TW202242103A - 併入編碼配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的基因的核酸分子 - Google Patents

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飯塚俊輔
今給黎厚志
高木春奈
薗田啟之
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Abstract

本發明提供一種核酸分子，其用以使配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質於細胞、組織、或活體內表現，且包含編碼該融合蛋白質的基因。本發明還提供一種核酸分子，其為質體的形態、內包於重組病毒之病毒顆粒(virion)的形態、或內包於微脂體(liposome)、脂質奈米粒子的形態，且包含編碼該融合蛋白質的基因。本發明還關於包含編碼該融合蛋白質的基因之核酸分子作為醫藥之用途。

Description

併入編碼配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的基因的核酸分子
本發明有關於一種核酸分子，其係用以使配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質於細胞、組織、或活體內發揮功能，且其包含編碼該融合蛋白質的基因，例如有關於AAV(adeno-associated virus)病毒載體系統中之經併入編碼該融合蛋白質的核酸分子的T載體、慢病毒載體系統中之經併入編碼該融合蛋白質的核酸分子的載體質體。
大部分作為醫藥使用的重組蛋白質係藉由皮下注射、肌肉內注射、靜脈內注射等之非經口的手段而被投予至患者。由於患者患有慢性疾病之情形，醫藥的投予有在長期間重複進行之必要，因此於投予利用非經口的手段之情形，患者被強加的負擔很大。
於重組蛋白質之中，有抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質。就該融合蛋白質而言，可列舉例如抗體與溶酶體酶(lysosomal enzyme)之融合蛋白質(專利文獻1～5、非專利文獻1)。
溶酶體病(lysosomal disease)為一種基因疾病，其原因是編碼溶酶體中應存在的溶酶體酶之基因的異常而導致溶酶體酶的活性減少或缺失。對於溶酶體病的患者，已有進行所謂的酵素補充療法，即藉由靜脈內注射而投予重組體的溶酶體酶，補充減少或缺失的溶酶體酶。為基因疾病之溶酶體病的患者有必要終生接受此酵素補充療法。
於溶酶體病之中有會對腦造成損傷者。為了治療腦的損傷，而有必要對腦內補充溶酶體酶，但是由於藉由靜脈內注射所投予的溶酶體酶幾乎不會通過血腦障壁(BBB)，因此無法對腦內補充溶酶體酶。
作為對腦內補充溶酶體酶的方法，已有報告作成使溶酶體酶與將存在於血管內皮細胞的表面上的分子作為抗原辨識的抗體結合而成的融合蛋白質，且將其藉由靜脈內注射而投予的方法(非專利文獻2)。該融合蛋白質可透過抗體部分而與血管內皮細胞的表面結合，再通過BBB而到達腦內。據此，可藉由該融合蛋白質而對腦內補充溶酶體酶。即使將溶酶體酶作成此種融合蛋白質之情形，患有為基因疾病之溶酶體病的患者仍有必要終生接受利用此融合蛋白質的酵素補充療法。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]WO2016/208695 [專利文獻2]WO2018/124121 [專利文獻3]US20070082380 [專利文獻4]US20090053219 [專利文獻5]US20110110935 [非專利文獻]
[非專利文獻1]Sonoda H. et al., Mol Ther. 26. 1366-74 (2018) [非專利文獻2]Okuyama T. et al., Mol Ther. 26. 27. 456-64 (2019)
[發明欲解決之課題]
本發明之一個目的係提供一種病毒載體，其用以使配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質於活體內表現，且其經併入編碼該融合蛋白質的基因。 [用以解決課題之手段]
於針對上述目的的研究中，本發明人等發現將編碼使抗體與為人類溶酶體酶之一種的人類艾杜糖醛酸-2-硫酸脂酶結合而成的蛋白質之基因併入AAV病毒載體系的T載體，於感染使用此T載體而製作的rAAV病毒顆粒(recombinant adeno-associated virus virion)之哺乳動物的活體內或培養細胞中，會表現抗體與人類溶酶體酶之融合蛋白質，而完成本發明。即，本發明包含以下。 1.一種核酸分子，其包含以下(1)～(6)之任一者的鹼基序列： (1)包含第一反向末端重複(ITR)或其功能等價物的鹼基序列、於其下游編碼配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列、再於下游包含第二反向末端重複(ITR)或其功能等價物的鹼基序列； (2)包含第一反向末端重複(ITR)或其功能等價物的鹼基序列、於其下游包含基因表現控制部位的鹼基序列、於更下游編碼配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列、再於下游包含第二反向末端重複(ITR)或其功能等價物的鹼基序列； (3)包含第一長末端重複(LTR)或其功能等價物的鹼基序列、於其下游編碼配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列、再於更下游包含第二長末端重複(LTR)或其功能等價物的鹼基序列； (4)包含第一長末端重複(LTR)或其功能等價物的鹼基序列、於其下游包含基因表現控制部位的鹼基序列、再於下游編碼配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列、再於下游包含第二長末端重複(LTR)或其功能等價物的鹼基序列； (5)包含領導序列(leader)或其功能等價物的鹼基序列、於其下游編碼配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列、再於下游包含尾曳序列(trailer)或其功能等價物的鹼基序列；或 (6)包含領導序列或其功能等價物的鹼基序列、於其下游包含基因表現控制部位的鹼基序列、再於下游編碼配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列、再於下游包含尾曳序列或其功能等價物的鹼基序列。 2.上述1之核酸分子，其中該配位體為抗體。 3.上述2之核酸分子，其為選自以下(1)～(4)者： (1)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼具有生理活性的蛋白質結合於抗體重鏈的C末端之結合體的鹼基序列、及編碼抗體輕鏈的鹼基序列； (2)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼具有生理活性的蛋白質結合於抗體重鏈的N末端之結合體的鹼基序列、及編碼抗體輕鏈的鹼基序列； (3)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼具有生理活性的蛋白質結合於抗體輕鏈的C末端之結合體的鹼基序列、及編碼抗體重鏈的鹼基序列；或 (4)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼具有生理活性的蛋白質結合於抗體輕鏈的N末端之結合體的鹼基序列、及編碼抗體重鏈的鹼基序列。 4.上述2記載之核酸分子，其為選自以下(1)～(4)者： (1)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼具有生理活性的蛋白質透過連接子(linker)而結合於抗體重鏈的C末端之結合體的鹼基序列、及編碼抗體輕鏈的鹼基序列； (2)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼具有生理活性的蛋白質透過連接子而結合於抗體重鏈的N末端之結合體的鹼基序列、及編碼抗體輕鏈的鹼基序列； (3)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼具有生理活性的蛋白質透過連接子而結合於抗體輕鏈的C末端之結合體的鹼基序列、及編碼抗體重鏈的鹼基序列；或 (4)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼具有生理活性的蛋白質透過連接子而結合於抗體輕鏈的N末端之結合體的鹼基序列、及編碼抗體重鏈的鹼基序列。 5.上述4記載之核酸分子，其中該連接子為由1～50個胺基酸殘基所構成的肽。 6.上述5記載之核酸分子，其中該連接子為包含選自下述群組的胺基酸序列而成的肽，該群組包含1個甘胺酸、1個絲胺酸、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、序列識別號1之胺基酸序列、序列識別號2之胺基酸序列、序列識別號3之胺基酸序列、及2～10個此等之胺基酸序列連續而成的胺基酸序列。 7.上述2記載之核酸分子，其為選自以下(1)～(4)者： (1)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼抗體重鏈透過第二連接子而結合於抗體輕鏈的C末端而且具有生理活性的蛋白質直接或透過連接子而結合於其C末端之結合體的鹼基序列； (2)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼抗體輕鏈透過第二連接子而結合於抗體重鏈的C末端而且具有生理活性的蛋白質直接結合或透過連接子而結合於其C末端之結合體的鹼基序列； (3)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼抗體重鏈直接透過連接子而結合於具有生理活性的蛋白質的C末端而且抗體輕鏈透過第二連接子而結合於其C末端之結合體的鹼基序列；或 (4)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼抗體輕鏈直接或透過連接子而結合於具有生理活性的蛋白質的C末端與而且抗體重鏈透過第二連接子而結合於其C末端之結合體的鹼基序列。 8.上述7記載之核酸分子，其中該連接子為由1～50個胺基酸殘基所構成的肽。 9.上述8記載之核酸分子，其中該連接子為包含選自下述群組的胺基酸序列而成的肽，該群組包含1個甘胺酸、1個絲胺酸、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、序列識別號1之胺基酸序列、序列識別號2之胺基酸序列、序列識別號3之胺基酸序列、及2～10個此等之胺基酸序列連續而成的胺基酸序列。 10.上述9記載之核酸分子，其中該第二連接子由8～50個胺基酸殘基所構成。 11.上述8記載之核酸分子，其中該第二連接子選自包含下列的群組：胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、序列識別號1、序列識別號2、序列識別號3之各胺基酸序列、序列識別號1之胺基酸序列之3個連續而成的胺基酸序列、及2～10個此等之胺基酸序列連續而成的胺基酸序列。 12.上述3記載之核酸分子，其為選自以下(1)～(4)者： (1)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼該具有生理活性的蛋白質結合於該抗體重鏈的C末端之結合體的鹼基序列、於其下游編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列、再於其下游編碼該抗體輕鏈的鹼基序列； (2)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼該具有生理活性的蛋白質結合於該抗體重鏈的N末端之結合體的鹼基序列、於其下游編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列、再於其下游編碼該抗體輕鏈的鹼基序列； (3)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼該具有生理活性的蛋白質結合於該抗體輕鏈的C末端之結合體的鹼基序列、於其下游編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列、再於其下游編碼該抗體重鏈的鹼基序列；或 (4)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼該具有生理活性的蛋白質結合於該抗體輕鏈的N末端之結合體的鹼基序列、於其下游編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列、再於其下游編碼該抗體重鏈的鹼基序列。 13.上述4～6中任一項記載之核酸分子，其為選自以下(1)～(4)者： (1)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼該具有生理活性的蛋白質透過連接子而結合於該抗體重鏈的C末端之結合體的鹼基序列、於其下游編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列、再於其下游編碼該抗體輕鏈的鹼基序列； (2)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼該具有生理活性的蛋白質透過連接子而結合於該抗體重鏈的N末端之結合體的鹼基序列、於其下游編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列、再於其下游編碼該抗體輕鏈的鹼基序列； (3)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼該具有生理活性的蛋白質透過連接子而結合於該抗體輕鏈的C末端之結合體的鹼基序列、於其下游編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列、再於其下游編碼該抗體重鏈的鹼基序列；或 (4)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼該具有生理活性的蛋白質透過連接子而結合於該抗體輕鏈的N末端之結合體的鹼基序列、於其下游編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列、再於其下游編碼該抗體重鏈的鹼基序列。 14.上述12或13記載之核酸分子，其中該內部核糖體結合部位源自病毒或基因的5’非轉譯區域，該病毒或基因選自包含下列的群組：小核糖核酸病毒科(picornavirus)之病毒、口蹄疫病毒、A型肝炎病毒、C型肝炎病毒、冠狀病毒、牛腸病毒(enterovirus)、泰勒氏鼠腦脊髓炎病毒(Theiler's mouse encephalomyelitis virus)、柯薩奇B型病毒(Coxsackievirus type B)、人類免疫球蛋白重鏈結合蛋白質基因、果蠅觸角足基因(Drosophila Antennapedia gene)、果蠅超級雙胸基因(Drosophila Ultrabithorax gene)。 15.上述12或13記載之核酸分子，其中該內部核糖體結合部位源自小核糖核酸病毒科之病毒的5’非轉譯區域。 16.上述2～14中任一項記載之核酸分子，其中該抗體為抗原結合性片段。 17.上述2～14中任一項記載之核酸分子，其中該抗體為Fab。 18.上述2記載之核酸分子，其中該抗體為單域抗體。 19.上述2～18中任一項記載之核酸分子，其中該抗體對於存在於血管內皮細胞表面上的蛋白質具有特異的親和性。 20.上述19記載之核酸分子，其中該血管內皮細胞為腦血管內皮細胞。 21.上述19或20記載之核酸分子，其中該存在於血管內皮細胞表面上的蛋白質選自包含下列的群組：運鐵蛋白受體、胰島素受體、瘦素受體、似胰島素生長因子I受體、似胰島素生長因子II受體、脂蛋白受體、葡萄糖運輸蛋白1(glucose transporter 1)、有機陰離子運輸蛋白(organic anion transporter)、單羧酸運輸蛋白(monocarboxylic acid transporter)、低密度脂蛋白受體相關蛋白質1、低密度脂蛋白受體相關蛋白質8、及肝素結合性上皮生長因子樣生長因子之膜結合型前驅物。 22.上述1～21中任一項記載之核酸分子，其中該基因表現控制部位選自包含下列的群組：源自細胞巨大病毒的啟動子、SV40早期啟動子、人類延長因子-1α(EF-1α)啟動子、人類泛蛋白C啟動子、反轉錄病毒之勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)LTR啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、β-肌動蛋白啟動子、磷甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase (PGK))啟動子、小鼠白蛋白啟動子、人類白蛋白啟動子、人類α-1抗胰蛋白酶啟動子、及小鼠α胎兒蛋白增強子/小鼠白蛋白啟動子。 23.上述1之核酸分子，其中該配位體對於存在於血管內皮細胞表面上的蛋白質具有特異的親和性。 24.上述23記載之核酸分子，其中該血管內皮細胞為腦血管內皮細胞。 25.上述23或24記載之核酸分子，其中該存在於血管內皮細胞表面上的蛋白質選自包含下列的群組：運鐵蛋白受體，胰島素受體、瘦素受體、似胰島素生長因子I受體、似胰島素生長因子II受體、脂蛋白受體、葡萄糖運輸蛋白1、有機陰離子運輸蛋白、單羧酸運輸蛋白、低密度脂蛋白受體相關蛋白質1、低密度脂蛋白受體相關蛋白質8、及肝素結合性上皮生長因子樣生長因子之膜結合型前驅物。 26.上述23或24記載之核酸分子，其中該配位體選自包含下列的群組：運鐵蛋白、胰島素、瘦素、似胰島素生長因子I、似胰島素生長因子II、脂蛋白、及低密度脂蛋白。 27.上述1～26中任一項記載之核酸分子，其中該具有生理活性的蛋白質選自包含下列的群組：生長激素、溶酶體酶、體介素、胰島素、升糖素、細胞激素、淋巴激素、血液凝固因子、抗體、抗體與其它蛋白質之融合蛋白質、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、紅血球生成素、達貝泊汀(darbepoetin)、組織漿胞素原活化劑(tissue plasminogen activator (t-PA))、凝血酶調節素(thrombomodulin)、濾泡激素(FSH)、促性腺激素釋放激素(GnRH)、促性腺激素、DNasel、促甲狀腺激素(TSH)、神經生長因子(NGF)、睫狀神經營養因子(CNTF)、神經膠細胞株神經營養因子(GDNF)、神經滋養素3(neurotrophin 3)、神經滋養素4/5、神經滋養素6、神經調節蛋白1(neuregulin 1)、活化素(activin)、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)、纖維母細胞生長因子2(FGF2)、上皮細胞增殖因子(EGF)、血管內皮增殖因子(VEGF)、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、介白素6、PD-1、PD-1配位體、腫瘤壞死因子α受體(TNF-α受體)、具有分解β類澱粉蛋白的活性的酵素、依那西普(etanercept)、培維索孟(pegvisomant)、美曲普汀(metreleptin)、阿巴西普(abatacept)、阿爾法(asfotase)、GLP-1受體促效劑、及抗體醫藥。 28.上述1～26中任一項記載之核酸分子，其中該具有生理活性的蛋白質選自包含下列的群組：α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸脂酶、葡萄糖腦苷酶、β-半乳糖苷酶、GM2活性化蛋白質、β-己醣胺酶A、β-己醣胺酶B、N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸轉移酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、半乳糖基神經醯胺酶(galactosylceramidase)、蛋白皂角素C(saposin C)、芳基硫酸脂酶A、α-L-岩藻糖苷酶、天冬胺醯基胺基葡萄糖苷酶(aspartylglucosaminidase)、α-N-乙醯基胺基半乳糖苷酶(α-N-acetyl-galactosaminidase)、酸性神經髓磷脂酶、α-半乳糖苷酶A、β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase)、肝素N-硫酸脂酶、α-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶(α-N-acetyl-glucosaminidase)、乙醯基CoAα-胺基葡萄糖苷N-乙醯基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-硫酸脂酶、酸性神經醯胺酶、澱粉-1、6-葡萄糖苷酶、唾液酸酶(sialidase)、軟脂醯基蛋白質硫酯酶-1、三肽基肽酶-1(Tripeptidyl Peptidase-1)、玻糖醛酸酶-1、CLN1及CLN2。 29.上述1～28中任一項記載之核酸分子，其中該第一反向末端重複及該第二反向末端重複為源自腺相關病毒者、源自腺病毒者、或彼等之變異體。 30.上述1～28中任一項記載之核酸分子，其中該第一反向末端重複包含序列識別號4所示的鹼基序列，該第二反向末端重複包含序列識別號5所示的鹼基序列。 31.上述1～28中任一項記載之核酸分子，其中該第一反向末端重複為選自以下(1)～(3)者，及 該第二反向末端重複為選自以下(4)～(6)者： (1)包含與序列識別號4所示的鹼基序列顯示80%以上同一性的鹼基序列者， (2)包含與序列識別號4所示的鹼基序列顯示90%以上同一性的鹼基序列者，或 (3)對於序列識別號4所示的鹼基序列施加由1～20個取代、缺失或加成所致的改變者；及 (4)包含與序列識別號5所示的鹼基序列顯示80%以上同一性的鹼基序列者， (5)包含與序列識別號5所示的鹼基序列顯示90%以上同一性的鹼基序列者，或 (6)對於序列識別號5所示的鹼基序列施加由1～20個取代、缺失或加成所致的改變者。 32.上述1～28中任一項記載之核酸分子，其中該第一反向末端重複之功能等價物包含序列識別號6所示的鹼基序列，且該第二反向末端重複之功能等價物包含序列識別號7所示的鹼基序列。 33.上述1～28中任一項記載之核酸分子，其中該第一反向末端重複之功能等價物為選自以下(1)～(3)者，及 該第二反向末端重複之功能等價物為選自以下(4)～(6)者： (1)包含與序列識別號6所示的鹼基序列顯示80%以上同一性的鹼基序列者， (2)包含與序列識別號6所示的鹼基序列顯示90%以上同一性的鹼基序列者，或 (3)對於序列識別號6所示的鹼基序列施加由1～20個取代、缺失或加成所致的改變者；及 (4)包含與序列識別號7所示的鹼基序列顯示80%以上同一性的鹼基序列者， (5)包含與序列識別號7所示的鹼基序列顯示90%以上同一性的鹼基序列者，或 (6)對於序列識別號7所示的鹼基序列施加由1～20個取代、缺失或加成所致的改變者。 34.上述1～28中任一項記載之核酸分子，其中該第一長末端重複及該第二長末端重複為源自慢病毒或反轉錄病毒者或其變異體。 35.上述1～28中任一項記載之核酸分子，其中該第一長末端重複包含序列識別號43所示的鹼基序列，且該第二長末端重複包含序列識別號44所示的鹼基序列。 36.上述1～28中任一項記載之核酸分子，其中該第一長末端重複為選自以下(1)～(3)者，及該第二長末端重複為選自以下(4)～(6)者： (1)包含與序列識別號43所示的鹼基序列顯示80%以上同一性的鹼基序列者， (2)包含與序列識別號43所示的鹼基序列顯示90%以上同一性的鹼基序列者，或 (3)對於序列識別號43所示的鹼基序列施加由1～20個取代、缺失或加成所致的改變者；及 (4)包含與序列識別號44所示的鹼基序列顯示80%以上同一性的鹼基序列者， (5)包含與序列識別號44所示的鹼基序列顯示90%以上同一性的鹼基序列者，或 (6)對於序列識別號44所示的鹼基序列施加由1～20個取代、缺失或加成所致的改變者。 37.上述1～28中任一項記載之核酸分子，其中該領導序列及該尾曳序列為源自仙台病毒(Sendai virus)者或其變異體。 38.上述1～28中任一項記載之核酸分子，其中該領導序列包含序列識別號45所示的鹼基序列，且該尾曳序列包含序列識別號46所示的鹼基序列。 39.上述1～28中任一項記載之核酸分子，其中該領導序列為選自以下(1)～(3)者，及該尾曳序列為選自以下(4)～(6)者： (1)包含與序列識別號45所示的鹼基序列顯示80%以上同一性的鹼基序列者， (2)包含與序列識別號45所示的鹼基序列顯示90%以上同一性的鹼基序列者，或 (3)對於序列識別號45所示的鹼基序列施加由1～20個取代、缺失或加成所致的改變者；及 (4)包含與序列識別號46所示的鹼基序列顯示80%以上同一性的鹼基序列者， (5)包含與序列識別號47所示的鹼基序列顯示90%以上同一性的鹼基序列者，或 (6)對於序列識別號47所示的鹼基序列施加由1～20個取代、缺失或加成所致的改變者。 40.一種細胞、組織或動物，其經導入如上述1～39中任一項記載之核酸分子。 41.一種幹細胞，其經導入如上述1～39中任一項記載之核酸分子。 42.上述41記載之幹細胞，其選自包含下列的群組：間葉系幹細胞、源自齒髓的幹細胞、造血幹細胞、胚性幹細胞、內皮幹細胞、乳腺幹細胞、腸幹細胞、肝幹細胞、胰幹細胞、神經幹細胞、及iPS細胞。 43.一種質體，其包含如上述1～39中任一項記載之核酸分子。 44.一種病毒之病毒顆粒，其包含如上述1～39中任一項記載之核酸分子。 [發明之效果]
若依據本發明，則例如可提供一種核酸分子，其可用以使配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質於細胞、組織、或活體內表現，且其包含編碼該融合蛋白質的基因。
[用以實施發明的形態]
於本發明中稱「核酸分子」時，主要指為去氧核糖核苷酸藉由磷酸二酯鍵聚合的DNA、為核糖核苷酸藉由磷酸二酯鍵聚合的RNA之任一者。
「核酸分子」為DNA的情形之DNA可為單鏈(單股)，又，可為伴隨互補鏈的雙鏈。DNA為單鏈的情形之DNA可為(+)鏈亦可為(-)鏈。構成DNA的每個去氧核糖核苷酸，只要DNA所含的編碼蛋白質的基因可於哺乳動物(特別是人類)之細胞內被轉譯成mRNA，則可為天然存在的型式者，亦可為對天然型施加修飾者。於本發明之一實施形態中，構成DNA的每個去氧核糖核苷酸，只要於哺乳動物(特別是人類)之細胞內，DNA所含的編碼蛋白質的基因可被轉譯成mRNA，且DNA之全部或一部分可被複製者，則可為天然存在的型式者，亦可為對天然型施加修飾者。
又，「核酸分子」為RNA的情形之RNA可為單鏈(單股)，亦可為伴隨互補鏈的雙鏈。RNA為單鏈的情形之RNA可為(+)鏈亦可為(-)鏈。於本發明之一實施形態中，構成RNA的每個核糖核苷酸，只要RNA所含的編碼蛋白質的基因可於哺乳動物(特別是人類)之細胞內被反轉錄成DNA，則可為天然存在的型式者，亦可為經修飾者。又，於本發明之一實施形態中，構成RNA的每個核糖核苷酸，只要於哺乳動物(特別是人類)之細胞內，RNA所含的編碼蛋白質的基因可被轉譯成蛋白質，則可為天然存在的型式者，亦可為經修飾者。核糖核苷酸之修飾係例如為了抑制RNA之由RNase所致的分解，提高RNA之細胞內的安定性而進行。
於本發明之一實施形態中，稱反向末端重複(ITR)時，係指存在於病毒基因體的末端之相同的序列反覆存在的鹼基序列。作為ITR，可適合地使用源自腺相關病毒者，及源自腺病毒者。例如，腺相關病毒之ITR為大約145個鹼基鏈長的區域，作為複製起始點等而作用。於本發明之一實施形態中，於核酸分子中，有2個反向末端重複(ITR)存在，分別稱為第一反向末端重複(ITR)、第二反向末端重複(ITR)。此處，於將編碼融合蛋白質的基因配置於2個ITR之間時，稱位於其5’側的ITR為第一反向末端重複(ITR)，稱位於3’側的ITR為第二反向末端重複(ITR)。於本發明中，反向末端重複(ITR)只要具有作為複製起始點之功能、對宿主細胞插入基因等之原本ITR的功能的至少一者，則可為源自任何的病毒者，腺相關病毒之ITR為適合者之一。又ITR不限於野生型之ITR，只要可替代野生型之ITR，則可為對於野生型之ITR的鹼基序列施加取代、缺失、加成等之改變的變異體。
ITR為腺相關病毒的情形，AAV的血清型未特別限定，可為血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11之任一者。例如，血清型2之AAV之反向末端重複(ITR)係第一ITR包含序列識別號4所示的鹼基序列，且第二ITR為包含序列識別號5所示的鹼基序列。
又，ITR不限於野生型之ITR，可為對野生型之ITR的鹼基序列施加取代、缺失、加成等之改變者。將野生型之ITR之鹼基序列的鹼基以其它鹼基取代的情形，取代的鹼基的個數，較佳為1～20個，更佳為1～10個，進一步較佳為1～3個。使野生型之ITR的鹼基序列缺失的情形，缺失的鹼基個數較佳為1～20個，更佳為1～10個，進一步較佳為1～3個。又，亦可施加組合此等鹼基之取代與缺失的變異。對野生型之ITR加成鹼基的情形，於ITR之鹼基序列中或5’末端或3’末端，較佳為加成1～20個鹼基，更佳為1～10個，進一步較佳為1～3個。亦可施加組合此等鹼基之加成、取代及缺失的變異。經施加變異的ITR之鹼基序列，係與野生型之ITR之鹼基序列較佳為顯示80%以上之同一性，更佳為顯示85%以上之同一性，進一步較佳為顯示90%以上之同一性，進一步較佳為顯示95%以上之同一性，進一步較佳為顯示98%以上之同一性。
ITR之功能等價物，係指功能上可替代ITR而使用者。ITR之功能等價物可為野生型之ITR之變異體。又，基於ITR而人工構築的ITR亦只要可替代ITR，則為ITR之功能等價物。
AAV的ITR之功能等價物，係指功能上可替代AAV的ITR而使用者。AAV的ITR之功能等價物可為野生型之AAV的ITR之變異體。又，基於AAV的ITR而人工構築的ITR亦只要可替代AAV的ITR，則為AAV的ITR之功能等價物。
作為人工構築的第一AAV之反向末端重複(第一AAV-ITR)之功能等價物，可列舉具有序列識別號6所示的鹼基序列者(第一AAV-ITR之功能等價物)。對此序列識別號6所示的鹼基序列施加取代、缺失、變異者，只要功能上可替代第一AAV的ITR而使用，則包含在第一AAV-ITR之功能等價物中。將序列識別號6所示的鹼基序列中之鹼基以其它鹼基取代的情形，取代的鹼基個數較佳為1～20個，更佳為1～20個，進一步較佳為1～5個，進一步較佳為1～3個。使序列識別號6所示的鹼基序列中之鹼基缺失的情形，缺失的鹼基個數較佳為1～20個，更佳為1～10個，進一步較佳為1～5個，進一步較佳為1～3個。又，施加組合此等鹼基之取代與缺失的變異的ITR，亦為第一AAV-ITR之功能等價物。對序列識別號6所示的鹼基序列加成鹼基的情形，於該鹼基序列中或5’末端或3’末端，較佳為加成1～20個鹼基，更佳為1～10個，進一步較佳為1～5個，進一步較佳為1～3個。施加組合此等鹼基之加成、取代及缺失的變異的ITR，亦包含在第一AAV-ITR之功能等價物中。經施加變異的ITR之鹼基序列，係與序列識別號6所示的鹼基序列較佳為顯示80%以上之同一性，更佳為顯示85%以上之同一性，進一步較佳為顯示90%以上之同一性，進一步較佳為顯示95%以上之同一性，進一步更佳為顯示98%以上之同一性。
又，作為人工構築的第2反向末端重複(第二AAV-ITR)之功能等價物，可列舉具有序列識別號7所示的鹼基序列者(第二AAV-ITR之功能等價物)。對此序列識別號7所示的鹼基序列施加取代、缺失、變異者，亦只要功能上可替代第二AAV的ITR而使用，則包含在第二AAV的ITR之功能等價物中。將序列識別號7所示的鹼基序列中之鹼基以其它鹼基取代的情形，取代的鹼基個數較佳為1～20個，更佳為1～10個，進一步較佳為1～5個，進一步較佳為1～3個。使序列識別號7所示的鹼基序列中之鹼基缺失的情形，缺失的鹼基個數較佳為1～20個，更佳為1～10個，進一步較佳為1～5個，進一步較佳為1～3個。又，施加組合此等鹼基之取代與缺失的變異的ITR，亦為第二AAV的ITR之功能等價物。對序列識別號7所示的鹼基序列加成鹼基的情形，於該鹼基序列中或5’末端或3’末端，較佳為加成1～20個，更佳為1～10個，進一步較佳為1～5個，進一步較佳為1～3個鹼基。施加組合此等鹼基之加成、取代及缺失的變異的ITR，亦包含在第二AAV的ITR之功能等價物中。經施加變異的ITR之鹼基序列，係與序列識別號7所示的鹼基序列較佳為顯示80%以上之同一性，更佳為顯示85%以上之同一性，進一步較佳為顯示90%以上之同一性，進一步較佳為顯示95%以上之同一性，進一步更佳為顯示98%以上之同一性。
於本發明之一實施形態中，稱為長末端重複(LTR)時，係例如指存在於真核生物之反轉錄轉座子(retrotransposon)、或存在於反轉錄病毒基因體、慢病毒基因體等之末端的相同序列數百至數千次反復存在的鹼基序列。於本發明之一實施形態中，核酸分子中，有2個長末端重複(LTR)存在，分別稱為第一長末端重複(LTR)、第二長末端重複(LTR)。此處，於將編碼融合蛋白質的基因配置於2個LTR之間時，稱位於其5’側的LTR為第一長末端重複(LTR)，稱位於3’側的LTR為第二長末端重複(LTR)。於本發明中，長末端重複(LTR)只要具有作為複製起始點之功能、對宿主細胞插入基因等之原本LTR的功能的至少一者，則可為源自任何的病毒者，就適合者而言，可列舉反轉錄病毒基因體及慢病毒。又，LTR並不限於野生型之LTR，只要可替代野生型之LTR，則可為對野生型之LTR的鹼基序列施加取代、缺失、加成等之改變的變異體。
將野生型之LTR的鹼基序列的鹼基以其它鹼基取代的情形，取代的鹼基個數較佳為1～20個，更佳為1～10個，進一步較佳為1～3個。使野生型之LTR的鹼基序列缺失的情形，缺失的鹼基個數較佳為1～20個，更佳為1～10個，進一步較佳為1～3個。又，亦可施加組合此等鹼基之取代與缺失的變異。對野生型之LTR加成鹼基的情形，於LTR之鹼基序列中或5’末端或3’末端，較佳為加成1～20個鹼基，更佳為1～10個，進一步較佳為1～3個。亦可施加組合此等鹼基之加成、取代及缺失的變異。經施加變異的LTR之鹼基序列，係與野生型之LTR之鹼基序列較佳為顯示80%以上之同一性，更佳為顯示85%以上之同一性，進一步較佳為顯示90%以上之同一性，進一步較佳為顯示95%以上之同一性，進一步更佳為顯示98%以上之同一性。
LTR之功能等價物，係指功能上可替代LTR而使用者。LTR之功能等價物可為野生型之LTR之變異體。又，基於LTR而人工構築的LTR亦只要可替代LTR，則為LTR之功能等價物。
慢病毒的LTR之功能等價物，係指功能上可替代慢病毒的LTR而使用者。慢病毒的LTR之功能等價物可為野生型之慢病毒的LTR之變異體。又，基於慢病毒之LTR而人工構築的LTR，亦只要可替代慢病毒的LTR，則為慢病毒的LTR之功能等價物。
反轉錄病毒的LTR之功能等價物，係指可功能上替代反轉錄病毒的LTR而使用者。反轉錄病毒的LTR之功能等價物可為野生型之反轉錄病毒的LTR之變異體。又，基於反轉錄病毒的LTR而人工構築的LTR，亦只要可替代反轉錄病毒的LTR，則為反轉錄病毒的LTR之功能等價物。
作為第一LTR之功能等價物，可列舉具有序列識別號43所示的鹼基序列者。對此序列識別號43所示的鹼基序列施加取代、缺失、變異者，亦只要功能上可作為第一LTR而使用，則包含在第一LTR之功能等價物中。將序列識別號43所示的鹼基序列中之鹼基以其它鹼基取代的情形，取代的鹼基個數較佳為1～20個，更佳為1～10個，進一步較佳為1～5個，進一步較佳為1～3個。使序列識別號43所示的鹼基序列中之鹼基缺失的情形，缺失的鹼基個數較佳為1～20個，更佳為1～10個，進一步較佳為1～5個，進一步較佳為1～3個。又，施加組合此等鹼基之取代與缺失的變異的LTR，亦為第一LTR之功能等價物。對序列識別號43所示的鹼基序列加成鹼基的情形，於該鹼基序列中或5’末端或3’末端，較佳為加成1～20個鹼基，更佳為1～10個，進一步較佳為1～5個，進一步較佳為1～3個。施加組合此等鹼基之加成、取代及缺失的變異的LTR，亦包含在第一LTR之功能等價物中。經施加變異的LTR之鹼基序列，係與序列識別號43所示的鹼基序列較佳為顯示80%以上之同一性，更佳為顯示85%以上之同一性，進一步較佳為顯示90%以上之同一性，進一步較佳為顯示95%以上之同一性，進一步更佳為顯示98%以上之同一性。
又，作為第二LTR之功能等價物，可列舉具有序列識別號44所示的鹼基序列者。對此序列識別號44所示的鹼基序列施加取代、缺失、變異者，亦只要功能上可作為第二LTR而使用，則包含在第二LTR之功能等價物中。將序列識別號44所示的鹼基序列中之鹼基以其它鹼基取代的情形，取代的鹼基個數較佳為1～20個，更佳為1～10個，進一步較佳為1～5個，進一步較佳為1～3個。使序列識別號44所示的鹼基序列中之鹼基缺失的情形，缺失的鹼基個數較佳為1～20個，更佳為1～10個，進一步較佳為1～5個，進一步較佳為1～3個。又，施加組合此等鹼基之取代與缺失的變異的LTR，亦為第二LTR之功能等價物。對序列識別號44所示的鹼基序列加成鹼基的情形，於該鹼基序列中或5’末端或3’末端，較佳為加成1～20個鹼基，更佳為1～10個，進一步較佳為1～5個，進一步較佳為1～3個。施加組合此等鹼基之加成、取代及缺失的變異的LTR，亦包含在第二LTR之功能等價物中。經施加變異的LTR之鹼基序列，係與序列識別號44所示的鹼基序列較佳為顯示80%以上之同一性，更佳為顯示85%以上之同一性，進一步較佳為顯示90%以上之同一性，進一步較佳為顯示95%以上之同一性，進一步更佳為顯示98%以上之同一性。
於本發明之一實施形態中，稱為領導序列及尾曳序列時，係指存在於病毒基因體之末端，且彼此部分地互補的鹼基序列。作為領導序列及尾曳序列，可適合地使用源自仙台病毒者。仙台病毒之領導序列及尾曳序列皆為約50鹼基之鏈長的區域。於本發明之一實施形態中，領導序列位於編碼融合蛋白質的基因之5’側，尾曳序列位於3’側。又領導序列及/或尾曳序列只要可替代野生型的領導序列及/或尾曳序列，則可為對野生型的領導序列及/或尾曳序列之鹼基序列施加取代、缺失、加成等之改變的變異體。
領導序列之功能等價物，係指功能上可替代領導序列而使用者。領導序列之功能等價物可為野生型之領導序列的LTR之變異體。又，基於領導序列而人工構築的領導序列，亦只要可替代領導序列，則為領導序列之功能等價物。關於尾曳序列亦相同。
作為於本發明之一實施形態中適合使用者，可列舉具有序列識別號45所示的鹼基序列之源自仙台病毒的領導序列、及具有序列識別號46所示的鹼基序列之源自仙台病毒的尾曳序列。
對源自野生型之仙台病毒的領導序列及尾曳序列施加變異者，亦可於本發明中適合地使用。將鹼基序列之鹼基以其它鹼基取代的情形，取代的鹼基個數較佳為1～20個，更佳為1～10個，進一步較佳為1～3個。使野生型的領導序列或/及尾曳序列之鹼基序列缺失的情形，缺失的鹼基個數較佳為1～20個，更佳為1～10個，進一步較佳為1～3個。又，亦可施加組合此等鹼基之取代與缺失的變異。加成鹼基的情形，於領導序列或/及尾曳序列之鹼基序列中或5’末端或3’末端，較佳為加成1～20個鹼基，更佳為1～10個，進一步較佳為1～3個。亦可施加組合此等鹼基之加成、取代及缺失的變異。經施加變異的鹼基序列，係與野生型之鹼基序列較佳為顯示80%以上之同一性，更佳為顯示85%以上之同一性，進一步較佳為顯示90%以上之同一性，進一步較佳為顯示95%以上之同一性，進一步更佳為顯示98%以上之同一性。對源自仙台病毒的領導序列及尾曳序列導入變異的形態，亦可適用於對源自其它病毒的領導序列及尾曳序列導入變異。
於本發明之一實施形態中，就可作為包含控制融合蛋白質之基因表現的基因表現控制部位的鹼基序列來使用的鹼基序列而言，只要其可在導入編碼融合蛋白質的基因之對象的哺乳動物(特別是人類)之細胞、組織或活體內使此融合蛋白質表現，則並未特別限制，但包含源自細胞巨大病毒的啟動子(包含任意選擇之增強子)、SV40早期啟動子、人類延長因子-1α(EF-1α)啟動子、人類泛蛋白C啟動子、反轉錄病毒之勞斯肉瘤病毒LTR啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、及β-肌動蛋白啟動子、磷甘油酸激酶(PGK)啟動子、小鼠白蛋白啟動子、人類白蛋白啟動子、及人類α-1抗胰蛋白酶啟動子者為適合的。例如，具有於小鼠α胎兒蛋白增強子的下游包含小鼠白蛋白啟動子之序列識別號8所示的鹼基序列的合成啟動子(小鼠α胎兒蛋白增強子/小鼠白蛋白啟動子)，係可適合地利用作為基因表現控制部位。於小鼠α胎兒蛋白增強子/小鼠白蛋白啟動子的下游，可配置具有序列識別號9所示的鹼基序列之雞β肌動蛋白/MVM嵌合內含子於其下游。可藉由配置如此的內含子，而使以基因表現控制部位控制的蛋白質的表現量增加。又，於序列識別號8所示的鹼基序列中，第1～219號之鹼基序列為小鼠α胎兒蛋白增強子，第241～549號之鹼基序列為小鼠白蛋白啟動子。
基因控制部位可為臟器特異性或細胞種類特異性地表現的基因之啟動子。可藉由使用臟器特異性表現啟動子或細胞種類特異性表現啟動子，而使核酸分子中所併入的編碼融合蛋白質的基因，於希望的臟器或細胞中特異性地表現。於本發明之一實施形態中，存在複數個由核酸分子編碼的作用子(cistron)的情形，基因控制部位會被配置於每個作用子。
於本發明之一實施形態中，「內部核糖體結合部位」，係指存在於mRNA鏈的內部之與核糖體直接結合且可帽(cap)構造非依存性地開始轉譯的區域(構造)、或會藉由轉錄而產生該區域的DNA鏈之區域(構造)。又，於本發明中，「編碼內部核糖體結合部位的基因」，係指會藉由轉錄而產生該區域的DNA鏈之區域(構造)。內部核糖體結合部位一般被稱為IRES(internal ribosome entry site)，在小核糖核酸病毒科之病毒(脊髓灰白質炎病毒、鼻病毒、小鼠腦心肌炎病毒等)、口蹄疫病毒、A型肝炎病毒、C型肝炎病毒、冠狀病毒、牛腸病毒、泰勒氏鼠腦脊髓炎病毒、柯薩奇B型病毒等之病毒之5'非轉譯區域、人類免疫球蛋白重鏈結合蛋白質、果蠅觸角足、果蠅超級雙胸等之基因之5'非轉譯區域被發現。小核糖核酸病毒的情形，其IRES係存在於mRNA的5'非轉譯區域之由約450 bp所構成的區域。此處「病毒之5'非轉譯區域」，係指病毒之mRNA之5'非轉譯區域、或會藉由轉錄而產生該領域的DNA鏈之區域(構造)。
於一實施形態中，內部核糖體結合部位只要在哺乳動物(特別是人類)之細胞、組織或活體內作為內部核糖體結合部位而發揮作用，則並未特別限定，任一者都可使用。彼等之中，可列舉較佳為源自病毒之5'非轉譯區域的內部核糖體結合部位，更佳為源自小核糖核酸病毒科之病毒的5'非轉譯區域的內部核糖體結合部位，進一步較佳為源自小鼠腦心肌炎病毒之5'非轉譯區域的內部核糖體結合部位。作為源自小鼠腦心肌炎病毒之5'非轉譯區域的內部核糖體結合部位之一實施形態，可列舉具有序列識別號10所示的鹼基序列者。
於一實施形態中，內部核糖體結合部位可直接使用具有野生型之鹼基序列者。又，對此等野生型之內部核糖體結合部位的鹼基序列施加1或2個以上的變異(例如，指取代、欠損、或/及插入等)之變異型的內部核糖體結合部位，亦只要在哺乳動物(特別是人類)之細胞、組織或活體內作為內部核糖體結合部位而發揮作用，則可使用任一者。又，亦可使用使2個以上之內部核糖體結合部位融合的嵌合型之內部核糖體結合部位。
於本發明之一實施形態中，構成抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的蛋白質，只要是在活體內顯示生理活性者，則未特別限定。作為該種具有生理活性的蛋白質之適合者，可列舉應作為醫藥而長期對患者投予者。作為該種醫藥，可列舉例如，生長激素、溶酶體酶、體介素、胰島素、升糖素、細胞激素、淋巴激素、血液凝固因子、抗體、抗體與其它蛋白質之融合蛋白質、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、紅血球生成素、達貝泊汀、組織漿胞素原活化劑(t-PA)、凝血酶調節素、濾泡激素(FSH)、促性腺激素釋放激素(GnRH)、促性腺激素、DNasel、促甲狀腺激素(TSH)、神經生長因子(NGF)、睫狀神經營養因子(CNTF)、神經膠細胞株神經營養因子(GDNF)、神經滋養素3、神經滋養素4/5、神經滋養素6、神經調節蛋白1、活化素、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)、纖維母細胞生長因子2(FGF2)、上皮細胞增殖因子(EGF)、血管內皮增殖因子(VEGF)、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、介白素6、PD-1、PD-1配位體、腫瘤壞死因子α受體(TNF-α受體)、具有分解β類澱粉蛋白的活性的酵素、依那西普、培維索孟、美曲普汀、阿巴西普、阿爾法、及GLP-1受體促效劑、抗體醫藥之任一者。
作為具有生理活性的蛋白質為溶酶體酶的情形之適合例，可列舉α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸脂酶、葡萄糖腦苷酶、β-半乳糖苷酶、GM2活性化蛋白質、β-己醣胺酶A、β-己醣胺酶B、N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸轉移酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、半乳糖基神經醯胺酶、蛋白皂角素C、芳基硫酸脂酶A、α-L-岩藻糖苷酶、天冬胺醯基胺基葡萄糖苷酶、α-N-乙醯基胺基半乳糖苷酶、酸性神經髓磷脂酶、α-半乳糖苷酶A、β-葡萄糖醛酸苷酶、肝素N-硫酸脂酶、α-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶、乙醯基CoAα-胺基葡萄糖苷N-乙醯基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-硫酸脂酶、酸性神經醯胺酶、澱粉-1,6-葡萄糖苷酶、唾液酸酶、軟脂醯基蛋白質硫酯酶-1、三肽基肽酶-1、玻糖醛酸酶-1、CLN1及CLN2。
於本發明之一實施形態中，具有生理活性的蛋白質為人類之蛋白質。此處，蛋白質可為野生型的蛋白質，只要具有該蛋白質原本具有的生理活性，則可為經施加變異者。此處，某蛋白質具有原本的生理活性，意指某蛋白質相對於該蛋白質的野生型蛋白質的生理活性而具有20%以上之生理活性。其生理活性相對於野生型蛋白質的生理活性更佳為40%以上，進一步較佳為50%以上，更進一步較佳為80%以上，還更進一步較佳為90%以上。
將具有野生型之生理活性的蛋白質之胺基酸序列的胺基酸以其它的胺基酸取代的情形，取代的胺基酸之個數，較佳為1～20個，更佳為1～10個，進一步較佳為1～3個。使野生型的該蛋白質之胺基酸缺失的情形，缺失的胺基酸個數較佳為1～20個，更佳為1～10個，進一步較佳為1～3個。又，亦可施加組合此等胺基酸之取代與缺失的變異。對野生型之該蛋白質加成胺基酸的情形，於該蛋白質之胺基酸序列中或N末端或C末端，較佳為加成1～20個胺基酸，更佳為1～10個，進一步較佳為1～3個。亦可施加組合此等胺基酸之加成、取代及缺失的變異。經施加變異的該蛋白質之胺基酸序列，係與野生型之該蛋白質的胺基酸序列較佳為顯示80%以上之同一性，較佳為顯示85%以上之同一性，更佳為顯示90%以上之同一性，進一步較佳為顯示95%以上之同一性，進一步更佳為顯示98%以上之同一性。
又，於本發明中，與野生型蛋白質比較時之各變異的位置及其形式(缺失、取代、加成)，可藉由野生型及變異型蛋白質之胺基酸序列的比對而輕易確認。又，於本發明中，野生型蛋白質之胺基酸序列與變異型蛋白質之胺基酸序列的同一性，可使用周知之相同性計算演算法而輕易算出。例如，作為這樣的演算法，有BLAST(Altschul SF. J Mol. Biol. 215. 403-10， (1990))，Pearson及Lipman之類似性檢索法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444 (1988))，Smith及Waterman之局部相同性演算法(Adv. Appl. Math. 2. 482-9(1981))等。
上述之蛋白質之胺基酸序列中的胺基酸之藉由其它胺基酸的取代，係例如在胺基酸之彼等的側鏈及化學性質中有關連性的胺基酸家族內發生。像這樣的胺基酸家族內的取代，預測並不會對蛋白質的功能帶來大的變化(即，為保存的胺基酸取代)。作為該種胺基酸家族，係例如有以下者： (1)為酸性胺基酸的天冬胺酸及麩胺酸， (2)為鹼性胺基酸的組胺酸、離胺酸、及精胺酸 (3)為芳香族胺基酸的苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸， (4)為具有羥基之胺基酸(羥基胺基酸)的絲胺酸及蘇胺酸， (5)為疏水性胺基酸的甲硫胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、及異白胺酸， (6)為中性之親水性胺基酸的半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺酸、及麩醯胺， (7)為影響肽鏈配向之胺基酸的甘胺酸及脯胺酸， (8)為醯胺型胺基酸(極性胺基酸)的天冬醯胺酸及麩醯胺， (9)為脂肪族胺基酸的丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、及纈胺酸， (10)為側鏈小的胺基酸的丙胺酸、甘胺酸、絲胺酸、及蘇胺酸， (11)為側鏈特小的胺基酸的丙胺酸及甘胺酸。
關於本發明中之構成配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的抗體，於以下詳述。
於本發明中，稱「配位體」時，係指會與成為標的之蛋白質特異性地結合的蛋白質。抗體包含在配位體中。本發明之一實施形態中之成為配位體之標的的蛋白質為存在於血管內皮細胞上的蛋白質，特別是存在於腦血管內皮細胞表面上的蛋白質。就該種存在於血管內皮細胞表面上的蛋白質而言，可例示運鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體(IR)、瘦素受體、似胰島素生長因子I受體、似胰島素生長因子II受體、脂蛋白受體、葡萄糖運輸蛋白1、有機陰離子運輸蛋白、單羧酸運輸蛋白、低密度脂蛋白受體相關蛋白質1、低密度脂蛋白受體相關蛋白質8、及肝素結合性上皮生長因子樣生長因子之膜結合型前驅物。再者，就有機陰離子運輸蛋白而言，可例示OATP-F，而就單羧酸運輸蛋白而言，可例示MCT-8。此等之存在於血管內皮細胞表面上的蛋白質之中，又特別以TfR及IR為適合的標的，TfR為更適合的標的。
就作為抗體以外的配位體的適合者而言，可例示運鐵蛋白、胰島素、瘦素、似胰島素生長因子I、似胰島素生長因子II、脂蛋白、及低密度脂蛋白。此等之中，又特別以運鐵蛋白及胰島素為適合的配位體，運鐵蛋白為更適合的配位體。此等配位體可為野生型的蛋白質，又，只要具有會與成為標的的蛋白質特異性地結合的功能，則可為其片段或變異體。此等配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質，可與存在於血管內皮細胞表面的標的結合。血管內皮細胞為腦血管內皮細胞的情形，會成為可通過BBB而到達中樞神經系統的組織。
抗體只要具有會與抗原特異性地結合的性質，則抗體的動物種等並未特別限制，但特別是人類抗體或人類化抗體。例如，抗體可為人類以外的哺乳動物的抗體，又可為人類抗體與人類以外之其它哺乳動物之抗體的嵌合抗體。
人類抗體係指其全體皆由源自人類的基因所編碼的抗體。惟，由以使基因表現效率提升等之目的而對原本的人類基因施加變異的基因所編碼的抗體，亦為人類抗體。又，組合編碼人類抗體的2個以上之基因，將某一個人類抗體的一部分以其它人類抗體的一部分置換的抗體，亦為人類抗體。人類抗體具有免疫球蛋白輕鏈之3處的互補性決定區域(CDR)與免疫球蛋白重鏈之3處的互補性決定區域(CDR)。免疫球蛋白輕鏈之3處的CDR，由位於N末端側者依序稱為CDR1、CDR2及CDR3。免疫球蛋白重鏈之3處的CDR，由位於N末端側者依序稱為CDR1、CDR2及CDR3。藉由將某一個人類抗體的CDR置換為其它人類抗體的CDR而改變人類抗體的抗原特異性、親和性等的抗體，亦為人類抗體。
於本發明中，藉由改變原本的人類抗體基因而對原本的抗體的胺基酸序列施加取代、缺失、加成等之變異的抗體，亦稱為人類抗體。使原本的抗體之胺基酸序列中的胺基酸取代為其它胺基酸的情形，取代的胺基酸個數較佳為1～20個，更佳為1～10個，進一步較佳為1～5個，進一步更佳為1～3個。使原本的抗體之胺基酸序列中的胺基酸缺失的情形，缺失的胺基酸個數較佳為1～20個，更佳為1～10個，進一步較佳為1～5個，更佳為1～3個。又，施加組合此等胺基酸之取代與缺失的變異的抗體亦為人類抗體。使胺基酸加成的情形，於原本的抗體之胺基酸序列中或N末端側或C末端側，較佳為加成1～20個胺基酸，更佳為1～10個，進一步較佳為1～5個，進一步更佳為1～3個。施加組合此等胺基酸的加成、取代及缺失的變異的抗體，亦為人類抗體。經施加變異的抗體之胺基酸序列，係與原本的抗體之胺基酸序列相比而較佳為顯示80%以上之同一性，更佳為顯示90%以上之同一性，進一步較佳為顯示95%以上之同一性，進一步更佳為顯示98%以上之同一性。即，於本發明中稱為「源自人類的基因」時，除了源自人類的原本的基因之外，亦包含藉由對源自人類的原本的基因施加改變而獲得的基因。
於本發明中，「人類化抗體」之用語，係指可變區的一部分(例如，特別是CDR的全部或一部分)之胺基酸序列源自人類以外的哺乳動物，而其以外的區域源自人類的抗體。例如，作為人類化抗體，可列舉藉由將構成人類抗體的免疫球蛋白輕鏈之3處的互補性決定區域(CDR)與免疫球蛋白重鏈之3處的互補性決定區域(CDR)，以其它哺乳動物的CDR取代而製作的抗體。成為被移植至人類抗體的適當位置之CDR的來源的其它哺乳動物的生物種，只要為人類以外的哺乳動物，則未特別限定，但較佳為小鼠、大鼠、兔、馬、或人類以外的靈長類，更佳為小鼠及大鼠，例如小鼠。
於本發明中，以下詳述關於抗體為人類抗體或人類化抗體的情形。於人類抗體及人類化抗體之輕鏈，有λ鏈及κ鏈。構成抗體的輕鏈可為λ鏈及κ鏈之任一者。又，於人類抗體及人類化抗體之重鏈，有γ鏈、μ鏈、α鏈、σ鏈及ε鏈，分別對應於IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。構成抗體的重鏈可為γ鏈、μ鏈、α鏈、σ鏈及ε鏈之任一者，但較佳為γ鏈。再者，於抗體重鏈的γ鏈，有γ1鏈、γ2鏈、γ3鏈及γ4鏈，分別對應於IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。構成抗體的重鏈為γ鏈的情形，其γ鏈可為γ1鏈、γ2鏈、γ3鏈及γ4鏈之任一者，但較佳為γ1鏈或γ4鏈。抗體為人類化抗體或人類抗體，且為IgG的情形，該抗體輕鏈可為λ鏈及κ鏈之任一者，該抗體之重鏈可為γ1鏈、γ2鏈、γ3鏈及γ4鏈之任一者，但較佳為γ1鏈或γ4鏈。例如，作為較佳抗體之一個態樣，可列舉輕鏈為λ鏈且重鏈為γ1鏈者。
於本發明中，「嵌合抗體」之用語，係指源自2個以上不同物種之2個以上不同抗體的片段經連結而成的抗體。
人類抗體與其它哺乳動物之抗體的嵌合抗體，係指人類抗體的一部分經人類以外的哺乳動物的抗體的一部分所取代的抗體。抗體包含以下說明的Fc區域、Fab區域及鉸鏈部。作為這樣的嵌合抗體之具體例，可列舉Fc區域源自人類抗體但Fab區域源自其它哺乳動物之抗體的嵌合抗體。相反地Fc區域源自其它哺乳動物但Fab區域源自人類抗體者，亦為嵌合抗體。鉸鏈部可源自人類抗體或其它哺乳動物的抗體之任一者。關於人類化抗TfR抗體亦可謂相同。
又，抗體亦可由可變區與恆定區所構成。作為嵌合抗體之其它具體例，可列舉重鏈之恆定區(C H)與輕鏈之恆定區(C L)源自人類抗體但重鏈之可變區(V H)及輕鏈之可變區(V L)源自其它哺乳動物的抗體者、相反地重鏈之恆定區(C H)與輕鏈之恆定區(C L)源自其它哺乳動物的抗體但重鏈之可變區(V H)及輕鏈之可變區(V L)源自人類抗體者。此處，其它哺乳動物的生物種只要為人類以外之哺乳動物，則未特別限定，但較佳為小鼠、大鼠、兔、馬、或人類以外之靈長類，更佳為小鼠。關於人類化抗TfR抗體亦可謂相同。
人類抗體與小鼠抗體的嵌合抗體，特別地稱為「人類/小鼠嵌合抗體」。於人類/小鼠嵌合抗體，可列舉Fc區域源自人類抗體但Fab區域源自小鼠抗體的嵌合抗體、或相反地Fc區域源自鼠抗體但Fab區域源自人類抗體的嵌合抗體。鉸鏈部源自人類抗體或小鼠抗體之任一者。作為人類/小鼠嵌合抗體之其它的具體例，可列舉重鏈之恆定區(C H)與輕鏈之恆定區(C L)源自人類抗體但重鏈之可變區(V H)及輕鏈之可變區(V L)為源自小鼠抗體者、相反地重鏈之恆定區(C H)與輕鏈之恆定區(C L)源自小鼠抗體但重鏈之可變區(V H)及輕鏈之可變區(V L)源自人類抗體者。關於人類化抗TfR抗體亦可謂相同。
抗體原來是具有由2條免疫球蛋白輕鏈與2條免疫球蛋白重鏈之共計4條多肽鏈所構成的基本構造。惟，於本發明中，稱為「抗體」時，除了具有此基本構造者之外，亦包含： (1)由1條的免疫球蛋白輕鏈與1條的免疫球蛋白重鏈之共計2條的多肽鏈所構成者；或如以下詳述， (2)為使連接子結合於免疫球蛋白輕鏈的C末端側，而且進一步使免疫球蛋白重鏈結合於該C末端側而成者的單股抗體； (3)為使連接子結合於免疫球蛋白重鏈的C末端側，而且進一步使免疫球蛋白輕鏈結合於該C末端側而成的單股抗體； (4)為使連接子結合於免疫球蛋白重鏈之可變區的C末端側，而且進一步使免疫球蛋白輕鏈之可變區結合於該C末端側而成者的單股抗體(scFv)；及 (5)為使連接子結合於免疫球蛋白輕鏈之可變區的C末端側，而且進一步使免疫球蛋白重鏈之可變區結合於該C末端側而成者的單股抗體(scFv)。又， (6)由從原來之意義的抗體之基本構造缺失了Fc區域的Fab區域所構成者及由Fab區域與鉸鏈部之全部或一部分所構成者(包含Fab、F(ab’)及F(ab’) 2)；及 (7)單域抗體，亦包含在本發明中的「抗體」中。再者，使輕鏈之可變區與重鏈之可變區藉由連接子結合而作成單股抗體的scFv，亦包含在本發明中的抗體中。
又，於本發明中稱為「連接子」時，係例如指由複數個胺基酸藉由肽鍵而結合的肽鏈所構成者。由該種肽鏈所構成的連接子，亦可稱為「肽連接子」。「連接子」於本說明書的上下文中亦可改稱為「連接子序列」。藉由此連接子之N末端與其它蛋白質之C末端以肽鍵結合，且該連接子之C末端進一步藉由與其它蛋白質的N末端結合，而2個蛋白質透過連接子而形成結合體。
具有由2條輕鏈與2條重鏈之共計4條多肽鏈所構成的基本構造的抗體，於輕鏈之可變區(V L)具有3處的互補性決定區域(CDR)及於重鏈之可變區(V H)具有3處的互補性決定區域(CDR)。輕鏈之3處的CDR，由位於N末端側者依序稱為CDR1、CDR2及CDR3。重鏈之3處的CDR亦由位於N末端側者依序稱為CDR1、CDR2及CDR3。惟，即使此等CDR之一部分或全部不完全、或不存在，只要具有會與特定之抗原特異性地結合的性質，則包含在抗體中。輕鏈及重鏈之可變區(V L及V H)的CDR以外的區域稱為框架區域(FR)。FR由位於N末端側者依序稱為FR1、FR2、FR3及FR4。通常，CDR與FR係由N末端側以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的順序存在。
於本發明之一實施形態中，Fab係指包含可變區與C L區域(輕鏈之恆定區)的1條輕鏈、與包含可變區與C H1區域(重鏈之恆定區的部分1)的1條重鏈，以分別存在的半胱胺酸殘基彼此藉由雙硫鍵而結合的分子。於Fab中，重鏈除了可變區與C H1區域(重鏈之恆定區的部分1)之外，可進一步包含鉸鏈部之一部分，但此情形的鉸鏈部欠缺存在於鉸鏈部而將抗體之重鏈彼此結合的半胱胺酸殘基。於Fab中，輕鏈與重鏈係藉由存在於輕鏈之恆定區(C L區域)的半胱胺酸殘基、與存在於重鏈之恆定區(C H1區域)或鉸鏈部的半胱胺酸殘基之間所形成的雙硫鍵而結合。將形成Fab之重鏈稱為Fab重鏈。Fab因欠缺存在於鉸鏈部而將抗體之重鏈彼此結合的半胱胺酸殘基，因此由1條輕鏈與1條重鏈所構成。構成Fab的輕鏈包含可變區與C L區域。構成Fab的重鏈可為由可變區與C H1區域所構成者，亦可為除了可變區、C H1區域之外還包含鉸鏈部的一部分者。然而此種情形，鉸鏈部被選擇不包含將重鏈間結合的半胱胺酸殘基，而使雙硫鍵不會在2條重鏈之間形成。於F(ab’)中，其重鏈除了可變區與C H1區域之外，還包含含有將重鏈彼此結合的半胱胺酸殘基的鉸鏈部之全部或一部分。F(ab’) 2係指2個F(ab’)以存在於雙方之鉸鏈部的半胱胺酸殘基彼此藉由雙硫鍵結合的分子。將形成F(ab’)或F(ab’) 2之重鏈稱為Fab’重鏈。又，複數個抗體直接或或透過連接子結合而成的二聚體、三聚體等之聚合體，亦為抗體。再者，未限於此等，包含抗體分子之一部分，且具有會與抗原特異性地結合的性質者，任一者皆包含在本發明中所稱「抗體」中。即，於本發明中稱為輕鏈時，係包含源自輕鏈且具有其可變區的全部或一部分之胺基酸序列者。又，稱為重鏈時，係包含源自重鏈且具有其可變區的全部或一部分之胺基酸序列者。因此，只要具有可變區的全部或一部分的胺基酸序列，則例如，Fc區域缺失者亦為重鏈。
又，此處Fc或Fc區域，係指抗體分子中之包含由C H2區域(重鏈之恆定區的部分2)，及C H3區域(重鏈之恆定區的部分3)所構成之片段的區域。
再者，本發明之一實施形態中之抗體亦包含： (8)使構成上述(6)所示的Fab、F(ab’)或F(ab’) 2的輕鏈與重鏈透過連接子序列而結合，而分別作為單股抗體的scFab、scF(ab’)、及scF(ab’) 2。此處，就scFab、scF(ab’)、及scF(ab’) 2來說，可為使連接子序列結合於輕鏈之C末端側，而且進一步使重鏈結合於該C末端側而成者，又，可為使連接子結合於重鏈之C末端側，而且進一步使輕鏈結合於該C末端側而成者。再者，使輕鏈之可變區與重鏈之可變區透過連接子結合而作成單股抗體的scFv，亦包含在本發明中的抗體中。就scFv來說，可使連接子序列結合於輕鏈之可變區的C末端側，而且進一步使重鏈結合於該C末端側之可變區而成者，又，亦可為使連接子序列結合於重鏈之可變區的C末端側，而且進一步使輕鏈之可變區結合於該C末端側而成者。
再者，於本說明書中所稱「抗體」，除了指完全長度的抗體、上述(1)～(8)所示者之外，亦包含完全長度的抗體之一部分有缺損者的抗原結合性片段(抗體片段)之任一者的形態，此形態為較包含(1)～(8)更廣的概念。於抗原結合性片段，亦包含重鏈抗體、輕鏈抗體、VHH、VNAR、及此等之一部分有缺損者。
「抗原結合性片段」之用語，係指保持著與抗原之特異的結合活性之至少一部分的抗體之片段。就結合性片段之例而言，包含Fab、Fab’、F(ab’) 2、可變區(Fv)、以適當連接子使重鏈可變區(V H)與輕鏈可變區(V L)連結而成的單股抗體(scFv)、為包含重鏈可變區(V H)與輕鏈可變區(V L)的多肽之二聚體的雙價抗體(diabodies)、為恆定區之一部分(C H3)結合於scFv之重鏈(H鏈)者之二聚體的微型抗體(minibody)、其它低分子化抗體等。惟，只要具有與抗原的結合能力，則並未限定於此等之分子。
於本發明中，稱為「單股抗體」時，係指一種可與特定之抗原特異性地結合的蛋白質，其係連接子結合於包含免疫球蛋白輕鏈之可變區的全部或一部分的胺基酸序列之C末端側，而且進一步，包含免疫球蛋白重鏈之可變區的全部或一部分的胺基酸序列結合於該C末端側而成。又，下述可與特定之抗原特異性地結合的蛋白質亦為本發明中的「單股抗體」，其係連接子結合於包含免疫球蛋白重鏈之可變區的全部或一部分的胺基酸序列之C末端側，而且進一步，包含免疫球蛋白輕鏈之可變區的全部或一部分的胺基酸序列結合於該C末端側而成。例如，上述(2)及(3)所示者包含在單股抗體中。就免疫球蛋白輕鏈透過連接子而結合於免疫球蛋白重鏈之C末端側而成的單股抗體來說，通常，免疫球蛋白重鏈係Fc區域缺失。免疫球蛋白輕鏈之可變區具有3個與抗體之抗原特異性有關的互補性決定區域(CDR)。同樣地，免疫球蛋白重鏈之可變區亦具有3個CDR。此等之CDR為決定抗體之抗原特異性的主要區域。因此，於單股抗體，較佳為包含免疫球蛋白重鏈之3個CDR全部及免疫球蛋白輕鏈之3個CDR全部。惟，只要可維持抗體之抗原特異的親和性，則亦可作成使CDR之1個或複數個缺失的單股抗體。
於單股抗體中，被配置於免疫球蛋白之輕鏈與重鏈之間的連接子，較佳為由2～50個胺基酸殘基所構成的肽鏈，更佳為8～50個，進一步較佳為10～30個，進一步更佳為12～18個或15～25個，例如15個或25個。如此的連接子，只要是藉其而兩鏈連結而成的抗hTfR抗體會保持對hTfR的親和性，則其胺基酸序列並未限定，但較佳為僅由甘胺酸或由甘胺酸與絲胺酸所構成者，例如，胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、序列識別號1、序列識別號2、序列識別號3、序列識別號13、或具有此等之胺基酸序列重複2～10次或2～5次的序列者。例如，使免疫球蛋白輕鏈之可變區透過連接子而結合於由免疫球蛋白重鏈之可變區的全部區域所構成的胺基酸序列之C末端側而作成ScFV的情形，可為適合使用具有序列識別號13之序列的連接子。
本發明之一實施形態中之抗體為源自駱駝科動物(包含羊駝)的抗體。於駱駝科動物之抗體，有由藉由雙硫鍵而連結的2條重鏈所構成者。將此由2條重鏈所構成的抗體稱為重鏈抗體。VHH為由包含構成重鏈抗體的重鏈之可變區的1條重鏈所構成的抗體、或由缺少構成重鏈抗體的恆定區(CH)的1條重鏈所構成的抗體。VHH亦為本發明之實施形態中之抗體之一者。為了減少將源自駱駝科動物的抗體(包含VHH)對人類投予時之抗原性，而對駱駝科動物之抗體的胺基酸序列施加變異者，亦為本發明之一實施形態中之抗體。對駱駝科動物之抗體的胺基酸施加變異的情形，可施加與本說明書中記載之可對抗體施加之變異相同的變異。此外，由藉由雙硫鍵而連結的2條輕鏈所構成的抗體，亦為本發明之實施形態中之抗體之一者。將此由2條輕鏈所構成的抗體稱為輕鏈抗體。
本發明之一實施形態中之抗體為源自鯊魚的抗體。鯊魚之抗體係由藉由雙硫鍵而連結的2條重鏈所構成。將此由2條重鏈所構成的抗體稱為重鏈抗體。VNAR為由包含構成重鏈抗體的重鏈之可變區的1條重鏈所構成的抗體、或由缺少構成重鏈抗體的恆定區(CH)的1條重鏈所構成的抗體。VNAR亦為本發明之實施形態中之抗體之一者。為了減少將源自鯊魚的抗體(包含VNAR)對人類投予時的抗原性，而對鯊魚之抗體之胺基酸序列施加變異者，亦為本發明之一實施形態中之抗體。對鯊魚之抗體的胺基酸施加變異的情形，可施加與本說明書中記載之可對抗體施加之變異相同的變異。將鯊魚之抗體人類化者，亦為本發明之實施形態中之抗體之一者。
於本發明之一實施形態中，單域抗體係指以單一可變區而具有會與抗原特異性地結合的性質的抗體。於單域抗體包含可變區僅由重鏈之可變區所構成的抗體(重鏈單域抗體)、可變區僅由輕鏈之可變區所構成的抗體(輕鏈單域抗體)。VHH、VNAR為單域抗體之一種。
於本發明之一實施形態中，構成抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的抗體，只要會於活體內對於特定之抗原顯示親和性，則未特別限定。例如，該抗體係對於存在於血管內皮細胞表面上的蛋白質具有特異的親和性的抗體。就該存在於血管內皮細胞表面上的蛋白質而言，可例示運鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體(IR)、瘦素受體、似胰島素生長因子I受體、似胰島素生長因子II受體、脂蛋白受體、葡萄糖運輸蛋白1、有機陰離子運輸蛋白、單羧酸運輸蛋白、低密度脂蛋白受體相關蛋白質1、低密度脂蛋白受體相關蛋白質8、及肝素結合性上皮生長因子樣生長因子之膜結合型前驅物。再者，就有機陰離子運輸蛋白而言，可例示OATP-F，就單羧酸運輸蛋白而言，可例示MCT-8。此等之存在於血管內皮細胞表面上的蛋白質之中，又特別以TfR及IR為適合的標的，TfR為更適合的標的。由於抗體會與存在於血管內皮細胞表面上的蛋白質結合的情形，融合蛋白質在被攝入血管內皮細胞後，可到達各種組織而在該處顯示生理活性，因此該種融合蛋白質可使用來作為應在各種組織中使藥效發揮的醫藥。例如，抗體為對於TfR、IR具有特異的親和性者的情形，該種融合蛋白質可使用來作為應在肌肉內使藥效發揮的醫藥。
於本發明之一實施形態中，抗體為對於存在於腦血管內皮細胞表面上的蛋白質具有特異的親和性的抗體。就該存在於腦血管內皮細胞表面上的蛋白質而言，可例示運鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體(IR)、瘦素受體、似胰島素生長因子I受體、似胰島素生長因子II受體、脂蛋白受體、葡萄糖運輸蛋白1、有機陰離子運輸蛋白、單羧酸運輸蛋白、低密度脂蛋白受體相關蛋白質1、低密度脂蛋白受體相關蛋白質8、及肝素結合性上皮生長因子樣生長因子之膜結合型前驅物。再者，就有機陰離子運輸蛋白而言，可例示OATP-F，就單羧酸運輸蛋白而言，可例示MCT-8。此等之存在於血管內皮細胞表面上的蛋白質之中，又特別以TfR及IR為適合的標的，TfR為更適合的標的。由於抗體會與存在於腦血管內皮細胞表面上的蛋白質結合的情形，融合蛋白質可藉由通過BBB而到達至腦組織且在該處顯示生理活性，因此該種融合蛋白質可使用作為應在腦內使藥效發揮的醫藥。
於本發明中，「人類運鐵蛋白受體」或「hTfR」之用語，係指具有序列識別號11所示的胺基酸序列的膜蛋白質。本發明之抗hTfR抗體，於其一實施態樣中，為會對於序列識別號11所示的胺基酸序列中由N末端側第89號的半胱胺酸殘基至C末端的苯丙胺酸為止的部分(hTfR之細胞外區域)特異性地結合者，但並未限定於此。
為一實施形態中之Fab的抗hTfR抗體之輕鏈，係具有序列識別號31或32所示的胺基酸序列作為抗hTfR抗體之輕鏈CDR1之胺基酸序列，具有序列識別號33或34所示的胺基酸序列作為hTfR抗體之輕鏈CDR2之胺基酸序列，具有序列識別號35所示的胺基酸序列作為hTfR抗體之輕鏈CDR3之胺基酸序列。為一實施形態中之Fab的抗hTfR抗體之重鏈，係具有序列識別號36或37所示的胺基酸序列作為抗hTfR抗體之重鏈CDR1之胺基酸序列，具有序列識別號38或39所示的胺基酸序列作為hTfR抗體之重鏈CDR2之胺基酸序列，具有序列識別號40或41所示的胺基酸序列作為hTfR抗體之重鏈CDR3之胺基酸序列。
為一實施形態中之Fab的抗hTfR抗體，係包含具有序列識別號15所示的胺基酸序列的輕鏈、與具有序列識別號16所示的胺基酸序列的重鏈者。
作為抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質中的抗體與具有生理活性的蛋白質之結合樣式，可例示以下(a)～(h)： (a)抗體為抗體輕鏈結合於抗體重鏈的C末端側而成的單股抗體，且具有生理活性的蛋白質直接或透過連接子而結合於該單股抗體之N末端側； (b)抗體為抗體輕鏈結合於抗體重鏈的C末端側而成的單股抗體，且具有生理活性的蛋白質直接或透過連接子而結合於該單股抗體之C末端側； (c)抗體為抗體重鏈結合於抗體輕鏈的C末端側而成的單股抗體，且具有生理活性的蛋白質直接或透過連接子而結合於該單股抗體之N末端側； (d)抗體為抗體重鏈結合於抗體輕鏈的C末端側而成的單股抗體，且具有生理活性的蛋白質直接或透過連接子而結合於該單股抗體之C末端側； (e)抗體為包含至少一條輕鏈和至少一條重鏈的抗體，且具有生理活性的蛋白質直接或透過連接子而結合於該抗體輕鏈的C末端側； (f)抗體為包含至少一條輕鏈和至少一條重鏈的抗體，且具有生理活性的蛋白質直接或透過連接子而結合於該抗體輕鏈的N末端側； (g)抗體為包含至少一條輕鏈和至少一條重鏈的抗體，且具有生理活性的蛋白質直接或透過連接子而結合於該抗體重鏈的C末端側； (h)抗體為包含至少一條輕鏈和至少一條重鏈的抗體，且具有生理活性的蛋白質直接或透過連接子而結合於該抗體重鏈的N末端側。
於上述(a)～(h)中，在抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質之間配置連接子的情形，該序列較佳為由1～50個胺基酸所構成者，更佳為1～17個，進一步較佳為1～10個，進一步更佳為1～5個，但根據應與抗體結合的人類溶酶體酶，構成連接子之胺基酸的個數可適宜調整為1個、2個、3個、1～17個、1～10個、10～40個、20～34個、23～31個、25～29個等。如此的連接子，只要藉其而連結的抗體保持與抗原的親和性，且藉由該連接子而連結的蛋白質於生理的條件下可發揮該蛋白質的生理活性，則胺基酸序列未特別限定。該胺基酸序列係較佳為由甘胺酸和絲胺酸所構成者，例如，由甘胺酸或絲胺酸之任一個胺基酸所構成者、具有胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、序列識別號1、序列識別號2、序列識別號3、序列識別號13、或由此等之胺基酸序列2～10個、或2～5個連續而成的2～50個胺基酸所構成的序列、由2～17個、2～10個、10～40個、20～34個、23～31個、25～29個胺基酸所構成的序列等。例如，具有胺基酸序列Gly-Ser者、具有序列識別號13所示的胺基酸序列者、及由Gly-Ser加成於序列識別號13所示的胺基酸序列之C末端而成的17個胺基酸所構成者，可適合地使用作為連接子。
又，為方便起見，於本發明中，將結合抗體之輕鏈或重鏈與具有生理活性的蛋白質的連接子簡稱為「連接子」或「第一連接子」，將於單股抗體中結合輕鏈與重鏈的連接子稱為「第二連接子」。
本發明之一實施形態中之核酸分子，係於第一反向末端重複(ITR)與第二反向末端重複(ITR)之間，包含編碼抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的基因者。以下(1)～(4)為該核酸分子之例示： (1)融合蛋白質為包含具有生理活性的蛋白質直接或透過連接子而結合於抗體重鏈的C末端側或N末端側而成的結合體與抗體輕鏈者，且為於編碼輕鏈的基因之下游包含編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列，而於其下游包含編碼該結合體的鹼基序列者； (2)融合蛋白質為包含具有生理活性的蛋白質直接或透過連接子而結合於抗體重鏈的C末端側或N末端側而成的結合體與抗體輕鏈者，且為於編碼該結合體的基因之下游包含編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列，而於其下游包含編碼輕鏈的鹼基序列者； (3)融合蛋白質為包含具有生理活性的蛋白質直接或透過連接子而結合於抗體輕鏈的C末端側或N末端側而成的結合體與抗體重鏈者，且為於編碼重鏈的基因之下游包含編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列，而於其下游包含編碼該結合體的鹼基序列者； (4)融合蛋白質為包含具有生理活性的蛋白質直接或透過連接子而結合於抗體輕鏈的C末端側或N末端側而成的結合體與抗體重鏈者，且為於編碼該結合體的基因之下游包含編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列，而於其下游包含編碼重鏈的鹼基序列者。 於上述(1)～(4)中，核酸分子可為包含基因表現控制部位的鹼基序列被包含在第一反向末端重複(ITR)與編碼融合蛋白質的基因之間者。又，於上述(1)～(4)中，可將編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列，替換為包含基因表現控制部位的鹼基序列。又，並未限於此，於核酸分子具有2個基因表現控制部位的情形，為方便起見，從第一反向末端重複(ITR)側依序稱為第一基因表現控制部位及第一基因表現控制部位。又，於上述(1)～(4)中，可將編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列，替換為編碼2A自我切割肽的鹼基序列。源自豬鐵士古病毒(porcine Teschovirus)的2A肽為2A自我切割肽之適合之一例。
抗體為單股抗體的情形，本發明之一實施形態中之核酸分子為在第一反向末端重複(ITR)與第二反向末端重複(ITR)之間包含編碼單股抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的基因者。以下(1)～(4)為該核酸分子的例示： (1)包含編碼使輕鏈透過第二連接子而結合於抗體重鏈的C末端側，而且使具有生理活性的蛋白質直接或透過連接子結合於輕鏈的C末端側而成的融合蛋白質的基因者； (2)包含編碼使重鏈透過第二連接子而結合於抗體輕鏈的C末端側，而且使具有生理活性的蛋白質直接或透過連接子而結合於輕鏈的C末端側而成的融合蛋白質的基因者； (3)包含編碼使抗體重鏈直接或透過連接子而結合於具有生理活性的蛋白質的C末端側，而且使輕鏈結合於重鏈的C末端側而成的融合蛋白質的基因者； (4)包含編碼使抗體輕鏈直接或透過連接子而結合於具有生理活性的蛋白質的C末端側，而且使重鏈結合於重鏈的C末端側而成的融合蛋白質的基因者。 於上述(1)～(4)中，核酸分子可為包含基因表現控制部位的鹼基序列被包含在第一反向末端重複(ITR)與編碼融合蛋白質的基因之間者。
一種在第一反向末端重複(ITR)與第二反向末端重複(ITR)之間包含編碼抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的基因的核酸分子，該融合蛋白質包含使具有生理活性的蛋白質結合於抗體重鏈的C末端側而成的結合體及抗體輕鏈，且於編碼輕鏈的基因之下游包含編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列，而於其下游包含編碼該結合體的基因，作為此核酸分子之一實施形態，可列舉該結合體為人類艾杜糖醛酸-2-硫酸脂酶(hI2S)透過連接子而結合於抗hTfR抗體重鏈的Fab區域的下游者，且抗體輕鏈為抗hTfR抗體輕鏈者。作為其具體例，有抗hTfR抗體重鏈的Fab區域包含序列識別號12所示的胺基酸序列，連接子包含序列識別號13所示的胺基酸序列，hI2S包含序列識別號14所示的胺基酸序列者，且抗hTfR抗體輕鏈包含序列識別號15所示的胺基酸序列者。此處，結合體作為全體而包含序列識別號42所示的胺基酸序列。
一種在第一反向末端重複(ITR)與第二反向末端重複(ITR)之間包含編碼抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的基因的核酸分子，該融合蛋白質包含使具有生理活性的蛋白質結合於抗體重鏈的C末端側而成的結合體及抗體輕鏈，且於編碼輕鏈的基因之下游包含編碼源自豬鐵士古病毒的2A肽的鹼基序列，而於其下游編碼該結合體的基因，作為此核酸分子之一實施形態，可列舉該結合體為β-半乳糖苷酶(hGLB1)透過連接子而結合於抗hTfR抗體重鏈的Fab區域的下游者，且抗體輕鏈為抗hTfR抗體輕鏈者。作為其具體的例，有抗hTfR抗體重鏈的Fab區域包含序列識別號12所示的胺基酸序列，連接子包含序列識別號13所示的胺基酸序列，hGLB1包含序列識別號50所示的胺基酸序列者，且抗hTfR抗體輕鏈包含序列識別號15所示的胺基酸序列者。此處，結合體作為全體而包含序列識別號48所示的胺基酸序列。
本發明之一實施形態中之核酸分子為在第一長末端重複(LTR)與第二長末端重複(LTR)之間包含編碼抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的基因者。以下(1)～(4)為該核酸分子的例示： (1)融合蛋白質為包含使具有生理活性的蛋白質結合於抗體重鏈的C末端側或N末端側而成的結合體與抗體輕鏈者，且為於編碼輕鏈的基因之下游包含編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列，而於其下游包含編碼該結合體的鹼基序列者， (2)融合蛋白質為包含使具有生理活性的蛋白質結合於抗體重鏈的C末端側或N末端側而成的結合體與抗體輕鏈者，且為於編碼該結合體的基因之下游包含編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列，而於其下游包含編碼輕鏈的鹼基序列者， (3)融合蛋白質為包含使具有生理活性的蛋白質結合於抗體輕鏈的C末端側或N末端側而成的結合體與抗體重鏈者，且為於編碼重鏈的基因之下游包含編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列，而於其下游包含編碼該結合體的鹼基序列者， (4)融合蛋白質為包含使具有生理活性的蛋白質結合於抗體輕鏈的C末端側或N末端側而成的結合體與抗體重鏈者，且為於編碼該結合體的基因之下游包含編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列，而於其下游包含編碼重鏈的鹼基序列者。 於上述(1)～(4)中，核酸分子可為包含基因表現控制部位的鹼基序列被包含在第一反向末端重複(LTR)與編碼融合蛋白質的基因之間者。又，於上述(1)～(4)，可將編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列替換為包含基因表現控制部位的鹼基序列。核酸分子具有2個基因表現控制部位的情形，為方便起見，從第一反向末端重複(LTR)側依序稱為第一基因表現控制部位及第一基因表現控制部位。又，於上述(1)～(4)中，可將編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列，替換為編碼2A自我切割肽的鹼基序列。源自豬鐵士古病毒的2A肽為2A自我切割肽的適合之一例。
抗體為單股抗體的情形之本發明之一實施形態中之核酸分子，係在第一長末端重複(LTR)與第二長末端重複(LTR)之間，包含編碼單股抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的基因者。以下(1)～(4)為該核酸分子之例示： (1)包含編碼使輕鏈透過第二連接子而結合於抗體重鏈的C末端側，而且使具有生理活性的蛋白質直接或透過連接子而結合於輕鏈的C末端側而成的融合蛋白質的基因者； (2)包含編碼使重鏈透過第二連接子而結合於抗體輕鏈的C末端側，而且使具有生理活性的蛋白質直接或透過連接子而結合於輕鏈的C末端側而成的融合蛋白質的基因者； (3)包含編碼使抗體重鏈直接或透過連接子而結合於具有生理活性的蛋白質之C末端側，而且使輕鏈結合於重鏈的C末端側而成的融合蛋白質的基因者； (4)包含編碼使抗體輕鏈直接或透過連接子而結合於具有生理活性的蛋白質的C末端側，而且使重鏈結合於重鏈的C末端側而成的融合蛋白質的基因者。 於上述(1)～(4)中，核酸分子可為包含基因表現控制部位的鹼基序列被包含在第一長末端重複(LTR)與編碼融合蛋白質的基因之間者。
就包含編碼上述內部核糖體結合部位的鹼基序列的核酸分子來說，係成為由基因表現控制部位控制構成融合蛋白質的一條肽鏈的表現，由編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列控制另一條肽鏈的表現。兩條肽鏈在細胞內配對而形成抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質。
本發明之一實施形態中之核酸分子可於AAV載體系統中使用。若野生型的AAV單獨感染宿主細胞的人類細胞，則病毒基因體會透過存在於病毒基因體兩端的反向末端重複(ITR)，而位點特異性地被併入第19號染色體中。被併入宿主細胞的基因體中的病毒基因體的基因幾乎不會表現，但若細胞被輔助病毒感染，則AAV會從宿主基因體被切出，而開始感染性病毒的複製。輔助病毒為腺病毒的情形，負責輔助作用的基因為E1A、E1B、E2A、VA1、及E4。此處，就宿主細胞為以腺病毒的E1A、E1B轉形的源自人類胎兒腎組織的細胞之HEK293細胞的情形來說，E1A及E1B基因原本就在宿主細胞中表現。
野生型AAV基因體包含2個基因：rep及cap。由rep基因所產生的rep蛋白質(rep78、rep68、rep52及rep40)為衣殼形成所必須，且同時干預病毒基因體往染色體的併入。cap基因負責3個衣殼蛋白質(VP1、VP2及VP3)的產生。
在野生型AAV的基因體，於兩端有ITR存在，於ITR之間有rep基因及cap基因存在。此基因體被內包於衣殼中而形成AAV病毒顆粒。重組AAV病毒顆粒(rAAV病毒顆粒)，係以編碼外來的蛋白質的基因取代包含rep基因及cap基因的區域，且其被內包於衣殼而成者。
rAAV病毒顆粒係作為用以將外來基因遞送至細胞的載體而用於治療目的。
於為了將外來的基因導入至細胞、組織、或活體內而使用的重組AAV病毒顆粒的生產，通常使用以下3種類的質體：(1)具有包含源自AAV等之病毒的第一反向末端重複(ITR)的鹼基序列與包含第二反向末端重複(ITR)的鹼基序列、及包含被配置於此等2個ITR之間的編碼期望的蛋白質的基因之構造的質體(質體1)；(2)包含具有為了將前述ITR序列所包夾的區域(包含ITR序列)之鹼基序列併入至宿主細胞的基因體中所必要之功能的AAV Rep基因、及編碼AAV的衣殼蛋白質的基因的質體(質體2)；及(3)包含腺病毒的E2A區域、E4區域、及VA1 RNA區域的質體(質體3)。但，並未限定於此等，也可使用使質體1～3中的2個連結而作成一個質體者、及剩餘的一個質體之2種類的質體。再者，也可使用使質體1～3連結而作成一個質體者。本發明中之期望的蛋白質為配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質。
一般於重組AAV病毒顆粒的生產，首先，此等3種類之質體藉由一般的轉染手法而被導入至有腺病毒之E1a基因與E1b基因被併入至基因體中的HEK293細胞等之宿主細胞。若是如此，則包含第一反向末端重複(ITR)的鹼基序列與包含第二反向末端重複(ITR)的鹼基序列、及包含被配置於此等2個ITR之間的編碼期望的蛋白質的基因的區域會在宿主細胞中被複製，所生成的單鏈DNA被包裝於AAV的衣殼蛋白質內，而形成重組AAV病毒顆粒。此重組AAV病毒顆粒因具有感染力，故可用於用以將外來的基因導入至細胞、組織、或活體內。本發明之一實施形態中之外來的基因為編碼配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的基因。在導入對象的細胞等，會由此基因而表現該融合蛋白質。
腺相關病毒(AAV)之Rep蛋白質係由AAV的rep基因編碼。Rep蛋白質係例如具有為了將AAV基因體透過存在於該基因體中的ITR而併入至宿主細胞的基因體中所必要的功能。Rep蛋白質有複數種亞型存在，但於AAV基因體往宿主細胞的基因體的併入，被認為Rep68和Rep78之2種類為必要的。Rep68和Rep78為從相同基因藉由選擇性剪接所轉錄的2種類的mRNA的轉譯產物。於本發明中稱為AAV的Rep蛋白質時，至少包含Rep68和Rep78的2種類蛋白質。
於本發明之一實施形態中，稱為編碼腺相關病毒的Rep蛋白質的鹼基序列(Rep區域的鹼基序列)時，係指至少編碼Rep68和Rep782的鹼基序列、或對其施加變異而成的鹼基序列。Rep蛋白質較佳為血清型2的AAV之物，未被限定於此，可為血清型1、3、4、5、6、7、8、9、10或11的任一者之物。作為編碼野生型之血清型2的AAV的Rep蛋白質的鹼基序列之較佳一例，可列舉具有序列識別號24所示的鹼基序列者。
又，Rep68只要會發揮其功能，則可為對血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11之任一者之AAV的野生型之Rep68的胺基酸序列進行取代、缺失、加成等之改變的變異體。於本發明中，施加此等變異的Rep68亦包含在Rep68中。
將野生型之Rep68的胺基酸序列中的胺基酸以其它胺基酸取代的情形，取代的胺基酸個數較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步較佳為1～3個。使野生型之Rep68的胺基酸序列中的胺基酸缺失的情形，缺失的胺基酸的個數較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步較佳為1～3個。又，施加組合此等胺基酸之取代和缺失的變異的Rep68，亦為Rep68。加成胺基酸的情形，於野生型之Rep68的胺基酸序列中或N末端或C末端，較佳為加成1～10個胺基酸，更佳為1～5個，進一步較佳為1～3個。施加組合此等胺基酸之加成、取代及缺失的變異的Rep68，亦包含在Rep68中。經施加變異的Rep68的胺基酸序列，係與野生型的Rep68的胺基酸序列較佳為顯示80%以上之同一性，更佳為顯示85%以上之同一性，進一步較佳為顯示90%以上之同一性，進一步較佳為顯示95%以上之同一性，進一步較佳為顯示98%以上之同一性。
又，Rep78只要會發揮其功能，則可為對血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11之任一者之AAV的野生型之Rep78的胺基酸序列進行取代、缺失、加成等之改變的變異體。於本發明中，施加此等變異的Rep78亦包含在Rep78中。
將野生型的Rep78的胺基酸序列中的胺基酸以其它胺基酸取代的情形，取代的胺基酸的個數，較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步較佳為1～3個。使野生型的Rep78的胺基酸序列中的胺基酸缺失的情形，缺失的胺基酸的個數，較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步較佳為1～3個。又，施加組合此等胺基酸的取代和缺失的變異的Rep78亦為Rep78。加成胺基酸的情形，野生型的Rep78的胺基酸序列中或在N末端或C末端，加成較佳為1～10個，更佳為1～5個，進一步較佳為1～3個胺基酸。施加組合此等胺基酸的加成、取代及缺失的變異的Rep78亦包含在Rep78中。經施加變異的Rep78的胺基酸序列，係與野生型的Rep78的胺基酸序列較佳為顯示80%以上之同一性，更佳為顯示85%以上之同一性，進一步較佳為顯示90%以上之同一性，進一步較佳為顯示95%以上之同一性，進一步較佳為顯示98%以上之同一性。
AAV的Rep蛋白質的功能等價物，就Rep68來說，係指功能上可替代Rep68使用者，就Rep78來說，係指功能上可替代Rep78者。Rep蛋白質的功能等價物可為野生型之Rep蛋白質的變異體。
序列識別號24所示的鹼基序列，只要為編碼功能性的Rep68及Rep78者，則可施加取代、缺失、加成等之改變。將序列識別號24所示的鹼基序列中的鹼基以其它鹼基取代的情形，取代的鹼基個數較佳為1～20個，更佳為1～10個，進一步較佳為1～3個。使序列識別號24所示的鹼基序列中的鹼基缺失的情形，缺失的鹼基個數較佳為1～20個，更佳為1～10個，進一步較佳為1～3個。又，施加組合此等鹼基之取代和缺失的變異者，亦可使用作為編碼Rep蛋白質的鹼基序列。加成鹼基的情形，於在序列識別號24所示的鹼基序列中或5’末端或3’末端，較佳為加成1～20個鹼基，更佳為1～10個，進一步較佳為1～3個。施加組合此等鹼基之加成、取代及缺失的變異者，亦可使用作為編碼Rep蛋白質的核酸分子。經施加變異的鹼基序列，係與序列識別號24所示的鹼基序列較佳為顯示80%以上之同一性，更佳為顯示85%以上之同一性，進一步較佳為顯示90%以上之同一性，進一步較佳為顯示95%以上之同一性，進一步較佳為顯示98%以上之同一性。但是，於施加此等變異的情形，較佳為將編碼Rep蛋白質之Rep68和Rep78的基因的起始密碼子設為ACG。
於本發明之一實施形態中，稱為編碼腺相關病毒的Cap蛋白質的鹼基序列(Cap區域的鹼基序列)時，係指至少包含編碼為構成AAV的衣殼的蛋白質的一種之VP1的鹼基序列、或對其施加變異而成的鹼基序列的鹼基序列。VP1係較佳為血清型8的AAV之物，但未被限定於此，可為血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11之任一之物。作為血清型8的Cap區域的鹼基序列之適合例，可列舉包含序列識別號22所示的鹼基序列者。
又，VP1只要會發揮其功能，則可為對血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11之任一者之AAV的野生型之VP1的胺基酸序列進行取代、缺失、加成等之改變者。於本發明之一實施形態中，施加此等變異的VP1亦包含在VP1中。
將序列識別號22所示的鹼基序列中的鹼基以其它鹼基取代的情形，取代的鹼基個數較佳為1～20個，更佳為1～10個，進一步較佳為1～3個。使序列識別號22所示的鹼基序列中的鹼基缺失的情形，缺失的鹼基的個數較佳為1～20個，更佳為1～10個，進一步較佳為1～3個。又，施加組合此等鹼基之取代和缺失的變異者，亦可使用作為編碼Cap蛋白質的鹼基序列。加成鹼基的情形，於序列識別號22所示的鹼基序列中或5’末端或3’末端，較佳為加成1～20個鹼基，更佳為1～10個，進一步較佳為1～3個。施加組合此等鹼基之加成、取代及缺失的變異者，亦可使用作為編碼Cap蛋白質的核酸分子。經施加變異的鹼基序列，係與序列識別號22所示的鹼基序列較佳為顯示80%以上之同一性，更佳為顯示85%以上之同一性，進一步較佳為顯示90%以上之同一性，進一步較佳為顯示95%以上之同一性，進一步更佳為顯示98%以上之同一性。
可藉由AAV載體，而得到於第一ITR與第二ITR之間包含外來基因的核酸分子經包裝而成的重組AAV病毒顆粒。重組AAV病毒顆粒因具有感染力，故可用於用以將外來的基因導入至細胞、組織、或活體內。本發明中之外來的基因為編碼配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的基因。在經導入該基因的細胞等中，會由此基因而表現融合蛋白質。作為一種於第一ITR與第二ITR之間包含外來基因的核酸分子經包裝而成的重組病毒顆粒，且可用於將基因導入細胞等中者，除了AAV載體系以外，有腺病毒載體系。於腺病毒載體系中，可得到於第一ITR與第二ITR之間包含外來基因的核酸分子經包裝而成的重組腺病毒之病毒顆粒。重組腺病毒之病毒顆粒因具有感染力，故可使用於用以將外來的基因導入細胞、組織、或活體內。
慢病毒係在為反轉錄病毒科的亞科之一的正反轉錄病毒(Orthoretrovirus)亞科中屬於慢病毒屬的病毒，具有單股的(+)鏈RNA基因體(ssRNA)。慢病毒的基因體包含作為必要基因的gag(編碼包含衣殼蛋白質的構造蛋白質的區域)、pol(編碼包含反轉錄酶的酵素群的區域)、env(編碼與宿主細胞的結合所必要的套膜蛋白質的區域)，此等被包夾於2個LTR(5’LTR及3’LTR)中。又除此等之外，慢病毒的基因體包含Rev(編碼具有會與存在於病毒RNA內的RRE(rev responsive element)結合而將病毒RNA從核輸送到細胞質之功能的蛋白質的區域)、tat(編碼具有會與位於5’LTR內的TAR結合而使LTR的啟動子活性上升之功能的蛋白質的區域)、其它vif、vpr、vpu、nef等作為輔助基因。
慢病毒為套膜病毒，藉由套膜與細胞膜融合而感染細胞。又，慢病毒為RNA病毒，病毒顆粒中有反轉錄酶存在。慢病毒感染後，藉由反轉錄酶，由(+)鏈RNA基因體複製單股正鏈DNA，進一步合成雙鏈DNA。由此雙鏈DNA表現為病毒顆粒的構成成分的蛋白質，且(+)鏈RNA基因體被包裝於其中，藉此而病毒顆粒增殖。於本發明之一實施形態中，慢病毒載體為基於慢病毒的一種的HIV-1的基因體所開發者，但未限於此。
第一世代慢病毒載體由包裝質體、Env質體、及導入質體的3種質體所構成。包裝質體於CMV啟動子等控制下具有gag及pol之各基因。Env質體於CMV啟動子控制下具有env基因。導入質體具有於5’LTR、RRE、CMV啟動子控制下編碼期望的蛋白質的基因、及3’LTR。將此等藉由一般的轉染手法導入宿主細胞，因此可獲得於第一ITR與第二ITR之間包含外來基因的核酸分子經包裝於衣殼蛋白質中而成的重組病毒顆粒。第一世代慢病毒載體的包裝質體中，亦包含源自病毒的rev、tat、vif、vpr、vpu、及nef之各輔助基因。於此，本發明中之期望的蛋白質為配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質。又，控制編碼期望的蛋白質的基因的啟動子為CMV啟動子以外的啟動子，例如較佳為包含SV40早期啟動子、人類延長因子-1α(EF-1α)啟動子、人類泛蛋白C啟動子、反轉錄病毒的勞斯肉瘤病毒LTR啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、β-肌動蛋白啟動子、磷甘油酸激酶(PGK)啟動子、小鼠白蛋白啟動子、人類白蛋白啟動子、及人類α-1抗胰蛋白酶啟動子者。例如，亦可為具有於小鼠α胎兒蛋白增強子的下游包含小鼠白蛋白啟動子之序列識別號8所示的鹼基序列的合成啟動子(小鼠α胎兒蛋白增強子/小鼠白蛋白啟動子)等。
第二世代慢病毒載體亦與第一世代相同，由包裝質體、Env質體(套膜質體)、及導入質體的3種質體所構成。但是，從包裝質體刪除了不是必要基因的vif、vpr、vpu、及nef的各輔助基因。
第三世代慢病毒載體由包裝質體、Env質體(套膜質體)、Rev質體、及導入質體之4種質體所構成。在第三世代，係使第二世代中在包裝質體的rev獨立而作為Rev質體。又，從包裝質體刪除了tat。再者，導入質體之5’LTR內的TAR被取代為CMV啟動子。
重組病毒顆粒因具有感染力，固可用於用以將外來基因導入至細胞、組織、或活體內。本發明中之外來基因為編碼配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的基因。在經導入該基因的細胞等，會由此基因而表現融合蛋白質。
反轉錄病毒具有單股之(+)鏈RNA基因體(ssRNA)。於病毒基因體中，編碼gag(編碼包含衣殼蛋白質的構造蛋白質)、pol(編碼包含反轉錄酶的酵素群)、env(編碼與宿主細胞的結合上必要的套膜蛋白質)及包裝訊息(Ψ)之各基因，此等被包夾於2個長末端重複(LTR、5’LTR及3’LTR)中。反轉錄病毒若感染宿主細胞，則(+)鏈RNA及反轉錄酶會移行至細胞內，並被反轉錄成雙股DNA。
反轉錄病毒載體主要基於小鼠白血病病毒而開發，以消除病原性並提高安全性為目的，為了保持其感染力並使使自體複製能力缺損而分割了病毒基因體。第1世代反轉錄病毒載體由包裝質體(除去包裝訊息的病毒基因體)和導入質體(將包裝訊息、gag的一部分、外來基因的兩端以5’LTR及3’LTR包夾者)所構成。因此，若在包裝質體和導入質體中共通存在的gag序列部分發生同源重組，則會出現可自體複製的反轉錄病毒，即RC(複製能力(replication compitent))病毒。在第2世代反轉錄病毒載體，係將第1世代的包裝質體之3'側的LTR取代為poly A加成訊息。因此，為要產生RC病毒，必須在gag序列及poly A加成訊息上游的2處中同時發生同源重組，其發生確率非常低，提高了安全性。第3世代由3個質體所構成，第2世代的包裝質體進一步被分割成編碼gag/pol的質體與編碼env的質體。因此，為要產生RC病毒，必須在3處所同時發生同源重組，其發生確率極低，進一步提高了安全性。
一般於重組反轉錄病毒之病毒顆粒的生產，首先，此等包裝質體和導入質體藉由一般的轉染手法被導入至宿主細胞。若是如此，則包含5’LTR及3’LTR及被配置於此等2個LTR之間的編碼期望的蛋白質的基因的區域會在宿主細胞中複製，所生成的單股之(+)鏈RNA被包裝於反轉錄病毒的衣殼蛋白質中，而形成了重組反轉錄病毒之病毒顆粒。此重組反轉錄病毒之病毒顆粒因具有感染力，故可用於用以將外來的基因導入至細胞、組織、或活體內。本發明中之外來的基因為編碼配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的基因。在經導入該基因的細胞等中，會由此基因而表現融合蛋白質。
於本發明之一實施形態中，核酸分子也可作成使其內包於微脂體、脂質奈米粒子(Lipid Nanoparticle；LNP)等之形態。微脂體係指具有脂雙層的球狀小胞，主要由磷脂質、尤其是磷脂醯膽鹼所構成。但並未限定於此，只要會形成脂雙層，則微脂體可為加入卵黃磷脂醯基乙醇胺等之其它脂質者。因細胞膜主要由磷脂質雙層膜所構成，故微脂體具有所謂生物相容性優異的優點。脂質奈米粒子係指直徑10 nm～1000 nm，典型而言小於約200 nm之以脂質為主成分的粒子，可內包疏水性(親油性)分子，以三酸甘油酯、雙甘油酯、單甘油酯、脂肪酸、類固醇等之具有生物相容性的脂質作為主要構成成分。茲認為若將內包於微脂體或脂質奈米粒子的基因投予至活體內，則會藉由胞與細胞的細胞膜直接融合、或胞吞作用等而被攝入至細胞中，之後移行至核中而於細胞中導入基因。利用微脂體或脂質奈米粒子的基因導入方法係相較於利用病毒載體的基因導入，而於導入的基因的大小沒有限制的點、安全性高的點為優異。內包本發明之核酸分子的微脂體、脂質奈米粒子等，可用於用以將配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的基因導入至細胞、組織、或活體內。在經導入該基因的細胞等中，會由此基因而表現融合蛋白質。於本說明書中稱為「微脂體、脂質奈米粒子等」時，除了上述之微脂體及脂質奈米粒子之外，包含聚合物奈米粒子、微膠束、乳液、奈米乳液、微球、奈米球、微膠囊、奈米膠囊、樹枝狀聚合物、奈米凝膠微球金屬奈米粒子、其它可作為藥物送達系統(DDS)使用的所有奈米・微粒子。
於本發明中，關於以質體的形態、內包於重組病毒之病毒顆粒的形態、或內包於微脂體、脂質奈米粒子等的形態被導入至細胞、組織、或活體內的核酸分子的行為，例示於以下(1)～(9)。但，核酸分子的行為並未限於此等。 (1)於一實施形態中，核酸分子為單股的(+)鏈RNA，若被導入至細胞內，則核酸分子所包含的編碼配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的基因被轉譯而表現該融合蛋白質。 (2)於一實施形態中，核酸分子為單股的(+)鏈RNA，若被導入至細胞內，則該核酸分子被反轉錄而成為單股的(+)鏈DNA，接著此DNA被轉錄、轉譯而表現該融合蛋白質。 (3)於一實施形態中，核酸分子為單股的(+)鏈RNA或(-)鏈RNA，若被導入至細胞內，則該核酸分子於被反轉錄後成為雙鏈DNA，接著此DNA被轉錄、轉譯而該表現融合蛋白質。 (4)於一實施形態中，核酸分子為單股的(+)鏈或(-)RNA，若被導入至細胞內，則該核酸分子於被反轉錄後成為雙鏈DNA，接著此DNA與宿主細胞的基因體發生隨機重組或同源重組而被併入基因體內，被併入的DNA被轉錄、轉譯而表現該融合蛋白質。 (5)於一實施形態中，核酸分子為單股的(+)鏈DNA，若被導入至細胞內，則該核酸分子被轉錄、轉譯而表現該融合蛋白質。 (6)於一實施形態中，核酸分子為單股的(-)鏈DNA，若被導入至細胞內，則雙鏈DNA由該核酸分子被合成，接著此雙鏈DNA被轉錄、轉譯而表現該融合蛋白質。 (7)於一實施形態中，核酸分子為單股的(+)鏈DNA或(-)鏈DNA，若被導入至細胞內，則雙鏈DNA由該核酸分子被合成，接著此DNA與宿主細胞的基因體發生隨機重組或同源重組而被併入基因體內，被併入的DNA被轉錄、轉譯而表現該融合蛋白質。 (8)於一實施形態中，核酸分子為雙鏈DNA，若被導入至細胞內，則該核酸分子被轉錄、轉譯而表現該融合蛋白質。 (9)於一實施形態中，核酸分子為雙鏈DNA，此DNA與宿主細胞的基因體發生隨機重組或同源重組而被併入基因體內，被併入的DNA被轉錄、轉譯而表現該融合蛋白質。
質體的形態、內包於重組病毒之病毒顆粒的形態、或內包於微脂體、脂質奈米粒子等的形態之核酸分子，可導入至細胞、組織、或活體內。
核酸分子的導入對象為活體內的情形，核酸分子以質體的形態、內包於重組病毒之病毒顆粒的形態、或內包於微脂體、脂質奈米粒子等的形態，利用皮下注射、肌肉內注射、靜脈內注射等之非經口的手段而被投予。
質體的形態、內包於重組病毒之病毒顆粒的形態、或內包於微脂體、脂質奈米粒子等的形態之核酸分子，可使用作為各種醫藥。關於核酸分子所編碼的融合蛋白質為特異性地辨識存在於腦血管內皮細胞的表面的分子(表面抗原)者，且具有生理活性的蛋白質為人類溶酶體酶的情形之核酸分子的用途，於以下詳述。
人類溶酶體酶為α-L-艾杜糖醛酸酶的情形，可使用作為賀勒氏症候群(Hurler syndrome)或賀勒氏・沙伊氏症候群(Hurler-Scheie syndrome)的中樞神經損傷治療劑，為艾杜糖醛酸-2-硫酸脂酶的情形，可使用作為韓特氏症候群(Hunter syndrom)的中樞神經損傷治療劑，為葡萄糖腦苷酶的情形，可使用作為高歇氏病(Gaucher disease)的中樞神經損傷治療劑，為β-半乳糖苷酶的情形，可使用作為GM1-神經節苷脂症1～3型的中樞神經損傷治療劑，為GM2活性化蛋白質的情形，可使用作為GM2-神經節苷脂症AB異型的中樞神經損傷治療劑，為β-己醣胺酶A的情形，可使用作為山多夫氏病(Sandhoff disease)及戴氏-薩克斯氏病(Tay-Sachs disease)的中樞神經損傷治療劑，為β-己醣胺酶B的情形，可使用作為山多夫氏病的中樞神經損傷治療劑，為N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸轉移酶的情形，可使用作為I-細胞病的中樞神經損傷治療劑，為α-甘露糖苷酶的情形，可使用作為α-甘露醣儲積症的中樞神經損傷治療劑，為β-甘露糖苷酶的情形，可使用作為β-甘露醣儲積症的中樞神經損傷治療劑，為半乳糖基神經醯胺酶的情形，可使用作為克拉培氏病(Krabbe disease)的中樞神經損傷治療劑，為蛋白皂角素C的情形，可使用作為高歇氏病樣蓄積症的中樞神經損傷治療劑，為芳基硫酸脂酶A的情形，可使用作為異染性白質變性症(異染性白質營養不良)的中樞神經損傷治療劑，為α-L-岩藻糖苷酶的情形，可使用作為岩藻糖沉積症的中樞神經損傷治療劑，為天冬胺醯基胺基葡萄糖苷酶的情形，可使用作為天冬胺醯基葡萄糖胺尿症的中樞神經損傷治療劑，為α-N-乙醯基胺基半乳糖苷酶的情形，可使用作為舒特拉病(Schindler disease)及川崎病的中樞神經損傷治療劑，酸性神經髓磷脂酶的情形，可使用作為尼曼-匹克二氏病(Niemann‐Pick disease)的中樞神經損傷治療劑，為α-半乳糖苷酶A的情形，可使用作為法布瑞氏症(Fabry disease)的中樞神經損傷治療劑，為β-葡萄糖醛酸苷酶的情形，可使用作為史萊氏症候群(Sly syndrome)的中樞神經損傷治療劑，為肝素N-硫酸脂酶、α-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶、乙醯基CoAα-胺基葡萄糖苷N-乙醯基轉移酶及N-乙醯基葡萄糖胺-6-硫酸脂酶之任一者的情形，可使用作為聖菲利柏氏症候群(Sanfilippo syndrome)的中樞神經損傷治療劑，為酸性神經醯胺酶的情形，可使用作為法伯病(Farber disease)的中樞神經損傷治療劑，為澱粉-1,6-葡萄糖苷酶的情形，可使用作為克芮氏症(Cori's disease)(富比士氏･克芮氏症(Forbes･Cori's disease))的中樞神經損傷治療劑，為唾液酸酶的情形，可使用作為唾液酸酶欠損症的中樞神經損傷治療劑，為天冬胺醯基胺基葡萄糖苷酶的情形，可使用作為天冬胺醯基葡萄糖胺尿症的中樞神經損傷治療劑，為軟脂醯基蛋白質硫酯酶-1(PPT-1)的情形，可使用作為神經類蠟質脂褐質(ceroid lipofuscin)類蠟質脂褐質症或桑-哈二氏病(Santavuori-Haltia disease)的中樞神經損傷治療劑，為三肽基肽酶-1(TPP-1)的情形，可使用作為神經類蠟質脂褐質症或詹-比二氏病(Jansky-Bielschowsky disease)的中樞神經損傷治療劑，為玻糖醛酸酶-1的情形，可使用作為玻糖醛酸酶欠損症的中樞神經損傷治療劑，為CLN1及CLN2之任一者的情形，可使用作為巴登氏病(Batten disease)的中樞神經損傷治療劑。
核酸分子的導入對象為細胞的情形，對於細胞的種類未特別限定，例如間葉系幹細胞、源自齒髓的幹細胞、造血幹細胞、胚性幹細胞、內皮幹細胞、乳腺幹細胞、腸幹細胞、肝幹細胞、胰幹細胞、神經幹細胞、及iPS細胞。
經導入核酸分子的細胞，因會表現融合蛋白質，而可以治療目的將其移植至患者。例如，經導入具有生理活性的蛋白質為人類溶酶體酶的核酸分子的細胞，可使用於上述之用途。 [實施例]
〔實施例1〕pAAV-mMAP-Fab-hI2S載體之構築 合成包含序列識別號18所示的鹼基序列之DNA片段，該序列識別號18所示的鹼基序列自5’側起包含：ClaI位置、小鼠α胎兒蛋白增強子/小鼠白蛋白啟動子、雞β肌動蛋白/MVM嵌合內含子、編碼hI2S結合於抗hTfR抗體重鏈的Fab區域的C末端側之結合體的基因、源自小鼠腦心肌炎病毒之5'非轉譯區域的內部核糖體結合部位(IRES)、編碼抗hTfR抗體輕鏈的基因、牛生長激素poly A序列、及BglII位置。將此DNA片段以ClaI和BglII進行消化。將pAAV-CMV載體(Takara Bio Inc.)以ClaI和BglII進行消化，且於此插入上述經限制酶處理的DNA片段。將獲得的質體設為pAAV-mMAP-Fab-hI2S載體(圖1)。pAAV-mMAP-Fab-hI2S載體具有由上游起依序包含下列的構造：第一AAV-ITR之功能等價物(序列識別號6)、小鼠α胎兒蛋白增強子/小鼠白蛋白啟動子(序列識別號8)、雞β肌動蛋白/MVM嵌合內含子(序列識別號9)、編碼hI2S結合於抗hTfR抗體重鏈的Fab區域的C末端側之結合體(序列識別號42)的基因、源自小鼠腦心肌炎病毒的5’非轉譯區域的內部核糖體結合部位、編碼抗hTfR抗體輕鏈(序列識別號10)的基因、牛生長激素polyA訊息(序列識別號17)、第二AAV-ITR之功能等價物(序列識別號7)。再者，pAAV-mMAP-Fab-hI2S載體包含安比西林(ampicillin)耐性基因及複製起始點(ColE1 ori)。
〔實施例2〕pR2(mod)C6載體之構築 合成包含序列識別號19所示的鹼基序列之DNA片段，該序列識別號19所示的鹼基序列自5’側起包含：AfeI位置、RsrII位置、BsrGI位置、AvrII位置、安比西林耐性基因位置、複製起始點(ColE1 ori)、RsrII位置、包含p5啟動子的AAV2的Rep區域的5’部分、及SacII位置。將此DNA片段以AfeI和SacII進行消化た。將pRC6載體(Takara Bio Inc.)以AfeI和SacII進行消化，且於此插入上述經限制酶處理的合成基因。將獲得的質體設為pR2(mod)C6載體。
〔實施例3〕pR2(mod)C8載體之構築 合成包含序列識別號20所示的鹼基序列之DNA片段，該序列識別號20所示的鹼基序列自5’側起包含：HindIII位置、AAV2的Rep區域的3’部分、AAV8的Cap區域、功能為增強子的p5啟動子、RsrII位置、及BsrGI位置。將此DNA片段以HindIII和BsrGI進行消化。將pR2(mod)C6載體以HindIII和BsrGI進行消化，且於此插入上述經限制酶處理的合成基因。將獲得的質體設為pR2(mod)C8載體(圖2)。pR2(mod)C8載體由上游起依序包含：包含p5啟動子的AAV2的Rep區域(序列識別號21)、AAV8的Cap區域(序列識別號22)、功能為增強子的p5啟動子(序列識別號23)。再者，pR2(mod)C8載體包含安比西林耐性基因及複製起始點(ColE1 ori)。又，上述包含p5啟動子的AAV2的Rep區域(序列識別號21)，係於p5啟動子(序列識別號23)的下游包含序列識別號24所示的包含AAV2的Rep區域的鹼基序列。
〔實施例4〕Fab-hI2S-rAAV之產生 使用為源自人類胎兒腎臟細胞的細胞株之HEK293細胞作為宿主細胞。在10-layer CellSTACK Chambers (Thermo Fisher Scientific公司)中，每個CellSTACK Chambers接種6.3x10 8個HEK293細胞，以含有10% FBS的MEM培養基(Thermo Fisher Scientific公司)在37℃、5% CO 2存在下培養16小時。製作包含pHelper載體(Takara Bio Inc.)、pR2(mod)C8載體、及pAAV-mMAP-Fab-hI2S載體的溶液作為轉染用的DNA溶液。此溶液以等莫耳濃度包含3種類的質體，總DNA濃度為1.0 mg/mL，且進行調整使總液量成為2.2 mL。在此溶液中添加聚乙亞胺使重量比成為DNA(μg)：聚乙亞胺(μg)=1:2，再添加MEM培養基而調整液量為1.5 L，將其作成轉染用溶液。從培養開始16小時後的10-layer CellSTACK Chambers將培養上清液完全去除後，添加1.5 L的轉染用溶液全量，於37℃、5% CO 2存在下培養5日，使rAAV病毒顆粒產生。宿主細胞所產生的rAAV病毒顆粒，係一部分被釋放至培養上清液中，一部分留在宿主細胞內。將獲得的rAAV病毒顆粒設為Fab-hI2S-rAAV。Fab-hI2S-rAAV被期待在感染細胞時會表現包含hI2S結合於抗hTfR抗體Fab區域重鏈的C末端側而成的結合體與抗hTfR抗體輕鏈之融合蛋白質。
〔實施例5〕包含Fab-hI2S-rAAV的培養上清液的回收 實施例4之培養結束後，使用孔徑5μm的ULTRA Prime GF 5.0 μm, 2 inch capsule, GG(Cytiva公司)將細胞培養液過濾後，再使用孔徑0.2 μm之Nalgen Rapid-Flow PES Filter unit(Thermo Fisher Scientific公司)進行過濾。
〔實施例6〕包含Fab-hI2S-rAAV的培養上清液中的游離核酸去除步驟 在實施例5中所回收的培養上清液中，添加為核酸內切酶的Benzonase(Merck公司)使濃度成為10 U/mL而混合，於37℃溫育1小時。將Benzonase處理後的培養上清液，使用孔徑0.2 μm之Nalgen Rapid-Flow PES Filter unit(Thermo Fisher Scientific公司)進行過濾，獲得含有Fab-hI2S-rAAV的細胞融解液。
〔實施例7〕使用親和性樹脂的Fab-hI2S-rAAV的層析純化 使用含有4 mmol/L MgCl 2、150 mmol/L NaCl的20 mmol/L Tris緩衝液(pH 7.5)，將已填充POROS AAVX樹脂(Thermo Fisher Scientific公司)的管柱(直徑1.6 cm、高度20 cm(管柱容量約20 mL))進行平衡化。將實施例6中所獲得的含有Fab-hI2S-rAAV的細胞融解液，以5 mL/分鐘的流速對管柱通液，藉此而使Fab-hI2S-rAAV吸附於樹脂。接著，將管柱容量的5倍以上的含有4 mmol/L MgCl 2、400 mmol/L精胺酸的20 mmol/L Tris緩衝液(pH 7.5)通液而將管柱洗淨後，將管柱容量的3倍以上之含有4 mmol/L MgCl 2、150 mmol/L NaCl的20 mmol/L Tris緩衝液(pH 7.5)通液而將管柱洗淨。接著，將管柱容量的2倍以上的含有4 mM MgCl 2的10 mM檸檬酸緩衝液(pH 3.5)對管柱進行通液，藉此而將吸附於樹脂的Fab-hI2S-rAAV溶離而獲得含有Fab-hI2S-rAAV的流分。於此流分中加入含有2mM MgCl 2的500 mmol/L Tris緩衝液(pH 8.5)而調整為pH 7.0。
〔實施例8〕利用超過濾膜的Fab-hI2S-rAAV的濃縮步驟 在利用含有4 mmol/L MgCl 2、150 mmol/L NaCl的20 mmol/L Tris緩衝液(pH 7.5)而經平衡化的SUIS PD(LP)Hystream 100 kDa(Repligen公司)，將實施例7所獲得的親和性步驟溶出流分以7 L/min/m 2以下之流速進行循環，藉此而濃縮成約8 mL而回收。接著，以2 mL之含有4 mmol/L MgCl 2及150 mmol/L NaCl的20 mmol/L Tris緩衝液(pH 7.5)將超過濾膜洗淨2次，將此洗淨液與先前回收的溶液合併，而取得合計約12 mL的濃縮液。
〔實施例9〕利用使用碘克沙醇(iodixanol)的超離心分離的Fab-hI2S-rAAV之純化 對60%碘克沙醇(多用途密度梯度離心分離媒體OptiPre TM，COSMO BIO公司)加入PBS-MK緩衝液(含有136.9 mmol/L NaCl、28.2 mmol/L KCl及1 mmol/L MgCl 2的20 mmol/L磷酸鈉緩衝液(pH 7.4))而調製45%碘克沙醇。又，對60%碘克沙醇加入PBS-MK緩衝液而調製25%碘克沙醇。再者，對60%碘克沙醇加入1M NaCl/PBS-MK緩衝液(含有1 mol/L氯化鈉的PBS-MK緩衝液)而調製15%碘克沙醇。
從39 mL, Quick-Seal TMRound-Top Polypropylene Tube，25 X 89 mm(Beckman Coulter Inc.)的底部，依照對60%碘克沙醇添加酚紅者、接著45%碘克沙醇、接著對25%碘克沙醇添加酚紅者、接著15%碘克沙醇的順序，分別重疊5 mL、8 mL、5 mL、8 mL。於此添加實施例8所獲得的約12 mL的濃縮液後，以1M NaCl/PBS-MK緩衝液裝滿管。接著，藉由Cordless Tube Topper Sealer kit(Beckman Coulter Inc.)將管的注入口封閉，設置於超離心裝置OptimaXPN(Beckman Coulter Inc.)的70Ti旋轉器，以63000 rpm(408500 ×g)的旋轉速度離心2小時。在離心後的管底部，使用Fraction Recovery System(Beckman Coulter Inc.)，連接帶針頭的Tygon E-LFL管，將18 G注射器針刺入管上部而開空氣孔後，藉由蠕動泵由管下部將溶媒各分流1 mL。回收此第4至第9或第5至第8的流分，獲得包含經純化的Fab-hI2S-rAAV的流分。
〔實施例10〕利用超過濾膜的Fab-hI2S-rAAV之濃縮及緩衝液交換步驟 將實施例9所獲得的包含Fab-hI2S-rAAV的流分，使用Amicon Ultra 15離心式過濾器單元50 kDa(Merck公司)，以3200 rpm(2100 ×g)以下、20分鐘以下之任意條件進行離心分離，藉此而濃縮。將所獲得的濃縮Fab-hI2S-rAAV溶液以350 mmol/L NaCl/PBS緩衝液(含有486.9 mmol/L NaCl及2.7 mmol/L KCl的20 mmol/L磷酸鈉緩衝液(pH7.4))稀釋為30倍。藉由將此重複3次，而獲得溶媒被取代為350 mmol/L NaCl/PBS緩衝液的Fab-hI2S-rAAV溶液。將此Fab-hI2S-rAAV溶液供給於以下之實驗。
〔實施例11〕Fab-hI2S-rAAV溶液中所含的rAAV基因體量之測定 利用微滴式數字PCR法測定實施例10所獲得的Fab-hI2S-rAAV溶液中的病毒基因體量。於以下詳述測定法。
在2 μL之Fab-hI2S-rAAV溶液中加入1.6 μL之DNaseI(Takara Bio Inc.)、2 μL之10× DNaseI Buffer(Takara Bio Inc.)、及14.4 μL之含有0.05% F-68的水，於37℃溫育30分鐘，將未內包於Fab-hI2S-rAAV的DNA進行消化。
將進行過DNaseI處理的Fab-hI2S-rAAV溶液使用含有0.05% F-68的TE緩衝液而適當稀釋，調製微滴式數字PCR用樣品溶液。調製包含1.0 μM之順向引子(引子SI-1，序列識別號25)、1.0 μM之反向引子(引子SI-2，序列識別號26)、及0.25 μM之探針(探針SI-1，分別於序列識別號27之5’末端修飾FAM作為報導子色素，於3’末端修飾BHQ1作為淬滅劑色素者)的FAM標識20×引子/探針混合物。又，調製包含1.0 μM 順向引子(引子SI-3，序列識別號28)、1.0 μM 反向引子(引子SI-4，序列識別號29)、及0.25 μM探針(探針SI-2，分別於序列識別號30之5’末端修飾HEX作為報導子色素，於3’末端修飾BHQ1作為淬滅劑色素者)的HEX標識20×引子/探針混合物。
於微滴式數字PCR用樣品溶液2 μL中，加入10 μL之ddPCR Supermix for probes (no dUTP) (BioRad公司)、1 μL之FAM標識20×引子/探針混合物、1 μL之HEX標識20×引子/探針混合物、2 μL之5 M甜菜鹼溶液(Sigma公司)、及4 μL之含有0.05% F-68的水，而調製PCR反應液。使用Droplet generator(BioRad公司)，調製20 μL之PCR反應液與70 μL之Droplet Generator oil for Probes(BioRad公司)的懸浮液滴(droplet)。將此液滴供給於QX200 Droplet Digital PCR系統(BioRad公司)。PCR的條件係設為包含變性反應(95℃、10分鐘)、40次循環的3步驟PCR(95℃、30秒→60℃、60秒→72℃、15秒)、及PCR酵素的不活化處理(98℃、10分鐘)。將FAM/HEX兩陽性液滴定義為rAAV陽性液滴，使用QuantaSoft Version 1.7 (BioRad公司)，求得rAAV基因體量(vg：病毒基因體)。又，於此PCR中，增幅的DNA區域為牛生長激素polyA、及ITR的內部區域。
〔實施例12〕I2S-KO/hTfR-KI小鼠之製作 I2S-KO/hTfR-KI小鼠係於同種接合子中缺損艾杜糖醛酸-2-硫酸脂酶(I2S)基因且於異種接合子具有嵌合TfR基因的小鼠。I2S-KO/hTfR-KI小鼠大致以下述方法製作。化學合成在編碼細胞內區域為小鼠TfR的胺基酸序列且細胞外區域為人類TfR的胺基酸序列之嵌合TfR的cDNA之3’側，配置以loxP序列包夾的新黴素(neomycin)耐性基因而成的DNA片段。藉由通常方法將此DNA片段併入具有5’臂序列及3’臂序列的靶向載體，藉由電穿孔法將其導入至小鼠ES細胞。將基因導入後之小鼠ES細胞於新黴素存在下進行選擇性培養，選擇靶向載體藉由同源重組而併入染色體的小鼠ES細胞。將所獲得的基因重組小鼠ES細胞，注入至ICR小鼠之8細胞期胚胎(宿主胚胎)，移植至藉由與進行過輸精管結紮之小鼠交配而獲得之假孕鼠(接受者小鼠)。對於所獲得之產仔(嵌合小鼠)進行毛色判定，篩選出ES細胞以高效率有助於生物體之形成之個體，即白色毛對整體毛所占之比率較高之個體。使該嵌合小鼠個體與ICR小鼠交配而獲得F1小鼠。篩選白色之F1小鼠，分析由尾巴之組織提取之DNA，將染色體上小鼠hTfR基因被置換為嵌合hTfR的小鼠設為hTfR-KI小鼠。以此小鼠為基礎，而製作於同種接合子中缺損I2S基因且於異種接合子具有嵌合TfR基因的小鼠(I2S-KO/hTfR-KI小鼠)。又，I2S-KO/hTfR-KI小鼠之製作係依據專利文獻(WO2016/208695)記載的手法進行。
〔實施例13〕使用I2S-KO/hTfR-KI小鼠的Fab-hI2S-rAAV之藥效評價 將對活體投予Fab-hI2S-rAAV時的藥效評價，使用於實施例12製作的I2S-KO/hTfR-KI小鼠進行。I2S-KO/hTfR-KI小鼠使用9～14週齡(投予開始時)的雄性小鼠。將實施例10中獲得的Fab-hI2S-rAAV溶液，對雄性I2S-KO/hTfR-KI小鼠以成為1.0×10 10vg/kg、1.0×10 11vg/kg、1.0×10 12vg/kg、及1.0×10 13vg/kg的用量的方式，進行單次尾靜脈內投予(各組N=3)。又，設置由雄性野生型小鼠所構成的正常對照組及由雄性I2S-KO/hTfR-KI小鼠所構成的病態對照組)(各組N=4)。對於正常對照組及病態對照組係投予生理食鹽液(大塚製藥工場公司)。
於投予起8、15、及22日後，自尾靜脈採取一部分血液至經EDTA-2K塗覆的採血管(CAPIJECT，Terumo公司)中，於冰上靜置後，進行離心(2000×g，20分鐘)而回收血漿。於投予起29日後在Vetorphale(Meiji Seika Pharma公司)･咪達唑侖(Midazolam)(Sandoz公司)･Domitor(日本全藥工業公司)的3劑混合麻醉下，由大池(cisterna magna)採取腦脊髓液(Cerebrospinal fluid，CSF)。接著將小鼠開胸進行心臟採血。血液採取至經EDTA-2K塗覆的採血管(CAPIJECT，Terumo公司)，於冰上靜置後，進行離心(2000 × g，20分鐘)而回收血漿。接著，以生理食鹽液(大塚製藥工場公司)進行全身灌流，分別摘出腦、脊髓、肝臟、心臟、腎臟、脾臟、及骨骼肌。測定各組織的濕重量後，迅速地浸漬於液態氮中進行急速冷凍。
〔實施例14〕血漿中之Fab-hI2S的定量 血漿之上清液中Fab-hI2S的濃度測定係利用實施例15記載的方法進行。將其結果呈示於表1。
[表1]
(表1)血漿中之Fab-hI2S之連續的濃度變化(μg/mL血漿)
投予組 投予後8日 投予後15日 投予後22日 投予後29日
平均值 標準偏差 平均值 標準偏差 平均值 標準偏差 平均值 標準偏差
Fab-hI2S-rAAV 1.0×10 13vg/kg 0.471 0.148 1.63 0.80 1.82 1.10 3.72 2.71
1.0×10 12vg/kg 0.222 0.081 0.330 0.097 0.420 0.146 0.594 0.209
1.0×10 11vg/kg 0.0110 0.0118 0.0189 0.0185 0.0223 0.0242 0.0251 0.0278
1.0×10 10vg/kg 0.000250 0.000433 0.000729 0.000709 0.000897 0.000834 0.00115 0.00101
在Fab-hI2S-rAAV投予組中，以任何的投予量皆於投予後8日起至投予後29日，血漿中的Fab-hI2S濃度上升。又，血漿中的Fab-hI2S的濃度係投予量依賴性地上升。此等數據顯示：靜脈注射至小鼠的Fab-hI2S-rAAV被細胞攝入，編碼hI2S的基因在細胞內被轉錄、轉譯而表現的hI2S被釋放至血液中。
〔實施例15〕Fab-hI2S的濃度測定 血漿的上清液中的Fab-hI2S的測定大致以下述方法實施。Streptavidin Gold plate(Meso scale diagnostics公司)的各孔中各添加Superblock Blocking Buffer in PBS(Thermo Fisher Scientific公司) 150 μL，進行1小時以上振盪而將平盤阻斷。接著，於生物素化抗hI2S單株抗體以及SULFO化抗hI2S單株抗體的混合溶液中，分別加入包含已知濃度的Fab-hI2S的校準曲線用標準樣品(Fab-hI2S校準曲線用標準樣品)及血漿而振盪1小時以上，作為抗體反應液。又，抗hI2S單株抗體，係藉由培養使用由以具有序列識別號14所示的胺基酸序列的人類艾杜糖醛酸-2-硫酸脂酶進行免疫的小鼠所取得的脾細胞而以通常方法製作的抗hI2S產生融合瘤而取得。將所獲得的單株抗體之一使用Biotin Labeling Kit-NH2(同仁化學研究所公司)按照附隨的步驟準則進行修飾，獲得生物素化抗hI2S單株抗體。又，所獲得的單株抗體之另外一個使用MSD GOLD SULFO-TAG NHS-Ester(Meso scale Diagnostics公司)，按照附隨的步驟準則進行修飾，獲得SULFO化抗hI2S單株抗體。從各孔去除阻斷溶液，以含有0.05% Tween 20的PBS(PBST，Sigma Aldrich公司)洗淨後，於各孔中添加抗體反應液25 μL，振盪1小時以上。接著去除抗體反應液，以PBST洗淨後，添加以注射用水(大塚製藥工場公司)稀釋為1/2的4 X Read Buffer(Meso scale diagnostics公司) 150 μL，使用Sector TMImager S600(Meso scale diagnostics公司)而測定來自各孔的發光量。由Fab-hI2S校準曲線用標準樣品的測定值作成校準曲線，於此內插各檢體的測定值，藉此而算出血漿每1mL所含的Fab-hI2S的量(血漿中之Fab-hI2S濃度)。又，校準曲線用標準樣品中所含的Fab-hI2S，係利用通常方法，使由具有序列識別號42所示的胺基酸序列之人類I2S結合於抗hTfR抗體重鏈的Fab區域的C末端而成的結合體、與具有序列識別號15所示的胺基酸序列之抗hTfR抗體輕鏈所構成的融合蛋白質(Fab-hI2S)，於CHO細胞中表現而取得者。
〔實施例16〕腦組織及脊髓中的I2S比活性測定 為了藉由I2S的酵素活性而評價腦組織及脊髓中之Fab-hI2S，而進行I2S比活性測定。I2S比活性測定大致以下述方法實施。於實施例13中採取的腦及脊髓中添加注射用水(大塚製藥工場公司)而進行均質化，將所獲得的均質物進行離心分離而回收上清液。均質物上清液的蛋白質濃度使用BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific公司)並按照附隨的說明書進行定量。
於FLUORO PLATE F96(Nunc公司)之各孔中各添加50 μL之作為標準物的4-甲基傘形酮(4-Methylumbelliferone)(4-MU，Sigma Aldrich公司，400～3.13 nmol/mL)、作為測定樣品的均質物上清液。接著，於各孔中各添加100μL之以含有0.05% BSA(Sigma Aldrich公司)/0.1% TritonX-100(富士軟片和光純藥公司)的5mM乙酸緩衝液(pH 5.0)稀釋為0.6 mg/mL的4-甲基傘形酮基硫酸酯(4-Methylumbelliferyl sulfate)(4-MUS，Sigma Aldrich公司)作為基質。以平盤混合器使平盤震盪後，於37℃靜置4小時而使酵素反應。於各孔中各添加150μL之0.05M甘胺酸/NaOH緩衝液(pH 10.6)而使反應停止，使用SpectraMaxGemini(Molecular Devices公司)以激發波長365 nm、檢測波長460 nm進行測定。又，比活性係將酵素活性1 Unit定義為4-MU nmol/4小時 37℃，將其除以蛋白質重量(mg)而求得。即，比活性可稱為蛋白質每單位重量的酵素活性(nmol/4hr/mg蛋白質)。將I2S比活性測定的結果呈示於表2。
[表2]
(表2)腦組織及脊髓中之I2S比活性的測定結果
投予組 腦組織 (nmol/4hr/mg蛋白質) 脊髓 (nmol/4hr/mg蛋白質)
平均值 標準偏差 平均值 標準偏差
正常對照組 355 11.0 227 21.0
病態對照組 0.000 0.000 0.000 0.000
Fab-hI2S-rAAV 投予組 1.0×10 13vg/kg 28.8 26.4 44.6 38.2
1.0×10 12vg/kg 1.91 1.70 4.12 3.60
1.0×10 11vg/kg 0.366 0.630 0.671 0.610
1.0×10 10vg/kg 1.05 1.08 1.88 0.98
在病態對照組中，係於中樞神經系組織中未檢測到I2S的酵素活性，但在Fab-hI2S-rAAV投予組中，則在所有的用量於腦組織及脊髓中大致用量依賴性地檢測到I2S的酵素活性。此等之結果顯示：(i)藉由投予Fab-hI2S-rAAV而Fab-hI2S會於宿主動物內表現；(ii)Fab-hI2S所含的抗hTfR抗體透過hTfR而通過BBB到達中樞神經系統的組織；及(iii)Fab-hI2S所含的hI2S於中樞神經系統的組織中以可作為酵素而作用的狀態存在。
〔實施例17〕各組織中之硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)及硫酸皮膚素(dermatan sulfate)的定量 血漿、CSF、及各組織中之硫酸乙醯肝素(HS)及硫酸皮膚素(DS)的定量大致以下述方法實施。又，硫酸乙醯肝素及硫酸皮膚素皆為I2S的基質。在由於編碼I2S的基因的異常而發病的韓特氏症候群之患者中，由於HS及DS蓄積於組織內而造成損傷。因此，藉由定量組織內的HS及DS，而可評價投予至模型動物的藥劑之藥效。
以下列步驟調製試驗所使用的(a)～(l)之溶液。 (a)MeCN/水： 混合2 mL之注射用水(大塚製藥工業公司)和18 mL的乙腈(富士軟片和光純藥公司)，將其設為MeCN/水。 (b)氘標記溶媒： 在冰浴下，對1.5 mL之甲醇-d 4(Sigma-Aldrich公司)滴下240 μL的乙醯氯(Sigma-Aldrich公司)，將其設為氘標記溶媒。 (c)移動相A： 將混合475 mL之注射用水與25 mL之1 M甲酸銨水溶液(富士軟片和光純藥公司)而成者設為移動相A。 (d)移動相B： 將以93:7(v/v)混合乙腈與移動相A而成者設為移動相B。 (e)硫酸乙醯肝素標準原液(HS標準原液)： 將Heparan sulphate(Iduron公司)以注射用水溶解，調製5.0 mg/mL之溶液。將此溶液設為HS標準原液。 (f)硫酸乙醯肝素內部標準溶液(HS內部標準溶液)： 在硼矽酸螺旋蓋試驗管中量取40 μL的HS標準原液，將溶媒於氮氣流下餾除。對乾固物添加400 μL之氘標記溶媒，攪拌後，於65℃使反應進行75分鐘，進行氘甲醇分解(deuterium methanolysis reaction; methanolysis)。反應後，氮氣流下餾除溶媒。對乾固物添加500 μL之MeCN/水，進行30分鐘超音波處理。將此溶液設為硫酸乙醯肝素內部標準溶液(HS內部標準溶液)。 (g)硫酸皮膚素標準原液(DS標準原液)： 將Chondroitin sulfate B sodium salt from porcine intestinal mucosa(Sigma-Aldrich公司)以注射用水溶解，調製5.0 mg/mL之溶液。將此溶液設為DS標準原液。 (h)硫酸皮膚素內部標準溶液(DS內部標準溶液)： 在硼矽酸螺旋蓋試驗管中量取40 μL之DS標準原液，將溶媒於氮氣流下餾除。對乾固物添加400 μL之氘標記溶媒，攪拌後，於65℃使反應進行75分鐘，進行氘甲醇分解。反應後，將溶媒於氮氣流下餾除。對乾固物添加500 μL之MeCN/水，進行30分鐘超音波處理。將此溶液設為硫酸皮膚素內部標準溶液(DS內部標準溶液)。 (i)內標準溶液： 攪拌對1 mL之甲醇以1 μL之HS內部標準溶液及1 μL之DS內部標準溶液的比率混合而成者後，進行30分鐘超音波處理。將此溶液設為內標準溶液。 (j)校準曲線樣品： 量取980 μL之注射用水，於此分別各添加10 μL之HS標準原液和DS標準原液，調製分別各含有50 μg/mL之硫酸皮膚素和硫酸乙醯肝素的溶液。將此溶液以注射用水進行稀釋，調製分別各含有5000 ng/mL之硫酸皮膚素和硫酸乙醯肝素的溶液。將此溶液以注射用水進行階段稀釋，調製分別以25、50、100、250、500、1000、2500及5000 ng/mL之濃度含有硫酸皮膚素和硫酸乙醯肝素的溶液。分別分取此等溶液20 μL於硼矽酸螺旋蓋試驗管中。將此溶液設為校準曲線樣品。 (k)組織萃取用溶液 將1 mL的聚氧乙烯(10)辛基苯基醚添加至生理食鹽液，將總量作成500 mL。將此溶液設為組織萃取用溶液。 (l)10%碳酸銨溶液 將5 g之碳酸銨溶解於50 mL之注射用水。將此溶液設為10%碳酸銨溶液。
量取血漿20 μL，分取於硼矽酸螺旋蓋試驗管。將此設為血液樣品溶液。
量取採取的CSF 20 μL，分取於硼矽酸螺旋蓋試驗管。將此設為CSF樣品溶液。
將冷凍乾燥組織於組織萃取用溶液中破碎後，離心分離上清液。將其量取20 μL，分取於硼矽酸螺旋蓋試驗管。將此設為組織及臟器樣品溶液。
於氮氣流下餾除調製的各樣品溶液及校準曲線樣品中之溶媒。對乾固物添加20 μL之2,2-二甲氧基丙烷(東京化成工業公司)和200 μL之鹽酸濃度為3 mol/L的鹽酸甲醇(Sigma-Aldrich公司)而攪拌後，以反應溫度70℃、反應時間90分鐘進行甲醇分解反應。反應後，進行冰冷而停止反應，添加200 μL之10%碳酸銨溶液及50 μL之內標準溶液。將溶媒於氮氣流下餾除後，對乾固物添加250 μL之注射用水而使溶解。將此負載於預先通液甲醇及注射用水而經調節的固相匣(OASIS HLB(1 cc、30 mg，Waters公司))，以注射用水洗淨後，添加甲醇500 μL，藉由離心分離而溶出。在氮氣流下餾除溶媒後，添加注射用水2 mL及乙腈18 mL，以超音波處理而進行再溶解。將其離心分離後，將上清液填充於LC小瓶。
LC/MS/MS分析係使用組合親水性相互作用超高性能液體層析與串聯四極型質量分析裝置者而實施。使用QTRAP5500(AB SCIEX公司)作為質量分析裝置(MS/MS裝置)，且對此設置Nexera X2(島津製作所)作為HPLC裝置。又，使用Acquity UPLC TMBEH Amide 1.7 μm (2.1 X 150 mm，Waters公司)作為LC管柱。使用移動相A及移動相B作為移動相。又，管柱溫度設定為60℃。
以移動相B將管柱平衡化後，注入5μL之樣品，以表3所示的移動相的梯度條件，實施層析。又，移動相之流量設為0.4 mL/分鐘。
[表3]
(表3)液體層析之條件
樣品注入後之經過時間 (分鐘) 移動相A (%(v/v)) 移動相B (%(v/v))
0 0 100
5.00 0 100
7.00 20 80
12.5 20 80
13.0 70 30
15.0 70 30
15.5 0 100
20.0 0 100
MS/MS裝置之離子源參數按照QTRAP5500(AB SCIEX公司)之使用說明書，如表4所示方式設定。
[表4]
(表4)MS/MS裝置之離子源之各種參數的設定
離子源 ESI (Turbo Spray)
極性 正極
掃描類型 MRM
離子噴霧電壓 5500 V
加熱器氣體溫度 425℃
氣簾(CUR) 30.00
碰撞氣體(CAD) 8.00
離子源氣體1 (GS1) 70.00
離子源氣體2 (GS2) 70.00
入口電壓 10.00
期間 15.00 分鐘
於表5呈示MS內部參數。
[表5]
(表5)MS內部參數
先驅物離子 (m/z) Q1 產物離子 (m/z) Q3 時間 (msec) DP (伏特) 碰撞能量 (伏特) CXP (伏特)
源自HS之物質 384.100 162.100 100.00 45.00 21.00 15.00
HS內部標準物質 390.200 162.100 100.00 45.00 21.00 15.00
源自DS之物質 426.100 236.100 100.00 45.00 12.00 17.00
DS內部標準物質 432.200 239.200 100.00 45.00 12.00 17.00
對校準曲線樣品進行LC/MS/MS分析，求得對應於源自校準曲線樣品中之硫酸皮膚素及硫酸乙醯肝素的產物離子之層析圖上的峰面積(DS檢測峰面積及HS檢測峰面積)。又，求得對應於源自DS內部標準溶液及HS內部標準溶液的產物離子之檢測峰的面積(DS-IS檢測峰面積及HS-IS檢測峰面積)。
將各校準曲線樣品中之源自硫酸皮膚素的檢測峰的面積對源自DS內部標準溶液的檢測峰面積(DS檢測峰面積/DS-IS檢測峰面積)設為縱軸，將各校準曲線樣品之硫酸皮膚素濃度設為橫軸，使用二次判別分析而獲得回歸式。
將各校準曲線樣品中之源自硫酸乙醯肝素的檢測峰之面積對源自HS內部標準溶液的檢測峰面積(HS檢測峰面積/HS-IS檢測峰面積)設為縱軸，將各校準曲線樣品之硫酸乙醯肝素濃度設為橫軸，使用二次判別分析而得到回歸式。
對於血液樣品溶液、CSF樣品溶液、及各組織樣品溶液進行LC/MS/MS分析，將樣品溶液中所含的硫酸皮膚素與硫酸乙醯肝素內插至回歸式而進行定量。
使用表示各組織中之HS及DS的減少作用之降低率(Reduction ratio)(%)，作為藥效的指標。降低率(%)定義為{([KO]-[WT])-([試驗物]-[WT])}× 100/([KO]-[WT])。又，分別為[WT]表示正常對照組織的平均HS或DS濃度，[KO]表示病態對照組的平均HS或DS濃度，[試驗物]表示各試驗物質投予組的平均HS或DS濃度。
將CSF、腦及脊髓中之HS濃度(μg/mL)及降低率(%)的測定結果呈示於表6～8。在Fab-hI2S-rAAV投予組中，CSF、腦及脊髓中之HS濃度，在任一者都相較於病態對照組而大致降低率(%)用量依賴性方式降低。此等之結果顯示：藉由對小鼠靜脈注射Fab-hI2S-rAAV而於活體內表現的Fab-hI2S會通過BBB而到達中樞神經系統的組織，於中樞神經系統之組織中發揮作為hI2S之酵素活性，而且分解蓄積於中樞神經系統的HS。
[表6]
(表6)CSF中之HS濃度的測定結果
投予組 平均值 (μg/mL) 標準偏差 降低率(%)
正常對照組 0.262 0.039 -
病態對照組 8.02 1.52 -
Fab-hI2S- rAAV投予組 (vg/kg) 1.0×10 13 1.33 1.10 86.2
1.0×10 12 4.46 1.34 45.9
1.0×10 11 7.86 0.54 2.10
1.0×10 10 6.71 0.37 16.9
[表7]
(表7)腦組織中之HS濃度的測定結果
投予組 平均值 (μg/mL) 標準偏差 降低率(%)
正常對照組 0.0649 0.0104 -
病態對照組 5.85 0.10 -
Fab-hI2S- rAAV投予組 (vg/kg) 1.0×10 13 1.20 0.92 80.3
1.0×10 12 3.88 1.22 34.1
1.0×10 11 5.23 0.14 10.7
1.0×10 10 5.90 0.39 -0.900
[表8]
(表8)脊髓中之HS濃度的測定結果
投予組 平均值 (μg/mL) 標準偏差 降低率(%)
正常對照組 0.0210 0.0054 -
病態對照組 2.99 0.35 -
Fab-hI2S- rAAV投予組 (vg/kg) 1.0×10 13 0.787 0.397 74.2
1.0×10 12 2.19 0.71 26.9
1.0×10 11 2.63 0.35 12.1
1.0×10 10 2.71 0.18 9.3
將血漿、肝臟、脾臟、心臟、及腎臟中之HS濃度(μg/mL)及DS濃度(μg/mL)及彼等之降低率(%)各自呈示於表9～13。在Fab-hI2S-rAAV投予組中，此等臟器中的HS濃度及DS濃度係相較於病態對照組而降低率(%)大致用量依賴性地降低。於肝臟中，投予超過1.0×10 12vg/kg的用量之Fab-hI2S-rAAV的情形，觀察到HS濃度及DS濃度的降低率的降低，但在到1.0×10 12vg/kg為止的用量，係用量依賴性地降低。此等之結果顯示：藉由對小鼠靜脈注射Fab-hI2S-rAAV而於活體內表現的Fab-hI2S，不僅在中樞神經系統中，在各種組織中皆發揮作為hI2S活性的酵素活性，而且分解蓄積於各種臟器的HS及DS。
[表9]
(表9)血漿中之HS及DS濃度的測定結果
投予組 HS(μg/mL) DS(μg/mL)
平均值 標準偏差 降低率(%) 平均值 標準偏差 降低率(%)
正常對照組 0.0741 0.0138 - 0.212 0.043 -
病態對照組 22.6 5.8 - 14.0 4.4 -
Fab-hI2S- rAAV投予組 (vg/kg) 1.0×10 13 6.99 11.61 69.3 3.67 5.74 74.9
1.0×10 12 0.744 0.664 97.0 0.561 0.290 97.5
1.0×10 11 6.94 4.83 69.5 6.30 4.92 55.8
1.0×10 10 21.5 8.5 4.90 14.2 4.7 -1.40
[表10]
(表10)肝臟中之HS及DS濃度的測定結果
投予組 HS(μg/mL) DS(μg/mL)
平均值 標準偏差 降低率(%) 平均值 標準偏差 降低率(%)
正常對照組 0.0862 0.0219 - 0.0840 0.0174 -
病態對照組 30.3 9.4 - 3.16 0.72 -
Fab-hI2S- rAAV投予組 (vg/kg) 1.0×10 13 2.47 0.43 92.1 0.888 0.085 73.9
1.0×10 12 2.11 0.75 93.3 0.780 0.202 77.4
1.0×10 11 7.30 5.10 76.2 1.61 0.99 50.5
1.0×10 10 24.9 11.5 18.0 2.12 0.24 33.7
[表11]
(表11)脾臟中之HS及DS濃度的測定結果
投予組 HS(μg/mL) DS(μg/mL)
平均值 標準偏差 降低率(%) 平均值 標準偏差 降低率(%)
正常對照組 0.112 0.019 - 0.0915 0.0144 -
病態對照組 13.2 0.5 - 4.89 0.49 -
Fab-hI2S- rAAV投予組 (vg/kg) 1.0×10 13 0.283 0.072 98.7 0.814 0.133 94.7
1.0×10 12 0.419 0.147 97.7 0.924 0.267 93.8
1.0×10 11 3.56 1.78 73.8 2.45 1.02 82.2
1.0×10 10 11.0 3.0 17.4 4.93 1.16 63.3
[表12]
(表12)心臟中之HS及DS濃度的測定結果
投予組 HS(μg/mL) DS(μg/mL)
平均值 標準偏差 降低率(%) 平均值 標準偏差 降低率(%)
正常對照組 0.0644 0.0061 - 0.0918 0.0348 -
病態對照組 9.72 1.05 - 5.13 0.93 -
Fab-hI2S- rAAV投予組 (vg/kg) 1.0×10 13 0.603 0.256 94.4 0.662 0.234 88.7
1.0×10 12 0.701 0.297 93.4 0.801 0.388 85.9
1.0×10 11 5.57 2.17 43.0 3.59 1.53 30.6
1.0×10 10 8.24 0.32 15.3 4.25 0.41 17.5
[表13]
(表13)腎臟中之HS及DS濃度的測定結果
投予組 HS(μg/mL) DS(μg/mL)
平均值 標準偏差 降低率(%) 平均值 標準偏差 降低率(%)
正常對照組 0.201 0.015 - 0.0569 0.0042 -
病態對照組 36.1 1.7 - 5.75 0.77 -
Fab-hI2S- rAAV投予組 (vg/kg) 1.0×10 13 3.06 2.82 92.0 0.536 0.103 91.6
1.0×10 12 9.83 4.69 73.2 1.10 0.46 81.7
1.0×10 11 33.0 8.3 8.80 5.21 1.61 9.50
1.0×10 10 36.7 3.4 -1.70 5.05 0.71 12.3
以上之結果顯示可藉由靜脈注射Fab-hI2S-rAAV而於活體內長期連續表現Fab-hI2S，且所表現的Fab-hI2S於病態模型小鼠之中樞神經系統及其它組織中發揮hI2S活性，而且可分解蓄積的HS及DS，顯示Fab-hI2S-rAAV作為韓特氏症候群之治療劑，特別是作為韓特氏症候群中的中樞神經損傷的治療劑為有效的。
即便為替代hI2S而併入其它溶酶體酶而成的rAAV病毒顆粒，亦認為可獲得同樣的結果。因此亦認為，併入其它溶酶體酶而成的rAAV病毒顆粒可使用作為以該其它溶酶體酶的基因異常為原因的疾病之治療劑。又，由於即便為替代hI2S而併入細胞激素等之液性因子、抗體醫藥等之所冀望的蛋白質而成的rAAV病毒顆粒，亦認為可於中樞神經系統中發揮該所冀望的蛋白質的功能，因此認為此等rAAV病毒顆粒也可使用作為伴隨中樞神經系統的異常的疾病之治療劑。
〔實施例18〕pAAV-mMAP-Fab-hGLB1載體之構築 合成包含序列識別號47所示的鹼基序列之DNA片段，該序列識別號47所示的鹼基序列自5’側起包含ClaI位置、小鼠α胎兒蛋白增強子/小鼠白蛋白啟動子、雞β肌動蛋白/MVM嵌合內含子、編碼hGLB1結合於抗hTfR抗體重鏈的Fab區域的C末端側之結合體的基因、編碼源自豬鐵士古病毒的2A肽的鹼基序列、編碼抗hTfR抗體輕鏈的基因、牛生長激素poly A序列、及BglII位置。將此DNA片段以ClaI和BglII進行消化。將pAAV-CMV載體(Takara Bio Inc.)以ClaI和BglII進行消化，且於此插入經上述制限酵素處理的DNA片段。將獲得的質體設為pAAV-mMAP-Fab-hGLB1載體。pAAV-mMAP-Fab-hGLB1載體具有下列構造：圖1所示的pAAV-mMAP-Fab-hI2S載體的符號4所示的部位被取代為編碼hGLB1結合於抗hTfR抗體重鏈的Fab區域的C末端側之結合體的基因，及相同符號5所示的部位被取代為編碼源自豬鐵士古病毒的2A肽的鹼基序列。pAAV-mMAP-Fab-hGLB1載體具有由上游起依序包含下列的構造：第一AAV-ITR之功能等價物(序列識別號6)、小鼠α胎兒蛋白增強子/小鼠白蛋白啟動子(序列識別號8)、雞β肌動蛋白/MVM嵌合內含子(序列識別號9)、編碼hGLB1結合於抗hTfR抗體重鏈的Fab區域的C末端側之結合體(序列識別號48)的基因、編碼源自豬鐵士古病毒的2A肽的鹼基序列(序列識別號49)、編碼抗hTfR抗體輕鏈(序列識別號10)的基因、牛生長激素polyA訊息(序列識別號17)、及第二AAV-ITR之功能等價物(序列識別號7)。再者，pAAV-mMAP-Fab-hGLB1載體包含安比西林耐性基因及複製起始點(ColE1 ori)。又hGLB1為溶酶體酶之一種，hGLB1之基因異常為GM1-神經節苷脂症之原因。
〔實施例19〕包含編碼Fab-hGLB1基因的rAAV的rAAV溶液之調製 使用包含pHelper載體(Takara Bio Inc.)、pR2(mod)C8載體、及pAAV-mMAP-Fab-hGLB1載體的轉染用之DNA溶液，以實施例4記載之方法使編碼Fab-hGLB1基因的rAAV病毒顆粒產生。將獲得的rAAV病毒顆粒設為Fab-hGLB1-rAAV。Fab-hGLB1-rAAV被期待在感染細胞時會表現包含人類β-半乳糖苷酶結合於抗人類運鐵蛋白受體抗體Fab區域重鏈的C末端側而成的結合體與抗人類hTfR抗體輕鏈之融合蛋白質。再者，依據實施例5～10記載之方法，取得包含編碼Fab-hGLB1基因的rAAV的rAAV溶液(Fab-hGLB1-rAAV溶液)。此Fab-hGLB1-rAAV溶液中之病毒基因體量以實施例11記載之方法測定。
〔實施例20〕使用GLB1-KO/hTfR-KI小鼠的Fab-hGLB1-rAAV之藥效評價 使用依據實施例12記載之方法製作的為GM1-神經節苷脂症之模型小鼠的GLB1-KO/hTfR-KI小鼠，進行對活體投予Fab-hGLB1-rAAV時的藥效評價。GLB1-KO/hTfR-KI小鼠為於同種接合子中缺損β-半乳糖苷酶(GLB1)基因且於異種接合子具有嵌合TfR基因的小鼠。GLB1-KO/hTfR-KI小鼠使用10～12週齡(投予開始時)者。將實施例19中所調製的Fab-hGLB1-rAAV溶液以成為1.0×10 13vg/kg及1.0×10 14vg/kg的用量的方式，對GLB1-KO/hTfR-KI小鼠單次尾靜脈內投予(各組N=3)。又，設置由雄性野生型小鼠所構成的正常對照組及由雄性GLB1-KO/hTfR-KI小鼠所構成的病態對照組(各組N=3)。對正常對照組及病態對照組，係投予生理食鹽液(大塚製藥工場公司)。
於投予起8、15、及22日後，自尾靜脈採取少量血液至經EDTA-2K塗覆的採血管(CAPIJECT，Terumo公司)，靜置於冰上後，離心(2000×g，20分鐘，4℃)而回收血漿。於投予起29日後於布托啡諾(Meiji SeikaPharma公司)・咪達唑侖(Sandoz公司)・Domitor(日本全藥工業公司)的3劑混合麻醉下，由大池採取腦脊髓液(Cerebrospinal fluid，CSF)。接著將小鼠開胸進行心臟採血。血液採取至經EDTA-2K塗覆的採血管(CAPIJECT，Terumo公司)，於冰上靜置後，進行離心(2000×g，20分鐘)而回收血漿。接著，以生理食鹽液(大塚製藥工場公司)進行全身灌流，分別摘出腦、脊髓、肝臟、心臟、腎臟及脾臟。測定各組織的濕重量後，迅速地浸漬於液態氮中並急速冷凍。
〔實施例21〕血漿中之Fab-hGLB1的定量 血漿之上清液中Fab-hGLB1的濃度測定，係利用實施例22記載的方法進行。將其結果呈示於表14。Fab-hGLB1濃度，係以血漿每1 mL所含的Fab-hGLB1之量(μg/mL血漿)算出。
在Fab-hGLB1-rAAV投予組中，以任何投予量皆投予後8日起至投予後29日，血漿中的Fab-hGLB1濃度上升。又，血漿中的Fab-hGLB1濃度係投予量依賴性地上升。此等數據顯示：被靜脈注射至小鼠的Fab-hGLB1-rAAV被細胞攝入，編碼hGLB1的基因在細胞內被轉錄、轉譯而表現的hGLB1被釋放至血液中。
[表14]
(表14)血漿中之Fab-hGLB1的經時的濃度變化(μg/mL血漿)
投予組 投予後8日 投予後15日 投予後22日 投予後29日
平均值 標準偏差 平均值 標準偏差 平均值 標準偏差 平均值 標準偏差
Fab-hGLB1-rAAV (vg/kg) 1.0×10 13 0.239 0.073 0.381 0.165 0.576 0.248 0.663 0.384
1.0×10 14 0.228 0.062 1.34 0.32 1.01 0.38 2.63 0.10
〔實施例22〕血漿中之Fab-hGLB1的濃度測定 血漿中的Fab-hGLB1濃度的測定大致以下述方法實施。於Streptavidin Gold plate(Meso scale diagnostics公司)的各孔中各添加Superblock Blocking Buffer in PBS(Thermo Fisher Scientific公司) 150 μL，進行振盪1小時以上而將平盤阻斷。接著，對生物素化抗hGLB1單株抗體以及SULFO化抗hGLB1單株抗體之混合溶液，分別各添加包含已知濃度的Fab-hGLB1的校準曲線用標準樣品(Fab-hGLB1校準曲線用標準樣品)及血漿而進行振盪1小時以上，作為抗體反應液。又，抗hGLB1單株抗體係藉由培養抗hGLB1產生融合瘤而取得，該抗hGLB1產生融合瘤係使用由以具有序列識別號50所示的胺基酸序列的人類β-半乳糖苷酶進行免疫的小鼠所取得的脾細胞，而以通常方法製作。將獲得的單株抗體之一使用Biotin Labeling Kit-NH2(同仁化學研究所公司)，而按照附隨的步驟準則進行修飾，獲得生物素化抗hGLB1單株抗體。又，將所獲得的單株抗體之另外一個使用MSD GOLD SULFO-TAG NHS-Ester(Meso scale Diagnostics公司)，而按照附隨的步驟準則進行修飾，獲得SULFO化抗hGLB1單株抗體。從各孔去除阻斷溶液，以含有0.05% Tween 20的PBS(PBST，Sigma Aldrich公司)洗淨後，於各孔中添加抗體反應液25 μL，進行振盪1小時以上。接著去除抗體反應液，以PBST洗淨後，添加以注射用水(大塚製藥工場公司)稀釋1/2的4 X Read Buffer(Meso scale diagnostics公司) 150 μL，使用Sector TMImager S600(Meso scale diagnostics公司)而測定來自各孔的發光量。由Fab-hGLB1校準曲線用標準樣品的測定值作成校準曲線，於此內插各檢體的測定值，藉此而算出血漿每1mL所含的Fab-hGLB1的量(血漿中之Fab-hGLB1濃度)。又，校準曲線用標準樣品中所含的Fab-hGLB1，係利用通常方法使由包含序列識別號48所示的胺基酸序列之人類GLB1結合於抗hTfR抗體重鏈的Fab區域的C末端之結合體、與包含序列識別號15所示的胺基酸序列之抗hTfR抗體輕鏈所構成的融合蛋白質(Fab-hGLB1)，於CHO細胞中表現而取得者。
〔實施例23〕腦及脊髓組織中之Fab-hGLB1的定量 腦及脊髓組織中之Fab-hGLB1濃度的測定，係使用將實施例20中所採取的腦及脊髓以含有0.025% Protease Inhibitor Cocktail(Sigma-Aldrich公司)的RIPA Buffer(和光純藥工業公司)均質化且將獲得的均質物離心而回收的上清液，依據實施例22記載之方法而實施。Fab-hGLB1濃度，係以組織每1 g所含的Fab-hGLB1之量(μg/mg組織)算出。將腦及脊髓組織中之Fab-hGLB1之濃度測定的結果分別呈示於表15及16。於腦及脊髓組織中，在Fab-hGLB1-rAAV投予組中，任何的投予量皆檢測到Fab-hGLB1。另一方面，在Fab-hGLB1-rAAV非投予組中，於GLB1 KO小鼠之腦及脊髓組織中並未檢測到Fab-hGLB1。又，Fab-hGLB1濃度係投予量依賴性地上升。此等數據顯示：藉由對小鼠靜脈內注射Fab-hGLB1-rAAV，而能夠使Fab-GLB1於中樞神經組織中分布。
[表15]
(表15)腦組織中之Fab-hGLB1的測定結果(μg/mg組織)
投予組 平均值 標準偏差
Fab-hGLB1-rAAV (vg/kg) 1.0×10 13 0.312 0.186
1.0×10 14 0.401 0.034
[表16]
(表16)脊髓組織中之Fab-hGLB1的測定結果(μg/mg組織)
投予組 平均值 標準偏差
Fab-hGLB1-rAAV (vg/kg) 1.0×10 13 0.247 0.143
1.0×10 14 0.364 0.057
〔實施例24〕CSF、腦及脊髓組織中之lyso-GM1的定量 CSF、血漿、及各組織中之lyso-GM1的定量以WO2021/039644記載之方法實施。又，lyso-GM1為經GLB1分解的基質，為蓄積於GM1-神經節苷脂症之患者的組織內的物質。因此，藉由定量組織內的lyso-GM1，而可評價對GM1-神經節苷脂症之模型動物投予的藥劑之對該疾病的藥效。使用表示各組織中之lyso-GM1的減少作用之降低率(%)，作為藥效的指標。降低率(%)定義為{([KO]-[WT])-([試驗物]-[WT])}× 100/([KO]-[WT])。又，分別為[WT]表示正常對照組之平均lyso-GM1濃度，[KO]表示病態對照組之平均lyso-GM1濃度，[試驗物]表示各試驗物質投予組之平均lyso-GM1濃度。
將CSF、腦及脊髓中之lyso-GM1濃度的測定結果及降低率(%)分別呈示於表17、18及19。CSF中之lyso-GM1濃度，係以CSF每1 mL所含的lyso-GM1濃度的量(μg/mL CSF)算出。腦及脊髓中之lyso-GM1濃度，係以各組織每1 mg所含的lyso-GM1濃度的量(μg/mg組織)而算出。在Fab-hGLB1-rAAV投予組中，CSF、腦及脊髓中之lyso-GM1濃度相較於病態對照組，而於任一投予組皆降低。此等之結果顯示：藉由對小鼠靜脈內注射Fab-hGLB1-rAAV而於活體內表現的Fab-hGLB1，會通過BBB而到達中樞神經系統的組織，於中樞神經系統之組織中發揮hGLB1活性，而且分解蓄積於中樞神經系統的lyso-GM1。
[表17]
(表17)CSF中之lyso-GM1的測定結果(μg/mL CSF)
投予組 平均值 (μg/mL) 標準偏差 降低率(%)
正常對照組 0.00 0.00 -
病態對照組 1.36 0.13 -
Fab-hGLB1-rAAV投予組 (vg/kg) 1.0×10 13 0.587 0.461 56.7
1.0×10 14 0.643 0.178 52.7
[表18]
(表18)腦組織中之lyso-GM1的測定結果(μg/mg組織)
投予組 平均值 (μg/mL) 標準偏差 降低率(%)
正常對照組 0.142 0.027 -
病態對照組 67.8 9.7 -
Fab-hGLB1-rAAV投予組 (vg/kg) 1.0×10 13 25.0 19.3 63.2
1.0×10 14 16.3 3.5 76.1
[表19]
(表19)脊髓組織中之lyso-GM1的測定結果(μg/mg組織)
投予組 平均值 (μg/mL) 標準偏差 降低率(%)
正常對照組 0.0 0.00 -
病態對照組 5.16 0.65 -
Fab-hGLB1-rAAV投予組 (vg/kg) 1.0×10 13 3.29 2.17 36.3
1.0×10 14 2.43 0.37 58.5
又，雖未呈示數據，但血漿及肝臟、心臟、腎臟及脾臟之lyso-GM1濃度係於任何投予組中皆下降到與正常對照組相同的程度。
以上之結果顯示可藉由將Fab-hGLB1-rAAV靜脈注射，而使Fab-hGLB1於活體內長期持續表現，且所表現的Fab-hGLB1於病態模型小鼠之中樞神經系統及其它組織中發揮hGLB1活性，而且可分解異常蓄積的hGLB1之基質，顯示Fab- hGLB1-rAAV作為GM1-神經節苷脂症之治療劑，特別是作為GM1-神經節苷脂症中的中樞神經損傷之治療劑而為有效的。 [產業上利用之可能性]
如依據本發明，則例如可提供可使配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質於細胞、組織、或活體內表現之質體的形態、內包於重組病毒之病毒顆粒的形態、或內包於微脂體、脂質奈米粒子等的形態之核酸分子作為醫藥。
1:第一AAV-ITR之功能等價物 2:小鼠α胎兒蛋白增強子/小鼠白蛋白啟動子 3:雞β肌動蛋白/MVM嵌合內含子 4:編碼hI2S結合於抗hTfR抗體重鏈的Fab區域的C末端側之結合體的基因 5:源自小鼠腦心肌炎病毒的5’非轉譯區域的內部核糖體結合部位 6:編碼抗hTfR抗體輕鏈的基因 7:牛生長激素polyA訊息 8:第二AAV-ITR之功能等價物 9:安比西林耐性基因 10:複製起始點(ColE1 ori) 11:p5啟動子 12:AAV2的Rep區域 13:AAV8的Cap區域 14:功能為增強子的p5啟動子 [序列表非關鍵詞文字]
序列識別號1:連接子之胺基酸序列的一例1 序列識別號2:連接子之胺基酸序列的一例2 序列識別號3:連接子之胺基酸序列的一例3 序列識別號4:血清型2的AAV的第一反向末端重複(第一ITR)之鹼基序列，野生型 序列識別號5:血清型2的AAV的第一反向末端重複(第二ITR)之鹼基序列，野生型 序列識別號6:第一反向末端重複(第一ITR)之鹼基序列的適合的一例，合成序列 序列識別號7:第二反向末端重複(第二ITR)之鹼基序列的適合的一例，合成序列 序列識別號8:小鼠α胎兒蛋白增強子/小鼠白蛋白啟動子之鹼基序列，合成序列 序列識別號9:雞β肌動蛋白/MVM嵌合內含子之鹼基序列，合成序列 序列識別號10:源自小鼠腦心肌炎病毒的5’非轉譯區域的內部核糖體結合部位之鹼基序列之一例 序列識別號11:人類運鐵蛋白受體之胺基酸序列 序列識別號12:抗hTfR抗體重鏈的Fab區域之胺基酸序列的一例 序列識別號13:連接子之胺基酸序列的一例4 序列識別號14:人類I2S之胺基酸序列 序列識別號15:抗hTfR抗體輕鏈的胺基酸序列之一例 序列識別號16:抗hTfR抗體重鏈的胺基酸序列之一例 序列識別號17:牛生長激素polyA訊息之鹼基序列 序列識別號18:用以製作pAAV-mMAP-Fab-hI2S載體的合成的DNA片段之鹼基序列，合成序列 序列識別號19:用以製作pR2(mod)C6載體的合成的DNA片段之鹼基序列，合成序列 序列識別號20:用以製作pR2(mod)C8載體的合成的DNA片段之鹼基序列，合成序列 序列識別號21:包含p5啟動子的AAV2的Rep區域的鹼基序列，合成序列 序列識別號22:AAV8的Cap區域的鹼基序列 序列識別號23:p5啟動子的鹼基序列 序列識別號24:包含AAV2的Rep區域的鹼基序列，合成序列 序列識別號25:引子SI-1的鹼基序列，合成序列 序列識別號26:引子SI-2的鹼基序列，合成序列 序列識別號27:探針SI-1的鹼基序列，合成序列 序列識別號28:引子SI-3的鹼基序列，合成序列 序列識別號29:引子SI-4的鹼基序列，合成序列 序列識別號30:探針SI-2的鹼基序列，合成序列 序列識別號31:抗hTfR抗體的輕鏈CDR1的胺基酸序列1 序列識別號32:抗hTfR抗體的輕鏈CDR1的胺基酸序列2 序列識別號33:抗hTfR抗體的輕鏈CDR2的胺基酸序列1 序列識別號34:抗hTfR抗體的輕鏈CDR2的胺基酸序列2 序列識別號35:抗hTfR抗體的輕鏈CDR3的胺基酸序列1 序列識別號36:抗hTfR抗體的重鏈CDR1的胺基酸序列1 序列識別號37:抗hTfR抗體的重鏈CDR1的胺基酸序列2 序列識別號38:抗hTfR抗體的重鏈CDR2的胺基酸序列1 序列識別號39:抗hTfR抗體的重鏈CDR2的胺基酸序列2 序列識別號40:抗hTfR抗體的重鏈CDR3的胺基酸序列1 序列識別號41:抗hTfR抗體的重鏈CDR3的胺基酸序列2 序列識別號42:抗hTfR抗體重鏈的Fab區域與人類I2S之結合體的胺基酸序列 序列識別號43:第一長末端重複(第一LTR)的鹼基序列的適合的一例，合成序列 序列識別號44:第二長末端重複(第二LTR)的鹼基序列的適合的一例，合成序列 序列識別號45:仙台病毒基因體之領導序列的鹼基序列 序列識別號46:仙台病毒基因體之尾曳序列的鹼基序列 序列識別號47:用以製作pAAV-mMAP-Fab-hGLB1載體的合成的DNA片段的鹼基序列，合成序列 序列識別號48:抗hTfR抗體重鏈的Fab區域與人類β-半乳糖苷酶之結合體的胺基酸序列之一例 序列識別號49:編碼源自豬鐵士古病毒的2A肽的鹼基序列 序列識別號50:人類β-半乳糖苷酶的胺基酸序列
圖1為呈示AAV8-mMAP-Fab-hI2S載體(質體)之結構的示意圖。 圖2為呈示pR2(mod)C8載體之結構的示意圖。
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1:第一AAV-ITR之功能等價物
2:小鼠α胎兒蛋白增強子/小鼠白蛋白啟動子
3:雞β肌動蛋白/MVM嵌合內含子
4:編碼hI2S結合於抗hTfR抗體重鏈的Fab區域的C末端側之結合體的基因
5:源自小鼠腦心肌炎病毒的5’非轉譯區域的內部核糖體結合部位
6:編碼抗hTfR抗體輕鏈的基因
7:牛生長激素polyA訊息
8:第二AAV-ITR之功能等價物
9:安比西林耐性基因
10:複製起始點(ColE1 ori)

Claims (44)

  1. 一種核酸分子，其包含以下(1)～(6)之任一者的鹼基序列： (1)包含第一反向末端重複(ITR)或其功能等價物的鹼基序列、於其下游編碼配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列、再於下游包含第二反向末端重複(ITR)或其功能等價物的鹼基序列； (2)包含第一反向末端重複(ITR)或其功能等價物的鹼基序列、於其下游包含基因表現控制部位的鹼基序列、再於下游編碼配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列、再於下游包含第二反向末端重複(ITR)或其功能等價物的鹼基序列； (3)包含第一長末端重複(LTR)或其功能等價物的鹼基序列、於其下游編碼配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列、再於下游包含第二長末端重複(LTR)或其功能等價物的鹼基序列； (4)包含第一長末端重複(LTR)或其功能等價物的鹼基序列、於其下游包含基因表現控制部位的鹼基序列、再於下游編碼配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列、再於下游包含第二長末端重複(LTR)或其功能等價物的鹼基序列； (5)包含領導序列(leader)或其功能等價物的鹼基序列、於其下游編碼配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列、再於下游包含尾曳序列(trailer)或其功能等價物的鹼基序列；或 (6)包含領導序列或其功能等價物的鹼基序列、於其下游包含基因表現控制部位的鹼基序列、再於下游編碼配位體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列、再於下游包含尾曳序列或其功能等價物的鹼基序列。
  2. 如請求項1之核酸分子，其中該配位體為抗體。
  3. 如請求項2之核酸分子，其為選自以下(1)～(4)者： (1)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼具有生理活性的蛋白質結合於抗體重鏈的C末端之結合體的鹼基序列、及編碼抗體輕鏈的鹼基序列； (2)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼具有生理活性的蛋白質結合於抗體重鏈的N末端之結合體的鹼基序列、及編碼抗體輕鏈的鹼基序列； (3)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼具有生理活性的蛋白質結合於抗體輕鏈的C末端之結合體的鹼基序列、及編碼抗體重鏈的鹼基序列；或 (4)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼具有生理活性的蛋白質結合於抗體輕鏈的N末端之結合體的鹼基序列、及編碼抗體重鏈的鹼基序列。
  4. 如請求項2之核酸分子，其為選自以下(1)～(4)者： (1)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼具有生理活性的蛋白質透過連接子(linker)而結合於抗體重鏈的C末端之結合體的鹼基序列、及編碼抗體輕鏈的鹼基序列； (2)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼具有生理活性的蛋白質透過連接子而結合於抗體重鏈的N末端之結合體的鹼基序列、及編碼抗體輕鏈的鹼基序列； (3)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼具有生理活性的蛋白質透過連接子而結合於抗體輕鏈的C末端之結合體的鹼基序列、及編碼抗體重鏈的鹼基序列；或 (4)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼具有生理活性的蛋白質透過連接子而結合於抗體輕鏈的N末端之結合體的鹼基序列、及編碼抗體重鏈的鹼基序列。
  5. 如請求項4之核酸分子，其中該連接子為由1～50個胺基酸殘基所構成的肽。
  6. 如請求項5之核酸分子，其中該連接子為包含選自下述群組的胺基酸序列而成的肽，該群組包含1個甘胺酸、1個絲胺酸、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、序列識別號1之胺基酸序列、序列識別號2之胺基酸序列、序列識別號3之胺基酸序列、及2～10個此等之胺基酸序列連續而成的胺基酸序列。
  7. 如請求項2之核酸分子，其為選自以下(1)～(4)者： (1)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼抗體重鏈透過第二連接子而結合於抗體輕鏈的C末端而且具有生理活性的蛋白質直接或透過連接子而結合於其C末端之結合體的鹼基序列； (2)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼抗體輕鏈透過第二連接子而結合於抗體重鏈的C末端而且具有生理活性的蛋白質直接或透過連接子而結合於其C末端之結合體的鹼基序列； (3)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼抗體重鏈直接與或透過連接子而結合於具有生理活性的蛋白質的C末端而且抗體輕鏈透過第二連接子而結合於其C末端之結合體的鹼基序列；或 (4)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼抗體輕鏈直接或透過連接子而結合於具有生理活性的蛋白質的C末端而且抗體重鏈透過第二連接子而結合於其C末端之結合體的鹼基序列。
  8. 如請求項7之核酸分子，其中該連接子為由1～50個胺基酸殘基所構成的肽。
  9. 如請求項8之核酸分子，其中該連接子為包含選自下述群組的胺基酸序列而成的肽，該群組包含1個甘胺酸、1個絲胺酸、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、序列識別號1之胺基酸序列、序列識別號2之胺基酸序列、序列識別號3之胺基酸序列、及2～10個此等之胺基酸序列連續而成的胺基酸序列。
  10. 如請求項9之核酸分子，其中該第二連接子由8～50個胺基酸殘基所構成。
  11. 如請求項8之核酸分子，其中該第二連接子選自包含下列的群組：胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、序列識別號1、序列識別號2、序列識別號3之各胺基酸序列、序列識別號1之胺基酸序列之3個連續而成的胺基酸序列、及2～10個此等之胺基酸序列連續而成的胺基酸序列。
  12. 如請求項3之核酸分子，其為選自以下(1)～(4)者： (1)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼該具有生理活性的蛋白質結合於該抗體重鏈的C末端之結合體的鹼基序列、於其下游編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列、再於其下游編碼該抗體輕鏈的鹼基序列； (2)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼該具有生理活性的蛋白質結合於該抗體重鏈的N末端之結合體的鹼基序列、於其下游編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列、再於其下游編碼該抗體輕鏈的鹼基序列； (3)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼該具有生理活性的蛋白質結合於該抗體輕鏈的C末端之結合體的鹼基序列、於其下游編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列、再於其下游編碼該抗體重鏈的鹼基序列；或 (4)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼該具有生理活性的蛋白質結合於該抗體輕鏈的N末端之結合體的鹼基序列、於其下游編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列、再於其下游編碼該抗體重鏈的鹼基序列。
  13. 如請求項4至6中任一項之核酸分子，其為選自以下(1)～(4)者： (1)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼該具有生理活性的蛋白質透過連接子而結合於該抗體重鏈的C末端之結合體的鹼基序列、於其下游編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列、再於其下游編碼該抗體輕鏈的鹼基序列； (2)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼該具有生理活性的蛋白質透過連接子而結合於該抗體重鏈的N末端之結合體的鹼基序列、於其下游編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列、再於其下游編碼該抗體輕鏈的鹼基序列； (3)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼該具有生理活性的蛋白質透過連接子而結合於該抗體輕鏈的C末端之結合體的鹼基序列、於其下游編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列、再於其下游編碼該抗體重鏈的鹼基序列；或 (4)編碼該抗體與具有生理活性的蛋白質之融合蛋白質的鹼基序列包含編碼該具有生理活性的蛋白質透過連接子而結合於該抗體輕鏈的N末端之結合體的鹼基序列、於其下游編碼內部核糖體結合部位的鹼基序列、再於其下游編碼該抗體重鏈的鹼基序列。
  14. 如請求項12或13之核酸分子，其中該內部核糖體結合部位源自病毒或基因的5’非轉譯區域，該病毒或基因選自包含下列的群組：小核糖核酸病毒(picornavirus)科之病毒、口蹄疫病毒、A型肝炎病毒、C型肝炎病毒、冠狀病毒、牛腸病毒(enterovirus)、泰勒氏鼠腦脊髓炎病毒(Theiler's mouse encephalomyelitis virus)、柯薩奇B型病毒(Coxsackievirus type B)、人類免疫球蛋白重鏈結合蛋白質基因、果蠅觸角足基因(Drosophila Antennapedia gene)、果蠅超級雙胸基因(Drosophila Ultrabithorax gene)。
  15. 如請求項12或13之核酸分子，其中該內部核糖體結合部位源自小核糖核酸病毒科之病毒的5’非轉譯區域。
  16. 如請求項2至14中任一項之核酸分子，其中該抗體為抗原結合性片段。
  17. 如請求項2至14中任一項之核酸分子，其中該抗體為Fab。
  18. 如請求項2之核酸分子，其中該抗體為單域抗體。
  19. 如請求項2至18中任一項之核酸分子，其中該抗體對於存在於血管內皮細胞表面上的蛋白質具有特異的親和性。
  20. 如請求項19之核酸分子，其中該血管內皮細胞為腦血管內皮細胞。
  21. 如請求項19或20之核酸分子，其中該存在於血管內皮細胞表面上的蛋白質選自包含下列的群組：運鐵蛋白受體、胰島素受體、瘦素受體、似胰島素生長因子I受體、似胰島素生長因子II受體、脂蛋白受體、葡萄糖運輸蛋白1(glucose transporter 1)、有機陰離子運輸蛋白(organic anion transporter)、單羧酸運輸蛋白(monocarboxylic acid transporter)、低密度脂蛋白受體相關蛋白質1、低密度脂蛋白受體相關蛋白質8、及肝素結合性上皮生長因子樣生長因子之膜結合型前驅物。
  22. 如請求項1至21中任一項之核酸分子，其中該基因表現控制部位選自包含下列的群組：源自細胞巨大病毒的啟動子、SV40早期啟動子、人類延長因子-1α(EF-1α)啟動子、人類泛蛋白C啟動子、反轉錄病毒之勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)LTR啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、β-肌動蛋白啟動子、磷甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase (PGK))啟動子、小鼠白蛋白啟動子、人類白蛋白啟動子、人類α-1抗胰蛋白酶啟動子、及小鼠α胎兒蛋白增強子/小鼠白蛋白啟動子。
  23. 如請求項1之核酸分子，其中該配位體對於存在於血管內皮細胞表面上的蛋白質具有特異的親和性。
  24. 如請求項23之核酸分子，其中該血管內皮細胞為腦血管內皮細胞。
  25. 如請求項23或24之核酸分子，其中該存在於血管內皮細胞表面上的蛋白質選自包含下列的群組：運鐵蛋白受體、胰島素受體、瘦素受體、似胰島素生長因子I受體、似胰島素生長因子II受體、脂蛋白受體、葡萄糖運輸蛋白1、有機陰離子運輸蛋白、單羧酸運輸蛋白、低密度脂蛋白受體相關蛋白質1、低密度脂蛋白受體相關蛋白質8、及肝素結合性上皮生長因子樣生長因子之膜結合型前驅物。
  26. 如請求項23或24之核酸分子，其中該配位體選自包含下列的群組：運鐵蛋白、胰島素、瘦素、似胰島素生長因子I、似胰島素生長因子II、脂蛋白、及低密度脂蛋白。
  27. 如請求項1至26中任一項之核酸分子，其中該具有生理活性的蛋白質選自包含下列的群組：生長激素、溶酶體酶、體介素、胰島素、升糖素、細胞激素、淋巴激素、血液凝固因子、抗體、抗體與其它蛋白質之融合蛋白質、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、紅血球生成素、達貝泊汀(darbepoetin)、組織漿胞素原活化劑(tissue plasminogen activator (t-PA))、凝血酶調節素(thrombomodulin)、濾泡激素(FSH)、促性腺激素釋放激素(GnRH)、促性腺激素、神經生長因子(NGF)、睫狀神經營養因子(ciliary neurotrophic factor (CNTF))、神經膠細胞株神經營養因子(GDNF)、神經滋養素3(neurotrophin 3)、神經滋養素4/5、神經滋養素6、神經調節蛋白1(neuregulin 1)、活化素(activin)、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)、纖維母細胞生長因子2(FGF2)、上皮細胞增殖因子(EGF)、血管內皮增殖因子(VEGF)、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、介白素6、PD-1、PD-1配位體、腫瘤壞死因子α受體(TNF-α受體)、具有分解β類澱粉蛋白的活性的酵素、依那西普(etanercept)、培維索孟(pegvisomant)、美曲普汀(metreleptin)、阿巴西普(abatacept)、阿爾法(asfotase)、GLP-1受體促效劑、及抗體醫藥。
  28. 如請求項1至26中任一項之核酸分子，其中該具有生理活性的蛋白質選自包含下列的群組：α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸脂酶、葡萄糖腦苷酶、β-半乳糖苷酶、GM2活性化蛋白質、β-己醣胺酶A、β-己醣胺酶B、N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸轉移酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、半乳糖基神經醯胺酶(galactosylceramidase)、蛋白皂角素C(saposin C)、芳基硫酸脂酶A、α-L-岩藻糖苷酶、天冬胺醯基胺基葡萄糖苷酶(aspartylglucosaminidase)、α-N-乙醯基胺基半乳糖苷酶(α-N-acetyl-galactosaminidase)、酸性神經髓磷脂酶、α-半乳糖苷酶A、β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase)、肝素N-硫酸脂酶、α-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶(α-N-acetyl-glucosaminidase)、乙醯基CoAα-胺基葡萄糖苷N-乙醯基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-硫酸脂酶、酸性神經醯胺酶、澱粉-1,6-葡萄糖苷酶、唾液酸酶(sialidase)、軟脂醯基蛋白質硫酯酶-1、三肽基肽酶-1(Tripeptidyl Peptidase-1)、玻糖醛酸酶-1、CLN1及CLN2。
  29. 如請求項1至28中任一項之核酸分子，其中該第一反向末端重複及該第二反向末端重複為源自腺相關病毒者、源自腺病毒者、或彼等之變異體。
  30. 如請求項1至28中任一項之核酸分子，其中該第一反向末端重複包含序列識別號4所示的鹼基序列，該第二反向末端重複包含序列識別號5所示的鹼基序列。
  31. 如請求項1至28中任一項之核酸分子，其中該第一反向末端重複為選自以下(1)～(3)者，及該第二反向末端重複為選自以下(4)～(6)者： (1)包含與序列識別號4所示的鹼基序列顯示80%以上同一性的鹼基序列者， (2)包含與序列識別號4所示的鹼基序列顯示90%以上同一性的鹼基序列者，或 (3)對於序列識別號4所示的鹼基序列施加由1～20個取代、缺失或加成所致的改變者；及 (4)包含與序列識別號5所示的鹼基序列顯示80%以上同一性的鹼基序列者， (5)包含與序列識別號5所示的鹼基序列顯示90%以上同一性的鹼基序列者，或 (6)對於序列識別號5所示的鹼基序列施加由1～20個取代、缺失或加成所致的改變者。
  32. 如請求項1至28中任一項之核酸分子，其中該第一反向末端重複之功能等價物包含序列識別號6所示的鹼基序列，且該第二反向末端重複之功能等價物包含序列識別號7所示的鹼基序列。
  33. 如請求項1至28中任一項之核酸分子，其中該第一反向末端重複之功能等價物為選自以下(1)～(3)者，及 該第二反向末端重複之功能等價物為選自以下(4)～(6)者： (1)包含與序列識別號6所示的鹼基序列顯示80%以上同一性的鹼基序列者， (2)包含與序列識別號6所示的鹼基序列顯示90%以上同一性的鹼基序列者，或 (3)對於序列識別號6所示的鹼基序列施加由1～20個取代、缺失或加成所致的改變者；及 (4)包含與序列識別號7所示的鹼基序列顯示80%以上同一性的鹼基序列者， (5)包含與序列識別號7所示的鹼基序列顯示90%以上同一性的鹼基序列者，或 (6)對於序列識別號7所示的鹼基序列施加由1～20個取代、缺失或加成所致的改變者。
  34. 如請求項1至28中任一項之核酸分子，其中該第一長末端重複及該第二長末端重複為源自慢病毒或反轉錄病毒者或其變異體。
  35. 如請求項1至28中任一項之核酸分子，其中該第一長末端重複包含序列識別號43所示的鹼基序列，且該第二長末端重複包含序列識別號44所示的鹼基序列。
  36. 如請求項1至28中任一項之核酸分子，其中該第一長末端重複為選自以下(1)～(3)者，及該第二長末端重複為選自以下(4)～(6)者： (1)包含與序列識別號43所示的鹼基序列顯示80%以上同一性的鹼基序列者， (2)包含與序列識別號43所示的鹼基序列顯示90%以上同一性的鹼基序列者，或 (3)對於序列識別號43所示的鹼基序列施加由1～20個取代、缺失或加成所致的改變者；及 (4)包含與序列識別號44所示的鹼基序列顯示80%以上同一性的鹼基序列者， (5)包含與序列識別號44所示的鹼基序列顯示90%以上同一性的鹼基序列者，或 (6)對於序列識別號44所示的鹼基序列施加由1～20個取代、缺失或加成所致的改變者。
  37. 如請求項1至28中任一項之核酸分子，其中該領導序列及該尾曳序列為源自仙台病毒(Sendai virus)者或其變異體。
  38. 如請求項1至28中任一項之核酸分子，其中該領導序列包含序列識別號45所示的鹼基序列，且該尾曳序列包含序列識別號46所示的鹼基序列。
  39. 如請求項1至28中任一項之核酸分子，其中該領導序列為選自以下(1)～(3)者，及該尾曳序列為選自以下(4)～(6)者： (1)包含與序列識別號45所示的鹼基序列顯示80%以上同一性的鹼基序列者， (2)包含與序列識別號45所示的鹼基序列顯示90%以上同一性的鹼基序列者，或 (3)對於序列識別號45所示的鹼基序列施加由1～20個取代、缺失或加成所致的改變者；及 (4)包含與序列識別號46所示的鹼基序列顯示80%以上同一性的鹼基序列者， (5)包含與序列識別號47所示的鹼基序列顯示90%以上同一性的鹼基序列者，或 (6)對於序列識別號47所示的鹼基序列施加由1～20個取代、缺失或加成所致的改變者。
  40. 一種細胞、組織或動物，其經導入如請求項1至39中任一項之核酸分子。
  41. 一種幹細胞，其經導入如請求項1至39中任一項之核酸分子。
  42. 如請求項41之幹細胞，其選自包含下列的群組：間葉系幹細胞、源自齒髓的幹細胞、造血幹細胞、胚性幹細胞、內皮幹細胞、乳腺幹細胞、腸幹細胞、肝幹細胞、胰幹細胞、神經幹細胞、及iPS細胞。
  43. 一種質體，其包含如請求項1至39中任一項之核酸分子。
  44. 一種病毒之病毒顆粒(virion)，其包含如請求項1至39中任一項之核酸分子。
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