KR20230131223A - 리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을코딩하는 유전자가 짜넣어진 핵산 분자 - Google Patents

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KR20230131223A
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마사후미 기노시타
슌스케 이이즈카
??스케 이이즈카
아쓰시 이마키이레
하루나 다카기
히로유키 소노다
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제이씨알 파마 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 세포, 조직, 또는 생체 내에 있어서 발현시키기 위해서 이용되는, 이러한 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 또한, 플라스미드의 형태, 재조합 바이러스 비리온에 내포된 형태, 또는 리포솜, 지질 나노입자에 내포된 형태의, 이러한 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 또한, 이러한 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 핵산 분자의 의약으로서의 사용에 관한 것이다.

Description

리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 유전자가 짜넣어진 핵산 분자
본 발명은, 리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 세포, 조직, 또는 생체 내에 있어서 기능시키기 위해서 이용되는, 이러한 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 핵산 분자에 관한 것이고, 예를 들어, AAV 바이러스 벡터계에 있어서의, 이러한 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자가 짜넣어진 T 벡터, 렌티바이러스 벡터계에 있어서의, 이러한 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자가 짜넣어진 벡터 플라스미드에 관한 것이다.
의약으로서 이용되고 있는 재조합 단백질의 대부분은, 피하 주사, 근육내 주사, 정맥내 주사 등의 비경구적 수단에 의해 환자에게 투여되고 있다. 환자가 만성 질환인 경우, 의약의 투여는 장기에 걸쳐 반복하여 행해지는 것이 필요하므로, 투여가 비경구적 수단에 의한 것인 경우, 환자가 강요당하는 부담은 크다.
재조합 단백질 중에는, 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질인 것이 있다. 이러한 융합 단백질로서, 예를 들어, 항체와 리소좀 효소의 융합 단백질을 들 수 있다(특허문헌 1~5, 비특허문헌 1).
리소좀병은, 리소좀에 존재해야 할 리소좀 효소를 코딩하는 유전자의 이상에 의해, 리소좀 효소의 활성이 감소되거나 또는 결실되는 것을 원인으로 하는 유전자 질환이다. 리소좀병의 환자에게는, 재조합체 리소좀 효소를 정맥내 주사에 의해 투여하여, 감소 또는 결실되어 있는 리소좀 효소를 보충하는, 이른바 효소 보충 요법이 행해지고 있다. 유전자 질환인 리소좀병의 환자는, 이 효소 보충 요법을 생애에 걸쳐 받을 필요가 있다.
리소좀병 중에는 뇌에 장애가 미치는 것이 있다. 뇌의 장애를 치료하기 위해서는, 뇌 내에 리소좀 효소를 보충할 필요가 있지만, 정맥내 주사에 의해 투여된 리소좀 효소는 혈액뇌 관문(BBB)을 거의 통과하지 않기 때문에, 뇌 내에 리소좀 효소를 보충할 수는 없다.
리소좀 효소를 뇌 내에 보충하기 위한 방법으로서, 리소좀 효소를 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 분자를 항원으로서 인식하는 항체와 결합시킨 융합 단백질로 하고, 이것을 정맥내 주사에 의해 투여하는 방법이 보고되어 있다(비특허문헌 2). 이러한 융합 단백질은, 항체 부분을 개재시켜 혈관 내피 세포의 표면에 결합하고, 추가로 BBB를 통과하여 뇌 내에 도달할 수 있다. 따라서, 이러한 융합 단백질에 의해, 뇌 내에 리소좀 효소를 보충할 수 있다. 리소좀 효소를 이와 같은 융합 단백질로 했을 경우에도, 유전자 질환인 리소좀병의 환자는, 이 융합 단백질에 의한 효소 보충 요법을 생애에 걸쳐 받을 필요가 있다.
WO2016/208695 WO2018/124121 US20070082380 US20090053219 US20110110935
Sonoda H. et al., Mol Ther. 26. 1366-74 (2018) Okuyama T. et al., Mol Ther. 26. 27. 456-64 (2019)
본 발명의 하나의 목적은, 리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 생체 내에 있어서 발현시키기 위해서 이용되는, 이러한 융합 단백질을 코딩하는 유전자가 짜넣어진 바이러스 벡터를 제공하는 것이다.
상기 목적을 위한 연구에 있어서, 본 발명자들은, 항체와 인간 리소좀 효소의 일종인 인간 이두론산-2-설파타제를 결합시킨 단백질을 코딩하는 유전자를 AAV 바이러스 벡터계에 있어서의 T 벡터에 짜넣고, 이 T 벡터를 이용하여 제작한 rAAV 비리온을 감염시킨 포유동물의 생체 내 또는 배양 세포에 있어서, 항체와 인간 리소좀 효소의 융합 단백질이 발현됨을 발견하여, 본 발명을 완성했다. 즉, 본 발명은 이하를 포함하는 것이다.
1. 이하의 (1)~(6) 중 어느 하나의 염기 서열을 포함하는 핵산 분자:
(1) 제1 역방향 말단 반복(ITR) 또는 그 기능적 등가물을 포함하는 염기 서열, 그 하류에 리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열, 더 하류에 제2 역방향 말단 반복(ITR) 또는 그 기능적 등가물을 포함하는 염기 서열;
(2) 제1 역방향 말단 반복(ITR) 또는 그 기능적 등가물을 포함하는 염기 서열, 그 하류에 유전자 발현 제어 부위를 포함하는 염기 서열, 더 하류에 리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열, 더 하류에 제2 역방향 말단 반복(ITR) 또는 그 기능적 등가물을 포함하는 염기 서열;
(3) 제1 긴 말단 반복(LTR) 또는 그 기능적 등가물을 포함하는 염기 서열, 그 하류에 리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열, 더 하류에 제2 긴 말단 반복(LTR) 또는 그 기능적 등가물을 포함하는 염기 서열;
(4) 제1 긴 말단 반복(LTR) 또는 그 기능적 등가물을 포함하는 염기 서열, 그 하류에 유전자 발현 제어 부위를 포함하는 염기 서열, 더 하류에 리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열, 더 하류에 제2 긴 말단 반복(LTR) 또는 그 기능적 등가물을 포함하는 염기 서열;
(5) 리더 또는 그 기능적 등가물을 포함하는 염기 서열, 그 하류에 리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열, 더 하류에 트레일러 또는 그 기능적 등가물을 포함하는 염기 서열; 또는
(6) 리더 또는 그 기능적 등가물을 포함하는 염기 서열, 그 하류에 유전자 발현 제어 부위를 포함하는 염기 서열, 더 하류에 리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열, 더 하류에 트레일러 또는 그 기능적 등가물을 포함하는 염기 서열.
2. 해당 리간드가 항체인, 상기 1의 핵산 분자.
3. 상기 2의 핵산 분자로서, 이하의 (1)~(4)로부터 선택되는 것:
(1) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 항체의 중쇄의 C말단에 생리 활성을 갖는 단백질이 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열과, 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것;
(2) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 항체의 중쇄의 N말단에 생리 활성을 갖는 단백질이 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열과, 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것;
(3) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 항체의 경쇄의 C말단에 생리 활성을 갖는 단백질이 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열과, 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것; 또는
(4) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 항체의 경쇄의 N말단에 생리 활성을 갖는 단백질이 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열과, 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것.
4. 상기 2에 기재된 핵산 분자로서, 이하의 (1)~(4)로부터 선택되는 것:
(1) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 항체의 중쇄의 C말단에 생리 활성을 갖는 단백질이 링커를 개재시켜 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열과, 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것;
(2) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 항체의 중쇄의 N말단에 생리 활성을 갖는 단백질이 링커를 개재시켜 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열과, 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것;
(3) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 항체의 경쇄의 C말단에 생리 활성을 갖는 단백질이 링커를 개재시켜 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열과, 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것; 또는
(4) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 항체의 경쇄의 N말단에 생리 활성을 갖는 단백질이 링커를 개재시켜 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열과, 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것.
5. 해당 링커가, 1~50개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩타이드인, 상기 4에 기재된 핵산 분자.
6. 해당 링커가, 1개의 글리신, 1개의 세린, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 1의 아미노산 서열, 서열 번호 2의 아미노산 서열, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 2~10개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 펩타이드인, 상기 5에 기재된 핵산 분자.
7. 상기 2에 기재된 핵산 분자로서, 이하의 (1)~(4)로부터 선택되는 것:
(1) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 항체의 경쇄의 C말단에 제2 링커를 개재시켜 항체의 중쇄가 결합하고, 추가로 그 C말단에 생리 활성을 갖는 단백질이 직접 또는 링커를 개재시켜 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것;
(2) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 항체의 중쇄의 C말단에 제2 링커를 개재시켜 항체의 경쇄가 결합하고, 추가로 그 C말단에 생리 활성을 갖는 단백질이 직접 또는 링커를 개재시켜 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것;
(3) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 생리 활성을 갖는 단백질의 C말단에 직접 또는 링커를 개재시켜 항체의 중쇄가 결합하고, 추가로 그 C말단에 제2 링커를 개재시켜 항체의 경쇄가 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것; 또는
(4) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 생리 활성을 갖는 단백질의 C말단에 직접 또는 링커를 개재시켜 항체의 경쇄가 결합하고, 추가로 그 C말단에 제2 링커를 개재시켜 항체의 중쇄가 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것.
8. 해당 링커가, 1~50개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩타이드인, 상기 7에 기재된 핵산 분자.
9. 해당 링커가, 1개의 글리신, 1개의 세린, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 1의 아미노산 서열, 서열 번호 2의 아미노산 서열, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 2~10개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 펩타이드인, 상기 8에 기재된 핵산 분자.
10. 해당 제2 링커가, 8~50개의 아미노산 잔기로 이루어지는 것인, 상기 9에 기재된 핵산 분자.
11. 해당 제2 링커가, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3의 각 아미노산 서열, 서열 번호 1의 아미노산 서열의 3개가 연속하여 이루어지는 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 2~10개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 상기 8에 기재된 핵산 분자.
12. 상기 3에 기재된 핵산 분자로서, 이하의 (1)~(4)로부터 선택되는 것:
(1) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 해당 항체의 중쇄의 C말단에 해당 생리 활성을 갖는 단백질이 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열, 그 하류에 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열, 추가로 그 하류에 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것;
(2) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 해당 항체의 중쇄의 N말단에 해당 생리 활성을 갖는 단백질이 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열, 그 하류에 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열, 추가로 그 하류에 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것;
(3) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 해당 항체의 경쇄의 C말단에 해당 생리 활성을 갖는 단백질이 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열, 그 하류에 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열, 추가로 그 하류에 해당 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것; 또는
(4) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 해당 항체의 경쇄의 N말단에 해당 생리 활성을 갖는 단백질이 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열, 그 하류에 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열, 추가로 그 하류에 해당 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것.
13. 상기 4~6 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자로서, 이하의 (1)~(4)로부터 선택되는 것:
(1) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 해당 항체의 중쇄의 C말단에 해당 생리 활성을 갖는 단백질이 링커를 개재시켜 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열, 그 하류에 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열, 추가로 그 하류에 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것;
(2) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 해당 항체의 중쇄의 N말단에 해당 생리 활성을 갖는 단백질이 링커를 개재시켜 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열, 그 하류에 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열, 추가로 그 하류에 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것;
(3) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 해당 항체의 경쇄의 C말단에 해당 생리 활성을 갖는 단백질이 링커를 개재시켜 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열, 그 하류에 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열, 추가로 그 하류에 해당 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것; 또는
(4) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 해당 항체의 경쇄의 N말단에 해당 생리 활성을 갖는 단백질이 링커를 개재시켜 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열, 그 하류에 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열, 추가로 그 하류에 해당 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것.
14. 해당 내부 리보솜 결합 부위가, 피코르나 바이러스과의 바이러스, 구제역 바이러스, A형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 코로나 바이러스, 소 장내 바이러스, 사일러의 쥐 뇌척수염 바이러스, 콕사키 B형 바이러스, 인간 면역글로불린 중쇄 결합 단백질 유전자, 초파리 안테나페디아 유전자, 초파리 울트라비토랙스 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 바이러스 또는 유전자의 5＇ 비번역 영역에서 유래하는 것인, 상기 12 또는 13에 기재된 핵산 분자.
15. 해당 내부 리보솜 결합 부위가, 피코르나 바이러스과의 바이러스의 5＇ 비번역 영역에서 유래하는 것인, 상기 12 또는 13에 기재된 핵산 분자.
16. 해당 항체가, 항원 결합성 단편인, 상기 2~14 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자.
17. 해당 항체가, Fab인, 상기 2~14 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자.
18. 해당 항체가, 단일 도메인 항체인, 상기 2에 기재된 핵산 분자.
19. 해당 항체가, 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 단백질에 대해서 특이적인 친화성을 갖는 것인, 상기 2~18 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자.
20. 해당 혈관 내피 세포가, 뇌혈관 내피 세포인 상기 19에 기재된 핵산 분자.
21. 해당 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 단백질이, 트랜스페린 수용체, 인슐린 수용체, 렙틴 수용체, 인슐린양 성장 인자 I 수용체, 인슐린양 성장 인자 II 수용체, 리포단백질 수용체, 포도당 수송 담체 1, 유기 음이온 트랜스포터, 모노카복실산 트랜스포터, 저밀도 리포단백질 수용체 관련 단백질 1, 저밀도 리포단백질 수용체 관련 단백질 8, 및 헤파린 결합성 상피 성장 인자양 성장 인자의 막결합형 전구체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 상기 19 또는 20에 기재된 핵산 분자.
22. 해당 유전자 발현 제어 부위가, 사이토메갈로바이러스 유래의 프로모터, SV40 초기 프로모터, 인간 신장 인자-1α(EF-1α) 프로모터, 인간 유비퀴틴 C 프로모터, 레트로바이러스의 라우스 육종 바이러스 LTR 프로모터, 다이하이드로엽산 환원 효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세린산 키나제(PGK) 프로모터, 마우스 알부민 프로모터, 인간 알부민 프로모터, 인간 α-1 안티트립신 프로모터, 및 마우스 α 페토프로틴 인핸서/마우스 알부민 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 상기 1~21 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자.
23. 해당 리간드가, 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 단백질에 대해서 특이적인 친화성을 갖는 것인, 상기 1의 핵산 분자.
24. 해당 혈관 내피 세포가, 뇌혈관 내피 세포인 상기 23에 기재된 핵산 분자.
25. 해당 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 단백질이, 트랜스페린 수용체, 인슐린 수용체, 렙틴 수용체, 인슐린양 성장 인자 I 수용체, 인슐린양 성장 인자 II 수용체, 리포단백질 수용체, 포도당 수송 담체 1, 유기 음이온 트랜스포터, 모노카복실산 트랜스포터, 저밀도 리포단백질 수용체 관련 단백질 1, 저밀도 리포단백질 수용체 관련 단백질 8, 및 헤파린 결합성 상피 성장 인자양 성장 인자의 막결합형 전구체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 상기 23 또는 24에 기재된 핵산 분자.
26. 해당 리간드가, 트랜스페린, 인슐린, 렙틴, 인슐린양 성장 인자 I, 인슐린양 성장 인자 II, 리포단백질, 및 저밀도 리포단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 상기 23 또는 24에 기재된 핵산 분자.
27. 해당 생리 활성을 갖는 단백질이, 성장 호르몬, 리소좀 효소, 소마토메딘, 인슐린, 글루카곤, 사이토카인, 림포카인, 혈액 응고 인자, 항체, 항체와 다른 단백질의 융합 단백질, 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 매크로파지 콜로니 자극 인자(M-CSF), 에리트로포이에틴, 다르베포에틴, 조직 플라스미노겐 액티베이터(t-PA), 트롬보 모듈린, 난포 자극 호르몬(FSH), 성선 자극 호르몬 방출 호르몬(GnRH), 고나도트로핀, DNasel, 갑상선 자극 호르몬(TSH), 신경 성장 인자(NGF), 모양체(毛樣體) 신경 영양 인자(CNTF), 글리아 세포주 신경 영양 인자(GDNF), 뉴로트로핀 3, 뉴로트로핀 4/5, 뉴로트로핀 6, 뉴레귤린 1, 액티빈, 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2), 상피 세포 증식 인자(EGF), 혈관 내피 증식 인자(VEGF), 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 γ, 인터류킨 6, PD-1, PD-1 리간드, 종양괴사 인자 α 수용체(TNF-α 수용체), 베타 아밀로이드를 분해하는 활성을 갖는 효소, 에타넬셉트, 페그비소만트, 메트레렙틴, 아바타셉트, 아스포타제, GLP-1 수용체 아고니스트, 및 항체 의약으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 상기 1~26 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자.
28. 해당 생리 활성을 갖는 단백질이, α-L-이두로니다제, 이두론산-2-설파타제, 글루코세레브로시다제, β-갈락토시다제, GM2 활성화 단백질, β-헥소사미니다제 A, β-헥소사미니다제 B, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스페라제, α-만노시다제, β-만노시다제, 갈락토실세라미다제, 사포신 C, 아릴설파타제 A, α-L-푸코시다제, 아스파르틸글루코사미니다제, α-N-아세틸갈락토사미니다제, 산성 스핑고미엘리나제, α-갈락토시다제 A, β-글루쿠로니다제, 헤파란 N-설파타제, α-N-아세틸글루코사미니다제, 아세틸 CoAα-글루코사미니드 N-아세틸트랜스페라제, N-아세틸글루코사민-6-설파타제, 산성 세라미다제, 아밀로-1,6-글루코시다제, 시알리다제, 팔미토일 단백질 싸이오에스테라제-1, 트라이펩티딜펩티다제-1, 하이알루로니다제-1, CLN1 및 CLN2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 상기 1~26 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자.
29. 해당 제1 역방향 말단 반복 및 해당 제2 역방향 말단 반복이, 아데노 수반 바이러스에서 유래하는 것, 아데노바이러스에서 유래하는 것, 또는 그들의 변이체인 것인, 상기 1~28 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자.
30. 해당 제1 역방향 말단 반복이 서열 번호 4로 나타나는 염기 서열을 포함하고, 해당 제2 역방향 말단 반복이 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열을 포함하는 것인, 상기 1~28 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자.
31. 해당 제1 역방향 말단 반복이 이하의 (1)~(3)으로부터 선택되는 것이고, 및
해당 제2 역방향 말단 반복이 이하의 (4)~(6)으로부터 선택되는 것인, 상기 1~28 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자:
(1) 서열 번호 4로 나타나는 염기 서열과 80% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것,
(2) 서열 번호 4로 나타나는 염기 서열과 90% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것, 또는
(3) 서열 번호 4로 나타나는 염기 서열에 1~20개의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 가해진 것; 및
(4) 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열과 80% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것,
(5) 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열과 90% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것, 또는
(6) 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열에 1~20개의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 가해진 것.
32. 해당 제1 역방향 말단 반복의 기능적 등가물이 서열 번호 6으로 나타나는 염기 서열을 포함하고, 해당 제2 역방향 말단 반복의 기능적 등가물이 서열 번호 7로 나타나는 염기 서열을 포함하는 것인, 상기 1~28 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자.
33. 해당 제1 역방향 말단 반복의 기능적 등가물이 이하의 (1)~(3)으로부터 선택되는 것이고, 및
해당 제2 역방향 말단 반복의 기능적 등가물이 이하의 (4)~(6)으로부터 선택되는 것인, 상기 1~28 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자:
(1) 서열 번호 6으로 나타나는 염기 서열과 80% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것,
(2) 서열 번호 6으로 나타나는 염기 서열과 90% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것, 또는
(3) 서열 번호 6으로 나타나는 염기 서열에 1~20개의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 가해진 것; 및
(4) 서열 번호 7로 나타나는 염기 서열과 80% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것,
(5) 서열 번호 7로 나타나는 염기 서열과 90% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것, 또는
(6) 서열 번호 7로 나타나는 염기 서열에 1~20개의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 가해진 것.
34. 해당 제1 긴 말단 반복 및 해당 제2 긴 말단 반복이, 렌티바이러스 또는 레트로바이러스에서 유래하는 것 또는 그 변이체인, 상기 1~28 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자.
35. 해당 제1 긴 말단 반복이 서열 번호 43으로 나타나는 염기 서열을 포함하고, 해당 제2 긴 말단 반복이 서열 번호 44로 나타나는 염기 서열을 포함하는 것인, 상기 1~28 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자.
36. 해당 제1 긴 말단 반복이 이하의 (1)~(3)으로부터 선택되는 것이고, 및 해당 제2 긴 말단 반복이 이하의 (4)~(6)으로부터 선택되는 것인, 상기 1~28 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자:
(1) 서열 번호 43으로 나타나는 염기 서열과 80% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것,
(2) 서열 번호 43으로 나타나는 염기 서열과 90% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것, 또는
(3) 서열 번호 43으로 나타나는 염기 서열에 1~20개의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 가해진 것; 및
(4) 서열 번호 44로 나타나는 염기 서열과 80% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것,
(5) 서열 번호 44로 나타나는 염기 서열과 90% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것, 또는
(6) 서열 번호 44로 나타나는 염기 서열에 1~20개의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 가해진 것.
37. 해당 리더 및 해당 트레일러가, 센다이 바이러스에서 유래하는 것 또는 그 변이체인, 상기 1~28 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자.
38. 해당 리더가 서열 번호 45로 나타나는 염기 서열을 포함하고, 해당 트레일러가 서열 번호 46으로 나타나는 염기 서열을 포함하는 것인, 상기 1~28 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자.
39. 해당 리더가 이하의 (1)~(3)으로부터 선택되는 것이고, 및 해당 트레일러가 이하의 (4)~(6)으로부터 선택되는 것인, 상기 1~28 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자:
(1) 서열 번호 45로 나타나는 염기 서열과 80% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것,
(2) 서열 번호 45로 나타나는 염기 서열과 90% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것, 또는
(3) 서열 번호 45로 나타나는 염기 서열에 1~20개의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 가해진 것; 및
(4) 서열 번호 46으로 나타나는 염기 서열과 80% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것,
(5) 서열 번호 47로 나타나는 염기 서열과 90% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것, 또는
(6) 서열 번호 47로 나타나는 염기 서열에 1~20개의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 가해진 것.
40. 상기 1~39 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자가 도입된 세포, 조직 또는 동물.
41. 상기 1~39 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자가 도입된 줄기세포.
42. 간엽계 줄기세포, 치수 유래 줄기세포, 조혈 줄기세포, 배성 줄기세포, 내피 줄기세포, 유선 줄기세포, 장 줄기세포, 간 줄기세포, 췌 줄기세포, 신경 줄기세포, 및 iPS 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 상기 41에 기재된 간세포.
43. 상기 1~39 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자를 포함하는, 플라스미드.
44. 상기 1~39 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자를 포함하는 비리온.
본 발명에 의하면, 예를 들어, 리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 세포, 조직, 또는 생체 내에 있어서 발현시키기 위해서 이용할 수 있는, 이러한 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 핵산 분자를 제공할 수 있다.
[도 1] AAV8-mMAP-Fab-hI2S 벡터(플라스미드)의 구조를 나타내는 모식도
[도 2] pR2(mod)C8 벡터의 구조를 나타내는 모식도
본 발명에 있어서 「핵산 분자」라고 할 때는, 주로, 데옥시리보뉴클레오타이드가 포스포다이에스터 결합에 의해 중합된 것인 DNA, 리보뉴클레오타이드가 포스포다이에스터 결합에 의해 중합된 것인 RNA의 어느 것인가를 말한다.
「핵산 분자」가 DNA인 경우의 DNA는 1중쇄(1본쇄)여도 되고, 또한, 상보쇄를 수반하는 이중쇄여도 된다. DNA가 1중쇄인 경우의, DNA는 (+)쇄여도 (-)쇄여도 된다. DNA를 구성하는 개개의 데옥시리보뉴클레오타이드는, DNA에 포함되는 단백질을 코딩하는 유전자가 포유동물(특히 인간)의 세포 내에서 mRNA로 번역될 수 있는 한, 천연에 존재하는 형태의 것이어도 되고, 천연형에 수식을 가한 것이어도 된다. 본 발명의 일 실시형태에 있어서, DNA를 구성하는 개개의 데옥시리보뉴클레오타이드는, 포유동물(특히 인간)의 세포 내에서, DNA에 포함되는 단백질을 코딩하는 유전자가 mRNA로 번역되고, 또한, DNA의 전부 또는 일부가 복제될 수 있는 것인 한, 천연에 존재하는 형태의 것이어도 되고, 천연형에 수식을 가한 것이어도 된다.
또한, 「핵산 분자」가 RNA인 경우의 RNA는 1중쇄(1본쇄)여도 되고, 상보쇄를 수반하는 이중쇄여도 된다. RNA가 1본쇄인 경우의, RNA는 (+)쇄여도 (-)쇄여도 된다. 본 발명의 일 실시형태에 있어서, RNA를 구성하는 개개의 리보뉴클레오타이드는, RNA에 포함되는 단백질을 코딩하는 유전자가 포유동물(특히 인간)의 세포 내에서 DNA에 역전사될 수 있는 한, 천연에 존재하는 형태의 것이어도 되고, 수식된 것이어도 된다. 또한, 본 발명의 일 실시형태에 있어서, RNA를 구성하는 개개의 리보뉴클레오타이드는, RNA에 포함되는 단백질을 코딩하는 유전자가 포유동물(특히 인간)의 세포 내에서 단백질로 번역될 수 있는 한, 천연에 존재하는 형태의 것이어도 되고, 수식된 것이어도 된다. 리보뉴클레오타이드의 수식은, 예를 들어, RNA의 RNase에 의한 분해를 억제하여, RNA의 세포 내에 있어서의 안정성을 높이기 위해서 행해진다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 역방향 말단 반복(ITR)이라고 할 때는, 바이러스 게놈의 말단에 존재하는, 동일한 서열이 반복하여 존재하는 염기 서열을 말한다. ITR로서 아데노 수반 바이러스에서 유래하는 것, 및 아데노바이러스에서 유래하는 것은 호적하게 이용할 수 있다. 예를 들어, 아데노 수반 바이러스의 ITR은, 대체로 145염기의 쇄길이의 영역이며, 복제 개시점 등으로서 기능한다. 본 발명의 일 실시형태에 있어서, 핵산 분자 중에는, 역방향 말단 반복(ITR)이 2개 존재하고, 각각 제1 역방향 말단 반복(ITR), 제2 역방향 말단 반복(ITR)이라고 한다. 여기에서, 2개의 ITR 사이에, 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 배치했을 때에, 그 5＇측에 위치하는 ITR을 제1 역방향 말단 반복(ITR)이라고 하고, 3＇측에 위치하는 ITR을 제2 역방향 말단 반복(ITR)이라고 한다. 본 발명에 있어서, 역방향 말단 반복(ITR)은, 복제 개시점으로서의 기능, 숙주 세포에의 유전자 삽입 등의, 본래의 ITR의 기능의 적어도 1개를 갖는 것인 한, 어느 쪽의 바이러스 유래의 것이어도 되고, 아데노 수반 바이러스의 ITR은 호적한 것 중 하나이다. 또한 ITR은 야생형의 ITR에 한정하지 않고, 야생형의 ITR을 대체할 수 있는 것인 한, 야생형의 ITR의 염기 서열에 치환, 결실, 부가 등의 개변을 가한 변이체여도 된다.
ITR이 아데노 수반 바이러스인 경우의, AAV의 혈청형에 특별히 한정은 없고, 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11의 어느 것이어도 된다. 예를 들어, 혈청형 2의 AAV의 역방향 말단 반복(ITR)은, 제1 ITR이 서열 번호 4로 나타나는 염기 서열을 포함하고, 제2 ITR이 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열을 포함한다.
또한, ITR은, 야생형의 ITR에 한정하지 않고, 야생형의 ITR의 염기 서열에 치환, 결실, 부가 등의 개변을 가한 것이어도 된다. 야생형의 ITR의 염기 서열의 염기를 다른 염기로 치환하는 경우, 치환하는 염기의 개수는, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~3개이다. 야생형의 ITR의 염기 서열을 결실시키는 경우, 결실시키는 염기의 개수는, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~3개이다. 또한, 이들 염기의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 야생형의 ITR에 염기를 부가하는 경우, ITR의 염기 서열 중 혹은 5＇말단 또는 3＇말단에, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~3개의 염기가 부가된다. 이들 염기의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 ITR의 염기 서열은, 야생형의 ITR의 염기 서열과 바람직하게는 80% 이상의 동일성을 나타내고, 보다 바람직하게는 85% 이상의 동일성을 나타내고, 더 바람직하게는 90% 이상의 동일성을 나타내고, 더 바람직하게는, 95% 이상의 동일성을 나타내고, 더 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 나타낸다.
ITR의 기능적 등가물이란, 기능적으로 ITR 대신에 이용할 수 있는 것을 말한다. ITR의 기능적 등가물은, 야생형의 ITR의 변이체여도 된다. 또한, ITR에 기초하여 인공적으로 구축된 ITR도, ITR을 대체할 수 있는 것인 한, ITR의 기능적 등가물이다.
AAV의 ITR의 기능적 등가물이란, 기능적으로 AAV의 ITR 대신에 이용할 수 있는 것을 말한다. AAV의 ITR의 기능적 등가물은, 야생형의 AAV의 ITR의 변이체여도 된다. 또한, AAV의 ITR에 기초하여 인공적으로 구축된 ITR도, AAV의 ITR을 대체할 수 있는 것인 한, AAV의 ITR의 기능적 등가물이다.
인공적으로 구축된 제1 AAV의 역방향 말단 반복(제1 AAV-ITR)의 기능적 등가물로서, 서열 번호 6으로 나타나는 염기 서열을 갖는 것을 들 수 있다(제1 AAV-ITR의 기능적 등가물). 이 서열 번호 6으로 나타나는 염기 서열에, 치환, 결실, 변이를 가한 것도, 기능적으로 제1 AAV의 ITR 대신에 이용할 수 있는 것인 한, 제1 AAV-ITR의 기능적 등가물에 포함된다. 서열 번호 6으로 나타나는 염기 서열 중의 염기를 다른 염기로 치환하는 경우, 치환하는 염기의 개수는, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~20개, 더 바람직하게는 1~5개, 더 바람직하게는 1~3개이다. 서열 번호 6으로 나타나는 염기 서열 중의 염기를 결실시키는 경우, 결실시키는 염기의 개수는, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~5개, 더 바람직하게는 1~3개이다. 또한, 이들 염기의 치환과 결실을 조합한 변이를 가한 ITR도, 제1 AAV-ITR의 기능적 등가물이다. 서열 번호 6으로 나타나는 염기 서열에 염기를 부가하는 경우, 당해 염기 서열 중 혹은 5＇말단 또는 3＇말단에, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~5개, 더 바람직하게는 1~3개의 염기를 부가한다. 이들 염기의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가한 ITR도, 제1 AAV-ITR의 기능적 등가물에 포함된다. 변이를 가한 ITR의 염기 서열은, 서열 번호 6으로 나타나는 염기 서열과 바람직하게는 80% 이상의 동일성을 나타내고, 보다 바람직하게는 85% 이상의 동일성을 나타내고, 더 바람직하게는 90% 이상의 동일성을 나타내고, 더 바람직하게는, 95% 이상의 동일성을 나타내고, 보다 더 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 나타낸다.
또한, 인공적으로 구축된 제2 역방향 말단 반복(제2 AAV-ITR)의 기능적 등가물로서, 서열 번호 7로 나타나는 염기 서열을 갖는 것을 들 수 있다(제2 AAV-ITR의 기능적 등가물). 이 서열 번호 7로 나타나는 염기 서열에, 치환, 결실, 변이를 가한 것도, 기능적으로 제2 AAV의 ITR 대신에 이용할 수 있는 것인 한, 제2 AAV의 ITR의 기능적 등가물에 포함된다. 서열 번호 7로 나타나는 염기 서열 중의 염기를 다른 염기로 치환하는 경우, 치환하는 염기의 개수는, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~5개, 더 바람직하게는 1~3개이다. 서열 번호 7로 나타나는 염기 서열 중의 염기를 결실시키는 경우, 결실시키는 염기의 개수는, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~5개, 더 바람직하게는 1~3개이다. 또한, 이들 염기의 치환과 결실을 조합한 변이를 가한 ITR도, 제2 AAV의 ITR의 기능적 등가물이다. 서열 번호 7로 나타나는 염기 서열에 염기를 부가하는 경우, 당해 염기 서열 중 혹은 5＇말단 또는 3＇말단에, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~5개, 더 바람직하게는 1~3개의 염기를 부가한다. 이들 염기의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가한 ITR도, 제2 AAV의 ITR의 기능적 등가물에 포함된다. 변이를 가한 ITR의 염기 서열은, 서열 번호 7로 나타나는 염기 서열과 바람직하게는 80% 이상의 동일성을 나타내고, 보다 바람직하게는 85% 이상의 동일성을 나타내고, 더 바람직하게는 90% 이상의 동일성을 나타내고, 더 바람직하게는, 95% 이상의 동일성을 나타내고, 보다 더 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 나타낸다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 긴 말단 반복(LTR)이라고 할 때는, 예를 들어, 진핵생물의 레트로트랜스포존, 또는 레트로바이러스 게놈, 렌티바이러스 게놈 등의 말단에 존재하는, 동일한 서열이 수백 내지 수천회 반복하여 존재하는 염기 서열을 말한다. 본 발명의 일 실시형태에 있어서, 핵산 분자 중에는, 긴 말단 반복(LTR)이 2개 존재하고, 각각 제1 긴 말단 반복(LTR), 제2 긴 말단 반복(LTR)이라고 한다. 여기에서, 2개의 LTR 사이에, 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 배치했을 때에, 그 5＇측에 위치하는 LTR을 제1 긴 말단 반복(LTR)이라고 하고, 3＇측에 위치하는 LTR을 제2 긴 말단 반복(LTR)이라고 한다. 본 발명에 있어서, 긴 말단 반복(LTR)은, 복제 개시점으로서의 기능, 숙주 세포에의 유전자 삽입 등의, 본래의 LTR의 기능의 적어도 1개를 갖는 것인 한, 어느 쪽의 바이러스 유래의 것이어도 되고, 호적한 것으로서 레트로바이러스 게놈 및 렌티바이러스를 들 수 있다. 또한 LTR은 야생형의 LTR에 한정하지 않고, 야생형의 LTR을 대체할 수 있는 것인 한, 야생형의 LTR의 염기 서열에 치환, 결실, 부가 등의 개변을 가한 변이체여도 된다.
야생형의 LTR의 염기 서열의 염기를 다른 염기로 치환하는 경우, 치환하는 염기의 개수는, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~3개이다. 야생형의 LTR의 염기 서열을 결실시키는 경우, 결실시키는 염기의 개수는, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~3개이다. 또한, 이들 염기의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 야생형의 LTR에 염기를 부가하는 경우, LTR의 염기 서열 중 혹은 5＇말단 또는 3＇말단에, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~3개의 염기가 부가된다. 이들 염기의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 LTR의 염기 서열은, 야생형의 LTR의 염기 서열과 바람직하게는 80% 이상의 동일성을 나타내고, 보다 바람직하게는 85% 이상의 동일성을 나타내고, 더 바람직하게는 90% 이상의 동일성을 나타내고, 더 바람직하게는, 95% 이상의 동일성을 나타내고, 보다 더 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 나타낸다.
LTR의 기능적 등가물이란, 기능적으로 LTR 대신에 이용할 수 있는 것을 말한다. LTR의 기능적 등가물은, 야생형의 LTR의 변이체여도 된다. 또한, LTR에 기초하여 인공적으로 구축된 LTR도, LTR을 대체할 수 있는 것인 한, LTR의 기능적 등가물이다.
렌티바이러스의 LTR의 기능적 등가물이란, 기능적으로 렌티바이러스의 LTR 대신에 이용할 수 있는 것을 말한다. 렌티바이러스의 LTR의 기능적 등가물은, 야생형의 렌티바이러스의 LTR의 변이체여도 된다. 또한, 렌티바이러스의 LTR에 기초하여 인공적으로 구축된 LTR도, 렌티바이러스의 LTR을 대체할 수 있는 것인 한, 렌티바이러스의 LTR의 기능적 등가물이다.
레트로바이러스의 LTR의 기능적 등가물이란, 기능적으로 레트로바이러스의 LTR 대신에 이용할 수 있는 것을 말한다. 레트로바이러스의 LTR의 기능적 등가물은, 야생형의 레트로바이러스의 LTR의 변이체여도 된다. 또한, 레트로바이러스의 LTR에 기초하여 인공적으로 구축된 LTR도, 레트로바이러스의 LTR을 대체할 수 있는 것인 한, 레트로바이러스의 LTR의 기능적 등가물이다.
제1 LTR의 기능적 등가물로서, 서열 번호 43으로 나타나는 염기 서열을 갖는 것을 들 수 있다. 이 서열 번호 43으로 나타나는 염기 서열에, 치환, 결실, 변이를 가한 것도, 기능적으로 제1 LTR로서 이용할 수 있는 것인 한, 제1 LTR의 기능적 등가물에 포함된다. 서열 번호 43으로 나타나는 염기 서열 중의 염기를 다른 염기로 치환하는 경우, 치환하는 염기의 개수는, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~5개, 더 바람직하게는 1~3개이다. 서열 번호 43으로 나타나는 염기 서열 중의 염기를 결실시키는 경우, 결실시키는 염기의 개수는, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~5개, 더 바람직하게는 1~3개이다. 또한, 이들 염기의 치환과 결실을 조합한 변이를 가한 LTR도, 제1 LTR의 기능적 등가물이다. 서열 번호 43으로 나타나는 염기 서열에 염기를 부가하는 경우, 당해 염기 서열 중 혹은 5＇말단 또는 3＇말단에, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~5개, 더 바람직하게는 1~3개의 염기를 부가한다. 이들 염기의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가한 LTR도, 제1 LTR의 기능적 등가물에 포함된다. 변이를 가한 LTR의 염기 서열은, 서열 번호 43으로 나타나는 염기 서열과 바람직하게는 80% 이상의 동일성을 나타내고, 보다 바람직하게는 85% 이상의 동일성을 나타내고, 더 바람직하게는 90% 이상의 동일성을 나타내고, 더 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 나타내고, 보다 더 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 나타낸다.
또한, 제2 LTR의 기능적 등가물로서, 서열 번호 44로 나타나는 염기 서열을 갖는 것을 들 수 있다. 이 서열 번호 44로 나타나는 염기 서열에, 치환, 결실, 변이를 가한 것도, 기능적으로 제2 LTR로서 이용할 수 있는 것인 한, 제2 LTR의 기능적 등가물에 포함된다. 서열 번호 44로 나타나는 염기 서열 중의 염기를 다른 염기로 치환하는 경우, 치환하는 염기의 개수는, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~5개, 더 바람직하게는 1~3개이다. 서열 번호 44로 나타나는 염기 서열 중의 염기를 결실시키는 경우, 결실시키는 염기의 개수는, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~5개, 더 바람직하게는 1~3개이다. 또한, 이들 염기의 치환과 결실을 조합한 변이를 가한 LTR도, 제2 LTR의 기능적 등가물이다. 서열 번호 44로 나타나는 염기 서열에 염기를 부가하는 경우, 당해 염기 서열 중 혹은 5＇말단 또는 3＇말단에, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~5개, 더 바람직하게는 1~3개의 염기를 부가한다. 이들 염기의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가한 LTR도, 제2 LTR의 기능적 등가물에 포함된다. 변이를 가한 LTR의 염기 서열은, 서열 번호 44로 나타나는 염기 서열과 바람직하게는 80% 이상의 동일성을 나타내고, 보다 바람직하게는 85% 이상의 동일성을 나타내고, 더 바람직하게는 90% 이상의 동일성을 나타내고, 더 바람직하게는, 95% 이상의 동일성을 나타내고, 보다 더 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 나타낸다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 리더 및 트레일러라고 할 때는, 바이러스 게놈의 말단에 존재하는, 서로 부분적으로 상보인 염기 서열을 말한다. 리더 및 트레일러로서, 센다이 바이러스에서 유래하는 것은 호적하게 이용할 수 있다. 센다이 바이러스의 리더 및 트레일러는, 어느 쪽도 약 50염기의 쇄길이의 영역이다. 본 발명의 일 실시형태에 있어서, 융합 단백질을 코딩하는 유전자의 5＇측에 리더, 3＇측에 트레일러가 위치한다. 또한 리더 및/또는 트레일러는, 야생형의 것을 대체할 수 있는 것인 한, 야생형의 것의 염기 서열에 치환, 결실, 부가 등의 개변을 가한 변이체여도 된다.
리더의 기능적 등가물이란, 기능적으로 리더 대신에 이용할 수 있는 것을 말한다. 리더의 기능적 등가물은, 야생형의 리더의 LTR의 변이체여도 된다. 또한, 리더에 기초하여 인공적으로 구축된 리더도, 리더를 대체할 수 있는 것인 한, 리더의 기능적 등가물이다. 트레일러에 대해서도 마찬가지이다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서 호적하게 이용되는 것으로서, 서열 번호 45로 나타나는 염기 서열을 갖는 센다이 바이러스 유래의 리더와, 서열 번호 46으로 나타나는 염기 서열을 갖는 센다이 바이러스 유래의 트레일러를 들 수 있다.
야생형의 센다이 바이러스 유래의 리더 및 트레일러에 변이를 가한 것도, 본 발명에 있어서 호적하게 사용할 수 있다. 염기 서열의 염기를 다른 염기로 치환하는 경우, 치환하는 염기의 개수는, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~3개이다. 야생형의 리더 또는/및 트레일러의 염기 서열을 결실시키는 경우, 결실시키는 염기의 개수는, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~3개이다. 또한, 이들 염기의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 염기를 부가하는 경우, 리더 또는/및 트레일러의 염기 서열 중 혹은 5＇말단 또는 3＇말단에, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~3개의 염기가 부가된다. 이들 염기의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 염기 서열은, 야생형의 염기 서열과 바람직하게는 80% 이상의 동일성을 나타내고, 보다 바람직하게는 85% 이상의 동일성을 나타내고, 더 바람직하게는 90% 이상의 동일성을 나타내고, 더 바람직하게는, 95% 이상의 동일성을 나타내고, 보다 더 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 나타낸다. 센다이 바이러스 유래의 리더 및 트레일러에의 변이의 도입의 형태는, 다른 바이러스 유래의 리더 및 트레일러에의 변이의 도입에도 적용할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 융합 단백질의 유전자의 발현을 제어하는 유전자 발현 제어 부위를 포함하는 염기 서열로서 이용할 수 있는 염기 서열에, 그것이 융합 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되는 목적하는 포유동물(특히 인간)의 세포, 조직 또는 생체 내에서, 이 융합 단백질을 발현시킬 수 있는 것인 한, 특별히 제한은 없지만, 사이토메갈로바이러스 유래의 프로모터(임의 선택으로 인핸서를 포함한다), SV40 초기 프로모터, 인간 신장 인자-1α(EF-1α) 프로모터, 인간 유비퀴틴 C 프로모터, 레트로바이러스의 라우스 육종 바이러스 LTR 프로모터, 다이하이드로엽산 환원 효소 프로모터, 및 β-액틴 프로모터, 포스포글리세린산 키나제(PGK) 프로모터, 마우스 알부민 프로모터, 인간 알부민 프로모터, 및 인간 α-1 안티트립신 프로모터를 포함하는 것이 호적하다. 예를 들어, 마우스 α 페토프로틴 인핸서의 하류에 마우스 알부민 프로모터를 포함하는 서열 번호 8로 나타나는 염기 서열을 갖는 합성 프로모터(마우스 α 페토프로틴 인핸서/마우스 알부민 프로모터)는 유전자 발현 제어 부위로서 호적하게 이용할 수 있다. 마우스 α 페토프로틴 인핸서/마우스 알부민 프로모터의 하류에 서열 번호 9로 나타나는 염기 서열을 갖는 닭 β 액틴/MVM 키메라 인트론을 그 하류에 배치시켜도 된다. 이러한 인트론을 배치하는 것에 의해, 유전자 발현 제어 부위에서 제어되는 단백질의 발현량을 증가시킬 수 있다. 한편, 서열 번호 8로 나타나는 염기 서열에 있어서, 1~219번째의 염기 서열이 마우스 α 페토프로틴 인핸서이며, 241~549번째의 염기 서열이 마우스 알부민 프로모터이다.
유전자 제어 부위는, 장기 특이적 또는 세포종 특이적으로 발현하는 유전자의 프로모터여도 된다. 장기 특이적 발현 프로모터 또는 세포종 특이적 발현 프로모터를 이용하는 것에 의해, 핵산 분자에 짜넣어진 융합 단백질을 코딩하는 유전자를, 소망의 장기 또는 세포에서 특이적으로 발현시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에 있어서, 유전자 제어 부위는, 핵산 분자에 코딩되는 시스트론이 복수 존재하는 경우, 각각의 시스트론마다 배치된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 「내부 리보솜 결합 부위」란, mRNA쇄의 내부에 존재하는, 리보솜이 직접 결합하고 또한 캡 구조 비의존성으로 번역을 개시 할 수 있는 영역(구조), 또는 전사되는 것에 의해 해당 영역을 생기게 하는 DNA쇄의 영역(구조)이다. 또한, 본 발명에 있어서, 「내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 유전자」란, 전사되는 것에 의해 해당 영역을 생기게 하는 DNA쇄의 영역(구조)이다. 내부 리보솜 결합 부위는, 일반적으로, IRES(internal ribosome entry site)라고 칭해지고, 피코르나 바이러스과의 바이러스(폴리오바이러스, 라이노바이러스, 마우스 뇌심근염 바이러스 등), 구제역 바이러스, A형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 코로나 바이러스, 소 장내 바이러스, 사일러의 쥐 뇌척수염 바이러스, 콕사키 B형 바이러스 등의 바이러스의 5' 비번역 영역, 인간 면역글로불린 중쇄 결합 단백질, 초파리 안테나페디아, 초파리 울트라비토랙스 등의 유전자의 5' 비번역 영역에 발견되고 있다. 피코르나 바이러스의 경우, 그 IRES는, mRNA의 5' 비번역 영역에 존재하는 약 450bp로 이루어지는 영역이다. 여기에서 「바이러스의 5' 비번역 영역」이란, 바이러스의 mRNA의 5' 비번역 영역, 또는 전사되는 것에 의해 해당 영역을 생기게 하는 DNA쇄의 영역(구조)이다.
일 실시형태에 있어서, 내부 리보솜 결합 부위는, 포유동물(특히 인간)의 세포, 조직 또는 생체 내에서, 내부 리보솜 결합 부위로서 기능하는 것인 한 특별히 한정은 없고, 어느 것도 사용할 수 있다. 그들 중, 바람직하게는 바이러스의 5' 비번역 영역에서 유래하는 내부 리보솜 결합 부위, 보다 바람직하게는 피코르나 바이러스과의 바이러스의 5' 비번역 영역에서 유래하는 내부 리보솜 결합 부위, 더 바람직하게는 마우스 뇌심근염 바이러스의 5' 비번역 영역에서 유래하는 내부 리보솜 결합 부위를 들 수 있다. 마우스 뇌심근염 바이러스의 5' 비번역 영역에서 유래하는 내부 리보솜 결합 부위의 일 실시형태로서 서열 번호 10으로 나타나는 염기 서열을 갖는 것을 들 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 내부 리보솜 결합 부위는, 야생형의 염기 서열을 갖는 것을 그대로 사용할 수 있다. 또한, 이들 야생형의 내부 리보솜 결합 부위의 염기 서열에, 1 또는 2 이상의 변이(예를 들어, 치환, 결손, 또는/및 삽입 등을 말한다.)를 가한 변이형의 내부 리보솜 결합 부위도, 포유동물(특히 인간)의 세포, 조직 또는 생체 내에서, 내부 리보솜 결합 부위로서 기능하는 것인 한, 어느 것도 사용할 수 있다. 또한, 2 이상의 내부 리보솜 결합 부위를 융합시킨 키메라형의 내부 리보솜 결합 부위도, 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 구성하는 단백질은, 생체 내에서 생리 활성을 나타내는 것인 한, 특별히 한정은 없다. 이러한 생리 활성을 갖는 단백질의 호적한 것으로서, 의약으로서 장기에 걸쳐 환자에게 투여되어야 할 것을 들 수 있다. 이러한 의약으로서는, 예를 들어, 성장 호르몬, 리소좀 효소, 소마토메딘, 인슐린, 글루카곤, 사이토카인, 림포카인, 혈액 응고 인자, 항체, 항체와 다른 단백질의 융합 단백질, 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 매크로파지 콜로니 자극 인자(M-CSF), 에리트로포이에틴, 다르베포에틴, 조직 플라스미노겐 액티베이터(t-PA), 트롬보 모듈린, 난포 자극 호르몬(FSH), 성선 자극 호르몬 방출 호르몬(GnRH), 고나도트로핀, DNasel, 갑상선 자극 호르몬(TSH), 신경 성장 인자(NGF), 모양체 신경 영양 인자(CNTF), 글리아 세포주 신경 영양 인자(GDNF), 뉴로트로핀 3, 뉴로트로핀 4/5, 뉴로트로핀 6, 뉴레귤린 1, 액티빈, 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2), 상피 세포 증식 인자(EGF), 혈관 내피 증식 인자(VEGF), 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 γ, 인터류킨 6, PD-1, PD-1 리간드, 종양괴사 인자 α 수용체(TNF-α 수용체), 베타 아밀로이드를 분해하는 활성을 갖는 효소, 에타넬셉트, 페그비소만트, 메트레렙틴, 아바타셉트, 아스포타제, 및 GLP-1 수용체 아고니스트, 어느 것인가의 항체 의약 중 1개를 들 수 있다.
생리 활성을 갖는 단백질이 리소좀 효소인 경우의 호적예로서, α-L-이두로니다제, 이두론산-2-설파타제, 글루코세레브로시다제, β-갈락토시다제, GM2 활성화 단백질, β-헥소사미니다제 A, β-헥소사미니다제 B, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스페라제, α-만노시다제, β-만노시다제, 갈락토실세라미다제, 사포신 C, 아릴설파타제 A, α-L-푸코시다제, 아스파르틸글루코사미니다제, α-N-아세틸갈락토사미니다제, 산성 스핑고미엘리나제, α-갈락토시다제 A, β-글루쿠로니다제, 헤파란 N-설파타제, α-N-아세틸글루코사미니다제, 아세틸 CoAα-글루코사미니드 N-아세틸트랜스페라제, N-아세틸글루코사민-6-설파타제, 산성 세라미다제, 아밀로1,6-글루코시다제, 시알리다제, 팔미토일 단백질 싸이오에스테라제-1, 트라이펩티딜펩티다제-1, 하이알루로니다제-1, CLN1 및 CLN2를 들 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 생리 활성을 갖는 단백질은 인간의 단백질이다. 여기에서, 단백질은 야생형의 것이어도 되고, 그 단백질이 갖는 본래의 생리 활성을 갖는 한, 변이를 가한 것이어도 된다. 여기에서, 어느 단백질이 본래의 생리 활성을 갖는다는 것은, 당해 단백질이, 그 단백질의 야생형 단백질의 생리 활성에 대해서 20% 이상의 생리 활성을 갖는 것을 의미한다. 야생형 단백질의 생리 활성에 대한 당해 생리 활성은, 40% 이상인 것이 보다 바람직하고, 50% 이상인 것이 더 바람직하고, 80% 이상인 것이 보다 더 바람직하고, 90% 이상인 것이 더욱 더 바람직하다.
야생형의 생리 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 경우, 치환하는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~3개이다. 야생형의 당해 단백질의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~3개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 야생형의 당해 단백질에 아미노산을 부가하는 경우, 당해 단백질의 아미노산 서열 중 혹은 N말단 또는 C말단에, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~3개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 당해 단백질의 아미노산 서열은, 야생형의 당해 단백질의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 동일성을 나타내고, 바람직하게는 85% 이상의 동일성을 나타내고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 동일성을 나타내고, 더 바람직하게는, 95% 이상의 동일성을 나타내고, 보다 더 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 나타낸다.
한편, 본 발명에 있어서, 야생형 단백질과 비교했을 때의 각 변이의 위치 및 그 형식(결실, 치환, 부가)은, 야생형 및 변이형 단백질의 아미노산 서열의 얼라인먼트에 의해, 용이하게 확인할 수 있다. 한편, 본 발명에 있어서, 야생형 단백질의 아미노산 서열과 변이형 단백질의 아미노산 서열의 동일성은, 주지된 상동성 계산 알고리즘을 이용하여 용이하게 산출할 수 있다. 예를 들어, 그와 같은 알고리즘으로서, BLAST(Altschul SF. J Mol. Biol. 215. 403-10, (1990)), Pearson 및 Lipman의 유사성 검색법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444 (1988)), Smith 및 Waterman의 국소 상동성 알고리즘(Adv. Appl. Math. 2. 482-9(1981)) 등이 있다.
상기의 단백질의 아미노산 서열 중의 아미노산의 다른 아미노산에 의한 치환은, 예를 들어, 아미노산의 그들의 측쇄 및 화학적 성질에 있어서 관련성이 있는 아미노산 패밀리 내에서 일어나는 것이다. 이와 같은 아미노산 패밀리 내에서의 치환은, 단백질의 기능에 큰 변화를 가져오지 않을(즉, 보존적 아미노산 치환일) 것이 예측된다. 이러한 아미노산 패밀리로서는, 예를 들어 이하의 것이 있다:
(1) 산성 아미노산인 아스파라긴산과 글루타민산,
(2) 염기성 아미노산인 히스티딘, 리신, 및 아르기닌
(3) 방향족 아민산인 페닐알라닌, 티로신, 트립토판,
(4) 수산기를 갖는 아미노산(하이드록시아미노산)인 세린과 트레오닌,
(5) 소수성 아미노산인 메티오닌, 알라닌, 발린, 류신, 및 아이소류신,
(6) 중성의 친수성 아미노산인 시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 및 글루타민,
(7) 펩타이드쇄의 배향에 영향을 주는 아미노산인 글리신과 프롤린,
(8) 아마이드형 아미노산(극성 아미노산)인 아스파라긴과 글루타민,
(9) 지방족 아미노산인, 알라닌, 류신, 아이소류신, 및 발린,
(10) 측쇄가 작은 아미노산인 알라닌, 글리신, 세린, 및 트레오닌,
(11) 측쇄가 특히 작은 아미노산인 알라닌과 글리신.
본 발명에 있어서의, 리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 구성하는 항체에 대해 이하, 상술한다.
본 발명에 있어서, 「리간드」라고 할 때는, 표적이 되는 단백질에 특이적으로 결합하는 단백질을 말한다. 항체는 리간드에 포함된다. 본 발명의 일 실시형태에 있어서의 리간드의 표적이 되는 단백질은, 혈관 내피 세포, 특히 뇌혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 단백질이다. 이러한 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 단백질로서는, 트랜스페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체(IR), 렙틴 수용체, 인슐린양 성장 인자 I 수용체, 인슐린양 성장 인자 II 수용체, 리포단백질 수용체, 포도당 수송 담체 1, 유기 음이온 트랜스포터, 모노카복실산 트랜스포터, 저밀도 리포단백질 수용체 관련 단백질 1, 저밀도 리포단백질 수용체 관련 단백질 8, 및 헤파린 결합성 상피 성장 인자양 성장 인자의 막결합형 전구체를 예시할 수 있다. 더욱이, 유기 음이온 트랜스포터로서는 OATP-F가, 모노카복실산 트랜스포터로서는 MCT-8을 예시할 수 있다. 이들 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 단백질 중에서도, 특히 TfR 및 IR이 호적한 표적이며, TfR이 보다 호적한 표적이다.
항체 이외의 리간드로서 호적한 것으로서, 트랜스페린, 인슐린, 렙틴, 인슐린양 성장 인자 I, 인슐린양 성장 인자 II, 리포단백질, 및 저밀도 리포단백질을 예시할 수 있다. 이들 중에서도, 특히 트랜스페린 및 인슐린이 호적한 리간드이며, 트랜스페린이 보다 호적한 리간드이다. 이들 리간드는 야생형의 단백질이어도 되고, 또한, 표적이 되는 단백질에 특이적으로 결합하는 기능을 갖는 한, 그 단편 또는 변이체여도 된다. 이들 리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질은, 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 표적에 결합할 수 있다. 혈관 내피 세포가 뇌혈관 내피 세포인 경우는, BBB를 통과하여 중추 신경계의 조직에 도달할 수 있게 된다.
항체는, 항원에 특이적으로 결합하는 성질을 갖는 것인 한, 항체의 동물종 등에 특별히 제한은 없지만, 특히 인간 항체 또는 인간화 항체이다. 예를 들어, 항체는, 인간 이외의 포유동물의 항체여도 되고, 또한 인간 항체와 인간 이외의 다른 포유동물의 항체의 키메라 항체여도 된다.
인간 항체는, 그 전체가 인간 유래의 유전자로 코딩되는 항체를 말한다. 단, 유전자의 발현 효율을 상승시키는 등의 목적으로, 원래의 인간의 유전자에 변이를 가한 유전자에 코딩되는 항체도, 인간 항체이다. 또한, 인간 항체를 코딩하는 2개 이상의 유전자를 조합하여, 어느 하나의 인간 항체의 일부를, 다른 인간 항체의 일부로 치환한 항체도, 인간 항체이다. 인간 항체는, 면역글로불린 경쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)과 면역글로불린 중쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는다. 면역글로불린 경쇄의 3개소의 CDR은, N말단측에 있는 것으로부터 순차로 CDR1, CDR2 및 CDR3이라고 한다. 면역글로불린 중쇄의 3개소의 CDR은, N말단측에 있는 것으로부터 순차로 CDR1, CDR2 및 CDR3이라고 한다. 어느 하나의 인간 항체의 CDR을, 그 외의 인간 항체의 CDR로 치환하는 것에 의해, 인간 항체의 항원 특이성, 친화성 등을 개변한 항체도, 인간 항체이다.
본 발명에 있어서, 원래의 인간 항체의 유전자를 개변하는 것에 의해, 원래의 항체의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가한 항체도, 인간 항체라고 한다. 원래의 항체의 아미노산 서열 중의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1~20개이고, 보다 바람직하게는 1~10개이며, 더 바람직하게는 1~5개이고, 보다 더 바람직하게는 1~3개이다. 원래의 항체의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1~20개이고, 보다 바람직하게는 1~10개이며, 더 바람직하게는 1~5개이고, 보다 더 바람직하게는 1~3개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가한 항체도, 인간 항체이다. 아미노산을 부가시키는 경우, 원래의 항체의 아미노산 서열 중 또는 N말단측 혹은 C말단측에, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~5개, 보다 더 바람직하게는 1~3개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가한 항체도, 인간 항체이다. 변이를 가한 항체의 아미노산 서열은, 원래의 항체의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 동일성을 나타내고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 동일성을 나타내고, 더 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 나타내고, 보다 더 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 나타내는 것이다. 즉, 본 발명에 있어서 「인간 유래의 유전자」라고 할 때는, 인간 유래의 원래의 유전자에 더하여, 인간 유래의 원래의 유전자에 개변을 가하는 것에 의해 얻어지는 유전자도 포함된다.
본 발명에 있어서, 「인간화 항체」란 말은, 가변 영역의 일부(예를 들어, 특히 CDR의 전부 또는 일부)의 아미노산 서열이 인간 이외의 포유동물 유래이며, 그 이외의 영역이 인간 유래인 항체를 말한다. 예를 들어, 인간화 항체로서, 인간 항체를 구성하는 면역글로불린 경쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)과 면역글로불린 중쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)을, 다른 포유동물의 CDR에 의해 치환하는 것에 의해 제작된 항체를 들 수 있다. 인간 항체의 적절한 위치에 이식되는 CDR의 유래가 되는 다른 포유동물의 생물종은, 인간 이외의 포유동물인 한 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 마우스, 래트, 토끼, 말, 또는 인간 이외의 영장류이고, 보다 바람직하게는 마우스 및 래트이며, 예를 들어 마우스이다.
본 발명에 있어서, 항체가 인간 항체 또는 인간화 항체인 경우에 대해, 이하 상술한다. 인간 항체 및 인간화 항체의 경쇄에는, λ쇄와 κ쇄가 있다. 항체를 구성하는 경쇄는, λ쇄와 κ쇄의 어느 것이어도 된다. 또한, 인간 항체 및 인간화 항체의 중쇄에는, γ쇄, μ쇄, α쇄, σ쇄 및 ε쇄가 있고, 각각, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE에 대응하고 있다. 항체를 구성하는 중쇄는, γ쇄, μ쇄, α쇄, σ쇄 및 ε쇄의 어느 것이어도 되지만, 바람직하게는 γ쇄이다. 더욱이, 항체의 중쇄의 γ쇄에는, γ1쇄, γ2쇄, γ3쇄 및 γ4쇄가 있고, 각각, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4에 대응하고 있다. 항체를 구성하는 중쇄가 γ쇄인 경우, 그 γ쇄는, γ1쇄, γ2쇄, γ3쇄 및 γ4쇄의 어느 것이어도 되지만, 바람직하게는, γ1쇄 또는 γ4쇄이다. 항체가, 인간화 항체 또는 인간 항체이며, 또한 IgG인 경우, 그 항체의 경쇄는 λ쇄와 κ쇄의 어느 것이어도 되고, 그 항체의 중쇄는, γ1쇄, γ2쇄, γ3쇄 및 γ4쇄의 어느 것이어도 되지만, 바람직하게는, γ1쇄 또는 γ4쇄이다. 예를 들어, 바람직한 항체의 하나의 태양으로서, 경쇄가 λ쇄이며 중쇄가 γ1쇄인 것을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「키메라 항체」란 말은, 2개 이상의 상이한 종에서 유래하는, 2개 이상의 상이한 항체의 단편이 연결되어 이루어지는 항체를 말한다.
인간 항체와 다른 포유동물의 항체의 키메라 항체란, 인간 항체의 일부가 인간 이외의 포유동물의 항체의 일부에 의해 치환된 항체이다. 항체는, 이하에 설명하는 Fc 영역, Fab 영역 및 힌지부로 이루어진다. 이와 같은 키메라 항체의 구체예로서, Fc 영역이 인간 항체에서 유래하는 한편으로 Fab 영역이 다른 포유동물의 항체에서 유래하는 키메라 항체를 들 수 있다. 반대로, Fc 영역이 다른 포유동물에서 유래하는 한편으로 Fab 영역이 인간 항체에서 유래하는 것도 키메라 항체이다. 힌지부는, 인간 항체 또는 다른 포유동물의 항체의 어느 것에서 유래해도 된다. 인간화 항TfR 항체에 대해서도 마찬가지의 것을 말할 수 있다.
또한, 항체는, 가변 영역과 정상 영역으로 이루어진다고 말할 수도 있다. 키메라 항체의 다른 구체예로서, 중쇄의 정상 영역(CH)과 경쇄의 정상 영역(CL)이 인간 항체에서 유래하는 한편으로, 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)이 다른 포유동물의 항체에서 유래하는 것, 반대로, 중쇄의 정상 영역(CH)과 경쇄의 정상 영역(CL)이 다른 포유동물의 항체에서 유래하는 한편으로, 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)이 인간 항체에서 유래하는 것을 들 수 있다. 여기에서, 다른 포유동물의 생물종은, 인간 이외의 포유동물인 한 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 마우스, 래트, 토끼, 말, 또는 인간 이외의 영장류이며, 보다 바람직하게는 마우스이다. 인간화 항TfR 항체에 대해서도 마찬가지의 것을 말할 수 있다.
인간 항체와 마우스 항체의 키메라 항체는, 특히, 「인간/마우스 키메라 항체」라고 한다. 인간/마우스 키메라 항체에는, Fc 영역이 인간 항체에서 유래하는 한편으로 Fab 영역이 마우스 항체에서 유래하는 키메라 항체나, 반대로, Fc 영역이 마우스 항체에서 유래하는 한편으로 Fab 영역이 인간 항체에서 유래하는 키메라 항체를 들 수 있다. 힌지부는, 인간 항체 또는 마우스 항체의 어느 것에서 유래한다. 인간/마우스 키메라 항체의 다른 구체예로서, 중쇄의 정상 영역(CH)과 경쇄의 정상 영역(CL)이 인간 항체에서 유래하는 한편으로, 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)이 마우스 항체에서 유래하는 것, 반대로, 중쇄의 정상 영역(CH)과 경쇄의 정상 영역(CL)이 마우스 항체에서 유래하는 한편으로, 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)이 인간 항체에서 유래하는 것을 들 수 있다. 인간화 항TfR 항체에 대해서도 마찬가지의 것을 말할 수 있다.
항체는, 본래, 2개의 면역글로불린 경쇄와 2개의 면역글로불린 중쇄의 합계 4개의 폴리펩타이드쇄로 이루어지는 기본 구조를 갖는다. 단, 본 발명에 있어서, 「항체」라고 할 때는, 이 기본 구조를 갖는 것에 더하여,
(1) 1개의 면역글로불린 경쇄와 1개의 면역글로불린 중쇄의 합계 2개의 폴리펩타이드쇄로 이루어지는 것이나, 이하에 상술하는 바와 같이,
(2) 면역글로불린 경쇄의 C말단측에 링커를, 그리고 추가로 그 C말단측에 면역글로불린 중쇄를 결합시켜 이루어지는 것인 1본쇄 항체,
(3) 면역글로불린 중쇄의 C말단측에 링커를, 그리고 추가로 그 C말단측에 면역글로불린 경쇄를 결합시켜 이루어지는 것인 1본쇄 항체,
(4) 면역글로불린 중쇄의 가변 영역의 C말단측에 링커를, 그리고 추가로 그 C말단측에 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 결합시켜 이루어지는 것인 1본쇄 항체(scFv), 및
(5) 면역글로불린 경쇄의 가변 영역의 C말단측에 링커를, 그리고 추가로 그 C말단측에 면역글로불린 중쇄의 가변 영역을 결합시켜 이루어지는 것인 1본쇄 항체(scFv)도 포함된다. 또한,
(6) 본래의 의미에서의 항체의 기본 구조로부터 Fc 영역이 결실된 것인 Fab 영역으로 이루어지는 것 및 Fab 영역과 힌지부의 전부 혹은 일부로 이루어지는 것(Fab, F(ab＇) 및 F(ab＇)2를 포함한다), 및
(7) 단일 도메인 항체도, 본 발명에 있어서의 「항체」에 포함된다. 더욱이, 경쇄의 가변 영역과 중쇄의 가변 영역을 링커를 개재시켜 결합시켜 1본쇄 항체로 한 scFv도, 본 발명에 있어서의 항체에 포함된다.
한편, 본 발명에 있어서 「링커」라고 할 때는, 예를 들어, 복수의 아미노산이 펩타이드 결합에 의해 결합한 펩타이드쇄로 이루어지는 것을 말한다. 이러한 펩타이드쇄로 이루어지는 링커는 「펩타이드 링커」라고 할 수도 있다. 「링커」는 본 명세서의 문맥에 있어서 「링커 서열」이라고 바꾸어 말할 수도 있다. 이 링커의 N말단과 다른 단백질의 C말단이 펩타이드 결합으로 결합하고, 당해 링커의 C말단에 추가로 다른 단백질의 N말단이 결합하는 것에 의해, 2개의 단백질이 링커를 개재시켜 결합체를 형성한다.
2개의 경쇄와 2개의 중쇄의 합계 4개의 폴리펩타이드쇄로 이루어지는 기본 구조를 갖는 항체는, 경쇄의 가변 영역(VL)에 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)과 중쇄의 가변 영역(VH)에 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는다. 경쇄의 3개소의 CDR은, N말단측에 있는 것으로부터 순차로 CDR1, CDR2 및 CDR3이라고 한다. 중쇄의 3개소의 CDR도, N말단측에 있는 것으로부터 순차로 CDR1, CDR2 및 CDR3이라고 한다. 단, 이들 CDR의 일부 또는 전부가 불완전하거나, 또는 존재하지 않는 것이어도, 특정의 항원에 특이적으로 결합하는 성질을 갖는 것인 한, 항체에 포함된다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역(VL 및 VH)의 CDR 이외의 영역은, 프레임워크 영역(FR)이라고 한다. FR은, N말단측에 있는 것으로부터 순차로 FR1, FR2, FR3 및 FR4라고 한다. 통상, CDR와 FR은 N말단측으로부터 순차로, FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 존재한다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, Fab란, 가변 영역과 CL 영역(경쇄의 정상 영역)을 포함하는 1개의 경쇄와 가변 영역과 CH1 영역(중쇄의 정상 영역의 부분 1)을 포함하는 1개의 중쇄가, 각각 존재하는 시스테인 잔기끼리로 다이설파이드 결합에 의해 결합한 분자를 말한다. Fab에 있어서, 중쇄는, 가변 영역과 CH1 영역(중쇄의 정상 영역의 부분 1)에 더하여, 추가로 힌지부의 일부를 포함해도 되지만, 이 경우의 힌지부는, 힌지부에 존재하여 항체의 중쇄끼리를 결합하는 시스테인 잔기를 결여하는 것이다. Fab에 있어서, 경쇄와 중쇄는, 경쇄의 정상 영역(CL 영역)에 존재하는 시스테인 잔기와, 중쇄의 정상 영역(CH1 영역) 또는 힌지부에 존재하는 시스테인 잔기 사이에 형성되는 다이설파이드 결합에 의해 결합한다. Fab를 형성하는 중쇄를 Fab 중쇄라고 한다. Fab는, 힌지부에 존재하여 항체의 중쇄끼리를 결합하는 시스테인 잔기를 결여하고 있으므로, 1개의 경쇄와 1개의 중쇄로 이루어진다. Fab를 구성하는 경쇄는, 가변 영역과 CL 영역을 포함한다. Fab를 구성하는 중쇄는, 가변 영역과 CH1 영역으로 이루어지는 것이어도 되고, 가변 영역, CH1 영역에 더하여 힌지부의 일부를 포함하는 것이어도 된다. 단 이 경우, 힌지부에서 2개의 중쇄 사이에 다이설파이드 결합이 형성되지 않도록, 힌지부는 중쇄 사이를 결합하는 시스테인 잔기를 포함하지 않도록 선택된다. F(ab＇)에 있어서는, 그 중쇄는 가변 영역과 CH1 영역에 더하여, 중쇄끼리를 결합하는 시스테인 잔기를 포함하는 힌지부의 전부 또는 일부를 포함한다. F(ab＇)2는 2개의 F(ab＇)가 서로의 힌지부에 존재하는 시스테인 잔기끼리로 다이설파이드 결합에 의해 결합한 분자를 말한다. F(ab＇) 또는 F(ab＇)2를 형성하는 중쇄를 Fab＇중쇄라고 한다. 또한, 복수의 항체가 직접 또는 링커를 개재시켜 결합하여 이루어지는 2량체, 3량체 등의 중합체도, 항체이다. 더욱이, 이들에 한정하지 않고, 항체 분자의 일부를 포함하고, 또한, 항원에 특이적으로 결합하는 성질을 갖는 것은 어느 것도, 본 발명에서 말하는 「항체」에 포함된다. 즉, 본 발명에 있어서 경쇄라고 할 때는, 경쇄에서 유래하고, 그 가변 영역의 모두 또는 일부의 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다. 또한, 중쇄라고 할 때는, 중쇄에서 유래하고, 그 가변 영역의 모두 또는 일부의 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다. 따라서, 가변 영역의 모두 또는 일부의 아미노산 서열을 갖는 한, 예를 들어, Fc 영역이 결실된 것도, 중쇄이다.
또한, 여기에서 Fc 또는 Fc 영역이란, 항체 분자 중의, CH2 영역(중쇄의 정상 영역의 부분 2), 및 CH3 영역(중쇄의 정상 영역의 부분 3)으로 이루어지는 단편을 포함하는 영역을 말한다.
더욱이, 본 발명의 일 실시형태에 있어서의 항체는,
(8) 상기 (6)에서 나타낸 Fab, F(ab＇) 또는 F(ab＇)2를 구성하는 경쇄와 중쇄를, 링커 서열을 개재시켜 결합시켜, 각각 1본쇄 항체로 한 scFab, scF(ab＇), 및 scF(ab＇)2도 포함된다. 여기에서, scFab, scF(ab＇), 및 scF(ab＇)2에 있어서는, 경쇄의 C말단측에 링커 서열을, 그리고 추가로 그 C말단측에 중쇄를 결합시켜 이루어지는 것이어도 되고, 또한, 중쇄의 C말단측에 링커를, 그리고 추가로 그 C말단측에 경쇄를 결합시켜 이루어지는 것이어도 된다. 더욱이, 경쇄의 가변 영역과 중쇄의 가변 영역을 링커를 개재시켜 결합시켜 1본쇄 항체로 한 scFv도, 본 발명에 있어서의 항체에 포함된다. scFv에 있어서는, 경쇄의 가변 영역의 C말단측에 링커 서열을, 그리고 추가로 그 C말단측에 중쇄의 가변 영역을 결합시켜 이루어지는 것이어도 되고, 또한, 중쇄의 가변 영역의 C말단측에 링커 서열을, 그리고 추가로 그 C말단측에 경쇄의 가변 영역을 결합시켜 이루어지는 것이어도 된다.
더욱이, 본 명세서에서 말하는 「항체」에는, 완전장 항체, 상기 (1)~(8)에 나타나는 것에 더하여, (1)~(8)을 포함하는 보다 넓은 개념인, 완전장 항체의 일부가 결손한 것인 항원 결합성 단편(항체 프래그먼트)의 어느 형태도 포함된다. 항원 결합성 단편에는, 중쇄 항체, 경쇄 항체, VHH, VNAR, 및 이들의 일부가 결손한 것도 포함된다.
「항원 결합성 단편」이란 말은, 항원과의 특이적 결합 활성의 적어도 일부를 유지하고 있는 항체의 단편을 말한다. 결합성 단편의 예로서는, Fab, Fab＇, F(ab＇)2, 가변 영역(Fv), 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)을 적당한 링커로 연결시킨 1본쇄 항체(scFv), 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 폴리펩타이드의 2량체인 다이아보디, scFv의 중쇄(H쇄)에 정상 영역의 일부(CH3)가 결합한 것의 2량체인 미니보디, 그 외의 저분자화 항체 등을 포함한다. 단, 항원과의 결합능을 갖고 있는 한 이들 분자로 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 「1본쇄 항체」라고 할 때는, 면역글로불린 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열의 C말단측에 링커가 결합하고, 추가로 그 C말단측에 면역글로불린 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열이 결합하여 이루어지고, 특정의 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 말한다. 또한, 면역글로불린 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열의 C말단측에 링커가 결합하고, 추가로 그 C말단측에 면역글로불린 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열이 결합하여 이루어지고, 특정의 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질도, 본 발명에 있어서의 「1본쇄 항체」이다. 예를 들어, 상기 (2) 및 (3)에 나타나는 것은 1본쇄 항체에 포함된다. 면역글로불린 중쇄의 C말단측에 링커를 개재시켜 면역글로불린 경쇄가 결합한 1본쇄 항체에 있어서는, 통상, 면역글로불린 중쇄는, Fc 영역이 결실하고 있다. 면역글로불린 경쇄의 가변 영역은, 항체의 항원 특이성에 관여하는 상보성 결정 영역(CDR)을 3개 갖고 있다. 마찬가지로, 면역글로불린 중쇄의 가변 영역도, CDR을 3개 갖고 있다. 이들 CDR은, 항체의 항원 특이성을 결정하는 주된 영역이다. 따라서, 1본쇄 항체에는, 면역글로불린 중쇄의 3개의 CDR의 모두와 면역글로불린 경쇄의 3개의 CDR의 모두가 포함되는 것이 바람직하다. 단, 항체의 항원 특이적인 친화성이 유지되는 한, CDR의 1개 또는 복수개를 결실시킨 1본쇄 항체로 할 수도 있다.
1본쇄 항체에 있어서, 면역글로불린의 경쇄와 중쇄 사이에 배치되는 링커는, 바람직하게는 2~50개, 보다 바람직하게는 8~50개, 더 바람직하게는 10~30개, 보다 더 바람직하게는 12~18개 또는 15~25개, 예를 들어 15개 혹은 25개의 아미노산 잔기로 구성되는 펩타이드쇄이다. 그와 같은 링커는, 이것에 의해 양 쇄가 연결되어 이루어지는 항hTfR 항체가 hTfR에 대한 친화성을 유지하는 한, 그 아미노산 서열에 한정은 없지만, 바람직하게는, 글리신만 또는 글리신과 세린으로 구성되는 것이고, 예를 들어, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 13, 또는 이들 아미노산 서열이 2~10회, 혹은 2~5회 반복된 서열을 갖는 것이다. 예를 들어, 면역글로불린 중쇄의 가변 영역의 전체 영역으로 이루어지는 아미노산 서열의 C말단측에, 링커를 개재시켜 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 결합시켜 ScFV로 하는 경우, 서열 번호 13의 서열을 갖는 링커가 호적하게 이용된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서의 항체는, 낙타과 동물(알파카를 포함한다) 유래의 항체이다. 낙타과 동물의 항체에는, 다이설파이드 결합에 의해 연결된 2개의 중쇄로 이루어지는 것이 있다. 이 2개의 중쇄로 이루어지는 항체를 중쇄 항체라고 한다. VHH는, 중쇄 항체를 구성하는 중쇄의 가변 영역을 포함하는 1개의 중쇄로 이루어지는 항체, 또는 중쇄 항체를 구성하는 정상 영역(CH)을 결여하는 1개의 중쇄로 이루어지는 항체이다. VHH도 본 발명의 실시형태에 있어서의 항체의 하나이다. 낙타과 동물 유래의 항체(VHH를 포함한다)를 인간에 투여했을 때의 항원성을 저감시키기 위해서, 낙타과 동물의 항체의 아미노산 서열에 변이를 가한 것도, 본 발명의 일 실시형태에 있어서의 항체이다. 낙타과 동물의 항체의 아미노산에 변이를 가하는 경우, 본 명세서에 기재된 항체에 가할 수 있는 변이와 마찬가지의 변이를 가할 수 있다. 그 외, 다이설파이드 결합에 의해 연결된 2개의 경쇄로 이루어지는 항체도 본 발명의 실시형태에 있어서의 항체의 하나이다. 이 2개의 경쇄로 이루어지는 항체를 경쇄 항체라고 한다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서의 항체는, 상어 유래의 항체이다. 상어의 항체는, 다이설파이드 결합에 의해 연결된 2개의 중쇄로 이루어진다. 이 2개의 중쇄로 이루어지는 항체를 중쇄 항체라고 한다. VNAR은, 중쇄 항체를 구성하는 중쇄의 가변 영역을 포함하는 1개의 중쇄로 이루어지는 항체, 또는 중쇄 항체를 구성하는 정상 영역(CH)을 결여하는 1개의 중쇄로 이루어지는 항체이다. VNAR도 본 발명의 실시형태에 있어서의 항체의 하나이다. 상어 유래의 항체(VNAR을 포함한다)를 인간에 투여했을 때의 항원성을 저감시키기 위해서, 상어의 항체의 아미노산 서열에 변이를 가한 것도, 본 발명의 일 실시형태에 있어서의 항체이다. 상어의 항체의 아미노산에 변이를 가하는 경우, 본 명세서에 기재된 항체에 가할 수 있는 변이와 마찬가지의 변이를 가할 수 있다. 상어의 항체를 인간화한 것도 본 발명의 실시형태에 있어서의 항체의 하나이다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 단일 도메인 항체란, 단일의 가변 영역에서 항원에 특이적으로 결합하는 성질을 갖는 항체를 말한다. 단일 도메인 항체에는, 가변 영역이 중쇄의 가변 영역만으로 이루어지는 항체(중쇄 단일 도메인 항체), 가변 영역이 경쇄의 가변 영역만으로 이루어지는 항체(경쇄 단일 도메인 항체)가 포함된다. VHH, VNAR은 단일 도메인 항체의 일종이다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 구성하는 항체는, 생체 내에서 특정의 항원에 대해서 친화성을 나타내는 것인 한, 특별히 한정은 없다. 예를 들어, 당해 항체는, 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 단백질에 대해서 특이적인 친화성을 갖는 항체이다. 이러한 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 단백질로서는, 트랜스페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체(IR), 렙틴 수용체, 인슐린양 성장 인자 I 수용체, 인슐린양 성장 인자 II 수용체, 리포단백질 수용체, 포도당 수송 담체 1, 유기 음이온 트랜스포터, 모노카복실산 트랜스포터, 저밀도 리포단백질 수용체 관련 단백질 1, 저밀도 리포단백질 수용체 관련 단백질 8, 및 헤파린 결합성 상피 성장 인자양 성장 인자의 막결합형 전구체를 예시할 수 있다. 더욱이, 유기 음이온 트랜스포터로서는 OATP-F를, 모노카복실산 트랜스포터로서는 MCT-8을 예시할 수 있다. 이들 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 단백질 중에서도, 특히 TfR 및 IR이 호적한 타겟이며, TfR이 보다 호적한 타겟이다. 항체가 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 단백질과 결합하는 것인 경우, 융합 단백질은, 혈관 내피 세포에 도입된 후, 여러 가지 조직에까지 도달하여 거기서 생리 활성을 나타낼 수 있으므로, 이러한 융합 단백질은, 여러 가지 조직에서 약효를 발휘시켜야 할 의약으로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 항체가 TfR, IR에 대해서 특이적인 친화성을 갖는 것인 경우, 이러한 융합 단백질은, 근육 내에서 약효를 발휘시켜야 할 의약으로서 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 항체는, 뇌혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 단백질에 대해서 특이적인 친화성을 갖는 항체이다. 이러한 뇌혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 단백질로서는, 트랜스페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체(IR), 렙틴 수용체, 인슐린양 성장 인자 I 수용체, 인슐린양 성장 인자 II 수용체, 리포단백질 수용체, 포도당 수송 담체 1, 유기 음이온 트랜스포터, 모노카복실산 트랜스포터, 저밀도 리포단백질 수용체 관련 단백질 1, 저밀도 리포단백질 수용체 관련 단백질 8, 및 헤파린 결합성 상피 성장 인자양 성장 인자의 막결합형 전구체를 예시할 수 있다. 더욱이, 유기 음이온 트랜스포터로서는 OATP-F를, 모노카복실산 트랜스포터로서는 MCT-8을 예시할 수 있다. 이들 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 단백질 중에서도, 특히 TfR 및 IR이 호적한 타겟이며, TfR이 보다 호적한 타겟이다. 항체가 뇌혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 단백질과 결합하는 것인 경우, 융합 단백질은, BBB를 통과하는 것에 의해 뇌 조직에까지 도달하여 거기서 생리 활성을 나타낼 수 있으므로, 이러한 융합 단백질은, 뇌 내에서 약효를 발휘시켜야 할 의약으로서 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「인간 트랜스페린 수용체」 또는 「hTfR」란 말은, 서열 번호 11에 나타나는 아미노산 서열을 갖는 막단백질을 말한다. 본 발명의 항hTfR 항체는, 그 일 실시태양에 있어서, 서열 번호 11로 나타나는 아미노산 서열 중 N말단측으로부터 89번째의 시스테인 잔기로부터 C말단의 페닐알라닌까지의 부분(hTfR의 세포외 영역)에 대해서 특이적으로 결합하는 것이지만, 이것으로 한정되지 않는다.
일 실시형태에 있어서의 Fab인 항hTfR 항체의 경쇄는, 항hTfR 항체의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열로서, 서열 번호 31 또는 32로 나타나는 아미노산 서열을 갖고, hTfR 항체의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열로서, 서열 번호 33 또는 34로 나타나는 아미노산 서열을 갖고, hTfR 항체의 경쇄 CDR3의 아미노산 서열로서, 서열 번호 35로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 일 실시형태에 있어서의 Fab인 항hTfR 항체의 중쇄는, 항hTfR 항체의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열로서, 서열 번호 36또는 37로 나타나는 아미노산 서열을 갖고, hTfR 항체의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열로서, 서열 번호 38 또는 39로 나타나는 아미노산 서열을 갖고, hTfR 항체의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열로서, 서열 번호 40 또는 41로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것이다.
일 실시형태에 있어서의 Fab인 항hTfR 항체는, 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 경쇄와, 서열 번호 16으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 것이다.
항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질에 있어서의, 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 결합 양식으로서 이하의 (a)~(h)를 예시할 수 있다;
(a) 항체가, 항체의 중쇄의 C말단측에 항체의 경쇄가 결합한 것인 1본쇄 항체이며, 그 1본쇄 항체의 N말단측에 직접 또는 링커를 개재시켜 생리 활성을 갖는 단백질이 결합한 것,
(b) 항체가, 항체의 중쇄의 C말단측에 항체의 경쇄가 결합한 것인 1본쇄 항체이며, 그 1본쇄 항체의 C말단측에 직접 또는 링커를 개재시켜 생리 활성을 갖는 단백질이 결합한 것,
(c) 항체가, 항체의 경쇄의 C말단측에 항체의 중쇄가 결합한 것인 1본쇄 항체이며, 그 1본쇄 항체의 N말단측에 직접 또는 링커를 개재시켜 생리 활성을 갖는 단백질이 결합한 것,
(d) 항체가, 항체의 경쇄의 C말단측에 항체의 중쇄가 결합한 것인 1본쇄 항체이며, 그 1본쇄 항체의 C말단측에 직접 또는 링커를 개재시켜 생리 활성을 갖는 단백질이 결합한 것,
(e) 항체가 적어도 하나의 경쇄와 적어도 하나의 중쇄를 포함하는 항체이며, 그 항체의 경쇄의 C말단측에 직접 또는 링커를 개재시켜 생리 활성을 갖는 단백질이 결합한 것,
(f) 항체가 적어도 하나의 경쇄와 적어도 하나의 중쇄를 포함하는 항체이며, 그 항체의 경쇄의 N말단측에 직접 또는 링커를 개재시켜 생리 활성을 갖는 단백질이 결합한 것,
(g) 항체가 적어도 하나의 경쇄와 적어도 하나의 중쇄를 포함하는 항체이며, 그 항체의 중쇄의 C말단측에 직접 또는 링커를 개재시켜 생리 활성을 갖는 단백질이 결합한 것,
(h) 항체가 적어도 하나의 경쇄와 적어도 하나의 중쇄를 포함하는 항체이며, 그 항체의 중쇄의 N말단측에 직접 또는 링커를 개재시켜 생리 활성을 갖는 단백질이 결합한 것.
상기 (a)~(h)에 있어서, 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질 사이에 링커를 배치하는 경우, 그 서열은, 바람직하게는 1~50개, 보다 바람직하게는 1~17개, 더 바람직하게는 1~10개, 보다 더 바람직하게는 1~5개의 아미노산으로 구성되는 것이지만, 항체에 결합시켜야 할 인간 리소좀 효소에 따라, 링커를 구성하는 아미노산의 개수는, 1개, 2개, 3개, 1~17개, 1~10개, 10~40개, 20~34개, 23~31개, 25~29개 등으로 적절히 조정할 수 있다. 그와 같은 링커는, 이것에 의해 연결된 항체가 항원과의 친화성을 유지하고, 또한 당해 링커에 의해 연결된 단백질이, 생리적 조건하에서 당해 단백질의 생리 활성을 발휘할 수 있는 한, 아미노산 서열에 특별히 한정은 없다. 그 아미노산 서열은 바람직하게는, 글리신과 세린으로 구성되는 것이고, 예를 들어, 글리신 또는 세린의 어느 1개의 아미노산으로 이루어지는 것, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 13, 또는 이들 아미노산 서열이 2~10개, 혹은 2~5개 연속하여 이루어지는 2~50개의 아미노산으로 이루어지는 서열, 2~17개, 2~10개, 10~40개, 20~34개, 23~31개, 25~29개의 아미노산으로 이루어지는 서열 등을 갖는 것이다. 예를 들어, 아미노산 서열 Gly-Ser을 갖는 것, 서열 번호 13으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것, 및 서열 번호 13으로 나타나는 아미노산 서열의 C말단에 Gly-Ser가 부가된 17개의 아미노산으로 이루어지는 것은, 링커로서 호적하게 이용할 수 있다.
한편, 편의상, 본 발명에 있어서, 항체의 경쇄 또는 중쇄와 생리 활성을 갖는 단백질을 결합하는 링커를 간단히 「링커」 또는 「제1 링커」라고 하고, 1본쇄 항체에 있어서 경쇄와 중쇄를 결합하는 링커를 「제2 링커」라고 한다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서의 핵산 분자는, 제1 역방향 말단 반복(ITR)과 제2 역방향 말단 반복(ITR) 사이에, 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 것이다. 이하의 (1)~(4)는 당해 핵산 분자의 예시이다:
(1) 융합 단백질이, 항체의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에 생리 활성을 갖는 단백질을 직접 또는 링커를 개재시켜 결합시킨 결합체와 항체의 경쇄를 포함하는 것이고, 경쇄를 코딩하는 유전자의 하류에 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열, 그 하류에 당해 결합체를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것;
(2) 융합 단백질이, 항체의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에 생리 활성을 갖는 단백질을 직접 또는 링커를 개재시켜 결합시킨 결합체와 항체의 경쇄를 포함하는 것이고, 당해 결합체를 코딩하는 유전자의 하류에 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열, 그 하류에 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것;
(3) 융합 단백질이, 항체의 경쇄의 C말단측 또는 N말단측에 생리 활성을 갖는 단백질을 직접 또는 링커를 개재시켜 결합시킨 결합체와 항체의 중쇄를 포함하는 것이고, 중쇄를 코딩하는 유전자의 하류에 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열, 그 하류에 당해 결합체를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것;
(4) 융합 단백질이, 항체의 경쇄의 C말단측 또는 N말단측에 생리 활성을 갖는 단백질을 직접 또는 링커를 개재시켜 결합시킨 결합체와 항체의 중쇄를 포함하는 것이고, 당해 결합체를 코딩하는 유전자의 하류에 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열, 그 하류에 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것.
상기 (1)~(4)에 있어서, 핵산 분자는, 제1 역방향 말단 반복(ITR)과 융합 단백질을 코딩하는 유전자 사이에, 유전자 발현 제어 부위를 포함하는 염기 서열이 포함하는 것이어도 된다. 또한, 상기 (1)~(4)에 있어서, 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열을, 유전자 발현 제어 부위를 포함하는 염기 서열로 바꿔도 된다. 한편, 이것에 한정하지 않고, 핵산 분자가 2개의 유전자 발현 제어 부위를 갖는 경우, 편의상, 제1 역방향 말단 반복(ITR)측으로부터 순차로, 제1 유전자 발현 제어 부위 및 제1 유전자 발현 제어 부위로 한다. 또한, 상기 (1)~(4)에 있어서, 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열을, 2A 자기 절단 펩타이드를 코딩하는 염기 서열로 바꿔도 된다. 돼지 테스코바이러스(teschovirus) 유래 2A 펩타이드는, 2A 자기 절단 펩타이드의 호적한 일례이다.
항체가 1본쇄 항체인 경우의, 본 발명의 일 실시형태에 있어서의 핵산 분자는, 제1 역방향 말단 반복(ITR)과 제2 역방향 말단 반복(ITR) 사이에, 1본쇄 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 것이다. 이하의 (1)~(4)는 당해 핵산 분자의 예시이다:
(1) 항체의 중쇄의 C말단측에 제2 링커를 개재시켜 경쇄를 결합시키고, 추가로 경쇄의 C말단측에 직접 또는 링커를 개재시켜 생리 활성을 갖는 단백질을 결합시킨 것인 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 것;
(2) 항체의 경쇄의 C말단측에 제2 링커를 개재시켜 중쇄를 결합시키고, 추가로 경쇄의 C말단측에 직접 또는 링커를 개재시켜 생리 활성을 갖는 단백질을 결합시킨 것인 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 것;
(3) 생리 활성을 갖는 단백질의 C말단측에 직접 또는 링커를 개재시켜 항체의 중쇄를 결합시키고, 추가로 중쇄의 C말단측에 경쇄를 결합시킨 것인 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 것;
(4) 생리 활성을 갖는 단백질의 C말단측에 직접 또는 링커를 개재시켜 항체의 경쇄를 결합시키고, 추가로 중쇄의 C말단측에 중쇄를 결합시킨 것인 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 것.
상기 (1)~(4)에 있어서, 핵산 분자는, 제1 역방향 말단 반복(ITR)과 융합 단백질을 코딩하는 유전자 사이에, 유전자 발현 제어 부위를 포함하는 염기 서열이 포함하는 것이어도 된다.
제1 역방향 말단 반복(ITR)과 제2 역방향 말단 반복(ITR)의 사이에, 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 것인 핵산 분자로서, 당해 융합 단백질이, 항체의 중쇄의 C말단측에 생리 활성을 갖는 단백질을 결합시킨 결합체와, 항체의 경쇄를 포함하는 것이고, 경쇄를 코딩하는 유전자의 하류에 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열, 그 하류에 당해 결합체를 코딩하는 유전자를 포함하는 것의 일 실시형태로서, 당해 결합체가, 항hTfR 항체의 중쇄의 Fab 영역의 하류에 링커를 개재시켜 인간 이두론산-2-설파타제(hI2S)가 결합한 것이고, 항체의 경쇄가, 항hTfR 항체의 경쇄인 것을 들 수 있다. 그 구체적 예로서, 항hTfR 항체의 중쇄의 Fab 영역이 서열 번호 12로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고, 링커가 서열 번호 13으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고, hI2S가 서열 번호 14로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 항hTfR 항체의 경쇄가 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 것이 있다. 여기에서 결합체는, 전체로서 서열 번호 42로 나타나는 아미노산 서열을 포함한다.
제1 역방향 말단 반복(ITR)과 제2 역방향 말단 반복(ITR)의 사이에, 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 것인 핵산 분자로서, 당해 융합 단백질이, 항체의 중쇄의 C말단측에 생리 활성을 갖는 단백질을 결합시킨 결합체와, 항체의 경쇄를 포함하는 것이고, 경쇄를 코딩하는 유전자의 하류에 돼지 테스코바이러스 유래 2A 펩타이드를 코딩하는 염기 서열, 그 하류에 당해 결합체를 코딩하는 유전자를 포함하는 것의 일 실시형태로서, 당해 결합체가, 항hTfR 항체의 중쇄의 Fab 영역의 하류에 링커를 개재시켜 β-갈락토시다제(hGLB1)가 결합한 것이고, 항체의 경쇄가, 항hTfR 항체의 경쇄인 것을 들 수 있다. 그 구체적 예로서, 항hTfR 항체의 중쇄의 Fab 영역이 서열 번호 12로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고, 링커가 서열 번호 13으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고, hGLB1이 서열 번호 50으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 항hTfR 항체의 경쇄가 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 것이 있다. 여기에서 결합체는, 전체로서 서열 번호 48로 나타나는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서의 핵산 분자는, 제1 긴 말단 반복(LTR)과 제2 긴 말단 반복(LTR)의 사이에, 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 것이다. 이하의 (1)~(4)는 당해 핵산 분자의 예시이다:
(1) 융합 단백질이, 항체의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에 생리 활성을 갖는 단백질을 결합시킨 결합체와 항체의 경쇄를 포함하는 것이고, 경쇄를 코딩하는 유전자의 하류에 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열, 그 하류에 당해 결합체를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것,
(2) 융합 단백질이, 항체의 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에 생리 활성을 갖는 단백질을 결합시킨 결합체와 항체의 경쇄를 포함하는 것이고, 당해 결합체를 코딩하는 유전자의 하류에 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열, 그 하류에 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것,
(3) 융합 단백질이, 항체의 경쇄의 C말단측 또는 N말단측에 생리 활성을 갖는 단백질을 결합시킨 결합체와 항체의 중쇄를 포함하는 것이고, 중쇄를 코딩하는 유전자의 하류에 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열, 그 하류에 당해 결합체를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것,
(4) 융합 단백질이, 항체의 경쇄의 C말단측 또는 N말단측에 생리 활성을 갖는 단백질을 결합시킨 결합체와 항체의 중쇄를 포함하는 것이고, 당해 결합체를 코딩하는 유전자의 하류에 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열, 그 하류에 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것.
상기 (1)~(4)에 있어서, 핵산 분자는, 제1 역방향 말단 반복(LTR)과 융합 단백질을 코딩하는 유전자의 사이에, 유전자 발현 제어 부위를 포함하는 염기 서열이 포함하는 것이어도 된다. 또한, 상기 (1)~(4)에 있어서, 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열을, 유전자 발현 제어 부위를 포함하는 염기 서열로 바꿔도 된다. 핵산 분자가 2개의 유전자 발현 제어 부위를 갖는 경우, 편의상, 제1 역방향 말단 반복(LTR)측으로부터 순차로, 제1 유전자 발현 제어 부위 및 제1 유전자 발현 제어 부위로 한다. 또한, 상기 (1)~(4)에 있어서, 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열을, 2A 자기 절단 펩타이드를 코딩하는 염기 서열로 바꿔도 된다. 돼지 테스코바이러스 유래 2A 펩타이드는, 2A 자기 절단 펩타이드의 호적한 일례이다.
항체가 1본쇄 항체인 경우의, 본 발명의 일 실시형태에 있어서의 핵산 분자는, 제1 긴 말단 반복(LTR)과 제2 긴 말단 반복(LTR)의 사이에, 1본쇄 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 것이다. 이하의 (1)~(4)는 당해 핵산 분자의 예시이다:
(1) 항체의 중쇄의 C말단측에 제2 링커를 개재시켜 경쇄를 결합시키고, 추가로 경쇄의 C말단측에 직접 또는 링커를 개재시켜 생리 활성을 갖는 단백질을 결합시킨 것인 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 것;
(2) 항체의 경쇄의 C말단측에 제2 링커를 개재시켜 중쇄를 결합시키고, 추가로 경쇄의 C말단측에 직접 또는 링커를 개재시켜 생리 활성을 갖는 단백질을 결합시킨 것인 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 것;
(3) 생리 활성을 갖는 단백질의 C말단측에 직접 또는 링커를 개재시켜 항체의 중쇄를 결합시키고, 추가로 중쇄의 C말단측에 경쇄를 결합시킨 것인 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 것;
(4) 생리 활성을 갖는 단백질의 C말단측에 직접 또는 링커를 개재시켜 항체의 경쇄를 결합시키고, 추가로 중쇄의 C말단측에 중쇄를 결합시킨 것인 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 것.
상기 (1)~(4)에 있어서, 핵산 분자는, 제1 긴 말단 반복(LTR)과 융합 단백질을 코딩하는 유전자의 사이에, 유전자 발현 제어 부위를 포함하는 염기 서열이 포함하는 것이어도 된다.
상기 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 핵산 분자에 있어서는, 유전자 발현 제어 부위로부터 융합 단백질을 구성하는 한쪽의 펩타이드쇄의, 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열로부터 다른 쪽의 펩타이드쇄의 발현이 제어되게 된다. 양 펩타이드쇄는, 세포 내에서 짝을 이루어 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질이 형성된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서의 핵산 분자는, AAV 벡터계에 있어서 이용할 수 있다. 야생형의 AAV가 숙주 세포인 인간 세포에 단독으로 감염되면, 바이러스 게놈은, 바이러스 게놈의 양단에 존재하는 역방향 말단 반복(ITR)을 개재시켜, 제19번 염색체에 부위 특이적으로 짜넣어진다. 숙주 세포의 게놈 중에 도입된 바이러스 게놈의 유전자는 거의 발현하지 않지만, 세포가 헬퍼 바이러스에 감염되면 AAV는 숙주 게놈으로부터 절출되어, 감염성 바이러스의 복제가 개시된다. 헬퍼 바이러스가 아데노바이러스인 경우, 헬퍼 작용을 담당하는 유전자는 E1A, E1B, E2A, VA1, 및 E4이다. 여기에서, 숙주 세포가, 아데노바이러스의 E1A, E1B로 트랜스폼 한 인간 태아 신장 조직 유래 세포인 HEK293 세포인 경우에 있어서는, E1A 및 E1B 유전자는, 숙주 세포에 있어서 원래 발현하고 있다.
야생형 AAV 게놈은 2개의 유전자 rep 및 cap를 포함한다. rep 유전자로부터 산생되는 rep 단백질(rep78, rep68, rep52 및 rep40)은, 캡시드 형성에 필수임과 함께, 바이러스 게놈의 염색체에의 짜넣기에 개재한다. cap 유전자는 3개의 캡시드 단백질(VP1, VP2 및 VP3)의 산생을 담당한다.
야생형 AAV의 게놈에서는, 양단에 ITR이 존재하고, ITR의 사이에 rep 유전자 및 cap 유전자가 존재한다. 이 게놈이 캡시드에 내포되어 AAV 비리온이 형성된다. 재조합 AAV 비리온(rAAV 비리온)은, rep 유전자 및 cap 유전자를 포함하는 영역을, 외래의 단백질을 코딩하는 유전자로 치환한 것이, 캡시드에 내포된 것이다.
rAAV 비리온은, 외래의 유전자를 세포에 송달하기 위한 벡터로서 치료 목적으로 이용된다.
외래의 유전자를 세포, 조직, 또는 생체 내에 도입하기 위해서 이용되는 재조합 AAV 비리온의 생산에는, 통상, (1) AAV 등의 바이러스에서 유래하는 제1 역방향 말단 반복(ITR)을 포함하는 염기 서열과 제2 역방향 말단 반복(ITR)을 포함하는 염기 서열, 및 이들 2개의 ITR 사이에 배치된 소망의 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 구조를 갖는 플라스미드(플라스미드 1), (2) 상기 ITR 서열에 끼워진 영역(ITR 서열을 포함한다)의 염기 서열을 숙주 세포의 게놈 중에 짜넣기 위해서 필요한 기능을 갖는 AAV Rep 유전자와, AAV의 캡시드 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드(플라스미드 2), 및 (3) 아데노바이러스의 E2A 영역, E4영역, 및 VA1 RNA 영역을 포함하는 플라스미드(플라스미드 3)의 3종류의 플라스미드가 이용된다. 단, 이것에 한정하지 않고, 플라스미드 1~3 중 2개를 연결시켜 하나의 플라스미드로 한 것과, 나머지의 하나의 플라스미드의 2종류의 플라스미드를 이용할 수도 있다. 더욱이, 플라스미드 1~3을 연결시켜 하나의 플라스미드로 한 것을 이용할 수도 있다. 본 발명에 있어서의 소망의 단백질은, 리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질이다.
일반적으로, 재조합 AAV 비리온의 생산에는, 우선, 이들 3종류의 플라스미드가, 아데노바이러스의 E1a 유전자와 E1b 유전자가 게놈 중에 짜넣어진 HEK293 세포 등의 숙주 세포에 일반적인 트랜스펙션 수법에 의해 도입된다. 그렇게 하면 제1 역방향 말단 반복(ITR)을 포함하는 염기 서열과 제2 역방향 말단 반복(ITR)을 포함하는 염기 서열, 및 이들 2개의 ITR 사이에 배치된 소망의 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 영역이 숙주 세포로 복제되고, 생긴 1중쇄 DNA가 AAV의 캡시드 단백질에 패키징되어, 재조합 AAV 비리온이 형성된다. 이 재조합 AAV 비리온은, 감염력을 가지므로, 외래의 유전자를 세포, 조직, 또는 생체 내에 도입하기 위해서 이용할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에 있어서의 외래의 유전자는, 리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 유전자이다. 도입처의 세포 등에서는 이 유전자로부터 해당 융합 단백질이 발현하게 된다.
아데노 수반 바이러스(AAV)의 Rep 단백질은, AAV의 rep 유전자에 코딩된다. Rep 단백질은, 예를 들어 AAV 게놈을, 당해 게놈 중에 존재하는 ITR을 개재시켜, 숙주 세포의 게놈 중에 짜넣기 위해서 필요한 기능을 갖는다. Rep 단백질은 복수의 서브타입이 존재하지만, AAV 게놈의 숙주 세포의 게놈에의 짜넣기에는, Rep68과 Rep78의 2종류가 필요해진다. Rep68과 Rep78은, 동일한 유전자로부터 선택적 스플라이싱에 의해 전사되는 2종류의 mRNA의 번역 산물이다. 본 발명에 있어서 AAV의 Rep 단백질이라고 할 때는, 적어도 Rep68과 Rep78의 2종류의 단백질을 포함하는 것이다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 아데노 수반 바이러스의 Rep 단백질을 코딩하는 염기 서열(Rep 영역의 염기 서열)이라고 할 때는, 적어도 Rep68과 Rep78을 코딩하는 염기 서열, 또는 이것에 변이를 가한 염기 서열을 말한다. Rep 단백질은, 바람직하게는 혈청형 2의 AAV의 것인 것이 바람직하지만, 이것으로 한정되지는 않고, 혈청형 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11의 어느 것이어도 된다. 야생형의 혈청형 2의 AAV의 Rep 단백질을 코딩하는 염기 서열의 바람직한 일례로서 서열 번호 24로 나타나는 염기 서열을 갖는 것을 들 수 있다.
또한, Rep68은, 그 기능을 발휘하는 한, 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11의 어느 것의 AAV의 야생형의 Rep68의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 개변이 이루어진 변이체여도 된다. 본 발명에 있어서, 이들 변이를 가한 Rep68도, Rep68에 포함된다.
야생형의 Rep68의 아미노산 서열 중의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 경우, 치환하는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1~10개, 보다 바람직하게는 1~5개, 더 바람직하게는 1~3개이다. 야생형의 Rep68의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1~10개, 보다 바람직하게는 1~5개, 더 바람직하게는 1~3개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가한 Rep68도, Rep68이다. 아미노산을 부가하는 경우, 야생형의 Rep68의 아미노산 서열 중 혹은 N말단 또는 C말단에, 바람직하게는 1~10개, 보다 바람직하게는 1~5개, 더 바람직하게는 1~3개의 아미노산을 부가한다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가한 Rep68도, Rep68에 포함된다. 변이를 가한 Rep68의 아미노산 서열은, 야생형의 Rep68의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 동일성을 나타내고, 보다 바람직하게는 85% 이상의 동일성을 나타내고, 더 바람직하게는 90% 이상의 동일성을 나타내고, 더 바람직하게는, 95% 이상의 동일성을 나타내고, 더 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 나타낸다.
또한, Rep78은, 그 기능을 발휘하는 한, 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11의 어느 것의 AAV의 야생형의 Rep78의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 개변이 이루어진 변이체여도 된다. 본 발명에 있어서, 이들 변이를 가한 Rep78도, Rep78에 포함된다.
야생형의 Rep78의 아미노산 서열 중의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 경우, 치환하는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1~10개, 보다 바람직하게는 1~5개, 더 바람직하게는 1~3개이다. 야생형의 Rep78의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1~10개, 보다 바람직하게는 1~5개, 더 바람직하게는 1~3개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가한 Rep78도, Rep78이다. 아미노산을 부가하는 경우, 야생형의 Rep78의 아미노산 서열 중 혹은 N말단 또는 C말단에, 바람직하게는 1~10개, 보다 바람직하게는 1~5개, 더 바람직하게는 1~3개의 아미노산을 부가한다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가한 Rep78도, Rep78에 포함된다. 변이를 가한 Rep78의 아미노산 서열은, 야생형의 Rep78의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 동일성을 나타내고, 보다 바람직하게는 85% 이상의 동일성을 나타내고, 더 바람직하게는 90% 이상의 동일성을 나타내고, 더 바람직하게는, 95% 이상의 동일성을 나타내고, 더 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 나타낸다.
AAV의 Rep 단백질의 기능적 등가물이란, Rep68에 있어서는, 기능적으로 Rep68 대신에 이용할 수 있는 것을 말하고, Rep78에 있어서는, 기능적으로 Rep78 대신에 이용할 수 있는 것을 말한다. Rep 단백질의 기능적 등가물은, 야생형의 Rep 단백질의 변이체여도 된다.
서열 번호 24로 나타나는 염기 서열은, 기능적인 Rep68 및 Rep78을 코딩하는 것인 한, 치환, 결실, 부가 등의 개변을 가할 수 있다. 서열 번호 24로 나타나는 염기 서열 중의 염기를 다른 염기로 치환하는 경우, 치환하는 염기의 개수는, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~3개이다. 서열 번호 24로 나타나는 염기 서열 중의 염기를 결실시키는 경우, 결실시키는 염기의 개수는, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~3개이다. 또한, 이들 염기의 치환과 결실을 조합한 변이를 가한 것도, Rep 단백질을 코딩하는 염기 서열로서 사용할 수 있다. 염기를 부가하는 경우, 서열 번호 24로 나타나는 염기 서열 중 혹은 5＇말단 또는 3＇말단에, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~3개의 염기를 부가한다. 이들 염기의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가한 것도, Rep 단백질을 코딩하는 핵산 분자로서 사용할 수 있다. 변이를 가한 염기 서열은, 서열 번호 24로 나타나는 염기 서열과 바람직하게는 80% 이상의 동일성을 나타내고, 보다 바람직하게는 85% 이상의 동일성을 나타내고, 더 바람직하게는 90% 이상의 동일성을 나타내고, 더 바람직하게는, 95% 이상의 동일성을 나타내고, 더 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 나타낸다. 단, 이들 변이를 가하는 경우에 있어서, Rep 단백질의 Rep68과 Rep78을 코딩하는 유전자의 개시 코돈을 ACG로 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서 아데노 수반 바이러스의 Cap 단백질을 코딩하는 염기 서열(Cap 영역의 염기 서열)이라고 할 때는, 적어도 AAV의 캡시드를 구성하는 단백질의 일종인 VP1을 코딩하는 염기 서열, 또는 이것에 변이를 가한 염기 서열을 포함하는 염기 서열을 말한다. VP1은, 바람직하게는 혈청형 8의 AAV의 것인 것이 바람직하지만, 이것으로 한정되지는 않고, 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11의 어느 것이어도 된다. 혈청형 8의 Cap 영역의 염기 서열의 호적예로서, 서열 번호 22로 나타나는 염기 서열을 포함하는 것을 들 수 있다.
또한, VP1은, 그 기능을 발휘하는 한, 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11의 어느 것의 AAV의 야생형의 VP1의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 개변이 이루어진 것이어도 된다. 본 발명의 일 실시형태에 있어서, 이들 변이를 가한 VP1도, VP1에 포함된다.
서열 번호 22로 나타나는 염기 서열 중의 염기를 다른 염기로 치환하는 경우, 치환하는 염기의 개수는, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~3개이다. 서열 번호 22로 나타나는 염기 서열 중의 염기를 결실시키는 경우, 결실시키는 염기의 개수는, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~3개이다. 또한, 이들 염기의 치환과 결실을 조합한 변이를 가한 것도, Cap 단백질을 코딩하는 염기 서열로서 사용할 수 있다. 염기를 부가하는 경우, 서열 번호 22로 나타나는 염기 서열 중 혹은 5＇말단 또는 3＇말단에, 바람직하게는 1~20개, 보다 바람직하게는 1~10개, 더 바람직하게는 1~3개의 염기를 부가한다. 이들 염기의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가한 것도, Cap 단백질을 코딩하는 핵산 분자로서 사용할 수 있다. 변이를 가한 염기 서열은, 서열 번호 22로 나타나는 염기 서열과 바람직하게는 80% 이상의 동일성을 나타내고, 보다 바람직하게는 85% 이상의 동일성을 나타내고, 더 바람직하게는 90% 이상의 동일성을 나타내고, 더 바람직하게는, 95% 이상의 동일성을 나타내고, 보다 더 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 나타낸다.
AAV 벡터에 의해, 제1 ITR와 제2 ITR 사이에 외래의 유전자를 포함하는 핵산 분자가 패키징된 재조합 AAV 비리온을 얻을 수 있다. 재조합 AAV 비리온은, 감염력을 가지므로, 외래의 유전자를 세포, 조직, 또는 생체 내에 도입하기 위해서 이용할 수 있다. 본 발명에 있어서의 외래의 유전자는, 리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 유전자이다. 당해 유전자가 도입된 세포 등에서는 이 유전자로부터 융합 단백질이 발현하게 된다. 제1 ITR와 제2 ITR 사이에 외래의 유전자를 포함하는 핵산 분자가 패키징된 재조합 비리온으로서, 세포 등에 유전자를 도입하기 위해서 이용할 수 있는 것으로서, AAV 벡터계 이외에, 아데노바이러스 벡터계가 있다. 아데노바이러스 벡터계에 있어서는, 제1 ITR와 제2 ITR 사이에 외래의 유전자를 포함하는 핵산 분자가 패키징된 재조합 아데노바이러스 비리온이 얻어진다. 재조합 아데노바이러스 비리온은, 감염력을 가지므로, 외래의 유전자를 세포, 조직, 또는 생체 내에 도입하기 위해서 이용할 수 있다.
렌티바이러스는 레트로바이러스과의 아과 중 하나인 오르토레트로바이러스 아과 중에서 렌티바이러스속에 속하는 바이러스이며, 1본쇄의 (+)쇄 RNA 게놈(ssRNA)을 갖는다. 렌티바이러스의 게놈은 필수 유전자로서 gag(캡시드 단백질을 포함하는 구조 단백질을 코딩하는 영역), pol(역전사 효소를 포함하는 효소군을 코딩하는 영역), env(숙주 세포에의 결합에 필요한 인벨로프 단백질을 코딩하는 영역)를 포함하고, 이들이 2개의 LTR(5＇LTR 및 3＇LTR)에 끼워져 있다. 또한 이들에 더하여, 렌티바이러스의 게놈은, 보조 유전자로서, Rev(바이러스 RNA 내에 존재하는 RRE(rev responsive element)에 결합하여 바이러스 RNA를 핵으로부터 세포질에 수송하는 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 영역), tat(5＇LTR 내에 있는 TAR에 결합하여 LTR의 프로모터 활성을 상승시키는 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 영역), 그 외 vif, vpr, vpu, nef 등을 포함한다.
렌티바이러스는 인벨로프 바이러스이며, 인벨로프가 세포막과 융합함으로써 세포에 감염한다. 또한, 렌티바이러스는 RNA 바이러스이며, 비리온 중에는 역전사 효소가 존재한다. 렌티바이러스의 감염 후, 역전사 효소에 의해, (+)쇄 RNA 게놈으로부터 1본쇄의 플러스쇄 DNA가 복제되고, 추가로 이중쇄 DNA가 합성된다. 이 이중쇄 DNA로부터 비리온의 구성 성분인 단백질이 발현하고, 이것에 (+)쇄 RNA 게놈이 패키징되는 것에 의해 비리온이 증식한다. 본 발명의 일 실시형태에 있어서, 렌티바이러스 벡터는, 렌티바이러스의 일종인 HIV-1의 게놈에 기초하여 개발된 것이 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
제1세대 렌티바이러스 벡터는, 패키징 플라스미드, Env 플라스미드, 및 도입 플라스미드의 3종의 플라스미드로 이루어진다. 패키징 플라스미드는 CMV 프로모터 등의 제어하에 gag 및 pol의 각 유전자를 갖는다. Env 플라스미드는 CMV 프로모터 제어하에 env 유전자를 갖는다. 도입 플라스미드는, 5＇LTR, RRE, CMV 프로모터 제어하에 소망의 단백질을 코딩하는 유전자, 및 3＇LTR을 갖는다. 이들을 숙주 세포에 일반적인 트랜스펙션 수법에 의해 도입함으로써, 제1 ITR과 제2 ITR 사이에 외래의 유전자를 포함하는 핵산 분자가 캡시드 단백질 중에 패키징된 재조합 비리온이 얻어진다. 제1세대 렌티바이러스 벡터의 패키징 플라스미드에는, 바이러스 유래의 rev, tat, vif, vpr, vpu, 및 nef의 각 보조 유전자도 포함된다. 여기에 있어서 본 발명에 있어서의 소망의 단백질은, 리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질이다. 한편, 소망의 단백질을 코딩하는 유전자를 제어하는 프로모터를 CMV 프로모터 이외의 프로모터, 예를 들어 SV40 초기 프로모터, 인간 신장 인자-1α(EF-1α) 프로모터, 인간 유비퀴틴 C 프로모터, 레트로바이러스의 라우스 육종 바이러스 LTR 프로모터, 다이하이드로엽산 환원 효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세린산 키나제(PGK) 프로모터, 마우스 알부민 프로모터, 인간 알부민 프로모터, 및 인간 α-1 안티트립신 프로모터를 포함하는 것이 호적하다. 예를 들어, 마우스 α 페토프로틴 인핸서의 하류에 마우스 알부민 프로모터를 포함하는 서열 번호 8로 나타나는 염기 서열을 갖는 합성 프로모터(마우스 α 페토프로틴 인핸서/마우스 알부민 프로모터) 등으로 할 수도 있다.
제2세대 렌티바이러스 벡터도, 제1세대와 동일하게 패키징 플라스미드, Env 플라스미드(인벨로프 플라스미드), 및 도입 플라스미드의 3종의 플라스미드로 이루어진다. 단, 패키징 플라스미드로부터, 필수 유전자가 아닌 vif, vpr, vpu, 및 nef의 각 보조 유전자는 삭제되어 있다.
제3세대 렌티바이러스 벡터는, 패키징 플라스미드, Env 플라스미드(인벨로프 플라스미드), Rev 플라스미드, 및 도입 플라스미드의 4종의 플라스미드로 이루어진다. 제3세대에서는, 제2세대에서 패키징 플라스미드에 있던 rev를 독립시켜 Rev 플라스미드로 하고 있다. 또한, 패키징 플라스미드로부터 tat가 삭제되어 있다. 더욱이, 도입 플라스미드의 5＇LTR 내의 TAR이 CMV 프로모터로 치환되어 있다.
재조합 비리온은, 감염력을 가지므로, 외래의 유전자를 세포, 조직, 또는 생체 내에 도입하기 위해서 이용할 수 있다. 본 발명에 있어서의 외래의 유전자는, 리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 유전자이다. 당해 유전자가 도입된 세포 등에서는 이 유전자로부터 융합 단백질이 발현하게 된다.
레트로바이러스는, 1본쇄의 (+)쇄 RNA 게놈(ssRNA)을 갖는다. 바이러스 게놈에는, gag(캡시드 단백질을 포함하는 구조 단백질을 코딩), pol(역전사 효소를 포함하는 효소군을 코딩), env(숙주 세포에의 결합에 필요한 인벨로프 단백질을 코딩) 및 패키징 시그널(Ψ)의 각 유전자가 코딩되어 있고, 이들이 2개의 긴 말단 반복(LTR, 5＇LTR 및 3＇LTR)에 끼워져 있다. 레트로바이러스는 숙주 세포에 감염하면, (+)쇄 RNA 및 역전사 효소가 세포 내로 이행하여, 2본쇄 DNA로 역전사된다.
레트로바이러스 벡터는 주로 마우스 백혈병 바이러스에 기초하여 개발되고, 병원성을 상실시켜 안전성을 높이는 것을 목적으로 하여, 그 감염력을 유지하면서 자기 복제능을 결손시키기 위해서 바이러스 게놈이 분할되어 있다. 제1세대 레트로바이러스 벡터는, 패키징 플라스미드(패키징 시그널을 제외한 바이러스 게놈)와 도입 플라스미드(패키징 시그널, gag의 일부, 외래 유전자의 양단을 5＇LTR 및 3＇LTR로 끼운 것)로 이루어진다. 따라서, 패키징 플라스미드와 도입 플라스미드에 공통되게 존재하는 gag 서열 부분에서 상동 재조합이 일어나면 자기 복제 가능한 레트로바이러스, 즉 RC(replication compitent) 바이러스가 출현한다. 제2세대 레트로바이러스 벡터에서는, 제1세대의 패키징 플라스미드의 3'측의 LTR을 폴리 A 부가 시그널로 치환하고 있다. 이것에 의해, RC 바이러스가 발생하기 위해서는 gag 서열 및 폴리 A 부가 시그널 상류의 2개소에서 동시에 상동 재조합이 일어날 필요가 있어, 그 발생 확률은 매우 낮고, 안전성이 높여져 있다. 제3세대는 3개의 플라스미드로 구성되어 있고, 제2세대의 패키징 플라스미드가 추가로 gag/pol을 코딩하는 플라스미드와 env를 코딩하는 플라스미드로 분할되어 있다. 이것에 의해, RC 바이러스가 발생하기 위해서는 3개소에서 동시에 상동 재조합이 생길 필요가 있어, 그 발생 확률은 극히 낮고, 안전성이 더 높여져 있다.
일반적으로, 재조합 레트로바이러스 비리온의 생산에는, 우선, 이들 패키징 플라스미드와 도입 플라스미드가, 숙주 세포에 일반적인 트랜스펙션 수법에 의해 도입된다. 그렇게 하면 5＇LTR 및 3＇LTR, 및 이들 2개의 LTR 사이에 배치된 소망의 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 영역이 숙주 세포로 복제되어 생긴 1본쇄의 (+)쇄 RNA가 레트로바이러스의 캡시드 단백질에 패키징되어, 재조합 레트로바이러스 비리온이 형성된다. 이 재조합 레트로바이러스 비리온은, 감염력을 가지므로, 외래의 유전자를 세포, 조직, 또는 생체 내에 도입하기 위해서 이용할 수 있다. 본 발명에 있어서의 외래의 유전자는, 리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 유전자이다. 당해 유전자가 도입된 세포 등에서는 이 유전자로부터 융합 단백질이 발현하게 된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 핵산 분자는, 이것을 리포솜, 지질 나노입자(Lipid Nanoparticle; LNP) 등에 내포시킨 형태로 할 수도 있다. 리포솜이란, 지질 이중층을 가지는 구상의 소포를 말하고, 주로 인지질, 특히 포스파티딜콜린으로 구성된다. 단 이것에 한정하지 않고, 지질 이중층을 형성하는 한, 리포솜은 난황 포스파티딜에탄올아민 등의 다른 지질을 가해진 것이어도 된다. 세포막은 주로 인지질 이중막으로 구성되어 있기 때문에, 리포솜은 생체 적합성이 우수하다고 하는 이점이 있다. 지질 나노입자는, 직경 10nm~1000nm, 전형적으로는 약 200nm 미만의, 지질을 주성분으로 하는 입자를 말하고, 소수성(친유성) 분자를 내포시킬 수 있고, 트라이글리세라이드, 다이글리세라이드, 모노글리세라이드, 지방산, 스테로이드 등의 생체 적합성이 있는 지질을 주된 구성 성분으로 한다. 리포솜 또는 지질 나노입자에 내포시킨 유전자를 생체 내에 투여하면, 세포의 세포막과 직접 융합, 또는 엔도사이토시스 등에 의해 세포에 흡수되고, 그 후 핵으로 이행하여 유전자가 세포에 도입된다고 생각되고 있다. 리포솜 또는 지질 나노입자에 의한 유전자 도입 방법은, 바이러스 벡터를 이용한 유전자 도입과 비교하여, 도입하는 유전자의 크기에 제한이 없는 점이나, 안전성이 높은 점에 있어서 우수하다. 본 발명의 핵산 분자를 내포시킨 리포솜, 지질 나노입자 등은, 리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질의 유전자를 세포, 조직, 또는 생체 내에 도입하기 위해서 이용할 수 있다. 당해 유전자가 도입된 세포 등에서는 이 유전자로부터 융합 단백질이 발현하게 된다. 본 명세에 있어서 「리포솜, 지질 나노입자 등」이라고 할 때는, 전술한 리포솜 및 지질 나노입자에 더하여, 폴리머 나노입자, 미셀, 에멀션, 나노에멀션, 마이크로스피어, 나노스피어, 마이크로캡슐, 나노캡슐, 덴드리머, 나노겔, 금속 나노입자, 그 외 약물 송달 시스템(DDS)으로서 이용될 수 있는 모든 나노·마이크로입자를 포함하는 것으로 한다.
본 발명에 있어서, 플라스미드의 형태, 재조합 바이러스 비리온에 내포된 형태, 또는 리포솜, 지질 나노입자 등에 내포된 형태로 세포, 조직, 또는 생체 내에 도입된 핵산 분자의 거동에 대해, 이하에 (1)~(9)에 예시한다. 단, 핵산 분자의 거동은 이들에 한정되는 것은 아니다.
(1) 일 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 1본쇄의 (+)쇄 RNA이며, 세포 내에 도입되면, 핵산 분자에 포함되는 리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 유전자가 번역되어 해당 융합 단백질이 발현한다.
(2) 일 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 1본쇄의 (+)쇄 RNA이며, 세포 내에 도입되면, 해당 핵산 분자가 역전사되어 1본쇄의 (+)쇄 DNA가 되고, 그 다음에 이 DNA가 전사·번역되어 해당 융합 단백질이 발현한다.
(3) 일 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 1본쇄의 (+)쇄 RNA 또는 (-)쇄 RNA이며, 세포 내에 도입되면, 해당 핵산 분자가 역전사된 후에 이중쇄 DNA가 되고, 그 다음에 이 DNA가 전사·번역되어 해당 융합 단백질이 발현한다.
(4) 일 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 1본쇄의 (+)쇄 또는 (-) RNA이며, 세포 내에 도입되면, 해당 핵산 분자가 역전사된 후에 이중쇄 DNA가 되고, 그 다음에 이 DNA가 숙주 세포의 게놈과 랜덤 재조합 또는 상동 재조합을 일으켜 게놈 내에 짜넣어지고, 짜넣어진 DNA가 전사·번역되어 해당 융합 단백질이 발현한다.
(5) 일 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 1본쇄의 (+)쇄 DNA이며, 세포 내에 도입되면, 해당 핵산 분자가 전사·번역되어 해당 융합 단백질이 발현한다.
(6) 일 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 1본쇄의 (-)쇄 DNA이며, 세포 내에 도입되면, 해당 핵산 분자로부터 이중쇄 DNA가 합성되고, 그 다음에 이 이중쇄 DNA가 전사·번역되어 해당 융합 단백질이 발현한다.
(7) 일 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 1본쇄의 (+)쇄 DNA 또는 (-)쇄 DNA이며, 세포 내에 도입되면, 해당 핵산 분자로부터 이중쇄 DNA가 합성되고, 그 다음에 이 DNA가 숙주 세포의 게놈과 랜덤 재조합 또는 상동 재조합을 일으켜 게놈 내에 짜넣어지고, 짜넣어진 DNA가 전사·번역되어 해당 융합 단백질이 발현한다.
(8) 일 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 이중쇄 DNA이며, 세포 내에 도입되면, 해당 핵산 분자가 전사·번역되어 해당 융합 단백질이 발현한다.
(9) 일 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 이중쇄 DNA이며, 이 DNA가 숙주 세포의 게놈과 랜덤 재조합 또는 상동 재조합을 일으켜 게놈 내에 짜넣어지고, 짜넣어진 DNA가 전사·번역되어 해당 융합 단백질이 발현한다.
플라스미드의 형태, 재조합 바이러스 비리온에 내포된 형태, 또는 리포솜, 지질 나노입자 등에 내포된 형태의 핵산 분자는, 세포, 조직, 또는 생체 내에 도입할 수 있다.
핵산 분자의 도입처가 생체 내인 경우, 핵산 분자는, 플라스미드의 형태, 재조합 바이러스 비리온에 내포된 형태, 또는 리포솜, 지질 나노입자 등에 내포된 형태로, 피하 주사, 근육내 주사, 정맥내 주사 등의 비경구적 수단에 의해 투여된다.
플라스미드의 형태, 재조합 바이러스 비리온에 내포된 형태, 또는 리포솜, 지질 나노입자 등에 내포된 형태의 핵산 분자는, 여러 가지 의약으로서 이용할 수 있다. 핵산 분자에 코딩되는 융합 단백질이 뇌혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 분자(표면 항원)를 특이적으로 인식하는 것이고, 생리 활성을 갖는 단백질이 인간 리소좀 효소인 경우의 핵산 분자의 용도에 대해, 이하 상술한다.
인간 리소좀 효소가 α-L-이두로니다제인 경우는 헐러 증후군 또는 헐러 샤이에 증후군에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 이두론산-2-설파타제인 경우는 헌터 증후군에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 글루코세레브로시다제인 경우는 고시병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, β-갈락토시다제인 경우는 GM1-강글리오시도시스 1~3형에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, GM2 활성화 단백질인 경우는 GM2-강글리오시도시스 AB이형에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, β-헥소사미니다제 A인 경우는 샌드호프병 및 티삭스병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, β-헥소사미니다제 B인 경우는 샌드호프병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스페라제인 경우는 I-세포병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, α-만노시다제인 경우는 α-만노시도시스에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, β-만노시다제인 경우는 β-만노시도시스에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 갈락토실세라미다제인 경우는 크라베병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 사포신 C인 경우는 고시병양 축적증에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 아릴설파타제 A인 경우는 이염성 백질 변성증(이염성 백질 디스트로피)에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, α-L-푸코시다제인 경우는 푸코시도시스에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 아스파르틸글루코사미니다제인 경우는 아스파르틸글루코사민뇨증에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, α-N-아세틸갈락토사미니다제인 경우는 쉰들러병 및 가와사키병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 산성 스핑고미엘리나제인 경우는 니만 피크병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, α-갈락토시다제 A인 경우는 파브리병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, β-글루쿠로니다제인 경우는 슬라이 증후군에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 헤파란 N-설파타제, α-N-아세틸글루코사미니다제, 아세틸 CoAα-글루코사미니드 N-아세틸트랜스페라제 및 N-아세틸글루코사민-6-설파타제 중 어느 하나인 경우는 산필리포 증후군에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 산성 세라미다제인 경우는 파버병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 아밀로-1,6-글루코시다제인 경우는 코리병(포브스 코리병)에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 시알리다제인 경우는 시알리다제 결손증에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 아스파르틸글루코사미니다제인 경우는 아스파르틸글루코사민뇨증에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 팔미토일 단백질 싸이오에스테라제-1(PPT-1)인 경우는 신경 세로이드 리포푸신증 또는 Santavuori-Haltia병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 트라이펩티딜펩티다제-1(TPP-1)인 경우는 신경 세로이드 리포푸신증 또는 Jansky-Bielschowsky병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, 하이알루로니다제-1인 경우는 하이알루로니다제 결손증에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서, CLN1 및 CLN2 중 어느 것인 경우는 바텐병에 있어서의 중추 신경 장애 치료제로서 사용할 수 있다.
핵산 분자의 도입처가 세포인 경우, 세포의 종류에 특별히 한정은 없지만, 예를 들어, 간엽계 줄기세포, 치수 유래 줄기세포, 조혈 줄기세포, 배성 줄기세포, 내피 줄기세포, 유선 줄기세포, 장 줄기세포, 간 줄기세포, 췌 줄기세포, 신경 줄기세포, 및 iPS 세포이다.
핵산 분자가 도입된 세포는, 융합 단백질을 발현하게 되므로, 이것을 치료 목적으로 환자에게 이식할 수 있다. 예를 들어, 생리 활성을 갖는 단백질이 인간 리소좀 효소인 핵산 분자가 도입된 세포는, 전술한 용도에 이용할 수 있다.
실시예
〔실시예 1〕 pAAV-mMAP-Fab-hI2S 벡터의 구축
5＇측으로부터, ClaI 사이트, 마우스 α 페토프로틴 인핸서/마우스 알부민 프로모터, 닭 β 액틴/MVM 키메라 인트론, 항hTfR 항체의 중쇄의 Fab 영역의 C말단측에 hI2S가 결합한 결합체를 코딩하는 유전자, 마우스 뇌심근염 바이러스의 5' 비번역 영역에서 유래하는 내부 리보솜 결합 부위(IRES), 항hTfR 항체의 경쇄를 코딩하는 유전자, 소 성장 호르몬 폴리 A 서열, 및 BglII 사이트를 포함하는 서열 번호 18로 나타나는 염기 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성했다. 이 DNA 단편을 ClaI와 BglII로 소화했다. pAAV-CMV 벡터(다카라 바이오사)를 ClaI와 BglII로 소화하고, 이것에 상기의 제한 효소 처리한 DNA 단편을 삽입했다. 얻어진 플라스미드를 pAAV-mMAP-Fab-hI2S 벡터로 했다(도 1). pAAV-mMAP-Fab-hI2S 벡터는, 상류로부터 순차로, 제1 AAV-ITR의 기능적 등가물(서열 번호 6), 마우스 α 페토프로틴 인핸서/마우스 알부민 프로모터(서열 번호 8), 닭 β 액틴/MVM 키메라 인트론(서열 번호 9), 항hTfR 항체의 중쇄의 Fab 영역의 C말단측에 hI2S가 결합한 결합체(서열 번호 42)를 코딩하는 유전자, 마우스 뇌심근염 바이러스의 5' 비번역 영역에서 유래하는 내부 리보솜 결합 부위, 항hTfR 항체의 경쇄(서열 번호 10)를 코딩하는 유전자, 소 성장 호르몬 polyA 시그널(서열 번호 17), 제2 AAV-ITR의 기능적 등가물(서열 번호 7)을 포함하는 구조를 갖는다. 더욱이, pAAV-mMAP-Fab-hI2S 벡터는, 암피실린 내성 유전자 및 복제 개시점(ColE1 ori)을 포함한다.
〔실시예 2〕 pR2(mod)C6 벡터의 구축
5＇측으로부터, AfeI 사이트, RsrII 사이트, BsrGI 사이트, AvrII 사이트, 암피실린 내성 유전자 사이트, 복제 개시점(ColE1 ori), RsrII 사이트, p5 프로모터를 포함하는 AAV2의 Rep 영역의 5＇ 부분, 및 SacII 사이트를 포함하는 서열 번호 19로 나타나는 염기 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성했다. 이 DNA 단편을 AfeI와 SacII로 소화했다. pRC6 벡터(다카라 바이오사)를 AfeI와 SacII로 소화하고, 이것에 상기의 제한 효소 처리한 합성 유전자를 삽입했다. 얻어진 플라스미드를 pR2(mod)C6 벡터로 했다.
〔실시예 3〕 pR2(mod)C8 벡터의 구축
5＇측으로부터, HindIII 사이트, AAV2의 Rep 영역의 3＇부분, AAV8의 Cap 영역, 인핸서로서 기능하는 p5 프로모터, RsrII 사이트, 및 BsrGI 사이트를 포함하는 서열 번호 20으로 나타나는 염기 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성했다. 이 DNA 단편을 HindIII와 BsrGI로 소화했다. pR2(mod)C6 벡터를 HindIII와 BsrGI로 소화하고, 이것에 상기의 제한 효소 처리한 합성 유전자를 삽입했다. 얻어진 플라스미드를 pR2(mod)C8 벡터로 했다(도 2). pR2(mod)C8 벡터는, 상류로부터 순차로, p5 프로모터를 포함하는 AAV2의 Rep 영역(서열 번호 21), AAV8의 Cap 영역(서열 번호 22), 인핸서로서 기능하는 p5 프로모터(서열 번호 23)를 포함한다. 더욱이 pR2(mod)C8 벡터는, 암피실린 내성 유전자 및 복제 개시점(ColE1 ori)을 포함한다. 한편, 상기 p5 프로모터를 포함하는 AAV2의 Rep 영역(서열 번호 21)은, p5 프로모터(서열 번호 23)의 하류에, 서열 번호 24로 나타나는 AAV2의 Rep 영역을 포함하는 염기 서열을 포함한다.
〔실시예 4〕 Fab-hI2S-rAAV의 산생
인간 태아 신장 세포 유래의 세포주인, HEK293 세포를 숙주 세포로서 이용했다. 10-layer 셀 스택 챔버(Thermo Fisher Scientific사)에, HEK293 세포를 셀 스택 챔버당 6.3x108개 파종하고, 10% FBS 함유 MEM 배지(Thermo Fisher Scientific사)로 37℃, 5% CO2 존재하에서 16시간 배양했다. 트랜스펙션용의 DNA 용액으로서, pHelper 벡터(다카라 바이오사), pR2(mod)C8 벡터, 및 pAAV-mMAP-Fab-hI2S 벡터를 포함하는 용액을 제작했다. 이 용액은, 3종류의 플라스미드를 등몰농도로 포함하고, 총DNA 농도가 1.0mg/mL이며, 총액량이 2.2mL가 되도록 조정한 것이다. 이 용액에, 폴리에틸렌이민을, 중량비가 DNA(μg):폴리에틸렌이민(μg)=1:2가 되도록 첨가하고, 추가로 MEM 배지를 가하여 액량을 1.5L로 조정한 것을 트랜스펙션용 용액으로 했다. 배양 개시 16시간 후의 10-layer 셀 스택 챔버로부터 배양 상청을 모두 제거한 후, 1.5L의 트랜스펙션용 용액을 전량 첨가하고, 37℃, 5% CO2 존재하에서 5일간 배양하여, rAAV 비리온을 산생시켰다. 숙주 세포에서 산생된 rAAV 비리온은, 일부가 배양 상청 중에 방출되고, 일부가 숙주 세포 내에 머문다. 얻어진 rAAV 비리온을 Fab-hI2S-rAAV로 했다. Fab-hI2S-rAAV는, 세포에 감염시켰을 때에, 항hTfR 항체 Fab 영역 중쇄의 C말단측에 hI2S가 결합한 결합체와 항hTfR 항체 경쇄를 포함하는 융합 단백질을 발현할 것이 기대되는 것이다.
〔실시예 5〕 Fab-hI2S-rAAV를 포함하는 배양 상청의 회수
실시예 4의 배양 종료 후, 세포 배양액을 공경 5μm의 ULTRA Prime GF 5.0μm, 2 inch capsule, GG(Cytiva사)를 이용하여 여과 후, 추가로 공경 0.2μm의 Nalgen Rapid-Flow PES 필터 유닛(Thermo Fisher Scientific사)을 이용하여 여과했다.
〔실시예 6〕 Fab-hI2S-rAAV를 포함하는 배양 상청 중의 유리 핵산 제거 공정
실시예 5에서 회수한 배양 상청에, 엔도뉴클레아제인 벤조나제(Merck사)를 농도가 10U/mL가 되도록 첨가하여 혼합하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트했다. 벤조나제 처리 후의 배양 상청을 공경 0.2μm의 Nalgen Rapid-Flow PES 필터 유닛(Thermo Fisher Scientific사)을 이용하여 여과하여, Fab-hI2S-rAAV 함유 세포 융해액을 얻었다.
〔실시예 7〕 어피니티 수지를 이용한 Fab-hI2S-rAAV의 크로마토그래피 정제
4mmol/L MgCl2, 150mmol/L NaCl 함유 20mmol/L Tris 완충액(pH 7.5)을 이용하여, POROS AAVX 수지(Thermo Fisher Scientific사)를 충전한 칼럼(지름 1.6cm, 높이 20cm(칼럼 용량 약 20mL))를 평형화했다. 실시예 6에서 얻어진 Fab-hI2S-rAAV 함유 세포 융해액을 5mL/분의 유속으로 칼럼에 통액하는 것에 의해 수지에 Fab-hI2S-rAAV를 흡착시켰다. 그 다음에, 칼럼 용량의 5배 이상의 4mmol/L MgCl2, 400mmol/L 아르기닌 함유 20mmol/L Tris 완충액(pH 7.5)을 통액하여 칼럼을 세정하고 나서, 칼럼 용량의 3배 이상의 4mmol/L MgCl2, 150mmol/L NaCl 함유 20mmol/L Tris 완충액(pH 7.5)을 통액하여 칼럼을 세정했다. 그 다음에, 칼럼 용량의 2배 이상의 4mM MgCl2 함유 10mM 시트르산 완충액(pH 3.5)을 칼럼에 통액하는 것에 의해 수지에 흡착된 Fab-hI2S-rAAV를 용리하여 Fab-hI2S-rAAV를 포함하는 획분을 얻었다. 이 획분에 2mM MgCl2 함유 500mmol/L Tris 완충액(pH 8.5)을 가하여 pH 7.0으로 조정했다.
〔실시예 8〕 한외 여과막에 의한 Fab-hI2S-rAAV의 농축 공정
4mmol/L MgCl2, 150mmol/L NaCl 함유 20mmol/L Tris 완충액(pH 7.5)에 의해 평형화한 SUIS PD(LP) Hystream 100 kDa(Repligen사)에, 실시예 7에서 얻어진 어피니티 공정 용출 획분을 7L/min/m2 이하의 유속으로 순환하는 것에 의해 약 8mL로 농축하여 회수했다. 그 다음에, 2mL의 4mmol/L MgCl2 및 150mmol/L NaCl을 포함하는 20mmol/L Tris 완충액(pH 7.5)으로 2회 한외 여과막을 세정하고, 이 세정액을 먼저 회수한 용액에 합쳐, 합계 약 12mL의 농축액을 취득했다.
〔실시예 9〕 이오딕산올을 이용한 초원심분리에 의한 Fab-hI2S-rAAV의 정제
60% 이오딕산올(다용도 밀도 구배 원심분리 매체 OptiPreTM, 코스모바이오사)에 PBS-MK 버퍼(136.9mmol/L NaCl, 28.2mmol/L KCl 및 1mmol/L MgCl2를 포함하는 20mmol/L 인산 나트륨 완충액(pH 7.4))를 가하여 45% 이오딕산올을 조제했다. 또한, 60% 이오딕산올에 PBS-MK 버퍼를 가하여 25% 이오딕산올을 조제했다. 추가로, 60% 이오딕산올에 1M NaCl/PBS-MK 버퍼(1mol/L 염화 나트륨을 포함하는 PBS-MK 버퍼)를 가하여 15% 이오딕산올을 조제했다.
39mL, Quick-SealTM Round-Top Polypropylene Tube, 25 X 89 mm(벡크만 쿨터사)의 저부로부터, 60% 이오딕산올에 페놀 레드를 첨가한 것, 그 다음에 45% 이오딕산올, 그 다음에 25% 이오딕산올에 페놀 레드를 첨가한 것, 그 다음에 15% 이오딕산올의 순서로 각각 5mL, 8mL, 5mL, 8mL를 중층했다. 이것에 실시예 8에서 얻어진 약 12mL의 농축액을 첨가한 후, 1M NaCl/PBS-MK 버퍼로 튜브 내를 채웠다. 그 다음에, 코드리스 튜브 토퍼 실러 키트(벡크만 쿨터사)에 의해 튜브의 주입구를 닫고, 초원심 장치 OptimaXPN(벡크만 쿨터사)의 70Ti 로터에 설치하고, 63000rpm(408500×g)의 회전 속도로 2시간 원심했다. 원심 후의 튜브 저부에, 프랙션 리커버리 시스템(벡크만 쿨터사)을 이용하여, 바늘 부가 타이곤 E-LFL 튜브를 접속하여, 18G 시린지 바늘을 튜브 상부에 찔러 공기 구멍을 뚫은 후, 페리스탈틱 펌프에 의해 튜브 하부로부터 용매를 1mL씩 분획했다. 이 4번째 내지 9번째 또는 5번째 내지 8번째의 획분을 회수하여, 정제된 Fab-hI2S-rAAV를 포함하는 획분을 얻었다.
〔실시예 10〕 한외 여과막에 의한 Fab-hI2S-rAAV의 농축 및 완충액 교환 공정
실시예 9에서 얻어진 Fab-hI2S-rAAV를 포함하는 획분을, 아미콘 울트라 15 원심식 필터 유닛 50kDa(Merck사)를 이용하여, 3200rpm(2100×g) 이하, 20분 이하의 임의의 조건에서 원심분리하는 것에 의해 농축했다. 얻어진, 농축 Fab-hI2S-rAAV 용액을 350mmol/L NaCl/PBS 버퍼(486.9mmol/L NaCl 및 2.7mmol/L KCl을 포함하는 20mmol/L 인산 나트륨 완충액(pH7.4))으로 30배로 희석했다. 이것을 3회 반복함으로써 350mmol/L NaCl/PBS 버퍼에 용매가 치환된 Fab-hI2S-rAAV 용액을 얻었다. 이 Fab-hI2S-rAAV 용액을, 이하의 실험에 제공했다.
〔실시예 11〕 Fab-hI2S-rAAV 용액 중에 포함되는 rAAV 게놈양의 측정
실시예 10에서 얻어진 Fab-hI2S-rAAV 용액 중의 바이러스 게놈양을, 드롭렛 디지털 PCR법에 의해 측정했다. 이하에 측정법을 상술한다.
2μL의 Fab-hI2S-rAAV 용액에 1.6μL의 DNaseI(다카라 바이오사), 2μL의 10×DNaseI Buffer(다카라 바이오사), 및 14.4μL의 0.05% F-68 함유수를 가하고, 37℃에서 30분간 인큐베이트하여, Fab-hI2S-rAAV에 내포되어 있지 않은 DNA를 소화했다.
DNaseI 처리를 행한 Fab-hI2S-rAAV 용액을 0.05% F-68 함유 TE 버퍼를 이용하여 적절히 희석하여, 드롭렛 디지털 PCR용 샘플 용액을 조제했다. 1.0μM의 순방향 프라이머(프라이머 SI-1, 서열 번호 25), 1.0μM의 역방향 프라이머(프라이머 SI-2, 서열 번호 26), 및 0.25μM의 프로브(프로브 SI-1, 서열 번호 27의 5＇말단에 리포터 색소로서 FAM을, 3＇말단에 쿠엔처 색소로서 BHQ1을, 각각 수식한 것)를 포함하는 FAM 표지 20×프라이머/프로브 믹스를 조제했다. 또한, 1.0μM 순방향 프라이머(프라이머 SI-3, 서열 번호 28), 1.0μM 역방향 프라이머(프라이머 SI-4, 서열 번호 29), 및 0.25μM 프로브(프로브 SI-2, 서열 번호 30의 5＇말단에 리포터 색소로서 HEX를, 3＇말단에 쿠엔처 색소로서 BHQ1을, 각각 수식한 것)를 포함하는 HEX 표지 20×프라이머/프로브 믹스를 조제했다.
드롭렛 디지털 PCR용 샘플 용액 2μL에, 10μL의 ddPCR Supermix for probes (no dUTP)(BioRad사), 1μL의 FAM 표지 20×프라이머/프로브 믹스, 1μL의 HEX 표지 20×프라이머/프로브 믹스, 2μL의 5M 베타인 용액(Sigma사), 및 4μL의 0.05% F-68 함유수를 가하여, PCR 반응액을 조제했다. Droplet generator(BioRad사)를 이용하여, 20μL의 PCR 반응액과 70μL의 Droplet Generator 오일 for Probes(BioRad사)의 현탁액적(드롭렛)을 조제했다. 이 드롭렛을 QX200 Droplet Digital PCR 시스템(BioRad사)에 제공했다. PCR의 조건은, 변성 반응(95℃, 10분), 40사이클의 3스텝 PCR(95℃, 30초→60℃, 60초→72℃, 15초), 및 PCR 효소의 비활화 처리(98℃, 10분)로 이루어지는 것으로 했다. FAM/HEX 두 양성 드롭렛을 rAAV 양성 드롭렛이라고 정의하고, QuantaSoft Version 1.7(BioRad사)을 이용하여 rAAV 게놈양(vg: 바이러스 게놈)을 구했다. 한편, 이 PCR에 있어서 증폭되는 DNA 영역은, 소 성장 호르몬 polyA, 및 ITR의 내부 영역이다.
〔실시예 12〕 I2S-KO/hTfR-KI 마우스의 제작
I2S-KO/hTfR-KI 마우스는, 이두론산-2-설파타제(I2S) 유전자를 호모로 결손하고 또한 키메라 TfR 유전자를 헤테로로 갖는 마우스이다. I2S-KO/hTfR-KI 마우스는 대체로 하기의 방법으로 제작했다. 세포 내 영역이 마우스 TfR의 아미노산 서열이며, 세포외 영역이 인간 TfR의 아미노산 서열인 키메라 TfR을 코딩하는 cDNA의 3＇측에 loxP 서열로 끼워 넣은 네오마이신 내성 유전자를 배치한 DNA 단편을 화학적으로 합성했다. 이 DNA 단편을, 5＇ 암(arm) 서열 및 3＇ 암 서열을 갖는 타겟팅 벡터에 통상적 방법에 의해 짜넣고, 이것을 일렉트로포레이션법에 의해 마우스 ES 세포에 도입했다. 유전자 도입 후의 마우스 ES 세포를, 네오마이신 존재하에서 선택 배양하고, 타겟팅 벡터가 상동 재조합에 의해 염색체에 짜넣어진 마우스 ES 세포를 선택했다. 얻어진 유전자 재조합 마우스 ES 세포를, ICR 마우스의 8세포기 배(숙주배)에 주입하고, 정관 결찰을 행한 마우스와의 교배에 의해 얻어진 위(僞)임신 마우스(레시피언트 마우스)에게 이식했다. 얻어진 산자(産仔)(chimera mouse)에 대해 모색 판정을 행하여, ES 세포가 생체의 형성에 고효율로 기여한 개체, 즉 전체모에 대한 백색모가 차지하는 비율이 높은 개체를 선별했다. 이 chimera mouse 개체를 ICR 마우스와 교배시켜 F1 마우스를 얻었다. 백색의 F1 마우스를 선별하고, 꼬리의 조직으로부터 추출한 DNA를 해석하여, 염색체 상에서 마우스 hTfR 유전자가 키메라 TfR로 치환되어 있는 마우스를 hTfR-KI 마우스로 했다. 이 마우스를 바탕으로 하여, I2S 유전자를 호모로 결손하고 또한 키메라 TfR 유전자를 헤테로로 갖는 마우스(I2S-KO/hTfR-KI 마우스)를 제작했다. 한편, I2S-KO/hTfR-KI 마우스의 제작은, 특허문헌(WO2016/208695)에 기재된 수법에 준하여 행했다.
〔실시예 13〕 I2S-KO/hTfR-KI 마우스를 이용한 Fab-hI2S-rAAV의 약효 평가
Fab-hI2S-rAAV를 생체에 투여했을 때의 약효 평가를 실시예 12에서 제작한 I2S-KO/hTfR-KI 마우스를 이용하여 행했다. I2S-KO/hTfR-KI 마우스는 9~14주령(투여 개시 시)의 웅성 마우스인 것을 이용했다. 실시예 10에서 얻은 Fab-hI2S-rAAV 용액을, 웅성 I2S-KO/hTfR-KI 마우스에게 1.0×1010vg/kg, 1.0×1011vg/kg, 1.0×1012vg/kg, 및 1.0×1013vg/kg의 용량이 되도록 단회 꼬리 정맥내 투여했다(각 군 N=3). 또한, 웅성 야생형 마우스로 이루어지는 정상 대조군과 웅성 I2S-KO/hTfR-KI 마우스로 이루어지는 병태 대조군)을 두었다(각 군 N=4). 정상 대조군 및 병태 대조군에는 생리 식염액(오쓰카 제약 공장사)을 투여했다.
투여로부터 8, 15, 및 22일 후에 꼬리 정맥으로부터 일부 혈액을, EDTA-2K 코트 채혈관(캐피젝트, 테루모사)에 채취하여 빙상 정치 후, 원심(2000×g, 20분간)하고 혈장을 회수했다. 투여로부터 29일 후에 베토르팔(Meiji Seika 파르마사)·미다졸람(산도사)·도미톨(닛폰 젠야쿠 공업사)의 3제 혼합 마취하, 소뇌연수조[大槽]로부터 뇌척수액(Cerebrospinal fluid, CSF)을 채취했다. 그 다음에 마우스를 개흉하여 심 채혈을 행했다. 혈액은 EDTA-2K 코트 채혈관(캐피젝트, 테루모사)에 채취하고 빙상 정치 후, 원심(2000×g, 20분간)하고 혈장을 회수했다. 그 다음에, 생리 식염액(오쓰카 제약 공장사)으로 전신 관류하고, 뇌, 척수, 간장, 심장, 신장, 비장, 및 골격근을 각각 적출했다. 각 조직의 습중량을 측정한 후, 재빠르게 액체 질소에 침지하여 급속 동결했다.
〔실시예 14〕 혈장 중의 Fab-hI2S의 정량
혈장 상청 중 Fab-hI2S의 농도 측정은, 실시예 15에 기재된 방법에 의해 행했다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.
Figure pct00001
Fab-hI2S-rAAV 투여군에서는, 어느 투여량에서도 투여 후 8일부터 투여 후 29일까지 혈장 중 Fab-hI2S의 농도가 상승했다. 또한, 혈장 중의 Fab-hI2S의 농도는 투여량 의존적으로 상승했다. 이들 데이터는, 마우스에게 정맥 주사된 Fab-hI2S-rAAV가 세포에 흡수되어, 세포 내에서 hI2S를 코딩하는 유전자가 전사, 번역되어 발현한 hI2S가, 혈액 중에 방출되었음을 나타낸다.
〔실시예 15〕 Fab-hI2S의 농도 측정
혈장 상청 중의 Fab-hI2S의 측정은 대체로 하기의 방법으로 실시했다. Streptavidin Gold plate(Meso scale diagnostics사)의 각 웰에 Superblock Blocking Buffer in PBS(Thermo Fisher Scientific사)를 150μL씩 첨가하고, 1시간 이상 진탕하여 플레이트를 블로킹했다. 그 다음에, 비오틴화 항hI2S 모노클로날 항체 및 SULFO화 항hI2S 모노클로날 항체의 혼합 용액에, 기지 농도의 Fab-hI2S를 포함하는 검량선용 표준 시료(Fab-hI2S 검량선용 표준 시료) 및 혈장을 각각 가하고 1시간 이상 진탕하여 항체 반응액으로 했다. 한편, 항hI2S 모노클로날 항체는, 서열 번호 14로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간 이두론산-2-설파타제로 면역한 마우스로부터 취득한 비(脾) 세포를 이용하여 통상적 방법으로 제작한 항hI2S 산생 하이브리도마를 배양하는 것에 의해 취득했다. 얻어진 모노클로날 항체 중 1개를 Biotin Labeling Kit-NH2(도진 화학 연구소사)를 이용하여 첨부된 프로토콜에 따라 수식하여 비오틴화 항hI2S 모노클로날 항체를 얻었다. 또한, 얻어진 모노클로날 항체 중 다른 1개를 MSD GOLD SULFO-TAG NHS-Ester(Meso scale Diagnostics사)를 이용하여 첨부된 프로토콜에 따라 수식하여, SULFO화 항hI2S 모노클로날 항체를 얻었다. 각 웰로부터 블로킹 용액을 제거하고, 0.05% Tween 20 함유 PBS(PBST, Sigma Aldrich사)로 세정 후, 각 웰에 항체 반응액을 25μL 첨가하고, 1시간 이상 진탕했다. 그 다음에 항체 반응액을 제거하고, PBST로 세정 후, 주사용수(오쓰카 제약 공장사)로 1/2로 희석한 4X Read Buffer(Meso scale diagnostics사)를 150μL 첨가하고, SectorTM Imager S600(Meso scale diagnostics사)을 이용하여 각 웰로부터의 발광량을 측정했다. Fab-hI2S 검량선용 표준 시료의 측정치로부터 검량선을 작성하고, 이것에 각 검체의 측정치를 내삽하는 것에 의해, 혈장 1mL당에 포함되는 Fab-hI2S의 양(혈장 중의 Fab-hI2S 농도)을 산출했다. 한편, 검량선용 표준 시료에 포함되는 Fab-hI2S는 서열 번호 42로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 항hTfR 항체의 중쇄의 Fab 영역의 C말단에 인간 I2S가 결합한 결합체와, 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 항hTfR 항체의 경쇄로 이루어지는 융합 단백질(Fab-hI2S)을, 통상적 방법에 의해 CHO 세포에 발현시켜, 취득한 것이다.
〔실시예 16〕 뇌 조직 및 척수 중의 I2S 비활성 측정
뇌 조직 및 척수 중의 Fab-hI2S를 I2S의 효소 활성에 의해 평가하기 위해, I2S 비활성 측정을 행했다. I2S 비활성 측정은 대체로 하기의 방법으로 실시했다. 실시예 13에서 채취한 뇌 및 척수에 주사용수(오쓰카 제약 공장사)를 첨가하여 호모지나이즈하고, 얻어진 호모지네이트를 원심분리하고 상청을 회수했다. 호모지네이트 상청의 단백질 농도를 BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific사)를 이용하여, 첨부된 설명서에 따라 정량했다.
스탠다드로서 4-Methylumbelliferone(4-MU, Sigma Aldrich사, 400~3.13nmol/mL), 측정 시료로서 호모지네이트 상청을 플루오로눈크플레이트 F96(Nunc사)의 각 웰에 50μL씩 가했다. 다음에, 기질로서 0.05% BSA(Sigma Aldrich사)/0.1% TritonX-100(후지필름 와코 준야쿠사)을 포함하는 5mM 아세트산 완충액(pH 5.0)으로 0.6mg/mL로 희석한 4-Methylumbelliferyl sulfate(4-MUS, Sigma Aldrich사)를 각 웰에 100μL씩 가했다. 플레이트를 플레이트 믹서로 진탕시킨 후, 37℃에서 4시간 정치하여 효소 반응시켰다. 0.05M Glycine/NaOH 완충액(pH 10.6)을 각 웰에 150μL씩 가하여 반응을 정지시키고, SpectraMaxGemini(몰데바사)를 이용하여 여기 파장 365nm, 검출 파장 460nm로 측정을 행했다. 한편, 비활성은, 효소 활성 1 Unit을 4-MU nmol/4시간 37℃로 정의하고, 이것을 단백질 중량(mg)으로 나누어 구했다. 즉, 비활성은 단백질 단위 무게당의 효소 활성(nmol/4hr/mg protein)이라고 할 수 있다. I2S 비활성 측정의 결과를 표 2에 나타낸다.
Figure pct00002
병태 대조군에서는 중추 신경계 조직에 있어서 I2S의 효소 활성은 검출되지 않았지만, Fab-hI2S-rAAV 투여군에서는 모든 용량에서 뇌 조직 및 척수 중에 I2S의 효소 활성이 대체로 용량 의존적으로 검출되었다. 이들 결과는, (i) Fab-hI2S-rAAV를 투여하는 것에 의해 Fab-hI2S가 호스트 동물 내에서 발현하는 것, (ii) Fab-hI2S에 포함되는 항hTfR 항체가, hTfR을 개재시켜 BBB를 통과하여 중추 신경계의 조직에 도달하는 것, 및 (iii) Fab-hI2S에 포함되는 hI2S가, 중추 신경계의 조직에 있어서 효소로서 기능할 수 있는 상태로 존재하는 것을 나타내는 것이다.
〔실시예 17〕 각 조직 중의 헤파란 황산 및 데르마탄 황산의 정량
혈장, CSF, 및 각 조직 중의 헤파란 황산(HS) 및 데르마탄 황산(DS)의 정량은 대체로 하기의 방법으로 실시했다. 한편, 헤파란 황산 및 데르마탄 황산은, 어느 것도 I2S의 기질이다. I2S를 코딩하는 유전자의 이상에 의해 발증하는 헌터 증후군의 환자에서는, HS 및 DS가 조직 내에 축적되는 것에 의해 장애가 생긴다. 따라서, 조직 내의 HS 및 DS를 정량하는 것에 의해, 모델 동물에 투여한 약제의 약효를 평가할 수 있다.
시험에 이용하는 (a)~(l)의 용액을 이하의 수순으로 조제했다.
(a) MeCN/water:
2mL의 주사용수(오쓰카 제약 공업사)와 18mL의 아세토나이트릴(후지필름 와코 준야쿠사)을 혼합하여, 이것을 MeCN/water로 했다.
(b) 중수소 라벨화 용매:
빙욕하에서, 1.5mL의 메탄올-d4(Sigma-Aldrich사)에 240μL의 아세틸 클로라이드(Sigma-Aldrich사)를 적하하여, 이것을 중수소 라벨화 용매로 했다.
(c) 이동상 A:
475mL의 주사용수와 25mL의 1M 폼산 암모늄 수용액(후지필름 와코 준야쿠사)을 혼합한 것을 이동상 A로 했다.
(d) 이동상 B:
아세토나이트릴과 이동상 A를 93:7(v/v)로 혼합한 것을 이동상 B로 했다.
(e) 헤파란 황산 표준 원액(HS 표준 원액):
Heparan sulphate(Iduron사)를 주사용수로 용해하여, 5.0mg/mL의 용액을 조제했다. 이 용액을 HS 표준 원액으로 했다.
(f) 헤파란 황산 내부 표준 용액(HS 내부 표준 용액):
붕규산 나사구 시험관에 40μL의 HS 표준 원액을 달아 취하고, 용매를 질소 기류하에서 증류제거했다. 건고물에 400μL의 중수소 라벨화 용매를 첨가하고, 교반한 후, 65℃에서 75분간 반응시켜, 중수소화 메탄올 분해(deuterium methanolysis reaction; 메탄올리시스)를 행했다. 반응 후, 용매를 질소 기류하에서 증류제거했다. 건고물에 500μL의 MeCN/water를 첨가하고, 초음파 처리를 30분간 행했다. 이 용액을 헤파란 황산 내부 표준 용액(HS 내부 표준 용액)으로 했다.
(g) 데르마탄 황산 표준 원액(DS 표준 원액):
Chondroitin sulfate B sodium salt from porcine intestinal mucosa(Sigma-Aldrich사)를 주사용수로 용해하여, 5.0mg/mL의 용액을 조제했다. 이 용액을 DS 표준 원액으로 했다.
(h) 데르마탄 황산 내부 표준 용액(DS 내부 표준 용액):
붕규산 나사구 시험관에 40μL의 DS 표준 원액을 달아 취하고, 용매를 질소 기류하에서 증류제거했다. 건고물에 400μL의 중수소 라벨화 용매를 첨가하고, 교반한 후, 65℃에서 75분간 반응시켜, 중수소화 메탄올 분해를 행했다. 반응 후, 용매를 질소 기류하에서 증류제거했다. 건고물에 500μL의 MeCN/water를 첨가하고, 초음파 처리를 30분간 행했다. 이 용액을 데르마탄 황산 내부 표준 용액(DS 내부 표준 용액)으로 했다.
(i) 내표준 용액:
1mL의 메탄올에, 1μL의 HS 내부 표준 용액 및 1μL의 DS 내부 표준 용액의 비율로 혼합한 것을 교반 후, 초음파 처리를 30분간 행했다. 이 용액을 내표준 용액으로 했다.
(j) 검량선 시료:
980μL의 주사용수를 달아 취하고, 이것에 HS 표준 원액과 DS 표준 원액을 각각 10μL씩 첨가하여, 데르마탄 황산과 헤파란 황산을 각각 50μg/mL씩 함유하는 용액을 조제했다. 이 용액을 주사용수로 희석하여, 데르마탄 황산과 헤파란 황산을, 각각 5000ng/mL씩 함유하는 용액을 조제했다. 이 용액을 주사용수로 단계 희석하여, 데르마탄 황산과 헤파란 황산을, 각각 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500 및 5000ng/mL의 농도로 함유하는 용액을 조제했다. 이들 용액의 20μL를, 각각 붕규산 나사구 시험관에 분취했다. 이 용액을 검량선 시료로 했다.
(k) 조직 추출용 용액
1mL의 폴리옥시에틸렌(10) 옥틸 페닐 에터를 생리 식염액에 첨가하고, 전량을 500mL로 했다. 이 용액을 조직 추출용 용액으로 했다.
(l) 10% 탄산 암모늄 용액
5g의 탄산 암모늄을 50mL의 주사용수에 용해했다. 이 용액을 10% 탄산 암모늄 용액으로 했다.
혈장을 20μL 달아 취하고, 붕규산 나사구 시험관에 분취했다. 이것을 혈액 샘플 용액으로 했다.
채취한 CSF를 20μL 달아 취하고, 붕규산 나사구 시험관에 분취했다. 이것을 CSF 샘플 용액으로 했다.
동결건조한 조직을, 조직 추출용 용액 중에서 파쇄한 후, 상청을 원심분리했다. 이것을 20μL 달아 취하고, 붕규산 나사구 시험관에 분취했다. 이것을 조직 및 장기 샘플 용액으로 했다.
조제한 각 샘플 용액 및 검량선 시료 중의 용매를 질소 기류하에서 증류제거했다. 건고물에, 20μL의 2,2-다이메톡시프로페인(도쿄 화성공업사)과 200μL의 염산의 농도가 3mol/L인 염산 메탄올(Sigma-Aldrich사)을 첨가하고 교반한 후, 반응 온도 70℃, 반응 시간 90분간으로 메탄올리시스 반응을 행했다. 반응 후, 빙랭하여 반응을 정지하고, 200μL의 10% 탄산 암모늄 용액 및 50μL 내표준 용액을 첨가했다. 용매를 질소 기류하에서 증류제거한 후, 건고물에 250μL의 주사용수를 첨가하여 용해시켰다. 이것을, 미리 메탄올 및 주사용수를 통액하여 조절한 고상 카트리지(OASIS HLB(1cc, 30mg, Waters사))에 부하하고, 주사용수로 세정한 후, 메탄올 500μL를 첨가하고, 원심분리로 용출했다. 질소 기류하에서 용매를 증류제거한 후, 주사용수 2mL 및 아세토나이트릴 18mL를 첨가하고, 초음파 처리로 재용해했다. 이것을 원심분리한 후, 상청을 LC 바이알에 충전했다.
LC/MS/MS 분석은, 친수성 상호작용 초고성능 액체 크로마토그래피와 탠덤 사중극형 질량 분석 장치를 조합한 것을 이용하여 실시했다. 질량 분석 장치(MS/MS 장치)로서, QTRAP5500(에이 비 사이엑스사)을 이용하고, 이것에 HPLC 장치로서 Nexera X2(시마즈 제작소)를 세팅했다. 또한, LC 칼럼으로서, Acquity UPLCTM BEH Amide 1.7μm(2.1 X 150mm, Waters사)를 이용했다. 이동상으로서, 이동상 A 및 이동상 B를 이용했다. 또한, 칼럼 온도는 60℃로 설정했다.
이동상 B로 칼럼을 평형화한 후, 5μL의 시료를 주입하고, 표 3에 나타내는 이동상의 그래디언트 조건에서, 크로마토그래피를 실시했다. 한편, 이동상의 유량은 0.4mL/분으로 했다.
Figure pct00003
MS/MS 장치의 이온원 파라미터를, QTRAP5500(에이 비 사이엑스사)의 사용 설명서에 따라, 표 4에 나타내는 바와 같이 설정했다.
Figure pct00004
표 5에 MS 내부 파라미터를 나타낸다.
Figure pct00005
검량선 시료에 대해 LC/MS/MS 분석을 행하여, 검량선 시료 중의 데르마탄 황산 및 헤파란 황산에서 유래하는 프로덕트 이온에 대응하는 크로마토그램 차트 상의 피크의 면적(DS 검출 피크 면적 및 HS 검출 피크 면적)을 구했다. 또한, DS 내부 표준 용액 및 HS 내부 표준 용액에서 유래하는 프로덕트 이온에 대응하는 검출 피크의 면적(DS-IS 검출 피크 면적 및 HS-IS 검출 피크 면적)을 구했다.
각 검량선 시료에 있어서의, DS 내부 표준 용액에서 유래하는 검출 피크 면적에 대한 데르마탄 황산에서 유래하는 검출 피크의 면적(DS 검출 피크 면적/DS-IS 검출 피크 면적)을 세로축에, 각 검량선 시료의 데르마탄 황산 농도를 가로축에 취하고, 2차 판별 분석을 이용하여 회귀식을 얻었다.
각 검량선 시료에 있어서의, HS 내부 표준 용액에서 유래하는 검출 피크 면적에 대한 헤파란 황산에서 유래하는 검출 피크의 면적(HS 검출 피크 면적/HS-IS 검출 피크 면적)을 세로축에, 각 검량선 시료의 헤파란 황산 농도를 가로축에 취하고, 2차 판별 분석을 이용하여 회귀식을 얻었다.
혈액 샘플 용액, CSF 샘플 용액, 및 각 조직 샘플 용액에 대해 LC/MS/MS 분석을 행하여, 샘플 용액 중에 포함되는 데르마탄 황산과 헤파란 황산을 회귀식에 내삽하여 정량했다.
약효의 지표로서, 각 조직에 있어서의 HS 및 DS의 감소 작용을 나타내는 Reduction ratio(%)를 이용했다. Reduction ratio(%)는, {([KO]-[WT])-([Test article]-[WT])}×100/([KO]-[WT])라고 정의했다. 한편, [WT]는 정상 대조군의 평균 HS 또는 DS 농도를, [KO]는 병태 대조군의 평균 HS 또는 DS 농도를, [Test article]은 각 시험 물질 투여군의 평균 HS 또는 DS 농도를 각각 나타낸다.
CSF, 뇌 및 척수 중의 HS 농도(μg/mL) 및 Reduction ratio(%)의 측정 결과를 표 6~8에 나타낸다. Fab-hI2S-rAAV 투여군에서는, CSF, 뇌 및 척수 중의 HS 농도는, 어느 것에 있어서도 병태 대조군과 비교하여 대체로 Reduction ratio(%)가 용량 의존적으로 저하되었다. 이들 결과는, 마우스에게 Fab-hI2S-rAAV를 정맥 주사하는 것에 의해 생체 내에서 발현한 Fab-hI2S가, BBB를 통과하여 중추 신경계의 조직에 도달하고, 중추 신경계의 조직에 있어서 hI2S로서의 효소 활성을 발휘하여, 그렇게 해서 중추 신경계에 축적된 HS를 분해하였음을 나타내는 것이다.
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
혈장, 간장, 비장, 심장, 및 신장 중의 HS 농도(μg/mL) 및 DS 농도(μg/mL) 및 그들의 Reduction ratio(%)를 표 9~13에, 각각 나타낸다. Fab-hI2S-rAAV 투여군에서는, 이들 장기에 있어서의 HS 농도 및 DS 농도는 병태 대조군과 비교하여, Reduction ratio(%)가 대체로 용량 의존적으로 저하되었다. 간장에 있어서는, 1.0×1012 vg/kg을 초과하는 용량의 Fab-hI2S-rAAV를 투여했을 경우, HS 농도 및 DS 농도의 Reduction ratio의 저하가 인정되었지만, 1.0×1012 vg/kg까지의 용량에서는, 용량 의존적으로 저하되었다. 이들 결과는, 마우스에게 Fab-hI2S-rAAV를 정맥 주사를 하는 것에 의해 생체 내에서 발현한 Fab-hI2S가, 중추 신경계뿐만 아니라, 각종 조직에 있어서 hI2S 활성으로서의 효소 활성을 발휘하여, 그렇게 해서 각종 장기에 축적된 HS 및 DS를 분해하였음을 나타내는 것이다.
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
이상의 결과는, Fab-hI2S-rAAV를 정맥 주사하는 것에 의해, 생체 내에서 장기에 걸쳐 Fab-hI2S를 발현시킬 수 있고, 또한, 발현한 Fab-hI2S가, 병태 모델 마우스의 중추 신경계 및 그 외의 조직에 있어서 hI2S 활성을 발휘하여, 그렇게 해서 축적된 HS 및 DS를 분해할 수 있음을 나타내는 것이고, Fab-hI2S-rAAV가 헌터 증후군의 치료제, 특히 헌터 증후군에 있어서의 중추 신경 장애의 치료제로서 유효함을 나타내는 것이다.
hI2S 대신에 다른 리소좀 효소를 짜넣은 rAAV 비리온이어도, 마찬가지의 결과가 얻어진다고 생각된다. 따라서, 다른 리소좀 효소를 짜넣은 rAAV 비리온도, 당해 다른 리소좀 효소의 유전자 이상을 원인으로 하는 질환의 치료제로서 사용할 수 있다고 생각된다. 또한, hI2S 대신에 사이토카인 등의 액성 인자, 항체 의약 등의 소망의 단백질을 짜넣은 rAAV 비리온이어도, 중추 신경계에서 당해 소망의 단백질의 기능을 발휘시킬 수 있다고 생각되므로, 이들 rAAV 비리온도 또한, 중추 신경계의 이상을 수반하는 질환의 치료제로서 사용할 수 있다고 생각된다.
〔실시예 18〕 pAAV-mMAP-Fab-hGLB1 벡터의 구축
5＇측으로부터, ClaI 사이트, 마우스 α 페토프로틴 인핸서/마우스 알부민 프로모터, 닭 β 액틴/MVM 키메라 인트론, 항hTfR 항체의 중쇄의 Fab 영역의 C말단측에 hGLB1이 결합한 결합체를 코딩하는 유전자, 돼지 테스코바이러스 유래 2A 펩타이드를 코딩하는 염기 서열, 항hTfR 항체의 경쇄를 코딩하는 유전자, 소 성장 호르몬 폴리 A서열, 및 BglII 사이트를 포함하는 서열 번호 47로 나타나는 염기 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성했다. 이 DNA 단편을 ClaI와 BglII로 소화했다. pAAV-CMV 벡터(다카라 바이오사)를 ClaI와 BglII로 소화하고, 이것에 상기의 제한 효소 처리한 DNA 단편을 삽입했다. 얻어진 플라스미드를 pAAV-mMAP-Fab-hGLB1 벡터로 했다. pAAV-mMAP-Fab-hGLB1 벡터는, 도 1에서 나타나는 pAAV-mMAP-Fab-hI2S 벡터의 부호 4로 나타나는 부위가, 항hTfR 항체의 중쇄의 Fab 영역의 C말단측에 hGLB1이 결합한 결합체를 코딩하는 유전자로 치환되고, 및 동 부호 5로 나타나는 부위가, 돼지 테스코바이러스 유래 2A 펩타이드를 코딩하는 염기 서열로 치환된 구조를 갖는다. pAAV-mMAP-Fab-hGLB1 벡터는, 상류로부터 순차로, 제1 AAV-ITR의 기능적 등가물(서열 번호 6), 마우스 α 페토프로틴 인핸서/마우스 알부민 프로모터(서열 번호 8), 닭 β 액틴/MVM 키메라 인트론(서열 번호 9), 항hTfR 항체의 중쇄의 Fab 영역의 C말단측에 hGLB1이 결합한 결합체(서열 번호 48)를 코딩하는 유전자, 돼지 테스코바이러스 유래 2A 펩타이드를 코딩하는 염기 서열(서열 번호 49), 항hTfR 항체의 경쇄(서열 번호 10)를 코딩하는 유전자, 소 성장 호르몬 polyA 시그널(서열 번호 17), 제2 AAV-ITR의 기능적 등가물(서열 번호 7)을 포함하는 구조를 갖는다. 더욱이, pAAV-mMAP-Fab-hGLB1 벡터는, 암피실린 내성 유전자 및 복제 개시점(ColE1 ori)을 포함한다. 또한 hGLB1은 리소좀 효소의 일종이며, hGLB1의 유전자 이상은 GM1-강글리오시도시스의 원인이 된다.
〔실시예 19〕 Fab-hGLB1 유전자를 코딩하는 rAAV를 포함하는 rAAV 용액의 조제
pHelper 벡터(다카라 바이오사), pR2(mod)C8 벡터, 및 pAAV-mMAP-Fab-hGLB1 벡터를 포함하는 트랜스펙션용의 DNA 용액을 이용하여, 실시예 4에 기재된 방법으로 Fab-hGLB1 유전자를 코딩하는 rAAV 비리온을 산생시켰다. 얻어진 rAAV 비리온을 Fab-hGLB1-rAAV로 했다. Fab-hGLB1-rAAV는, 세포에 감염시켰을 때에, 항인간 트랜스페린 리셉터 항체 Fab 영역 중쇄의 C말단측에 인간 β-갈락토시다제가 결합한 결합체와 항인간 hTfR 항체 경쇄를 포함하는 융합 단백질을 발현할 것이 기대되는 것이다. 추가로, 실시예 5~10에 기재된 방법에 준하여 Fab-hGLB1 유전자를 코딩하는 rAAV를 포함하는 rAAV 용액(Fab-hGLB1-rAAV 용액)을 취득했다. 이 Fab-hGLB1-rAAV 용액 중의 바이러스 게놈양을 실시예 11에 기재된 방법으로 측정했다.
〔실시예 20〕 GLB1-KO/hTfR-KI 마우스를 이용한 Fab-hGLB1-rAAV의 약효 평가
Fab-hGLB1-rAAV를 생체에 투여했을 때의 약효 평가를, 실시예 12에 기재된 방법에 준하여 제작한, GM1-강글리오시도시스의 모델 마우스인 GLB1-KO/hTfR-KI 마우스를 이용하여 행했다. GLB1-KO/hTfR-KI 마우스는, β-갈락토시다제(GLB1) 유전자를 호모로 결손하고 또한 키메라 TfR 유전자를 헤테로로 갖는 마우스이다. GLB1-KO/hTfR-KI 마우스는 10~12주령(투여 개시 시)의 것을 이용했다. 실시예 19에서 조제한 Fab-hGLB1-rAAV 용액을 GLB1-KO/hTfR-KI 마우스에게 1.0×1013 vg/kg, 및 1.0×1014 vg/kg의 용량이 되도록 단회 꼬리 정맥내 투여했다(각 군 N=3). 또한, 웅성 야생형 마우스로 이루어지는 정상 대조군과, 웅성 GLB1-KO/hTfR-KI 마우스로 이루어지는 병태 대조군을 두었다(각 군 N=3). 정상 대조군 및 병태 대조군에는 생리 식염액(오쓰카 제약 공장사)을 투여했다.
투여로부터 8, 15, 22일 후에, 꼬리 정맥으로부터 소량의 혈액을 EDTA-2K 코트 채혈관(캐피젝트, 테루모사)에 채취하고, 빙상 정치 후, 원심(2000×g, 20분간, 4℃)하고 혈장을 회수했다. 투여로부터 29일 후에 베토르팔(Meiji Seika 파르마사)·미다졸람(산도사)·도미톨(닛폰 젠야쿠 공업사)의 3제의 혼합 마취하에서, 소뇌연수조로부터 뇌척수액(Cerebrospinal fluid, CSF)을 채취했다. 그 다음에 마우스를 개흉하여 심 채혈을 행했다. 혈액은 EDTA-2K 코트 채혈관(캐피젝트, 테루모사)에 채취하고, 빙상 정치 후, 원심(2000×g, 20분간)하고 혈장을 회수했다. 그 다음에, 생리 식염액(오쓰카 제약 공장사)으로 전신 관류하고, 뇌, 척수, 간장, 심장, 신장 및 비장을 각각 적출했다. 각 조직의 습중량을 측정한 후, 재빠르게 액체 질소에 침지하여 급속 동결했다.
〔실시예 21〕 혈장 중의 Fab-hGLB1의 정량
혈장 상청 중 Fab-hGLB1의 농도 측정은, 실시예 22 기재의 방법에 의해 행했다. 그 결과를 표 14에 나타낸다. Fab-hGLB1 농도는, 혈장 1mL당에 포함되는 Fab-hGLB1의 양(μg/mL혈장)으로서 산출했다.
Fab-hGLB1-rAAV 투여군에서는, 어느 투여량에서도 투여 후 8일부터 투여 후 29일까지 혈장 중의 Fab-hGLB1 농도가 상승했다. 또한, 혈장 중의 Fab-hGLB1 농도는 투여량 의존적으로 상승했다. 이들 데이터는, 마우스에게 정맥 주사된 Fab-hGLB1-rAAV가 세포에 흡수되어, 세포 내에서 hGLB1을 코딩하는 유전자가 전사, 번역되어 발현한 hGLB1이, 혈액 중에 방출되었음을 나타낸다.
Figure pct00014
〔실시예 22〕 혈장 중의 Fab-hGLB1의 농도 측정
혈장 중의 Fab-hGLB1 농도의 측정은 대체로 하기의 방법으로 실시했다. Streptavidin Gold plate(Meso scale diagnostics사)의 각 웰에 Superblock Blocking Buffer in PBS(Thermo Fisher Scientific사)를 150μL씩 첨가하고, 1시간 이상 진탕하여 플레이트를 블로킹했다. 그 다음에, 비오틴화 항hGLB1 모노클로날 항체 및 SULFO화 항hGLB1 모노클로날 항체의 혼합 용액에, 기지 농도의 Fab-hGLB1을 포함하는 검량선용 표준 시료(Fab-hGLB1 검량선용 표준 시료) 및 혈장을 각각 가하고 1시간 이상 진탕하여 항체 반응액으로 했다. 한편, 항hGLB1 모노클로날 항체는, 서열 번호 50으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간 β-갈락토시다제로 면역한 마우스로부터 취득한 비 세포를 이용하여 통상적 방법으로 제작한 항hGLB1 산생 하이브리도마를 배양하는 것에 의해 취득했다. 얻어진 모노클로날 항체 중 1개를 Biotin Labeling Kit-NH2(도진 화학 연구소사)를 이용하여 첨부된 프로토콜에 따라 수식하여 비오틴화 항hGLB1 모노클로날 항체를 얻었다. 또한, 얻어진 모노클로날 항체 중 다른 1개를 MSD GOLD SULFO-TAG NHS-Ester(Meso scale Diagnostics사)를 이용하여 첨부된 프로토콜에 따라 수식하여, SULFO화 항hGLB1 모노클로날 항체를 얻었다. 각 웰로부터 블로킹 용액을 제거하고, 0.05% Tween 20 함유 PBS(PBST, Sigma Aldrich사)로 세정 후, 각 웰에 항체 반응액을 25μL 첨가하고, 1시간 이상 진탕했다. 그 다음에 항체 반응액을 제거하고, PBST로 세정 후, 주사용수(오쓰카 제약 공장사)로 1/2로 희석한 4X Read Buffer(Meso scale diagnostics사)를 150μL 첨가하고, SectorTM Imager S600(Meso scale diagnostics사)을 이용하여 각 웰로부터의 발광량을 측정했다. Fab-hGLB1 검량선용 표준 시료의 측정치로부터 검량선을 작성하고, 이것에 각 검체의 측정치를 내삽하는 것에 의해, 혈장 1mL당에 포함되는 Fab-hGLB1의 양(혈장 중의 Fab-hGLB1 농도)을 산출했다. 한편, 검량선용 표준 시료에 포함되는 Fab-hGLB1은, 서열 번호 48로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 항hTfR 항체의 중쇄의 Fab 영역의 C말단에 인간 GLB1이 결합한 결합체와, 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 항hTfR 항체의 경쇄로 이루어지는 융합 단백질(Fab-hGLB1)을, 통상적 방법에 의해 CHO 세포에 발현시켜, 취득한 것이다.
〔실시예 23〕 뇌 및 척수 조직 중의 Fab-hGLB1의 정량
뇌 및 척수 조직 중의 Fab-hGLB1 농도의 측정은, 실시예 20에서 채취한 뇌 및 척수를 0.025% Protease Inhibitor Cocktail(Sigma-Aldrich사)을 함유하는 RIPA Buffer(와코 준야쿠 공업사)로 호모지나이즈하고, 얻어진 호모지네이트를 원심하여 회수한 상청을 이용하여, 실시예 22에 기재된 방법에 준하여 실시했다. Fab-hGLB1 농도는, 조직 1g당에 포함되는 Fab-hGLB1의 양(μg/mg 조직)으로서 산출했다. 뇌 및 척수 조직 중의 Fab-hGLB1의 농도 측정의 결과를 표 15 및 16에 각각 나타낸다. 뇌 및 척수 조직에 있어서, Fab-hGLB1-rAAV 투여군에서는, 어느 투여량에서도 Fab-hGLB1이 검출되었다. 한편, Fab-hGLB1-rAAV 비투여군에서는, GLB1 KO 마우스의 뇌 및 척수 조직에 있어서, Fab-hGLB1은 검출되지 않았다. 또한, Fab-hGLB1 농도는 투여량 의존적으로 상승했다. 이들 데이터는, 마우스에게 Fab-hGLB1-rAAV를 정맥내 주사하는 것에 의해, Fab-GLB1을 중추 신경 조직 중에 분포시키는 것이 가능함을 나타낸다.
Figure pct00015
Figure pct00016
〔실시예 24〕 CSF, 뇌 및 척수 조직 중의 lyso-GM1의 정량
CSF, 혈장, 및 각 조직 중의 lyso-GM1의 정량은, WO2021/039644에 기재된 방법으로 실시했다. 한편, lyso-GM1은, GLB1에 의해 분해되는 기질이며, GM1-강글리오시도시스의 환자의 조직 내에 축적하는 물질이다. 따라서, 조직 내에서의 lyso-GM1을 정량하는 것에 의해, GM1-강글리오시도시스의 모델 동물에게 투여한 약제의, 당해 질환에 대한 약효를 평가할 수 있다. 약효의 지표로서, 각 조직에 있어서의 lyso-GM1의 감소 작용을 나타내는 Reduction ratio(%)를 이용했다. Reduction ratio(%)는, {([KO]-[WT])-([Test article]-[WT])}×100/([KO]-[WT])라고 정의했다. 한편, [WT]는 정상 대조군의 평균 lyso-GM1 농도를, [KO]는 병태 대조군의 평균 lyso-GM1 농도를, [Test article]은 각 시험 물질 투여군의 평균 lyso-GM1 농도를 각각 나타낸다.
CSF, 뇌 및 척수 중의 lyso-GM1 농도의 측정 결과 및 Reduction ratio(%)를 표 17, 18 및 19에 각각 나타낸다. CSF 중의 lyso-GM1 농도는, CSF 1mL당에 포함되는 lyso-GM1 농도의 양(μg/mL CSF)으로서 산출했다. 뇌 및 척수 중의 lyso-GM1 농도는, 각 조직 1mg당에 포함되는 lyso-GM1 농도의 양(μg/mg 조직)으로서 산출했다. Fab-hGLB1-rAAV 투여군에서는, CSF, 뇌 및 척수 중의 lyso-GM1 농도는 병태 대조군과 비교하여, 어느 투여군에 있어서도 저하되었다. 이들 결과는, 마우스에게 Fab-hGLB1-rAAV를 정맥내 주사하는 것에 의해 생체 내에서 발현한 Fab-hGLB1이, BBB를 통과하여 중추 신경계의 조직에 도달하고, 중추 신경계의 조직에 있어서 hGLB1 활성을 발휘하여, 그렇게 해서 중추 신경계에 축적된 lyso-GM1을 분해하였음을 나타내는 것이다.
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
또한, 데이터는 나타내지 않지만 혈장 및 간장, 심장, 신장 및 비장의 lyso-GM1 농도는, 어느 투여군에 있어서도 정상 대조군과 동일한 정도까지 저하되었다.
이상의 결과는, Fab-hGLB1-rAAV를 정맥 주사하는 것에 의해, 생체 내에서 장기에 걸쳐 Fab-hGLB1을 발현시킬 수 있고, 또한, 발현된 Fab-hGLB1이, 병태 모델 마우스의 중추 신경계 및 그 외의 조직에 있어서 hGLB1 활성을 발휘하고, 그렇게 해서 이상하게 축적한 hGLB1의 기질을 분해할 수 있음을 나타내는 것이고, Fab- hGLB1-rAAV가 GM1-강글리오시도시스의 치료제, 특히 GM1-강글리오시도시스에 있어서의 중추 신경 장애의 치료제로서 유효함을 나타내는 것이다.
본 발명에 의하면, 예를 들어, 리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 세포, 조직, 또는 생체 내에 있어서 발현시킬 수 있는, 플라스미드의 형태, 재조합 바이러스 비리온에 내포된 형태, 또는 리포솜, 지질 나노입자 등에 내포된 형태의 핵산 분자를 의약으로서 공급할 수 있다.
1 제1 AAV-ITR의 기능적 등가물
2 마우스 α 페토프로틴 인핸서/마우스 알부민 프로모터
3 닭 β 액틴/MVM 키메라 인트론
4 항hTfR 항체의 중쇄의 Fab 영역의 C말단측에 hI2S가 결합한 결합체를 코딩하는 유전자
5 마우스 뇌심근염 바이러스의 5' 비번역 영역에서 유래하는 내부 리보솜 결합 부위
6 항hTfR 항체의 경쇄를 코딩하는 유전자
7 소 성장 호르몬 polyA 시그널
8 제2 AAV-ITR의 기능적 등가물
9 암피실린 내성 유전자
10 복제 개시점(ColE1 ori)
11 p5 프로모터
12 AAV2의 Rep 영역
13 AAV8의 Cap 영역
14 인핸서로서 기능하는 p5 프로모터
서열 번호 1: 링커의 아미노산 서열의 일례 1
서열 번호 2: 링커의 아미노산 서열의 일례 2
서열 번호 3: 링커의 아미노산 서열의 일례 3
서열 번호 4: 혈청형 2의 AAV의 제1 역방향 말단 반복(제1 ITR)의 염기 서열, 야생형
서열 번호 5: 혈청형 2의 AAV의 제1 역방향 말단 반복(제2 ITR)의 염기 서열, 야생형
서열 번호 6: 제1 역방향 말단 반복(제1 ITR)의 염기 서열의 호적한 일례, 합성 서열
서열 번호 7: 제2 역방향 말단 반복(제2 ITR)의 염기 서열의 호적한 일례, 합성 서열
서열 번호 8: 마우스 α 페토프로틴 인핸서/마우스 알부민 프로모터의 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 9: 닭 β 액틴/MVM 키메라 인트론의 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 10: 마우스 뇌심근염 바이러스의 5' 비번역 영역에서 유래하는 내부 리보솜 결합 부위의 염기 서열의 일례
서열 번호 11: 인간 트랜스페린 수용체의 아미노산 서열
서열 번호 12: 항hTfR 항체의 중쇄의 Fab 영역의 아미노산 서열의 일례
서열 번호 13: 링커의 아미노산 서열의 일례 4
서열 번호 14: 인간 I2S의 아미노산 서열
서열 번호 15: 항hTfR 항체의 경쇄의 아미노산 서열의 일례
서열 번호 16: 항hTfR 항체의 중쇄의 아미노산 서열의 일례
서열 번호 17: 소 성장 호르몬 polyA 시그널의 염기 서열
서열 번호 18: pAAV-mMAP-Fab-hI2S 벡터를 제작하기 위해서 합성한 DNA 단편의 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 19: pR2(mod)C6 벡터를 제작하기 위해서 합성한 DNA 단편의 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 20: pR2(mod)C8 벡터를 제작하기 위해서 합성한 DNA 단편의 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 21: p5 프로모터를 포함하는 AAV2의 Rep 영역의 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 22: AAV8의 Cap 영역의 염기 서열
서열 번호 23: p5 프로모터의 염기 서열
서열 번호 24: AAV2의 Rep 영역을 포함하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 25: 프라이머 SI-1의 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 26: 프라이머 SI-2의 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 27: 프로브 SI-1의 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 28: 프라이머 SI-3의 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 29: 프라이머 SI-4의 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 30: 프로브 SI-2의 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 31: 항hTfR 항체의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열 1
서열 번호 32: 항hTfR 항체의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열 2
서열 번호 33: 항hTfR 항체의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열 1
서열 번호 34: 항hTfR 항체의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열 2
서열 번호 35: 항hTfR 항체의 경쇄 CDR3의 아미노산 서열 1
서열 번호 36: 항hTfR 항체의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열 1
서열 번호 37: 항hTfR 항체의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열 2
서열 번호 38: 항hTfR 항체의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열 1
서열 번호 39: 항hTfR 항체의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열 2
서열 번호 40: 항hTfR 항체의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열 1
서열 번호 41: 항hTfR 항체의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열 2
서열 번호 42: 항hTfR 항체의 중쇄의 Fab 영역과 인간 I2S의 결합체의 아미노산 서열
서열 번호 43: 제1 긴 말단 반복(제1 LTR)의 염기 서열의 호적한 일례, 합성 서열
서열 번호 44: 제2 긴 말단 반복(제2 LTR)의 염기 서열의 호적한 일례, 합성 서열
서열 번호 45: 센다이 바이러스 게놈의 리더의 염기 서열
서열 번호 46: 센다이 바이러스 게놈의 트레일러의 염기 서열
서열 번호 47: pAAV-mMAP-Fab-hGLB1 벡터를 제작하기 위해서 합성한 DNA 단편의 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 48: 항hTfR 항체의 중쇄의 Fab 영역과 인간 β-갈락토시다제의 결합체의 아미노산 서열의 일례
서열 번호 49: 돼지 테스코바이러스 유래 2A 펩타이드를 코딩하는 염기 서열
서열 번호 50: 인간 β-갈락토시다제의 아미노산 서열
SEQUENCE LISTING <110> JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. <120> A nucleic acid molecule containing a gene encoding a fusion protein of an antibody and a physiologically active protein <130> 1235JP <150> JP2021-002567 <151> 2021-01-12 <160> 50 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of an exemplified linker 1 <400> 1 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of an exemplified linker 2 <400> 2 Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of an exemplified linker 3 <400> 3 Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 4 <211> 145 <212> DNA <213> adeno-associated virus 2 <400> 4 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttcct 145 <210> 5 <211> 145 <212> DNA <213> adeno-associated virus 2 <400> 5 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag agagggagtg gccaa 145 <210> 6 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A preferable example of nucleic acid sequence of the first Inverted Terminal Repeat (first ITR) , synthetic sequence <400> 6 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc t 141 <210> 7 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A preferable example of nucleic acid sequence of the second Inverted Terminal Repeat (second ITR) , synthetic sequence <400> 7 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag ctgcctgcag g 141 <210> 8 <211> 559 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of mouse alpha fetoprotein enhancer/mouse albumin promoter, synthetic sequence <400> 8 agatcatttt gatggcagag ttcagtttac cgggtcacat tgtacctggg aagattcaag 60 gatttatgga aaaagtcaac aacaggagtc agagcagccg gaaaagcatg gactctgtac 120 ttaggactgc gctttgagca atggcacagc aagctataac cctgtttgca gtcagcacac 180 aaactgtggt tcaaagctcc actttatctc ttcttgtgga attcagatat cagatcagtt 240 ttgctcaaat gggagacaaa gagattaagc tcttatgtaa aatttgctgt tttacataac 300 tttaatgaat ggacaaagtc ttgtgcatgg gggtgggggt ggggttagag gggaacagct 360 ccagatggca aacatacgca agggatttag tcaaacaact ttttggcaaa gatggtatga 420 ttttgtaatg gggtaggaac caatgaaatg cgaggtaagt atggttaata atctacagtt 480 attggttaaa gaagtatatt agagcgagtc tttctgcaca cagatcacct tcctatcaac 540 cccactagcc tctggcaaa 559 <210> 9 <211> 225 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of chicken beta actin/MVM chimeric intron, synthetic sequence <400> 9 ggagtcgctg cgttgccttc gccccgtgcc ccgctccgcg ccgcctcgcg ccgcccgccc 60 cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg 120 ggctgtaatt agcaagaggt aagggtttaa gggatggttg gttggtgggg tattaatgtt 180 taattacctg gagcacctgc ctgaaatcac tttttttcag gttgg 225 <210> 10 <211> 593 <212> DNA <213> Encephalomyocarditis virus <400> 10 cccccccccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc cgaagccgct tggaataagg 60 ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc caccatattg ccgtcttttg gcaatgtgag 120 ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt cccctctcgc 180 caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca gttcctctgg aagcttcttg 240 aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg aaccccccac ctggcgacag 300 gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct gcaaaggcgg cacaacccca 360 gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa tggctctcct caagcgtatt 420 caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt atgggatctg atctggggcc 480 tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa aaacgtctag gccccccgaa 540 ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac acgatgataa tatggccaca acc 593 <210> 11 <211> 760 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu 1 5 10 15 Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp 20 25 30 Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Glu Glu Glu Asn Ala 35 40 45 Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys Pro Lys Arg Cys Ser Gly 50 55 60 Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Val Phe Phe Leu Ile Gly 65 70 75 80 Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr 85 90 95 Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Val Arg Glu Glu Pro 100 105 110 Gly Glu Asp Phe Pro Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys 115 120 125 Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr Gly Thr Ile 130 135 140 Lys Leu Leu Asn Glu Asn Ser Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln 145 150 155 160 Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Val Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe 165 170 175 Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val 180 185 190 Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg 195 200 205 Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys 210 215 220 Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys 225 230 235 240 Lys Asp Phe Glu Asp Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile 245 250 255 Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu 260 265 270 Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe 275 280 285 Pro Ile Val Asn Ala Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly 290 295 300 Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln 305 310 315 320 Phe Pro Pro Ser Arg Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr 325 330 335 Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp 340 345 350 Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser 355 360 365 Glu Ser Lys Asn Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Ile 370 375 380 Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp 385 390 395 400 His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala 405 410 415 Ala Lys Ser Gly Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met 420 425 430 Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile 435 440 445 Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr 450 455 460 Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr 465 470 475 480 Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val 485 490 495 Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asn 500 505 510 Val Lys His Pro Val Thr Gly Gln Phe Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp 515 520 525 Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe 530 535 540 Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp 545 550 555 560 Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu 565 570 575 Ile Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu 580 585 590 Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Val Glu Leu Asn 595 600 605 Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Ser Phe Val Arg Asp 610 615 620 Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Ile Lys Glu Met Gly Leu 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Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 14 <211> 525 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu 1 5 10 15 Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys 20 25 30 Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu 35 40 45 Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val 50 55 60 Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe 65 70 75 80 Asn Ser Tyr Trp Arg Val His Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln 85 90 95 Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe 100 105 110 His Pro Gly Ile Ser Ser Asn His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp 115 120 125 Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys 130 135 140 Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro 145 150 155 160 Val Asp Val Leu Asp Val Pro Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser 165 170 175 Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser 180 185 190 Pro Phe Phe Leu 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Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr 225 <210> 17 <211> 208 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 17 ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60 tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120 tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180 gggaagacaa tagcaggcat gctgggga 208 <210> 18 <211> 4744 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of the DNA fragment synthesized for construction of pAAV-mMAP-Fab-hI2S vector, synthetic sequence <400> 18 atcgatatca agcttagatc attttgatgg cagagttcag tttaccgggt cacattgtac 60 ctgggaagat tcaaggattt atggaaaaag tcaacaacag gagtcagagc agccggaaaa 120 gcatggactc tgtacttagg actgcgcttt gagcaatggc acagcaagct ataaccctgt 180 ttgcagtcag cacacaaact gtggttcaaa gctccacttt atctcttctt gtggaattca 240 gatatcagat cagttttgct caaatgggag acaaagagat taagctctta tgtaaaattt 300 gctgttttac ataactttaa tgaatggaca aagtcttgtg catgggggtg ggggtggggt 360 tagaggggaa cagctccaga tggcaaacat acgcaaggga tttagtcaaa caactttttg 420 gcaaagatgg tatgattttg taatggggta ggaaccaatg aaatgcgagg taagtatggt 480 taataatcta cagttattgg ttaaagaagt atattagagc gagtctttct gcacacagat 540 caccttccta tcaaccccac tagcctctgg caaaggtacc agtgtacagg gagtcgctgc 600 gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgcgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 660 gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 720 gcaagaggta agggtttaag ggatggttgg ttggtggggt attaatgttt aattacctgg 780 agcacctgcc tgaaatcact ttttttcagg ttggacgcgt cgccaccatg ggttggagcc 840 tcatcttgct cttccttgtc gctgttgcta cgcgagtcgg cagcgaggtg caactagtgc 900 agtctggagc agaggtgaaa aagcccgggg agtctctgaa gatttcctgt aagggttctg 960 gatacagctt tatgaactac tggctgggat gggtgcgcca gatgcccggg aaaggcctgg 1020 agtggatggg ggacatctac cccggcggag actaccctac atacagcgag aagttcaagg 1080 tccaggtcac catctcagcc gacaagtcca tcagcaccgc ctacctgcag ttgagcagcc 1140 tgaaggcctc ggacaccgcc atgtattact gtgcgagatc aggcaattac gacgaagtgg 1200 cctactgggg ccaaggaacc ctggtcaccg tctcctcagc tagcaccaag ggcccatcgg 1260 tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc 1320 tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca 1380 gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg 1440 tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca 1500 agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagccgaa gagctgtgat aagacgcata 1560 cgggtggcgg agggtctgga ggtggcggat caggcggagg tggatcttcc gaaacgcagg 1620 ccaactcgac cacagatgct ctgaacgttc ttctcatcat cgtggatgac ctgcgcccct 1680 ccctgggctg ttatggggat aagctggtga ggtccccaaa tattgaccaa ctggcatccc 1740 acagcctcct cttccagaat gcctttgcgc agcaagcagt gtgcgccccg agccgcgttt 1800 ctttcctcac tggcaggaga cctgacacca cccgcctgta cgacttcaac tcctactgga 1860 gggtgcacgc tggaaacttc tccaccatcc cccagtactt caaggagaat ggctatgtga 1920 ccatgtcggt gggaaaagtc tttcaccctg ggatatcttc taaccatacc gatgattctc 1980 cgtatagctg gtcttttcca ccttatcatc cttcctctga gaagtatgaa aacactaaga 2040 catgtcgagg gccagatgga gaactccatg ccaacctgct ttgccctgtg gatgtgctgg 2100 atgttcccga gggcaccttg cctgacaaac agagcactga gcaagccata cagttgttgg 2160 aaaagatgaa aacgtcagcc agtcctttct tcctggccgt tgggtatcat aagccacaca 2220 tccccttcag ataccccaag gaatttcaga agttgtatcc cttggagaac atcaccctgg 2280 cccccgatcc cgaggtccct gatggcctac cccctgtggc ctacaacccc tggatggaca 2340 tcaggcaacg ggaagacgtc caagccttaa acatcagtgt gccgtatggt ccaattcctg 2400 tggactttca gcggaaaatc cgccagagct actttgcctc tgtgtcatat ttggatacac 2460 aggtcggccg cctcttgagt gctttggacg atcttcagct ggccaacagc accatcattg 2520 catttacctc ggatcatggg tgggctctag gtgaacatgg agaatgggcc aaatacagca 2580 attttgatgt tgctacccat gttcccctga tattctatgt tcctggaagg acggcttcac 2640 ttccggaggc aggcgagaag cttttccctt acctcgaccc ttttgattcc gcctcacagt 2700 tgatggagcc aggcaggcaa tccatggacc ttgtggaact tgtgtctctt tttcccacgc 2760 tggctggact tgcaggactg caggttccac ctcgctgccc cgttccttca tttcacgttg 2820 agctgtgcag agaaggcaag aaccttctga agcattttcg attccgtgac ttggaagaag 2880 atccgtacct ccctggtaat ccccgtgaac tgattgccta tagccagtat ccccggcctt 2940 cagacatccc tcagtggaat tctgacaagc cgagtttaaa agatataaag atcatgggct 3000 attccatacg caccatagac tataggtata ctgtgtgggt tggcttcaat cctgatgaat 3060 ttctagctaa cttttctgac atccatgcag gggaactgta ttttgtggat tctgacccat 3120 tgcaggatca caatatgtat aatgattccc aaggtggaga ccttttccag ttgttgatgc 3180 cttaataagc ggccgccccc cccccctctc cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa 3240 gccgcttgga ataaggccgg tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc atattgccgt 3300 cttttggcaa tgtgagggcc cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg 3360 gtctttcccc tctcgccaaa ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc 3420 ctctggaagc ttcttgaaga caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc 3480 ccccacctgg cgacaggtgc ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa 3540 aggcggcaca accccagtgc cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc 3600 tctcctcaag cgtattcaac aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg 3660 gatctgatct ggggcctcgg tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaaac 3720 gtctaggccc cccgaaccac ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga tgataatatg 3780 gccacaacca tgggctggag ctggattctg ctgttcctcc tgagcgtgac agcaggagtg 3840 cacagcgaca tcgtgatgac ccagactccc ctgagcctga gcgtgacacc tggccagcct 3900 gccagcatca gctgcagaag ctctcagagc ctggtgcaca gcaacggcaa cacctacctg 3960 cactggtatc tgcagaagcc cggccagagc cctcagctgc tgatctacaa ggtgtccaac 4020 agattcagcg gcgtgcccga cagattctcc ggcagcggct ctggcaccga cttcaccctg 4080 aagatttcca gagtggaagc cgaggacgtg ggcgtgtact actgcagcca gagcacccac 4140 gtgccctgga cattcggcca gggcaccaag gtggaaatca agagaaccgt ggccgctccc 4200 agcgtgttca tcttcccacc tagcgacgag cagctgaagt ccggcacagc ctctgtcgtg 4260 tgcctgctga acaacttcta cccccgcgag gccaaggtgc agtggaaggt ggacaacgcc 4320 ctgcagagcg gcaacagcca ggaaagcgtg accgagcagg actccaagga cagcacctac 4380 agcctgagca gcaccctgac cctgagcaag gccgactacg agaagcacaa ggtgtacgcc 4440 tgcgaagtga cccaccaggg cctgtctagc cccgtgacca agagcttcaa cagaggcgag 4500 tgctaaattt aaatgcggcc gcatttaaat ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg 4560 tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct 4620 aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg 4680 gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggaag 4740 atct 4744 <210> 19 <211> 2820 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of the DNA fragment synthesized for construction of pR2(mod)C6 vector, synthetic sequence <400> 19 agcgctcgga ccgggcgcgc tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc 60 ctgtacaggc tgaccggtgt tgcctaggtg aatggcgaat ggtcaggtgg cacttttcgg 120 ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 180 ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt 240 attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt 300 gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg 360 ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa 420 cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt 480 gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag 540 tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt 600 gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga 660 ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt 720 tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta 780 gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg 840 caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc 900 cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt 960 atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg 1020 gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg 1080 attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa 1140 cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 1200 atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 1260 tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 1320 ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 1380 ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta gttaggccac 1440 cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 1500 gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 1560 gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 1620 acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc 1680 gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 1740 agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 1800 tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 1860 agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt 1920 cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc 1980 gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc 2040 ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctggcacgac 2100 aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag ttagctcact 2160 cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg tggaattgtg 2220 agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa cggaccggga 2280 ggggtggagt cgtgacgtga attacgtcat agggttaggg aggtcctgta ttagaggtca 2340 cgtgagtgtt ttgcgacatt ttgcgacacc atgtggtctc gctggggggg ggggcccgag 2400 tgagcacgca gggtctccat tttgaagcgg gaggtttgaa cgcgcagccg ccacgccggg 2460 gttttacgag attgtgatta aggtccccag cgaccttgac gagcatctgc ccggcatttc 2520 tgacagcttt gtgaactggg tggccgagaa ggaatgggag ttgccgccag attctgacat 2580 ggatctgaat ctgattgagc aggcacccct gaccgtggcc gagaagctgc agcgcgactt 2640 tctgacggaa tggcgccgtg tgagtaaggc cccggaggcc cttttctttg tgcaatttga 2700 gaagggagag agctacttcc acatgcacgt gctcgtggaa accaccgggg tgaaatccat 2760 ggttttggga cgtttcctga gtcagattcg cgaaaaactg attcagagaa tttaccgcgg 2820 <210> 20 <211> 2911 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of the DNA fragment synthesized for construction of pR2(mod)C8 vector, synthetic sequence <400> 20 aagcttcgat caactacgca gacaggtacc aaaacaaatg ttctcgtcac gtgggcatga 60 atctgatgct gtttccctgc agacaatgcg agagaatgaa tcagaattca aatatctgct 120 tcactcacgg acagaaagac tgtttagagt gctttcccgt gtcagaatct caacccgttt 180 ctgtcgtcaa aaaggcgtat cagaaactgt gctacattca tcatatcatg ggaaaggtgc 240 cagacgcttg cactgcctgc gatctggtca atgtggattt ggatgactgc atctttgaac 300 aataaatgat ttaaatcagg tatggctgcc gatggttatc ttccagattg gctcgaggac 360 aacctctctg agggcattcg cgagtggtgg gacttgaaac ctggagcccc gaaacccaaa 420 gccaaccagc aaaagcagga cgacggccgg ggtctggtgc ttcctggcta caagtacctc 480 ggacccttca acggactcga caagggggag cccgtcaacg cggcggatgc agcggccctc 540 gagcacgaca aggcctacga ccagcagctc aaagcgggtg acaatccgta cctgcggtat 600 aaccacgccg acgccgagtt tcaggagcgt ctgcaagaag atacgtcttt tgggggcaac 660 ctcgggcgag cagtcttcca ggccaagaag agggttctcg aaccttttgg tctggttgag 720 gaaggtgcta agacggctcc tggaaagaaa cgtccggtag agcagtcgcc acaagagcca 780 gactcctcct cgggcattgg caagacaggc cagcagcccg ctaaaaagag actcaatttt 840 ggtcagactg gcgactcaga gtcagtcccc gacccacaac ctctcggaga acctccagca 900 acccccgctg ctgtgggacc tactacaatg gcttcaggcg gtggcgcacc aatggcagac 960 aataacgaag gcgccgacgg agtgggtaat gcctcaggaa attggcattg cgattccaca 1020 tggctgggcg acagagtcat caccaccagc acccgaacat gggccttgcc cacctataac 1080 aaccacctct acaagcaaat ctccagtgct tcaacggggg ccagcaacga caaccactac 1140 ttcggctaca gcaccccctg ggggtatttt gatttcaaca gattccactg ccatttctca 1200 ccacgtgact ggcagcgact catcaacaac aattggggat tccggcccaa gagactcaac 1260 ttcaagctct tcaacatcca agtcaaggag gtcacgacga atgatggcgt cacgaccatc 1320 gctaataacc ttaccagcac ggttcaagtc ttctcggact cggagtacca gttgccgtac 1380 gtcctcggct ctgcgcacca gggctgcctc cctccgttcc cggcggacgt gttcatgatt 1440 ccgcagtacg gctacctaac gctcaacaat ggcagccagg cagtgggacg gtcatccttt 1500 tactgcctgg aatatttccc atcgcagatg ctgagaacgg gcaataactt taccttcagc 1560 tacaccttcg aggacgtgcc tttccacagc agctacgcgc acagccagag cctggaccgg 1620 ctgatgaatc ctctcatcga ccagtacctg tattacctga acagaactca gaatcagtcc 1680 ggaagtgccc aaaacaagga cttgctgttt agccgggggt ctccagctgg catgtctgtt 1740 cagcccaaaa actggctacc tggaccctgt taccggcagc agcgcgtttc taaaacaaaa 1800 acagacaaca acaacagcaa ctttacctgg actggtgctt caaaatataa ccttaatggg 1860 cgtgaatcta taatcaaccc tggcactgct atggcctcac acaaagacga caaagacaag 1920 ttctttccca tgagcggtgt catgattttt ggaaaggaga gcgccggagc ttcaaacact 1980 gcattggaca atgtcatgat cacagacgaa gaggaaatca aagccactaa ccccgtggcc 2040 accgaaagat ttgggactgt ggcagtcaat ctccagagca gcagcacaga ccctgcgacc 2100 ggagatgtgc atgttatggg agccttacct ggaatggtgt ggcaagacag agacgtatac 2160 ctgcagggtc ctatttgggc caaaattcct cacacggatg gacactttca cccgtctcct 2220 ctcatgggcg gctttggact taagcacccg cctcctcaga tcctcatcaa aaacacgcct 2280 gttcctgcga atcctccggc agagttttcg gctacaaagt ttgcttcatt catcacccag 2340 tattccacag gacaagtgag cgtggagatt gaatgggagc tgcagaaaga aaacagcaaa 2400 cgctggaatc ccgaagtgca gtatacatct aactatgcaa aatctgccaa cgttgatttc 2460 actgtggaca acaatggact ttatactgag cctcgcccca ttggcacccg ttacctcacc 2520 cgtcccctgt aattgcttgt taatcaataa accgtttaat tcgtttcagt tgaactttgg 2580 tctctgcgta tttctttctt atctagtttc catggctacg tagataagta gcatggcggg 2640 ttaatcatta actacagccc gggcgtttaa acagcgggcg gaggggtgga gtcgtgacgt 2700 gaattacgtc atagggttag ggaggtcctg tattagaggt cacgtgagtg ttttgcgaca 2760 ttttgcgaca ccatgtggtc tcgctggggg ggggggcccg agtgagcacg cagggtctcc 2820 attttgaagc gggaggtttg aacgagcgct cggaccgggc gcgctcactg gccgtcgttt 2880 tacaacgtcg tgactgggaa aaccctgtac a 2911 <210> 21 <211> 2038 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of Rep region of serotype 2 AAV containing p5 promoter, synthetic sequence <400> 21 ggaggggtgg agtcgtgacg tgaattacgt catagggtta gggaggtcct gtattagagg 60 tcacgtgagt gttttgcgac attttgcgac accatgtggt ctcgctgggg gggggggccc 120 gagtgagcac gcagggtctc cattttgaag cgggaggttt gaacgcgcag ccgccacgcc 180 ggggttttac gagattgtga ttaaggtccc cagcgacctt gacgagcatc tgcccggcat 240 ttctgacagc tttgtgaact gggtggccga gaaggaatgg gagttgccgc cagattctga 300 catggatctg aatctgattg agcaggcacc cctgaccgtg gccgagaagc tgcagcgcga 360 ctttctgacg gaatggcgcc gtgtgagtaa ggccccggag gcccttttct ttgtgcaatt 420 tgagaaggga gagagctact tccacatgca cgtgctcgtg gaaaccaccg gggtgaaatc 480 catggttttg ggacgtttcc tgagtcagat tcgcgaaaaa ctgattcaga gaatttaccg 540 cgggatcgag ccgactttgc caaactggtt cgcggtcaca aagaccagaa atggcgccgg 600 aggcgggaac aaggtggtgg atgagtgcta catccccaat tacttgctcc ccaaaaccca 660 gcctgagctc cagtgggcgt ggactaatat ggaacagtat ttaagcgcct gtttgaatct 720 cacggagcgt aaacggttgg tggcgcagca tctgacgcac gtgtcgcaga cgcaggagca 780 gaacaaagag aatcagaatc ccaattctga tgcgccggtg atcagatcaa aaacttcagc 840 caggtacatg gagctggtcg ggtggctcgt ggacaagggg attacctcgg agaagcagtg 900 gatccaggag gaccaggcct catacatctc cttcaatgcg gcctccaact cgcggtccca 960 aatcaaggct gccttggaca atgcgggaaa gattatgagc ctgactaaaa ccgcccccga 1020 ctacctggtg ggccagcagc ccgtggagga catttccagc aatcggattt ataaaatttt 1080 ggaactaaac gggtacgatc cccaatatgc ggcttccgtc tttctgggat gggccacgaa 1140 aaagttcggc aagaggaaca ccatctggct gtttgggcct gcaactaccg ggaagaccaa 1200 catcgcggag gccatagccc acactgtgcc cttctacggg tgcgtaaact ggaccaatga 1260 gaactttccc ttcaacgact gtgtcgacaa gatggtgatc tggtgggagg aggggaagat 1320 gaccgccaag gtcgtggagt cggccaaagc cattctcgga ggaagcaagg tgcgcgtgga 1380 ccagaaatgc aagtcctcgg cccagataga cccgactccc gtgatcgtca cctccaacac 1440 caacatgtgc gccgtgattg acgggaactc aacgaccttc gaacaccagc agccgttgca 1500 agaccggatg ttcaaatttg aactcacccg ccgtctggat catgactttg ggaaggtcac 1560 caagcaggaa gtcaaagact ttttccggtg ggcaaaggat cacgtggttg aggtggagca 1620 tgaattctac gtcaaaaagg gtggagccaa gaaaagaccc gcccccagtg acgcagatat 1680 aagtgagccc aaacgggtgc gcgagtcagt tgcgcagcca tcgacgtcag acgcggaagc 1740 ttcgatcaac tacgcagaca ggtaccaaaa caaatgttct cgtcacgtgg gcatgaatct 1800 gatgctgttt ccctgcagac aatgcgagag aatgaatcag aattcaaata tctgcttcac 1860 tcacggacag aaagactgtt tagagtgctt tcccgtgtca gaatctcaac ccgtttctgt 1920 cgtcaaaaag gcgtatcaga aactgtgcta cattcatcat atcatgggaa aggtgccaga 1980 cgcttgcact gcctgcgatc tggtcaatgt ggatttggat gactgcatct ttgaacaa 2038 <210> 22 <211> 2214 <212> DNA <213> adeno-associated virus 8 <400> 22 atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctctga gggcattcgc 60 gagtggtggg cgctgaaacc tggagccccg aagcccaaag ccaaccagca aaagcaggac 120 gacggccggg gtctggtgct tcctggctac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180 aagggggagc ccgtcaacgc ggcggacgca gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240 cagcagctgc aggcgggtga caatccgtac ctgcggtata accacgccga cgccgagttt 300 caggagcgtc tgcaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360 gccaagaagc gggttctcga acctctcggt ctggttgagg aaggcgctaa gacggctcct 420 ggaaagaaga gaccggtaga gccatcaccc cagcgttctc cagactcctc tacgggcatc 480 ggcaagaaag gccaacagcc cgccagaaaa agactcaatt ttggtcagac tggcgactca 540 gagtcagttc cagaccctca acctctcgga gaacctccag cagcgccctc tggtgtggga 600 cctaatacaa tggctgcagg cggtggcgca ccaatggcag acaataacga aggcgccgac 660 ggagtgggta gttcctcggg aaattggcat tgcgattcca catggctggg cgacagagtc 720 atcaccacca gcacccgaac ctgggccctg cccacctaca acaaccacct ctacaagcaa 780 atctccaacg ggacatcggg aggagccacc aacgacaaca cctacttcgg ctacagcacc 840 ccctgggggt attttgactt taacagattc cactgccact tttcaccacg tgactggcag 900 cgactcatca acaacaactg gggattccgg cccaagagac tcagcttcaa gctcttcaac 960 atccaggtca aggaggtcac gcagaatgaa ggcaccaaga ccatcgccaa taacctcacc 1020 agcaccatcc aggtgtttac ggactcggag taccagctgc cgtacgttct cggctctgcc 1080 caccagggct gcctgcctcc gttcccggcg gacgtgttca tgattcccca gtacggctac 1140 ctaacactca acaacggtag tcaggccgtg ggacgctcct ccttctactg cctggaatac 1200 tttccttcgc agatgctgag aaccggcaac aacttccagt ttacttacac cttcgaggac 1260 gtgcctttcc acagcagcta cgcccacagc cagagcttgg accggctgat gaatcctctg 1320 attgaccagt acctgtacta cttgtctcgg actcaaacaa caggaggcac ggcaaatacg 1380 cagactctgg gcttcagcca aggtgggcct aatacaatgg ccaatcaggc aaagaactgg 1440 ctgccaggac cctgttaccg ccaacaacgc gtctcaacga caaccgggca aaacaacaat 1500 agcaactttg cctggactgc tgggaccaaa taccatctga atggaagaaa ttcattggct 1560 aatcctggca tcgctatggc aacacacaaa gacgacgagg agcgtttttt tcccagtaac 1620 gggatcctga tttttggcaa acaaaatgct gccagagaca atgcggatta cagcgatgtc 1680 atgctcacca gcgaggaaga aatcaaaacc actaaccctg tggctacaga ggaatacggt 1740 atcgtggcag ataacttgca gcagcaaaac acggctcctc aaattggaac tgtcaacagc 1800 cagggggcct tacccggtat ggtctggcag aaccgggacg tgtacctgca gggtcccatc 1860 tgggccaaga ttcctcacac ggacggcaac ttccacccgt ctccgctgat gggcggcttt 1920 ggcctgaaac atcctccgcc tcagatcctg atcaagaaca cgcctgtacc tgcggatcct 1980 ccgaccacct tcaaccagtc aaagctgaac tctttcatca cgcaatacag caccggacag 2040 gtcagcgtgg aaattgaatg ggagctgcag aaggaaaaca gcaagcgctg gaaccccgag 2100 atccagtaca cctccaacta ctacaaatct acaagtgtgg actttgctgt taatacagaa 2160 ggcgtgtact ctgaaccccg ccccattggc acccgttacc tcacccgtaa tctg 2214 <210> 23 <211> 165 <212> DNA <213> adeno-associated virus 2 <400> 23 ggaggggtgg agtcgtgacg tgaattacgt catagggtta gggaggtcct gtattagagg 60 tcacgtgagt gttttgcgac attttgcgac accatgtggt ctcgctgggg gggggggccc 120 gagtgagcac gcagggtctc cattttgaag cgggaggttt gaacg 165 <210> 24 <211> 1866 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence containing Rep region of serotype 2 AAV, synthetic sequence <400> 24 acgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 60 ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120 tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180 cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240 caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300 aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 360 taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc 420 gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 480 acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg 540 aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600 gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact 660 tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 720 cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 780 tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 840 cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 900 attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 960 acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1020 accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1080 aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1140 aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1200 gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260 aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1320 ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1380 gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1440 gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1500 gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1560 gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1620 aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1680 ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1740 tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1800 ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1860 caataa 1866 <210> 25 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of primer SI-1, synthetic sequence <400> 25 gccagccatc tgttgt 16 <210> 26 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of primer SI-2, synthetic sequence <400> 26 ggagtggcac cttcca 16 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of probe SI-1, synthetic sequence <400> 27 tcccccgtgc cttccttgac c 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of primer SI-3, synthetic sequence <400> 28 ggaaccccta gtgatggagt t 21 <210> 29 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of primer SI-4, synthetic sequence <400> 29 cggcctcagt gagcga 16 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of probe SI-2, synthetic sequence <400> 30 cactccctct ctgcgcgctc g 21 <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR1 in the light chain of anti-hTfR antibody 1 <400> 31 Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 32 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR1 in the light chain of anti-hTfR antibody 2 <400> 32 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 33 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR2 in the light chain of anti-hTfR antibody 1 <400> 33 Lys Val Ser Asn Arg Phe 1 5 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR2 in the light chain of anti-hTfR antibody 2 <400> 34 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR3 in the light chain of anti-hTfR antibody 3 <400> 35 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR1 in the heavy chain of anti-hTfR antibody 1 <400> 36 Asn Tyr Trp Leu Gly 1 5 <210> 37 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR1 in the heavy chain of anti-hTfR antibody 2 <400> 37 Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr Trp 1 5 <210> 38 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR2 in the heavy chain of anti-hTfR antibody 1 <400> 38 Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro 1 5 <210> 39 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR2 in the heavy chain of anti-hTfR antibody 2 <400> 39 Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Val <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR3 in the heavy chain of anti-hTfR antibody 1 <400> 40 Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr 1 5 <210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of CDR3 in the heavy chain of anti-hTfR antibody 2 <400> 41 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr 1 5 10 <210> 42 <211> 766 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An example of amino acid sequence of a conjugate of human I2S and the Fab region of the heavy chain of an anti-hTfR antibody <400> 42 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 225 230 235 240 Ser Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu 245 250 255 Leu Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp 260 265 270 Lys Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu 275 280 285 Leu Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg 290 295 300 Val Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp 305 310 315 320 Phe Asn Ser Tyr Trp Arg Val His Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro 325 330 335 Gln Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val 340 345 350 Phe His Pro Gly Ile Ser Ser Asn His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser 355 360 365 Trp Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr 370 375 380 Lys Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys 385 390 395 400 Pro Val Asp Val Leu Asp Val Pro Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln 405 410 415 Ser Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala 420 425 430 Ser Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe 435 440 445 Arg Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr 450 455 460 Leu Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr 465 470 475 480 Asn Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn 485 490 495 Ile Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile 500 505 510 Arg Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly 515 520 525 Arg Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile 530 535 540 Ile Ala Phe Thr Ser Asp His Gly Trp Ala Leu Gly Glu His Gly Glu 545 550 555 560 Trp Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile 565 570 575 Phe Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys 580 585 590 Leu Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu 595 600 605 Pro Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro 610 615 620 Thr Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val 625 630 635 640 Pro Ser Phe His Val Glu Leu Cys Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys 645 650 655 His Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn 660 665 670 Pro Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile 675 680 685 Pro Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met 690 695 700 Gly Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly 705 710 715 720 Phe Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly 725 730 735 Glu Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr 740 745 750 Asn Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu Phe Gln Leu Leu Met Pro 755 760 765 <210> 43 <211> 589 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A preferable example of nucleic acid sequence of the first Long Terminal Repeat (first LTR) , synthetic sequence <400> 43 tttgaaagac cccacccgta ggtggcaagc tagcttaagt aacgccactt tgcaaggcat 60 ggaaaaatac ataactgaga atagaaaagt tcagatcaag gtcaggaaca aagaaacagc 120 tgaataccaa acaggatatc tgtggtaagc ggttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca 180 gatgagacag ctgagtgatg ggccaaacag gatatctgtg gtaagcagtt cctgccccgg 240 ctcggggcca agaacagatg gtccccagat gcggtccagc cctcagcagt ttctagtgaa 300 tcatcagatg tttccagggt gccccaagga cctgaaaatg accctgtacc ttatttgaac 360 taaccaatca gttcgcttct cgcttctgtt cgcgcgcttc cgctctccga gctcaataaa 420 agagcccaca acccctcact cggcgcgcca gtcttccgat agactgcgtc gcccgggtac 480 ccgtattccc aataaagcct cttgctgttt gcatccgaat cgtggtctcg ctgttccttg 540 ggagggtctc ctctgagtga ttgactaccc acgacggggg tctttcatt 589 <210> 44 <211> 594 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A preferable example of nucleic acid sequence of the second Long Terminal Repeat (second LTR) , synthetic sequence <400> 44 aatgaaagac cccacctgta ggtttggcaa gctagcttaa gtaacgccat tttgcaaggc 60 atggaaaaat acataactga gaatagagaa gttcagatca aggtcaggaa cagatggaac 120 agctgaatat gggccaaaca ggatatctgt ggtaagcagt tcctgccccg gctcagggcc 180 aagaacagat ggaacagctg aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg 240 ccccggctca gggccaagaa cagatggtcc ccagatgcgg tccagccctc agcagtttct 300 agagaaccat cagatgtttc cagggtgccc caaggacctg aaatgaccct gtgccttatt 360 tgaactaacc aatcagttcg cttctcgctt ctgttcgcgc gcttctgctc cccgagctca 420 ataaaagagc ccacaacccc tcactcgggg cgccagtcct ccgattgact gagtcgcccg 480 ggtacccgtg tatccaataa accctcttgc agttgcatcc gacttgtggt ctcgctgttc 540 cttgggaggg tctcctctga gtgattgact acccgtcagc gggggtcttt catt 594 <210> 45 <211> 52 <212> DNA <213> Sendai virus <400> 45 accaaacaag agaagaaact tgtttggaat atataatgaa gttagacagg at 52 <210> 46 <211> 54 <212> DNA <213> Sendai virus <400> 46 acaaggagac aagaaaattt gaaagaataa atatctctta aactcttgtc tggt 54 <210> 47 <211> 4578 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of the DNA fragment synthesized for construction of pAAV-mMAP-Fab-hGLB1 vector, synthetic sequence <400> 47 atcgatatca agcttagatc attttgatgg cagagttcag tttaccgggt cacattgtac 60 ctgggaagat tcaaggattt atggaaaaag tcaacaacag gagtcagagc agccggaaaa 120 gcatggactc tgtacttagg actgcgcttt gagcaatggc acagcaagct ataaccctgt 180 ttgcagtcag cacacaaact gtggttcaaa gctccacttt atctcttctt gtggaattca 240 gatatcagat cagttttgct caaatgggag acaaagagat taagctctta tgtaaaattt 300 gctgttttac ataactttaa tgaatggaca aagtcttgtg catgggggtg ggggtggggt 360 tagaggggaa cagctccaga tggcaaacat acgcaaggga tttagtcaaa caactttttg 420 gcaaagatgg tatgattttg taatggggta ggaaccaatg aaatgcgagg taagtatggt 480 taataatcta cagttattgg ttaaagaagt atattagagc gagtctttct gcacacagat 540 caccttccta tcaaccccac tagcctctgg caaaggtacc agtgtacagg gagtcgctgc 600 gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgcgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 660 gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 720 gcaagaggta agggtttaag ggatggttgg ttggtggggt attaatgttt aattacctgg 780 agcacctgcc tgaaatcact ttttttcagg ttggacgcgt cgccaccatg ggttggagcc 840 tcatcttgct cttccttgtc gctgttgcta cgcgagtcgg cagcgaggtg caactagtgc 900 agtctggagc agaggtgaaa aagcccgggg agtctctgaa gatttcctgt aagggttctg 960 gatacagctt tatgaactac tggctgggat gggtgcgcca gatgcccggg aaaggcctgg 1020 agtggatggg ggacatctac cccggcggag actaccctac atacagcgag aagttcaagg 1080 tccaggtcac catctcagcc gacaagtcca tcagcaccgc ctacctgcag ttgagcagcc 1140 tgaaggcctc ggacaccgcc atgtattact gtgcgagatc aggcaattac gacgaagtgg 1200 cctactgggg ccaaggaacc ctggtcaccg tctcctcagc tagcaccaag ggcccatcgg 1260 tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc 1320 tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca 1380 gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg 1440 tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca 1500 agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagccgaa gagctgtgat aagacgcata 1560 cgggtggcgg agggtctgga ggtggcggat caggcggagg tggatctcag aggatgttcg 1620 aaattgatta ctcccgggat agcttcctca aagacggcca gccttttagg tacatctccg 1680 gctccattca ctattcccgg gtgcctcgtt tttactggaa agaccggctg ctgaagatga 1740 agatggccgg actgaacgct atccagacct acgtcccttg gaactttcat gagccttggc 1800 ccggccagta ccaatttagc gaggaccacg acgtcgagta ctttttacgg ctggcccacg 1860 aactcggact cctcgtgatt ctgaggcccg gcccctacat ttgcgccgag tgggagatgg 1920 gaggtttacc cgcttggctg ctggagaagg agtccatctt attacggagc agcgatcccg 1980 attatttagc cgccgtggac aaatggctgg gagttttact ccccaagatg aaacctttac 2040 tgtaccagaa tggcggcccc gttatcaccg tccaagttga gaatgagtat ggctcctatt 2100 tcgcttgcga cttcgactat ttacggtttt tacagaagag gtttcgtcac cacctcggag 2160 acgatgtcgt cctcttcacc accgatggag cccataagac ctttttaaag tgtggcgccc 2220 tccaaggttt atataccacc gtggatttcg gcactggtag caacatcaca gatgcctttc 2280 tctcccagcg gaagtgcgaa cctaagggcc ctttaatcaa ttccgagttc tacaccggct 2340 ggctcgacca ctggggccag cctcactcca ccatcaagac agaagccgtg gccagctctt 2400 tatacgacat cctcgctcgg ggcgcctccg tcaatttata catgtttatc ggcggcacca 2460 acttcgccta ttggaacggc gctaactccc cctacgccgc tcagcccaca agctatgact 2520 atgatgcccc tctgtccgaa gccggagatt taaccgagaa gtacttcgcc ctccggaaca 2580 tcattcagaa gttcgagaag gtgcccgagg gacccatccc tcccagcacc cccaagttcg 2640 cttacggaaa agtcaccctc gaaaaactga agaccgtggg cgccgcttta gatattctgt 2700 gccccagcgg ccctattaag tctttatacc ccctcacctt tattcaagtt aagcagcatt 2760 acggctttgt tttataccgg accactttac cccaagattg tagcaacccc gctcctctga 2820 gcagcccttt aaacggcgtc catgatcggg cttatgtggc tgtcgacggc attccccaag 2880 gtgtgctcga acggaacaac gtgatcactt taaatatcac cggcaaagct ggcgctacac 2940 tggatctgct ggtcgaaaac atgggccggg tgaactacgg cgcctacatt aacgatttca 3000 agggtttagt gtccaattta acactcagct ccaacattct caccgactgg accatcttcc 3060 ctttagacac cgaggatgct gtgaggagcc atttaggcgg atggggccat cgggacagcg 3120 gacatcacga cgaggcttgg gctcacaata gctccaacta cacactgccc gctttctaca 3180 tgggcaactt cagcatccct agcggaattc ccgatctgcc tcaagatacc ttcatccaat 3240 tccccggctg gaccaagggc caagtttgga tcaacggctt taatttaggc cggtactggc 3300 ccgctcgtgg acctcagctg acactgttcg tgcctcaaca cattttaatg acctccgctc 3360 ctaacacaat caccgtgctg gagctggagt gggctccttg tagctccgac gatcccgagc 3420 tgtgcgccgt caccttcgtc gatcgtcccg tcatcggctc ctccgtgaca tacgaccacc 3480 ccagcaagcc cgttgagaag cggctgatgc ctcctcctcc tcagaagaac aaggactctt 3540 ggctggacca cgtgggaagc ggagctacta acttcagcct gctgaagcag gctggagacg 3600 tggaggagaa ccctggacct atgggctgga gctggattct gctgttcctc ctgagcgtga 3660 cagcaggagt gcacagcgac atcgtgatga cccagactcc cctgagcctg agcgtgacac 3720 ctggccagcc tgccagcatc agctgcagaa gctctcagag cctggtgcac agcaacggca 3780 acacctacct gcactggtat ctgcagaagc ccggccagag ccctcagctg ctgatctaca 3840 aggtgtccaa cagattcagc ggcgtgcccg acagattctc cggcagcggc tctggcaccg 3900 acttcaccct gaagatttcc agagtggaag ccgaggacgt gggcgtgtac tactgcagcc 3960 agagcaccca cgtgccctgg acattcggcc agggcaccaa ggtggaaatc aagagaaccg 4020 tggccgctcc cagcgtgttc atcttcccac ctagcgacga gcagctgaag tccggcacag 4080 cctctgtcgt gtgcctgctg aacaacttct acccccgcga ggccaaggtg cagtggaagg 4140 tggacaacgc cctgcagagc ggcaacagcc aggaaagcgt gaccgagcag gactccaagg 4200 acagcaccta cagcctgagc agcaccctga ccctgagcaa ggccgactac gagaagcaca 4260 aggtgtacgc ctgcgaagtg acccaccagg gcctgtctag ccccgtgacc aagagcttca 4320 acagaggcga gtgctaataa atttaaatgc ggccgcattt aaatctgtgc cttctagttg 4380 ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc 4440 cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc 4500 tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag 4560 gcatgctggg gaagatct 4578 <210> 48 <211> 890 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An example of amino acid sequence of a conjugate of human ??-galactosidase and the Fab region of the heavy chain of an anti-hTfR antibody <400> 48 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 225 230 235 240 Ser Gln Arg Met Phe Glu Ile Asp Tyr Ser Arg Asp Ser Phe Leu Lys 245 250 255 Asp Gly Gln Pro Phe Arg Tyr Ile Ser Gly Ser Ile His Tyr Ser Arg 260 265 270 Val Pro Arg Phe Tyr Trp Lys Asp Arg Leu Leu Lys Met Lys Met Ala 275 280 285 Gly Leu Asn Ala Ile Gln Thr Tyr Val Pro Trp Asn Phe His Glu Pro 290 295 300 Trp Pro Gly Gln Tyr Gln Phe Ser Glu Asp His Asp Val Glu Tyr Phe 305 310 315 320 Leu Arg Leu Ala His Glu Leu Gly Leu Leu Val Ile Leu Arg Pro Gly 325 330 335 Pro Tyr Ile Cys Ala Glu Trp Glu Met Gly Gly Leu Pro Ala Trp Leu 340 345 350 Leu Glu Lys Glu Ser Ile Leu Leu Arg Ser Ser Asp Pro Asp Tyr Leu 355 360 365 Ala Ala Val Asp Lys Trp Leu Gly Val Leu Leu Pro Lys Met Lys Pro 370 375 380 Leu Leu Tyr Gln Asn Gly Gly Pro Val Ile Thr Val Gln Val Glu Asn 385 390 395 400 Glu Tyr Gly Ser Tyr Phe Ala Cys Asp Phe Asp Tyr Leu Arg Phe Leu 405 410 415 Gln Lys Arg Phe Arg His His Leu Gly Asp Asp Val Val Leu Phe Thr 420 425 430 Thr Asp Gly Ala His Lys Thr Phe Leu Lys Cys Gly Ala Leu Gln Gly 435 440 445 Leu Tyr Thr Thr Val Asp Phe Gly Thr Gly Ser Asn Ile Thr Asp Ala 450 455 460 Phe Leu Ser Gln Arg Lys Cys Glu Pro Lys Gly Pro Leu Ile Asn Ser 465 470 475 480 Glu Phe Tyr Thr Gly Trp Leu Asp His Trp Gly Gln Pro His Ser Thr 485 490 495 Ile Lys Thr Glu Ala Val Ala Ser Ser Leu Tyr Asp Ile Leu Ala Arg 500 505 510 Gly Ala Ser Val Asn Leu Tyr Met Phe Ile Gly Gly Thr Asn Phe Ala 515 520 525 Tyr Trp Asn Gly Ala Asn Ser Pro Tyr Ala Ala Gln Pro Thr Ser Tyr 530 535 540 Asp Tyr Asp Ala Pro Leu Ser Glu Ala Gly Asp Leu Thr Glu Lys Tyr 545 550 555 560 Phe Ala Leu Arg Asn Ile Ile Gln Lys Phe Glu Lys Val Pro Glu Gly 565 570 575 Pro Ile Pro Pro Ser Thr Pro Lys Phe Ala Tyr Gly Lys Val Thr Leu 580 585 590 Glu Lys Leu Lys Thr Val Gly Ala Ala Leu Asp Ile Leu Cys Pro Ser 595 600 605 Gly Pro Ile Lys Ser Leu Tyr Pro Leu Thr Phe Ile Gln Val Lys Gln 610 615 620 His Tyr Gly Phe Val Leu Tyr Arg Thr Thr Leu Pro Gln Asp Cys Ser 625 630 635 640 Asn Pro Ala Pro Leu Ser Ser Pro Leu Asn Gly Val His Asp Arg Ala 645 650 655 Tyr Val Ala Val Asp Gly Ile Pro Gln Gly Val Leu Glu Arg Asn Asn 660 665 670 Val Ile Thr Leu Asn Ile Thr Gly Lys Ala Gly Ala Thr Leu Asp Leu 675 680 685 Leu Val Glu Asn Met Gly Arg Val Asn Tyr Gly Ala Tyr Ile Asn Asp 690 695 700 Phe Lys Gly Leu Val Ser Asn Leu Thr Leu Ser Ser Asn Ile Leu Thr 705 710 715 720 Asp Trp Thr Ile Phe Pro Leu Asp Thr Glu Asp Ala Val Arg Ser His 725 730 735 Leu Gly Gly Trp Gly His Arg Asp Ser Gly His His Asp Glu Ala Trp 740 745 750 Ala His Asn Ser Ser Asn Tyr Thr Leu Pro Ala Phe Tyr Met Gly Asn 755 760 765 Phe Ser Ile Pro Ser Gly Ile Pro Asp Leu Pro Gln Asp Thr Phe Ile 770 775 780 Gln Phe Pro Gly Trp Thr Lys Gly Gln Val Trp Ile Asn Gly Phe Asn 785 790 795 800 Leu Gly Arg Tyr Trp Pro Ala Arg Gly Pro Gln Leu Thr Leu Phe Val 805 810 815 Pro Gln His Ile Leu Met Thr Ser Ala Pro Asn Thr Ile Thr Val Leu 820 825 830 Glu Leu Glu Trp Ala Pro Cys Ser Ser Asp Asp Pro Glu Leu Cys Ala 835 840 845 Val Thr Phe Val Asp Arg Pro Val Ile Gly Ser Ser Val Thr 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Pro Leu 130 135 140 Leu Tyr Gln Asn Gly Gly Pro Val Ile Thr Val Gln Val Glu Asn Glu 145 150 155 160 Tyr Gly Ser Tyr Phe Ala Cys Asp Phe Asp Tyr Leu Arg Phe Leu Gln 165 170 175 Lys Arg Phe Arg His His Leu Gly Asp Asp Val Val Leu Phe Thr Thr 180 185 190 Asp Gly Ala His Lys Thr Phe Leu Lys Cys Gly Ala Leu Gln Gly Leu 195 200 205 Tyr Thr Thr Val Asp Phe Gly Thr Gly Ser Asn Ile Thr Asp Ala Phe 210 215 220 Leu Ser Gln Arg Lys Cys Glu Pro Lys Gly Pro Leu Ile Asn Ser Glu 225 230 235 240 Phe Tyr Thr Gly Trp Leu Asp His Trp Gly Gln Pro His Ser Thr Ile 245 250 255 Lys Thr Glu Ala Val Ala Ser Ser Leu Tyr Asp Ile Leu Ala Arg Gly 260 265 270 Ala Ser Val Asn Leu Tyr Met Phe Ile Gly Gly Thr Asn Phe Ala Tyr 275 280 285 Trp Asn Gly Ala Asn Ser Pro Tyr Ala Ala Gln Pro Thr Ser Tyr Asp 290 295 300 Tyr Asp Ala Pro Leu Ser Glu Ala Gly Asp Leu Thr Glu Lys Tyr Phe 305 310 315 320 Ala Leu Arg Asn Ile Ile Gln Lys Phe Glu Lys Val Pro Glu Gly Pro 325 330 335 Ile Pro Pro Ser Thr Pro Lys Phe Ala Tyr Gly Lys Val Thr Leu Glu 340 345 350 Lys Leu Lys Thr Val Gly Ala Ala Leu Asp Ile Leu Cys Pro Ser Gly 355 360 365 Pro Ile Lys Ser Leu Tyr Pro Leu Thr Phe Ile Gln Val Lys Gln His 370 375 380 Tyr Gly Phe Val Leu Tyr Arg Thr Thr Leu Pro Gln Asp Cys Ser Asn 385 390 395 400 Pro Ala Pro Leu Ser Ser Pro Leu Asn Gly Val His Asp Arg Ala Tyr 405 410 415 Val Ala Val Asp Gly Ile Pro Gln Gly Val Leu Glu Arg Asn Asn Val 420 425 430 Ile Thr Leu Asn Ile Thr Gly Lys Ala Gly Ala Thr Leu Asp Leu Leu 435 440 445 Val Glu Asn Met Gly Arg Val Asn Tyr Gly Ala Tyr Ile Asn Asp Phe 450 455 460 Lys Gly Leu Val Ser Asn Leu Thr Leu Ser Ser Asn Ile Leu Thr Asp 465 470 475 480 Trp Thr Ile Phe Pro Leu Asp Thr Glu Asp Ala Val Arg Ser His Leu 485 490 495 Gly Gly Trp Gly His Arg Asp Ser Gly His His Asp Glu Ala Trp Ala 500 505 510 His Asn Ser Ser Asn Tyr Thr Leu Pro Ala Phe Tyr Met Gly Asn Phe 515 520 525 Ser Ile Pro Ser Gly Ile Pro Asp Leu Pro Gln Asp Thr Phe Ile Gln 530 535 540 Phe Pro Gly Trp Thr Lys Gly Gln Val Trp Ile Asn Gly Phe Asn Leu 545 550 555 560 Gly Arg Tyr Trp Pro Ala Arg Gly Pro Gln Leu Thr Leu Phe Val Pro 565 570 575 Gln His Ile Leu Met Thr Ser Ala Pro Asn Thr Ile Thr Val Leu Glu 580 585 590 Leu Glu Trp Ala Pro Cys Ser Ser Asp Asp Pro Glu Leu Cys Ala Val 595 600 605 Thr Phe Val Asp Arg Pro Val Ile Gly Ser Ser Val Thr Tyr Asp His 610 615 620 Pro Ser Lys Pro Val Glu Lys Arg Leu Met Pro Pro Pro Pro Gln Lys 625 630 635 640 Asn Lys Asp Ser Trp Leu Asp His Val 645

Claims (44)

  1. 이하의 (1)~(6) 중 어느 하나의 염기 서열을 포함하는 핵산 분자:
    (1) 제1 역방향 말단 반복(ITR) 또는 그 기능적 등가물을 포함하는 염기 서열, 그 하류에 리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열, 더 하류에 제2 역방향 말단 반복(ITR) 또는 그 기능적 등가물을 포함하는 염기 서열;
    (2) 제1 역방향 말단 반복(ITR) 또는 그 기능적 등가물을 포함하는 염기 서열, 그 하류에 유전자 발현 제어 부위를 포함하는 염기 서열, 더 하류에 리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열, 더 하류에 제2 역방향 말단 반복(ITR) 또는 그 기능적 등가물을 포함하는 염기 서열;
    (3) 제1 긴 말단 반복(LTR) 또는 그 기능적 등가물을 포함하는 염기 서열, 그 하류에 리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열, 더 하류에 제2 긴 말단 반복(LTR) 또는 그 기능적 등가물을 포함하는 염기 서열;
    (4) 제1 긴 말단 반복(LTR) 또는 그 기능적 등가물을 포함하는 염기 서열, 그 하류에 유전자 발현 제어 부위를 포함하는 염기 서열, 더 하류에 리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열, 더 하류에 제2 긴 말단 반복(LTR) 또는 그 기능적 등가물을 포함하는 염기 서열;
    (5) 리더 또는 그 기능적 등가물을 포함하는 염기 서열, 그 하류에 리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열, 더 하류에 트레일러 또는 그 기능적 등가물을 포함하는 염기 서열; 또는
    (6) 리더 또는 그 기능적 등가물을 포함하는 염기 서열, 그 하류에 유전자 발현 제어 부위를 포함하는 염기 서열, 더 하류에 리간드와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열, 더 하류에 트레일러 또는 그 기능적 등가물을 포함하는 염기 서열.
  2. 제 1 항에 있어서,
    해당 리간드가 항체인, 핵산 분자.
  3. 제 2 항에 있어서,
    이하의 (1)~(4)로부터 선택되는 것인, 핵산 분자:
    (1) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 항체의 중쇄의 C말단에 생리 활성을 갖는 단백질이 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열과, 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것;
    (2) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 항체의 중쇄의 N말단에 생리 활성을 갖는 단백질이 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열과, 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것;
    (3) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 항체의 경쇄의 C말단에 생리 활성을 갖는 단백질이 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열과, 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것; 또는
    (4) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 항체의 경쇄의 N말단에 생리 활성을 갖는 단백질이 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열과, 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것.
  4. 제 2 항에 있어서,
    이하의 (1)~(4)로부터 선택되는 것인, 핵산 분자:
    (1) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 항체의 중쇄의 C말단에 생리 활성을 갖는 단백질이 링커를 개재시켜 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열과, 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것;
    (2) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 항체의 중쇄의 N말단에 생리 활성을 갖는 단백질이 링커를 개재시켜 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열과, 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것;
    (3) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 항체의 경쇄의 C말단에 생리 활성을 갖는 단백질이 링커를 개재시켜 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열과, 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것; 또는
    (4) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 항체의 경쇄의 N말단에 생리 활성을 갖는 단백질이 링커를 개재시켜 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열과, 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것.
  5. 제 4 항에 있어서,
    해당 링커가, 1~50개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩타이드인, 핵산 분자.
  6. 제 5 항에 있어서,
    해당 링커가, 1개의 글리신, 1개의 세린, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 1의 아미노산 서열, 서열 번호 2의 아미노산 서열, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 2~10개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 펩타이드인, 핵산 분자.
  7. 제 2 항에 있어서,
    이하의 (1)~(4)로부터 선택되는 것인, 핵산 분자:
    (1) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 항체의 경쇄의 C말단에 제2 링커를 개재시켜 항체의 중쇄가 결합하고, 추가로 그 C말단에 생리 활성을 갖는 단백질이 직접 또는 링커를 개재시켜 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것;
    (2) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 항체의 중쇄의 C말단에 제2 링커를 개재시켜 항체의 경쇄가 결합하고, 추가로 그 C말단에 생리 활성을 갖는 단백질이 직접 또는 링커를 개재시켜 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것;
    (3) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 생리 활성을 갖는 단백질의 C말단에 직접 또는 링커를 개재시켜 항체의 중쇄가 결합하고, 추가로 그 C말단에 제2 링커를 개재시켜 항체의 경쇄가 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것; 또는
    (4) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 생리 활성을 갖는 단백질의 C말단에 직접 또는 링커를 개재시켜 항체의 경쇄가 결합하고, 추가로 그 C말단에 제2 링커를 개재시켜 항체의 중쇄가 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것.
  8. 제 7 항에 있어서,
    해당 링커가, 1~50개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩타이드인, 핵산 분자.
  9. 제 8 항에 있어서,
    해당 링커가, 1개의 글리신, 1개의 세린, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 1의 아미노산 서열, 서열 번호 2의 아미노산 서열, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 2~10개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 펩타이드인, 핵산 분자.
  10. 제 9 항에 있어서,
    해당 제2 링커가, 8~50개의 아미노산 잔기로 이루어지는 것인, 핵산 분자.
  11. 제 8 항에 있어서,
    해당 제2 링커가, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3의 각 아미노산 서열, 서열 번호 1의 아미노산 서열의 3개가 연속하여 이루어지는 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열이 2~10개 연속하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 핵산 분자.
  12. 제 3 항에 있어서,
    이하의 (1)~(4)로부터 선택되는 것인, 핵산 분자:
    (1) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 해당 항체의 중쇄의 C말단에 해당 생리 활성을 갖는 단백질이 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열, 그 하류에 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열, 추가로 그 하류에 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것;
    (2) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 해당 항체의 중쇄의 N말단에 해당 생리 활성을 갖는 단백질이 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열, 그 하류에 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열, 추가로 그 하류에 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것;
    (3) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 해당 항체의 경쇄의 C말단에 해당 생리 활성을 갖는 단백질이 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열, 그 하류에 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열, 추가로 그 하류에 해당 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것; 또는
    (4) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 해당 항체의 경쇄의 N말단에 해당 생리 활성을 갖는 단백질이 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열, 그 하류에 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열, 추가로 그 하류에 해당 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것.
  13. 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이하의 (1)~(4)로부터 선택되는 것인, 핵산 분자:
    (1) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 해당 항체의 중쇄의 C말단에 해당 생리 활성을 갖는 단백질이 링커를 개재시켜 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열, 그 하류에 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열, 추가로 그 하류에 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것;
    (2) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 해당 항체의 중쇄의 N말단에 해당 생리 활성을 갖는 단백질이 링커를 개재시켜 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열, 그 하류에 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열, 추가로 그 하류에 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것;
    (3) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 해당 항체의 경쇄의 C말단에 해당 생리 활성을 갖는 단백질이 링커를 개재시켜 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열, 그 하류에 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열, 추가로 그 하류에 해당 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것; 또는
    (4) 해당 항체와 생리 활성을 갖는 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열이, 해당 항체의 경쇄의 N말단에 해당 생리 활성을 갖는 단백질이 링커를 개재시켜 결합한 결합체를 코딩하는 염기 서열, 그 하류에 내부 리보솜 결합 부위를 코딩하는 염기 서열, 추가로 그 하류에 해당 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
    해당 내부 리보솜 결합 부위가, 피코르나 바이러스과의 바이러스, 구제역 바이러스, A형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 코로나 바이러스, 소 장내 바이러스, 사일러의 쥐 뇌척수염 바이러스, 콕사키 B형 바이러스, 인간 면역글로불린 중쇄 결합 단백질 유전자, 초파리 안테나페디아 유전자, 초파리 울트라비토랙스 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 바이러스 또는 유전자의 5＇ 비번역 영역에서 유래하는 것인, 핵산 분자.
  15. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
    해당 내부 리보솜 결합 부위가, 피코르나 바이러스과의 바이러스의 5＇ 비번역 영역에서 유래하는 것인, 핵산 분자.
  16. 제 2 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 항체가, 항원 결합성 단편인, 핵산 분자.
  17. 제 2 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 항체가, Fab인, 핵산 분자.
  18. 제 2 항에 있어서,
    해당 항체가, 단일 도메인 항체인, 핵산 분자.
  19. 제 2 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 항체가, 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 단백질에 대해서 특이적인 친화성을 갖는 것인, 핵산 분자.
  20. 제 19 항에 있어서,
    해당 혈관 내피 세포가, 뇌혈관 내피 세포인 핵산 분자.
  21. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서,
    해당 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 단백질이, 트랜스페린 수용체, 인슐린 수용체, 렙틴 수용체, 인슐린양 성장 인자 I 수용체, 인슐린양 성장 인자 II 수용체, 리포단백질 수용체, 포도당 수송 담체 1, 유기 음이온 트랜스포터, 모노카복실산 트랜스포터, 저밀도 리포단백질 수용체 관련 단백질 1, 저밀도 리포단백질 수용체 관련 단백질 8, 및 헤파린 결합성 상피 성장 인자양 성장 인자의 막결합형 전구체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 핵산 분자.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 유전자 발현 제어 부위가, 사이토메갈로바이러스 유래의 프로모터, SV40 초기 프로모터, 인간 신장 인자-1α(EF-1α) 프로모터, 인간 유비퀴틴 C 프로모터, 레트로바이러스의 라우스 육종 바이러스 LTR 프로모터, 다이하이드로엽산 환원 효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세린산 키나제(PGK) 프로모터, 마우스 알부민 프로모터, 인간 알부민 프로모터, 인간 α-1 안티트립신 프로모터, 및 마우스 α 페토프로틴 인핸서/마우스 알부민 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 핵산 분자.
  23. 제 1 항에 있어서,
    해당 리간드가, 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 단백질에 대해서 특이적인 친화성을 갖는 것인, 핵산 분자.
  24. 제 23 항에 있어서,
    해당 혈관 내피 세포가, 뇌혈관 내피 세포인 핵산 분자.
  25. 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서,
    해당 혈관 내피 세포의 표면에 존재하는 단백질이, 트랜스페린 수용체, 인슐린 수용체, 렙틴 수용체, 인슐린양 성장 인자 I 수용체, 인슐린양 성장 인자 II 수용체, 리포단백질 수용체, 포도당 수송 담체 1, 유기 음이온 트랜스포터, 모노카복실산 트랜스포터, 저밀도 리포단백질 수용체 관련 단백질 1, 저밀도 리포단백질 수용체 관련 단백질 8, 및 헤파린 결합성 상피 성장 인자양 성장 인자의 막결합형 전구체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 핵산 분자.
  26. 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서,
    해당 리간드가, 트랜스페린, 인슐린, 렙틴, 인슐린양 성장 인자 I, 인슐린양 성장 인자 II, 리포단백질, 및 저밀도 리포단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 핵산 분자.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 생리 활성을 갖는 단백질이, 성장 호르몬, 리소좀 효소, 소마토메딘, 인슐린, 글루카곤, 사이토카인, 림포카인, 혈액 응고 인자, 항체, 항체와 다른 단백질의 융합 단백질, 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 매크로파지 콜로니 자극 인자(M-CSF), 에리트로포이에틴, 다르베포에틴, 조직 플라스미노겐 액티베이터(t-PA), 트롬보 모듈린, 난포 자극 호르몬(FSH), 성선 자극 호르몬 방출 호르몬(GnRH), 고나도트로핀, 신경 성장 인자(NGF), 모양체(毛樣體) 신경 영양 인자(CNTF), 글리아 세포주 신경 영양 인자(GDNF), 뉴로트로핀 3, 뉴로트로핀 4/5, 뉴로트로핀 6, 뉴레귤린 1, 액티빈, 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2), 상피 세포 증식 인자(EGF), 혈관 내피 증식 인자(VEGF), 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 γ, 인터류킨 6, PD-1, PD-1 리간드, 종양괴사 인자 α 수용체(TNF-α 수용체), 베타 아밀로이드를 분해하는 활성을 갖는 효소, 에타넬셉트, 페그비소만트, 메트레렙틴, 아바타셉트, 아스포타제, GLP-1 수용체 아고니스트, 및 항체 의약으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 핵산 분자.
  28. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 생리 활성을 갖는 단백질이, α-L-이두로니다제, 이두론산-2-설파타제, 글루코세레브로시다제, β-갈락토시다제, GM2 활성화 단백질, β-헥소사미니다제 A, β-헥소사미니다제 B, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스페라제, α-만노시다제, β-만노시다제, 갈락토실세라미다제, 사포신 C, 아릴설파타제 A, α-L-푸코시다제, 아스파르틸글루코사미니다제, α-N-아세틸갈락토사미니다제, 산성 스핑고미엘리나제, α-갈락토시다제 A, β-글루쿠로니다제, 헤파란 N-설파타제, α-N-아세틸글루코사미니다제, 아세틸 CoAα-글루코사미니드 N-아세틸트랜스페라제, N-아세틸글루코사민-6-설파타제, 산성 세라미다제, 아밀로-1,6-글루코시다제, 시알리다제, 팔미토일 단백질 싸이오에스테라제-1, 트라이펩티딜펩티다제-1, 하이알루로니다제-1, CLN1 및 CLN2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 핵산 분자.
  29. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 제1 역방향 말단 반복 및 해당 제2 역방향 말단 반복이, 아데노 수반 바이러스에서 유래하는 것, 아데노바이러스에서 유래하는 것, 또는 그들의 변이체인 것인, 핵산 분자.
  30. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 제1 역방향 말단 반복이 서열 번호 4로 나타나는 염기 서열을 포함하고, 해당 제2 역방향 말단 반복이 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열을 포함하는 것인, 핵산 분자.
  31. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 제1 역방향 말단 반복이 이하의 (1)~(3)으로부터 선택되는 것이고, 및
    해당 제2 역방향 말단 반복이 이하의 (4)~(6)으로부터 선택되는 것인, 핵산 분자:
    (1) 서열 번호 4로 나타나는 염기 서열과 80% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것,
    (2) 서열 번호 4로 나타나는 염기 서열과 90% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것, 또는
    (3) 서열 번호 4로 나타나는 염기 서열에 1~20개의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 가해진 것; 및
    (4) 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열과 80% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것,
    (5) 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열과 90% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것, 또는
    (6) 서열 번호 5로 나타나는 염기 서열에 1~20개의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 가해진 것.
  32. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 제1 역방향 말단 반복의 기능적 등가물이 서열 번호 6으로 나타나는 염기 서열을 포함하고, 해당 제2 역방향 말단 반복의 기능적 등가물이 서열 번호 7로 나타나는 염기 서열을 포함하는 것인, 핵산 분자.
  33. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 제1 역방향 말단 반복의 기능적 등가물이 이하의 (1)~(3)으로부터 선택되는 것이고, 및
    해당 제2 역방향 말단 반복의 기능적 등가물이 이하의 (4)~(6)으로부터 선택되는 것인, 핵산 분자:
    (1) 서열 번호 6으로 나타나는 염기 서열과 80% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것,
    (2) 서열 번호 6으로 나타나는 염기 서열과 90% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것, 또는
    (3) 서열 번호 6으로 나타나는 염기 서열에 1~20개의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 가해진 것; 및
    (4) 서열 번호 7로 나타나는 염기 서열과 80% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것,
    (5) 서열 번호 7로 나타나는 염기 서열과 90% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것, 또는
    (6) 서열 번호 7로 나타나는 염기 서열에 1~20개의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 가해진 것.
  34. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 제1 긴 말단 반복 및 해당 제2 긴 말단 반복이, 렌티바이러스 또는 레트로바이러스에서 유래하는 것 또는 그 변이체인, 핵산 분자.
  35. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 제1 긴 말단 반복이 서열 번호 43으로 나타나는 염기 서열을 포함하고, 해당 제2 긴 말단 반복이 서열 번호 44로 나타나는 염기 서열을 포함하는 것인, 핵산 분자.
  36. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 제1 긴 말단 반복이 이하의 (1)~(3)으로부터 선택되는 것이고, 및 해당 제2 긴 말단 반복이 이하의 (4)~(6)으로부터 선택되는 것인, 핵산 분자:
    (1) 서열 번호 43으로 나타나는 염기 서열과 80% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것,
    (2) 서열 번호 43으로 나타나는 염기 서열과 90% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것, 또는
    (3) 서열 번호 43으로 나타나는 염기 서열에 1~20개의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 가해진 것; 및
    (4) 서열 번호 44로 나타나는 염기 서열과 80% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것,
    (5) 서열 번호 44로 나타나는 염기 서열과 90% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것, 또는
    (6) 서열 번호 44로 나타나는 염기 서열에 1~20개의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 가해진 것.
  37. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 리더 및 해당 트레일러가, 센다이 바이러스에서 유래하는 것 또는 그 변이체인, 핵산 분자.
  38. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 리더가 서열 번호 45로 나타나는 염기 서열을 포함하고, 해당 트레일러가 서열 번호 46으로 나타나는 염기 서열을 포함하는 것인, 핵산 분자.
  39. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 리더가 이하의 (1)~(3)으로부터 선택되는 것이고, 및 해당 트레일러가 이하의 (4)~(6)으로부터 선택되는 것인, 핵산 분자:
    (1) 서열 번호 45로 나타나는 염기 서열과 80% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것,
    (2) 서열 번호 45로 나타나는 염기 서열과 90% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것, 또는
    (3) 서열 번호 45로 나타나는 염기 서열에 1~20개의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 가해진 것; 및
    (4) 서열 번호 46으로 나타나는 염기 서열과 80% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것,
    (5) 서열 번호 47로 나타나는 염기 서열과 90% 이상의 동일성을 나타내는 염기 서열을 포함하는 것, 또는
    (6) 서열 번호 47로 나타나는 염기 서열에 1~20개의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 가해진 것.
  40. 제 1 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 분자가 도입된 세포, 조직 또는 동물.
  41. 제 1 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 분자가 도입된 줄기세포.
  42. 제 41 항에 있어서,
    간엽계 줄기세포, 치수 유래 줄기세포, 조혈 줄기세포, 배성 줄기세포, 내피 줄기세포, 유선 줄기세포, 장 줄기세포, 간 줄기세포, 췌 줄기세포, 신경 줄기세포, 및 iPS 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 줄기세포.
  43. 제 1 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 분자를 포함하는, 플라스미드.
  44. 제 1 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 분자를 포함하는 비리온.
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW202330591A (zh) * 2021-11-19 2023-08-01 日商Ｊｃｒ製藥股份有限公司 人類運鐵蛋白受體親和性肽

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070082380A1 (en) 2005-10-07 2007-04-12 Pardridge William M Nucleic acids encoding and methods of producing fusion proteins
US20090053219A1 (en) 2007-07-27 2009-02-26 Armagen Technologies, Inc. Methods and compositions for increasing alpha-l-iduronidase activity in the cns
US20110110935A1 (en) 2009-10-09 2011-05-12 Armagen Technologies, Inc. Methods and Compositions for Increasing Iduronate 2-Sulfatase Activity in the CNS
WO2016208695A1 (ja) 2015-06-24 2016-12-29 Ｊｃｒファーマ株式会社 血液脳関門を通過する抗ヒトトランスフェリン受容体抗体
WO2018124121A1 (ja) 2016-12-26 2018-07-05 Ｊｃｒファーマ株式会社 血液脳関門を通過する新規な抗ヒトトランスフェリン受容体抗体

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021513355A (ja) * 2018-02-14 2021-05-27 ジェネレーション バイオ カンパニー 非ウイルス性ｄｎａベクター、ならびに抗体および融合タンパク質の産生のためのその使用
US20210261645A1 (en) * 2018-05-23 2021-08-26 Manysmart Therapeutics, Inc. Bispecific t cell engager and uses thereof
EP4019958A4 (en) 2019-08-23 2023-08-02 JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. METHOD FOR QUANTIFYING HEX4, LYSO-GM1, FUC-GLCNAC-ASN, AND LYSO-SULFATAIDE INCLUDED IN CEREPO-SPINAL FLUID

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070082380A1 (en) 2005-10-07 2007-04-12 Pardridge William M Nucleic acids encoding and methods of producing fusion proteins
US20090053219A1 (en) 2007-07-27 2009-02-26 Armagen Technologies, Inc. Methods and compositions for increasing alpha-l-iduronidase activity in the cns
US20110110935A1 (en) 2009-10-09 2011-05-12 Armagen Technologies, Inc. Methods and Compositions for Increasing Iduronate 2-Sulfatase Activity in the CNS
WO2016208695A1 (ja) 2015-06-24 2016-12-29 Ｊｃｒファーマ株式会社 血液脳関門を通過する抗ヒトトランスフェリン受容体抗体
WO2018124121A1 (ja) 2016-12-26 2018-07-05 Ｊｃｒファーマ株式会社 血液脳関門を通過する新規な抗ヒトトランスフェリン受容体抗体

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Okuyama T. et al., Mol Ther. 26. 27. 456-64 (2019)
Sonoda H. et al., Mol Ther. 26. 1366-74 (2018)

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