DE3787044T2

DE3787044T2 - Transformant einer tierischen Zelle, Verfahren zur Herstellung des Transformanten und dessen Verwendung zur Präparation eines gewünschten Fremdgenproduktes.

Info

Publication number: DE3787044T2
Application number: DE87304152T
Authority: DE
Inventors: Tomoko Ishii; Eriko Mine; Fumio Omae; Noboru Tomioka
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Priority date: 1986-05-10
Filing date: 1987-05-11
Publication date: 1993-12-09
Anticipated expiration: 2007-05-12
Also published as: JP2585532B2; FI872013A; NO871912L; FI872013A0; DE3787044D1; US5219738A; ZA873211B; EP0246049B1; NO871912D0; DK235587D0; AU7265087A; AU599977B2; EP0246049A1; DK235587A; JPS62262988A

Description

Die Erfindung betrifft eine Technik zur Einführung eines Wildtyp DHFR-Gens, das für die Dihydrofolatreduktase kodiert, als einen dominanten Selektionsmarker in Wildtyp tierische Zellen, so daß ein Transformand erhalten wird, und zur anschließenden Züchtung des Transformanden in einem Amplifikationsmedium, das einen Inhibitor von DHFR enthält, so daß ein amplifizierter Transformand mit amplifizierter Produktivität einer nützlichen Substanz erhalten wird. Die vorliegende Erfindung kann als eine Technik für die Herstellung des Gewebe-Plasminogen-Aktivators (im Nachfolgenden mit tPA abgekürzt) wirksam verwendet werden.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, mittels eines speziellen Verfahrens einen amplifizierten Transformanden aus einem Transformanden zu erhalten, der selbst ein gewünschtes Gen enthält. Es ist ein Merkmal der vorliegenden Erfindung, daß der amplifizierte Transformand ein fremdes Wildtyp DHFR-Gen enthält.
Ein DHFR-Gen kodiert für Dihydrofolatreduktase, die an der Biosynthese von DNA und RNA beteiligt ist. Das Gen kann in gegen Methotrexat (MTX) resistenten Zellen amplifiziert werden, und Methotrexat ist als ein krebshemmendes Mittel bekannt.
Es sind Versuche unternommen worden, ein gewünschtes Fremdgen mittels DHFR-Gen-Amplifikation in einem Transformanden zu amplifizieren, um den Level der Produktion eines Fremdgen-Produkts verbessern zu können.
Die Co-Amplifikation des DHFR-Gens und des gewünschten Fremdgens erfolgt durch Züchten eines Transformanden, der das DHFR- Gen und das Fremdgen enthält, in frischem Medium mit einer höheren Konzentration an Methotrexat, und durch Screening eines gegenüber den höheren Methotrexat-Konzentrationen resistenten Stamms unter Verwendung des DHFR-Gens als Marker. Dieser Vorgang kann bei einer wesentlich höheren Methotrexat-Konzentration wiederholt werden.
Nützliche Quellen für das DHFR-Gen sind das Wildtyp- und ein mutantes Gen. Wenn ein Wildtyp DHFR-Gen ausgewählt wird, wird im allgemeinen ein DHFR-defizienter Stamm als Wirt verwendet.
Als Beispiel für die Verwendung eines mutanten DHFR-Gens offenbart die Europäische Patentveröffentlichung 117 059 A eine Technik, um tPA produzierende Transformanden unter Verwendung eines mutanten DHFR-Gens als dominanten Selektionsmarker-Gen für Wildtyp-Zellen zu erhalten, so daß diese Zellen eine Resistenz gegen Methotrexat (MTX) bekommen, den Transformanden zu selektieren, der mit einem menschlichen tPA-Gen cotransfiziert worden ist, und anschließend den so erhaltenen Transformanden in Gegenwart von Methotrexat in einer höheren Konzentration zu züchten, so daß sowohl das DHFR-Gen als auch das tPA-Gen verstärkt werden.
Die oben beschriebene herkömmliche Technik bringt allerdings Probleme mit sich. Zunächst ergibt das mutante DHFR-Gen auf Grund seiner Mutation ein genetisches Produkt, bei dem die 22.
Aminosäure von Leucin nach Arginin ausgetauscht worden ist. Mögliche abträgliche Wirkungen wie malignes Wachstum, die ein derartiges mutantes DHFR-Gen oder sein Genprodukt gegenüber den Wildtyp-Zellen, die als Wirt verwendet werden, verursachen können, sind noch nicht völlig untersucht worden. Als eine pharmazeutische Technik, die möglicherweise strenge Sicherheitserfordernisse erfüllen muß, glaubt man immer noch, daß die Verwendung des mutanten DHFR-Gens ungelöste Probleme mit sich bringt.
Das mutante DHFR-Gen unterscheidet sich in seiner Bindungsaffinität gegenüber Methotrexat von den Wildtyp DHFR-Genen. Die Bindungsaffinität des mutanten DHFR-Gens ist nur ein 270stel der Bindungsaffinität der Wildtyp DHFR-Gene.
In einer Reihe von Genmultiplikationsvorgängen in Gegenwart von Methotrexat in erhöhter Konzentration ist es dementsprechend unverzichtbar, transformierte Zellen mit dem mutanten DHFR-Gen bei einer im Vergleich zu der Verwendung von Wildtyp DHFR-Genen wesentlich höheren Konzentration an Methotrexat zu züchten, um einen gegen Methotrexat resistenten Stamm zu erhalten.
Die Methotrexat-Konzentration, die für die Züchtung der amplifizierten Transformanden erforderlich ist, ist viel höher als die, die verwendet wird, wenn Wildtyp DHFR-Gene verwendet werden. Da eine derart hohe Methotrexat-Konzentration den Zellen schadet, ist ein resistenter Stamm, der in Gegenwart von Methotrexat in einer so hohen Konzentration erhalten wurde, selbst instabil. Nach der derzeitigen Technologie hat das oben beschriebene Selektionsverfahren, bei dem eine hohe Konzentration an Methotrexat verwendet wurde, um amplifizierte Transformanden zu erhalten, noch keine reproduzierbare und praktikable Technik ergeben.
Aus den oben genannten Gründen wird das Verfahren zur Bildung eines Transformanden, der tPA in großen Mengen produziert, mittels eines mutanten DHFR-Gens immer noch für unvollständig für eine Technik gehalten, die für die Herstellung pharmazeutischer Produkte verwendet werden soll.
In der Regel werden Wildtyp-Zellen, die zur Expression ihres DHFR-Gens befähigt sind, als tierische Wirtszellen ausgewählt, da mutante Zellen im Fall tierischer Zellen nicht auf einfache Weise zu etablieren sind. Daher sind die mutanten Zellen für die industrielle Herstellung wenig vorteilhaft. Jedoch kann ein Transformand nicht immer stabil erhalten werden, wenn ein Wildtyp DHFR-Gen als dominantes Selektionsmarker-Gen für solche Wildtyp-Zellen verwendet wird. Selbst wenn ein Transformand erhalten werden konnte, ist die Expression der Kennzeichen durch den Transformanden außergewöhnlich instabil. Deshalb treten in vielen Fällen Schwierigkeiten beim Screenen eines Transformanden nach diesem Verfahren auf. Tatsächlich wurde kein stabiler, tPA produzierender Stamm erhalten, wenn ein Wildtyp DHFR-Gen für Wildtyp Hamsterzellen (Chinese hamster cells) (Europäische Offenlegungsschrift 117 060 A) verwendet wurde.
Es kann daher damit gerechnet werden, daß ein Wildtyp DHFR-Gen als Selektionsmarker-Gen verwendet werden kann, wenn ein DHFR- defizienter Stamm aus Wildtyp-Zellen etabliert werden kann. Dieser Ansatz ist jedoch nicht einfach, da das Etablieren (Aufbauen) eines solchen DHFR-defizienten Stamms per se vielschichtig und zeitraubend ist. [Nähere Angaben in Urlanb, G. & Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)]
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, daß die Nachteile bei der Verwendung eines mutanten DHFR-Gens überwunden werden können, und daß ein ausgesprochen vorteilhaftes Verfahren, das die stabile Produktion eines nützlichen Fremdgen-Produkts wie menschliches tPA mit guter Reproduzierbarkeit ermöglicht, bereitgestellt werden kann, wenn ein Wildtyp DHFR-Gen als dominanter Selektionsmarker für Wildtyp tierische Zellen, die für die industrielle Produktion geeignet sind, eingeführt werden kann. Weitere intensive Untersuchungen sind dann an diesem Verfahren durchgeführt worden.
Auf Grund der Tatsache, daß Wildtyp tierische Zellen in Gegenwart von Methotrexat in einer wirksamen Konzentration nicht überleben können, wenn das endogene DHFR-Gen inaktiviert ist, kann auf einfache Weise aus dem Stand der Technik gefolgert werden, daß, wenn ein exogenes Wildtyp DHFR-Gen in die Wildtyp Zellen eingeführt wird, das exogene DHFR-Gen in Gegenwart von Methotrexat in der wirksamen Konzentration wie das endogene DHFR-Gen inaktiviert würde, und deshalb könnte kein stabiler Transformand erhalten werden.
Trotz dieser Voraussage haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung als Wirtszellen tierische Zellen ausgewählt, die für die industrielle Produktion von Vorteil sind, und haben verschiedene Bedingungen und Kombinationen der tierischen Zellen und Wildtyp DHFR-Gene getestet, um stabile, gegen Methotrexat resistente Transformanden zu erhalten. Als Ergebnis haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung dahingehend unerwarteterweise insofern Erfolg gehabt, als sie in Gegenwart von Methotrexat in der wirksamen Konzentration einen stabilen Transformanden erhielten, was schließlich zur Vollendung der vorliegenden Erfindung führte.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, die verschiedenen, oben genannten Probleme aus dem Stand der Technik zu lösen und einen höheren Transformanden mit stabiler und hoher Produktionskapazität für eine nützliche Substanz zu erhalten.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen zur effizienten Herstellung einer nützlichen Substanz mittels eines Transformanden, der stabil bleibt und eine hohe Produktionskapazität für eine nützliche Substanz aufrecht erhält.
Diese Aufgaben können mittels eines Verfahrens zur Herstellung eines Transformanden gelöst werden, das die Schritte umfaßt: eine Wildtyp tierische Zelle mit einem Vektor zu transformieren, der ein heterologes Wildtyp DHFR-Gen enthält, das wirksam verbunden ist mit Affenvirus 40 (SV 40) regulatorischen DNA- Sequenzen, die das SV 40 Polyadenylierungssignal und ein Strukturgen enthalten, wobei die tierische Zelle, in die der Vektor eingeführt worden ist, zunächst in einem Selektionsmedium, das Methotrexat in einer Konzentration von 0,25 bis 1 uM enthält, gezüchtet wird, so daß der so erhaltene Transformand selektiert wird, und dann den Transformanden in einem Amplifikationsmedium, das Methotrexat in einer Konzentration von 0,25 bis 50 uM enthält, zu züchten, so daß sowohl das Wildtyp DHFR-Gen als auch das Strukturgen amplifiziert werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Resistenz gegen Methotrexat in industriell nützliche Wildtyp tierische Zellen eingeführt, wodurch es möglich wird, Zellen zu screenen, die gleichzeitig mit einem Vektor, der ein gewünschtes Fremdgen wie das menschliche tPA-Gen enthält, transformiert worden sind. Außerdem wird auch ein amplifizierter Transformand erhalten, so daß die stabile Herstellung einer nützlichen Substanz in hoher Ausbeute ermöglicht wird.
Wenn die vorliegende Erfindung angewendet wird, wird die Amplifikation der Gene an einem Transformanden in Gegenwart von Methotrexat in einer Konzentration, die geringer ist als die im Stand der Technik verwendete Konzentration, ausgeführt (z. B. bei 0,25 uM). Es ist daher möglich, einen Transformanden mit stabiler und hoher Produktionskapazität für eine nützliche Substanz zu erhalten.
Fig. 1 zeigt die Struktur des zu expremierenden Plasmids pSV 2, das in dem Beispiel der vorliegenden Erfindung verwendet wurde.
Bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung werden entweder getrennte Vektoren oder nur ein Vektor, der ein gewünschtes Fremdgen und ein Wildtyp DHFR-Gen enthält, in Wildtyp tierische Zellen eingeführt. Transformanden werden in einem Selektionsmedium, das Methotrexat in einer wirksamen Konzentration enthält, gescreent. Transformanden, die das gewünschte Fremdgen expremieren, werden aus den gegenüber Methotrexat resistenten Transformanden herausgefischt. Mit den so erhaltenen Transformanden wird ein amplifizierender Vorgang für das Selektionsmarker-Gen in Gegenwart von Methotrexat in einer Konzentration von 50 uM oder kleiner ausgeführt, so daß ein Transformand erhalten wird, der das gewünschte Fremdgen mit hoher Produktivität expremiert. Außerdem wird das Produkt des gewünschten Fremdgens durch diesen Vorgang ebenfalls mit amplifiziert.
Als gewünschtes zu amplifizierendes Fremdgen kann irgend eines von verschiedenen, den Zielprodukten entsprechenden Genen verwendet werden.
Als Beispiel ist tPA ein Enzym, das einem fibrinolytischen System angehört. Da die Lyse der Fibrin-Gerinnsel, Bestandteilen des Thrombus, in Folge der Aktivierung durch tPA erfolgt, ist tPA als neues therapeutisches Mittel für die Behandlung von Thrombosen wertvoll. Bei der Herstellung menschlichen tPAs ist es möglich, als ein menschliches tPA-Gen das zu benutzen, das als cDNA erhältlich ist und aus der mRNA von Krebszellen gewonnen wurde (Bowes Melanom Stamm) [Goeddel, D.V. et al., Britische Patent-Anmeldung 8 312 221 (1983)], ferner ist es möglich, cDNA, die von der mRNA von normalen Zellen in der Kultur gewonnen wurde, oder einen genomischen DNA-Klon, der von menschlicher chromosomaler DNA gewonnen worden ist [Ny, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5355 (1984)], zu verwenden.
Es sind bereits einige Unterschiede festgestellt worden in den DNA-Sequenzen zwischen dem tPA-Gen, das aus Krebszellen isoliert wurde, und dem tPA-Gen, das aus normalen Zellen isoliert wurde [Ny, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5355 (1984)]. In der gegenwärtigen Situation, da die Wirkungen des tPA-Gens aus Krebszellen auf die Carcinogenität noch nicht erwiesen sind, muß bei der Herstellung von pharmazeutischen Produkten ein tPA-Gen, das aus normalen Zellen isoliert wurde, verwendet werden.
Um ein gewünschtes Fremdgen in tierischen Zellen zu expremieren, ist es bevorzugt, die Transformation der tierischen Zellen unter Verwendung eines Vektors durchzuführen, in dem das gewünschte Fremdgen funktionell mit den regulatorischen DNA- Sequenzen verbunden ist. Der Begriff "regulatorische Sequenzen", wie er hier verwendet wird, bedeutet Sequenzen von Promotoren, Terminations- und Polyadenylierungssignalen, Enhancern und anderen die Expression kontrollierenden Sequenzen. Eine oder mehrere dieser Sequenzen kann/können je nach Bedarf verwendet werden. Um optimale Expression in den speziellen tierischen Zellen, die als Wirtszellen verwendet werden, zu erzielen, werden wirksame Sequenzen ausgewählt. Je stärker die Wirkung der regulatorischen Sequenzen ist, umso bessere Ergebnisse werden erzielt.
Wenn die Wirtszellen beispielsweise Hamster-(Chinese hamster) Zellen sind, können die SV 40 (Affenvirus 40) Sequenzen zufriedenstellende Ergebnisse liefern. Die regulatorischen Sequenzen sind jedoch nicht auf das oben erwähnte Beispiel beschränkt; vielmehr können jegliche regulatorische Sequenzen genauso gut verwendet werden, so lange sie zu hoher Expression in Hamster-(Chinese hamster-)Zellen führen.
Regulatorische DNA-Sequenzen, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden und von denen erwartet wird, daß sie hohe Aktivität ergeben, können beispielsweise außerdem den menschlichen Metallothionin-Promotor [Karin, M. et al., Nature 308, 513 (1984)], den Maus-Metallothionin-Promotor [Pavlakis, G. N. und Hamer, D. H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 397 (1983)], den Maus MuLV-LTR Promotor [Anson, D. S. et al., Nature 315, 683 (1985)], den Hitzeschock (heat shock) Promotor [Peter Bromley und Richard Voellmy, Europäische Patentanmeldung 118 393 A2], den Adenovirus Promotor [Wood, W. I. et al., Nature 312, 330 (1984)], den menschlichen Cytomegalovirus Promotor [Boshart, M. et al., Cell 41, 521 (1985) ], etc. umfassen.
Wildtyp DHFR-Gene können als cDNA-Klon oder als genomischer Klon von Wildtyp-Zellen isoliert werden. Als Wildtyp DHFR-Gene kann für die vorliegende Erfindung zum Beispiel das Maus Wildtyp DHFR-Gen [(Lee, F. et al., Nature 294, 228 (1981)], das in Form eines cDNA-Klons isoliert worden ist und das in einen Vektor eingefügt worden ist, gut verwendet werden.
In tierischen Zellen wird Folsäure durch DHFR (Dihydrofolatreduktase) zu Tetrahydrofolsäure, eine aktive Form, reduziert, diese ist dann an der Synthese der Thymidylsäure beteiligt. Methotrexat, ein Analog der Folsäure, bindet an Dihydrofolatreduktase und inhibiert deren Aktivität. In Folge der Inhibition der Aktivität der DHFR durch MTX können die Zellen in einem Kulturmedium, das keinen Nukleinsäure-Bestandteil enthält, nicht überleben.
Um ein fremdes Wildtyp DHFR-Gen in Wildtyp tierische Zellen einzubringen, und um in Gegenwart von Methotrexat in einer derart hohen Konzentration, daß die Wirtszellen gewöhnlich nicht überleben können, überraschenderweise einen MTX resistenten Transformanden zu erhalten, ist es erforderlich, eine verbesserte Expression des in die Wildtyp-Zellen eingeführten DHFR-Gens zu erzielen.
Für die höhere Expression des fremden DHFR-Gens werden regulatorische Sequenzen zur Bildung eines Expressionsvektors künstlich mit einem DHFR-Gen kombiniert. Wenn die Wirtszellen zum Beispiel Hamster-(Chinese hamster-)Zellen sind, können die regulatorischen Sequenzen von SV 40 eine zufriedenstellende Expression ergeben. Die wirksamen regulatorischen Sequenzen sind jedoch nicht auf solche von SV 40 beschränkt. Vielmehr kann jede regulatorische Sequenz verwendet werden, die in Hamster- (Chinese hamster-)Zellen eine erhöhte Expression von DHFR bewirkt.
Wenn ein gewünschtes Fremdgen und ein Wildtyp DHFR-Gen gemeinsam auf demselben Expressionsvektor enthalten sind, werden die Wirtszellen mit diesem Vektor transformiert. Wenn das gewünschte Fremdgen und das Wildtyp DHFR-Gen auf getrennten Expressionsvektoren sitzen, werden die Wirtszellen mit einem Gemisch dieser beiden Expressionsvektoren in einem geeigneten Verhältnis zueinander transformiert.
Unter dem Begriff "tierische Zellen", wie er hierin verwendet wird, können irgendwelche Zellen verstanden werden, so lang sie Wildtyp-Zellen sind.
Für die industrielle Herstellung zu verwendende Wirtszellen können wünschenswerterweise Toleranz gegenüber jeglichen Art von Streß aufweisen; ferner ist ihre Züchtung wünschenswerterweise einfach, ihre Wachstumsgeschwindigkeit groß, erlauben sie eine Kultur hoher Dichte, hat ihr Kulturmedium einen geringen Bedarf an Serum, haben sie eine potentiell höhere Fähigkeit zur Expression und Sekretion der Fremdgen-Produkte, haben sie die Fähigkeit, fremde Gen-Produkte zu glykolysieren, und/oder produzieren sie im Vergleich zu den gewünschten Fremdgen-Produkten wesentlich geringere Mengen endogener Substanzen, etc.
Insbesondere wenn das menschliche tPA-Gen als das gewünschte Fremdgen verwendet wird, und wenn das tPA-Gen nicht von Krebszellen abstammt, ist es wünschenswert, eine kontinuierliche Zellinie, die jedoch nicht von einer Krebszelle abgeleitet worden ist, als Wirtszelle auszuwählen, da die gewünschten Produkte dann nicht mit irgendwelchen von den Krebszellen stammenden Kontaminationen verunreinigt sind.
In dem Beispiel wurden Zellen, die den oben genannten charakteristischen Merkmalen in gewissem Maße Genüge tun, unter etablierten Hamster-Ovarienzellen (CHO) und Hamster-Lungenzellen (CHL) gefunden. Diese Zellen wurden als Wirtszellen verwendet. Es ist wohl nicht nötig zu erwähnen, daß die Wirtszellen nicht auf diese genannten Beispiele beschränkt sein sollen.
Als Verfahren zum Einführen einer vektoriellen DNA in Wirtszellen gemäß der vorliegenden Erfindung ist es wünschenswert, so ein Verfahren anzuwenden, das die Einführung der Vektor-DNA mit hoher Ausbeute erlaubt, da das Screening auf den Transformanden im folgenden Schritt unter harten Bedingungen erfolgt. Es können gute Ergebnisse zum Beispiel erzielt werden, wenn die Vektor-DNA nach der modifizierten Calciumphosphat- Methode einschließlich Glyzerinschock in den Wirt eingeführt wird.
Um auf das DHFR-Gen als dominantes Markergen einen Selektionsdruck auszuüben, wird als Selektionsmedium zum Screenen eines gegen Methotrexat resistenten Transformanden ein Kulturmedium mit MTX, aber ohne Nukleinsäure-Bestandteile verwendet. Als Selektionsmedium ist die Verwendung eines Mediums bevorzugt, das das überleben der Wirtszellen nicht zuläßt, wohl aber das der Transformanden. Das Selektionsmedium enthält Methotrexat in einer Konzentration von 0,25-1 uM.
Die genetische Amplifikation des Wildtyp DHFR-Gens, das in den Transformanden eingeführt worden ist, und die gleichzeitige Amplifikation des gewünschten Fremdgens kann mittels eines per se aus dem Stand der Technik bekannten Verfahrens ausgeführt werden. Bezüglich der Amplifikation wird zum Beispiel auf Schimke, R. T. in Gene Amplification, Herausgeber Schimke, R. T., Cold Spring Harbor Laboratory, P1, 1982, verwiesen. Was die gleichzeitige Amplifikation eines DHFR-Gens und eines gewünschten Genes in einem Transformanden betrifft, wird zum Beispiel auf Ringold, G. et al., J. Mol. Appln. Genet. 1, 165 (1981), verwiesen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Stamm mit hoher Produktivität für das gewünschte Fremdgen-Produkt erhalten werden, indem ein Transformand, der gegenüber Methotrexat in einer bestimmten Konzentration resistent ist, in einem Medium gezüchtet wird, das Methotrexat in einer Konzentration enthält, die 2 bis 4 Mal höher ist als die erstgenannte Konzentration des Methotrexats, so daß Zellen erhalten werden, die gegenüber deutlich höheren Konzentrationen von Methotrexat resistent sind, indem weiterhin die Zellen unter den so erhaltenen Zellen gescreent werden, die eine hohe Produktionsrate des gewünschten Fremdgen-Produkts aufweisen, und indem dann die Züchtungs- und Screening-Schritte bei ansteigenden Konzentrationen von Methotrexat wiederholt werden.
Das wesentliche kennzeichnende Merkmal der vorliegenden Erfindung beruht auf der Verwendung eines Wildtyp DHFR-Gens anstelle eines mutanten DHFR-Gens, dessen Affinität für MTX relativ niedrig ist. Dieses wesentliche kennzeichnende Merkmal hat die folgenden positiven Auswirkungen hervorgebracht.
Die genetische Amplifikation wird bei einer Methotrexat-Konzentration von 0,25 uM-50 uM, vorzugsweise bei einer Methotrexat-Konzentration von 0,25 uM-20 uM (viel tiefer als die Methotrexat-Konzentration (50 uM-1000 uM), die bei der genetischen Amplifikation verwendet wird, wenn ein mutantes DHFR- Gen verwendet wird) durchgeführt. Im Ergebnis ist es durch die Verwendung einer derart niedrigeren Methotrexat-Konzentration möglich, einen stabilen Transformanden zu erhalten, der eine hohe Produktivität bezüglich des gewünschten Fremdgen-Produkts aufweist.
Auf Grund der Verwendung der im Vergleich zum Stand der Technik wesentlich niedrigeren Methotrexat-Konzentration zeigt der Transformand gemäß der vorliegenden Erfindung gutes Wachstum, und seine Fähigkeit, das Produkt des gewünschten Fremdgens herzustellen, bleibt selbst nach seiner Züchtung über lange Zeiträume stabil.
Die vorliegende Erfindung wird im Nachfolgenden an Hand des folgenden Beispiels genauer beschrieben. Es sollte jedoch berücksichtigt werden, daß die vorliegende Erfindung keinesfalls durch das nachfolgende Beispiel beschränkt wird.

Beispiel:

(1) Einführung des Plasmids pSV 2 in Hamster-(Chinese hamster) Zellen und Expression des menschlichen tPA-Gens:

Nach dem in der Europäischen Patentanmeldung 86 309 250.8 beschriebenen Verfahren wurde ein Stamm (MTC 017) mit der Fähigkeit zur Produktion von tPA in großen Mengen aus mehreren normalen menschlichen Zellen (Zahl der Chromosomen 2n = 46) ausgewählt und im großen Maßstab gezüchtet. Die Gesamt-RNA wurde aus den gezüchteten Zellen extrahiert und poly(A)&spplus;-mRNA wurde abgetrennt und unter Verwendung von oligo-dT-Cellulose wiedergewonnen.
Unter Verwendung der mRNA wurde eine cDNA-Genbank gemäß des von Gubler und Hoffman [Gubler, U. und Hoffman, B. J., Gene 25, 263 (1983)] vorgeschlagenen Verfahrens hergestellt.
Unter Verwendung einer synthetischen Oligonukleotidsonde, die die Aminosäure-Sequenz des menschlichen tPA wiederspiegelt, wurde eine cDNA kloniert, die für das menschliche tPA kodiert. Die gesamte Basen-Sequenzen des tPA-Gens wurde mit der Maxam- Gilbert-Methode [Maxam, A. M. und Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560 (1977)] bestimmt.
Das zu expremierende Plasmid pSV 2, dessen Struktur in der beiliegenden Zeichnung wiedergegeben ist, wurde hergestellt, indem ein Enhancer, ein Replikationsursprung, ein Promotor, ein Terminations- und ein Polyadenylierungssignal, alle von SV 40, mit je einer der oben erwähnten cDNA-Sequenzen für menschliches tPA bzw. der Maus DHFR cDNA-Sequenzen [Lee, F. et al., Nature 294, 228 (1981)] verknüpft wurden und das so erhaltene Konstrukt auf eine in dem Stand der Technik bekannte und übliche Weise in ein DNA-Fragment, das einen bakteriellen Replikationsursprung und einen von pML [Lusky, M. und Botchan, M., Nature 293, 79 (1981)] stammenden Ampicillin-Resistenz-Marker enthält, eingebaut wurde.
Als Wirtszellen wurden Hamster-Ovarien-(CHO) und Hamster-Lungen-Zellen (CHL) verwendet [Elkind, M. M. und Sutton, H., Radiation Research 13, 556 (1960)].
Die Hamster-Ovarien-(CHO) oder Hamster-Lungen-Zellen (CHL) wurden bei 37ºC in 5% CO&sub2; enthaltender Luft in Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium (DME), supplementiert mit 5% fötalem Kälberserum (FCS), gezüchtet.
Die Zellen wurden zu je 5 · 10&sup5; Zellen pro Platte auf 60 mm Platten ausplattiert.
Nach dem Kultivieren über einen Zeitraum von 16 Stunden wurde pSV 2-DNA (5 ug oder 10 ug pro Platte) mittels der Calciumphosphatmethode [Graham, F. L. und Van der Eb, A. J., Virology 52, 456 (1973)] und nachfolgendem Glyzerinschock [Parker, B. A. und Stark, G. R., Virol 31 360 (1979)] in die Zellen eingeführt.
Nach Kultivierung für weitere 48 Stunden wurden die Zellen mit Trypsin behandelt und in einer im Vergleich zu oben auf ein Zehntel reduzierten Dichte auf mehrere 35 mm Platten ausplattiert. Sie wurden in DME - 10% dialysiertes FCS - 0,25 uM MTX (ein Selektionsmedium) gezüchtet. Das Selektionsmedium enthielt keinerlei Nukleinsäure-Bestandteile.
Drei Wochen später erschienen 39 Kolonien auf insgesamt zwei der Platten aus dem Experiment mit den CHO-Zellen. Ein ähnliches Experiment wurde unter Verwendung eines Selektionsmediums mit einer Konzentration von Methotrexat von 0,5 uM durchgeführt. Im Vergleich mit dem Ergebnis, das bei einer Konzentration von 0,25 uM Methotrexat erzielt wurde, war die Zahl der erschienenen, gegenüber MTX resistenten Transformanden bei der Methotrexat-Konzentration von 0,5 UM reduziert.
Ein Wachstum der Wirtszellen wurde in dem Selektionsmedium mit 0,25 uM MTX, ohne daß das Plasmid pSV 2 in die Zellen transfiziert worden war, nicht beobachtet.
Im Fall eines Selektionsmediums mit 0,1 uM MTX zeigten die Wirtszellen Resistenz und wuchsen bis zur Konfluenz, unabhängig ob DNA von pSV 2 transfiziert worden war oder nicht.
16 Kolonien, die gegenüber 0,25 uM MTX resistent gemacht worden waren, wurden mit Hilfe von Klonierringen abgetrennt, in Titer-Platten mit 12 Vertiefungen überführt und dann bis zur Konfluenz in einem Selektionsmedium mit 0,25 uM MTX hochgezogen.
Das Kulturmedium wurde durch einen frischen Vorrat desselben Mediums ersetzt, und die Zellen wurden weitere 24 Stunden gezüchtet. 15 ml des Kulturüberstandes wurden aufgenommen, die lytische Aktivität des Fibrin-Gerinnsels wurde an Hand des Fibrin-Plattier-Verfahrens (fibrin plate method) gemessen [R&ijlig;ken, D. C. et al., Biochim. Biophys. Acta 580, 140 (1979)]. 12 Kolonien zeigten Aktivität (10-40 U/ml).
Wenn Anti-tPA-Serum dann dem Kulturüberstand zugemischt wurde, löschte das Serum die lytische Aktivität gegenüber den Fibrin- Gerinnseln. Die Aktivität wurde jedoch nicht verloren, wenn Anti-UK-Serum dem Kulturüberstand zugemischt wurde. Es ist daher klar, daß tPA in dem Überstand enthalten war.
Nachdem die oben erwähnten 12 Klone getrennt in 25 cm² Flaschen gezüchtet worden waren, wurden sie mit geringer Dichte (100 - 1000 Zellen/Platte) auf 10 cm Platten ausplattiert. In einem Selektionsmedium, das 0,25 uM enthielt, wurden die Zellen etwa 2 Wochen kultiviert, und 160 einzelne Klone wurden isoliert.

(2) Messen der tPA-Aktivität:

Die durch die Transformanden produzierte Menge an tPA wurde nach dem folgenden verfahren ermittelt.
Einer 25 cm² Flasche wurde das Kulturmedium entnommen, die die an der Platte haftenden gewachsenen Zellen enthalten, das Innere der Flasche wurde mit Phosphat gepufferter Salzlösung gewaschen. Anschließend wurde eine geringe Menge 0,25% Trypsin zugesetzt, und die Zellen wurden von der Bodenwandung der Flasche abgelöst.
Eine geeignete Menge des Kulturmediums wurde dann in die Flasche gefüllt, und die Zellen wurden gründlich darin suspendiert. Dann wurde die Zahl der Zellen ermittelt. Es erfolgte ein Verdünnen der Zellen, so daß eine Zellsuspension von 2 · 10&sup5; oder 1 ·10&sup5; Zellen/ml hergestellt wurde. Nachdem 1 ml der Suspension auf die Vertiefungen einer Titerplatte mit 12 Vertiefungen gegeben worden war, und die Zellen dann dort 24 Stunden gehalten worden waren, wurden 15 ul des Kulturüberstands verwendet, um die tPA-Aktivität nach dem oben beschriebenen Fibrin-Plattier-Verfahren zu bestimmen. Es wurde gegenüber der Anzahl der Zellen nach der 24 Stunden-Kultur keine bedeutende Zunahme festgestellt.
Da das Fibrin-Plattier-Verfahren bei einer tPA-Aktivität von um die 50 U/ml eine hohe Reproduzierbarkeit hatte, wurden Kulturüberstände mit höheren Aktivitäten nach 2- bis 8-facher Verdünnung gemessen.

(3) Genetische Amplifikation mittels Methotrexat:

Um die Produktionsrate des tPA durch die das tPA produzierenden Transformanden zu erhöhen, wurde eine genetische Amplifikation derart durchgeführt, daß 160 Einzelklone, die in dem oben beschriebenen Vorgang (1) erhalten worden sind, als Ausgangsmaterial Verwendung fanden.
Der gegenüber MTX in einer Konzentration von 0,25 uM resistente Transformand wurde mit einer Dichte von 10³-10&sup5; Zellen/Platte auf eine 10 cm Platte ausplattiert und dann etwa 2 Wochen in einem Selektionsmedium gezüchtet, das 1 uM MTX enthielt.
Kolonien, die erschienen, wurden mittels Klonierringen isoliert, in Platten mit 24 Vertiefungen überführt und dann bis zur 90%igen Konfluenz hochgezogen.
Das Kulturmedium wurde durch einen frischen Vorrat desselben Mediums ersetzt, und die Zellen wurden weitere 24 Stunden gezüchtet. 15 ul des Kulturüberstandes wurden dann aufgenommen, und seine tPA-Aktivität wurde an Hand des Fibrin-Plattier-Verfahrens gemessen.
Zellen jeden Klons, der eine hohe Aktivität zeigte, wurden in eine 25 cm² Flasche überführt und dann darin kultiviert. Die tPA-Aktivität pro Einheits-Zellzahl wurde nach der Methode der Aktivitätsmessung bestimmt, die in dem oben beschriebenen Vorgang (2) erläutert ist. Auf diese Weise wurden Klone mit der Fähigkeit zur Produktion höherer Mengen an tPA selektiert.
Die Zellen und der so erhaltene, große Mengen tPA produzierende Transformand wurden in Gegenwart einer wesentlich höheren Konzentration von MTX gezüchtet. Dann wurden aus den Zellen, die gegenüber MTX in der wesentlich höheren Konzentration resistent gemacht worden waren, die Zellen gescreent, die eine höhere tPA-Produktionsrate aufweisen. Durch sukzessive Wiederholung der vorherigen Schritte wurde ein Transformand erhalten, der tPA in großen Mengen produziert. Einige der Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt.
Übrigens wurden Transformanden mit Resistenz gegenüber 0,25 uM MTX auf ähnliche Art nicht nur bei Verwendung von CHO-Zellen erhalten, sondern auch wenn CHL-Zellen als Wirt verwendet wurden. Mittels genetischer Amplifikation mit MTX wurde von den gegenüber 0,25 uM MTX resistenten Transformanden ein Transformand von CHL-Zellen erhalten, der große Mengen tPA produziert. Tabelle Klon No. MTX t-PA Produktionsrate
Nachdem die erhaltenen Transformanden, die große Mengen tPA produzieren, für etwa 3 Monate unter Verwendung eines Selektionsmediums der Subkultur unterzogen worden sind, wurde die Aktivität wiederum gemessen. Es wurde keine Verschlechterung der Fähigkeit zur Produktion von tPA festgestellt. Die Wachstumsgeschwindigkeit der Transformanden mit der Fähigkeit, große Mengen tPA zu produzieren, betrug in dem Selektionsmedium 24-40 Stunden, was die Verdopplungszeit der Zellen betrifft.
Wie oben beschrieben versteht es sich von selbst, daß ein amplifizierter Transformand mit hoher Produktivität eines Fremdgen-Produkts gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden kann, insbesondere durch Einführung eines Wildtyp DHFR- Gens als Selektionsmarker in Wildtyp tierische Zellen, so daß daraus ein Transformand erhalten werden kann, und durch anschließende Züchtung des Transformanden in einem Amplifikationsmedium, das MTX als einen Inhibitor der DHFR in einer Konzentration von 50 uM oder weniger enthält.

Claims

1. Transformand, erhältlich durch Transformation einer Wildtyp tierischen Zelle mit einem Vektor, der ein heterologes Wildtyp DHFR-Gen, wirksam verbunden mit regulatorischen DNA-Sequenzen des Affenvirus 40 (SV 40), die wiederum das SV 40 Polyadenylierungssignal sowie ein Strukturgen umfassen, enthält, wobei diese tierische Zelle, in die der Vektor eingebracht worden ist, zunächst in einem Selektionsmedium, das Methotrexat in einer Konzentration von 0,25 bis 1 uM enthält, gezüchtet wird, so daß der so erhaltene Transformand selektiert wird, und anschließendes Züchten des Transformanden in einem Amplifikationsmedium, das Methotrexat in einer Konzentration von 0,25 bis 50 UM enthält, so daß sowohl das Wildtyp DHFR-Gen als auch das Strukturgen amplifiziert werden.

2. Der Transformand nach Anspruch 1, wobei das Wildtyp DHFR-Gen von einer Maus-Zellinie stammt.

3. Der Transformand nach Anspruch 1, wobei das Strukturgen ein menschliches tPA-Gen ist, das von einer normalen Zelle, z. B. von dem MTC-Stamm, stammt.

4. Der Transformand nach Anspruch 3, wobei das menschliche tPA-Gen mit den SV 40 regulatorischen DNA-Sequenzen für die Expression, die die Expression des menschlichen tPA regulieren, wirksam verbunden ist.

5. Der Transformand nach Anspruch 1, wobei die Wildtyp tierische Zelle eine Wildtyp Säugerzelle, z. B. eine Wildtyp Hamsterzelle (Chinese hamster cell), ist.

6. Der Transformand nach Anspruch 5, wobei die Wildtyp Hamsterzelle (Chinese hamster cell) eine Wildtyp Ham- Ster-Ovarienzelle (CHO) oder eine Wildtyp Hamster-Lungenzelle (CHL), ist.

7. Verfahren zur Herstellung eines Transformanden, umfassend die Transformation einer Wildtyp tierischen Zelle mit einem Vektor, der ein heterologes Wildtyp DHFR-Gen, wirksam verbunden mit regulatorischen DNA-Sequenzen des Affenvirus 40 (SV 40), die wiederum das SV 40 Polyadenylierungssignal sowie ein Strukturgen umfassen, enthält, wobei diese tierische Zelle, in die der Vektor eingebracht worden ist, zunächst in einem Selektionsmedium, das Methotrexat in einer Konzentration von 0,25 bis 1 uM enthält, gezüchtet wird, so daß der so erhaltene Transformand selektiert wird, und wobei der Transformand anschließend in einem Amplifikationsmedium, das Methotrexat in einer Konzentration von 0,25 bis 50 uM enthält, gezüchtet wird, so daß sowohl das Wildtyp DHFR-Gen als auch das Strukturgen amplifiziert werden.

8. Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Wildtyp DHFR- Gen von einer Maus-Zellinie stammt.

9. Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Strukturgen ein menschliches tPA-Gen ist, das von einer normalen Zelle, z. B. von dem MTC-Stamm, stammt.

10. Das Verfahren nach Anspruch 9, wobei das menschliche tPA-Gen mit den Affenvirus 40 (SV 40) regulatorischen DNA-Sequenzen, die die Expression des menschlichen tPA regulieren, wirksam verbunden ist.

11. Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Wildtyp tierische Zelle eine Wildtyp Säugerzelle, z. B. eine Wildtyp Hamsterzelle (Chinese hamster cell), ist.

12. Das Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Wildtyp Hamsterzelle (Chinese hamster cell) eine Wildtyp Hamster- Ovarienzelle (CHO) oder eine Wildtyp Hamster-Lungenzelle (CHL), ist.