.
인간 배양물에 대해, 70,000 골수 유래된 단핵 세포(올셀 아이엔씨)를 표시된 바와 같이, 메쏘컬토 4434 배지, 4330 기초 배지 또는 10 ng/㎖ IL-3, 10 ng/㎖ IL-6, 5 ng/㎖ G-CSF, 5 ng/㎖ GM-CSF, 50nM EG-VEGF 및 50 nM Bv8으로 보충된 기초 배지(모두 스템셀 테크놀로지 아이엔씨로부터)에 플레이팅하였다. 세포 콜로니를 배양물에서 14-16 일 후 현미경적 관찰에 의해 동정하고 계수하였다.
도 17b에 나타낸 바와 같이, Bv8 또는 EG-VEGF는 적어도 어느 유형의 계통-수임된 골수 선조 세포의 콜로니 형성을 증가시켰다. 예를 들어, Bv8 또는 EG-VEGF를 IL-3와 IL-6로 보충된 기초 배지에 가하였을 때, CFU-GM 세포의 콜로니 수가 각각 1.7배와 약 2.2배 증가하였다; CFU-G 세포는 각각 약 1.7배와 약 2.5배; CFU-GEMM 세포는 각각 4배와 약 7배. 콜로니 수 관점에서, 이들 증가는 잘 알려진 과립구 콜로니-자극 인자인 G-CSF로 처리된 그룹과 닮았음이 주목할만한 가치가 있다.
실시예 3
세포 이동 어세이
면역결핍(누드) 마우스에게 꼬리 정맥을 통해 LacZ(5×108 pfu), VEGF(107 pfu), EG-VEGF(5×108 pfu) 또는 Bv8(5×108 pfu)을 코딩하는 아데노바이러스를 주사하였다. 이 투여경로는 분비 인자의 전신적 생산을 얻기 위하여 사용되었다. HSC 이동을 평가하기 위하여, 혈액 샘플을 3, 6, 및 12 일에 안와후방 공동으로부터 모으고, 차등적인 혈액 세포 계수를 코울터 계수기를 이용하여 결정하였다. 6 및 12 일에 부검 기간에, 체중과 기관 중량을 결정하였다. Bv8은 BBC 상피 세포를 증가시켰다. 특히, 2% FCS나 25 nM EG-VEGF 존재 하에서 보다 어느 한 농도의 Bv8 존재 하에서 더 적은 고사 세포가 배양물에서 보였다. Bv8과 VEGF는, 두 화합물의 배합물이 그들 자신의 성장인자나 10% FCS 보다 더 큰 정도로 세포 생존을 증가시켜, 상승 효과를 나타내었다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 아데노바이러스-Bv8 주사는 백혈구 계수를 약 2 내지 약 2.5배 증가시켰다. 한편, 적혈구나 혈소판의 계수는 유의한 변화를 갖지 않았다. 유사한 효과가 EG-VEGF 발현을 아데노바이러스 주사에 의해 도입하였을 때 보여질 수 있다.
실시예 4
림프구에서의 Bv8 / EG - VEGF 수용체 발현
인간과 쥐 림프구에 의한 Bv8/EG-VEGF과 그들 각각의 수용체의 발현을 실시간 정량적 PCR을 이용하여 연구하였다. 급속하게 분리된 인간 및 마우스 정제 세포와 상업적으로 이용가능한 제제(올셀 아이엔씨., CA, 버클리)로부터의 인간 세포를 수용체 발현에 대해 분석하였다. B 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포와 자연 킬러 세포를 상자성(paramagnetic) 비드(밀테나이 바이오텍, CA, 아우번)에 포접된 적절한 항체(각각 항-CD19, 항-CD4, 항-CD8 및 항-CD56 항체)를 이용하여 양성으로 선별하였다. 간략하게, 90 ㎕의 MACS 완충액(0.5% 우혈청 알부민과 2 mM EDTA를 갖는 PBS) 중 107 총 세포와 10 ㎕ 항체-포접된 상자성 비드를 4 ℃에서 15 분간 인큐베이션하였다. 그런 다음 비드를 과량의 MACS 완충액에서 세척하고, 300×g에서 10 분간 원심분리하고, 침전물을 2 ㎖의 MACS 완충액에 재현탁하였다. 그런 다음 세포 현탁액을 MACS 분리기(밀테나이 바이오텍, CA, 아우번)의 자기장 내에 위치된 LS+/VS+ 선별 칼럼(밀테나이 바이오텍, CA, 아우번)에 적용하였다. 칼럼을 3 ㎖의 MACS 완충액으로 2회 헹구고, 분리기로부터 제거하여, 양성 세포 분획을 칼럼에 제공된 플런저를 이용하여 MACS 완충액으로 칼럼으로부터 흘러나오게 하였다.
총 RNA를 RNeasy 키트(퀴아젠, CA, 발렌시아)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 양성으로 선별된 세포로부터 제조하였다. 적어도 두 독립적으로 정제된 인간과 마우스 RNA 분리물을 이들 연구에서 유사한 결과로 분석하였다. 실시간 정량적 PCR 분석을 위해, 50 ng의 총 RNA를 EG-VEGF, Bv8, 및 그들의 동족 수용체 Bv8/EG-VEGF 수용체-1 및 Bv8/EG-VEGF 수용체-2의 발현을 평가한 반응을 위한 주형으로 사용하였다 [LeCouter 등, 2003, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 100:2685-2690]. 마우스와 인간 샘플 모두에 대해, 표준 곡선을 고환 RNA를 이용하여 만들었다.
분석에 사용된 프라이머와 프로브는 아래와 같았다.
Figure 112011055195135-pat00003
도 19a-d에 나타낸 바와 같이, 인간 및 마우스 B 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포와 자연 킬러 세포는 Bv8/EG-VEGF 수용체-1과 수용체-2를 발현한다. 이들 결과는 이들 림프구가 호중구에 의해 일차적으로 발현되는 Bv8 및(또는) EG-VEGF 리간드에 대해 생체 내에서 반응성일 수 있음을 가리킨다.
실시예 5
Bv8 / EG - VEGF 에 의해 촉진되는 B 세포 증식
B 세포의 증식을 촉진하는 Bv8 및(또는) EG-VEGF의 능력을 연구하였다. B 세포를 Balb/C 또는 C57B1/6J 마우스의 지라로부터 분리하였다. 지라를 마우스로부터 수획하고 두 유리 슬라이드 사이에서 기계적으로 분해하였다. 세포 제제를 MACS 완충액(0.5% 우혈청 알부민과 2 mM EDTA를 갖는 PBS)에 현탁한 후 40 ㎛ 나일론 세포 여과기를 통해 통과시켰다. 결과로 생긴 단일 세포 현탁액을 피콜 구배(림프구 M, 세다레인 래보라토리즈 엘티디., 캐나다, 온타리오)에 가하고 2500 rpm에서 15 분간 원심분리하였다. 경계면에 있는 세포를 모으고 MACS 완충액에 3회 세척하였다. 그런 다음 B 세포를 실시예 1에 대해 상기한 바와 같이 CD19 마이크로비드(밀테나이 바이오텍, CA, 아우번)를이용하여 정제된 세포 집단으로부터 양성으로 선별하였다.
증식 어세이를 위해, 웰 당 5×105 세포를 RPMI 어세이 배지(10% 태아 송아지 혈청과 페니실린/스트렙토마이신 용액(라이프 테크놀로지즈, 아이엔씨., MD, 로크빌)으로 보충된 RMPI 1640)에서 평저 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 재조합 Bv8 또는 EG-VEGF를 각 웰에 2 내지 200 nM 범위의 농도로 가하였다. 일부 웰에서, 20 또는 30 ㎍/㎖의 항-마우스 IgM Fab 단편(잭슨 이뮤노리써치, PA, 웨스트 그로브)을 가하여 B 세포의 기초 활성화를 유도하였다. 양성 대조에서, 1 ㎍/㎖ LPS(시그마-알드리치, MO, 세인트 루이스) 또는 10 ㎍/㎖ Bly(제넨테크, 아이엔씨., CA, 사우쓰 샌프란시스코)를 각 웰에 재조합 Bv8과 EG-VEGF 대신 가하였다. 세포를 37 ℃에서 72 시간 인큐베이션한 후 ㎖ 당 1 μ큐리의 3H-티미딘(아머샴 바이오사이언시즈, NJ, 피스카타웨이)으로 펄스하였다. 샘플을 필터메이트 196 수획기(팩커드, MA, 보스톤)를 이용하여 모으고 마이크로플레이트 섬광계수기(팩커드, MA, 보스톤)를 이용하여 분석하였다.
마우스 B 세포의 증식을 3H-티미딘 도입을 평가하여 분석하였다. 도 20에 나타낸 바와 같이, Bv8와 EG-VEGF 각각은 B 세포에서 3H-티미딘 도입을 4 내지 6배 재현가능하게 유도하였다. 이 데이터는 Bv8과 EG-VEGF가 B 림프구에 대해 마이토젠과 생존 인자로 작용함을 가리킨다.
실시예 6
Bv8 / EG - VEGF 에 의해 촉진되는 T 세포 증식
CD4+ T 세포의 증식을 촉진하는 Bv8 및(또는) EG-VEGF의 능력을 연구하였다. CD4+ T 세포를 Balb/C 또는 C57B1/6J 마우스의 지라로부터 분리하였다. 지라를 실시예 5에 대해 상기한 바와 같이 수획하고 기계적으로 분해하였다. 그런 다음 세포 제제를 실시예 5에 대해 상기한 바와 같이 MACS 완충액에 현탁하고 정제하였다. T 세포를 CD4+ T 세포 분리 키트(밀테나이 바이오텍, CA, 아우번)를 이용하여 정제된 세포 집단으로부터 음성으로 선별하였다.
간략하게, 90 ㎕의 MACS 완충액(0.5% 우혈청 알부민과 2 mM EDTA를 갖는 PBS) 중 107 총 세포와 10 ㎕ MACS 항-합텐 마이크로비드를 4 ℃에서 10 분간 인큐베이션하였다. 그런 다음 비드를 과량의 MACS 완충액으로 세척하고, 300×g에서 10 분간 원심분리하고, 침전물을 2 ㎖의 MACS 완충액에 재현탁하였다. 그런 다음 세포 현탁액을 MACS 분리기(밀테나이, CA, 아우번)의 자기장 내에 위치된 LS+/VS+ 선별 칼럼(밀테나이, CA, 아우번)에 적용하였다. 농후화된 CD4+ T 세포 분획을 나타내는, 칼럼으로부터의 용출액을 모았다. 칼럼을 3 ㎖의 MACS 완충액으로 4회 헹구고 농후화된 CD4+ T 세포 분획을 나타내는 용출액을 모았다. 농후화된 CD4+ T 세포 분획을 MACS 완충액에 세척한 후 RPMI 어세이 배지에 재현탁하였다.
음성으로 선별된 CD4+ T 세포를 사용하는 증식 어세이를 실시예 5에 대해 상기한 바와 같이 수행하였다. 재조합 Bv8 또는 EG-VEGF를 각 웰에 2 내지 200 nM 범위의 농도로 각 웰에 가하였다. 일부 웰을 pH 9.0, 탄산염 완충액 중 0.5 ㎍/㎖ 항-마우스 CD3 항체(파밍겐, CA, 라졸라) 및(또는) 1 ㎍/㎖ 항-마우스 CD28 항체(파밍겐, CA, 라졸라)로 37 ℃에서 2 시간 미리 코팅하였다. 항체는 기초 활성화를 포함하여, T 세포의 표면 상의 각각의 수용체와 가교결합하였다. 항-CD28 항체와 배합된 CD3 항체의 첨가가 최적의 활성을 유도하였다.
도 21A와 B에서, 각각의 Bv8과 EG-VEGF가 T 세포로의 3H-티미딘 도입의 5 내지 8배 증가를 유도하였다. 이 데이터는 Bv8과 EG-VEGF가 CD4+ T 세포의 마이토젠과 잠재적인 생존 인자로서 작용함을 가리킨다.
실시예 7
CD4 + T 세포에서 EG - VEGF 의 사이토킨 생산의 유도
CD4+ T 세포에서 사이토킨 생산을 유도하는 EG-VEGF의 능력을 연구하였다. CD4+ T 세포를 실시예 6에 대해 상기한 바와 같이 분리하고 정제하였다. T 세포 증식 어세이를 실시예 6에 대해 상기한 바와 같이 수행하였다. 재조합 EG-VEGF를 2 내지 200 nM 범위의 농도로 각 웰에 가하였다. 웰을 pH 9.0, 탄산염 완충액 중 0.5 ㎍/㎖ 항-마우스 CD3 항체(파밍겐, CA, 라졸라) 및(또는) 1 ㎍/㎖ 항-마우스 CD28 항체(파밍겐, CA, 라졸라)로 37 ℃에서 2 시간 미리 코팅하였다. 항체는 기초 활성화를 포함하여, T 세포의 표면 상의 각각의 수용체와 가교결합하였다. 항-CD28 항체와 배합된 CD3 항체의 첨가가 최적의 활성을 유도하였다. 인큐베이션 단계 전에, 30 ㎕ 수적의 RPMI 어세이 배지를 모으고 동일 부피의 신선한 어세이 배지로 교체하였다. 72 시간 인큐베이션 단계 동안, 30 ㎕ 수적의 RPMI 어세이 배지를 사이킨 생산의 분석을 위해 24 시간에 모으고 동일 부피의 신선한 RPMI 어세이 배지로 교체하였다. 두번째 수적을 3H-티미딘 첨가 직전에 모았다. IL-2와 IFN-γ에 대해 모은 샘플의 분석을 루미넥스 멀티플렉스 어세이 시스템(루미넥스 코퍼레이션, TX, 오스틴)을 이용하여 수행하였다.
CD4+ T 세포로부터의 사이토킨 생산을 EG-VEGF로의 자극 후에 모니터링하였다. 24 시간의 리간드 첨가 내에서, EG-VEGF는 T세포에 의한 IL-2(도 22a 및 b)와 IFN-γ(도 22c 및 d)의 생산을 유도하였다. EG-VEGF로의 72 시간의 인큐베이션 후 T 세포에 의해 생산된 IFN-γ의 농도는 어세이의 검출 한계를 초과하였다. 이들 결과는 Bv8과 EG-VEGF가 CD4+ T 세포 반응의 발생을 조절할 수 있음을 가리킨다.
실시예 8
Bv8 은 5- FU 골수억제 후 회복을 촉진한다
5-FU로의 골수억제 후 조혈 회복을 촉진하는 Bv8의 능력을 연구하였다. 재조합 아데노바이러스를 AdEasy 벡터 시스템(스트라타진, CA, 라졸라)을 이용하여 생산하였다. 마우스 Bv8(서열번호 6) 또는 전장 인간 EG-VEGF(서열번호 8)의 81 아미노산 이소폼을 코딩하는 cDNA를 pCT015 셔틀 벡터의 다중 클로닝 위치로 클로닝하였다. 293 세포에서의 재조합과 잇따른 증폭을 제조자에 의해 권고되는 바와 같이 수행하였다. AAV 정제 키트(바이라푸, CA, 샌디에고)를 이용하여 바이러스를 상등액과 세포 침전물로부터 정제하였다. 바이러스 역가를 대조로서 CMV-LacZ 바이러스를 이용하여 표준 플라크 어세이에 의해 결정하였다. 부가적인 대조는 VEGF의 수용체 선별적 돌연변이를 포함하였다.
대조 누드 마우스에게 꼬리 정맥을 통해 아데노바이러스를 주사하였다. 각 동물에 대한 바이러스 용량은 100 마이크로리터의 인산염 완충 염수 중 108 pfu였다. 혈액 세포 계수를 바이러스 투여 후 12 일간 모니터링하였다. 혈액 샘플을 마우스의 안와 공동으로부터 얻고 셀 다인 자동화 혈액 분석기(애보트 다이아그노스틱스, CA, 산타 클라라)를 이용하여 분석하였다. 차등적 계수를 광학현미경을 이용하여 자동화된 분석과 결합하여 수작업으로 수행하였다.
재조합 아데노바이러스를 골수억제 유도 3 일전에 마우스에게 투여하였다. 각 동물의 바이러스 용량은 100 마이크로리터의 인산염 완충 염수 중 108 pfu였다. 마우스에서 골수억제를 유도하기 위하여, 단일 용량의 125 ㎎/㎏ 5-플루오로우라실(아드루실, NDC 0013-1046-94)을 복막에 주사하였다. 혈액 세포 계수와 차등적 계수를 5-FU의 투여 후 5, 10 및 14 일에 측정하였다. 혈액 샘플을 마우스의 안와 공동 혈액으로부터 얻고 셀 다인 자동화 혈액 분석기(애보트 다이아그노스틱스, CA, 산타 클라라)를 이용하여 분석하였다. 5-FU 투여 후 14 일에, 동물을 희생시키고 지라를 절제하였다. 지라를 칭량하고 실시예 5에 대해 기재된 바와 같이 기계적으로 분리하였다. 지라 세포성을 코울터 계수기를 이용하여 단일 세포 현탁액 중 세포를 계수하여 측정하였다 (베크만 코울터, FL, 미아마). 각각의 지라로부터의 2×104 세포를 마우스 완전 메쏘컬트(스템 셀 테크놀로지, 아이엔씨.) 배지에 삼중으로 플레이트하고 조혈 세포 콜로니 형태를 배양에서 10-14 일 후 측정하였다.
도 23a에 나타낸 바와 같이, Bv8 처리 그룹에서 백혈구 수는 연구 과정에 걸쳐 다른 그룹 보다 유의하게 더 높았다. 이 데이터와 일치하게, 과립구와 단핵구 수도 더 높았다 (약 2.5배)(도 23b 및 c). 지라 세포성은 대조 그룹에서 보다 Bv8 처리된 마우스에서 유의하게 더 높았다 (도 24). 부가적으로, Bv8 지라는 비-바이러스나 LacZ 처리된 마우스에 비해 유의하게 더 높은 수의 선조 세포를 함유하였다 (도 24).
앞서 기재된 명세서는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분하다고 생각된다. 그러나, 여기에 나타내어지고 기재된 것들에 부가하여 본 발명의 다양한 변형이 위 기재로부터 당업자에게 명백하고 첨부된 청구범위의 범위 내에 속할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (22)

  1. 삭제
  2. (a) Bv8을 화합물과 접촉시켜 혼합물을 형성하는 것;
    (b) 상기 혼합물을 림프 계통 선조 세포 또는 그 자손 세포에 투여하는 것; 및
    (c) Bv8 유도된 세포 증식 또는 Bv8 유도된 세포 활성화를 억제하는 화합물을 Bv8 길항제로서 동정하는 것
    을 포함하는 Bv8 길항제 동정 방법.
  3. (a) 림프 계통 선조 세포 또는 그 자손 세포를 Bv8 또는 Bv8을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 것;
    (b) 화합물을 상기 접촉된 세포에 투여하는 것; 및
    (c) Bv8 유도된 세포 증식 또는 Bv8 유도된 세포 활성화를 억제하는 화합물을 Bv8 길항제로서 동정하는 것
    을 포함하는 Bv8 길항제 동정 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제2항 또는 제3항에 있어서, 자손 세포가 림프계 전구 세포 또는 림프구인 방법.
  7. 제2항 또는 제3항에 있어서, 자손 세포가 B 세포 또는 T 세포인 방법.
  8. 제7항에 있어서, T 세포가 CD4+ T 세포인 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
KR1020117016764A 2003-03-12 2004-03-12 조혈을 촉진하기 위한 ｂｖ８ 및(또는) ｅｇ-ｖｅｇｆ의 용도 KR101294959B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US45446203P 2003-03-12 2003-03-12
US60/454,462 2003-03-12
US51139003P 2003-10-14 2003-10-14
US60/511,390 2003-10-14
PCT/US2004/007622 WO2004081229A2 (en) 2003-03-12 2004-03-12 Use of bv8 and/or eg-vegf to promote hematopoiesis

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020057016887A Division KR101118340B1 (ko) 2003-03-12 2004-03-12 조혈을 촉진하기 위한 ｂｖ８ 및(또는) ｅｇ-ｖｅｇｆ의용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110097965A KR20110097965A (ko) 2011-08-31
KR101294959B1 true KR101294959B1 (ko) 2013-08-09

Family

ID=32994559

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117016764A KR101294959B1 (ko) 2003-03-12 2004-03-12 조혈을 촉진하기 위한 ｂｖ８ 및(또는) ｅｇ-ｖｅｇｆ의 용도
KR1020057016887A KR101118340B1 (ko) 2003-03-12 2004-03-12 조혈을 촉진하기 위한 ｂｖ８ 및(또는) ｅｇ-ｖｅｇｆ의용도

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020057016887A KR101118340B1 (ko) 2003-03-12 2004-03-12 조혈을 촉진하기 위한 ｂｖ８ 및(또는) ｅｇ-ｖｅｇｆ의용도

Country Status (11)

Country Link
US (3) US7632810B2 (ko)
EP (2) EP2526960A1 (ko)
JP (3) JP4912144B2 (ko)
KR (2) KR101294959B1 (ko)
CN (2) CN102225194B (ko)
AU (2) AU2004219592C1 (ko)
CA (1) CA2515288A1 (ko)
HK (2) HK1085388A1 (ko)
MX (1) MXPA05009743A (ko)
NZ (1) NZ541480A (ko)
WO (1) WO2004081229A2 (ko)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020172678A1 (en) * 2000-06-23 2002-11-21 Napoleone Ferrara EG-VEGF nucleic acids and polypeptides and methods of use
US6485938B1 (en) 1999-11-16 2002-11-26 Zymogenetics, Inc. Nucleic acid molecules that encodes human Zven1
ES2386346T3 (es) 2001-08-29 2012-08-17 Genentech, Inc. Ácidos nucleicos y polipéptidos Bv8 con actividad mitógena
WO2004032850A2 (en) 2002-10-07 2004-04-22 Zymogenetics, Inc. Uses of human zven antagonists
EP2526960A1 (en) 2003-03-12 2012-11-28 Genentech, Inc. Use of BV8 and/or EG-VEGF to promote hematopoiesis
WO2007033140A2 (en) 2005-09-13 2007-03-22 Zymogenetics, Inc. Prok2 antagonists and methods of use
US20080050814A1 (en) * 2006-06-05 2008-02-28 Cryo-Cell International, Inc. Procurement, isolation and cryopreservation of fetal placental cells
WO2007146106A2 (en) * 2006-06-05 2007-12-21 Cryo- Cell International, Inc. Procurement, isolation and cryopreservation of maternal placental cells
MX2009005398A (es) * 2006-11-21 2009-08-20 Kalobios Pharmaceuticals Inc Metodos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias cronicas usando antagonista de gm-csf.
CL2008002782A1 (es) * 2007-09-21 2009-07-31 Genentech Inc Anticuerpo anti-bv8 neutralizante; composicion que lo comprende; y su uso para tratar tumores en humanos previamente tratados con un antagonista del factor de crecimiento endotelial vascular.
US20110190380A1 (en) * 2008-10-23 2011-08-04 Elena Feinstein Methods for delivery of sirna to bone marrow cells and uses thereof
RU2673156C2 (ru) * 2012-11-05 2018-11-22 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Генетически модифицированные не относящиеся к человеческому роду животные и способы их применения
US11071754B2 (en) * 2013-03-11 2021-07-27 Case Western Reserve University Method of generating tumor-specific T cells
RU2662944C1 (ru) * 2017-02-17 2018-07-31 Общество с ограниченной ответственностью "Группа развития "АПЕКС" Средство для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена prok 1 и/или уменьшением количества белка прокинетицина 1 на основе генно-терапевтических субстанций с геном prok 1, способ получения и использования

Family Cites Families (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4109496A (en) 1977-12-20 1978-08-29 Norris Industries Trapped key mechanism
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
ZA811368B (en) 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
ATE12348T1 (de) 1980-11-10 1985-04-15 Gersonde Klaus Prof Dr Verfahren zur herstellung von lipid-vesikeln durch ultraschallbehandlung, anwendung des verfahrens und vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens.
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
JPS58118008A (ja) 1982-01-06 1983-07-13 Nec Corp デ−タ処理装置
EP0088046B1 (de) 1982-02-17 1987-12-09 Ciba-Geigy Ag Lipide in wässriger Phase
DE3218121A1 (de) 1982-05-14 1983-11-17 Leskovar, Peter, Dr.-Ing., 8000 München Arzneimittel zur tumorbehandlung
US4943529A (en) 1982-05-19 1990-07-24 Gist-Brocades Nv Kluyveromyces as a host strain
EP0102324A3 (de) 1982-07-29 1984-11-07 Ciba-Geigy Ag Lipide und Tenside in wässriger Phase
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
AU2353384A (en) 1983-01-19 1984-07-26 Genentech Inc. Amplification in eukaryotic host cells
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US4643980A (en) * 1983-06-13 1987-02-17 Info-Chem, Inc. Glutaraldehyde indicator
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
AU3145184A (en) 1983-08-16 1985-02-21 Zymogenetics Inc. High expression of foreign genes in schizosaccharomyces pombe
DE3486459D1 (de) 1983-09-26 1997-12-11 Udo Dr Med Ehrenfeld Mittel und Erzeugnis für die Diagnose und Therapie von Tumoren sowie zur Behandlung von Schwächen der zelligen und humoralen Immunabwehr
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
EP0143949B1 (en) 1983-11-01 1988-10-12 TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION Pharmaceutical composition containing urokinase
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
AU597574B2 (en) 1986-03-07 1990-06-07 Massachusetts Institute Of Technology Method for enhancing glycoprotein stability
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4946783A (en) 1987-01-30 1990-08-07 President And Fellows Of Harvard College Periplasmic protease mutants of Escherichia coli
US5010182A (en) 1987-07-28 1991-04-23 Chiron Corporation DNA constructs containing a Kluyveromyces alpha factor leader sequence for directing secretion of heterologous polypeptides
IL87737A (en) 1987-09-11 1993-08-18 Genentech Inc Method for culturing polypeptide factor dependent vertebrate recombinant cells
GB8724885D0 (en) 1987-10-23 1987-11-25 Binns M M Fowlpox virus promotors
EP0321196A3 (en) 1987-12-18 1990-07-18 Mycogen Plant Science, Inc. 780 t-dna gene transcription activator
JPH04501201A (ja) 1987-12-21 1992-03-05 ジ・アップジョン・カンパニー 発芽植物種子類のアグロバクテリウム媒介形質転換
AU4005289A (en) 1988-08-25 1990-03-01 Smithkline Beecham Corporation Recombinant saccharomyces
ATE135397T1 (de) 1988-09-23 1996-03-15 Cetus Oncology Corp Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte
US5240848A (en) 1988-11-21 1993-08-31 Monsanto Company Dna sequences encoding human vascular permeability factor having 189 amino acids
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
DE68927344T2 (de) 1989-04-28 1997-02-20 Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh Hefezellen der Gattung-Schwanniomyces
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
US5332671A (en) 1989-05-12 1994-07-26 Genetech, Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor and DNA encoding same
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
ATE144793T1 (de) 1989-06-29 1996-11-15 Medarex Inc Bispezifische reagenzien für die aids-therapie
DK168302B1 (da) 1989-06-29 1994-03-07 Danisco Fremgangsmåde til indføring af molekyler, især genetisk materiale i planteceller
FR2649120B1 (fr) 1989-06-30 1994-01-28 Cayla Nouvelle souche et ses mutants de champignons filamenteux, procede de production de proteines recombinantes a l'aide de ladite souche et souches et proteines obtenues selon ce procede
DK0502036T3 (da) 1989-11-22 1996-05-06 Genentech Inc Latens-associeret peptid og anvendelser herfor
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5206161A (en) 1991-02-01 1993-04-27 Genentech, Inc. Human plasma carboxypeptidase B
WO1992020373A1 (en) 1991-05-14 1992-11-26 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
DE69229477T2 (de) 1991-09-23 1999-12-09 Cambridge Antibody Technology Ltd., Melbourn Methoden zur Herstellung humanisierter Antikörper
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
ES2241710T3 (es) 1991-11-25 2005-11-01 Enzon, Inc. Procedimiento para producir proteinas multivalentes de union a antigeno.
EP0656064B1 (en) 1992-08-17 1997-03-05 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5561053A (en) 1994-08-05 1996-10-01 Genentech, Inc. Method for selecting high-expressing host cells
WO2000053753A2 (en) 1999-03-08 2000-09-14 Genentech, Inc. Promotion or inhibition of angiogenesis and cardiovascularization
WO2000073454A1 (en) 1999-06-02 2000-12-07 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AUPN263895A0 (en) * 1995-04-28 1995-05-25 Bradley, Christopher Mark Apparatus and method for producing bone graft material
US6020473A (en) 1995-08-25 2000-02-01 Genentech, Inc. Nucleic acids encoding variants of vascular endothelial cell growth factor
US6013780A (en) 1996-09-06 2000-01-11 Technion Research & Development Co. Ltd. VEGF145 expression vectors
WO2002008284A2 (en) 2000-07-20 2002-01-31 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogenesis
CA2192004C (en) * 1996-12-04 2006-05-02 Chris Parkinson Diagnostic test for bacterial vaginosis
CA2296287A1 (en) 1997-08-01 1999-02-11 Genset 5' ests for secreted proteins expressed in prostate
IL139686A0 (en) 1998-06-02 2002-02-10 Genentech Inc Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20020172678A1 (en) * 2000-06-23 2002-11-21 Napoleone Ferrara EG-VEGF nucleic acids and polypeptides and methods of use
US7264801B2 (en) * 1998-08-11 2007-09-04 Genentech, Inc. EG-VEGF nucleic acids and polypeptides and method of use
US20030027998A1 (en) * 1998-10-30 2003-02-06 Holtzman Douglas A. Novel genes encoding proteins having prognostic, diagnostic, preventive, therapeutic, and other uses
WO2000052022A1 (en) 1999-03-01 2000-09-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Secreted proteins and nucleic acids encoding them
KR100634926B1 (ko) 1999-04-16 2006-10-17 제넨테크, 인크. 혈관 내피 세포 성장 인자 변이체 및 그의 용도
CA2373231A1 (en) 1999-05-19 2000-11-23 Incyte Genomics, Inc. Extracellular signaling molecules
AU3246100A (en) 1999-06-02 2000-12-28 Genentech Inc. Methods and compositions for inhibiting neoplastic cell growth
EP1230362A2 (en) 1999-11-16 2002-08-14 ZymoGenetics, Inc. Human zven proteins
US6485938B1 (en) * 1999-11-16 2002-11-26 Zymogenetics, Inc. Nucleic acid molecules that encodes human Zven1
EP1690872A3 (en) 1999-12-01 2006-08-23 Genentech, Inc. Composition and methods for the diagnosis of tumours
AU6531101A (en) 2000-06-02 2001-12-17 Genentech Inc Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
CA2412211A1 (en) 2000-06-23 2002-01-03 Genetech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogenesis
EP1354040A2 (en) 2000-07-20 2003-10-22 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
MXPA03003902A (es) * 2000-11-03 2004-04-02 Univ California Polipeptidos de proquineticina, composiciones relacionadas y metodos.
US20030171306A1 (en) * 2001-06-04 2003-09-11 Davis Stephen Thomas Cancer treatment method
ES2386346T3 (es) * 2001-08-29 2012-08-17 Genentech, Inc. Ácidos nucleicos y polipéptidos Bv8 con actividad mitógena
WO2004032850A2 (en) * 2002-10-07 2004-04-22 Zymogenetics, Inc. Uses of human zven antagonists
EP2526960A1 (en) 2003-03-12 2012-11-28 Genentech, Inc. Use of BV8 and/or EG-VEGF to promote hematopoiesis
CL2008002782A1 (es) 2007-09-21 2009-07-31 Genentech Inc Anticuerpo anti-bv8 neutralizante; composicion que lo comprende; y su uso para tratar tumores en humanos previamente tratados con un antagonista del factor de crecimiento endotelial vascular.

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
nature medicine vol.8,no.9, 2002, p913-917 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2010238554A1 (en) 2010-11-18
AU2004219592B2 (en) 2010-07-29
CA2515288A1 (en) 2004-09-23
AU2004219592A1 (en) 2004-09-23
US7632810B2 (en) 2009-12-15
US20060217301A1 (en) 2006-09-28
CN102225194A (zh) 2011-10-26
WO2004081229A2 (en) 2004-09-23
KR20050114229A (ko) 2005-12-05
HK1200715A1 (en) 2015-08-14
WO2004081229A3 (en) 2004-10-28
JP2011004745A (ja) 2011-01-13
US8858936B2 (en) 2014-10-14
KR20110097965A (ko) 2011-08-31
EP2526960A1 (en) 2012-11-28
CN102225194B (zh) 2014-07-16
KR101118340B1 (ko) 2012-04-12
HK1085388A1 (en) 2006-08-25
US20130195885A1 (en) 2013-08-01
EP1615659B1 (en) 2014-04-16
JP2007520998A (ja) 2007-08-02
AU2004219592C1 (en) 2011-02-24
CN104001158A (zh) 2014-08-27
EP1615659A2 (en) 2006-01-18
JP2015119708A (ja) 2015-07-02
JP4912144B2 (ja) 2012-04-11
US20100310555A1 (en) 2010-12-09
MXPA05009743A (es) 2006-03-09
NZ541480A (en) 2008-03-28
US8257702B2 (en) 2012-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8858936B2 (en) Compositions with hematopoietic and immune activity
US7811984B2 (en) BV8 nucleic acids and polypeptides with mitogenic activity
KR20080067719A (ko) Ｇｄｎｆ 리간드 족의 구성원인 아르테민의 신규 용도
WO2004081229A9 (en) Use of bv8 and/or eg-vegf to promote hematopoiesis

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160629

Year of fee payment: 4

LAPS Lapse due to unpaid annual fee