CN109337931A - Vegfb基因的应用及vegfb肿瘤诱导和肿瘤抑制动物模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，提供一种VEGFB基因的应用及VEGFB肿瘤诱导和肿瘤抑制动物模型的构建方法。本发明公开了血管内皮生长因子VEGFB基因可以作为治疗多种癌症的靶基因，VEGFB过表达提供转基因小鼠癌症诱导模型，VEGFB敲除提供转基因小鼠癌症抑制模型，这两种转基因小鼠模型可以用于多种癌症致病机理的研究，也可以用于药物筛选和药效测试，更重要的是根据VEGFB敲除提供转基因小鼠癌症抑制模型对肿瘤的抑制效果和VEGFB脂肪组织过表达提供转基因小鼠癌症诱导模型促进肿瘤生长，开发针对VEGFB的抗癌药物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及VEGFB基因的应用及VEGFB肿瘤诱导和肿瘤抑制动物模型的构建方法。
背景技术
恶性肿瘤是威胁人类健康和生命的常见疾病，其发病率和死亡率呈上升趋势，国际癌症研究中心预测未来 20 年全球新增癌症病例会上升到每年2 200万，癌症死亡病例将上升到每年1 300万；而亚太地区的癌症负担也不断加重。目前我国恶性肿瘤的发病率为285．91/10 万，平均每天每分钟有 6 人被诊断为恶性肿瘤，死亡率为 180.54/10万，未来肿瘤将越来越成为疾病防控中的重大问题。实验动物模型可以模拟某些人类疾病，为医学研究的重要手段之一。癌症诱导动物模型和肿瘤抑制动物模型在癌症发病机理研究，药物筛选评估方面起着非常重要的作用。
VEGF(血管内皮生长因子)家族包括VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE、PlGF(胎盘生长因子)及VEGF-F。血管内皮生长因子通过与其受体相联系而发挥各自的生物学功能。这些受体包含跨膜酪氨酸激酶受体VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3和神经纤毛蛋白受体(NRP-1和NRP-2)。VEGF家族成员在诱导血管和淋巴管的形成中起着重要的作用。
Olofsson 等发现了一种新的作用于内皮细胞上的生长因子，命名为VEGFB,与VEGF高度同源，在许多组织中与VEGF协调表达。VEGFB大量表达于心脏、肌肉和棕色脂肪组织等线粒体丰富的组织，其受体包括VEGFR1和NRP1。人的VEGFB基因位于11号染色体的q13臂上，长度大约4000bp。VEGFB通过可变剪接产生两个剪接突变体VEGFB167和VEGFB186。VEGFB167 和VEGFB186 序列不同并且分子C-末端的长度也不同。VEGFB167和VEGFB186成熟蛋白都包含相同的116个氨基酸N-末端区域。这个N-末端区域包含VEGFB 受体结合区域，而且此N-末端区域与VEGFA 和PlGF 相应区域有着高同源性，因此预测VEGFB 也可能会形成类似于VEGFA 和PlGF 中的半胱氨酸-二硫化物连接的同型二聚体蛋白。VEGFB167 和VEGFB186 的C 末端区域则存在差异，使其具有不同的特性因此会影响VEGFB在体内的分布。VEGFB167含有一个C-末端肝素结合区域，能够与细胞表面相关的肝素样粘多糖相联系，因此能够在细胞外基质中锚定这种亚型。相比之下，VEGFB186 不能与肝素结合，因此VEGFB186能够自由扩散。
VEGFB的功能目前还不是很清楚。人们发现VEGFB在多种肿瘤中高表达，如结肠癌，乳腺癌和肾脏癌。VEGFB在肿瘤细胞中的表达及其对VEGFR1和神经黏蛋白-1的活化作用暗示其作为抗癌治疗靶标的可能性。VEGFB基因敲除小鼠没有像VEGF基因敲除那样出现胚胎致死现象，小鼠的产仔率正常，敲除鼠各项生理状态均正常，说明抑制VEGFB的表达对人体伤害较小。开发针对VEGFB的抗癌药物比VEGF抗癌药物更具有临床应用价值。
因此，构建VEGFB肿瘤诱导动物模型和肿瘤抑制动物模型在癌症治疗中具有极其重要的应用价值；针对VEGFB基因开发相关的抗癌药物具有极其重要的临床应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种VEGFB基因的应用及VEGFB肿瘤诱导和肿瘤抑制动物模型的构建方法。本发明公开了VEGFB基因可以作为治疗癌症的靶基因，构建的VEGFB肿瘤诱导动物模型和肿瘤抑制动物模型可以用于多种癌症致病机理的研究，也可以用于药物筛选和药效测试。更有意义的是可以开发一些针对VEGFB的抗癌药物。
为实现以上发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了VEGFB基因作为预防和/或治疗癌症的药物靶点的应用。
本发明还提供了VEGFB基因的过表达在构建癌症诱导动物模型的应用。
本发明还提供了VEGFB基因的敲除在构建肿瘤抑制动物模型的应用。
本发明还提供了VEGFB基因的抑制剂或拮抗剂在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。
本发明还提供了表达载体，VEGFB过表达质粒含有编码VEGFB基因的核苷酸序列；VEGFB敲除质粒含有分别位于VEGFB外显子2和外显子4上的20bp的两个sgRNA。
本发明中VEGFB过表达质粒还含有aP2启动子,VEGFB敲除载体利用CRASPR-Cas9技术构建。
利用所述的一种VEGFB过表达载体构建肿瘤诱导动物模型的方法，所述VEGFB过表达载体转入动物体内，即得肿瘤诱导动物模型，具体方法为：以小鼠心脏组织VEGFB的cDNA为模板，以aP2-pLVCT为载体，构建重组质粒pLVCT-VEGFB-186和pLVCT-VEGFB-167，限制性内切酶酶切线性化重组质粒pLVCT-VEGFB-186和pLVCT-VEGFB-167，回收6.1kb的pLVCT-VEGFB-186和pLVCT-VEGFB-167，显微注射获得肿瘤诱导小鼠模型。
利用所述的一种VEGFB敲除载体构建肿瘤抑制动物模型的方法，所述VEGFB敲除载体转入动物体内，即得肿瘤抑制动物模型；具体方法为：VEGFB在外显子2和外显子4上分别设计一个sgRNA,插入pX330质粒获得pX330-sgRNA1和pX330-sgRNA2，将纯化得到的pX330-sgRNA1和pX330-sgRNA2混合，显微注射到小鼠受精卵原核中，获得转基因小鼠。
本发明中构建的VEGFB肿瘤诱导模型和肿瘤抑制模型主要分为如下两部分：
（1）转基因载体的构建：VEGFB过表达载体选取aP2-pLVCT，该载体含有5.5kb 的aP2启动子；以小鼠cDNA为模板PCR扩增VEGFB基因CDS区；酶切纯化DNA片段进行显微注射，浓度为2.5-4ng/ul；VEGFB敲除载体选用PX330，sgRNA设计和筛选；纯化得到的pX330-sgRNA1和pX330-sgRNA2进行显微注射，浓度为2.5-4ng/ul。
（2）受精卵细胞核显微注射：1）促排卵素注射、合笼；2）分离超排受精卵；3)显微注射DNA片段或载体；4）胚胎37℃过夜培养；5）二细胞期受精卵移植到代孕雌鼠体内。
本发明提供了VEGFB基因作为抗肿瘤的靶基因，根据我们构建的VEGFB敲除小鼠的肿瘤明显被抑制的现象以及VEGFB脂肪组织过表达小鼠促进肿瘤生长的现象，我们发现外源性抑制VEGFB能够抑制肿瘤的生长且外源性过表达能够促进肿瘤生长，据此，我们可以将VEGFB基因作为肿瘤治疗的靶点，开发针对VEGFB基因的抗癌药物。目前，有很多抗癌药物是针对VEGF基因的药物，主要作用原理是干扰VEGF的血管生成的作用，减少机体对肿瘤营养物质的供应，从而抑制肿瘤生长。但是，此疗法只在用药初期有疗效，随后病情会恶化引发其他并发症，这是因为VEGF基因对正常机体维持毛细血管起着重要作用。目前研究发现VEGFB基因单条染色体敲除或者完全敲除，并不影响小鼠的生殖与健康状况，只是引起一定范围的体重的增加。从而，开发针对VEGFB的抗肿瘤药物不仅能够抑制肿瘤的生长，同时不会像其他抑制血管生成药物那样损害患者身体健康。因此，针对VEGFB基因开发相关的抗癌药物具有极其重要的临床应用价值。
附图说明
图1为CRISPR-Cas9作用原理；图2为pX330 载体图；图3为利用CRISPR/Cas9构建VEGFB缺失小鼠模型及基因型鉴定结果；图4为VEGFB基因脂肪组织过表达载体构建图谱及基因型鉴定结果；图5为移植的肿瘤细胞在VEGFB缺失小鼠模型和VEGFB脂肪组织过表达小鼠模型中的生长状况。
具体实施方式
本发明公开了VEGFB作为抗肿瘤的靶基因，这一成果通过VEGFB敲除鼠和VEGFB脂肪组织过表达的小鼠得到验证，同时，我们公开了VEGFB敲除鼠和VEGFB脂肪组织过表达的小鼠构建方法。
下面结合实施例，进一步详述本发明，但本发明的保护范围不仅限于此。
实施例1： VEGFB敲除小鼠的构建
VEGFB敲除小鼠利用CRISPR-Cas9技术构建，CRISPR/Cas 系统为细菌获得性免疫中的重要组成部分，由Cas 核酸酶以及两个不同的RNA组成（可变的crRNA以及固定的tracrRNA）。Cas蛋白能够将入侵的噬菌体DNA 切割成小的片段，这些小片段作为间隔片段整合至CRISPR 系列中，随后CRISPR系列转录形成crRNA以及互补的tracrRNA，形成的这种双链RNA结构有利于募集Cas 蛋白以便进行切割。PAM 序列（即间区邻近基序）为外来DNA上crRNA-靶序列相邻的一段短序列，也是CRISPR/Cas 复合体结合到靶DNA的识别位点并且在适应和阻断阶段起着必不可少的作用（图1）。缺乏PAM 序列就会改变Cas 蛋白和靶DNA序列的亲和性，因此特定的PAM 序列识别有助于区别外来靶序列以及非靶序列。
1 设计sgRNAs
外显子3为VEGFB基因最大的外显子，为了切除外显子3，我们针对外显子2和外显子4设计sgRNA片段。sgRNA的设计原则为GN20GG。我们设计的序列分别为sg1：GCCCCTGTGTCCCAGTTTGA；sg2：GTACCCGAGCAGTCAGCTGG。将设计的sgRNA片段通过NCBI与基因组进行比对，保证sgRNA的特异性。在sgRNAs前分别加上BbsⅠ酶酶切位点：sgRNA1:CACCGCCCCTGTGTCCCAGTTTGA; sgRNA2:AAACGTACCCGAGCAGTCAGCTGG。
2 sgRNAs的退火
将合成得到的sgRNA片段经过以下处理得到双链sgRNA片段。
表1 sgRNAs的退火体系
3 构建pX330-sgRNAs载体
用BbsⅠ酶酶切pX330载体（图2），得到片段经纯化后与退火后的sgRNA1和sgRNA2分别用T4连接酶进行连接，连接产物经转化、质粒小提、质粒大提后获得pX330-sgRNA1和pX330-sgRNA2质粒。测序以确保sgRNAs片段正确的插入到pX330质粒中。
pX330载体同时含有sgRNA片段以及编码Cas9蛋白序列。两个BbsⅠ酶酶切位点之间即可插入sgRNA片段。
4 原核注射
将纯化得到的pX330-sgRNA1和pX330-sgRNA2质粒按照2.5 ng/ul的浓度进行混合，通过显微注射的方式将混匀的质粒注射到小鼠受精卵原核中，将注射后能成功发育至二细胞的受精卵移植到代孕母鼠体内，待其自然生产后进行小鼠基因型鉴定。具体方法如下：
（1）提前72小时给4周龄的B6雌鼠注射PMSG。
（2）提前24小时给小鼠注射hCG，3PM将超排的B6雌鼠同B6种公鼠合笼，一个B6种公鼠可以放两只超排的B6雌鼠。
（3）第四天8AM将小鼠从洁净房转移至显微注射室，将小鼠腹腔打开，从输卵管壶腹部将超排的受精卵取出，放入事先准备好的M2培养液，对取出的受精卵进行反复几次清洗后转移至37℃培养箱中培养。
（4）将预先准备好的质粒放在冰上融化，12, 000rpm离心10min取上清，转移至新的离心管中。
（5）利用拉针仪制作注射针和固定针。
（6）将注射针放入预先准备好的质粒中，通过虹吸作用，质粒会转移至注射针中。
（7）3PM将小鼠受精卵转移至M16培养基中，并滴加200μl的石蜡油。将其放置在显微操作仪中，将质粒注射至小鼠受精卵的原核中。注射完立即放入37℃培养箱培养过夜。
（8）操作完，挑取处于发情期的代孕母鼠，与结扎后的公鼠合笼。
（9）第二天上午，检栓。将见栓的代孕母鼠转移至显微操作间。
（10）将代孕母鼠麻醉后，将发育至二细胞期的受精卵转移至输卵管内，用针仔细缝合，消毒，待其苏醒后将其转移至洁净鼠房。
5基因型鉴定
小鼠出生2周后便可进行基因型鉴定。剪小鼠脚趾进行标号并把多余的脚趾放入GNT-K消化液中，55 °C水浴锅消化过夜。第二天拿出后瞬时离心，开水煮沸15 min后，放到冰上冷却。我们将鉴定引物设计在外显子2和4两侧（图3A箭头所示），通过PCR的方法鉴定VEGFB敲除小鼠，鼠尾鉴定引物：Vegfb-f：AGGACGGAGCCCTTACATAGC，Vegfb-r：CTGGCACCTGCATTCACATT。基因组PCR鉴定VEGFB缺失小鼠，从左至右依次为Marker、WT小鼠、VEGFB+/-小鼠、VEGFB-/-小鼠。Marker条带大小从上至下依次为1000bp、750 bp、500 bp、250 bp。WT小鼠扩增得到一条884 bp条带，VEGFB+/-小鼠扩增分别得到884bp条带和382 bp条带，VEGFB-/-小鼠扩增得到一条382 bp条带（图3B）。对扩增长度为382 bp的条带回收后进行测序进一步验证VEGFB是否缺失，我们发现Cas9介导的VEGFB 的缺失并不是连续的，而是在第一个sgRNA 的第6 个碱基处进行切割，长度在22 bp，随后相隔16 个碱基后又一次进行长度为477 bp 的切割，最后在跨越3个碱基后再一次进行了3 个碱基的切割，其切割总长度为502 bp。同时缺失还伴随了移码突变的发生，这也充分说明VEGFB基因功能的失活（图3A）。
VEGFB 基因广泛表达于线粒体丰富的组织中，例如心脏、肌肉以及BAT 中。我们通过Real-time PCR 的方法检测VEGFB 缺失小鼠的心脏、肌肉、WAT 和BAT 组织中VEGFB 基因的表达。与WT 小鼠相比，VEGFB+/-小鼠心脏、肌肉中VEGFB 基因的表达量降低约90%；BAT中VEGFB 基因的表达量降低约70%，而在WAT 中降低约50%。可能的原因是VEGFB 基因在这些线粒体丰富的组织中存在自身的调节机制。VEGFB-/-小鼠的这四种组织中几乎检测不到VEGFB 基因的表达(图3C)。
PCR体系（25 μl）见表2。PCR扩增条件见表3。
表2 基因型鉴定PCR体系
表3：PCR扩增条件
实施例2： VEGFB脂肪组织过表达小鼠的构建
1 获得目的基因，以小鼠心脏组织总RNA逆转录得到的cDNA为模板，PCR得到VEGFB的CDS区。引物序列为VEGFB-186-Forward: GGCCACGCGTCCACCATGAGCCCCCTGCTCCG; VEGFB-186-Reverse: GGCCCTCGAGCTAAGCCCCGCCCTTGG。VEGFB-167-Forward: GGCCACGCGTCCACCATGAGCCCCCTGCTCCG; VEGFB-167-Reverse: GGCCCTCGAGTCACTTTCGCGGCT。得到片段大小分别为624bp和567bp。
反应体系表4，PCR扩增条件见表5。
表4：VEGFB基因PCR体系
表5
割胶回收PCR产物。
2 限制性内切酶MluI和XhoI切割步骤1中扩增的PCR产物和aP2-pLVCT质粒，割胶回收VEGFB186 (624bp), VEGFB167 (567bp)和aP2-pLVC片段(8834bp)；其中VEGFB186的CDS区的基因序列如SEQ ID No.1所示；VEGFB167的CDS区的基因序列如SEQ ID No.2所示。
3 将VEGFB186和VEGFB167的CDS区插入aP2-pLVCT质粒，得到aP2-pLVCT-VEGFB186 和aP2-pLVCT-VEGFB167重组质粒。
3 限制性内切酶线性化重组质粒aP2-pLVCT-VEGFB186 和aP2-pLVCT-VEGFB167，得到6.1kb的目标片段aP2-VEGFB186 和aP2-VEGFB167(如图4A)。
4 显微注射上述目标片段，将成活的分裂至二细胞期的受精卵移植到代孕雌鼠体内。
5 基因型鉴定
小鼠出生2周后便可进行基因型鉴定。剪小鼠脚趾进行标号并把多余的脚趾放入GNT-K消化液中，55 °C水浴锅消化过夜。第二天拿出后瞬时离心，开水煮沸15 min后，放到冰上冷却。12，000rpm, 2min。VEGFB167鉴定引物：AP2-VEGFB167jd-F：CCGTCGCCTGCTGCTTGTT；AP2-VEGFB167jd-R：CATTCGGACTTGGTGTTGCCC，VEGFB167阳性鼠扩增得到一条250bbp的条带，阴性鼠没有条带。VEGFB186鉴定引物：AP2-VEGFB186jd-F：TGACGATGGCCTGGAATGTGT；AP2-VEGFB186jd-R：GCTGGAGTGGGATGGATGATGT，VEGFB186阳性鼠扩增得到一条250bbp的条带，阴性鼠没有条带（图4B）。
PCR体系（25 μl）见表2。PCR扩增条件见表3。
实施例3：肿瘤细胞皮下移植实验
1 肿瘤细胞的传代扩增，培养黑色素瘤细胞B16-F10，确保肿瘤细胞的活力和良好的生长状态。
2 计算细胞的接种量，每只小鼠接种200-400万/只。
3 在小鼠右背侧大腿附近移植肿瘤细胞。
4 待肿瘤细胞生长20天，解剖小鼠并观察肿瘤大小：小鼠处死后， 取肿瘤，测量肿瘤体积并观察拍照。发现与野生型小鼠相比，在VEGFB敲除鼠中肿瘤生长明显被抑制且体积较小，而在VEGFB167过表达小鼠中明显促进肿瘤生长且体积较大（如图5A和B）。
序列表
<110> 东北师范大学
<120> VEGFB基因的应用及VEGFB肿瘤诱导和肿瘤抑制动物模型的构建方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 624
<212> DNA
<213> VEGFB186的CDS区(Artificial Sequence)
<400> 1
atgagccccc tgctccgtcg cctgctgctt gttgcactgc tgcagctggc tcgcacccag 60
gcccctgtgt cccagtttga tggccccagc caccagaaga aagtggtgcc atggatagac 120
gtttatgcac gtgccacatg ccagcccagg gaggtggtgg tgcctctgag catggaactc 180
atgggcaatg tggtcaaaca actagtgccc agctgtgtga ctgtgcagcg ctgtggtggc 240
tgctgccctg acgatggcct ggaatgtgtg cccactgggc aacaccaagt ccgaatgcag 300
atcctcatga tccagtaccc gagcagtcag ctgggggaga tgtccctgga agaacacagc 360
caatgtgaat gcagaccaaa aaaaaaggag agtgctgtga agccagacag ggttgccata 420
ccccaccacc gtccccagcc ccgctctgtt ccgggctggg actctacccc gggagcatcc 480
tccccagctg acatcatcca tcccactcca gccccaggat cctctgcccg ccttgcaccc 540
agcgccgtca acgccctgac ccccggacct gccgctgccg ctgcagacgc cgccgcttcc 600
tccattgcca agggcggggc ttag 624
<210> 2
<211> 567
<212> DNA
<213> VEGFB167的CDS区(Artificial Sequence)
<400> 2
atgagccccc tgctccgtcg cctgctgctt gttgcactgc tgcagctggc tcgcacccag 60
gcccctgtgt cccagtttga tggccccagc caccagaaga aagtggtgcc atggatagac 120
gtttatgcac gtgccacatg ccagcccagg gaggtggtgg tgcctctgag catggaactc 180
atgggcaatg tggtcaaaca actagtgccc agctgtgtga ctgtgcagcg ctgtggtggc 240
tgctgccctg acgatggcct ggaatgtgtg cccactgggc aacaccaagt ccgaatgcag 300
atcctcatga tccagtaccc gagcagtcag ctgggggaga tgtccctgga agaacacagc 360
caatgtgaat gcagaccaaa aaaaaaggag agtgctgtga agccagacag ccccaggatc 420
ctctgcccgc cttgcaccca gcgccgtcaa cgccctgacc cccggacctg ccgctgccgc 480
tgcagacgcc gccgcttcct ccattgccaa gggcggggct tagagctcaa cccagacacc 540
tgtaggtgcc ggaagccgcg aaagtga 567
Claims (10)
1.VEGFB基因作为预防和/或治疗癌症的药物靶点的应用。
2.VEGFB基因的过表达在构建肿瘤诱导动物模型中的应用。
3.VEGFB基因的敲除在构建肿瘤抑制动物模型的应用。
4.VEGFB基因的抑制剂或拮抗剂在制备预防和/或治疗癌症的药物中的应用。
5.一种VEGFB过表达载体，其特征在于：含有编码VEGFB基因的核苷酸序列。
6.一种VEGFB敲除载体，其特征在于：含有分别位于VEGFB外显子2和外显子4上的20bp的两个sgRNA。
7.根据权利要求5所述的一种VEGFB过表达载体，其特征在于：所述过表达载体中还含有aP2启动子。
8.根据权利要求6所述的一种VEGFB敲除载体，其特征在于：所述VEGFB敲除载体利用CRASPR-Cas9技术构建。
9.利用权利要求5所述的一种VEGFB过表达载体构建肿瘤诱导动物模型的方法，其特征在于：所述VEGFB过表达载体转入动物体内，即得肿瘤诱导动物模型，具体方法为：以小鼠心脏组织VEGFB的cDNA为模板，以aP2-pLVCT为载体，构建重组质粒pLVCT-VEGFB186和pLVCT-VEGFB167，限制性内切酶酶切线性化重组质粒pLVCT-VEGFB186和pLVCT-VEGFB167，回收6.1kb的pLVCT-VEGFB186和pLVCT-VEGFB167，显微注射获得肿瘤诱导小鼠模型。
10.利用权利要求6所述的一种VEGFB敲除载体构建肿瘤抑制动物模型的方法，其特征在于：所述VEGFB敲除载体转入动物体内，即得肿瘤抑制动物模型；具体方法为：VEGFB在外显子2和外显子4上分别设计一个sgRNA,插入pX330质粒获得pX330-sgRNA1和pX330-sgRNA2，将纯化得到的pX330-sgRNA1和pX330-sgRNA2混合，显微注射到小鼠受精卵原核中，获得转基因小鼠。
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2018
- 2018-11-02 CN CN201811298447.6A patent/CN109337931A/zh active Pending
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