CN106399306B - 靶向人lncRNA-UCA1抑制膀胱癌的sgRNA、基因载体及其应用 - Google Patents

靶向人lncRNA-UCA1抑制膀胱癌的sgRNA、基因载体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供靶向人lncRNA‑UCA1抑制膀胱癌的sgRNA、基因载体及其应用：具体包括设计适合CRISPR‑Cas9靶向剪辑的lncRNA‑UCA1基因和PD‑1基因的sgRNA序列，将特异性剪接lncRNA‑UCA1基因和CRISPR‑Cas9核酸酶基因的质粒转入人膀胱癌细胞可引起其lncRNAUCA1基因表达下降，抑制肿瘤细胞的生长，联合靶向敲除人PD‑1基因载体共同转入人化小鼠膀胱癌移植瘤模型体内，能明显抑制肿瘤的生长。本发明载体制备步骤简单、sgRNA靶向性好、CRISPR‑Cas9系统的敲除效率高。

Description

靶向人lncRNA-UCA1抑制膀胱癌的sgRNA、基因载体及其应用
技术领域
本发明属于基因工程及生物医药领域，涉及CRISPR/Cas9特异性修饰人长链非编码RNA(lncRNA)-UCA1及PD-1多个基因靶点的创新设计，通过靶向敲除lncRNA UCA1的表达抑制膀胱癌细胞生长，联合应用免疫基因(PD-1/PDL-1)治疗策略可以增强膀胱癌的治疗效果，是靶向免疫基因治疗膀胱癌的新策略。
背景技术
近年来，基因组编辑工具已被广泛应用于生物医学领域，能够通过改变目的基因的表达、阐明基因的功能并试图用于临床疾病的治疗。其中，成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)技术由于能快速、简便、高效地靶向基因组任何基因，具有容易操作、可以同时靶向多个基因、高通量制备、造价低等特点而成为编辑基因的首选技术。CRISPR是自然存在于细菌DNA中的序列，与CRISPR相关核酸酶(Cas)结合，具有指导RNAs保护细菌基因组免受侵入性噬菌体中检测到的靶向特异性序列攻击的作用。该项技术经过不断改进成为2015年科学杂志评选的十大发现之首，将成为功能基因组学和系统生物学领域中强有力的研究工具。
膀胱癌是我国最常见的泌尿系统恶性肿瘤，治疗后很容易复发并对治疗药物产生耐药性，导致患者预后不佳，5年生存率仅为50％。因此，探索膀胱癌发生发展的分子机制，寻找特异性诊断标志物和有效的治疗靶点有望提高膀胱癌患者的生存率。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)参与人细胞生长、分化和代谢的调节，其表达异常与多种疾病发生有关，包括恶性肿瘤，并且可能作为某些肿瘤的特异性标志物。故阐明这些非编码RNA分子的功能不仅有助于揭示肿瘤发生发展的分子机制，还可以鉴定出具有临床潜在应用价值的分子靶点。尿路上皮癌相关基因1(urothelial cancer associated 1,UCA1)是采用抑制消减杂交技术分析膀胱癌细胞株BLS-211和BLZ-211而首先确定的lncRNA,其长度为1442bp，位于人染色体19p13,12，有3个外显子，定位于细胞质内。lncRNA-UCA1在人胚胎组织广泛表达而在成体绝大多数正常组织中不表达，在膀胱癌组织中表达上调但在正常膀胱和肾组织良性增生的前列腺组织肾癌组织均不表达，其与人膀胱癌的发生发展、肿瘤细胞耐药和代谢改变有关。其他研究者还发现lncRNA-UCA1在其他肿瘤组织中普遍表达，如结肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、食管癌等。这些结果证明lncRNA-UCA1表达改变参与了包括人膀胱癌在内的多种肿瘤的发生发展过程。
程序性死亡因子-1(programmed death-1,PD-1)作为近年发现的CD28家族新成员，常在活化的淋巴细胞呈现高水平表达。PD-1与其配体PDL-1结合，通过阻断CD28分子介导激活PI3K(phsphatidylinositol 3-kinase,磷酸肌醇3激酶)途径，抑制T淋巴细胞的增殖和分化，已经发现其在肿瘤免疫应答过程中与病程进展中起到了重要的作用。研究发现两个针对程序性死亡-1(PD-1/PDL-1)分子通路起作用的药物，Keytruda(pembrolizumab)和MPDL3280A对晚期尿路上皮癌有明显的治疗作用。还有证据表明免疫系统对肌肉浸润性尿路上皮膀胱癌比较活跃，PD-1及配体相互作用的抑制可恢复抗肿瘤T细胞活性，增强细胞免疫对抗原的攻击，提高人膀胱癌的治疗效果。
脂质体是具有良好的生物相容性的传递载体，其表面修饰配体是构建主动靶向脂质体的重要方式。细胞穿膜肽(TAT)能够穿过与之接触的任何细胞的细胞膜，而对细胞膜没有损伤，因而可以应用设计的靶向肿瘤细胞给药(如TAT修饰包裹靶向lncRNA-UCA1基因的sgRNA质粒的脂质体)方式抑制lncRNA-UCA1基因的表达，治疗该基因异常表达的恶性肿瘤。
现在人膀胱癌治疗存在的问题：(1)患者治疗后常易复发；(2)药物治疗后容易产生耐药性；(3)靶向人膀胱癌致癌基因的治疗药物很少，效果有限，副作用较明显；(4)需要联合用药治疗膀胱癌以提高治疗效果，改善患者的预后。
发明内容
本发明的目的在于提供靶向人lncRNA-UCA1抑制膀胱癌的sgRNA、基因载体及其应用。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
靶向人lncRNA-UCA1抑制膀胱癌的sgRNA，该抑制膀胱癌的sgRNA包括在CRISPR-Cas9特异性修饰lncRNA-UCA1基因中可特异性靶向人lncRNA-UCA1基因的sgRNA，该sgRNA的序列如SEQ.ID.NO.4或SEQ.ID.NO.5所示。
靶向人lncRNA-UCA1抑制膀胱癌的基因载体，该基因载体选自重组质粒pGL3-U6-UCA1 sgl、pGL3-U6-UCA1 sg2中的一种，pGL3-U6-UCA1 sgl由序列如SEQ.ID.NO.4所示的sgRNA的寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，pGL3-U6-UCA1 sg2由序列如SEQ.ID.NO.5所示的sgRNA的寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，通过连接使SEQ.ID.NO.4或SEQ.ID.NO.5所示序列插入至pGL3-U6-sgRNA质粒的多克隆位点内，或者，该基因载体为构建于用于表达核酸酶Cas9的质粒基础上的重组质粒，构建方法为在所述用于表达核酸酶Cas9的质粒的多克隆 位点内分别插入有如SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5所示序列中的一种或两种。
靶向人lncRNA-UCA1抑制膀胱癌的基因载体组合物，该组合物包括pGL3-U6-UCA1sg质粒，所述pGL3-U6-UCA1 sg质粒选自重组质粒pGL3-U6-UCA1 sgl、pGL3-U6-UCA1 sg2中的一种或两种，pGL3-U6-UCA1 sgl由序列如SEQ.ID.NO.4所示的sgRNA的寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，pGL3-U6-UCA1 sg2由序列如SEQ.ID.NO.5所示的sgRNA的寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，通过连接使SEQ.ID.NO.4或SEQ.ID.NO.5所示序列插入至pGL3-U6-sgRNA质粒的多克隆位点内。
所述pGL3-U6-UCA1 sgl与pGL3-U6-UCA1 sg2的质量比为(1～2):(1～2)。
所述组合物还包括pGL3-U6-PD1 sg质粒，所述pGL3-U6-PD1 sg质粒选自重组质粒pGL3-U6-PD1-1 sg、pGL3-U6-PD1-2 sg中的一种或两种，pGL3-U6-PD1-1 sg由序列如SEQ.ID.NO.6所示的sgRNA的寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，pGL3-U6-PD1-2 sg由序列如SEQ.ID.NO.7所示的sgRNA的寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，通过连接使SEQ.ID.NO.6或SEQ.ID.NO.7所示序列插入至pGL3-U6-sgRNA质粒的多克隆位点内。
所述pGL3-U6-UCA1 sg质粒与pGL3-U6-PD1 sg质粒的质量比为(1～3):(1～2)；所述pGL3-U6-PD1-1 sg与pGL3-U6-PD1-2 sg的质量比为(1～2):(1～2)。
所述组合物还包括用于表达核酸酶Cas9的质粒，所述用于表达核酸酶Cas9的质粒:pGL3-U6-UCA1 sg质粒的质量比为(1～4):(1～3)，所述用于表达核酸酶Cas9的质粒:pGL3-U6-UCA1 sg质粒:pGL3-U6-PD1 sg质粒的质量比为(1～4):(1～3):(1～2)。
上述靶向人lncRNA-UCA1抑制膀胱癌的sgRNA在制备用于治疗人膀胱癌的药物中的应用。
上述靶向人lncRNA-UCA1抑制膀胱癌的基因载体组合物在制备用于治疗人膀胱癌的药物中的应用。
可特异性靶向人PD-1基因的sgRNA在制备用于治疗人膀胱癌的药物中的应用，所述的应用包括仅使用所述可特异性靶向人PD-1基因的sgRNA或者与可特异性靶向人lncRNA-UCA1基因的sgRNA联合使用。
本发明的有益效果体现在：
本发明提出了适合CRISPR-Cas9靶向剪辑的lncRNA-UCA1基因的sgRNA序列，其与CRISPR-Cas9靶向剪辑的人PD-1基因的sgRNA序列，可用于构建表达抑制人 lncRNA-UCA1和人PD-1基因的sgRNA质粒载体，共同转入膀胱癌移植瘤小鼠体内，可以明显降低lncRNA-UCA1的表达，并抑制肿瘤的生长。本发明基因载体制备的方法步骤简单、sgRNA靶向性好，CRISPR-Cas9系统的敲除效率高。
本发明制备的特异性靶向人膀胱癌lncRNA-UCA1和PD-1基因的sgRNA载体，不仅能够精确靶向剪接人膀胱癌lncRNA-UCA1和PD-1基因，高效降低人膀胱癌lncRNA-UCA1的基因表达，联合应用可以明显抑制肿瘤的生长，既显示出免疫基因方法治疗恶性肿瘤的优效性，还将成为制备靶向治疗膀胱癌新型药物的核心成分。
本发明可应用于CRISPR/Cas9快速、简便、高效、特异性剪接lncRNA-UCA1基因和人PD-1基因的方法，并为将来采用脂质体包裹表达靶向人膀胱癌lncRNA-UCA1基因的sgRNA及其他给药方式奠定了物质基础，展现出可有效清除人膀胱癌lncRNA-UCA1的表达，抑制膀胱癌细胞的生长并能解决目前膀胱癌治疗中存在问题的诱人前景。本发明具有(1)概念新，利用CRISPR/Cas9剪辑lncRNA-UCA1和PD-1基因；(2)效率高，在体内、外实验可明显降低lncRNA-UCA1的表达，抑制肿瘤的生长；(3)多靶点，可以同时敲除修饰多个靶点基因的突出特点。
附图说明
图1为Cas9实现定点切割导致DNA及双链断裂过程示意图；
图2为sgRNA/Cas9介导的UCA1特异性切割造成UCA1表达变化情况；
图3为sgRNA/Cas9介导的PD-1特异性切割造成PD-1基因表达变化情况；
图4为用ELISA检测建立人化小鼠lgG的表达情况；
图5为人化荷瘤小鼠模型内，联合敲除UCA1和PD-1后，DC表型的变化情况；
图6为人化荷瘤小鼠模型内，联合敲除UCA1和PD-1后，肿瘤细胞凋亡的变化情况；
图7为观察肿瘤体积(Tumor Volume)的变化的结果图；
图8为PgL3-U6-sgRNA质粒的结构；
图9为载体pST1374-NLS-flag-cas9-ZF质粒的结构。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作详细说明。
如图1所示，CRISPR/Cas9系统对基因的定向识别和剪切是由sgRNA和Cas9实现的，sgRNA决定了Cas9的靶向性，也决定了Cas9的切割活性。本发明旨在应用CRISPR/Cas9技术，以高表达lncRNA-UCA1的人膀胱癌细胞和荷膀胱癌移植瘤小鼠模型为研究对象，采用靶致病基因lncRNA-UCA1，以及协同靶向肿瘤免疫调节分子PD-1的基因编辑策略。 首先，通过体内外筛选针对lncRNA-UCA1基因的sgRNA序列，实现lncRNA-UCA1基因的有效敲除；然后，通过体内外筛选针对PD-1的sgRNA序列，通过共转染实现多基因协同编辑效应，进而考察联合干预不同靶点的治疗策略是否对膀胱癌小鼠移植瘤治疗具有“1+1>2”的协同效应。本发明是采用cas9能够实现多重基因敲除的优势，采取特异性靶向“单一基因”或“协同作战”的方法，针对与肿瘤发生的癌基因和机体免疫抑制的分子靶点同时进行干预，能够联合发挥抑制致癌lncRNA基因和主动免疫的治疗作用，从而为人膀胱癌lncRNA-UCA1清除和膀胱癌的有效治疗提供新的策略。
本发明在除了直接靶向剪接lncRNA-UCA1基因，还利用CRISPR/Cas9联合特异性敲除lncRNA-UCA1和人PD-1基因的方法，对小鼠膀胱癌的移植瘤实施免疫基因治疗的策略。首先分别设计和合成特异性靶向lncRNA-UCA1基因的sgRNA1和特异性靶向PD-1基因的sgRNA2，将sgRNA1和sgRNA2与线性的pGL3-U6-sgRNA质粒连接成pGL3-U6-UCA1 sg质粒和pGL3-U6-PD1 sg质粒。在验证除了将pGL3-U6-UCA1 sg质粒和pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒转入膀胱癌的5637细胞后可以明显抑制lncRNA-UCA1基因表达，还将pGL3-U6-UCA1 sg质粒和pGL3-U6-PD1 sg质粒联合转入荷膀胱癌移植瘤的小鼠体内，获得高效敲除lncRNA-UCA1基因表达并明显抑制移植瘤生长的效果。
一、靶向lncRNA-UCA1的sgRNA1和靶向PD-1的sgRNA2寡核苷酸的设计和选择，如无特殊说明，文中sgRNA1是靶向lncRNA-UCA1的序列；sgRNA2是靶向人PD-1的序列。
1、在lncRNA-UCA1基因上选择5’-GGN(19)GG的序列，如果没有5’-GGN(19)GG的序列，5’-GN(20)GG或者5’-N(21)GG也可以。在PD-1基因上选择5’-GGN(19)GG的序列，如果没有5’-GGN(19)GG的序列，5’-GN(20)GG或者5’-N(21)GG也可以。
2、sgRNA1在lncRNA-UCA1的靶向位点分别位于lncRNA-UCA1的启动子和转录起始区域。sgRNA2在人PD-1基因上的靶点位于基因的外显子，这样更容易引起片段的缺失或移框突变，从而达到基因完全失活的目的。sgRNA2在人PD-1基因上的靶位点位于不同的各种剪切形式的共有外显子上。
3、在UCSC数据库中用BLAT或NCBI数据库中用BLAST，确定sgRNA1和sgRNA2的靶序列的唯一性，以减少潜在的脱靶位点。
4、如果用针对lncRNA-UCA1不同区域的sgRNA1来实现联合靶向UCA1，即可更有效的敲低UCA1基因。
5、如果用靶向lncRNA-UCA1不同区域的两个sgRNA1联合靶向人PD-1基因的sgRNA2，能更有效的抑制小鼠膀胱癌移植瘤的生长。
二、构建sgRNA的寡聚核苷酸双链
根据选择的sgRNA1s和sgRNA2s，在其5’加上CCGG得到正向寡核苷酸(Forwardoligo)，如果序列本身在5’端已经有1或者2个G，那么就对应的省略1或者2个G；根据选择的sgRNA，获得其对应DNA的互补链，并且在其5’加上AAAC得到反向寡核苷酸(Reverseoligo)，分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸的Forward oligo和Reverse oligo成对退火。
退火反应体系如下：
在PCR仪中按照以下touch down程序运行：95℃，5min；95-85℃at-2℃/s；85-25℃at-0.1℃/s；hold at 4℃
退火之后形成可以连入U6真核表达载体的双链，序列如下：
Forward oligo:5’-CCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNN
Reverse oligo:NNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’。
三、sgRNA寡聚核苷酸质粒的构建
1.线性化pGL3-U6-sgRNA质粒(如图8所示，Addgene(Cambridge,MA,USA))酶切体系和条件如下：2μg pGL3-U6-sgRNA(400ng/μL)；1μL CutSmart Buffer；1μL BsaI(NEB).补水至50μL，37℃孵育3-4小时；酶切完成后用AxyPrep PCR Clean up Kit(AP-PCR-250)纯化回收至20-40μL灭菌水中。
2.将退火的sgRNA1寡聚核苷酸双链和退火的sgRNA2寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒分别连接，获得pGL3-U6-UCA1 sg质粒和pGL3-U6-PD1 sg质粒。
3.转化大肠杆菌感受态细胞，并涂Amp+平板(50μg/mL)。
4.用SEQ.ID.NO.1的通用引物U6测序的方法鉴定阳性克隆。
5.37℃摇床摇菌过夜培养阳性克隆并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit(AP-MN-P-250)抽提pGL3-U6-UCA1 sg质粒和pGL3-U6-PD1 sg质粒。
四、转染人膀胱癌5637细胞
1.按Lipofectamine 2000Transfection Reagent(Invitrogen,11668-019)的操作手册，将分别带有对应UCA1基因的sgRNA寡聚核苷酸的pGL3-U6-UCA1 sg质粒(单独靶向UCA1启动子或转录起始区)与用于表达核酸酶Cas9的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒(结构如图9所示，Addgene(Cambridge,MA,USA))混匀，共转染5637细胞。具体如下：
2.为提高基因敲除效率，在靶向UCA1基因的sgRNA寡核苷酸设计、选择和合成之后，将靶向UCA1基因的sgRNA1寡聚核苷酸(即靶向UCA1启动子以及转录起始区的sgRNAUCA1-1以及UCA1-2)分别与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接分别获得含靶向UCA1启动子以及转录起始区的sgRNA寡聚核苷酸的载体pGL3-U6-UCA1 sg1以及pGL3-U6-UCA1 sg2，按如下操作转染5637细胞：按照Lipofectamine 2000Transfection Reagent(Invitrogen,11668-019)的操作手册，将两组(第一组：靶向UCA1启动子区的sgRNA的寡聚核苷酸的载体pGL3-U6-UCA1 sg1，对应的sgRNA为序列表的SEQ.ID.NO.4；第二组：靶向UCA1转录起始区的sgRNA的寡聚核苷酸的载体pGL3-U6-UCA1 sg2，对应的sgRNA参照序列表中的SEQ.ID.NO.5)按混合质量比例1:1(病人类型不同，对应的靶点的量也可调整)混合，将混合质粒与pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒混匀，共转染5637细胞。
在转染后二天，提取细胞RNA，用RT-PCR的方法检测UCA1基因的表达。
如图2所示，对照组(gRNA empty vector)是转入了没有切割活性的sgRNA载体pGL3-U6-UCA1 sg(对应的sgRNA为SEQ.ID.NO.2)；处理组是单独加入针对UCA1-1的sgRNA载体pGL3-U6-UCA1 sg1(图2中UCA1-1组)或针对UCA1-2的sgRNA载体pGL3-U6-UCA1 sg2(图2中UCA1-2组)，或者联合加入针对UCA1-1以及UCA1-2的sgRNA载体pGL3-U6-UCA1 sg1+2(图2中UCA1-(1+2)组)；图2中的Blank组是不加任何质粒的细胞，图2结果表明：用RT-PCR方法检测UCA1基因的表达情况，相比较Blank组和对照组，单独敲除可以有效降低UCA1的表达，联合敲除相比较单独敲除有更好的效果。
五、敲除人PD-1基因，检测PD-1基因的表达水平
1.取新鲜血液，用枸橼酸钠(ACD)抗凝，如果不马上分离，将血液先保存于4℃，六小时之内分离PBMC(人外周血单个核细胞)。(如果需要保存血清备用，先将血液2500rpm/min离心5min，将上层血清吸出)
2.用等体积的生理盐水稀释血液或血浆。1：1稀释血液可降低红细胞的凝聚，提高淋巴细胞的收获量。
3.取稀释后血液的二分之一体积的淋巴细胞分离液(每一份淋巴细胞分离液加两份稀释后的血液)，加入玻璃管管底，并升温到室温。
4.用塑料吸管吸取稀释后的血液样品，沿管壁缓慢铺到淋巴细胞分离液上面，勿打乱液层界面。
5. 2000rpm/min离心20min，室温约20℃。存放2h以上的血液应离心30min。
6.离心后管底是红细胞，中间层是分离液，最上层是血浆。血浆层与分离液之间是一薄层较致密的白色雾状层，含单个核细胞(包括淋巴细胞和单核粒细胞)。用吸管直接插入到单个核细胞层并吸取该层，放入另一试管中。
7.加10mL生理盐水稀释分离的PBMC(人外周血单个核细胞)，2500rpm/min离心10min，弃上清。重复洗涤1-2次，除去血小板和抗凝物质。
8.按Lipofectamine 2000Transfection Reagent(Invitrogen,11668-019)的操作手册，将分别带有对应PD-1基因的sgRNA寡聚核苷酸的pGL3-U6-PD1 sg质粒(sgRNA分别如SEQ.ID.NO.6或SEQ.ID.NO.7所示)与用于表达核酸酶Cas9的pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒(结构如图9所示，Addgene(Cambridge,MA,USA))混匀，转染PBMC细胞，用RT-PCR的方法检测PD-1的变化。
如图3所示，对照组(gRNA empty vector)是转入了没有切割活性的sgRNA载体pGL3-U6-PD1 sg(对应的sgRNA为SEQ.ID.NO.3)，处理组是单独加入针对PD1-1(SEQ.ID.NO.6)的sgRNA载体pGL3-U6-PD1-1 sg(图3中gRNA PD1-1组)和联合加入针对PD1-1以及PD1-2(SEQ.ID.NO.7)的sgRNA载体pGL3-U6-PD1-1 sg以及 pGL3-U6-PD1-2 sg(图3中gRNA PD1-(1+2)组)。用RT-PCR方法检测转染细胞后，PD-1基因的表达情况。图3结果表明：相比较对照组，单独敲除可以有效降低PD-1的表达，联合敲除相比较单独敲除有更好的效果。
六、建立人化荷瘤移植瘤模型，观察联合靶向剪接UCA1和PD-1基因抑制肿瘤的效果
1、建立人化小鼠模型
培养SCID完全免疫缺陷小鼠，然后腹腔注射4x107人PBMC，按时间点检测小鼠静脉血内人lgG水平。取小鼠尾静脉血，按照(ELISA)使用说明书测量人lgG。
(1)配制工作浓度洗涤液(以纯化水做25倍稀释，充分混匀后待用)；
(2)根据实验要求，选择一定量的反应板条；
(3)加入75μL待测样本和阴性阳性对照于反应孔中；
(4)用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育60分钟；
(5)取出反应板，撕去封片，在已加入待测样本和阴性，阳性对照孔中加入50μL酶结合物；
(6)在微孔振荡器上震荡10秒钟；
(7)用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育30分钟；
(8)取出反应板，撕去封片纸，洗涤反应板5次；
(9)洗涤结束后立即在所有孔内加入显色剂A，显色剂B各50μL，混匀；
(10)在微孔振荡器上震荡10秒钟；
(11)用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育30分钟；
(12)在所有孔内加入50μL终止液，震荡反应5秒钟，使之充分混匀；
(13)用酶标仪读数(波长450nm)，并计算获得人lgG含量。
2、建立小鼠荷膀胱癌移植瘤模型
培养膀胱癌5637细胞，按每个注射点2×106个细胞的数量接种人化小鼠背部皮下。如图4所示，空白组是不注射PBMC的小鼠，图4结果表明：随着时间点的变化，人化荷瘤组小鼠lgG水平相比较空白组水平明显增高，表明人化荷瘤小鼠模型建立成功。
待移植瘤长至2mm3大小，将其分为5组进行体内联合免疫基因治疗实验，即对照组(Control或gRNA empty vector)、阳性对照组(LPS)、敲低UCA1组(gRNA-UCA1)、敲低PD-1组(gRNA-PD1)以及联合敲低UCA1+PD-1组(gRNA-(UCA1+PD1))。采用电穿孔注射靶向UCA1和人PD-1基因质粒的方法，每组给的剂量分别为对照组：40μg pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF+10μg没有切割活性的sgRNA载体(含SEQ.ID.NO.2)+10μg 没有切割活性的sgRNA载体(含SEQ.ID.NO.3)；敲低UCA1组：40μgpST1374-NLS-flag-Cas9-ZF+10μg pGL3-U6-UCA1 sg1+10μg pGL3-U6-UCA1 sg2；敲低PD1组：40μg pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF+10μg pGL3-U6-PD1-1 sg+10μg pGL3-U6-PD1-2 sg；联合敲低UCA1+PD1组：40μg pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF+10μg pGL3-U6-UCA1 sg1+10μg pGL3-U6-UCA1 sg2+10μg pGL3-U6-PD1-1 sg+10μg pGL3-U6-PD1-2 sg。
3、分析小鼠DC表型的变化
3.1.DC细胞的分离，诱导
(1)小鼠外周血加PBS稀释到3-5mL，加Ficoll 5mL，离心1600*20min，小心取出白膜层，用PBS 12mL重悬，离心1600*8min，PBS 10mL重悬，计数，离心1600*8min，10mL DC无血清培养基重悬，铺六孔板，每孔5X106，空隙中加入PBS，放入培养箱。剩余单个核细胞冻存，冻存液为9:1的血清和DMSO；
(2)3h后，观察贴壁情况，吸出未贴壁细胞，用PBS洗两遍，离心1500*5min，这些细胞合并起来冻存，冻存液为9:1的血清和DMSO；
(3)贴壁细胞中加入1.5mL DC完全培养基；
3.2.DC表型的检测
(1)收集各组DC，用生理盐水冲洗2遍；
(2)将细胞转移至流式试管，用100μL的生理盐水重悬，要求细胞量不少于5x105/管，加入10％正常小鼠血清常温封闭30min；
(3)分别加入流式抗体HLA-DR(APC)，CD80(FITC)，CD83(PE)常温避光孵育30min；
(4)用生理盐水洗细胞2次，最后用200μL的生理盐水重悬；
(5)流式细胞仪分析。
如图5所示，根据人化荷瘤小鼠模型内DC表型的变化，单独敲除UCA1可以有效提高DC的抗原递呈作用，联合敲除UCA1+PD-1相比较单独敲除有更好的效果。
4.检测体内肿瘤细胞凋亡的变化
(1)去除瘤块不需要的组织，使用无菌的解剖刀和剪刀把剩余组织切成3-4mm小片，通过悬浮在无钙镁的平衡盐溶液中清晰组织碎片。让组织碎片沉淀，去除上清液，重复清晰2-3次；
(2)将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液。加入0.25％溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶(100mg组织加入1mL胰蛋白酶)；
(3)在4℃孵育6到18小时，胰蛋白酶充分作用；
(4)移弃组织碎片中的液体，在37℃孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟；
(5)在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂；
(6)通过无菌不锈钢丝网(100～200mm)过滤，分散所有剩余组织，将分离得单细胞计数；
(7)调整待检测细胞浓度为106/mL，取200uL、1000rpmX5min(4℃)；
(8)预冷的PBS润洗2次；
(9)将细胞重悬于100uL bind buffer，加入2uL Annexin-V-FITC(20ug/mL)，轻轻混匀，避光冰上放置15分钟；
(10)转至流式检测管，加入400ulPBS，每个样品临上级前加入1uL PI(50ug/mL)，2分钟后经流式细胞仪迅速检测；
(11)同时以不加Annexin-V-FITC和PI的一管作为阴性对照。
如图6所示，根据人化荷瘤小鼠模型内细胞凋亡的变化，相比较对照组，单独敲除UCA1可以有效增加肿瘤细胞的凋亡，联合敲除相比较单独敲除有更好的效果。
5、观察移植瘤生长变化
于给药后3d/7d/14d分别用游标卡尺测量移植瘤大小(3次)，计算、观察移植瘤变化情况，在给药后于22d脱臼处死小鼠，称量移植瘤。如图7所示，相比较于对照组(gRNAempty vector)，单独敲除PD-1(gRNA-PD1)或UCA1(gRNA-UCA1)有很好的抑制肿瘤生长效果；联合敲除UCA1+PD-1(gRNA-(UCA1+PD1))相比较对照组和单独敲除组有更好的抑制肿瘤生长的作用。

Claims (11)

1.靶向人lncRNA-UCA1抑制膀胱癌的sgRNA，其特征在于：该抑制膀胱癌的sgRNA包括在CRISPR-Cas9特异性修饰lncRNA-UCA1基因中可特异性靶向人lncRNA-UCA1基因的sgRNA，该sgRNA的序列如SEQ.ID.NO.4或SEQ.ID.NO.5所示。
2.靶向人lncRNA-UCA1抑制膀胱癌的基因载体，其特征在于：该基因载体选自重组质粒pGL3-U6-UCA1sgl、pGL3-U6-UCA1sg2中的一种，pGL3-U6-UCA1sgl由序列如SEQ.ID.NO.4所示的sgRNA的寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，pGL3-U6-UCA1sg2由序列如SEQ.ID.NO.5所示的sgRNA的寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，通过连接使SEQ.ID.NO.4或SEQ.ID.NO.5所示序列插入至pGL3-U6-sgRNA质粒的多克隆位点内。
3.靶向人lncRNA-UCA1抑制膀胱癌的基因载体组合物，其特征在于：该组合物包括pGL3-U6-UCA1sg质粒，所述pGL3-U6-UCA1sg质粒选自重组质粒pGL3-U6-UCA1sgl、pGL3-U6-UCA1sg2中的一种或两种，pGL3-U6-UCA1sgl由序列如SEQ.ID.NO.4所示的sgRNA的寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，pGL3-U6-UCA1sg2由序列如SEQ.ID.NO.5所示的sgRNA的寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，通过连接使SEQ.ID.NO.4或SEQ.ID.NO.5所示序列插入至pGL3-U6-sgRNA质粒的多克隆位点内。
4.如权利要求3所述靶向人lncRNA-UCA1抑制膀胱癌的基因载体组合物，其特征在于：所述pGL3-U6-UCA1sgl与pGL3-U6-UCA1sg2的质量比为(1～2):(1～2)。
5.如权利要求3所述靶向人lncRNA-UCA1抑制膀胱癌的基因载体组合物，其特征在于：所述组合物还包括pGL3-U6-PD1sg质粒，所述pGL3-U6-PD1sg质粒选自重组质粒pGL3-U6-PD1-1sg、pGL3-U6-PD1-2sg中的一种或两种，pGL3-U6-PD1-1sg由序列如SEQ.ID.NO.6所示的sgRNA的寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，pGL3-U6-PD1-2sg由序列如SEQ.ID.NO.7所示的sgRNA的寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，通过连接使SEQ.ID.NO.6或SEQ.ID.NO.7所示序列插入至pGL3-U6-sgRNA质粒的多克隆位点内。
6.如权利要求5所述靶向人lncRNA-UCA1抑制膀胱癌的基因载体组合物，其特征在于：所述pGL3-U6-UCA1sg质粒与pGL3-U6-PD1sg质粒的质量比为(1～3):(1～2)；所述pGL3-U6-PD1-1sg与pGL3-U6-PD1-2sg的质量比为(1～2):(1～2)。
7.如权利要求3所述靶向人lncRNA-UCA1抑制膀胱癌的基因载体组合物，其特征在于：所述组合物还包括用于表达核酸酶Cas9的质粒，所述用于表达核酸酶Cas9的质粒:pGL3-U6-UCA1sg质粒的质量比为(1～4):(1～3)。
8.如权利要求5所述靶向人lncRNA-UCA1抑制膀胱癌的基因载体组合物，其特征在于：所述组合物还包括用于表达核酸酶Cas9的质粒，所述用于表达核酸酶Cas9的质粒:pGL3-U6-UCA1sg质粒:pGL3-U6-PD1sg质粒的质量比为(1～4):(1～3):(1～2)。
9.如权利要求1所述靶向人lncRNA-UCA1抑制膀胱癌的sgRNA在制备用于治疗人膀胱癌的药物中的应用。
10.如权利要求3或5所述靶向人lncRNA-UCA1抑制膀胱癌的基因载体组合物在制备用于治疗人膀胱癌的药物中的应用。
11.可特异性靶向人PD1基因的sgRNA在制备用于治疗人膀胱癌的药物中的应用，所述的应用包括与可特异性靶向人lncRNA-UCA1基因的sgRNA联合使用，可特异性靶向人lncRNA-UCA1基因的sgRNA的序列如SEQ.ID.NO.4或SEQ.ID.NO.5所示，可特异性靶向人PD1基因的sgRNA的序列如SEQ.ID.NO.6或SEQ.ID.NO.7所示。
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