CN110327458B - 自分泌vegfb在t细胞代谢与功能以及肿瘤免疫治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及自分泌VEGF‑B促进T细胞代谢与功能以及在肿瘤免疫治疗中的应用。本发明首次公开了血管内皮生长因子B(VEGF‑B)是活化的T细胞不同亚型选择性分泌的代谢调控因子。本发明通过抗体或肽活化T细胞，和/或采用能够促进线粒体生物合成的激动剂，或调控线粒体相关的ROS/AP‑1信号的试剂，通过ROS/AP‑1信号通路能够诱导活化的T细胞分泌VEGF‑B，从而促进T细胞的脂肪酸摄取、抗凋亡、抗肿瘤活性等。本发明通过肿瘤微环境编程T淋巴细胞的代谢，在肿瘤免疫治疗中具有广泛的应用前景。

Description

自分泌VEGFB在T细胞代谢与功能以及肿瘤免疫治疗中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及自分泌VEGF-B促进T细胞代谢与功能以及在肿瘤免疫治疗中的应用。
背景技术
在病毒感染，炎症和肿瘤等条件下，初始T淋巴细胞被抗原递呈细胞激活后能够增殖并向效应和记忆T细胞亚群分化，以对抗威胁机体的因素。在此过程中，活化的T淋巴细胞能够产生大量的信号分子，如细胞因子、生长因子等，并以自分泌或旁分泌模式调节细胞形态、增殖、迁移和分化；同时，生理刺激被认为是影响T淋巴细胞代谢和功能的关键因素。研究表明，葡萄糖的代谢对于CD8+效应T细胞分泌INF-γ至关重要；治疗性粪便微生物群移植(FMT)可增加CD4+T细胞IL-10的分泌，从而减少结肠炎症。最近的一项研究表明，由缺氧激活的浸润于肿瘤的CD8+T效应细胞可以分泌血管内皮生长因子A(VEGF-A)调节肿瘤的发展，并且缺乏VEGF-A的T细胞能够加速肿瘤血管化。
越来越多的证据表明，T细胞的活化表现出了对营养的选择性。与肿瘤细胞相似，效应T细胞优先利用有氧糖酵解，葡萄糖或氨基酸的缺乏就会加剧T细胞与肿瘤细胞之间的竞争。作为代谢工厂，T细胞激活后其线粒体必须精确地从氧化磷酸化状态向糖酵解效应状态转变。然而，由于线粒体的功能障碍，长期刺激的淋巴细胞表现出更高水平的活性氧。同时，脂肪酸的摄取与T细胞的代谢能力相协调。研究表明，记忆性或调节性T细胞可以摄取游离脂肪酸，并氧化提供ATP、乙酰辅酶A和NADPH，使其长期存活。然而，究竟是哪种分泌因子帮助活化的效应T淋巴细胞对其代谢过程进行重新编程并影响其免疫活性，目前仍不清楚。
氧化应激被认为是引起众多人类疾病进展性损害的关键调节因子，并伴随着与炎症信号的加强和代谢功能的障碍。在激活信号、细胞因子失衡或过度抗原刺激下，氧化应激介导的活性氧水平(ROS)可诱导细胞的凋亡。细胞内的ROS主要通过NOX(NADPH氧化酶)和SOD(超氧化物歧化酶)的催化得以形成。抗氧化化合物，如N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)、谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢酶，能够抑制氧化应激，防止细胞凋亡，有利于临床治疗。
VEGF-B是血管内皮生长因子中的一种，被发现在氧化应激相关疾病方面具有治疗作用。尽管如此，然而对抗氧化剂VEGF-B的认识仍然是有限的。
发明内容
本发明首次提出肿瘤微环境能够编程T淋巴细胞的代谢。VEGF-B在体外与体内激活的CD4+与CD8+T细胞中均能够产生。此外，本发明提出VEGF-B在激活的T细胞不同亚型中有选择性表达，这种分泌依赖于ROS/AP-1信号。同时，内源性VEGF-B对效应T细胞的脂肪酸摄取和抗凋亡是必不可少的，VEGF-B抑制剂可以降低T细胞(如CD8+T细胞)的存活能力与抗肿瘤作用。本发明的研究表明，效应T细胞分泌的VEGF-B对肿瘤和自身免疫疾病具有较强的治疗价值。
本发明具体涉及自分泌VEGF-B促进T细胞代谢与功能以及在肿瘤免疫治疗中的应用。本发明首次提出了血管内皮生长因子B(VEGF-B)是活化的T细胞不同亚型选择性分泌的代谢调控因子。本发明通过抗体或肽活化T细胞，和/或采用能够促进线粒体生物合成的激动剂，或调控线粒体相关的ROS/AP-1信号的试剂，通过ROS/AP-1信号通路能够诱导活化的T细胞分泌VEGF-B，从而促进T细胞的脂肪酸摄取、抗凋亡、抗肿瘤活性等。本发明通过肿瘤微环境编程T淋巴细胞的代谢，在肿瘤免疫治疗中具有广泛的应用前景。
本发明中，所述肿瘤微环境编程T淋巴细胞的代谢是指肿瘤中缺氧、低糖、酸碱度等微环境因素，可影响T细胞的脂肪酸氧化、糖酵解、氨基酸代谢等代谢过程与免疫活性。
本发明还提出了Vegfb基因或VEGF-B蛋白在作为T细胞的标志物中的应用。所述VEGF-B在不同亚型的T细胞中选择性表达。
其中，所述不同亚型的T细胞包括CD8+分化产生的初始、中央记忆和效应记忆的T细胞和CD4+分化产生的初始和效应记忆T细胞以及Th0、Th1、Th2、Th17、Treg细胞等。
其中，所述的选择性表达是指T细胞分化的亚型有不同的VEGF-B的表达。
本发明还提出了VEGF-B蛋白、或能够促进Vegfb基因或VEGF-B蛋白表达的试剂在制备促进T细胞抗氧化、T细胞抗凋亡的药物中的应用。
其中，所述VEGF-B蛋白通过调控氧化介导的凋亡基因使所述T细胞抗凋亡。
其中，所述VEGF-B蛋白上调氧化应激基因Nox4，使所述T细胞抗凋亡。
本发明中，所述VEGF-B能够使活化后的T细胞抗凋亡。
本发明还提出了VEGF-B蛋白、或能够促进Vegfb基因或VEGF-B蛋白表达的试剂在制备调节T细胞分化的药物中的应用。
本发明中，所述T细胞为记忆T细胞和Treg细胞；所述VEGF-B能够调节记忆T细胞和Treg细胞的分化，进而可以用于不同功能T细胞的诱导。
本发明还提出了VEGF-B蛋白、或能够促进Vegfb基因或VEGF-B蛋白表达的试剂在制备促进T细胞代谢与功能的药物中的应用。
其中，所述VEGF-B蛋白、或能够促进Vegfb基因或VEGF-B蛋白表达的试剂能够促进T细胞对脂肪酸的摄取。
本发明中，所述VEGF-B能够促进活化的T细胞摄取脂肪酸，从而可以氧化提供ATP、乙酰辅酶A和NADPH，使T细胞长期存活。
本发明中，所述VEGF-B能够调节记忆T细胞和Treg细胞的分化，进而可以用于不同功能T细胞的诱导。
本发明还提出了VEGF-B蛋白、或能够促进Vegfb基因或VEGF-B蛋白表达的试剂在制备调控T细胞脂肪酸转运蛋白家族成员FATP4的转录水平的药物中的应用。
本发明还提出了VEGF-B蛋白、或能够促进Vegfb基因或VEGF-B蛋白表达的试剂在制备抗肿瘤活性的药物、或肿瘤免疫治疗相关药物中的应用。本发明中，所述VEGF-B增强T细胞的抗肿瘤作用。其中，所述T细胞优选为CD8+T细胞。其中，所述肿瘤包括黑色素瘤，结直肠癌，乳腺癌，肝癌，肺癌等实体肿瘤。
本发明还提出了所述促进Vegfb基因或VEGF-B蛋白表达的试剂为活化T细胞的试剂，促进线粒体生物合成的激动剂，或调控线粒体相关的ROS/AP-1信号的试剂。
其中，所述活化T细胞的试剂为CD3和CD28抗体、或OVA257-264肽；所述促进线粒体生物合成的激动剂为PGC-1α激动剂ZLN005。
其中，VEGF-B在T细胞中的表达/分泌依赖于ROS/AP-1信号。
其中，所述ROS/AP-1信号是指活性氧水平调控的转录因子激活蛋白1信号通路。
本发明还提出了所述T细胞为脾细胞来源；和/或，所述T细胞为活化的T细胞；和/或，所述T细胞通过激活TCR而活化；和/或，所述VEGF-B蛋白为VEGF-B167。
本发明还提出了所述T细胞为CD4+、CD8+T细胞中的一种或两种。
本发明还提出了一种促进T细胞分泌VEGF-B蛋白的方法，
向T细胞施与促进Vegfb基因或VEGF-B蛋白表达的试剂；
所述促进Vegfb基因或VEGF-B蛋白表达的试剂为活化T细胞的试剂，促进线粒体生物合成的激动剂，或调控线粒体相关的ROS/AP-1信号的试剂；
其中，所述促进线粒体生物合成的激动剂为PGC-1α激动剂ZLN005；
其中，活化T细胞的试剂为CD3、CD28抗体、特异性抗原OVA257-264肽；
其中，所述特异性抗原OVA257-264肽的浓度为1微克/毫升；
其中，所述活化的时间为72小时以上。
对于非抗原特异性T细胞的激活和增殖，用CD3(5微克/毫升)和CD28(2微克/毫升)抗体激活72小时。T细胞激活的培养基使用RPMI 1640+10％血清+100单位/毫升的青霉素/链霉素+2毫摩的L-谷氨酰胺+55微摩的β巯基乙醇)；对于抗原特异性T细胞激活，CD8+OT-1naive T细胞从全脾细胞中分离，然后用OVA257-264肽(1微克/毫升，SIINFEKL，Sigma)和IL-2(100单位/毫升，PeproTech)激活3天。
本发明还提出了抑制Vegfb基因或VEGF-B蛋白表达的试剂在制备T细胞免疫抑制剂中的应用。VEGF-B蛋白表达下降，可降低T细胞脂肪酸代谢与抗氧化抗凋亡的能力，具有潜在的T细胞免疫抑制作用，可应用于自身免疫疾病的免疫抑制治疗。
其中，所述试剂对T细胞进行阻断，进而抑制T细胞的代谢和功能；
其中，所述抑制T细胞的代谢和功能指抑制脂肪酸的摄取、转运、合成以及分解代谢，抑制T细胞的凋亡。
所述试剂为抑制线粒体生物合成的抑制剂，或下调线粒体相关的ROS/AP-1信号的试剂。
其中，所述抑制线粒体生物合成的抑制剂为VEGF-B的中和抗体(VB)。
本发明还提出了一种引物，其中，所述引物的序列如SEQ ID No.1-108所示的任意一种或几种。
与现有技术相比，本发明显著的有益效果在于：本发明提出的血管内皮生长因子B(VEGF-B)是效应T细胞不同亚型选择性分泌的因子。ROS能够诱导VEGF-B活化T细胞，从而促进其脂肪酸的摄取、抗凋亡、抗肿瘤活性等，具有应用前景。本发明在用于阻断T细胞分泌的VEGF-B可以治疗T细胞过度活化引起的自身免疫疾病，如溃疡性结肠炎，系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎以及自身免疫性脑脊髓炎等具有广泛前景。本发明在用于免疫抑制治疗和CAR-T效果增强，并且很有可能调控机体或细胞的整个代谢功能，例如糖代谢、氨基酸代谢等，以及通过T细胞调控其它免疫细胞，包括B细胞、巨噬细胞等具有预料不到的功能。
附图说明
图1为VEGF-B蛋白能够通过活化T细胞分泌产生的示意图；其中，A为CD3/CD28抗体处理72小时活化的脾脏细胞中代谢因子的相关基因表达；B为活化的脾脏细胞中Vegf-b、Vegf-b167和Vegf-b186形式的表达水平；C为未活化T细胞，活化T细胞与心脏组织中VEGFB的表达水平；D为通过慢病毒感染敲低非活化和活化的脾脏细胞中的VEGF-B后的VEGF-B蛋白水平；E为在非活化和活化24、48、72、96和120小时的脾脏细胞中VEGF-B蛋白水平；F为CD3/CD28抗体处理72小时活化的脾脏细胞和纯化的
Figure BDA0002123069220000051
CD4+和CD8+T细胞中VEGF-B的mRNA水平，***P<0.001,n＝12～16；G为CD3/CD28抗体处理72小时活化的脾脏细胞和纯化的
Figure BDA0002123069220000052
CD4+和CD8+T细胞中VEGF-B的蛋白水平；H为ELISA检测的
Figure BDA0002123069220000053
和CD3/CD28抗体处理72小时活化的CD4+和CD8+T细胞培养上清的VEGF-B蛋白水平；I为CD3/CD28抗体处理72小时活化的人的外周血单核细胞中VEGF-B的蛋白水平，n＝3。
图2为T细胞VEGF-B的表达依赖于ROS信号的示意图；其中，A为PGC-1α的激活剂ZLN005处理12小时的活化脾脏细胞中VEGF-B蛋白水平；B为FCCP处理12小时的活化脾脏细胞中VEGF-B蛋白水平；C为抗氧化剂NAC处理12小时的活化脾脏细胞中VEGF-B蛋白水平；D为抗氧化剂谷胱甘肽GSH处理12小时的活化脾脏细胞中VEGF-B蛋白水平；E为抗氧化剂过氧化氢酶处理12小时的活化脾脏细胞中VEGF-B蛋白水平；F为抗氧化剂白藜芦醇处理12小时的活化脾脏细胞中VEGF-B蛋白水平；G为不同浓度的过氧化氢处理12小时的活化脾脏细胞中VEGF-B蛋白水平；H为AP-1抑制剂SR-11302处理12小时的活化脾脏细胞中VEGF-B蛋白水平；I为AP-1抑制剂T-5224处理12小时的活化脾脏细胞中VEGF-B蛋白水平；J为NF-κB抑制剂BAY-11-7082处理12小时的活化脾脏细胞中VEGF-B蛋白水平；K为过氧化氢、T-5224、BAY-11-7082或NAC联合处理12小时的活化脾脏细胞中VEGF-B蛋白水平。
图3为VEGF-B能够促进效应T细胞摄取脂肪酸的示意图；其中，A为在活化的脾脏细胞、CD4+和CD8+T细胞中VEGFR-1蛋白的表达水平；B为验证通过慢病毒感染OVA257-264激活的CD8+OT-1T细胞敲低或过表达VEGF-B后VEGF-B的蛋白水平；C为VEGF-B敲低的CD8+OT-1T细胞中脂肪酸摄取相关基因表达水平，*P<0.05,n＝3；D为CD8+OT-1T细胞敲低或过表达VEGF-B后脂肪酸摄取的流式定量分析；E为效应CD4+和CD8+T细胞经VEGF-B抗体处理后脂肪酸摄取的流式定量分析，**P<0.01,***P<0.001,n＝4。
图4为VEGF-B能够调节记忆T细胞和Treg细胞的分化的示意图；其中，A为VEGF-B抗体在
Figure BDA0002123069220000061
CD4+和CD8+T细胞早期活化的影响，其中CD25、CD44、KLRG1、CD62L和CD127a是早期活化的标志物；B为VEGF-B抗体在
Figure BDA0002123069220000062
CD4+和CD8+T细胞增殖的影响，其中CFSE标记用于检测T细胞增殖；C为VEGF-B抗体对
Figure BDA0002123069220000063
CD4+和CD8+T细胞产生IFN-γ的影响；D为VEGF-B抗体对IL-15诱导活化3天的
Figure BDA0002123069220000064
CD8+T细胞为记忆细胞的影响(CD8+CD44+CD62L+)，**P<0.01,***P<0.001,n＝6；E为VEGF-B抗体对IL-15诱导活化3天的
Figure BDA0002123069220000065
CD8+T细胞为记忆细胞的影响(CD8+KLRG–CD127a+)，**P<0.01,***P<0.001,n＝6；F为VEGF-B抗体对TGF-β诱导活化的
Figure BDA0002123069220000066
CD4+T细胞为Treg细胞的影响(CD4+CD25+FOXP3+)，***P<0.001，n＝6。
图5为VEGF-B能够让活化后的T细胞抗凋亡的示意图；其中，A为VEGF-B敲低的CD8+OT-1T细胞中抗氧化和氧化应激的基因表达水平，*P<0.05，n＝3；B为通过DCFH-DA染色流式定量分析VEGF-B抗体处理的活化CD4+和CD8+T细胞中活性氧水平；C为通过TMRM染色流式定量分析线粒体膜电势*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n＝6；D为通过JC1染色流式定量分析线粒体膜电势*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n＝6；E为通过Annexin V和PI染色流式定量分析活化的VEGF-B敲低的CD8+OT-1T细胞凋亡状况*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n＝5；F为通过Annexin V和PI染色流式定量分析VEGF-B抗体处理的活化CD4+和CD8+T细胞凋亡状况*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n＝5；G为VEGF-B敲低的CD8+OT-1T细胞中caspase3前体/剪切体的蛋白水平。
图6为VEGF-B促进CD8+T细胞的抗肿瘤作用的示意图；其中，A为从荷瘤(人黑色素瘤B16105皮下接种20天)小鼠中取出肿瘤组织(尺寸<1.50cm x 1.50cm)分析CD4+和CD8+T细胞中VEGF-B阳性细胞比例，n＝5；B为用B16-OVA人黑色素瘤细胞105皮下接种14天后，将OVA257-264激活的敲低VEGF-B的CD8+OT-1T细胞过继转移到受体小鼠进行免疫治疗；C为通过不同CD8+OT-1治疗后的受体小鼠生存曲线的比较分析，n＝10。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1、体外活化T淋巴细胞的方式
从小鼠脾细胞中分离纯化CD4+和CD8+T细胞。通过CD4+/CD44-/CD62L+和CD8+/CD44-/CD62L+抗原标记筛选CD4+和CD8+
Figure BDA0002123069220000071
T细胞，经EasySep小鼠CD4+或CD8+
Figure BDA0002123069220000072
T细胞分离试剂盒或MoFloAstrios(BeckMan)分选。
对于非抗原特异性T细胞的激活和增殖，用CD3(5微克/毫升)和CD28(2微克/毫升)抗体激活72小时。T细胞激活的培养基使用RPMI 1640+10％血清+100单位/毫升的青霉素/链霉素+2毫摩的L-谷氨酰胺+55微摩的β巯基乙醇)。抗原特异性T细胞激活，CD8+OT-1naiveT细胞从全脾细胞中分离，然后用OVA257-264肽(1微克/毫升，SIINFEKL，Sigma)和IL-2(100单位/毫升，PeproTech)激活3天。
通过细胞因子诱导小鼠对CD3和CD28抗体激活的CD4+
Figure BDA0002123069220000073
T细胞进行体外分化为不同亚型，即Th1、Th2、Th17和Treg细胞。IL-12(20纳克/毫升，PeproTech)用于Th1细胞分化，IL-4(20纳克/毫升，PeproTech)用于Th2细胞分化，TGF-β1(5纳克/毫升，PeproTech)用于Treg细胞分化，IL-6(10纳克/毫升，PeproTech)用于Th17细胞分化。为促进T记忆细胞的发育，用IL-15(10纳克/毫升，PeproTech)诱导活化的CD8+
Figure BDA0002123069220000082
T细胞3天。
实施例2、流式细胞术
采用荧光标记抗体(Biolegend,eBioscience和BD Pharmingen)、红色线粒体追踪染料(Invitrogen)、线粒体活性氧检测染料(Invitrogen)、BODIPY FL C16(Invitrogen)、DCFH-DA(碧云天)、TMRM(Invitrogen)、JC1(Invitrogen)、Annexin V/PI(ebioscience)等染色，按照制造商的说明进行。采用H2-Kb OVA257-264MHC肽四聚体(MBL)对OVA特异性CD8+T细胞进行染色。在膜染色前，细胞用纯化自小鼠的CD16/CD32(#101302,BioLegend)在4℃孵育30分钟。细胞内细胞因子染色，细胞接受布蕾菲德菌素A(BD，Biosciences)处理2.5小时。细胞固定/细胞壁固定/渗透试剂盒(#554714,BD，Biosciences)用于细胞内VEGF-B、IFN-γ、IL-4、IL-17染色。对VEGF-B细胞内染色，采用针对VEGF-B的抗体(AF-590，1:2000，R&D系统)在室温放置90分钟固定并渗透细胞染色，然后用荧光素标记的二抗室温下染色60分钟。细胞内染色采用Foxp3染色试剂盒(#00-5523-00，eBioscience)。使用固定的活性染料eFluor 450(#65-0863-14，eBioscience)清除死细胞。细胞用FACSverseTM或LSRFortessa X-20细胞分析仪(BD Biosciences)进行收集，使用FlowJo(TreeStar)软件进行分析。具体的抗体和其他材料请参照表1。
表1.抗体和材料。
Figure BDA0002123069220000081
Figure BDA0002123069220000091
Figure BDA0002123069220000101
实施例3、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测转录产物的表达。采用Light Cycler480系统(Roche，Applied Science,Germany)进行qRT-PCR反应。Actb(β-actin)是用作内参。引物序列请见表2。
表2.qRT-PCR引物
Figure BDA0002123069220000102
Figure BDA0002123069220000111
Figure BDA0002123069220000121
实施例4、酶联免疫吸附试验(ELISA)
采用ELISA试剂盒(Rockland Immunochemicals Inc,Gilbertsville,PA,USA)测定小鼠VEGF-B蛋白产量，操作方法参照产品说明书。
实施例5、VEGF-B蛋白能够通过活化T细胞分泌产生
为了确定T细胞是否分泌代谢调节因子，本发明在体外用CD3/CD28抗体通过刺激T细胞受体(TCR)活化了脾脏细胞，并检测了一系列的代谢相关基因的表达。如图1A所示，本发明发现Vegfb基因在T细胞激活状态下高度表达。Vegfb所表达的VEGF-B蛋白是血管内皮生长因子的成员，它能够通过选择性剪接产生VEGF-B167和VEGF-B186两种亚型。数据结果显示VEGF-B167在活化的脾细胞中选择性表达(图1B)，而VEGF-B186几乎没有表达。
VEGF-B167蛋白分子量为21kDa，能够与细胞表面的VEGF受体-1(VEGFR-1)相识别。由于VEGF-B在心肌细胞中高表达，本发明用抗VEGF-B167/186抗体检测了小鼠活化和非活化的脾细胞、心肌细胞中的VEGF-B蛋白水平。如图1C所示，VEGF-B蛋白在通过刺激TCR而活化的脾细胞中高度表达。同时，如图1D所示，经慢病毒shRNA敲除VEGF-B，并用VEGF-B抗体检测进一步证实了在活化的脾细胞中高表达的确实是VEGF-B蛋白。如图1E所示，经过定时检测，本发明发现VEGF-B蛋白在TCR激活72小时后的产量达到峰值。
此外，如图1F-1G所示，本发明还通过qPCR和western blot，在转录水平和表达水平都证明了在TCR激活后，纯化的CD4+和CD8+
Figure BDA0002123069220000131
T细胞能够产生VEGF-B。通过特异性抗原OVA257-264肽(1微克/毫升)激活的纯化的CD8+OT-1T细胞中也可以检测到VEGF-B。然后，本发明对分泌物进行了量化，在活化的T细胞培养上清液中，VEGF-B的蛋白浓度约为50-100皮克/毫升/100微克细胞总蛋白，如图1H。此外，如图1I所示，通过TCR激活人的外周血单核细胞，用VEGF-B抗体也检测到了大量的VEGF-B蛋白产生。
实施例6、抗氧化药物筛选
用CD3/CD28抗体处理T细胞48小时后，然后用以下药物继续处理12小时，包括PGC-1α活化剂ZLN005(20微摩，Sigma)、FCCP(20微摩，Sigma)、NAC(5微摩，Sigma)、谷胱甘肽(5微摩，Sigma)、过氧化氢酶(1000单位/毫升，Sigma)、白藜芦醇(50微克/毫升，Sigma)、过氧化氢(0～100微摩，生工)、SR-11302(5微摩，R&D)、T-5224(80微摩，Biovision)和NF-κB抑制剂BAY-11-7082(5微摩，PeproTech)。VEGF-B中和抗体(1纳克/毫升；#AF-590，R&D)用于VEGF-B信号的阻断，正常山羊IgG作为对照(1纳克/毫升；#AB-108-C，R&D)。
实施例7、T细胞VEGF-B的表达依赖于ROS信号
VEGF-B在心脏和棕色脂肪组织中高表达，并伴随有核编码线粒体基因表达。同时，T细胞的活化伴随着线粒体的生物合成和功能重塑。本发明提出使用促进线粒体生物合成的PGC-1α激动剂ZLN005能够上调活化的脾细胞分泌VEGF-B，如图2A所示，通过VEGF-B抗体检测到20微摩的ZLN005能够明显增加VEGF-B的产生。同时，如果FCCP处理细胞引发线粒体功能障碍会导致VEGF-B的表达下降，如图2B所示，通过VEGF-B抗体检测到20微摩的FCCP能够明显增加VEGF-B的产生。因此，活化的T细胞分泌VEGF-B与线粒体的功能密切相关。通过N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC，5微摩)、谷胱甘肽(5微摩)和过氧化氢酶(1000单位/毫升)和白藜芦醇(50微克/毫升)处理活化的T细胞，如图2C-F所示，本发明发现除了白藜芦醇外都能够对VEGF-B分泌产生影响。如图2G所示,过氧化氢低浓度(10-30微摩)处理，VEGF-B的分泌就会增强。因此，T细胞VEGF-B的表达依赖于线粒体的活性氧水平(ROS)。转录因子激活蛋白1(AP-1c-Jun 382和c-Fos的复合物)和核因子κB(NF-κB)在T细胞激活后分泌细胞因子至关重要，而且是ROS的下游信号。如图2H-J所示，VEGF-B的表达能够被AP-1抑制剂5微摩的SR11302或80微摩的T5224所抑制，而在NF-κB的抑制剂5微摩的BAY-11-7082作用下则不受影响。此外，如图2K所示，AP-1抑制剂T5224能够抑制过氧化氢诱导的VEGF-B上调。因此，本发明能够通过调控线粒体相关的ROS/AP-1信号来改变活化的T细胞中VEGF-B的分泌。说明活化的T细胞中VEGF-B的表达与线粒体功能有关。
实施例8、慢病毒感染原代T细胞技术
采用标准pCDH-GFP慢病毒包装策略感染原代T淋巴细胞。流式细胞仪(FACS)筛选带有绿色荧光的细胞。采用OVA257-264肽(100微克/毫升)和IL-2(100单位/毫升，PeproTech)在体外激活OT-1CD8+T细胞。48小时后，VEGF-B shRNA或过表达慢病毒颗粒加聚凝胺(10微克/毫升)与激活的T细胞混合后，在30℃下1200转/分离心60分。感染后取上清，用包含OVA257-264肽(100微克/毫升)和IL-2(100单位/毫升，PeproTech)的T细胞培养液稀释培养48～72小时后进行筛选。
实施例9、VEGF-B能够促进效应T细胞摄取脂肪酸
VEGF-B与细胞表面受体VEGFR1特异性结合，具有调节脂肪酸摄取和抗凋亡作用。为了研究内源性VEGF-B对T细胞的作用，如图3A所示，通过VEGFR-1抗体检测，本发明首先证实了VEGFR-1蛋白在效应CD4+和CD8+T细胞上能够表达。进而本发明评估了通过慢病毒感染，敲低(sh-RNA)和过表达(OE)VEGF-B对T细胞的影响，如图3B所示，在活化的CD8+OT-1T细胞中分别成功的敲低和过表达了VEGF-B蛋白水平。有报道，VEGF-B在代谢中的核心作用是通过调节血管特异性脂肪酸转运蛋白相关基因Fatp3和Fatp4的表达来调控脂肪酸摄取。本发明证实了VEGF-B敲低后激活的T细胞中Fatp4的下调，如图3C所示，通过检测脂肪酸转运蛋白家族成员的转录水平筛选到了只有Fatp4受到VEGF-B的表达调控。如图3D所示，通过对脂肪酸产物磷脂进行荧光染色证明了VEGF-B敲低能够抑制脂肪酸摄取，而VEGF-B过表达则促进脂肪酸的摄取。此外，如图3E所示，通过VEGF-B中和抗体(VB)对激活的CD4+和CD8+T细胞进行阻断，能够有效抑制脂肪酸的摄取。因此，内源性VEGF-B的分泌对于效应T细胞的脂肪酸摄取是必不可少的。
实施例10、VEGF-B能够调节记忆T细胞和Treg细胞的分化
为了探讨VEGF-B对T细胞免疫功能的影响，本发明通过VEGF-B的阻断抗体VB处理活化后的CD4+和CD8+T细胞，然后分析激活、增殖和细胞因子的产生。如图4A-C所示，通过检测CD25、CD44、KLRG1、CD62L和CD127a等T细胞早期活化的标志物(峰没有出现迁移)，通过检测CFSE标记的T细胞增殖状况(与对照组相比，CD4+的阳性率均在75％左右，CD8+的阳性率均在79％左右)，通过检测IFN-γ的产生(与对照组相比，分泌IFN-γ的细胞比例均在40％左右)，发现早期活化、增殖和IFN-γ的产生都不受VB的阻断。然而，如图4D-F所示，IL-15诱导的记忆T细胞形成(CD8+CD44+CD62L+和CD8+KLRG1-CD127a+)以及TGF-β诱导的Treg细胞形成(CD4+CD25+FOXP3+)都能被VB显著抑制，其中至少25％的记忆T细胞形成被阻断，至少27％的Treg细胞形成被阻断。因此，VEGF-B对活化后的T细胞分化至关重要。
实施例11、VEGF-B能够使活化后的T细胞抗凋亡
近年来，VEGF-B被证明是一种有效的抗氧化剂，可调控一系列氧化介导的凋亡基因。为了研究内源性VEGF-B对T细胞凋亡的作用，本发明证实了VEGF-B靶基因的表达具有抗氧化和抗凋亡作用。图5A的结果显示，敲低VEGF-B下调活化的T细胞抗氧化基因SOD2，上调氧化应激基因Nox4。此外，如图5B所示，通过DCFH-DA染色发现VEGF-B的阻断抗体VB促进了细胞内ROS水平。线粒体膜电位(MMP)是氧化介导凋亡的重要指标，本发明通过TMRM和JC1染色检测活化的T细胞中的MMP，图5C-D的结果显示VEGF-B的阻断能够显著降低MMP。如图5E-G所示，VEGF-B的阻断或敲除促进了活化的T细胞凋亡，即Annexin V+/PI+至少上升了30％(其中CD4+细胞上升了5％左右，CD8+细胞上升了7％左右)和caspase-3活化。因此，内源性VEGF-B能够帮助活化的CD4+和CD8+T细胞抗凋亡。
实施例12、LM-OVA感染实验
表达OVA(LM-OVA)的重组单核增生李斯特菌菌株(参考文献1)。LM-OVA在脑心灌注培养基(BHI)中生长，并在OD600光度计下测定其生长情况，直到指数期前期。在体内激活CD8+T细胞后，用CFU 5.0x 103的LM-OVA对受体OT-1小鼠进行检测。感染3天后，脾脏中OVA特异性的CD8+T细胞进行检测。
实施例13、DSS诱发急性结肠炎模型
用含有2.5％(w/v)硫酸右旋糖酐钠(DSS)的饮用水喂养小鼠，引起急性结肠炎。连续喂食7天后，根据体重减轻、潜血和粪便浓度确定疾病指数，判断炎症程度。
实施例14、T细胞过继转移用于肿瘤免疫治疗
从供体脾细胞中分离出来1.5×106个活化的OT-1CD8+T细胞(C57BL/6)进行过继转移，静脉输注至B16-OVA荷瘤同源受体小鼠(C57BL/6)。
实施例15、VEGF-B促进CD8+T细胞的抗肿瘤作用
浸润于肿瘤的T淋巴细胞(TIL)在肿瘤微环境中的募集是免疫治疗恶性肿瘤的主要策略之一。首先，本发明证实了VEGF-B在异种B16黑色素移植瘤组织中CD4+和CD8+的TILs中表达，如图6A所示，其中有4.81％的CD4+细胞产生VEGF-B，有3.89％的CD8+细胞产生VEGF-B。为了探讨内源性VEGF-B对CD8+T细胞抗肿瘤的作用，本发明将B16-OVA肿瘤细胞注射到C57BL/6受体小鼠体内，14天后通过慢病毒感染敲低VEGF-B过继转移到已经由OVA257-264肽激活的OT-1T细胞，如图6B所示，肿瘤尺寸小于1.50cm x 1.50cm时切取进行分析。VEGF-B表达下调的OT-1T细胞在体内无法抑制肿瘤生长，导致荷瘤小鼠存活时间缩短，如图6C所示，皮下接种肿瘤细胞24天，即免疫治疗10天后，敲低VEGF-B组小鼠全部死亡，而对照组仍有40％的小鼠存活。因此，VEGF-B能够加强CD8+T细胞在体内的抗肿瘤作用。
参考文献
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
acggacaggg cttctcctac 20
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
atggtggtat cgagggtgga a 21
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
acatgcagcg tgaaatcctg 20
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
gcgtggtata ggtccaacat ga 22
<210> 55
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
cacttcctac ccctgctgg 19
<210> 56
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
accacaaaga tgctgtttga ca 22
<210> 57
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
gcttcttcta cacacccatg tc 22
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
agcactgatc tacaatgcca c 21
<210> 59
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
ctcccgtggc ttctagtgc 19
<210> 60
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
gccttagttt ggacaggatc tg 22
<210> 61
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
tcgacatgga tcagtttatg cg 22
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
ccctggtact gttgtagatg ga 22
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
atgaacgcta cacactgcat c 21
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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ccatcctttt gccagttcct c 21
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
ccactctcga ccctacatgg 20
<210> 66
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
ggcccccaaa gtgacattta tt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
agcacaagtt cgtgccagg 19
<210> 68
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
gcgtctctca ttagggagtt ttt 23
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
ccctcacact cagatcatct tct 23
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<211> 19
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<213> 人工序列
<400> 70
gctacgacgt gggctacag 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
tgccatggat agacgtttat gc 22
<210> 72
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
tgctcagagg caccaccac 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 73
gccaatgtga atgcagacca a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 74
tgcaaggcgg gcaga 15
<210> 75
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 75
tctgttccgg gctggga 17
<210> 76
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 76
agtgggatgg atgatgtcag ct 22
<210> 77
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 77
gggactacac cgagatgaac g 21
<210> 78
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 78
ccgcaggaag gtaaagagc 19
<210> 79
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 79
gtgtgcgtgc tgaagggcg 19
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 80
cttcatttcc acctttgccc 20
<210> 81
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 81
ggcaggcaga gcaggccg 18
<210> 82
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 82
ggtgaggcct gtgccatc 18
<210> 83
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 83
cggttgccac cccagtt 17
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 84
tgccacgatc tttctacgga c 21
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 85
ggaacttgat caagttgatg 20
<210> 86
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 86
ggctgcctga tgcatcagc 19
<210> 87
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 87
cagatcatgc agctgcacc 19
<210> 88
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 88
cattctccca gttgattaca ttc 23
<210> 89
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 89
gggatgtaaa tggtgaaaac ga 22
<210> 90
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 90
ccagcgcatg acagggat 18
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 91
gaatgccacc ttcatccgag 20
<210> 92
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 92
ccagcacctg gtacttaag 19
<210> 93
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 93
cctcttcttt gtcttctaca tg 22
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 94
gcacaaaggt ccagaaatcc 20
<210> 95
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 95
caaaagcatc aacagagaca ag 22
<210> 96
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 96
gctgactgtg gctgcagag 19
<210> 97
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 97
tcaatgtacc aggaattaca gaagg 25
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 98
gagtgagaag tcgcctgcac 20
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 99
catgagctaa accaccaggg 20
<210> 100
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 100
ttcctgagga tacaagatac cattg 25
<210> 101
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 101
cgcaggctct gaacctgg 18
<210> 102
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 102
tcgaaggtct ccagacagga g 21
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 103
gcaagtccca tcagcaactg 20
<210> 104
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 104
gggggaaatc acagcttctc 20
<210> 105
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 105
gtggtcagag attccaggtt cc 22
<210> 106
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 106
gctataccag catgtccgct c 21
<210> 107
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 107
tacaaccaag tggtgacatc tctg 24
<210> 108
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 108
aatctcttcg gtcaatggga c 21

Claims (10)

1.VEGF-B蛋白、或能够促进Vegfb基因或VEGF-B蛋白表达的试剂在制备促进活化的T细胞抗氧化、活化的T细胞抗凋亡的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述VEGF-B蛋白通过调控氧化介导的凋亡基因使所述活化的T细胞抗凋亡，或敲低所述VEGF-B蛋白可以上调氧化应激基因Nox4，使所述活化的T细胞抗凋亡。
3.VEGF-B蛋白、或能够促进Vegfb基因或VEGF-B蛋白表达的试剂在制备促进IL-15诱导的活化的记忆T细胞形成CD8+CD44+CD62L+和CD8+KLRG1-CD127a+以及TGF-β诱导的Treg细胞形成CD4+CD25+FOXP3+的药物中的应用。
4.VEGF-B蛋白、或能够促进Vegfb基因或VEGF-B蛋白表达的试剂在制备促进活化的T细胞摄取脂肪酸的药物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述VEGF-B蛋白、或能够促进Vegfb基因或VEGF-B蛋白表达的试剂能够促进活化的T细胞对脂肪酸的摄取。
6.VEGF-B蛋白、或能够促进Vegfb基因或VEGF-B蛋白表达的试剂在制备调控活化的T细胞脂肪酸转运蛋白家族成员FATP4的转录水平的药物中的应用。
7.能够促进活化T细胞中Vegfb基因或VEGF-B蛋白表达的试剂在制备抗肿瘤活性的药物、或肿瘤免疫治疗相关药物中的应用。
8.如权利要求1~7之任一项所述的应用，其特征在于，所述活化的T细胞为脾细胞来源；和/或，所述活化的T细胞通过激活TCR而活化；和/或，所述VEGF-B蛋白为VEGF-B167。
9.如权利要求1~7之任一项所述的应用，其特征在于，所述活化的T细胞为CD4+、CD8+ T细胞中的一种或两种。
10.抑制Vegfb基因或VEGF-B蛋白表达的试剂在制备活化的T细胞免疫抑制剂中的应用；其中，所述试剂对活化的T细胞进行阻断，进而抑制活化的T细胞的代谢和功能。
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