DE3752281T2

DE3752281T2 - Stabilisierung von messenger-rns in tierischen zellen

Info

Publication number: DE3752281T2
Application number: DE3752281T
Authority: DE
Inventors: Stephen Gillies
Original assignee: Damon Biotech Inc
Current assignee: Abbott Biotech Inc
Priority date: 1986-09-12
Filing date: 1987-09-03
Publication date: 2000-01-13
Anticipated expiration: 2007-09-04
Also published as: JPH07163388A; AU7851087A; EP0282512A1; JPH02500947A; EP0282512B1; DE3752281D1; DK256788D0; JP2622355B2; AU601214B2; DK256788A; WO1988002029A1; CA1297435C; JP2619891B2; ATE181115T1; EP0282512A4

Description

Hintergrund der Erfindung

Die Erfindung betrifft Produkte und Verfahren zur Verbesserung der Produktion von Proteinen in Säugerzellen lymphoiden Ursprungs. Insbesondere betrifft sie Produkte und Verfahren zur Verbesserung der Proteinproduktion, indem die Gleichgewichtskonzentration von translationskompetenter nRMA durch Verminderung der Geschwindigkeit des intrazellulären Abbaus der mRNA erhöht wird.
Die Proteinproduktion umfaßt in den meisten tierischen Zellen die Synthese von Enzymen, Strukturproteinen, Oberflächenproteinen und zahlreichen Proteinen mit speziellen Funktionen, wie Lymphokinen und Hormonen. In der Regel werden relativ kleine Mengen dieser Proteine produziert. Allerdings existieren Typen von tierischen Zellen, die große Mengen von Porteinen zur systemischen Verwendung im tierischen Körper zu produzieren und zu sezernieren vermögen. Beispiele für den letzteren Typ von Zellen umfassen Zellen des Kreislaufsystems, die Globuline und Fibrinogen produzieren, Leberzellen, die Serumalbumin produzieren, und die β-Zellen der Langerhanschen Inselzellen, die Insulin produzieren. Könnten die für die Expression mit derartig hoher Stärke verantwortlichen genetischen Mechanismen zur Herstellung von Lymphokinen, Antikörpern oder anderen proteinartigen Materialien von Interesse genutzt werden, so könnten wertvolle Proteine massenhaft verfügbar gemacht werden.
Die Expression von endogener DNA in eukaryotischen Zellen umfaßt die Transkription der DNA zu mRNA, die anschließende Migration der mRNA zu Ribosomen und die tRNA-vermittelte Translation der mRNA zu Proteinen, die die Aminosäuresequenz, für die die mRNA codiert, zwischen ihrem Start- und Stopcodon enthalten.
Wie bei Gillies et al. in Cell, Bd. 33, Ss. 717-728, Juli 1983 und in der mitanhängigen U.S.-Anmeldung mit der Seriennummer 592 231, eingereicht am 22. März 1984, offenbart, sind für die hohe Stärke der Proteinexpression in spezialisierten Zellen, die große Mengen Immunglobulin produzieren, zelluläre Enhancer-Elemente von großer Bedeutung. Die Enhancer bewirken offensichtlich durch endogene mRNA-Polymerase eine Erhöhung der Transkriptionsgeschwindigkeit von DNA zu mRNA. Höhere mRNA-Konzentrationen führen in solchen Zellen zu einer deutlichen Zunahmen der Expressionsstärke. Die Aktivität solcher Enhancer-Elemente ist unabhängig von der Orientierung und kann auch beobachtet werden, wenn die Sequenz, die den Enhancer enthält, 10000 oder mehr Basenpaare von dem Promotor für das Gen, das das Protein codiert, entfernt liegt. Diese zellulären Enhancer sind anscheinend gewebespezifisch, d. h. die Aktivität eines zellulären Enhancers, der seine Funktion im endogenen Genom einer Lymphoidzelle ausübt und die Produktion einer bestimmten mRNA verbessert, ist stark vermindert oder fehlt, wenn der Enhancer in einen zur Transformation nichtlymphoider Zellen verwendeten Vektor eingebaut ist. Allerdings kann ein Vektor, der das Enhancer-Element, den Promotor und ein rekombiniertes Gen, das ein gewünschtes Protein codiert, enthält, wenn er in eine Zelle entsprechend der Art, bei der der Enhancer von Natur aus die Transkriptionsgeschwindigkeit steigert, transfiziert wird, die Zelle erfolgreich transformieren, so daß das rekombinierte Gen mit hoher Stärke exprimiert wird.
Eukaryotische DNAs enthalten hinter dem Stopsignal eine Sequenz von Basen, wovon ein Teil als Signal zum Start einer Addition von Adeninresten (im folgenden Poly(A)) 3' vom Stopsignal in der translatierten mRNA dient. Die Polyadenylierung erfolgt hauptsächlich im Kern und wird durch Poly(A)-Polymerase vermittelt, die jeweils einen Adenylsäurerest addiert. Poly(A) codiert nicht für eine Aminosäuresequenz, nachdem das Stopcodon die Translation beendet hat, sondern es wird angenommen, daß sie zur Stabilisierung der mRNAs und zur Effizienz der Translation der mRNA-codierenden Region in Aminosäuren beiträgt.
Die Poly(A) in der mRNA von Säugerzellen liegen in einer als 3'-untranslatierbarer (im folgenden 3'UT) Endteil bekannten Sequenz. Die 3'UT erstreckt sich in der Regel vom Stopcodon für das Translationsprodukt zum Terminus der Poly(A). Die 3'UT-Regionen der Säuger-mRNA besitzen typischerweise einen als AAUAAA-Hexanucleotidsequenz bekannten homologen Bereich. Diese Sequenz wird als Poly(A)-Additionssignal betrachtet. Es liegt oft um 11 bis 30 Basen vor der Poly(A)-Additionsstelle.
Die Funktion, sofern vorhanden, der 3'UT- und Poly(A)- Region wurde unlängst von Soreq et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Bd. 78, Nr. 3, Ss. 1741-1745, März 1981); Zaret et al. (J. Mol. Biol., 1984, Bd. 176, Ss. 107-135); Baralle (International Review of Cytology, Bd. 81, Ss. 71-106); und Ross et al. (J. Mol. Biol., 1983, Bd. 167, Ss. 607-617) erforscht.
Soreq et al. berichten, daß die Entfernung der Poly(A) und von ungefähr 100 angrenzenden Resten von einer ersten menschlichen Fibroblasten-β-Interferon-mRNA die Translationsaktivität oder die funktionelle Stabilität dieser mRNA in Oozyten nicht verändert, wohingegen sich durch die Deletion der Poly(A) und von ungefähr 200 angrenzenden Resten ihre Translationswirksamkeit verringert. Die Entfernung von ungefähr 200 Poly(A)-Resten und von 200 angrenzenden Resten einer zweiten β-Interferon-mRNA veränderte weder die Translationsaktivität noch die funktionelle Stabilität der mRNA in Oozyten. Die Autoren folgerten daraus, daß weder die Poly(A)- Reste noch große Abschnitte der 3'-nichtcodierenden Region zur Aufrechterhaltung der funktionellen Stabilität von menschlichen β-Interferon-mRNAs in solchen Oozyten erforderlich sind.
Zaret et al. studierten die cycl-512-Mutante der Hefe S. cerevisiae, die eine Deletion von 38 Basenpaaren in der 3'-nichtcodierenden Region des CYC-1-Gens, das Iso- 1-Cytochrom C codiert, aufweist. Sie berichten, daß verschiedene 3'-nichtcodierende Sequenzen, die durch chromosomale Umlagerung entstanden sind, die Stabilität von CYC-1-mRNA verbessern und unterschiedliche Wirkungen auf die mRNA-Translationseffizienz besitzen.
In der Veröffentlichung von Baralle, The Functional Significance of Leader and Trailer Sequences in Eucaryotic mRNAs, beschreibt der Autor, daß "der 3'- nichtcodierenden Region keine eindeutige Funktion zukommt" und daß "das Auftreten von großen Deletionen oder Insertionen während der Evolution dieser Gene die Vermutung nahelegt, daß die bestimmten Sequenzen, die die 3'-nichtcodierende Region enthalten, für die mRNA- Funktion nicht essentiell sind". Allerdings beschreibt Baralle, daß Poly(A) bei der Unterstützung der mRNA- Stabilität keine Rolle spielt. Beispielsweise wurde festgestellt, daß die Entfernung des Poly(A)-Segmentes aus Globin-mRNA die Halbwertszeit der mRNA in Oozyten stark verringert. Baralle vermutet jedoch, daß Poly(A) zur erfolgreichen Translation anscheinend nicht notwendig ist, was durch Studien bewiesen wurde, in denen die Poly(A) aus der mRNA entfernt wurde.
Ross und Pizarro überprüften die Hypothese, daß die Gleichgewichtskonzentrationen von menschlichen β- und δ-Globinproteinen zum Teil durch die intrazelluläre Stabilität ihrer entsprechenden Messenger-mRNA bestimmt werden. Sie haben festgestellt, daß der schnelle Umsatz von δ-Globin in mRNA wenigstens zum Teil für die niedrige Konzentration an δ-Globin-mRNA in kernlosen peripheren Blut-Retikulozyten verantwortlich ist, und vermuteten, daß die Geschwindigkeit des mRNA-Zerfalls von Nucleotidsequenzsignalen, die in der 3'-untranslatierten Region liegen, festgelegt werden kann. Sie beobachteten, daß die 5'-untranslatierten Regionen von β- und δ-Globin-mRNAs ähnlich sind, daß sich aber ihre 3'-untranslatierten Regionen deutlich unterscheiden, und schlagen vor, daß die Möglichkeit bestehen sollte, die Rolle der 3'-untranslatierten Region bei der Festlegung der mRNA-Stabilität durch Vergleich der Halbwertszeiten in transfizierten Zellen von chimären mRNAs, die β- oder δ-3'-Termini enthalten, zu testen.
Die europäische Patentschrift 0077689 offenbart ein Genmanipulationsverfahren, wobei eine Hefe mit einem Gen transformiert wird, in dem die 3'UT eines Strukturgens stromabwärts von einem exogenen Gen hinzugefügt ist. Der Transformant weist eine höhere Expressionsstärke auf, wenn das exogene Gen den 3'UT enthält. In der Tat haben Studien ergeben, daß die Expression in der Hefe, die das Plasmid mit der Region entsprechend der 3'UT wie hinzugefügt trägt, im Vergleich mit der Hefe, die das Plasmid ohne eine solche hinzugefügte Region trägt, etwa zehnmal so stark ist.
Die EP 0 237 157 offenbart ein Verfahren zur Vergrößerung der Proteinkonzentrationen unter Verwendung eines Enhancergens. Die EP 0 237 157 schlägt weiterhin vor, daß eine Verkürzung der UT-Region die Stabilität der mRNA in Kombination mit dem Kombinationsgen vergrößern kann.
Die EP 0 173 552 offenbart die Konstruktion eines beweglichen Poly(A)-Additionssignals aus dem Rinderwachstumshormon-Gen und die Verwendung des beweglichen Poly(A)-Signals zur Verbesserung der Produktion von TPA. Das bewegliche Poly(A)-Signal wird durch successive Deletionen auf einer der beiden Seiten der AATAA- Sequenz hergestellt.
Ein Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Produktes und eines Verfahrens zur wirksamen Produktion eines gewünschten Proteins, einschließlich von menschlichem TPA in einer Myelom-Zellinie. Ein weiteres Ziel ist die Bereitstellung von Vektoren zur Transfektion von Myelomzellen zur Induktion einer starken Expression eines Gens, das für ein gewünschtes Protein codiert. Ein weiteres Ziel besteht in der Bereitstellung von Transformanten, die in Kultur große Proteinmengen zu therapeutischen, diagnostischen und ähnlichen Zwecken produzieren. Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren und rekombinierten nativen DNAs, die die mRNA-Stabilität in transfizierten Myelom-Zellinien durch Verminderung der Geschwindigkeit des intrazellulären mRNA-Zerfalls unterstützen, wodurch die Expressionsstärken erhöht werden.
Diese und weitere Ziele der Erfindung werden der Fachwelt durch die folgende Beschreibung und die Ansprüche nahegebracht.

Zusammenfassung der Erfindung

Es wurde ein Verfahren zur Verbesserung der Produktion ausgewählter Proteine in Säugerzellinien gefunden, die normalerweise in Immunglobuline sezernieren. Es wurde festgestellt, daß ein kurzes Segment einer 3'UT-Region und die Polyadenylierungsregion bei Rekombination 3' vom Stopcodon in einer für ein Protein von Interesse codierenden DNA eine unterstützende Wirkung auf die Verbesserung der Produktion des Proteins von Interesse haben. Die Sequenzen, die das kleine 3'UT-Segment und die Polyandenylierungsstelle enthalten, stabilisieren offensichtlich die mRNA entsprechend der translatierten Region und erhöhen die Translationsstärken. Die Gleichgewichtskonzentration der mRNA, die das Protein von Interesse codiert, ist relativ zu mRNAs mit längeren untranslatierten Regionen erhöht.
Erfindungsgemäß wird diese Entdeckung zur Bereitstellung von Vektoren und von Verfahren zur Herstellung eines Proteins von Interesse und zur Herstellung von Transformanten, die zur Produktion solcher Materialien unter erhöhten Expressionsstärken kultiviert werden können, ausgenutzt. Erfindungsgemäß können entweder exogene oder endogene Proteine produziert werden, d. h. es können Proteine, die im natürlichen Genom der Wirtszellen nicht codiert werden, Proteine, die codiert, jedoch normalerweise in der Wirtszelle nicht exprimiert werden, oder Proteine, die normalerweise nur schwach exprimiert werden, produziert werden.
Erfindungsgemäß wird aus einer Zelle, die von Natur aus das Protein von Interesse produziert, eine DNA gewonnen, die eine codierende Region, ein Stopcodon und eine native 3'UT, enthaltend ein Polyadenylierungssignal für das Protein von Interesse, enthält. Die Nucleotidsequenz der 3'UT-Region dieser DNA wird so verändert, daß eine intakte transkriptionskompetente kürzere rekombinierte native DNA mit veränderter 3'UT mit weniger als 300 Nucleotidbasen zwischen Stopsignal und AATAAA-Polyadenylierungssignal produziert wird. Die rekombinierte DNA wird in eine ausgewählte Säugerzellinie transfiziert, die normalerweise Immunglobuline sezerniert. Die resultierende transfizierte Zellinie wird zur Produktion des Proteins von Interesse kultiviert. Die produzierte Proteinmenge ist größer als die Proteinmenge derselben Zellinie, die unveränderte, die längere native 3'UT enthaltende DNA für das Protein von Interesse enthält.
Bei einer Ausführungsform enthält die kürzere rekombinierte DNA einen Teil der 3'UT der DNA des Proteins von Interesse.
Bei anderen Ausführungsformen wird wenigstens ein Teil der veränderten 3'UT aus nichtzellulärer DNA, z. B. viraler DNA, erhalten, während er sonst aus Säuger-DNA erhalten wird. Das Protein von Interesse kann ein Immunglobulin oder ein Bruchteil davon, ein Hormon, ein Impfstoff, Lymphokin, Zytokin, Enzym oder Proenzym sein. Beispielsweise können die gewünschten Proteine einen Plasminogenaktivator wie den menschlichen Gewebe- Plasminogen-Aktivator enthalten, dessen Produktion hier als Modell verwendet und ausführlich beschrieben ist. Die Säugerzellinie ist eine kultivierbare Zellinie wie eine Myelom-Zellinie, obwohl andere Säugerzellen, die normalerweise Immunglobuline sezernieren, verwendet werden können.
Erfindungsgemäß kann das Verfahren den zusätzlichen Schritt der Kombination einer DNA, enthaltend ein zelluläres Enhancerelement zur Verstärkung der Transkription der rekombinierten DNA, proximal zu der für das Protein von Interesse codierenden DNA umfassen. Die Erfindung kann außerdem als Merkmal ein Blockierungselement, wie in der mitanhängigen Anmeldung mit der Seriennummer 837 595, eingereicht am 7. März 1986, beschrieben, aufweisen. Solche Blockierungselemente ermöglichen die Produktion von Transformanten, die hohe Konzentrationen eines gewünschten Proteins produzieren, während das Markerprotein nur in zur Selektion erforderlichen Konzentrationen produziert wird.
Die Erfindung weist ferner als Merkmale einen Vektor zur Produktion eines Proteins bei Transfektion in eine Säugerzellinie, die normalerweise Immunglobuline sezerniert, auf. Der Vektor besteht aus transkriptionskompetenter DNA, die gemäß dem oben zusammengefaßten Verfahren produziert wird. Dieser Vektor verbessert die Produktion eines Proteins in einer Myelomzellinie relativ zu sonst identischen Vektoren, die für ein Protein von Interesse mit einer nicht verkürzten untranslatierten Region codieren.
Die Erfindung weist ferner als Merkmale eine Transformante zur Produktion eines Proteins von Interesse auf. Die Transformante umfaßt vorzugsweise eine Säugerzelle, die normalerweise Immunglobuline produziert, wie eine Myelomzelle. Die Transformante enthält den Vektor, der die oben geschilderte exprimierbare DNA aufweist. Die Transformante vermag erhöhte Mengen des Proteins von Interesse relativ zu sonst identischen Transformanten zu produzieren, die rekombinierte DNA einschließlich der 3'-untranslatierten Region in der vollen Länge enthalten, die von Natur aus in dem Gen, das für das Protein von Interesse codiert, vorhanden ist. Der Grund für die erfindungsgemäß erzeugten erhöhten Expressionsstärken liegt offensichtlich in einer Verbesserung der der Gleichgewichtskonzentration der entsprechenden mRNA in den transfizierten Zellen. Es wird angenommen, daß die Kürze der 3'UT-Region der mRNA dazu dient, den Abbau der mRNA innerhalb der Zelle zu verringern, wodurch die intrazelluläre Halbwertszeit der mRNA und die Expressionsstärken erhöht werden.
Es ist bekannt, daß die Phosphodiester-Brücken der DNA und RNA durch Exonukleasen angegriffen werden, die entweder auf das 3'- oder das 5'-Ende des Moleküls einwirken. Enzyme, die auf das 3'-Ende einwirken, hydrolysieren die Esterbindung zwischen dem 3'-Kohlenstoff und der Phosphorgruppe, während die 5'-Enyzme die Esterbindung zwischen der Phosphorgruppe und dem 5'-Kohlenstoff der Phosphodiester-Brücke angreifen. Endonukleasen erfordern keine freie terminale 3'- oder 5'-Hydroxylgruppe. Sie greifen 3'- oder 5'-Bindungen an, unabhängig davon, wo sie in der Polynucleotidkette vorkommen.
Es wird angenommen, daß rekombinierte DNAs, die eine lange 3'UT enthalten, verdaut werden, wenn eine Endonuklease einen Teil der mRNA der 3'UT, die nicht von einem Ribosom gebunden ist, abspalten, woran sich die Verdauung durch die Exonuklease anschließt. Aufgrund der Kürze der 3'UT-Region der mRNA bei Assoziation mit den Ribosomen verbleibt weniger mRNA in einem an Ribosomen ungebundenen Zustand zurück, und die Anzahl der Stellen für einen Endonukleaseangriff ist geringer. Das Vorhandensein der Poly(A)-Stelle schützt das 3'- Ende vor Exonukleasen. Die Geschwindigkeit des Abbaus der mRNA ist darum aufgrund der Kürze der 3'UT-Region verringert. mRNA wird darum durch den erfindungsgemäßen Mechanismus stabilisiert und ihre biologische Funktion gesteigert, was zu der verstärkten Expression der gewünschten Proteine führt.
Für ein vollständigeres Verständnis der Natur und Ziele der Erfindung sollte auf die folgende ausführliche Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 ist ein schematisches Diagramm und erläutert die gesamte erfindungsgemäße Verfahrensweise;
Fig. 2 ist ein Diagramm und erläutert verschiedene DNA- Segmente, die mit einem für ein gewünschtes Proteinprodukt (tPA) codierendes Gen verschmolzen sind; und
Fig. 3 ist ein Diagramm von Plasmid-pEMpt-PA, dem bevorzugten Expressionsvektor zur Verwendung bei der Produktion von tPA in Myelomzellen. Dieser Vektor stellt die derzeit bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar.

Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung stellt ein Verfahren, einen Vektor und eine Transformante zur Verbesserung der Produktion ausgewählter Proteine in Säugerzellen bereit. Die 3'UT- Region einer für ein Protein von Interesse codierenden DNA wird verändert, so daß eine kürzere rekombinierte DNA mit einer 3'UT-Region produziert wird, die im allgemeinen weniger als 300 Nucleotidbasen enthält und zwischen dem Stopcodon des Gens und dem AATAAA-Poly(A)- Signal weniger als 200 Basen enthalten kann. Mit der resultierenden rekombinierten DNA wird eine Säugerzellinie, die normalerweise Immunglobuline produziert und sezerniert, transfiziert. Die Transformante wird kultiviert, um im Vergleich mit derselben, mit einer unveränderten 3'-Region transfizierten Zellinie erhöhte Mengen des Proteins von Interesse zu produzieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist in Fig. 1 dargestellt. DNA 2 enthält eine codierende Region 6, die für ein Protein von Interesse codiert. Sie stammt aus einer Zelle, die von Natur aus das Protein produziert, z. B. synthetisiert durch herkömmliche Techniken unter Kenntnis der DNA-Sequenz. Beispielsweise kann die DNA eine natürlich vorkommende DNA oder eine chemisch synthetisiert DNA sein. Alternativ kann die DNA eine revers transkribierte cDNA sein, die herkömmlichen cDNA-Techniken entstammt. Die in der Regel lange Nucleotidsequenz der untranslatierten Region 4 dieser DNA 2 wird verändert, um eine intakte transkriptionskompetente kürzere rekombinierte DNA 5, die die Region 6 enthält, die für das Protein von Interesse codiert, und hinter dem Stopsignal liegt; eine 3'UT (7) mit einer Länge von weniger als etwa 300 Nucleotidbasen, verknüpft mit einem Polyadenylierungsadditionssignal 8, zu produzieren. Die rekombinierte DNA 5 enthält darum eine für das Protein von Interesse 6 codierende Region, ein Stopsignal 12 und eine kürzere 3'UT, die mit 7 bezeichnet und zwischen dem Stopsignal 12 und einem Poly(A)-Additionssignal 8 eingeschoben ist. Die 3'UT, die die Poly(A)-Stelle der rekombinierten DNA enthält, kann aus der DNA 2, die für das Protein von Interesse codiert, durch Abspleißen eines Segmentes der 3'UT erhalten werden.
Die rekombinierte DNA 5 wird zur Produktion eines Expressionsvektors 14 in ein Plasmid 10 inseriert. Das Plasmid enthält eine Promotorsequenz 16 und ein exprimierbares Markergen 18. Eine Säugerzellinie wird mit der rekombinierten DNA transfiziert, kloniert und auf eine Subpopulation von Zellen geprüft, die erfolgreich eingebracht wurden und das Gen 6 exprimieren können. Die transfizierte Zellinie wird zur Produktion des gewünschten Proteins kultiviert, das sodann isoliert und gereinigt wird.
Es wurde festgestellt, daß die 3'Uts der in großen Mengen vorkommenden Immunglobulin-mRNAs in lymphoiden Zellen, die Immunglobuline sezernieren, relativ kurz (weniger als etwa 300 Nucleotide) sind, wohingegen die 3'UTs von mehreren Genen von Interesse, die nicht in den lymphoiden Zellen exprimiert werden, relativ lang sind. Beispielsweise ist die UT-Region von tPA ungefähr 800 Nucleotide lang (Pennica et al., Nature, V. 301, 214-231. Jan., 10 = 983), diejenige des Faktors VIII etwa 1800 Nucleotide lang (Wood et al., Nature V. 313, 330- 337, Nov., 1984) und diejenige von Erythropoietin etwa 560 Nucleotide lang (Jacobs et al., Nature, V. 313, 806-810, Feb., 1985).
Die DNA-Rekombinationstechniken zur Herstellung von Expressionsvektoren und Transformanten, die bei der Erfindung geeignet sind, sind gut bekannt und entwickelt. Sie umfassen die Verwendung von diversen Restriktionsenzymen, die die DNA sequenzspezifisch schneiden, um glatte oder klebrige Enden zu erzeugen, DNA-Ligasen, Techniken, die die enzymatische Addition von klebrigen Enden an glattendige DNA-Moleküle erlauben, cDNA-Synthesetechniken, synthetischen Sonden zur Isolierung von Genen mit einer bestimmten Funktion, Aneinanderreihung von Oligonucleotiden zur Herstellung synthetischer DNAs, herkömmlichen Transfektionstech niken und ebenfalls herkömmlichen Techniken zur Klonierung und Subklonierung von DNA.
Es können verschiedene Vektortypen wie Plasmide und Viren einschließlich von tierischen Viren und Phagen eingesetzt werden. Normalerweise verwendet der Vektor ein Markergen 18, das einer erfolgreich transfizierten Zelle eine nachweisbare phänotypische Eigenschaft verleiht, die zur Identifizierung dafür verwendet werden kann, welche Individuen einer Population von Zellen erfolgreich die rekombinierte DNA des Vektors 14 eingebaut haben. Bevorzugte Marker zur Verwendung in den Myelomzellinien umfassen cDNA, die für ein Enzym codiert, das normalerweise von den Zellen nicht (oder nur schwach) exprimiert wird und die Zellen zum Überleben in einem Medium, das ein Toxin enthält, befähigt. Beispiele für solche Enzyme umfassen Thymidinkinase (TK), Adenosinphosphoribosyltransferase (APRT) und Hypoxanthinphosphoribosyltansferase (HPRT), die TK-, APRT- oder HPRT-defiziente Zellen zum Wachstum in Hypoxanthin/Aminopterin/Thymidin-Medium befähigen; Dihydrofolat-Reduktase (DHFR), die DHRF-defiziente Zellen zum Wachstum in Gegenwart von Methotrexat befähigen; die E.-coli-Enzym-Xanthin-Guanosin-Phosphoribosyltransferase (XGPRT, das Produkt des gpt-Gens), die normale Zellen zum Wachstum in Gegenwart von Mycophenolsäure befähigt; und das prokaryotische Enzym Tn5- Phosphotransferase, die normale Zellen zum Wachstum in Gegenwart von Neomycin befähigen. Weitere geeignete Markergene sind in Vektoren geeignet, die zur erfindungsgemäßen Transformation von Myelomzellen eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Vektoren können ein Enhancerelement des Typs enthalten, welches auf Promotoren einwirkt, die sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende des Enhancerelementes oder beanstandet von beiden Enden angeordnet sind, um die Transkription von Genen, die am 3'-Ende des Promotors liegen, zu verstärken. Das Enhancerelement kann DNA viralen Ursprungs enthalten, wie diejenigen, die von Banerji et al. (Cell, V. 27, 288-308, 1981), deVilliers und Shaffner (Nucl. Acids Res., V. 9, 6251-6264, 1981) oder Levinson et al. (Nature, V. 295, 568-572, 1982) offenbart sind, allerdings ist ein zelluläres Enhancerelement vorzugsweise von dem unlängst von Gillies und Tonegawa entdecken und in Cell (V. 33, 717-728, 1983) offenbarten und ausführlicher in der U.S.-Anmeldung mit der Seriennummer 592 231, eingereicht am 22. März 1984, offenbarten Typs. Der Vektor kann zudem ein Blockierungselement, wie beschrieben in der mitanhängigen Anmeldung mit der Seriennummer 827 595, eingereicht am 7. März 1986, enthalten, welches die Produktion von Transformanten ermöglicht, die unter dem Einfluß des Enhancers hohe Konzentration eines gewünschten Proteins produzieren, während das Markerprotein nur in geringeren Mengen, die zur Selektion erforderlich sind, produziert werden.
Fig. 3 stellt die Restriktionskarte des bevorzugten Plasmidvektors dar, der erfindungsgemäß zur Produktion von tPA eingesetzt wird. Dieser Vektor wird als pEMp- tPA bezeichnet und enthält 7498 Basenpaare. Er enthält ein von einer Myelomzelle stammendes Enhancerelement, welches die Transkription von mRNA aus inserierter DNA verstärkt, die Protein, hier menschlicher tPA (siehe Gillies et al. Cell 1983, supra), codiert, und die Vektorkonstruktionsprinzipien ausnutzt, die selektiv die Enhancerfunktion gemäß der Offenbarung der mitanhängigen U.S.-Anmeldung mit der Seriennummer 837 595 regulieren. Genauere Angaben über die Konstruktion des Vektors sind nachstehend offenbart.
In den bevorzugten Ausführungsformen ist das Wirtszellensystem, das mit der rekombinierten DNA transfiziert wird, eine kontinuierliche oder etablierte Zellinie, die eine Änderung erfahren hat, wodurch die Zellen zum unbegrenzten Wachstum befähigt sind. Diese Zellen sind darum anders als normale Zellen, die sich in Kultur in einer begrenzten Anzahl von Generationen vor der Alterung teilen. Die Fähigkeit zum unbegrenzten Wachstum fördert ferner die erhöhte Produktion der Proteine von Interesse.
Die zur Durchführung der Erfindung verwendeten Wirtszellen sind Säugerzellen, die normalerweise Immunglobuline produzieren und sezernieren. Diese Zellen kommen sich in der Regel im Kreislaufsystem vor. Die tatsächlich verwendete Zelle kann die Fähigkeit zur Sezernierung von Immunglobulinen durch vorherige Selektion verloren haben.
Zudem ist es bevorzugt, daß das Wirtszellensystem Zellen enthält, die aus Mäusen oder Ratten (im Gegensatz zu menschlichen Zellen) stammen, um die Möglichkeit einer Verunreinigung des produzierten Proteins durch menschliche Viren zu vermindern. Bei den bevorzugten Ausführungsformen sind die Myelomzellen das Wirtskultursystem. Myelomzellen sind in der Regel leicht zu kultivieren und sezernieren die Expressionsprodukte in das extrazelluläre Medium.
Der in Fig. 3 offenbarte Vektor und andere geeignete Expressionsvektoren werden erfindungsgemäß zur Transfektion von Myelomzellen vorzugsweise aus der Maus, wie die Zellinie J558 (ATCC-TIB 6), Sp2/0-Ag14 (ATCC CRL 1581) und P3 · 63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580), verwendet. Die bevorzugte Myelomzellinie ist J558L (ATCC CRL 9132, siehe Oi et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, V, 80, S. 825 1983). Diese Zellen umfassen bösartige Transformanten von B-Zellen aus dem Kreislaufsystem der Balb/C-Maus und stammen aus Knochenmarksgewebe.
Die Transformanten der Zellen des vorstehend ausgeführten Typs können in Suspension oder vorzugsweise in Mikrokapseln gemäß der in der U.S.-Patentschrift Nr. 4 409 331 von F. Lim offenbarten Verfahrensweise kultiviert werden. Zur leichten Reinigung und zur Unterstützung der postsekretorischen Stabilität des Proteinproduktes ist es bevorzugt, daß die Zellen in serumfreiem Medium kultiviert werden. Das extrazelluläre Protein wird täglich geerntet, wenn das Medium erneuert wird. Dieser Weg hat den Vorteil, daß das Produkt ohne verunreinigende proteolytische Enzyme und andere inaktivierende Faktoren, die oft in Rinder- oder Pferdeseren vorhanden sind, produziert wird. Die bevorzugte J558L-Zelle sezerniert die leichte lambda- Kette von Immunglobulin A in beträchtlichen Mengen. Diese und andere verunreinigenden Proteine können vom Proteinprodukt leicht abgetrennt werden.
Die Erfindung kann, abgesehen von tPA, zur Herstellung großer Mengen wertvoller Proteine in Zellen, die durch Gentechnik hergestellt worden sind, verwendet werden, wie hier offenbart. Nicht einschränkende Beispiele umfassen weitere Plasminogenaktivatoren und Proaktivatoren, Blutgerinnungsfaktoren, Hormone, Interferone, Antikörper, Enzyme und Proenzyme, Impfstoffe und verschiedene Lymphokine und Zytokine.
Das folgende Beispiel sollte in jeder Hinsicht als Erläuterung verstanden werden und beschreibt ausführlich das tPA-Herstellungsprotokoll als Ausführungsform der Erfindung und offenbart die derzeit beste bekannte Weise der Durchführung der Erfindung.

Beispiel -

Die Produktion von tPA-produzierenden Myelom- Transformanten

Der Expressions-Grundvektor, als pEMp1 bezeichnet, wurde aus folgenden Fragmenten konstruiert: (a) einem 2,25 kb PvuII-BamHI-Fragment aus pSV2-gpt (Mulligan und Berg, Science, V. 209, 1422-1427, 1980), enthaltend den SV40-Enhancer und den Promotor für frühe Regionen, das E.-Coli-pgt-Gen, die intervenierende Sequenz SV40 des kleinzelligen Karzinom-Antigens und die SV40-Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungssignale; (b) einem 2,3 kb pVuII-ecoRI-Fragment aus pBR322, enthaltend das Ampicillinasegen und den bakteriellen Ursprung der Replikation (Scutcliffe, Proc. Natl. Acad. Sci., USA. V. 75, 3737, 1978); (c) einem 0,3 kb PvuII-EcoRI- Fragment, enthaltend einen Immunglobulin-Enhancer für die schweren Ketten (Gillies et al., Cell, V. 33, S. 717-728, 1983); (d) einem 0,25 kb SacI-BglII-Fragment, enthaltend den Metallothionein-I-Promotor (Brinster et al., Nature, V. 296, 39-42, 1982) und (e) einem 0,4 kb AvaII-HaeIII-Fragment aus der 3'UT-Region des Gens für die leichte kappa-Kette des Immunglobulins, die das Polyadenylierungssignal enthält (Max et al., J. Biol. Chem., V. 256, 5116-5120, 1981). Diese Fragmente wurden miteinander in einer Reihe von Reaktionen gemäß gut bekannten Methoden (siehe z. B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982) ligiert.
Der Expressions-Grundvektor wurde zur Konstruktion einer Reihe von tPA-exprimierenden Vektoren verwendet, die als pEM1-tPA-A, -B und -C bezeichnet wurden. Diese drei Vektoren enthielten alle die gesamte codierende Region der tPA-cDNA, unterschieden sich allerdings in ihren 3'-untranslatierten Regionen, wie nachstehend beschrieben.
Die cDNA für tPA wurde durch Standardtechniken (Maniatis, supra) erhalten. tPA-Klone, die die gesamte codierende Region und ungefähr 800 Basenpaare der 3'UT- Region enthielten, wurden identifiziert und durch Nucleotidsequenzierung bestätigt. Die tPA-cDNA wurde an der Bg1-II-Stelle ungefähr 400 Basenpaare stromabwärts vom Translationsstopcodon verkürzt und über Xho-I- Linker in die einzige Xho-I-Stelle in dem Grundvektor inseriert. Die tPA-3"-UT-Region in diesem Expressionsvektor pEM1-tPA-A bestand darum aus ca. 400 Basenpaaren der nativen tPA-3'UT und aus 200 Basen paaren der 3"UT-Region des Gens für die leichte kappa- Kette des Immunglobulins.
In dem Vektor pEM1-tPA-B wurde die Masse der nativen tPA-3'UT durch Klonieren an der Sau-3A-Stelle, die 34 Basenpaare stromabwärts vom Translationsstopsignal liegt, und durch Verbinden mit der 200-Basenpaare-3'UT des Gens für die leichte kappa-Kette des Immunglobulins eliminiert.
Der Vektor pEM1-tPA-C unterschied sich von pEM1-tPA-B dadurch, daß die 3'UT-Region des Gens für die leichte kappa-Kette durch ein Fragment von etwa 200 Basenpaaren aus der 3'UT-Region der späten SV40-Gene ersetzt war.
Die rekombinierten tPA-Gene mit den verschiedenen 3'UT- Regionen, die vorstehend beschrieben wurden, sind in Fig. 2 abgebildet. Zwischen dem Stopcodon und dem AATAA-Polyadditionssignal liegen im Vektor pEM1-tpA-A etwa 0,59 kb, 0, 32 kb im Vektor pEM1-tpA-B und 0,16 kb im Vektor pEM1-tpA-C.
Die tPA-haltigen Plasmide wurden durch die Protoplastenfusionsmethode (Gillies et a., supra) in J558L- Myelomzellen transfiziert. Die Zellen, die das Plasmid enthielten, und darum das gpt-Gen, wurden durch Kultivieren in den Medien, die Mycophenolsäure enthielten, selektiert. Resistente Kolonien, die die Plasmide enthielten, wurden subkloniert und auf die tPA-Expression geprüft. Die Synthese und Sekretion von tPA in das Medium wurde mittels eines Tests bestimmt, bei dem tPA Plasminogen zu Plasmin umwandelt, welches dann das chromogene Tripeptid S2251 spaltet (Pennica et al., supra). Da bekannt ist, daß das Serum Inhibitoren sowohl für tPA als auch für Plasmin enthält (Collen und Lijnen, CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology, V. 4, 249-301, 1986), wurden die Transformanten vor dem Test 48 h lang in serumfreien Medium kultiviert. Die Aktivität wurde in internationalen Einheiten (IU) auf der Basis eines Standards von der World Health Organization gemessen und an Hand eines tPA-Standards von der Firma American Diagnostics, Inc. bestätigt.
Es wurde keine Klonierung festgestellt, die signifikante Mengen von tPA in den mit dem pEM1-tpA-A-Vektor transfizierten Zellen exprimierte, obwohl die Auswertung das Vorliegen von geringen Konzentrationen von mRNA, die tPA codiert, ergab. Von 26 mit pEM1-tpA-B transfizierten Klonen exprimierten 5 tPA. Wenn die höchste Expressionsstärke bei einem relativen Wert von 1,00 gegeben ist, so lag die Expression von tPA durch pEM1-tpA-B-Transfektanten zwischen 0,28 und 1,00. Von 14 mit pEM1-tpA-C transfizierten Klonen exprimierten 6 tPA in einer relativen Konzentration von 0,12 bis 0,44.
Die Erfindung kann in weiteren speziellen Formen ohne Abweichen von Geist und Umfang davon durchgeführt werden.

Claims

1. Verfahren zur Verbesserung der Produktion eines Proteins in einer Myelom-Zellinie durch Erhöhen der Stabilität der für das Protein codierenden mRNA, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:

a) Bereitstellung von DNA, die aus einer Zelle stammt, die das Protein von Natur aus produziert, wobei die DNA in Sequenz einen codierenden Bereich, ein Stopcodon und einen nativen untranslatierten Bereich, der ein Polyadenylierungssignal enthält, umfaßt, und wobei die DNA außerdem gegebenenfalls ein nahe am codierenden Bereich liegendes zelluläres Enhancer-Element zur Verstärkung der Transkription enthält;

b) Verminderung der Anzahl der Basen dieses nativen 3'-untranslatierten Bereiches der DNA durch Spleißen eines Segmentes aus dem 3'-untranslatierten Bereich, um eine intakte transkriptionskompetente kürzere DNA mit einem veränderten untranslatierten Bereich, der vollständig aus nativer DNA besteht und weniger als etwa 300 Nucleotidbasen zwischen dem Stopcodon und einem Polyadenylierungssignal aufweist, zu erzeugen;

c) Transfektion der Myelom-Zellinie mit der kürzeren DNA; und

d) Kultivierung der transfizierten Zellinie, um das Protein zu produzieren, wobei die Menge des durch die transfizierte Zellinie produzierten Proteins größer ist als die durch eine sonst identische Zellinie, die die in Schritt (a) beschriebene DNA enthält, produzierte Menge des Proteins.

2. Verfahren zur Verbesserung der Produktion eines Proteins in einer Myelom-Zellinie durch Erhöhen der Stabilität der für das Protein codierenden mRNA, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

a) Bereitstellung von DNA, die aus einer Zelle stammt, die das Protein von Natur aus produziert, wobei die DNA in Sequenz einen codierenden Bereich, ein Stopcodon und einen nativen untranslatierten Bereich, der ein Polyadenylierungssignal enthält, umfaßt, wobei der DNA eine Enhancer-Sequenz fehlt;

b) Änderung der Nucleotidsequenz des nativen 3'-untranslatierten Bereiches der DNA, um eine intakte, transkriptionskompetente kürzere DNA mit einem veränderten untranslatierten Bereich herzustellen, die weniger als etwa 300 Nucleotidbasen zwischen dem Stopcodon und einem Polyadenylierungssignal umfaßt;

c) Transfektion der Myelom-Zellinie mit der kürzeren DNA, der eine Enhancer-Sequenz fehlt; und

d) Kultivierung der transfizierten Zellinie, um das Protein zu erzeugen, wobei die Menge des durch die transfizierte Zellinie produzierten Proteins größer ist als die durch eine sonst identische Zellinie, die die in Schritt (a) beschriebene DNA ohne eine Enhancer-Sequenz enthält, produzierte Menge des Proteins.

3. Verfahren nach entweder Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der veränderte untranslatierte Bereich die Sequenz AATAAA enthält, worin A Adenin und T Thymin bedeutet.

4. Verfahren nach Anspruch 2 und nach dessen Unteransprüchen, wobei Stufe (b) außerdem folgendes umfaßt: Verknüpfen einer 3'-untranslatierten, zu der DNA nicht nativen Sequenz mit dem kürzeren untranslatierten Bereich, um einen 3'-untranslatierten Hybridbereich zwischen dem Stopcodon und dem Polyadenylierungssignal zu erzeugen.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei wenigstens ein Teil des nicht nativen, untranslatierten Bereichs aus Nichtsäuger DNA oder aus Säuger DNA, z. B. aus der 3' UT einer Immunglobulin-mRNA, erhalten wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der codierende Bereich für ein Protein, ausgewählt aus Immunglobulinen, Hormonen, Impfstoffen, Lymphokinen, Cytokinen, Enzymen und Proenzymen, beispielsweise für einen Plasminogenaktivator, z. B. für einen Plasminogenaktivator aus menschlichem Körpergewebe, codiert.

7. Vektor zur Verbesserung der Produktion eines Proteins in einer Myelom-Zellinie, wobei der Vektor replizierbare transkriptionskompetente DNA enthält, die in Sequenz folgendes aufweist: ein erstes DNA-Segment, das eine Promotor-Sequenz enthält, ein zweites DNA-Segment, das für das Protein codiert, ein Stopcodon und ein drittes DNA-Segment 3' zu dem Stopcodon, das ein Polyadenylierungssignal, und einen verkürzten untranslatierten Bereich enthält, der vollständig aus DNA besteht, die zu dem für das Protein codierende Gen nativ ist und weniger als etwa 300 Basenpaare zwischen dem Stopcodon und dem Polyadenylierungssignal aufweist, wobei der Vektor gegebenenfalls ein zelluläres, nahe an der für das Protein codierenden DNA liegendes Enhancer-Element aufweist und geeignet ist, relativ zu sonst identischen Vektoren, die den 3'- untranslatierten, zu dem für das Protein codierenden Gen nativen Bereich enthalten, vergrößerte Mengen des Proteins zu produzieren.