CN115956124A - 改善蛋白质表达的方法 - Google Patents

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CN115956124A CN202180047935.3A CN202180047935A CN115956124A CN 115956124 A CN115956124 A CN 115956124A CN 202180047935 A CN202180047935 A CN 202180047935A CN 115956124 A CN115956124 A CN 115956124A
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Abstract

本披露涉及包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸，其中该免疫球蛋白重链中的一个或两个内含子的核苷酸序列缺失。这些核酸可用于增加免疫球蛋白表达。

Description

改善蛋白质表达的方法
技术领域
本披露涉及表达目标多肽的改良方法。包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列和内含子缺失的核酸有助于增加免疫球蛋白的特定细胞生产力。
背景技术
DNA由内含子序列和外显子序列构成，其中内含子在mRNA加工期间通过剪接被去除。该加工与通过核孔复合物从细胞核中输出的mRNA出核密切相关。该出核是表达的基础，并在文献中有详细记载。参见Kohler A.等人，Nature Review Molecular Cell Biology[自然评论分子细胞生物学]8：761-773(2007)；Bjork，P.等人，Seminars in Cell&Developmental Biology[细胞与发育生物学研讨会]32：47-54(2014)：Reed，R.CurrentOpinion in Cell Biology[当代细胞生物学观点]，15：326-331(2003)。
已经观察到，与在该区域中没有内含子的相同核苷酸序列相比，在表达载体中编码的密码子优化的重链恒定区内存在内含子引起收获滴度提高。然而，与使用含有内含子的表达载体相关的风险是，在比如抗体或免疫球蛋白等目标蛋白质的表达期间可能会发生内含子保留和错误剪接事件，从而引起需要在纯化期间去除的不需要的异常蛋白质种类。如果在下游加工期间无法去除这些替代种类，这会增加纯化加工的额外复杂性和潜在的批次间差异。
已经表明，使用含有来自重链恒定区的内含子的非密码子优化的序列可以消除重链恒定区中剪接变体的出现。密码子优化引起的核苷酸序列变化被认为引入了隐蔽剪接，从而产生了这些替代种类。此外，已经表明，单独去除内含子中的每一个内含子(从而留下剩余的三个内含子中的两个)表现出收获滴度的惊人提高。
从免疫球蛋白重链恒定区去除一个或两个内含子可以降低内含子保留和错误剪接事件的风险，同时增加免疫球蛋白表达。这将产生新一代的表达载体，其在基于抗体或免疫球蛋白的重组蛋白的生产期间产生异常蛋白质种类的风险较低。
发明内容
本披露总体上涉及一种分离的核酸，其包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子2和内含子3的核苷酸序列缺失。
本披露还涉及一种分离的核酸，其包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列，其中免疫球蛋白重链恒定区的一个内含子的核苷酸序列缺失。在一个方面，免疫球蛋白重链恒定区的内含子1的核苷酸序列缺失。在另一方面，免疫球蛋白重链恒定区的内含子2的核苷酸序列缺失。在另一方面，免疫球蛋白重链恒定区的内含子3的核苷酸序列缺失。
本披露还涉及一种分离的核酸，其包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列，其中免疫球蛋白重链恒定区的两个内含子的核苷酸序列缺失。在一个方面，免疫球蛋白重链恒定区的内含子1和内含子2的核苷酸序列缺失。在另一方面，免疫球蛋白重链恒定区的内含子1和内含子3的核苷酸序列缺失。
本披露还涉及一种分离的核酸，其包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子1的核苷酸序列缺失，并且免疫球蛋白重链恒定区的内含子2和/或内含子3的核苷酸序列缺失，并且其中内含子2和/或内含子3的核苷酸序列经内含子1的核苷酸序列取代。在一个方面，免疫球蛋白重链恒定区的内含子2的核苷酸序列经内含子1的核苷酸序列取代。在一个方面，免疫球蛋白重链恒定区的内含子3的核苷酸序列经内含子1的核苷酸序列取代。
本披露还涉及一种分离的核酸，其包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子2和/或内含子3的核苷酸序列经内含子1的核苷酸序列替换。在一个方面，免疫球蛋白重链恒定区的内含子2的核苷酸序列经内含子1的核苷酸序列替换。在一个方面，免疫球蛋白重链恒定区的内含子3的核苷酸序列经内含子1的核苷酸序列替换。
本披露还涉及一种分离的核酸，其包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子3的核苷酸序列经包含与免疫球蛋白重链恒定区的内含子1的核苷酸序列大约相同数量的核苷酸的内含子的核苷酸序列替换。
本披露还涉及一种分离的核酸，其包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子2的核苷酸序列经包含与免疫球蛋白重链恒定区的内含子1的核苷酸序列大约相同数量的核苷酸的内含子的核苷酸序列替换。在一个方面，免疫球蛋白重链恒定区的内含子1的核苷酸序列缺失。
在一个方面，该核酸当以编码免疫球蛋白轻链的核酸表达时，以比含有免疫球蛋白重链恒定区的所有内含子序列的核酸更高的滴度表达免疫球蛋白。在另一方面，该核酸当以编码免疫球蛋白轻链的核酸表达时，以比不含有免疫球蛋白重链恒定区的内含子序列的核酸更高的滴度表达免疫球蛋白。在另一方面，免疫球蛋白轻链是κ轻链或λ轻链。在另一方面，该核酸是密码子优化的。在另一方面，经表达的免疫球蛋白具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。在另一方面，经表达的免疫球蛋白是人免疫球蛋白、人源化免疫球蛋白、嵌合免疫球蛋白或表面重塑的免疫球蛋白。在另一方面，编码免疫球蛋白重链的核酸是脱氧核糖核酸(DNA)。
在另一方面，本披露涉及一种包含本披露的核酸的载体或表达载体。在另一方面，本披露涉及一种包含本披露的载体或表达载体的宿主细胞。在一个方面，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
本披露还总体涉及一种产生免疫球蛋白的方法，该方法包括在宿主细胞表达该免疫球蛋白的条件下在培养基中培养该细胞；其中宿主细胞包含含有编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸以及编码免疫球蛋白轻链的核酸，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子2和内含子3的核苷酸序列缺失，其中宿主细胞以比包含编码免疫球蛋白重链的核酸和编码免疫球蛋白轻链的核酸的宿主细胞更高的滴度表达该免疫球蛋白，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子1至3中的全部均存在或其中无任一者存在。
本披露还总体涉及一种产生免疫球蛋白的方法，该方法包括在宿主细胞表达该免疫球蛋白的条件下在培养基中培养该细胞；其中宿主细胞包含含有编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸以及编码免疫球蛋白轻链的核酸，其中免疫球蛋白重链恒定区的一个内含子的核苷酸序列缺失，该宿主细胞以比包含编码免疫球蛋白重链的核酸和编码免疫球蛋白轻链的核酸的宿主细胞更高的滴度表达该免疫球蛋白，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子1至3中的全部均存在或其中无任一者存在。在一个方面，免疫球蛋白重链恒定区的内含子1的核苷酸序列缺失。在另一方面，免疫球蛋白重链恒定区的内含子2的核苷酸序列缺失。在另一方面，免疫球蛋白重链恒定区的内含子3的核苷酸序列缺失。
本披露还总体涉及一种产生免疫球蛋白的方法，该方法包括在宿主细胞表达该免疫球蛋白的条件下在培养基中培养该细胞；其中宿主细胞包含含有编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸以及编码免疫球蛋白轻链的核酸，其中免疫球蛋白重链恒定区的两个内含子的核苷酸序列缺失，其中宿主细胞以比包含编码免疫球蛋白重链的核酸和编码免疫球蛋白轻链的核酸的宿主细胞更高的滴度表达该免疫球蛋白，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子1至3中的全部均存在或其中无任一者存在。在一个方面，免疫球蛋白重链恒定区的内含子1和2缺失。在另一方面，免疫球蛋白重链恒定区的内含子1和内含子3缺失。
本披露还总体涉及一种产生免疫球蛋白的方法，该方法包括在宿主细胞表达该免疫球蛋白的条件下在培养基中培养该细胞；其中宿主细胞包含含有编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸以及编码免疫球蛋白轻链的核酸，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子1的核苷酸序列缺失，并且免疫球蛋白重链的内含子2和/或内含子3的核苷酸序列缺失，并且其中内含子2和/或内含子3的核苷酸序列经内含子1的核苷酸序列取代，其中宿主细胞以比包含编码免疫球蛋白重链的核酸和编码免疫球蛋白轻链的核酸的宿主细胞更高的滴度表达该免疫球蛋白，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子1-3中的全部存在或无任一者存在。在一个方面，免疫球蛋白重链恒定区的内含子2的核苷酸序列经内含子1的核苷酸序列取代。在另一方面，免疫球蛋白重链恒定区的内含子3的核苷酸序列经内含子1的核苷酸序列取代。
本披露还总体涉及一种产生免疫球蛋白的方法，该方法包括在宿主细胞表达该免疫球蛋白的条件下在培养基中培养该细胞；其中宿主细胞包含含有编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸以及编码免疫球蛋白轻链的核酸，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子2和/或内含子3的核苷酸序列经内含子1的核苷酸序列替换，其中宿主细胞以比包含编码免疫球蛋白重链的核酸和编码免疫球蛋白轻链的核酸的宿主细胞更高的滴度表达该免疫球蛋白，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子1-3中的全部存在或无任一者存在。在一个方面，免疫球蛋白重链恒定区的内含子2的核苷酸序列经内含子1的核苷酸序列替换。在另一方面，免疫球蛋白重链恒定区的内含子3的核苷酸序列经内含子1的核苷酸序列替换。
本披露还总体涉及一种产生免疫球蛋白的方法，该方法包括在宿主细胞表达该免疫球蛋白的条件下在培养基中培养该细胞；其中宿主细胞包含含有编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸以及编码免疫球蛋白轻链的核酸，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子3的核苷酸序列经包含与免疫球蛋白重链恒定区的内含子1的核苷酸序列大约相同数量的核苷酸的内含子的核苷酸序列替换，其中宿主细胞以比包含编码免疫球蛋白重链的核酸和编码免疫球蛋白轻链的核酸的宿主细胞更高的滴度表达该免疫球蛋白，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子1至3中的全部均存在或其中无任一者存在。在一个方面，免疫球蛋白重链恒定区中的内含子1的核苷酸序列缺失。
本披露还总体涉及一种产生免疫球蛋白的方法，该方法包括在宿主细胞表达该免疫球蛋白的条件下在培养基中培养该细胞；其中宿主细胞包含含有编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸以及编码免疫球蛋白轻链的核酸，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子2的核苷酸序列经包含与免疫球蛋白重链恒定区的内含子1的核苷酸序列大约相同数量的核苷酸的内含子的核苷酸序列替换。其中宿主细胞以比包含编码免疫球蛋白重链的核酸和编码免疫球蛋白轻链的核酸的宿主细胞更高的滴度表达该免疫球蛋白，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子1至3中的全部均存在或其中无任一者存在。在一个方面，免疫球蛋白重链恒定区中的内含子1的核苷酸序列缺失。
在一个方面，经表达的免疫球蛋白具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。在另一方面，经表达的免疫球蛋白是人免疫球蛋白、人源化免疫球蛋白、嵌合免疫球蛋白或表面重塑的免疫球蛋白。
在一个方面，从克隆池产生的经表达的免疫球蛋白具有至少1,000mg/L、至少1,500mg/L、至少2,000mg/L、至少2,500mg/L或至少3，000mg/L的收获滴度。在另一方面，从最高表达的克隆产生的经表达的免疫球蛋白具有至少1,000mg/L、至少1,500mg/L、至少2,000mg/L、至少3,000mg/L、至少4,000mg/L、至少5,000mg/L、至少6,000mg/L、至少7,000mg/L、至少8,000mg/L、至少9,000mg/L、至少10,000mg/L、至少11,000mg/L或至少12,000mg/L的收获滴度。
在一个方面，宿主细胞是真核细胞。在另一方面，真核细胞是CHO细胞。
附图说明
图1示出了MAb1的高效尺寸排阻色谱和对所产生的免疫球蛋白变体的描绘。
图2A至图2B.图2A示出了非密码子优化基因组DNA(gDNA)和针对MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的密码子优化互补DNA(cDNA)的图解。图2B示出了在用gDNA或cDNA核苷酸序列的MAb2生产的第14天时的免疫球蛋白滴度(mg/L)。
图3A至图3B.图3A示出了针对免疫球蛋白重链恒定区的非密码子优化基因组DNA(gDNA)、针对MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的密码子优化互补DNA(cDNA)、不具有MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的内含子1的gDNA、不具有MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的内含子2的gDNA、不具有MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的内含子3的gDNA以及不具有MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的任何内含子的gDNA的图解。图3B显示了在使用以下构建体中的每一个的MAb2生产的第13天时的免疫球蛋白滴度(mg/L)：(1)针对免疫球蛋白重链恒定区的非密码子优化基因组DNA(gDNA)；(2)针对MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的密码子优化互补DNA(cDNA)；(3)不具有MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的内含子1的gDNA；(4)不具有MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的内含子2的gDNA；(5)不具有MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的内含子3的gDNA；和(6)不具有MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的任何内含子的gDNA。
图4A至图4D.图4A示出了描绘以下构建体中的每一个构建体的平均活细胞数(VCN)(x106/mL)的图：(1)针对免疫球蛋白重链恒定区的非密码子优化基因组DNA(gDNA)；(2)针对MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的密码子优化互补DNA(cDNA)；(3)不具有MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的内含子1的gDNA；(4)不具有MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的内含子2的gDNA；(5)不具有MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的内含子3的gDNA；和(6)不具有MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的任何内含子的gDNA。图4B示出了描绘以下构建体中的每一个构建体的细胞活力(％)的图：(1)针对免疫球蛋白重链恒定区的非密码子优化基因组DNA(gDNA)；(2)针对MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的密码子优化互补DNA(cDNA)；(3)不具有MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的内含子1的gDNA；(4)不具有MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的内含子2的gDNA；(5)不具有MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的内含子3的gDNA；和(6)不具有MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的任何内含子的gDNA。图4C示出了描绘以下构建体中的每一个构建体的活细胞积分(IVC)(109个细胞/日/L)的图：(1)针对免疫球蛋白重链恒定区的非密码子优化基因组DNA(gDNA)；(2)针对MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的密码子优化互补DNA(cDNA)；(3)不具有MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的内含子1的gDNA；(4)不具有MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的内含子2的gDNA；(5)不具有MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的内含子3的gDNA；和(6)不具有MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的任何内含子的gDNA。图4D示出了描述以下构建体中的每一个构建体的细胞生产力(qP)(pg/(细胞/日))的图：(1)针对免疫球蛋白重链恒定区的非密码子优化基因组DNA(gDNA)；(2)针对MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的密码子优化互补DNA(cDNA)；(3)不具有MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的内含子1的gDNA；(4)不具有MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的内含子2的gDNA；(5)不具有MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的内含子3的gDNA；和(6)不具有MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的任何内含子的gDNA。
图5A-5D.图5A显示了在用以下构建体中的每一个的MAb2生产的第11天时的免疫球蛋白滴度(mg/L)：(1)gDNA(非密码子优化)，其中内含子2从MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中去除；(2)gDNA(非密码子优化)，其中内含子1和2从MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中去除；(3)gDNA(非密码子优化)，其中内含子2和3从MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中去除；(4)gDNA(非密码子优化)，其在MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中不具有任何内含子；(5)gDNA(密码子优化)，其中内含子2从MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中去除；(6)gDNA(密码子优化)，其中内含子1和2从MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中去除；(7)gDNA(密码子优化)，其中内含子2和3从MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中去除；和(8)gDNA(密码子优化)，其在MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中不具有任何内含子。图5B示出了描绘以下构建体中的每一个构建体的平均活细胞数(VCN)(x106/ml)的图：(1)gDNA(非密码子优化)，其中内含子2从MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中去除；(2)gDNA(非密码子优化)，其中内含子1和2从MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中去除；(3)gDNA(非密码子优化)，其中内含子2和3从MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中去除；(4)gDNA(非密码子优化)，其在MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中不具有任何内含子；(5)gDNA(密码子优化)，其中内含子2从MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中去除；(6)gDNA(密码子优化)，其中内含子1和2从MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中去除；(7)gDNA(密码子优化)，其中内含子2和3从MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中去除；(8)gDNA(密码子优化)，其在MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中不具有任何内含子；和(9)MAb3(阳性对照)。图5C示出了描绘以下构建体中的每一个构建体的活细胞积分(IVC)(109个细胞hr/L)的图：(1)gDNA(非密码子优化)，其中内含子2从MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中去除；(2)gDNA(非密码子优化)，其中内含子1和2从MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中去除；(3)gDNA(非密码子优化)，其中内含子2和3从MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中去除；(4)gDNA(非密码子优化)，其在MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中不具有任何内含子；(5)gDNA(密码子优化)，其中内含子2从MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中去除；(6)gDNA(密码子优化)，其中内含子1和2从MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中去除；(7)gDNA(密码子优化)，其中内含子2和3从MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中去除；(8)gDNA(密码子优化)，其在MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中不具有任何内含子；和(9)MAb3(阳性对照)。图5D示出了描述以下构建体中的每一个构建体的细胞生产力(qP)(pg/(细胞/日))的图：(1)gDNA(非密码子优化)，其中内含子2从MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中去除；(2)gDNA(非密码子优化)，其中内含子1和2从MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中去除；(3)gDNA(非密码子优化)，其中内含子2和3从MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中去除；(4)gDNA(非密码子优化)，其在MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中不具有任何内含子；(5)gDNA(密码子优化)，其中内含子2从MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中去除；(6)gDNA(密码子优化)，其中内含子1和2从MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中去除；(7)gDNA(密码子优化)，其中内含子2和3从MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中去除；和(8)gDNA(密码子优化)，其在MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中不具有任何内含子。
图6A至图6B.图6A示出了以下构建体的图解：(1)非密码子优化基因组DNA(gDNA)，其来自MAb2的免疫球蛋白重链恒定区；(2)非密码子优化gDNA，其不含来自MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的内含子2；(3)非密码子优化gDNA，其不含来自MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的内含子2和3；(4)非密码子优化gDNA，其不含来自MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的内含子1和2；(5)非密码子优化gDNA，其在MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中的内含子1的位置处具有内含子3；(6)非密码子优化gDNA，其在MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中的内含子1的位置处具有修饰的内含子3核苷酸序列；(7)非密码子优化gDNA，其在MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中的内含子3的位置处具有内含子1；(8)非密码子优化gDNA，其在MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中不具有任何内含子；(9)非密码子优化基因组DNA(gDNA)，其在MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的具有所有内含子和野生型IgG1；(10)非密码子优化gDNA，其在MAb2的免疫球蛋白重链恒定区不含内含子2和3和野生型IgG1；(11)非密码子优化gDNA，其在MAb2的免疫球蛋白重链恒定区不含内含子1和2和野生型IgG1；和(12)非密码子优化gDNA，其在MAb2的免疫球蛋白重链恒定区具有野生型IgG1。图6B显示了在用以下构建体的MAb2生产的第11天时的免疫球蛋白滴度(mg/L)：(1)非密码子优化基因组DNA(gDNA)，其来自MAb2的免疫球蛋白重链恒定区；(2)非密码子优化gDNA，其不含来自MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的内含子2；(3)非密码子优化gDNA，其不含来自MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的内含子2和3；(4)非密码子优化gDNA，其不含来自MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的内含子1和2；(5)非密码子优化gDNA，其在MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中的内含子1的位置处具有内含子3；(6)非密码子优化gDNA，其在MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中的内含子1的位置处具有修饰的内含子3核苷酸序列；(7)非密码子优化gDNA，其在MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中的内含子3的位置处具有内含子1；(8)非密码子优化gDNA，其在MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中不具有任何内含子；(9)非密码子优化基因组DNA(gDNA)，其在MAb2的免疫球蛋白重链恒定区的具有所有内含子和野生型IgG1；(10)非密码子优化gDNA，其在MAb2的免疫球蛋白重链恒定区不含内含子2和3和野生型IgG1；(11)非密码子优化gDNA，其在MAb2的免疫球蛋白重链恒定区不含内含子1和2和野生型IgG1；和(12)非密码子优化gDNA，其在MAb2的免疫球蛋白重链恒定区具有野生型IgG1。
图7示出了以下的图解：MAb2、MAb1、MAb3和MAb4的免疫球蛋白重链恒定区的非密码子优化基因组DNA(gDNA)；MAb2、MAb1、MAb3和MAb4的免疫球蛋白重链恒定区的不含内含子2和3的非密码子优化gDNA；以及MAb2、MAb1、MAb3和MAb4的免疫球蛋白重链恒定区的不含任何内含子的非密码子优化gDNA。
图8显示了MAb2、MAb1、MAb3和MAb4的免疫球蛋白重链恒定区的非密码子优化基因组DNA(gDNA)在第11天时的免疫球蛋白滴度(mg/L)；MAb2、MAb1、MAb3和MAb4的免疫球蛋白重链恒定区的不含内含子2和3的非密码子优化gDNA；以及MAb2、MAb1、MAb3和MAb4的免疫球蛋白重链恒定区的不含任何内含子的非密码子优化gDNA。
图9示出了描绘MAb2、MAb1、MAb3和MAb4的免疫球蛋白重链恒定区的非密码子优化基因组DNA(gDNA)的滴度水平随时间变化的图；MAb2、MAb1、MAb3和MAb4的免疫球蛋白重链恒定区的不含内含子2和3的非密码子优化gDNA；以及MAb2、MAb1、MAb3和MAb4的免疫球蛋白重链恒定区的不含任何内含子的非密码子优化gDNA。
图10示出了免疫球蛋白重链恒定区的基因组DNA排列的图解。
具体实施方式
为了便于理解本披露，下文定义了一些术语和短语。
I.定义
如本文所用，术语“免疫球蛋白”、“抗体(antibody)”和“抗体(antibodies)”是本领域的术语并且在本文中可以互换使用，并且指具有至少一个特异性结合抗原的抗原结合位点的分子或分子复合物。
抗体可包括例如，单克隆抗体、重组产生的抗体、人抗体、人源化抗体、表面重塑的抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包含两条重链和两条轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、胞内抗体、异源偶联抗体、单结构域抗体、单价抗体、单链抗体或单链Fv(scFv)、骆驼化抗体、亲和体、Fab片段、F(ab′)2片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、抗独特型(抗Id)抗体(包括例如，抗-抗Id抗体)、双特异性抗体和多特异性抗体。在某些方面，本文所述的抗体是指多克隆抗体群。抗体可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)或任何亚类(例如，IgG2a或IgG2b)的免疫球蛋白分子。在某些方面，本文所述的抗体是IgG抗体或其类别(例如，人IgG1、IgG2或IgG4)或亚类。在特定方面，该抗体是人源化单克隆抗体。在另一特定方面，该抗体是人单克隆抗体，例如，即免疫球蛋白。在某些方面，本文所述的抗体是IgG1、IgG2或IgG4抗体。
如本文所用，术语“抗原结合结构域”、“抗原结合区”、“抗原结合位点”和类似术语是指抗体分子的部分，其包含在抗体分子上使得针对抗原(例如，互补决定区(CDR))呈特异性的氨基酸残基。抗原结合区可以衍生自比如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠或仓鼠)和人的任何动物物种。
“单克隆”抗体是指参与单一抗原决定簇或表位的高度特异性识别和结合的同源抗体群。这与典型地包括针对不同抗原决定簇的不同抗体的多克隆抗体相反。术语“单克隆”抗体涵盖完整和全长免疫球蛋白分子以及Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv)、单链(scFv)、包含抗体部分的融合蛋白和包含抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆”抗体是指以任何数目的方式(包括但不限于通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达和转基因动物)制备的此类抗体。
术语“嵌合”抗体是指其中氨基酸序列衍生自两种或更多种物种的抗体。典型地，轻链和重链两者的可变区对应于衍生自具有所希望的特异性、亲和力和能力的一种哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔等)的抗体的可变区，而恒定区同源于衍生自另一种(通常为人)的抗体中的序列，以避免在该物种中引起免疫应答。
术语“人源化”抗体是指含有最少的非人(例如，鼠类)序列的非人(例如，鼠类)抗体的形式。典型地，人源化抗体是人免疫球蛋白，其中来自互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(例如，小鼠、大鼠、兔、仓鼠)的CDR的具有所希望特异性、亲和力和能力的残基替换(“CDR移植”)(Jones等人，Nature[自然]，321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature[自然]332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science[科学]239：1534-1536(1988))。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基经来自非人物种的具有所希望特异性、亲和力和能力的抗体中的相应残基替换。其人源化抗体可以通过在Fv框架区中和/或在替换的非人残基内的另外的残基的取代来进一步修饰，以改进和优化抗体特异性、亲和力和/或能力。通常，人源化抗体将包含基本上所有至少一个(并且典型地两个或三个)可变结构域，该可变结构域包含对应于非人免疫球蛋白的所有或基本上所有CDR区，而所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的恒定区或结构域。用于产生人源化抗体的方法的实例描述于美国专利5,225,539；Roguska等人，Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]USA，91(3)：969-973(1994)；以及Roguska等人，Protein Eng.[蛋白质工程]9(10)：895-904(1996)。
术语“表面重塑的抗体(resurfaced antibody或resurfaced antibodies)”意指一种鼠类抗体，其通过仅将在重组FV的V区的表面可及的那些氨基酸人源化而重新设计以类似于人抗体。对鼠类单克隆抗体进行表面重整以降低其免疫原性可能有利于维持重构(reshaped)版本的原始单克隆抗体的亲合力，这是因为保留了天然框架-CDR相互作用。
术语“人抗体”意指具有衍生自人免疫球蛋白基因座的氨基酸序列的抗体，其中此类抗体是使用本领域已知的任何技术制备的。
可变区典型地是指抗体的一部分，通常是轻链或重链的一部分，典型地是成熟重链中约110至125个氨基酸以及成熟轻链中约90至115个氨基酸的氨基末端，该部分在抗体之间的序列广泛不同并且用于特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。序列的变异性集中在称为互补决定区(CDR)的那些区域中，而可变结构域中保守性更高的区域称为框架区(FR)。不希望受任何特定机制或理论的束缚，据信轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用和特异性。在某些方面，可变区是人可变区。在某些方面，可变区包含啮齿动物或鼠类CDR和人框架区(FR)。在特定方面，可变区是灵长类动物(例如，非人灵长类动物)可变区。在某些方面，可变区包含啮齿动物或鼠类CDR和灵长类动物(例如，非人灵长类动物)框架区(FR)。
如本文所用，术语“恒定区”或“恒定结构域”是可互换的并且具有其在本领域中常见的含义。恒定区是抗体的一部分，例如轻链和/或重链的羧基端部分，该部分不直接涉及抗体与抗原的结合，但是可以表现出各种效应子功能，诸如与Fc受体的相互作用。相对于免疫球蛋白可变结构域，免疫球蛋白分子的恒定区通常具有更保守的氨基酸序列。免疫球蛋白“恒定区”或“恒定结构域”可含有CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域或这些结构域的子集，例如CH2结构域和CH3结构域。在本文提供的某些方面，免疫球蛋白恒定区不含有CH1结构域。在本文提供的某些方面，免疫球蛋白恒定区不含有铰链。在本文提供的某些方面，免疫球蛋白恒定区含有CH2结构域和CH3结构域。
“Fc区”或“Fc结构域”是指对应于或衍生自源抗体的部分的多肽序列，该部分负责与细胞上的抗体受体和补体的C1q组分结合。Fc代表“结晶片段”并且是指将易于形成蛋白质晶体的抗体片段。最初通过蛋白水解消化描述的不同蛋白质片段可以定义免疫球蛋白的总体通用结构。“Fc区”或“Fc结构域”含有CH2结构域、CH3结构域和任选的全部或部分铰链。“Fc区”或“Fc结构域”可指单个多肽或两个二硫键连接的多肽。有关免疫球蛋白结构和功能的综述，请参见Putnam，The Plasma Proteins[血浆蛋白]，第V卷(学术出版社公司(Academic Press，Inc.)，1987)，第49-140页；和Padlan，Mol.Immunol.[分子免疫学]31：169-217，1994。如本文所用，术语Fc包括具有天然存在的序列的变体。
“野生型免疫球蛋白铰链区”是指天然存在的抗体的重链中发现的插入在CH1结构域和CH2结构域(针对IgG、IgA和IgD)之间并连接这些结构域或插入在CH1结构域和CH3结构域(针对IgE和IgM)之间并连接这些结构域的天然存在的上部和中间铰链氨基酸序列。在某些方面，野生型免疫球蛋白铰链区序列是人的，并且可以包含人IgG铰链区。“改变的野生型免疫球蛋白铰链区”或“改变的免疫球蛋白铰链区”是指(a)野生型免疫球蛋白铰链区，其具有最多30％氨基酸变化(例如，最多25％、20％、15％、10％或5％的氨基酸取代或缺失)，或(b)野生型免疫球蛋白铰链区的一部分，其长度为约5个氨基酸(例如，约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸)至最多约120个氨基酸(例如，具有约10至约40个氨基酸或约15至约30个氨基酸或约15至约20个氨基酸或约20至约25个氨基酸)，具有最多约30％的氨基酸变化(例如，最多约25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的氨基酸取代或缺失或其组合)，并且具有IgG核心铰链区，如US2013/0129723和US 2013/0095097中所披露。
如本文所用，术语“重链”在用于指抗体时可以基于恒定区的氨基酸序列指任何不同类型，例如，alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)，其分别产生抗体的IgA、IgD、IgE、IgG及IgM类别，包括IgG的亚类，例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
如本文所用，术语“轻链”在用于指抗体时可以基于恒定区的氨基酸序列指任何不同的类型，例如，kappa(κ)或lambda(λ)。轻链氨基酸序列是本领域熟知的。在特定方面，轻链是人轻链。
在文中可互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指具有任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已经被天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，诸如与标记组分缀合。该定义还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。应当理解，由于本发明的多肽是基于抗体的，因此在某些方面，该多肽可以作为单链或相关链出现。
如本文所用，术语“核酸”、“核酸分子”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和其聚合物。除非明确限制，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的类似物的核酸，这些核酸具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式被代谢。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可以通过产生如下序列来实现，其中一个或多个选定的(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人(1991)Nucleic Acid Res.[核酸研究]19：5081；Ohtsuka等人(1985)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]260：2605-2608；Cassol等人(1992)；Rossolini等人(1994)Mol.Cell.Probes[分子细胞探针]8：91-98)。术语核酸可与基因、cDNA和由基因编码的mRNA互换使用。如本文所用，术语“核酸”、“核酸分子”或“多核苷酸”旨在包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、DNA类似物或使用核苷酸类似物和其衍生物、片段和同源物产生的RNA。
如本文所用，术语“内含子”是指转录成RNA并且随后通常通过剪接从RNA中去除以产生成熟形式的RNA(例如mRNA)的核苷酸序列。通常，内含子的核苷酸序列不并入成熟RNA，内含子序列或其部分通常也不翻译且并入多肽。细胞的剪接机制使用比如剪接供体和受体的剪接信号序列以从RNA中去除内含子。
如本文所用，术语“载体”是指线性或环状核酸，其包含根据目标核酸的区段。
如本文所用，术语“表达载体”是指包含一个或多个表达单元的线性或环状核酸分子。除了一个或多个表达单元之外，表达载体还可以包括另外的核酸区段，比如，表达载体一般衍生自质粒或病毒DNA，或者可以含有两者的元件。
如本文所用，术语“宿主细胞”可以是任何类型的细胞，例如原代细胞、培养中的细胞或来自细胞系的细胞。在具体方面，术语“宿主细胞”是指用核酸分子转染的细胞和此类细胞的后代或潜在后代。此类细胞的后代可能与用核酸分子转染的亲本细胞不同，例如，这是由于在后续世代中可能发生的突变或环境影响或将核酸分子整合到宿主细胞基因组中引起的。
如本文所用的术语“活细胞数”是指培养物中存在的活(存活)细胞数。
如本文所用，术语“细胞活力”是指培养物中的细胞在给定的培养条件或实验变化集合下存活的能力。如本文所用的术语还指在特定时间存活的细胞部分，其与当时培养物中存活和死亡的细胞总数有关。
如本文所用，术语“收获滴度”或“滴度”是指细胞培养物中产生的经表达多肽或免疫球蛋白的总量除以给定量的培养基体积。
如本文所用，术语“qP”是指细胞特异性生产力并且由产生的总免疫球蛋白除以活细胞积分来确定。
如本文所用，术语“IVC”是指活细胞积分并且通过
Figure BDA0004039186290000181
计算其中X是活细胞浓度，V是培养物体积，并且t是时间。
“分离的”多肽、抗体、核酸、载体、细胞或组合物是呈自然界中未发现形式的多肽、抗体、核酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、核酸、载体、细胞或组合物包括已经被纯化至它们不再呈自然界中发现形式的程度的那些。在一些方面，分离的抗体、核酸、载体、细胞或组合物是基本上纯的。如本文所用，“基本上纯的”是指至少50％纯(即不含污染物)的材料。在一些情况下，材料是至少90％纯的、至少95％纯的、至少98％纯的或至少99％纯的。
应当理解，除非另有说明，否则如本文所用的术语“一(a)”和“一个(an)”是指所列举的组分中的“一个或多个”。
除非明确声明或从上下文显而易见，如本文所用的，术语“或”被理解为包括在内。如本文在短语诸如“A和/或B”中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”和“B”。同样，如短语诸如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下每个方面：A、B、和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
应当理解，无论在什么情况下本文用语言“包含”描述方面时，也提供了用“由......组成”和/或“基本上由......组成”描述的其他类似方面并且作为本申请披露内容的部分。在本披露中，“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有(containing)”和“具有(having)”以及类似术语可以具有美国和欧洲专利法赋予它们的意义并且可以意指“包括(includes)”、“包括(including)”以及类似术语；“基本上由......组成(consistingessentially of)”或“基本上由......组成(consists essentially)”同样具有美国和欧洲专利法所赋予的含义。应当理解，就相关美国专利法而言，该术语是开放性的，允许超出所叙述的存在，只要所叙述的基本或新颖特征不被超过叙述的存在改变，但是排除现有技术方面。还应当理解，就相关欧洲专利法而言，使用“基本上由......组成”或“基本上包含”意指可以存在特定的其他组分，即不会实质性影响化合物或组合物的基本特征的那些。
如本文所用，术语“约”和“大约”在用于修饰数值或数值范围时，指示最多高于该数值或范围5％或低于该数值或范围5％的偏差仍在所叙述的值或范围的预期含义内。
II.编码免疫球蛋白的核酸
人免疫球蛋白G(IgG)含有重链多肽和轻链多肽，它们一起形成免疫球蛋白。免疫球蛋白轻链具有可变轻链，其包含有助于结合于表位的可变轻区互补决定区(CDR)。免疫球蛋白轻链还含有轻链恒定区。IgG轻链可以是κ或λ轻链。
免疫球蛋白重链具有可变重链，其包含有助于结合于表位的可变重区互补决定区(CDR)。免疫球蛋白重链还含有重链恒定区。在IgG重链恒定区中，存在三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)和一个铰链区。
编码人IgG重链恒定区的核苷酸序列含有三个内含子(参见图10)。人IgG重链恒定区中的内含子1位于编码CH1和铰链区的外显子之间。人IgG重链恒定区中的内含子2位于编码铰链区和CH2区的外显子之间。人IgG重链恒定区中的内含子3位于编码CH2区和CH3区的外显子之间。
已知内含子与经由核孔复合体从细胞核中输出的mRNA相关联。一般参见KohlerA.等人，Nature Review Molecular Cell Biology[自然评论分子细胞生物学]8：761-773(2007)；Bjork，P.等人，Seminars in Cell&Developmental Biology[细胞与发育生物学研讨会]32：47-54(2014)；Reed，R.Current Opinion in Cell Biology[当代细胞生物学观点]，15：326-331(2003)。因此，当制备用于重组免疫球蛋白生产的核酸时，内源性内含子通常不会被切除，因为与相应的cDNA版本相比，具有内含子的核酸通常会增加免疫球蛋白生产滴度。参见例如图2。
尽管使用在人IgG重链中含有内源性内含子的核酸生产免疫球蛋白会导致免疫球蛋白滴度增加，但内含子可能引入不正确的剪接位点，这些剪接位点可能导致免疫球蛋白片段或变体，从而降低产物纯度。在免疫球蛋白池中引入免疫球蛋白片段或变体可能会增加纯化这些片段和变体的难度，从而对纯化加工施加过度负担并促使产物纯度降低。
在一个方面，IgG重链恒定区中一个或两个内含子的核苷酸序列的缺失导致免疫球蛋白片段或变体的产量减少，并且当用编码IgG轻链的适当核酸表达时导致免疫球蛋白滴度增加。
在某些方面，本披露涵盖包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸，其中免疫球蛋白重链恒定区的第二内含子和第三内含子的核苷酸序列缺失。在某些方面，本披露涵盖包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸，其中核苷酸序列包含第一内含子的序列并且免疫球蛋白重链恒定区的第二内含子和第三内含子的序列缺失。在某些方面，本披露涵盖包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸，其中核苷酸序列仅包含免疫球蛋白重链恒定区的第一内含子。在某些方面，本披露涵盖包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸，其中核苷酸序列仅包含免疫球蛋白重链恒定区的第二内含子。在某些方面，本披露涵盖包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸，其中核苷酸序列仅包含免疫球蛋白重链恒定区的第三内含子。
在某些方面，本披露涵盖包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸，其中免疫球蛋白重链恒定区的三个内源性内含子中的一个内含子的核苷酸序列缺失。在一些情况下，第一内含子缺失。在一些情况下，第二内含子缺失。在一些情况下，第三内含子缺失。在某些方面，本披露涵盖包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸，其中核苷酸序列包含第二内含子和第三内含子的序列，但免疫球蛋白重链恒定区的第一内含子的序列缺失。在某些方面，本披露涵盖包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸，其中核苷酸序列包含第一内含子和第三内含子的序列，但免疫球蛋白重链恒定区的第二内含子的序列缺失。在某些方面，本披露涵盖包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸，其中核苷酸序列包含第一内含子和第二内含子的序列，但免疫球蛋白重链恒定区的第三内含子的序列缺失。
在某些方面，本披露涵盖包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸，其中免疫球蛋白重链恒定区中三个内源性内含子中的两个内含子的核苷酸序列缺失。在一些情况下，第一内含子和第二内含子缺失。在一些情况下，第一内含子和第三内含子缺失。在一些情况下，第二内含子和第三内含子缺失。在某些方面，本披露涵盖包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸，其中核苷酸序列包含第一内含子的序列但免疫球蛋白重链恒定区的第二内含子和第三内含子的序列缺失。在某些方面，本披露涵盖包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸，其中核苷酸序列包含第二内含子的序列但免疫球蛋白重链恒定区的第一内含子和第三内含子的序列缺失。在某些方面，本披露涵盖包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸，其中核苷酸序列包含第三内含子的序列但免疫球蛋白重链恒定区的第一内含子和第二内含子的序列缺失。
在某些方面，本披露涵盖包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸，其中第一内含子的核苷酸序列缺失并且免疫球蛋白重链恒定区的第二内含子和/或第三内含子的核苷酸序列缺失，并且其中第二内含子和/或第三内含子的核苷酸序列经第一内含子的核苷酸序列取代。在一些情况下，第二内含子的核苷酸序列经第一内含子的核苷酸序列取代。在一些情况下，第三内含子的核苷酸序列经第一内含子的核苷酸序列取代。在某些方面，本披露涵盖包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸，其中第一内含子和第二内含子的核苷酸序列从免疫球蛋白重链恒定区缺失，并且其中第二内含子的核苷酸序列经第一内含子的核苷酸序列取代。在某些方面，本披露涵盖包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸，其中第一内含子和第三内含子的核苷酸序列从免疫球蛋白重链恒定区缺失，并且其中第三内含子的核苷酸序列经第一内含子的核苷酸序列取代。在某些方面，本披露涵盖包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸，其中第一内含子的核苷酸序列缺失并且免疫球蛋白重链恒定区的第二内含子和第三内含子的核苷酸序列缺失，并且其中第二内含子和第三内含子的核苷酸序列各自经第一内含子的核苷酸序列取代。
在某些方面，本披露涵盖包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸，其中免疫球蛋白重链恒定区中第二内含子和/或第三内含子的核苷酸序列经第一内含子的核苷酸序列取代。在一些情况下，第二内含子的核苷酸序列经第一内含子的核苷酸序列取代。在一些情况下，第三内含子的核苷酸序列经第一内含子的核苷酸序列取代。在某些方面，本披露涵盖包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸，其中免疫球蛋白重链恒定区中的第二内含子的核苷酸序列经第一内含子的核苷酸序列取代而不缺失第一内含子和第三内含子的序列。在某些方面，本披露涵盖包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸，其中免疫球蛋白重链恒定区中的第三内含子的核苷酸序列经第一内含子的核苷酸序列取代而不缺失第一内含子和第二内含子的序列。在某些方面，本披露涵盖包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸，其中免疫球蛋白重链恒定区中的第二内含子和第三内含子的核苷酸序列经第一内含子的核苷酸序列取代而不缺失第一内含子的序列。
在某些方面，本披露涵盖包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸，其中免疫球蛋白重链恒定区中的第三内含子的核苷酸序列经包含与免疫球蛋白重链恒定区的第一内含子的核苷酸序列大约相同数量的核苷酸的内含子的核苷酸序列替换。在一些情况下，免疫球蛋白重链恒定区中的第一内含子的核苷酸序列缺失。在某些方面，本披露涵盖包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸，其中免疫球蛋白重链恒定区中的第三内含子的核苷酸序列经包含与免疫球蛋白重链恒定区的第一内含子的核苷酸序列大约相同数量的核苷酸的内含子的核苷酸序列替换并且第一内含子和/或第二内含子的序列缺失。
在某些方面，本披露涵盖包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸，其中免疫球蛋白重链恒定区中的第二内含子的核苷酸序列经包含与免疫球蛋白重链恒定区的第一内含子的核苷酸序列大约相同数量的核苷酸的内含子的核苷酸序列替换。在一些情况下，免疫球蛋白重链恒定区中的第一内含子的核苷酸序列缺失。在某些方面，本披露涵盖包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸，其中免疫球蛋白重链恒定区中的第二内含子的核苷酸序列经包含与免疫球蛋白重链恒定区的第一内含子的核苷酸序列大约相同数量的核苷酸的内含子的核苷酸序列替换并且第一内含子和/或第三内含子的序列缺失。
在上述任一方面，包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸也可以编码免疫球蛋白轻链的核酸表达。在一些情况下，免疫球蛋白轻链是κ轻链。在一些情况下，免疫球蛋白轻链是λ轻链。
在上述任一方面，该核酸在以编码免疫球蛋白轻链的核酸表达时以比在重链恒定区中含有所有内含子序列的核酸更高的滴度表达免疫球蛋白。
在上述任一方面，该核酸在以编码免疫球蛋白轻链的核酸表达时以比在重链恒定区中不含内含子序列的核酸更高的滴度表达免疫球蛋白。
在上述任一方面，核酸不是密码子优化的。在上述任一方面，核酸是密码子优化的。
在上述任一方面，所表达的免疫球蛋白具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
在上述任一方面，所表达的免疫球蛋白是人、人源化、嵌合或表面重塑的免疫球蛋白。
本披露的核酸可以呈RNA形式或呈DNA形式。DNA包括基因组DNA或合成DNA；并且可以是双链的或单链的，并且如果是单链的话，可以是编码链或非编码(反义)链。在一些方面，核酸是缺少一个、多个内源性内含子的DNA。
在一些方面，核酸包含非天然存在的核苷酸。在一些方面，核酸是重组产生的。
在某些方面，核酸是分离的。
III.细胞和载体
还提供包含本文所述的核酸的载体和细胞。
在某些方面，本文提供包含表达载体的细胞(例如，宿主细胞)，这些表达载体表达(例如，重组地)本文所述的编码免疫球蛋白的核酸。本文提供包含编码免疫球蛋白重链和轻链的核苷酸序列的载体(例如，表达载体)以用于在宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中重组表达。本文还提供了包含此类载体的宿主细胞以用于重组表达包含编码免疫球蛋白的核苷酸序列的核酸。
免疫球蛋白的重组表达涉及含有核酸的表达载体，该核酸包含编码本文所述的免疫球蛋白(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的核苷酸序列。在一些方面，载体包含如本文所述的核酸，其含有编码免疫球蛋白的核苷酸序列。在一些态样，宿主细胞包含载体。本披露还提供了呈包含如本文所述的核酸的质粒、载体、转录盒或表达盒形式的构建体。在一些方面，载体是表达载体，其具有额外的核苷酸序列(例如，启动子)以帮助在宿主细胞中产生重组免疫球蛋白。
可以通过常规技术将表达载体转移到细胞(例如，宿主细胞)，并且可以随后通过常规技术来培养所得细胞以产生本文所述的免疫球蛋白。因此，本文提供了宿主细胞，其含有编码本文所述的免疫球蛋白或其多肽的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至启动子以用于在宿主细胞中表达此类序列。
在某些方面，宿主细胞含有载体，其包含编码本文所述的免疫球蛋白的免疫球蛋白重链和轻链多肽的核酸。在某些方面，宿主细胞含有多种不同的载体，其包含编码本文所述的免疫球蛋白的所有多肽的核酸。
载体或载体组合可包含编码两种或更多种多肽的核酸，这些多肽相互作用以形成本文所述的免疫球蛋白：例如，编码重链的第一核酸和编码轻链的第二核酸。当两个多肽由两个不同载体中的核酸编码时，这些载体可以被转染到同一宿主细胞中。
多种宿主表达载体系统可用于表达本文所述的免疫球蛋白或其多肽(例如，免疫球蛋白恒定区；重链或轻链)。此类宿主表达系统代表可以产生并随后纯化目标编码序列的媒介物，而且还代表当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时，可原位表达本文所述的免疫球蛋白或其多肽的细胞。这些包括但不限于微生物，诸如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia))；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)转化的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统(例如，比如菜茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的绿藻类)；或带有含衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或衍生自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS(例如COS1或COS)、CHO、BHK、MDCK、HEK 293、NS0、PER.C6、VERO、CRL7O3O、HsS78Bst、HeLa和NIH 3T3、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20和BMT10细胞)。
一旦本文所述的免疫球蛋白或其多肽(例如，免疫球蛋白恒定区；重链或轻链)已经通过重组表达产生，其就可以通过本领域已知的用于抗体的纯化的任何方法来纯化，例如，通过色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法(特别是通过针对蛋白质A后的特异性抗原的亲和色谱法)以及尺寸柱色谱法)、离心、差别溶解度，或者通过用于蛋白质的纯化的任何其他标准技术来纯化。此外，本文所述的抗体可与本文所述(例如，FLAG标签、his标签或抗生物素蛋白)或本领域另外已知的异源多肽序列融合以促进纯化。
IV.免疫球蛋白生产
免疫球蛋白可以通过本领域已知的用于合成免疫球蛋白的任何方法，例如通过重组表达技术产生。除非另有说明，否则本文所述的方法采用分子生物学、微生物学、遗传分析、重组DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交以及本领域技术范围内相关领域的常规技术。这些技术例如在本文引用的参考文献中有描述并且在文献中对其进行了充分解释。参见例如，Maniatis T等人，(1982)Molecular Cloning：A LaboratoryManual[分子克隆：实验室手册]，Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社]；Sambrook J等人，(1989)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社]；Sambrook J等人，(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]，Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社]，Cold SpringHarbor，NY[纽约冷泉港]；Ausubel FM等人，Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学实验指南]，约翰·威利父子公司[John Wiley&Sons](1987年和年度更新)；Current Protocols in Immunology[免疫学实验指南]，约翰·威利父子公司[JohnWiley&Sons](1987年和年度更新)Gait(编辑)(1984)Oligonucleotide Synthesis：APractical Approach[寡核苷酸合成：实用方法]，IRL出版社[IRL Press]；Eckstein(编辑)(1991)Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach[寡核苷酸合成：实用方法]，IRL出版社[IRL Press]；Birren B等人，(编辑)(1999)Genome Analysis：ALaboratory Manual[基因组分析：实验室手册]，Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社]。
在一些方面，提供了具有编码任何免疫球蛋白重链恒定区的核苷酸序列的分离的核酸，和任选地具有编码本披露的免疫球蛋白重链可变区和/或免疫球蛋白轻链的核苷酸序列的分离的核酸。此类核酸可以编码免疫球蛋白的包含CL的氨基酸序列和/或包含CH的氨基酸序列(例如，免疫球蛋白的轻和/或重恒定链)。此类核酸可以编码免疫球蛋白的包含VL的氨基酸序列和/或包含VH的氨基酸序列(例如，免疫球蛋白的轻和/或重可变链)。在一些方面，提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如，表达载体)。在一些方面，还提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一些方面，宿主细胞包含(例如，已经用以下进行转染)：(1)包含核酸的载体，该核酸编码包含免疫球蛋白轻链的氨基酸序列和包含免疫球蛋白重链的氨基酸序列，或(2)包含核酸的第一载体，该核酸编码包含免疫球蛋白轻链的氨基酸序列；和包含核酸的第二载体，该核酸编码包含免疫球蛋白重链的氨基酸序列。
在一些方面，包含本披露的编码免疫球蛋白的核酸的宿主细胞在适合抗体表达的条件下培养。对于使用本披露的核酸重组生产免疫球蛋白，分离一种或多种编码重链和/或轻链的核酸并插入到一种或多种载体中以用于在如本文所述的宿主细胞中进一步克隆和/或表达。
在某个方面，宿主细胞包含含有编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列的核酸和编码免疫球蛋白轻链的核酸，其中免疫球蛋白重链恒定区的第二内含子和第三内含子的核苷酸序列缺失，其中宿主细胞以比包含编码免疫球蛋白重链恒定区的核酸的宿主细胞更高的滴度表达该免疫球蛋白，该免疫球蛋白重链恒定区包含所有内含子序列或不含内含子序列。在特定方面，细胞是分离的细胞。在一些方面，第一内含子的核酸序列缺失。在一些方面，第二内含子的核酸序列缺失。在一些方面，第三内含子的核酸序列缺失。在一些方面，第一内含子和第二内含子的核苷酸序列缺失。在一些方面，第一内含子和第三内含子的核苷酸序列缺失。在一些方面，第二内含子的核苷酸序列经第一内含子的核苷酸序列取代。在一些方面，第三内含子的核苷酸序列经第一内含子的核苷酸序列取代。在一些方面，第二内含子的核苷酸序列经第一内含子的核苷酸序列替换。在一些方面，第三内含子的核苷酸序列经第一内含子的核苷酸序列替换。在某个方面，免疫球蛋白重链恒定区中的第三内含子的核苷酸序列经包含与免疫球蛋白重链恒定区的第一内含子的核苷酸序列大约相同数量的核苷酸的内含子的核苷酸序列替换。在某个方面，免疫球蛋白重链恒定区中的第二内含子的核苷酸序列经包含与免疫球蛋白重链恒定区的第一内含子的核苷酸序列大约相同数量的核苷酸的内含子的核苷酸序列替换。在一些方面，免疫球蛋白重链恒定区中的第一内含子的核苷酸序列也缺失。
在上述任一方面，免疫球蛋白轻链是κ轻链或λ轻链。
在上述任一方面，核酸是密码子优化的。在上述任一方面，核酸不是密码子优化的。
在上述任一方面，免疫球蛋白具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
在上述任一方面，免疫球蛋白是人免疫球蛋白、人源化免疫球蛋白、嵌合免疫球蛋白或表面重塑的免疫球蛋白。
在上述任一方面，从克隆池产生的免疫球蛋白具有至少1,000mg/L的收获滴度。在上述任一方面，从克隆池产生的免疫球蛋白具有至少1,500mg/L的收获滴度。在上述任一方面，从克隆池产生的免疫球蛋白具有至少2,000mg/L的收获滴度。在上述任一方面，从克隆池产生的免疫球蛋白具有至少2,500mg/L的收获滴度。在上述任一方面，从克隆池产生的免疫球蛋白具有至少3,000mg/L的收获滴度。
在上述任一方面，从最高表达的克隆产生的免疫球蛋白具有至少1,000mg/L的收获滴度。在上述任一方面，从最高表达的克隆产生的免疫球蛋白具有至少1,500mg/L的收获滴度。在上述任一方面，从最高表达的克隆产生的免疫球蛋白具有至少2,000mg/L的收获滴度。在上述任一方面，从最高表达的克隆产生的免疫球蛋白具有至少3,000mg/L的收获滴度。在上述任一方面，从最高表达的克隆产生的免疫球蛋白具有至少4,000mg/L的收获滴度。在上述任一方面，从最高表达的克隆产生的免疫球蛋白具有至少5,000mg/L的收获滴度。在上述任一方面，从最高表达的克隆产生的免疫球蛋白具有至少6,000mg/L的收获滴度。在上述任一方面，从最高表达的克隆产生的免疫球蛋白具有至少7,000mg/L的收获滴度。在上述任一方面，从最高表达的克隆产生的免疫球蛋白具有至少8,000mg/L的收获滴度。在上述任一方面，从最高表达的克隆产生的免疫球蛋白具有至少9,000mg/L的收获滴度。在上述任一方面，从最高表达的克隆产生的免疫球蛋白具有至少10,000mg/L的收获滴度。在上述任一方面，从最高表达的克隆产生的免疫球蛋白具有至少11,000mg/L的收获滴度。在上述任一方面，从最高表达的克隆产生的免疫球蛋白具有至少12,000mg/L的收获滴度。
在上述任一方面，宿主细胞是真核细胞。在上述任一方面，真核细胞是CHO细胞。
在一些方面，已将外源核酸引入细胞中。
在一些方面，该方法进一步包括从细胞或宿主细胞中纯化免疫球蛋白的步骤。
本披露的多方面可以进一步通过参考以下非限制性实例进行定义，这些非限制性实例详细描述了本披露的某些抗体的制备以及使用本披露抗体的方法。本领域技术人员应当清楚的是可以在不偏离本披露的范围的情况下对材料和方法进行许多修改。
实例
应当理解，本文所述的实例和方面仅用于说明目的，并且将向本领域技术人员建议根据其进行的各种修改或改变，并且将包括在本申请的精神和范围内。
实例1.表征错误剪接的免疫球蛋白变体
内含子在多个领域都很重要，包括调节可变剪接、增强基因表达和控制mRNA从细胞核中转运。因此，在表达载体中使用核酸以产生含有内源性内含子的免疫球蛋白。然而，这可能导致错误剪接的免疫球蛋白变体，这些变体可能难以纯化和/或降低免疫球蛋白产物的收获滴度。
由于内含子剪接变体，MAb1的细胞培养物生产引起了三种免疫球蛋白变体。含有每个免疫球蛋白的轻链序列和重链序列的表达载体，其在重链恒定区中包括内源性内含子序列，经线性化并转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中。线性化表达载体的转染通过核转染进行以产生细胞池。线性化表达载体经由随机整合来整合到CHO基因组中。此时使用适当的细胞系开发工艺克隆出表达MAb1的细胞池以产生克隆制造细胞系。
使CHO细胞生长并诱导其以开始生产MAb1。收获免疫球蛋白，并使用高效尺寸排阻色谱法(HPSEC)纯化免疫球蛋白。对于HPSEC分级分离，在环境柱温下将MAb1注射到TSK-gelG3000SWxL柱(7.8mm x 30cm；东曹生命科学(Tosoh Bioscience)，美国宾夕法尼亚州普鲁士王(King of Prussia，PA，USA))上。使用由0.1M磷酸钠、0.1M硫酸钠(pH 6.8)构成的流动相以1.0mL/min的流速等度洗脱样品。在表征和分析之前，将从多次注射中收集的级分汇集并浓缩。参见Harris，C.等人，MABS，11：1452-1463(2019)。
如图1所示，HPSEC揭示了3种剪接变体：具有延伸部分和两个片段的单体免疫球蛋白。具有延伸部分的免疫球蛋白变体被鉴定为在免疫球蛋白的C末端上具有额外的λ轻链恒定结构域。这是由替代的重链转录物引起的，该转录物在重链的C末端上具有额外的λ轻链恒定结构域。这两个片段被确定为与内含子2相关的剪接变体，其位于铰链和CH2区之间。具体而言，一个片段是由框内终止密码子引起的，从而引起截短的重链，并且另一片段是由引起移码的错误剪接事件引起的，从而产生终止密码子和截短的重链。因此，免疫球蛋白片段变体是由免疫球蛋白重链恒定区中的内含子产生的。
实例2.对核酸进行工程化以减少免疫球蛋白剪接变体
为了消除实例1中产生的免疫球蛋白片段，产生了密码子优化cDNA核苷酸序列而在MAb2的免疫球蛋白重链恒定区中没有任何内含子。cDNA版本去除了免疫球蛋白重链恒定区中的内含子2，从而防止这两个片段的产生。
然而，众所周知，需要内含子来增强CHO细胞中的蛋白质表达。因此，CHO细胞通过核转染用非密码子优化gDNA或密码子优化cDNA转染以产生池，使这些细胞生长并诱导它们以产生免疫球蛋白，如在摇瓶中的池补料分批加工中一样。参见图2A。图2B表明，MAb2的cDNA版本与基因组DNA(gDNA)版本相比产生明显较少的免疫球蛋白，如收获滴度所示。
因为这两个免疫球蛋白片段变体是由内含子2中的错误剪接引起的，所以将该个别内含子从免疫球蛋白重链恒定区中去除，并与没有任何免疫球蛋白重链恒定区内含子的cDNA版本或gDNA版本进行比较。创建并测试了以下构建体：(1)在重链恒定区中含有所有三个内含子的gDNA(非密码子优化)；(2)cDNA(密码子优化)；(3)去除内含子1的gDNA(非密码子优化)；(4)去除内含子2的gDNA(非密码子优化)；(5)去除内含子3的gDNA(非密码子优化)；和(6)去除所有内含子的gDNA(非密码子优化)。参见图3A。
如实例1中所述制备核酸并在CHO细胞中转染至池阶段。通过使用Single CellPrinterTM(Cytena)，将含有单细胞的液滴沉积到384孔板的孔中来针对单细胞克隆对池进行筛选。使用
Figure BDA0004039186290000321
读板器(Synentec)确认单细胞沉积。选择最高表达的克隆以用于进一步表征。使最高克隆生长并诱导其产生针对每个构建体的MAb2。在第13天收获MAb2。图3B表明cDNA和gDNA(无内含子)的收获滴度具有最低的收获滴度。然而与含有所有三个内含子的gDNA、gDNA(无内含子)和cDNA构建体相比，gDNA减去内含子1、内含子2或内含子3构建体中的一个会引起收获滴度增加。
图4A-C表明平均活细胞数(VCN)、细胞活力和活细胞积分(IVC)在所有构建体之间大致相同，但图4D揭示滴度的增加来自于细胞生产力(qP)的增加。由于已知内含子会增加免疫球蛋白的表达，因此去除一个内含子会增加收获滴度是令人惊讶的。
实例3.对核酸进行工程化以增加收获滴度
为了进一步确定每个内含子对CHO细胞产生免疫球蛋白的能力的重要性，创建了以下MAb2构建体：(1)去除内含子2的gDNA(非密码子优化)；(2)去除内含子1和2的gDNA(非密码子优化)；(3)去除内含子2和3的gDNA(非密码子优化)；和(4)不含任何内含子的gDNA(非密码子优化)。为了确定使用密码子优化核苷酸序列的重要性，除了使用密码子优化序列之外，还创建了相同的构建体集。
如实例2，将构建体转染到CHO细胞中。类似地，使CHO细胞生长并按照实例2进行免疫球蛋白生产的诱导。在第11天，收获免疫球蛋白产物并测定收获滴度、qP、VCN和IVC。图5A揭示，无论核苷酸序列是否经密码子优化，从不含内含子2的gDNA以及不含内含子2和3的gDNA产生的免疫球蛋白的收获滴度最高。然而，不含内含子1和2的gDNA与不含任何内含子的gDNA具有相似的滴度水平。图5B和图5C表明，VCN和IVC对于每一者大致相同。然而，细胞生产力(qP)揭示无内含子2的gDNA以及无内含子2和3的gDNA的生产力最高。参见图5D。这表明内含子1对于增加免疫球蛋白的产量很重要。
为了进一步了解内含子1对增加免疫球蛋白产量的重要性，创建了几种新的MAb2构建体。除了上文创建的非密码子优化构建体(即，具有所有内含子的gDNA(非密码子优化)、无内含子2的gDNA(非密码子优化)、无内含子2和3的gDNA(非密码子优化)以及无内含子1和2的gDNA(非密码子优化))，创建了以下构建体：(1)将内含子3移至内含子1的位置并缺失内含子1和2的gDNA(非密码子优化)；(2)将内含子3移至内含子1的位置并缺失内含子1和2的gDNA(非密码子优化)，内含子3的核苷酸序列经修饰以通过对内含子序列进行1个核苷酸改变来增加5′剪接供体位点的强度；(3)将内含子1移至内含子3的位置并缺失内含子2和3的gDNA(非密码子优化)；(4)不含任何内含子的gDNA(非密码子优化)；(5)具有野生型IgG1和所有内含子的gDNA(非密码子优化)；(6)具有野生型IgG1且不含内含子2和子3的gDNA(非密码子优化)；(7)具有野生型IgG1且不含内含子1和子2的gDNA(非密码子优化)；和(8)具有野生型IgG1且不含任何内含子的gDNA(非密码子优化)。参见图6A。
如实例1中所述将这些构建体转染到CHO细胞中。如实例1中所述使CHO细胞生长并诱导其以产生免疫球蛋白。在第11天收获免疫球蛋白并测定收获滴度。图6B表明，将内含子1移至内含子3的位置会产生与含所有内含子的gDNA和仅含内含子1的gDNA相似的收获滴度。图6B还证实，内含子1在维持与含有所有三个内含子的构建体相似的滴度方面的作用不受形式是野生型IgG1还是半衰期延长的IgG1的影响。
实例4.对额外的免疫球蛋白中的核酸进行工程化以确定是否增加了收获滴度
为了确定MAb2中发现的结果是否特定于该免疫球蛋白，测试了额外的免疫球蛋白分子。图7显示了针对MAb2、MAb1、MAb3和MAb4创建的不同构建体。对于每种免疫球蛋白，创建了以下构建体：(1)含所有内含子的gDNA(非密码子优化)；(2)仅含内含子1的gDNA(非密码子优化)；和(3)不含任何内含子的gDNA(非密码子优化)。MAb2和MAb3含有κ轻链，而MAb1和MAb4含有λ轻链。λ轻链在可变轻链和恒定轻链之间具有不同的内含子，以及不同的polyA尾。创建这些构建体并如先前在实例1中所述。如实例2中所述将这些构建体转染到CHO细胞中以产生池。如实例2中所述使CHO细胞生长并诱导其以产生免疫球蛋白。在第11天收获免疫球蛋白并测定收获滴度。
图8表明，MAb2、MAb3、MAb1和MAb4的重链恒定区中仅存在内含子1引起与具有所有重链恒定区内含子的每个构建体相比相似的免疫球蛋白滴度。另外，与在免疫球蛋白重链恒定区中没有任何内含子的gDNA相比，仅具有内含子1的构建体具有增加的滴度。此外，图9显示，与在MAb2、MAb3、MAb1和MAb4的重链恒定区中仅含内含子1的构建体相比，具有所有重链恒定区内含子的构建体之间的从第7天到第11天的免疫球蛋白滴度相似。对于所有测试的分子，不含任何内含子的gDNA的免疫球蛋白滴度明显低于在重链恒定区中具有所有内含子的构建体和仅含内含子1的构建体。
这些数据进一步提供证据证明，重链恒定区的内含子1对于维持较高的免疫球蛋白滴度水平很重要。此外，该数据表明增加的滴度水平不限于MAb2。此外，免疫球蛋白κ或λ轻链的存在不影响滴度水平。
实例5.对核酸进行工程化用与内含子1大小相同的内含子替换内含子3
为了确定内含子1可以增加收获滴度的原因，本实例将证明这是由内含子1的大小而非核苷酸序列本身引起。MAb2中的内含子1为391个核苷酸，而内含子3为97个核苷酸。将创建以下构建体：(1)含所有内含子的MAb2 gDNA(非密码子优化)；(2)不含内含子2和3的MAb2(非密码子优化)；(3)不含内含子1和2的MAb2(非密码子优化)，但增加了内含子3中的核苷酸数量以使大小与内含子1大致相同；(4)MAb2(非密码子优化)，但将内含子1的大小减少到接近内含子3的大小，并缺失了内含子2和3；和(5)不含任何内含子的MAb2 gDNA(非密码子优化)。
将创建这些构建体并如先前在实例2中所述。如实例2中所述，将这些构建体转染到CHO细胞中。如实例1中所述将使CHO细胞生长并将诱导其以产生免疫球蛋白。将在第11天收获免疫球蛋白并将测定收获滴度。结果将表明，增加内含子3的大小将导致收获滴度增加，并且类似于无内含子2和内含子3的MAb2。然而，减小内含子1的大小将引起与无内含子1和2的MAb2类似的结果。该实例将揭示内含子1的大小是重要的，而非核苷酸序列本身。
***
本发明不受本文所述的特定方面的范围的限制。实际上，除了本文描述的那些之外，根据前面的描述和附图，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。
本文引用的所有参考文献(例如，出版物或专利或专利申请)通过援引以其全文并入本文并用于所有目的，其程度如同具体和单独指示各个参考文献(例如，出版物或专利或专利申请)通过援引以其全文并入以用于所有目的一样。
其他方面在以下权利要求的范围内。

Claims (56)

1.一种分离的核酸，其包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子2和内含子3的核苷酸序列缺失。
2.一种分离的核酸，其包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列，其中免疫球蛋白重链恒定区的一个内含子的核苷酸序列缺失。
3.如权利要求2所述的核酸，其中该免疫球蛋白重链恒定区的内含子1的核苷酸序列缺失。
4.如权利要求2所述的核酸，其中该免疫球蛋白重链恒定区的内含子2的核苷酸序列缺失。
5.如权利要求2所述的核酸，其中该免疫球蛋白重链恒定区的内含子3的核苷酸序列缺失。
6.一种分离的核酸，其包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列，其中免疫球蛋白重链恒定区的两个内含子的核苷酸序列缺失。
7.如权利要求6所述的核酸，其中该免疫球蛋白重链恒定区的内含子1和内含子2的核苷酸序列缺失。
8.如权利要求6所述的核酸，其中该免疫球蛋白重链恒定区的内含子1和内含子3的核苷酸序列缺失。
9.一种分离的核酸，其包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子1的核苷酸序列缺失，并且该免疫球蛋白重链恒定区的内含子2和/或内含子3的核苷酸序列缺失，并且其中内含子2和/或内含子3的核苷酸序列经内含子1的核苷酸序列取代。
10.如权利要求9所述的核酸，其中该免疫球蛋白重链恒定区的内含子2的该核苷酸序列经内含子1的该核苷酸序列取代。
11.如权利要求9所述的核酸，其中该免疫球蛋白重链恒定区的内含子3的该核苷酸序列经内含子1的该核苷酸序列取代。
12.一种分离的核酸，其包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子2和/或内含子3的核苷酸序列经内含子1的核苷酸序列替换。
13.如权利要求12所述的核酸，其中该免疫球蛋白重链恒定区的内含子2的该核苷酸序列经内含子1的该核苷酸序列替换。
14.如权利要求12所述的核酸，其中该免疫球蛋白重链恒定区的内含子3的该核苷酸序列经内含子1的该核苷酸序列替换。
15.一种分离的核酸，其包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子3的核苷酸序列经包含与该免疫球蛋白重链恒定区的内含子1的核苷酸序列大约相同数量的核苷酸的内含子的核苷酸序列替换。
16.一种分离的核酸，其包含编码免疫球蛋白重链的核苷酸序列，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子2的核苷酸序列经包含与该免疫球蛋白重链恒定区的内含子l的核苷酸序列大约相同数量的核苷酸的内含子的核苷酸序列替换。
17.如权利要求15或16所述的核酸，其中该免疫球蛋白重链恒定区的内含子1的核苷酸序列缺失。
18.如权利要求1至17中任一项所述的核酸，其中该核酸当以编码免疫球蛋白轻链的核酸表达时，以比含有该免疫球蛋白重链恒定区的所有内含子序列的核酸更高的滴度表达免疫球蛋白。
19.如权利要求1至17中任一项所述的核酸，其中该核酸当以编码免疫球蛋白轻链的核酸表达时，以比不含有该免疫球蛋白重链恒定区的内含子序列的核酸更高的滴度表达免疫球蛋白。
20.如权利要求18或19所述的核酸，其中该免疫球蛋白轻链是κ轻链或λ轻链。
21.如权利要求1至20中任一项所述的核酸，其中该核酸是密码子优化的。
22.如权利要求18至21中任一项所述的核酸，其中经表达的免疫球蛋白具有IgGl、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
23.如权利要求22所述的核酸，其中该免疫球蛋白是人免疫球蛋白、人源化免疫球蛋白、嵌合免疫球蛋白或表面重塑的免疫球蛋白。
24.如权利要求1至23中任一项所述的核酸，其是脱氧核糖核酸(DNA)。
25.一种载体，其包含如权利要求1至24中任一项所述的核酸。
26.一种表达载体，其包含如权利要求1至25中任一项所述的核酸。
27.一种宿主细胞，其包含如权利要求25所述的载体。
28.一种宿主细胞，其包含如权利要求26所述的表达载体。
29.如权利要求27或28所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是真核细胞。
30.如权利要求29所述的宿主细胞，其中该真核细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
31.一种产生免疫球蛋白的方法，该方法包括在宿主细胞表达该免疫球蛋白的条件下在培养基中培养该细胞；其中该宿主细胞包含编码免疫球蛋白重链的如权利要求1所述的核酸，以及编码免疫球蛋白轻链的核酸，其中该宿主细胞以比包含编码免疫球蛋白重链的核酸和编码免疫球蛋白轻链的核酸的宿主细胞更高的滴度表达该免疫球蛋白，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子1至3中的全部均存在或其中无任一者存在。
32.一种产生免疫球蛋白的方法，该方法包括在宿主细胞表达该免疫球蛋白的条件下在培养基中培养该细胞；其中该宿主细胞包含编码免疫球蛋白重链的如权利要求2所述的核酸，以及编码免疫球蛋白轻链的核酸，其中该宿主细胞以比包含编码免疫球蛋白重链的核酸和编码免疫球蛋白轻链的核酸的宿主细胞更高的滴度表达该免疫球蛋白，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子1至3中的全部均存在或其中无任一者存在。
33.如权利要求32所述的方法，其中该免疫球蛋白重链恒定区的内含子1的核苷酸序列缺失。
34.如权利要求32所述的方法，其中该免疫球蛋白重链恒定区的内含子2的核苷酸序列缺失。
35.如权利要求32所述的方法，其中该免疫球蛋白重链恒定区的内含子3的核苷酸序列缺失。
36.一种产生免疫球蛋白的方法，该方法包括在宿主细胞表达该免疫球蛋白的条件下在培养基中培养该细胞；其中该宿主细胞包含编码免疫球蛋白重链的如权利要求6所述的核酸，以及编码免疫球蛋白轻链的核酸，其中该宿主细胞以比包含编码免疫球蛋白重链的核酸和编码免疫球蛋白轻链的核酸的宿主细胞更高的滴度表达该免疫球蛋白，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子1至3中的全部均存在或其中无任一者存在。
37.如权利要求36所述的方法，其中该免疫球蛋白重链恒定区的内含子1和2缺失。
38.如权利要求36所述的方法，其中该免疫球蛋白重链恒定区的内含子1和3缺失。
39.一种产生免疫球蛋白的方法，该方法包括在宿主细胞表达该免疫球蛋白的条件下在培养基中培养该细胞；其中该宿主细胞包含编码免疫球蛋白重链的如权利要求9所述的核酸，以及编码免疫球蛋白轻链的核酸，其中该宿主细胞以比包含编码免疫球蛋白重链的核酸和编码免疫球蛋白轻链的核酸的宿主细胞更高的滴度表达该免疫球蛋白，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子1至3中的全部均存在或其中无任一者存在。
40.如权利要求39所述的方法，其中该免疫球蛋白重链恒定区的内含子2的该核苷酸序列经内含子1的该核苷酸序列取代。
41.如权利要求39所述的方法，其中该免疫球蛋白重链恒定区的内含子3的该核苷酸序列经内含子1的该核苷酸序列取代。
42.一种产生免疫球蛋白的方法，该方法包括在宿主细胞表达该免疫球蛋白的条件下在培养基中培养该细胞；其中该宿主细胞包含编码免疫球蛋白重链的如权利要求12所述的核酸，以及编码免疫球蛋白轻链的核酸，其中该宿主细胞以比包含编码免疫球蛋白重链的核酸和编码免疫球蛋白轻链的核酸的宿主细胞更高的滴度表达该免疫球蛋白，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子1至3中的全部均存在或其中无任一者存在。
43.如权利要求42所述的方法，其中该免疫球蛋白重链恒定区的内含子2的该核苷酸序列经内含子1的该核苷酸序列替换。
44.如权利要求42所述的方法，其中该免疫球蛋白重链恒定区的内含子3的该核苷酸序列经内含子1的该核苷酸序列替换。
45.一种产生免疫球蛋白的方法，该方法包括在宿主细胞表达该免疫球蛋白的条件下在培养基中培养该细胞；其中该宿主细胞包含编码免疫球蛋白重链的如权利要求15所述的核酸，以及编码免疫球蛋白轻链的核酸，其中该宿主细胞以比包含编码免疫球蛋白重链的核酸和编码免疫球蛋白轻链的核酸的宿主细胞更高的滴度表达该免疫球蛋白，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子1至3中的全部均存在或其中无任一者存在。
46.一种产生免疫球蛋白的方法，该方法包括在宿主细胞表达该免疫球蛋白的条件下在培养基中培养该细胞；其中该宿主细胞包含编码免疫球蛋白重链的如权利要求16所述的核酸，以及编码免疫球蛋白轻链的核酸，其中该宿主细胞以比包含编码免疫球蛋白重链的核酸和编码免疫球蛋白轻链的核酸的宿主细胞更高的滴度表达该免疫球蛋白，其中免疫球蛋白重链恒定区的内含子1至3中的全部均存在或其中无任一者存在。
47.如权利要求45或46所述的方法，其中该免疫球蛋白重链恒定区中的内含子1的该核苷酸序列缺失。
48.如权利要求31至47中任一项所述的方法，其中该编码免疫球蛋白重链的核酸是脱氧核糖核酸(DNA)。
49.如权利要求31至47中任一项所述的方法，其中该免疫球蛋白轻链是κ轻链或λ轻链。
50.如权利要求31至49中任一项所述的方法，其中该编码免疫球蛋白重链的核酸是密码子优化的。
51.如权利要求31至50中任一项所述的方法，其中经表达的免疫球蛋白具有IgGl、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
52.如权利要求5l所述的方法，其中该经表达的免疫球蛋白是人免疫球蛋白、人源化免疫球蛋白、嵌合免疫球蛋白或表面重塑的免疫球蛋白。
53.如权利要求31至52中任一项所述的方法，其中从克隆池产生的该经表达的免疫球蛋白具有至少1，000mg/L、至少1，500mg/L、至少2，000mg/L、至少2，500mg/L或至少3，000mg/L的收获滴度。
54.如权利要求31至53中任一项所述的方法，其中从最高表达的克隆产生的该免疫球蛋白具有至少1，000mg/L、至少1，500mg/L、至少2，000mg/L、至少3，000mg/L、至少4，000mg/L、至少5，000mg/L、至少6，000mg/L、至少7，000mg/L、至少8，000mg/L、至少9，000mg/L、至少10，000mg/L、至少11，000mg/L或至少12，000mg/L的收获滴度。
55.如权利要求31至54中任一项所述的方法，其中该宿主细胞是真核细胞。
56.如权利要求55所述的方法，其中该真核细胞是CHO细胞。
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