ES2592385T3 - Proteínas de unión a heterodímeros y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un heterodímero de polipéptidos, que comprende: (a) un primer polipéptido de cadena única (SCP-I) que comprende de uno a cuatro dominios de unión que se unen específicamente a entre una y cuatro dianas, una bisagra (H-I), un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas (HD-I) y un dominio CH2 y CH3 de inmunoglobulinas de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD o cualquier combinación de las mismas (CH2CH3-I); y (b) un segundo polipéptido de cadena única (SCP-II) que comprende de cero a cuatro dominios de unión que se unen específicamente a entre cero y cuatro dianas, una bisagra (H-II), un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas (HD-II) y un dominio CH2 y CH3 de inmunoglobulinas de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD o cualquier combinación de las mismas (CH2CH3-II), donde (i) el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del primer polipéptido de cadena única (HD-I) y el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del segundo polipéptido de cadena única (HD-II) se asocian preferentemente entre sí para formar un heterodímero de polipéptidos formado por el primer polipéptido de cadena única (SCP-I) y el segundo polipéptido de cadena única (SCP-II), (1) el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del primer polipéptido de cadena única (HD-I) comprende una primera región CH1 de inmunoglobulinas, y el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del segundo polipéptido de cadena única (HD-II) comprende una primera región CL de inmunoglobulinas, o (2) el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del primer polipéptido de cadena única (HD-I) comprende una primera región CL de inmunoglobulinas, y el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del segundo polipéptido de cadena única (HD-II) comprende una primera región CH1 de inmunoglobulinas; y (ii) donde la primera región CL de inmunoglobulinas es una región Ck de inmunoglobulinas humana alterada con uno o más aminoácidos de una región Ck humana natural sustituida en N29, N30, Q52, V55, T56, S68 o T70, Siempre que el heterodímero de polipéptidos comprenda al menos dos dominios de unión que se unen específicamente al menos a dos dianas diferentes.

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas de unión a heterodímeros y usos de los mismos
DECLARACIÓN RELACIONADA CON EL LISTADO DE SECUENCIAS 5
El Listado de secuencias asociado a la presente solicitud se proporciona en formato de texto en lugar de en copia en papel, y se incorpora como referencia en la memoria descriptiva. El nombre del archivo de texto que contiene el Listado de secuencias es 910180_422PC_SEQUENCE_LISTING.txt. El archivo de texto tiene 839 KB, fue creado el 29 de diciembre de 2010, y se remite de forma electrónica por medio de EFS-Web, junto con la presentación de la 10 presente memoria descriptiva.
ANTECEDENTES
Campo técnico 15
La presente descripción proporciona en general heterodímeros de polipéptidos, composiciones de los mismos y procedimientos para preparar y usar dichos heterodímeros de polipéptidos. Más en concreto, los heterodímeros de polipéptidos proporcionados en la presente memoria descriptiva se forman, en parte, por medio de heterodimerización natural entre una región CH1 de inmunoglobulinas y una región constante de cadena ligera de 20 inmunoglobulinas (CL). Además, los heterodímeros de polipéptidos proporcionados en la presente memoria descriptiva comprenden dos o más dominios de unión que se unen específicamente a una o más dianas. Además, los dos polipéptidos de cadena única de los heterodímeros de polipéptidos proporcionados en la presente memoria descriptiva comprenden cada uno una parte de región Fc (por ejemplo, dominios CH2 y CH3 de inmunoglobulinas).
25
Descripción de la técnica relacionada
El proceso de transducción de señales implica a menudo a proteínas receptoras que tienen dominios extracelulares, dominios de transmembrana y dominios intracelulares. Durante la unión de ligandos, a menudo las moléculas receptoras de superficie celular se oligomerizan o se multimerizan (también referido como "reticulación") para 30 transmitir de forma efectiva una señal a un compartimiento intracelular de la célula. La estimulación o bloqueo de esta interacción entre un receptor y un ligando o de la posterior oligomerización o multimerización de los receptores tiene implicaciones terapéuticas importantes para una amplia variedad de enfermedades.
Algunas moléculas de ejemplo útiles para modular las interacciones entre receptor y ligando incluyen anticuerpos o 35 moléculas derivadas de anticuerpos. Por ejemplo, un anticuerpo o su derivado pueden actuar como un antagonista de receptor que se une a un receptor de superficie celular y lo inactiva bloqueando el sitio de unión de un ligando de activación o impidiendo la dimerización o multimerización del receptor necesaria para su activación. En algunos otros casos, un anticuerpo o su derivado puede actuar como un agonista mediante la unión y reticulación de múltiples receptores de membrana, con lo que imita la función de un ligando natural. Otro ejemplo es un derivado de 40 anticuerpo biespecífico que puede usarse para dirigir los agentes citotóxicos o las células efectoras inmunitarias a sitios diana, como, por ejemplo, tumores.
Los anticuerpos biespecíficos son moléculas basadas en anticuerpos que pueden unirse simultáneamente a dos antígenos separados y distintos (o diferentes epítopos del mismo antígeno). Un uso de anticuerpos biespecíficos ha 45 consistido en redirigir las células efectoras inmunitarias citotóxicas para potenciar la destrucción de las células tumorales por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). En este contexto, un brazo del anticuerpo biespecífico se une a un antígeno en la célula tumoral, y el otro se une a un determinante expresado en las células efectoras. Al reticular las células tumorales y efectoras, el anticuerpo biespecífico no sólo lleva las células efectoras en proximidad con las células tumorales sino que además, al mismo tiempo, provoca su activación, lo que lleva a 50 una destrucción efectiva de las células tumorales. Los anticuerpos biespecíficos se han usado también para enriquecer agentes de quimioterapia o radioterapia en tejidos tumorales para reducir al mínimo los efectos perjudiciales en el tejido normal. En este escenario, un brazo del anticuerpo biespecífico se une a un antígeno expresado en la célula diana para su destrucción, y el otro brazo suministra un fármaco quimioterapéutico, un radioisótopo o una toxina. 55
Un obstáculo importante en el desarrollo general de anticuerpos biespecíficos ha sido la dificultad de producir materiales de suficiente calidad y en cantidad suficiente para estudios preclínicos y clínicos. Inicialmente, la principal vía para la producción de anticuerpos biespecíficos fue la coexpresión de las dos cadenas ligeras y las dos cadenas pesadas de dos anticuerpos progenitores de diferentes especificidades en una única célula. Sin embargo, los anticuerpos biespecíficos competentes de unión deseados son un producto menor, y la purificación a partir de otros productos es muy difícil. Otro procedimiento tradicional para producción de anticuerpos biespecíficos es la conjugación química de dos anticuerpos o sus fragmentos que tienen diferentes especificidades. Sin embargo, este procedimiento también es complicado, y el proceso de modificación química puede inactivar el anticuerpo o 5 promover la agregación. Dado que la purificación a partir de productos no deseados sigue siendo difícil, el bajo rendimiento y la baja calidad resultantes de anticuerpo biespecífico hacen este proceso no adecuado para la producción a gran escala necesaria para el desarrollo clínico.
Recientemente, se han usado varias técnicas de heterodimerización para mejorar la producción de anticuerpos 10 biespecíficos. Sin embargo, la fusión de dominios de heterodimerización simples como Jun/Fos arrollado en dominios scFv conduce a una mezcla de homodímeros y heterodímeros y deben ser ensamblados mediante nuevo plegamiento (de Kruif y Logtenberg, J. Biol. Chem. 271: 7630-4, 1996). La fusión de fragmentos scFv a anticuerpos enteros se usó también como un dispositivo de dimerización (Coloma y Morrison, Nat. Biotechnol. 15:159-63, 1997). Sin embargo, dicha fusión produce una molécula grande con bajas capacidades de penetración en los tejidos 15 sólidos. La fusión de dos fragmentos scFv se ha usado también para generar proteínas biespecíficas (por ejemplo, anticuerpos BITE® de Micromet Inc., Bethesda, MD, patente de EE.UU. nº 7.635.472). Sin embargo, dichas proteínas no contienen regiones Fc, y así no permiten la manipulación de sus actividades por medio de regiones Fc. Además, estas proteínas son pequeñas (~55 kDa) y tienen por tanto vidas medias en suero relativamente cortas.
20
El documento WO-2006/074.399-A2 divulga moléculas de unión multiespecíficas que comprenden péptidos de conexión sintéticos.
El documento WO-02/02.781-A1 se refiere a la producción de anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos bivalentes o tetravalentes mediante el uso de procedimientos de ADN recombinante y procedimientos de producción 25 recombinante. El anticuerpo resultante consiste en una o dos moléculas de diacuerpos que son heterodimerizados mediante la creación de una proteína de fusión con los dominios constantes de inmunoglobulinas CL y CH1.
El documento US-6.809.185-B1 divulga una clase de moléculas especificadas como nuevos derivados de anticuerpos de múltiples fines. 30
El documento US-2007/014.794-A1 divulga un procedimiento de preparación de polipéptidos heteromultiméricos tales como anticuerpos biespecíficos, inmunoadhesinas biespecíficas y quimeras anticuerpo-inmunoadhesina.
Hasta la fecha, la tecnología de fusión de inmunoglobulinas no ha proporcionado proteínas de heterodímeros 35 comercialmente viables o procedimientos para prepararlas. Así, aún existe la necesidad en la técnica de proteínas heterodiméricas multiespecíficas alternativas así como procedimientos eficientes para producirlas.
En un primer aspecto de la presente descripción se proporciona un heterodímero de polipéptidos, que comprende:
40
(a) un primer polipéptido de cadena única (SCP-I) que comprende de uno a cuatro dominios de unión que se unen específicamente a entre una y cuatro dianas, una bisagra (H-I), un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas (HD-I) y un dominio CH2 y CH3 de inmunoglobulinas de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD o cualquier combinación de las mismas (CH2CH3-I); y
(b) un segundo polipéptido de cadena única (SCP-II) que comprende de cero a cuatro dominios de unión que se 45 unen específicamente a entre cero y cuatro dianas, una bisagra (H-II), un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas (HD-II) y un dominio CH2 y CH3 de inmunoglobulinas de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD o cualquier combinación de las mismas (CH2CH3-II),
donde 50
(i) el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del primer polipéptido de cadena única (HD-I) y el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del segundo polipéptido de cadena única (HD-II) se asocian preferentemente entre sí para formar un heterodímero de polipéptidos formado por el primer polipéptido de cadena única (SCP-I) y el segundo polipéptido de cadena única (SCP-II), y 55
(1) el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del primer polipéptido de cadena única (HD-I) comprende una primera región CH1 de inmunoglobulinas, y el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del segundo polipéptido de cadena única (HD-II) comprende una primera región CL de inmunoglobulinas, o
(2) el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del primer polipéptido de cadena única (HD-I) comprende una primera región CL de inmunoglobulinas, y el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del segundo polipéptido de cadena única (HD-II) comprende una primera región CH1 de inmunoglobulinas;
(ii) donde la primera región CL de inmunoglobulinas es una región CL de inmunoglobulinas humana alterada con uno 5 o más aminoácidos de una región Cκ humana natural sustituida en N29, N30, Q52, V55, T56, S68 o T70,
siempre que el heterodímero de polipéptidos comprenda al menos dos dominios de unión que se unen específicamente al menos a dos dianas diferentes.
10
En un aspecto adicional de la invención se proporciona también una composición que comprende el heterodímero de polipéptidos de la presente invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto de la presente invención se proporciona también el heterodímero de polipéptidos de la presente invención para su uso en a) un procedimiento para dirigir la activación de linfocitos T, donde el heterodímero de 15 polipéptidos comprende un dominio de unión que se une específicamente a TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, o una combinación de los mismos, y un segundo dominio de unión que se une específicamente a una diana diferente; o
b) la inhibición del crecimiento, metástasis o crecimiento metastásico de una malignidad, donde el heterodímero de polipéptidos comprende un dominio de unión que se une específicamente a TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, c-Met 20 o Ron.
c) el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria, donde el heterodímero de polipéptidos comprende un dominio de unión que se une específicamente a TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε o CD28.
25
En otro aspecto de la presente invención se proporciona un efector de expresión capaz de expresar el heterodímero de polipéptidos de la presente invención que comprende un vector de expresión capaz de expresar el heterodímero de polipéptidos de la presente invención, que comprende un primer polinucleótido que codifica el primer polipéptido de cadena única y un segundo polinucleótido que codifica el segundo polipéptido de cadena única.
30
La presente invención proporciona también una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la presente invención y una célula hospedadora que comprende vectores de expresión primero y segundo capaces de expresar los polipéptidos de cadena única primero y segundo, respectivamente, del heterodímero de polipéptidos de la presente invención.
35
En otro aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento para preparar un heterodímero de polipéptidos, que comprende:
(a) el cultivo de una célula hospedadora de acuerdo con la presente invención en condiciones adecuadas para expresar polipéptidos de cadena única primero y segundo, y 40
(b) el aislamiento o purificación opcionales de los heterodímeros formados a partir de los polipéptidos de cadena única primero y segundo desde el cultivo.
La presente descripción proporciona heterodímeros de polipéptidos formados entre dos polipéptidos de cadena única diferentes por medio de heterodimerización natural de una región CHI de inmunoglobulinas y una región 45 constante de cadena ligera de inmunoglobulinas (CL). La presente descripción proporciona también ácidos nucleicos, vectores, células hospedadoras y procedimientos para preparar heterodímeros de polipéptidos así como procedimientos para usar dichos heterodímeros de polipéptidos, por ejemplo en activación dirigida de linfocitos T, inhibición de crecimiento de tumores malignos sólidos, tratamiento de enfermedades autoinmunitarias o inflamatorias o tratamiento de trastornos o enfermedades asociados con los linfocitos B. 50
En un aspecto, la presente descripción proporciona un heterodímero de polipéptidos que comprende (a) un primer polipéptido de cadena única (SCP-I) que comprende de uno a cuatro dominios de unión que se unen específicamente a entre una y cuatro dianas, una bisagra (H-I), un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas (HD-I), y una parte de región Fc (FRP-I); y (b) un segundo polipéptido de cadena única (SCP-II) 55 que comprende de cero a cuatro dominios de unión que se unen específicamente a entre cero y cuatro dianas, una bisagra (H-II), un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas (HD-II) y una parte de región Fc (FRP-II); donde (i) la inmunoglobulina HD-I y la inmunoglobulina HD-II se asocian preferentemente entre sí para formar un heterodímero de polipéptidos formado por SCP-I y SCP-II, y (1) el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del primer polipéptido de cadena única (HD-I) comprende una primera región CH1 de inmunoglobulinas, y el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del segundo polipéptido de cadena única (HD-II) comprende una primera región CL de inmunoglobulinas, o (2) el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del primer polipéptido de cadena única (HD-I) comprende una primera región CL de inmunoglobulinas, y el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del segundo polipéptido de cadena única 5 (HD-II) comprende una primera región CH1 de inmunoglobulinas; y (ii) la parte de región Fc de SCP-I y la parte de región Fc de SCP-II comprenden un dominio CH2 y CH3 de inmunoglobulinas de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD o cualquier combinación de las mismas; unos o dos dominios CH3 de inmunoglobulinas de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM o cualquier combinación de las mismas; o un dominio CH3 y CH4 de inmunoglobulinas de IgE, IgM o cualquier combinación de las mismas, siempre que el heterodímero de polipéptidos 10 comprenda al menos dos dominios de unión que se unen específicamente a una diana, por ejemplo, al menos dos dianas diferentes.
En algunas realizaciones, los dominios de unión de los heterodímeros de polipéptidos son polipéptidos Fv de cadena única (scFv). 15
En algunas realizaciones, el heterodímero de polipéptidos comprende dos dominios de unión (BD1 y BD2). En una realización, los dos dominios de unión (BD1 y BD2) están en el primer polipéptido de cadena única (SCP-I) y donde HD-I y FRP-I están dispuestos entre BD1 y BD2. En otra realización, el primer dominio de unión (BD1) está en el primer polipéptido de cadena única (SCP-I) y el segundo dominio de unión (BD2) está en el segundo polipéptido de 20 cadena única (SCP-II). Por ejemplo, el primer dominio de unión (BD1) puede estar en el extremo amino en la parte de región Fc del primer polipéptido de cadena única (FRP-I), y el segundo dominio de unión (BD2) puede estar en el extremo amino en la parte de región Fc del segundo polipéptido de cadena única (FRP-II). Alternativamente, el primer dominio de unión (BD1) puede estar en el extremo amino en la parte de región Fc del primer polipéptido de cadena única (FRP-I), y el segundo dominio de unión (BD2) puede estar en el extremo carboxilo en la parte de 25 región Fc del segundo polipéptido de cadena única (FRP-II). Además, alternativamente, el primer dominio de unión (BD1) puede estar en el extremo carboxilo en la parte de región Fc del primer polipéptido de cadena única (FRP-I), y el segundo dominio de unión (BD2) puede estar en el extremo carboxilo en la parte de región Fc del segundo polipéptido de cadena única (FRP-II).
30
En algunas realizaciones, el heterodímero de polipéptidos comprende tres dominios de unión (BD1, BD2 y BD3). En una realización, HD-I y FRP-I están dispuestos entre BD1 y BD2, y el tercer dominio de unión (BD3) está en el extremo amino en la parte de región Fc del segundo polipéptido de cadena única (FRP-II). En una realización alternativa, HD-I y FRP-I están dispuestos entre BD1 y BD2, y el tercer dominio de unión (BD3) está en el extremo carboxilo en la parte de región Fc del segundo polipéptido de cadena única (FRP-II). 35
En algunas realizaciones, el heterodímero de polipéptidos comprende cuatro dominios de unión (BD1, BD2, BD3 y BD4). Por ejemplo, HD-I y FRP-I pueden estar dispuestos entre BD1 y BD2, y HD-II y FRP-II pueden estar dispuestos entre BD3 y BD4.
40
En algunas realizaciones, el heterodímero de polipéptidos comprende de cinco a ocho dominios de unión (por ejemplo, 5, 6, 7 u 8 dominios de unión).
En algunas realizaciones, al menos uno de los dominios de unión de los heterodímeros de polipéptidos proporcionados en la presente memoria descriptiva se une específicamente a, o es un antagonista de, TCRα, TCRβ, 45 CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD28, CD79b, hiper-IL-6, mono-IL-10, CD86, CD20, PSMA, CD19, HLA-DR, Ron, c-Met, CEACAM-6, LIGHT, GITRL, CD40, PDL1, PDL2, HVEM, LTBR, EGFR, EGFRvIII, ErbB2, ErbB3, ErbB4, IGF1R, EphA2, PDGFR, VEGFR1-4, angiopoyetina 2, CD64, CD32A, CD16, CD71, TNFR1, TNFR2, TWEAKR, TACI, BAFF-R, BCMA, FAS, CD32B, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD70, TNFα, IL-6, hiper-IL-6, IL-2, IL-1, IL-7, IL-8, IL-17A/C, IP-10, IFNγ, IFNα, RANKL, FASL, TGFβ, IL10, IL17A/F, CSF2, IGF1, IGF2, BLyS/APRIL, HGF, MSP, EGF 50 (incluyendo epirregulina, herrregulina, β-regulina, neurregulina), HIF-1α, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD, TNFα, Wnt, sHH, TGFβ, PDGF, TWEAK, EpCAM, CEA, PCTA-1, STEAP-1, PSCA, ALCAM (CD166), EphA2, CD151, CA-125, MUC-1, MAGE-1, TROP2, CCR5, HER-3, HER-4, EGFR, CEA, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5b, MUC7, βhCG, Lewis-Y, gangliósido GD3, 9-O-acetil-GD3, GM2, Globo H, fucosil GM1, Poli SA, GD2, carboanhidrasa IX (MN/CA IX), CD44v6, Sonic Hedgehog (Shh), Wue-1, antígeno de células plasmáticas, IgE (ligada 55 a membrana), proteoglicano de sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP), CCR8, precursor de TNF-alfa, STEAP, mesotelina, antígeno A33, antígeno de células madre de próstata (PSCA), Ly-6; desmogleína 4, neoepítopo de E-cadherina, receptor de acetilcolina fetal, CD25, marcador de CA19-9, marcador de CA-125 y receptor de sustancia inhibidora de Mueller (MIS) tipo II, sTn (antígeno Tn sialilado; TAG-72), FAP (antígeno de activación de fibroblastos), endosialina, EGFRvIII, LG, SAS, CD63, IGF1R, CD151, TGFBR2, GHRHR, GHR, IL-6R, gp130, TNFR2, OSMRβ, Patched-1, Frizzled, Robo1, CD80, CD81, CD86, OX40, CD40, CD137, LIFRβ, TLR7 o TLR9.
En algunas otras realizaciones, al menos uno de los dominios de unión del heterodímero de polipéptidos es un agonista de IL-10, HLA-G, HGF, IL-35, PD-1, BTLA, TNFR1, TNFR2, DR4, DR5, TWEAKR o FAS. 5
En algunos heterodímeros de polipéptidos proporcionados en la presente memoria descriptiva, al menos un dominio de unión se une específicamente a un complejo TCR o un componente de los mismos, y al menos otro dominio de unión se une específicamente a PSMA, CD79b, CD19, HLA-DR, CD20, RON, c-Met o CEACAM-6.
10
En algunos otros heterodímeros de polipéptidos proporcionados en la presente memoria descriptiva, al menos un dominio de unión se une específicamente a CD28, y al menos otro dominio de unión se une específicamente a, o es un antagonista de, CD79b, hiper-IL-6, PDL2, mono-IL-10, CD86, LIGHT, GITRL, CD40, PDL1, HVEM o LTBR.
En algunos otros heterodímeros de polipéptidos proporcionados en la presente memoria descriptiva, al menos un 15 dominio de unión se une específicamente a CD28, y al menos otro dominio de unión es un agonista de IL-10, HLA-G, HGF, IL-35, PD-1 o BTLA.
En algunas realizaciones, el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del primer polipéptido de cadena única (HD-I) comprende la primera región CH1 de inmunoglobulinas y el dominio de heterodimerización de 20 inmunoglobulinas del segundo polipéptido de cadena única (HD-II) comprende la primera región CL de inmunoglobulinas. En una realización, la primera región CH1 está en el extremo amino en la parte de región Fc del primer polipéptido de cadena única, y la primera región CL está en el extremo amino en la parte de región Fc del segundo polipéptido de cadena única. En otra realización, la primera región CH1 está en el extremo carboxilo en la parte de región Fc del primer polipéptido de cadena única, y la primera región CL está en el extremo carboxilo en la 25 parte de región Fc del segundo polipéptido de cadena única.
En algunas realizaciones donde el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del primer polipéptido de cadena única (HD-I) comprende la primera región CH1 de inmunoglobulinas y el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del segundo polipéptido de cadena única (HD-II) comprende la primera región CL de 30 inmunoglobulinas, el primer polipéptido de cadena única comprende además una segunda región CH1 y el segundo polipéptido de cadena única comprende además una segunda región CL, y la segunda región CH1 del primer polipéptido de cadena única y la segunda región CL del segundo polipéptido de cadena única se asocian entre sí en el heterodímero de polipéptidos. Por ejemplo, la parte de región Fc del primer polipéptido de cadena única puede estar dispuesta entre las regiones CH1 primera y segunda, y la parte de región Fc del segundo polipéptido de 35 cadena única puede estar dispuesta entre las regiones CL primera y segunda. Alternativamente, las dos regiones CH1 primera y segunda pueden estar en el extremo amino en la parte de región Fc del primer polipéptido de cadena única, y las dos regiones CL primera y segunda pueden estar en el extremo amino en la parte de región Fc del segundo polipéptido de cadena única. Además, alternativamente, las dos regiones CH1 primera y segunda pueden estar en el extremo carboxilo en la parte de región Fc del primer polipéptido de cadena única, y las dos regiones CL 40 primera y segunda pueden estar en el extremo carboxilo en la parte de región Fc del segundo polipéptido de cadena única.
En algunas otras realizaciones donde el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del primer polipéptido de cadena única (HD-I) comprende la primera región CH1 de inmunoglobulinas y el dominio de heterodimerización 45 de inmunoglobulinas del segundo polipéptido de cadena única (HD-II) comprende la primera región CL de inmunoglobulinas, el primer polipéptido de cadena única comprende además una segunda región CL y el segundo polipéptido de cadena única comprende además una segunda región CH1, y la segunda región CL del primer polipéptido de cadena única y la segunda región CH1 del segundo polipéptido de cadena única se asocian entre sí en el heterodímero de polipéptidos. Por ejemplo, en una realización, en el primer polipéptido de cadena única, la 50 primera región CH1 está en el extremo amino en la parte de región Fc y la segunda región CL está en el extremo carboxilo en la parte de región Fc; y en el segundo polipéptido de cadena única, la primera región CL está en el extremo amino en la parte de región Fc, y la segunda región CH1 está en el extremo carboxilo en la parte de región Fc. En otra realización, en el primer polipéptido de cadena única, la primera región CH1 está en el extremo carboxilo en la parte de región Fc, y la segunda región CL está en el extremo amino en la parte de región Fc; y en el segundo 55 polipéptido de cadena única, la primera región CL está en el extremo carboxilo en la parte de región Fc, y la segunda región CH1 está en el extremo amino en la parte de región Fc. En otra realización más, en el primer polipéptido de cadena única, la primera región CH1 y las segundas regiones CL están en el extremo amino en la parte de región Fc, y la primera región CH1 está en el extremo amino en la segunda región CL; y en el segundo polipéptido de cadena única, la primera región CL y la segunda región CH1 están en el extremo amino en la parte de región Fc, y la primera región CL está en el extremo amino en la segunda región CH1. En otra realización más, en el primer polipéptido de cadena única, la primera región CH1 y las segundas regiones CL están en el extremo amino en la parte de región Fc, y la segunda región CL está en el extremo amino en la primera región CH1; y en el segundo polipéptido de cadena única, la primera región CL y la segunda región CH1 están en el extremo amino en la parte de 5 región Fc, y la segunda región CH1 está en el extremo amino en la primera región CL. En una realización adicional, en el primer polipéptido de cadena única, la primera región CH1 y las segundas regiones CL están en el extremo carboxilo en la parte de región Fc, y la primera región CH1 está en el extremo amino en la segunda región CL; y en el segundo polipéptido de cadena única, la primera región CL y la segunda región CH1 están en el extremo carboxilo en la parte de región Fc, y la primera región CL está en el extremo amino en la segunda región CH1. En otra 10 realización, en el primer polipéptido de cadena única, la primera región CH1 y las segundas regiones CL están en el extremo carboxilo en la parte de región Fc, y la segunda región CL está en el extremo amino en la primera región CH1; y en el segundo polipéptido de cadena única, la primera región CL y la segunda región CH1 están en el extremo carboxilo en la parte de región Fc, y la segunda región CH1 está en el extremo amino en la primera región CL. 15
En algunas realizaciones, el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del primer polipéptido de cadena única (HD-I) comprende una primera región CL de inmunoglobulinas, y el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del segundo polipéptido de cadena única (HD-II) comprende una primera región CH1 de inmunoglobulinas. En una realización, la primera región CL está en el extremo amino en la parte de región Fc del 20 primer polipéptido de cadena única, y la primera región CH1 está en el extremo amino en la parte de región Fc del segundo polipéptido de cadena única. En otra realización, la primera región CL está en el extremo carboxilo en la parte de región Fc del primer polipéptido de cadena única, y la primera región CH1 está en el extremo carboxilo en la parte de región Fc del segundo polipéptido de cadena única. En otra realización más, el primer polipéptido de cadena única comprende además una segunda región CL y el segundo polipéptido de cadena única comprende 25 además una segunda región CH1, y la segunda región CL del primer polipéptido de cadena única y la segunda región CH1 del segundo polipéptido de cadena única se asocian entre sí en el heterodímero de polipéptidos. Por ejemplo, la parte de región Fc del primer polipéptido de cadena única puede estar dispuesta entre las regiones CL primera y segunda, y la parte de región Fc del segundo polipéptido de cadena única puede estar dispuesta entre las regiones CH1 primera y segunda. Alternativamente, las dos regiones CL primera y segunda pueden estar en el 30 extremo amino en la parte de región Fc del primer polipéptido de cadena única, y las dos regiones CH1 primera y segunda pueden estar en el extremo amino en la parte de región Fc del segundo polipéptido de cadena única. Además, alternativamente, las dos regiones CL primera y segunda pueden estar en el extremo carboxilo en la parte de región Fc del primer polipéptido de cadena única, y las dos regiones CH1 primera y segunda pueden estar en el extremo carboxilo en la parte de región Fc del segundo polipéptido de cadena única. 35
En algunas realizaciones, la primera región CL es una región Cκ. En otras realizaciones, la primera región CL es una región Cλ.
En algunas realizaciones, la segunda región CL es una región Cκ. En otras realizaciones, la segunda región CL es 40 una región Cλ.
En algunas realizaciones, la región Cκ es una región Cκ de inmunoglobulinas humana natural. En algunas otras realizaciones, la región Cκ es una región Cκ de inmunoglobulinas humana alterada con uno o más aminoácidos de una región Cκ humana natural sustituida en N29, N30, Q52, V55, T56, T56, S68 o T70. Por ejemplo, la una o más 45 sustituciones de aminoácidos pueden seleccionarse de entre Ala (A), Arg (R), Trp (W), Tyr (Y), Glu (E), Gln (Q), Lys (K), Asp (D), Met (M), Ser (S) y Phe (F).
En algunas realizaciones, la región CH1 es una región CH1 de inmunoglobulinas humana alterada que comprende una sustitución de aminoácidos por la cual Val (V) en la posición 68 es sustituida por Lys (K), Arg (R) o His (H), y 50 donde la región Cκ es una región Cκ de inmunoglobulinas humana alterada que comprende una sustitución de aminoácidos por la cual Leu (L) en la posición 27 es sustituida por Asp (D) o Glu (E). En algunas otras realizaciones, la región CH1 es una región CH1 de inmunoglobulinas humana alterada que comprende una sustitución de aminoácidos por la cual Val (V) en la posición 68 se modifica a Asp (D) o Glu (E), y donde la región Cκ es una región Cκ de inmunoglobulinas humana alterada que comprende una sustitución de aminoácidos por la cual Leu (L) en la 55 posición 29 se modifica a Lys (K), Arg (R) o His (H).
En algunas realizaciones, la región Cλ es una región Cλ de inmunoglobulina humana natural.
En algunas realizaciones, la primera región CH1 o la segunda región CH1 cuando está presente es una región CH1 de inmunoglobulinas humana natural, tal como una región CH1 IgG1 humana natural.
En algunas realizaciones, la primera región CH1 o la segunda región CH1 cuando está presente es una región CH1 de inmunoglobulinas humana alterada, tal como una región CH1 IgG1 humana alterada, con la cisteína de una 5 región CH1 de inmunoglobulinas humana natural que interviene en la formación de un enlace de disulfuro con una región CL de inmunoglobulinas humana natural suprimida o sustituida.
En algunas realizaciones, la región Cκ es una región Cκ de inmunoglobulinas humana alterada, tal como un con el resto de cisteína de una región Cκ humana natural que interviene en la formación de un enlace de disulfuro con una 10 región CH1 de inmunoglobulinas humana natural suprimida o sustituida.
En algunas realizaciones, la región Cλ es una región Cλ de inmunoglobulinas humana alterada con el resto de cisteína de una región Cλ humana natural que interviene en la formación de un enlace de disulfuro con una región CH1 de inmunoglobulinas humana natural suprimida o sustituida. 15
En algunas realizaciones, la primera región CH1 y la segunda región CH1 cuando está presente es un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 114, 844 ó 845.
En algunas realizaciones, la región Cκ cuando está presente se selecciona de entre uno cualquiera de los 20 polipéptidos que comprenden SEQ ID NO: 141-178, 202, y 838-843.
En algunas realizaciones, la región Cλ cuando está presente es un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 140.
En algunas realizaciones, la parte de región Fc del primer polipéptido de cadena única (FRP-I) y la parte de región 25 Fc del segundo polipéptido de cadena única (FRP-II) comprenden un dominio CH2 de inmunoglobulinas, tal como un dominio CH2 IgG1 o un dominio CH2 IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 o IgD.
En algunas realizaciones, la parte de región Fc del primer polipéptido de cadena única (FRP-I) y la parte de región Fc del segundo polipéptido de cadena única (FRP-II) comprenden un dominio CH3 de inmunoglobulinas, tal como un 30 dominio CH3 IgG1 o un dominio CH3 IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE o IgM.
En algunas realizaciones, la parte de región Fc del primer polipéptido de cadena única (FRP-I) y la parte de región Fc del segundo polipéptido de cadena única (FRP-II) comprenden un dominio CH2 de inmunoglobulinas y un dominio CH3 de inmunoglobulinas, tal como dominios CH2 y CH3 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 o IgD. 35
En algunas realizaciones donde la parte de región Fc comprende un dominio CH3 de inmunoglobulinas que está inmediatamente en el extremo amino en un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas (por ejemplo, un dominio CH1 o un dominio Cκ), el dominio CH3 de inmunoglobulinas está vinculado con el dominio CH1 inmediatamente en el extremo carboxilo en el dominio CH3 de inmunoglobulinas en un polipéptido de cadena única 40 por medio de un péptido que comprende SEQ ID NO: 846, 847, 848 ó 849; y el dominio CH3 de inmunoglobulinas está vinculado con el dominio Cκ inmediatamente en el extremo carboxilo en el dominio CH3 de inmunoglobulinas en el otro polipéptido de cadena única por medio de un péptido que comprende SEQ ID NO: 846, 850, 951 ó 852.
En algunas realizaciones, la parte de región Fc del primer polipéptido de cadena única (FRP-I) y la parte de región 45 Fc del segundo polipéptido de cadena única (FRP-II) comprenden dominios CH3 y CH4 IgM o IgE.
En algunas realizaciones donde la parte de región Fc comprende un dominio CH2 de inmunoglobulinas, el dominio CH2 puede ser un dominio CH2 IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas alterado. Los dominios CH2 IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas alterados de ejemplo incluyen los que comprenden (a) una sustitución de aminoácidos en la posición 50 297 y al menos una deleción o sustitución adicional en las posiciones 234 a 238; (b) una o más mutaciones de aminoácidos en las posiciones 234-238 y al menos una sustitución en la posición 253, 310, 318, 320, 322 ó 331; o (c) una sustitución de aminoácidos en la asparagina de la posición 297, una o más sustituciones o deleciones en las posiciones 234 a 238, y al menos una sustitución en la posición 253, 310, 318, 320, 322 ó 331. Otro dominio CH2 de ejemplo es un dominio CH2 IgG1 humanas alterado que comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 55 L234, L235, G237, E318, K320 y K322.
En algunas realizaciones, el dominio CH3 del primer polipéptido de cadena única es un dominio CH3 IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas alterado que comprende una sustitución T366W, y el dominio CH3 del segundo polipéptido de cadena única es un dominio CH3 IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas alterado que comprende una sustitución Y407A. En algunas otras realizaciones, el dominio CH3 del primer polipéptido de cadena única es un dominio CH3 IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas alterado que comprende una sustitución T366Y, y el dominio CH3 del segundo polipéptido de cadena única es un dominio CH3 IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas alterado que comprende una sustitución Y407T. En algunas otras realizaciones, el dominio CH3 del primer polipéptido de cadena única es un 5 dominio CH3 IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas alterado que comprende una sustitución T366W, y el dominio CH3 del segundo polipéptido de cadena única es un dominio CH3 IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas alterado que comprende sustituciones T366S, L368A y Y407V. En algunas otras realizaciones, el dominio CH3 del primer polipéptido de cadena única es un dominio CH3 IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas alterado que comprende una sustitución Y407A, y el dominio CH3 del segundo polipéptido de cadena única es un dominio CH3 IgG1, IgG2, IgG3 10 o IgG4 humanas alterado que comprende una sustitución T366W. En algunas otras realizaciones, el dominio CH3 del primer polipéptido de cadena única es un dominio CH3 IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas alterado que comprende una sustitución Y407T, y el dominio CH3 del segundo polipéptido de cadena única es un dominio CH3 IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas alterado que comprende una sustitución T366Y. En algunas otras realizaciones, el dominio CH3 del primer polipéptido de cadena única es un dominio CH3 IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas 15 alterado que comprende sustituciones T366S, L368A y Y407W, y el dominio CH3 del segundo polipéptido de cadena única es un dominio CH3 IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humanas alterado que comprende una sustitución T366W.
En algunas realizaciones, la bisagra de los polipéptidos de cadena única primero y segundo es una región bisagra de inmunoglobulinas, tal como una bisagra de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD o IgE. En algunas 20 realizaciones, la bisagra de inmunoglobulinas es una bisagra de inmunoglobulinas natural. En algunas otras realizaciones, la bisagra de inmunoglobulinas es una bisagra de inmunoglobulinas alterada seleccionadas de entre SEQ ID NO: 232, 234, 240, 664-673, 675 y 676.
En algunas realizaciones, la región bisagra está (a) en el extremo amino en la parte de región Fc, (b) dispuesta entre 25 el dominio de unión y el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas, (c) dispuesta entre el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas y la parte de región Fc, (d) en el extremo amino del primer o el segundo polipéptido de cadena única, (e) dispuesta entre la parte de región Fc y un dominio de unión, o (f) en el extremo carboxilo del primer o el segundo polipéptido de cadena única.
30
En algunas realizaciones, al menos una de las bisagras de los polipéptidos de cadena única primero y segundo es una región bisagra de lectina de tipo C, tal como un péptido NKg2A o NKg2D, o un derivado de los mismos.
En algunas realizaciones, las bisagras de los polipéptidos de cadena única primero y segundo son idénticas. En algunas otras realizaciones, las bisagras de los polipéptidos de cadena única primero y segundo son diferentes. 35
En algunas realizaciones, el primer polipéptido de cadena única comprende un dominio de unión que se une específicamente a un complejo TCR o un componente de los mismos, y el segundo polipéptido de cadena única comprende un dominio de unión que se une específicamente a CD19, CD79b, HLA-DR o CD20.
40
En algunas realizaciones, el primer polipéptido de cadena única comprende un dominio de unión que se une específicamente a CD28, y el segundo polipéptido de cadena única comprende un dominio de unión (a) que se une específicamente a CD79b, hiper-IL-6 o CD86 o (b) que comprende un ectodominio de PDL o un mono-IL-10.
En algunas realizaciones, el primer polipéptido de cadena única comprende un dominio de unión que se une 45 específicamente a c-Met, y el segundo polipéptido de cadena única comprende un dominio de unión que se une específicamente a RON.
En algunas realizaciones, los polipéptidos de cadena única primero y segundo comprenden SEQ ID NO: SEQ ID NO: 2 y 4, SEQ ID NO: 6 y 8, SEQ ID NO: 10 y 12, SEQ ID NO: 14 y 16, SEQ ID NO: 18 y 20, SEQ ID NO: 20 y 22, 50 SEQ ID NO: 20 y 24, SEQ ID NO: 30 y 32, SEQ ID NO: 29 y 31, SEQ ID NO: 29 y 32, SEQ ID NO: 30 y 72, SEQ ID NO: 53 y 72, SEQ ID NO: 54 y 72, SEQ ID NO: 55 y 72, SEQ ID NO: 70 y 72, SEQ ID NO: 71 y 72, SEQ ID NO: 63 y 56, SEQ ID NO: 64 y 57, SEQ ID NO: 65 y 60, SEQ ID NO: 66 y 58, SEQ ID NO: 67 y 59, SEQ ID NO: 68 y 61, SEQ ID NO: 69 y 62, SEQ ID NO: 54 y 811, SEQ ID NO: 54 y 812, SEQ ID NO: 54 y 813, SEQ ID NO: 814 y 818, SEQ ID NO: 815 y 818, SEQ ID NO: 816 y 818, SEQ ID NO: 817 y 818, SEQ ID NO: 814 y 820, SEQ ID NO: 814 y 821, SEQ 55 ID NO: 54 y 819, SEQ ID NO: 814 y 826, SEQ ID NO: 814 y 822, SEQ ID NO: 814 y 823, SEQ ID NO: 814 y 824, SEQ ID NO: 859 y 862, SEQ ID NO: 860 y 863, SEQ ID NO: 861 y 864, SEQ ID NO: 874 y 825, SEQ ID NO: 875 y 879, SEQ ID NO: 876 y 880, SEQ ID NO: 877 y 881, o SEQ ID NO: 878 y 882.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona una composición que comprende un heterodímero de polipéptidos proporcionados en la presente memoria descriptiva y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un vector de expresión capaz de expresar un heterodímero de polipéptidos proporcionados en la presente memoria descriptiva, que comprende un primer polinucleótido que 5 codifica el primer polipéptido de cadena única y un segundo polinucleótido que codifica el segundo polipéptido de cadena única.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona una célula hospedadora que comprende el vector de expresión anterior. 10
En otro aspecto, la presente descripción proporciona una célula hospedadora que comprende vectores de expresión primero y segundo capaces de expresar los polipéptidos de cadena única primero y segundo, respectivamente, del heterodímero de polipéptidos proporcionados en la presente memoria descriptiva.
15
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un procedimiento para preparar un heterodímero de polipéptidos, que comprende (a) el cultivo de una célula hospedadora proporcionada en la presente memoria descriptiva en condiciones adecuadas para expresar los polipéptidos de cadena única primero y segundo, y (b) el aislamiento o purificación opcionales de los heterodímeros formados a partir de los polipéptidos de cadena única primero y segundo desde el cultivo. 20
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un procedimiento para dirigir la activación de linfocitos T, que comprende la administración a un paciente que lo necesita de una cantidad efectiva de un heterodímero de polipéptidos que comprende un dominio de unión que se une específicamente a TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, o una combinación de los mismos, y un segundo dominio de unión que se une específicamente a una diana diferente, 25 por ejemplo, un antígeno específico de tumor u otro antígeno de elección en el lugar o células donde se desea la activación de linfocitos T.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un procedimiento para inhibir el crecimiento, metástasis o crecimiento metastásico de una malignidad, que comprende la administración a un paciente que lo necesita de una 30 cantidad efectiva de un heterodímero de polipéptidos que comprende un dominio de unión que se une específicamente a TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, c-Met, RON, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además la administración a un paciente que lo necesita de un agente quimioterapéutico o radiación ionizante.
35
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria, que comprende la administración a un paciente que lo necesita de una cantidad efectiva de un heterodímero de polipéptidos que comprende un dominio de unión que se une específicamente a TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε o CD28.
40
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un procedimiento para tratar un trastorno o enfermedad asociado a linfocitos B que comprende la administración a un paciente que lo necesita de una cantidad efectiva de un heterodímero de polipéptidos que comprende un dominio de unión que se une específicamente a TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ o CD3ε, y un segundo dominio de unión que se une específicamente a CD19, CD20, CD79b o HLA-DR.
45
En algunas realizaciones, los procedimientos para usar los heterodímeros de polipéptidos proporcionados en la presente memoria descriptiva pueden comprender además la administración a un paciente que lo necesita de un segundo agente activo, tal como un segundo heterodímero de polipéptidos, un anticuerpo monoclonal o una proteína de fusión derivada de inmunoglobulinas.
50
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1 es una representación esquemática del heterodímero de polipéptidos anti-CD28 bivalente X0172 (izquierda) y análisis por SDS-PAGE de X0172 (derecha). "NR" significa "no reducido”, y "Red" significa "reducido”.
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La figura 2 muestra que un heterodímero de polipéptidos anti-CD28 monovalente (X0124) y uno bivalente (X0172) establecen una sinergia con una concentración subóptima de PMA al estimular linfocitos T humanos purificados cuando se compara con una scFv anti-CD28 (scFv 2E12) pero menos que una proteína SMIP anti-CD28 bivalente (SMIP 2E12).
La figura 3 muestra que el heterodímero de polipéptidos bivalente X0172 se une a los linfocitos T CD4+ mejor que la scFv 2E12 y el heterodímero de polipéptidos monovalente X0124.
La figura 4 muestra la cromatografía por intercambio de cationes de los heterodímeros de polipéptidos X0251, X0252 5 y X0253 (izquierda) y análisis mediante electroforesis SDS-PAGE de los mismos heterodímeros de polipéptidos en condiciones no reducida (NR) y reducida (Red) (derecha).
La figura 5 muestra los espectros de masas del heterodímero de polipéptidos X0252, que revelan que el heterodímero es la especie predominante. 10
La figura 6 muestra un análisis mediante electroforesis SDS-PAGE de los heterodímeros de polipéptidos X0283 y X0284 en condiciones no reducida (NR) y reducida (Red) (izquierda) y el análisis por cromatografía por intercambio de cationes del heterodímero de polipéptidos X0283.
15
La figura 7 muestra la unión directa a CD86 por el heterodímero de polipéptidos X0283 de acuerdo con su análisis mediante BIACORE®, con las unidades de respuesta (Ru) representadas con respecto al tiempo (izquierda) y una representación esquemática de X0283.
Las figuras 8A y 8B muestran la unión de construcciones biespecíficas anti-RON y anti-CD3 (heterodímero de 20 polipéptidos S0268 y proteína Scorpion S0266) a células MDA-MB-453 (A) y a linfocitos T aislados (B).
Las figuras 9A y 9B muestran la especificidad de unión a (A) células Rec1 (CD19+, CD20+) o (B) células Jurkat (CD3+) por heterodímeros biespecíficos que tienen dominios de unión anti-CD19 y anti-CD3 (TSC020) o que tienen dominios de unión anti-CD20 y anti-CD3 (TSC021). 25
Las figuras 10A-10D muestran la proliferación de linfocitos T CD4+ y CD8+ en respuesta a los heterodímeros de polipéptidos biespecíficos TSC054, TSC078, TSC079 y bsc19x3 (TSC036) con (A y B) células Daudi (CD19+) o (C y D) células MDA-MB-453 (CD19-).
30
Las figuras 11A y 11B muestra la citotoxicidad dirigida a linfocitos T inducida por los heterodímeros de polipéptidos biespecíficos TSC054, TSC078, TSC079, y S0268 en un ensayo de liberación de cromo (51Cr) con (A) células Daudi (RON", CD19+) o (B) células BxPC-3 (RON+, CD19-).
La figura 12 muestra la proliferación de linfocitos T dependiente de la diana inducida por una línea celular CD19+ 35 (Daudi) usando los heterodímeros de polipéptidos biespecíficos TSC165, TSC166, TSC167, TSC168 y TSC100 a concentraciones desde 0,1 pM a 10.000 pM.
La figura 13 muestra la proliferación de linfocitos T dependiente de la diana inducida por una línea celular CD19+ (Daudi) usando los heterodímeros de polipéptidos biespecíficos TSC127 y TS 165 con bsc19x3 BiTE como control a 40 concentraciones desde 0,001 pM a 1.000 pM.
La figura 14 muestra la citotoxicidad de linfocitos T redirigida dependiente de la diana en una línea celular CD19+ (Daudi) usando los heterodímeros de polipéptidos biespecíficos TSC100, TSC165, TC166, TSC167 y TSC168.
45
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La presente descripción proporciona heterodímeros de polipéptidos formados entre dos polipéptidos de cadena única diferentes por medio de heterodimerización natural de una región CH1 de inmunoglobulinas y una región constante de cadena ligera de inmunoglobulinas (CL). El heterodímero de polipéptidos tiene dos o más dominios de 50 unión que se unen específicamente a una o más dianas (por ejemplo, un antígeno, un receptor o un ligando). Además, las dos cadenas de un heterodímero comprenden, cada una, una parte de región Fc (por ejemplo, dominios CH2 y/o CH3 de inmunoglobulinas). La presente descripción proporciona también ácidos nucleicos, vectores, células hospedadoras y procedimientos para preparar heterodímeros de polipéptidos.
55
La tecnología de heterodimerización descrita en la presente memoria descriptiva presenta una o más de las ventajas siguientes: (1) potencial de inmunogenicidad mínima de los heterodímeros de polipéptidos debido a que los dímeros se forman por medio de heterodimerización natural de una región CH1 de inmunoglobulinas y una región CL de inmunoglobulinas; (2) la producción y purificación eficientes de heterodímeros de polipéptidos de la presente descripción es posible mediante la coexpresión de los dos polipéptidos de cadena única diferentes, tal como se muestra en los ejemplos; (3) la capacidad de mediar en las funciones de efector Fc (por ejemplo, CDC, ADCC, ADCP), que pueden modularse en sentido ascendente o descendente por mutagenia, y una semivida más larga en suero debido a que cada cadena de un heterodímero de polipéptidos de acuerdo con la presente descripción tiene una parte de región Fc (por ejemplo, dominios CH2 y CH3 de inmunoglobulinas); y (4) los heterodímeros de 5 polipéptidos de la presente descripción tienen un tamaño que es normalmente menor que una molécula de anticuerpos, que pueden permitir una mejor penetración en los tejidos, por ejemplo en una malignidad sólida.
Los heterodímeros de polipéptidos proporcionados en la presente memoria descriptiva son útiles para dirigir agentes terapéuticos o células efectoras inmunitarias a células diana. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los 10 heterodímeros de polipéptidos pueden comprender un dominio de unión que se une específicamente a un complejo TCR o un componente de los mismos (por ejemplo, TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ y CD3ε) y otro dominio de unión que se une específicamente a una segunda diana diferente, tal como una diana de oncología (por ejemplo, c-Met, RON, CEACAM-6 y PSMA) o una diana de linfocitos T (por ejemplo, CD19, CD79b, HLA-DR y CD20). El dominio de unión específico para la segunda diana diferente puede tener una afinidad superior para su diana que la afinidad del 15 dominio de unión para el complejo TCR o el componente del mismo, tal como CD3. Dichos heterodímeros de polipéptidos se unirán primero preferentemente a la diana de oncología o la diana de linfocitos T y posteriormente reclutan linfocitos T para las células tumorales o cancerosas que expresa la diana de oncología o diana de linfocitos B y son útiles para inhibir el crecimiento, metástasis o crecimiento metastásico de una malignidad (incluyendo cánceres de linfocitos B). Los usos adicionales de heterodímeros de polipéptidos proporcionados en la presente 20 memoria descriptiva incluyen la activación dirigida de linfocitos T y el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias o inflamatorias.
Los encabezamientos de sección usados en la presente memoria descriptiva tienen sólo fines organizativos y no deben entenderse como limitativos del objeto descrito. Todos los documentos, o partes de documentos, citados en la 25 presente memoria descriptiva, que incluyen pero no se limitan a patentes, solicitudes de patente, artículos, libros y tratados, se incorporan como referencia en su totalidad en el presente documento para cualquier finalidad. En el caso en que uno o más de los documentos o partes de documentos incorporados definan un término que esté en contradicción con la definición de términos de la solicitud, prevalecerá la definición que aparece en la presente solicitud. 30
En la presente descripción, debe entenderse que cualquier intervalo de concentraciones, intervalo porcentual, intervalo de proporciones o intervalo de números enteros incluye el valor de cualquier número entero comprendido dentro del intervalo indicado y, cuando resulte apropiado, las fracciones de los mismos (tales como la décima parte o la centésima parte de un número entero), salvo que se indique lo contrario. Tal como se usa en la presente memoria 35 descriptiva, "aproximadamente" significa ± 20% del intervalo, valor, secuencia o estructura indicados, salvo que se indique lo contrario. Debe entenderse que los términos "un" y "una" tal como se usa en la presente memoria descriptiva se refieren a "uno o más" de los componentes enumerados salvo que se indique o por el contexto se deduzca lo contrario. Debe entenderse que el uso de la disyuntiva (por ejemplo, "o") significa uno, las dos o cualquier combinación de las alternativas. Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, los términos "incluir" 40 y "comprender" se usan como sinónimos. Además, debe entenderse que los polipéptidos de cadena única o heterodímeros individuales obtenidos de diversas combinaciones de las estructuras y sustituyentes (por ejemplo, dominios, regiones, bisagras y conectores) descritos en la presente memoria descriptiva se divulgan mediante la presente solicitud en la misma medida como si se indicara de forma individual cada polipéptido de cadena única o heterodímero. Así, la selección de componentes particulares para formar polipéptidos de cadena única o 45 heterodímeros individuales se encuentra dentro del ámbito de la presente descripción.
Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, una proteína "consiste esencialmente en” varios dominios (por ejemplo, un dominio de unión que se une específicamente a una diana, una bisagra, un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas, y una parte de región Fc) si las otras partes de la proteína (por ejemplo, 50 aminoácidos en el extremo amino o carboxilo o entre dos dominios), en combinación, contribuyen como máximo en un 20% (por ejemplo, como máximo el 15%, el 10%, el 8%, el 6%, el 5%, el 4%, el 3%, el 2% o el 1%) de la longitud de la proteína y no afectan sustancialmente (es decir, no reducen la actividad en más del 50%, por ejemplo más del 40%, el 30%, el 25%, el 20%, el 15%, el 10% o el 5%) de las actividades de varios dominios (por ejemplo, la afinidad de unión a la diana del dominio de unión, las actividades de la parte de región Fc, y la capacidad del dominio de 55 heterodimerización de inmunoglobulinas para facilitar la heterodimerización). En algunas realizaciones, una proteína (por ejemplo, un polipéptido de cadena única) consiste esencialmente en un dominio de unión que se une específicamente a una diana, un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas, una bisagra y una parte de región Fc puede comprender aminoácidos de unión en el extremo amino y/o carboxilo de la proteína y/o entre dos dominios diferentes (por ejemplo, entre el dominio de unión y el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas, entre el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas y la bisagra, y/o entre la bisagra y la parte de región Fc).
Un "heterodímero de polipéptidos" o "heterodímero”, tal como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a un dímero formado a partir de dos polipéptidos de cadena única diferentes. Este término no incluye un anticuerpo 5 formado a partir de cuatro polipéptidos de cadena única (es decir, dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas). Un "dímero" se refiere a una entidad biológica que consiste en dos subunidades asociadas entre sí por medio de una o más formas de fuerzas intramoleculares, lo que incluye enlaces covalentes (por ejemplo, enlaces de disulfuro) y otras interacciones (por ejemplo, interacciones electrostáticas, puentes salinos, enlaces de hidrógeno e interacciones hidrófobas), y es estable en las condiciones apropiadas (por ejemplo, en condiciones fisiológicas, en una solución 10 acuosa adecuada para expresar, purificar y/o almacenar proteínas recombinantes, o en condiciones para electroforesis no reductora sin desnaturalización).
Un "polipéptido de cadena única" es una disposición única, lineal y contigua de aminoácidos ligados por enlaces covalentes. No incluye dos cadenas de polipéptidos que se unen conjuntamente de una forma no lineal, por ejemplo, 15 por medio de un enlace intercadena de disulfuro (por ejemplo, media molécula de inmunoglobulina en la que una cadena ligera se une a una cadena pesada por medio de un enlace de disulfuro). En algunas realizaciones, un polipéptido de cadena única puede tener o formar uno o más enlaces de disulfuro intracadena.
Un "dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas”, tal como se usa en la presente memoria descriptiva, se 20 refiere a un dominio de inmunoglobulinas de un polipéptido de cadena única que interacciona o se asocia preferentemente con un dominio de inmunoglobulinas diferente de otro polipéptido de cadena única donde la interacción de los diferentes dominios de heterodimerización contribuye sustancialmente o promueve de manera eficiente la heterodimerización de los polipéptidos de cadena única primero y segundo (es decir, la formación de un dímero entre dos polipéptidos de cadena única diferentes, que se refiere también como "heterodímero"). La o las 25 interacciones entre dominios de heterodimerización "contribuyen sustancialmente a o promueven de manera eficiente" la heterodimerización de polipéptidos de cadena única primero y segundo si existe una reducción estadísticamente significativa en la dimerización entre los polipéptidos de cadena única primero y segundo en ausencia del dominio de heterodimerización del primer polipéptido de cadena única (HD-I) y/o el dominio de heterodimerización del segundo polipéptido de cadena única (HD-II). En algunas realizaciones, cuando los 30 polipéptidos de cadena única primero y segundo están coexpresados, al menos el 60%, de al menos aproximadamente el 60% a aproximadamente el 70%, de al menos aproximadamente el 70% a aproximadamente el 80%, de al menos aproximadamente el 80% a aproximadamente el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o el 100%, y al menos aproximadamente el 90% a aproximadamente el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% de los polipéptidos de cadena única primero y segundo forman 35 heterodímeros entre sí. Los dominios de heterodimerización de inmunoglobulinas representativos de la presente descripción incluyen una región CH1 de inmunoglobulinas, una región CL de inmunoglobulinas (por ejemplo, isotipos Cκ o Cλ), o derivados de los mismos, que incluyen regiones CH1 y CL de inmunoglobulinas naturales y regiones CH1 y CL de inmunoglobulinas alteradas (o mutadas), tal como se proporcionan en la presente memoria descriptiva.
40
Un "dominio de unión" o "región de unión”, tal como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a una proteína, polipéptido, oligopéptido o péptido que posee la capacidad de reconocer específicamente y unirse a una diana (por ejemplo, CD3, TCR, CD28, c-Met, RON). Un dominio de unión incluye cualquier compañero de unión de ocurrencia natural, sintético, semisintético o producido de forma recombinante para una molécula biológica u otra diana de interés. Los dominios de unión de ejemplo incluyen regiones variables de anticuerpos de cadena única (por 45 ejemplo, anticuerpos de dominio, sFv, scFv, Fab), ectodominios de receptor (por ejemplo, c-Met, RON) o ligandos (por ejemplo, citocinas, quimiocinas). Se conocen diversos ensayos para identificar dominios de unión de la presente descripción que se unen específicamente a una diana en particular, lo que incluye Western blot, ELISA y análisis Biacore.
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Un dominio de unión y una proteína de fusión de los mismos "se unen específicamente a" una diana si se unen a la diana con una afinidad o Ka (es decir, una constante de asociación en equilibrio de una interacción de unión en particular con unidades de 1/M) igual o mayor que 105 M-1, mientras que no se une de forma significativa a otros componentes presentes en una muestra de prueba. Los dominios de unión (o proteínas de fusión de los mismos) pueden clasificarse como dominios de unión (o proteínas de fusión de los mismos) de “alta afinidad” y dominios de 55 unión (o proteínas de fusión de los mismos) de “baja afinidad”. Los dominios de unión de "alta afinidad" se refieren a aquellos dominios de unión con una Ka de al menos 107 M-1, al menos 108 M-1, al menos 109 M-1, al menos 1010 M-1, al menos 1011 M-1, al menos 1012 M-1 o al menos 1013 M-1. Los dominios de unión de "baja afinidad" se refieren a aquellos dominios de unión con una Ka de hasta 107 M-1, hasta 106 M-1, hasta 105 M-1. Alternativamente, la afinidad puede definirse como una constante de disociación de equilibrio (Kpuede definirse como una constante de disociación de equilibrio (Kpuede definirse como una constante de disociación de equilibrio (Kpuede definirse como una constante de disociación de equilibrio (Kpuede definirse como una constante de disociación de equilibrio (Kpuede definirse como una constante de disociación de equilibrio (Kpuede definirse como una constante de disociación de equilibrio (K
Un "receptor de linfocitos T" (TCR) es una molécula unida a la superficie de linfocitos T que, junto con CD3, es responsable generalmente del reconocimiento de antígenos unidos a moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). Consiste en un heterodímero unido a disulfuro de las cadenas α y β altamente variables en la mayor parte de los linfocitos T. En otros linfocitos T, se expresa un receptor alternativo constituido por cadenas 10 γ y δ variables. Cada cadena del TCR es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas y posee un dominio variable de inmunoglobulinas en el extremo T, un dominio constante de inmunoglobulinas, una región de transmembrana y una corta cola citoplásmica en el extremo C (véase, Abbas y Lichtman, Cellular and Molecular Immunology (5ª ed.), Editor: Saunders, Philadelphia, 2003; Janeway y col., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4ª Ed., Current Biology Publications, pág. 148, 149 y 172, 1999). TCR tal como se usa en la 15 presente descripción puede proceder de diversas especies animales, entre ellas el ser humano, el ratón, la rata u otros mamíferos.
"CD3" es conocido en la técnica como un complejo de multiproteínas de seis cadenas (véase Abbas y Lichtman, 2003; Janeway y col., pág. 172 y 178, 1999). En los mamíferos, el complejo comprende una cadena CD3γ, una 20 cadena CD3δ, dos cadenas CD3ε y un homodímero de cadenas CD3ζ. Las cadenas CD3γ, CD3δ y CD3ε están muy relacionadas con las proteínas de la superficie celular de la superfamilia de inmunoglobulinas que contienen un único dominio de inmunoglobulinas. Las regiones de transmembrana de las cadenas CD3γ, CD3δ y CD3ε están cargadas negativamente, que es una característica que permite que estas cadenas se asocien con las cadenas de receptores de linfocitos T con carga positiva. Las colas intracelulares de las cadenas CD3γ, CD3δ y CD3ε contienen cada una 25 un único motivo conservado conocido como motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptor o ITAM, mientras que cada cadena CD3ζ tiene tres. Según se cree, los ITAM son importantes para la capacidad de señalización de un complejo TCR. CD3 tal como se usa en la presente descripción puede proceder de diversas especies animales, entre ellas el ser humano, el ratón, la rata u otros mamíferos.
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"Complejo TCR”, tal como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a un complejo formado por la asociación de CD3 con TCR. Por ejemplo, un complejo TCR puede estar compuesto por una cadena CD3γ, una cadena CD3δ, dos cadenas CD3ε, un homodímero de cadenas CD3ζ, una cadena TCRα y una cadena TCRβ. Alternativamente, un complejo TCR puede estar compuesto por una cadena CD3γ, una cadena CD3δ, dos cadenas CD3ε, un homodímero de cadenas CD3ζ, una cadena TCRγ y una cadena TCRδ. 35
"Un componente de un complejo TCR”, tal como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a una cadena TCR (es decir, TCRα, TCRβ, TCRγo TCRδ), una cadena CD3 (es decir, CD3γ, CD3δ, CD3ε o CD3ζ) o un complejo formado por dos o más cadenas TCR o cadenas CD3 (por ejemplo, un complejo de TCRα y TCRβ, un complejo de TCRγ y TCRδ, un complejo de CD3ε y CD3δ, un complejo de CD3γ y CD3ε, o un subcomplejo TCR de TCRα, 40 TCRβ, CD3γ, CD3δ y dos cadenas CD3ε).
Los términos conocidos por los expertos en la materia de la tecnología de anticuerpos tienen el significado adquirido en la técnica, salvo que en la presente memoria descriptiva se exprese de forma totalmente diferente. Se sabe que los anticuerpos tienen regiones variables, una región bisagra y dominios constantes. La estructura y la función de las 45 inmunoglobulinas se revisan, por ejemplo, en Harlow y col, Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, capítulo 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988).
Por ejemplo, los términos " VL" y " VH" se refieren a la región de unión variable a partir de una cadena ligera y una cadena pesada de anticuerpos, respectivamente. Las regiones de unión variables están formadas por subregiones 50 discretas bien definidas conocidas como "regiones de determinación de complementariedad" (CDR) y "regiones de marco de lectura" (FR). El término "CL" se refiere a una "región constante de cadena ligera de inmunoglobulinas" o una "región constante de cadena ligera”, es decir, una región constante de una cadena ligera de anticuerpos. El término "CH" se refiere a una "región constante de cadena pesada de inmunoglobulinas" o una "región constante de cadena pesada”, que puede dividirse además, dependiendo del isotipo de anticuerpos en dominios CH1, CH2 y CH3 55 (IgA, IgD, IgG) o dominios CH1, CH2, CH3 y CH4 (IgE, IgM). Un "Fab" (fragmento de unión al antígeno) es la parte de un anticuerpo que se une a antígenos e incluye la región variable y CH1 de la cadena pesada unida a la cadena ligera por medio de un enlace de disulfuro intercadena.
Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, "una parte del dominio constante de la región Fc" o "parte de la región Fc" se refiere al segmento de la región constante de cadena pesada del fragmento Fc (la región de "fragmento cristalizable" o región Fc) de un anticuerpo, que puede incluir uno o más dominios constantes, tales como CH2, CH3, CH4 o cualquier combinación de los mismos. A modo de antecedentes, la región Fc es responsable de las funciones de efector de una inmunoglobulina, tales como ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente 5 de anticuerpos), ADCP (fagocitosis celular dependiente de anticuerpos), CDC (citotoxicidad dependiente del complemento) y fijación del complemento, unión a receptores Fc (por ejemplo, CD16, CD32, FcRn), mayor semivida in vivo con respecto a un polipéptido que carece de una región Fc, unión a proteína A y tal vez incluso transferencia placentaria (véase Capon y col., Nature, 337: 525 (1989)).
10
Además, los anticuerpos tienen una secuencia bisagra que está situada normalmente entre la región Fab y Fc (aunque una sección inferior de la bisagra puede incluir una parte en el extremo amino de la región Fc). Como base, una bisagra de inmunoglobulinas actúa como un separador flexible para permitir que la parte Fab se mueva libremente en el espacio. A diferencia de las regiones constantes, las bisagras son estructuralmente diversas, variando en secuencia y en longitud entre clases de inmunoglobulinas e incluso entre subclases. Por ejemplo, una 15 bisagra de región IgG1 humana es libremente flexible, y permite los fragmentos Fab giren aproximadamente sus ejes de simetría y se muevan dentro de una esfera centrada en el primero de dos puentes de disulfuro de intercadena pesada. Como comparación, una bisagra IgG2 humana es relativamente corta y contiene una doble hélice rígida de poli-prolina estabilizada por cuatro puentes de disulfuro de intercadena pesada, lo que limita la flexibilidad. Una bisagra IgG3 humana difiere de las otras subclases por su singular región bisagra extendida (aproximadamente 20 cuatro veces la longitud de la bisagra IgG1), conteniendo 62 aminoácidos (lo que incluye 21 prolinas y 11 cisteínas), que forman una doble hélice de poli-prolina inflexible y proporcionan mayor flexibilidad dado que los fragmentos Fab están relativamente mucho más lejos del fragmento Fc. Una bisagra IgG4 humana es más corta que la IgG1 pero tiene la misma longitud que IgG2, y su flexibilidad es intermedia entre las de IgG1 e IgG2.
25
De acuerdo con estudios cristalográficos, un dominio de bisagras IgG puede subdividirse funcional y estructuralmente en tres regiones: regiones bisagra superior, central o media e inferior (Shin y col., Immunological Reviews 130: 87 (1992)). Las regiones bisagra superiores de ejemplo incluyen EPKSCDKTHT (SEQ ID NO: 227) tal como se encuentra en IgG1, ERCCVE (SEQ ID NO: 211) tal como se encuentra en IgG2, ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO: 245) o EPKSCDTPPP (SEQ ID NO: 246) tal como se encuentra en IgG3, y ESKYGPP (SEQ ID NO: 247) tal 30 como se encuentra en IgG4. Las regiones bisagra centrales o medias de ejemplo incluyen CPPCP (SEQ ID NO: 228) tal como se encuentra en IgG1 e IgG2, CPRCP (SEQ ID NO: 248) tal como se encuentra en IgG3, y CPSCP (SEQ ID NO: 249) tal como se encuentra en IgG4. Mientras los anticuerpos IgG1, IgG2 e IgG4 parecen tener una única bisagra superior y media, IgG3 tiene cuatro en tándem, de las que una es ELKTPLGDTTHTCPRCP (SEQ ID NO: 250) y tres son EPKSCDTPPPCPRCP (SEQ ID NO: 251). 35
Los anticuerpos IgA e IgD parecen carecer de región central de tipo IgG, e IgD parece tener dos regiones bisagra superiores en tándem (véase SEQ ID NO: 222 y 252). Las regiones bisagra superiores naturales de ejemplo presentes en los anticuerpos IgA1 e IgA2 son establecen en SEQ ID NO: 215 y 216.
40
En cambio, los anticuerpos IgE e IgM carecen de una región bisagra típica y en su lugar tienen un dominio CH2 con propiedades de tipo bisagra. Las secuencias de tipo bisagra superior CH2 natural de ejemplo de IgE e IgM se determinan en SEQ ID NO: 253 (VCSRDFTPPTVKILQSSSDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCA) y SEQ ID NO: 254 45 (VIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTI KESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVP), respectivamente.
Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, una "región bisagra" o una "bisagra" se refiere a (a) una región bisagra de inmunoglobulinas (formada, por ejemplo, por regiones superiores y centrales) o una variante funcional de 50 las mismas, que incluye bisagras de inmunoglobulinas naturales y alteradas (b) una región de interdominio de lectina o una variante funcional de la misma, (c) un grupo de región del tallo de molécula de diferenciación (CD) o una variante funcional de la misma, o (d) una parte de un receptor de superficie celular (región de interdominio) que conecta dominios de tipo inmunoglobulinas V o de tipo inmunoglobulinas C.
55
Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, una "región bisagra de inmunoglobulinas natural" se refiere a secuencias de aminoácidos de regiones bisagra superior y media de ocurrencia natural interpuestas entre y que conectan los dominios CH1 y CH2 (para IgG, IgA, e IgD) o interpuestas entre y que conectan los dominios CH1 y CH3 (para IgE e IgM) presentes en la cadena pesada de un anticuerpo. En algunas realizaciones, una secuencia de región bisagra de inmunoglobulinas natural es humana, y puede comprender una región bisagra de IgG humana. Las regiones bisagra de inmunoglobulinas naturales de ejemplo se determinan en SEQ ID NO: 215 (bisagra IgA1), 216 (bisagra IgA2), 217 (bisagra IgD), 667 (bisagra IgG1), 219 (bisagra IgG2), 220 (bisagra IgG3) y 221 (bisagra IgG4).
Una "región bisagra de inmunoglobulinas natural alterada" o "región bisagra de inmunoglobulinas alterada" se refiere 5 a (a) una región bisagra de inmunoglobulinas natural con hasta el 30% de cambios de aminoácidos (por ejemplo, hasta el 25%, el 20%, el 15%, el 10% o el 5% de sustituciones o deleciones de aminoácidos), o (b) una parte de una región bisagra de inmunoglobulinas natural que tiene una longitud de aproximadamente 5 aminoácidos (por ejemplo, aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 aminoácidos) hasta aproximadamente 120 aminoácidos (por ejemplo, que tiene una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 aminoácidos o de 10 aproximadamente 15 a aproximadamente 30 aminoácidos o de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 aminoácidos o de aproximadamente 20 a aproximadamente 25 aminoácidos), tiene hasta aproximadamente el 30% de cambios de aminoácidos (por ejemplo, hasta aproximadamente el 25%, el 20%, el 15%, el 10%, el 5%, el 4%, el 3%, el 2% o el 1% de sustituciones o deleciones de aminoácidos o una combinación de los mismos), y tiene una región bisagra central de IgG tal como se determina en SEQ ID NO: 228, 248 ó 249. 15
Un "conector peptídico" se refiere a una secuencia de aminoácidos que conecta una región variable de cadena pesada con una región variable de cadena ligera y proporciona una función separadora compatible con la interacción de los dos subdominios de unión de manera que el polipéptido resultante conserve una afinidad de unión específica a la misma molécula diana como un anticuerpo que comprende las mismas regiones de cadena ligera y pesada. En 20 algunas realizaciones, un conector está formado por de cinco a aproximadamente 35 aminoácidos, por ejemplo, de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 aminoácidos.
"Aminoácidos de unión" o "restos de aminoácidos de unión" se refieren a uno o más (por ejemplo, aproximadamente 2-10) restos de aminoácidos entre dos regiones adyacentes o dominios de un polipéptido de cadena única, tal como 25 entre una bisagra y una parte adyacente de la región Fc o entre una bisagra y un dominio de unión adyacente o entre un conector peptídico que conecta dos dominios variables de inmunoglobulinas y un dominio variable de inmunoglobulinas adyacente. Los aminoácidos de unión pueden proceder del diseño de construcción de un polipéptido de cadena única (por ejemplo, restos de aminoácidos procedentes del el uso de un sitio de enzimas de restricción durante la construcción de una molécula de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de cadena 30 única).
Un "conector entre CH3 y CH1 o CL" se refiere a uno o más (por ejemplo, aproximadamente 2-12) restos de aminoácidos entre el extremo C de un dominio CH3 (por ejemplo, un CH3 natural o un CH3 mutado) y el extremo N de un dominio CH1 o un dominio CL (por ejemplo, Cκ). 35
Una "región de inmunoglobulinas natural" o "dominio de inmunoglobulinas natural" se refiere a una región o dominio de inmunoglobulina de ocurrencia natural (por ejemplo, VL, VH, bisagra, CL, CH1, CH2, CH3 o CH4 de ocurrencia natural) de diversas clases o subclases de inmunoglobulinas (incluyendo, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE e IgM) y de diversas especies (incluyendo, por ejemplo, ser humano, oveja, ratón, rata y otros 40 mamíferos). Las regiones CH1 humanas naturales se determinan en SEQ ID NO: 114, 186-192 y 194, la región Cκ humana natural en SEQ ID NO: 112, las regiones Cλhumanas naturales en SEQ ID NO: 113 y 224-226, los dominios CH2 humanos naturales en SEQ ID NO: 115, 195-201 y 203, los dominios CH3 humanos naturales en SEQ ID NO: 116, 204-210 y 212, y los dominios CH4 humanos naturales en SEQ ID NO: 213 y 214.
45
Una "región de inmunoglobulinas alterada”, "dominio de inmunoglobulinas alterado”, "dominio de inmunoglobulinas mutado”, o similares, se refiere a una región de inmunoglobulinas con una identidad de secuencias con una región o dominio de inmunoglobulinas natural (por ejemplo, VL, VH, bisagra, CL, CH1, CH2, CH3 o CH4 natural) de al menos el 75% (por ejemplo, el 80%, el 82%, el 84%, el 86%, el 88%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o el 99,5%). Por ejemplo, una "región CH1 de inmunoglobulinas alterada" o 50 "región CH1 alterada" se refiere a una región CH1 con una identidad de secuencias con una región CH1 de inmunoglobulinas natural (por ejemplo, CH1 humana) de al menos el 75% (por ejemplo, el 80%, el 82%, el 84%, el 86%, el 88%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o el 99,5%). De forma similar, un "dominio CH2 de inmunoglobulinas alterado" o "dominio CH2 alterado" se refiere a un dominio CH2 con una identidad de secuencias con una región CH2 de inmunoglobulinas natural (por ejemplo, CH2 humano) de al 55 menos el 75% (por ejemplo, el 80%, el 82%, el 84%, el 86%, el 88%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o el 99,5%).
"Identidad de secuencias”, tal como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere al porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia que son idénticos a los restos de aminoácidos en otra secuencia de polipéptidos de referencia después de alinear las secuencias y de introducir huecos, si fuera necesario, para conseguir el porcentaje máximo de identidad de secuencias, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencias. Los valores porcentuales de identidad de secuencias son generados por el software NCBI BLAST2.0 tal como se define en Altschul y col. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database 5 search programs”, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, con los parámetros fijados a valores por omisión.
En algunas realizaciones, un dominio de inmunoglobulinas alterado contiene sólo sustituciones conservadoras de aminoácidos de un dominio de inmunoglobulinas natural. En algunas otras realizaciones, un dominio de inmunoglobulinas alterado contiene sólo sustituciones no conservadoras de aminoácidos de un dominio de 10 inmunoglobulinas natural. En otras realizaciones más, un dominio de inmunoglobulinas alterado contiene sustituciones conservadoras y no conservadoras de aminoácidos.
Una "sustitución conservadora" se reconoce en la técnica como una sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades similares. Las sustituciones conservadoras de ejemplo son bien conocidas en la 15 técnica (véase, por ejemplo, el documento WO-97/09.433, página 10, publicado el 13 de marzo de 1997; Lehninger, Biochemistry, Segunda edición; Worth Publishers, Inc. NY: NY (1975), pág. 71-77; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY y Cell Press, Cambridge, MA (1990), pág. 8). En algunas realizaciones, una sustitución conservadora incluye una sustitución de leucina por serina.
20
Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, el término "derivado" se refiere a la modificación de uno o más restos de aminoácidos de un péptido por medios químicos o biológicos, con o sin una enzima, por ejemplo, por glucosilación, alquilación, acilación, formación de ésteres o formación de amidas. En general, un "derivado" difiere de un "análogo" en que un polipéptido de origen puede ser el material de partida para generar un "derivado”, mientras que el polipéptido de origen puede no usarse necesariamente como material de partida para generar un 25 "análogo”. Un derivado puede tener diferentes propiedades químicas, biológicas o físicas del polipéptido de origen. Por ejemplo, un derivado puede ser más hidrófilo o puede tener una reactividad alterada (por ejemplo, un CDR que tiene un cambio de aminoácidos que altera su afinidad por una diana) en comparación con el polipéptido de origen.
Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, salvo que se indique de otra forma, una posición de un resto de 30 aminoácidos en una región variable de una molécula de inmunoglobulinas se numera de acuerdo con la convención de numeración de Kabat (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed. Bethesda, MD: Public Health Service, National Institutes of Health (1991)), y una posición de un resto de aminoácidos en una región constante de una molécula de inmunoglobulinas se numera de acuerdo con la nomenclatura EU (Ward y col., 1995 Therap. Immunol. 2: 77-94). 35
Un "receptor" es una molécula de proteínas presente en la membrana plasmática o en el citoplasma de una célula a la que puede unirse una molécula de señal (es decir, un ligando, por ejemplo, una hormona, un neurotransmisor, una toxina, una citocina). La unión de la molécula de señal al receptor provoca un cambio conformacional del receptor, que comúnmente inicia una respuesta celular. Sin embargo, algunos ligandos simplemente bloquean los receptores 40 sin inducir ninguna respuesta (por ejemplo, antagonistas). Algunas proteínas receptoras son proteínas de membranas periféricas. Muchos receptores de hormonas y neurotransmisores son proteínas de transmembrana que están integradas en la bicapa de fosfolípidos de las membranas celulares, y otra clase principal de receptores son las proteínas intracelulares tales como las de receptores de hormonas peptídicas esteroideas e intracrinas.
45
"Trastorno o enfermedad asociado a linfocitos B" o " enfermedad o trastorno asociado con actividad aberrante de linfocitos B" se refiere a una enfermedad o trastorno asociado con (por ejemplo, que provoca o se deriva de) la actividad aberrante de linfocitos B o una actividad que se desvía del curso normal, apropiado o esperado. Por ejemplo, un trastorno o enfermedad asociado a linfocitos B puede incluir una proliferación inapropiada de linfocitos B que presentan ADN dañado o defectuoso u otros componentes celulares. La actividad aberrante de linfocitos B 50 puede incluir proliferación celular caracterizada por niveles inapropiadamente altos de división de linfocitos B, niveles inapropiadamente bajos de apoptosis de linfocitos B, o ambos. Estas enfermedades pueden tener, por ejemplo, proliferaciones anómalas locales únicas o múltiples de linfocitos B, grupos de linfocitos B o tejidos, ya sean cancerosos o no cancerosos, benignos o malignos. Un trastorno o enfermedad asociado a linfocitos B puede incluir también producción de anticuerpos aberrantes, tal como producción de autoanticuerpos, o sobreproducción de 55 anticuerpos más deseable cuando se producen en niveles normales. En la presente memoria descriptiva se contempla también que la actividad aberrante de linfocitos B puede tener lugar en determinadas subpoblaciones de linfocitos B y no en otras subpoblaciones, o puede incluir estimulación inapropiada de linfocitos T, tal como por presentación de antígenos inapropiada ante linfocitos T o por otras vías de linfocitos B. Los ejemplos de trastornos o enfermedades asociados con los linfocitos B incluyen una malignidad por linfocitos B o cáncer por linfocitos B (por ejemplo, linfoma de linfocitos B, leucemia de linfocitos B o mieloma de linfocitos B), una enfermedad caracterizada por la autoproducción de anticuerpos (por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias) o inflamación o una enfermedad caracterizada por estimulación inapropiada de linfocitos T causada por presentación de antígenos inapropiada de linfocitos B ante linfocitos T o causada por otras vías que implican a los linfocitos B. 5
"Tratamiento”, "tratar" o "mejorar" se refiere a un tratamiento terapéutico o un tratamiento profiláctico/preventivo. Un tratamiento es terapéutico si mejora al menos un síntoma de la enfermedad en una persona que recibe el tratamiento o si un tratamiento puede retrasar el empeoramiento de una enfermedad progresiva en una persona, o prevenir la instauración de enfermedades asociadas adicionales. 10
Una "cantidad (o dosis) terapéuticamente efectiva" o "cantidad (o dosis) efectiva" de una molécula o compuesto de unión específico se refiere a aquella cantidad del compuesto suficiente para producir una mejoría de uno o más síntomas de la enfermedad sometida a tratamiento de una forma estadísticamente significativa. Cuando se refiere a un ingrediente activo individual, administrado en solitario, una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a ese 15 ingrediente en solitario. Cuando se refiere a una combinación, una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a cantidades combinadas de los ingredientes activos que producen el efecto terapéutico, ya se administren en serie o de forma simultánea (en la misma formulación o de forma concurrente en formulaciones separadas).
El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades y composiciones moleculares que no producen 20 reacciones alérgicas u otras reacciones adversas importantes cuando se administran a través de vías bien conocidas en la técnica.
Un "paciente necesitado" se refiere a un paciente en riesgo de, o que sufre, una enfermedad, trastorno o dolencia a la que puede aplicarse un tratamiento o una mejoría con un heterodímero de polipéptidos o una composición de los 25 mismos proporcionados en la presente memoria descriptiva.
El término "proteína de fusión derivada de inmunoglobulinas”, tal como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a una proteína de fusión que comprende al menos una región de inmunoglobulinas, tal como un dominio VL, VH, CL, CH1, CH2, CH3 y CH4. La región de inmunoglobulinas puede ser una región de inmunoglobulinas 30 natural o una región de inmunoglobulinas alterada. Las proteínas de fusión de ejemplo derivadas de inmunoglobulinas incluyen fragmento de anticuerpos de cadena única variable (scFv) (véase, por ejemplo, Huston y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83, 1988), proteínas SMIP™ (véase publicaciones de patente de EE.UU. nº 2003/0.133.939, 2003/0.118.592 y 2005/0.136.049), proteínas PIMS (véase solicitud PCT publicación nº WO-2009/023.386), y proteínas de unión multifuncional (tales como proteínas SCORPION™ y Xceptor) (véase solicitud 35 PCT publicación nº WO-2007/146.968, solicitud de patente de EE.UU. publicación nº 2006/0.051.844 y patente de EE.UU. nº 7.166.707).
A lo largo de la presente descripción se proporcionan definiciones adicionales.
40
Heterodímeros de polipéptidos
En un aspecto, la presente descripción proporciona un heterodímero de polipéptidos formado por la asociación de dos polipéptidos de cadena única diferentes. El primer polipéptido de cadena única (SCP-I) comprende, consiste esencialmente en o consiste en de uno a cuatro dominios de unión que se unen específicamente a entre una y 45 cuatro dianas, una bisagra (H-I), un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas (HD-I) y una parte de región Fc (FRP-I), mientras que el segundo polipéptido de cadena única (SCP-II) comprende, consiste esencialmente en o consiste en de cero a cuatro dominios de unión que se unen específicamente a entre cero y cuatro dianas, una bisagra (H-II), un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas (HD-II) y una parte de región Fc (FRP-II), siempre que el heterodímero de polipéptidos comprenda al menos dos dominios de unión que se unen 50 específicamente a una o más dianas, por ejemplo, al menos dos dianas diferentes. H-I y H-II pueden tener la misma secuencia, pero pueden ser diferentes. HD-I puede comprender una región CH1 de inmunoglobulinas, y HD-II puede comprender una región CL de inmunoglobulinas. Alternativamente, HD-I puede comprender una región CL de inmunoglobulinas y HD-II pueden comprender una región CH1 de inmunoglobulinas. FRP-I y FRP-II pueden tener la misma secuencia, pero pueden ser diferentes. Los componentes individuales de los heterodímeros de polipéptidos 55 de la presente descripción se describen en detalle en la presente memoria descriptiva.
Dominios de unión
Tal como se indica anteriormente, el heterodímero de polipéptidos de la presente descripción comprende dos polipéptidos de cadena única: Un polipéptido de cadena única comprende de uno a cuatro dominios de unión que se unen específicamente a entre una y cuatro dianas, y el otro polipéptido de cadena única del heterodímero de polipéptidos comprende de cero a cuatro dominios de unión que se unen a entre cero y cuatro dianas. El número total de dominios de unión del heterodímero de polipéptidos está comprendido entre aproximadamente dos y ocho, y 5 el número total de dianas diferentes a las que se unen los dominios de unión está comprendido entre aproximadamente uno y ocho, por ejemplo, de dos a ocho, de dos a cuatro, de dos a tres o dos dianas.
Si un polipéptido de cadena única de un heterodímero de polipéptidos comprende un único dominio de unión, el dominio de unión puede estar situado en el extremo amino o carboxilo en la parte de región Fc del polipéptido de 10 cadena única. Por ejemplo, un polipéptido de cadena única que comprende dos dominios de unión puede tener un dominio de unión situado en el extremo amino y el otro en el extremo carboxilo en la parte de región Fc del polipéptido de cadena única, o los dos dominios de unión pueden estar en el extremo amino o en el extremo carboxilo en la parte de región Fc. En otro ejemplo, un polipéptido de cadena única puede comprender tres dominios de unión donde (a) dos dominios de unión están en el extremo amino en diferentes proteínas de cadena única y el 15 tercer dominio de unión está en el extremo carboxilo en la parte de región Fc en SCP-I o en SCP-II, (b) dos dominios de unión están en el extremo carboxilo en diferentes proteínas de cadena única y el tercer dominio de unión está en el extremo amino en la parte de región Fc en SCP-I o en SCP-II. En un ejemplo adicional más, un heterodímero de polipéptidos puede comprender cuatro dominios de unión, donde dos dominios de unión están situados en el extremo amino en la parte de región Fc en diferentes cadenas y los otros dos dominios de unión están situados en el 20 extremo carboxilo en la parte de región Fc en diferentes cadenas. Alternativamente, en cualquiera de estas realizaciones, dos dominios de unión pueden estar unidos entre sí en tándem y situados en SCP-I o en SCP-II o en ambos, dependiendo del número de dominios de unión presente; se usa el apilamiento en tándem cuando en SCP-I y SCP-II están presentes de cinco a ocho dominios de unión combinados.
25
La unión de una diana por medio de un dominio de unión modula la interacción entre la diana (por ejemplo, un receptor o un ligando) y otra molécula. En algunas realizaciones, la unión de una diana (por ejemplo, un receptor) por medio de un dominio de unión estimula ciertas funciones de la diana (por ejemplo, transducción de señal) o acerca entre sí dianas diferentes para producir un efecto biológico (por ejemplo, dirección de linfocitos T a un tumor que a su vez activa los linfocitos T). En algunas otras realizaciones, la unión de una diana por medio de un dominio 30 de unión bloquea la interacción entre la diana y otra molécula y así interfiere, reduce o elimina ciertas funciones de la diana.
Una molécula diana, que está unida específicamente por un dominio de unión contenido en un heterodímero de polipéptidos de la presente descripción, puede encontrarse en o en asociación con una célula de interés ("célula 35 diana"). Entre las células diana de ejemplo se incluyen células cancerosas, células asociadas con una enfermedad o trastorno autoinmunitarios o con una enfermedad o trastorno inflamatorios, linfocitos B y linfocitos T. Una molécula diana no puede asociarse tampoco con una célula. Entre las moléculas diana de ejemplo no asociadas con una célula se incluyen proteínas solubles, proteínas secretadas, proteínas depositadas y proteínas (de matriz) estructurales extracelulares. 40
En algunas realizaciones, los dominios de unión de heterodímeros de polipéptidos de la presente descripción se unen específicamente a dianas seleccionadas de entre dianas de linfocitos T, antígenos tumorales, dianas de linfocitos B, citocinas o quimiocinas proinflamatorias, citocinas o factores de crecimiento pro-oncógenos, agentes angiógenos, receptores Fc, receptor de transferrina, receptor tirosina-cinasas (RTK), TNFSFR o cualquier 45 combinación de los mismos. Por ejemplo, los heterodímeros de polipéptidos de la presente descripción se unen específicamente a una diana de linfocitos T y una diana tumoral.
En algunas realizaciones, un dominio de unión de un heterodímero de polipéptidos de la presente descripción se une específicamente a una diana de linfocitos T, tal como un complejo TCR o un componente del mismo (por ejemplo, 50 TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ y CD3ε), CD28, PD-1, HVEM, BTLA, CD80, CD86, GITR y TGFBR1.
En algunas realizaciones, un dominio de unión de heterodímero de polipéptidos de la presente descripción se une específicamente a un complejo TCR o un componente del mismo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un dominio de unión se une específicamente a una cadena CD3 humana individual (por ejemplo, cadena CD3γ humana, cadena 55 CD3δ humana y cadena CD3ε humana) o una combinación de dos o más de las cadenas CD3 humanas individuales (por ejemplo, un complejo de CD3γ humana y CD3ε humana o un complejo de CD3δ humana y CD3ε humana). En algunas realizaciones, un dominio de unión se une específicamente a una cadena CD3ε humana. En algunas otras realizaciones, un dominio de unión se une específicamente a una o más de TCRα humana, TCRβ humana o un heterodímero formado a partir de TCRα humana y TCRβ humana. En algunas otras realizaciones, un dominio de unión de la presente descripción se une a un complejo formado a partir de una o más cadenas CD3 humanas con una o más cadenas TCR humanas, tal como un complejo formado a partir de una cadena CD3γ humana, una cadena CD3δ humana o una cadena CD3ε humana con una cadena TCRα humana o una cadena TCRβ humana. En cualquiera de estas realizaciones, un heterodímero de polipéptidos de la presente descripción puede unirse 5 también a una diana tumoral.
En algunas realizaciones, uno o más dominios de unión de un heterodímero de polipéptidos de la presente descripción se unen específicamente a una diana tumoral, lo que incluye RON, c-Met, CEACAM-6, PSMA, EpCAM, CEA, PCTA-1, STEAP-1, PSCA, ALCAM (CD166), EphA2, CD151, CA-125, MUC-1, MAGE-1, TROP2, IGF1R, 10 CD44v6, CD151, TGFBR2, GHRHR, GHR, IL-6R, gp130, TNFR2, OSMRβ, Patched-1, Frizzled, Robo1, ίΤβΤ, CD80, CD81, CD86, CCR5, HER-3, HER-4, EGFR, CEA, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5b, MUC7, βhCG, Lewis-Y, CD33, CD30, gangliósido GD3, 9-O-acetil-GD3, GM2, Globo H, fucosil GM1, Poli SA, GD2, carboanhidrasa IX (MN/CA IX) CD44v6, Sonic Hedgehog (Shh), Wue-1, antígeno de células plasmáticas, IgE (ligada a membrana), proteoglicano de sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP), CCR8, precursor de TNF-alfa, STEAP-2, 15 mesotelina, antígeno A33, antígeno de células madre de próstata (PSCA), Ly-6; desmogleína 4, neoepítopo de E-cadherina, receptor de acetilcolina fetal, CD25, marcador de CA19-9, marcador de CA-125 y receptor de sustancia inhibidora de Mueller (MIS) tipo II, sTn (antígeno Tn sialilado; TAG-72), FAP (antígeno de activación de fibroblastos), endosialina, EGFRvIII, LG, SAS, CD63, B7-H3 o cualquier combinación de los mismos.
20
En algunas realizaciones, uno o más dominios de unión de un heterodímero de polipéptidos de la presente descripción se unen específicamente a una diana de linfocitos B, tal como CD19, CD20, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD70, CD79b, HLA-DR o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, uno o más dominios de unión de un heterodímero de polipéptidos de la presente 25 descripción se unen específicamente a citocina o quimiocina proinflamatoria, tal como TNFα, IL-6, hiper-IL-6, IL-2, IL-1, IL-8, IP-10, IFNγ, IFNα, RANKL, FASL, TGFβ, IL7, IL10, IL17A/F, TWEAK, CSF2, IGF1, IGF2 o BLyS/APRIL o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, uno o más dominios de unión de un heterodímero de polipéptidos de la presente 30 descripción se unen específicamente a una citocina o un factor de crecimiento pro-oncógenos, tales como HGF, MSP, EGF (incluyendo epirregulina, herrregulina, β-regulina, neurregulina), HIF-1α, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD, TNFα, IL-6, hiper-IL-6, IL-8, Wnt, sHH, TGFβ, PDGF o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, uno o más dominios de unión de un heterodímero de polipéptidos de la presente 35 descripción se unen específicamente a un agente angiógeno, tal como PDGFR, VEGFR1-4, NRP 1, angiopoyetina 2, c-Met o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, uno o más dominios de unión de un heterodímero de polipéptidos de la presente descripción se unen específicamente a un receptor Fc, tal como CD64, CD32A, CD32B, CD16, FcRn o cualquier 40 combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, un dominio de unión de un heterodímero de polipéptidos de la presente descripción se une específicamente a un receptor de transferrina, tal como CD71.
45
En algunas realizaciones, uno o más dominios de unión de un heterodímero de polipéptidos de la presente descripción se une específicamente a un receptor tirosina-cinasa, tal como EGFR, EGFRvIII, ErbB2, ErbB3, ErbB4, IGF1R, EphA2, c-Met, RON o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, uno o más dominios de unión de un heterodímero de polipéptidos de la presente 50 descripción se une específicamente a TNFSFR, tal como TNFR1, TNFR2, TWEAKR, TACI, BAFF-R, BCMA, FAS, OX40, GITR, 4-1-BB, LTbetaR, HVEM, RANK o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, uno o más dominios de unión de un heterodímero de polipéptidos de la presente descripción se unen específicamente a hiper-IL-6, IL-10, LIGHT, CD40, PDL1, PDL2 o cualquier combinación de los 55 mismos.
En algunas realizaciones, uno o más dominios de unión de un heterodímero de polipéptidos de la presente descripción son un agonista de una de las siguientes moléculas: IL-10, HLA-G, HGF, IL-35, PD-1, BTLA, TNFR1, TNFR2, DR4, DR5, TWEAKR, FAS o cualquier combinación de los mismos.
Un dominio de unión puede ser cualquier péptido que se une específicamente a una diana de interés. Entre las fuentes de dominios de unión se incluyen regiones variables de anticuerpos de diversas especies (que pueden formatearse como anticuerpos, sFv, scFv, Fab, o dominio VH soluble o anticuerpos de dominio), que incluyen al ser 5 humano, roedores, aves y ovinos. Entre las fuentes adicionales de dominios de unión se incluyen regiones variables de anticuerpos de otras especies, tales como camélidos (de camellos, dromedarios o llamas; Ghahroudi y col. (1997) FEBS Letters 414(3): 521-526; Vincke y col. (2009) Journal of Biological Chemistry (2009) 284: 3273-3284; Hamers-Casterman y col. (1993) Nature, 363: 446 y Nguyen y col. (1998) J. Mol. Biol, 275: 413), tiburones nodriza (Roux y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95: 11804), quimera manchada (Nguyen y col. (2002) Immunogenetics, 54: 10 39) o lamprea (Herrin y col. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 105: 2040-2045 y Alder y col. (2008) Nature Inmunology 9: 319-327). Estos anticuerpos pueden formar aparentemente regiones de unión a antígeno que usan sólo una región variable de cadena pesada, es decir, estos anticuerpos funcionales son homodímeros sólo de cadenas pesadas (referidos como "anticuerpos de cadena pesada") (Jespers y col. (2004) Nature Biotechnology 22: 1161-1165; Cortez-Retamozo y col. (2004) Cancer Research 64: 2853-2857; Baral y col. (2006) Nature Medicine 12: 15 580-584, y Barthelemy y col. (2008) Journal of Biological Chemistry 283: 3639-3654).
Entre los anticuerpos anti-CD3 de ejemplo a partir de los cuales puede obtenerse el dominio de unión de la presente descripción se incluyen anticuerpo monoclonal Cris-7 (Reinherz, E. L. y col. (eds.), Leukocyte typing II, Springer Verlag, Nueva York, (1986)), anticuerpo monoclonal BC3 (Anasetti y col. (1990) J. Exp. Med. 172: 1691), OKT3 20 (Ortho multicenter Transplant Study Group (1985) N. Engl. J. Med. 313: 337) y derivados de los mismos tales como OKT3 ala-ala (Herald y col. (2003) J. Clin. Invest. 11: 409), visilizumab (Carpenter y col. (2002) Blood 99: 2712), y 145-anticuerpo monoclonal 2C11 (Hirsch y col. (1988) J. Immunol. 140: 3766). Un anticuerpo anti-TCR de ejemplo es el anticuerpo monoclonal H57 (Lavasani y col. (2007) Scandinavian Journal of Inmunology 65: 39-47).
25
Una fuente alternativa de dominios de unión de la presente descripción incluye secuencias que codifican bibliotecas de péptidos aleatorias o secuencias que codifican una diversidad diseñada de aminoácidos en regiones de bucle de supercóntigos no de anticuerpos alternativos, tales como dominios de fibrinógeno (véase, por ejemplo, Weisel y col. (1985) Science 230: 1388), dominios Kunitz (véase, por ejemplo, patente de EE.UU. nº 6.423.498), proteínas de repetición de anquirina (Binz y col. (2003) Journal of Molecular Biology 332: 489-503 y Binz y col. (2004) Nature 30 Biotechnology 22(5): 575-582), dominios de unión de fibronectina (Richards y col. (2003) Journal of Molecular Biology 326: 1475-1488; Parker y col. (2005) Protein Engineering Design and Selection 18(9): 435-444 y Hackel y col. (2008) Journal of Molecular Biology 381: 1238-1252), miniproteínas nodales de cisteína (Vita y col. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 92: 6404-6408; Martin y col. (2002) Nature Biotechnology 21: 71-76 y Huang y col. (2005) Structure 13: 755-768), dominios de repetición de tetratricopéptidos (Main y col. (2003) Structure 11: 497-508 y 35 Cortajarena y col. (2008) ACS Chemical Biology 3: 161-166), dominios de repetición ricos en leucina (Stumpp y col. (2003) Journal of Molecular Biology 332: 471-487), dominios de lipocalina (véase, por ejemplo, el documento WO-2006/095.164, Beste y col. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 96: 1898-1903 y Schonfeld y col. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 106: 8198-8203), dominios de tipo V (véase, por ejemplo, solicitud de patente de EE.UU. publicación nº 2007/0065431), dominios de lectina de tipo C (Zelensky y Gready (2005) FEBS J. 272: 6179; Beavil y 40 col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 753-757 y Sato y col. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 100: 7779-7784), mAb2 o FCAB™ (véase, por ejemplo, solicitudes de patente PCT publicación nº WO-2007/098.934; WO-2006/0726.20), o similares (Nord y col. (1995) Protein Engineering 8(6): 601-608; Nord y col. (1997) Nature Biotechnology 15: 772-777; Nord y col. (2001) European Journal of Biochemistry 268(15): 4269-4277 y Binz y col. (2005) Nature Biotechnology 23: 1257-1268). 45
Los dominios de unión de la presente descripción pueden generarse tal como se describe en la presente memoria descriptiva o mediante una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, patentes de EE.UU. nº 6.291.161 y 6.291.158). Por ejemplo, los dominios de unión de la presente descripción pueden identificarse mediante cribado de una biblioteca de fagos Fab de fragmentos Fab que se unen específicamente a 50 una diana de interés (véase Hoet y col. (2005) Nature Biotechnol. 23: 344). Además, pueden usarse estrategias tradicionales para desarrollo de hibridomas usando una diana de interés como inmunógeno en sistemas convenientes (por ejemplo, ratones, HUMAB RATÓN®, TC RATÓN™, KM-RATÓN®, llamas, pollos, ratas, hámsteres, conejos, etc.) para desarrollar los dominios de unión de la presente descripción.
55
En algunas realizaciones, un heterodímero de polipéptidos comprende un dominio de unión CD86, tal como un ectodominio CTLA4, un ectodominio CD28 o un dominio de unión de región variable de inmunoglobulinas (tal como un scFv) específico para CD86 (por ejemplo, de los anticuerpos monoclonales 3D1 o FUN1). En algunas realizaciones se usa menos de un ectodominio entero. Por ejemplo, pueden usarse dominios dentro del ectodominio CTLA4 que se unen a CD86 y evitan la unión de CD86 a CD28. El dominio de unión CD86 puede bloquear la unión de CD86 a CD28 y de este modo regular por disminución la activación de linfocitos T.
En algunas realizaciones, un heterodímero de polipéptidos comprende un agonista IL-10, tal como IL-10, mono-IL-10, o una región funcional de los mismos. "MonoIL-10" se refiere a una molécula IL-10 que tiene un conector corto 5 (GGGSGG, SEQ ID NO: 760) que separa los dos subdominios de la molécula (dominios de extremo amino y carboxilo) de manera que estos subdominios pueden formar un dímero intramolecular.
En algunas realizaciones, un heterodímero de polipéptidos comprende un agonista HLA, tal como una muteína HLA-G5, HLA-G1, HLA-G o una región funcional de las mismas; un ectodominio de una muteína HLA-G5, HLA-G1 o HLA-10 G; o un dominio de unión de región variable de inmunoglobulinas (tal como scFv) específico para ILT2, ILT4 o KIR2DL4.
En algunas realizaciones, un heterodímero de polipéptidos comprende un agonista HGF, tal como HGF o un subdominio del mismo. 15
En algunas realizaciones, un heterodímero de polipéptidos comprende un agonista IL35, tal como un dominio de unión de región variable de inmunoglobulinas (tal como scFv) específico para IL35R o IL35, o una región funcional del mismo.
20
En algunas realizaciones, un heterodímero de polipéptidos comprende un antagonista LIGHT, tal como un dominio de unión de región variable de inmunoglobulinas (tal como scFv) específico para LIGHT, o un ectodominio HVEM o una región funcional de los mismos.
En algunas realizaciones, un heterodímero de polipéptidos comprende un agonista PD-1, tal como un dominio de 25 unión de región variable de inmunoglobulinas (tal como scFv) específico para PD-1, o un ligando de PD-1 (por ejemplo PD-L1 o PD-L2) o una región funcional de los mismos.
En algunas realizaciones, un heterodímero de polipéptidos comprende un agonista BTLA, tal como un dominio de unión de región variable de tipo inmunoglobulina (tal como scFv) específico para BTLA, o un ectodominio HVEM o 30 una región funcional de los mismos.
En algunas realizaciones, un heterodímero de polipéptidos comprende un antagonista GITRL, tal como un dominio de unión de región variable de tipo inmunoglobulina (tal como scFv) específico para GITRL, o un ectodominio GITR, GITR soluble o una región funcional de los mismos. 35
En algunas realizaciones, un heterodímero de polipéptidos comprende un antagonista CD40, tal como un dominio de unión de región variable de tipo inmunoglobulina (tal como scFv) específico para CD40.
En algunas realizaciones, un dominio de unión es un fragmento de Fv de cadena única (scFv) que comprende 40 regiones VH y VL específicas para una diana de interés. En algunas realizaciones, los dominios VH y VL son humanos. Las regiones VH de ejemplo incluyen la región VH de scFv 2E12 (anti-CD28) tal como se determina en SEQ ID NO: 106, la región VH de scFv P2C2 (anti-CD79b) tal como se determina en SEQ ID NO: 184, la región VH de scFv 5D5 (anti-c-Met) tal como se determina en SEQ ID NO: 258, la región VH de scFv A2 (anti-hiper-IL-6) tal como se determina en SEQ ID NO: 80, la región VH de scFv 3D1 (anti-CD86) tal como se determina en SEQ ID NO: 45 92, la región VH de scFv MET021 (anti-c-Met) tal como se determina en SEQ ID NO: 100, la región VH de scFv G19-4 (anti-CD3) tal como se determina en SEQ ID NO: 103, la región VH de scFv HD37 (anti-CD19) tal como se determina en SEQ ID NO: 117, la región VH de scFv M0042 (anti-HLA-DR) tal como se determina en SEQ ID NO: 121, la región VH de scFv BMA031 (anti-TCR) tal como se determina en SEQ ID NO: 828, la región VH de scFv OKT3-M (anti-CD3) tal como se determina en SEQ ID NO: 831, y la región VH de scFv HuM291 (anti-CD3) tal como 50 se determina en SEQ ID NO: 835. Las secuencias de nucleótidos que codifican las regiones VH de los scFV A2 (anti-hiper-IL-6) y 3D1 (anti-CD86) se determinan en SEQ ID NO: 79 y 91, respectivamente.
Los dominios VL de ejemplo son la región VL de scFv 2E12 (anti-CD28) tal como se determina en SEQ ID NO: 107, la región VL de scFv P2C2 (anti-CD79b) tal como se determina en SEQ ID NO: 182, la región VL de scFv 5D5 (anti-55 c-Met) tal como se determina en SEQ ID NO: 259, la región VL de scFv A2 (anti-hiper IL-6) tal como se determina en SEQ ID NO: 84, la región VL de scFv 3D1 (anti-CD86) tal como se determina en SEQ ID NO: 96, la región VL de scFv MET021 (anti-c-Met) tal como se determina en SEQ ID NO: 101, la región VL de scFv G19-4 (anti-CD3) tal como se determina en SEQ ID NO: 104, la región VL de scFv HD37 (anti-CD19) tal como se determina en SEQ ID NO: 119, la región VL de scFv M0042 (anti-HLA-DR) tal como se determina en SEQ ID NO: 122, la región VL de scFv BMA031 (anti-TCR) tal como se determina en SEQ ID NO: 829, la región VL de scFv OKT3-M (anti-CD3) tal como se determina en SEQ ID NO: 833, y la región VL de scFv HuM291 (anti-CD3) tal como se determina en SEQ ID NO: 836. Las secuencias de nucleótidos que codifican las regiones VL de las scFv A2 (anti-hiper-IL-6) y 3D1 (anti-CD86) se determinan en SEQ ID NO: 83 y 95, respectivamente. 5
En algunas realizaciones, un dominio de unión es un fragmento de Fv de cadena única (scFv) que comprende dominios VH y VL específicos para un complejo TCR o un componente del mismo. En algunas realizaciones, los dominios VH y VL son dominios VH y VL humanos o humanizados. Los dominios VH de ejemplo incluyen dominios VH BC3 (anti-CD3), VH OKT3 (anti-CD3), VH H57 (anti-TCR) y VH 2C11 (anti-CD3) tal como se 10 determina en SEQ ID NO: 301, 303, 313 y 317, respectivamente. Algunos ejemplos adicionales de dominios VH incluyen dominios VH Cris-7 (anti-CD3), tales como los establecidos en SEQ ID NO: 327 y 331-333. Los dominios VL de ejemplo son dominios BC3 (anti-CD3) VL, OKT3 (anti-CD3) VL, H57 (anti-TCR) VL y 2C11 (anti-CD3) VL dominios tal como se determina en SEQ ID NO: 302, 304, 315 y 318, respectivamente. Algunos dominios VL adicionales de ejemplo incluyen dominios VL Cris-7 (anti-CD3), tales como los establecidos en SEQ ID NO: 328, 15 329 y 330.
En algunas realizaciones, un dominio de unión comprende o es una secuencia que es idéntica en al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%, al menos el 99,5% o el 100% a una secuencia de aminoácidos de una 20 región variable de cadena ligera ( VL) o a una región variable de cadena pesada ( VH), o ambos, donde cada CDR comprende cero cambios o como máximo uno, dos, o tres cambios, con respecto a un anticuerpo monoclonal o un fragmento o derivado del mismo que se une específicamente a una diana de interés (por ejemplo, c-Met, RON, CD28, CD79b, CD3ε, TCRα, TCRβ, hiper-IL-6, CD86, CD19, y HLA-DR) y dicho mutante o derivado se une todavía a su diana. 25
En algunas realizaciones, una región VH o VL de dominio de unión de la presente descripción puede obtenerse de o basarse en una VH o VL de un anticuerpo monoclonal conocido y contiene una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) inserciones, una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) deleciones, una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) sustituciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones conservadoras de aminoácidos o 30 sustituciones no conservadoras de aminoácidos), o una combinación de los cambios indicados anteriormente, cuando se compara con la VH o VL de un anticuerpo monoclonal conocido. Las inserciones, deleciones o sustituciones pueden estar en cualquier lugar de la región VH, incluido el extremo amino o carboxilo o los dos extremos de esta región, siempre que cada CDR comprenda cero cambios o como máximo uno, dos o tres cambios y siempre que un dominio de unión que contiene la región VH o VL modificada siga unido específicamente a su 35 diana con una afinidad aproximadamente igual al dominio de unión natural.
Los dominios VH y VL pueden disponerse en cualquier orientación (es decir, desde el extremo amino al extremo carboxilo, VH- VL o VL- VH) y pueden unirse mediante una secuencia de aminoácidos (por ejemplo, con una longitud de aproximadamente cinco a aproximadamente 35 aminoácidos) capaz de proporcionar una función de 40 separación de manera que los dos subdominios de unión pueden interaccionar para formar un dominio de unión funcional. En algunas realizaciones, una secuencia de aminoácidos que se une a los dominios VH y VL (también referida en la presente memoria descriptiva como "conector") incluye los pertenecientes a la familia (GlynSer), tal como (Gly3Ser)n(Gly4Ser)1, (Gly3Ser)1(Gly4Ser)n, (Gly3Ser)n(Gly4Ser)n, o (Gly4Ser)n, donde n es un número entero de 1 a 5. En algunas realizaciones, el conector es GGGGSGGGGS GGGGS (SEQ ID NO: 183) o 45 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 108). Un conector adicional de ejemplo es GGGGSGGGGSGGGGAS (SEQ ID NO: 739). En algunas realizaciones, estos conectores basados en (GlynSer) se usan para unir los dominios VH y VL en un dominio de unión, pero no se usan para unir un dominio de unión a un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas o a una parte de región Fc.
50
Los dominios de unión de ejemplo específicos para CD28 incluyen scFv 2E12 tal como se determina en SEQ ID NO: 109, los dominios de unión específicos para CD79b incluyen scFv P2C2 tal como se determina en SEQ ID NO: 185; los dominios de unión específicos para c-Met incluyen scFv 5D5 tal como se determina en SEQ ID NO: 257; los dominios de unión específicos para RON incluyen scFv 4C04 tal como se determina en SEQ ID NO: 261 y scFv 11H09 tal como se determina en SEQ ID NO: 265; los dominios de unión específicos para hiper-IL-6 incluyen scFv 55 A2 tal como se determina en SEQ ID NO: 86; los dominios de unión específicos para CD86 incluyen scFv 3D1 tal como se determina en SEQ ID NO: 98; los dominios de unión específicos para HLA-DR incluyen scFv M0042 tal como se determina en SEQ ID NO: 120; los dominios de unión específicos para CD3 incluyen scFv G19-4 tal como se determina en SEQ ID NO: 102, scFv OKT3-M tal como se determina en SEQ ID NO: 834 y scFv HuM291 tal como se determina en SEQ ID NO: 837; el dominio de unión específico para CD19 incluye scFv H37 tal como se determina en SEQ ID NO: 105; y los dominios de unión específicos para c-Met incluyen scFv MET021 tal como se determina en SEQ ID NO: 120 (con la cadena ligera CDR1, CDR2, CDR3 y la cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 tal como se determina en SEQ ID NO: 296-298 y 464-466, respectivamente). Las secuencias de nucleótidos que codifican las scFv A2 (anti-hiper-IL6) y 3D1 (anti-CD86) se determinan en SEQ ID NO: 85 y 97, respectivamente. Los 5 dominios de unión de ejemplo que se unen a un complejo TCR o un componente del mismo incluyen scFv BMA031 tal como se determina en SEQ ID NO: 830 y otras scFv tal como se determina en SEQ ID NO: 310, 311, 312, 319 y 334-340.
Los dominios de unión de ejemplo adicionales incluyen un ectodominio PDL2 tal como se determina en SEQ ID NO: 10 88 y mono-IL-10 tal como se determina en SEQ ID NO: 90. Las secuencias de nucleótidos que codifican el ectodominio PDL2 y mono-IL-10 se determinan en SEQ ID NO: 87 y 89, respectivamente.
La cadena ligera aminoácido secuencia de scFv 4C04 (anti-RON) se determina en SEQ ID NO: 602, y sus CDR1, CDR2 y CDR3 se determinan en SEQ ID NO: 604-606, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de cadena 15 pesada de scFv 4C04 (anti-RON) se determina en SEQ ID NO: 603, y sus CDR1, CDR2 y CDR3 se determinan en SEQ ID NO: 607-609, respectivamente.
La secuencia de aminoácidos de cadena ligera de scFv 11H09 (anti-RON) se determina en SEQ ID NO: 610, y sus CDR1, CDR2 y CDR3 se determinan en SEQ ID NO: 612-614, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de 20 cadena pesada de scFv 11H09 (anti-RON) se determina en SEQ ID NO: 611, y sus CDR1, CDR2 y CDR3 se determinan en SEQ ID NO: 615-617, respectivamente.
Un dominio de unión puede estar situado en el extremo amino o el extremo carboxilo en la parte de región Fc de un polipéptido de cadena única de la presente descripción. En algunas realizaciones, el dominio de unión está situado 25 en el extremo amino de un polipéptido de cadena única. En algunas otras realizaciones, el dominio de unión está situado en el extremo carboxilo de un polipéptido de cadena única. En algunas otras realizaciones, un dominio de unión está situado en el extremo amino y en el extremo carboxilo de un polipéptido de cadena única.
Dominios de heterodimerización 30
Tal como se indica anteriormente, un heterodímero de polipéptidos de la presente descripción comprende un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas en cada cadena de polipéptidos. Los dominios de heterodimerización de inmunoglobulinas en los dos polipéptidos de cadena única de un heterodímero de polipéptidos son diferentes entre sí y así pueden modificarse diferencialmente para facilitar la heterodimerización de las dos 35 cadenas y reducir al mínimo la homodimerización de la cadena. Tal como se muestra en los ejemplos, los dominios de heterodimerización de inmunoglobulinas proporcionados en la presente memoria descriptiva permiten una heterodimerización eficiente entre diferentes polipéptidos y facilitar la purificación de los heterodímeros de polipéptidos resultantes.
40
Tal como se proporcionan en la presente memoria descriptiva, los dominios de heterodimerización de inmunoglobulinas útiles para promover la heterodimerización de dos polipéptidos de cadena única diferentes (por ejemplo, una corta y otra larga) de acuerdo con la presente descripción incluyen dominios CH1 y CL de inmunoglobulinas, por ejemplo, dominios CH1 y CL humanos. En algunas realizaciones, un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas es una región CH1 natural, tal como una región CH1 IgG1, IgG2, IgG3, 45 IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE o IgM natural. En realizaciones adicionales, un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas es una región CH1 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE o IgM humana natural tal como se determina en SEQ ID NO: 114, 186-192 y 194, respectivamente. En algunas realizaciones, un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas es una región CH1 IgG1 humana natural tal como se determina en SEQ ID NO: 114. 50
En realizaciones adicionales, un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas es una región CH1 de inmunoglobulinas alterada, tal como una región CH1 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 IgD, IgE o IgM alterada. En algunas realizaciones, un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas es una región CH1 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE o IgM humana alterada. En otras realizaciones adicionales, un resto de cisteína de una 55 región CH1 natural (por ejemplo, CH1 humana) implicado en la formación de un enlace de disulfuro con un dominio CL de inmunoglobulinas natural (por ejemplo, CL humana) es suprimido o sustituido en la región CH1 de inmunoglobulinas alterada de manera que un enlace de disulfuro no se forma entre la región CH1 alterada y el dominio CL natural.
En algunas realizaciones, un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas es un dominio CL natural, tal como un dominio Cκ natural o un dominio Cλ natural. En realizaciones particulares, un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas es un dominio Cκ natural o Cλ humano tal como se determina en SEQ ID NO: 112 y 113, respectivamente. En realizaciones adicionales, un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas es un 5 dominio CL de inmunoglobulinas alterado, tal como un dominio Cκ o Cλ alterado, por ejemplo, un dominio Cκ o Cλ humano alterado.
En algunas realizaciones, un resto de cisteína de un dominio CL natural (por ejemplo, CL humano) implicado en la formación de un enlace de disulfuro con una región CH1 de inmunoglobulinas natural (por ejemplo, CH1 humano) es 10 suprimido o sustituido en el dominio CL de inmunoglobulinas alterado. Dichos dominios CL alterados pueden comprender además una deleción de aminoácidos en sus extremos amino. Un dominio Cκ de ejemplo se determina en SEQ ID NO: 141, donde la primera arginina y la última cisteína del dominio Cκ humano natural se suprimen. En algunas realizaciones, sólo se suprime la última cisteína del dominio Cκ humano natural en el dominio Cκ alterado dado que la primera arginina suprimida del dominio Cκ humano natural puede ser proporcionada por un conector 15 que tiene una arginina en su extremo carboxilo y se une al extremo amino del dominio Cκ alterado con otro dominio (por ejemplo, una parte de región Fc). Se determina un dominio Cλ de ejemplo en SEQ ID NO: 140, donde la primera arginina de un dominio Cλ humano natural se suprime y la cisteína implicada en la formación de un enlace de disulfuro con una cisteína en una región CH1 es sustituida por una serina.
20
En realizaciones adicionales, un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas es un dominio Cκ alterado que contiene una o más sustituciones de aminoácidos, en comparación con un dominio Cκ natural, en las posiciones que pueden estar implicadas en la formación de la red de enlaces de hidrógeno entre cadenas en una interfaz Cκ-Cκ. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas es un dominio Cκ humano alterado que tiene uno o más aminoácidos en las posiciones N29, N30, Q52, V55, T56, S68 o T70 que son 25 sustituidos por un aminoácido diferente. La numeración de los aminoácidos se basa en sus posiciones en la secuencia Cκ humana alterada tal como se determina en SEQ ID NO: 141. En algunas realizaciones, un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas es un dominio Cκ humano alterado que tiene uno, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos en las posiciones N29, N30, V55 o T70. El aminoácido usado como sustituto en las posiciones indicadas anteriormente puede ser una alanina, o un resto de aminoácidos con una fracción de cadena 30 lateral en volumen tal como arginina, triptófano, tirosina, glutamato, glutamina o lisina. Los restos de aminoácidos adicionales que pueden usarse para sustituir restos de aminoácidos de la secuencia Cκ humana natural en las posiciones indicadas anteriormente (por ejemplo, N30) incluyen aspartato, metionina, serina y fenilalanina. Los dominios Cκ humanos alterados de ejemplo se determinan en SEQ ID NO: 142-178. Los dominios Cκ humanos alterados son los que facilitan la heterodimerización con una región CH1, pero reducen al mínimo la 35 homodimerización con otro dominio Cκ. Los dominios Cκ humanos alterados representativos se determinan en SEQ ID NO: 160 (N29W V55A T70A), 161 (N29Y V55A T70A), 202 (T70E N29A N30A V55A), 167 (N30R V55A T70A), 168 (N30K V55A T70A), 170 (N30E V55A T70A), 172 (V55R N29A N30A), 175 (N29W N30Y V55A T70E), 176 (N29Y N30Y V55A T70E), 177 (N30E V55A T70E), 178 (N30Y V55A T70E), 838 (N30D V55A T70E), 839 (N30M V55A T70E), 840 (N30S V55A T70E) y 841 (N30F V55A T70E). 40
En algunas realizaciones, además de o como alternativa a las mutaciones en dominios Cκ descritos en la presente memoria descriptiva, los dominios de heterodimerización de inmunoglobulinas (es decir, dominios CH1 y CL de inmunoglobulinas) de un heterodímero de polipéptidos tienen mutaciones de manera que los dominios de heterodimerización de inmunoglobulinas resultantes forman puentes salinos (es decir, interacciones iónicas) entre 45 los restos de aminoácidos en los sitios mutados. Por ejemplo, los dominios de heterodimerización de inmunoglobulinas de un heterodímero de polipéptidos pueden ser un dominio CH1 mutado en combinación con un dominio Cκ mutado. En el dominio CH1 mutado, la valina en la posición 68 (V68) del dominio CH1 humano natural es sustituida por un resto de aminoácidos que tiene una carga negativa (por ejemplo, aspartato o glutamato), mientras que la leucina en la posición 29 (L29) de un dominio Cκ humano mutado donde se han suprimido la primera 50 arginina y la última cisteína es sustituida por un resto de aminoácidos que tiene una carga positiva (por ejemplo, lisina, arginina o histidina). La interacción entre cargas entre el resto de aminoácidos que tiene una carga negativa del dominio CH1 mutado resultante y el resto de aminoácidos que tiene una carga positiva del dominio Cκ mutado resultante forma un puente salino, que estabiliza la interfaz heterodimérica entre los dominios CH1 y Cκ mutados. Alternativamente, V68 del CH1 natural puede sustituirse por un resto de aminoácidos que tiene una carga positiva, 55 mientras que L29 de un dominio Cκ humano mutado donde se han suprimido la primera arginina y la última cisteína puede sustituirse por un resto de aminoácidos que tiene una carga negativa. Las secuencias CH1 mutadas de ejemplo donde V68 está sustituida por un aminoácido con una carga negativa o positiva se determinan en SEQ ID NO: 844 y 845. Las secuencias Cκ mutadas de ejemplo en las que L29 está sustituida por un aminoácido con una carga negativa o positiva se determinan en SEQ ID NO: 842 y 843.
Las posiciones distintas de V68 de dominio CH1 humano y L29 de dominio Cκ humano pueden sustituirse por aminoácidos que tienen cargas opuestas para producir interacciones iónicas entre los aminoácidos además o como alternativa a las mutaciones en V68 de dominio CH1 y L29 de dominio Cκ. Dichas posiciones pueden identificarse 5 por cualquier procedimiento adecuado, lo que incluye mutagenia aleatoria, análisis de la estructura cristalina del par CH1-Cκ para identificar restos de aminoácidos en la interfaz CH1-Cκ, e identificar además posiciones adecuadas entre los restos de aminoácidos en la interfaz CH1-Cκ usando un conjunto de criterios (por ejemplo, propensión a intervenir en interacciones iónicas, proximidad a un resto acompañante potencial, etc.).
10
En algunas realizaciones, los heterodímeros de polipéptidos de la presente descripción contienen sólo un par de dominios de heterodimerización de inmunoglobulinas. Por ejemplo, una primera cadena de un heterodímero de polipéptidos puede comprender una región CH1 como un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas, mientras que una segunda cadena puede comprender un dominio CL (por ejemplo, Cκ o Cλ) como un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas. Alternativamente, una primera cadena puede comprender una región CL 15 (por ejemplo, Cκ o Cλ) como un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas, mientras que una segunda cadena puede comprender una región CH1 como un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas. Tal como se expone en la presente memoria descriptiva, los dominios de heterodimerización de inmunoglobulinas de las cadenas primera y segunda son capaces de asociarse para formar un heterodímero de polipéptidos de la presente descripción. 20
En algunas otras realizaciones, los heterodímeros de polipéptidos de la presente descripción pueden tener dos pares de dominios de heterodimerización de inmunoglobulinas. Por ejemplo, una primera cadena de un heterodímero de polipéptidos puede comprender dos regiones CH1, mientras que una segunda cadena puede tener dos dominios CL que se asocian con las dos regiones CH1 en la primera cadena. Alternativamente, una primera cadena puede 25 comprender dos dominios CL, mientras que una segunda cadena puede tener dos regiones CH1 que se asocian con los dos dominios CL en la primera cadena. En algunas realizaciones, una primera cadena de polipéptidos comprende una región CH1 y un dominio CL, mientras que una segunda cadena de polipéptidos comprende un dominio CL y una región CH1 que se asocian con la región CH1 y el dominio CL, respectivamente, de la primera cadena de polipéptidos. 30
En las realizaciones donde un heterodímero de polipéptidos comprende sólo un par de heterodimerización (es decir, un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas en cada cadena), el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas de cada cadena puede estar situado en el extremo amino en la parte de región Fc de esa cadena. Alternativamente, el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas en cada cadena puede estar situado en el 35 extremo carboxilo de la parte de región Fc de esa cadena.
En las realizaciones donde un heterodímero de polipéptidos comprende dos pares de heterodimerización (es decir, dos dominios de heterodimerización de inmunoglobulinas en cada cadena), los dos dominios de heterodimerización de inmunoglobulinas en cada cadena pueden estar situados en el extremo amino de la parte de región Fc de esa 40 cadena. Alternativamente, los dos dominios de heterodimerización de inmunoglobulinas en cada cadena pueden estar situados en el extremo carboxilo de la parte de región Fc de esa cadena. En realizaciones adicionales, un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas en cada cadena puede estar situado en el extremo amino de la parte de región Fc de esa cadena, mientras que el otro dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas de cada cadena puede estar situado en el extremo carboxilo de la parte de región Fc de esa cadena. En otras palabras, en 45 estas realizaciones, la parte de región Fc está interpuesta entre los dos dominios de heterodimerización de inmunoglobulinas de cada cadena.
Parte de la región Fc
50
Tal como se indica en la presente memoria descriptiva, los heterodímeros de polipéptidos de la presente descripción comprenden una parte del dominio constante de la región Fc (también referida como una parte de región Fc) en cada cadena de polipéptidos. La inclusión de una parte de región Fc ralentiza el aclaramiento de los heterodímeros de la circulación después de la administración a un sujeto. Por mutaciones u otras alteraciones, la parte de región Fc permite además una modulación relativamente sencilla de las funciones de efector de polipéptido heterodímero (por 55 ejemplo, ADCC, ADCP, CDC, fijación del complemento y unión a receptores Fc), que pueden aumentarse o disminuirse dependiendo de la enfermedad sujeta a tratamiento, tal como se conoce en la técnica y se describe en la presente memoria descriptiva. En algunas realizaciones, una parte de región Fc de heterodímeros de polipéptidos de la presente descripción será capaz de mediar en una o más de estas funciones de efector.
Una parte de región Fc presente en los polipéptidos de cadena única que forman parte de los heterodímeros de polipéptidos de la presente descripción puede comprender un dominio CH2, un dominio CH3, un dominio CH4 o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, una parte de región Fc puede comprender un dominio CH2, un dominio CH3, dominios CH2 y CH3, dominios CH3 y CH4, dos dominios CH3, un dominio CH4 o dos dominios CH4. 5
Un dominio CH2 que puede formar una parte de región Fc de un polipéptido de cadena única de un heterodímero de la presente descripción puede ser un dominio CH2 de inmunoglobulinas natural o un dominio CH2 de inmunoglobulinas alterado de los mismos a partir de ciertas clases o subclases de inmunoglobulinas (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 o IgD) y de varias especies (lo que incluye ser humano, ratón, rata y otros 10 mamíferos).
En algunas realizaciones, un dominio CH2 es un dominio CH2 de inmunoglobulinas humano natural, tal como dominios CH2 naturales de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 o IgD humanas, tal como se determina en SEQ ID NO: 115, 199-201 y 195-197, respectivamente. En algunas realizaciones, el dominio CH2 es un dominio CH2 IgG1 15 humano natural tal como se determina en SEQ ID NO: 115.
En algunas realizaciones, un dominio CH2 es una región CH2 de inmunoglobulinas alterada (por ejemplo, un dominio CH2 IgG1 humano alterado) que comprende una sustitución de aminoácidos en la asparagina de la posición 297 (por ejemplo, de asparagina a alanina). Dicha sustitución de aminoácidos reduce o elimina la glucosilación en 20 este punto y anula la unión de Fc eficiente a FcyR y C1q. La secuencia de un dominio CH2 IgG1 humano alterado con una sustitución de Asn a Ala en la posición 297 se determina en SEQ ID NO: 324.
En algunas realizaciones, un dominio CH2 es una región CH2 de inmunoglobulinas alterada (por ejemplo, un dominio CH2 IgG1 humano alterado) que comprende al menos una sustitución o deleción en las posiciones 234 a 25 238. Por ejemplo, una región CH2 de inmunoglobulinas pueden comprender una sustitución en la posición 234, 235, 236, 237 ó 238, las posiciones 234 y 235, las posiciones 234 y 236, las posiciones 234 y 237, las posiciones 234 y 238, las posiciones 234-236, las posiciones 234, 235 y 237, las posiciones 234, 236 y 238, las posiciones 234, 235, 237 y 238, las posiciones 236-238, o cualquier otra combinación de dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos en las posiciones 234-238. Además o alternativamente, una región CH2 alterada puede comprender una o más (por 30 ejemplo, dos, tres, cuatro o cinco) deleciones de aminoácidos en las posiciones 234-238, por ejemplo, en una de la posición 236 o la posición 237 mientras que la otra posición está sustituida. La o las mutaciones indicadas anteriormente reducen o eliminan la actividad de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o la capacidad de unión a receptores Fc de un heterodímero de polipéptidos que comprende el dominio CH2 alterado. En algunas realizaciones, los restos de aminoácidos en una o más de las posiciones 234-238 se han 35 sustituido por uno o más restos de alanina. En realizaciones adicionales, sólo uno de los restos de aminoácidos en las posiciones 234-238 ha sido suprimido mientras que uno o más de los aminoácidos restantes en las posiciones 234-238 pueden sustituirse por otro aminoácido (por ejemplo, alanina o serina).
En algunas otras realizaciones, un dominio CH2 es una región CH2 de inmunoglobulinas alterada (por ejemplo, un 40 dominio CH2 IgG1 humano alterado) que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones 253, 310, 318, 320, 322 y 331. Por ejemplo, una región CH2 de inmunoglobulinas puede comprender una sustitución en la posición 253, 310, 318, 320, 322 ó 331, las posiciones 318 y 320, las posiciones 318 y 322, las posiciones 318, 320 y 322, o cualquier otra combinación de dos, tres, cuatro, cinco o seis aminoácidos en las posiciones 253, 310, 318, 320, 322 y 331. La o las mutaciones indicadas anteriormente reducen o eliminan la citotoxicidad dependiente 45 del complemento (CDC) de un heterodímero de polipéptidos que comprende el dominio CH2 alterado.
En algunas otras realizaciones, además de la sustitución de aminoácidos en la posición 297, una región CH2 alterada (por ejemplo, un dominio CH2 IgG1 humano alterado) puede comprender además una o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro o cinco) sustituciones adicionales en las posiciones 234-238. Por ejemplo, una región CH2 de 50 inmunoglobulinas puede comprender una sustitución en las posiciones 234 y 297, las posiciones 234, 235 y 297, las posiciones 234, 236 y 297, las posiciones 234-236 y 297, las posiciones 234, 235, 237 y 297, las posiciones 234, 236, 238 y 297, las posiciones 234, 235, 237, 238 y 297, las posiciones 236-238 y 297, o cualquier combinación de dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos en las posiciones 234-238 además de la posición 297. Además o alternativamente, una región CH2 alterada puede comprender una o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro o cinco) 55 deleciones de aminoácidos en las posiciones 234-238, por ejemplo en la posición 236 o posición 237. La o las mutaciones adicionales reducen o eliminan la actividad de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o la capacidad de unión a receptores Fc de un heterodímero de polipéptidos que comprende el dominio CH2 alterado. En algunas realizaciones, los restos de aminoácidos en una o más de posiciones 234-238 se han sustituido por uno o más restos de alanina. En realizaciones adicionales, sólo uno de los restos de aminoácidos en las posiciones 234-238 ha sido suprimido mientras uno o más de los aminoácidos restantes en las posiciones 234-238 pueden sustituirse por otro aminoácido (por ejemplo, alanina o serina).
En algunas realizaciones, además de una o más (por ejemplo, 2, 3, 4 ó 5) sustituciones de aminoácidos en las 5 posiciones 234-238, una región CH2 mutada (por ejemplo, un dominio CH2 IgG1 humano alterado) en una proteína de fusión de la presente descripción puede contener una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 ó 6) sustituciones de aminoácidos adicionales (por ejemplo, sustituidos por alanina) en una o más posiciones implicadas en la fijación del complemento (por ejemplo, en las posiciones I253, H310, E318, K320, K322 o P331). Los ejemplos de regiones CH2 de inmunoglobulinas mutadas incluyen IgG1, IgG2, IgG4 humanas y regiones CH2 IgG2a de ratón con sustituciones 10 de alanina en las posiciones 234, 235, 237 (si existe), 318, 320 y 322. Una región CH2 de inmunoglobulinas mutada de ejemplo es la región CH2 IgHG2c de ratón con sustituciones de alanina en L234, L235, G237, E318, K320 y K322 (SEQ ID NO: 314).
En otras realizaciones adicionales, además de la sustitución de aminoácidos en la posición 297 y la o las deleciones 15 o sustituciones adicionales en las posiciones 234-238, una región CH2 alterada (por ejemplo, un dominio CH2 IgG1 humano alterado) puede comprender además una o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o seis) sustituciones adicionales en las posiciones 253, 310, 318, 320, 322 y 331. Por ejemplo, una región CH2 de inmunoglobulinas puede comprender (1) una sustitución en la posición 297, (2) una o más sustituciones o deleciones o una combinación de las mismas en las posiciones 234-238, y una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 ó 6) sustituciones de 20 aminoácidos en las posiciones I253, H310, E318, K320, K322 y P331, por ejemplo una, dos, tres sustituciones en las posiciones E318, K320 y K322. Los aminoácidos en las posiciones indicadas anteriormente pueden estar sustituidos por alanina o serina.
En algunas realizaciones, un polipéptido de una región CH2 de inmunoglobulinas comprende: (i) una sustitución de 25 aminoácidos en las asparaginas de la posición 297 y una sustitución de aminoácidos en la posición 234, 235, 236 ó 237; (ii) una sustitución de aminoácidos en la asparagina de la posición 297 y sustituciones de aminoácidos en dos de las posiciones 234-237; (iii) una sustitución de aminoácidos en la asparagina de la posición 297 y sustituciones de aminoácidos en tres de las posiciones 234-237; (iv) una sustitución de aminoácidos en la asparagina de la posición 297, sustituciones de aminoácidos en las posiciones 234, 235 y 237, y una deleción de aminoácidos en la posición 30 236; (v) sustituciones de aminoácidos en tres de las posiciones 234-237 y sustituciones de aminoácidos en las posiciones 318, 320 y 322; o (vi) sustituciones de aminoácidos en tres de las posiciones 234-237, una deleción de aminoácidos en la posición 236, y sustituciones de aminoácidos en las posiciones 318, 320 y 322.
Las regiones CH2 de inmunoglobulinas alteradas de ejemplo con sustituciones de aminoácidos en la asparagina de 35 la posición 297 incluyen: región CH2 IgG1 humana con sustituciones de alanina en L234, L235, G237 y N297 y una deleción en G236 (SEQ ID NO: 325), región CH2 IgG2 humana con sustituciones de alanina en V234, G236, y N297 (SEQ ID NO: 326), región CH2 IgG4 humana con sustituciones de alanina en F234, L235, G237 y N297 y una deleción de G236 (SEQ ID NO: 322), región CH2 IgG4 humana con sustituciones de alanina en F234 y N297 (SEQ ID NO: 343), región CH2 IgG4 humana con sustituciones de alanina en L235 y N297 (SEQ ID NO: 344), región CH2 40 IgG4 humana con sustituciones de alanina en G236 y N297 (SEQ ID NO: 345) y región CH2 IgG4 humana con sustituciones de alanina en G237 y N297 (SEQ ID NO: 346).
En algunas realizaciones, además de las sustituciones de aminoácidos descritas anteriormente, una región CH2 alterada (por ejemplo, un dominio CH2 IgG1 humano alterado) puede contener una o más sustituciones de 45 aminoácidos adicionales en una o más posiciones distintas de las posiciones indicadas anteriormente. Dichas sustituciones de aminoácidos pueden ser sustituciones conservadoras o no conservadoras de aminoácidos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, P233 puede cambiarse por E233 en una región CH2 IgG2 alterada (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 326). Además o alternativamente, en algunas realizaciones, la región CH2 alterada puede contener una o más inserciones o deleciones de aminoácidos, o ambas. La o las inserciones, deleciones o 50 sustituciones pueden producirse en cualquier lugar en una región CH2 de inmunoglobulinas, tal como en el extremo N o C de una región CH2 de inmunoglobulinas natural resultante de la unión de la región CH2 con otra región (por ejemplo, un dominio de unión o un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas) por medio de una bisagra.
En algunas realizaciones, una región CH2 alterada en un heterodímero de polipéptidos de la presente descripción 55 comprende o es una secuencia que es idéntica en al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% a una región CH2 de inmunoglobulina natural, tal como la región CH2 IgG1, IgG2 o IgG4 humanas naturales o IgG2a de ratón (por ejemplo, IGHG2c).
Una región CH2 de inmunoglobulinas alterada en un heterodímero de polipéptidos de la presente descripción puede obtenerse a partir de una región CH2 de varios isotipos de inmunoglobulinas, tales como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 e IgD, de diversas especies (incluyendo ser humano, ratón, rata y otros mamíferos). En algunas realizaciones, una región CH2 de inmunoglobulinas alterada en una proteína de fusión de la presente descripción 5 puede obtenerse a partir de una región CH2 IgG1, IgG2 o IgG4 humanas o IgG2a de ratón (por ejemplo, IGHG2c), cuyas secuencias se determinan en SEQ ID NO: 115, 199, 201 y 320.
En algunas realizaciones, un dominio CH2 alterado es un dominio CH2 IgG1 humano con sustituciones de alanina en las posiciones 235, 318, 320 y 322 (es decir, un dominio CH2 IgG1 humano con sustituciones L235A, E318A, 10 K320A y K322A) (SEQ ID NO: 595), y opcionalmente una mutación N297 (por ejemplo, por alanina). En algunas otras realizaciones, un dominio CH2 alterado es un dominio CH2 IgG1 humano con sustituciones de alanina en las posiciones 234, 235, 237, 318, 320 y 322 (es decir, un dominio CH2 IgG1 humano con sustituciones L234A, L235A, G237A, E318A, K320A y K322A) (SEQ ID NO: 596), y opcionalmente una mutación N297 (por ejemplo, por alanina).
15
En algunas realizaciones, un dominio CH2 alterado es un dominio CH2 IgG1 humano alterado con mutaciones que de acuerdo con lo conocido en la técnica potencian actividades inmunológicas tales como ADCC, ADCP, CDC, fijación del complemento, unión a receptores Fc o cualquier combinación de los mismos.
El dominio CH3 que puede formar una parte de región Fc de un polipéptido de cadena única de un heterodímero de 20 la presente descripción puede ser un dominio CH3 de inmunoglobulinas natural o un dominio CH3 de inmunoglobulinas alterado de los mismos de ciertas clases o subclases de inmunoglobulinas (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM) de diversas especies (incluyendo ser humano, ratón, rata y otros mamíferos). En algunas realizaciones, un dominio CH3 es un dominio CH3 de inmunoglobulinas humano natural, tal como dominios CH3 naturales de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE o IgM humanas tal como se 25 determina en SEQ ID NO: 116, 208-210, 204-207 y 212, respectivamente. En algunas realizaciones, el dominio CH3 es un dominio CH3 IgG1 humano natural tal como se determina en SEQ ID NO: 116. En algunas realizaciones, un dominio CH3 es un dominio CH3 de inmunoglobulinas humano alterado, tal como un dominio CH3 alterado basado en o derivado de un dominio CH3 natural de anticuerpos IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE o IgM humanos. Por ejemplo, un dominio CH3 alterado puede ser un dominio CH3 humano de IgG1 con una o dos 30 mutaciones en las posiciones H433 y N434 (las posiciones están numeradas de acuerdo con la numeración EU). Las mutaciones en dichas posiciones pueden estar implicadas en la fijación del complemento. En algunas otras realizaciones, un dominio CH3 alterado puede ser un dominio CH3 humano de IgG1 pero con una o dos sustituciones de aminoácidos en la posición F405 o Y407. Los aminoácidos en dichas posiciones intervienen en la interacción con otro dominio CH3. En algunas realizaciones, un dominio CH3 alterado puede ser un dominio CH3 35 IgG1 humano alterado con su última lisina suprimida. La secuencia de este dominio CH3 alterado se determina en SEQ ID NO: 761.
En algunas realizaciones, un heterodímero de polipéptidos comprende un par de CH3 que comprende las denominadas mutaciones de tipo "botón en ojal" (véase Marvin y Zhu, Acta Pharmacologica Sinica 26: 649-58, 2005; 40 Ridgway y col. Protein Engineering 9: 617-21, 1966). Más específicamente, las mutaciones pueden introducirse en cada uno de los dos dominios CH3 de manera que la complementariedad estérica requerida para la asociación CH3/CH3 obliga a estos dos dominios CH3 a emparejarse entre sí. Por ejemplo, un dominio CH3 en un polipéptido de cadena única de un heterodímero de polipéptidos puede contener una mutación T366W (una mutación de tipo "botón", que sustituye un pequeño aminoácido por uno grande) y un dominio CH3 en el otro polipéptido de cadena 45 única del heterodímero de polipéptidos puede contener una mutación Y407A (una mutación de tipo "ojal", que sustituye un aminoácido grande por uno pequeño). Otras mutaciones de ejemplo de tipo “botón en ojal” incluyen (1) una mutación T366Y en un dominio CH3 y a Y407T en el otro dominio CH3, y (2) una mutación T366W en un dominio CH3 y mutaciones T366S, L368A y Y407V en el otro dominio CH3.
50
El dominio CH4 que puede formar una parte de región Fc de un polipéptido de cadena única de un heterodímero de la presente descripción puede ser un dominio CH4 de inmunoglobulinas natural o un dominio CH4 de inmunoglobulinas alterado de los mismos a partir de moléculas IgE o IgM. En algunas realizaciones, el dominio CH4 es un dominio CH4 de inmunoglobulinas natural, tal como dominios CH4 naturales de moléculas IgE e IgM humanas tal como se determina en SEQ ID NO: 213 y 214, respectivamente. En algunas realizaciones, un dominio CH4 es un 55 dominio CH4 de inmunoglobulinas humano alterado, tal como un dominio CH4 alterado basado en o derivado de un dominio CH4 de moléculas IgE o IgM humanas, que tienen mutaciones que aumentan o disminuyen una actividad inmunológica que se sabe asociada con una región Fc de IgE o IgM Fc.
En algunas realizaciones, una parte del dominio constante de la región Fc en heterodímeros de la presente descripción comprende una combinación de dominios CH2, CH3 o CH4 (es decir, más de un subdominio constante seleccionado de entre CH2, CH3 y CH4). Por ejemplo, la parte de región Fc puede comprender dominios CH2 y CH3 o dominios CH3 y CH4. En algunas otras realizaciones, la parte de región Fc puede comprender dos dominios CH3 y no CH2 o dominios CH4 (es decir, sólo dos o más CH3). Los múltiples subdominios constantes que forman parte de 5 la región Fc pueden basarse en o derivarse de la misma molécula de inmunoglobulinas, o la misma clase o subclase de moléculas de inmunoglobulinas. En algunas realizaciones, la parte de región Fc es una CH2CH3 IgG (por ejemplo, CH2CH3 IgG1 CH2CH3, IgG2 CH2CH3 e IgG4) y puede ser una CH2CH3 humana (por ejemplo, IgG1, IgG2 e IgG4 humanas). Por ejemplo, en algunas realizaciones, la parte de región Fc comprende (1) dominios CH2 y CH3 IgG1 humanos naturales, (2) CH2 IgG1 humano con sustitución de N297A (es decir, CH2(N297A)) y CH3 IgG1 10 humano natural, o (3) CH2 IgG1 humano (N297A) y un CH3 IgG1 humano alterado con la última lisina suprimida.
Alternativamente, los múltiples subdominios constantes pueden basarse en o derivarse de diferentes moléculas de inmunoglobulinas, o diferentes clases o subclases de moléculas de inmunoglobulinas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una parte de región Fc comprende un dominio CH3 IgM humano y un dominio CH3 IgG1 humano. Los 15 múltiples subdominios constantes que forman parte de la región Fc pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos entre sí por medio de uno o más (por ejemplo, aproximadamente 2-10) aminoácidos.
Las partes de región Fc de ejemplo se determinan en SEQ ID NO: 305-309, 321, 323, 341, 342 y 762.
20
En algunas realizaciones, las partes de la región Fc de los dos polipéptidos de cadena única de un heterodímero de polipéptidos son idénticas entre sí. En algunas otras realizaciones, la parte de región Fc de un polipéptido de cadena única de un heterodímero de polipéptidos es diferente de la parte de región Fc del otro polipéptido de cadena única del heterodímero. Por ejemplo, una parte de la región Fc puede contener un dominio CH3 con una mutación de tipo "botón", mientras que la otra parte de la región Fc puede contener un dominio CH3 con una mutación de tipo "ojal". 25
Bisagra
Una región bisagra contenida en un polipéptido de cadena única de un heterodímero de polipéptidos de acuerdo con la presente descripción puede esta situada (a) inmediatamente en el extremo amino de una parte de región Fc (por 30 ejemplo, dependiendo del isotipo, el extremo amino de un dominio CH2 donde la parte de región Fc es una CH2CH3, o el extremo amino de un dominio CH3 donde la parte de región Fc es una CH3CH4), (b) interpuesta entre y en conexión con un dominio de unión (por ejemplo, scFv) y un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas, (c) interpuesta entre y en conexión con un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas y una parte de región Fc (por ejemplo, donde la parte de región Fc es un CH2CH3 o un CH3CH4, dependiendo del isotipo o isotipos), (d) 35 interpuesta entre y en conexión con una parte de región Fc y un dominio de unión, (e) en el extremo amino del polipéptido de cadena única, o (f) en el extremo carboxilo del polipéptido de cadena única. El polipéptido de cadena única que comprende una región bisagra tal como se describe en la presente memoria descriptiva será capaz de asociarse con un polipéptido de fusión de cadena única diferente para formar un heterodímero de polipéptidos proporcionado en la presente memoria descriptiva, y el heterodímero de polipéptidos formado contendrá un dominio 40 de unión que conserva su especificidad de diana o su afinidad de unión específica a la diana.
En algunas realizaciones, una bisagra presente en un polipéptido de cadena única que forma un heterodímero de polipéptidos con otro polipéptido de cadena única puede ser una región bisagra de inmunoglobulinas, tal como una región bisagra de inmunoglobulinas natural o una región bisagra de inmunoglobulinas alterada del mismo. 45
En algunas realizaciones, una bisagra es una región bisagra de inmunoglobulinas humana natural (por ejemplo, regiones bisagra de inmunoglobulinas humanas tal como se determina en SEQ ID NO: 215-221). En algunas otras realizaciones, puede añadirse uno o más restos de aminoácidos en el extremo amino o carboxilo de una región bisagra de inmunoglobulinas natural como parte de un diseño de construcción de proteínas de fusión. Por ejemplo, 50 los restos de aminoácidos de unión adicionales en la bisagra en el extremo amino pueden ser "RT”, "RSS”, "TG” o "T", o en la bisagra en el extremo carboxilo pueden ser "SG", o puede combinarse una deleción de bisagra con una adición, tal como ΔΡ con "SG" añadido en el extremo carboxilo.
En algunas realizaciones, una bisagra es una bisagra de inmunoglobulinas alterada donde uno o más restos de 55 cisteínas en una región bisagra de inmunoglobulinas natural están sustituidos por uno o más restos de aminoácidos (por ejemplo, serina o alanina). Por ejemplo, una bisagra puede ser una bisagra de inmunoglobulinas alterada basada en o derivada de una bisagra IgG1 natural tal como se determina en SEQ ID NO: 667, que desde el extremo amino al extremo carboxilo comprende la región bisagra superior (EPKSCDKTHT, SEQ ID NO: 227) y la región bisagra central (CPPCP, SEQ ID NO: 228). Las bisagras de inmunoglobulinas alteradas de ejemplo incluyen una región bisagra de IgG1 humana que tiene uno, dos o tres restos de cisteínas encontrados en una bisagra IgG1 natural sustituida por uno, dos o tres restos de aminoácidos diferentes (por ejemplo, serina o alanina). Una bisagra de inmunoglobulinas alterada puede tener además una prolina sustituida por otro aminoácido (por ejemplo, serina o alanina). Por ejemplo, la bisagra IgG1 humana alterada descrita anteriormente puede tener además una prolina 5 situada en el extremo carboxilo en las tres cisteínas de región bisagra IgG1 natural sustituidas por otro resto de aminoácidos (por ejemplo, serina, alanina). En una realización, las prolinas de la región bisagra central no están sustituidas. Las bisagras de inmunoglobulinas alteradas de ejemplo se determinan en SEQ ID NO: 229-240, 255, 664-677 y 748-759. Un ejemplo de una bisagra IgG1 alterada es una bisagra IgG1 humana alterada donde la primera cisteína está sustituida por serina. La secuencia de esta bisagra IgG1 alterada se determina en SEQ ID NO: 10 664, y es referida como "bisagra SCC-P de IgG1 humana" o "bisagra SCC-P”. En algunas realizaciones, puede añadirse uno o más restos de aminoácidos (por ejemplo, "RT”, "RSS” o "T") en el extremo amino o carboxilo de una región bisagra de inmunoglobulinas mutada como parte de un diseño de construcción de proteínas de fusión.
En algunas realizaciones, un polipéptido de bisagra comprende o es una secuencia que es al menos el 80%, al 15 menos el 81%, al menos el 82%, al menos el 83%, al menos el 84%, al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a una región bisagra de inmunoglobulinas natural, tal como una bisagra IgG1 humana natural, una bisagra IgG2 humana natural o una bisagra IgG4 humana natural. 20
En realizaciones adicionales, una bisagra presente en un polipéptido de cadena única que forma un heterodímero de polipéptidos con otro polipéptido de cadena única puede ser una bisagra que no se basa en o se deriva de una bisagra de inmunoglobulinas (es decir, no es una bisagra de inmunoglobulinas natural o una bisagra de inmunoglobulinas alterada). Estos tipos de bisagras no basadas en inmunoglobulinas pueden usarse en o cerca del 25 extremo carboxilo (por ejemplo, situadas en el extremo carboxilo de las partes de la región Fc) de los polipéptidos de cadena única que forman los heterodímeros de polipéptidos. Los ejemplos para dichas bisagras incluyen péptidos de aproximadamente cinco a aproximadamente 150 aminoácidos de la región de interdominio o tallo de moléculas CD o lectinas C de tipo II, por ejemplo, péptidos de aproximadamente ocho a 25 aminoácidos y péptidos de aproximadamente siete a 18 aminoácidos, y derivados de los mismos. 30
La "región de tallo o interdominio" de una molécula CD o una lectina C de tipo II se refiere a la parte del dominio extracelular de la molécula CD o la lectina C de tipo II que está situada en el dominio de tipo lectina de tipo C (CTLD; por ejemplo, similar a CTLD de receptores de células citolíticas naturales) y el dominio de transmembrana. Por ejemplo, en la molécula CD94 humana (GenBank nº de acceso AAC50291.1, PRI 30 de noviembre de 1995), el 35 dominio extracelular corresponde a restos de aminoácidos 34-179, mientras que el CTLD corresponde a restos de aminoácidos 61-176. En consecuencia, la región de tallo o interdominio de la molécula CD94 humana incluye restos de aminoácidos 34-60, que se encuentran entre la membrana y el CTLD (véase Boyington y col., Immunity 10: 75, 1999; para descripciones de otras regiones de tallo, véase también Beavil y col., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89: 753, 1992; y Figdor y col. Nature Rev. Immunol. 2: 77, 2002). Estas moléculas CD o lectinas C de tipo II pueden tener 40 también de seis a 10 aminoácidos de unión entre la región de tallo y la región de transmembrana o el CTLD. En otro ejemplo, la proteína NKG2A humana de 233 aminoácidos (GenBank nº de acceso P26715.1, PRI 15 de junio de 2010) tiene un dominio de transmembrana formado por los aminoácidos 71-93 y un dominio extracelular formado por los aminoácidos 94-233. El CTLD está formado por los aminoácidos 119-231, y la región de tallo comprende los aminoácidos 99-116, que están flanqueados por uniones de cinco y dos aminoácidos. Otras moléculas CD y lectinas 45 C de tipo II, así como sus dominios de unión a ligandos extracelulares, regiones de tallo o interdominio, y CTLD son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, GenBank nº de acceso. NP 001993.2; AAH07037.1, PRI 15 de julio 2006; NP 001773.1, PRI 20 de junio de 1010; AAL65234.1, PRI 17 de enero de 2002 y CAA04925.1, PRI 14 de noviembre de 2006, para las secuencias de CD23, CD69, CD72, NKG2A y NKG2D humanas y sus descripciones, respectivamente). 50
Un "derivado" de una región de tallo o interdominio, o un fragmento del mismo, de una molécula CD o lectina C de tipo II incluye una secuencia de aproximadamente ocho a aproximadamente 150 aminoácidos donde uno, dos o tres aminoácidos de la región de tallo de una molécula CD o lectina C de tipo II natural tiene una deleción, inserción, sustitución o cualquier combinación de las mismas, por ejemplo, el uno o más cambios son sustituciones o la una o 55 más mutaciones incluyen sólo una deleción. En realizaciones adicionales, un derivado de una región de tallo o interdominio es más resistente a la escisión proteolítica que la secuencia de región de tallo o interdominio natural, tal como las derivadas de aproximadamente ocho a aproximadamente 20 aminoácidos de NKG2A, NKG2D, CD23, CD64, CD72 o CD94.
En algunas realizaciones, las bisagras de regiones de tallo o interdominio tienen de siete a 18 aminoácidos y pueden formar una estructura espiral enrollada de hélice α. En algunas realizaciones, las bisagras de regiones de tallo o interdominio contienen 0, 1, 2, 3 ó 4 cisteínas. Las bisagras de regiones de tallo o interdominio de ejemplo son fragmentos de péptidos de las regiones de tallo o interdominio, por ejemplo de diez a 150 fragmentos de 5 aminoácidos de las regiones de tallo de CD69, CD72, CD94, NKG2A y NKG2D, tal como se determina en SEQ ID NO: 241-244, 716 y 601. Las bisagras de regiones de tallo o interdominio adicionales de ejemplo incluyen las determinadas en SEQ ID NO: 78, 734-737, 742-747, y 766-790.
Las bisagras alternativas que pueden usarse en polipéptidos de cadena única de heterodímeros de polipéptidos 10 proceden de partes de receptores de superficie celular (regiones interdominio) que conectan dominios de tipo V de inmunoglobulinas o dominios de tipo C de inmunoglobulinas. Las regiones entre dominios de tipo V de Ig donde el receptor de superficie celular contiene múltiples dominios de tipo V de Ig en tándem y entre dominios de tipo C de Ig donde el receptor de superficie celular contiene múltiples regiones de tipo C de Ig en tándem también se contemplan como bisagras útiles en los polipéptidos de cadena única de heterodímeros de polipéptidos. En algunas 15 realizaciones, las secuencias bisagra formadas por regiones interdominio de receptores de superficie celular pueden contener además un motivo añadido o de ocurrencia natural, tal como una secuencia bisagra central de IgG que confiere uno o más enlaces de disulfuro para estabilizar la formación del heterodímero de polipéptidos. Los ejemplos de bisagras incluyen regiones interdominio entre las regiones de tipo V de Ig y las regiones de tipo C de Ig de CD2, CD4, CD22, CD33, CD48, CD58, CD66, CD80, CD86, CD150, CD166 y CD244. 20
En algunas realizaciones, las secuencias bisagra tienen aproximadamente de 5 a 150 aminoácidos, de 5 a 10 aminoácidos, de 10 a 20 aminoácidos, de 20 a 30 aminoácidos, de 30 a 40 aminoácidos, de 40 a 50 aminoácidos, de 50 a 60 aminoácidos, de 5 a 60 aminoácidos, de 5 a 40 aminoácidos, de 8 a 20 aminoácidos o de 10 a 15 aminoácidos. La bisagra puede ser principalmente flexible, pero también puede proporcionar características más 25 rígidas o puede contener principalmente un estructura helicoidal mínima de láminas β. Las longitudes o las secuencias de las bisagras pueden influir en las afinidades de unión de los dominios de unión a las que están conectadas las bisagras directa o indirectamente (por medio de otra región o dominio, tal como un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas) así como una o más actividades de las partes de la región Fc a las que están conectadas las bisagras directa o indirectamente (véase Ejemplos 9 y 10). 30
En algunas realizaciones, las secuencias bisagra son estables en plasma y suero y son resistentes a la escisión proteolítica. La primera lisina en la región bisagra superior de IgG1 puede estar mutada para reducir al mínimo la escisión proteolítica, por ejemplo, la lisina puede sustituirse por metionina, treonina, alanina o glicina, o estar suprimida (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 379-434, que pueden incluir aminoácidos de unión en el extremo amino 35 tales como RT).
En algunas realizaciones, las secuencias bisagra pueden un motivo añadido o de ocurrencia natural tal como una estructura central de bisagras de inmunoglobulinas CPPCP (SEQ ID NO: 228) que confiere la capacidad de formar un enlace de disulfuro o múltiples enlaces de disulfuro para estabilizar el extremo carboxilo de una molécula. En 40 otras realizaciones, las secuencias bisagra pueden contener uno o más sitios de glucosilación.
Las bisagras de ejemplo, que incluyen bisagras de inmunoglobulinas alteradas, se determinan en SEQ ID NO: 379-434, 618-749 y 763-791.
45
En algunas realizaciones, un polipéptido de cadena única de un heterodímero de polipéptidos de acuerdo con la presente descripción comprende más de una bisagra. Por ejemplo, un polipéptido de cadena única que tiene dos dominios de unión, uno de ellos en el extremo amino y el otro en el extremo carboxilo, puede tener dos bisagras. Una bisagra puede estar conectada directa o indirectamente (por ejemplo, por medio de un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas) con el dominio de unión en o cerca del extremo amino, y la otra bisagra 50 puede estar conectada (por ejemplo, conectada directamente) con el otro dominio de unión en o cerca del extremo carboxilo. En algunas realizaciones, incluso si un polipéptido de cadena única tiene sólo un dominio de unión, puede tener más de una bisagra, por ejemplo, en su extremo amino o en su extremo carboxilo. Dicha bisagra puede interaccionar con una bisagra correspondiente en la otra cadena del heterodímero, por ejemplo, formando uno o más enlaces de disulfuro entre cadenas, para facilitar o potenciar la heterodimerización de las dos cadenas. Una bisagra 55 (H-I) de una SCP-I de un heterodímero de polipéptidos "corresponde a" una bisagra (H-II) de una SCP-II del heterodímero cuando H-I y H-II se sitúan en el mismo extremo de la parte de región Fc de su polipéptido de cadena única respectivo. Por ejemplo, un heterodímero de polipéptidos puede comprender los dos polipéptidos de cadena única siguientes: un primer polipéptido de cadena del extremo amino al extremo carboxilo comprende un primer dominio de unión, CH1, bisagra, CH2 y CH3, y un segundo polipéptido de cadena del extremo amino al extremo carboxilo comprende una CK, primera bisagra, CH2, CH3, segunda bisagra y un segundo dominio de unión. La bisagra en la primera cadena se vería como "correspondiente" a la primera bisagra de la segunda cadena dado que las dos están en el extremo amino en las partes de la región Fc a la que están conectadas.
5
En algunas realizaciones donde un polipéptido de cadena única de un heterodímero de polipéptidos comprende un dominio de unión en o cerca de su extremo carboxilo, puede estar presente una bisagra para unir el dominio de unión con otra parte del polipéptido de cadena única (por ejemplo, una parte de región Fc o un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas). En una realización, dicha bisagra es una bisagra no de inmunoglobulinas (es decir, una bisagra no basada en o derivada de una bisagra de inmunoglobulinas natural) y puede ser una región 10 de tallo de una molécula CD o lectina C de tipo II, una región de interdominio que conecta dominios de tipo V de Ig o dominios de tipo C de Ig de un receptor de superficie celular, o un derivado o variante funcional de los mismos. Las bisagras del extremo carboxilo de ejemplo, referidas a veces como bisagras “de extremo trasero”, incluyen las determinadas en SEQ ID NO: 78, 734-737, 742-747 y 766-790.
15
En algunas realizaciones, una bisagra de un polipéptido de cadena única de un heterodímero de polipéptidos es idéntica a una bisagra correspondiente del otro polipéptido de cadena única del heterodímero. En algunas otras realizaciones, una bisagra de una cadena es diferente de la de la otra cadena (en longitud o secuencia). Las bisagras diferentes en las diferentes cadenas permiten una manipulación distinta de las afinidades de unión de los dominios de unión a los que están conectadas las bisagras, de manera que el heterodímero puede unirse 20 preferentemente a la diana de un dominio de unión sobre la diana del otro dominio de unión. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un heterodímero de polipéptidos tiene un dominio de unión CD3 o TCR en una cadena y un dominio de unión de antígeno tumoral en otra cadena. Al tener dos bisagras diferentes en las dos cadenas se permite que el heterodímero se una primero al antígeno tumoral, y después a la molécula CD3 o TCR. Así, el heterodímero puede reclutar linfocitos T CD3+ en las células tumorales que llevan el antígeno tumoral, lo que a su 25 vez puede dañar o destruir las células tumorales.
Otros componentes o modificaciones
En algunas realizaciones, un polipéptido de cadena única que forma un heterodímero con otro polipéptido de cadena 30 única puede contener uno o más dominios o regiones adicionales. Dichas regiones adicionales pueden ser una secuencia delantera (también referida como "péptido de señal") en el extremo amino para la secreción de un polipéptido de cadena única expresado. Los péptidos delanteros de ejemplo de la presente descripción incluyen secuencias delanteras naturales u otras, tal como las determinadas en SEQ ID NO: 110 y 111.
35
Las regiones adicionales pueden ser también secuencias en el extremo carboxilo para identificar o purificar polipéptidos de cadena única (por ejemplo, etiquetas de epítopos para detección o purificación, tal como una etiqueta de histidina, biotina, un epítopo FLAG® o cualquier combinación de los mismos).
Las regiones opcionales adicionales pueden ser restos de aminoácidos adicionales (referidos como "aminoácidos de 40 unión" o "restos de aminoácidos de unión") que tienen una longitud de 1 a aproximadamente 10 aminoácidos (por ejemplo, de aproximadamente 2 a 5 aminoácidos), que pueden derivarse del uso de sistemas de expresión específicos o diseño de construcciones para los polipéptidos de cadena única de la presente descripción. Dichos restos de aminoácidos adicionales (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos adicionales) pueden estar presentes en el extremo amino o carboxilo o entre varias regiones o dominios de un polipéptido de cadena 45 única, tal como entre un dominio de unión y un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas, entre un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas y una bisagra, entre una bisagra y una parte de región Fc, entre dominios de una parte de región Fc (por ejemplo, entre dominios CH2 y CH3 o entre dos dominios CH3), entre un dominio de unión y una bisagra, entre una parte de región Fc y un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas, o entre un dominio variable y un conector. Los aminoácidos de unión en terminal amino a una 50 bisagra de ejemplo incluyen RDQ (SEQ ID NO: 598), RT, SS, SASS (SEQ ID NO: 599) y SSS (SEQ ID NO: 600). Los aminoácidos de unión de ejemplo en el terminal carboxilo a una bisagra incluyen aminoácidos SG. Los aminoácidos de unión de ejemplo adicionales incluyen SR.
En algunas realizaciones, los aminoácidos de unión están presentes entre una parte de región Fc que comprende 55 dominios CH2 y CH3 y un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas (CH1 o CL). Estos aminoácidos de unión se refieren también como "conector entre CH3 y CH1 o CL" si están presentes entre el extremo C de CH3 y el extremo N de CH1 o CL. Dicho conector puede tener aproximadamente 2-12 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, la parte de región Fc comprende dominios CH2 y CH3 IgG1 humanos donde el resto de lisina en el extremo C de CH3 IgG1 humano está suprimido. Los conectores de ejemplo entre CH3 y CH1 incluyen los determinados por SEQ ID NO: 847-849. Los conectores de ejemplo entre CH3 y Cκ incluyen los determinados en SEQ ID NO: 850-852 (donde el extremo carboxilo arginina en los conectores puede verse alternativamente como la primera arginina de Cκ). En algunas realizaciones, la presencia de dichos conectores o pares de conectores (por ejemplo, SEQ ID NO: 847 como conector CH3-CH1 en un polipéptido de cadena única de un heterodímero y SEQ ID 5 NO: 850 como conector CH3-Cκ en el otro polipéptido de cadena única del heterodímero; SEQ ID NO: 848 como conector CH3-CH1 y SEQ ID NO: 851 como conector CH3-Cκ; y SEQ ID NO: 849 como conector CH3-CH1 y SEQ ID NO: 852 como conector CH3-Cκ) mejora la producción de heterodímero en comparación con la presencia de un conector de referencia tal como se determina en SEQ ID NO: 846 (donde la última lisina de CH3 se incluye como parte del conector) en los dos polipéptidos de cadena única de un heterodímero. 10
En algunas realizaciones, una región Fc de inmunoglobulinas (por ejemplo, regiones CH2, CH3 y/o CH4) de un heterodímero de polipéptidos de la presente descripción puede tener un patrón de glucosilación alterado con respecto a una secuencia de referencia de inmunoglobulinas. Por ejemplo, puede emplearse cualquiera de una variedad de técnicas genéticas para modificar uno o más restos de aminoácidos en particular que forman un sitio de 15 glucosilación (véase Co y col. (1993) Mol. Immunol. 30: 1361; Jacquemon y col. (2006) J. Thromb. Haemost. 4: 1047; Schuster y col. (2005) Cancer Res. 65: 7934; Warnock y col. (2005) Biotechnol. Bioeng. 92: 831), tal como N297 del dominio CH2 (numeración EU). Alternativamente, las células hospedadoras que producen heterodímeros de polipéptidos de la presente descripción pueden diseñarse para producir un patrón de glucosilación alterado. Un procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, proporciona glucosilación alterada en forma de variantes 20 bisecadas no fucosiladas que aumentan el valor de ADCC. Las variantes proceden de la expresión en una célula hospedadora que contiene una enzima modificadora de oligosacáridos. Alternativamente, se contempla que la tecnología POTELLIGENT® de BioWa/Kyowa Hakko reduce el contenido de fucosa de moléculas glucosiladas de acuerdo con la presente descripción. En un procedimiento conocido, se proporciona una célula hospedadora CHO para producción de inmunoglobulinas que modifica el patrón de glucosilación de la región Fc de inmunoglobulinas, a 25 través de la producción de GDP-fucosa.
Alternativamente, se usan técnicas químicas para modificar el patrón de glucosilación de heterodímeros de polipéptidos de la presente descripción. Por ejemplo, una variedad de inhibidores de glucosidasa y/o manosidasa proporciona uno o más de los efectos deseados de la mayor actividad ADCC, el aumento de la unión a receptores 30 Fc y la alteración del patrón de glucosilación. En algunas realizaciones, las células que expresan heterodímeros de polipéptidos de la presente descripción se desarrollan en un medio de cultivo que comprende un modificador de hidratos de carbono a una concentración que aumenta el valor de ADCC de moléculas de inmunoglucoproteínas producidas por dicha célula hospedadora, donde dicho modificador de hidratos de carbono está a una concentración de menos de 800 μΜ. En una realización, las células que expresan estos heterodímeros de polipéptidos se cultivan 35 en un medio de cultivo que comprende castanospermina o kifunensina, por ejemplo, castanospermina a una concentración de 100-800 μΜ, tal como 100 μΜ, 200 μΜ, 300 μΜ, 400 μΜ, 500 μΜ, 600 μΜ, 700 μΜ o 800 μΜ. Los procedimientos para modificar la glucosilación con un modificador de hidratos de carbono tal como castanospermina se proporcionan en la patente de EE.UU. nº 7.846.434 o la publicación PCT nº WO-2008/052.030.
40
Disposiciones estructurales y heterodímeros de ejemplo
Para formar un heterodímero de polipéptidos de acuerdo con la presente invención, se diseñan dos polipéptidos de cadena única de manera que el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del primer polipéptido de cadena única se alinea adecuadamente e interacciona con el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas 45 del segundo polipéptido de cadena única. En algunas realizaciones, el heterodímero puede comprender un segundo par de dominios de heterodimerización de inmunoglobulinas para facilitar o mejorar la heterodimerización de las dos cadenas. En algunas realizaciones, además de la interacción entre los dos dominios de heterodimerización de inmunoglobulinas, una parte de región Fc (por ejemplo, un dominio CH3) en la primera cadena puede interaccionar con una región Fc en la segunda cadena para potenciar la heterodimerización (por ejemplo, por medio de la 50 interacción entre dos dominios CH3 naturales o entre un par de dominios CH3 con mutaciones de tipo "botón en ojal"). Por otra parte, en algunas realizaciones, la bisagra en la primera cadena (por ejemplo, una bisagra IgG1 humana alterada con dos restos de cisteínas tal como se determina en SEQ ID NO: 664) puede interaccionar con la bisagra en la segunda cadena (por ejemplo, la misma bisagra IgG1 humana alterada tal como se determina en SEQ ID NO: 664) para formar, por ejemplo, enlaces de disulfuro, que pueden reforzar adicionalmente la interacción entre 55 los polipéptidos de cadena única primero y segundo para formar un heterodímero de polipéptidos de la presente descripción. Además, en algunas realizaciones, las cadenas primera y segunda pueden comprender un segundo par de bisagras (por ejemplo, en los extremos carboxilo de las dos cadenas) con el fin de potenciar adicionalmente las interacciones entre las dos cadenas.
En algunas realizaciones, un heterodímero de polipéptidos de la presente descripción comprende dos dominios de unión (BD1 y BD2), donde los dominios de unión se unen a dos moléculas diana diferentes. En algunas realizaciones, los dos dominios de unión (BD1 y BD2) están en SCP-I con el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas (HD-I) y la parte de región Fc (FRP-1) dispuesta entre BD1 y BD2. En algunas otras realizaciones, 5 el primer dominio de unión (BD1) está en SCP-I y el segundo dominio de unión (BD2) está en SCP-II. En algunas realizaciones, BD1 y BD2 están en el extremo amino en la parte de región Fc de SCP-I y SCP-II, respectivamente. En algunas otras realizaciones, BD1 está en el extremo amino en la parte de región Fc de SCP-I y BD2 está en el extremo carboxilo en la parte de región Fc de SCP-II. En algunas otras realizaciones, BD1 está en el extremo carboxilo en la parte de región Fc de SCP-I y BD2 está en el extremo amino en la parte de región Fc de SCP-II. En 10 algunas otras realizaciones, BD1 y BD2 están en el extremo carboxilo en la parte de región Fc de SCP-I y SCP-II, respectivamente.
En algunas realizaciones, un heterodímero de polipéptidos comprende tres dominios de unión (BD1, BD2 y BD3), donde los dominios de unión se unen a dos o tres moléculas diana diferentes. Por ejemplo, BD1, BD2 y BD3 se unen 15 cada uno a una diana diferente, o BD1 y BD2 se unen a una primera diana mientras que BD3 se une a una segunda diana, o BD1 y BD3 se unen a una primera diana mientras BD2 se une a una segunda diana, o BD2 y BD3 se unen a una primera diana mientras BD1 se une a una segunda diana. En algunas realizaciones, el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas y la parte de región Fc están dispuestos entre BD1 y BD2 en SCP-I, y BD3 está en el extremo amino en la parte de región Fc de SCP-II. En realizaciones adicionales, el dominio de 20 heterodimerización de inmunoglobulinas y la parte de región Fc están dispuestos entre BD1 y BD2 en SCP-II, y BD3 está en el extremo carboxilo en la parte de región Fc de SCP-I.
En algunas realizaciones, un heterodímero de polipéptidos comprende cuatro dominios de unión (BD1, BD2, BD3 y BD4), donde los dominios de unión se unen a entre dos y cuatro moléculas diana diferentes. En algunas 25 realizaciones, el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas y parte de la región Fc del SCP-I están dispuestos entre BD1 y BD2, y el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas y parte de la región Fc de SCP-II están dispuestos entre BD3 y BD4.
En algunas realizaciones, un heterodímero de polipéptidos comprende cinco dominios de unión (BD1, BD2, BD3, 30 BD4 y BD5), donde los dominios de unión se unen a entre dos y cuatro moléculas diana diferentes. En algunas realizaciones, SCP-I comprende tres dominios de unión (BD1, BD2 y BD3), y SCP-II comprende dos dominios de unión (BD4 y BD5). En realizaciones adicionales, BD1 y BD2 pueden estar, por ejemplo, ligadas en tándem entre sí (directamente o por medio de un conector peptídico de aproximadamente dos a ocho aminoácidos) en el extremo amino (o carboxilo) de SCP-I con BD3 situado en el extremo carboxilo (o amino) de SCP-I o SCP-II, donde BD4 y 35 BD5 están en SCP-II si BD3 está en SCP-I, o BD4 o BD5 están en SCP-I si BD3 está en SCP-II.
En otras realizaciones adicionales, el heterodímero de polipéptidos comprende seis dominios de unión (BD1-BD6). En algunas realizaciones, SCP-I y SCP-II comprenden cada uno tres dominios de unión (por ejemplo, BD1-BD3 en SCP-I, y BD4-BD6 en SCP-II). En dichas realizaciones, por ejemplo, BD1 y BD2 pueden estar unidas en tándem y 40 situadas en el extremo amino (o carboxilo) de SCP-I, y BD3 puede estar situado en el extremo carboxilo (o amino) de SCP-I. De forma similar, BD4 y BD5 pueden unirse en tándem y estar situados en el extremo amino (o carboxilo) de SCP-II, y BD6 puede estar situado en el extremo carboxilo (o amino) de SCP-II. En algunas otras realizaciones, el primer polipéptido de cadena única (SCP-I) comprende cuatro dominios de unión (BD1-BD4) y el segundo polipéptido de cadena única (SCP-II) comprende dos dominios de unión (BD5 y BD6). En dichas realizaciones, BD1 45 y BD2 pueden estar unidos en tándem y situados en o cerca del extremo amino de SCP-I, BD3 y BD4 pueden estar unidos en tándem y situado en o cerca del extremo carboxilo de SCP-I, y BD5 y BD6 pueden estar situados en o cerca de los extremos amino y carboxilo de SCP-II, respectivamente.
En algunas realizaciones, el heterodímero de polipéptidos comprende siete dominios de unión (BD1-BD7). En dichas 50 realizaciones, SCP-I puede comprender cuatro dominios de unión (BD1-BD4), y SCP-II puede comprender los otros tres dominios de unión (BD5-BD7). Por ejemplo, BD1 y BD2 pueden estar unidos en tándem y situados en o cerca del extremo amino de SCP-I, y BD3 y BD4 pueden estar unidos en tándem y situados en o cerca del extremo carboxilo de SCP-II. BD5 y BD6 pueden estar unidos en tándem y situados en o cerca del extremo amino (o carboxilo) de SCP-II, y BD7 pueden estar situados en o cerca del extremo carboxilo (o amino) de SCP-II. 55
En algunas realizaciones, el heterodímero de polipéptidos comprende ocho dominios de unión (BD1-BD8). En dichas realizaciones, los polipéptidos de cadena única primero y segundo pueden comprender cada uno cuatro dominios de unión. En cada cadena, dos dominios de unión pueden estar situados en o cerca del extremo amino, y los otros dos dominios de unión estar situados en o cerca del extremo carboxilo.
Para simplificar la descripción de cómo pueden disponerse diversos componentes para formar polipéptidos de cadena única primero y segundo que forman heterodímeros de polipéptidos de la presente descripción, a continuación se proporcionan las disposiciones en las realizaciones de ejemplo (1) a (50) donde sólo se incluyen dos 5 dominios de unión en cada heterodímero.
En la realización (1), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una región CH1, una bisagra y una parte de región Fc; y un segundo polipéptido de cadena única 10 que comprende un segundo dominio de unión, una región CL (por ejemplo, Cκ, Cλ), una bisagra y una parte de región Fc.
En la realización (2), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer 15 dominio de unión, una bisagra, una parte de región Fc y una región CH1; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende un segundo dominio de unión, una bisagra, una parte de región Fc y una región CL.
En la realización (3), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer 20 dominio de unión, una región CH1, una bisagra, una parte de región Fc y una segunda región CH1; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende un segundo dominio de unión, una región CL, una bisagra, una parte de región Fc y una segunda región CL.
En la realización (4), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: 25 desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una región CH1, una segunda región CH1, una bisagra y una parte de región Fc; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende un segundo dominio de unión, una región CL, una segunda región CL, una bisagra y una parte de región Fc.
30
En la realización (5), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una bisagra, una parte de región Fc, una región CH1 y una segunda región CH1; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende un segundo dominio de unión, una bisagra, una parte de región Fc, una región CL y una segunda región CL. 35
En la realización (6), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende una región CH1, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda bisagra y un primer dominio de unión; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende una región CL, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda 40 bisagra y un segundo dominio de unión.
En la realización (7), se forma un heterodímero de polipéptidos a partir de los dos siguientes polipéptidos de cadena única: desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende una bisagra, una parte de región Fc, una región CH1, una segunda bisagra y un primer dominio de unión; y un segundo 45 polipéptido de cadena única que comprende una bisagra, una parte de región Fc, una región CL, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión.
En la realización (8), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende una región 50 CH1, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda región CH1, una segunda bisagra y un primer dominio de unión; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende una región CL, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda región CL, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión.
En la realización (9), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: 55 desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende una región CH1, una segunda región CH1, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda bisagra y un primer dominio de unión; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende una región CL, una segunda región CL, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión.
En la realización (10), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende una bisagra, una parte de región Fc, una región CH1, una segunda región CH1, una segunda bisagra y un primer dominio de unión; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende una bisagra, una parte de región Fc, una región 5 CL, una segunda región CL, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión.
En la realización (11), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una región CL, una bisagra y una parte de región Fc; y un segundo polipéptido de cadena única 10 que comprende un segundo dominio de unión, una región CH1, una bisagra y una parte de región Fc.
En la realización (12), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una bisagra, una parte de región Fc y una región CL; y un segundo polipéptido de cadena única 15 que comprende un segundo dominio de unión, una bisagra, una parte de región Fc y una región CH1.
En la realización (13), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una región CL, una bisagra, una parte de región Fc y una segunda región CL; y un segundo 20 polipéptido de cadena única que comprende un segundo dominio de unión, una región CH1, una bisagra, una parte de región Fc y una segunda región CH1.
En la realización (14), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer 25 dominio de unión, una región CL, una segunda región CL, una bisagra y una parte de región Fc; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende un segundo dominio de unión, una región CH1, una segunda región CH1, una bisagra y una parte de región Fc.
En la realización (15), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: 30 desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una bisagra, una parte de región Fc, una región CL y una segunda región CL; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende un segundo dominio de unión, una bisagra, una parte de región Fc, una región CH1 y una segunda región CH1.
35
En la realización (16), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende una región CL, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda bisagra y un primer dominio de unión; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende una región CH1, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión. 40
En la realización (17), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende una bisagra, una parte de región Fc, una región CL, una segunda bisagra y un primer dominio de unión; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende una bisagra, una parte de región Fc, una región CH1, una segunda bisagra y un 45 segundo dominio de unión.
En la realización (18), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende una región CL, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda región CL, una segunda bisagra y un primer dominio de unión; y 50 un segundo polipéptido de cadena única que comprende una región CH1, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda región CH1, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión.
En la realización (19), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende una región CL, 55 una segunda región CL, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda bisagra y un primer dominio de unión; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende una región CH1, una segunda región CH1, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión.
En la realización (20), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende una bisagra, una parte de región Fc, una región CL, una segunda región CL, una segunda bisagra y un primer dominio de unión; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende una bisagra, una parte de región Fc, una región CH1, una segunda región CH1, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión. 5
En la realización (21), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una región CH1, una bisagra, una parte de región Fc y una región CL; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende un segundo dominio de unión, una región CL, una bisagra, una parte de región Fc y 10 una región CH1.
En la realización (22), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una región CL, una bisagra, una parte de región Fc y una región CH1; y un segundo polipéptido de 15 cadena única que comprende un segundo dominio de unión, una región CH1, una bisagra, una parte de región Fc y una región CL.
En la realización (23), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer 20 dominio de unión, una región CH1, una región CL, una bisagra y una parte de región Fc; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende un segundo dominio de unión, una región CL, una región CH1, una bisagra y una parte de región Fc.
En la realización (24), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: 25 desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una región CL, una región CH1, una bisagra y una parte de región Fc; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende un segundo dominio de unión, una región CH1, una región CL, una bisagra y una parte de región Fc.
30
En la realización (25), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una bisagra, una parte de región Fc, una región CH1 y una región CL; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende un segundo dominio de unión, una bisagra, una parte de región Fc, una región CL y una región CH1. 35
En la realización (26), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una bisagra, una parte de región Fc, una región CL y una región CH1; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende un segundo dominio de unión, una bisagra, una parte de región Fc, una región CH1 y 40 una región CL.
En la realización (27), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende una región CH1, una bisagra, una parte de región Fc, una región CL, una segunda bisagra y un primer dominio de unión; y un 45 segundo polipéptido de cadena única que comprende una región CL, una bisagra, una parte de región Fc, una región CH1, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión.
En la realización (28), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende una región CL, 50 una bisagra, una parte de región Fc, una región CH1, una segunda bisagra y un primer dominio de unión; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende una región CH1, una bisagra, una parte de región Fc, una región CL, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión.
En la realización (29), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: 55 desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende una región CH1, una región CL, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda bisagra y un primer dominio de unión; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende una región CL, una región CH1, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión.
En la realización (30), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende una región CL, una región CH1, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda bisagra y un primer dominio de unión; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende una región CH1, una región CL, una bisagra, una parte de 5 región Fc, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión.
En la realización (31), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende una bisagra, una parte de región Fc, una región CH1, una región CL, una segunda bisagra y un primer dominio de unión; y un 10 segundo polipéptido de cadena única que comprende una bisagra, una parte de región Fc, una región CL, una región CH1, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión.
En la realización (32), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: desde el extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende una bisagra, 15 una parte de región Fc, una región CL, una región CH1, una segunda bisagra y un primer dominio de unión; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende una bisagra, una parte de región Fc, una región CH1, una región CL, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión.
En la realización (33), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: 20 del extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una región CH1, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende una región CL, una bisagra, y una región Fc.
En la realización (34), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: 25 del extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una región CL, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende una región CH1, una bisagra y una parte de región Fc.
En la realización (35), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: 30 del extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una región CH1, una bisagra y una parte de región Fc; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende una región CL, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión.
35
En la realización (36), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: del extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende una región CH1, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda bisagra y un primer dominio de unión; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende un segundo dominio de unión, una región CL, una bisagra y una parte de región Fc.
40
En la realización (37), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: del extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una región CH1, una bisagra, una parte de región Fc y una segunda bisagra; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende un segundo dominio de unión, una región CL, una bisagra, una parte de región Fc y una segunda bisagra. 45
En la realización (38), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: del extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una bisagra, una parte de región Fc, una región CH1, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión; y el segundo polipéptido de cadena única que comprende una bisagra, una parte de región Fc y una región CL. 50
En la realización (39), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: del extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende una bisagra, una parte de región Fc y una región CH1; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una bisagra, una parte de región Fc, una región CL, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión. 55
En la realización (40), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: del extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una bisagra, una parte de región Fc y una región CH1; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende una bisagra, una parte de región Fc, una región CL, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión.
En la realización (41), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: del extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende una bisagra, una 5 parte de región Fc, una región CH1, una segunda bisagra y un primer dominio de unión; y el segundo polipéptido de cadena única que comprende un segundo dominio de unión, una bisagra, una parte de región Fc y una región CL.
En la realización (42), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: del extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de 10 unión, una bisagra, una parte de región Fc, una región CH1 y una segunda bisagra; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende un segundo dominio de unión, una bisagra, una parte de región Fc, una región CL y una segunda bisagra.
En la realización (43), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: 15 del extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una región CH1, una bisagra una parte de región Fc, una región CL, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión; y el segundo polipéptido de cadena única que comprende una región CL, una bisagra, una parte de región Fc y una región CH1.
20
En la realización (44), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: del extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende una región CH1, una bisagra, una parte de región Fc y una región CL; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una región CL, una bisagra, una región Fc, una región CH1, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión. 25
En la realización (45), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: del extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una región CH1, una bisagra, una parte de región Fc y una región CL; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende una región CL, una bisagra, una parte de región Fc, una región CH1, una segunda bisagra y 30 un segundo dominio de unión.
En la realización (46), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: del extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende una región CH1, una bisagra, una parte de región Fc, a CL, una segunda bisagra y un primer dominio de unión; y un segundo polipéptido 35 de cadena única que comprende un segundo dominio de unión, una región CL, una bisagra, una parte de región Fc y una región CH1.
En la realización (47), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: del extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de 40 unión, una región CH1, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda región CH1, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende una región CL, una bisagra, una parte de región Fc y una segunda región CL.
En la realización (48), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: 45 del extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende una región CH1, una bisagra, una parte de región Fc y una segunda región CH1; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una región CL, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda región CL, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión.
50
En la realización (49), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: del extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una región CH1, una bisagra, una parte de región Fc y una segunda región CH1; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende una región CL, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda región CL, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión. 55
En la realización (50), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: del extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende una región CH1, una bisagra, una parte de región Fc, una región CH1, una segunda bisagra y un primer dominio de unión; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende un segundo dominio de unión, una región CL, una bisagra, una parte de región Fc y una segunda región CL.
A continuación se proporcionan también las realizaciones de ejemplo (51) a (60) donde se incluyen tres o cuatro dominios de unión en cada heterodímero. Pueden incluirse dominios de unión adicionales para preparar 5 heterodímeros de polipéptidos que comprenden de cinco a ocho dominios de unión de acuerdo con la presente descripción a la vista de la descripción general proporcionada en la presente memoria descriptiva.
En la realización (51), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: del extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de 10 unión, una región CH1, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende un tercer dominio de unión, una región CL, una bisagra y una parte de región Fc.
En la realización (52), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: 15 del extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una región CH1, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende una región CL, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda bisagra y un tercer dominio de unión.
20
En la realización (53), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: del extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una región CL, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión; y el segundo polipéptido de cadena única que comprende un tercer dominio de unión, una región CH1, una bisagra y una parte de región Fc. 25
En la realización (54), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: del extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una región CL, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende una región CH1, una bisagra, una parte de región Fc, una 30 segunda bisagra y un tercer dominio de unión.
En la realización (55), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: del extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una bisagra, una parte de región Fc, una región CH1, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión; y 35 el segundo polipéptido de cadena única que comprende un tercer dominio de unión, una bisagra, una parte de región Fc y una región CL.
En la realización (56), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: del extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de 40 unión, una bisagra, una parte de región Fc, una región CH1, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende una bisagra, una parte de región Fc, una región CL, una segunda bisagra y un tercer dominio de unión.
En la realización (57), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: 45 del extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una bisagra, una parte de región Fc, una región CL, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende un tercer dominio de unión, una bisagra, una parte de región Fc y una región CH1.
50
En la realización (58), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: del extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión, una bisagra, una parte de región Fc, una región CL, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende una bisagra, una parte de región Fc, una región CH1, una segunda bisagra y un tercer dominio de unión. 55
En la realización (59), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: del extremo amino al extremo carboxilo: un primer dominio de unión, una región CH1, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende un tercer dominio de unión, una región CL, una bisagra, una parte de región Fc, una segunda bisagra y un cuarto dominio de unión.
En la realización (60), un heterodímero de polipéptidos comprende los dos siguientes polipéptidos de cadena única: del extremo amino al extremo carboxilo, un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de 5 unión, una bisagra, una parte de región Fc, una región CH1, una segunda bisagra y un segundo dominio de unión; y un segundo polipéptido de cadena única que comprende un tercer dominio de unión, una bisagra, una parte de región Fc, una región CL, una segunda bisagra y un cuarto dominio de unión.
En las realizaciones (1) a (32), un heterodímero de polipéptidos de la presente descripción comprende los dos 10 siguientes polipéptidos de cadena única: un primer polipéptido de cadena única que comprende un primer dominio de unión (BD1) que se une específicamente a una diana de linfocitos T (por ejemplo, un complejo TCR o un componente de los mismos, que incluye TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ y CD3ε), una bisagra que es una bisagra de IgG1 SCC-P, una parte de región Fc que es un CH2CH3 IgG1 humano natural o alterado y una región CL que es región Cκ humana natural o alterada con sustituciones N30Y V55A T70E (YAE); y un segundo polipéptido de cadena 15 única que comprende dominio de unión (BD2) que se une específicamente a una diana de linfocitos B (por ejemplo, CD19, CD79b, HLA-DR, CD37, CD20) o un antígeno tumoral o canceroso (por ejemplo, RON, c-Met, EpCAM, CEACAM-6, PSMA), una bisagra que es también una bisagra de IgG1 SCC-P, una parte de región Fc que es un CH2CH3 IgG1 humano natural o alterado y una región CH1 que es una región CH1 humana.
20
En realizaciones adicionales, un heterodímero de polipéptidos de las realizaciones (1) a (32) puede comprender además un tercer dominio de unión (BD3) que es idéntico a BD1 o BD2, y está unido a un polipéptido de cadena única por medio de una segunda bisagra (por ejemplo, conector H75 o H68 tal como se determina en SEQ ID NO: 742 y 78, respectivamente). En otras realizaciones adicionales, un heterodímero de polipéptidos de las realizaciones (1) a (32) puede comprender además terceros y cuartos dominios de unión (BD3) y (BD4) que son cada uno idéntico 25 o diferente de BD1 o BD2 y que están unidos al polipéptido o a los polipéptidos de cadena única por medio de una segunda bisagra (por ejemplo, conector H75 o H68 tal como se determina en SEQ ID NO: 742 y 78).
En algunas realizaciones, los heterodímeros de polipéptidos de la presente descripción pueden diseñarse para tener dominios de unión con diferentes afinidades a tipos celulares específicos diana. Por ejemplo, puede ser conveniente 30 un heterodímero de polipéptidos con un dominio de unión para un complejo TCR o un componente de los mismos y otro dominio de unión para un antígeno tumoral (o una diana de linfocitos B) para unirse preferentemente a células tumorales que tienen el antígeno tumoral (o linfocitos B que llevan la diana de linfocitos B) con una afinidad superior de manera que el heterodímero de polipéptidos se unirá primero a las células tumorales (o los linfocitos B) y después reclutará linfocitos T por medio de su dominio de unión TCR/CD3 al sitio o las células tumorales. Las afinidades de 35 unión diferenciales pueden conseguirse, por ejemplo, eligiendo un dominio de unión para una diana con una afinidad de unión superior que el otro dominio de unión tiene para su diana o incluyendo múltiples dominios de unión para una diana en un heterodímero de polipéptidos y un único dominio de unión o menos dominios de unión para la segunda diana u otras. Además, el uso de bisagras diferentes (por ejemplo, el uso de bisagras de diferentes longitudes) puede afectar a la unión de un dominio más que otro o al uso de diferentes bisagras para diferentes 40 dominios de unión con el fin de alterar la actividad de unión de los dominios de unión.
En algunas realizaciones, puede ser necesario localizar múltiples dominios de unión a una distancia apropiada entre sí de manera que sus interacciones con sus dianas produzcan un efecto conveniente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un heterodímero de polipéptidos que comprende un dominio de unión para un complejo TCR o un 45 componente de los mismos en un polipéptido de cadena única y otro dominio de unión para un antígeno tumoral o una diana de linfocitos B en un segundo polipéptido de cadena única puede tener los dos dominios de unión en los extremos amino o carboxilo de sus cadenas correspondientes de manera que están en proximidad física entre sí en el heterodímero de polipéptidos.
50
Los heterodímeros de ejemplo pueden formarse a partir de pares de polipéptido de cadena única descritos en la presente memoria descriptiva. Si los números de identificación de secuencias anotados en la presente memoria descriptiva contienen secuencias de péptidos de señal (por ejemplo, los 20 primeros aminoácidos), dichas secuencias de péptidos de señal no forman parte de los polipéptidos de cadena única maduros que forman los heterodímeros de polipéptidos de ejemplo y así deberían considerarse excluidos. 55
Se determinan polipéptidos de cadena única de ejemplo en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 29-32, 53-72, 74, 810-826, 859-864 y 874-882.
Pueden formarse heterodímeros de ejemplo a partir de los siguientes pares de polipéptidos de cadena única: SEQ ID NO: 2 y 4, SEQ ID NO: 6 y 8, SEQ ID NO: 10 y 12, SEQ ID NO: 14 y 16, SEQ ID NO: 18 y 20, SEQ ID NO: 20 y 22, SEQ ID NO: 20 y 24, SEQ ID NO: 30 y 32, SEQ ID NO: 29 y 31, SEQ ID NO: 29 y 32, SEQ ID NO: 30 y 72, SEQ ID NO: 53 y 72, SEQ ID NO: 54 y 72, SEQ ID NO: 55 y 72, SEQ ID NO: 70 y 72, SEQ ID NO: 71 y 72, SEQ ID NO: 63 y 56, SEQ ID NO: 64 y 57, SEQ ID NO: 65 y 60, SEQ ID NO: 66 y 58, SEQ ID NO: 67 y 59, SEQ ID NO: 68 y 61, 5 SEQ ID NO: 69 y 62, SEQ ID NO: 54 y 81 1, SEQ ID NO: 54 y 812, SEQ ID NO: 54 y 813, SEQ ID NO: 814 y 818, SEQ ID NO: 815 y 818, SEQ ID NO: 816 y 818, SEQ ID NO: 817 y 818, SEQ ID NO: 814 y 820, SEQ ID NO: 814 y 821, SEQ ID NO: 54 y 819, SEQ ID NO: 814 y 826, SEQ ID NO: 814 y 822, SEQ ID NO: 814 y 823, SEQ ID NO: 814 y 824, SEQ ID NO: 859 y 862, SEQ ID NO: 860 y 863, SEQ ID NO: 861 y 864, SEQ ID NO: 874 y 825, SEQ ID NO: 875 y 879, SEQ ID NO: 876 y 880, SEQ ID NO: 877 y 881, o SEQ ID NO: 878 y 882. 10
Ácidos nucleicos, vectores, células hospedadoras y procedimientos para preparar heterodímeros
En un aspecto relacionado, la presente descripción proporciona también moléculas de ácidos nucleicos aisladas (usadas indistintamente con "polinucleótido") que codifican polipéptidos de cadena única proporcionados en la 15 presente memoria descriptiva. Las moléculas de ácidos nucleicos de ejemplo (con o sin una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de péptidos de señal) se determinan en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25-28, 33-52 y 792-808.
La presente descripción proporciona también vectores que comprenden secuencia de ácidos nucleicos que codifica 20 polipéptidos de cadena única proporcionados en la presente memoria descriptiva. Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Los vectores de ejemplo incluyen plásmidos, cromosomas artificiales de levadura y genomas víricos. Algunos vectores pueden replicarse de forma autónoma en una célula hospedadora, mientras que otros vectores pueden integrarse en el genoma de una célula hospedadora y con ello se replican con el genoma 25 hospedador.
En algunas realizaciones, los vectores pueden ser vectores de expresión recombinantes. "Vectores de expresión recombinantes" o "vectores de expresión" se refieren a vectores que contienen secuencias de ácidos nucleicos que están unidas operativamente a una secuencia de control de expresión (por ejemplo, un promotor) y así son capaces 30 de dirigir la expresión de dichas secuencias.
Las secuencias de promotores útiles en los vectores de expresión proporcionados en la presente memoria descriptiva pueden seleccionarse de entre cualquier gen deseado que usa vectores CAT (cloranfenicol-transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables. Los promotores eucariotas incluyen CMV inmediato temprano, HSV 35 timidina-cinasa, SV40 tempranos y tardíos, LTR de retrovirus y metalotioneína-I de ratón. En algunas realizaciones, los promotores son promotores inducibles.
En algunas realizaciones, un vector es un vector de expresión que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un primer polipéptido de cadena única de un heterodímero de polipéptidos proporcionados en la 40 presente memoria descriptiva. En algunas otras realizaciones, un vector es un vector de expresión que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un segundo polipéptido de cadena única de un heterodímero de polipéptidos proporcionados en la presente memoria descriptiva.
En algunas realizaciones, un vector es un vector de expresión que comprende secuencias de ácidos nucleicos que 45 codifican los polipéptidos de cadena única primero y segundo de un heterodímero de polipéptidos. El promotor para la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el primer polipéptido de cadena única puede ser el mismo que el promotor para el ácido nucleico que codifica el segundo polipéptido de cadena única. Alternativamente, el promotor para la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el primer polipéptido de cadena única puede ser diferente del promotor para el ácido nucleico que codifica el segundo polipéptido de cadena única de manera que el nivel de 50 expresión de los polipéptidos de cadena única primero y segundo puede modularse de forma diferencial para conseguir una heterodimerización máxima de los polipéptidos de cadena única primero y segundo. En algunas realizaciones, uno o los dos promotores para el ácido nucleico que codifica los polipéptidos de cadena única primero y segundo son promotores inducibles.
55
La presente descripción proporciona también una célula hospedadora transformada o transfectada con, o que contiene por otros medios, cualquiera de los ácidos nucleicos o vectores proporcionados en la presente memoria descriptiva. Las células hospedadoras de ejemplo incluyen células VERO, células HeLa, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO) (incluyendo células CHO modificadas capaces de modificar el patrón de glucosilación de moléculas de unión multivalentes expresadas, véase la solicitud de patente de EE.UU. publicación nº 2003/0.115.614), células COS (tales como COS-7), W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562, células HEK293, células HepG2, células N, células 3T3, células de Spodoptera frugiperda (por ejemplo, células Sf9), células de Saccharomyces cerevisiae Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, o miembros de la familia Streptomycete. 5
En algunas realizaciones, una célula hospedadora comprende un primer vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica un primer polipéptido de cadena única y un segundo vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido de cadena única.
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En algunas otras realizaciones, una célula hospedadora comprende un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica los dos polipéptidos de cadena única primero y segundo.
La descripción incluye también un procedimiento para producir heterodímeros de polipéptidos descrito en la presente memoria descriptiva. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende el cultivo de una célula hospedadora 15 que comprende ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de cadena única primero y segundo en condiciones adecuadas para expresar los polipéptidos, y aislamiento o purificación opcionales de los heterodímeros formados a partir de los polipéptidos de cadena única primero y segundo desde el cultivo. El ácido nucleico que codifica el primer polipéptido de cadena única y el ácido nucleico que codifica el segundo polipéptido de cadena única pueden estar presentes en un único vector de expresión en la célula hospedadora o en dos vectores de expresión diferentes 20 en las células hospedadoras. En el último caso, la relación entre los dos vectores de expresión puede controlarse para elevar al máximo la heterodimerización de los polipéptidos de cadena única primero y segundo.
La presente descripción proporciona heterodímeros de polipéptidos purificados tal como se describe en la presente memoria descriptiva. El término "purificado”, tal como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a una 25 composición, aislable de otros componentes, donde el heterodímero de polipéptidos está enriquecido en cualquier grado con respecto a su estado alcanzable de forma natural. En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona heterodímeros de polipéptidos purificados sustancialmente tal como se describe en la presente memoria descriptiva. "Purificados sustancialmente" se refiere a una composición de heterodímeros de polipéptidos donde el heterodímero de polipéptidos forma el principal componente de la composición, tal como constituir al menos 30 aproximadamente el 50%, tal como al menos aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 99%, de los polipéptidos, en peso, en la composición.
Las técnicas de purificación de proteínas son bien conocidas para los expertos en la materia. Estas técnicas 35 implican, en un nivel, el fraccionamiento en crudo de las fracciones de polipéptidos y de no polipéptidos. Con frecuencia se desea una purificación adicional que utiliza técnicas cromatográficas y electroforéticas para conseguir una purificación parcial o completa (o purificación hasta homogeneidad). Los procedimientos analíticos adecuados en particular para la preparación de una proteína de fusión pura son cromatografía de intercambio iónico, cromatografía por exclusión de tamaños; electroforesis en gel de poliacrilamida y enfoque isoeléctrico. Los 40 procedimientos particularmente eficaces de purificación de péptidos son cromatografía líquida de proteínas rápida y HPLC.
A la luz de la presente invención, los expertos en la materia conocen varios procedimientos para cuantificar el grado de purificación. Entre ellos se incluye, por ejemplo, la evaluación de la cantidad de heterodímeros de polipéptidos en 45 una fracción por análisis SDS/PAGE y HPLC tal como se ilustra en los ejemplos proporcionados en la presente memoria descriptiva.
El procedimiento para preparar heterodímeros de polipéptidos proporcionados en la presente memoria descriptiva es ventajoso con respecto a un procedimiento para para expresar y purificar primero por separado polipéptidos de 50 cadena única individuales y después incubar polipéptidos de cadena única individuales purificados en conjunto para formar heterodímeros de polipéptidos. Por ejemplo, algunos polipéptidos de cadena única (por ejemplo, algunos polipéptidos que contienen sólo regiones CH1 como sus dominios de heterodimerización de inmunoglobulinas) son inestables cuando se expresan en solitario. Además, la expresión y purificación separada de polipéptidos de cadena única individuales seguida por la combinación de los polipéptidos de cadena única individuales purificados más 55 etapas que la coexpresión de los polipéptidos de cadena única seguida por la purificación de los heterodímeros de polipéptidos resultantes y generalmente menos eficientes.
Composiciones y procedimientos para usar heterodímeros
Además de heterodímeros de polipéptidos, la presente descripción proporciona también composiciones farmacéuticas y formas de dosis unitarias que comprenden los heterodímeros de polipéptidos así como procedimientos para usar los heterodímeros de polipéptidos, las composiciones farmacéuticas y las formas de dosis unitarias. 5
Las composiciones de heterodímeros de polipéptidos de la presente descripción comprenden generalmente un heterodímero de polipéptidos proporcionado en la presente memoria descriptiva en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable, que incluye vehículos y diluyentes farmacéuticamente aceptables. Los excipientes farmacéuticos aceptables serán no tóxicos para los receptores en las dosis y las concentraciones empleadas. Son 10 bien conocidos en la técnica farmacéutica y se describen, por ejemplo, en Rowe y col., Handbook of Pharmaceutical Excipients: A Comprehensive Guide to Uses, Properties, and Safety, 5th Ed., 2006.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables para uso terapéutico son también bien conocidos en la técnica farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. 15 Gennaro (Ed.) 1985). Los vehículos farmacéuticamente aceptables de ejemplo incluyen suero salino estéril y suero salino con tampón de fosfato a pH fisiológico. En la composición farmacéutica pueden proporcionarse conservantes, estabilizadores, colorantes y similares. Además, también pueden usarse antioxidantes y agentes en suspensión.
Las composiciones farmacéuticas pueden contener también diluyentes tales como tampones, antioxidantes tales 20 como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos), proteínas, aminoácidos, hidratos de carbono (por ejemplo, glucosa, sacarosa, dextrinas), agentes de quelación (por ejemplo, EDTA), glutatión y otros estabilizantes y excipientes. El suero salino de tampón neutro o el suero salino mezclado con albúmina sérica no específica son diluyentes de ejemplo. Por ejemplo, el producto puede formularse como un liofilizado usando soluciones de excipientes apropiadas (por ejemplo, sacarosa) como diluyentes. 25
La presente descripción proporciona también un procedimiento para tratar una enfermedad o trastorno asociado con, por ejemplo, un exceso de transducción de señal mediada por receptores, que comprende la administración a un paciente que lo necesita de una cantidad efectiva de un heterodímero de polipéptidos que comprende un dominio de unión que se une específicamente a un receptor, tal como un receptor tirosina-cinasa, que incluye EGFR, EGFRvIII, 30 ErbB2, ErbB3, ErbB4, IGF1R, c-Met, RON y EphA2.
Las enfermedades o trastornos de ejemplo asociados con un exceso de transducción de señal mediada por receptor en exceso incluyen cáncer (por ejemplo, malignidad sólida y malignidad hematológica), enfermedades o dolencias autoinmunitarias o inflamatorias, sepsis resultante de infección bacteriana e infección vírica. 35
En un aspecto, la presente descripción proporciona un procedimiento para dirigir la activación de linfocitos T, que comprende la administración a un paciente que lo necesita de una cantidad efectiva de un heterodímero de polipéptidos que comprende un dominio de unión que se une específicamente a TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε o una combinación de los mismos, y un segundo dominio de unión que se une específicamente a una diana diferente, 40 por ejemplo, un antígeno específico de tumor u otro antígeno de elección como un sitio o una célula donde se desea la activación de linfocitos T.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un procedimiento para inhibir el crecimiento, la metástasis o el crecimiento metastásico de una malignidad (por ejemplo, una malignidad sólida o una malignidad hematológica), que 45 comprende la administración a un paciente que lo necesita de una cantidad efectiva de un heterodímero de polipéptidos proporcionados en la presente memoria descriptiva o una composición de los mismos.
Una amplia variedad de cánceres, que incluyen malignidad sólida y malignidad hematológica, son abordables para las composiciones y procedimientos divulgados en la presente memoria descriptiva. Los tipos de cáncer que pueden 50 ser tratados incluyen, pero no se limitan a: adenocarcinoma de mama, próstata, páncreas, colon y recto; todas las formas de carcinoma broncógeno del pulmón (incluyendo carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, carcinoma microcítico pulmonar y carcinoma pulmonar no microcítico); mieloide; melanoma; hepatoma; neuroblastoma; papiloma; apudoma; coristoma; branquioma; síndrome carcinoide maligno; cardiopatía carcinoide; y carcinoma (por ejemplo, Walker, células basales, basoescamoso, Brown-Pearce, ductal, tumor de Ehrlich, Krebs 2, 55 células de Merkel, mucinoso, pulmonar no microcítico, células en avena, papilar, escirro, bronquiolar, broncógeno, de células escamosas y de células transicionales). Los tipos adicionales de cánceres que pueden tratarse incluyen: trastornos histiocíticos; leucemia; histiocitosis maligna; enfermedad de Hodgkin; pequeño inmunoproliferativo; linfoma no hodgkiniano; plasmacitoma; reticuloendoteliosis; melanoma; condroblastoma; condroma; condrosarcoma; fibroma; fibrosarcoma; tumores de células gigantes; histiocitoma; lipoma; liposarcoma; mesotelioma; mixoma; mixosarcoma; osteoma; osteosarcoma; cordoma; craneofaringioma; disgerminoma; hamartoma; mesenquimoma; mesonefroma; miosarcoma; ameloblastoma; cementoma; odontoma; teratoma; timoma; tumor trofoblástico. Además, se contemplan también los siguientes tipos de cánceres como abordables al tratamiento: adenoma; colangioma; colesteatoma; ciclindroma; cistoadenocarcinoma; cistoadenoma; tumor de células granulosas; ginandroblastoma; 5 hepatoma; hidroadenoma; tumor de las células de los islotes; tumor de células de Leydig; papiloma; tumor de células de Sertoli; tumor de células tecales; leimioma; leiomiosarcoma; mioblastoma; mioma; miosarcoma; rabdomioma; rabdomiosarcoma; ependimoma; ganglioneuroma; glioma; meduloblastoma; meningioma; neurilemoma; neuroblastoma; neuroepitelioma; neurofibroma; neuroma; paraganglioma; paraganglioma no cromafín; y glioblastoma multiforme. Los tipos de cánceres que pueden tratarse incluyen también, pero no se limitan a, 10 angioqueratoma; hiperplasia angiolinfoide con eosinofilia; angioma esclerosante; angiomatosis; glomangioma; hemangioendotelioma; hemangioma; hemangiopericitoma; hemangiosarcoma; linfangioma; linfangiomioma; linfangiosarcoma; pinealoma; carcinosarcoma; condrosarcoma; cistosarcoma phillodes; fibrosarcoma; hemangiosarcoma; leiomiosarcoma; leucosarcoma; liposarcoma; linfangiosarcoma; miosarcoma; mixosarcoma; carcinoma de ovario; rabdomiosarcoma; sarcoma; neoplasias; nerofibromatosis y displasia cervical. 15
Los cánceres adicionales de ejemplo que son también abordables para las composiciones y los procedimientos divulgados en la presente memoria descriptiva son cánceres de linfocitos B, que incluyen linfomas de linfocitos B [tales como varias formas de enfermedad de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano (LNH) o linfomas del sistema nervioso central], leucemias [tales como leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia de 20 tricoleucocitos y leucemia mioblástica crónica] y mielomas (tales como mieloma múltiple). Los cánceres adicionales de linfocitos B incluyen linfoma linfocítico pequeño, leucemia prolinfocítica de linfocitos B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de zona marginal esplénica, mieloma de células plasmáticas, plasmacitoma solitario de hueso, plasmacitoma extraóseo, linfoma de linfocitos B de zona marginal extranodular de tejido linfoide asociado a mucosa (MALT), linfoma de linfocitos B de zona marginal nodal, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma de linfocitos B 25 grande difuso, linfoma de linfocitos B grande mediastínico (tímico), linfoma de linfocitos B grande intravascular, linfoma de derrame primario, linfoma/leucemia de Burkitt, proliferaciones de linfocitos B de potencial maligno incierto, granulomatosis linfomatoide y trastorno linfoproliferativo postrasplante.
En algunas realizaciones, los heterodímeros de polipéptidos útiles para inhibir el crecimiento de una malignidad 30 sólida o metástasis o crecimiento metastásico de una malignidad sólida o una malignidad hematológica incluyen aquellos que se unen específicamente a un antígeno tumoral o canceroso y una diana de linfocitos T. Dichos heterodímeros están diseñados normalmente para tener una afinidad de unión superior al antígeno tumoral o canceroso (por ejemplo, al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75 ó 100 veces superior) que la de la diana de linfocitos T de manera que se unen preferentemente al antígeno tumoral o canceroso primero y 35 posteriormente se unen a la diana de linfocitos T, que a su vez reclutan y activan linfocitos T para dañar o destruir las células tumorales o cancerosas que llevan el antígeno tumoral o canceroso en su superficie. Los antígenos tumorales o cancerosos y las dianas de linfocitos T de ejemplos incluyen los proporcionados anteriormente en la sección que describe los dominios de unión de heterodímeros de polipéptidos. Por ejemplo, una diana de linfocitos T puede ser CD3 o PSMA. 40
En algunas realizaciones, los heterodímeros de polipéptidos útiles para inhibir el crecimiento, la metástasis o el crecimiento metastásico de una malignidad, o por activación de linfocitos T dirigida, comprenden al menos un dominio de unión que se une específicamente a una diana de oncología (que incluye un antígeno tumoral o celular, tal como RON, c-Met, CEACAM-6, o PSMA) y otro dominio de unión que se une específicamente a un complejo TCR 45 o un componente del mismo (por ejemplo, TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ y CD3ε).
En algunas otras realizaciones, los heterodímeros de polipéptidos útiles para inhibir el crecimiento, la metástasis o el crecimiento metastásico de una malignidad comprenden al menos un dominio de unión que se une específicamente a CD28 y otro dominio de unión que se une específicamente a CD79b. Dichos heterodímeros de polipéptidos 50 pueden comprender además un dominio de unión que comprende un ectodominio PDL2, un dominio de unión que se une específicamente a hiper-IL-6, o los dos dominios de unión.
En algunas otras realizaciones, los heterodímeros de polipéptidos útiles para inhibir el crecimiento, la metástasis o el crecimiento metastásico de una malignidad comprenden al menos un dominio de unión que se une específicamente 55 a RON y otro dominio de unión que se une específicamente a c-Met.
En algunas otras realizaciones, los heterodímeros de polipéptidos útiles para inhibir el crecimiento, la metástasis o el crecimiento metastásico de una malignidad comprenden dominios de unión que se unen específicamente a una o más de las siguientes tirosina-cinasas de receptor: c-Met, RON, EGFR, EGFRvIII, Her2, ErbB3, ErbB4 e IgF1R, EphA2. En algunas realizaciones, los heterodímeros pueden comprender además uno o más dominios de unión que se unen específicamente a uno o más de los siguientes agentes antiangiógenos: PDGFR, VEGFR1-4 y angiopoyetina 2. En algunas realizaciones, los heterodímeros anteriores pueden comprender además uno o más dominios de unión que se unen específicamente a uno o más de los siguientes receptores Fc para aumentar el 5 direccionamiento de la función de efector citotóxica: CD64, CD32A y CD16. En algunas realizaciones, los heterodímeros anteriores pueden comprender además un dominio de unión que se une específicamente al receptor de transferrina (CD71) para permitir la degradación de los receptores.
En algunas otras realizaciones, los heterodímeros de polipéptidos útiles para inhibir el crecimiento, la metástasis o el 10 crecimiento metastásico de una malignidad comprenden dominios de unión que son agonistas de dos o más de los siguientes TNFSFR: TNFR1, TNFR2, DR4, DR5, TWEAKR y FAS.
En algunas otras realizaciones, los heterodímeros de polipéptidos útiles para inhibir el crecimiento, la metástasis o el crecimiento metastásico de una malignidad comprenden dominios de unión que se unen específicamente a dos o 15 más de las siguientes citocinas prooncógenas o factores de crecimiento: HGF, MSP, EGF (incluyendo epirregulina, herrregulina, β-regulina, neurregulina), HIF-1α, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD, TNFα, IL-6, hiper-IL-6, IL-8, Wnt, sHH, TGFβ o PDGF.
En algunas realizaciones, los heterodímeros de polipéptidos útiles para inhibir el crecimiento de una malignidad 20 sólida o metástasis o crecimiento metastásico de una malignidad sólida incluyen aquellos que se unen específicamente, por ejemplo, a EGFR, ErbB3, ErbB4, c-Met, RON, EphA2, IGF1R, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, CD44v6, CD151, EpCAM, CEACAM6, TGFBR2, GHRHR, GHR, IL-6R, gp130, TNFR2, PD1, TWEAK-R, OSMRβ, Patched-1, Frizzled o Robo1.
25
Los heterodímeros de polipéptidos útiles para inhibir la metástasis o el crecimiento metastásico de una malignidad hematológica incluyen aquellos que se unen específicamente, por ejemplo, a EGFR, ErbB3, c-Met, RON, EphA2, IGF1R, TGFBR2, IL-6R, gpl 30, TNFR2, PD1, OSMRβ, LTβR, CD19, CD80, CD81 o CD86.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad, trastorno o 30 dolencia autoinmunitaria o inflamatoria, que comprende la administración a un paciente que lo necesita de una cantidad efectiva de un heterodímero de polipéptidos proporcionados en la presente memoria descriptiva o una composición de los mismos.
Las enfermedades, trastornos o dolencias autoinmunitarias o inflamatorias de ejemplo que pueden ser tratados por 35 las proteínas de fusión y las composiciones y formas de dosis unitarias de las mismas incluyen, y no se limitan a, enfermedad inflamatoria intestinal (por ejemplo, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa), diabetes mellitus (por ejemplo, diabetes tipo I), dermatomiositis, polimiositis, anemia perniciosa, cirrosis biliar primaria, encefalomielitis diseminada aguda (EMDA), enfermedad de Addison, espondilitis anquilosante, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos (SAF), hepatitis autoinmunitaria, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, síndrome de 40 Guillain-Barré (SGB), enfermedad de Hashimoto, púrpura trombocitopénica idiopática, lupus eritematoso sistémico, nefritis por lupus, lupus neuropsiquiátrico, esclerosis múltiple (EM), miastenia grave, pénfigo vulgar, asma, artritis psoriásica, artritis reumatoide, síndrome de Sjögren, arteritis temporal (también conocida como "arteritis de células gigantes"), anemia hemolítica autoinmunitaria, penfigoide ampolloso, vasculitis, enfermedad celiaca, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, endometriosis, hidradenitis supurativa, cistitis intersticial, morfea, esclerodermia, 45 narcolepsia, neuromiotonía, vitíligo y enfermedad autoinmunitaria del oído interno.
Los heterodímeros de polipéptidos de ejemplo útiles para tratar una enfermedad, trastorno o dolencia autoinmunitarios o inflamatorios pueden comprender uno o más dominios de unión que se unen específicamente a CD28, y uno, dos o tres de los dominios de unión adicionales siguientes: un dominio de unión que comprende el 50 ectodominio PDL2, un dominio de unión que comprende mono-IL-10 y un dominio de unión que se une específicamente a CD86. Por ejemplo, un heterodímero de polipéptidos puede comprender un dominio de unión que se une específicamente a CD28 y de uno a tres dominios de unión que se unen específicamente a CD86.
Los heterodímeros de polipéptidos de ejemplo útiles adicionales para tratar una enfermedad, trastorno o dolencia 55 autoinmunitarios o inflamatorios pueden comprender uno o más dominios de unión que se unen específicamente a CD28 y uno o más dominios de unión que son un agonista de IL-10 (por ejemplo, mono-IL-10), un agonista de HLA-G, un agonista de HGF, un agonista de IL-35, un agonista de PD-1, un agonista de BTLA, un antagonista LIGHT, un antagonista GITRL o un antagonista CD40. Alternativamente, los heterodímeros de polipéptidos pueden comprender dos o más dominios de unión seleccionados de entre un agonista IL-10 (por ejemplo, mono-IL-10), un agonista HLA-G, un agonista HGF, un agonista IL-35, un agonista PD-1, un agonista BTLA, un antagonista LIGHT, un antagonista GITRL o un antagonista CD40.
Los heterodímeros de polipéptidos de ejemplo útiles adicionales para tratar una enfermedad, trastorno o dolencia 5 autoinmunitarios o inflamatorios pueden comprender uno o más dominios de unión que se unen específicamente a CD32B y uno o más dominios de unión que son un agonista IL-10 (por ejemplo, mono-IL-10), un agonista HLA-G, un agonista HGF, un agonista IL-35, un agonista PD-1, un agonista BTLA, un antagonista LIGHT, un antagonista GITRL o un antagonista CD40.
10
Los heterodímeros de polipéptidos de ejemplo útiles adicionales para tratar una enfermedad, trastorno o dolencia autoinmunitarios o inflamatorios pueden comprender dominios de unión que se unen específicamente a uno o más de los siguientes TNFSFR: TNFR1, TNFR2, HVEW, LTβR, TWEAKR, TACI, BAFF-R, BCMA o FAS.
Los heterodímeros de polipéptidos de ejemplo útiles adicionales para tratar una enfermedad, trastorno o dolencia 15 autoinmunitarios o inflamatorios pueden comprender dominios de unión que se unen específicamente a dos o más de las siguientes citocinas/quimiocinas proinflamatorias, tales como TNFα, IL-6, IL-2, IL-1, IL-8, IP-10, IFNγ, IFNα, RANKL, FASL, TGFβ, IL7, IL10, IL17A/F, TWEAK, CSF2, IGF1, IGF2 o BLyS/APRIL.
Los heterodímeros de polipéptidos útiles para tratar una enfermedad, trastorno o dolencia autoinmunitarios o 20 inflamatorios incluyen aquellos que se unen específicamente a, por ejemplo, TGFBR2, IL-6R, gp130, TNFR1, TNFR2, PD1, HVEM, OX40, CD40, CD137, TWEAK-R, LTβR, LIFRβ, OSMRβ, CD3, TCRα, TCRβ, CD19, CD28, CD80, CD81, CD86, TLR7, TLR9 o cualquier combinación de los mismos.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un procedimiento para tratar un trastorno o enfermedad 25 asociado a linfocitos B que comprende la administración a un paciente que lo necesita de (por ejemplo, un paciente que tiene o se sospecha que tiene un trastorno o enfermedad asociado a linfocitos B) una cantidad efectiva de un heterodímero de polipéptidos proporcionado en la presente memoria descriptiva, tales como los que se unen específicamente a una diana de linfocitos B.
30
Los heterodímeros de polipéptidos útiles en el tratamiento de un trastorno o enfermedad asociado a linfocitos B pueden comprender dominios de unión que se unen específicamente a una o más dianas de linfocitos B, tales como CD79b, CD19, HLA-DR, CD20, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38 o CD70. Los heterodímeros de polipéptidos pueden comprender además un dominio de unión que se une específicamente a una diana de linfocitos T, tal como un complejo TCR o un componente de los mismos, que incluye TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ o CD3ε. 35
Los heterodímeros de polipéptidos útiles en el tratamiento de un trastorno o enfermedad asociado a linfocitos B pueden comprender un dominio de unión que se une específicamente a una diana de linfocitos B, tal como CD79b, CD19, HLA-DR, CD20, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38 y CD70, y un dominio de unión que se une específicamente a CD64, CD32A, o CD16 para aumentar el direccionamiento de la función efectora citotóxica. 40
Los heterodímeros de polipéptidos o composiciones de los mismos de la presente descripción pueden administrarse por vía oral, tópica, transdérmica, parenteral, por aerosol en inhalación, vía vaginal, rectal o por inyección intracraneal o cualquier combinación de los mismos. En una realización, los heterodímeros de polipéptidos o composiciones de los mismos se administran parenteralmente. El término "parenteral”, tal como se usa en la 45 presente memoria descriptiva, incluye inyecciones subcutáneas, inyecciones intravenosas, intramusculares, intracisternales o técnicas de infusión. Se contempla también la administración por inyección intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamaria, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar y/o implantación quirúrgica en un sitio en particular. Por ejemplo, la invención incluye la administración de heterodímeros de polipéptidos o composiciones de los mismos por inyección intravenosa. 50
La dosis farmacéuticamente eficaz depende del tipo de enfermedad, la composición usada, la vía de administración, el tipo de sujeto tratado, las características físicas del sujeto específico en consideración para tratamiento, la medicación concurrente y otros factores que reconocerán los expertos en la materia de la medicina. Por ejemplo, puede administrarse una cantidad entre 0,01 mg/kg y 1.000 mg/kg (por ejemplo, aproximadamente 0,1 a 1 mg/kg, 55 aproximadamente 1 a 10 mg/kg, aproximadamente 10-50 mg/kg, aproximadamente 50-100 mg/kg, aproximadamente 100-500 mg/kg, o aproximadamente 500-1.000 mg/kg) de peso corporal (que puede administrarse como una dosis única, diaria, semanal, mensual o en cualquier intervalo apropiado) de ingrediente activo dependiendo de la potencia de un heterodímero de polipéptidos de la presente descripción.
También se contempla la administración de heterodímeros de polipéptidos o composiciones de los mismos en combinación con un segundo agente. Un segundo agente puede ser aceptado en la técnica como tratamiento estándar para un estado de enfermedad o trastorno en particular, tal como en cáncer, inflamación, autoinmunidad e infección. Los segundos agentes de ejemplo contemplados incluyen heterodímeros de polipéptidos que se unen a 5 dianas diferentes de las de aquellas a las que se unen los heterodímeros de polipéptidos primarios, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, proteínas de fusión derivadas de inmunoglobulinas, agentes quimioterapéuticos, radiación ionizante, esteroides, NSAID, agentes antiinfecciosos, u otros agentes activos y auxiliares o cualquier combinación de los mismos.
10
En algunas realizaciones, un heterodímero de polipéptidos y un segundo agente actúan de forma sinérgica. En otras palabras, estos dos compuestos interaccionan de manera que el efecto combinado de los compuestos es mayor que la suma de los efectos individuales de cada compuesto cuando se administra en solitario (véase, por ejemplo, Berenbaum, Pharmacol. Rev. 41: 93, 1989).
15
En algunas otras realizaciones, un heterodímero de polipéptidos y un segundo agente actúan de forma aditiva. En otras palabras, estos dos compuestos interaccionan de manera que el efecto combinado de los compuestos es el mismo que la suma de los efectos individuales de cada compuesto cuando se administra en solitario.
Los segundos agentes útiles en combinación con heterodímeros de polipéptidos o composiciones de los mismos 20 proporcionados en la presente memoria descriptiva pueden ser esteroides, NSAID, inhibidores mTOR (por ejemplo, rapamicina (sirolimus), temsirolimus, deforolimus, everolimus, zotarolimus, curcumina, ácido farnesiltiosalicílico), inhibidores de la calcineurina (por ejemplo, ciclosporina, tacrolimus), antimetabolitos (por ejemplo, ácido micofenólico, micofenolato mofetilo), anticuerpos policlonales (por ejemplo, anti-timocito globulina), anticuerpos monoclonales (por ejemplo, daclizumab, basiliximab) y proteínas de fusión CTLA4-Ig (por ejemplo, abatacept o 25 belatacept).
Los segundos agentes útiles para inhibir el crecimiento de una malignidad sólida, inhibir la metástasis o el crecimiento metastásico de una malignidad sólida, o tratar o mejorar una malignidad hematológica incluyen agentes quimioterapéuticos, radiación ionizante, y otros fármacos anticancerosos. Los ejemplos de agentes 30 quimioterapéuticos contemplados como agentes terapéuticos adicionales incluyen agentes de alquilación, tales como mostazas de nitrógeno (por ejemplo, mecloretamina, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalán y clorambucilo); agentes quimioterapéuticos bifuncionales (por ejemplo, bendamustina); nitrosoureas (por ejemplo, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), y semustina (metil-CCNU)); etileniminas y metil-melaminas (por ejemplo, trietilenmelamina (TEM), trietilentiofosforamida (tiotepa), y hexametilmelamina (HMM, altretamina)); sulfonatos de 35 alquilo (por ejemplo, busulfán); y triacinas (por ejemplo, dacabcina (DTIC)); antimetabolitos, tales como análogos de ácido fólico (por ejemplo, metotrexato, trimetrexato y pemetrexed (antifolato multidiana)); análogos de la pirimidina (tales como 5-fluorouracilo (5-FU), fluorodeoxiuridina, gemcitabina, citosina arabinósido (AraC, citarabina), 5-azacitidina y 2,2'-difluorodeoxicitidina); y análogos de purina (por ejemplo, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, azatioprina, 2'-deoxicoformicina (pentostatina), eritrohidroxinoniladeina (EHNA), fosfato de fludarabina, 2-40 clorodeoxiadenosina (cladribina, 2-CdA)); inhibidores de topoisomerasa de tipo I tales como camptotecina (CPT), topotecán e irinotecán; productos naturales, tales como epipodofilotoxinas (por ejemplo, etopósido y tenipósido); y alcaloides vinca (por ejemplo, vinblastina, vincristina, y vinorrelbina); antibióticos antitumorales tales como actinomicina D, doxorrubicina y bleomicina; radiosensibilizadores tales como 5-bromodesoxiuridina, 5-yododesoxiuridina y bromodesoxicitidina; complejos de coordinación de platino tales como cisplatino, carboplatino y 45 oxaliplatino; ureas sustituidas, tales como hidroxiurea; y derivados de metilhidracina tales como N-metilhidracina (MIH) y procarbacina.
En algunas realizaciones, los segundos agentes útiles para inhibir el crecimiento, metástasis o crecimiento metastásico de una malignidad incluyen heterodímeros de polipéptidos de acuerdo con la presente descripción que 50 se unen a células cancerosas diana distintas de la diana a la que se une el primer heterodímero de polipéptidos. En algunas otras realizaciones, los segundos agentes útiles para dichos tratamientos incluyen anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales y proteínas de fusión derivadas de inmunoglobulinas que se unen a células cancerosas diana. Las células cancerosas diana de ejemplo se proporcionan anteriormente en el contexto de la descripción de dianas de heterodímeros de polipéptidos útiles para el tratamiento indicado anteriormente. 55
Los agentes terapéuticos adicionales contemplados por la presente descripción para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias se refieren como agentes inmunosupresores, que actúan para suprimir o enmascarar el sistema inmunitario de la persona sometida a tratamiento. Los agentes de inmunosupresión incluyen, por ejemplo, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAID), analgésicos, glucocorticoides, fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARD) para el tratamiento de artritis o modificadores de la respuesta biológica. Las composiciones la descripción de DMARD son también útiles en el tratamiento de otras muchas enfermedades autoinmunitarias aparte de la artritis reumatoide.
5
Los NSAID de ejemplo se eligen entre el grupo que consiste en ibuprofeno, naproxeno, naproxeno sódico, inhibidores de Cox-2 tales como Vioxx y Celebrex, y sialilatos. Los analgésicos de ejemplo se eligen entre el grupo que consiste en paracetamol, oxicodona, tramadol de clorhidrato de propoxifeno. Los glucocorticoides de ejemplo se eligen entre el grupo que consiste en cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona o prednisona. Los modificadores de la respuesta biológica de ejemplo incluyen moléculas dirigidas contra marcadores 10 de la superficie celular (por ejemplo, CD4, CD5, etc.), inhibidores de citocinas, tales como los antagonistas de TNF (por ejemplo etanercept (Enbrel), adalimumab (Humira) e infliximab (Remicade)), inhibidores de las quimiocinas e inhibidores de moléculas de adhesión. Los modificadores de la respuesta biológica incluyen anticuerpos monoclonales así como formas recombinantes de moléculas. Los DMARD de ejemplo incluyen azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina, metotrexato, penicilamina, leflunomida, sulfasalacina, hidroxicloroquina, Gold (oral 15 (auranofm) e intramuscular) y minociclina.
Los segundos agentes útiles adicionales para tratar una enfermedad, trastorno o dolencia autoinmunitarios o inflamatorios pueden ser un anticuerpo policlonal o monoclonal, una proteína de fusión derivada de inmunoglobulinas (por ejemplo, proteínas de fusión scFv, SMIP™, PIMS, SCORPION™) o un heterodímero de 20 polipéptidos de acuerdo con la presente descripción que se unen específicamente a una diana asociada con dicha enfermedad, trastorno o dolencia. Los ejemplos de dichas dianas se proporcionan anteriormente en el contexto de las dianas de heterodímeros de polipéptidos de la presente descripción útiles en el tratamiento mencionado anteriormente.
25
Se contempla que la composición de moléculas de unión y el segundo agente activo pueden suministrarse simultáneamente en la misma formulación. Alternativamente, los segundos agentes pueden administrarse en una formulación separada pero de forma concurrente (es decir, se suministran en menos de una hora entre sí).
En algunas realizaciones, el segundo agente activo puede administrarse antes de la administración de un 30 heterodímero de polipéptidos o una composición de los mismos. Administración previa se refiere a la administración del segundo agente activo al menos una hora antes del tratamiento con el heterodímero de polipéptidos o la composición de los mismos. Se contempla además que el agente activo puede administrarse después de la administración de la composición de moléculas de unión. Administración posterior significa describir la administración al menos una hora después de la administración del heterodímero de polipéptidos o la composición 35 de los mismos.
La presente descripción contempla una unidad de dosificación que comprende una composición farmacéutica de la presente descripción. Dichas unidades de dosificación incluyen, por ejemplo, un vial o jeringa monodosis o multidosis, que incluye un vial o jeringa de dos compartimentos, uno que comprende la composición farmacéutica de 40 la presente descripción en forma liofilizada y el otro un diluyente para reconstitución. Una unidad de dosificación multidosis también puede ser, por ejemplo, una bolsa o tubo para conexión a un dispositivo de infusión intravenosa.
La presente descripción también contempla un kit que comprende una composición farmacéutica de la presente descripción en dosis unidad, o multidosis, un envase, por ejemplo, un vial, y un conjunto de instrucciones para 45 administrar la composición a pacientes que sufren un trastorno tal como un trastorno descrito anteriormente.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1 50
HETERODÍMERO DE POLIPÉPTIDOS BIVALENTE CON DOS PARES DE DOMINIOS DE HETERODIMERIZACIÓN
Se preparó el heterodímero de polipéptidos X0172 por coexpresión de los polipéptidos de cadena única X0130 55 (2E12 CH1 CH2 CH3 Cκ) y X0168 (Cκ CH2 CH3 CH1 H68 2E12). El polipéptido de cadena única X0130 comprende, desde el extremo amino al carboxilo: scFv 2E12 (anti-CD28), CH1 IgG1 humano, bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano, CH3 IgG1 humano y Cκ humano alterado (sin la primera Arg o la última Cys). Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de X130 se determinan en SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente. El polipéptido de cadena única X0168 comprende, desde el extremo amino al carboxilo: Cκ humano alterado (sin la primera Arg o la última Cys), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano, CH3 IgG1 humano, CH1 IgG1 humano, conector H68 y scFv 2E12 (anti-CD28). Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de X0168 se determinan en SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente. La secuencia de aminoácidos del conector H68 se determina en SEQ ID NO: 78.
5
Como comparación, se preparó el heterodímero de polipéptidos X0124 por coexpresión de los polipéptidos de cadena única X0112 (2E12 CH1 CH2 CH3) y X0113 (Cκ CH2 CH3). El polipéptido de cadena única X0112 comprende, desde el extremo amino al carboxilo: scFv 2E12 (anti-CD28), CH1 IgG1 humano, bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano y CH3 IgG1 humano. Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de X0112 se determinan en SEQ ID NO: 5 y 6, respectivamente. El polipéptido de cadena única X0113 comprende, desde el 10 extremo amino al carboxilo: Cκ humano alterado (sin la primera Arg o la última Cys), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano y CH3 IgG1 humano. La secuencia de ácidos nucleicos y aminoácidos de X0113 se determinan en SEQ ID NO: 7 y 8, respectivamente.
Expresión 15
El día antes de la transfección, se suspendieron células HEK293 a una concentración celular de 0,5 x 106 células/ml en medio de expresión Freestyle 293 (Gibco). Para una transfección grande, se usaron 250 ml de células, pero para una transfección pequeña se usaron 60 ml de células. El día de la transfección, se mezclaron 320 μL de reactivo 293fectin (Invitrogen) con 8 ml de medio. Al mismo tiempo, se mezclaron también 250 μg de ADN para cada de una 20 de las dos cadenas con 8 ml de medio y se incubó durante 5 minutos. Después de 15 minutos de incubación, se añadió la mezcla de ADN-293fectin a los 250 ml de células 293 y se devolvió al agitador a 37°C y se agitó a una velocidad de 120 RPM. Para la transfección pequeña que usaba 60 ml de células, se usó un cuarto del ADN, 293fectin y medio.
25
Purificación
Se usó cromatografía de afinidad de proteína A para purificar las proteínas. Se añadieron 2 mL de proteínas A agarosa concentradas (Repligen) a una columna Biorad (columna de cromatografía Econo-column, tamaño 2,5 x 10 cm), se lavó ampliamente con PBS (volumen de columna 10x) y se cargaron los sobrenadantes, se lavó de nuevo 30 con PBS y se eluyó con 3 volúmenes de columna de tampón de elución de IgG Pierce. A continuación se dializaron las proteínas extensamente con respecto a PBS. Después se concentraron las proteínas usando dispositivos de filtro centrífugo Amicon hasta un volumen final de aproximadamente 0,5 mL.
Para purificación de segunda etapa, se usó cromatografía de afinidad de proteínas L o cromatografía por intercambio 35 de cationes. Para purificación de proteínas L, se hizo pasar el heterodímero de polipéptidos purificado con proteína A sobre una columna de agarosa de proteína L que había sido equilibrada previamente con PBS, se lavó con PBS (volumen de columna 10x) y después se eluyó con tampón de elución IgG Pierce. Después se analizaron las proteínas con respecto a PBS extensamente y se concentró usando dispositivos de filtro centrífugo Amicon hasta un volumen final de aproximadamente 0,5 mL. 40
Se dializaron muestras (200-300 μg) de construcciones de heterodímeros de polipéptidos purificados por afinidad anteriormente (proteína A o proteína L) en MES 20 mM, pH 6,0 (tampón A) y se cargaron en una columna de intercambio de cationes MonoS 5/50 GL (GE Healthcare) a una velocidad de flujo de 2 mL/min, usando AKTA Explorer FPLC. Se dejó que la columna se equilibrara 5 volúmenes de columna (CV) y después se trabajó en un 45 formato de gradiente hasta una mezcla del 50%:50% de tampón A:tampón B (siendo tampón B MES 20 mM, NaCl 1 M, pH 6,0) en 20 CV. Se hizo pasar una mezcla posterior de tampón B al 100% durante 5 CV con el fin de limpiar la columna, y se dejó en funcionamiento el sistema durante otros 5 CV a un tampón A del 100% para reequilibrar antes de la siguiente inyección. Se recogieron los picos y se analizaron por SDS-PAGE y espectrometría de masas con electropulverización. 50
Análisis SDS-PAGE
Se analizaron las proteínas purificadas en un gel SDS-PAGE al 10% con caja de gel de células X de Invitrogen.
55
Sinergia con concentración subóptima de PMA
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes internos a partir de sangre entera heparinizada por medio de centrifugación sobre Linfocyte Separation Media (MP Biomedicals, Aurora, OH) y se lavó dos veces con medio RPMI (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA). A continuación se enriquecieron linfocitos T CD4+ a partir de PBMC usando selección negativa con un kit de aislamiento de linfocitos T CD4+ MACS (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). A continuación se resuspendieron los linfocitos T CD4+ enriquecidos (> 95%) a una concentración de 1 x 10dos veces con medio RPMI (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA). A continuación se enriquecieron linfocitos T CD4+ a partir de PBMC usando selección negativa con un kit de aislamiento de linfocitos T CD4+ MACS (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). A continuación se resuspendieron los linfocitos T CD4+ enriquecidos (> 95%) a una concentración de 1 x 10dos veces con medio RPMI (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA). A continuación se enriquecieron linfocitos T CD4+ a partir de PBMC usando selección negativa con un kit de aislamiento de linfocitos T CD4+ MACS (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). A continuación se resuspendieron los linfocitos T CD4+ enriquecidos (> 95%) a una concentración de 1 x 10dos veces con medio RPMI (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA). A continuación se enriquecieron linfocitos T CD4+ a partir de PBMC usando selección negativa con un kit de aislamiento de linfocitos T CD4+ MACS (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). A continuación se resuspendieron los linfocitos T CD4+ enriquecidos (> 95%) a una concentración de 1 x 10dos veces con medio RPMI (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA). A continuación se enriquecieron linfocitos T CD4+ a partir de PBMC usando selección negativa con un kit de aislamiento de linfocitos T CD4+ MACS (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). A continuación se resuspendieron los linfocitos T CD4+ enriquecidos (> 95%) a una concentración de 1 x 10dos veces con medio RPMI (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA). A continuación se enriquecieron linfocitos T CD4+ a partir de PBMC usando selección negativa con un kit de aislamiento de linfocitos T CD4+ MACS (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). A continuación se resuspendieron los linfocitos T CD4+ enriquecidos (> 95%) a una concentración de 1 x 10dos veces con medio RPMI (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA). A continuación se enriquecieron linfocitos T CD4+ a partir de PBMC usando selección negativa con un kit de aislamiento de linfocitos T CD4+ MACS (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). A continuación se resuspendieron los linfocitos T CD4+ enriquecidos (> 95%) a una concentración de 1 x 10
La figura 2 muestra que el heterodímero de polipéptidos X0172 tiene una propiedad diferencial comparada con 2E12 SMIP M0039 (SEQ ID NO: 77). No mostró sinergia con PMA así como SMIP. Este heterodímero de polipéptidos bivalente tiene una propiedad más cercana al heterodímero de polipéptidos monovalente, X0124, que al SMIP bivalente. 20
La figura 3 muestra que el heterodímero de polipéptidos bivalente X0172 unido a células CD4+ es mejor que scFv 2E12 (SEQ ID NO: 109) y el heterodímero de polipéptidos monovalente X0124.
EJEMPLO 2 25
HETERODÍMERO DE POLIPÉPTIDOS BIVALENTE, TRIVALENTE Y TETRAVALENTE QUE USA UN ÚNICO PAR DE DOMINIOS DE HETERODIMERIZACIÓN
Se preparó el heterodímero de polipéptidos bivalente X0251 por coexpresión de polipéptidos de cadena única X0244 30 (Cκ(YAE) CH2(N297A) CH3 H68 2E12) y X0245 (2E12 CH1 CH2(N297A) CH3). El polipéptido de cadena única X0244 comprende, desde el extremo amino al carboxilo: Cκ humano (YAE) (es decir, Cκ humano sin la primera Arg o última Cys pero con sustituciones N30Y, V55A y T70E), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano (N297A) (es decir, CH2 IgG1 humano con una sustitución de N297A), CH3 IgG1 humano, conector H68 y scFv 2E12 (anti-CD28). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de X0244 se determinan en SEQ ID NO: 9 y 10, 35 respectivamente. El polipéptido de cadena única X0245 comprende, desde el extremo amino al carboxilo: scFv 2E12 (anti-CD28), CH1 IgG1 humano, bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano (N297A) y CH3 IgG1 humano. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de X0245 se determinan en SEQ ID NO: 11 y 12, respectivamente.
Se preparó el heterodímero de polipéptidos biespecífico trivalente X0252 por coexpresión de polipéptidos de cadena 40 única X0246 (P2C2 Cκ(YAE) CH2(N297A) CH3) y X0247 (2E12 CH1 CH2(N297A) CH3 H68 2E12). El polipéptido de cadena única X0246 comprende, desde el extremo amino al carboxilo: scFv P2C2 (anti-CD79b), Cκ humano (YAE), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano (N297A) y CH3 IgG1 humano. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de X0246 se determinan en SEQ ID NO: 13 y 14, respectivamente. El polipéptido de cadena única X0247 comprende, desde el extremo amino al carboxilo: scFv 2E12 (anti-CD28), CH1 IgG1 humano, bisagra SCC-P 45 IgG1 humana, CH2 IgG1 humano (N297A), CH3 IgG1 humano, conector H68 y scFv 2E12 (anti-CD28). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de X0247 se determinan en SEQ ID NO: 15 y 16, respectivamente.
Se preparó el heterodímero de polipéptidos trivalente triespecífico X0253 por coexpresión de polipéptidos de cadena única X0248 (P2C2 Cκ(YAE) CH2(N297A) CH3 H68 A2) y X0249 (PDL2 ECD CH1 CH2(N297A) CH3 H68 2E12). El 50 polipéptido de cadena única X0248 comprende, desde el extremo amino al carboxilo: scFv P2C2 (anti-CD79b), Cκ humano (YAE), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano (N297A), CH3 IgG1 humano, conector H68 y scFv A2 (anti-hiper-IL-6). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de X0248 se determinan en SEQ ID NO: 17 y 18, respectivamente. El polipéptido de cadena única X0249 comprende, desde el extremo amino al carboxilo: PDL2 ECD (es decir, PDL2 ectodominio), CH1 IgG1 humano, bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano (N297A), CH3 55 IgG1 humano, conector H68 y scFv 2E12 (anti-CD28). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de X0249 se determinan en SEQ ID NO: 19 y 20, respectivamente.
Se preparó otro heterodímero de polipéptidos tetravalente tetraespecífico X0283, por coexpresión de polipéptidos de cadena única X0249 (PDL2 ECD CH1 CH2(N297A) CH3 H68 2E12) y X0281 (mono-IL-10 Cκ(YAE) CH2(N297A) CH3 H68 3D1). El polipéptido de cadena única X0281 comprende, desde el extremo amino al carboxilo: mono-IL-10, Cκ humano (YAE), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano (N297A), CH3 IgG1 humano, conector H68 y scFv 3D1 (anti-CD86). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de X0281 se determinan en SEQ ID NO: 21 y 22. 5
Como control para heterodímero de polipéptidos X0283, se preparó heterodímero de polipéptidos tetravalente X0284, por coexpresión de polipéptidos de cadena única X0249 (PDL2 ECD CH1 CH2(N297A) CH3 H68 2E12) y X0282 (mono-IL-10 Cκ CH2(N297A) CH3 H68 3D1). El polipéptido de cadena única X0282 es idéntico a X0281 con la salvedad de que no contiene sustituciones N30Y V55A T70E en la secuencia de Cκ humana. Así, el polipéptido de 10 cadena única X0282 comprende, desde el extremo amino al carboxilo: mono-IL-10, Cκ humano alterado (sin la primera Arg o la última Cys), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano (N297A), CH3 IgG1 humano, conector H68 y scFv 3D1 (anti-CD86). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de X0282 se determinan en SEQ ID NO: 23 y 24, respectivamente.
15
Las moléculas del heterodímero de polipéptidos se expresaron y purificaron de acuerdo con el Ejemplo 1. Se analizaron las proteínas purificadas usando electroforesis SDS-PAGE en condiciones reducidas y no reducidas. Se realizó cromatografía por exclusión de tamaño en un AKTA Explorer FPLC (Pharmacia Biotech) usando una columna Superdex200 10/300 GL. Se analizaron algunas proteínas por espectrometría de masas con electropulverización usando ES/MS TOF Agilent 6120. 20
Se realizaron medidas de resonancia de plasmones superficiales (SPR) en un Biacore T100 SPR usando HBS-P+ (GE Healthcare) como tampón. Se inmovilizó directamente la diana en un chip CM5 usando química de acoplamiento de aminas estándar (BIACORE® Amine Coupling Kit, GE Healthcare), con niveles de inmovilización final entre 800 y 1.900 Ru (unidades de resonancia). Se inyectó el heterodímero de polipéptidos X0283 a 25°C o 25 37°C durante 150 segundos a una velocidad de flujo de 30 μL/min en una serie de concentraciones de 10 nM a 1 μΜ. Se vigiló la disociación durante 1.200 segundos, y se regeneró la superficie inyectando NaOH 50 mM durante 60 segundos. Las interacciones de unión con la superficie fueron estables a través de al menos 60 ciclos de regeneración. Los datos se analizaron usando BiaEvaluation para el software T100 (versión 2.0, GE Healthcare).
30
Los análisis de electroforesis SDS-PAGE y cromatografía por intercambio de cationes muestran que los heterodímeros de polipéptidos X0251, X0252 y X0253 estuvieron razonablemente bien expresados y purificados (Figura 4). El análisis de espectrometría de masas de X0252 muestra que la proteína es básicamente homogénea con una cantidad indetectable de los homodímeros (Figura 5). Además, los análisis de electroforesis SDS-PAGE y cromatografía por intercambio de cationes de los heterodímeros de polipéptidos X0283 y X0284 muestran que el 35 heterodímero de polipéptidos X0283 que tiene los dominios de heterodimerización CH1/Cκ(YAE) se ensambló eficientemente en un heterodímero en comparación con el heterodímero de polipéptidos X0284 de control que tiene los dominios de heterodimerización CH1/Cκ, que formó también homodímeros (Figura 6). El análisis Biocore muestra además que el dominio de unión 3D1 (anti-CD86) en el extremo carboxilo de polipéptido de cadena única X0281 se unió de forma monovalente a CD86 (Figura 7). 40
EJEMPLO 3
HETERODÍMEROS DE POLIPÉPTIDOS CON ANTI-RON Y DOMINIOS DE UNIÓN ANTI-C-MET
45
Se preparó un heterodímero de polipéptidos bivalente con dominios de unión anti-RON (ORN151) y dos heterodímeros de polipéptidos biespecíficos que comprendía anti-RON y dominios de unión anti-cMet (ORN152 y ORN153).
El heterodímero de polipéptidos bivalente ORN151 comprende los polipéptidos de cadena única ORN145 (4C04 50 CH2 CH3 CH1) y ORN148 (11H09 CH2 CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única ORN145 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv 4C04 (anti-RON), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano, CH3 IgG1 humano y CH1 IgG1 humano. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de ORN145 se determinan en SEQ ID NO: 26 y 30, respectivamente. El polipéptido de cadena única ORN148 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv 11H09 (anti-RON), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 humano, CH3 humano y Cκ humano (YAE). 55 Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de ORN148 se determinan en SEQ ID NO: 28 y 32, respectivamente.
El heterodímero de polipéptidos ORN152 biespecífico (c-Met, RON) comprende los polipéptidos de cadena única ORN116 (MET021 CH2 CH3 CH1) y ORN146 (4C04 CH2 CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única ORN116 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv MET021 (anti-c-Met), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano, CH3 IgG1 humano y CH1 IgG1 humano. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de ORN116 se determinan en SEQ ID NO: 25 y 29, respectivamente. El polipéptido de cadena única ORN146 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv 4C04 (anti-RON), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 humano, CH3 humano y Cκ humano (YAE). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de ORN146 se determinan en SEQ ID NO: 27 y 31, 5 respectivamente.
El heterodímero de polipéptidos ORN153 biespecífico (c-Met, RON) comprende los polipéptidos de cadena única ORN116 (MET021 CH2 CH3 CH1) y ORN148 (11H09 CH2 CH3 Cκ(YAE)).
10
Los heterodímeros de polipéptidos ORN151, ORN152 y ORN153 se expresaron de acuerdo con el Ejemplo 1. Se obtuvieron los siguientes niveles de expresión: 1,9 μg de proteínas/mL de cultivo para ORN151, 3,1 μg/mL para ORN152 y 4,9 μg/mL para ORN153.
EJEMPLO 4 15
HETERODÍMEROS DE POLIPÉPTIDOS CON DOMINIOS DE UNIÓN ANTI-CD3
Se prepararon varios heterodímeros de polipéptidos biespecíficos con un dominio de unión anti-CD3: heterodímeros de polipéptidos S0268, S0269 y TSC020 a TSC030. El heterodímero de polipéptidos S0268 comprende los 20 polipéptidos de cadena única ORN145 (4C04 CH2 CH3 CH1) y TSC019 (G19-4 CH2 CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única TSC019 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv G19-4 (anti-CD3), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 humano, CH3 humano y Cκ humano (YAE). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC019 se determinan en SEQ ID NO: 52 y 72, respectivamente.
25
El heterodímero de polipéptidos S0269 biespecífico (CD3, c-Met) comprende los polipéptidos de cadena única ORN160 (5D5 CH2 CH3 CH1) y TSC019 (G19-4 CH2 CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única ORN160 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv 5D5 (anti-c-Met), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano, CH3 IgG1 humano y CH1 IgG1 humano. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de ORN160 se determinan en SEQ ID NO: 33 y 53, respectivamente. 30
El heterodímero de polipéptidos TSC020 bivalente (CD19) comprende los polipéptidos de cadena única TSC001 (HD37 CH2 CH3 CH1) y TSC019 (G19-4 CH2 CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única TSC001 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv HD37 (anti-CD19), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano, CH3 IgG1 humano y CH1 IgG1 humano. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC001 se determinan en 35 SEQ ID NO: 34 y 54, respectivamente.
El heterodímero de polipéptidos TSC021 biespecífico (CD20, CD3) comprende los polipéptidos de cadena única TSC002 (2H7 CH2 CH3 CH1) y TSC019 (G19-4 CH2 CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única TSC002 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv 2H7 (anti-CD20), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 40 humano, CH3 IgG1 humano y CH1 IgG1 humano. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC002 se determinan en SEQ ID NO: 35 y 55, respectivamente.
El heterodímero de polipéptidos TSC022 biespecífico (CD79b, CD3) comprende los polipéptidos de cadena única TSC017 (P2C2 H2 CH3 CH1) y TSC019 (G19-4 CH2 CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única TSC017 45 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv P2C2 (anti-CD79b), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano, CH3 IgG1 humano y CH1 IgG1 humano. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC017 se determinan en SEQ ID NO: 50 y 70, respectivamente.
El heterodímero de polipéptidos TSC023 biespecífico (HLA-DR, CD3) comprende los polipéptidos de cadena única 50 TSC018 (M0042 CH2 CH3 CH1) y TSC019 (G19-4 CH2 CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única TSC018 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv M0042 (anti-HLA-DR), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano, CH3 IgG1 humano y CH1 IgG1 humano. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC018 se determinan en SEQ ID NO: 51 y 71, respectivamente.
55
El heterodímero de polipéptidos bivalente TSC024 comprende los polipéptidos de cadena única TSC010 (HD37-"IgA1 bisagra"-CH2 CH3 CH1) y TSC003 (G19-4-"IgA1 bisagra"-CH2 CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única TSC010 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv HD37 (anti-CD19), bisagra IgA1 humana alterada (PSTPPTPSPSTPPTPSPSCPPCP, SEQ ID NO: 752), CH2 IgG1 humano, CH3 IgG1 humano y CH1 IgG1 humano. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC010 se determinan en SEQ ID NO: 43 y 63, respectivamente. El polipéptido de cadena única TSC003 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv G19-4 (anti-CD3), bisagra IgA1 humana alterada (SEQ ID NO: 752), CH2 IgG1 humano, CH3 IgG1 humano y Cκ humano (YAE). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC003 se determinan en SEQ ID NO: 36 y 56, respectivamente.
5
El heterodímero de polipéptidos bivalente TSC025 comprende los polipéptidos de cadena única TSC011 (HD37-"bisagra IgA2"-CH2 CH3 CH1) y TSC004 (G19-4-"bisagra IgA2"-CH2 CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única TSC011 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv HD37 (anti-CD19), bisagra IgA2 humana alterada (PPPPPCPPCP, SEQ ID NO: 748), CH2 IgG1 humano, CH3 IgG1 humano y CH1 IgG1 humano. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC011 se determinan en SEQ ID NO: 44 y 64, respectivamente. El polipéptido de 10 cadena única TSC004 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv G19-4 (anti-CD3), bisagra IgA2 humana alterada (SEQ ID NO: 748), CH2 IgG1 humano, CH3 IgG1 humano y Cκ humano (YAE). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC004 se determinan en SEQ ID NO: 37 y 57, respectivamente.
El heterodímero de polipéptidos bivalente TSC026 comprende los polipéptidos de cadena única TSC012 (HD37-15 "bisagra IgG1"-CH2 CH3 CH1) y TSC007 (G19-4-"bisagra IgG1"-CH2 CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única TSC012 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv HD37 (anti-CD19), bisagra IgG1 humana alterada (EPKSSDKTHTSPPSPCPPCP, SEQ ID NO: 750), CH2 IgG1 humano, CH3 IgG1 humano y CH1 IgG1 humano. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC012 se determinan en SEQ ID NO: 45 y 65, respectivamente. El polipéptido de cadena única TSC007 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv G19-4 (anti-CD3), 20 bisagra IgG1 humana alterada (SEQ ID NO: 750), CH2 IgG1 humano, CH3 IgG1 humano y Cκ humano (YAE). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC007 se determinan en SEQ ID NO: 40 y 60, respectivamente. El heterodímero de polipéptidos bivalente TSC027 comprende los polipéptidos de cadena única TSC013 (HD37-"bisagra IgG3"-CH2 CH3 CH1) y TSC005 (G19-4-"bisagra IgG3"-CH2 CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única TSC013 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv HD37 (anti-CD19), bisagra IgG3 humana alterada 25 (EPKSSDTPPPSPRSPCPPCP, SEQ ID NO: 751), CH2 IgG1 humano, CH3 IgG1 humano y CH1 IgG1 humano. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC013 se determinan en SEQ ID NO: 46 y 66, respectivamente. El polipéptido de cadena única TSC005 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv G19-4 (anti-CD3), bisagra IgG3 humana alterada (SEQ ID NO: 751), CH2 IgG1 humano, CH3 IgG1 humano y Cκ humano (YAE). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC005 se determinan en SEQ ID NO: 38 y 58, respectivamente. 30
El heterodímero de polipéptidos bivalente TSC028 comprende los polipéptidos de cadena única TSC014 (HD37-"bisagra IgD"-CH2 CH3 CH1) y TSC006 (G19-4-"bisagra IgD"-CH2 CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única TSC014 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv HD37 (anti-CD19), bisagra IgD humana alterada (ESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRTCPPCP, SEQ ID NO: 754), CH2 IgG1 humano, CH3 IgG1 humano 35 y CH1 IgG1 humano. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC014 se determinan en SEQ ID NO: 47 y 67, respectivamente. El polipéptido de cadena única TSC006 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv G19-4 (anti-CD3), bisagra IgD humana alterada (SEQ ID NO: 754), CH2 IgG1 humano, CH3 IgG1 humano y Cκ humano (YAE). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC006 se determinan en SEQ ID NO: 39 y 59, respectivamente. 40
El heterodímero de polipéptidos bivalente TSC029 comprende los polipéptidos de cadena única TSC015 (HD37-"bisagra IgE CH2"-CH2 CH3 CH1) y TSC008 (G19-4-"bisagra IgE CH2"-CH2 CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única TSC015 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv HD37 (anti-CD19), bisagra IgE CH2 humana alterada (SEQ ID NO: 757), CH2 IgG1 humano, CH3 IgG1 humano y CH1 IgG1 humano. Las secuencias de 45 nucleótidos y aminoácidos de TSC014 se determinan en SEQ ID NO: 48 y 68, respectivamente. El polipéptido de cadena única TSC008 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv G19-4 (anti-CD3), bisagra IgE CH2 humana alterada (SEQ ID NO: 757), CH2 IgG1 humano, CH3 IgG1 humano y Cκ humano (YAE). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC008 se determinan en SEQ ID NO: 41 y 61, respectivamente.
50
El heterodímero de polipéptidos bivalente TSC030 comprende los polipéptidos de cadena única TSC016 (HD37-"bisagra CH2 IgM"-CH2 CH3 CH1) y TSC009 (G19-4-"bisagra CH2 IgM"-CH2 CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única TSC016 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv HD37 (anti-CD19), bisagra CH2 IgM humana alterada (SEQ ID NO: 759), CH2 IgG1 humano, CH3 IgG1 humano y CH1 IgG1 humano. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC015 se determinan en SEQ ID NO: 49 y 69, respectivamente. El polipéptido de 55 cadena única TSC009 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv G19-4 (anti-CD3), bisagra CH2 IgM humana alterada (SEQ ID NO: 759), CH2 IgG1 humano, CH3 IgG1 humano y Cκ humano (YAE). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC009 se determinan en SEQ ID NO: 42 y 62, respectivamente.
Los heterodímeros de polipéptidos biespecíficos S0268 (RON, CD3) y S0269 (CD3, c-Met) se expresaron de acuerdo con el Ejemplo 1. Se obtuvieron los siguientes niveles de expresión: 2,2 μg de proteínas/mL de cultivo para S0268 y 2,7 μg/mL para S0269.
EJEMPLO 5 5
UNIÓN CELULAR DE HETERODÍMEROS DE POLIPÉPTIDOS BIESPECÍFICOS
Para comparar la efectividad de moléculas de heterodímero de polipéptidos biespecíficas en el direccionamiento a un tumoral antígeno de célula tumoral y linfocitos T, se compararon las características de unión en la célula de un 10 heterodímero de polipéptidos anti-RON (4C04 dominio de unión) x anti-CD3 (dominio de unión G19-4), S0268 (tal como se describe en el Ejemplo 4), con un andamio biespecífico diferente (proteína SCORPION™) que contiene los mismos dominios de unión, S0266. Además, se compararon las características de unión en la célula de dos heterodímeros de polipéptidos biespecíficos, TSC020 y TSC021 (tal como se describe en el Ejemplo 4), el direccionamiento de diferentes antígenos de linfocitos B (CD19 para TSC020 y CD20 para TSC021) así como un 15 antígeno de linfocitos T (CD3). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la proteína SCORPION S0266 se determinan en SEQ ID NO: 73 y 74, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de los polipéptidos de cadena única que conforman los heterodímeros de polipéptidos biespecíficos S0268, TSC020 y TSC021 se determinan en SEQ ID NO: 26 y 52 (nucleótido), 30 y 72 (aminoácido); 34 y 52 (nucleótido), 54 y 72 (aminoácido); y 35 y 52 (nucleótido), 55 y 72 (aminoácido), respectivamente (véase también Ejemplo 4). La 20 transfección transitoria en células 293 humanas produjo 6,9 μg de proteínas/mL de cultivo para S0266; 2,3 μg/mL de cultivo para S0268; 3,0 μg/mL de cultivo para TSC020; y 3,2 μg/mL de cultivo para TSC021.
Las células de carcinoma de mama MDA-MB-453 (RON+), las células de linfoma de células del manto Rec1 (CD19+, CD20+) y las células de leucemia de linfocitos T Jurkat (CD3+) se obtuvieron a partir de ATCC (Manassas, VA), y se 25 cultivaron de acuerdo con el protocolo proporcionado. Se aislaron linfocitos T de PBMC de donante usando kit de aislamiento de linfocitos T Pan Kit II de Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Alemania). Se separaron de las PMBC las células no linfocitos T marcándolas indirectamente por medio magnético con anticuerpos monoclonales conjugados por biotina y microperlas magnéticas antibiotina. A continuación se suprimieron estas células reteniéndolas en una columna rodeada por un campo magnético. Los linfocitos T no se retuvieron en la columna y se 30 recogieron en el flujo transversal.
La unión se valoró incubando 5 x 105 linfocitos T o células diana (MDA-MB-453, Rec1, Jurkat) durante 30 minutos a 4°C con moléculas biespecíficas diluidas en serie S0266 (proteína αRON × αCD3 SCORPION™) o S0268 (heterodímero de polipéptidos αRON × αCD3) (para células MDA-MB-453 y linfocitos T aislados); o TSC020 (αCD19 35 x αCD3) o TSC021 (αCD20 x αCD3) para células Rec1 y Jurkat, en concentraciones de 100 nM a 0,1 nM. Se lavaron las células tres veces y a continuación se incubaron con IgG-FITC antihumana de cabra (dilución 1:200) durante otros 30 minutos a 4°C. A continuación se lavaron de nuevo las células tres veces, se fijaron en paraformaldehído al 1% y se leyeron en un instrumento FACS-Calibur.
40
El análisis del subconjunto elevado en FSC y elevado en SSC en FlowJo v7.5 (Tree Star, Inc, Ashland, OR) demostró unión dependiente de la dosis de moléculas biespecíficas S0266 y S0268 a MDA-MB-453 y linfocitos T aislados (Figuras 8A y 8B). Inesperadamente, el heterodímero de polipéptidos S0268 se unió con afinidad similar a la molécula SCORPION™ comparable (S0266) en células MDA-MB-453 y linfocitos T, aunque carecía de potencial de avidez. También se observó mayor saturación en los tipos de células diana con el heterodímero de polipéptidos, 45 que sucedería si el heterodímero de polipéptidos se hubiera unido a una mayor estequiometría (unión 1:1 de heterodímero de polipéptidos a antígeno de superficie) que el SCORPION™ equivalente (unión 1:2 potencial del Scorpion bivalente a antígenos de superficie). La comparación del heterodímero biespecífico de direccionamiento CD19 (dominios de unión TSC020; HD37 y G19-4) y el heterodímero biespecífico de direccionamiento CD20 (dominios de unión TSC021; 2H7 y G19-4) en células Rec1 y Jurkat reveló que el heterodímero TSC020 tenía 50 superior afinidad para las células Rec1 que el heterodímero TSC021 (Figura 9A). Sin embargo, los heterodímeros TSC020 y TSC021 mostraron una unión similar a células Jurkat CD3+, que es de esperar dado que los dos heterodímeros poseen el mismo dominio de unión anti-CD3 (G19-4) (Figura 9B).
EJEMPLO 6 55
HETERODÍMEROS DE POLIPÉPTIDOS BIVALENTES Y TRIVALENTES ADICIONALES QUE USAN UN ÚNICO PAR DE DOMINIOS DE HETERODIMERIZACIÓN
Se prepararon los heterodímeros multiespecíficos adicionales: TSC046, TSC047, TSC048, TSC054, TSC055, TSC056, TSC057, TSC078, TSC079, TSC080, TSC099, TSC100, TSC101 y TSC102.
El heterodímero de polipéptidos bivalente TSC046 comprende los polipéptidos de cadena única TSC001 (HD37 CH2 CH3 CH1) y TSC039 (BMA031 CH2 CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única TSC001 comprende desde el 5 extremo amino al carboxilo: scFv HD37 (anti-CD19), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano, CH3 IgG1 humano y CH1 IgG1 humano. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC001 se determinan en SEQ ID NO: 34 y 54, respectivamente. El polipéptido de cadena única TSC039 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv BMA031 (anti-TCR), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano, CH3 IgG1 humano y Cκ humano (YAE). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC039 se determinan en SEQ ID NO: 793 y 811, 10 respectivamente.
El heterodímero de polipéptidos bivalente TSC047 comprende los polipéptidos de cadena única TSC001 (HD37 CH2 CH3 CH1) y TSC041 (CRIS7 CH2 CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única TSC041 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv CRIS7 (anti-CD3), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano, CH3 IgG1 15 humano y Cκ humano (YAE). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC041 se determinan en SEQ ID NO: 794 y 812, respectivamente.
El heterodímero de polipéptidos bivalente TSC048 comprende los polipéptidos de cadena única TSC001 (HD37 CH2 CH3 CH1) y TSC043 (OKT3-M CH2 CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única TSC043 comprende desde el 20 extremo amino al carboxilo: scFv OKT3-M (Micromet variante anti-CD3, véase también el documento US-7.635.472), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano, CH3 IgG1 humano y Cκ humano (YAE). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC043 se determinan en SEQ ID NO: 795 y 813, respectivamente.
El heterodímero de polipéptidos bivalente TSC054 comprende los polipéptidos de cadena única TSC049 (HD37 25 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 CH1) y TSC053 (G19-4 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única TSC049 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv HD37 (anti-CD19), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano (ADCC/CDC nulo) (es decir, CH2 IgG1 humano con sustituciones L234A, L235A, G237A, E318A, K320A y K322A), CH3 IgG1 humano y CH1 IgG1 humano. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC049 se determinan en SEQ ID NO: 796 y 814, respectivamente. El polipéptido de cadena única 30 TSC053 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv G19-4 (anti-CD3), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano (ADCC/CDC nulo) (es decir, CH2 IgG1 humano con sustituciones L234A, L235A, G237A, E318A, K320A y K322A), CH3 IgG1 humano y Cκ humano (YAE). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC053 se determinan en SEQ ID NO: 800 y 818, respectivamente.
35
El heterodímero de polipéptidos bivalente TSC055 comprende los polipéptidos de cadena única TSC050 (2H7 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 CH1) y TSC053 (G19-4 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única TSC050 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv 2H7 (anti-CD20), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 IgG1 humano y CH1 IgG1 humano. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC050 se determinan en SEQ ID NO: 797 y 815, respectivamente. 40
El heterodímero de polipéptidos bivalente TSC056 comprende los polipéptidos de cadena única TSC051 (P2C2 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 CH1) y TSC053 (G19-4 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única TSC051 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv P2C2 (anti-CD79), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 IgG1 humano y CH1 IgG1 humano. Las secuencias de 45 nucleótidos y aminoácidos de TSC051 se determinan en SEQ ID NO: 798 y 816, respectivamente.
El heterodímero de polipéptidos bivalente TSC057 comprende los polipéptidos de cadena única TSC052 (5D5 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 CH1) y TSC053 (G19-4 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única TSC052 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv 5D5 (anti-cMet), bisagra SCC-P IgG1 humana, 50 CH2 IgG1 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 IgG1 humano y CH1 IgG1 humano. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC052 se determinan en SEQ ID NO: 799 y 817, respectivamente.
El heterodímero de polipéptidos bivalente TSC078 comprende los polipéptidos de cadena única TSC049 (HD37 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 CH1) y TSC076 (OKT3 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena 55 única TSC076 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv OKT3 (anti-CD3), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 IgG1 humano y Cκ humano (YAE). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC076 se determinan en SEQ ID NO: 802 y 820, respectivamente.
El heterodímero de polipéptidos bivalente TSC079 comprende los polipéptidos de cadena única TSC049 (HD37 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 CH1) y TSC077 (Nuvion CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única TSC077 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv Nuvion (anti-CD3), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 IgG1 humano y Cκ humano (YAE). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC077 se determinan en SEQ ID NO: 803 y 821, respectivamente. 5
El heterodímero de polipéptidos trivalente TSC080 comprende los polipéptidos de cadena única TSC001 (HD37 CH2 CH3 CH1) y TSC064 (G19-4 CH2 CH3 Cκ(YAE) H75 Met021). El polipéptido de cadena única TSC064 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv G19-4 (anti-CD3), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano, CH3 IgG1 humano, Cκ humano (YAE), conector H75 y Met021 (anti-c-Met) scFv (con los tres restos de serina en el 10 extremo C suprimidos). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC064 se determinan en SEQ ID NO: 801 y 819, respectivamente.
El heterodímero de polipéptidos bivalente TSC099 comprende los polipéptidos de cadena única TSC049 (HD37 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 CH1) y TSC097 (4C04 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena 15 única TSC097 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv 4C04 (anti-RON), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 IgG1 humano y Cκ humano (YAE). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC097 se determinan en SEQ ID NO: 808 y 826, respectivamente.
El heterodímero de polipéptidos bivalente TSC100 comprende los polipéptidos de cadena única TSC049 (HD37 20 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 CH1) y TSC093 (CRIS7 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única TSC093 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv CRIS7 (anti-CD3), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 IgG1 humano y Cκ humano (YAE). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC093 se determinan en SEQ ID NO: 804 y 822, respectivamente.
25
El heterodímero de polipéptidos bivalente TSC101 comprende los polipéptidos de cadena única TSC049 (HD37 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 CH1) y TSC094 (OKT3-M CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única TSC094 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv OKT3-M (Micromet variante anti-CD3), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 IgG1 humano, Cκ humano (YAE). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC094 se determinan en SEQ ID NO: 805 y 823, respectivamente. 30
El heterodímero de polipéptidos bivalente TSC102 comprende los polipéptidos de cadena única TSC049 (HD37 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 CH1) y TSC095 (BMA031 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única TSC095 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv BMA031 (anti-TCR), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 IgG1 humano, Cκ humano (YAE). Las secuencias de 35 nucleótidos y aminoácidos de TSC095 se determinan en SEQ ID NO: 806 y 824, respectivamente.
Las moléculas del heterodímero de polipéptidos se expresaron y purificaron de acuerdo con el Ejemplo 1.
EJEMPLO 7 40
PROLIFERACIÓN DE LINFOCITOS T DEPENDIENTE DE LA DIANA POR HETERODÍMEROS DE POLIPÉPTIDOS
Para comparar la efectividad de diferentes moléculas de heterodímero de polipéptidos biespecíficas al inducir la activación y proliferación de linfocitos T dependientes de la diana, se compararon tres moléculas biespecíficas 45 diferentes (TSC054, TSC078 y TSC079 tal como se describe en el Ejemplo 6) con un dominio de unión anti-CD19 común (HD37) y tres dominios de unión anti-CD3 diferentes (G19-4 para TSC054, OKT3 para TSC078, HuM291 para TSC079). Como control positivo, se preparó también una molécula de acoplamiento con linfocitos T biespecífica (BiTE) conocida como bsc19x3 (véase patente de EE.UU. 7.635.472). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para bsc19x3 se determinan en SEQ ID NO: 809 y 827, respectivamente. La transfección temporal en células 293 50 humanas produjo 2,33 μg/mL de proteínas para TSC054, 0,67 μg/mL de proteínas para TSC078 y 3,5 μg/mL para TSC079.
Se obtuvieron células de linfoma de Burkitt Daudi (CD19+) y células de carcinoma de mama MDA-MB-453 (CD19-) a partir de ATCC (Manassas, VA) y se cultivaron de acuerdo con el protocolo proporcionado. Se aislaron células 55 mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre humana usando gradientes de ficol estándar. Se lavaron las células aisladas en tampón salino. Se aislaron además linfocitos T usando un kit de aislamiento de linfocitos T Pan Kit II de Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Alemania) usando el protocolo del fabricante (véase también Ejemplo 5 para más información).
Se evaluó la proliferación mediante marcado de poblaciones aisladas de PBMC o linfocitos T con éster de succinimidilo de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE). Se sembraron en placa PBMC o linfocitos T marcados con CFSE en placas de 96 pocillos con fondo en U a 150.000 ó 100.000 células/pocillo, respectivamente, con diversos números de células tumorales, para conseguir proporciones entre linfocitos T y células tumorales de 10:1 a 3:1. Se 5 añadieron a las mezclas de células concentraciones de moléculas de prueba comprendidas entre 8 nM y 0,08 pM en un total de 200 μL/pocillo en medio RPMI 1640 suplementado con suero humano o bovino al 10%, piruvato de sodio y aminoácidos no esenciales. Se incubaron las placas a 37°C, CO2 al 5% en incubadoras humidificadas. Después de 3 días, se marcaron las células con anticuerpos para análisis por citometría de flujo. Se marcaron las células y se lavaron en sus placas originales para reducir al mínimo las pérdidas de células durante las transferencias, y todo el 10 marcado se realizó en tampón salino con albúmina sérica bovina al 0,2%. En primer lugar, se preincubaron las células con 100 μg/ml de IgG humana a temperatura ambiente durante 15 min. Posteriormente, se incubaron las células con una mezcla (volumen total 50 μL) de los siguientes anticuerpos marcados con colorante: CD5-PE, CD4-APC, CD8-Pacific Blue, CD25-PE-Cy7, así como 7-amino actinomicina D (en lo sucesivo, 7AAD) durante 40 min. Se lavaron las placas dos veces, se resuspendieron en volúmenes de 80 a 120 μL y se pasaron inmediatamente en un 15 citómetro de flujo BD LSRII para adquirir el 80% del contenido de cada pocillo. Se analizaron los archivos de muestra usando software FlowJo para calcular los porcentajes y números de células que se habían sometido al menos a una división celular, de acuerdo con su perfil de CFSE, mediante activación secuencial en linfocitos T CD4+ o CD8+ activados o vivos (7AAD-, CD5+ CD25+ CD4+ o 7AAD-CD5+ CD25+ CD8+, respectivamente). Los valores medios y las desviaciones típicas se calcularon usando software Microsoft Excel. Los gráficos se representaron usando 20 Microsoft Excel o Graphpad Prism.
El análisis de las poblaciones de CD4+ y CD8+ vivos de células Daudi o células MDA-MB-453 tratadas con PBMC enteras (Figuras 10A-10D) reveló un aumento significativo en el número total de células y en el porcentaje de células en proliferación en presencia de células Daudi que muestran el antígeno CD19 diana (Figuras 10A, 10B), pero 25 ausencia de proliferación significativa en presencia de células MDA-MB-453 que carecían del antígeno CD19 (Figuras 10C, 10D). Se observó cierta proliferación en un nivel inferior con las células MDA-MB-453 y PBMC enteras, dado que estaban presentes linfocitos B (CD19+) en las PBMC, pero la proliferación global se redujo enormemente en comparación. Esta selectividad se observó también con linfocitos T aislados. La proliferación fue mayor para linfocitos T CD8+ que para linfocitos T CD4+ en presencia de células Daudi o células MDA-MB-453 30 tratadas con PBMC (Figura 10A-10D), y la proliferación inducida por TSC078 (HD37xOKT3) fue mayor generalmente para todas las concentraciones que la respuesta inducida por TSC054 (HD37xG19-4) o TSC079 (HD37 x HuM291) (Figuras 10A-10D). La proliferación inducida de linfocitos T CD4+ fue menor en todos los casos para TSC054, TSC078 y TSC079 que la bsc19x3 BiTE (Figura 10A), aunque TSC078 y TSC079 mostraron superior inducción de proliferación de linfocitos CD8+ a menores concentraciones (por ejemplo 5 pM) que la molécula BiTE (Figura 10B). 35
EJEMPLO 8
CITOTOXICIDAD DE LINFOCITOS T REDIRIGIDA POR HETERODÍMEROS DE POLIPÉPTIDOS
40
Para comparar la efectividad de diferentes moléculas de heterodímero de polipéptidos biespecíficas en la inducción de citotoxicidad de linfocitos T dependientes de la diana, se compararon cuatro moléculas biespecíficas diferentes en un ensayo de liberación de cromo (51Cr). Se sometieron a ensayo tres moléculas biespecíficas diferentes (TSC054, TSC078, TSC079, tal como se describe en el Ejemplo 6) con un dominio de unión anti-CD19 común (HD37) y tres dominios de unión anti-CD3 diferentes (G19-4 para TSC054, OKT3 para TSC078, HuM291 para TSC079) junto con 45 una cuarta molécula biespecífica (S0268, descrita en el Ejemplo 4) con un dominio de unión anti-RON (4C04) y un dominio de unión anti-CD3 (G19-4). La transfección temporal en células 293 humanas produjo aproximadamente 2,33 μg/mL de proteínas para TSC054, aproximadamente 0,67 μg/mL de proteínas para TSC078 y aproximadamente 3,5 μg/mL de proteínas para TSC079.
50
Se obtuvieron células de linfoma de Burkitt Daudi (CD19+, RON-) y células BxPC-3 (CD19-, RON+) a partir de ATCC (Manassas, VA) y se cultivaron de acuerdo con el protocolo proporcionado. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre humana usando gradientes de ficol estándar. Se lavaron las células aisladas en tampón salino. Se aislaron además linfocitos T usando un kit de aislamiento de linfocitos T Pan Kit II de Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Alemania) usando el protocolo del fabricante (véase también Ejemplo 5 para más 55 información).
Se evaluó la citotoxicidad mediante un ensayo de liberación de 51Cr. Se trataron aproximadamente 5 x 106 células Daudi o BxPC-3 con 0,3 mCi de 51Cr y se incubó durante 75 minutos a 37°C. Después de 75 minutos, se lavaron las células 3 veces con medio (RPMI + 10% FBS) y se resuspendieron en 11,5 mL de media. A partir de esta suspensión, se dispensaron 50 μL por pocillo en placas de fondo en U de 96 pocillos (aproximadamente 20.000 células/pocillo). Se añadieron concentraciones de moléculas biespecíficas comprendidas entre 10 nM y 0,1 pM a la diana (células Daudi, BxPC-3), llevando el volumen total a 100 μL/pocillo. Se incubaron las células diana a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después se añadieron 100 μL de linfocitos T aislados (aproximadamente 5 200.000) para llevar a la proporción entre linfocitos T y células diana a 10:1. Se añadieron 50 μL. de NP-40 al 0,8% a un pocillo de control que contenía células diana, se dejó durante 15 minutos, y después se añadieron 100 μL de medio para proporcionar un control de lisis total.
Se incubaron las placas durante 4 horas, se centrifugó a 1.500 rpm durante 3 minutos, y se transfirieron 25 μL de 10 sobrenadante desde cada pocillo al pocillo correspondiente de una muestra Luma de 96 pocillos. Se dejó que las placas de muestra se secaran al aire en una campana de seguridad química durante 18 horas, y después se leyó la radiactividad en un contador de centelleo Topcount usando un protocolo estándar.
El análisis de los datos de citotoxicidad mostró falta de citotoxicidad fuera de la diana en las células Daudi (RON-) a 15 partir de la molécula biespecífica dirigida anti-RON S0268 (Figura 11A). De forma similar, se produjo una ausencia de citotoxicidad directa observada a partir del tratamiento de células Daudi con TSC054 en ausencia de linfocitos T (Figura 11A). Sin embargo, se observó una acusada citotoxicidad dirigida a linfocitos T con las células Daudi en presencia de linfocitos T y una molécula biespecífica dirigida anti-CD19 (TSC054), alcanzando una lisis máxima a una concentración de entre 10 y 100 pM (Figura 11A). De forma similar, usando un segundo donador de linfocitos T 20 (Figura 11B), no se observó citotoxicidad fuera de la diana de las células BxPC-3 (CD19-) a partir de las moléculas biespecíficas dirigidas CD19-TSC054, TSC078 o TSC079, o la BiTE bsc19x3 dirigida a CD19. La molécula biespecífica S0268 dirigida anti-RON indujo citotoxicidad en células BxPC-3 (RON+), alcanzando un máximo entre 10 y 100 pM (Figura 11B).
25
EJEMPLO 9
MODULACIÓN DE PROLIFERACIÓN DE LINFOCITOS T DEPENDIENTE DE LA DIANA POR HETERODÍMEROS DE POLIPÉPTIDOS CON SECUENCIAS BISAGRA ALTERADAS
30
Para comparar la efectividad de diferentes moléculas de heterodímero de polipéptidos biespecíficas con secuencias bisagra alteradas al inducir la activación y proliferación de linfocitos T dependientes de la diana, se compararon seis heterodímeros biespecíficos diferentes (TSC100, TSC127, TSC165, TSC166, TSC167 y TSC168 con un dominio de unión anti-CD19 común (HD37), un dominio de unión anti-CD3 común (Cris7) y cinco construcciones de bisagra diferentes (bisagra SCC-P IgG1 para TSC100 y TSC127, bisagra IgA2 sin el primer resto Val unido a una bisagra 35 central IgG1 humana para TSC165, bisagra SSS-P IgG1 unida a una bisagra central IgG1 humana para TSC166, una parte de bisagra IgG3 mutada unida a una bisagra central IgG1 para TSC167, y el dominio CH2 IgM sin la primera Val unida a una bisagra central IgG1 para TSC168).
Más específicamente, el heterodímero biespecífico TSC100 es tal como se describe en el Ejemplo 6. 40
El heterodímero biespecífico TSC127 comprende los polipéptidos de cadena única TSC125 (Cris7 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 CH1) y TSC096 (HD37 CH2(ADCC/CDC nulo) CH3 Cκ(YAE). El polipéptido de cadena única TSC125 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv Cris7 humanizada (anti-CD3), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 IgG1 humano y CH1 IgG1 humano. Las secuencias de nucleótidos y 45 aminoácidos de TSC125 se determinan en SEQ ID NO: 865 y 874, respectivamente. El polipéptido de cadena única TSC096 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv HD37 (anti-CD19), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 IgG1 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 IgG1 humano y Cκ humano (YAE). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC096 se determinan en SEQ ID NO: 807 y 825, respectivamente.
50
El heterodímero biespecífico TSC165 comprende los polipéptidos de cadena única TSC157 (Cris7 IgA2UH CH2 (ADCC/CDC nulo) CH3 CH1) y TSC161 (HD37 IgA2UH CH2 (ADCC/CDC nulo) CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única TSC157 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv Cris7 humanizada (anti-CD3), bisagra IgA2 humana sin la primera Val unida con una bisagra central IgG1 humana, CH2 IgG1 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 IgG1 humano y CH1 IgG1 humano. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC157 se determinan en 55 SEQ ID NO: 866 y 875, respectivamente. El polipéptido de cadena única TSC161 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv HD37 (anti-CD19), bisagra IgA2 humana sin la primera Val unida con una bisagra central IgG1 humana, CH2 IgG1 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 IgG1 humano y Cκ humano (YAE). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC161 se determinan en SEQ ID NO: 870 y 879, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de la bisagra usada en TSC157 y TSC161 se determina en SEQ ID NO: 748.
El heterodímero biespecífico TSC166 comprende el polipéptido de cadena única TSC158 (Cris7 IgG1miniUH CH2 (ADCC/CDC nulo) CH3 CH1) y TSC162 (HD37 IgG1miniUH CH2 (ADCC/CDC nulo) CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única TSC158 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv Cris7 humanizada (anti-CD3), 5 bisagra SSC-P IgG1 humana unida con una bisagra central IgG1 humana, CH2 IgG1 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 IgG1 humano y CH1 IgG1 humano. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC158 se determinan en SEQ ID NO: 867 y 876, respectivamente. El polipéptido de cadena única TSC162 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv HD37 (anti-CD19), bisagra SSC-P IgG1 humana unida con una bisagra central IgG1 humana, CH2 IgG1 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 IgG1 humano y Cκ humano (YAE). Las secuencias de 10 nucleótidos y aminoácidos de TSC162 se determinan en SEQ ID NO: 871 y 880. La secuencia de aminoácidos de la bisagra usada en TSC158 y TSC162 se determina en SEQ ID NO: 750.
El heterodímero biespecífico TSC167 comprende el polipéptido de cadena única TSC159 (Cris7 IgG3UH CH2 (ADCC/CDC nulo) CH3 CH1) y TSC163 (HD37 IgG3UH CH2 (ADCC/CDC nulo) CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de 15 cadena única TSC159 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv Cris7 humanizada (anti-CD3), una parte de bisagra Igg3 humana mutada unida con una bisagra central IgG1 humana, CH2 IgG1 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 IgG1 humano y CH1 IgG1 humano. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC159 se determinan en SEQ ID NO: 868 y 877, respectivamente. El polipéptido de cadena única TSC163 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv HD37 (anti-CD19), una parte de bisagra IgG3 humana mutada unida con una 20 bisagra central IgG1 humana, CH2 IgG1 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 IgG1 humano y Cκ humano (YAE). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC163 se determinan en SEQ ID NO: 872 y 881. La secuencia de aminoácidos de la bisagra usada en TSC159 y TSC163 se determina en SEQ ID NO: 751.
El heterodímero biespecífico TSC168 comprende el polipéptido de cadena única TSC160 (Cris7 IgMCH2UH CH2 25 (ADCC/CDC nulo) CH3 CH1) y TSC164 (HD37 IgMCH2UH CH2 (ADCC/CDC nulo) CH3 Cκ(YAE)). El polipéptido de cadena única TSC160 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv Cris7 humanizada (anti-CD3), CH2 IgM humano sin la primera Val unida con una bisagra central IgG1 humana, CH2 IgG1 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 IgG1 humano y CH1 IgG1 humano. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC160 se determinan en SEQ ID NO: 869 y 878, respectivamente. El polipéptido de cadena única TSC163 comprende desde el extremo 30 amino al carboxilo: scFv HD37 (anti-CD19), CH2 IgM humano sin la primera Val unida con una bisagra central IgG1 humana, CH2 IgG1 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 IgG1 humano y Cκ humano (YAE). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC164 se determinan en SEQ ID NO: 873 y 882. La secuencia de aminoácidos de la bisagra usada en TSC160 y TSC164 se determina en SEQ ID NO: 759.
35
Como control positivo, se preparó también una molécula de acoplamiento con linfocitos T biespecífica (BiTE) conocida como bsc19x3 (véase patente de EE.UU. 7.635.472). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para bsc19x3 se determinan en SEQ ID NO: 809 y 827, respectivamente.
La transfección temporal en células 293 humanas produjo 3,2 μg de proteínas/mL de cultivo para TSC100, 6,1 μg de 40 proteínas/mL de cultivo para TSC127, 4,8 μg de proteínas/mL de cultivo para TSC165, 6,2 μg de proteínas/mL de cultivo para TSC166, 6,4 μg de proteínas/mL de cultivo para TSC167 y 6,4 μg/mL de proteínas para TSC168.
Se obtuvieron células de linfoma de Burkitt Daudi (CD19+) y células de carcinoma de próstata C4-2 (CD19-) a partir de ATCC (Manassas, VA) y MD Anderson Cancer Center (Houston, TX) y se cultivaron de acuerdo con el protocolo 45 proporcionado. Se aislaron linfocitos T usando un kit de aislamiento de linfocitos T Pan Kit II de Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Alemania) usando el protocolo del fabricante (véase también Ejemplo 5 para más información).
Se evaluó la proliferación mediante marcado de poblaciones de linfocitos T aisladas con éster de succinimidilo de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE). Se sembraron en placa linfocitos T marcados con CFSE en placas de 96 50 pocillos con fondo en U a 100.000 células/pocillo, con 10.000 células tumorales/pocillo, para conseguir una proporción entre linfocitos T y células tumorales de 10:1. Se añadieron concentraciones de moléculas de prueba comprendidas entre 5 nM y 0,005 pM a las mezclas de células en un total de 200 μL/pocillo en medio RPMI 1640 suplementado con suero humano o bovino al 10%, piruvato de sodio y aminoácidos no esenciales. Se incubaron las placas a 37°C, CO2 al 5% en incubadoras humidificadas. Después de 3 días, se marcaron las células con 55 anticuerpos para análisis por citometría de flujo. Se marcaron las células y se lavaron en sus placas originales para reducir al mínimo las pérdidas de células durante las transferencias, y todo el marcado se realizó en tampón salino con albúmina sérica bovina al 0,2%. En primer lugar, se preincubaron las células con 100 μg/ml de IgG humana a temperatura ambiente durante 15 min. Posteriormente, se incubaron las células con una mezcla (volumen total 50 μL) de los siguientes anticuerpos marcados con colorante: CD5-PE, CD4-APC, CD8-Pacific Blue, CD25-PE-Cy7, así como 7-amino actinomicina D (en lo sucesivo 7AAD) durante 40 minutos. Se lavaron las placas dos veces, se resuspendieron en volúmenes de 80 a 120 μL y se pasaron inmediatamente en un citómetro de flujo BD LSRII para adquirir el 80% del contenido de cada pocillo. Se analizaron los archivos de muestra usando software FlowJo para calcular los porcentajes y números de células que se habían sometido al menos a una división celular, de acuerdo 5 con su perfil de CFSE, mediante activación secuencial en linfocitos T CD4+ o CD8+ vivos activados (7AAD-, CD5+ CD25+ CD4+ o 7AAD-CD5+ CD25+ CD8+, respectivamente). Los valores medios y las desviaciones típicas se calcularon usando software Microsoft Excel. Los gráficos se representaron usando Microsoft Excel o Graphpad Prism.
10
El análisis de poblaciones de CD4+ y CD8+ en vivo de células Daudi o células C4-2 tratadas con linfocitos T aislados revelaron un aumento significativo en el número total de células y en el porcentaje de células en proliferación en presencia de células Daudi que muestran el antígeno CD19 diana, pero ausencia de proliferación significativa en presencia de células C4-2 que carecían del antígeno CD19 (Figura 12). La proliferación de CD8+ células fue muy similar para moléculas biespecíficas con la bisagra IgG1 por omisión (TSC100) así como con bisagras más largas 15 (TSC166, TSC167, TSC168). Se observó una proliferación de CD8+ ligeramente superior a bajas concentraciones con la molécula biespecífica con la bisagra superior IgA2 más corta (TSC165). De forma similar, se observaron diferencias más marcadas con proliferación de células CD4+, donde la molécula que contenía la bisagra IgA2 más corta (TSC165) mostró mayor proliferación como concentraciones máximas que la bisagra IgG1 estándar (TSC100), y las moléculas con bisagras más largas (TSC166, TSC167, TSC168) mostraron menor proliferación. 20
Para confirmar la actividad diferencial de la bisagra IgA2, se llevó a cabo un segundo experimento de proliferación con una valoración para menores concentraciones de proteínas (Figura 13), comparando la molécula biespecífica que contenía la bisagra IgA2 (TSC165) con dos lotes de producción diferentes de una molécula biespecífica que presentaba la bisagra IgG1 por omisión (TSC127) y la molécula bsc19x3 BiTE. De forma similar al experimento 25 anterior, se observó menos variación con proliferación de células CD8+, con TSC165 mostrando una inducción de proliferación comparable o superior que bsc19x3, que a su vez mostró una proliferación comparable o ligeramente superior que TSC127. De nuevo, de forma similar al experimento anterior, estas tendencias se repitieron de una forma aumentada con la proliferación de células CD4+, donde TSC165 y bsc19x3 mostraron una proliferación comparable, que a su vez era apreciablemente mayor que la de TSC127. 30
EJEMPLO 10
MODULACIÓN DE CITOTOXICIDAD DE LINFOCITOS T REDIRIGIDA POR HETERODÍMEROS DE POLIPÉPTIDOS CON SECUENCIAS BISAGRA ALTERADAS 35
Para comparar la efectividad de cambio de la composición de bisagra en moléculas de heterodímero de polipéptidos biespecíficas en la inducción de citotoxicidad de linfocitos T dependiente de la diana, se compararon cinco moléculas biespecíficas diferentes en un ensayo de liberación de cromo (51Cr). Se compararon cinco moléculas biespecíficas diferentes (TSC100, TSC165, TSC166, TSC167 y TSC168, tal como se describe en el Ejemplo 9) con un dominio de 40 unión anti-CD19 común (HD37), un dominio de unión anti-CD3 común (Cris7) y cinco construcciones de bisagra diferentes (bisagra SCC-P IgG1 para TSC100 y TSC127, bisagra IgA2 sin la primera Val unida a una bisagra central IgG1 humana para TSC165, bisagra SSS-P IgG1 unida a una bisagra central IgG1 humana para TSC166, una parte de bisagra IgG3 mutada unida a una bisagra central IgG1 humana para TSC167 y el dominio CH2 IgM sin la primera Val unida a una bisagra central IgG1 humana para TSC168). 45
Se obtuvieron células de linfoma de Burkitt Daudi (CD19+, RON-) a partir de ATCC (Manassas, VA) y se cultivaron de acuerdo con el protocolo proporcionado. Se aislaron linfocitos T usando un kit de aislamiento de linfocitos T Pan Kit II de Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Alemania) usando el protocolo del fabricante (véase también Ejemplo 5 para más información). 50
Se evaluó la citotoxicidad mediante un ensayo de liberación de 51Cr. Se trataron aproximadamente 5 x 106 células Daudi con 0,3 mCi de 51Cr y se incubó durante 75 minutos a 37°C. Después de 75 minutos, se lavaron las células 3 veces con medio (RPMI + FBS al 10%) y se resuspendieron en 11,5 mL de media. A partir de esta suspensión, se dispensaron 50 μL por pocillo en placas de fondo en U de 96 pocillos (aproximadamente 20.000 células/pocillo). Se 55 añadieron concentraciones de moléculas biespecíficas comprendidas entre 10 nM y 0,1 pM a la diana (Daudi) células, llevando el volumen total a 100 μL/pocillo. Se incubaron las células diana a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación se añadieron 100 μL de linfocitos T aislados (aproximadamente 200.000) para llevar la proporción entre linfocitos T y células diana a 10:1. Se añadieron 50 μL, de NP-40 al 0,8% a un pocillo de control que contenía células diana, se dejó durante 15 minutos, a continuación se añadieron 100 μL de medio para proporcionar un control de lisis total.
Se incubaron las placas durante 4 horas, se centrifugó a 1.500 rpm durante 3 minutos y se transfirieron 25 μL de sobrenadante desde cada pocillo al pocillo correspondiente de una placa de muestra Luna de 96 pocillos. Se dejó 5 que las placas de muestra se secaran al aire en una campana de seguridad química durante 18 horas, y después se leyó la radiactividad en un contador de centelleo Topcount usando un protocolo estándar.
El análisis de los datos de citotoxicidad mostró una intensa citotoxicidad dirigida a linfocitos T con las células Daudi en presencia de linfocitos T y las moléculas biespecíficas dirigidas anti-CD19 (TSC100-TSC168), para alcanzar una 10 lisis máxima a una concentración de entre 5 y 50 pM (Figura 14). De manera similar a las tendencias observadas en el Ejemplo 9, la molécula biespecífica con una región bisagra superior IgA2 (TSC165) mostró una citotoxicidad comparable o mayor a la de la molécula con la región bisagra superior IgG1 estándar (TSC100), mientras que las moléculas con regiones bisagra superiores más largas (TSC166, TSC167, TSC168) fueron menos potentes en la inducción de citotoxicidad. 15
EJEMPLO 11
HETERODÍMEROS BIESPECÍFICOS CON VARIACIONES DE LOS CONECTORES CH3-CH1 Y CH3-Cκ
20
Se prepararon los siguientes heterodímeros biespecíficos con variaciones de conectores CH3-CH1 y CH3-Cκ:
El heterodímero biespecífico TSC151 comprende los polipéptidos de cadena única TSC145 y TSC148. El polipéptido de cadena única TSC145 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv Cris7 humanizada (anti-CD3), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 humano y CH1 IgG1 humano. El CH3 humano 25 y el CH1 IgG1 humano están unidos por un conector que tiene la secuencia GGGSS (SEQ ID NO: 847). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC145 se determinan en SEQ ID NO: 853 y 859, respectivamente. El polipéptido de cadena única TSC148 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv HD37 (anti-CD19), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 humano y Cκ humano (YAE). El CH3 humano y el Cκ humano (YAE) están unidos con un conector que tiene la secuencia GGGSR (SEQ ID NO: 850) donde R 30 puede verse alternativamente como la primera arginina de Cκ humano (YAE). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC148 se determinan en SEQ ID NO: 856 y 862, respectivamente.
El heterodímero biespecífico TSC152 comprende los polipéptidos de cadena única TSC146 y TSC149. El polipéptido de cadena única TSC146 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv Cris7 humanizada (anti-CD3), 35 bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 humano y CH1 IgG1 humano. El CH3 humano y el CH1 IgG1 humano están unidos por un conector que tiene la secuencia SYSPNS (SEQ ID NO: 848). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC146 se determinan en SEQ ID NO: 854 y 860, respectivamente. El polipéptido de cadena única TSC149 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv HD37 (anti-CD19), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 humano y Cκ humano (YAE). El CH3 humano y 40 el Cκ humano (YAE) están unidos con un conector que tiene la secuencia SYSPNSR (SEQ ID NO: 851) donde R puede verse alternativamente como la primera arginina de Cκ humano (YAE). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC149 se determinan en SEQ ID NO: 857 y 863, respectivamente.
El heterodímero biespecífico TSC153 comprende los polipéptidos de cadena única TSC147 y TSC150. El polipéptido 45 de cadena única TSC147 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv Cris7 humanizada (anti-CD3), bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 humano y CH1 IgG1 humano. El CH3 humano y el CH1 IgG1 humano están unidos por un conector que tiene la secuencia SSLNTPNS (SEQ ID NO: 849). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC147 se determinan en SEQ ID NO: 855 y 861, respectivamente. El polipéptido de cadena única TSC150 comprende desde el extremo amino al carboxilo: scFv HD37 (anti-CD19), 50 bisagra SCC-P IgG1 humana, CH2 humano (ADCC/CDC nulo), CH3 humano y Cκ humano (YAE). El CH3 humano y el Cκ humano (YAE) están unidos con un conector que tiene la secuencia SSLNTPNSR (SEQ ID NO: 852) donde R puede verse alternativamente como la primera arginina de Cκ humano (YAE). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TSC150 se determinan en SEQ ID NO: 858 y 864, respectivamente.
55
Los heterodímeros biespecíficos anteriores se expresaron de acuerdo con el Ejemplo 1. Se obtuvieron los siguientes niveles de expresión: 9,2 μg de proteínas/ml de cultivo para TSC151, 11,2 μg de proteínas/ml de cultivo para TSC152 y 14,7 μg de proteínas/ml de cultivo para TSC153. En comparación, se obtuvieron aproximadamente 6 μg de proteínas/ml de cultivo para heterodímeros con un conector CH3-CH1 y CH3-Cκ que tiene la secuencia de aminoácidos KSR (SEQ ID NO: 846).
Las diversas realizaciones descritas anteriormente pueden combinarse para proporcionar realizaciones adicionales. Los aspectos de las realizaciones pueden modificarse en caso necesario para emplear conceptos de las diversas patentes, solicitudes y publicaciones con el fin de proporcionar más realizaciones adicionales. 5
Estos y otros cambios pueden realizarse en las realizaciones a la luz de la descripción detallada anterior. En general, en las siguientes reivindicaciones, los términos usados no deben entenderse como limitativos de las realizaciones específicas divulgadas en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, sino que debe entenderse que incluyen todas las realizaciones posibles junto con el alcance completo de equivalentes para los cuales se establecen las 10 reivindicaciones. En consecuencia, las reivindicaciones no están limitadas por la descripción.

Claims (21)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un heterodímero de polipéptidos, que comprende:
    (a) un primer polipéptido de cadena única (SCP-I) que comprende de uno a cuatro dominios de unión que se unen 5 específicamente a entre una y cuatro dianas, una bisagra (H-I), un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas (HD-I) y un dominio CH2 y CH3 de inmunoglobulinas de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD o cualquier combinación de las mismas (CH2CH3-I); y
    (b) un segundo polipéptido de cadena única (SCP-II) que comprende de cero a cuatro dominios de unión que se 10 unen específicamente a entre cero y cuatro dianas, una bisagra (H-II), un dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas (HD-II) y un dominio CH2 y CH3 de inmunoglobulinas de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD o cualquier combinación de las mismas (CH2CH3-II),
    donde 15
    (i) el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del primer polipéptido de cadena única (HD-I) y el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del segundo polipéptido de cadena única (HD-II) se asocian preferentemente entre sí para formar un heterodímero de polipéptidos formado por el primer polipéptido de cadena única (SCP-I) y el segundo polipéptido de cadena única (SCP-II), 20
    (1) el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del primer polipéptido de cadena única (HD-I) comprende una primera región CH1 de inmunoglobulinas, y el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del segundo polipéptido de cadena única (HD-II) comprende una primera región CL de inmunoglobulinas, o
    (2) el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del primer polipéptido de cadena única (HD-I) comprende 25 una primera región CL de inmunoglobulinas, y el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del segundo polipéptido de cadena única (HD-II) comprende una primera región CH1 de inmunoglobulinas; y
    (ii) donde la primera región CL de inmunoglobulinas es una región Cκ de inmunoglobulinas humana alterada con uno o más aminoácidos de una región Cκ humana natural sustituida en N29, N30, Q52, V55, T56, S68 o T70, 30
    Siempre que el heterodímero de polipéptidos comprenda al menos dos dominios de unión que se unen específicamente al menos a dos dianas diferentes.
  2. 2. El heterodímero de polipéptidos de acuerdo con la reivindicación 1, donde los dominios de unión son 35 polipéptidos Fv de cadena única (scFv).
  3. 3. El heterodímero de polipéptidos de acuerdo con la reivindicación 1, donde el heterodímero de polipéptidos comprende dos dominios de unión (BD1 y BD2), donde preferentemente el primer dominio de unión (BD1) está en el primer polipéptido de cadena única (SCP-I) y el segundo dominio de unión (BD2) está en el 40 segundo polipéptido de cadena única (SCP-II).
  4. 4. El heterodímero de polipéptidos de acuerdo con la reivindicación 3, donde el primer dominio de unión (BD1) está en el extremo amino en el CH2CH3-I del primer polipéptido de cadena única, y el segundo dominio de unión (BD2) está en el extremo amino en el CH2CH3-II del segundo polipéptido de cadena única. 45
  5. 5. El heterodímero de polipéptidos de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde el heterodímero de polipéptidos comprende tres dominios de unión (BD1, BD2 y BD3).
  6. 6. El heterodímero de polipéptidos de acuerdo con la reivindicación 1, donde el heterodímero de 50 polipéptidos comprende cuatro dominios de unión (BD1, BD2, BD3 y BD4), donde preferentemente HD-I y CH2CH3-I están dispuestos entre BD1 y BD2, y HD-II y CH2CH3-II están dispuestos entre BD3 y BD4.
  7. 7. El heterodímero de polipéptidos de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde el heterodímero de polipéptidos comprende de cinco a ocho dominios de unión. 55
  8. 8. El heterodímero de polipéptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde al menos uno de los dominios de unión se une específicamente a, o es un antagonista de, un complejo TCR, TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD28, CD79b, hiper-IL-6, mono-IL-10, CD86, CD20, PSMA, CD19, HLA-DR, Ron, c-Met, CEACAM-6, LIGHT, GITRL, CD40, PDL1, PDL2, HVEM, LTBR, EGFR, EGFRvIII, ErbB2, ErbB3, ErbB4, IGF1R, EphA2, PDGFR, VEGFR1-4, angiopoyetina 2, CD64, CD32A, CD16, CD71, TNFR1, TNFR2, TWEAKR, TACI, BAFF-R, BCMA, FAS, CD32B, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD70, TNFα, IL-6, hiper-IL-6, IL-2, IL-1, IL-7, IL-8, IL-17A/C, IP-10, IFNγ, IFNα, RANKL, FASL, TGFβ, IL10, IL17A/F, CSF2, IGF1, IGF2, BLyS/APRIL, HGF, MSP, EGF (incluyendo epirregulina, herrregulina, β-regulina, neurregulina), HIF-1α, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD, TNFα, 5 Wnt, sHH, TGFβ, PDGF, TWEAK, EpCAM, CEA, PCTA-1, STEAP-1, PSCA, ALCAM (CD166), EphA2, CD151, CA-125, MUC-1, MAGE-1, TROP2, CCR5, HER-3, HER-4, EGFR, CEA, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5CEACAM-6, LIGHT, GITRL, CD40, PDL1, PDL2, HVEM, LTBR, EGFR, EGFRvIII, ErbB2, ErbB3, ErbB4, IGF1R, EphA2, PDGFR, VEGFR1-4, angiopoyetina 2, CD64, CD32A, CD16, CD71, TNFR1, TNFR2, TWEAKR, TACI, BAFF-R, BCMA, FAS, CD32B, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD70, TNFα, IL-6, hiper-IL-6, IL-2, IL-1, IL-7, IL-8, IL-17A/C, IP-10, IFNγ, IFNα, RANKL, FASL, TGFβ, IL10, IL17A/F, CSF2, IGF1, IGF2, BLyS/APRIL, HGF, MSP, EGF (incluyendo epirregulina, herrregulina, β-regulina, neurregulina), HIF-1α, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD, TNFα, 5 Wnt, sHH, TGFβ, PDGF, TWEAK, EpCAM, CEA, PCTA-1, STEAP-1, PSCA, ALCAM (CD166), EphA2, CD151, CA-125, MUC-1, MAGE-1, TROP2, CCR5, HER-3, HER-4, EGFR, CEA, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5CEACAM-6, LIGHT, GITRL, CD40, PDL1, PDL2, HVEM, LTBR, EGFR, EGFRvIII, ErbB2, ErbB3, ErbB4, IGF1R, EphA2, PDGFR, VEGFR1-4, angiopoyetina 2, CD64, CD32A, CD16, CD71, TNFR1, TNFR2, TWEAKR, TACI, BAFF-R, BCMA, FAS, CD32B, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD70, TNFα, IL-6, hiper-IL-6, IL-2, IL-1, IL-7, IL-8, IL-17A/C, IP-10, IFNγ, IFNα, RANKL, FASL, TGFβ, IL10, IL17A/F, CSF2, IGF1, IGF2, BLyS/APRIL, HGF, MSP, EGF (incluyendo epirregulina, herrregulina, β-regulina, neurregulina), HIF-1α, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD, TNFα, 5 Wnt, sHH, TGFβ, PDGF, TWEAK, EpCAM, CEA, PCTA-1, STEAP-1, PSCA, ALCAM (CD166), EphA2, CD151, CA-125, MUC-1, MAGE-1, TROP2, CCR5, HER-3, HER-4, EGFR, CEA, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5CEACAM-6, LIGHT, GITRL, CD40, PDL1, PDL2, HVEM, LTBR, EGFR, EGFRvIII, ErbB2, ErbB3, ErbB4, IGF1R, EphA2, PDGFR, VEGFR1-4, angiopoyetina 2, CD64, CD32A, CD16, CD71, TNFR1, TNFR2, TWEAKR, TACI, BAFF-R, BCMA, FAS, CD32B, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD70, TNFα, IL-6, hiper-IL-6, IL-2, IL-1, IL-7, IL-8, IL-17A/C, IP-10, IFNγ, IFNα, RANKL, FASL, TGFβ, IL10, IL17A/F, CSF2, IGF1, IGF2, BLyS/APRIL, HGF, MSP, EGF (incluyendo epirregulina, herrregulina, β-regulina, neurregulina), HIF-1α, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD, TNFα, 5 Wnt, sHH, TGFβ, PDGF, TWEAK, EpCAM, CEA, PCTA-1, STEAP-1, PSCA, ALCAM (CD166), EphA2, CD151, CA-125, MUC-1, MAGE-1, TROP2, CCR5, HER-3, HER-4, EGFR, CEA, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5CEACAM-6, LIGHT, GITRL, CD40, PDL1, PDL2, HVEM, LTBR, EGFR, EGFRvIII, ErbB2, ErbB3, ErbB4, IGF1R, EphA2, PDGFR, VEGFR1-4, angiopoyetina 2, CD64, CD32A, CD16, CD71, TNFR1, TNFR2, TWEAKR, TACI, BAFF-R, BCMA, FAS, CD32B, CD21, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD70, TNFα, IL-6, hiper-IL-6, IL-2, IL-1, IL-7, IL-8, IL-17A/C, IP-10, IFNγ, IFNα, RANKL, FASL, TGFβ, IL10, IL17A/F, CSF2, IGF1, IGF2, BLyS/APRIL, HGF, MSP, EGF (incluyendo epirregulina, herrregulina, β-regulina, neurregulina), HIF-1α, VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD, TNFα, 5 Wnt, sHH, TGFβ, PDGF, TWEAK, EpCAM, CEA, PCTA-1, STEAP-1, PSCA, ALCAM (CD166), EphA2, CD151, CA-125, MUC-1, MAGE-1, TROP2, CCR5, HER-3, HER-4, EGFR, CEA, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5
  9. 9. El heterodímero de polipéptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el uno o más aminoácidos de una región Cκ humana natural están sustituidos por una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas de entre Ala (A), Arg (R), Trp (W), Tyr (Y), Glu (E), Gln (Q), Lys (K), Asp (D), Met (M), Ser (S) y Phe (F). 20
  10. 10. El heterodímero de polipéptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la región Cκ de inmunoglobulinas humana alterada comprende las siguientes sustituciones: (i) N30Y V55A T70E; o (ii) N30M, V55A T70E.
    25
  11. 11. El heterodímero de polipéptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la región CH1 es una región CH1 de inmunoglobulinas humana alterada que comprende una sustitución de aminoácidos por la cual Val (V) en la posición 68 es sustituido por Lys (K), Arg (R) o His (H), y donde la región Cκ es una región Cκ de inmunoglobulinas humana alterada que comprende una sustitución de aminoácidos por la cual Leu (L) en la posición 27 es sustituido por Asp (D) o Glu (E) o donde la región CH1 es una región CH1 de 30 inmunoglobulinas humana alterada que comprende una sustitución de aminoácidos por la cual Val (V) en la posición 68 es sustituido por Asp (D) o Glu (E), y donde la región Cκ es una región Cκ de inmunoglobulinas humana alterada que comprende una sustitución de aminoácidos por la cual Leu (L) en la posición 27 se modifica a Lys (K), Arg (R) o His (H).
    35
  12. 12. El heterodímero de polipéptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde la primera región CH1 es una región CH1 de inmunoglobulinas humana alterada con la cisteína de una región CH1 de inmunoglobulinas humana natural que interviene en la formación de un enlace de disulfuro con una región CL de inmunoglobulinas humana natural suprimida o sustituida.
    40
  13. 13. El heterodímero de polipéptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la región Cκ es una región Cκ de inmunoglobulinas humana alterada con el residuo de cisteína de una región Cκ humana natural que interviene en la formación de un enlace de disulfuro con una región CH1 de inmunoglobulinas humana natural suprimida o sustituida.
    45
  14. 14. El heterodímero de polipéptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 donde la bisagra de los polipéptidos de cadena única primero y segundo es una región bisagra de inmunoglobulinas.
  15. 15. El heterodímero de polipéptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 donde la región bisagra está 50
    (a) en el extremo amino para CH2CH3-I o CH2CH3-II,
    (b) dispuesta entre el dominio de unión y el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del primer polipéptido de cadena única (HD-I) y/o el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas del segundo 55 polipéptido de cadena única (HD-II),
    (c) dispuesta entre el dominio de heterodimerización de inmunoglobulinas y CH2CH3-I o CH2CH3-II,
    (d) en el extremo amino del primer o el segundo polipéptido de cadena única,
    (e) una región bisagra de lectina de tipo C,
    (f) un péptido NKg2A o NKg2D, o un derivado de los mismos, 5
    (g) dispuesta entre CH2CH3-I y un dominio de unión, o
    (h) en el extremo carboxilo del primer o el segundo polipéptido de cadena única.
    10
  16. 16. El heterodímero de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el primer polipéptido de cadena única comprende un dominio de unión que se une específicamente a un complejo TCR o un componente del mismo, y el segundo polipéptido de cadena única comprende un dominio de unión que se une específicamente a un antígeno específico de tumor.
    15
  17. 17. Una composición que comprende un heterodímero de polipéptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
  18. 18. El heterodímero de polipéptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para su uso en: 20
    a) un procedimiento para dirigir la activación de linfocitos T, donde el heterodímero de polipéptidos comprende un dominio de unión que se une específicamente a TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε o una combinación de los mismos, y un segundo dominio de unión que se une específicamente a una diana diferente, o
    b) la inhibición del crecimiento, metástasis o crecimiento metastásico de una malignidad, donde el heterodímero de 25 polipéptidos comprende un dominio de unión que se une específicamente a TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, c-Met o Ron.
    c) el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria, donde el heterodímero de polipéptidos comprende un dominio de unión que se une específicamente a TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε o CD28.
    d) el tratamiento de un trastorno o enfermedad asociado a linfocitos B, donde el heterodímero de polipéptidos 30 comprende un dominio de unión que se une específicamente a TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ, o CD3ε, y un segundo dominio de unión que se une específicamente a CD19, CD20, CD79b o HLA-DR.
  19. 19. Un vector de expresión capaz de expresar el heterodímero de polipéptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende un primer polinucleótido que codifica el primer polipéptido de cadena 35 única y un segundo polinucleótido que codifica el segundo polipéptido de cadena única.
  20. 20. Una célula hospedadora que comprende (i) el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 19 o (ii) vectores de expresión primero y segundo capaces de expresar los polipéptidos de cadena única primero y segundo, respectivamente, del heterodímero de polipéptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 40 16.
  21. 21. Un procedimiento para preparar un heterodímero de polipéptidos, que comprende:
    (a) cultivo de una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 20 en condiciones adecuadas para expresar 45 los polipéptidos de cadena única primero y segundo, y
    (b) aislamiento o purificación opcionales de los heterodímeros formados a partir de los polipéptidos de cadena única primero y segundo desde el cultivo.
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