DE3640550C2

DE3640550C2 -

Info

Publication number: DE3640550C2
Application number: DE3640550A
Authority: DE
Inventors: Seishi Takahashi; Kazushi Morimoto; Nobumi Yokohama Kanagawa Jp Kusuhara; Noboru Mobara Chiba Jp Tomioka; Tadashi Makino; Fumio Yokohama Kanagawa Jp Omae
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1985-11-27
Filing date: 1986-11-27
Publication date: 1989-02-02
Anticipated expiration: 2006-11-28
Also published as: EP0225177A2; NO864742D0; AU6560886A; NO175434C; JPS62126978A; AU602664B2; FI864777A; DE3640550C3; FI101401B1; ZA868813B; FI864777A0; FI101401B; EP0225177A3; EP0225177B1; DK571986D0; DK571986A; NO175434B; DE3640550A1; JP2581668B2

Description

Die Erfindung betrifft die im Anspruch 1 angegebene DNA-Sequenz. Anspruch 2 betrifft die Verwendung einer rekombinanten DNA, die sie zusammen mit einem Vektor umfaßt, zur Herstellung von menschlichem Gewebe-Plasminogen-Aktivator.

Bei der Behandlung von Thrombose werden gegenwärtig Urokinase und Streptokinase aus Gründen der Bequemlichkeit verwendet. Diese werfen jedoch Probleme bezüglich Blutung und Antigenwirkung auf, und sie besitzen eine schwache Affinität für Fibrin.

Weiterhin wird Urokinase hauptsächlich durch Extrahieren von Roh-Urokinase aus menschlichem Urin und nachfolgende Reinigung hergestellt. Dieses Herstellungsverfahren hat den Nachteil, daß es schwierig ist, eine konstante Versorgung mit menschlichem Urin sicherzustellen, und daß die Verfahrensschritte nicht hygienisch sind.

Dementsprechend sind verschiedene Versuche unternommen worden, um Ersatz-Arzneimittel zu entwickeln. In der gegenwärtigen Situation kann jedoch kein thrombolytisches Mittel die vorstehend beschriebenen Probleme lösen und ist vom Standpunkt der Sicherheit und der Massenherstellung für praktische Zwecke verfügbar.

Als Ersatz für herkömmliche thrombolytische Mittel wie Urokinase und dergleichen fand Gewebe-Plasminogenaktivator (hier im folgenden als t-PA von englisch: "tissue plasminogen activator" bezeichnet) Beachtung, der eine bedeutende Rolle bei der in vivo Fibrinolysereaktion spielt und eine hohe Affinität für Fibrin besitzt.

Es gibt eine Anzahl gut bekannter Verfahren für die Herstellung von t-PA. Sie umfassen ein Zellkulturverfahren, bei dem Bowes-Melanom verwendet wird, das von malignen Melanosarkom-Zellen, einer Art Krebs, abgeleitet wird, und ein Verfahren, das die folgenden Verfahrensschritte umfaßt: Isolieren eines DNA-Fragmentes, das die DNA-Sequenzkodierung für t-PA von Bowes-Melanom enthält, Inkorporieren dieses DNA-Fragmentes in einen Expressionsvektor, um eine rekombinante DNA zu bilden, Transformieren von Wirtszellen mit dieser rekombinanten DNA und Kultivieren oder Züchten der transformierten Wirtszellen, um sie zum Erzeugen von t-PA zu bringen.

Der Mechanismus der Karzinogenese ist jedoch vom wissenschaftlichen Standpunkt aus noch nicht genügend geklärt worden, deshalb ist auch noch keine endgültige Antwort über die Sicherheit der Verfahrensschritte in den vorstehend beschriebenen Verfahren, bei denen Krebszellen verwendet werden, und in bezug auf die Sicherheit des entstehenden t-PA für die Verwendung als ein Arzneimittel gegeben worden. Aus diesen Gründen ist noch eine sorgfältige und völlige Prüfung erforderlich, wenn die vorstehend beschriebenen Verfahren praktisch durchgeführt werden und wenn der dadurch erzeugte t-PA verwendet wird.

Zur Klärung der vorstehend beschriebenen Probleme, die beim Stand der Technik auftreten, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung ausgedehnte Untersuchungen durchgeführt, wobei normalen menschlichen Zellen besondere Aufmerksamkeit gewidmet wurde, die das mit der Anwendung von von Krebs abgeleiteten Zellinien wie Bowes-Melanom verbundene Risiko eliminieren können, und haben nach normalen menschlichen Zellen gesucht, die verwendet werden können, um die DNA-Kodierung für t-PA zu erhalten.

Als ein Ergebnis haben die Erfindung gefunden, daß eine Zellinie, die aus menschlichen normalen Zellen besteht, die in hohem Maße produktionsfähig für t-PA sind, von menschlichen normalen Zellen abgeleitet werden kann und daß entsprechend einem Verfahren für rekombinante DNA unter Verwendung dieser Zellinie eine neue DNA-Sequenz aufgebaut werden kann, die die DNA-Sequenzkodierung für t-PA enthält, daß diese DNA-Sequenz in einen replizierenden Vektor inkorporiert werden kann, der die Expression von t-PA gestattet, und die so gebildete rekombinante DNA verwendet werden kann, um transformierte Wirtszellen zu erhalten, die bei der Herstellung von t-PA brauchbar sind. Die vorliegende Erfindung beruht auf der Grundlage dieser Ergebnisse.

Dementsprechend ist es Aufgabe der Erfindung, eine DNA-Sequenz zu schaffen, die die DNA-Sequenzkodierung für Gewebe-Plasminogen- Aktivator enthält und mit der die vorstehend beschriebenen Probleme von herkömmlichen Arzneimitteln wie Urokinase und dergleichen gelöst werden können und außerdem auch das Risiko vermieden werden kann, das mit der Anwendung von von Krebszellen (z. B. Bowes Melanom) abgeleiteten Zellen verbunden ist, und die bei der Großherstellung von Gewebe-Plasminogen-Aktivator einsetzbar ist.

Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung durch eine DNA-Sequenz gelöst, wie sie im Anspruch 1 angegeben ist.

Menschlicher Gewebe-Plasminogen-Aktivator wird gemäß der Erfindung hergestellt, indem eine rekombinante DNA, die einen Vektor mit einem Abschnitt, der zur Selbst-Replikation in Säuretierzellen fähig ist, und die damit verbundene DNA-Sequenz gemäß der Erfindung umfaßt, verwendet wird und die Säugetierzellen gezüchtet werden.

Die Erfindung wird im folgenden näher beschrieben, wobei auch auf die beigefügten Zeichnungen bezug genommen wird.

In den Zeichnungen zeigt

Fig. 1 eine DNA-Basensequenz, die die DNA-Basensequenzkodierung für menschlichen Gewebe-Plasminogenaktivator enthält, der durch menschliche normale Zellen in Übereinstimmung mit der Erfindung hergestellt worden ist, und zeigt, daß diese DNA-Basensequenz eine 5′ nicht-translatierte Region, eine Signalsequenz, die DNA-Sequenzkodierung für t-PA und eine 3′ nicht-translatierte Region enthält,

Fig. 2 ein Diagramm, das das Verfahren zur Herstellung des Plasmids pMT-1 darstellt, das in Beispiel 2 beschrieben ist,

Fig. 3 ein Diagramm, das das Verfahren zur Herstellung des Plasmids phT-1 darstellt, das in Beispiel 3 beschrieben ist,

Fig. 4 ein Diagramm, das das Verfahren zur Herstellung des Plasmids pIg-1 darstellt, das in Beispiel 4 beschrieben ist,

Fig. 5 ein Diagramm, das das Verfahren zur Herstellung des Plasmids pSV-2 darstellt, das in Beispiel 5 beschrieben ist,

Fig. 6 ein Diagramm, das das Verfahren zur Herstellung des t-PA Expressions-Plasmids darstellt, das in Beispiel 6 beschrieben ist, wobei der Promotor eines menschlichen Cytomegalo-Virus verwendet wird, und

Fig. 7 ein Diagramm, das das Verfahren zur Herstellung des t-PA Expressions-Plasmids darstellt, das in Beispiel 7 beschrieben ist, wobei der LTR von Ha-MSV als Promotor verwendet wird.

Es folgt eine Beschreibung der Erfindung und die Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine DNA-Sequenz, die die DNA-Sequenzkodierung für menschlichen t-PA enthält, die durch menschliche normale Zellen hergestellt worden ist, durch Verwendung von irgendwelchen verschiedenartigen von menschlichen normalen Zellen abgeleiteten Zellstämmen, die aus menschlichen normalen Zellen bestehen und die Fähigkeit haben, t-PA zu erzeugen, erhalten werden.

Derartige Zellstämme können durch Züchten verschiedener Typen menschlicher normaler Zellen (vorzugsweise menschlicher fötaler epidermaler Zellen, fötaler Lungenzellen, fötaler Nierenzellen und dergleichen) und nachfolgendes Screening derselben auf die Fähigkeit, t-PA zu erzeugen, erhalten werden. Unter anderem können vorzugsweise Zellstämme verwendet werden, die größere Fähigkeit haben, t-PA zu erzeugen, und aus menschlichen normalen Diploid- Zellen mit der Diploid-Nummer (2n = 46) von Chromosomen bestehen und eine endliche Anzahl von Subkulturen durchlaufen haben.

Ein beispielhaftes Screening-Verfahren ist das Verfahren von A. Granelli-Piperno und E. Reich (J. Exp. Med., 148, 223, 1978), wie es in den Beispielen verwendet wird, die später angegeben werden. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die fibrinolytische Aktivität auf einer Fibrinplatte als ein Index für die Fähigkeit, t-PA zu erzeugen, verwendet wird.

Um die DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung von einem Zellstamm mit der Fähigkeit, t-PA zu erzeugen, zu erhalten, können beliebige verschiedenartige genetische Verfahrenstechniken angewendet werden. Das Verfahren, das von den Erfindern geschaffen worden ist und das später noch spezieller beschrieben wird, ist jedoch besonders gut brauchbar.

Reinigung und Größenfraktionierung von mRNA

Die gesamte RNA wird zuerst von Zellen mit der Fähigkeit, menschlichen t-PA zu erzeugen, extrahiert. Dann wird Oligo(dT)-Zellulose verwendet, um Poly(A) plus mRNA von der gesamten RNA abzutrennen und zu gewinnen. Die entstehende mRNA wird der Agarose-Gel-Elektrophorese unterworfen und dadurch entsprechend der Größe fraktioniert. Die entstehenden Fraktionen werden getrennt in Oocyten von Xenopus laevis mikroinjiziert, die getrennt in Barthschem Medium kultiviert worden sind (J. B. Gurdon, The Control of Gene Expression in Animal Development, Oxford University Press, 1974).

Nach Abschluß der Kultivierung wird die Fraktion, die die gewünschte mRNA mit einem Anteil entsprechend der DNA- Sequenzkodierung für menschlichen t-PA enthält, durch Prüfen der menschlichen t-PA-Aktivität jedes einzelnen Kulturmediums nach dem vorstehend genannten Verfahren unter Verwendung einer Fibrinplatte selektiert. Das Vorhandensein der gewünschten mRNA in dieser Fraktion kann zum Beispiel durch die Tatsache bestätigt werden, daß, wenn sowohl eine Probe des Kulturmediums von dem Oocyt, in dem die Fraktion eingeführt worden ist, als auch ein anti-humanes t-PA-Serum auf eine Fibrinplatte gebracht werden, die Fibrinolyse-Reaktion auf der Fibrinplatte durch das anti-humane t-PA-Serum gehemmt wird.

Dann wird die gewünschte DNA-Sequenz erhalten, indem die ausgewählte Fraktion, die die mRNA mit einem Abschnitt entsprechend der gewünschten DNA-Sequenzkodierung für t-PA enthält, verwendet wird. Zu diesem Zweck wird die vorgenannte Fraktion dazu verwendet, um cDNAs entsprechend der mRNAs, die in der Fraktion vorhanden sind, zu synthetisieren, und die cDNA, die die gewünschte DNA- Sequenz enthält, wird aus jenen cDNAs mit Hilfe einer DNA-Probe ausgewählt. Dieses Verfahren wird nachfolgend näher beschrieben.

Aufbau einer cDNA-Bibliothek, die das t-PA-Gen enthält

Die mRNA-Fraktion, die Human-t-PA-Aktivität zeigt und auf die vorstehend beschriebene Weise ausgewählt worden ist, wird zum Synthetisieren von cDNAs entsprechend den in der Fraktion vorhandenen mRNAs verwendet. Dies kann beispielsweise durch das Verfahren von Gubler und Hoffman durchgeführt werden (U. Gubler und B. J. Hoffman, Gene, 25, 263, 1983). Die so erhaltenen cDNAs werden in das Plasmid pUC13 eingesetzt.

Dann wird das Gemisch von dem Plasmid pUC13, in das verschiedene cDNAs eingeschoben sind, in E. coli HB101 (ATCC 33694) eingeführt. Auf diese Weise werden ampicillinresistente Kolonien erhalten.

Als das Plasmid (Vektor), in das cDNAs eingeschoben werden, und das Wirtsbakterium, in das das Plasmid eingeführt wird, können irgendein anderes Plasmid (Vektor) und Wirtsbakterium entsprechend den Notwendigkeiten gewählt werden, vorausgesetzt, daß sie einen gewünschten cDNA-Klon liefern können, der die DNA-Sequenzkodierung für humanes t-PA enthält.

Von jeder der so erhaltenen Kolonien wird ein Teil der Zellen zu einem Whatman 541 Filter übergeführt. Dann wird nach dem Verfahren von Gergen et al. (J. P. Gergen et al., Nucleic Acids Res., 7, 2115, 1979) die von jeder einzelnen Kolonie abgeleitete DNA auf dem Filter fixiert, um eine cDNA-Bibliothek zu erhalten.

Herstellung einer DNA-Probe

Zuerst werden die vorher ausgewählten menschlichen normalen Zellen, die t-PA erzeugen können, in Kultur gezüchtet. Dann wird nach dem Verfahren, das in der DE-PS 33 90 272 beschrieben ist, der so hergestellte menschliche t-PA aus dem Kulturmedium gewonnen und für die Verwendung bei der Zubereitung einer DNA-Probe gereinigt.

Um eine Probe herzustellen, werden dann Partial-Aminosäure- Sequenzen dieses humanen t-PA bestimmt, indem das humane t-PA-Protein mit Trypsin teilweise hydrolysiert wird, die Hydrolysate abgetrennt und gereinigt werden und ihre Aminosäure-Sequenzen von dem Aminoende analysiert werden. Danach wird die optimale Region für die Zubereitung einer Probe aus den Aminosäure-Sequenzen ausgewählt, die in der vorstehend beschriebenen Weise bestimmt wurden. Als die optimale Region haben die Erfinder den Sequenzabschnitt von Tyr-Cys-Trp-Cys-Asn ausgewählt.

Als nächstes werden acht Typen von 14-Nukleotid-Oligomeren (14 mere), die komplementär zu der DNA-Sequenzkodierung für die obige Aminosäure-Sequenz sind, d. h. 5′-dTT

nach dem Phosphotriester-Verfahren in fester Phase synthetisiert (Crea et al., Nucleic Acids Res., 8, 2331, 1980).

Isolation und Identifikation von bakteriellen Klonen, die die t-PA cDNA-Sequenz enthalten

Ein Gemisch von den acht Typen von 14-Nukleotid-Oligomeren (14 mere), die auf die vorstehend beschriebene Weise erhalten worden sind, wird mit T4-Polynukleotidkinase behandelt, um ihre 5′-Enden mit ³²P zu markieren. Dieses Gemisch, das als eine Probe dient, wird zu der vorher präparierten cDNA-Bibliothek hybridisiert.

Dann wird nach dem Verfahren von Birnboim und Doly (Nucleic Acid Res., 7, 1513, 1979) Plasmid-DNA von den Kolonien isoliert, die die Quellen von DNA bilden, das eine positive Hybridisierungsreaktion zeigt. Die Basensequenz von seiner cDNA-Insertion wird durch das Verfahren von Maxam und Gilbert bestimmt (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 560, 1977). Das Vorhandensein der gewünschten DNA-Sequenz in der cDNA-Insertion von dieser isolierten Plasmid-DNA kann bestätigt werden, indem die Aminosäure-Sequenz, die von der oben bestimmten Basen-Sequenz der cDNA-Insertion abgeleitet worden ist, mit der vorher bestimmten Aminosäure- Sequenz von gereinigtem humanen t-PA verglichen wird.

Die auf die vorstehend beschriebene Weise isolierte und identifizierte cDNA enthält die DNA-Sequenzkodierung für menschlichen t-PA und ist zum ersten Mal von den Erfindern aufgebaut worden. Die Schaffung einer solchen neuen DNA- Sequenz durch die Erfinder hat es ermöglicht, menschlichen t-PA durch Verwendung von Wirtszellen, die mit einer rekombinanten DNA transformiert worden sind, die die DNA- Sequenzkodierung für menschlichen t-PA enthält, herzustellen, und dies kann die vorstehend beschriebenen verschiedenartigen Probleme des Standes der Technik lösen. Dieses Verfahren zum Herstellen von menschlichem t-PA wird im folgenden näher beschrieben.

Auf der Basis der folgenden Ergebnisse, die von den Erfindern gefunden worden sind, umfassen die Wirtszellen, die bei dem vorliegenden Verfahren zum Herstellen von menschlichem t-PA verwendet werden, vorzugsweise Säuretierzellen.

Spezieller gesagt, die gesamte Aminosäure-Sequenz von menschlichem t-PA, die von menschlichen normalen Zellen herrührt, wurde von der vorher bestimmten DNA-Sequenz von menschlichem t-PA abgeleitet. Durch Prüfen dieser Aminosäure- Sequenz ist angenommen worden, daß das menschliche t-PA-Molekül vier Plätze hat, an die Zuckerketten hinzugegeben werden können. Tatsächlich wird das Molekulargewicht von menschlichem t-PA auf etwa 50 000 reduziert, wenn ein Zellstamm, der menschlichen t-PA erzeugen kann, in Anwesenheit von Tunicamycin gezüchtet wird, welches eine antibiotische Substanz ist, die den Zusatz von Zuckerketten verhindert. Dementsprechend nimmt man an, daß Zucker etwa 30% des Molekulargewichtes ausmacht. Unter der Annahme, daß die Zugabe von Zuckerketten an dem stabilen in vivo Funktionieren des Enzyms teilnehmen kann und das Enzym, das keine Zuckerketten hat, Antigenwirkung in vivo zeigen kann, haben die Erfindung gefolgert, daß es besser wäre zu bewirken, daß das geklonte menschliche t-PA- Gen in Säugetierzellen exprimiert wird und dadurch die natürliche Form von menschlichem t-PA mit hinzugefügten Zuckerketten produziert. Aus diesem Grund wird es als wünschenswert angesehen, Säugetierzellen als Wirte zu verwenden.

Die als Wirte verwendeten Säugetierzellen können aus einer Vielzahl von gegenwärtig verfügbaren geschaffenen Zellinien von Säugetier-Ursprung ausgewählt werden.

Bevorzugte Beispiele dafür umfassen Mäuse-L-Zellen; Thymidin-Kinase-negative L-Zellen; dihydrofolatreduktasearme Eierstockzellen von chinesischem Hamster; Mäuse C127I-Zellen (ATCC CRL1616); Mäuse NIH3T3-Zellen (ATCC CRL1658); Mäuse FM3A-Zellen; menschliche HeLa-Zellen (ATCC CCL2); COS1-Zellen vom afrikanischen Grünaffen (ATCC CCL1650); verschiedene Typen von Mäuse- und menschlichen Myelom- Zellen wie Mäuse P3/NS1/1-Ag4-1 (NS-1) Zellen (ATCC TIB18), Mäuse P3X63Ag8-Zellen (ATCC TIB9) und Mäuse J558-Zellen (ATCC TIB6) und dergleichen. Es wird bemerkt, daß die vorstehend aufgeführten Zellen nur als Beispiele angegeben werden und daß andere Typen von Säugetierzellen auch verwendet werden können.

Als der Expressionsvektor, in den die DNA-Sequenzkodierung für menschlichen t-PA inkorporiert wird, kann irgendein Vektor verwendet werden, der sich innerhalb der verwendeten Wirtszellen replizieren kann und die Wirtszellen so transformieren kann, daß die Expession der Gen-Kodierung für menschlichen t-PA möglich wird. Unter anderem können vorzugsweise Vektoren verwendet werden, die eine Promotor-Region, eine Ribosomen-Bindungsstelle, eine Terminations-Sequenz, eine polyadenylierte Stelle, einen Replikationsursprung und ein Gen, das als ein selektierbarer Marker dient, wenn Wirtszellen mit dem Vektor transfektiert werden, enthalten.

Als die Promotor-Region und die Ribosomen-Bindungsstelle, die in den vorstehend aufgeführten Expressions-Vektoren vorhanden sind, können allgemein solche verwendet werden, die von Viren vom Säugetier-Ursprung abgeleitet sind. Brauchbar sind z. B. die Promotor-Regionen und Ribosomen- Bindungsstellen, die von Papova-Viren, Adeno-Viren, Retroviren, menschlichen Cytomegalo-Viren und dergleichen eingenommen werden. Weiterhin kann auch die Promotor-Region und die Ribosomen-Bindungsstelle, die in einem "stromaufwärts" liegenden Abschnitt von Genen, die von Säugetierzellen abgeleitet sind, verwendet werden. In diesem Falle ist es vorteilhaft, die Promotor- Region eines stark exprimierten Gens zu verwenden, weil im allgemeinen angenommen iwrd, daß solch ein Promotor auch als ein starker Promotor für andere Gene dient. Es scheint zum Beispiel vorteilhaft zu sein, die Promotor- Regionen und Ribosomen-Bindungsstellen von Mäuse-, menschlichen und anderen Säugetier-Genen für Metallothionein, Immunglobuline, Insulin, Albumin und dergleichen zu verwenden.

Als die Terminationssequenz und polyadenylierte Stelle können in gleicher Weise solche verwendet werden, die von Viren und verschiedenen Genen abgeleitet sind.

Was den Replikationsursprung anbelangt, so kann der Vektor so aufgebaut sein, daß er einen exogenen Ursprung enthält, der von einem Virus abgeleitet sein kann, wie vorstehend beschrieben wurde, insbesondere von Rinder- Papillom-Virus (hier im folgenden als BPV bezeichnet) oder von Simian-Virus 40 (hier im folgenden als SV 40 bezeichnet). Alternativ dazu kann der gewünschte Expressions- Vektor als ein Fragment in ein Chromosom der Wirtszelle inkorporiert werden, um so den Replikationsmechanismus des Chromosoms auszunutzen.

Das Gen, das als ein selektierbarer Marker dient, wenn Wirtszellen mit dem Vektor transfektiert werden, ist nicht immer erforderlich. Seine Anwesenheit ist jedoch insofern vorteilhaft, als die transformierten Zellen schnell und genau selektiert werden können.

Die für diesen Zweck brauchbaren Gene umfassen z. B. das Thymidin-Kinase-Gen (TK) von Herpes-Simplex-Virus (HSV) und das Dihydrofolat-Reduktase-Gen (DHFR) von Mäusen. In diesen Fällen sollte ein Thymidin-Kinase-negativer (tk^-) Stamm oder ein Dihydrofolat-Reduktase-negativer (dhfr^-) Stamm als Wirtszellen verwendet werden.

Zusätzlich können auch das Xanthin-guanin-phosphoribosyl- transferase-Gen (Ecogpt) von Escherichia coli, das Resistenz gegen Mycophenolsäure in Säugetierzellen zeigt, und das Neomycin-Resistenz-Gen (neo), das von Transposon 5 abgeleitet ist, das Resistenz gegen die antibiotische Substanz G418 in Säugetierzellen zeigt, verwendet werden.

Der Expressions-Vektor, der vorzugsweise die oben beschriebenen verschiedenen Regionen enthält, kann nach an sich gut bekannten genetischen Rekombinationstechniken aufgebaut werden.

Um Wirtszellen mit dem Vektor der vorliegenden Erfindung, der die DNA-Sequenzkodierung für menschlichen t-PA enthält, zu transfektieren, kann irgendeine von verschiedenen Verfahren verwendet werden, wie z. B. Behandlung mit Calciumphosphat (F. L. Graham und A. J. Van der Eb, Virology, 52, 546, 1978), Injektion in den Nucleus oder Kern (A. Graessman et al., Methods in Enzymology, 65, 816, 1980, Academic Press, New York), Protoplastfusion (W. Schaffner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 2163, 1980), Einführen durch einen elektrischen Schock (H. Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 7161, 1984), Behandlung mit DEAE-Dextran (P. Sheldrick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70, 3621, 1973) und dergleichen.

Nachdem die Transfektion nach irgendeinem der vorstehend angegebenen Verfahren durchgeführt worden ist, werden die entstehenden transformierten Zellen getrennt gezüchtet. Ihre Erzeugung von menschlichem t-PA, der von menschlichen normalen Zellen herrührt, kann durch Prüfen der Human-t-PA-Aktivität der überstehenden Flüssigkeit derartiger Kulturen bestätigt werden.

Auf diese Weise kann menschlicher t-PA, der von menschlichen normalen Zellen herrührt, auf Massenbasis produziert werden, indem die transformierten Zellen gezüchtet werden und dadurch bewirkt wird, daß sie menschlichen t-PA in das Kulturmedium sekretieren. Einige typische Ausführungsformen dieses Verfahrens zur Erzeugung von menschlichem t-PA werden in den folgenden Beispielen spezieller beschrieben.

Beispiel 1 (Konstruktion einer DNA-Sequenz, die die DNA- Sequenzkodierung für menschlichen t-PA enthält) 1. Screening von menschlichen normalen Zellen, die menschlichen t-PA produzieren können

Die verschiedenen Typen von menschlichen normalen Zellen, die in Tabelle 1 zusammengestellt sind, wurden einem Screening-Verfahren unterworfen. Die von den Erfindern geschaffenen Zellinien wurden folgendermaßen erhalten: Ein Stück des Quellen- oder Ursprungsgewebes wurde mit einer Schere oder dergleichen zerkleinert und dann mit Trypsin, Kollagenase, Dispase und dergleichen verdaut, um dispergierte und freigesetzte Zellen zu erhalten. Diese Zellen wurden in einem Kulturmedium suspendiert und plattiert. Dann wurden Klone, die aktives Wachstum zeigten, isoliert und wiederholt in Sekundär-Kulturen gezüchtet. Schließlich wurden Stämme, die stabil in Sekundär-Kulturen gezüchtet werden konnten, selektiert und als normale Zellinien für Screening-Zwecke verwendet. Die Zellinien, die dem Screening unterworfen werden sollten, wurden gezüchtet, bis der Zusammenfließzustand erreicht worden war. Unter Verwendung von 15 µl der überstehenden Flüssigkeit jeder Kultur wurde die Human-t- PA-Aktivität der überstehenden Flüssigkeit geprüft. Bei dieser Prüfung wurden 15 µl der überstehenden Flüssigkeit auf eine Fibrinplatte gegeben, die nach dem vorstehend genannten Verfahren von Granelli-Piperno und Reich präpariert worden war. Nachdem diese Fibrinplatte bei 37°C 16 Stunden stehengelassen worden war, wurde die entstandene Lösungszone gemessen. Zur gleichen Zeit wurden eine Probe von der überstehenden Flüssigkeit, gemischt mit einem Anti-Urokinase-Serum und eine Probe der überstehenden Flüssigkeit, gemischt mit einem Anti-Human- t-PA-Serum, ebenfalls hergestellt. Die von diesen Proben erzeugten Lösungszonen wurden auch gemessen und mit der Lösungszone, die von der kein Anti-Serum enthaltenden Probe erzeugt worden war, verglichen.

Es wurde eine Standard- oder Referenzkurve aufgebaut, indem gereinigte Uronkinase als eine Referenz verwendet wurde und die Lösungszonen gemessen wurden, die durch ihre verdünnten Lösungen erzeugt wurden. Unter Verwendung dieser Referenzkurve wurde die fibrinolytische Aktivität in Werten internationaler Urokinase-Einheiten ausgedrückt. Einige der dem Screening unterworfenen Zellen und ihre Human-t-PA-Aktivitäten und Urokinase-Aktivitäten sind in Tabelle 1 angegeben. Es wurde so gefunden, daß die Zellinie MTC017 Human-t-PA in relativ großen Mengen erzeugt und sekretiert, so daß diese Zellinie als das Quellen- oder Ursprungsmaterial für die Isolation des Human-t-PA-Gens ausgewählt wurde. Dieser Zellstamm war von menschlichem fötalem Epithel abgeleitet und bestand aus normalen Diploid-Zellen mit der Diploid-Nummer (2n = 46) von Chromosomen und hatte etwa 80 Zweitkulturen oder Subkulturen durchlaufen.

Tabelle I

Screening von menschlichen normalen Zellen, die Human- t-PA erzeugen können

2. Reinigung und Größenfraktionierung von mRNA

Unter Verwendung von "Eagle's minimal essential Medium", das 10% FCS enthielt, wurde die Zellinie MTC017 in großen Mengen gezüchtet, um 5×10⁸ Zellen aufzusammeln. Die gewonnenen Zellen wurden mit 200 ml phosphat-gepufferter Saline (PBS) gewaschen und dann in 20 ml einer 10 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,6), die 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂ und 3 mM Dithiothreitol enthielt, zurück suspendiert. Nachdem die Zellen durch Zugabe von Nonidet P-40 zu der Suspension (um so eine Endkonzentration von 0,5% zu erhalten) lysiert oder aufgelöst worden waren, wurde die entstandene Lösung zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit, die die gesamte RNA enthielt, weiter durch Extraktion mit Phenol-Chloroform gereinigt.

Dann wurde Natriumacetat zu der wäßrigen Phase hinzugegeben, so daß eine Konzentration von 0,3 M entstand, und die ganze RNA wurde durch Zugabe von 2 Volumen Äthanol zu der Lösung ausgefällt. Nach dem Verfahren von T. Maniatis et al. (T. Maniatis et al., Molecular Cloning, 197-198, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982) wurde der so gebildete Niederschlag mit Oligo(dT)-Zellulose behandelt, um mRNA von der gesamten RNA zu trennen. Auf die oben beschriebene Weise wurden 4 bis 5 mg gesamte RNA und 100 bis 150 µg Poly(A) plus mRNA von 5×10⁸ gezüchteten Zellern erhalten.

Nach dem Verfahren von T. Maniatis et al. (T. Maniatis et al., Molecular Cloning, 204-205, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982) wurde das auf die oben beschriebene Weise erhaltene Poly(A) plus mRNA in niedrig-schmelzendem Agarosegel fraktioniert. Diese Fraktionierung wurde durchgeführt, indem das Poly(A) plus mRNA mit Methylquecksilberhydroxid behandelt wurde und dann der Elektrophorese in einer flachen Platte Gel unterworfen wurde, das 1,5% niedrig-schmelzende Agarose, 50 mM Borsäure, 5 mM Natriumborat und 10 mM Natriumsulfat enthielt. Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Gel in eine 0,1 M Dithiothreitol-Lösung über 30 Minuten eingetaucht und dann entsprechend der Größe des Molekulargewichtes geschnitten. Vier Volumen 0,5 M Ammoniumacetat wurden zu jeder Scheibe hinzugegeben und sie wurde auf 65°C erhitzt, bis das Gel gelöst war. Danach wurde die entstandene Lösung wiederholt mit Phenol und mit Chloroform extrahiert, um die Agarose-Bestandteile zu entfernen. Schließlich wurde die mRNA-Fraktion durch Ausfällen mit Äthanol zurückgewonnen.

Dann wurden nach dem oben angegebenen Verfahren von J. B. Gurdon 50 ng von jeder mRNA-Fraktion in ein Oocyt von Xenopus laevis mikroinjiziert. Die Oocyten, in die mRNA eingeführt worden war, wurden in Barthsches Medium gebracht und 24 Stunden bei 20°C stehengelassen. Daraufhin wurde eine Probe von jedem Medium auf eine Fibrinplatte gebracht, die durch das vorgenannte Verfahren von Granelli- Piperno und Reich präpariert worden war. Diese Fibrinplatte wurde 16 Stunden bei 37°C inkubiert, und die entstandene Lösungszone wurde gemessen. Gleichzeitig wurde auch eine Probe des Mediums, gemischt mit einem Anti- Human-t-PA-Serum gebrütet. Auf diese Weise wurde die mRNA-Fraktion selektiert, die die größte Lösungszone lieferte und eine Unterdrückung der fibrinolytischen Aktivität in Anwesenheit des Anti-Human-t-PA-Serums durchlief.

3. Konstruktion einer cDNA-Bibliothek, die das t-PA-Gen enthält

Nach dem vorstehend genannten Verfahren von Gubler und Hoffman wurden 5 µg der auf die vorstehend beschriebene Weise selektierten Fraktion, die die mRNA-Kodierung für t-PA enthielt, verwendet, um doppel-strängige cDNAs herzustellen. Nachdem Deoxy(C)-Reste an jede cDNA gebunden worden waren, wurden die entstandenen cDNAs mit 1 µg des Plasmids pUC13 mit an der PstI-Stelle gebundenen Deoxy(G)- Resten getempert. Unter Verwendung der getemperten Mischung wurde E. coli HB101 (ATCC 33694) transformiert, wodurch 5000 ampicillinresistente Kolonien erhalten wurden.

Nach dem Verfahren von Gergen et al. wurde ein Anteil jeder Kolonie zu einem Whatman 541-Filter übertragen. Danach wurde die DNA jeder Kolonie an dem Filter fixiert, indem sie einer Reihe von Behandlungen, einschließlich Alkalibehandlung, Neutralisation, Waschen und Trocknen, unterworfen wurde.

4. Herstellung einer DNA-Probe

Menschlicher t-PA wurde von menschlichem normalen Zellstamm MTC017 nach dem Verfahren isoliert, das in der DE-PS 33 90 272 beschrieben ist und eine Kombination von Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, Gelfiltrierung und dergleichen umfaßt. Zum Zweck der Herstellung einer DNA-Probe wurden partielle Aminosäure-Sequenzen von menschlichen t-PA auf die folgende Weise bestimmt.

1 mg gereinigter menschlicher t-PA wurde in 3 ml 0,1 M Ammoniumbicarbonat (pH 7,5) gelöst. Zu der entstandenen Lösung wurde Trypsin (behandelt mit L-1-Tosylamido-2- phenyläthylchlormethylketon (TPCK)) in einem molaren Verhältnis von 100 000 : 1 hinzugegeben. Dann wurde partielle Hydrolyse bei Raumtemperatur 2 Stunden durchgeführt. Die Reaktion wurde abgestoppt, indem Diisopropylfluorphosphat (DFP) in einer Menge hinzugegeben wurde, die gleich der bis 10 000mal so groß wie die Anzahl der Mole von hinzugegebenem Trypsin war. Das Reaktionsprodukt wurde gegen 5 mM Ameisensäure dialysiert und dann gefriergetrocknet. Dann wurde das gefriergetrocknete Protein in 5 ml einer Lösung gelöst, die 0,56 M Tris-HCl (pH 8,6), 8 M Harnstoff und 5 mM EDTA enthielt. Zu der entstandenen Lösung wurden 0,1 ml β-Mercaptoäthanol hinzugegeben, um die Disulfid-Bindungen zu reduzieren. Die Reaktion wurde 2 Stunden bei 45°C unter einer Atmosphäre von Stickstoff durchgeführt. Dann wurden die reduzierten Disulfid-Bindungen durch Zugabe von 1,0 ml einer Lösung, die 1,4 M Jodessigsäure und 1 N NaOH enthielt, carboxymethyliert. Nachdem die Reaktionsmischung 20 Minuten bei Raumtemperatur gestanden hatte, wurde sie bei Raumtemperatur gegen Wasser, das 0,01% Tween 80 enthielt, dialysiert und dann gefriergetrocknet.

Das gefriergetrocknete carboxymethylierte Protein wurde in 5 ml einer 0,1 M Ammoniumbicarbonat-Pufferlösung (pH 7,2) gelöst, die 0,1 M Ammoniumthiocyanat enthielt. Die entstandene Lösung wurde durch eine "Red-Sepharose"- Säule geleitet, die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war. Nachdem die Säule mit der gleichen Pufferlösung gewaschen worden war, wurde das adsorbierte Protein eluiert, indem die Konzentration von Ammoniumthiocyanat linear auf 1,0 M erhöht wurde. Als Ergebnis wurden Protein- Peaks (Protein-Spitzen) in der nicht adsorbierten Fraktion und in der adsorbierten Fraktion erhalten. Bei Analyse durch SDS-Acrylamid-Gel-Elektrophorese lieferte jeder Protein-Peak ein einziges Proteinband mit einem Molekulargewicht von etwa 35 000.

Jeder der Protein-Peaks wurde aufgesammelt, gegen 0,1 M Ammoniumbicarbonat (pH 7,5) dialysiert und dann gefriergetrocknet.

Die Aminosäure-Sequenzen des gereinigten menschlichen t-PA, der von einer Kultur vom Zellstamm MTC017 erhalten worden war und die Proteine, die davon auf die vorstehend beschriebene Weise erhalten worden waren, wurden mittels eines Gasphasen-Protein-Sequenzers bestimmt.

Für den gereinigten menschlichen t-PA wurde die Sequenz von N-Terminal 38-Aminosäuren-Resten bestimmt, und es wurde gefunden, daß sie Gly-Ala-Arg-Ser-Tyr-Gln- in der N-Terminal- Region einschließen. Die Aminosäure-Sequenz der nicht adsorbierten Proteinfraktion begann mit Ile-Lys-Gly-Gly- leu-, und die adsorbierte Proteinfraktion hatte die Aminosäure- Sequenz von Ser-Asn-Arg-Val-Glu-Tyr-Cys-Trp-Cys-Asn- Ser-Gly-Arg-. Es wurde gefunden, daß das N-Terminal-Ser von dieser adsorbierten Proteinfraktion bei Stellung 31, gezählt von dem N-Terminus des gereinigten menschlichen t-PA, gelegen war.

Als Ergebnis wurde die Aminosäure-Sequenz von Tyr-Cys-Trp- Cys-Asn als die optimale Region für die Zubereitung einer Probe ausgewählt.

Auf diese Weise wurden acht Typen von 14-Nucleotid-Oligomeren (14 mere), die komplementär zu der DNA-Sequenzkodierung für die obige Aminosäure-Sequenz waren, d. h.

nach dem bereits genannten Phosphotriester-Verfahren in fester Phase chemisch synthetisiert.

5. Isolierung und Identifizierung von bakteriellen Klonen, die die Human-t-PA-cDNA-Sequenz enthielten

Ein Gemisch der acht Typen von 14-Nucleotid-Oligomeren (14-meren), die auf die vorstehend beschriebene Weise synthetisiert worden waren, wurde mit T4-Polynucleotid- Kinase behandelt, um ihr 5′-Ende mit ³²P zu markieren. Andererseits wurden die vorher präparierten Filter, die eine cDNA-Bibliothek enthielten, in eine Lösung gebracht, die 6 × SSC (1 × SSC; 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumsuccinat, pH 7,0), 10 × Denhardt'sche Lösung (1 × Denhardt'sche Lösung; 0,02% Rinder-Serum-Albumin (Fraktion V), 0,02% Polyvinylpyrrolidon (3,6 × 10³ - 4 × 10⁴ Dalton), 0,02% Ficoll (4 × 10⁵ Dalton), 0,1% SDS und 100 µg/ml ultraschallbehandelte Lachs-Sperma-DNA enthielt, und bei Raumtemperatur 2 Stunden vorhybridisiert. Dann wurden sie in eine Lösung gebracht, die 6 × SSC, 10 × Denhard'sche Lösung und eine markierte Probe mit einer Konzentration von 5 × 10⁶ Zählimpulsen/min/ml oder Counts/min/ml enthielt, und bei Raumtemperatur über Nacht hybridisiert. Danach wurden die Filter dreimal bei Raumtemperatur 5 Minuten in einer Lösung, die 6 × SSC und 0,1% SDS enthielt, gewaschen und dann dreimal 5 Minuten bei 30°C in der gleichen Lösung gewaschen.

Nachdem die gewaschenen Filter luftgetrocknet worden waren, wurden sie dazu verwendet, Kodak XR-5 Röntgenfilm 16 Stunden mit Hilfe von Dupont Kronex Lightening Plus Verstärkerfolien zu belichten.

Von 14 Kolonien, die eine positive Hybridisierungsreaktion zeigten, wurde das Plasmid DNA gemäß einer Modifikation des vorstehend erwähnten Verfahrens von Birnboim und Doly isoliert. Unter Verwendung dieser Plasmid DNA wurde die Basen-Sequenz ihrer cDNA-Insertion gemäß dem vorstehend erwähnten Verfahren von Maxam und Gilbert bestimmt.

Durch Vergleich der Aminosäure-Sequenz, die von der DNA- Basen-Sequenz von Klon T-1 (der einer der 14 Kolonien war) bestimmt worden war, mit der vorstehend bestimmten Aminosäure-Sequenz von gereinigtem menschlichem t-PA wurde gefunden, daß dieser Klon die cDNA-Kodierung für menschlichen t-PA enthielt. Fig. 1 stellt die Basen-Sequenz dieser cDNA-Insertion dar. Diese Insertion besaß eine Größe von 2170 bp und enthielt einen offenen Leserahmen oder "reading frame" von 1686 bp, eine 5′ nicht-translatierte Region von 76 bp und eine 3′ nicht-translatierte Region von 408 bp. Als diese DNA-Sequenz mit der DNA- Sequenzkodierung für menschlichen t-PA, der von Bowes- Melanom isoliert worden war, verglichen wurde, waren diese an drei Stellen oder Punkten in der 5′ nicht-translatierten Region, an einer Stelle oder einem Punkt in der Region der Kodierung für menschlichen t-PA und an fünf Stellen oder Punkten in der 3′ nicht-translatierten Region voneinander verschieden.

Beispiel 2 (Expression des t-PA-Gens in Säugetierzellen durch Verwendung des Mäuse-Metallothionein (MMT)-Promotors)

Entsprechend dem Verfahren, das in Fig. 2 dargestellt ist, wurde eine Anzahl Plasmide, die in die Säugetierzellen eingeführt werden sollten, auf folgende Weise hergestellt.

1. Herstellung des Plasmids pMT-1

Zuerst wurde das Plasmid pT-1 von dem in Beispiel 1 erhaltenen Klon T-1 isoliert. Um den Doppelstrang von GC-Basenpaaren, der während der cDNA-Synthese gebildet worden war, zu entfernen, wurden 25 µg von dem PT-1 mit HindIII gespleißt und dann mit 0,4U von Bal31 2 Stunden bei 37°C behandelt. Unter Verwendung von T4 DNA- Ligase wurde ein HindIII-Linker an das entstehende DNA- Fragment gebunden, woraufhin Spleißen mit HindIII und BamHI folgte. Von dem entstandenen DNA- Fragment-Gemisch wurde ein DNA-Fragment, das das t-PA- Gen enthielt, abgetrennt und durch Polyacrylamid-Gel- Elektrophorese gewonnen.

Andererseits wurde pUC13 mit HindIII und BamHI gespleißt. Von dem entstandenen DNA-Fragment-Gemisch wurde ein DNA- Fragment von etwa 2700 bp abgetrennt und durch niedrigschmelzende Agarose-Gel-Elektrophorese gewonnen.

Unter Verwendung von T4 DNA-Ligase wurden das oben angegebene DNA-Fragment (von etwa 2700 bp) und das vorher hergestellte DNA-Fragment, das das t-PA-Gen enthielt, miteinander verbunden. Die so gebildete rekombinante DNA wurde dazu verwendet, E. coli HB101 auf die gleiche Weise, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, zu transformieren.

Es wurden Plasmide von zehn der entstandenen ampicillinresistenten Kolonien hergestellt und dann dazu verwendet, um die DNA-Basensequenz der 5′ nicht-translatierten Region des t-PA-Gens zu bestimmen.

Das von dem Klon T-406 hergestellte Plasmid pT406, wobei dieser einer der vorstehend genannten zehn Kolonien war, enthielt eine 5′ nicht-translatierte Region von 39 bp. 20 µg pT406 wurden mit HindIII und BamHI gespleißt. Von der entstandenen DNA-Fragment-Mischung wurde ein DNA-Fragment von etwa 2200 bp, das das t-PA-Gen enthielt, abgetrennt und durch Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese gewonnen.

Andererseits wurden 10 µg des Plasmids pSV2-dhfr (ATCC 37 146) mit HindIII und BamHI gespleißt. Von der entstandenen DNA-Fragment-Mischung wurde ein DNA-Fragment von etwa 4200 bp, das von dem dhfr-Gen befreit war, abgetrennt und durch niedrigschmelzende Agarose-Gel-Elektrophorese gewonnen.

Unter Verwendung von T4 DNA-Ligase wurden 0,2 µg des vorstehenden DNA-Fragments (von etwa 4200 bp) und 0,1 µg des vorher isolierten Fragmentes von etwa 2200 bp, das das menschliche t-PA-Gen enthielt, miteinander verbunden. Die so gebildete rekombinante DNA wurde dazu verwendet, E. coli HB101 auf die gleiche Weise, wie es vorstehend beschrieben wurde, zu transformieren und dadurch ampicillinresistente Kolonien zu erhalten. Kleine Mengen von Plasmiden wurden von diesen Kolonien isoliert und mit Restriktions- Enzymen behandelt. Auf der Basis ihrer Spleißmuster wurden die Klone mit dem gewünschten Plasmid pMT-1 identifiziert, und das Plasmid pMT-1 wurde davon isoliert.

2. Herstellung des Plasmids pMT-2

10 µg des Plasmids pMT-1, das gemäß dem vorhergehenden Abschnitt 1 hergestellt worden war, wurden mit HindIII und BamHI gespleißt. Von der entstandenen DNA-Fragment-Mischung wurde ein DNA-Fragment von etwa 3 kbp, das das t-PA-Gen und das Poly(A)-Signal von SV40 enthielt, abgetrennt und durch niedrigschmelzende Agarose-Gel-Elektrophorese gewonnen.

Andererseits wurde ein DNA-Fragment, das pML (M. Lusky und M. Botchan, Nature, 293, 79, 1981) und den MMT-Promotor enthielt, von dem Plasmid pdBPV-MMTneo (342-12) (M. Law et al., Molecular and Cellular Biology, 3, 2110, 1983) hergestellt. Spezieller gesagt, es wurden 10 µg pdBPV- MMTneo (342-12) mit BglII gespleißt. Nach dieser Behandlung wurden 5 Einheiten des Klenow-Fragmentes von DNA- Polymerase I und 0,1 mM jeweils von dATP, dCTP, dGTP und TTp zu dem entstandenen DNA-Fragment-Gemisch hinzugegeben. Dieses Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei 37°C inkubiert, um die kohäsiven Enden, die durch Spleißen mit BglII erzeugt worden waren, in stumpfe Enden überzuführen. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsprodukt durch Extraktion mit Phenol, Behandlung mit Chloroform und Ausfällung mit Äthanol gereinigt. Unter Verwendung von T4 DNA-Ligase wurden 0,05 µg eines HindIII-Linkers mit dem gereinigten Produkt verbunden, woraufhin Spleißen mit BamHI und dann partielles Spleißen mit HindIII folgten. Von dem entstandenen DNA-Fragment-Gemisch wurde ein Fragment, das pML und den MMT-Promotor enthielt, abgetrennt und durch niedrigschmelzende Agarose-Gel-Elektrophorese gewonnen.

Unter Verwendung von T4 DNA-Ligase wurden 0,05 µg des obigen DNA-Fragmentes und 0,04 µg des vorher hergestellten DNA-Fragmentes von 3 kbp, das das menschliche t-PA-Gen und das Poly(A)-Signal von SV40 enthielt, miteinander verbunden. Die so gebildete rekombinante DNA wurde dazu verwendet, E. coli HB101 auf die gleiche Weise, wie es vorstehend beschrieben wurde, zu transformieren und dadurch ampicillinresistente Kolonien zu erhalten.

Es wurden kleine Mengen Plasmide von diesen Kolonien isoliert und mit Restriktions-Enzymen behandelt. Auf der Basis ihrer Spleiß-Muster wurde das Klon mit dem gewünschten Plasmid pMT-2 identifiziert, und das Plasmid pMT-2 wurde davon isoliert.

3. Herstellung des Plasmids pMT-3 (nachgereicht)

Das nach der Beschreibung in dem vorstehenden Abschnitt 2 hergestellte Plasmid pMT-2 wurde mit BamHI gespleißt. Das entstandene DNA-Fragment wurde mit Kalb-intestinal-alkalischer Phosphatase (im folgenden als CIP bezeichnet) behandelt, um Dephosphorylierung des 5′-Endes (5′-Terminus) zu bewirken.

Andererseits wurde pdBPV-1 (142-6) (ATCC 37 134) mit BamHI gespleißt. Von dem entstandenen DNA-Fragment-Gemisch wurde ein BPV_100TDNA-Fragment von etwa 8 kbp abgetrennt und durch niedrigschmelzende Agarose-Gel-Elektrophorese gewonnen.

Unter Verwendung von T4 DNA-Ligase wurden 0,05 µg des BPV_100TDNA-Fragmentes und 0,02 µg des vorher BamHI-gespleißten und CIP-behandelten pMT-2 miteinander verbunden. Die so gebildete rekombinante DNA wurde dazu verwendet, E. coli HB101 auf die gleiche Weise, wie vorstehend beschrieben wurde, zu transformieren und dadurch ampicillinresistente Kolonien zu erhalten. Kleine Mengen Plasmide wurden von diesen Kolonien isoliert und mit Restriktions- Enzymen behandelt. Auf der Basis ihrer Spleiß-Muster wurde das Klon mit dem gewünschten Plasmid pMT-3 identifiziert, und das Plasmid pMT-3 wurde davon isoliert.

4. Herstellung des Plasmids pMT-4

Das Plasmid pMT-2, das gemäß dem vorstehenden Abschnitt 2 hergestellt worden war, wurde mit SalI partiell gespleißt, mit CIP behandelt und dann mit dem Klenow-Fragment behandelt, um seine kohäsiven Enden in stumpfe Enden umzuwandeln. Dieses DNA-Fragment wurde als ein Vektor verwendet.

Andererseits wurde pdBPV-MMTneo (342-12) mit EcoRI und BamHI gespleißt und dann mit dem Klenow-Fragment von DNA- Polymerase I behandelt, um die kohäsiven Enden, die durch das Spleißen erzeugt worden waren, in stumpfe Enden umzuwandeln. Von dem entstandenen DNA-Fragment-Gemisch wurde ein DNA-Fragment von etwa 4 kbp, das das neo^r-Gen enthielt, abgetrennt und durch niedrigschmelzende Agarose-Gel-Elektrophorese gewonnen.

Unter Verwendung von T4 DNA-Ligase wurden 0,05 µg des vorstehenden DNA-Fragmentes (mit etwa 4 kbp) und 0,05 µg des vorher hergestellten Vektors miteinander verbunden. Die so gebildete rekombinante DNA wurde dazu verwendet, E. coli HB101 auf die gleiche Weise, wie es vorher beschrieben worden war, zu transformieren. Danach wurde das gleiche Verfahren, das in dem vorhergehenden Abschnitt 3 beschrieben worden ist, wiederholt, um den Klon mit dem gewünschten Plasmid pMT-4 zu identifizieren und das Plasmid pMT-4 davon zu isolieren.

5. Herstellung des Plasmids pMT-5

Das Plasmid pMT-4, das gemäß dem vorhergehenden Abschnitt 4 hergestellt worden war, wurde mit BamHI gespleißt und dann mit CIP behandelt. Unter Verwendung von T4 DNA-Ligase wurden 0,05 µg des entstandenen DNA-Fragments und 0,05 µg des BPV_100TDNA-Fragments, das gemäß dem vorhergehenden Abschnitt 3 hergestellt worden war, miteinander verbunden. Die so gebildete rekombinante DNA wurde dazu verwendet, E. coli HB101 auf die gleiche Weise, wie es vorstehend beschrieben wurde, zu transformieren. Danach wurde das gleiche Verfahren, das in dem vorhergehenden Abschnitt 4 beschrieben worden war, wiederholt, um den Klon mit dem gewünschten Plasmid pMT-5 zu identifizieren und das Plasmid pMT-5 davon zu isolieren.

6. Einsetzen der MMT Promotor tragenden Plasmide in Säugetierzellen und Expression des t-PA-Gens

Die MMT Promotor tragenden Plasmide pMT-2 bis -5 für die Expression des t-PA-Gens, die gemäß den vorhergehenden Abschnitten 2 bis 5 hergestellt worden waren, wurden getrennt in Säugetierzellen eingesetzt. Das Einsetzen wurde gemäß einer Modifikation des Calciumphosphat- Ausfällungsverfahrens durchgeführt, das von Graham und Van der Eb entwickelt worden war. Spezieller gesagt, es wurde eine Lösung hergestellt, die 2 × HBS (50 mM Hepes (pH 7,1), 280 mM NaCl), 1,4 mM NaH₂PO₄ und 1,4 mM Na₂HPO₄ enthielt. Während sterile Luft durch die Lösung gesaugt wurde, wurde ein gleiches Volumen einer Lösung, die eines der Plasmide für die Expression des t-PA-Gens und 250 mM CaCl₂ enthielt, tropfenweise dort hinzugegeben, um so einen Plasmid-CaPO₄-Niederschlag zu bilden. Nach Beendigung der Zugabe wurde die Lösung 20 Minuten stehengelassen. Dann wurde der Niederschlag mit einer Pipette suspendiert, und die entstandene Suspension wurde tropfenweise zu Wirtszellen hinzugegeben, die in einem Kolben gezüchtet wurden. Nachdem die Wirtszellen bei 37°C einige Stunden in einem CO₂-Brutapparat (Inkubator) gewachsen waren, wurde das Medium entfernt und eine Lösung, die 15% Glycerol und 2 × HBS enthielt, hinzugegeben, woraufhin Stehenlassen 3 Minuten bei 37°C folgte. Danach wurde diese Lösung entfernt, ein frisches Medium wurde hinzugegeben, und die Wirtszellen wurden 2 Tage in einem CO₂-Brutapparat wachsengelassen. Dann wurden die Wirtszellen auf eine Platte übertragen, die ein frisches Medium enthielt und eine Woche wachsengelassen. In diesem Falle wurde ein Medium verwendet, das die antibiotische Substanz G418 enthielt, weil das neo-Resistenz-Gen als ein Marker für die Selektion von Transformanden verwendet wurde.

Danach wurde das Medium von der Platte entfernt. In Übereinstimmung mit Jones et al. (P. Jones et al., Cell, 5, 323, 1975) wurde eine Casein-Agar-Schicht (anstelle von Fibrin) über die Wirtszellen gelegt, und die Platte wurde über Nacht gebrütet. Die t-PA erzeugenden Klone, die eine transparente Lösungszone in der Casein-Agar-Schicht zeigten, wurden selektiert. Dann wurden Klone, die hoch-produktiv für t-PA waren, erhalten, indem jeder Klon gezüchtet wurde und die Human-t-PA-Aktivität der überstehenden Flüssigkeit der entstandenen Kultur geprüft wurde. Die so erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben. Diese in hohem Maße produktionsfähigen Klone wurden auch in einem Medium, das 1 µM Cd⁺⁺ oder 50 µM Zn⁺⁺ enthielt, gezüchtet, und die Human-t-PA-Aktivität der überstehenden Flüssigkeit der entstandenen Kultur wurde geprüft. Die so erhaltenen Ergebnisse sind auch in Tabelle 2 angegeben.

Als Ergebnis zeigte der Klon MT-325 die höchste Human-t- PA-Aktivität. Spezieller gesagt, dieser Klon erzeugte 110 Einheiten/ml/Tag menschlichen t-PA in Abwesenheit von Cd⁺⁺ oder Zn⁺⁺ und 305 oder 310 Einheiten/ml/Tag Human-t-PA in Anwesenheit von Cd⁺⁺ oder Zn⁺⁺ entsprechend.

Tabelle 2

Klone, die menschlichen t-PA bei Verwendung des MMT-Promotors exprimieren

Beispiel 3 (Expression des menschlichen t-PA-Gens in Säugetierzellen unter Verwendung des menschlichen Metallothionein (hMT)-Promotors)

Gemäß dem in Fig. 3 dargestellten Verfahren wurde eine Anzahl von Plasmiden mit dem hMT-Promotor auf die folgende Weise hergestellt.

1. Herstellung des Plasmids phT-1

Zuerst wurde das Plasmid pMTSVPA (erhalten von Dr. M. Karin, School of Medicine, University of Southern California, U.S.A.) mit XbaI gespleißt und dann mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I behandelt, um die kohäsiven Enden, die durch das Spleißen erzeugt worden waren, in stumpfe Enden umzuwandeln.

Unter Verwendung von T4 DNA-Ligase wurde ein HindIII-Linker an das entstandene DNA-Fragment gebunden, woraufhin Spleißen mit HindIII folgte. Von dem entstandenen DNA-Fragment-Gemisch wurde ein DNA-Fragment von etwa 840 bp entsprechend dem hMT-Promotor abgetrennt und durch niedrigschmelzende Agarose-Gel-Elektrophorese gewonnen.

Andererseits wurde das Plasmid pMT-2, das gemäß Abschnitt 2 von Beispiel 2 erhalten worden war, mit HindIII gespleißt und dann mit CIP behandelt. Von dem entstandenen DNA-Fragment-Gemisch wurde ein DNA-Fragment von etwa 5,5 kbp, das das Plasmid pMT-2 umfaßte, das frei von dem MMT- Promotor war, abgetrennt und durch niedrigschmelzende Agarose-Gel-Elektrophorese gewonnen.

Unter Verwendung von T4 DNA-Ligase wurden das vorstehend angegebene DNA-Fragment (von etwa 5,5 kbp) und das vorher hergestellte DNA-Fragment mit dem hMT-Promotor miteinander verbunden. Die so gebildete rekombinante DNA wurde dazu verwendet, E. coli HB101 auf die gleiche Weise, wie es vorstehend beschrieben worden war, zu transformieren.

Es wurden kleine Mengen Plasmide von den entstandenen ampicillinresistenten Kolonien isoliert und mit Restriktions- Enzymen behandelt. Auf der Basis ihrer Spleiß-Muster wurde das Klon mit dem gewünschten Plasmid phT-1 identifiziert, und das Plasmid phT-1 wurde davon isoliert.

2. Herstellung des Plasmids phT-2

Das Plasmid phT-2 wurde auf die gleiche Weise, wie es in dem vorhergehenden Abschnitt 1 beschrieben ist, mit der Ausnahme isoliert, daß das gemäß Abschnitt 4 des Beispiels 1 erhaltene Plasmid pMT-4 anstelle des Plasmids pMT-2 verwendet wurde.

3. Herstellung des Plasmids phT-3

Das gemäß dem vorhergehenden Abschnitt 1 hergestellte Plasmid phT-1 wurde mit BamHI gespleißt und dann mit CIP behandelt. Unter Verwendung von T4 DNA-Ligase wurden das entstandene DNA-Fragment und das BPV_100TDNA-Fragment von etwa 8 kbp, das bei der Herstellung des Plasmids pMT-3 erhalten worden war, miteinander verbunden. Die so gebildete rekombinante DNA wurde dazu verwendet, um E. coli HB101 auf die gleiche Weise, wie vorstehend beschrieben worden war, zu transformieren. Danach wurde das gleiche Verfahren, das in dem vorstehenden Abschnitt 2 beschrieben worden ist, wiederholt, um das Plasmid phT-3 zu isolieren.

4. Herstellung des Plasmids phT-4

Das Plasmid phT-4 wurde auf die gleiche Weise isoliert, wie es in dem vorhergehenden Abschnitt 3 beschrieben worden ist, mit der Ausnahme, daß das in dem vorhergehenden Abschnitt 2 erhaltene Plasmid phT-2 anstelle des Plasmids phT-1 verwendet wurde.

5. Einsetzen der hMT-Promotor tragenden Plasmide in Säugetierzellen und Expression des menschlichen t-PA-Gens (nachgereicht)

Die hMT-Promotor tragenden Plasmide phT-1 bis -4 für die Expression des t-PA-Gens, die in den vorhergehenden Abschnitten 1 bis 4 hergestellt worden waren, wurden getrennt in Säugetierzellen eingesetzt. Das Einsetzen und das Screening von Klonen, die hoch-produktiv für t-PA sind wurde auf die gleiche Weise durchgeführt, wie es in Abschnitt 6 von Beispiel 2 beschrieben ist. Die so erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Die hoch-produktiven Klone wurden auch in einem Medium, das 1 µM Cd⁺⁺, 50 µM Zn⁺⁺ oder 1 µM Dexamethason enthielt, gezüchtet, und die Human-t-PA-Aktivität der überstehenden Flüssigkeit der entstandenen Kultur wurde geprüft. Die so erhaltenen Ergebnisse sind auch in Tabelle 3 angegeben.

Ein Ergebnis war, daß Klon hT-382 die höchste Human-t-PA- Aktivität zeigte. Spezieller gesagt, dieser Klon erzeugte 105 Einheiten/ml/Tag menschlichen t-PA in Abwesenheit von Cd⁺⁺, Zn⁺⁺ oder Dexamethason und 330 bis 340 Einheiten/ml/ Tag menschlichen t-PA in Anwesenheit von Cd⁺⁺, Zn⁺⁺ oder Dexamethason.

Tabelle 3

Klone, die menschlichen t-PA durch Verwendung des hMT-Promotors exprimieren

Beispiel 4 (Expression des menschlichen t-PA-Gens unter Verwendung des Promotors von dem Maus-Immunglobulin γ₁-Ketten-Gen (Igγ₁))

Entsprechend dem in Fig. 4 dargestellten Verfahren wurde eine Anzahl Plasmide mit dem Igγ₁-Promotor auf die folgende Weise hergestellt.

1. Herstellung des Plasmids pIg-1

Zuerst wurde das Plasmid p1Bg1II (das von Dr. Honjo, School of Medicine, Kyoto University, Japan, erhalten worden war) mit HindIII gespleißt und dann partiell gespleißt mit AccI. Von dem entstandenen DNA-Fragment-Gemisch wurde ein DNA-Fragment von etwa 3 kbp, das die Enhancer-Region enthielt, abgetrennt und durch niedrigschmelzende Agarose- Gel-Elektrophorese gewonnen. In ähnlicher Weise wurde ein AccI-AluI DNA-Fragment von etwa 180 bp, das die Promotor- Region enthielt, abgetrennt und von dem Plasmid p1BglII gewonnen. Weiterhin wurde ein DNA-Fragment von 53 bp mit einer DNA-Basen-Sequenz, das sich von der AluI-Stelle bis zu der Stelle, die vor dem Initiierungs-Codon (ATG) des Igγ₁-Gens liegt und eine HindIII-Stelle am Ende hat, nach dem Phosphotriester- Verfahren in fester Phase synthetisiert.

Unter Verwendung von T4 DNA-Ligase wurden die drei DNA- Fragmente, die wie vorstehend angegeben hergestellt wurden (d. h. das HindIII-AccI-Fragment, das AccI-A1uI-Fragment und das AluI-HindIII-Fragment) in der angegebenen Reihenfolge miteinander verbunden. Dann wurden unter Verwendung von T4 DNA-Ligase das entstandene DNA-Fragment und das DNA-Fragment von etwa 5,5 kbp, das von pMT-2 (durch Spleißen mit HindIII und Behandlung mit CIP) in Abschnitt 1 von Beispiel 3 hergestellt worden war, miteinander verbunden. Die so gebildete rekombinante DNA wurde dazu verwendet, E. coli HB101 auf die Weise, die oben beschrieben worden war, zu transformieren.

Kleine Mengen Plasmide wurden von den entstandenen ampicillinresistenten Kolonien isoliert und mit Restriktions- Enzymen behandelt. Auf der Basis ihrer Spleiß-Muster wurde das Klon mit dem gewünschten Plasmid pIg-1 identifiziert, und das Plasmid pIg-1 wurde davon isoliert.

2. Herstellung des Plasmids pIg-2

Unter Verwendung von T4 DNA-Ligase wurden das DNA-Fragment von etwa 9,7 kbp, das von dem Plasmid pMT-4 (durch Spleißen mit HindIII und Behandlung mit CIP) in Abschnitt 2 von Beispiel 3 hergestellt worden war, und die DNA, die in dem vorhergehenden Abschnitt 1 hergestellt worden war und die Enhancer- und Promotor-Regionen von dem Igγ₁-Gen enthielt, miteinander verbunden. Die so gebildete rekombinante DNA wurde dazu verwendet, E. coli HB101 auf die gleiche Weise, wie es vorstehend beschrieben worden war, zu transformieren. Danach wurde das gleiche Verfahren, das in dem vorhergehenden Abschnitt 1 beschrieben worden war, wiederholt, um das Plasmid pIg-2 zu isolieren.

3. Herstellung des Plasmids pIg-3

Das in dem vorhergehenden Abschnitt 1 hergestellte Plasmid pIg-1 wurde mit BamHI gespleißt und dann mit CIP behandelt. Unter Verwendung von T4 DNA-Ligase wurden das entstandene DNA-Fragment und das BPV_100T-DNA-Fragment von etwa 8 kbp, das bei der Herstellung des Plasmids pMT-3 erhalten worden war, wie es in Abschnitt 3 von Beispiel 2 beschrieben worden ist, miteinander verbunden. Die so gebildete rekombinante DNA wurde dazu verwendet, E. coli HB101 auf die gleiche Weise, wie es oben beschrieben wurde, zu transformieren. Danach wurde das gleiche Verfahren, das in dem vorhergehenden Abschnitt 1 beschrieben worden war, wiederholt, um das Plasmid pIg-3 zu isolieren.

4. Herstellung des Plasmids pIg-4

Das Plasmid pIg-4 wurde auf die gleiche Weise, wie es in dem vorhergehenden Abschnitt 3 beschrieben wurde, isoliert mit der Ausnahme, daß das in dem vorhergehenden Abschnitt 2 erhaltene Plasmid pIg-2 anstelle des Plasmids pIg-1 verwendet wurde.

5. Einsetzen der Igγ₁-Promotor tragende Plasmide in Säugetierzellen und Expression des t-PA-Gens

Die Igγ₁-Promotor tragenden Plasmide pIg-1 bis -4 für die Expression des t-PA-Gens, die in den vorhergehenden Abschnitten 1 bis 4 hergestellt worden waren, wurden getrennt in Säugetierzellen eingesetzt. Das Einsetzen wurde nach dem bereits genannten elektrischen Schock-Verfahren durchgeführt, das von Potter et al. entwickelt wurde.

Spezieller gesagt, es wurden Wirtszellen gezüchtet und in Phosphat-gepufferte Saline bei 0°C suspendiert. Die entstandene Zellsuspension wurde in eine 1,5-ml-Küvette mit einer positiven und einer negativen Aluminiumfolien- Elektrode gegeben und auf 0°C abgekühlt. Nachdem eine Lösung, die eines der Plasmide für die Expression des t-PA-Gens hinzugegeben worden war, wurde sofort eine Spannung von 2000 Volt bei 0°C angelegt. Nachdem diese Zellsuspension 10 Minuten bei 0°C stehengelassen worden war, wurde sie auf eine Platte übertragen, die ein frisches Medium enthielt, und 2 Tage in einem CO₂-Brutapparat oder Inkubator gezüchtet. Dann wurde das Medium durch ein frisches ersetzt, und die Wirtszellen wurden 2 Wochen wachsengelassen. Auch in diesem Falle wurde ein Medium verwendet, das die antibiotische Substanz G418 enthielt, weil das neo-Resistenz-Gen als ein Marker für die Selektion von Transformanden verwendet wurde.

Die entstandene Kultur wurde zentrifugiert, um die Zellen aufzusammeln. Entsprechend dem Verfahren von Jones et al., wie es in Beispiel 2 verwendet worden war, wurden die Zellen in Casein-Agar suspendiert, und diese Suspension wurde in einer Platte ausgebreitet, um eine Casein- Agar-Schicht zu bilden. Nachdem diese Platte in einem CO₂-Brutapparat oder Inkubator bebrütet oder inkubiert worden war, wurden menschliche t-PA erzeugende Klone, die eine transparente Lösungszone in der Casein-Agar- Schicht zeigten, selektiert. Dann wurden Klone, die hochproduktiv für menschlichen t-PA waren, durch Kultivieren jedes Klons und Prüfen der Human-t-PA-Aktivität der überstehenden Flüssigkeit der entstandenen Kultur erhalten. Die so erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben.

Ein Ergebnis war, daß Klon Ig-2P45 die höchste Human-t- PA-Aktivität zeigte und 215 Einheiten/ml/Tag menschlichen t-PA erzeugte.

Tabelle 4

Klone, die menschlichen t-PA durch Verwendung des Igγ₁- Promotors exprimieren

Beispiel 5 (Expression des menschlichen t-PA-Gens durch Verwendung des "frühen" Promotors von Simian- Virus 40 (SV40))

Gemäß dem in Fig. 5 dargestellten Verfahren wurde eine Anzahl von Plasmiden mit dem "frühen" Promotor von SV40 auf die folgende Weise hergestellt.

1. Herstellung des Plasmids pSV210-dhfr

Um eine pBR322-abgeleitete DNA-Sequenz, die die Replikation des Plasmids pSV2-dhfr in Affenzellen hemmte, zu entfernen, wurde pBR322-abgeleitete DNA-Sequenz durch pML ersetzt.

Spezieller gesagt, das Plasmid pSV2-dhfr wurde mit PvuII und BamHI gespleißt. Von dem entstandenen DNA-Fragment- Gemisch wurde ein DNA-Fragment, das das dhfr-Gen enthielt, abgetrennt und durch niedrigschmelzende Agarose-Gel-Elektrophorese gewonnen.

Andererseits wurde das Plasmid pMT-2, das gemäß Abschnitt 2 von Beispiel 2 erhalten worden war, mit EcoRI gespleißt und dann mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I behandelt, um die kohäsiven Enden, die durch das Spleißen entstanden waren, in stumpfe Enden umzuwandeln. Das entstandene DNA-Fragment wurde weiter mit BamHI gespleißt. Von dem entstandenen DNA-Fragment-Gemisch wurde ein pML-DNA-Fragment von etwa 2,6 kbp abgetrennt und durch niedrigschmelzende Agarose-Gel-Elektrophorese gewonnen.

Unter Verwendung von T4 DNA-Ligase wurden das vorstehende DNA-Fragment (von etwa 2,6 kbp) und das vorher hergestellte DNA-Fragment, das das dhfr-Gen enthielt, miteinander verbunden. Die so gebildete rekombinante DNA wurde dazu verwendet, um E. coli HB101 auf die gleiche Weise, wie es vorstehend beschrieben worden war, zu transformieren. Es wurden kleine Mengen Plasmide von den entstandenen ampicillinresistenten Kolonien isoliert und mit Restriktions-Enzymen behandelt. Auf der Basis ihrer Spleiß-Muster wurde der Klon mit dem gewünschten Plasmid pSV210-dhfr identifiziert, und das Plasmid pSV210-dhfr wurde davon isoliert.

2. Herstellung des Plasmids pSV-1

Das gemäß dem vorhergehenden Abschnitt 1 hergestellte Plasmid pSV210-dhfr wurde mit HindIII und BglII gespleißt. Von dem entstandenen DNA-Fragment-Gemisch wurde ein DNA-Fragment, das frei von dem dhfr-Gen war, abgetrennt und durch niedrigschmelzende Agarose-Gel-Elektrophorese gewonnen.

Andererseits wurde das gemäß Abschnitt 1 von Beispiel 2 erhaltene Plasmid pT406 mit HindIII und BamH1 gespleißt. Von dem entstandenen DNA-Fragment-Gemisch wurde ein DNA- Fragment, das das t-PA-Gen enthielt, abgetrennt und durch niedrigschmelzende Agarose-Gel-Elektrophorese gewonnen.

Unter Verwendung von T4 DNA-Ligase wurden das vorstehende DNA-Fragment und das vorher hergestellte DNA-Fragment, das frei von dem dhfr-Gen war, miteinander verbunden. Die so gebildete rekombinante DNA wurde dazu verwendet, E. coli HB101 auf die gleiche Weise, wie es vorstehend beschrieben worden war, zu transformieren. Danach wurde das gleiche Verfahren, das in dem vorhergehenden Abschnitt 1 beschrieben worden war, wiederholt, um das Plasmid pSV-1 zu isolieren.

3. Herstellung des Plasmids pSV-2

Das Plasmid pSV2-dhfr wurde mit PvuII gespleißt. Unter Verwendung von T4 DNA-Ligase wurde ein BamHI-Linker an das entstandene DNA-Fragment gebunden, woraufhin Spleißen mit BamHI folgte. Von dem entstandenen DNA-Fragment-Gemisch wurde ein DNA-Fragment, das das dhfr-Gen enthielt, abgetrennt und durch niedrigschmelzende Agarose-Gel-Elektrophorese gewonnen.

Andererseits wurde das Plasmid pSV-1, das gemäß dem vorhergehenden Abschnitt 2 erhalten worden war, mit BamHI gespleißt und dann mit CIP behandelt, um Dephosphorylierung des 5′-Endes (5′-Terminus) zu bewirken.

Unter Verwendung von T4 DNA-Ligase wurden das vorstehende DNA-Fragment und das vorher hergestellte DNA-Fragment, das das dhfr-Gen enthielt, miteinander verbunden. Die so gebildete rekombinante DNA wurde dazu verwendet, um E. coli HB101 auf die gleiche Weise, wie es beschrieben worden war, zu transformieren. Danach wurde das gleiche Verfahren, das in dem vorstehenden Abschnitt 1 beschrieben worden war, wiederholt, um das Plasmid pSV-2 zu isolieren.

4. Einsetzen des SV40 "frühen" Promotor tragenden Plasmids in Säugetierzellen und Expression des menschlichen t-PA-Gens

Das SV40 "frühen" Promotor tragende Plasmid pSV-2 für die Expression des t-PA-Gens, das gemäß dem vorhergehenden Abschnitt 3 hergestellt worden war, wurde in Dihydrofolat- Reduktase-arme oder -freie Eierstockzellen vom chinesischen Hamster (CHO-dhfr^-; erhalten von D. Chasin, Department of Biological Sciences, Columbia, University, U.S.A.) eingeführt.

Das Einführen wurde nach einer Modifikation des Calciumphosphat- Ausfällungs-Verfahrens durchgeführt, wie es in Abschnitt 6 von Beispiel 2 beschrieben ist. Danach wurden die Wirtszellen in einem Medium, das kein Adenosin, Deoxyadenosin oder Thymidin enthielt und für die Selektion von Transformanden brauchbar war, wachsen gelassen. Dann wurden Klone, die menschlichen t-PA erzeugen konnten, auf die gleiche Weise, wie es in Abschnitt 6 von Beispiel 2 beschrieben ist, dem Screening unterworfen. Die so erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 angegeben.

Tabelle 5

Klone, die menschlichen t-PA durch Verwendung des SV40 "frühen" Promotors exprimieren

Anmerkung zu Tabelle 5

Die chinesischer Hamster-CHO-dhfr^--Zelle wurde als Wirt verwendet, und pSV-2 wurde als das Plasmid für die Expression des menschlichen t-PA-Gens verwendet.

Ein Ergebnis war, daß Klon SV-21 die höchste Human-t-PA- Aktivität zeigte und 30 Einheiten/ml/Tag menschliches t-PA erzeugte. Um den Expressionsbetrag weiter zu erhöhen, wurde Klon SV-21 in einem Medium wachsen gelassen, das 50 nM Methotrexat (MTX) als einen DHFR-Inhibitor enthielt. Klone mit erworbener Resistenz gegen MTX wurden isoliert und auf Human-t-PA-Aktivität geprüft.

Als ein Ergebnis wurde gefunden, daß Klon SV-21-M506 110 Einheiten/ml/Tag menschlichen t-PA erzeugte. Dieser Klon wurde weiter in Anwesenheit von 1 µM MTX gezüchtet, und die entstandenen MTX-resistenten Klone wurden auf Human-t-PA-Aktivität geprüft.

Als ein Ergebnis wurde gefunden, daß der Klon SV-21-M1K12 250 Einheiten/ml/Tag menschlichen t-PA erzeugte. Als dieser Klon weiterhin einer ähnlichen Verstärkungsbehandlung unter Verwendung von 2,5 µM MTX unterworfen wurde, wurde gefunden, daß der Klon SV-21-M2.5K7 330 Einheiten/ ml/Tag menschlichen t-PA erzeugte.

Beispiel 6 (Expression des menschlichen t-PA-Gens durch Verwendung des Promotors eines menschlichen Cytomegalovirus (hCMV))

Gemäß dem Verfahren, das in Fig. 6 dargestellt ist, wurde eine Anzahl von Plasmiden mit dem Promotor eines menschlichen Cytomegalovirus auf die folgende Weise hergestellt.

1. Herstellung des Plasmids phC-1

Zuerst wurde das Plasmid pRR23 (das von Dr. B. Fleckenstein, Institut für Klinische Virologie der Universität Erlangen, Nürnberg, West Deutschland, erhalten worden war) mit XamIII gespleißt und dann mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I behandelt, um die kohäsiven Enden, die durch das Spleißen erzeugt worden waren, in stumpfe Enden umzuwandeln.

Unter Verwendung von T4 DNA-Ligase wurde ein HindIII-Linker an das entstandene DNA-Fragment gebunden, woraufhin Spleißen mit HindIII folgte. Von dem entstandenen DNA- Fragment-Gemisch wurde ein DNA-Fragment von etwa 750 bp, das die Promotor- und Enhancer-Regionen von hCMV enthielt, abgetrennt und durch niedrigschmelzende Agarose-Gel-Elektrophorese gewonnen.

Andererseits wurde das gemäß Abschnitt 2 von Beispiel 2 erhaltene Plasmid pMT-2 mit HindIII gespleißt und dann mit CIP behandelt. Von dem entstandenen DNA-Fragment-Gemisch wurde ein DNA-Fragment von etwa 5,5 kbp abgetrennt und durch niedrigschmelzende Agarose-Gel-Elektrophorese gewonnen.

Unter Verwendung von T4 DNA-Ligase wurden das vorstehende DNA-Fragment (von etwa 5,5 kbp) und das vorher hergestellte DNA-Fragment mit der hCMV-Promotor-Region miteinander verbunden. Die so gebildete rekombinante DNA wurde dazu verwendet, um E. coli HB101 auf die gleiche Weise, wie es vorstehend beschrieben worden war, zu transformieren. Es wurden kleine Mengen Plasmide von den entstandenen ampicillinresistenten Kolonien isoliert und mit Restriktions-Enzymen behandelt. Auf der Basis ihrer Spleiß-Muster wurde der Klon mit dem gewünschten Plasmid phC-1 identifiziert, und das Plasmid phC-1 wurde davon isoliert.

2. Herstellung der Plasmide phC-2, phC-3 und phC-4

Das Plasmid phC-2 wurde auf die gleiche Weise hergestellt, wie es für das Plasmid phC-1 beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß pMT-4 anstelle von pMT-2 verwendet wurde. Die Plasmide phC-3 und phC-4 wurden durch Einfügen oder Insertieren eines DNA-Fragments von BPV_100T in phC-1 bzw. phC-2 auf die gleiche Weise hergestellt, wie es entsprechend in den Abschnitten 3 bzw. 4 von Beispiel 3 beschrieben ist.

3. Einsetzen der hCMV-Promotor tragenden Plasmide in Säugetierzellen und Expression des menschlichen t-PA-Gens

Die hCMV-Enhancer und Promotor tragenden Plasmide phC-1, phC-3 und phC-4 für die Expression des menschlichen t-PA- Gens, die nach den vorstehenden Abschnitten 1 und 2 hergestellt worden waren, wurden in Säugetierzellen eingesetzt.

Das Einsetzen und das Screening von Klonen, die menschlichen t-PA erzeugen konnten, wurde auf die gleiche Weise durchgeführt, wie es in Abschnitt 6 von Beispiel 2 beschrieben ist. Die so erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 6 angegeben. Klon hc-372 zeigte die höchste Human-t-PA-Aktivität und erzeugte 120 Einheiten/ml/Tag menschlichen t-PA.

Tabelle 6

Klone, die menschlichen t-PA durch Verwendung des hCMV- Promotors exprimieren

Beispiel 7 (Expression des menschlichen t-PA-Gens durch Verwendung des LTR-Promotors eines Retrovirus)

Gemäß dem in Fig. 7 dargestellten Verfahren wurde eine Anzahl Plasmide mit dem LTR (long terminal repeat) Promotor vom Harvey mäuse- oder rattenartigen Sarcoma-Virus und brauchbar für die Expression des menschlichen t-PA-Gens auf die folgende Weise hergestellt.

1. Herstellung des Plasmids pLTR-1

Zuerst wurde das Plasmid pDVXR (das von Dr. M. Botchan, Department of Molecular Biology and Virus Laboratory, University of California, Berkeley, U.S.A. erhalten worden war) mit BamHI gespleißt und dann mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I behandelt, um die kohäsiven Enden, die durch das Spleißen erzeugt worden waren, in stumpfe Enden umzuwandeln. Das entstandene DNA-Fragment wurde mit BalI gespleißt. Von dem entstandenen DNA-Fragment- Gemisch wurde ein DNA-Fragment, das die LTR-Region von Ha-MSV enthielt, abgetrennt und durch niedrigschmelzende Agarose-Gel-Elektrophorese gewonnen.

Andererseits wurde das Plasmid pMT-2, das gemäß Abschnitt 2 von Beispiel 2 erhalten worden war, mit HindIII gespleißt und dann mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I behandelt, um die kohäsiven Enden, die durch das Spleißen erzeugt worden waren, in stumpfe Enden umzuwandeln. Das entstandene DNA-Fragment wurde mit CIP behandelt. Von dem entstandenen DNA-Fragment-Gemisch wurde ein DNA-Fragment von etwa 5,5 kbp abgetrennt und durch niedrigschmelzende Agarose-Gel-Elektrophorese gewonnen.

Unter Verwendung von T4 DNA-Ligase wurden das vorstehende DNA-Fragment (von etwa 5,5 kbp) und das vorher hergestellte DNA-Fragment, das die LTR-Promotor-Region von Ha-MSV enthielt, miteinander verbunden. Die so gebildete rekombinante DNA wurde dazu verwendet, E. coli HB101 auf die gleiche Weise, wie es vorstehend beschrieben worden war, zu transformieren. Es wurden kleine Mengen Plasmide von den entstandenen ampicillinresistenten Kolonien isoliert und mit Restriktions-Enzymen behandelt. Auf der Basis ihrer Spleiß-Muster wurde der Klon mit dem gewünschten Plasmid pLTR-1 identifiziert, und das Plasmid pLTR-1 wurde davon isoliert.

2. Herstellung des Plasmids pLTR-2

Das Plasmid pLTR-1, das gemäß dem vorstehenden Abschnitt 1 hergestellt worden war, wurde mit BamHI gespleißt und dann mit CIP behandelt.

Unter Verwendung von T4 DNA-Ligase wurden das vorstehende DNA-Fragment und das BPV_100T-DNA-Fragment von etwa 8 kbp, das gemäß Abschnitt 3 von Beispiel 2 hergestellt worden war, miteinander verbunden. Die so gebildete rekombinante DNA wurde dazu verwendet, E. coli HB101 auf die gleiche Weise, wie es beschrieben worden war, zu transformieren. Danach wurde das gleiche Verfahren, das in dem vorstehenden Abschnitt 1 beschrieben worden ist, wiederholt, um das Plasmid pLTR-2 zu isolieren.

3. Herstellung des Plasmids pLTR-3

Das Plasmid pSV2-dhfr wurde mit BamHI gespleißt und dann mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I behandelt, um die kohäsiven Enden, die während des Spleißens erzeugt worden waren, in stumpfe Enden umzuwandeln. Das entstandene DNA-Fragment wurde mit PvuII behandelt. Von dem entstandenen DNA-Fragment-Gemisch wurde ein DNA-Fragment, das das dhfr-Gen enthielt, abgetrennt und durch niedrigschmelzende Agarose-Gel-Elektrophorese gewonnen.

Andererseits wurde das Plasmid pLTR-1, das gemäß dem vorhergehenden Abschnitt 1 erhalten worden war, mit ClaI gespleißt und dann mit Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I behandelt, um die kohäsiven Enden, die durch das Spleißen erzeugt worden waren, in stumpfe Enden umzuwandeln. Von dem entstandenen DNA-Fragment-Gemisch wurde ein DNA- Fragment von etwa 6,8 kbp abgetrennt und durch niedrigschmelzende Agarose-Gel-Elektrophorese gewonnen.

Unter Verwendung von T4 DNA-Ligase wurden das vorstehende DNA-Fragment (von etwa 6,8 kbp) und das vorher hergestellte DNA-Fragment, das das dhfr-Gen enthielt, miteinander verbunden. Die so gebildete rekombinante DNA wurde dazu verwendet, E. coli HB101 auf die gleiche Weise, wie es beschrieben worden war, zu transformieren. Danach wurde das gleiche Verfahren, das in dem vorstehenden Abschnitt 1 beschrieben worden war, wiederholt, um das Plasmid pLTR-3 zu isolieren.

4. Herstellung des Plasmids pLTR-4

Das Plasmid pLTR-4 wurde auf die gleiche Weise, wie es in dem vorstehenden Abschnitt 2 beschrieben ist, mit der Ausnahme isoliert, daß das Plasmid pLTR-3, das gemäß dem vorstehenden Abschnitt 3 hergestellt worden war, anstelle des Plasmids pLTR-1 verwendet wurde.

5. Einsetzen der LTR-Promotor tragenden Plasmide in Säugetierzellen und Expression des menschlichen t-PA- Gens

Die LTR-Promotor tragenden Plasmide pLTR-2 bis -4 für die Expression des menschlichen t-PA-Gens, die gemäß den vorhergehenden Abschnitten 2 bis 4 hergestellt worden waren, wurden getrennt in Säugetierzellen eingesetzt. Das Einsetzen und das Screening von Klonen, die t-PA produzieren konnten, wurde auf die gleiche Weise durchgeführt, wie es in Abschnitt 6 von Beispiel 2 beschrieben ist.

Es wurde versucht, bei den Klonen mit dem eingesetzten pLTR-3 oder pLTR-4 den Expressionsbetrag durch Behandlung mit MTX zu erhöhen. Die so erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 7 angegeben.

Ein Ergebnis ist, daß 340 Einheiten/ml/Tag menschlicher t-PA von Klon LTR-M2008-M1K19 mit eingesetztem pLTR-3 und behandelt mit MTX zur Erhöhung des Expressionsbetrages erzeugt wurden. Weiterhin wurden 355 Einheiten/ml/ Tag menschlicher t-PA von Klon LTR-459-M1K3 mit eingesetztem pLTR-4 und behandelt mit MTX zur Erhöhung des Expressionsbetrages erzeugt.

Zu bemerken ist, daß dann, wenn keine spezifischen Arbeitsbedingungen in den vorstehenden Beispielen angegeben wurden, übliche Arbeitsbedingungen, die dem Fachmann geläufig sind, nach der Eignung ausgewählt und angewendet wurden.

Tabelle 7

Klone, die humanen t-PA durch Verwendung des Ha-MSV LTR-Promotors exprimieren

Claims

1. Eine DNA-Sequenz, die die DNA-Sequenzkodierung für menschlichen Gewebe-Plasminogen-Aktivator enthält, die durch menschliche normale Zellen erhalten worden ist, wobei ein Strang dieser DNA-Sequenzkodierung die folgende Basen-Sequenz besitzt:

2. Verwendung einer rekombinanten DNA, die einen Vektor mit einem Abschnitt, der zur Selbst-Replikation in Säugetierzellen fähig ist, und die damit verbundene DNA-Sequenz nach Anspruch 1 umfaßt, zur Herstellung von menschlichem Gewebe-Plasminogen-Aktivator durch Züchten dieser Säugetierzellen.