BR112019005333A2 - proteínas de ligação a cd123 e composições e métodos relacionados - Google Patents

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Abstract

a presente divulgação se refere a moléculas de proteína que se ligam especificamente a cd123, que podem ter pelo menos um domínio de ligação a cd123 humano ou humanizado. tais moléculas são adequadas para o tratamento de câncer. a molécula de proteína que se liga a cd123 pode ter um segundo domínio de ligação que se liga a outro alvo. em uma modalidade, moléculas de polipeptídeo multiespecíficas se ligam tanto a células que expressam cd123 quanto ao complexo de receptor de célula t em células t para induzir citotoxicidade, ativação e proliferação de células t dependentes de alvo. a divulgação também fornece composições farmacêuticas que compreendem as moléculas de polipeptídeo de ligação a cd123, moléculas de ácido nucleico que codificam estes polipeptídeos e métodos para produzir estas moléculas.

Description

“PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO A CD123 E COMPOSIÇÕES E MÉTODOS RELACIONADOS” [001] Este pedido reivindica a prioridade e o benefício do Pedido de Patente Provisório US nQ 62/397.736, depositado em 21 de setembro de 2016, e Pedido de Patente Provisório US nQ 62/466.192, depositado em 02 de março de 2017. O conteúdo de cada um destes pedidos é incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.
DESCRIÇÃO DO ARQUIVO DE TEXTO ENVIADO ELETRONICAMENTE [002] O conteúdo do arquivo de texto enviado eletronicamente com o presente documento é incorporado presente documento a título de referência e sua totalidade: Uma cópia em formato legível por computador da Listagem de Sequências (nome do arquivo: APVO_054_03WO_SeqList_ST25.txt; data registrada: 21 de setembro de 2017; tamanho de arquivo 257.861 bytes).
CAMPO DA DIVULGAÇÃO [003] A presente divulgação refere-se a moléculas que se ligam especificamente a CD123, que podem ter pelo menos um domínio de ligação a CD123 humanizado. Estas moléculas são úteis para a caracterização ou o tratamento de distúrbios caracterizados pela superexpressão de CD123, como câncer. Um terapêutico de proteína que se liga a CD123 pode ser um terapêutico de proteína monoespecífico ou um terapêutico de proteína multiespecífico. Um terapêutico de proteína multiespecífico pode se ligar tanto às células que expressam CD123 quanto ao complexo de receptor de célula T em células T para induzir a citotoxicidade, ativação e proliferação de célula T dependente de alvo.
ANTECEDENTES DA DIVULGAÇÃO [004]CD123 também é conhecido como a cadeia alfa do receptor de interleucina-3 (IL-3) humano. CD123 é uma glicoproteína de transmembrana de tipo I e é um membro da superfamília do receptor de
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2/236 citocina. O receptor de interleucina-3 é um heterodímero formado por CD123 e a cadeia beta (CD131). IL-3 se liga a CD123, e a tradução de sinal é fornecida por CD131. A IL-3 regula a função e a produção de células hematopoiéticas e imunes e estimula a proliferação de célula endotelial (Testa et al., Biomark Res. 2:4 (2014)).
[005]CD123 é superexpresso em muitas malignidades hematológicas, incluindo um subconjunto de leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoide B, neoplasmas dendríticos plasmocitoides blásticos (BPDCN) e leucemia de célula capilar. Id. Embora a maioria dos pacientes com AML respondam bem às terapias iniciais, a maioria dos pacientes com AML são finalmente diagnosticados com doença recidiva ou refratária (Ramos et al., J. Clin. Med. 4:665-695 (2015)). Há uma necessidade por moléculas que alvejam CD123 com eficiência e potência aumentadas e efeitos adversos reduzidos e que podem ser usadas para tratar distúrbios associados à desregulação de CD123.
SUMÁRIO DA DIVULGAÇÃO [006] Em algumas modalidades, a divulgação abrange um polipeptídeo recombinante que compreende um domínio de ligação a CD123, em que o domínio de ligação a CD123 compreende (I) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende LCDR1, LCDR2, e LCDR3, e (li) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende HCDR1, HCDR2, e HCDR3, em que a LCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:6 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:6 em pelo menos uma substituição de aminoácido; a LCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:8 ou um sequência que difere da SEQ ID NO:8 em pelo menos uma substituição de aminoácido; a LCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NQ:10 ou uma sequência que difere da SEQ ID NQ:10 em pelo menos uma substituição de aminoácido; a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na
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SEQ ID N0:12 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:12 em pelo menos uma substituição de aminoácido; a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:14 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:14 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:16 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:16 em pelo menos uma substituição de aminoácido. Por exemplo, a divulgação abrange um polipeptídeo recombinante que compreende um domínio de ligação a CD123, em que o domínio de ligação a CD123 compreende (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende LCDR1, LCDR2, e LCDR3, e (ii) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende HCDR1, HCDR2, e HCDR3, em que a LCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:6 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:6 numa ou duas substituições de aminoácido; a LCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:8 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:8 numa ou duas substituições de aminoácido; a LCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:10 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:10 numa ou duas substituições de aminoácido; a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:12 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:12 numa ou duas substituições de aminoácido; a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:14 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:14 numa ou duas substituições de aminoácido; e a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:16 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:16 numa ou duas substituições de aminoácido. A invenção inclui um polipeptídeo recombinante com um domínio de ligação a CD-123 que compreende (a) a sequência de aminoácidos de LCDR1 conforme estabelecida na SEQ ID NO:6; (b) a sequência de aminoácidos de LCDR2 conforme estabelecida na SEQ ID NO:8;
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4/236 (c) a sequência de aminoácidos de LCDR3 conforme estabelecida na SEQ ID NO:10; (d) a sequência de aminoácidos de HCDR1 conforme estabelecida na SEQ ID NO:12; (e) a sequência de aminoácidos de HCDR2 conforme estabelecida na SEQ ID NO:14; e (f) a sequência de aminoácidos de HCDR3 conforme estabelecida na SEQ ID NO:16. Um polipeptídeo recombinante que se liga a CD123 pode compreender (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2; e (ii) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:4. Por exemplo, a invenção inclui um polipeptídeo recombinante de acordo com a reivindicação 1, em que o domínio de ligação a CD123 compreende: (I) a região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2; e (ii) a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4.
[007] Numa outra modalidade, a invenção inclui um polipeptídeo de ligação a CD123 recombinante que compreende um domínio de ligação a CD123, em que o domínio de ligação compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende LCDR1, LCDR2, LCDR3 e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3, e em que (I) (a) a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:28 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:28 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (b) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:30 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:30 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (c)
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5/236 a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:32 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:32 em pelo menos uma substituição de aminoácido; ou (li) (a) a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:36 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:36 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (b) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:38 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:38 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (c) a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NQ:40 ou uma sequência que difere da SEQ ID NQ:40 em pelo menos uma substituição de aminoácido; ou (iii)(a) a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:44 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:44 em pelo menos uma substituição de aminoácido;(b) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:46 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:46 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (c) a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:48 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:48 em pelo menos uma substituição de aminoácido; ou (iv) (a) a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NQ:100 ou uma sequência que difere da SEQ ID NQ:100 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (b) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NQ:102 ou uma sequência que difere da SEQ ID NQ:102 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (c) a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NQ:104 ou uma sequência que difere da SEQ ID NQ:104 em pelo menos uma substituição de aminoácido; ou (v)(a) a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NQ:108 ou uma sequência que difere da SEQ ID NQ:108 em pelo menos uma substituição de aminoácido;(b) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID
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N0:110 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:110 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (c) a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:112 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:112 em pelo menos uma substituição de aminoácido; ou (vi) (a) a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:116 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:116 em pelo menos uma substituição de aminoácido;(b) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:118 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:118 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (c) a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NQ:120 ou uma sequência que difere da SEQ ID NQ:120 em pelo menos uma substituição de aminoácido; ou (vii) (a) a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:124 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:124 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (b) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:126 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:126 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (c) a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:128 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:128 em pelo menos uma substituição de aminoácido. A invenção inclui polipeptídeos recombinantes que compreendem uma região variável de cadeia pesada conforme definido por (i) a (vii) e uma região variável de cadeia leve que compreende (a) a LCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:22 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:22 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (b) a LCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:24 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:24 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (c) a LCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:26 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:26 em pelo menos uma substituição de aminoácido.
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Por exemplo, a invenção inclui um polipeptídeo recombinante que compreende uma região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:18, e uma região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:20, 34, 42, 98, 106, 114, ou 122.
[008] Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de ligação a CD123 recombinante compreende (a) a LCDR1 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:54 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:54 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (b) a LCDR2 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:56 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:56 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (c) a LCDR3 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:58 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:58 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (d) a HCDR1 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:60 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:60 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (e) a HCDR2 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:61 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:61 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (f) a HCDR3 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:62 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:62 em pelo menos uma substituição de aminoácido. Por exemplo, a invenção inclui um polipeptídeo recombinante que compreende um domínio de ligação a CD123, em que (i) a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID
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NO:50; e (ii) a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:52.
[009] Numa outra modalidade, o polipeptídeo recombinante compreende um domínio de ligação a CD123, compreende (a) a LCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NQ:70 ou uma sequência que difere da SEQ ID NQ:70 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (b) a LCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:72 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:72 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (c) a LCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:74 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:74 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (d) a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:76 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:76 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (e) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:78 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:78 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (f) a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NQ:80 ou uma sequência que difere da SEQ ID NQ:80 em pelo menos uma substituição de aminoácido. Por exemplo, a invenção inclui a polipeptídeo recombinante que compreende as regiões variáveis estabelecidas nas SEQ ID Nos: 66 e 68.
[010] Em determinadas modalidades, o polipeptídeo recombinante compreende (a) a LCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:86 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:86 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (b) a LCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:88 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:88 em pelo menos
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9/236 uma substituição de aminoácido; (c) a LCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:90 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:90 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (d) a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:92 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:92 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (e) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:94 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:94 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (f) a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:96 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:96 em pelo menos uma substituição de aminoácido. Por exemplo, a invenção inclui um polipeptídeo que compreende os domínios variáveis conforme estabelecidos nas SEQ ID NOs:82 e 84.
[011](ii) a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:84.
[012] Os polipeptídeos da invenção se ligam a CD123 humano com especificidade. Em determinadas modalidades, os polipeptídeos se ligam a CD123 primata não humano. Em modalidades adicionais, os polipeptídeos se ligam a CD123 de macaco cinomolgo. A invenção inclui um polipeptídeo de ligação a CD123 que compreende um domínio de ligação a CD123 humano e um polipeptídeo de ligação a CD123 que compreende um domínio de ligação a CD123 humanizado. Numa modalidade, o domínio de ligação a CD123 é um fragmento variável de cadeia simples (scFv).
[013] Os polipeptídeos recombinantes da invenção incluem polipeptídeos biespecíficos que compreendem um segundo domínio de ligação. Numa modalidade, o segundo domínio de ligação se liga a uma célula T, CD3, CD3s ou um complexo de receptor de célula T (TCR) ou um
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10/236 componente de um complexo de receptor de célula T com especificidade. Por exemplo, a invenção inclui polipeptídeos de ligação a CD123 recombinantes que compreendem um scFv de ligação a CD3. A invenção inclui combinar qualquer um dos scFvs de ligação a CD123 divulgados com um scFv de ligação a CD3 divulgado. Numa modalidade, o polipeptídeo compreende, a partir de (i) o domínio de ligação a CD123, (ii) uma região de dobradiça, (iii) uma região constante de imunoglobulina, (iv) um ligante de terminação carboxila, e (v) o segundo domínio de ligação. Por exemplo, a invenção inclui um polipeptídeo recombinante que compreende, na ordem a partir de terminação amino a carboxila, (i) a domínio de ligação a CD123, (ii) a região de dobradiça, (iii) a região constante de imunoglobulina, (iv) a ligante de terminação carboxila, e (v) o segundo domínio de ligação.
[014] Numa modalidade da invenção, os polipeptídeos biespecíficos que compreendem um domínio de ligação a CD123 e um domínio de ligação a CD3 compreendem uma região constante de imunoglobulina modificada geneticamente modificada para exibir nenhuma a mínima atividade de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e/ou atividade de citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Numa modalidade da invenção, o domínio de ligação a CD3 é derivado de um anticorpo monoclonal selecionado dentre CRIS-7, HuM291 e I2C.
[015] Em determinadas modalidades da invenção, o polipeptídeo de ligação a CD123 compreende (i) uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:130; (ii) uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:132; (iii) uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95%
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11/236 idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:134; (iv) uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:136; (v) uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:138; (vi) uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:140; (vii) uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:142; (viii) uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:144; (iv) uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:146; (x) sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:148; (xi) uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:150; (xii) uma
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12/236 sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:152; (xiii) uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:154; ou (xiv) uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:156.
[016] Numa modalidade da invenção, o polipeptídeo recombinante induz a citotoxicidade de célula T redirecionada (RTCC). Em determinadas modalidades, o polipeptídeo recombinante induz a ativação de célula T ou proliferação de célula T. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo induz a lise dependente de célula T de células que expressam CD123.
[017] Em determinadas modalidades da invenção, o polipeptídeo biespecífico que compreende um domínio de ligação a CD123 e um domínio de ligação a CD3 quando ligado a uma proteína de CD3 numa célula T induz a liberação de citocina reduzida da referida célula T em comparação com um controle de anticorpo de OKT3. Em determinadas modalidades da invenção, o polipeptídeo biespecífico que compreende um domínio de ligação a CD123 e um domínio de ligação a CD3 derivado de CRIS7 induz a liberação de citocina reduzida da referida célula T em comparação com um biespecífico que compreende um domínio de ligação a CD3 derivado de OKT3 ou I2C. Em determinadas modalidades da invenção, o polipeptídeo biespecífico que compreende um domínio de ligação a CD123 (por exemplo, um domínio de ligação a CD123 que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 93%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos
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97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 2 e/ou SEQ ID NO:4) e um domínio de ligação a CD3 derivado de CRIS-7 e no formato de scFv-Fc-scFv induz a liberação de citocina reduzida num primata não humano ou ser humano em comparação com um polipeptídeo biespecífico que compreende um domínio de ligação a CD123 e domínio de ligação a CD3 derivado de 12C num formato de scFv-scFv ou de diacorpo.
[018] Em determinadas modalidades da invenção, o polipeptídeo biespecífico que compreende um domínio de ligação a CD123 e um domínio de ligação a CD3 (por exemplo, um polipeptídeo recombinante que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 93%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à o SEQ ID NO:130 ou SEQ ID NO:132) induz a liberação de citocina reduzida num primata não humano ou ser humano em comparação com MGD006 ou TRI168. Numa modalidade da invenção, um polipeptídeo recombinante que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 93%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO:130 ou SEQ ID NO:132 induz níveis reduzidos de IFNy, IL-2, TNFa e/ou IL-10 em comparação com MGD006 ou TRI168.
[019] A divulgação abrange uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica um polipeptídeo de ligação a CD123 descrito no presente documento ou uma porção do referido polipeptídeo de ligação a CD123. A molécula de ácido nucleico isolada pode compreender uma sequência de nucleotídeos estabelecida em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:147, SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:153, ou SEQ ID NO:155.
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14/236 [020] A divulgação se refere a um vetor de expressão que compreende um segmento de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de ligação a CD123 descrito no presente documento, em que o segmento de ácido nucleico é operativamente ligado a sequências reguladoras adequadas para a expressão do segmento de ácido nucleico numa célula hospedeira. O segmento de ácido nucleico do vetor de expressão pode compreender uma sequência de nucleotídeos estabelecida em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:97, SEQ ID NQ:105, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:147, SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:153, ou SEQ ID NO:155.
[021] A divulgação inclui uma célula hospedeira recombinante que compreende um vetor de expressão descrito no presente documento.
[022] A divulgação se refere a um método para produzir um polipeptídeo de ligação a CD123, sendo que o método compreende cultivar uma célula hospedeira recombinante que compreende um vetor de expressão descrito no presente documento sob condições em que o segmento de ácido nucleico do vetor é expresso produzindo, deste modo, o polipeptídeo de ligação a CD123. O método pode compreender ainda recuperar o polipeptídeo de ligação a CD123.
[023] Em algumas modalidades, a divulgação se refere a uma composição farmacêutica que compreende um polipeptídeo de ligação a CD123 descrito no presente documento e um carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode ser formulada numa forma de dosagem selecionada do grupo que consiste em: uma forma de dosagem unitária oral, uma forma de dosagem unitária intravenosa, uma forma de dosagem unitária intranasal, um forma de dosagem unitária de supositório,
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15/236 uma forma de dosagem unitária intradérmica, uma forma de dosagem unitária intramuscular, uma forma de dosagem unitária intraperitoneal, uma forma de dosagem unitária subcutânea, uma forma de dosagem unitária epidural, uma forma de dosagem unitária sublingual, e uma forma de dosagem unitária intracerebral. A composição farmacêutica formulada como uma forma de dosagem unitária oral pode ser selecionada do grupo que consiste em: tabletes, pílulas, péletes, cápsulas, pós, comprimidos, grânulos, soluções, suspensões, emulsões, xaropes, elixires, formulações de liberação sustentada, aerossóis e aspersões.
[024] A divulgação também se refere a um método para induzir a citotoxicidade de célula T redirecionada (RTCC) contra uma célula que expressa CD123, sendo que o método compreende: colocar em contato a referida célula de expressão de CD123 com um polipeptídeo de ligação a CD123 descrito no presente documento, em que o segundo domínio de ligação liga especificamente uma célula T, CD3, CD3s ou um complexo de receptor de célula T (TCR) ou um componente de um complexo de receptor de célula T; e em que o referido contato está sob condições em que a RTCC contra a célula de expressão de CD123 é induzida.
[025] A divulgação abrange um método para induzir a lise dependente de célula T de uma célula que expressa CD123, sendo que o método compreende: colocar a referida célula de expressão de CD123 em contato com um polipeptídeo ou proteína de ligação a CD123 de ligação de CD123 descrita no presente documento, em que o segundo domínio de ligação especificamente liga uma célula T, CD3, CD3s ou um complexo de receptor de célula T (TCR) ou um componente de um complexo de receptor de célula T; e em que o referido contato está sob condições em que a lise dependente de célula T da célula de expressão de CD123 é induzida.
[026] A divulgação abrange um método para tratar um distúrbio (por exemplo, câncer) num indivíduo, em que o referido distúrbio é caracterizado pela superexpressão de CD123, sendo que o método
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16/236 compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo de ligação a CD123 descrito no presente documento. A divulgação também se refere a um polipeptídeo de ligação a CD123 descrito no presente documento para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio (por exemplo, câncer) num indivíduo, em que o referido distúrbio é caracterizado pela superexpressão de CD123. A divulgação inclui um polipeptídeo de ligação a CD123 descrito no presente documento para uso no tratamento de um distúrbio (por exemplo, câncer) num indivíduo, em que o referido distúrbio é caracterizado pela superexpressão de CD123. O câncer tratado pelos polipeptídeos de ligação a CD123 descritos no presente documento pode ser leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoide B, neoplasma dendrítico plasmocitoide blástico (BPDCN), ou leucemia de célula capilar.
[027] Estas e outras modalidades e/ou outros aspectos da divulgação se tornarão evidentes mediante a referência à descrição detalhada a seguir da divulgação e dos desenhos anexos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [028] As Figuras 1A a D mostram a ligação de 13 moléculas anti-CD123 x anti-CD3s biespecíficas diferentes (TRI123, TRI125, TRI126, TRI127, TRI128, TRI129, TRI130, TRI131, TRI132, TRI134, TRI137, TRI138 e TRI139) em três experimentos independentes para a linhagem de célula tumoral humana CD123 (+) Molm-13.
[029] As Figuras 2A a C, 2B e 2C mostra a ligação de 13 moléculas anti-CD123 x anti-CD3s biespecíficas diferentes (TRI123, TRI125, TRI126, TRI127, TRI128, TRI129, TRI130, TRI131, TRI132, TRI134, TRI137, TRI138 e TRI139) em dois experimentos independentes para a proteína de CD123 de cinomolgo que expressa estavelmente células CHO.
[030] As Figuras 3A a C mostram os resultados dos ensaios de liberação de cromo-51 com a linhagem celular Molm-13 medida em 4 horas como uso de 13 moléculas anti-CD123 x anti-CD3s biespecíficas
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17/236 diferentes (TR1123, TR1125, TR1126, TR1127, TR1128, TR1129, TR1130, TR1131, TRI132, TRI134, TRI137, TRI138 e TRI139) nos dois experimentos independentes. Todas as moléculas anti-CD123 x anti-CD3s biespecificas mostraram lise de célula-alvo eficaz em 4 horas na faixa entre 24 e 48% de lise específica máxima.
[031] As Figuras 4A a D mostram uma indução de proliferação de célula T em baixas concentrações (10 pM).
[032] As Figuras 5A a D mostram ativação dependente de alvo de células T CD4+ e CD8+ na presença de células Molm-13.
[033] A Figura 6 mostra um exemplo de análise SPR de TRI-130 em concentrações de ECD diferentes.
[034] A Figura 7 mostra as curvas de concentração em função de tempo para moléculas biespecificas TRI129 e TRI130.
[035] A Figura 8 mostra a redução em volume tumoral num modelo de tumor de camundongo tratado com TRI129.
[036] A Figura 9 mostra a redução em volume tumoral num modelo de tumor de camundongo tratado com TRI130.
[037] A Figura 10 mostra que o tratamento de um modelo de tumor de camundongo com TRI129 ou TRI130 resulta no aumento em sobrevivência.
[038] A Figura 11 é uma ilustração de um polipeptídeo de ligação a CD123 recombinante capaz de RTCC na configuração de domínio de ligação a CD123 - domínio de dobradiça - domínio constante de imunoglobulina - domínio de ligação a CD3.
[039] A Figura 12 mostra o resultado de um ensaio de liberação de cromo-51 com as linhagens de célula Molm-13, KG-1a e Daudi medidas em 4 horas usando a molécula anti-CD123 x anti-CD3s biespecífica TRI130. Este ensaio mediu a citotoxicidade de TRI130 incubada com linhagem de célula tumoral positiva a CD123 ou negativa a C123 e células T humanas purificadas.
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18/236 [040] A Figura 13 mostra as estimativas não compartimentalizadas (NCA) de WinNonlin® e o ajuste de meia vida (HL) para grupos de tratamento de macacos cinomolgos tratados com TRI130, conforme descrito no Exemplo 14.
[041] A Figura 14 mostra um gráfico que representa a alteração na população de linfócito ao longo do tempo em macacos cinomolgos tratados com TRI130, conforme descrito no Exemplo 14.
[042] A Figura 15 mostra um gráfico que representa a alteração na população de basófila ao longo do tempo em macacos cinomolgos tratados com TRI130, conforme descrito no Exemplo 14.
[043] A Figura 16 mostra um gráfico que representa a carga tumoral conforme medida por níveis de bioluminescência ao longo do tempo num modelo de camundongo de xenoenxerto disseminado de leucemia mieloide aguda (AML), conforme descrito no Exemplo 15.
[044] A Figura 17 mostra imagens bioluminescentes de carga tumoral em camundongos no dia 14.
[045] A Figura 18 mostra os resultados de ensaios que medem a ativação de célula T induzida por TRI130 e TRI168 com células-alvo CD123+ Molm-13, conforme descrito no Exemplo 17.
[046] A Figura 19 mostra os resultados dos ensaios que medem a citotoxicidade de célula T induzida por TRI130 e TRI168 de célulasalvo CD123+ Molm-13, conforme descrito no Exemplo 17.
[047] A Figura 20 mostra os resultados dos ensaios que medem a liberação de citocina de célula T induzida por TRI130 e TRI168 com células-alvo CD123+ Molm-13, conforme descrito no Exemplo 17.
[048] A Figura 21 mostra os resultados dos ensaios que medem a liberação de citocina de célula T induzida por TRI130 e TRI168 em culturas de células mononucleares de sangue periférico (PBMC), conforme descrito no Exemplo 17.
[049] A Figura 22 mostra os resultados dos ensaios que
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19/236 medem a citotoxicidade de TRI130 incubada com amostras de célula de AML de indivíduos com AML, conforme descrito no Exemplo 18.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA DIVULGAÇÃO [050] A divulgação fornece domínios de ligação que se ligam especificamente a CD123 (também conhecido como receptor de interleucina-3 cadeia alfa) e moléculas de ligação (por exemplo, polipeptídeos e proteínas) que se ligam especificamente a CD123. Estas moléculas de ligação podem se ligar especificamente a CD123 e a um outro alvo. A administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo ou proteína de ligação a CD123 a um paciente com necessidade do mesmo é útil para o tratamento de determinados distúrbios associados à superexpressão de CD123, incluindo determinados cânceres. Numa modalidade, um polipeptídeo ou proteína de ligação a CD123 liga tanto uma célula-alvo que superexpressa CD123 quanto uma célula T “reticulando”, deste modo, a célula-alvo que superexpressa CD123 e a célula T. A ligação de ambos os domínios a seus alvos infere na citotoxicidade de célula T redirecionada (RTCC) dependente de alvo potente (por exemplo, induz a citotoxicidade de célula T dependente de alvo, ativação de célula T e/ou proliferação de célula T). Os terapêuticos de ligação a CD123 da divulgação oferecem várias vantagens no tratamento de pacientes, por exemplo, ligação eficaz a CD123, indução eficaz de atividade de RTCC, níveis reduzidos de liberação de citocina e/ou um risco menor de eventos adversos (por exemplo, toxicidade). Em determinados aspectos, as proteínas de ligação de CD123 se ligam a CD123 mais efetivamente em determinados formatos (por exemplo, scFv em comparação ao anticorpo descendente) e/ou determinadas orientações (por exemplo, VL-VH em comparação com VH-VL), levando à potência maior e utilidade aprimorada no tratamento de distúrbios associados a superexpressão de CD123.
[051] Os cabeçalhos de seção usados no presente documento servem apenas a propósitos organizacionais e não devem ser interpretados como limitando a matéria descrita. Todos os documentos ou
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20/236 partes de documentos, o presente documento citado, incluindo, mas sem limitação, patentes, pedidos de patente, artigos, livros, tratados, são expressamente incorporados a título de referência em sua totalidade para qualquer propósito. No caso em que um ou mais dos documentos incorporados ou partes de documentos definem um termo que contradiz a definição daquele termo no pedido, a definição que aparece neste pedido prevalece. No entanto, menção de qualquer referência, artigo, publicação, patente, publicação de patente e pedido de patente citados no presente documento não é, e não deve ser, tomada como um reconhecimento, ou qualquer forma de sugestão, que constituam a técnica anterior válida ou formem parte do conhecimento geral comum em qualquer país no mundo.
[052] Na presente descrição, qualquer faixa de concentração, faixa de porcentagem, faixa de razão ou faixa de número inteiro não deve ser compreendida para incluir o valor de qualquer número inteiro dentro da faixa citada e, quando adequado, frações da mesma (como um décimo e um centésimo de um número inteiro), a menos que seja indicado o contrário. Deve-se compreender que os termos “um” e “uma” conforme usado no presente documento se referem a “um ou mais” dos componentes enumerados a menos que seja indicado o contrário. O uso da alternativa (por exemplo, “ou”) deve ser compreendido para significar tanto um, ambos, quanto qualquer combinação dos mesmos das alternativas. Conforme usado no presente documento, os termos “incluir” e “compreender” são usados como sinônimos. Além disto, deve-se compreender que os polipeptídeos que compreender as várias combinações dos componentes (por exemplo, domínios ou regiões) e substituintes descritos no presente documento, são revelados pelo presente pedido até o mesmo ponto como se cada polipeptídeo fosse estabelecido individualmente. Assim, a seleção de componentes específicos de polipeptídeos individuais está dentro do escopo da presente divulgação.
[053] Conforme usado no presente documento, o termo “domínio de ligação” ou “região de ligação” se refere a domínio, região, porção,
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21/236 ou sítio de uma proteína, polipeptídeo, oligopeptídeo, ou peptídeo ou anticorpo ou domínio de ligação derivado de um anticorpo que possui a capacidade de reconhecer especificamente e se ligar a uma molécula-alvo, como um antígeno, aglutinante, receptor, substrato, ou inibidor (por exemplo, CD123, CD3). Os domínios de ligação exemplificativos incluem regiões variáveis de anticorpo de cadeia simples (por exemplo, anticorpos de domínio, sFv, scFv, scFab), ectodomínios de receptor, e aglutinantes (por exemplo, citocinas, quimioquinas). Em determinadas modalidades, o domínio de ligação compreende ou consiste num sítio de ligação a antígeno (por exemplo, que compreende uma sequência de cadeia pesada variável e sequência de cadeia leve variável ou três regiões de determinação complementares de cadeia leve (CDRs) e três CDRs de cadeia pesada de um anticorpo colocado nas regiões de armação (FRs) alternativas (por exemplo, FRs humanas que compreendem opcionalmente uma ou mais substituições de aminoácido). Uma variedade de ensaios é conhecida para identificar os domínios de ligação da presente divulgação que se ligam especificamente a um alvo específico, incluindo Western blot, ELISA, triagem de biblioteca de exibição de fago, e análise de interação BIACORE®. Conforme usado no presente documento, um polipeptídeo de ligação a CD123 pode ter um “primeiro domínio de ligação” e, opcionalmente, um “segundo domínio de ligação”. Em determinadas modalidades, o “primeiro domínio de ligação” é um domínio de ligação a CD123 e o formato é um anticorpo ou proteína ou domínio semelhante a anticorpo. Em determinadas modalidades que compreendem tanto primeiro quanto o segundo domínios de ligação, o segundo domínio de ligação é um domínio de ligação a célula T como um scFv derivado de um anticorpo monoclonal de camundongo (por exemplo, CRIS-7) ou exibição de fago (por exemplo, I2C) que se liga a um antígeno de superfície de célula T (por exemplo, CD3). Em outras modalidades, o segundo domínio de ligação é um segundo domínio de ligação a CD123. Em ainda outras modalidades, o segundo domínio de ligação é um domínio de ligação além de um domínio de ligação a CD123 ou um domínio de ligação a
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22/236 célula T.
[054] “Liberação de citocina” ou “tempestade de citocina” ou “reação de infusão” se refere à liberação de citocinas das células T. Quando as citocinas forem liberadas na circulação, os sintomas sistêmicos como febre, náusea, calafrios, hipotensão, taquicardia, astenia, dor de cabeça, irritação da pele, garganta inflamada e dispnéia podem resultar. Alguns pacientes podem experimentar reações graves, que ameaçam a vida que resultar da liberação massiva de citocinas. Liberação “reduzida” de citocina se refere à redução na liberação de pelo menos uma citocina (por exemplo, IFNy, IL-2, TNFa e/ou IL10) seguindo a administração de um polipeptídeo recombinante da invenção em comparação com o anticorpo de OKT-3 ou outra molécula biespecífica de ligação a CD3. A liberação reduzida de citocina pode ser medida usando ensaios in vitro ou in vivo.
[055] Um domínio ou proteína de ligação “se liga especificamente” a um alvo se o mesmo ligar o alvo com uma afinidade ou Ka (isto é, uma constante de associação em equilíbrio de uma interação de ligação específica com unidades de 1/M) igual ou maior que 105 M’1, enquanto são se liga significativamente a outros componentes presentes numa amostra de teste. Os domínios de ligação podem ser classificados como domínios de ligação de “alta afinidade” e domínios de ligação de “baixa afinidade”. Os domínios de ligação de “alta afinidade” se referem àqueles domínios de ligação com um Ka de pelo menos 107 M’1, pelo menos 108 M’1, pelo menos 109 M’1, pelo menos 101° M’1, pelo menos 1011 M’1, pelo menos 1012 M’1, ou pelo menos 1013 M’1. Os domínios de ligação de “baixa afinidade” se referem àqueles domínios de ligação com um Ka de até 107 M’1, até 106 M’1, até 105 M’1. Alternativamente, a afinidade pode ser definida como uma constante de dissociação de equilíbrio (Kd) de uma interação de ligação específica com unidades de M (por exemplo, 10'5 M a 10'13 M). As afinidades de domínios de ligação polipeptídeo e polipeptídeos de cadeia única de acordo com a presente divulgação podem ser prontamente determinados usando técnicas convencionais (consulte, por
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23/236 exemplo, Scatchard et al. (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660; e Patentes US n— 5.283.173, 5.468.614, ou o equivalente).
[056] “CD3” é conhecido na técnica como um complexo multiproteína de seis cadeias (consulte, por exemplo, Abbas e Lichtman, 2003; Janeway et al., páginas 172 e 178, 1999), que são subunidades do complexo de receptor de célula T. Em mamíferos, as subunidades de CD3 do complexo de receptor de célula T são uma cadeia de CD3y, uma cadeia de CD3õ, duas cadeias de CD3s , e um homodímero de cadeias de Οϋ3ζ. As cadeias de CD3y, CD3õ, e CD3s são proteínas de superfície celular altamente relacionadas da superfamília da imunoglobulina que contêm um domínio de imunoglobulina único. As regiões de transmembrana das cadeias de CD3y, CD3õ e CD3s são carregadas negativamente, o que é uma característica que permite que estas cadeiras se associem às cadeias de receptor de célula T carregadas positivamente. As caudas intracelulares das cadeias de CD3y, CD3õ, e CD3s contêm, cada uma, um único motivo conservado conhecido como um motivo de ativação à base de tirosina de imunorreceptor ou ITAM, enquanto cada cadeia de Οϋ3ζ tem três. Acredita-se que os ITAMs são importantes para a capacidade de sinalização de um complexo de TCR. CD3 conforme usado na presente divulgação pode ser de várias espécies de animal, incluindo ser humano, macaco, camundongo, rato ou outros mamíferos.
[057] Conforme usado no presente documento, uma “substituição conservative” é reconhecida na técnica como uma substituição de um aminoácido para um outro aminoácido que tem propriedades semelhantes. As substituições conservatives exemplificativas são bem conhecidas na técnica (consulte, por exemplo, WO 97/09433, página 10, publicada em 13 de março de 1997; Lehninger, Biochemistry, Segunda Edição; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), páginas 71-77; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY e Cell Press, Cambridge, MA (1990), página 8). Em determinadas modalidades, uma substituição conservative inclui uma substituição de leucina por serina.
[058] Conforme usado no presente documento, o termo
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24/236 “derivado” se refere a uma modificação de um ou mais resíduos de aminoácido de um peptídeo através de meios químicos ou biológicos, seja com ou sem uma enzima, por exemplo, por meio de glicosilação, alquilação, acilação, formação de éster ou formação de amida.
[059] Conforme usado no presente documento, uma sequência de polipeptídeos ou aminoácidos “derivada de” um polipeptídeo ou uma proteína designada se refere à origem do polipeptídeo. Em determinadas modalidades, a sequência de polipeptídeos ou aminoácidos que é derivada de uma sequência específica (às vezes denominada como a sequência “de partida” ou “descendente” ou “parental”) tem uma sequência de aminoácidos que é essencialmente idêntica à sequência de partida ou uma porção da mesma, em que a porção consiste em pelo menos 10 a 20 aminoácidos, pelo menos 20 a 30 aminoácidos, ou pelo menos 30 a 50 aminoácidos, ou pelo menos 50 a 150 aminoácidos, ou que é identificável, de outro modo, com uma de habilidade comum na técnica como tendo sua origem na sequência de partida. Por exemplo, um domínio de ligação pode ser derivado de um anticorpo, por exemplo, um Fab, F(ab’)2, Fab’, scFv, anticorpo de domínio único (sdAb), etc.
[060] Os polipeptídeos derivados de um outro polipeptídeo podem ter uma ou mais mutações relacionadas ao polipeptídeo de partida, por exemplo, um ou mais resíduos de aminoácidos que foram substituídos por um outro resíduo de aminoácido ou que tem um ou mais inserções ou deleções de resíduo de aminoácido. O polipeptídeo pode compreender uma sequência de aminoácidos que não ocorre naturalmente. Tais variações têm necessariamente menos que 100% de identidade de sequência ou similaridade com o polipeptídeo de partida. Numa modalidade, a variante terá uma sequência de aminoácidos de cerca de 60% a menos que 100% de identidade de sequência de aminoácidos ou similaridade com a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de partida. Numa outra modalidade, a variante terá uma sequência de aminoácidos de cerca de 75% a menos que 100%, de cerca de
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80% a menos que 100%, de cerca de 85% a menos que 100%, de cerca de 90% a menos que 100%, de cerca de 95% a menos que 100% de identidade de sequência de aminoácidos ou similaridade com a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de partida.
[061] Conforme usado no presente documento, a menos que seja fornecido de outro modo, uma posição de um resíduo de aminoácido numa região variável de uma molécula de imunoglobulina é numerada de acordo com a convenção de numeração IMGT (Brochet, X, et al, Nucl. Acids Res. (2008) 36, W503-508) e uma posição de um resíduo de aminoácido numa região constante de uma molécula de imunoglobulina é numerada de acordo com a nomenclatura EU (Ward et al., 1995 Therap. Immunol. 2:77-94). Outras convenções de numeração são conhecidas na técnica (por exemplo, a convenção de numeração Kabat (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Bethesda, MD: Public Health Service, National Institutes of Health (1991)).
[062] Conforme usado no presente documento, o termo “dímero” se refere a uma entidade biológica que consiste em duas subunidades associadas entre si por meio de uma ou mais formas de forças intramoleculares, incluindo ligações covalentes (por exemplo, ligações de dissulfeto) e outras interações (por exemplo, interações eletrostáticas, pontes de sal, ligação de hidrogênio e interações hidrofóbicas), e é estável sob condições adequadas (por exemplo, sob condições fisiológicas, numa solução aquosa adequada para expressar, purificar e/ou armazenar proteínas recombinantes, ou sob condições para a eletroforese de não desnaturação e/ou não redução). Um “heterodímero” ou “proteína heterodimérica”, conforme usada no presente documento, se refere a um dímero formado de dois polipeptídeos diferentes. Um heterodímero não inclui um anticorpo formado a partir de quatro polipeptídeos (isto é, duas cadeias leves e duas cadeias pesadas). Um “homodímero” ou “proteína homodimérica”, conforme usado no presente documento, se refere a um dímero formado a partir de dois
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26/236 polipeptídeos idênticos. Os polipeptídeos recombinantes da invenção existem principalmente numa forma dimerizada. Toda a divulgação do polipeptídeo, incluindo características e atividades (como ligação e RTCC) deve ser compreendida para incluir o polipeptídeo em sua forma dimérica assim como outras formas multidiméricas.
[063] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de ligação a CD123 compreende, na ordem da terminação amino a carboxila ou na ordem da terminação carboxila a amino, (i) o domínio de ligação a CD123, (ii) uma região de dobradiça, (iii) uma região constante de imunoglobulina, (iv) um ligante de terminação carboxila (ou um ligante de terminação amino), e (v) um segundo domínio de ligação. Conforme usado no presente documento e dependendo do contexto, uma “região de dobradiça” ou uma “dobradiça” se refere a uma região de polipeptídeo entre um domínio de ligação (por exemplo, um domínio de ligação a CD123) e uma região constante de imunoglobulina. Conforme usado no presente documento e dependendo do contexto, um “ligante” pode se referir a (1) uma região de polipeptídeo entre as regiões VH e VL num Fv de única cadeia (scFv) ou (2) uma região de polipeptídeo entre uma região constante de imunoglobulina e um segundo domínio de ligação num polipeptídeo de ligação a CD123 que compreende dois domínios de ligação. Uma região de polipeptídeo entre uma região constante de imunoglobulina e um segundo domínio de ligação num polipeptídeo de ligação a CD123 que compreende dois domínios de ligação também pode ser referido como um “ligante de terminação carboxila” ou um “ligante de terminação amino.” Exemplos não limitantes de ligantes de terminação carboxila e terminação amino incluem ligantes que compreendem repetições de glicina-serina (por exemplo, (Gly4Ser)) (SEQ ID NO: 315), e ligantes derivados de (a) uma região interdomínio de uma proteína de transmembrana (por exemplo, uma proteína de transmembrana do tipo I); (b) um região de talo de uma C-lectina do tipo II; ou (c) uma dobradiça de imunoglobulina. Exemplos não limitantes de dobradiças e ligantes são fornecidos nas Tabelas 1 e 2. Em algumas
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27/236 modalidades, um “ligante” fornece uma função de espaçador compatível com a interação dos dois domínios de subligação para que o polipeptídeo resultante retenha uma afinidade de ligação específica à mesma molécula-alvo como um anticorpo que compreende as mesmas regiões variáveis de cadeias leve e pesada. Em determinadas modalidades, um ligante é compreendido de cinco a cerca de 35 aminoácidos, por exemplo, cerca de 15 a cerca de 25 aminoácidos. Em algumas modalidades, um ligante é compreendido de pelo menos 5 aminoácidos, pelo menos 7 aminoácidos ou pelo menos 9 aminoácidos.
[064] Uma “região de dobradiça de imunoglobulina do tipo selvagem” se refere a sequências de aminoácidos de dobradiça superior e intermediária de ocorrência natural interpostas entre e conectando os domínios de CH1 e CH2 (para IgG, IgA, e IgD) ou interpostas entre e conectando-se os domínios de CH1 e CH3 (para IgE e IgM) encontradas na cadeia pesada de um anticorpo. Em determinadas modalidades, uma sequência de região de dobradiça de imunoglobulina do tipo selvagem é humana, e pode compreender uma região de dobradiça de IgG humana.
[065] Uma “região de dobradiça de imunoglobulina do tipo selvagem alterada” ou “região de dobradiça de imunoglobulina alterada” se refere a (a) uma região de dobradiça de imunoglobulina do tipo selvagem com até 30% de alterações de aminoácido (por exemplo, até 25%, 20%, 15%, 10%, ou 5% de substituições ou deleções de aminoácido), ou (b) uma porção de uma região de dobradiça de imunoglobulina do tipo selvagem que tem um comprimento de cerca de 5 aminoácidos (por exemplo, cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 aminoácidos) até cerca de 120 aminoácidos (por exemplo, que tem um comprimento de cerca de 10 a cerca de 40 aminoácidos ou cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos ou cerca de 15 a cerca de 20 aminoácidos ou cerca de 20 to cerca de 25 aminoácidos), tem até cerca de 30% de alterações de aminoácido (por exemplo, até cerca de 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, ou 1% de substituições ou deleções de
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28/236 aminoácido ou uma combinação dos mesmos), e tem uma região de dobradiça principal de IgG conforme divulgado nos documentos US 2013/0129723 e US 2013/0095097.
[066] Conforme usado no presente documento, o termo “humanizado” se refere a um processo para produzir um anticorpo ou proteínas e polipeptídeos de ligação de imunoglobulina derivados de uma espécie não humana (por exemplo, camundongo ou rato) menos imunogênico para seres humanos, enquanto ainda retêm as propriedades de ligação a antígeno do anticorpo original, usando técnicas de engenharia genética. Em algumas modalidades, o domínio (ou domínios) de ligação de um anticorpo ou proteínas e polipeptídeos de ligação de imunoglobulina (por exemplo, as regiões variáveis de cadeias leve e pesada, Fab, scFv) são humanizados. Os domínios de ligação não humanos podem ser humanizados usando técnicas conhecidas como enxertação de CDR (Jones etal., Nature 321:522 (1986)) e variantes dos mesmos, incluindo “remodelação” (Verhoeyen, et a!., 1988 Science 239:15341536; Riechmann, et al., 1988 Nature 332:323-337; Tempest, et al., Bio/Technol 1991 9:266-271), “hiperquimerização” (Queen, et al., 1989 Proc Natl Acad Sei USA 86:10029-10033; Co, et al., 1991 Proc Natl Acad Sei USA 88:2869-2873; Co, et al., 1992 J Immunol 148:1149-1154), e “recobrimento” (Mark, et al., “Derivation of therapeutically active humanized and veneered antiCD18 antibodies.” Em: Metcalf BW, Dalton BJ, eds. Cellular adhesion: molecular definition to therapeutic potential. Nova York: Plenum Press, 1994: 291-312). Se derivado de uma fonte não humana, outras regiões do anticorpo ou proteínas e polipeptídeos de ligação de imunoglobulina, como os domínios de região de dobradiça e região constante, também podem ser humanizados.
[067] Um “domínio de dimerização de imunoglobulina” ou “domínio de heterodimerização de imunoglobulina”, conforme usado no presente documento, se refere a um domínio de imunoglobulina de uma cadeia de polipeptídeo que interage ou se associa, de preferência, a um domínio de imunoglobulina diferente de uma segunda cadeia de polipeptídeo, em que a
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29/236 interação dos domínios de heterodimerização de imunoglobulina diferentes contribui substancialmente ou promove efetivamente a heterodimerização da primeira e da segunda cadeias de polipeptídeos (isto é, a formação de um dímero entre duas cadeias de polipeptídeos diferentes, que também é referido como “heterodímero”). As interações entre domínios de heterodimerização de imunoglobulina “contribui substancialmente para ou promove eficientemente” a heterodimerização da primeira e da segunda cadeias de polipeptídeo se houver uma redução substancialmente significativa na dimerização entre a primeira e a segunda cadeias de polipeptídeo na ausência do domínio de heterodimerização de imunoglobulina da primeira cadeia de polipeptídeo e/ou do domínio de heterodimerização de imunoglobulina da segunda cadeia de polipeptídeo. Em determinadas modalidades, quando a primeira e a segunda cadeias de polipeptídeo forem coexpressas, pelo menos 60%, pelo menos cerca de 60% to cerca de 70%, pelo menos cerca de 70% to cerca de 80%, pelo menos 80% a cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% da primeira e da segunda cadeias de polipeptídeo forma os heterodímeros entre si. Os domínios de heterodimerização de imunoglobulina representativos incluem um domínio de CH1 de imunoglobulina, um domínio de CL de imunoglobulina (por exemplo, isotipos de Ck ou CÃ), ou derivados dos mesmos, incluindo domínio de CH1 e CL de imunoglobulina do tipo selvagem e domínio de CH1 e CL de imunoglobulina alterados (ou mutados), conforme fornecido no presente documento.
[068] Uma “região constante de imunoglobulina” ou “região constante” é um termo definido no presente documento para se referir a uma sequência de peptídeos ou polipeptídeos que corresponde ou é derivada de parte ou todo o um ou mais domínios de região constante. Em determinadas modalidades, a região constante de imunoglobulina corresponde ou é derivado de parte ou de todo o um ou mais domínios de região constante, mas nem todos os domínios de região constante de um anticorpo de fonte. Em determinadas modalidades, a região constante compreende domínios de CH2
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30/236 e CH3 de IgG, por exemplo, domínios de CH2 e CH3 de lgG1. Em determinadas modalidades, a região constante não compreende um domínio de CH1. Em determinadas modalidades, as domínios de região constante que constituem a região constante são humanos. Em algumas modalidades (por exemplo, em determinadas variações de um polipeptídeo ou proteína de ligação a CD123 que compreende um segundo domínio de ligação que se liga especificamente a CD3 ou um outro antígeno de superfície de célula T), os domínios de região constante de uma proteína de fusão desta divulgação carece ou têm funções efetoras mínimas de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e citotoxicidade de ativação de complemento e dependente de complemento (CDC), enquanto retém a capacidade de ligar alguns receptores de Fc (como FcRn, o receptor de Fc neonatal) e retêm uma meia vida relativamente longa in vivo. Em outras variações, uma proteína de fusão desta divulgação inclui domínios constantes que retêm tal função efetora de um ou ambos dentre ADCC e CDC. Em determinadas modalidades, um domínio de ligação desta divulgação é fundido a uma região constante de lgG1 humana, em que a região constante de lgG1 tem um ou mais dos seguintes aminoácidos mutados: leucina na posição 234 (L234), leucina na posição 235 (L235), glicina na posição 237 (G237), glutamato na posição 318 (E318), lisina na posição 320 (K320), lisina na posição 322 (K322), ou qualquer combinação dos mesmos (numeração de acordo com EU). Por exemplo, qualquer um ou mais destes aminoácidos pode ser alterado para alanina. Numa modalidade adicional, um domínio de Fc de lgG1 tem cada um dentre L234, L235, G237, E318, K320, e K322 (de acordo com a numeração EU) mutado para uma alanina (isto é, L234A, L235A, G237A, E318A, K320A, e K322A, respectivamente), e opcionalmente uma mutação de N297A assim como (isto é, eliminando essencialmente a glicosilação do domínio de CH2). Numa outra modalidade, o domínio de Fc de lgG1 tem cada uma dentre as mutações de L234A, L235A, G237A e K322A. Por exemplo, a invenção inclui um polipeptídeo recombinante que compreende um domínio de ligação a CD123
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31/236 ou scFv com uma sequência de aminoácidos pelo menos 93%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO:130; um domínio de lgG1 que compreende as mutações L234A, L235A, G237A e K322A; e um domínio de ligação a CD3. A invenção inclui um polipeptídeo recombinante que compreende um domínio de ligação a CD123 que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 93%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NQ:130; um domínio de lgG1 que compreende as mutações L234A, L235A, G237A e K322A; e um domínio de ligação a CD3 que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 93%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO:192 ou SEQ ID NO:193.
[069]“Região de Fc” ou “domínio de Fc” se refere a uma sequência de polipeptídeos que corresponde ou é derivada da porção de um anticorpo-fonte que é responsável por se ligar aos receptores de anticorpo em células e o componente C1q do complemento. Os filamentos de Fc para “cristalino de fragmento”, o fragmento de um anticorpo que formará prontamente um cristal de proteína. Os fragmentos de proteína distintos, que foram originalmente descritos por digestão proteolítica, podem definir a estrutura geral de uma proteína de imunoglobulina. Conforme originalmente definido na literatura, o fragmento Fc consiste nas regiões de dobradiça de cadeia pesada ligadas por dissulfeto, domínios de CH2 e CH3. No entanto, mais recentemente o termo foi aplicado a uma única cadeia que consiste em CH3, CH2, e pelo menos uma porção da dobradiça suficiente para formar um dímero ligado por dissulfeto com uma segunda tal cadeia. Para uma revisão da estrutura e função de imunoglobulina, consulte Putnam, The Plasma Proteins, Vol. V (Academic Press, Inc., 1987), páginas 49-140; e Padlan, Mol. Immunol. 31:169-217, 1994. Conforme usado no presente documento, o termo Fc inclui variantes de sequências de ocorrência natural.
[070] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação
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32/236 de CD123 compreende um arcabouço de proteína conforme geralmente divulgado, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente US n— 2003/0133939, 2003/0118592 e 2005/0136049. Uma proteína de ligação de CD123 pode compreender, na ordem de terminação amino a terminação carboxila: um primeiro domínio de ligação, uma região de dobradiça e uma região constante de imunoglobulina. Em outras modalidades, uma proteína de ligação de CD123 compreende um arcabouço de proteína conforme geralmente divulgado, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente US nQ 2009/0148447. Uma proteína de ligação de CD123 pode compreender, na ordem da terminação amino a terminação carboxila: uma região constante de imunoglobulina, uma região de dobradiça e um primeiro domínio de ligação.
[071] Os polipeptídeos e proteínas de ligação a CD123 divulgados no presente documento podem incorporar um arcabouço de proteína de ligação multiespecífico. As proteínas e polipeptídeos de ligação multiespecíficos usando arcabouços são divulgadas, por exemplo, na Publicação de Pedido PCT nQ WO 2007/146968, Publicação de Pedido de Patente US nQ 2006/0051844, Publicação de Pedido PCT nQ WO 2010/040105, Publicação de Pedido PCT nQ WO 2010/003108, Patente US nQ 7.166.707 e Patente US nQ 8.409.577, que são incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade. Uma proteína de ligação de CD123 pode compreender dois domínios de ligação (os domínios podem ser projetados para ligar especificamente os mesmos alvos ou diferentes), uma região de dobradiça, a ligante (por exemplo, um ligante de terminação carboxila ou um de terminação carboxila), e uma região constante de imunoglobulina. Uma proteína de ligação de CD123 pode ser uma proteína homodimérica que compreende dois polipeptídeos ligados por dissulfeto idênticos.
[072] Numa modalidade da invenção, a proteína de ligação de CD123 compreende, na ordem da terminação amino a terminação carboxila, um primeiro domínio de ligação, uma região de dobradiça, uma região constante de imunoglobulina e um segundo domínio de ligação. A Figura
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33/236 ilustra uma proteína de ligação de CD123 nesta configuração.
[073] Conforme usado no presente documento, o termo “aminoácidos de junção” ou “resíduos de aminoácido de junção” se refere a um ou mais (por exemplo, cerca de 2 a 10) resíduos de aminoácido entre duas regiões ou domínios adjacentes de um polipeptídeo, como entre uma região de dobradiça e uma região constante de imunoglobulina adjacente ou entre um domínio de dobradiça e um domínio de ligação adjacente ou entre um ligante de peptídeo e um domínio variável de imunoglobulina adjacente ou uma região constante de imunoglobulina adjacente. Os aminoácidos de junção podem resultar do projeto de construto de um polipeptídeo (por exemplo, resíduos de aminoácido que resultam do uso de um sítio de enzima de restrição durante a construção de uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo).
[074] Conforme usado no presente documento, o termo “paciente com necessidade” ou “indivíduo com necessidade” se refere a um paciente em risco ou que sofre de uma doença, distúrbio ou afecção que é amenizável com o tratamento ou a melhoria com uma proteína ou polipeptídeo de ligação de CD123 ou uma composição da mesma fornecida no presente documento. Um paciente com necessidade pode, por exemplo, ser um paciente diagnosticado com uma doença associada à expressão de CD123 como leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoide B, neoplasmas dendríticos plasmocitoides blásticos (BPDCN), leucemia de célula capilar (HCL), síndrome mielodisplástica (MDS), leucemia linfoblástica aguda (ALL), anemia refratária com blastos excessivos (RAEB), leucemia mieloide crônica e linfoma de Hodgkin.
[075] Conforme usado no presente documento, o termo “farmaceuticamente aceitável” se refere a entidades moleculares e composições que não produzem, em geral, reações alérgicas ou outras reações adversas quando administradas usando vias bem conhecidas na técnica. As entidades moleculares e composições aprovadas por uma agência reguladora do Governo Federal ou Estadual ou listadas na Farmacopeia US ou
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34/236 outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais, e mais particularmente em seres humanos são consideradas como “farmaceuticamente aceitáveis”.
[076] Conforme usado no presente documento, o termo “promotor” se refere a uma região de DNA envolvida na ligação de RNA polimerase para iniciar a transcrição.
[077] Conforme usado no presente documento, os termos “ácido nucleico”, “molécula de ácido nucleico”, ou “polinucleotídeo” se referem a desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e polímeros dos mesmos na forma de filamento único ou duplo. A menos que seja especificamente limitado, os termos abrangem ácidos nucleicos que contêm análogos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação semelhantes àquelas do ácido nucleico de referência e são metabolizados de uma maneira semelhante aos nucleotídeos de ocorrência natural. A menos que seja indicado o contrário, uma sequência de ácido nucleico específica também abrange implicitamente variantes conservativamente modificadas da mesma (por exemplo, substituições de códon degenerado) e sequências complementares assim como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, as substituições de códon degenerado podem ser obtidas gerando-se sequências em que a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) são substituídos por resíduos de base mista e/ou de desoxinosina (Batzer et al. (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; Cassol et al. (1992); Rossolini et al. (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98). O termo ácido nucleico é usado intercambiavelmente com gene, cDNA e mRNA codificado por urn gene. Conforme usado no presente documento, os termos “ácido nucleico”, “molécula de ácido nucleico”, ou “polinucleotídeo” se destinam a incluir moléculas de DNA (por exemplo, cDNA ou DNA genômico), moléculas de RNA (por exemplo, mRNA), análogos do DNA ou RNA gerados usando análogos de nucleotídeo, e derivados, fragmentos e homólogos dos mesmos.
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35/236 [078] O termo “expressão” se refere a biossíntese de um produto codificado por um ácido nucleico. Por exemplo, no caso de segmento de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de interesse, a expressão envolve a transcrição do segmento de ácido nucleico em mRNA e a tradução de mRNA para um ou mais polipeptídeos.
[079] Os termos “unidade de expressão” e “cassete de expressão” são usados intercambiavelmente no presente documento e denota um segmento de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de interesse e capaz de fornecer a expressão do segmento de ácido nucleico numa célula hospedeira. Uma unidade de expressão compreende tipicamente um promotor de transcrição, um quadro de leitura aberto que codifica o polipeptídeo de interesse, e um terminador de transcrição, todos na configuração operável. Além de um promotor e terminador de transcrição, uma unidade de expressão pode incluir ainda outros segmentos de ácido nucleico como, por exemplo, um intensificador ou um sinal de poliadenilação.
[080] O termo “vetor de expressão”, conforme usado no presente documento, se refere a uma molécula de ácido nucleico, linear ou circular, que compreende uma ou mais unidades de expressão. Além de uma ou mais unidades de expressão, um vetor de expressão também pode incluir segmentos de ácido nucleico adicionais como, por exemplo, uma ou mais origens de replicação ou um ou mais marcadores selecionáveis. Os vetores de expressão são geralmente derivados de DNA plasmídeo ou viral, ou podem conter elementos de ambos.
[081] Conforme usado no presente documento, o termo “identidade de sequência” se refere a uma relação entre duas ou mais sequências de polinucleotídeos ou entre duas ou mais sequências de polipeptídeos. Quando uma posição numa sequência for ocupada pela mesma base de ácido nucleico ou resíduo de aminoácido na posição correspondente da sequência comparadora, as sequências são ditas como “idênticas” nesta posição. A porcentagem de “identidade de sequência” é calculada
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36/236 determinando-se o número das posições em que a base de ácido nucleico ou resíduo de aminoácido idêntico ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições “idênticas”. O número de posições “idênticas” é, então, dividido pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicado por 100 para produzir a porcentagem da “identidade de sequência.” A porcentagem de “identidade de sequência” é determinada comparando-se duas sequências idealmente alinhadas numa janela de comparação. A janela de comparação para a sequência de ácido nucleicos pode ser, por exemplo, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 ou mais ácidos nucleicos de comprimento. A janela de comparação para as sequências de polipeptídeos pode ser, pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300 ou mais aminoácidos de comprimento. A fim de alinhar idealmente as sequências para comparação, a porção de uma sequência de polinucleotídeos ou polipeptídeos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções denominadas lacunas enquanto a sequência de referência é mantida constante. Um alinhamento ideal é aquele alinhamento que, mesmo com lacunas, produz o maior número possível de posições idênticas” entre as sequências de referência e comparadoras. A porcentagem de “identidade de sequência” entre duas sequências pode ser determinada usando a versão do programa “BLAST 2 Sequences” que estava disponível junto à National Center for Biotechnology Information de 1Q de setembro de 2004, cujo programa incorpora os programas BLASTN (para a comparação de sequência de nucleotídeos) e BLASTP (para a comparação de sequência de polipeptídeos), cujos programas se baseia no algoritmo de Karlin e Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(12):5873-5877, 1993). Quando se utiliza “BLAST 2 Sequences”, os parâmetros que eram parâmetros padrão de 1o de setembro de 2004, podem ser usados para o tamanho da palavra (3), penalidade por lacuna aberta (11), penalidade por extensão da lacuna (1), queda de lacuna (50), valor esperado (10) e qualquer outro parâmetro
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37/236 necessário incluindo, mas sem limitação, a opção de matriz. Duas sequências de nucleotídeos ou aminoácidos são consideradas para ter “identidade de sequência substancialmente semelhante” ou “identidade de sequência substancial” se as duas sequências tiverem pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência uma em relação à outra.
[082] Conforme usado no presente documento, um “polipeptídeo” ou “cadeia de polipeptídeos” é uma disposição única, linear e contígua de aminoácidos covalentemente ligados. Os polipeptídeos podem ter ou formar uma ou mais ligações de dissulfeto intercadeias. Em relação aos polipeptídeos conforme descritos no presente documento, a referência aos resíduos de aminoácido que correspondem àqueles especificados por SEQ ID NO inclui modificações pós-transcricionais de tais resíduos.
[083] Conforme usado no presente documento, “proteína de ligação de CD123” pode ser usado intercambiavelmente com “polipeptídeo de ligação a CD123”, “polipeptídeo” e “polipeptídeo recombinante.” Tais moléculas se ligam especificamente a CD123 (por exemplo, CD123 humano), também conhecido como Agrupamento de Diferenciação 123, cadeia alfa de receptor de lnterleucina-3, e IL3RA. CD123 é uma glicoproteína de transmembrana de tipo I, com um domínio extracelular que compreende um domínio semelhante a Ig predito e dois domínios de Fnlll. As proteínas de ligação de CD123 da divulgação se ligam ao domínio extracelular de CD123. O termo “CD123” pode se referir a qualquer isoforma de CD123. As sequências de nucleotídeo e aminoácidos de CD123 humanas exemplificativas são fornecidas na SEQ ID NOs:205 e 206 e SEQ ID NQs:207 e 208, respectivamente. CD123 se associa à cadeia beta do receptor de interleucina-3 para formar o receptor.
[084] Uma “proteína” é uma macromolécula que compreende uma ou mais cadeias de polipeptídeo. Uma proteína também pode
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38/236 compreender componentes não peptídicos, como grupos carboidrato. Os carboidratos e outros substituintes não peptídicos podem ser adicionados a uma proteína pela célula em que a proteína é produzida, e variará com o tipo de célula. As proteínas são definidas no presente documento em termos de suas estruturas principais de aminoácido; substituintes como grupos carboidrato são geralmente não especificados, mas podem estar presentes, não obstante. Uma proteína pode ser um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo. Em algumas modalidades, uma proteína também pode ser uma molécula de scFv-Fc-scFv, dímero de scFv-scFv, ou um diacorpo.
[085] Os termos “terminação amino” e “terminação carboxila” são usados no presente documento para denotar posições dentro dos polipeptídeos. Quando o contexto permitir, estes termos são usados com referência a uma sequência ou porção específica de um polipeptídeo para denotar proximidade ou posição relativa. Por exemplo, uma determinada terminação carboxila posicionada em sequência para uma sequência de referência dentro de um polipeptídeo está localizada próxima à terminação carboxila da sequência de referência, mas não é necessariamente na terminação carboxila do polipeptídeo completo.
[086] “Receptor de célula T” (TCR) é uma molécula encontrada na superfície de células T que, juntamente com CD3, é geralmente responsável por reconhecer antígenos encontrados para moléculas de complexo de maior histocompatibilidade (MHC). Isto consiste num heterodímero ligado por dissulfeto das cadeias α e β altamente variáveis na maioria das células T. Em outras células T, um receptor alternativo constituído de cadeias γ e δ variáveis é expresso. Cada cadeia do TCR é um membro da superfamília da imunoglobulina e processa um domínio variável de imunoglobulina N-terminal, um domínio constante de imunoglobulina, uma região de transmembrana, e uma cauda citoplásmica curta na extremidade Cterminal (consulte Abbas e Lichtman, Cellular and Molecular Immunology (5
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Ed.), Editor: Saunders, Philadelphia, 2003; Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4a Ed., Current Biology Publications, páginas 148, 149, e 172, 1999). O TCR conforme usado na presente divulgação pode ser de várias espécies animais, incluindo ser humano, camundongo, rato ou outros mamíferos.
[087] O “complexo de TCR”, conforme usado no presente documento, se refere a um complexo formado pela associação de cadeias de CD3 com outras cadeias de TCR. Por exemplo, um complexo de TCR pode ser composto de uma cadeia de CD3y, uma cadeia de CD3õ, duas cadeias de CD3s , um homodímero de cadeias de ΰϋ3ζ, uma cadeia de TCRa e uma cadeia de TCRp. Alternativamente, um complexo de TCR pode ser composto de uma cadeia de CD3y, uma cadeia de CD3õ, duas cadeias de CD3s , um homodímero de cadeias de ΰϋ3ζ, uma cadeia de TCRy, e uma cadeia de TCRõ.
[088] “Um componente de um complexo de TCR”, conforme usado no presente documento, se refere a uma cadeia de TCR (isto é, TCRa, TCR3, TCRy ou TCRõ), uma cadeia de CD3 (isto é, CD3y, CD3õ, CD3s ou CD3ζ), ou um complexo formado por duas ou mais cadeias de TCR ou cadeias de CD3 (por exemplo, um complexo de TCRa e TCRp, um complexo de TCRy e TCRõ, um complexo de CD3s e CD3õ, um complexo de CD3y e CD3s, ou um complexo de sub-TCR de TCRa, TCRp, CD3y, CD3õ, e duas cadeias de CD3s).
[089] “Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo” e “ADCC”, conforme usado no presente documento, se refere a um processo mediado por célula em que as células citotóxicas não específicas que expressam FcyRs (por exemplo, células monocíticas como células Exterminadoras Naturais (NK) e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligado (ou outra proteína capaz de ligar FcyRs) numa célula-alvo e, subsequentemente, causam lise da célula-alvo. Em princípio, qualquer célula
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40/236 efetora com um FcyR de ativação pode ser desencadeada para mediar ADCC. As células primárias para mediar ADCC são células NK, que expressam apenas FcyRIII, enquanto monócitos, dependendo de seu estado de ativação, localização ou diferenciação, podem expressar FcyRI, FcyRI I, e FcyRIII. Para uma revisão da expressão de FcyR em células hematopoiéticas, consulte, por exemplo, Ravetch et al., 1991, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92.
[090] O termo “que tem atividade de ADCC”, conforme usado no presente documento em referência a um polipeptídeo ou proteína, significa que o polipeptídeo ou proteína (por exemplo, um que compreende uma região de dobradiça de imunoglobulina e uma região constante de imunoglobulina que tem domínios de CH2 e CH3, como derivado de IgG (por exemplo, lgG1)), é capaz de mediar a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) através da ligação de um receptor de Fc citolítico (por exemplo, FcyRIII) numa célula efetora imune citolítica que expressa o receptor de Fc (por exemplo, uma célula NK).
[091] “Citotoxicidade dependente de complemento” e “CDC”, conforme usado no presente documento, se refere a um processo em que os componentes em soro normal (“complemento”), juntamente com um anticorpo ou outra proteína de ligação a complemento C1q ligada a um antígeno-alvo, exibe lise de uma célula-alvo que expressa o antígeno-alvo. O complemento consiste num grupo de proteínas séricas que agem em conjunto e numa sequência ordenada para exercer seu efeito.
[092] Os termos “percurso de complemento clássico” e “sistema de complemento clássico”, conforme usado no presente documento, são sinônimos e se refere a um percurso específico para a ativação de complemento. O percurso clássico requer complexos antígeno-anticorpo para iniciação e envolve a ativação, de uma maneira ordenada, de nove componentes de proteína importantes designados C1 a C9. Para diversas etapas no processo de ativação, o produto é uma enzima que catalisa a etapa
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41/236 subsequente. Esta cascata fornece amplificação e ativação de grandes quantidades de complemento por um sinal inicial relativamente pequeno.
[093] O termo “que tem atividade de CDC”, conforme usado no presente documento em referência a um polipeptídeo ou proteína, significa que o polipeptídeo ou a proteína (por exemplo, um que compreende uma região de dobradiça de imunoglobulina e uma região constante de imunoglobulina que tem domínios de CH2 e CH3, como derivado de IgG (por exemplo, lgG1)) é capaz de medir a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) através da ligação de proteína de complemento de C1q e ativação do sistema de complemento clássico. Numa modalidade da invenção, o polipeptídeo recombinante foi modificado para diminuir a atividade de CDC.
[094] “Citotoxicidade de célula T redirecionada” e “RTCC”, conforme usado no presente documento, se refere a um processo mediado por célula T em que uma célula T citotóxica é recrutada para uma célula-alvo usando uma proteína multiespecífica que é capaz de se ligar especificamente tanto à célula T citotóxica quanto à célula-alvo, e em que uma resposta de célula T citotóxica dependente de alvo é obtida contra a célula-alvo. Os polipeptídeos e proteínas que compreendem e domínios de ligação anti-CD123 e anti-CD3, conforme divulgado no presente documento, têm capacidade para RTCC.
[095] Conforme usado no presente documento, o termo “tratamento”, “tratar”, ou “melhorar” se refere a um tratamento terapêutico ou tratamento profilático/preventivo. Um tratamento é terapêutico se pelo menos um sintoma da doença num tratamento de recebimento individual melhora ou um tratamento pode atrasar a piora de uma doença progressiva num indivíduo, ou impedir o começo de doenças associadas adicionais.
[096] Conforme usado no presente documento, o termo “quantidade (ou dose) terapeuticamente eficaz” ou “quantidade (ou dose) eficaz” de uma molécula ou composto de ligação específico se refere àquela quantidade do composto suficiente para resultar na melhora de um ou mais
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42/236 sintomas da doença que é tratada de uma maneira estatisticamente significativa ou um aprimoramento estatisticamente significativo na função do órgão. Quando se refere a um ingrediente ativo individual, administrado sozinho, uma dose terapeuticamente eficaz se refere àquele ingrediente sozinho. Quando se refere a uma combinação, uma dose terapeuticamente eficaz se refere às quantidades combinadas dos ingrediente sativos que resultam no efeito terapêutico, seja administrado serial ou simultaneamente (na mesma formulação ou concomitantemente em formulações separadas).
[097] Conforme usado no presente documento, o termo “transformação”, “transfecção”, e “transdução” se refere à transferência de ácido nucleico (isto é, um polímero de nucleotídeo) para uma célula. Conforme usado no presente documento, o termo “transformação genética” se refere à transferência e incorporação de DNA, especialmente DNA recombinante, numa célula. O ácido nucleico transferido pode ser introduzido numa célula por meio de um vetor de expressão.
[098] Conforme usado no presente documento, o termo “variante” ou “variantes” se refere a um ácido nucleico ou polipeptídeo que difere de um ácido nucleico ou polipeptídeo de referência, mas que retém propriedades essenciais dos mesmos. Em geral, as variantes são muito próximas no geral, e, em muitas regiões, idênticas ao ácido nucleico ou polipeptídeo de referência. Por exemplo, uma variante pode exibir pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência em comparação com o ácido nucleico ou polipeptídeo de referência de comprimento total ou de porção ativa.
[099] Os termos “região variável de cadeia leve” (também denominado como “domínio variável de cadeia leve” ou “VL” ou VL) e “região variável de cadeia pesada” (também denominado como “domínio variável de cadeia pesada” ou “VH” ou VH) se refere à região de ligação variável de uma
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43/236 cadeia leve e pesada de anticorpo, respectivamente. As regiões de ligação variáveis são constituídas por sub-regiões discretas, bem definidas conhecidas como “regiões de determinação de complementaridade” (CDRs) e “regiões de armação” (FRs), que compreendem geralmente na ordem FR1-CDR1-FR2CDR2-FR3-CDR3-FR4 de terminação amino a terminação carboxila. Numa modalidade, as FRs são humanizadas. O termo “CL” se refere a uma “região constante de cadeia leve de imunoglobulina” ou uma “região constante de cadeia leve”, isto é, uma região constante de uma cadeia leve de anticorpo. O termo “CH” se refere a uma “região constante de cadeia pesada de imunoglobulina” ou uma “cadeia pesada região constante”, que é, ainda, divisível, dependendo do isotipo do nos domínios de CH1, CH2, e CH3 (IgA, IgD, IgG), ou CH1, CH2, CH3, e CH4 (IgE, IgM). Uma “Fab” (ligação a antígeno de fragmento) é a parte de um anticorpo que se liga a antígenos e inclui a região variável e domínio de CH1 da cadeia pesada ligada à cadeia leve por meio de uma ligação de dissulfeto intercadeia.
[0100] A presente divulgação descreve domínios de ligação que ligam especificamente CD123 (por exemplo, CD123 humano), assim como polipeptídeos e proteínas que compreendem estes domínios de ligação. Em algumas modalidades, as proteínas de ligação de CD123 e polipeptídeos compreendem um segundo domínio de ligação, que pode se ligar a CD123 ou a um alvo diferente. Os polipeptídeos e as proteínas que compreendem domínios de ligação desta divulgação podem compreender ainda regiões constantes de imunoglobulina, peptídeos de ligante, regiões de dobradiça, domínios de dimerização/heterodimerização de imunoglobulina, aminoácidos de junção, etiquetas, etc. Estes componentes dos polipeptídeos e proteínas divulgados são descritos em mais detalhes abaixo.
[0101] Adicionalmente, os polipeptídeos e as proteínas de ligação a CD123 divulgados no presente documento podem estar na forma de um anticorpo ou uma proteína de fusão de qualquer um dentre uma variedade de formatos diferentes (por exemplo, a proteína de fusão pode
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44/236 estar na forma de uma molécula multiespecífica ou biespecífica de ligação a CD123). Exemplos não limitantes de moléculas biespecíficas incluem uma molécula de scFv-Fc-scFv. Algumas moléculas biespecíficas compreendem ou consistem num scFv anti-CD123 ligado a um segundo scFv de domínio de ligação e não incluem outras sequências como uma região constante de imunoglobulina. Em outras modalidades, uma proteína de ligação de CD123 é um diacorpo.
[0102] Uma proteína de ligação de CD123 de acordo com a presente divulgação inclui geralmente pelo menos uma cadeia de polipeptídeo de ligação a CD123 que compreende (a) um domínio de ligação a CD123 conforme estabelecido no presente documento. Em determinadas variações, o polipeptídeo de ligação a CD123 inclui ainda (b) uma terminação carboxila de região de dobradiça para o domínio de ligação a CD123, e (c) uma região constante de imunoglobulina. Em mais variações, o polipeptídeo de ligação a CD123 inclui ainda (d) uma terminação carboxila de ligante de terminação carboxila para a região constante de imunoglobulina, e (e) uma terminação carboxila de segundo domínio de ligação para o ligante de terminação carboxila.
[0103] Em ainda outras variações, o polipeptídeo de ligação a CD123 compreende (b) uma região de dobradiça de terminação amino para o domínio de ligação a CD123, e (c) uma terminação amino de subregião de imunoglobulina para a região de dobradiça.
[0104] Em algumas modalidades, os polipeptídeos recombinantes são capazes de homodimerização, tipicamente através de ligação de dissulfeto, por meio da região constante de imunoglobulina e/ou região de dobradiça (por exemplo, por meio de uma região constante de imunoglobulina que compreende domínios de CH2 e CH3 de IgG e uma região de dobradiça de IgG). Deste modo, em determinadas modalidades da presente divulgação, dois polipeptídeos de cadeia única de ligação a CD123 idênticos se homodizerizam para formar uma proteína de ligação de CD123 dimérica. Um
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45/236 exemplo de um homodímero da invenção é fornecido na Figura 11.
[0105] Em outras modalidades, um polipeptídeo de ligação a CD123 inclui um domínio de heterodimerização que é capaz de heterodimerização com um domínio de heterodimerização diferente numa segunda cadeia de polipeptídeo não idêntica. Em determinadas variações, a segunda cadeia de polipeptídeo para heterodimerização inclui um segundo domínio de ligação. Consequentemente, em determinadas modalidades da presente divulgação, duas cadeias de polipeptídeo não idênticas, sendo que uma compreende o domínio de ligação a CD123 e o segundo compreende opcionalmente um segundo domínio de ligação, se dimerizam para formar uma proteína de ligação de CD123 heterodimérica. Exemplos de tipos de heterodímeros incluem aqueles descritos na Publicação de Pedido de Patente US nQ 2013/0095097 e US 2013/0129723.
[0106] Em algumas modalidades, um domínio de ligação a CD123, proteína ou polipeptídeo é conjugado a um fármaco ou uma porção química tóxica.
[0107] Polipeptídeos, proteínas de ligação a CD123 e seus vários componentes usados nos terapêuticos da presente divulgação são adicionalmente descritos abaixo.
[0108] Conforme indicado acima, a divulgação se refere a domínios de ligação que se ligam especificamente a CD123. Em algumas variações, o domínio de ligação a CD123 é capaz de competir para se ligar a CD123 com um anticorpo que tem regiões VL e VH que têm sequências de aminoácidos conforme mostradas na SEQ ID NO:194 e na SEQ ID NO:196, respectivamente (por exemplo, 12F1). O anticorpo 12F1 anti-CD123 murino é descrito, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente US nQ 2013/041739 e Kuo et al, (2012) Protein Eng Design Select, páginas 1-9.
[0109] O domínio de ligação a CD123 pode compreender sequências mostradas na Tabela 3, e algumas SEQ ID NOs relevantes são resumidas na Tabela 6. Em determinadas modalidades, o
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46/236 domínio de ligação a CD123 compreende (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) que compreende CDRs LCDR1, LCDR2, e LCDR3, e (ii) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) que compreende CDRs HCDR1, HCDR2, e HCDR3 com HCDR1 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:12, com HCDR2 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:14 e com HCDR3 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:16. Em determinadas modalidades, o domínio de ligação a CD123 compreende (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) que compreende CDRs LCDR1, LCDR2, e LCDR3, e (ii) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) que compreende CDRs HCDR1, HCDR2, e HCDR3. Em algumas tais modalidades, (i) um LCDR1 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:6 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:6 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (ii) um LCDR2 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:8 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:8 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (ill) um LCDR3 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NQ:10 ou uma sequência que difere da SEQ ID NQ:10 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (iv) um HCDR1 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:12 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:12 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (v) um HCDR2 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:14 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:14 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (vi) uma HCDR3 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:16 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:16 em pelo menos uma substituição de aminoácido. A substituição de aminoácido descrita acima pode ser uma substituição de aminoácido conservativa ou não conservativa. Em algumas modalidades, um LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, e/ou HCDR3 difere de uma sequência citada por 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9
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47/236 ou 10 aminoácidos. Em determinadas modalidades, uma CDR da presente divulgação contém cerca de uma ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) inserções, cerca de uma ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) deleções, cerca de um ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) substituições de aminoácido (por exemplo, substituições de aminoácido conservativas ou substituições de aminoácido não conservativas), ou uma combinação das alterações notadas acima, quando comparadas à sequência de CDR de um anticorpo monoclonal conhecido. Por exemplo, a invenção inclui um polipeptídeo recombinante que compreende (i) um LCDR1 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:6 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:6 numa ou duas substituições de aminoácido; (ii) um LCDR2 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:8 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:8 numa ou duas substituições de aminoácido; (ill) um LCDR3 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NQ:10 ou uma sequência que difere da SEQ ID NQ:10 numa ou duas substituições de aminoácido; (iv) um HCDR1 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:12 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:12 numa ou duas substituições de aminoácido; (v) um HCDR2 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:14 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:14 numa ou duas substituições de aminoácido; e (vi) um HCDR3 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:16 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:16 numa ou duas substituições de aminoácido. A substituição de aminoácido descrita acima pode ser uma substituição de aminoácido conservativa ou não conservativa.
[0110] Nas modalidades relacionadas, um polipeptídeo recombinante da invenção compreende ou é uma sequência que é pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos
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48/236 cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, pelo menos cerca de 99,5% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve (VL) (por exemplo, SEQ ID NO:2) ou a uma região variável de cadeia pesada (VH) (por exemplo, SEQ ID NO:4), ou ambas. Numa modalidade, o domínio de ligação a CD123 do polipeptídeo recombinante é um scfv que compreende uma cadeia pesada variável que compreende SEQ ID NO:4 e uma cadeia leve variável que compreende SEQ ID NO:2 na orientação de VHVL. Numa outra modalidade, o domínio de ligação a CD123 do polipeptídeo recombinante é um scFv que compreende uma cadeia leve variável que compreende SEQ ID NO:2 e uma cadeia pesada variável que compreende SEQ ID NO:4 na orientação de VLVH. Por exemplo, em determinadas modalidades, o polipeptídeo da invenção compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NQ:130 ou SEQ ID NO:132. A invenção inclui um polipeptídeo recombinante que é pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, pelo menos cerca de 99,5%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NQ:130 ou SEQ ID NO:132.
[0111] Em determinadas modalidades, o domínio de ligação a CD123 compreende (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) que compreende CDRs LCDR1, LCDR2, e LCDR3, e (ii) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) que compreende CDRs HCDR1, HCDR2, e HCDR3. Em algumas tais modalidades, (i) um LCDR1 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:22 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:22 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (ii) um LCDR2 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:24 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:24
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49/236 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (ill) um LCDR3 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:26 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:26 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (iv) um HCDR1 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:28 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:28 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (v) um HCDR2 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NQ:30 ou uma sequência que difere da SEQ ID NQ:30 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (vi) uma HCDR3 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:32 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:32 em pelo menos uma substituição de aminoácido. A substituição de aminoácido descrita acima pode ser uma substituição de aminoácido conservativa ou não conservativa. Em algumas modalidades, um LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, e/ou HCDR3 difere de uma sequência citada por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos. Em determinadas modalidades, uma CDR da presente divulgação contém cerca de uma ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) inserções, cerca de uma ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) deleções, cerca de um ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) substituições de aminoácido (por exemplo, substituições de aminoácido conservativas ou substituições de aminoácido não conservativas), ou uma combinação das alterações notadas acima, quando comparadas à sequência de CDR de um anticorpo monoclonal conhecido.
[0112] Nas modalidades relacionadas, um domínio de ligação a CD123 compreende ou é uma sequência que é pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, pelo menos cerca de 99,5%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve (VL)
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50/236 (por exemplo, SEQ ID NO:18) ou a uma região variável de cadeia pesada (VH) (por exemplo, SEQ ID NO:20), ou ambas.
[0113] Em determinadas modalidades, o domínio de ligação a CD123 compreende (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) que compreende CDRs LCDR1, LCDR2, e LCDR3, e (ii) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) que compreende CDRs HCDR1, HCDR2, e HCDR3. Em algumas tais modalidades, (i) um LCDR1 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:22 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:22 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (ii) um LCDR2 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:24 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:24 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (iii) um LCDR3 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:26 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:26 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (iv) um HCDR1 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:36 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:36 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (v) um HCDR2 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:38 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:38 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (vi) uma HCDR3 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:40 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:40 em pelo menos uma substituição de aminoácido. A substituição de aminoácido descrita acima pode ser uma substituição de aminoácido conservativa ou não conservativa. Em algumas modalidades, um LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, e/ou HCDR3 difere de uma sequência citada por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos. Em determinadas modalidades, uma CDR da presente divulgação contém cerca de uma ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) inserções, cerca de uma ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) deleções, cerca de um ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) substituições de aminoácido (por exemplo, substituições de aminoácido
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51/236 conservativas ou substituições de aminoácido não conservativas), ou uma combinação das alterações notadas acima, quando comparadas à sequência de CDR de um anticorpo monoclonal conhecido.
[0114] Nas modalidades relacionadas, um domínio de ligação a CD123 compreende ou é uma sequência que é pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, pelo menos cerca de 99.5%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve (VL) (por exemplo, SEQ ID NO:18) ou a uma região variável de cadeia pesada (VH) (por exemplo, SEQ ID NO:34), ou ambas.
[0115] Em determinadas modalidades, o domínio de ligação a CD123 compreende (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) que compreende CDRs LCDR1, LCDR2, e LCDR3, e (ii) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) que compreende CDRs HCDR1, HCDR2, e HCDR3. Em algumas tais modalidades, (i) um LCDR1 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:22 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:22 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (ii) um LCDR2 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:24 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:24 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (ill) um LCDR3 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:26 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:26 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (iv) um HCDR1 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:44 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:44 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (v) um HCDR2 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:46 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:46 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (vi) uma
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HCDR3 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:48 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:48 em pelo menos uma substituição de aminoácido. A substituição de aminoácido descrita acima pode ser uma substituição de aminoácido conservativa ou não conservativa. Em algumas modalidades, um LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, e/ou HCDR3 difere de uma sequência citada por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos. Em determinadas modalidades, uma CDR da presente divulgação contém cerca de uma ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) inserções, cerca de uma ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) deleções, cerca de um ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) substituições de aminoácido (por exemplo, substituições de aminoácido conservativas ou substituições de aminoácido não conservativas), ou uma combinação das alterações notadas acima, quando comparadas à sequência de CDR de um anticorpo monoclonal conhecido.
[0116] Nas modalidades relacionadas, um domínio de ligação a CD123 compreende ou é uma sequência que é pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, pelo menos cerca de 99.5%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve (VL) (por exemplo, SEQ ID NO:18) ou a uma região variável de cadeia pesada (VH) (por exemplo, SEQ ID NO:42), ou ambas.
[0117] Em determinadas modalidades, o domínio de ligação a CD123 compreende (I) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) que compreende CDRs LCDR1, LCDR2, e LCDR3, e (ii) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) que compreende CDRs HCDR1, HCDR2, e HCDR3. Em algumas tais modalidades, (I) um LCDR1 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:22 ou
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53/236 uma sequência que difere da SEQ ID NO:22 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (ii) um LCDR2 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:24 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:24 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (ill) um LCDR3 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:26 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:26 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (iv) um HCDR1 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:100 ou uma sequência que difere da SEQ ID NQ:100 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (v) um HCDR2 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:102 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:102 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (vi) uma HCDR3 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:104 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:104 em pelo menos uma substituição de aminoácido. A substituição de aminoácido descrita acima pode ser uma substituição de aminoácido conservativa ou não conservativa. Em algumas modalidades, um LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, e/ou HCDR3 difere de uma sequência citada por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos. Em determinadas modalidades, uma CDR da presente divulgação contém cerca de uma ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) inserções, cerca de uma ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) deleções, cerca de um ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) substituições de aminoácido (por exemplo, substituições de aminoácido conservativas ou substituições de aminoácido não conservativas), ou uma combinação das alterações notadas acima, quando comparadas à sequência de CDR de um anticorpo monoclonal conhecido.
[0118] Nas modalidades relacionadas, um domínio de ligação a CD123 compreende ou é uma sequência que é pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%,
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54/236 pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, pelo menos cerca de 99.5%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve (VL) (por exemplo, SEQ ID NO:18) ou a uma região variável de cadeia pesada (VH) (por exemplo, SEQ ID NO:98), ou ambas.
[0119] Em determinadas modalidades, o domínio de ligação a CD123 compreende (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) que compreende CDRs LCDR1, LCDR2, e LCDR3, e (ii) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) que compreende CDRs HCDR1, HCDR2, e HCDR3. Em algumas tais modalidades, (i) um LCDR1 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:22 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:22 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (ii) um LCDR2 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:24 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:24 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (iii) um LCDR3 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:26 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:26 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (iv) um HCDR1 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:116 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:116 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (v) um HCDR2 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:118 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:118 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (vi) uma HCDR3 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NQ:120 ou uma sequência que difere da SEQ ID NQ:120 em pelo menos uma substituição de aminoácido. A substituição de aminoácido descrita acima pode ser uma substituição de aminoácido conservativa ou não conservativa. Em algumas modalidades, um LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, e/ou HCDR3 difere de uma sequência citada por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos. Em determinadas modalidades, uma CDR da presente divulgação contém cerca de uma ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6,
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7, 8, 9, 10) inserções, cerca de uma ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) deleções, cerca de um ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) substituições de aminoácido (por exemplo, substituições de aminoácido conservativas ou substituições de aminoácido não conservativas), ou uma combinação das alterações notadas acima, quando comparadas à sequência de CDR de um anticorpo monoclonal conhecido.
[0120] Nas modalidades relacionadas, um domínio de ligação a CD123 compreende ou é uma sequência que é pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, pelo menos cerca de 99.5%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve (VL) (por exemplo, SEQ ID NO:18) ou a uma região variável de cadeia pesada (VH) (por exemplo, SEQ ID NO:114), ou ambas.
[0121] Em determinadas modalidades, o domínio de ligação a CD123 compreende (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) que compreende CDRs LCDR1, LCDR2, e LCDR3, e (ii) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) que compreende CDRs HCDR1, HCDR2, e HCDR3. Em algumas tais modalidades, (i) um LCDR1 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:22 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:22 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (ii) um LCDR2 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:24 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:24 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (ill) um LCDR3 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:26 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:26 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (iv) um HCDR1 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:124 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:124 em pelo menos uma
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56/236 substituição de aminoácido; (v) um HCDR2 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:126 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:126 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (vi) uma HCDR3 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:128 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:128 em pelo menos uma substituição de aminoácido. A substituição de aminoácido descrita acima pode ser uma substituição de aminoácido conservativa ou não conservativa. Em algumas modalidades, um LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, e/ou HCDR3 difere de uma sequência citada por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos. Em determinadas modalidades, uma CDR da presente divulgação contém cerca de uma ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) inserções, cerca de uma ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) deleções, cerca de um ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) substituições de aminoácido (por exemplo, substituições de aminoácido conservativas ou substituições de aminoácido não conservativas), ou uma combinação das alterações notadas acima, quando comparadas à sequência de CDR de um anticorpo monoclonal conhecido.
[0122] Nas modalidades relacionadas, um domínio de ligação a CD123 compreende ou é uma sequência que é pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, pelo menos cerca de 99.5%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve (VL) (por exemplo, SEQ ID NO:18) ou a uma região variável de cadeia pesada (VH) (por exemplo, SEQ ID NO:122), ou ambas.
[0123] Em determinadas modalidades, o domínio de ligação a CD123 compreende (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) que compreende CDRs LCDR1, LCDR2, e LCDR3, e (ii)
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57/236 uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) que compreende CDRs HCDR1, HCDR2, e HCDR3. Em algumas tais modalidades, (i) um LCDR1 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:54 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:54 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (ii) um LCDR2 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:56 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:56 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (ill) um LCDR3 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:58 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:58 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (iv) um HCDR1 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:60 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:60 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (v) um HCDR2 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:62 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:62 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (vi) uma HCDR3 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:64 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:64 em pelo menos uma substituição de aminoácido. A substituição de aminoácido descrita acima pode ser uma substituição de aminoácido conservativa ou não conservativa. Em algumas modalidades, um LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, e/ou HCDR3 difere de uma sequência citada por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos. Em determinadas modalidades, uma CDR da presente divulgação contém cerca de uma ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) inserções, cerca de uma ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) deleções, cerca de um ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) substituições de aminoácido (por exemplo, substituições de aminoácido conservativas ou substituições de aminoácido não conservativas), ou uma combinação das alterações notadas acima, quando comparadas à sequência de CDR de um anticorpo monoclonal conhecido.
[0124] Nas modalidades relacionadas, um domínio de ligação a CD123 compreende ou é uma sequência que é pelo menos cerca
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58/236 de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, pelo menos cerca de 99.5%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve (VL) (por exemplo, SEQ ID NQ:50) ou a uma região variável de cadeia pesada (VH) (por exemplo, SEQ ID NO:52), ou ambas.
[0125] Em determinadas modalidades, o domínio de ligação a CD123 compreende (I) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) que compreende CDRs LCDR1, LCDR2, e LCDR3, e (li) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) que compreende CDRs HCDR1, HCDR2, e HCDR3. Em algumas tais modalidades, (I) um LCDR1 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NQ:70 ou uma sequência que difere da SEQ ID NQ:70 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (li) um LCDR2 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:72 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:72 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (ill) um LCDR3 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:74 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:74 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (iv) um HCDR1 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:76 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:76 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (v) um HCDR2 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:78 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:78 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (vi) uma HCDR3 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NQ:80 ou uma sequência que difere da SEQ ID NQ:80 em pelo menos uma substituição de aminoácido. A substituição de aminoácido descrita acima pode ser uma substituição de aminoácido conservativa ou não conservativa. Em algumas modalidades, um LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, e/ou HCDR3
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59/236 difere de uma sequência citada por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos. Em determinadas modalidades, uma CDR da presente divulgação contém cerca de uma ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) inserções, cerca de uma ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) deleções, cerca de um ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) substituições de aminoácido (por exemplo, substituições de aminoácido conservativas ou substituições de aminoácido não conservativas), ou uma combinação das alterações notadas acima, quando comparadas à sequência de CDR de um anticorpo monoclonal conhecido.
[0126] Nas modalidades relacionadas, um domínio de ligação a CD123 compreende ou é uma sequência que é pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, pelo menos cerca de 99.5%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve (VL) (por exemplo, SEQ ID NO:66) ou a uma região variável de cadeia pesada (VH) (por exemplo, SEQ ID NO:68), ou ambas.
[0127] Em determinadas modalidades, o domínio de ligação a CD123 compreende (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) que compreende CDRs LCDR1, LCDR2, e LCDR3, e (ii) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) que compreende CDRs HCDR1, HCDR2, e HCDR3. Em algumas tais modalidades, (I) um LCDR1 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:86 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:86 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (ii) um LCDR2 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:88 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:88 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (ill) um LCDR3 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NQ:90 ou uma sequência
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60/236 que difere da SEQ ID NO:90 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (iv) um HCDR1 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:92 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:92 em pelo menos uma substituição de aminoácido; (v) um HCDR2 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:94 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:94 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (vi) uma HCDR3 tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:96 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:96 em pelo menos uma substituição de aminoácido. A substituição de aminoácido descrita acima pode ser uma substituição de aminoácido conservativa ou não conservativa. Em algumas modalidades, um LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2, e/ou HCDR3 difere de uma sequência citada por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos. Em determinadas modalidades, uma CDR da presente divulgação contém cerca de uma ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) inserções, cerca de uma ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) deleções, cerca de um ou mais (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) substituições de aminoácido (por exemplo, substituições de aminoácido conservativas ou substituições de aminoácido não conservativas), ou uma combinação das alterações notadas acima, quando comparadas à sequência de CDR de um anticorpo monoclonal conhecido.
[0128] Nas modalidades relacionadas, um domínio de ligação a CD123 compreende ou é uma sequência que é pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, pelo menos cerca de 99.5%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos de uma região variável de cadeia leve (VL) (por exemplo, SEQ ID NO:82) ou a uma região variável de cadeia pesada (VH) (por exemplo, SEQ ID NO:84), ou ambas.
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61/236 [0129] Em determinadas modalidades, um domínio de ligação a CD123 compreende regiões de VL e/ou VH de imunoglobulina humanizadas. As técnicas para humanizar regiões de VL e VH de imunoglobulina são conhecidas na técnica e são discutidas, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente US nQ 2006/0153837. Em determinadas modalidades, um domínio de ligação a CD123 compreende regiões de VL e/ou VH de imunoglobulina humana.
[0130] A “humanização” é esperada para resultar num anticorpo que é menos imunogênico, com retenção completa das propriedades de ligação a antígeno da molécula original. A fim de reter todas as propriedades de ligação a antígeno do anticorpo original, a estrutura de seu sítio de ligação a antígeno deve ser reproduzida na versão “humanizada”. Isto pode ser obtido enxertando-se apenas as CDRs não humanas nos domínios de armação variável humana e regiões constantes, com ou sem retenção de resíduos de armação crítica (Jones et al., Nature 321:522 (1986); Verhoeyen et al., Science 239:1539 (1988)) ou recombinando-se todos os domínios variáveis não humanos (para preservar propriedades de ligação a aglutinante), mas “encobrindo” os mesmos com uma superfície do tipo humana através de substituição judiciosa de resíduos expostos (para reduzir a antigenicidade) (Padlan, Molec. Immunol. 28:489 (1991)).
[0131] Essencialmente, a humanização por enxerto de CDR envolve recombinar apenas as CDRs de um anticorpo não humano numa armação de região variável humana e uma região constante humana. Teoricamente, isto deve reduzir substancialmente ou eliminar a imunogenicidade (exceto se existir diferenças alotípicas ou idiotípicas). No entanto, foi relatado que alguns resíduos de armação do anticorpo original também pode precisar ser preservado (Reichmann et al., Nature, 332:323 (1988); Queen etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10,029 (1989)).
[0132] Os resíduos de armação que precisam ser preservados são favoráveis para a identificação através de modelagem de
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62/236 computador. Alternativamente, os resíduos de armação críticos podem ser potencial mente identificados comparando-se as estruturas de sítio de ligação a antígeno conhecidas (Padlan, Molec. Immunol., 31(3):169-217 (1994), incorporado ao presente documento a título de referência).
[0133] Os resíduos que afetam potencialmente a ligação a antígeno estão dentro de diversos grupos. O primeiro grupo compreende resíduos que são contíguos com a superfície do sítio de antígeno, que podería, portanto, fazer contato direto com os antígenos. Estes resíduos incluem os resíduos de terminação amino e aqueles adjacentes às CDRs. O segundo grupo inclui resíduos que poderíam alterar a estrutura ou alinhamento relativo das CDRs, seja pelo contato das CDRs ou uma outra cadeia de peptídeo no anticorpo. O terceiro grupo compreende aminoácidos com cadeias laterais escondidas que poderíam influenciar a integridade estrutural dos domínios variáveis. Os resíduos nestes grupos são normalmente encontrados nas mesmas posições (Padlan, 1994, supra) embora suas posições conforme identificadas possam diferir dependendo do sistema de numeração (consulte Kabat et al., “Sequences of proteins of immunological interest, 5ã ed., Pub. nQ 91-3242, U.S. Dept. Health & Human Services, NIH, Bethesda, Md., 1991).
[0134] O conhecimento sobre anticorpos humanizados na técnica é aplicável aos polipeptídeos de acordo com a divulgação, mesmo e estes polipeptídeos não forem anticorpos.
[0135] Em algumas modalidades, a divulgação se refere a domínios de ligação a CD123 em que (i) a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2 e a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de
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63/236 aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:4; (ii) a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:18 e a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:20; (ill) a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:18 e a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:34; (iv) a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:18 e a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:42; (v) a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:50 e a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é
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64/236 pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:52; (vi) a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:66 e a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:68; (vii) a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:82 e a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:84; (viii) a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:18 e a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:122; (ix) a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de
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65/236 aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:18 e a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:98; (x) a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:18 e a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NQ:106; ou (xi) a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:18 e a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:114.
[0136] Em modalidades adicionais, cada CDR compreende no máximo uma, duas ou três substituições, inserções ou deleções, em comparação com aquela de um anticorpo monoclonal ou fragmento ou derivado do mesmo que se liga especificamente a um alvo de interesse (por exemplo, CD123).
[0137] Em determinadas modalidades, uma proteína de ligação de CD123 pode compreender um ou mais domínios de ligação adicionais (por exemplo, segundo domínio de ligação) que liga um alvo além de CD123. Estes outros domínios de ligação podem compreender, por exemplo,
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66/236 uma citocina específica ou uma molécula que alveja o polipeptídeo de domínio de ligação a um tipo de célula específico, uma toxina, um receptor de célula adicional, um anticorpo, etc.
[0138] Em determinadas modalidades, uma molécula ou proteína de ligação a CD123 pode compreender um domínio de ligação a célula T para recrutamento de células T para células-alvo que expressam CD123. Em determinadas modalidades, uma proteína de ligação de CD123 conforme descrito no presente documento pode compreender (I) um domínio de ligação que liga especificamente um complexo de TCR ou um componente do mesmo (por exemplo, TCRa, TCRp, CD3y, CD3õ, e CD3s) e (ii) um outro domínio de ligação que se liga especificamente a CD123. Uma proteína de ligação de CD123 pode utilizar essencialmente qualquer domínio de ligação que se liga a uma célula T, por exemplo, um domínio de ligação derivado de anticorpo. Os anticorpos anti-CD3 exemplificativos dos quais o domínio de ligação a CD3 pode ser derivado incluem o anticorpo monoclonal de CRIS-7 (Reinherz, E. L. et al. (eds.), Leukocyte typing 11., Springer Verlag, Nova York, (1986); VL e VH sequências de aminoácidos mostradas, respectivamente, na SEQ ID NO:209 (QVVLTQSPAIMSAFPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDSS KLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMETEDAATYYCQQWSRNPPTFGGGTKL QITR) e SEQ ID NQ:210 (QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRSTMHWVKQRPGQGLEWIGY INPSSAYTNYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCASPQVHY DYNGFPYWGQGTLVTVSA)); HuM291 (Chau et al. (2001) Transplantation 71:941-950; sequências de aminoácidos de VL e VH mostradas, respectivamente, na SEQ ID
NO:211 (DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLI YDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPPTFGG GTKVEIK) e SEQ ID NO:212 (QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFISYTMHWVRQAPGQGLEWMGY
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INPRSGYTHYNQKLKDKATLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSAYYD YDGFAYWGQGTLVTVSS)); anticorpo monoclonal de BC3 (Anasetti et al. (1990) J. Exp. Med. 172:1691); anticorpo monoclonal de OKT3 (Ortho multicenter Transplant Study Group (1985) N. Engl. J. Med. 313:337) e derivados dos mesmos como OKT3 ala-ala (também referido como OKT3 AAFL ou OKT3 FL), uma variante de Fc humanizada com substituições de alanina nas posições 234 e 235 (Herold et al. (2003) J. Clin. Invest. 11:409); visilizumabe (Carpenter et al. (2002) Blood 99:2712), anticorpo monoclonal de G19-4 (Ledbetter et al., 1986, J. Immunol. 136:3945), anticorpo monoclonal de 145-2C11 (Hirsch et al. (1988) J. Immunol. 140: 3766) e anticorpo monoclonal de I2C (consulte, por exemplo, US 2011/0293619 e US20120244162). Por exemplo, um domínio de ligação a CD3 pode compreender um domínio de ligação a CD3 divulgado na Publicação de Pedido de Patente US nQ 2012/0244162, incluindo um domínio de ligação a CD3 que compreende uma região de VL selecionada dentre SEQ ID NO: 17, 21,35, 39, 53, 57, 71,75, 89, 83, 107, 111, 125, 129, 143, 147, 161, 165, 179 e 183 do documento US 2012/0244162 e/ou uma região de VH selecionada dentre SEQ ID NO:15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91. 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 e 181 do documento US 2012/0244162. Em algumas modalidades, um domínio de ligação a CD3 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre SEQ ID NO: 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185, e 187 do documento US 2012/0244162. Em algumas modalidades, um domínio de ligação a CD3 é um descrito em WQ2004/106380, WQ2005/040220A1, US 2014/0099318 ou derivado de um domínio de ligação a CD3 do mesmo. Um anticorpo anti-TCR exemplificativo é o anticorpo monoclonal de BMA031 (Borst et al. (1990) Human Immunology 29:175-188). O domínio de ligação a CD3 pode ser derivado de qualquer um dos anticorpos ou sequências descritos em WO 2013/158856 (incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade). Em determinadas variações, o segundo domínio de ligação de um polipeptídeo de ligação a
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CD123 descrito no presente documento compreende: (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende LCDR1, LCDR2, e LCDR3, e (ii) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende HCDR1, HCDR2, e HCDR3, em que (a) um LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tem as sequências de aminoácidos estabelecidas na SEQ ID NOs:162, 163 e 164, respectivamente, e um HCDR1, HCDR2, e HCDR3 tem as sequências de aminoácidos estabelecidas na SEQ ID NOs: 165, 166 e 167, respectivamente; ou (b) um LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tem as sequências de aminoácidos estabelecidas na SEQ ID NO:168, SEQ ID NO:169, e SEQ ID NQ:170, respectivamente, e um HCDR1, HCDR2, e HCDR3 tem as sequências de aminoácidos estabelecidas na SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO:172, e SEQ ID NO:173, respectivamente. Em outros aspectos, o segundo domínio de ligação de um polipeptídeo de ligação a CD123 descrito no presente documento compreende: (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende LCDR1, LCDR2, e LCDR3, e (ii) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende HCDR1, HCDR2, e HCDR3, em que (a) o LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tem as sequências de aminoácidos estabelecidas na SEQ ID NOs: 171, 172 e 173, respectivamente, e um HCDR1, HCDR2, e HCDR3 tem as sequências de aminoácidos estabelecidas na SEQ ID NOs: 174, 175 e 176, respectivamente; ou (b) um LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tem as sequências de aminoácidos estabelecidas na SEQ ID NOs: 176, 177 e 178, respectivamente, e um HCDR1, HCDR2, e HCDR3 tem as sequências de aminoácidos estabelecidas na SEQ ID NOs: 179, 180 e 181, respectivamente. Em determinadas modalidades, o segundo domínio de ligação de um polipeptídeo de ligação a CD123 descrito no presente documento compreende: (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende LCDR1, LCDR2, e LCDR3, e (ii) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende HCDR1, HCDR2, e HCDR3, em que (a) o LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tem as sequências de aminoácidos estabelecidas na SEQ ID NOs: 182, 183 e 184, respectivamente, e um HCDR1, HCDR2, e
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HCDR3 tem as sequências de aminoácidos estabelecidas na SEQ ID NOs: 185, 186 e 187, respectivamente; ou (b) um LCDR1, LCDR2 e LCDR3 tem as sequências de aminoácidos estabelecidas na SEQ ID NOs: 188, 189 e 190, respectivamente, e um HCDR1, HCDR2, e HCDR3 tem as sequências de aminoácidos estabelecidas na SEQ ID NOs: 191, 192 e 193, respectivamente. Em alguns aspectos, os segundos domínios de ligação que compreendem as sequências de CDR citadas neste parágrafo são humanizadas.
[0139] Em algumas modalidades de uma proteína de ligação de CD123 que compreende um segundo domínio de ligação que se liga especificamente a CD3s, o segundo domínio de ligação compete pela ligação a CD3s com o anticorpo monoclonal de CRIS-7, HuM291 ou I2C. Em determinadas variações, o domínio de ligação a CD3 compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) derivada do anticorpo monoclonal de CRIS-7, HuM291 ou I2C (por exemplo, a VL e a VH do segundo domínio de ligação podem ser regiões variáveis humanizadas que compreendem, respectivamente, as CDRs de cadeia leve e as CDRs de cadeia pesada do anticorpo monoclonal). Um segundo domínio de ligação pode compreender a região variável de cadeia leve, a região variável de cadeia pesada, ou ambas, dos domínios de ligação a CD3 de DRA222, TSC455, ou TSC456. As sequências de aminoácidos de DRA222, TSC455, e TSC456 são fornecidas na Tabela 3. Os domínios de ligação de DRA222 também são descritos no documento WO 2013/158856. TSC455 também pode ser denominado como TSC394 F87Y. TSC455 também pode ser denominado como TSC394 E86D F87Y ou TSC394 DY. Em algumas modalidades, o segundo domínio de ligação se liga especificamente a CD3 e compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina; em que a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica,
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70/236 pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos na SEQ ID NO:157; ou pelo menos cerca de 94% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos na SEQ ID NO:158; e em que a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 82% idêntica, pelo menos cerca de 85% idêntica, pelo menos cerca de 87% idêntica, pelo menos cerca de 90% idêntica, pelo menos cerca de 92% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos na SEQ ID NO:159. Em algumas modalidades, um polipeptídeo ou proteína de ligação a CD123 que compreende ainda um domínio de ligação a CD3 pode ter um nível baixo de agregados de alto peso molecular produzido durante a expressão recombinante do polipeptídeo ou da proteína. Um polipeptídeo ou proteína de ligação a CD123 que compreende ainda um domínio de ligação a CD3 pode exibir uma estabilidade relativamente longa em soro humano, dependendo do domínio de ligação a CD3 presente no polipeptídeo ou na proteína.
[0140] Em determinadas variações, o segundo domínio de ligação de um polipeptídeo de ligação a CD123 descrito no presente documento é um domínio de ligação a CD3 e compreende uma ou mais das sequências de ligação a CD3 (por exemplo, CDRs ou regiões variáveis) reveladas nos documentos US 2013/0129730, US 2011/0293619, US 7.635.472, WO 2010/037836, WO 2004/106381, ou WO 2011/121110; cada um incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, um domínio de ligação a CD3 compreende uma ou mais das seguintes sequências:
LCDR1 LCDR2 LCDR3
GSSTGAVTSGYYPN GTKFLAP ALWYSNRWV
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(SEQ ID NO:289) (SEQ ID NO:292) (SEQ ID NO:295)
RSSTGAVTSGYYPN (SEQ ID NO:290) ATDMRPS (SEQ ID NO:293) ALWYSNRWV (SEQ ID NO:296)
GSSTGAVTSGNYPN (SEQ ID NO:291) GTKFLAP (SEQ ID NO:294) VLWYSNRWV (SEQ ID NO:297)
[0141] Em várias modalidades, um domínio de ligação a CD3 compreende uma ou mais das seguintes sequências:
HCDR1 HCDR2 HCDR3
IYAMN (SEQ ID NO:298) RIRSKYNNYATYYADSV KS (SEQ ID NO:301) HGNFGNSYVSFFAY (SEQ ID NO:304)
KYAMN (SEQ ID NO:299) RIRSKYNNYATYYADSV KD (SEQ ID NO:302) HGNFGNSYISYWAY (SEQ ID NO:305)
SYAMN (SEQ ID NQ:300) RIRSKYNNYATYYADSV KG (SEQ ID NO:303) HGNFGNSYLSFWAY (SEQ ID NO:306)
[0142] Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de ligação a CD123 usado nos métodos e composições descritos no presente documento é uma molécula de cadeia única biespecífica que compreende um domínio de ligação a CD123 e um domínio de ligação a CD3. Em algumas modalidades, um domínio de ligação a CD123 e/ou a CD3 é derivado de um anticorpo e compreende uma cadeia pesada variável (VH) e uma cadeia leve variável (VL). Por exemplo, um scFv compreende uma VH e VL. Estes domínios de ligação e cadeias variáveis podem ser dispostos em qualquer
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72/236 ordem que ainda retenha alguma ligação ao alvo (ou alvos). Por exemplo, os domínios variáveis podem ser dispostos na ordem como VH CD123-VL CD123VH CD3-VL CD3; VL CD123-VH CD123-VH CD3-VL CD3; VH CD123-VL CD123-VL CD3-VH CD3; VL CD123-VH CD123-VL CD3-VH CD3; VH CD3-VL CD3-VH CD123-VL CD123; VL CD3-VH CD3-VL CD123-VH CD123; VH CD3VL CD3-VL CD123-VH CD123; ou VL CD3-VH CD3-VH CD123-VL CD123. Os pares de regiões VH e regiões VL no domínio de ligação que se liga a CD3 podem estar no formato de um anticorpo de única cadeia (scFv). As regiões de VH e VL podem ser dispostas na ordem VH-VL ou VL-VH. Em algumas modalidades, o scFv pode se ligar a CD123 mais eficientemente que o anticorpo que compreende as mesmas sequências de região de VH e VL na mesma orientação. Em determinadas modalidades, o scFv pode se ligar mais eficientemente a CD123 na orientação VL-VH do que na orientação VH-VL, ou vice-versa (vide, por exemplo, Exemplo 2). A região de VH pode ser posicionada de modo N-terminal em relação à sequência de ligante. A região de VL pode ser posicionada de modo C-terminal em relação à sequência de ligante. A disposição do domínio no domínio de ligação a CD3 da molécula de cadeia única biespecífica pode ser VH-VL, com o referido domínio de ligação a CD3 localizado de modo C-terminal em relação ao domínio de ligação a CD123. Uma molécula biespecífica pode compreender uma ligação de scFv a CD123 ligado a um scFv que se liga a CD3. Estes scFvs podem ser ligados com um peptídeo curto. Em algumas modalidades, as moléculas de cadeia única biespecífica não compreendem uma região de dobradiça ou uma região constante (consulte, por exemplo, US 2013/0295121, WO 2010/037836, WO 2004/106381 e WO 2011/121110; cada uma incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade).
[0143] Em algumas modalidades, um domínio de ligação é um fragmento Fv de cadeia única (scFv) que compreende regiões VH e VL específicas para um alvo de interesse. Em determinadas modalidades, as regiões de VH e VL são humanas ou humanizadas.
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73/236 [0144] Em algumas variações, um domínio de ligação é um Fv de cadeia única (scFv) que compreende regiões de VL e VH de imunoglobulina unidas por um ligante de peptídeo. O uso de ligantes de peptídeo para unir as regiões de VL e VH é bem conhecido na técnica, e um grande número de publicações existe dentro deste campo específico. Em algumas modalidades, um ligante de peptídeo é um 15mer que consiste em três repetições de uma sequência de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Gly-Ser ((Gly4Ser)3) (SEQ ID NO:213). Outros ligantes foram usados e a tecnologia de exibição de fago, assim como tecnologia de fago infeccioso seletivo, foi usada para diversificar e selecionar as sequências de ligante adequadas (Tang et al., J. Biol. Chem. 271, 15682-15686, 1996; Hennecke et al., Protein Eng. 11,405410, 1998). Em determinadas modalidades, as regiões de VL e VH são unidas por um ligante de peptídeo que tem uma sequência de aminoácidos que compreende a fórmula (Gly4Ser)n, em que n = 1-5 (SEQ ID NO:214). Outros ligantes adequados podem ser obtidos otimizando-se um simples ligante (por exemplo, (Gly4Ser)n) (SEQ ID NO: 315) através de mutagênese aleatória.
[0145] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de ligação a CD123 compreende, na ordem da terminação amino a terminação carboxila (ou na ordem de terminação carboxila a terminação amino), (i) o domínio de ligação a CD123, (ii) uma região de dobradiça, (iii) uma região constante de imunoglobulina, (iv) um ligante de terminação carboxila (ou um ligante de terminação amino), e (ν) o segundo domínio de ligação. Conforme usado no presente documento no contexto de um construto de polipeptídeo que compreende um primeiro domínio de ligação e um segundo domínio de ligação, uma “região de dobradiça” ou uma “dobradiça” se refere a uma região de polipeptídeo entre o primeiro domínio de ligação e a região de Fc. Um “ligante de terminação carboxila” ou “um ligante de terminação amino” se refere a uma região de polipeptídeo entre a região de Fc e o segundo domínio de ligação. Em algumas modalidades, um ligante de terminação carboxila (ou um ligante de terminação amino) compreende ou consiste na SEQ ID NO:248. Em
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74/236 determinadas modalidades, uma dobradiça é uma região de dobradiça de imunoglobulina humana do tipo selvagem. Em determinadas outras modalidades, um ou mais resíduos de aminoácido podem ser adicionados na terminação amino ou carboxila de uma região de dobradiça de imunoglobulina do tipo selvagem como parte de um projeto de construto de proteína de fusão. Por exemplo, os resíduos de aminoácido de junção adicionais na terminação amino de dobradiça podem ser “RT”, “RSS”, “TG” ou “T”, ou na terminação carboxila de dobradiça pode ser “SG”, ou uma deleção de dobradiça pode ser combinada com uma adição, como ΔΡ com “SG” adicionado na terminação carboxila.
[0146] Em determinadas modalidades, uma dobradiça, um ligante de terminação carboxila ou um ligante de terminação amino é uma dobradiça de imunoglobulina alterada em que um ou mais resíduos de citosina numa região de dobradiça de imunoglobulina do tipo selvagem é substituído por um ou mais outros resíduos de aminoácido (por exemplo, serina ou alanina).
[0147] As dobradiças de imunoglobulina alteradas exemplificativas, ligantes de terminação carboxila, e ligantes de terminação amino incluem uma região de dobradiça de imunoglobulina humana lgG1 que tem um, dois ou três resíduos de cisteína encontrados numa dobradiça de IgG 1 humana do tipo selvagem substituída por um, dois ou três resíduos de aminoácido diferentes (por exemplo, serina ou alanina). Uma dobradiça de imunoglobulina alterada pode ter adicionalmente uma prolina substituída por um outro aminoácido (por exemplo, serina ou alanina). Por exemplo, a dobradiça de lgG1 humana alterada descrita acima pode ter adicionalmente uma prolina localizada na terminação carboxila em relação às três cisteínas da região de dobradiça de lgG1 humana do tipo selvagem substituída por um outro resíduo de aminoácido (por exemplo, serina, alanina). Numa modalidade, as prolinas da região de dobradiça principal não são substituídas.
[0148] Em determinadas modalidades, uma
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75/236 dobradiça, um ligante de terminação carboxila ou um polipeptídeo de ligante de terminação amino compreende ou é uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica a uma região de dobradiça de imunoglobulina do tipo selvagem, como uma dobradiça de lgG1 humana do tipo selvagem, uma dobradiça de lgG2 humana do tipo selvagem ou uma dobradiça de lgG4 humana do tipo selvagem.
[0149] Em modalidades adicionais, uma dobradiça, um ligante de terminação carboxila ou um ligante de terminação amino presente num polipeptídeo de ligação a CD123 pode ser uma dobradiça que não se baseia ou é derivada de uma dobradiça de imunoglobulina (isto é, não uma dobradiça de imunoglobulina do tipo selvagem ou uma dobradiça de imunoglobulina alterada). Exemplos para tais dobradiças e ligantes de terminação carboxila incluem peptídeos de cerca de cinco a cerca de 150 aminoácidos derivados de uma região interdomínio de uma proteína de transmembrana ou região de caule de uma C-lectina do tipo II, por exemplo, peptídeos de cerca de oito a 25 aminoácidos e peptídeos de cerca de sete a 18 aminoácidos. Numa outra modalidade, um ligante de terminação carboxila ou ligante de terminação amino compreende uma repetição (Gly4Ser) (SEQ ID NO: 315) como (Gly4Ser)3PS (SEQ ID NO: 316).
[0150] Em determinadas modalidades, as sequências de dobradiça, ligante de terminação carboxila e ligante de terminação amino têm cerca de 5 a 150 aminoácidos, 5 a 10 aminoácidos, 10 a 20 aminoácidos, 20 a 30 aminoácidos, 30 a 40 aminoácidos, 40 a 50 aminoácidos, 50 a 60 aminoácidos, 5 a 60 aminoácidos, 5 a 40 aminoácidos, 8 a 20 aminoácidos ou 10 a 15 aminoácidos. A dobradiça ou o ligante pode ser principalmente flexível, mas também pode fornecer características mais rígidas
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76/236 ou pode conter estrutura principalmente a-helicoidal com estrutura de lâmina β mínima. Os comprimentos ou as sequências das dobradiças e ligantes podem afetar as afinidades de ligação dos domínios de ligação aos quais as dobradiças são direta ou indiretamente (por meio de uma outra região ou domínio, como um domínio de heterodimerização) conectadas assim como uma ou mais atividades das porções de região de Fc às quais as dobradiças ou os ligantes são direta ou indiretamente conectados.
[0151] Em determinadas modalidades, as sequências de dobradiça, de ligante de terminação carboxila e de ligante de terminação amino são estáveis em plasma e soro e são resistentes à divagem proteolítica. A primeira lisina na região de dobradiça superior de IgG 1 pode ser mutada para minimizar a divagem proteolítica, por exemplo, a lisina pode ser substituída por metionina, treonina, alanina ou glicina, ou é deletada.
[0152] Em algumas modalidades da divulgação, um polipeptídeo de ligação a CD123 é capaz de formar um heterodímero com uma segunda cadeia de polipeptídeo e compreende uma região de dobradiça (a) imediatamente, terminação amino a uma região constante de imunoglobulina (por exemplo, terminação amino para um domínio de CH2 em que a região constante de imunoglobulina inclui domínios de CH2 e CH3, ou terminação amino para um domínio de CH3 em que as sub-regiões de imunoglobulina incluem domínios de CH3 e CH4), (b) interpostos entre e conectando um domínio de ligação (por exemplo, scFv) e um domínio de heterodimerização de imunoglobulina, (c) interpostos entre e conectando um domínio de heterodimerização de imunoglobulina e uma região constante de imunoglobulina (por exemplo, em que a região constante de imunoglobulina inclui domínios de CH2 e CH3 ou domínios de CH3 e CH4), (d) interpostos entre e conectando uma região constante de imunoglobulina e um domínio de ligação, (e) na terminação amino de uma cadeia de polipeptídeo, ou (f) na terminação carboxila de uma cadeia de polipeptídeo. Uma cadeia de polipeptídeo que compreende uma região de dobradiça conforme descrito no
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77/236 presente documento será capaz de se associar a uma cadeia de polipeptídeo diferente para formar uma proteína heterodimérica fornecida no presente documento, e o heterodímero formado conterá um domínio de ligação que retém sua especificidade-alvo ou sua afinidade de ligação a alvo específica.
[0153] Algumas sequências de dobradiça, de ligante de terminação carboxila e de ligante de terminação amino exemplificativas adequadas para uso de acordo com a presente divulgação são mostradas nas Tabelas 1 e 2 abaixo. As regiões de dobradiça e ligante exemplificativas adicionais são estabelecidas na SEQ ID NOs: 241-244, 601,78, 763-791,228, 379-434, 618-749 do documento US 2013/0129723 (as referidas sequências são incorporadas a título de referência no presente documento).
TABELA 1: DOBRADIÇAS E LIGANTES EXEMPLIFICATIVOS
Nome Sequência de Aminoácidos SEQ ID NO
Dobradiça sss(s)-hlgG1 de EPKSSDKTHTSPPSS SEQ ID NO:215
Dobradiça csc(s)-hlgG1 de EPKSCDKTHTSPPCS SEQ ID NO:216
Dobradiça ssc(s)-hlgG1 de EPKSSDKTHTSPPCS SEQ ID NO:217
Dobradiça scc(s)-hlgG1 de EPKSSDKTHTCPPCS SEQ ID NO:218
Dobradiça css(s)-hlgG1 de EPKSCDKTHTSPPSS SEQ ID NO:219
Dobradiça scs(s)-hlgG1 de EPKSSDKTHTCPPSS SEQ ID NQ:220
Dobradiça de EPKSCDKTHTSPPCS SEQ ID NO:221
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ccc(s)-hlgG1
Dobradiça ccc(p)-hlgG1 de EPKSCDKTHTSPPCP SEQ ID NO:222
Dobradiça sss(p)-hlgG1 de EPKSSDKTHTSPPSP SEQ ID NO:223
Dobradiça csc(p)-hlgG1 de EPKSCDKTHTSPPCP SEQ ID NO:224
Dobradiça ssc(p)-hlgG1 de EPKSSDKTHTSPPCP SEQ ID NO:225
Dobradiça scc(p)-hlgG1 de EPKSSDKTHTCPPCP SEQ ID NO:226
Dobradiça css(p)-hlgG1 de EPKSCDKTHTSPPSP SEQ ID NO:227
Dobradiça scs(p)-hlgG1 de EPKSSDKTHTCPPSP SEQ ID NO:228
Scppcp SCPPCP SEQ ID NO:229
STD1 NYGGGGSGGGGSGGGGSGNS SEQ ID NQ:230
STD2 NYGGGGSGGGGSGGGGSGNY GGGGSGGGGSGGGGSGNS SEQ ID NO:231
H1 NS SEQ ID NO:232
H2 GGGGSGNS SEQ ID NO:233
H3 NYGGGGSGNS SEQ ID NO:234
H4 GGGGSGGGGSGNS SEQ ID NO:235
H5 NYGGGGSGGGGSGNS SEQ ID NO:236
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H6 GGGGSGGGGSGGGGSGNS SEQ ID NO:237
H7 GCPPCPNS SEQ ID NO:238
(G4S)3 GGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO:239
H105 SGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO:240
(G4S)4 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO:241
H75 (mutante quádruplo de NKG2A) QRHNNSSLNTGTQMAGHSPNS SEQ ID NO:242
H83 (derivado de NKG2A) SSLNTGTQMAGHSPNS SEQ ID NO:243
H106 (derivado de NKG2A) QRHNNSSLNTGTQMAGHS SEQ ID NO:244
H81 (derivado de NKG2D) EVQIPLTESYSPNS SEQ ID NO:245
H91 (derivado de NKG2D) NSLANQEVQIPLTESYSPNS SEQ ID NO:246
H94 SGGGGSGGGGSGGGGSPNS SEQ ID NO:247
H111 SGGGGSGGGGSGGGGSPGS SEQ ID NO:248
H114 GGGGSGGGGSGGGGSPS SEQ ID NO:288
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TABELA 2: DOBRADIÇAS E LIGANTES EXEMPLIFICATIVOS (DERIVADOS DA DOBRADIÇA DE H7, REGIÃO DE TALO DE UMA CLECTINA DO TIPO II, OU REGIÃO INTERDOMÍNIO DE UMA PROTEÍNA DE
TRANSMEMBRANA DO TIPO I)
Nome Sequência de Aminoácidos Molécula e/ou SEQ IP NO
dobradiça da
qual se
derivaram
H16 LSVKADFLTPSIGNS CD80 SEQ ID NO:249
H17 LSVKADFLTPSISCPPCPNS CD80 + H7 SEQ ID NQ:250
H18 LSVLANFSQPEIGNS CD86 SEQ ID NO:251
H19 LSVLANFSQPEISCPPCPNS CD86 + H7 SEQ ID NO:252
H20 LKIQERVSKPKISNS CD2 SEQ ID NO:253
H21 LKIQERVSKPKISCPPCPNS CD2 + H7 SEQ ID NO:254
H22 LNVSERPFPPHIQNS CD22 SEQ ID NO:255
H23 LDVSERPFPPHIQSCPPCPNS CD22 + H7 SEQ ID NO:256
H24 REQLAEVTLSLKANS CD80 SEQ ID NO:257
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H25 REQLAEVTLSLKACPPCPNS CD80 + H7 SEQ ID NO:258
H26 RIHQMNSELSVLANS CD86 SEQ ID NO:259
H27 RIHQMNSELSVLACPPCPNS CD86 + H7 SEQ ID NO:260
H28 DTKGKNVLEKIFSNS CD2 SEQ ID NO:261
H30 LPPETQESQEVTLNS CD22 SEQ ID NO:262
H32 RIHLNVSERPFPPNS CD22 SEQ ID NO:263
H33 RIHLNVSERPFPPCPPCPNS CD22 + H7 SEQ ID NO:264
H36 GCPPCPGGGGSNS H7 SEQ ID NO:265
H40 GCPPCPANS H7 SEQ ID NO:266
H41 GCPPCPANS H7 SEQ ID NO:267
H42 GCPPCPNS H7 SEQ ID NO:268
H44 GGGASCPPCPGNS H7 SEQ ID NO:269
H45 GGGASCPPCAGNS H7 SEQ ID
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NO:270
H46 GGGASCPPCANS H7 SEQ NO:271 ID
H47 LSVKADFLTPSIGNS CD80 SEQ NO:272 ID
H48 ADFLTPSIGNS CD80 SEQ NO:273 ID
H50 LSVLANFSQPEIGNS CD86 SEQ NO:274 ID
H51 LSVLANFSQPEIGNS CD86 SEQ NO:275 ID
H52 SQPEIVPISNS CD86 SEQ NO:276 ID
H53 SQPEIVPISCPPCPNS CD86 + H7 SEQ NO:277 ID
H54 SVLANFSQPEISCPPCPNS CD86 + H7 SEQ NO:278 ID
H55 RIHQMNSELSVLANS CD86 SEQ NO:279 ID
H56 QMNSELSVLANS CD86 SEQ NQ:280 ID
H57 VSERPFPPNS CD22 SEQ NO:281 ID
H58 KPFFTCGSADTCPNS CD72 SEQ NO:282 ID
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H59 KPFFTCGSADTCPNS CD72 SEQ NO:283 ID
H60 QYNCPGQYTFSMPNS CD69 SEQ NO:284 ID
H61 EPAFTPGPNIELQKDSDCPNS CD94 SEQ NO:285 ID
H62 QRHNNSSLNTRTQKARHCPNS NKG2A SEQ NO:286 ID
H63 NSLFNQEVQIPLTESYCPNS NKG2D SEQ NO:287 ID
[0154] Conforme indicado no presente documento, em determinadas modalidades, os polipeptídeos da presente divulgação compreendem uma região constante de imunoglobulina (também denominadas como uma região constante) numa cadeia de polipeptídeo. A inclusão de uma região constante de imunoglobulina mostra a folga das proteínas homodiméricas e heterodiméricas formadas de duas cadeias de polipeptídeo de ligação a CD123 a partir da circulação após administração a um indivíduo. Por meio de mutações ou outras alterações, uma região constante de imunoglobulina possibilita ainda mais a modulação relativamente fácil de funções efetoras de polipeptídeo dimérico (por exemplo, ADCC, ADCP, CDC, fixação de complemento, e ligação aos receptores de Fc), que podem ser aumentados ou diminuídos dependendo da doença que é tratada, conforme conhecido na técnica e descrito no presente documento. Em determinadas modalidades, uma região constante de imunoglobulina de uma ou ambas as cadeias de polipeptídeo dos homodímeros e heterodímeros de polipeptídeo da presente divulgação serão capazes de mediar uma ou mais destas funções efetoras. Em outras modalidades, uma ou mais destas funções efetoras são
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84/236 reduzidas ou estão ausentes numa região constante de imunoglobulina de uma ou ambas as cadeias de polipeptídeo dos homodímeros e heterodímeros de polipeptídeo da presente divulgação, em comparação com uma região constante de imunoglobulina do tipo selvagem correspondente. Por exemplo, para polipeptídeos de ligação a CD123 diméricos projetados para elicitar RTCC, como, por exemplo, por meio da inclusão de um domínio de ligação a CD3, uma região constante de imunoglobulina pode ter função efetora reduzida ou nenhuma função em relação a uma região constante de imunoglobulina do tipo selvagem correspondente.
[0155] Uma região constante de imunoglobulina presente em polipeptídeos da presente divulgação pode compreender ou é derivada de parte ou todos dentre: um domínio de CH2, um domínio de CH3, um domínio de CH4, ou qualquer combinação dos mesmos. Por exemplo, uma região constante de imunoglobulina pode compreender um domínio de CH2, um domínio de CH3, ambos os domínios de CH2 e CH3, ambos os domínios de CH3 e CH4, dois domínios de CH3, um domínio de CH4, dois domínios de CH4 e um domínio de CH2 e parte de um domínio de CH3.
[0156] Um domínio de CH2 que pode formar uma região constante de imunoglobulina de um polipeptídeo da presente divulgação pode ser um domínio de CH2 de imunoglobulina do tipo selvagem ou um domínio de CH2 de imunoglobulina alterado do mesmo de determinadas classes ou subclasses da imunoglobulina (por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, lgA2 ou IgD) e de várias espécies (incluindo ser humano, camundongo, rato e outros mamíferos).
[0157] Em determinadas modalidades, um domínio de CH2 é um domínio de CH2 de imunoglobulina humana do tipo selvagem, como domínios de CH2 do tipo selvagem de lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, lgA2 ou IgD humana, conforme estabelecida na SEQ ID NOS:115, 199-201 e 195-197, respectivamente, do documento US 2013/0129723 (as referidas sequências incorporadas a título de referência no presente documento). Em
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85/236 determinadas modalidades, o domínio de CH2 é um domínio de CH2 de lgG1 humana do tipo selvagem conforme estabelecida na SEQ ID NO:115 do documento US 2013/0129723 (a referida sequência incorporada a título de referência no presente documento).
[0158] Em determinadas modalidades, um domínio de CH2 é uma região de CH2 de imunoglobulina alterada (por exemplo, um domínio de CH2 de lgG1 humana alterada) que compreende uma substituição de aminoácido na asparagina da posição 297 (por exemplo, asparagina para alanina). Tal substituição de aminoácido reduz ou elimina a glicosilação neste sítio e revoga a ligação de Fc eficaz a FcyR e C1q. A sequência de um domínio de CH2 de lgG1 humana alterada com uma substituição de Asn para Ala na posição 297 é estabelecida na SEQ ID NO:324 do documento US 2013/0129723 (referida sequência incorporada a título de referência no presente documento).
[0159] Em determinadas modalidades, um domínio de CH2 é uma região de CH2 de imunoglobulina alterada (por exemplo, um domínio de CH2 de lgG1 humana alterada) que compreende pelo menos uma substituição ou deleção nas posições 234 a 238. Por exemplo, uma região de CH2 de imunoglobulina pode compreender uma substituição na posição 234, 235, 236, 237 ou 238, posições 234 e 235, posições 234 e 236, posições 234 e 237, posições 234 e 238, posições 234 a 236, posições 234, 235 e 237, posições 234, 236 e 238, posições 234, 235, 237, e 238, posições 236 a 238, ou qualquer outra combinação de dois, três, quatro ou cinco aminoácidos nas posições 234 a 238. Adicional ou alternativamente, uma região de CH2 alterada pode compreender uma ou mais (por exemplo, duas, três, quatro ou cinco) deleções de aminoácido nas posições 234 a 238, por exemplo, numa dentre a posição 236 ou posição 237 enquanto a outra posição é substituída. A mutação (ou mutações) notada acima diminui ou elimina a atividade de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) ou capacidade de ligação a receptor de Fc de um heterodímero de polipeptídeo
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86/236 que compreende o domínio de CH2 alterado. Em determinadas modalidades, os resíduos de aminoácido numa ou mais das posições 234 a 238 foram substituídos por um ou mais resíduos de alanina. Em modalidades adicionais, apenas um dos resíduos de aminoácido nas posições 234 a 238 foi deletado enquanto um ou mais dos aminoácidos restantes nas posições 234 a 238 podem ser substituídos por um outro aminoácido (por exemplo, alanina ou serina).
[0160] Em determinadas outras modalidades, um domínio de CH2 é uma região de CH2 de imunoglobulina alterada (por exemplo, um domínio de CH2 de lgG1 humana alterada) que compreende uma ou mais substituições de aminoácido nas posições 253, 310, 318, 320, 322 e 331. Por exemplo, uma região de CH2 de imunoglobulina pode compreender uma substituição na posição 253, 310, 318, 320, 322, ou 331, posições 318 e 320, posições 318 e 322, posições 318, 320 e 322, ou qualquer outra combinação de dois, três, quatro, cinco ou seis aminoácidos nas posições 253, 310, 318, 320, 322 e 331. A mutação (ou mutações) notada acima diminui ou elimina a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) de um heterodímero de polipeptídeo que compreende o domínio de CH2 alterado.
[0161] Em determinadas outras modalidades, além da substituição de aminoácido na posição 297, uma região de CH2 alterada (por exemplo, um domínio de CH2 de lgG1 humana alterada) pode compreender ainda uma ou mais (por exemplo, duas, três, quatro ou cinco) substituições adicionais nas posições 234 a 238. Por exemplo, uma região de CH2 de imunoglobulina pode compreender uma substituição nas posições 234 e 297, posições 234, 235, e 297, posições 234, 236 e 297, posições 234 a 236 e 297, posições 234, 235, 237 e 297, posições 234, 236, 238 e 297, posições 234, 235, 237, 238 e 297, posições 236 a 238 e 297, ou qualquer combinação de dois, três, quatro ou cinco aminoácidos nas posições 234 a 238 além da posição 297. Adicional ou alternativamente, uma região de CH2 alterada pode compreender um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro ou cinco) deleções
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87/236 de aminoácido nas posições 234 a 238, como na posição 236 ou posição 237. A mutação (ou mutações) adicional diminui ou elimina a atividade de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) ou capacidade de ligação a receptor de Fc de um heterodímero de polipeptídeo que compreende o domínio de CH2 alterado. Em determinadas modalidades, os resíduos de aminoácido numa ou mais das posições 234 a 238 foram substituídos por um ou mais resíduos de alanina. Em modalidades adicionais, apenas um dos resíduos de aminoácido nas posições 234 a 238 foi deletado enquanto um ou mais dos aminoácidos restantes nas posições 234 a 238 pode ser substituído por um outro aminoácido (por exemplo, alanina ou serina).
[0162] Em determinadas modalidades, além de um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4 ou 5) substituições de aminoácido nas posições 234 a 238, uma região de CH2 mutada (por exemplo, um domínio de CH2 de lgG1 humana alterada) numa proteína de fusão da presente divulgação pode conter um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou 6) substituições adicionais de aminoácido (por exemplo, substituída por alanina) numa ou mais posições envolvidas na fixação de complemento (por exemplo, nas posições I253, H310, E318, K320, K322 ou P331). Exemplos de regiões de CH2 de imunoglobulina mutadas incluem regiões de CH2 de lgG1, lgG2, lgG4 humana e lgG2a de camundongo com substituições de alanina nas posições 234, 235, 237 (caso presente), 318, 320 e 322. Uma região de CH2 de imunoglobulina mutada exemplificativa é região de CH2 de IGHG2c de camundongo com substituições de alanina em L234, L235, G237, E318, K320 e K322.
[0163] Em ainda mais modalidades, além da substituição de aminoácido na posição 297 e da deleção (ou deleções) ou substituição (ou substituições) adicional nas posições 234 a 238, uma região de CH2 alterada (por exemplo, um domínio de CH2 de lgG1 humana alterada) pode compreender ainda uma ou mais (por exemplo, duas, três, quatro, cinco ou seis) substituições adicionais nas posições 253, 310, 318, 320, 322 e 331. Por exemplo, uma região de CH2 de imunoglobulina pode compreender uma
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88/236 (1) substituição na posição 297, (2) uma ou mais substituições ou deleções ou uma combinação das mesmas nas posições 234 a 238, e um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou 6) substituições de aminoácido nas posições I253, H310, E318, K320, K322 e P331, como uma, duas, três substituições nas posições E318, K320 e K322. Os aminoácidos nas posições notadas acima podem ser substituídas por alanina ou serina.
[0164] Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de região de CH2 de imunoglobulina compreende: (i) uma substituição de aminoácido nas asparaginas da posição 297 e uma substituição de aminoácido na posição 234, 235, 236 ou 237; (ii) uma substituição de aminoácido na asparagina da posição 297 e substituições de aminoácido em duas das posições 234 a 237; (iii) uma substituição de aminoácido na asparagina da posição 297 e substituições de aminoácido em três das posições 234 a 237; (iv) uma substituição de aminoácido na asparagina da posição 297, substituições de aminoácido nas posições 234, 235 e 237, e uma deleção de aminoácido na posição 236; (v) substituições de aminoácido em três das posições 234 a 237 e substituições de aminoácido nas posições 318, 320 e 322; ou (vi) substituições de aminoácido em três das posições 234 a 237, uma deleção de aminoácido na posição 236, e substituições de aminoácido nas posições 318, 320 e 322.
[0165] As regiões de CH2 de imunoglobulina alterada com substituições de aminoácido na asparagina da posição 297 incluem: região de CH2 de lgG1 humana com substituições de alanina em L234, L235, G237 e N297 e uma deleção em G236 (SEQ ID NO:325 do documento US 2013/0129723, a referida sequência incorporada a título de referência no presente documento), região de CH2 de lgG2 humana com substituições de alanina em V234, G236, e N297 (SEQ ID NO:326 do documento US 2013/0129723, a referida sequência incorporada a título de referência no presente documento), região de CH2 de lgG4 humana com substituições de alanina em F234, L235, G237 e N297 e uma deleção de G236
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89/236 (SEQ ID NO:322 do documento US 2013/0129723, a referida sequência incorporada a título de referência no presente documento), região de CH2 de lgG4 humana com substituições de alanina em F234 e N297 (SEQ ID NO:343 do documento US 2013/0129723, a referida sequência incorporada a título de referência no presente documento), região de CH2 de lgG4 humana com substituições de alanina em L235 e N297 (SEQ ID NO:344 do documento US 2013/0129723, a referida sequência incorporada a título de referência no presente documento), região de CH2 de lgG4 humana com substituições de alanina em G236 e N297 (SEQ ID NO:345 do documento US 2013/0129723, a referida sequência incorporada a título de referência no presente documento), e região de CH2 de lgG4 humana com substituições de alanina em G237 e N297 (SEQ ID NO:346 do documento US 2013/0129723, a referida sequência incorporada a título de referência no presente documento).
[0166] Em determinadas modalidades, além das substituições de aminoácido descritas acima, uma região de CH2 alterada (por exemplo, um domínio de CH2 de lgG1 humana alterada) pode conter uma ou mais substituições de aminoácido adicionais numa ou mais posições além das posições notadas acima. Tais substituições de aminoácido podem ser substituições de aminoácido conservativas ou não conservativas. Por exemplo, em determinadas modalidades, P233 pode ser alterado para E233 numa região de CH2 de lgG2 alterada (consulte, por exemplo, SEQ ID NO:326 do documento US 2013/0129723, a referida sequência incorporada a título de referência no presente documento). Adicional ou alternativamente, em determinadas modalidades, a região de CH2 alterada pode conter uma ou mais inserções, deleções de aminoácido, ou ambas. A inserção (ou inserções), deleção (ou deleções) ou substituição (ou substituições) pode ser em qualquer lugar numa região de CH2de imunoglobulina, como na terminação N ou C de uma região de CH2 de imunoglobulina do tipo selvagem que resulta da ligação da região de CH2 com uma outra região (por exemplo, um domínio de ligação ou um domínio de heterodimerização de imunoglobulina) por meio de uma
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90/236 dobradiça.
[0167] Em determinadas modalidades, uma região de CH2 alterada num polipeptídeo da presente divulgação compreende ou é uma sequência que é pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idêntica to a região de CH2 de imunoglobulina do tipo selvagem, como a região de CH2 da lgG1, lgG2 ou lgG4 humana do tipo selvagem, ou lgG2a de camundongo (por exemplo, IGHG2c).
[0168] Uma região de CH2 de imunoglobulina alterada num polipeptídeo de ligação a CD123 da presente divulgação pode ser derivado de uma região de CH2 de vários isotipos de imunoglobulina, como lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, lgA2 e IgD, de várias espécies (incluindo ser humano, camundongo, rato e outros mamíferos). Em determinadas modalidades, uma região de CH2 de imunoglobulina alterada numa proteína de fusão da presente divulgação pode ser derivada de uma região de CH2 de IgG 1, lgG2 ou lgG4 humana ou lgG2a de camundongo (por exemplo, IGHG2c), cujas sequências são estabelecidas na SEQ ID NOS:115, 199, 201 e 320 do documento US 2013/0129723 (as referidas sequências incorporadas a título de referência no presente documento).
[0169] Em determinadas modalidades, um domínio de CH2 alterado é um domínio de CH2 de lgG1 humana com substituições de alanina nas posições 235, 318, 320 e 322 (isto é, um domínio de CH2 de lgG1 humana com substituições de L235A, E318A, K320A e K322A) (SEQ ID NO:595 do documento US 2013/0129723, a referida sequência incorporada a título de referência no presente documento), e opcionalmente uma mutação de N297 (por exemplo, para alanina). Em determinadas outras modalidades, um domínio de CH2 alterado é um domínio de CH2 de lgG1 humana com substituições de alanina nas posições 234, 235, 237, 318, 320 e 322 (isto é, um domínio de CH2 de lgG1 humana com substituições de L234A, L235A, G237A,
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E318A, K320A e K322A) (SEQ ID NO:596 do documento US 2013/0129723, a referida sequência incorporada a título de referência no presente documento), e opcionalmente uma mutação de N297 (por exemplo, para alanina).
[0170] Em determinadas modalidades, um domínio de CH2 alterado é um domínio de CH2 de lgG1 humana alterada com mutações conhecidas na técnica que intensificam as atividades imunológicas como ADCC, ADCP, CDC, fixação de complemento, ligação de receptor de Fc, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0171] O domínio de CH3 que pode formar uma região constante de imunoglobulina de um polipeptídeo da presente divulgação pode ser um domínio de CH3 de imunoglobulina do tipo selvagem ou um domínio de CH3 de imunoglobulina alterado do mesmo de determinadas classes ou subclasses de imunoglobulina (por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, lgA2, IgD, IgE, IgM) de várias espécies (incluindo ser humano, camundongo, rato e outros mamíferos). Em determinadas modalidades, um domínio de CH3 é um domínio de CH3 de imunoglobulina humana do tipo selvagem, como domínios de CH3 do tipo selvagem de IgG 1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, lgA2, IgD, IgE ou IgM humana conforme estabelecida na SEQ ID NOS:116, 208 a 210, 204 a 207 e 212, respectivamente, do documento US 2013/0129723 (as referidas sequências incorporadas a título de referência no presente documento). Em determinadas modalidades, o domínio de CH3 é um domínio de CH3 de lgG1 humana do tipo selvagem conforme estabelecida na SEQ ID NO:116 do documento US 2013/0129723 (a referida sequência incorporada a título de referência no presente documento). Em determinadas modalidades, um domínio de CH3 é um domínio de CH3 de imunoglobulina humana alterado, como um domínio de CH3 alterado com base ou derivado de um domínio de CH3 do tipo selvagem de anticorpos de IgG 1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, lgA2, IgD, IgE, ou IgM humana. Por exemplo, um domínio de CH3 alterado pode ser um domínio de CH3 de lgG1 humana com uma ou duas mutações nas posições H433 e N434 (as posições são numeradas de acordo
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92/236 com a numeração EU). As mutações em tais posições podem estar envolvidas na fixação de complemento. Em determinadas outras modalidades, um domínio de CH3 alterado pode ser um domínio de CH3 de lgG1 humana, mas com uma ou duas substituições de aminoácido na posição F405 ou Y407. Os aminoácidos em tais posições estão envolvidas na interação com um outro domínio de CH3. Em determinadas modalidades, um domínio de CH3 alterado pode ser um domínio de CH3 de lgG1 humana alterado com sua última lisina deletada. A sequência deste domínio de CH3 alterado é definida na SEQ ID NO:761 do documento US 2013/0129723 (a referida sequência incorporada a título de referência no presente documento).
[0172] Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de ligação a CD123 que formam um heterodímero de polipeptídeo compreende um par de CH3 que compreende as denominadas mutações “knobs-into-holes” (consulte, Marvin e Zhu, Acta Pharmacologica Sinica 26:649-58, 2005; Ridgway et al., Protein Engineering 9:617-21, 1996). Mais especificamente, as mutações podem ser introduzidas em cada um dos dois domínios de CH3 de cada cadeia de polipeptídeo para que a complementaridade estérica necessária para associação de CH3/CH3 obrigue estes dois domínios de CH3 a se emparelharem. Por exemplo, um domínio de CH3 num polipeptídeo de única cadeia de um heterodímero de polipeptídeo pode conter uma mutação de T366W (uma mutação “knob”, que substitui um aminoácido pequeno com um maior), e um domínio de CH3 no polipeptídeo de única cadeia do heterodímero de polipeptídeo pode conter uma mutação de Y407A (uma mutação “hole”, que substitui um aminoácido grande por um menor). Outras mutações knobs-into-holes exemplificativas incluem (1) uma mutação de T366Y num domínio de CH3 e uma Y407T no outro domínio de CH3, e (2) uma mutação de T366W num domínio de CH3 e T366S, mutações de L368A e Y407V no outro domínio de CH3.
[0173] O domínio de CH4 que pode formar uma região constante de imunoglobulina de polipeptídeos de ligação a CD123 da
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93/236 presente divulgação pode ser um domínio de CH4 de imunoglobulina do tipo selvagem ou um domínio de CH4 de imunoglobulina alterado do mesmo das moléculas de IgE ou IgM. Em determinadas modalidades, o domínio de CH4 é um domínio de CH4 de imunoglobulina humana do tipo selvagem, como domínios de CH4 do tipo selvagem de moléculas de IgE e IgM humanas conforme estabelecida na SEQ ID NOS:213 e 214, respectivamente, do documento US 2013/0129723 (as referidas sequências incorporadas a título de referência no presente documento). Em determinadas modalidades, um domínio de CH4 é um domínio de CH4 de imunoglobulina humana alterado, como um domínio de CH4 alterado com base ou derivado de um domínio de CH4 de moléculas de IgE ou IgM humana, que tem mutações que aumentam ou diminuem a atividade imunológica conhecida a ser associada a uma região de Fc de IgE ou IgM.
[0174] Em determinadas modalidades, uma região constante de imunoglobulina de polipeptídeos de ligação a CD123 da presente divulgação compreende uma combinação de domínios de CH2, CH3 ou CH4 (isto é, mais de um domínio de região constante selecionado dentre CH2, CH3 e CH4). Por exemplo, a região constante de imunoglobulina pode compreender domínios de CH2 e CH3 ou CH3 e domínios de CH4. Em determinadas outras modalidades, a região constante de imunoglobulina pode compreender dois domínios de CH3 e nenhum domínio de CH2 ou CH4 (isto é, apenas dois ou mais de CH3). Os múltiplos domínios de região constante que formam uma região constante de imunoglobulina podem se basear ou derivar da mesma molécula de imunoglobulina, ou das mesmas classes ou subclasses de moléculas de imunoglobulina. Em determinadas modalidades, a região constante de imunoglobulina é um CH2CH3 de IgG (por exemplo, CH2CH3 de lgG1, CH2CH3 de lgG2 e CH2CH3 de lgG4) e pode ser um CH2CH3 humano (por exemplo, lgG1, lgG2 e lgG4 humano). Por exemplo, em determinadas modalidades, a região constante de imunoglobulina compreende (1) domínios de CH2 e CH3 de lgG1 humana do tipo selvagem, (2) CH2 de lgG1 humana
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94/236 com substituição de N297A (isto é, CH2(N297A)) e CH3 de lgG1 humana do tipo selvagem, ou (3) CH2 de lgG1 humana (N297A) e um CH3 de lgG1 humana alterado com a última Usina deletada.
[0175] Alternativamente, os múltiplos domínios de região constante podem se basear ou derivar de diferentes moléculas de imunoglobulina, ou diferentes classes ou subclasses de moléculas de imunoglobulina. Por exemplo, em determinadas modalidades, uma região constante de imunoglobulina compreende tanto domínio de CH3 de IgM humana e domínio de CH3 de lgG1 humana. Os múltiplos domínios de região constante que formam uma região constante de imunoglobulina podem ser diretamente ligados juntos ou podem ser ligados entre si por meio de um ou mais (por exemplo, cerca de 2 a 10) aminoácidos.
[0176] As regiões constantes de imunoglobulina exemplificativas são estabelecidas na SEQ ID NQS:305-309, 321, 323, 341, 342 e 762 do documento US 2013/0129723 (as referidas sequências incorporadas a título de referência no presente documento).
[0177] Em determinadas modalidades, as regiões constantes de imunoglobulina de ambos os polipeptídeos de ligação a CD123 de um polipeptídeo dímero são idênticas entre si. Em determinadas outras modalidades, a região constante de imunoglobulina de uma cadeia de polipeptídeo de uma proteína dimérica é diferente da região constante de imunoglobulina da outra cadeia de polipeptídeo do dímero. Por exemplo, uma região constante de imunoglobulina de uma proteína heterodimérica pode conter um domínio de CH3 com uma mutação “knob”, enquanto a outra região constante de imunoglobulina da proteína heterodimérica pode conter um domínio de CH3 com uma mutação “hole”.
[0178] A divulgação se refere a proteínas e polipeptídeos de ligação de CD123 que podem compreender qualquer uma das sequências mostradas na Tabela 3. Em algumas modalidades, as proteínas e polipeptídeos de ligação de CD123 podem compreender uma sequência de
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95/236 sinal. As sequências para várias sequências e componentes clonados também são apresentados na Tabela 3. As sequências de aminoácidos dadas para construtos de polipeptídeo não incluem as sequências líderes de imunoglobulina humana ou de coelho. As sequências de CDR e posições de substituição de aminoácido são aquelas definidas com o uso dos critérios de IMGT (Brochet, X, et al, Nucl. Acids Res. (2008) 36, W503-508). Assim, o primeiro resíduo em FR1 de um domínio ou região variável de cadeia pesada ou leve é considerado como a posição 1.
TABELA 3: SEQUÊNCIAS DE POLIPEPTÍDEO DE LIGAÇÃO E COMPONENTES
Nome Sequência de Nucleotídeos Sequência de Aminoácidos SEQ ID NOs: Nucleotídeo (aminoácido)
domínio de cadeia leve variável de OMT1 gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggct gtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcaa gtccagccacagtgttttatacagctccaacaataag aactacttagcttggtaccagcagaaaccaggaca gcctcctaagctgctcatttactgggcatctacccgg gaatccggggtccctgaccgattcagtggcagcgg gtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctg caggctgaagatgtggcagtttattactgtcagcaat attatagtactcctccgaccactttcggcggagggac caaggtggagatcaaa divmtqspdslav slgeratinckssh svlyssnnknyla wyqqkpgqppkll iywastresgvpd rfsgsgsgtdftltis slqaedvavyycq qyystppttfgggt kveik SEQ ID NO:1 (SEQ ID NO:2)
domínio de gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggta cagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcc evqllesggglvqp ggslrlscaasgftf SEQ ID NO:3
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cadeia pesada variável de 0MT1 tctggattcacctttagcagctatggcatgagctgggt ccgccaggctccagggaaggggctggagggggtc tcagctattagtggtagtggtggtagcacatactacg cagactccgtgaagggccggttcaccatctccaga gacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaac agcctgagagccgaggacacggccgtatattactgt gcgaaagaaaagttacgatattttgactggttatccg atgcttttgatatctggggccaagggacaatggtcac cgtctcttca ssygmswvrqap gkglegvsaisgs ggstyyadsvkgr ftisrdnskntlylq mnslraedtavyy cakeklryfdwlsd afdiwgqgtmvtv ss (SEQ ID NO:4)
0MT1 CDR L1 cacagtgttttatacagctccaacaataagaactac HSVLYSSNN KNY SEQ ID NO:5 (SEQ ID NO:6)
0MT1 CDR L2 tgggcatct WAS SEQ ID NO:7 (SEQ ID NO:8)
0MT1 CDR L3 cagcaatattatagtactcctccgaccact QQYYSTPPT T SEQ ID NO:9 (SEQ ID NQ:10)
0MT1 CDR H1 ggattcacctttagcagctatggc GFTFSSYG SEQ ID NO:11 (SEQ ID NO:12)
0MT1 CDR H2 attagtggtagtggtggtagcaca ISGSGGST SEQ ID NO:13
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(SEQ ID N0:14)
0MT1 CDR H3 gcgaaagaaaagttacgatattttgactggttatccg atgcttttgatatc AKEKLRYFD WLSDAFDI SEQ ID N0:15 (SEQ ID N0:16)
domínio de cadeia leve variável de DB8 gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctg catctgtaggagacagagtcaccatcacttgccggg caagtcagagcattagcagctatctgaattggtatca gcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatct atgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaag gttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctc accatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaactt actactgtcaacagagttacagtacccctctcactttc ggcggaggtaccaaggtggagatcaaa diqmtqspsslsa svgdrvtitcrasq sissylnwyqqkp gkapklliyaassl qsgvpsrfsgsgs gtdftltisslqpedf atyycqqsystpltf gggtkveik SEQ ID N0:17 (SEQ ID N0:18)
domínio de cadeia pesada variável de DB8 caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaa gaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggc atctggatacatcttcaccgactactatatgcactggg tgcgtcaggcccctggacaagggcttgagtggatg ggatggatgagccctaacagtggtaacacaggcta tgcacagaagttccagggccgtgtcaccatgaccc gcgacacgtccacgagcacagtctacatggagctg agcagcctgcgttctgaggacacggccgtgtattact gtgcgagagatgcggcggattacggtgactacgttg cttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgt ctcttca qvqlvqsgaevkk pgasvkvsckas gyiftdyymhwvr qapgqglewmg wmspnsgntgy aqkfqgrvtmtrdt ststvymelsslrs edtavyycardaa dygdyvafdiwgq gtmvtvss SEQ ID N0:19 (SEQ ID NQ:20)
DB8 CDR L1 cagagcattagcagctat QSISSY SEQ ID N0:21
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(SEQ ID NO:22)
DB8 CDR L2 gctgcatcc AAS SEQ ID NO:23 (SEQ ID NO:24)
DB8 CDR L3 caacagagttacagtacccctctcact QQSYSTPLT SEQ ID NO:25 (SEQ ID NO:26)
DB8 CDR H1 ggatacatcttcaccgactactat GYIFTDYY SEQ ID NO:27 (SEQ ID NO:28)
DB8 CDR H2 atgagccctaacagtggtaacaca MSPNSGNT SEQ ID NO:29 (SEQ ID NO:30)
DB8 CDR H3 gcgagagatgcggcggattacggtgactacgttgct tttgatatc ARDAADYGD YVAFDI SEQ ID NO:31 (SEQ ID NO:32)
domínio de cadeia leve variável gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctg catctgtaggagacagagtcaccatcacttgccggg caagtcagagcattagcagctatctgaattggtatca gcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatct atgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaag diqmtqspsslsa svgdrvtitcrasq sissylnwyqqkp gkapklliyaassl qsgvpsrfsgsgs SEQ ID NO:17 (SEQ ID NO:18)
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de DB60 gttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctc accatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaactt actactgtcaacagagttacagtacccctctcactttc ggcggaggtaccaaggtggagatcaaa gtdftltisslqpedf atyycqqsystpltf gggtkveik
domínio de cadeia pesada variável de DB60 caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaa gaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggc atctggatacaccttcaccagctactatatgcactgg gtgcgtcaggcccctggacaagggcttgagtggat ggggtggatcaaccctaacagtggtgacacaagct atgcacagaagttccagggccgtgtcaccatgacc cgcgacacgtccacgagcacagtctacatggagct gagcagcctgcgttctgaggacacggccgtgtatta ctgtgcgcaggatagtagtggttccggggcttttgata tctggggccaagggacaatggtcaccgtctcttca qvqlvqsgaevkk pgasvkvsckas gytftsyymhwvr qapgqglewmg winpnsgdtsyaq kfqgrvtmtrdtsts tvymelsslrsedt avyycaqdssgs gafdiwgqgtmvt vss SEQ ID NO:33 (SEQ ID NO:34)
DB60 CDR L1 cagagcattagcagctat QSISSY SEQ ID NO:21 (SEQ ID NO:22)
DB60 CDR L2 gctgcatcc AAS SEQ ID NO:23 (SEQ ID NO:24)
DB60 CDR L3 caacagagttacagtacccctctcact QQSYSTPLT SEQ ID NO:25 (SEQ ID NO:26)
DB60 ggatacaccttcaccagctactat GY IhISYY SEQ ID
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CDR H1 NO:35 (SEQ ID NO:36)
DB60 CDR H2 atcaaccctaacagtggtgacaca INPNSGDT SEQ ID NO:37 (SEQ ID NO:38)
DB60 CDR H3 gcgcaggatagtagtggttccggggcttttgatatc AQDSSGSGA FDI SEQ ID NO:39 (SEQ ID NO:40)
domínio de cadeia leve variável de DB65 gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctg catctgtaggagacagagtcaccatcacttgccggg caagtcagagcattagcagctatctgaattggtatca gcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatct atgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaag gttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctc accatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaactt actactgtcaacagagttacagtacccctctcactttc ggcggaggtaccaaggtggagatcaaa diqmtqspsslsa svgdrvtitcrasq sissylnwyqqkp gkapklliyaassl qsgvpsrfsgsgs gtdftltisslqpedf atyycqqsystpltf gggtkveik SEQ ID NO:17 (SEQ ID NO:18)
domínio de cadeia pesada variável de DB65 caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaa gaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggc atctggatacaccttcaccggctactatatgcactgg gtgcgtcaggcccctggacaagggcttgagtggat gggatggatgaaccctaacagtggtaacacaggct atgcacagaagttccagggccgtgtcaccatgacc cgcgacacgtccacgagcacagtctacatggagct gagcagcctgcgttctgaggacacggccgtgtatta qvqlvqsgaevkk pgasvkvsckas gytftgyymhwvr qapgqglewmg wmnpnsgntgy aqkfqgrvtmtrdt ststvymelsslrs edtavyycakee SEQ ID NO:41 (SEQ ID NO:42)
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ctgtgcgaaagaggaaccgatttttggagtggttatg gatgcttttgatatctggggccaagggacaatggtca ccgtctcctca pifgvvmdafdiw gqgtmvtvss
DB65 CDR L1 cagagcattagcagctat QSISSY SEQ ID NO:21 (SEQ ID NO:22)
DB65 CDR L2 gctgcatcc AAS SEQ ID NO:23 (SEQ ID NO:24)
DB65 CDR L3 caacagagttacagtacccctctcact QQSYSTPLT SEQ ID NO:25 (SEQ ID NO:26)
DB65 CDR H1 ggatacaccttcaccggctactat GY I F IGYY SEQ ID NO:43 (SEQ ID NO:44)
DB65 CDR H2 atgaaccctaacagtggtaacaca MNPNSGNT SEQ ID NO:45 (SEQ ID NO:46)
DB65 CDR H3 gcgaaagaggaaccgatttttggagtggttatggat gcttttgatatc AKEEPIFGVV MDAFDI SEQ ID NO:47 (SEQ ID NO:48)
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domínio de cadeia leve variável de DB82 gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctg catctgtaggagaccgcgtcaccatcacttgccggg caagtcagaccataaacaactatttgaactggtatc agcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgat ctattctgcatctactttgcaaagtggggtcccatcac gtttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctc accatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaactt actactgtcaccagagttacacttcacctctcactttcg gcggaggtaccaaggtggagatcaaa diqmtqspsslsa svgdrvtitcrasqt innylnwyqqkpg kapklliysastlqs gvpsrfsgsgsgt dftltisslqpedfat yychqsytspltfg ggtkveik SEQ ID NO:49 (SEQ ID NQ:50)
domínio de cadeia pesada variável de DB82 gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggta cagcctggggggtccctgcgcctctcctgtgcagcct ctggattcacctttagcagctatgccatgagctgggtc cgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctc agttattagtgccaatagtgctggtctaggccatgcg gactctgtgaagggccggttcaccatctcccgcgac aattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagc ctgcgcgccgaggacacggccgtatattactgtgcg agagtgggctatagcagctcggctgatgcttttgatat ctggggccaagggacaatggtcaccgtctcctcg evqlvesggglvq pggslrlscaasgf tfssyamswvrqa pgkglewvsvisa nsaglghadsvk grftisrdnskntlyl qmnslraedtavy ycarvgysssada fdiwgqgtmvtvs s SEQ ID N0:51 (SEQ ID NO:52)
DB82 CDR L1 cagaccataaacaactat QTINNY SEQ ID NO:53 (SEQ ID NO:54)
DB82 CDR L2 tctgcatct SAS SEQ ID NO:55 (SEQ ID NO:56)
DB82 caccagagttacacttcacctctcact HQSYTSPLT SEQ ID
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CDR L3 NO:57 (SEQ ID NO:58)
DB82 CDR H1 ggattcacctttagcagctatgcc GFTFSSYA SEQ ID NO:59 (SEQ ID NQ:60)
DB82 CDR H2 attagtgccaatagtgctggtcta ISANSAGL SEQ ID NO:61 (SEQ ID NO:62)
DB82 CDR H3 gcgagagtgggctatagcagctcggctgatgcttttg atatc ARVGYSSSA DAFDI SEQ ID NO:63 (SEQ ID NO:64)
domínio de cadeia leve variável de DB83 gatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcccgtc acccctggagagccggcctccatctcctgcaggtct agtcagagcctcctgcatagtaatggagacaactat ttggattggtacctgcagaagccagggcagtctcca cagctcctgatctatttgggttctaatcgggcctccgg ggtccctgaccgtttcagtggcagtggatcaggcac agattttacactgaaaatcagccgtgtggaggctga ggatgttggggtttattactgcatgcaagctacacact ggccactcactttcggccctggtaccaaagtggatat caaa dvvmtqsplslpvt pgepasiscrssq sllhsngdnyldw ylqkpgqspqlliyl gsnrasgvpdrfs gsgsgtdftlkisrv eaedvgvyycm qathwpltfgpgtk vdik SEQ ID NO:65 (SEQ ID NO:66)
domínio de caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaa gaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggc qvqlvqsgaevkk pgasvkvsckas SEQ ID NO:67
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cadeia pesada variável de DB83 atctggatacaccttcactagctatgctatgcattgggt gcgtcaggcccctggacaagggcttgagtggatgg gacttgttgatcctgaagatggtgaaacaatatatgc agagaagttccagggccgtgtcaccatgacccgcg acacgtccacgagcacagtctacatggagctgagc agcctgcgttctgaggacacggccgtgtattactgtg cgagacgaacgtattactatgatagtagtggttcccg ttatgcttttgatatctggggccaagggaccacggtc accgtctcttca gytftsyamhwvr qapgqglewmgl vdpedgetiyaek fqgrvtmtrdtstst vymelsslrsedta vyycarrtyyydss gsryafdiwgqgtt vtvss (SEQ ID NO:68)
DB83 CDR L1 cagagcctcctgcatagtaatggagacaactat QSLLHSNGD NY SEQ ID NO:69 (SEQ ID NQ:70)
DB83 CDR L2 ttgggttct LGS SEQ ID NO:71 (SEQ ID NO:72)
DB83 CDR L3 atgcaagctacacactggccactcact MQATHWPLT SEQ ID NO:73 (SEQ ID NO:74)
DB83 CDR H1 ggatacaccttcactagctatgct GY IhISYA SEQ ID NO:75 (SEQ ID NO:76)
DB83 CDR H2 gttgatcctgaagatggtgaaaca VDPEDGET SEQ ID NO:77
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(SEQ ID NO:78)
DB83 CDR H3 gcgagacgaacgtattactatgatagtagtggttccc gttatgcttttgatatc ARRTYYYDS SGSRYAFDI SEQ ID NO:79 (SEQ ID NQ:80)
domínio de cadeia leve variável de DB86 gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctg catctgtaggagaccgcgtcaccatcacttgccggg caagtcagggcatcagaaatgatttaggttggtatca gcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatct atgctgcatccactttgcaatcaggggtcccatcacg tttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctca ccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaactta ctactgtcaacagagttacggtgcccccctcactttcg gcggaggtaccaaggtggagatcaaa diqmtqspsslsa svgdrvtitcrasq girndlgwyqqkp gkapklliyaastlq sgvpsrfsgsgsg tdftltisslqpedfa tyycqqsygapltf gggtkveik SEQ ID N0:81 (SEQ ID NO:82)
domínio de cadeia pesada variável de DB86 caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaa gaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggc atctggatatatgttcagtggccattctgcacactggg tgcgtcaggcccctggacaagggcttgagtggatg ggatggatgaaccctaacagtggtaacacaggcta tgcacagaagttccagggccgtgtcaccatgaccc gcgacacgtccacgagcacagtctacatggagctg agcagcctgcgttctgaggacacggccgtgtattact gtgcgagagatagcagtggctggtacgatgtctttga ctactggggccaggggaccctggtcaccgtctcctc a qvqlvqsgaevkk pgasvkvsckas gymfsghsahwv rqapgqglewmg wmnpnsgntgy aqkfqgrvtmtrdt ststvymelsslrs edtavyycardss gwydvfdywgqg tlvtvss SEQ ID NO:83 (SEQ ID NO:84)
DB86 CDR L1 cagggcatcagaaatgat QGIRND SEQ ID NO:85
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(SEQ ID NO:86)
DB86 CDR L2 gctgcatcc AAS SEQ ID NO:87 (SEQ ID NO:88)
DB86 CDR L3 caacagagttacggtgcccccctc QQSYGAPLT SEQ ID NO:89 (SEQ ID NO:90)
DB86 CDR H1 ggatatatgttcagtggccattct GYMFSGHS SEQ ID NO:91 (SEQ ID NO:92)
DB86 CDR H2 atgaaccctaacagtggtaacaca MNPNSGNT SEQ ID NO:93 (SEQ ID NO:94)
DB86 CDR H3 gcgagagatagcagtggctggtacgatgtctttgact ac ARDSSGWYD VFDY SEQ ID NO:95 (SEQ ID NO:96)
domínio de cadeia leve variável gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctg catctgtaggagacagagtcaccatcacttgccggg caagtcagagcattagcagctatctgaattggtatca gcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatct atgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaag diqmtqspsslsa svgdrvtitcrasq sissylnwyqqkp gkapklliyaassl qsgvpsrfsgsgs SEQ ID NO:17 (SEQ ID NO:18)
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de DB280 gttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctc accatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaactt actactgtcaacagagttacagtacccctctcactttc ggcggaggtaccaaggtggagatcaaa gtdftltisslqpedf atyycqqsystpltf gggtkveik
domínio de cadeia pesada variável de DB280 caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaa gaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggc atctggatacagcctcaacttatactatatgcactggg tgcgtcaggcccctggacaagggcttgagtggatg ggatggatgaaccctaacagtggtaacacaggcta tgcacagaagttccagggccgtgtcaccatgaccc gcgacacgtccacgagcacagtctacatggagctg agcagcctgcgttctgaggacacggccgtgtattact gtgcgagcctcgattgtagtggtggtagctgctactcc gaatatgatgcttttgatatctggggccaagggacca cggtcaccgtctcctca qvqlvqsgaevkk pgasvkvsckas gyslnlyymhwvr qapgqglewmg wmnpnsgntgy aqkfqgrvtmtrdt ststvymelsslrs edtavyycasldc sggscyseydafd iwgqgttvtvss SEQ ID NO:97 (SEQ ID NO:98)
DB280 CDR L1 cagagcattagcagctat QSISSY SEQ ID NO:21 (SEQ ID NO:22)
DB280 CDR L2 gctgcatcc AAS SEQ ID NO:23 (SEQ ID NO:24)
DB280 CDR L3 caacagagttacagtacccctctcact QQSYSTPLT SEQ ID NO:25 (SEQ ID NO:26)
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DB280 CDR H1 ggatacagcctcaacttatactat GYSLNLYY SEQ ID NO:99 (SEQ ID NQ:100)
DB280 CDR H2 atgaaccctaacagtggtaacaca MNPNSGNT SEQ ID NQ:101 (SEQ ID NQ:102)
DB280 CDR H3 gcgagcctcgattgtagtggtggtagctgctactccg aatatgatgcttttgatatc ASLDCSGGS CYSEYDAFDI SEQ ID NQ:103 (SEQ ID NQ:104)
domínio de cadeia leve variável de DB331 gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctg catctgtaggagacagagtcaccatcacttgccggg caagtcagagcattagcagctatctgaattggtatca gcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatct atgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaag gttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctc accatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaactt actactgtcaacagagttacagtacccctctcactttc ggcggaggtaccaaggtggagatcaaa diqmtqspsslsa svgdrvtitcrasq sissylnwyqqkp gkapklliyaassl qsgvpsrfsgsgs gtdftltisslqpedf atyycqqsystpltf gggtkveik SEQ ID NO:17 (SEQ ID NO: 18)
domínio de cadeia pesada variável de DB331 caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaa gaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggc atctggatacaccttcaccagctactatatgcactgg gtgcgtcaggcccctggacaagggcttgagtggat gggatggatgaaccctaacagtggtaacacaggct atgcacagaagttccagggccgtgtcaccatgacc cgcgacacgtccacgagcacagtctacatggagct qvqlvqsgaevkk pgasvkvsckas gytftsyymhwvr qapgqglewmg wmnpnsgntgy aqkfqgrvtmtrdt ststvymelsslrs SEQ ID NQ:105 (SEQ ID NQ:106)
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gagcagcctgcgttctgaggacacggccgtgtatta ctgtgcaacagatctcgcgggggaagccttgttcga cccctggggccagggcaccctggtcaccgtctcctc a edtavyycatdla gealfdpwgqgtl vtvss
DB331 CDR L1 cagagcattagcagctat QSISSY SEQ ID NO:21 (SEQ ID NO:22)
DB331 CDR L2 gctgcatcc AAS SEQ ID NO:23 (SEQ ID NO:24)
DB331 CDR L3 caacagagttacagtacccctctcact QQSYSTPLT SEQ ID NO:25 (SEQ ID NO:26)
DB331 CDR H1 ggatacaccttcaccagctactat GY IhISYY SEQ ID NQ:107 (SEQ ID NQ:108)
DB331 CDR H2 atgaaccctaacagtggtaacaca MNPNSGNT SEQ ID NQ:109 (SEQ ID NQ:110)
DB331 CDR H3 gcaacagatctcgcgggggaagccttgttcgaccc c ATDLAGEALF DP SEQ ID NO:111 (SEQ ID
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N0:112)
domínio de cadeia leve variável de DB415 gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctg catctgtaggagacagagtcaccatcacttgccggg caagtcagagcattagcagctatctgaattggtatca gcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatct atgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaag gttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctc accatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaactt actactgtcaacagagttacagtacccctctcactttc ggcggaggtaccaaggtggagatcaaa diqmtqspsslsa svgdrvtitcrasq sissylnwyqqkp gkapklliyaassl qsgvpsrfsgsgs gtdftltisslqpedf atyycqqsystpltf gggtkveik SEQ ID N0:17 (SEQ ID N0:18)
domínio de cadeia pesada variável de DB415 gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggta cagcctggggggtccctgcgcctctcctgtgcagcct ctggaatcaccttcagtagttatggcatgcattgggtc cgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctc aggtattagttggaatagtggtaacagagtctatgtg gactctgtgaagggccggttcaccatctcccgcgac aattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagc ctgcgcgccgaggacacggccgtatattactgtgcg agagatactaatgatgcttttgatatctggggccaag ggaccacggtcaccgtctcctca evqlvesggglvq pggslrlscaasgit fssygmhwvrqa pgkglewvsgis wnsgnrvyvdsv kgrftisrdnskntl ylqmnslraedta vyycardtndafdi wgqgttvtvss SEQ ID N0:113 (SEQ ID N0:114)
DB415 CDR L1 cagagcattagcagctat QSISSY SEQ ID N0:21 (SEQ ID NO:22)
DB415 CDR L2 gctgcatcc AAS SEQ ID NO:23 (SEQ ID NO:24)
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DB415 CDR L3 caacagagttacagtacccctctcact QQSYSTPLT SEQ ID NO: 25 (SEQ ID NO:26)
DB415 CDR H1 ggaatcaccttcagtagttatggc GITFSSYG SEQ ID NO:115 (SEQ ID NO:116)
DB415 CDR H2 attagttggaatagtggtaacaga ISWNSGNR SEQ ID NO:117 (SEQ ID NO:118)
DB415 CDR H3 gcgagagatactaatgatgcttttgatatc ARDTNDAFDI SEQ ID NO:119 (SEQ ID NQ:120)
domínio de cadeia leve variável de DB435 gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctg catctgtaggagacagagtcaccatcacttgccggg caagtcagagcattagcagctatctgaattggtatca gcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatct atgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaag gttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctc accatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaactt actactgtcaacagagttacagtacccctctcactttc ggcggaggtaccaaggtggagatcaaa diqmtqspsslsa svgdrvtitcrasq sissylnwyqqkp gkapklliyaassl qsgvpsrfsgsgs gtdftltisslqpedf atyycqqsystpltf gggtkveik SEQ ID NO:17 (SEQ ID NO:18)
domínio de caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaa gaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggc qvqlvqsgaevkk pgasvkvsckas SEQ ID NO:121
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cadeia pesada variável de DB435 atctggaggcaccttcagcagctatgctatcagctgg gtgcgtcaggcccctggacaagggcttgagtggat gggctggatcacccctcacaatggtaacataaagta tgcacgggagttccagggccgtgtcaccatgaccc gcgacacgtccacgagcacagtctacatggagctg agcagcctgcgttctgaggacacggccgtgtattact gtgcgaaagatctgaactggaacgcagcctttgact actggggccaggggaccctggtcaccgtctcctca ggtfssyaiswvrq apgqglewmgwi tphngnikyarefq grvtmtrdtststvy melsslrsedtavy ycakdlnwnaafd ywgqgtlvtvss (SEQ ID NO:122)
DB435 CDR L1 cagagcattagcagctat QSISSY SEQ ID NO: 21 (SEQ ID NO:22)
DB435 CDR L2 gctgcatcc AAS SEQ ID NO:233 (SEQ ID NO:24)
DB435 CDR L3 caacagagttacagtacccctctcact QQSYSTPLT SEQ ID NO: 25 (SEQ ID NO:26)
DB435 CDR H1 ggaggcaccttcagcagctatgct GGTFSSYA SEQ ID NO:123 (SEQ ID NO:124)
DB435 CDR H2 atcacccctcacaatggtaacata ITPHNGNI SEQ ID NO: 125 (SEQ ID
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NO:126)
DB435 CDR H3 gcgaaagatctgaactggaacgcagcctttgactac AKDLNWNAA FDY SEQ ID NO:127 (SEQ ID NO:128)
0MT1 VHVL x TSC456 scFv-FcscFv TRI129 atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctact ctggctcccagataccaccggtgaggtgcagctgtt ggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggt ccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttta gcagctatggcatgagctgggtccgccaggctcca gggaaggggctggagggggtctcagctattagtggt agtggtggtagcacatactacgcagactccgtgaa gggccggttcaccatctccagagacaattccaaga acacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagcc gaggacacggccgtatattactgtgcgaaagaaaa gttacgatattttgactggttatccgatgcttttgatatct ggggccaagggacaatggtcaccgtctcttcaggtg gaggcggttcaggcggaggtggatccggcggtgg cggctccggtggcggcggatctgacatcgtgatgac ccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgag agggccaccatcaactgcaagtccagccacagtgt tttatacagctccaacaataagaactacttagcttggt accagcagaaaccaggacagcctcctaagctgct catttactgggcatctacccgggaatccggggtccct gaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttc actctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtg gcagtttattactgtcagcaatattatagtactcctccg accactttcggcggagggaccaaggtggagatca evqllesggglvqp ggslrlscaasgftf ssygmswvrqap gkglegvsaisgs ggstyyadsvkgr ftisrdnskntlylq mnslraedtavyy cakeklryfdwlsd afdiwgqgtmvtv ssggggsggggs ggggsggggsdi vmtqspdslavsl geratincksshsv lyssnnknylawy qqkpgqppklliy wastresgvpdrf sgsgsgtdftltissl qaedvavyycqq yystppttfgggtk veiksssepkssd kthtcppcpapea agapsvflfppkp kdtlmisrtpevtcv SEQ ID NO:129 (SEQ ID NQ:130)
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aatcctcgagtgagcccaaatcttctgacaaaactc vvdvshedpevkf
acacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgc nwyvdgvevhna
gggtgcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaaccc ktkpreeqynstyr
aaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtc vvsvltvlhqdwln
acatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccc gkeykcavsnkal
tgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtgga papiektiskakgq
ggtgcataatgccaagacaaagccgcgggagga prepqvytlppsrd
gcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcct eltknqvsltclvkg
caccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaagg fypsdiavewesn
aatacaagtgcgcggtctccaacaaagccctccca gqpennykttppv
gcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaag Idsdgsfflyskltv
ggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcc dksrwqqgnvfsc
cccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtc svmhealhnhyt
agcctgacctgcctggtcaaaggcttctatccaagc qkslslspgsggg
gacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagc gsggggsggggs
cggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgct psqvqlvqsgpev
ggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctc kkpgssvkvsck
accgtggacaagagcaggtggcagcaggggaac asgytfsrstmhw
gtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaa vrqapgqglewig
ccactacacgcagaagagcctctccctgtctccggg yinpssaytnynq
ttccggaggagggggttcaggtgggggaggttctgg kfkdrvtitadkstst
cggcgggggaagcccttcacaggtgcaactggtgc aymelsslrsedt
agagtggacccgaggttaaaaaaccagggtcctcc avyycarpqvhy
gttaaggttagctgcaaagcctctggctacacattttc dyngfpywgqgtl
caggagtacaatgcactgggtgaggcaggctcctg vtvssggggsgg
gacagggactcgagtggatcgggtatatcaaccca ggsggggsgggg
tctagcgcctataccaattacaaccaaaagtttaagg sdiqmtqspstlsa
accgagttaccattaccgctgacaaatccaccagta svgdrvtmtcsas
cagcttatatggagctgtcatctcttaggtccgaggac ssvsymnwyqq
Petição 870190046145, de 16/05/2019, pág. 118/260
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actgctgtttattactgcgctcgtcctcaggttcactatg actataatggttttccctactggggtcagggaaccctg gtgactgtctcttctggcggtggaggcagcggtggg ggtgggtctggaggcggtggcagtggcggcggag gctctgatattcagatgactcagtctcctagcactctc agcgccagcgtgggggatcgtgtgacaatgacttg ctccgctagcagtagtgtgtcttacatgaattggtatc agcagaagcccgggaaagcacctaagcgctggat ctatgactcttccaagctggcaagtggtgtcccctca cggttctctggctcaggttctggtactgactatactttga ctatctcctccctccagcccgatgatttcgctacctatt attgtcagcagtggagccgtaacccacccactttcg gaggcggtaccaaagtggagatcaagaggtcata a kpgkapkrwiyds sklasgvpsrfsgs gsgtdytltisslqp ddfatyycqqwsr npptfgggtkveik rs
VLVH de 0MT1 x TSC456 scFv-FcscFv TRI130 atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctact ctggctcccagataccaccggtgacatcgtgatgac ccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgag agggccaccatcaactgcaagtccagccacagtgt tttatacagctccaacaataagaactacttagcttggt accagcagaaaccaggacagcctcctaagctgct catttactgggcatctacccgggaatccggggtccct gaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttc actctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtg gcagtttattactgtcagcaatattatagtactcctccg accactttcggcggagggaccaaggtggagatca aaggtggaggcggttcaggcggaggtggatccgg cggtggcggctccggtggcggcggatctgaggtgc agctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctg gggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggatt divmtqspdslav slgeratinckssh svlyssnnknyla wyqqkpgqppkll iywastresgvpd rfsgsgsgtdftltis slqaedvavyycq qyystppttfgggt kveikggggsgg ggsggggsgggg sevqllesggglvq pggslrlscaasgf tfssygmswvrqa pgkglegvsaisg sggstyyadsvkg SEQ ID NO:131 (SEQ ID NO:132)
Petição 870190046145, de 16/05/2019, pág. 119/260
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cacctttagcagctatggcatgagctgggtccgcca rftisrdnskntlylq
ggctccagggaaggggctggagggggtctcagct mnslraedtavyy
attagtggtagtggtggtagcacatactacgcagact cakeklryfdwlsd
ccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaatt afdiwgqgtmvtv
ccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctg sssepkssdktht
agagccgaggacacggccgtatattactgtgcgaa cppcpapeaaga
agaaaagttacgatattttgactggttatccgatgctttt psvflfppkpkdtl
gatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcc misrtpevtcvvvd
tcgagtgagcccaaatcttctgacaaaactcacaca vshedpevkfnw
tgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcgggtgc yvdgvevhnaktk
accgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaagga preeqynstyrvv
caccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatg svltvlhqdwlngk
cgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgag eykcavsnkalpa
gtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtg piektiskakgqpr
cataatgccaagacaaagccgcgggaggagcag epqvytlppsrdel
tacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcacc tknqvsltclvkgfy
gtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggaata psdiavewesng
caagtgcgcggtctccaacaaagccctcccagccc qpennykttppvl
ccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggca dsdgsfflyskltvd
gccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccat ksrwqqgnvfscs
cccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcct vmhealhnhytq
gacctgcctggtcaaaggcttctatccaagcgacat kslslspgsgggg
cgccgtggagtgggagagcaatgggcagccgga sggggsggggsp
gaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggact sqvqlvqsgpevk
ccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgt kpgssvkvscka
ggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttc sgytfsrstmhwv
tcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccact rqapgqglewigy
acacgcagaagagcctctccctgtctccgggttccg inpssaytnynqkf
gaggagggggttcaggtgggggaggttctggcggc kdrvtitadkststa
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gggggaagcccttcacaggtgcaactggtgcaga gtggacccgaggttaaaaaaccagggtcctccgtta aggttagctgcaaagcctctggctacacattttccag gagtacaatgcactgggtgaggcaggctcctggac agggactcgagtggatcgggtatatcaacccatcta gcgcctataccaattacaaccaaaagtttaaggacc gagttaccattaccgctgacaaatccaccagtacag cttatatggagctgtcatctcttaggtccgaggacact gctgtttattactgcgctcgtcctcaggttcactatgact ataatggttttccctactggggtcagggaaccctggt gactgtctcttctggcggtggaggcagcggtggggg tgggtctggaggcggtggcagtggcggcggaggct ctgatattcagatgactcagtctcctagcactctcagc gccagcgtgggggatcgtgtgacaatgacttgctcc gctagcagtagtgtgtcttacatgaattggtatcagca gaagcccgggaaagcacctaagcgctggatctatg actcttccaagctggcaagtggtgtcccctcacggtt ctctggctcaggttctggtactgactatactttgactatc tcctccctccagcccgatgatttcgctacctattattgtc agcagtggagccgtaacccacccactttcggaggc ggtaccaaagtggagatcaagaggtcataa ymelsslrsedtav yycarpqvhydy ngfpywgqgtlvtv ssggggsggggs ggggsggggsdi qmtqspstlsasv gdrvtmtcsasss vsymnwyqqkp gkapkrwiydssk lasgvpsrfsgsgs gtdytltisslqpddf atyycqqwsrnp ptfgggtkveikrs
VHVL de DB8 x TSC456 scFv-FcscFv TRI123 atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctact ctggctcccagataccaccggtcaggtgcagctggt gcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcct cagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacatcttc accgactactatatgcactgggtgcgtcaggcccct ggacaagggcttgagtggatgggatggatgagccc taacagtggtaacacaggctatgcacagaagttcc agggccgtgtcaccatgacccgcgacacgtccacg qvqlvqsgaevkk pgasvkvsckas gyiftdyymhwvr qapgqglewmg wmspnsgntgy aqkfqgrvtmtrdt ststvymelsslrs edtavyycardaa SEQ ID NO:133 (SEQ ID NO:134)
Petição 870190046145, de 16/05/2019, pág. 121/260
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agcacagtctacatggagctgagcagcctgcgttct dygdyvafdiwgq
gaggacacggccgtgtattactgtgcgagagatgc gtmvtvssgggg
ggcggattacggtgactacgttgcttttgatatctggg sggggsggggsg
gccaagggacaatggtcaccgtctcttcaggcggc gggsdiqmtqsp
ggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcgg sslsasvgdrvtitc
aggctccggcggcggcggcagcgacatccagatg rasqsissylnwy
acccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggaga qqkpgkapklliya
cagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagca asslqsgvpsrfsg
ttagcagctatctgaattggtatcagcagaaaccag sgsgtdftltisslqp
ggaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatcca edfatyycqqsyst
gtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggca pltfgggtkveikss
gtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcag sepkssdkthtcp
tctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaac pcpapeaagaps
agagttacagtacccctctcactttcggcggaggtac vflfppkpkdtlmis
caaggtggagatcaaatcctcgagtgagcccaaat rtpevtcvvvdvsh
cttctgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccag edpevkfnwyvd
cacctgaagccgcgggtgcaccgtcagtcttcctctt gvevhnaktkpre
ccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctccc eqynstyrvvsvlt
ggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtg vlhqdwlngkeyk
agccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggta cavsnkalpapie
cgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagaca ktiskakgqprep
aagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtac qvytlppsrdeltk
cgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggact nqvsltclvkgfyp
ggctgaatggcaaggaatacaagtgcgcggtctcc sdiavewesngq
aacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacca pennykttppvld
tctccaaagccaaagggcagccccgagaaccac sdgsfflyskltvdk
aggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctg srwqqgnvfscsv
accaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaa mhealhnhytqk
aggcttctatccaagcgacatcgccgtggagtggga slslspgsggggs
Petição 870190046145, de 16/05/2019, pág. 122/260
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gagcaatgggcagccggagaacaactacaagac cacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttc ctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtg gcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcat gaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcc tctccctgtctccgggttccggaggagggggttcagg tgggggaggttctggcggcgggggaagcccttcac aggtgcaactggtgcagagtggacccgaggttaaa aaaccagggtcctccgttaaggttagctgcaaagcc tctggctacacattttccaggagtacaatgcactgggt gaggcaggctcctggacagggactcgagtggatc gggtatatcaacccatctagcgcctataccaattaca accaaaagtttaaggaccgagttaccattaccgctg acaaatccaccagtacagcttatatggagctgtcatc tcttaggtccgaggacactgctgtttattactgcgctcg tcctcaggttcactatgactataatggttttccctactgg ggtcagggaaccctggtgactgtctcttctggcggtg gaggcagcggtgggggtgggtctggaggcggtgg cagtggcggcggaggctctgatattcagatgactca gtctcctagcactctcagcgccagcgtgggggatcg tgtgacaatgacttgctccgctagcagtagtgtgtctt acatgaattggtatcagcagaagcccgggaaagc acctaagcgctggatctatgactcttccaagctggca agtggtgtcccctcacggttctctggctcaggttctggt actgactatactttgactatctcctccctccagcccgat gatttcgctacctattattgtcagcagtggagccgtaa cccacccactttcggaggcggtaccaaagtggaga tcaagaggtcataa ggggsggggsps qvqlvqsgpevkk pgssvkvsckas gytfsrstmhwvr qapgqglewigyi npssaytnynqkf kdrvtitadkststa ymelsslrsedtav yycarpqvhydy ngfpywgqgtlvtv ssggggsggggs ggggsggggsdi qmtqspstlsasv gdrvtmtcsasss vsymnwyqqkp gkapkrwiydssk lasgvpsrfsgsgs gtdytltisslqpddf atyycqqwsrnp ptfgggtkveikrs
VLVH de atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctact diqmtqspsslsa SEQ ID
Petição 870190046145, de 16/05/2019, pág. 123/260
120/236
DB8 x TSC456 scFv-FcscFv
TRI124
ctggctcccagataccaccggtgacatccagatga svgdrvtitcrasq NO:135
cccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagac sissylnwyqqkp (SEQ
agagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcatt gkapklliyaassl NO:136)
agcagctatctgaattggtatcagcagaaaccagg qsgvpsrfsgsgs
gaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatccagt gtdftltisslqpedf
ttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagt atyycqqsystpltf
ggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtc gggtkveikgggg
tgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacag sggggsggggsg
agttacagtacccctctcactttcggcggaggtacca gggsqvqlvqsg
aggtggagatcaaaggcggcggcggcagcggcg aevkkpgasvkv
gcggcggcagcggcggcggaggctccggcggcg sckasgyiftdyy
gcggcagccaggtgcagctggtgcagtctggggct mhwvrqapgqgl
gaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttc ewmgwmspns
ctgcaaggcatctggatacatcttcaccgactactat gntgyaqkfqgrvt
atgcactgggtgcgtcaggcccctggacaagggctt mtrdtststvymel
gagtggatgggatggatgagccctaacagtggtaa sslrsedtavyyca
cacaggctatgcacagaagttccagggccgtgtca rdaadygdyvafd
ccatgacccgcgacacgtccacgagcacagtctac iwgqgtmvtvsss
atggagctgagcagcctgcgttctgaggacacggc epkssdkthtcpp
cgtgtattactgtgcgagagatgcggcggattacggt cpapeaagapsv
gactacgttgcttttgatatctggggccaagggacaa flfppkpkdtlmisr
tggtcaccgtctcctcgagtgagcccaaatcttctga tpevtcvvvdvsh
caaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctg edpevkfnwyvd
aagccgcgggtgcaccgtcagtcttcctcttcccccc gvevhnaktkpre
aaaacccaaggacaccctcatgatctcccggaccc eqynstyrvvsvlt
ctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccac vlhqdwlngkeyk
gaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtgga cavsnkalpapie
cggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccg ktiskakgqprep
cgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtgg qvytlppsrdeltk
ID
Petição 870190046145, de 16/05/2019, pág. 124/260
121/236
tcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctga nqvsltclvkgfyp
atggcaaggaatacaagtgcgcggtctccaacaa sdiavewesngq
agccctcccagcccccatcgagaaaaccatctcca pennykttppvld
aagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgt sdgsfflyskltvdk
acaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaag srwqqgnvfscsv
aaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttc mhealhnhytqk
tatccaagcgacatcgccgtggagtgggagagca slslspgsggggs
atgggcagccggagaacaactacaagaccacgc ggggsggggsps
ctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctac qvqlvqsgpevkk
agcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagc pgssvkvsckas
aggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggc gytfsrstmhwvr
tctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccct qapgqglewigyi
gtctccgggttccggaggagggggttcaggtgggg npssaytnynqkf
gaggttctggcggcgggggaagcccttcacaggtg kdrvtitadkststa
caactggtgcagagtggacccgaggttaaaaaac ymelsslrsedtav
cagggtcctccgttaaggttagctgcaaagcctctgg yycarpqvhydy
ctacacattttccaggagtacaatgcactgggtgag ngfpywgqgtlvtv
gcaggctcctggacagggactcgagtggatcgggt ssggggsggggs
atatcaacccatctagcgcctataccaattacaacc ggggsggggsdi
aaaagtttaaggaccgagttaccattaccgctgaca qmtqspstlsasv
aatccaccagtacagcttatatggagctgtcatctctt gdrvtmtcsasss
aggtccgaggacactgctgtttattactgcgctcgtcc vsymnwyqqkp
tcaggttcactatgactataatggttttccctactgggg gkapkrwiydssk
tcagggaaccctggtgactgtctcttctggcggtgga lasgvpsrfsgsgs
ggcagcggtgggggtgggtctggaggcggtggca gtdytltisslqpddf
gtggcggcggaggctctgatattcagatgactcagt atyycqqwsrnp
ctcctagcactctcagcgccagcgtgggggatcgtg tgacaatgacttgctccgctagcagtagtgtgtcttac atgaattggtatcagcagaagcccgggaaagcac ptfgggtkveikrs
Petição 870190046145, de 16/05/2019, pág. 125/260
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ctaagcgctggatctatgactcttccaagctggcaag tggtgtcccctcacggttctctggctcaggttctggtac tgactatactttgactatctcctccctccagcccgatga tttcgctacctattattgtcagcagtggagccgtaacc cacccactttcggaggcggtaccaaagtggagatc aagaggtcataa
VHVL de DB8 x TSC456 scFv-FcscFv TRI137 atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctact ctggctcccagataccaccggtcaggtgcagctggt gcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcct cagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacatcttc accgactactatatgcactgggtgcgtcaggcccct ggacaagggcttgagtggatgggatggatgagccc taacagtggtaacacaggctatgcacagaagttcc agggccgtgtcaccatgacccgcgacacgtccacg agcacagtctacatggagctgagcagcctgcgttct gaggacacggccgtgtattactgtgcgagagatgc ggcggattacggtgactacgttgcttttgatatctggg gccaagggacaatggtcaccgtctcttcaggtggag gcggttcaggcggaggtggatccggcggtggcgg ctccggtggcggcggatctgacatccagatgaccc agtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacag agtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattag cagctatctgaattggtatcagcagaaaccaggga aagcccctaagctcctgatctatgctgcatccagtttg caaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtgg atctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctg caacctgaagattttgcaacttactactgtcaacaga gttacagtacccctctcactttcggcggaggtaccaa ggtggagatcaaatcctcgagtgagcccaaatcttct qvqlvqsgaevkk pgasvkvsckas gyiftdyymhwvr qapgqglewmg wmspnsgntgy aqkfqgrvtmtrdt ststvymelsslrs edtavyycardaa dygdyvafdiwgq gtmvtvssgggg sggggsggggsg gggsdiqmtqsp sslsasvgdrvtitc rasqsissylnwy qqkpgkapklliya asslqsgvpsrfsg sgsgtdftltisslqp edfatyycqqsyst pltfgggtkveikss sepkssdkthtcp pcpapeaagaps vflfppkpkdtlmis rtpevtcvvvdvsh SEQ ID NO:137 (SEQ ID NO:138)
Petição 870190046145, de 16/05/2019, pág. 126/260
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gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcac edpevkfnwyvd
ctgaagccgcgggtgcaccgtcagtcttcctcttccc gvevhnaktkpre
cccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccgga eqynstyrvvsvlt
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cgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgt qvytlppsrdeltk
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caaagccaaagggcagccccgagaaccacaggt sdgsfflyskltvdk
gtacaccctgcccccatcccgggatgagctgacca srwqqgnvfscsv
agaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggc mhealhnhytqk
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cctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctcta qvqlvqsgpevkk
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caggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgagg gytfsrstmhwvr
ctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctcc qapgqglewigyi
ctgtctccgggttccggaggagggggttcaggtggg npssaytnynqkf
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gcaactggtgcagagtggacccgaggttaaaaaa ymelsslrsedtav
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gctacacattttccaggagtacaatgcactgggtga ngfpywgqgtlvtv
ggcaggctcctggacagggactcgagtggatcgg ssggggsggggs
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aaatccaccagtacagcttatatggagctgtcatctct gdrvtmtcsasss
taggtccgaggacactgctgtttattactgcgctcgtc vsymnwyqqkp
Petição 870190046145, de 16/05/2019, pág. 127/260
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ctcaggttcactatgactataatggttttccctactggg gtcagggaaccctggtgactgtctcttctggcggtgg aggcagcggtgggggtgggtctggaggcggtggc agtggcggcggaggctctgatattcagatgactcag tctcctagcactctcagcgccagcgtgggggatcgt gtgacaatgacttgctccgctagcagtagtgtgtctta catgaattggtatcagcagaagcccgggaaagca cctaagcgctggatctatgactcttccaagctggcaa gtggtgtcccctcacggttctctggctcaggttctggta ctgactatactttgactatctcctccctccagcccgatg atttcgctacctattattgtcagcagtggagccgtaac ccacccactttcggaggcggtaccaaagtggagat caagaggtcatga gkapkrwiydssk lasgvpsrfsgsgs gtdytltisslqpddf atyycqqwsrnp ptfgggtkveikrs
VHVL de DB60 x TSC456 scFv-FcscFv TRI125 atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctact ctggctcccagataccaccggtcaggtgcagctggt gcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcct cagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacacctt caccagctactatatgcactgggtgcgtcaggcccc tggacaagggcttgagtggatggggtggatcaacc ctaacagtggtgacacaagctatgcacagaagttcc agggccgtgtcaccatgacccgcgacacgtccacg agcacagtctacatggagctgagcagcctgcgttct gaggacacggccgtgtattactgtgcgcaggatagt agtggttccggggcttttgatatctggggccaaggga caatggtcaccgtctcttcaggcggcggcggcagc ggcggcggcggcagcggcggcggaggctccggc ggcggcggcagcgacatccagatgacccagtctc catcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcac catcacttgccgggcaagtcagagcattagcagcta qvqlvqsgaevkk pgasvkvsckas gytftsyymhwvr qapgqglewmg winpnsgdtsyaq kfqgrvtmtrdtsts tvymelsslrsedt avyycaqdssgs gafdiwgqgtmvt vssggggsgggg sggggsggggsd iqmtqspsslsas vgdrvtitcrasqsi ssylnwyqqkpg kapklliyaasslq sgvpsrfsgsgsg SEQ ID NO:139 (SEQ ID NQ:140)
Petição 870190046145, de 16/05/2019, pág. 128/260
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tctgaattggtatcagcagaaaccagggaaagccc tdftltisslqpedfa
ctaagctcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagt tyycqqsystpltfg
ggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctggg ggtkveiksssep
acagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctg kssdkthtcppcp
aagattttgcaacttactactgtcaacagagttacagt apeaagapsvflf
acccctctcactttcggcggaggtaccaaggtggag ppkpkdtlmisrtp
atcaaatcctcgagtgagcccaaatcttctgacaaa evtcvvvdvshed
actcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagc pevkfnwyvdgv
cgcgggtgcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaa evhnaktkpreeq
cccaaggacaccctcatgatctcccggacccctga ynstyrvvsvltvlh
ggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaag qdwlngkeykca
accctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcg vsnkalpapiekti
tggaggtgcataatgccaagacaaagccgcggga skakgqprepqv
ggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcg ytlppsrdeltknq
tcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggca vsltclvkgfypsdi
aggaatacaagtgcgcggtctccaacaaagccctc avewesngqpe
ccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagcca nnykttppvldsd
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gcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccag wqqgnvfscsvm
gtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatccaa healhnhytqksls
gcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggca Ispgsggggsgg
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ctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagct qlvqsgpevkkpg
caccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaa ssvkvsckasgyt
cgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcaca fsrstmhwvrqap
accactacacgcagaagagcctctccctgtctccgg gqglewigyinps
gttccggaggagggggttcaggtgggggaggttctg saytnynqkfkdr
gcggcgggggaagcccttcacaggtgcaactggtg vtitadkststaym
cagagtggacccgaggttaaaaaaccagggtcctc elsslrsedtavyy
Petição 870190046145, de 16/05/2019, pág. 129/260
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cgttaaggttagctgcaaagcctctggctacacatttt ccaggagtacaatgcactgggtgaggcaggctcct ggacagggactcgagtggatcgggtatatcaaccc atctagcgcctataccaattacaaccaaaagtttaag gaccgagttaccattaccgctgacaaatccaccagt acagcttatatggagctgtcatctcttaggtccgagg acactgctgtttattactgcgctcgtcctcaggttcact atgactataatggttttccctactggggtcagggaac cctggtgactgtctcttctggcggtggaggcagcggt gggggtgggtctggaggcggtggcagtggcggcg gaggctctgatattcagatgactcagtctcctagcact ctcagcgccagcgtgggggatcgtgtgacaatgact tgctccgctagcagtagtgtgtcttacatgaattggtat cagcagaagcccgggaaagcacctaagcgctgg atctatgactcttccaagctggcaagtggtgtcccctc acggttctctggctcaggttctggtactgactatactttg actatctcctccctccagcccgatgatttcgctacctat tattgtcagcagtggagccgtaacccacccactttcg gaggcggtaccaaagtggagatcaagaggtcata a carpqvhydyngf pywgqgtlvtvss ggggsggggsgg ggsggggsdiqm tqspstlsasvgdr vtmtcsasssvsy mnwyqqkpgka pkrwiydssklas gvpsrfsgsgsgt dytltisslqpddfat yycqqwsrnpptf gggtkveikrs
VHVL de DB65 x TSC456 scFv-FcscFv TRI126 atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctact ctggctcccagataccaccggtcaggtgcagctggt gcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcct cagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacacctt caccggctactatatgcactgggtgcgtcaggcccc tggacaagggcttgagtggatgggatggatgaacc ctaacagtggtaacacaggctatgcacagaagttcc agggccgtgtcaccatgacccgcgacacgtccacg agcacagtctacatggagctgagcagcctgcgttct qvqlvqsgaevkk pgasvkvsckas gytftgyymhwvr qapgqglewmg wmnpnsgntgy aqkfqgrvtmtrdt ststvymelsslrs edtavyycakee pifgvvmdafdiw SEQ ID NO:141 (SEQ ID NO:142)
Petição 870190046145, de 16/05/2019, pág. 130/260
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gaggacacggccgtgtattactgtgcgaaagagga gqgtmvtvssgg
accgatttttggagtggttatggatgcttttgatatctgg ggsggggsgggg
ggccaagggacaatggtcaccgtctcctcaggcgg sggggsdiqmtq
cggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcg spsslsasvgdrvt
gaggctccggcggcggcggcagcgacatccagat itcrasqsissyln
gacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggag wyqqkpgkapkll
acagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagc iyaasslqsgvpsr
attagcagctatctgaattggtatcagcagaaacca fsgsgsgtdftltiss
gggaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatcc Iqpedfatyycqq
agtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggc systpltfgggtkve
agtggatctgggacagatttcactctcaccatcagca iksssepkssdkt
gtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaa htcppcpapeaa
cagagttacagtacccctctcactttcggcggaggta gapsvflfppkpk
ccaaggtggagatcaaatcctcgagtgagcccaaa dtlmisrtpevtcvv
tcttctgacaaaactcacacatgcccaccgtgccca vdvshedpevkf
gcacctgaagccgcgggtgcaccgtcagtcttcctct nwyvdgvevhna
tccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcc ktkpreeqynstyr
cggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtg vvsvltvlhqdwln
agccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggta gkeykcavsnkal
cgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagaca papiektiskakgq
aagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtac prepqvytlppsrd
cgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggact eltknqvsltclvkg
ggctgaatggcaaggaatacaagtgcgcggtctcc fypsdiavewesn
aacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacca gqpennykttppv
tctccaaagccaaagggcagccccgagaaccac Idsdgsfflyskltv
aggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctg dksrwqqgnvfsc
accaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaa svmhealhnhyt
aggcttctatccaagcgacatcgccgtggagtggga qkslslspgsggg
gagcaatgggcagccggagaacaactacaagac gsggggsggggs
Petição 870190046145, de 16/05/2019, pág. 131/260
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cacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttc ctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtg gcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcat gaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcc tctccctgtctccgggttccggaggagggggttcagg tgggggaggttctggcggcgggggaagcccttcac aggtgcaactggtgcagagtggacccgaggttaaa aaaccagggtcctccgttaaggttagctgcaaagcc tctggctacacattttccaggagtacaatgcactgggt gaggcaggctcctggacagggactcgagtggatc gggtatatcaacccatctagcgcctataccaattaca accaaaagtttaaggaccgagttaccattaccgctg acaaatccaccagtacagcttatatggagctgtcatc tcttaggtccgaggacactgctgtttattactgcgctcg tcctcaggttcactatgactataatggttttccctactgg ggtcagggaaccctggtgactgtctcttctggcggtg gaggcagcggtgggggtgggtctggaggcggtgg cagtggcggcggaggctctgatattcagatgactca gtctcctagcactctcagcgccagcgtgggggatcg tgtgacaatgacttgctccgctagcagtagtgtgtctt acatgaattggtatcagcagaagcccgggaaagc acctaagcgctggatctatgactcttccaagctggca agtggtgtcccctcacggttctctggctcaggttctggt actgactatactttgactatctcctccctccagcccgat gatttcgctacctattattgtcagcagtggagccgtaa cccacccactttcggaggcggtaccaaagtggaga tcaagaggtcataa psqvqlvqsgpev kkpgssvkvsck asgytfsrstmhw vrqapgqglewig yinpssaytnynq kfkdrvtitadkstst aymelsslrsedt avyycarpqvhy dyngfpywgqgtl vtvssggggsgg ggsggggsgggg sdiqmtqspstlsa svgdrvtmtcsas ssvsymnwyqq kpgkapkrwiyds sklasgvpsrfsgs gsgtdytltisslqp ddfatyycqqwsr npptfgggtkveik rs
VLVH de DB82 x atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctact ctggctcccagataccaccggtgacatccagatga diqmtqspsslsa svgdrvtitcrasqt SEQ ID NO:143
Petição 870190046145, de 16/05/2019, pág. 132/260
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TSC456 scFv-FcscFv
TRI127
cccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagac innylnwyqqkpg
cgcgtcaccatcacttgccgggcaagtcagaccat kapklliysastlqs
aaacaactatttgaactggtatcagcagaaaccag gvpsrfsgsgsgt
ggaaagcccctaagctcctgatctattctgcatctact dftltisslqpedfat
ttgcaaagtggggtcccatcacgtttcagtggcagtg yychqsytspltfg
gatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtct ggtkveikggggs
gcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaccag ggggsggggsgg
agttacacttcacctctcactttcggcggaggtacca ggsevqlvesgg
aggtggagatcaaaggcggcggcggcagcggcg glvqpggslrlsca
gcggcggcagcggcggcggaggctccggcggcg asgftfssyamsw
gcggcagcgaggtgcagctggtggagtctggggg vrqapgkglewvs
aggcttggtacagcctggggggtccctgcgcctctc visansaglghad
ctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgcca svkgrftisrdnsk
tgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctg ntlylqmnslraed
gagtgggtctcagttattagtgccaatagtgctggtct tavyycarvgyss
aggccatgcggactctgtgaagggccggttcaccat sadafdiwgqgt
ctcccgcgacaattccaagaacacgctgtatctgca mvtvsssepkss
aatgaacagcctgcgcgccgaggacacggccgta dkthtcppcpape
tattactgtgcgagagtgggctatagcagctcggctg aagapsvflfppk
atgcttttgatatctggggccaagggacaatggtcac pkdtlmisrtpevt
cgtctcctcgagtgagcccaaatcttctgacaaaact cvvvdvshedpe
cacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccg vkfnwyvdgvev
cgggtgcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc hnaktkpreeqyn
caaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggt styrvvsvltvlhqd
cacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagacc wlngkeykcavs
ctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtgg nkalpapiektisk
aggtgcataatgccaagacaaagccgcgggagg akgqprepqvytl
agcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtc ppsrdeltknqvsl
ctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaa tclvkgfypsdiav
(SEQ
NO :144)
ID
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ggaatacaagtgcgcggtctccaacaaagccctcc ewesngqpenn
cagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaa ykttppvldsdgsff
agggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctg lyskltvdksrwqq
cccccatcccgggatgagctgaccaagaaccagg gnvfscsvmheal
tcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatccaag hnhytqkslslspg
cgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcag sggggsggggsg
ccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgct gggspsqvqlvqs
ggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctc gpevkkpgssvk
accgtggacaagagcaggtggcagcaggggaac vsckasgytfsrst
gtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaa mhwvrqapgqgl
ccactacacgcagaagagcctctccctgtctccggg ewigyinpssayt
ttccggaggagggggttcaggtgggggaggttctgg nynqkfkdrvtita
cggcgggggaagcccttcacaggtgcaactggtgc dkststaymelssl
agagtggacccgaggttaaaaaaccagggtcctcc rsedtavyycarp
gttaaggttagctgcaaagcctctggctacacattttc qvhydyngfpyw
caggagtacaatgcactgggtgaggcaggctcctg gqgtlvtvssggg
gacagggactcgagtggatcgggtatatcaaccca gsggggsggggs
tctagcgcctataccaattacaaccaaaagtttaagg ggggsdiqmtqs
accgagttaccattaccgctgacaaatccaccagta pstlsasvgdrvt
cagcttatatggagctgtcatctcttaggtccgaggac mtcsasssvsym
actgctgtttattactgcgctcgtcctcaggttcactatg nwyqqkpgkapk
actataatggttttccctactggggtcagggaaccctg rwiydssklasgv
gtgactgtctcttctggcggtggaggcagcggtggg psrfsgsgsgtdyt
ggtgggtctggaggcggtggcagtggcggcggag Itisslqpddfatyy
gctctgatattcagatgactcagtctcctagcactctc cqqwsrnpptfgg
agcgccagcgtgggggatcgtgtgacaatgacttg ctccgctagcagtagtgtgtcttacatgaattggtatc agcagaagcccgggaaagcacctaagcgctggat ctatgactcttccaagctggcaagtggtgtcccctca gtkveikrs
Petição 870190046145, de 16/05/2019, pág. 134/260
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cggttctctggctcaggttctggtactgactatactttga ctatctcctccctccagcccgatgatttcgctacctatt attgtcagcagtggagccgtaacccacccactttcg gaggcggtaccaaagtggagatcaagaggtcata a
VHVL de DB83 x TSC456 scFv-FcscFv TRI134 atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctact ctggctcccagataccaccggtcaggtgcagctggt gcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcct cagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacacctt cactagctatgctatgcattgggtgcgtcaggcccct ggacaagggcttgagtggatgggacttgttgatcctg aagatggtgaaacaatatatgcagagaagttccag ggccgtgtcaccatgacccgcgacacgtccacgag cacagtctacatggagctgagcagcctgcgttctga ggacacggccgtgtattactgtgcgagacgaacgt attactatgatagtagtggttcccgttatgcttttgatatc tggggccaagggaccacggtcaccgtctcttcagg cggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcg gcggaggctccggcggcggcggcagcgatgttgtg atgactcagtctccactctccctgcccgtcacccctg gagagccggcctccatctcctgcaggtctagtcaga gcctcctgcatagtaatggagacaactatttggattg gtacctgcagaagccagggcagtctccacagctcc tgatctatttgggttctaatcgggcctccggggtccctg accgtttcagtggcagtggatcaggcacagattttac actgaaaatcagccgtgtggaggctgaggatgttgg ggtttattactgcatgcaagctacacactggccactc actttcggccctggtaccaaagtggatatcaaatcct cgagtgagcccaaatcttctgacaaaactcacacat qvqlvqsgaevkk pgasvkvsckas gytftsyamhwvr qapgqglewmgl vdpedgetiyaek fqgrvtmtrdtstst vymelsslrsedta vyycarrtyyydss gsryafdiwgqgtt vtvssggggsgg ggsggggsgggg sdvvmtqsplslp vtpgepasiscrss qsllhsngdnyld wylqkpgqspqlli ylgsnrasgvpdrf sgsgsgtdftlkisr veaedvgvyycm qathwpltfgpgtk vdiksssepkssd kthtcppcpapea agapsvflfppkp kdtlmisrtpevtcv vvdvshedpevkf SEQ ID NO:145 (SEQ ID NO:146)
Petição 870190046145, de 16/05/2019, pág. 135/260
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gcccaccgtgcccagcacctgaagccgcgggtgc nwyvdgvevhna
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caccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatg vvsvltvlhqdwln
cgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgag gkeykcavsnkal
gtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtg papiektiskakgq
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gaggagggggttcaggtgggggaggttctggcggc kfkdrvtitadkstst
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Petição 870190046145, de 16/05/2019, pág. 136/260
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ataatggttttccctactggggtcagggaaccctggt gactgtctcttctggcggtggaggcagcggtggggg tgggtctggaggcggtggcagtggcggcggaggct ctgatattcagatgactcagtctcctagcactctcagc gccagcgtgggggatcgtgtgacaatgacttgctcc gctagcagtagtgtgtcttacatgaattggtatcagca gaagcccgggaaagcacctaagcgctggatctatg actcttccaagctggcaagtggtgtcccctcacggtt ctctggctcaggttctggtactgactatactttgactatc tcctccctccagcccgatgatttcgctacctattattgtc agcagtggagccgtaacccacccactttcggaggc ggtaccaaagtggagatcaagaggtcataa sklasgvpsrfsgs gsgtdytltisslqp ddfatyycqqwsr npptfgggtkveik rs
VHVL de DB86 x TSC456 scFv-FcscFv TRI128 atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctact ctggctcccagataccaccggtcaggtgcagctggt gcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcct cagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatatatgttc agtggccattctgcacactgggtgcgtcaggcccct ggacaagggcttgagtggatgggatggatgaaccc taacagtggtaacacaggctatgcacagaagttcc agggccgtgtcaccatgacccgcgacacgtccacg agcacagtctacatggagctgagcagcctgcgttct gaggacacggccgtgtattactgtgcgagagatag cagtggctggtacgatgtctttgactactggggccag gggaccctggtcaccgtctcctcaggtggaggcggt tcaggcggaggtggatccggcggtggcggctccgg tggcggcggatctgacatccagatgacccagtctcc atcctccctgtctgcatctgtaggagaccgcgtcacc atcacttgccgggcaagtcagggcatcagaaatga tttaggttggtatcagcagaaaccagggaaagccc qvqlvqsgaevkk pgasvkvsckas gymfsghsahwv rqapgqglewmg wmnpnsgntgy aqkfqgrvtmtrdt ststvymelsslrs edtavyycardss gwydvfdywgqg tlvtvssggggsgg ggsggggsgggg sdiqmtqspssls asvgdrvtitcras qgirndlgwyqqk pgkapklliyaastl qsgvpsrfsgsgs gtdftltisslqpedf SEQ ID NO:147 (SEQ ID NO:148)
Petição 870190046145, de 16/05/2019, pág. 137/260
134/236
ctaagctcctgatctatgctgcatccactttgcaatca atyycqqsygaplt
ggggtcccatcacgtttcagtggcagtggatctggg fgggtkveikssse
acagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctg pkssdkthtcppc
aagattttgcaacttactactgtcaacagagttacggt papeaagapsvfl
gcccccctcactttcggcggaggtaccaaggtgga fppkpkdtlmisrt
gatcaaatcctcgagtgagcccaaatcttctgacaa pevtcvvvdvshe
aactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaag dpevkfnwyvdg
ccgcgggtgcaccgtcagtcttcctcttccccccaaa vevhnaktkpree
acccaaggacaccctcatgatctcccggacccctg qynstyrvvsvltvl
aggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaa hqdwlngkeykc
gaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggc avsnkalpapiekt
gtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcggg iskakgqprepqv
aggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagc ytlppsrdeltknq
gtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggc vsltclvkgfypsdi
aaggaatacaagtgcgcggtctccaacaaagccct avewesngqpe
cccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagcc nnykttppvldsd
aaagggcagccccgagaaccacaggtgtacacc gsfflyskltvdksr
ctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaacca wqqgnvfscsvm
ggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcca healhnhytqksls
agcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggc Ispgsggggsgg
agccggagaacaactacaagaccacgcctcccgt ggsggggspsqv
gctggactccgacggctccttcttcctctacagcaag qlvqsgpevkkpg
ctcaccgtggacaagagcaggtggcagcagggg ssvkvsckasgyt
aacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgca fsrstmhwvrqap
caaccactacacgcagaagagcctctccctgtctcc gqglewigyinps
gggttccggaggagggggttcaggtgggggaggtt saytnynqkfkdr
ctggcggcgggggaagcccttcacaggtgcaactg vtitadkststaym
gtgcagagtggacccgaggttaaaaaaccagggt elsslrsedtavyy
cctccgttaaggttagctgcaaagcctctggctacac carpqvhydyngf
Petição 870190046145, de 16/05/2019, pág. 138/260
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attttccaggagtacaatgcactgggtgaggcaggc tcctggacagggactcgagtggatcgggtatatcaa cccatctagcgcctataccaattacaaccaaaagttt aaggaccgagttaccattaccgctgacaaatccac cagtacagcttatatggagctgtcatctcttaggtccg aggacactgctgtttattactgcgctcgtcctcaggttc actatgactataatggttttccctactggggtcaggga accctggtgactgtctcttctggcggtggaggcagcg gtgggggtgggtctggaggcggtggcagtggcggc ggaggctctgatattcagatgactcagtctcctagca ctctcagcgccagcgtgggggatcgtgtgacaatga cttgctccgctagcagtagtgtgtcttacatgaattggt atcagcagaagcccgggaaagcacctaagcgctg gatctatgactcttccaagctggcaagtggtgtcccct cacggttctctggctcaggttctggtactgactatacttt gactatctcctccctccagcccgatgatttcgctacct attattgtcagcagtggagccgtaacccacccacttt cggaggcggtaccaaagtggagatcaagaggtca taa pywgqgtlvtvss ggggsggggsgg ggsggggsdiqm tqspstlsasvgdr vtmtcsasssvsy mnwyqqkpgka pkrwiydssklas gvpsrfsgsgsgt dytltisslqpddfat yycqqwsrnpptf gggtkveikrs
VHVL de DB280 x TSC456 scFv-FcscFv TRI131 atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctact ctggctcccagataccaccggtcaggtgcagctggt gcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcct cagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacagcct caacttatactatatgcactgggtgcgtcaggcccct ggacaagggcttgagtggatgggatggatgaaccc taacagtggtaacacaggctatgcacagaagttcc agggccgtgtcaccatgacccgcgacacgtccacg agcacagtctacatggagctgagcagcctgcgttct gaggacacggccgtgtattactgtgcgagcctcgatt qvqlvqsgaevkk pgasvkvsckas gyslnlyymhwvr qapgqglewmg wmnpnsgntgy aqkfqgrvtmtrdt ststvymelsslrs edtavyycasldc sggscyseydafd iwgqgttvtvssgg SEQ ID NO:149 (SEQ ID NQ:150)
Petição 870190046145, de 16/05/2019, pág. 139/260
136/236
gtagtggtggtagctgctactccgaatatgatgcttttg ggsggggsgggg
atatctggggccaagggaccacggtcaccgtctcct sggggsdiqmtq
caggcggcggcggcagcggcggcggcggcagc spsslsasvgdrvt
ggcggcggaggctccggcggcggcggcagcgac itcrasqsissyln
atccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatc wyqqkpgkapkll
tgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaa iyaasslqsgvpsr
gtcagagcattagcagctatctgaattggtatcagca fsgsgsgtdftltiss
gaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatg Iqpedfatyycqq
ctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggtt systpltfgggtkve
cagtggcagtggatctgggacagatttcactctcacc iksssepkssdkt
atcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttacta htcppcpapeaa
ctgtcaacagagttacagtacccctctcactttcggc gapsvflfppkpk
ggaggtaccaaggtggagatcaaatcctcgagtga dtlmisrtpevtcvv
gcccaaatcttctgacaaaactcacacatgcccacc vdvshedpevkf
gtgcccagcacctgaagccgcgggtgcaccgtca nwyvdgvevhna
gtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctc ktkpreeqynstyr
atgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtg vvsvltvlhqdwln
gtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagtt gkeykcavsnkal
caactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatg papiektiskakgq
ccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaaca prepqvytlppsrd
gcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgca eltknqvsltclvkg
ccaggactggctgaatggcaaggaatacaagtgc fypsdiavewesn
gcggtctccaacaaagccctcccagcccccatcga gqpennykttppv
gaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccg Idsdgsfflyskltv
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ctggtcaaaggcttctatccaagcgacatcgccgtg qkslslspgsggg
gagtgggagagcaatgggcagccggagaacaac gsggggsggggs
tacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacgg psqvqlvqsgpev
Petição 870190046145, de 16/05/2019, pág. 140/260
137/236
ctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaag agcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctcc gtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgca gaagagcctctccctgtctccgggttccggaggagg gggttcaggtgggggaggttctggcggcgggggaa gcccttcacaggtgcaactggtgcagagtggaccc gaggttaaaaaaccagggtcctccgttaaggttagc tgcaaagcctctggctacacattttccaggagtacaa tgcactgggtgaggcaggctcctggacagggactc gagtggatcgggtatatcaacccatctagcgcctata ccaattacaaccaaaagtttaaggaccgagttacca ttaccgctgacaaatccaccagtacagcttatatgga gctgtcatctcttaggtccgaggacactgctgtttatta ctgcgctcgtcctcaggttcactatgactataatggtttt ccctactggggtcagggaaccctggtgactgtctctt ctggcggtggaggcagcggtgggggtgggtctgga ggcggtggcagtggcggcggaggctctgatattca gatgactcagtctcctagcactctcagcgccagcgt gggggatcgtgtgacaatgacttgctccgctagcag tagtgtgtcttacatgaattggtatcagcagaagccc gggaaagcacctaagcgctggatctatgactcttcc aagctggcaagtggtgtcccctcacggttctctggct caggttctggtactgactatactttgactatctcctccct ccagcccgatgatttcgctacctattattgtcagcagt ggagccgtaacccacccactttcggaggcggtacc aaagtggagatcaagaggtcataa kkpgssvkvsck asgytfsrstmhw vrqapgqglewig yinpssaytnynq kfkdrvtitadkstst aymelsslrsedt avyycarpqvhy dyngfpywgqgtl vtvssggggsgg ggsggggsgggg sdiqmtqspstlsa svgdrvtmtcsas ssvsymnwyqq kpgkapkrwiyds sklasgvpsrfsgs gsgtdytltisslqp ddfatyycqqwsr npptfgggtkveik rs
VHVL de DB331 x TSC456 atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctact ctggctcccagataccaccggtcaggtgcagctggt gcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcct qvqlvqsgaevkk pgasvkvsckas gytftsyymhwvr SEQ ID NO:151 (SEQ ID
Petição 870190046145, de 16/05/2019, pág. 141/260
138/236 scFv-FcscFv
TRI132
cagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacacctt qapgqglewmg
caccagctactatatgcactgggtgcgtcaggcccc wmnpnsgntgy
tggacaagggcttgagtggatgggatggatgaacc aqkfqgrvtmtrdt
ctaacagtggtaacacaggctatgcacagaagttcc ststvymelsslrs
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agcacagtctacatggagctgagcagcctgcgttct gealfdpwgqgtl
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gcgggggaagccttgttcgacccctggggccaggg ggsggggsgggg
caccctggtcaccgtctcctcaggcggcggcggca sdiqmtqspssls
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gcggcggcggcagcgacatccagatgacccagtc qsissylnwyqqk
tccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtc pgkapklliyaass
accatcacttgccgggcaagtcagagcattagcag Iqsgvpsrfsgsgs
ctatctgaattggtatcagcagaaaccagggaaag gtdftltisslqpedf
cccctaagctcctgatctatgctgcatccagtttgcaa atyycqqsystpltf
agtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatct gggtkveikssse
gggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaa pkssdkthtcppc
cctgaagattttgcaacttactactgtcaacagagtta papeaagapsvfl
cagtacccctctcactttcggcggaggtaccaaggt fppkpkdtlmisrt
ggagatcaaatcctcgagtgagcccaaatcttctga pevtcvvvdvshe
caaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctg dpevkfnwyvdg
aagccgcgggtgcaccgtcagtcttcctcttcccccc vevhnaktkpree
aaaacccaaggacaccctcatgatctcccggaccc qynstyrvvsvltvl
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gaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtgga avsnkalpapiekt
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tcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctga vsltclvkgfypsdi
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NO:152)
Petição 870190046145, de 16/05/2019, pág. 142/260
139/236
agccctcccagcccccatcgagaaaaccatctcca nnykttppvldsd
aagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgt gsfflyskltvdksr
acaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaag wqqgnvfscsvm
aaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttc healhnhytqksls
tatccaagcgacatcgccgtggagtgggagagca Ispgsggggsgg
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caactggtgcagagtggacccgaggttaaaaaac elsslrsedtavyy
cagggtcctccgttaaggttagctgcaaagcctctgg carpqvhydyngf
ctacacattttccaggagtacaatgcactgggtgag pywgqgtlvtvss
gcaggctcctggacagggactcgagtggatcgggt ggggsggggsgg
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aaaagtttaaggaccgagttaccattaccgctgaca tqspstlsasvgdr
aatccaccagtacagcttatatggagctgtcatctctt vtmtcsasssvsy
aggtccgaggacactgctgtttattactgcgctcgtcc mnwyqqkpgka
tcaggttcactatgactataatggttttccctactgggg pkrwiydssklas
tcagggaaccctggtgactgtctcttctggcggtgga gvpsrfsgsgsgt
ggcagcggtgggggtgggtctggaggcggtggca dytltisslqpddfat
gtggcggcggaggctctgatattcagatgactcagt yycqqwsrnpptf
ctcctagcactctcagcgccagcgtgggggatcgtg tgacaatgacttgctccgctagcagtagtgtgtcttac atgaattggtatcagcagaagcccgggaaagcac ctaagcgctggatctatgactcttccaagctggcaag tggtgtcccctcacggttctctggctcaggttctggtac gggtkveikrs
Petição 870190046145, de 16/05/2019, pág. 143/260
140/236
tgactatactttgactatctcctccctccagcccgatga tttcgctacctattattgtcagcagtggagccgtaacc cacccactttcggaggcggtaccaaagtggagatc aagaggtcataa
VHVL de DB415 x TSC456 scFv-FcscFv TRI138 atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctact ctggctcccagataccaccggtgaggtgcagctggt ggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggt ccctgcgcctctcctgtgcagcctctggaatcaccttc agtagttatggcatgcattgggtccgccaggctccag ggaaggggctggagtgggtctcaggtattagttgga atagtggtaacagagtctatgtggactctgtgaaggg ccggttcaccatctcccgcgacaattccaagaacac gctgtatctgcaaatgaacagcctgcgcgccgagg acacggccgtatattactgtgcgagagatactaatg atgcttttgatatctggggccaagggaccacggtcac cgtctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtg gatccggcggtggcggctccggtggcggcggatct gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctg catctgtaggagacagagtcaccatcacttgccggg caagtcagagcattagcagctatctgaattggtatca gcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatct atgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaag gttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctc accatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaactt actactgtcaacagagttacagtacccctctcactttc ggcggaggtaccaaggtggagatcaaatcctcga gtgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgcc caccgtgcccagcacctgaagccgcgggtgcacc gtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacac evqlvesggglvq pggslrlscaasgit fssygmhwvrqa pgkglewvsgis wnsgnrvyvdsv kgrftisrdnskntl ylqmnslraedta vyycardtndafdi wgqgttvtvssgg ggsggggsgggg sggggsdiqmtq spsslsasvgdrvt itcrasqsissyln wyqqkpgkapkll iyaasslqsgvpsr fsgsgsgtdftltiss Iqpedfatyycqq systpltfgggtkve iksssepkssdkt htcppcpapeaa gapsvflfppkpk dtlmisrtpevtcvv vdvshedpevkf nwyvdgvevhna ktkpreeqynstyr SEQ ID NO:153 (SEQ ID NO:154)
Petição 870190046145, de 16/05/2019, pág. 144/260
141/236
cctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtg vvsvltvlhqdwln
gtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtca gkeykcavsnkal
agttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcata papiektiskakgq
atgccaagacaaagccgcgggaggagcagtaca prepqvytlppsrd
acagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcct eltknqvsltclvkg
gcaccaggactggctgaatggcaaggaatacaag fypsdiavewesn
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cgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagcc Idsdgsfflyskltv
ccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatccc dksrwqqgnvfsc
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cgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaa gsggggsggggs
caactacaagaccacgcctcccgtgctggactccg psqvqlvqsgpev
acggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtgga kkpgssvkvsck
caagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcat asgytfsrstmhw
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cgcagaagagcctctccctgtctccgggttccggag yinpssaytnynq
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ggaagcccttcacaggtgcaactggtgcagagtgg aymelsslrsedt
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tagctgcaaagcctctggctacacattttccaggagt dyngfpywgqgtl
acaatgcactgggtgaggcaggctcctggacagg vtvssggggsgg
gactggagtggatcgggtatatcaacccatctagcg ggsggggsgggg
cctataccaattacaaccaaaagtttaaggaccgag sdiqmtqspstlsa
ttaccattaccgctgacaaatccaccagtacagctta svgdrvtmtcsas
tatggagctgtcatctcttaggtccgaggacactgctg ssvsymnwyqq
tttattactgcgctcgtcctcaggttcactatgactataa kpgkapkrwiyds
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tctcttctggcggtggaggcagcggtgggggtgggt gsgtdytltisslqp
Petição 870190046145, de 16/05/2019, pág. 145/260
142/236
ctggaggcggtggcagtggcggcggaggctctgat attcagatgactcagtctcctagcactctcagcgcca gcgtgggggatcgtgtgacaatgacttgctccgcta gcagtagtgtgtcttacatgaattggtatcagcagaa gcccgggaaagcacctaagcgctggatctatgact cttccaagctggcaagtggtgtcccctcacggttctct ggctcaggttctggtactgactatactttgactatctcct ccctccagcccgatgatttcgctacctattattgtcagc agtggagccgtaacccacccactttcggaggcggt accaaagtggagatcaagaggtcatga ddfatyycqqwsr npptfgggtkveik rs
VHVL de DB435 x TSC456 scFv-FcscFv TRI139 atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctact ctggctcccagataccaccggtcaggtgcagctggt gcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcct cagtgaaggtttcctgcaaggcatctggaggcacctt cagcagctatgctatcagctgggtgcgtcaggcccc tggacaagggcttgagtggatgggctggatcaccc ctcacaatggtaacataaagtatgcacgggagttcc agggccgtgtcaccatgacccgcgacacgtccacg agcacagtctacatggagctgagcagcctgcgttct gaggacacggccgtgtattactgtgcgaaagatctg aactggaacgcagcctttgactactggggccaggg gaccctggtcaccgtctcctcaggtggaggcggttc aggcggaggtggatccggcggtggcggctccggt ggcggcggatctgacatccagatgacccagtctcc atcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcacc atcacttgccgggcaagtcagagcattagcagctat ctgaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccc taagctcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtg gggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctggga qvqlvqsgaevkk pgasvkvsckas ggtfssyaiswvrq apgqglewmgwi tphngnikyarefq grvtmtrdtststvy melsslrsedtavy ycakdlnwnaafd ywgqgtlvtvssg gggsggggsggg gsggggsdiqmt qspsslsasvgdr vtitcrasqsissyl nwyqqkpgkapk lliyaasslqsgvp srfsgsgsgtdftlti sslqpedfatyycq qsystpltfgggtkv eiksssepkssdk SEQ ID NO:155 (SEQ ID NO:156)
Petição 870190046145, de 16/05/2019, pág. 146/260
143/236
cagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctga thtcppcpapeaa
agattttgcaacttactactgtcaacagagttacagta gapsvflfppkpk
cccctctcactttcggcggaggtaccaaggtggaga dtlmisrtpevtcvv
tcaaatcctcgagtgagcccaaatcttctgacaaaa vdvshedpevkf
ctcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagcc nwyvdgvevhna
gcgggtgcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaac ktkpreeqynstyr
ccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgag vvsvltvlhqdwln
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ccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgt papiektiskakgq
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tcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggca fypsdiavewesn
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ccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagcca Idsdgsfflyskltv
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gcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggca gsggggsggggs
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Petição 870190046145, de 16/05/2019, pág. 147/260
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atctagcgcctataccaattacaaccaaaagtttaag gaccgagttaccattaccgctgacaaatccaccagt acagcttatatggagctgtcatctcttaggtccgagg acactgctgtttattactgcgctcgtcctcaggttcact atgactataatggttttccctactggggtcagggaac cctggtgactgtctcttctggcggtggaggcagcggt gggggtgggtctggaggcggtggcagtggcggcg gaggctctgatattcagatgactcagtctcctagcact ctcagcgccagcgtgggggatcgtgtgacaatgact tgctccgctagcagtagtgtgtcttacatgaattggtat cagcagaagcccgggaaagcacctaagcgctgg atctatgactcttccaagctggcaagtggtgtcccctc acggttctctggctcaggttctggtactgactatactttg actatctcctccctccagcccgatgatttcgctacctat tattgtcagcagtggagccgtaacccacccactttcg gaggcggtaccaaagtggagatcaagaggtcatg a sdiqmtqspstlsa svgdrvtmtcsas ssvsymnwyqq kpgkapkrwiyds sklasgvpsrfsgs gsgtdytltisslqp ddfatyycqqwsr npptfgggtkveik rs
CDR1 de VH (Kabat) de Cris7 e DRA222 RSTMH (SEQ ID NO:165)
CDR2 de VH (Kabat) de Cris7 e YINPSSAYTN YNQKFK (SEQ ID NO:166)
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DRA222
CDR3 de VH (Kabat) de Cris7 e DRA222 QVHYDYNGF PY (SEQ ID NO:167)
CDR1 de VL (Kabat) de Cris7 e DRA222 SASSSVSYM N (SEQ ID NO:162)
CDR2 de VL (Kabat) de Cris7 e DRA222 DSSKLAS (SEQ ID NO:163)
CDR3 de VL (Kabat) de Cris7 e DRA222 QQWSRNPPT (SEQ ID NO:164)
CDR1 de VH GY 11-1 RST (SEQ ID NO:171)
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(IMGT) de Cris7 e DRA222
CDR2 de VH (IMGT) de Cris7 e DRA222 INPSSAYT (SEQ ID NO:172)
CDR3 de VH (IMGT) de Cris7 e DRA222 QQWSRNPPT (SEQ ID NO:173)
CDR1 de VL (IMGT) de Cris7 e DRA222 ASSSVSY (SEQ ID NO:168)
CDR2 de VL (IMGT) de Cris7 e DRA222 DSS (SEQ ID NO:169)
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CDR3 de VL (IMGT) de Cris7 e DRA222 QQWSRNPPT (SEQ ID NO:170)
CDR1 de VH (Kabat) de I2C KYAMN (SEQ ID NO :174)
CDR2 de VH (Kabat) de I2C RIRSKYNNYA TYYADSVKD (SEQ ID NO:175)
CDR3 de VH (Kabat) de I2C HGNFGNSYIS YWAY (SEQ ID NO:176)
CDR1 de VL (Kabat) de I2C GSSTGAVTS GNYPN (SEQ ID NO:307)
CDR2 de VL (Kabat) de I2C GTKFLAP (SEQ ID NO:308)
CDR3 de VLWYSNRWV (SEQ ID
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VL (Kabat) de I2C NO:309)
CDR1 de VH (IMGT) de I2C GFTFNKYA (SEQ ID NO:179)
CDR2 de VH (IMGT) de I2C IRSKYNNYAT (SEQ ID NQ:180)
CDR3 de VH (IMGT) de I2C VRHGNFGNS YISYWAY (SEQ ID NO:181)
CDR1 de VL (IMGT) de I2C TGAVTSGNY (SEQ ID NQ:310)
CDR2 de VL (IMGT) de I2C GTK (SEQ ID NO:177)
CDR3 de VL (IMGT) de I2C VLWYSNRWV (SEQ ID NO:178)
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CDR1 de VH (Kabat) de HuM291 SYTMH (SEQ ID NO:185)
CDR2 de VH (Kabat) de HuM291 YINPRSGYTH YNQKLKD (SEQ ID NO:186)
CDR3 de VH (Kabat) de HuM291 SAYYDYDGF AY (SEQ ID NO:187)
CDR1 de VL (Kabat) de HuM291 SASSSVSYM N (SEQ ID NO:182)
CDR2 de VL (Kabat) de HuM291 DTSKLAS (SEQ ID NO:183)
CDR3 de VL QQWSSNPPT (SEQ ID NO:184)
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(Kabat) de HuM291
CDR1 de VH (IMGT) de HuM291 GYTFISYT (SEQ ID NO:191)
CDR2 de VH (IMGT) de HuM291 INPRSGYT (SEQ ID NO:192)
CDR3 de VH (IMGT) de HuM291 ARSAYYDYD GFAY (SEQ ID NO:193)
CDR1 de VL (IMGT) de HuM291 ASSSVSY (SEQ ID NO:188)
CDR2 de VL (IMGT) de DTS (SEQ ID NO:189)
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HuM291
CDR3 de VL (IMGT) de HuM291 QQWSSNPPT (SEQ ID NO:190)
TSC455 (antiCD3) scFv de TSC394 F87Y QVQLVQSGP EVKKPGSSV KVSCKASGY TFSRSTMHW VRQAPGQGL EWIGYINPSS AYTNYNQKF KDRVTITADK STSTAYMELS SLRSEDTAVY YCARPQVHY DYNGFPYWG QGTLVTVSS GGGGSGGG GSGGGGSG GGGSDIQMT QSPSTLSASV GDRVTMTCS ASSSVSYMN WYQQKPGKA PKRWIYDSS KLASGVPSR (SEQ ID NO:311)
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FSGSGSGTE YTLTISSLQP DDFATYYCQ QWSRNPPTF GGGTKVEIKR SSS
TSC456 (antiCD3) scFv de TSC394 E86D F87Y QVQLVQSGP EVKKPGSSV KVSCKASGY TFSRSTMHW VRQAPGQGL EWIGYINPSS AYTNYNQKF KDRVTITADK STSTAYMELS SLRSEDTAVY YCARPQVHY DYNGFPYWG QGTLVTVSS GGGGSGGG GSGGGGSG GGGSDIQMT QSPSTLSASV GDRVTMTCS ASSSVSYMN WYQQKPGKA PKRWIYDSS KLASGVPSR FSGSGSGTD (SEQ ID NO:312)
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YTLTISSLQP DDFATYYCQ QWSRNPPTF GGGTKVEIKR SSS
domínio pesado variável de TSC455 e TSC456 QVQLVQSGP EVKKPGSSV KVSCKASGY TFSRSTMHW VRQAPGQGL EWIGYINPSS AYTNYNQKF KDRVTITADK STSTAYMELS SLRSEDTAVY YCARPQVHY DYNGFPYWG QGTLVTVSS (SEQ ID NO:159)
domínio leve variável de TSC455 DIQMTQSPST LSASVGDRV TMTCSASSS VSYMNWYQ QKPGKAPKR WIYDSSKLAS GVPSRFSGS GSGTEYTLTI SSLQPDDFA (SEQ ID NO:157)
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TYYCQQWSR NPPTFGGGT KVEIKRS
domínio leve variável de TSC456 DIQMTQSPST LSASVGDRV TMTCSASSS VSYMNWYQ QKPGKAPKR WIYDSSKLAS GVPSRFSGS GSGTDYTLTI SSLQPDDFA TYYCQQWSR NPPTFGGGT KVEIKRS (SEQ ID NO:158)
DRA222 (antiCD3) scFv QVQLVESGG GVVQPGRSL RLSCKASGY TFTRSTMHW VRQAPGQGL EWIGYINPSS AYTNYNQKF KDRFTISADK SKSTAFLQM DSLRPEDTG VYFCARPQV (SEQ ID NO:313)
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HYDYNGFPY WGQGTPVTV SSGGGGSG GGGSGGGG SAQDIQMTQ SPSSLSASV GDRVTMTCS ASSSVSYMN WYQQKPGKA PKRWIYDSS KLASGVPAR FSGSGSGTD YTLTISSLQP EDFATYYCQ QWSRNPPTF GGGTKLQITS SS
domínio pesado variável de DRA222 QVQLVESGG GVVQPGRSL RLSCKASGY TFTRSTMHW VRQAPGQGL EWIGYINPSS AYTNYNQKF KDRFTISADK SKSTAFLQM DSLRPEDTG VYFCARPQV HYDYNGFPY (SEQ ID NO:161)
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WGQGTPVTV SS
domínio leve variável de DRA222 DIQMTQSPS SLSASVGDR VTMTCSASS SVSYMNWYQ QKPGKAPKR WIYDSSKLAS GVPARFSGS GSGTDYTLTI SSLQPEDFAT YYCQQWSR NPPTFGGGT KLQITS (SEQ ID NO:160)
[0179] As proteínas de ligação de CD123 podem compreender qualquer um dos domínios de ligação a CD123 descritos acima. Em alguns aspectos, as proteínas de ligação de CD123 compreendem sequências de aminoácidos de VH ou VL humanizadas ou ambas.
[0180] Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88% idêntica, pelo menos 89% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 91% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4. Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88% idêntica, pelo menos 89% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 91% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 94% idêntica,
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157/236 pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:4. Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NQ:130 ou SEQ ID NO:132. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, ou pelo menos cerca de 99% idêntica à porção de scFv da sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NQ:130 ou SEQ ID NO:132. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo compreende ou consiste numa sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NQ:130, ou SEQ ID NO:132.
[0181] Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88% idêntica, pelo menos 89% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 91% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:18 ou SEQ ID NQ:20. Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88% idêntica, pelo menos 89% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 91% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:18 e SEQ ID NQ:20. Os
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158/236 polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:18 ou SEQ ID NQ:20. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:136, ou SEQ ID NO:138. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, ou pelo menos cerca de 99% idêntica à porção de scFv da sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:136, ou SEQ ID NO:138. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo compreende ou consiste numa sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:18, SEQ ID NQ:20, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:136, ou SEQ ID NO:138.
[0182] Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88% idêntica, pelo menos 89% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 91% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:18 ou SEQ ID NO:34. Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88% idêntica, pelo menos 89% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 91% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:18 e SEQ ID NO:34. Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de
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99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:18 ou SEQ ID NO:34. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:140. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, ou pelo menos cerca de 99% idêntica à porção de scFv da sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:140. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo compreende ou consiste numa sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:34, ou SEQ ID NO:140.
[0183] Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88% idêntica, pelo menos 89% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 91% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:18 ou SEQ ID NO:42. Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88% idêntica, pelo menos 89% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 91% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:18 e SEQ ID NO:42. Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:18 ou SEQ ID NO:42. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, ou pelo menos cerca de 99% idêntica à
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160/236 sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:142. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, ou pelo menos cerca de 99% idêntica à porção de scFv da sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:142. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo compreende ou consiste numa sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:42, ou SEQ ID NO:142.
[0184] Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88% idêntica, pelo menos 89% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 91% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:50 ou SEQ ID NO:52. Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88% idêntica, pelo menos 89% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 91% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:50 e SEQ ID NO:52. Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:50 ou SEQ ID NO:52. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:144. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, ou pelo menos cerca de 99% idêntica à porção de scFv da sequência de aminoácidos
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161/236 estabelecida na SEQ ID NO:144. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo compreende ou consiste numa sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NQ:50, SEQ ID NO:52, ou SEQ ID NO:144.
[0185] Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88% idêntica, pelo menos 89% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 91% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:66 ou SEQ ID NO:68. Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88% idêntica, pelo menos 89% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 91% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:66 e SEQ ID NO:68. Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:66 ou SEQ ID NO:68. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:146. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, ou pelo menos cerca de 99% idêntica à porção de scFv da sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:146. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo compreende ou consiste numa sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, ou SEQ ID NO:146.
[0186] Os polipeptídeos podem compreender uma
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162/236 sequência de aminoácidos que é pelo menos 88% idêntica, pelo menos 89% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 91% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:82 ou SEQ ID NO:84. Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88% idêntica, pelo menos 89% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 91% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:82 e SEQ ID NO:84. Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:82 ou SEQ ID NO:84. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:148. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, ou pelo menos cerca de 99% idêntica à porção de scFv da sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:148. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo compreende ou consiste numa sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, ou SEQ ID NO:148.
[0187] Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88% idêntica, pelo menos 89% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 91% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98%
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163/236 idêntica ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:18 ou SEQ ID NO:98. Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88% idêntica, pelo menos 89% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 91% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:18 e SEQ ID NO:98. Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:18 ou SEQ ID NQ:150. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NQ:150. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, ou pelo menos cerca de 99% idêntica à porção de scFv da sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NQ:140. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo compreende ou consiste numa sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:98, ou SEQ ID NQ:150.
[0188] Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88% idêntica, pelo menos 89% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 91% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:18 ou SEQ ID NQ:106. Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88% idêntica, pelo menos 89% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 91% idêntica,
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164/236 pelo menos 92% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:18 e SEQ ID NO:106. Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:18 ou SEQ ID NQ:106. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:152. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, ou pelo menos cerca de 99% idêntica à porção de scFv da sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:152. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo compreende ou consiste numa sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:18, SEQ ID NQ:106, ou SEQ ID NO:152.
[0189] Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88% idêntica, pelo menos 89% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 91% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:18 ou SEQ ID NO:114. Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88% idêntica, pelo menos 89% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 91% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:18 e SEQ ID NO:114. Os
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165/236 polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:18 ou SEQ ID NO:114. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:154. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, ou pelo menos cerca de 99% idêntica à porção de scFv da sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:154. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo compreende ou consiste numa sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:114, ou SEQ ID NO:154.
[0190] Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88% idêntica, pelo menos 89% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 91% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:18 ou SEQ ID NO:122. Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88% idêntica, pelo menos 89% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 91% idêntica, pelo menos 92% idêntica, pelo menos 93% idêntica, pelo menos 94% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO:18 e SEQ ID NO:122. Os polipeptídeos podem compreender uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:18 ou SEQ ID NO:122. Em algumas modalidades, o polipeptídeo
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166/236 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:156. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97% idêntica, ou pelo menos cerca de 99% idêntica à porção de scFv da sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:156. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo compreende ou consiste numa sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:122, ou SEQ ID NO:156.
[0191] Os polipeptídeos divulgados no presente documento podem ter características aprimoradas em comparação com outros domínios ou polipeptídeos de ligação a CD123. Por exemplo, um domínio ou polipeptídeo de ligação a CD123 pode exibir um ponto isoelétrico reduzido em comparação com o ponto isoelétrico de um domínio ou polipeptídeo de ligação a CD123 diferente. “Ponto isoelétrico” ou “pl” é o pH no qual a carga líquida é zero. O ponto isoelétrico de uma proteína pode ser medido por qualquer método adequado, por exemplo, cromatografia de focalização isoelétrica capilar analítica.
[0192] Um domínio ou uma proteína de ligação a CD123 divulgados no presente documento pode se ligar a CD123 (por exemplo, CD123 humano) com uma afinidade maior que o anticorpo parental.
[0193] Numa modalidade da invenção, o polipeptídeo recombinante compreende, na ordem da terminação amino a carboxila, (I) um domínio de ligação a CD123 humano ou humanizado, (ii) uma região de dobradiça, (ill) uma região constante de imunoglobulina, (iv) um ligante de terminação carboxila, e (v) um segundo domínio de ligação humano ou humanizado que se liga especificamente a uma célula T, CD3, CD3s ou um complexo de receptor de célula T (TCR) ou um componente de um complexo de receptor de célula T, em que o domínio de ligação a CD123 humano ou humanizado compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de
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80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou pelo menos cerca de 99,5% idêntica à SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:4 e em que o segundo domínio de ligação humano ou humanizado que se liga especificamente a uma célula T, CD3, CD3s ou um complexo de receptor de célula T (TCR) ou um componente de um complexo de receptor de célula T compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou pelo menos cerca de 99,5% idêntica à SEQ ID NO:311 ou SEQ ID NO:312.
[0194] Numa modalidade da invenção, o polipeptídeo recombinante não contém um domínio de ligação a CD123 derivado de anticorpo murino 12F1 (SEQ ID Nos:195 e 197). Por exemplo, numa modalidade, o domínio de ligação a CD123 não compreende um domínio variável de cadeia pesada ou cadeia leve que é significativamente idêntico a um domínio variável de cadeia pesada ou cadeia leve de 12F1 (por exemplo, não é 95% idêntica ou maior para domínios variáveis de cadeia pesada e leve de 12F1) ou não contém todas as seis CDRs conforme contido no 12F1 murino. Numa modalidade da invenção, o domínio de ligação a CD123 não compete pela ligação a CD123 com o anticorpo murino 12F1 (SEQ ID NOs:195 e 197). Numa modalidade da invenção, o polipeptídeo recombinante é reativo cruzado em relação ao CD123 cinomolgo enquanto o anticorpo 12F1 (e derivados humanizados do mesmo) não é reativo cruzado em relação ao CD123 cinomolgo.
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TABELA 4: SEQUÊNCIAS DE ANTICORPO MURINO DE 12F1
Nome Sequência de Nucleotídeos Sequência de Aminoácidos SEQ ID Nos: nucleotídeo (aminoácido)
domínio de cadeia leve variável murino de 12F1 gacatcatgatgtcccagtccccc tcctccctggccgtgtccgtgggc gagaagttcaccatgacctgcaa gtcctcccagtccctgttcttcggct ccacccagaagaactacctggc ctggtaccagcagaagcccggc cagtcccccaagctgctgatctac tgggcctccacccgggagtccg gcgtgcccgaccggttcaccggc tccggctccggcaccgacttcac cctggccatctcctccgtgatgcc cgaggacctggccgtgtactact gccagcagtactacaactacccc tggaccttcggcggcggcacca agctggagatcaag dimmsqspsslavsvgekft mtckssqslffgstqknylaw yqqkpgqspklliywastres gvpdrftgsgsgtdftlaissv mpedlavyycqqyynypwtf gggtkieik SEQ ID NO:194 (SEQ ID NO:195)
domínio de cadeia pesada variável murino de 12F1 cagctgcaggagtccggccccg gcctggtgaagccctcccagtcc ctgtccctgacctgctccgtgacc gactactccatcacctccggctac tactggaactggattcggcagttc cccggcaacaagctggagtgga tgggctacatctcctacgacggct ccaacaactacaacccctccctg aagaaccggatctccatcaccc vqlqesgpglvkpsqslsltcs vtdysitsgyywnwirqfpgn klewmgyisydgsnnynpsl knrisitrdtsknqfflklssvtte dtatyycsrgegfyfdswgqg ttltvss SEQ ID NO:196 (SEQ ID NO:197)
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gggacacctccaagaaccagtt cttcctgaagctgtcctccgtgacc accgaggacaccgccacctact actgctcccggggcgagggcttc tacttcgactcctggggccaggg caccaccctgaccgtgtcctcg
[0195] Numa modalidade, o polipeptídeo da invenção (incluindo na forma dimérica) se liga a CD123 humano e CD123 primata não humano (NHP) com especificidade. Numa outra modalidade da invenção, o polipeptídeo se liga a CD123 de macaco cinomolgo.
[0196] A divulgação também inclui ácidos nucleicos (por exemplo, DNA ou RNA) que codificam domínios de ligação a CD123 e polipeptídeos descritos no presente documento. Os ácidos nucleicos da divulgação incluem ácidos nucleicos que têm uma região que é substancial mente idêntica a um polinucleotídeo conforme listado na Tabela 3, infra. Em determinadas modalidades, um ácido nucleico de acordo com a presente divulgação tem pelo menos 80%, tipicamente pelo menos cerca de 90%, e mais tipicamente pelo menos cerca de 95% ou pelo menos cerca de 98% de identidade com um polinucleotídeo que codifica polipeptídeo conforme listado na Tabela 3. Os ácidos nucleicos da divulgação também incluem ácidos nucleicos complementares. Em alguns casos, as sequências serão totalmente complementares (nenhuma incompatibilidade) quando alinhadas. Em outros casos, pode haver até cerca de 20% de incompatibilidade nas sequências. Em algumas modalidades da divulgação são fornecidos ácidos nucleicos que codificam tanto a primeira quanto segunda cadeias de polipeptídeo de uma proteína de ligação de CD123 heterodimérica da divulgação. A sequência de ácido nucleicos fornecida no presente documento pode ser explorada usando otimização de códon, sequência degenerativa, mutações silenciosas e outras
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170/236 técnicas de DNA para otimizar a expressão num hospedeiro específico, e a presente divulgação abrange tais modificações de sequência.
[0197] A invenção inclui um polipeptídeo recombinante codificado por um ácido nucleico que compreende na sequência de ácido nucleico pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% e pelo menos 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:1 e/ou SEQ ID NO:3. A invenção inclui um polipeptídeo recombinante codificado por um ácido nucleico que compreende na sequência de ácido nucleico pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% e pelo menos 100% idêntica à sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:131.
[0198] A divulgação se refere a uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica domínios, proteínas e polipeptídeos de ligação a CD123 (ou porções dos mesmos) descritos no presente documento, em que a referida molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos estabelecida em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:97, SEQ ID NQ:105, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:147, SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:153, ou SEQ ID NO:155.
[0199] As moléculas de polinucleotídeos que compreende uma sequência de polinucleotídeos desejada são propagadas colocando-se a molécula num vetor. Os vetores virais e não virais podem ser usados, incluindo plasmídeos. A escolha do plasmídeo dependerá do tipo de célula em que a propagação é desejada e o propósito da propagação.
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Determinados vetores são úteis para amplificar e produzir grandes quantidades da sequência de DNA desejada. Outros vetores são adequados para a expressão em células na cultura. Ainda outros vetores são adequados para transferência e expressão em células em todo um animal ou pessoa. A escolha do vetor adequado está bem dentro da habilidade da técnica. Muitos de tais vetores estão comercialmente disponíveis. O polinucleotídeo de comprimento total ou parcial é inserido num vetor tipicamente por meio de fixação por DNA ligase a um sítio de enzima de restrição clivado no vetor. Alternativamente, a sequência de nucleotídeos desejada pode ser inserida por meio de recombinação homóloga in vivo. Tipicamente, isto é alcançado fixando-se regiões de homologia ao vetor nos flancos da sequência de nucleotídeos desejada. As regiões de homologia são adicionadas por meio de ligação de oligonucleotídeos, ou por meio de reação em cadeia de polimerase usando iniciadores que compreendem tanto a região de homologia quanto uma porção da sequência de nucleotídeos desejada, por exemplo.
[0200] Para a expressão, um cassete ou sistema de expressão ser empregado. Para expressar um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo divulgado no presente documento, uma molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo, se liga operativamente às sequências reguladoras que controlam a expressão transcricional num vetor de expressão, é introduzida numa célula hospedeira. Além das sequências reguladoras transcricionais, como promotores e intensificadores, os vetores de expressão podem incluir sequências reguladoras transcricionais e um gene marcador que é adequado para a seleção de células que carregam o vetor de expressão. O produto de gene codificado por um polinucleotídeo da divulgação é expresso em qualquer sistema de expressão conveniente, incluindo, por exemplo, sistemas de bactéria, levedura, inserto, anfíbio e mamífero. No vetor de expressão, o polinucleotídeo que codifica polipeptídeo é ligado a uma sequência reguladora conforme adequado para obter as propriedades de expressão desejadas. Estes podem incluir promotores, intensificadores,
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172/236 terminadores, operadores, repressores e indutores. Os promotores podem ser regulados (por exemplo, o promotor do vetor de pIND induzível por esteroide (Invitrogen)) ou constitutivos (por exemplo, promotores de CMV, SV40, Fator de Alongamento ou sequências de LTR). Estes são ligados à sequência de nucleotídeos desejada usando as técnicas descritas acima para ligação aos vetores. Quaisquer técnicas conhecidas na arte podem ser usadas. Consequentemente, o vetor de expressão fornecerá, em geral, uma região de iniciação de transcrição e tradução, que pode ser induzível ou constitutiva, em que a região de codificação é operativamente ligada sob o controle transcricional da região de iniciação de transcrição, e uma região de terminação de transcrição e tradução.
[0201] Um cassete de expressão (“unidade de expressão”) pode ser introduzido numa variedade de vetores, por exemplo, plasmídeo, BAC, YAC, bacteriófago como lambda, P1, M13, etc., vetores virais vegetais ou animais (por exemplo, vetores com base retroviral, vetores de adenovirus), e semelhantes, em que os vetores são normalmente caracterizados pela habilidade de fornecer seleção de células que compreendem os vetores de expressão. Os vetores podem fornecer manutenção extracromossômica, particularmente, como plasmídeos ou vírus, ou para integração no cromossomo hospedeiro. Quando a manutenção extracromossômica for desejada, uma sequência de origem é fornecida para a replicação do plasmídeo, que pode ter número de cópia baixo ou alto. Uma ampla variedade de marcadores está disponível para seleção, particularmente aqueles que protegem contra toxinas, mais particularmente contra antibióticos. O marcador específico que é escolhido é selecionado de acordo com a natureza do hospedeiro, em que, em alguns casos, a complementação pode ser empregada com hospedeiros auxotróficos. A introdução do construto de DNA pode usar qualquer método conveniente, incluindo, por exemplo, conjugação, transformação bacteriana, DNA precipitado por cálcio, eletroporação, fusão, transfecção, infecção com vetores virais, biolística e
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173/236 semelhantes. A divulgação se refere a um vetor de expressão que compreende um segmento de ácido nucleico, em que o referido segmento de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeos estabelecida em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:147, SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:153, ou SEQ ID NO:155.
[0202] Consequentemente, as proteínas para uso na presente divulgação podem ser produzidas em células hospedeiras geneticamente modificadas de acordo com as técnicas convencionais. As células hospedeiras adequadas são aqueles tipos de célula que podem ser transformados ou transfectados com DNA exógeno e cultivadas em cultura, e incluem bactérias, células fúngicas, e células eucariontes superiores cultivadas (incluindo células cultivadas de organismos multicelulares), células de mamíferos particularmente cultivadas. As técnicas para manipular moléculas de DNA clonadas e introduzir DNA exógeno numa variedade de células hospedeiras são divulgadas por Sambrook e Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ã ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001), e Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (4ã ed., John Wiley & Sons, 1999). Por exemplo, os polipeptídeos recombinantes da invenção podem ser expressos a partir de células CHO e HEK293.
[0203] Por exemplo, para a expressão recombinante de uma proteína homodimérica de ligação de CD123 que compreende dois polipeptídeos de ligação a CD123 idênticos conforme descrito no presente documento, um vetor de expressão incluirá, geralmente, um segmento de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de ligação a CD123, operativamente ligado a um promotor. Para a expressão recombinante de uma proteína de ligação de
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CD123 heterodimérica, que compreende a primeira e a segunda cadeias de polipeptídeo diferentes, a primeira e a segunda cadeias de polipeptídeo podem ser coexpressas a partir de vetores separados na célula hospedeira para expressão de toda a proteína heterodimérica. Alternativamente, para a expressão de proteínas heterodiméricas de ligação de CD123, a primeira e a segunda cadeias de polipeptídeo são coexpressas a partir de unidades de expressão separadas no mesmo vetor na célula hospedeira para expressão de toda a proteína heterodimérica. O vetor (ou vetores) de expressão é transferido para uma célula hospedeira por meio de técnicas convencionais, e as células transfectadas são, então, cultivadas por meio de técnicas convencionais para produzir o polipeptídeo (ou polipeptídeos) codificados para produzir a proteína de ligação de CD123 correspondente.
[0204] Para direcionar uma proteína recombinante para o percurso secretor de uma célula hospedeira, uma sequência de sinal secretora (também conhecida como uma sequência líder) é fornecida no vetor de expressão. A sequência de sinal secretora pode ser aquela da forma nativa da proteína recombinante, ou pode ser derivada de uma outra proteína secretora ou sintetizada de novo. A sequência de sinal secretora é operativamente ligada à sequência de DNA que codifica polipeptídeo, isto é, as duas sequências são unidas no quadro de leitura correto e posicionadas para direcionar o polipeptídeo recentemente sintetizado no percurso secretor da célula hospedeira. As sequências de sinal secretoras são comumente posicionadas 5’ em relação à sequência de DNA que codifica o polipeptídeo de interesse, embora determinadas sequências de sinal possam ser posicionadas em outro lugar na sequência de DNA de interesse (consulte, por exemplo, Welch etal., Patente US nQ 5.037.743; Holland etal., Patente US nQ 5.143.830). Em determinadas variações, uma sequência de sinal secretora para uso de acordo com a presente divulgação tem a sequência de aminoácidos MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG (SEQ ID NO:198).
[0205] As células de mamífero cultivadas são
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175/236 hospedeiras adequadas para a produção de proteínas recombinantes para uso na presente divulgação. Os métodos para introduzir o DNA exógeno nas células hospedeiras de mamífero incluem transfecção mediada por fosfato de cálcio (Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro e Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981: Graham e Van der Eb, Virology 52:456, 1973), eletroporação (Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982), transfecção mediada por DEAE-dextrano (Ausubel et al., supra), e transfecção mediada por lipossoma (Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993). A produção de polipeptídeos recombinantes em células de mamífero cultivadas é revelada por, por exemplo, Levinson et al., Patente US nQ 4.713.339; Hagen et al., Patente US nQ 4.784.950; Palmiter et al., Patente US nQ 4.579.821; e Ringold, Patente US nQ 4.656.134. Exemplos de células hospedeiras de mamífero adequadas incluem células do rim de macaco Verde Africano (Vero; ATCC CRL 1587), células embrionárias do rim humano (293HEK; ATCC CRL 1573), células do rim de hamster filhote (BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), células do rim canino (MDCK; ATCC CCL 34), células do ovário de hamster chinês (CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44; CHO DXB11 (Hyclone, Logan, UT); consulte também, por exemplo, Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986)), célula pituitárias do rato (GH1; ATCC CCL82), células HeLa S3 (ATCC CCL2.2), célula hepatomais do rato (H-4-II-E; ATCC CRL 1548) células do rim do macaco transformadas por SV40 (COS-1; ATCC CRL 1650) e células embrionárias murinas (NIH-3T3; ATCC CRL 1658). As linhagens celulares adequadas adicionais são conhecidas na técnica e estão disponíveis a partir de depósitos públicos como a American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Fortes promotores de transcrição podem ser usados, como promotores de SV-40 ou cetomegalovírus. Consulte, por exemplo, Patente US nQ 4.956.288. Outros promotores adequados incluem aqueles de genes de metalotioneína (Patentes US n— 4.579.821 e 4.601.978) e o promotor tardio principal do adenovirus.
[0206] A seleção de fármaco é geralmente usada
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176/236 para células de mamífero cultivadas em que o DNA estranho foi inserido. Tais células são comumente referidas como “transfectantes”. As células que foram cultivadas na presença do agente seletivo e são capazes de passar o gene de interesse para sua progênie são denominadas como “transfectantes estáveis”. Os marcadores selecionáveis exemplificativos incluem uma resistência de codificação de gene à neomicina antibiótica, que permite a seleção a ser realizada na presença de um fármaco do tipo neomicina, como G-418 ou semelhante; o gene gpt para xantina-guanina fosforibosil transferase, que permite o crescimento da célula hospedeira na presença de ácido micofenólico/xantina; e marcadores que fornecem resistência à zeocina, bleomicina, blastocidina e higromicina (consulte, por exemplo, Gatignol et al., Mol. Gen. Genet. 207:342, 1987; Drocourt et al., Nucl. Acids Res. 18:4009, 1990). Os sistemas de seleção também podem ser usados para aumentar o nível de expressão do gene de interesse, um processo denominado “amplificação”. A amplificação é realizada cultivando-se transfectantes na presença de um baixo nível do agente seletivo e, então, aumentando a quantidade de agente seletivo para selecionar as células que produzem altos níveis dos produtos dos genes introduzidos. Um marcador selecionável amplificável exemplificativo é di-hidrofolato reductase, que confere resistência ao metotrexato. Outros genes de resistência a fármaco (por exemplo, resistência a higromicina, resistência a múltiplos fármacos, puromicina acetil transferase) também podem ser usados.
[0207] Outras células eucariontes superiores também podem ser usadas como hospedeiras, incluindo, células de inseto, células vegetais e células de ave. O uso de Agrobacterium rhizogenes como um vetor para expressar genes em células vegetais foi revisto por Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987. A transformação de células de inseto e a produção de polipeptídeos estranhos é divulgada por Guarino et al., US 5.162.222 eWO 94/06463.
[0208] As células de inseto podem ser infectadas
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177/236 com baculovírus recombinante, comumente derivado de virus de poli-hedrose nuclear de Autographs californica (AcNPV). Consulte King e Possee, The Baculovírus Expression System: A Laboratory Guide (Chapman & Hall, London); O’Reilly et al., Baculovírus Expression Vectors: A Laboratory Manual (Oxford University Press., Nova York 1994); e Baculovírus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology (Richardson ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1995). O baculovírus recombinante também pode ser produzido através do uso de um sistema baseado em transposon descrito por Luckow et al. (J. Virol. 67:4566-4579, 1993). Este sistema, que utiliza vetores de transferência, é comercialmente disponível na forma de kit (kit BAC-TO-BAC; Life Technologies, Gaithersburg, MD). O vetor de transferência (por exemplo, PFASTBAC1; Life Technologies) contém um transposon Tn7 para mover o DNA que codifica a proteína de interesse para um genoma de baculovírus mantido em E. coli como um grande plasmídeo chamado de um “bacmídeo”. Consulte Hill-Perkins e Possee, J. Gen. Virol. 71:971-976, 1990; Benning et al., J. Gen. Virol. 75:1551-1556, 1994; e Chazenbalk e Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543-1549, 1995. Além disto, os vetores de transferência podem incluir uma fusão em quadro com o DNA que codifica uma extensão de polipeptídeo ou etiqueta de afinidade conforme revelado acima. Usando as técnicas conhecidas na arte, um vetor de transferência que contém uma sequência de DNA que codifica proteína é transformado em células hospedeiras de E. coli, e as células são tríadas para baemídeos que contêm um gene lacZ interrompido indicativo de baculovírus recombinante. O DNA de bacmídeo que contém o genoma de baculovírus recombinante é isolado, usando técnicas comuns, e usado para transfectar células de Spodoptera frugiperda, como células Sf9. O vírus recombinante que expressa a proteína de interesse é subsequentemente produzida. Os estoques virais são produzidos por meio de métodos comumente usados na técnica.
[0209] Para a produção de proteína, um vírus recombinante pode ser usado para infectar células hospedeiras, tipicamente
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178/236 uma linhagem celular derivada da lagarta-do-cartucho, Spodoptera frugiperda (por exemplo, células Sf9 ou Sf21) ou Trichoplusia ni (por exemplo, célula HIGH FIVE; Invitrogen, Carlsbad, CA). Consulte geralmente Glick e Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA (ASM Press, Washington, D.C., 1994). Consulte também Patente US nQ 5.300.435. Os meios livres de soro são usados para cultivar e manter as células. As formulações de meios adequadas são conhecidas na técnica e podem ser obtidas a partir de fornecedores comerciais. As células são cultivadas a partir de uma densidade de inoculação de aproximadamente 2-5 x 105 células para uma densidade de 1-2 x 106 células, em cujo tempo um estoque viral recombinante é adicionado numa multiplicidade de infecções (MOI) de 0,1 a 10, mais tipicamente quase 3. Os procedimentos usados são geralmente descritos em manuais de laboratório disponíveis (consulte, por exemplo, King e Possee, supra; O’Reilly etal., supra: Richardson, supra).
[0210] As células fúngicas, incluindo células de levedura, também podem ser usadas dentro da presente divulgação. As espécies de levedura neste sentido incluem, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, e Pichia methanolica. Os métodos para transformar células de S. cerevisiae com DNA exógeno e produzir polipeptídeos recombinantes a partir do mesmo são divulgados, por exemplo, por Kawasaki, Patente US nQ 4.599.311; Kawasaki et al., Patente US nQ 4.931.373; Brake, Patente US nQ 4.870.008; Welch et al., Patente US nQ 5.037.743; e Murray et al., Patente US nQ 4.845.075. As células transformadas são selecionadas pelo fenótipo determinado pelo marcador selecionável, comumente resistência a fármaco ou capacidade de crescer na ausência de um nutriente específico (por exemplo, leucina). Um sistema de vetor exemplificativo para uso em Saccharomyces cerevisiae é o sistema a de vetor POT1 divulgado por Kawasaki et al. (Patente US nQ 4.931.373), que permite que as células transformadas sejam selecionadas pelo crescimento em meios que contêm glicose. Os promotores e terminadores adequados para uso em levedura
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179/236 incluem aqueles de genes de enzima glicolítica (consulte, por exemplo,, Kawasaki, Patente US nQ 4.599.311; Kingsman et al., Patente US nQ 4.615.974; e Bitter, Patente US nQ 4.977.092) e genes de álcool desidrogenase. Consulte fâmbémPatentes US n- 4.990.446; 5.063.154; 5.139.936; e 4.661.454. Os sistemas de transformação para outras leveduras, incluindo Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guiHermondii, e Candida maltosa são conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 1986; Cregg, Patente US nQ 4,882,279; e Raymond et al., Yeast 14:11-23, 1998. As células de Aspergillus podem ser utilizadas de acordo com os métodos de McKnight et al., Patente US nQ 4.935.349. Os métodos para transformar Acremonium chrysogenum são divulgados por Sumino et al., Patente US nQ 5.162.228. Os métodos para transformar Neurospora são divulgados por Lambowitz, Patente US nQ 4.486.533. A produção de proteínas recombinantes em Pichia methanolica é divulgada nas Patentes US n— 5.716.808; 5.736.383; 5.854.039; e 5.888.768.
[0211] As células hospedeiras procariontes, incluindo cepas das bactérias Escherichia coli, Bacillus, e outros gêneros também são células hospedeiras úteis na presente divulgação. As técnicas para transformar estes hospedeiros e expressar sequências de DNA estranho clonadas nas mesmas são bem conhecidas na técnica (consulte, por exemplo, Sambrook e Russell, supra). Quando expressa uma proteína recombinante nas bactérias como E. coli, a proteína pode ser retida no citoplasma, tipicamente como grânulos insolúveis, ou pode ser direcionada para o espaço periplásmico por uma sequência de secreção bacteriana. No caso anterior, as células são lisadas, os grânulos são recuperados e desnaturados usando, por exemplo, isotiocianato de guanidina ou ureia. A proteína desnaturada pode ser, então, redobrada e dimerizada diluindo-se o desnaturante, como por meio de diálise contra uma solução de ureia e uma combinação de glutationa oxidada e
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180/236 reduzida, seguida pela diálise contra uma solução salina tamponada. Alternativamente, a proteína pode ser recuperada do citoplasma na forma solúvel e isolada sem o uso de desnaturantes. A proteína é recuperada da célula como um extrato aquoso, por exemplo, em solução salina tamponada com fosfato. Para capturar a proteína de interesse, o extrato é aplicado diretamente num meio cromatográfico, como um anticorpo imobilizado ou coluna de heparina-Sefarose. As proteínas secretadas podem ser recuperadas do espaço periplásmico numa forma solúvel e funcional rompendo-se as células (por meio, por exemplo, de sonicação ou choque osmótico) para liberar o conteúdo do espaço periplásmico e recuperando-se a proteína tornando óbvio, deste modo, a necessidade por desnaturação e redobra. Os anticorpos, incluindo anticorpos de cadeia única, podem ser produzidos em células hospedeiras bacterianas de acordo com os métodos conhecidos. Consulte, por exemplo, Bird et al., Science 242:423-426, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883, 1988; e Pantoliano et al., Biochem. 30:1011710125, 1991.
[0212] As células hospedeiras transformadas ou transfectadas de acordo com os procedimentos convencionais num meio de cultura que contém nutrientes e outros componentes necessários para o crescimento das células hospedeiras escolhidas. Uma variedade de meios adequados, incluindo meios definidos e meios complexos, são conhecidos na técnica e incluem geralmente uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, aminoácidos essenciais, vitaminas e minerais. Os meios também podem conter tais componentes como fatores de crescimento ou soro, conforme necessário. O meio de crescimento irá selecionar geralmente as células que contêm o DNA adicionado exogenamente, por exemplo, por meio de seleção de fármaco ou deficiência num nutriente essencial que é complementado pelo marcador selecionável carregado no vetor de expressão ou cotransfectado para a célula hospedeira.
[0213] As proteínas de ligação de CD123 podem ser
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181/236 purificadas por meio de métodos de purificação de proteína convencional, tipicamente por uma combinação de técnicas cromatográficas. Consulte geralmente Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suécia, 1988); Scopes, Protein Purification: Principles e Practice (Springer-Verlag, Nova York 1994). As proteínas que compreendem uma região de Fc de imunoglobulina podem ser purificadas por meio de cromatografia de afinidade em proteína A ou proteína G imobilizada. As etapas de purificação adicionais, como filtração de gel, podem ser usadas para obter o nível desejado de pureza ou fornecer a dessalinização, troca de tampão, e semelhantes.
[0214] A presente divulgação fornece métodos para tratar um indivíduo com um distúrbio caracterizado pela superexpressão de CD123. Geralmente, tais métodos incluem administrar a um indivíduo com necessidade de tal tratamento o polipeptídeo ou proteína de ligação de CD123 conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, a proteína de ligação de CD123 compreende pelo menos uma função efetora selecionada dentre citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC), de modo que a proteína de ligação de CD123 induz ADCC e/ou CDC contra células que expressam CD123 no indivíduo.
[0215] Em outras modalidades, quando o polipeptídeo compreender um segundo domínio de ligação que se liga especificamente a uma célula T (por exemplo, a um complexo de TCR ou componente do mesmo, como CD3s), o polipeptídeo ou proteína de ligação de CD123 induz citotoxicidade de célula T redirecionada (RTCC) contra células que expressam CD123 no indivíduo. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de RTCC (por exemplo, polipeptídeos que induzem RTCC) compreende um domínio constante modificado para reduzir ou remover atividade de ADCC e/ou CDC.
[0216] Em determinadas variações do método, o
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182/236 distúrbio é um câncer. Cânceres exemplificativos favoráveis ao tratamento de acordo com a presente divulgação incluem, por exemplo, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoide B, neoplasma dendrítico plasmocitoide blástico (BPDCN), leucemia de célula capilar, síndrome mielodisplástica, leucemia linfoblástica aguda, anemia refratária com blastos excessos, leucemia mieloide crônica e linfoma de Hodgkin.
[0217] A divulgação também abrange um uso de um polipeptídeo de ligação a CD123 para a fabricação de um medicamento para tratamento de um distúrbio (por exemplo, câncer) caracterizado pela superexpressão de CD123. Numa modalidade, o polipeptídeo de ligação a CD123 tem atividade de RTCC, por exemplo, o mesmo compreende um domínio de ligação a anti-CD123 e anti-CD3. Numa modalidade, a divulgação inclui um polipeptídeo de ligação a CD123 para uso no tratamento de um distúrbio (por exemplo, câncer) caracterizado pela superexpressão de CD123.
[0218] Numa modalidade, a divulgação fornece um método de tratamento de um paciente diagnosticado com leucemia mieloide aguda, leucemia linfoide B, neoplasmas dendríticos plasmocitoides blásticos, leucemia de célula capilar, síndrome mielodisplástica, leucemia linfoblástica aguda, anemia refratária com blastos em excesso, leucemia mieloide crônica, linfoma de Hodgkin ou outro câncer associado à expressão de CD123 administrando-se uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que compreende um polipeptídeo recombinante pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou pelo menos cerca de 100% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:130 ou 132.
[0219] Em algumas modalidades, a divulgação fornece um método de tratamento de um paciente com um câncer, que compreende administrar ao paciente um polipeptídeo de ligação a CD123 que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:130,
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SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:138, SEQ ID NQ:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:148, SEQ ID NQ:150, SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:154, ou SEQ ID NO:156.
[0220] Em algumas modalidades, para os métodos e usos de tratamento descritos no presente documento, um polipeptídeo da invenção é distribuído de uma maneira consistente com as metodologias convencionais associadas ao gerenciamento da doença ou do distúrbio para o qual o tratamento é buscado. De acordo com a divulgação presente documento, uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo ou proteína de ligação de CD123 em forma dimérica é administrada a um indivíduo com necessidade de tal tratamento por um tempo e sob condições suficientes para prevenir ou tratar a doença ou distúrbio.
[0221] indivíduos para administração de polipeptídeos conforme descrito no presente documento incluem pacientes de alto risco para desenvolver um distúrbio específico caracterizado pela superexpressão de CD123 assim como pacientes que apresentam um tal distúrbio existente. Tipicamente, o indivíduo foi diagnosticado como tendo o distúrbio para o qual o tratamento é buscado. Ademais, os indivíduos podem ser monitorados durante o curso do tratamento para qualquer alteração no distúrbio (por exemplo, para um aumento ou uma diminuição nos sintomas clínicos do distúrbio). Também, em algumas variações, o indivíduo não sofre de um outro distúrbio que requer tratamento que envolve alvejar células que expressam CD123.
[0222] Em aplicações profiláticas, as composições farmacêuticas ou os medicamentos são administradas a um paciente suscetível, ou de outro modo, em risco, a um distúrbio específico numa quantidade suficiente para eliminar ou reduzir o risco ou atrasar o início do distúrbio. Em aplicações terapêuticas, as composições ou medicamentos são administrados a um paciente suspeito de, ou já estar sofrendo de tal distúrbio numa quantidade suficiente para curar, ou pelo menos deter parcialmente, os
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184/236 sintomas do distúrbio e suas complicações. Uma quantidade adequada para obter isto é denominada como uma dose ou quantidade terapeuticamente eficaz. Nos regimes tanto profiláticos quanto terapêuticos, os agentes são normalmente administrados em diversas dosagens até uma resposta suficiente (por exemplo, inibição de atividade de angiogênese inadequada) ser obtida. Tipicamente, a resposta é monitorada e as dosagens repetidas são dadas se a resposta deseja começar a falhar.
[0223] Para identificar pacientes submetidos ao tratamento de acordo com o métodos da divulgação, os métodos de triagem aceitos podem ser empregados para determinar os fatores de risco associados a distúrbios específicos ou para determinar a situação de um distúrbio existente identificado num indivíduo. Tais métodos podem incluir, por exemplo, determinar se um indivíduo tem parentes que foram diagnosticados com um distúrbio específico. Os métodos de triagem também podem incluir, por exemplo, check-ups convencionais para determinar situação familiar para um distúrbio específico conhecido por ter um componente hereditários. Por exemplo, vários cânceres também são bem conhecidos por ter determinados componentes hereditários. Os componentes hereditários de cânceres incluem, por exemplo, mutações em múltiplos genes que estão transformando (por exemplo, Ras, Raf, EGFR, cMet, e outros), a presença ou ausência de determinadas moléculas de receptor inibidor exterminadoras (KIR) e HLA, ou mecanismos pelos quais as células cancerosas são capazes de modular a supressão imune de células como as células NK e células T, seja direta ou indiretamente (consulte, por exemplo, Ljunggren e Malmberg, Nature Rev. Immunol. 7:329-339, 2007; Boyton e Altmann, Clin. Exp. Immunol. 149:1-8, 2007). Para este firn, as sondas de nucleotídeo podem ser rotineiramente empregadas para identificar indivíduos que carregam marcadores genéticos associados a um distúrbio específico de interesse. Além disso, uma ampla variedade de métodos imunológicos são conhecidos na técnica que são úteis para identificar marcadores para o distúrbio específico. Por exemplo, vários
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185/236 métodos de imunoensaio ELISA estão disponíveis e são bem conhecidos na técnica que empregam sondas de anticorpo monoclonal para detectar antígenos associados a tumores específicos. A triagem pode ser implantada conforme indicado pela sintomologia do paciente conhecido, fatores de idade, fatores de risco relacionados, etc. Estes métodos permitem que o médico selecione rotineiramente pacientes com necessidade dos métodos descritos no presente documento para o tratamento. De acordo com estes métodos, o alvejamento patológico de células que expressam CD123 pode ser implantado como um programa de tratamento independente ou como um regime de acompanhamento, tratamento auxiliar ou coordenado para outros tratamentos.
[0224] Para administração, o polipeptídeo da invenção (por exemplo, na forma dimérica) pode ser formulado como uma composição farmacêutica. Uma composição farmacêutica pode compreender: (I) um polipeptídeo de ligação a CD123; e (ii) um carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Uma composição farmacêutica que compreende uma proteína de ligação de CD123 pode ser formulada de acordo com métodos conhecidos para preparar composições farmaceuticamente úteis, em que a molécula terapêutica é combinada numa mistura com um carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Um carreador é dito como um “carreador farmaceuticamente aceitável” se sua administração puder ser tolerada por um paciente receptor. A solução salina tamponada com fosfato estéril é um exemplo de um carreador farmaceuticamente aceitável. Outros carreadores, diluentes ou excipientes adequados são bem conhecidos na técnica. (Consulte, por exemplo, Gennaro (ed.), Flemington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19ã ed. 1995).) As formulações podem incluir ainda um ou mais excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes de tamponamento, albumina para impedir a perda de proteína em superfícies do frasco, etc.
[0225] Uma composição farmacêutica pode ser formulada numa forma de dosagem selecionada do grupo que consiste em:
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186/236 uma forma de dosagem unitária oral, uma forma de dosagem unitária intravenosa, uma forma de dosagem unitária intranasal, uma forma de dosagem unitária de supositório, uma forma de dosagem unitária intradérmica, uma forma de dosagem unitária intramuscular, uma forma de dosagem unitária intraperitoneal, uma forma de dosagem unitária subcutânea, uma forma de dosagem unitária epidural, uma forma de dosagem unitária sublingual, e uma forma de dosagem unitária intracerebral. A forma de dosagem unitária oral pode ser selecionada do grupo que consiste em: comprimidos, pílulas, péletes, cápsulas, pós, pastilhas, grânulos, soluções, suspensões, emulsões, xaropes, elixires, formulações de liberação sustentada, aerossóis e aspersões.
[0226] Uma composição farmacêutica que compreende um polipeptídeo da invenção pode ser administrada a um indivíduo numa quantidade terapeuticamente eficaz. De acordo com os métodos da presente divulgação, uma proteína de ligação de CD123 pode ser administrada aos indivíduos por uma variedade de modos de administração, incluindo, por exemplo, por meio de vias de administração intramuscular, subcutânea, intravenosa, intra-atrial, intra-articular, parenteral, intranasal, intrapulmonar, transdérmica, intrapleural, intratecal e oral.
[0227] A determinação de dosagens eficazes neste contexto se baseia tipicamente nos estudos de modelo animal seguidos pelos testes clínicos humanos e é guiada pela determinação de dosagens eficazes e protocolos de administração que reduzem significativamente a ocorrência ou gravidade do distúrbio do indivíduo em indivíduos modelos. As doses eficazes das composições da presente divulgação variam dependendo de muitos fatores diferentes, incluindo meios de administração, sítio-alvo, estado fisiológico do paciente, seja o paciente ser humano ou um animal, outros medicamentos administrados, seja o tratamento profilático ou terapêutico, assim como a atividade específica da própria composição e sua capacidade de elicitar a resposta desejada no indivíduo. Normalmente, o paciente é um ser humano, mas em algumas doenças, o paciente pode ser um mamífero não humano.
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Tipicamente, os regimes de dosagem são ajustados para fornecer uma resposta terapêutica ideal, isto é, para otimizar a segurança e a eficácia. Consequentemente, uma quantidade terapeuticamente eficaz também é uma em que quaisquer efeitos colaterais indesejados superados pelos efeitos benéficos de administrar uma proteína de ligação de CD123 conforme descrito no presente documento. Para a administração da proteína de ligação de CD123, uma dosagem está na faixa de, por exemplo, cerca de 0,1 pg a 100 mg/kg ou 1 pg/kg a cerca de 50 mg/kg, ou 10 pg a 5 mg/kg do peso corporal do indivíduo.
[0228] A dosagem da composição farmacêutica pode ser variada pelo médico atendente para manter uma concentração desejada num sítio-alvo.
[0229] Em relação específica ao tratamento de tumores sólidos, os protocolos para avaliar os pontos finais e a atividade antitumoral são bem conhecidos na técnica. Embora cada protocolo possa definir avaliações de resposta tumoral de modo diferente, os critérios RECIST (Critérios de avaliação de resposta em tumores sólidos) são atualmente considerados como as diretrizes recomendadas para avaliação de resposta tumoral pelo National Cancer Institute (consulte Therasse et al., J. Natl. Cancer Inst. 92:205-216, 2000). De acordo com os critérios RECIST, a resposta tumoral significa uma redução ou eliminação de todas as lesões ou metástases mensuráveis. A doença é geralmente considerada mensurável se a mesma compreender lesões que podem ser precisamente medidas em pelo menos uma dimensão como > 20 mm com técnicas convencionais ou > 10 mm com tomografia computadorizada espiral com margens claramente definidas por meio de fotografia médica ou raios X, tomografia computadorizada (CT) axial, imageamento por ressonância magnética (MRI), ou examinação clínica (se as lesões forem superficiais). A doença não mensurável significa que a doença compreende lesões de < 20 mm com técnicas convencionais ou de < 10 mm com tomografia computadorizada espiral, e lesões verdadeiramente não
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188/236 mensuráveis (muito pequenas para medir com precisão). A doença não mensurável inclui efusões pleurais, ascites, e doença documentada por evidência indireta.
[0230] Os critérios para situação objetiva são necessários para os protocolos para avaliar a resposta tumoral sólida. Os critérios representativos incluem o seguinte: (1) Resposta Completa (CR), definida como o desaparecimento completo de todas as doenças mensuráveis; nenhuma lesão nova; nenhum sintoma relacionado à doença; nenhuma evidência de doenças não mensuráveis; (2) Resposta Parcial (PR) definida como 30% de diminuição na soma do maior diâmetro de lesões-alvo (3) Doença Progressiva (PD), definida como 20% de aumento na soma do maior diâmetro de lesões-alvo ou aparecimento de qualquer nova lesão; (4) Resposta Estável ou Sem Resposta, definida como não qualificatória para CR, PR ou Doença Progressiva. (Consulte Therasse etal., supra.) [0231] Os pontos finais adicionais que são aceitos dentro da técnica de oncologia incluem sobrevivência geral (OS), sobrevivência livre da doença (DFS), taxa de resposta objetiva (ORR), tempo para progressão (TTP), e sobrevivência livre de progressão (PFS) (consulte Guidance for Industry: Clinical Trial Endpoints for the Approval of Cancer Drugs and Biologies, abril de 2005, Center for Drug Evaluation and Research, FDA, Rockville, MD.) [0232] As composições farmacêuticas podem ser fornecidas como um kit que compreende um recipiente que compreende a composição farmacêutica conforme descrito no presente documento. Uma composição farmacêutica pode ser fornecida, por exemplo, na forma de uma solução injetável para doses únicas ou múltiplas, ou como um pó estéril que será reconstituído antes da injeção. Alternativamente, tal kit pode incluir um dispensador de pó seco, gerador de aerossol líquido ou nebulizador para administração de uma composição farmacêutica. Tal kit pode compreender ainda informações escritas sobre indicações e uso da composição
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189/236 farmacêutica.
[0233] A divulgação será mais esclarecida pelos seguintes exemplos, que se destinam a ser puramente exemplificativos da divulgação e não limitantes de modo algum.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1: GERAÇÃO DE VARIANTES HUMANIZADAS DE ANTICORPOS ANTI-CD123 E CONSTRUÇÃO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO A CD123 MONOESPECÍFICAS E BIESPECÍFICAS
ISOLAMENTO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO A CD123 MONOESPECÍFICAS POR EXIBIÇÃO DE FAGO [0234] As moléculas de ligação a scFv específicas a anti-CD123 foram isoladas da biblioteca SuperHuman, Distributed Bio Inc. (South San Francisco, CA), usando a técnica de drageamento por exibição de fago solúvel contra proteína recombinante de CD123 biotinilada (SEQ ID NQ:200) seguindo os protocolos da Distributed Bio e conforme descrito anteriormente por Ayriss, J et al, (2007) J Proteome Res., páginas 1072-82. A especificidade de ligação de clones foi caracterizada por ELISA usando CD123 e proteína recombinante não relacionada com etiqueta de purificação idêntica. A citometria de fluxo que usa células HEK293 transfectadas com variantes humanas e de macacos cinomolgo de CD123, SEQ ID NO: 201 e SEQ ID NQ:203, respectivamente, foi usada para identificar clones que se ligam a CD123 no contexto da superfície celular. As sequências de nucleotídeos e aminoácidos da moléculas de ligação referidas nestes Exemplos podem ser encontradas na Tabela 5.
ISOLAMENTO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO A CD123 MONOESPECÍFICAS POR MEIO DE GERAÇÃO DE HIBRIDOMA [0235] Os anticorpos específicos anti-CD123 foram isolados de uma biblioteca de hibridoma gerada após imunização OmniMice (Ligand Inc., San Diego, CA) com ectodomínio de CD123 humano
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190/236 recombinante (SEQ ID NQ:200). A especificidade de ligação de clones individuais foi confirmada testando-se a ligação que usa citometria de fluxo em células HEK293 transfectadas com variantes humanas e de macaco cinomolgo de CD123, SEQ ID NQ:201 e 203, respectivamente, e confirmada ainda por meio de falta de ligação de células HEK293 parentais. As sequências foram obtidas por meio de RT-PCR usando o kit OneStep RT-PCR (QIAGEN Inc., Valencia, CA), seguindo uma versão modificada do protocolo do fabricante. Brevemente, as células de cada clone foram raspadas dos frascos do banco de células congeladas e ressuspensas em água livre de RNase. Esta suspensão de células foi, então, usada como modelo numa reação RT-PCR usando conjuntos de iniciadores específicos a gene que flanqueiam os domínios variáveis pesados, kapp ou lambda. O sequenciamento foi realizado usando um iniciador reverso nos domínios constantes para cada um destes fragmentos. As sequências foram, então, convertidas em formato scFv amplificando-se os domínios variáveis usando iniciadores que contêm sequências de sobreposição e foram montadas num vetor de expressão de mamífero usando o Kit de Clonagem de Montagem de DNA NEBuilder® HIF (New England Biolabs, Beverly, MA).
TABELA 5: SEQUÊNCIAS DE CD123 USADAS PARA IMUNIZAÇÃO E TRIAGEM
Nome Sequência de Nucleotídeos Sequência de Aminoácidos SEQ ID NOs: Nucleotídeo (aminoácido)
Ectodo atggaagcaccagcgcagcttctcttcctcctgctact kedpnppitnlrm SEQ ID NO:
mínio ctggctcccagataccaccggtaaggaggacccc kakaqqltwdlnr 199
humano aacccccccatcaccaacctgaggatgaaggcca nvtdiecvkdady (SEQ ID
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de CD123, com etiqueta de afinidade Avi3xFLA G-His TRI032 aggcccagcagctgacctgggacctgaacaggaa cgtgacagacatcgaatgcgtgaaggatgccgact acagcatgcccgccgtgaacaactcctactgccagt tcggcgccatcagcctgtgcgaggtgacaaactac accgtgagagtggccaacccccccttcagcacctg gatcctgtttcccgagaacagcggcaaaccctggg ctggcgctgagaacctgacctgctggatccacgac gtggactttctgtcctgcagctgggctgtgggacccg gagctcctgccgatgtgcagtacgacctgtacctga atgtggccaacagaagacagcagtacgagtgcct gcattacaagaccgacgcccagggaaccaggatc ggctgcaggtttgatgacatcagcaggctgtcctccg gcagccagtccagccacatcctggtgagaggcag atccgccgccttcggcattccctgcacagacaagttc gtcgtcttcagccagatcgagattctgacccccccca acatgaccgccaagtgtaacaagacccacagcttc atgcactggaagatgaggagccacttcaacagga agttcaggtacgagctccagatccagaagaggatg cagcccgtgatcaccgagcaggtgagggacagga catccttccagctgctgaatcccggcacatacaccgt gcagatcagggccagggaaagggtgtacgagttc ctgtccgcctggagcaccccccagaggttcgagtgt gaccaggaggagggagccaataccagggcctgg agatcctcgagtctcaacgatatttttgaagcccaaa aaattgagtggcatgaagattacaaggacgatgac gacaaagactataaggacgacgacgataaggatt acaaggatgacgatgataagcaccatcatcatcac catcaccaccaccactga smpavnnsycqf gaislcevtnytvrv anppfstwilfpen sgkpwagaenltc wihdvdflscswa vgpgapadvqyd lylnvanrrqqyec Ihyktdaqgtrigcr fddisrlssgsqss hilvrgrsaafgipc tdkfvvfsqieiltpp nmtakcnkthsf mhwkmrshfnrk fryelqiqkrmqpv iteqvrdrtsfqllnp gtytvqirarervye flsawstpqrfecd qeegantrawrss slndifeaqkiewh edykddddkdyk ddddkdykdddd khhhhhhhhhh N0:200)
Sequên atggtcctcctttggctcacgctgctcctgatcgccctg ggkpwagaenlt SEQ ID
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cia de CD123 humano de comprimento total, isoforma 2 TRI074 ccctgtctcctgcaaacgaaggaaggtgggaagcc ttgggcaggtgcggagaatctgacctgctggattcat gacgtggatttcttgagctgcagctgggcggtaggc ccgggggcccccgcggacgtccagtacgacctgta cttgaacgttgccaacaggcgtcaacagtacgagtg tcttcactacaaaacggatgctcagggaacacgtat cgggtgtcgtttcgatgacatctctcgactctccagcg gttctcaaagttcccacatcctggtgcggggcagga gcgcagccttcggtatcccctgcacagataagtttgt cgtcttttcacagattgagatattaactccacccaaca tgactgcaaagtgtaataagacacattcctttatgca ctggaaaatgagaagtcatttcaatcgcaaatttcgc tatgagcttcagatacaaaagagaatgcagcctgta atcacagaacaggtcagagacagaacctccttcca gctactcaatcctggaacgtacacagtacaaataag agcccgggaaagagtgtatgaattcttgagcgcctg gagcaccccccagcgcttcgagtgcgaccaggag gagggcgcaaacacacgtgcctggcggacgtcgc tgctgatcgcgctggggacgctgctggccctggtctg tgtcttcgtgatctgcagaaggtatctggtgatgcaga gactctttccccgcatccctcacatgaaagaccccat cggtgacagcttccaaaacgacaagctggtggtctg ggaggcgggcaaagccggcctggaggagtgtctg gtgactgaagtacaggtcgtgcagaaaactacgcg tacgcggccgctcgagcagaaactcatctcagaag aggatctggcagcaaatgatatcctggattacaagg atgacgacgataaggtttaa cwihdvdflscsw avgpgapadvqy dlylnvanrrqqye clhyktdaqgtrig crfddisrlssgsqs shilvrgrsaafgip ctdkfvvfsqieiltp pnmtakcnkthsf mhwkmrshfnrk fryelqiqkrmqpv iteqvrdrtsfqllnp gtytvqirarervye flsawstpqrfecd qeegantrawrtsl lialgtllalvcvfvicr rylvmqrlfpriph mkdpigdsfqnd klvvweagkagle eclvtevqvvqkttr trpleqkliseedla andildykddddk V NO:201 (SEQ ID NO:202)
Sequên cia de atggaagcccccgcccagctgctcttcctgctgctcc tgtggctgcctgacaccaccggcaaggaagaccc kedpnapirnlrm kekaqqlmwdln SEQ ID NQ:203
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CD123 caatgcccccatcaggaacctgagaatgaaggag rnvtdvecikgtdy (SEQ
de aaggcccagcagctcatgtgggatctgaacagga smpamnnsycq NO:204)
cinomol acgtgaccgacgtggagtgtatcaagggcaccgac fgaislcevtnytvr
go de tactccatgcccgccatgaataacagctattgccagt vasppfstwilfpe
compri- tcggcgccatcagcctgtgcgaggtcaccaactac nsgtpragaenltc
mento accgtgagagtggccagcccccccttctccacctgg wvhdvdflscswv
total, attctgttccctgagaacagcggcacccctagggct vgpaapadvqyd
isofor- ggcgctgagaatctgacatgctgggtccatgacgtg lylnnpnsheqyr
ma 1 gacttcctgagctgcagctgggtggtgggacctgctg clhyktdargtqig
TRI114 ctcccgctgacgtgcagtacgatctgtatctgaacaa crfddiaplsrgsq
ccccaactcccacgagcagtacaggtgcctgcact sshilvrgrsaavsi
acaagacagacgctagaggcacccagatcggctg pctdkfvffsqierlt
caggttcgatgatatcgcccctctgagcaggggatc ppnmtgecneth
ccagagctcccatatcctggtgaggggcaggtccg sfmhwkmkshfn
ccgctgtgagcattccttgcaccgacaagttcgtcttc rkfryelriqkrmqp
ttcagccagatcgagaggctgaccccccctaacat vrteqvrdttsfqlp
gacaggcgagtgcaacgagacccacagcttcatg npgtytvqiraretv
cactggaagatgaagagccatttcaacaggaaatt yeflsawstpqrfe
caggtacgaactgaggattcagaagagaatgcag cdqeegassraw
cccgtgaggacagagcaggtgagggatacaacc rtsllialgtllallcvfli
agcttccagctgcccaatcctggcacctataccgtgc crrylvmqrlfprip
agatcagggctagagagaccgtgtacgagtttctgt hmkdpigdtfqqd
ccgcctggagcaccccccagaggtttgaatgtgac klvvweagkagle
caggaggagggagcctccagcagggcttggaga accagcctcctcatcgccctgggcacactgctggct ctgctgtgtgtgttcctgatctgcagaaggtacctggt gatgcagaggctcttccctaggattccccacatgaa ggaccccatcggcgacaccttccagcaggacaaa ctggtggtgtgggaagccggaaaggccggcctgg eclvsevqvvekt
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aggaatgcctcgtgtccgaggtgcaggtggtggag aagacctaa
PREPARAÇÃO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO A CD123 BIESPECÍFICAS
[0236] As moléculas de ligação a CD123
biespecíficas que alvejam CD123 e CD3 épsilon, TRI129 (SEQ ID NO:129
(ácido nucleico), SEQ ID NQ:130 (aminoácido)); TRI130 (SEQ ID NO:131
(ácido nucleico), SEQ ID NO:132 (aminoácido)); TRI1123 (SEQ ID NO:133
(ácido nucleico), SEQ ID NO:134 (aminoácido)); TRI124 (SEQ ID NO:135
(ácido nucleico), SEQ ID NO:136 (aminoácido)); TRI137 (SEQ ID NO:137
(ácido nucleico), SEQ ID NO:138 (aminoácido)); TRI125 (SEQ ID NO:139
(ácido nucleico), SEQ ID NQ:140 (aminoácido)); TRI126 (SEQ ID NO:141
(ácido nucleico), SEQ ID NO:142 (aminoácido)); TRI127 (SEQ ID NO:143
(ácido nucleico), SEQ ID NO:144 (aminoácido)); TRI134 (SEQ ID NO:145
(ácido nucleico), SEQ ID NO:146 (aminoácido)); TRI128 (SEQ ID NO:147
(ácido nucleico), SEQ ID NO:148 (aminoácido)); TRI131 (SEQ ID NO:149
(ácido nucleico), SEQ ID NQ:150 (aminoácido)); TRI132 (SEQ ID NO:151
(ácido nucleico), SEQ ID NO:152 (aminoácido)); TRI138 (SEQ ID NO:153
(ácido nucleico), SEQ ID 1 NO:154 (aminoácido)); 6 ; TRI139 (SEQ ID NO:155
(ácido nucleico), SEQ ID NO:156 (aminoácido)), foram produzidas usando
técnicas de biologia molecular padrão, começando com moléculas de ligação biespecíficas existentes como modelos e usando os métodos geralmente revelados, por exemplo, na Publicação de Pedido PCT nQ WO 2007/146968, Publicação de Pedido de Patente US nQ 2006/0051844, Publicação de Pedido PCT nQ WO 2010/040105, Publicação de Pedido PCT nQ WO 2010/003108 e Patente US nQ 7.166.707 (consulte também a Tabela 3). A inserção do domínio de ligação a anti-CD123 de scFv de terminação N foi obtida através da digestão do modelo parental e inserto de scFv com as enzimas de restrição
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Hindlll e Xhol, os fragmentos desejados foram identificados e isolados por purificação de gel de agarose e ligados. A inserção do C-terminal domínio de ligação de scFv anti-CD3 épsilon de terminação C foi obtida através da digestão do modelo parental e inserto de scFv com as enzimas de restrição EcoRI e Notl, os fragmentos desejados foram identificados e isolados por meio de purificação de gel de agarose e ligados.
[0237] A montagem de construtos com domínios de scFv humano foi obtida por meio de uma ligação de três peças usando um fragmento Hindlll/BamHI, um fragmento BamHI/Xhol e um vetor de destino cortado com Hindill/Xhol. Isto foi usado para produzir as sequências de gene que correspondem às moléculas biespecíficas humanizadas mostradas na Tabela 4.
TABELA 6: COMPOSIÇÃO DE CONSTRUTOS HUMANIZADOS
INICIAIS
ID de Construto Orientação de scFv SEQ ID NO de Nucleotídeos SEQ ID NO de Aminoácidos
TRI129 VHVL 129 130
TRI130 VLVH 131 132
TRI123 VHVL 133 134
TRI124 VLVH 135 136
TRI139 VHVL 155 156
TRI137 VHVL 137 138
TRI125 VHVL 139 140
TRI126 VHVL 141 142
TRI127 VLVH 143 144
TRI131 VHVL 149 150
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TRI132 VHVL 151 152
TRI134 VHVL 145 146
TRI128 VHVL 147 148
TRI138 VHVL 153 154
EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO A CD123 E ANTICORPOS [0238] As moléculas de ligação a CD123 biespecíficas divulgadas no presente documento foram produzidas tanto por meio de transfecção transiente de células HEK293 humanas quanto, em alguns casos, também de transfecção estável de células CHO. As células transfectadas foram purificadas de sobrenadantes de cultura celular por meio de cromatografia por afinidade de Proteína A. Se os agregados fossem detectados após cromatografia de afinidade, a cromatografia de exclusão de tamanho secundária também foi realizada para garantir a homogeneidade da proteína.
EXEMPLO 2: LIGAÇÃO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO A CD123 A LINHAGENS DE CÉLULA CD123(+) [0239] Para confirmar que a atividade de ligação a CD123 na superfície de células cancerosas foi retida para moléculas antiCD123 x anti-CD3s e reatividade cruzada para CD123 cinomolgo, a citometria de fluxo foi usada para quantificar a ligação de moléculas de ligação a CD123 construídas para as linhagens celulares que expressam CD123.
LIGAÇÃO DE PROTEÍNAS MONOESPECÍFICAS E BIESPECÍFICAS A LINHAGENS DE CÉLULA CD123(+) [0240] Estudos de ligação na linhagem de célula cancerosa de Molm-13 de CD123(+) (Matsuo, Y et ai, 1997, Leukemia 11, 1469-1477.) e células CHO que expressa CD123 cinomolgo foram realizados
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197/236 por meio de procedimentos de manchamento baseado em citometria de fluxo padrão. A linhagem celular Molm-13 foi obtida a partir de DSMZ (Braunschweig, Alemanha). A linhagem celular Molm-13 foi cultivada de acordo com os protocolos fornecidos. As células de ovário de hamster chinês (CHO) que expressam de modo estável a proteína de CD123 de cinomolgo de comprimento total se desenvolveram em casa. Um típico experimento podería rotular 100000 células por poço, em placas com 96 poços, com uma faixa de 1000 nM a 0,012 nM de molécula de ligação em 100 μΙ de tampão PBS com 0,2% de BSA e EDTA 2 mM, por 30 min no gelo, seguido por lavagens e incubação com anticorpo secundário reativo a espécie cruzada mínima etiquetação de PE, Fcy IgG anti-humana de cabra, F(ab’)2 (Jackson Laboratory) por 30 minutos no gelo. O sinal das moléculas ligadas foi detectado usando um citometria de fluxo LSR-II™ (BD Biosciences) e analisado por meio de software de análise de citometria de fluxo FlowJo. A intensidade de fluorescência principal (MFI) de moléculas ligadas em células foi determinada após exclusão de dupletos. A análise de regressão não linear para determinar o valor de EC50 foi realizada em software de gráficos e estatística GraphPad Prism 7®.
[0241] As Figuras 1A, 1B, 1C e 1D mostram a ligação de 13 moléculas anti-CD123 x anti-CD3s biespecíficas diferentes (TRI123, TRI125, TRI126, TRI127, TRI128, TRI129, TRI130, TRI131, TRI132, TRI134, TRI137, TRI138 e TRI139) em três experimentos independentes para a linhagem de célula tumoral humana CD123 (+) Molm-13. Estes experimentos utilizaram construtos biespecíficos preparados a partir de células HEK293 transientemente transfectadas. Quatro das moléculas demonstraram níveis máximos comparados de ligação em concentrações de saturação. Os valores de EC5o observados para TRI125, TRI129, TRI130 e TRI139 estavam entre 2 e 10 nM. Os experimentos foram repetidos para TRI129 e TRI130 de células CHO transfectadas de modo estável com resultados semelhantes (dados não mostrados).
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198/236 [0242] As Figuras 2A, 2B e 2C mostram a ligação de 13 moléculas anti-CD123 x anti-CD3s biespecíficas diferentes (TRI123, TRI125, TRI126, TRI127, TRI128, TRI129, TRI130, TRI131, TRI132, TRI134, TRI137, TRI138 e TRI139) em dois experimentos independentes para células CHO que expressam de modo estável proteína de CD123 de cinomolgo. sete das moléculas demonstraram níveis máximos comparáveis de ligação em concentrações de saturação. Os valores de EC5o observados para TRI123, TRI126, TRI129, TRI130, TRI132, TRI137 e TRI139 estavam entre 3 a 38 nM.
[0243] Estes resultados confirma que as moléculas anti-CD123 x anti-CD3s construídas retêm atividade de ligação a CD123 humano na superfície de células cancerosas e são reativas cruzadas com CD123 de cinomolgo.
EXEMPLO 3: Ensaios de citotoxicidade de célula redirecionada com linhagens de célula CD123(+)
Para confirmar que as moléculas biespecíficas que se ligam tanto a CD123 quanto a CD3s poderíam redirecionar a citotoxicidade de célula T contra uma linhagem de célula CD123(+), ensaios de liberação de cromo-51 foram usados para quantificar a lise de célula-alvo induzida por células T.
ENSAIOS DE LIBERAÇÃO DE CROMO-51 COM LINHAGENS DE CÉLULA CD123(+) [0244] A linhagem de célula tumoral humana Molm13 foi cultivada de acordo com os protocolos fornecidos. As células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram isoladas de sangue humano usando gradientes ficoll padrão. As células isoladas foram lavadas em tampão de solução salina. PBMC foram cultivadas por 24 horas com Ativador T Humano CD3/CD28 Dynabeads® (nQ de catálogo 11131 D, Gibco Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, EUA) para ativar células T usando os protocolos do fabricante. Após 24 horas de cultura, as PBMC foram colhidas e colocadas num campo magnético para remover os Dynabeads. As células
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199/236 isoladas foram lavadas em meio RPMI + 10% de soro humano. Durante o ensaio, as concentrações de moléculas biespecíficas com concentração final na faixa de 1000 pM a 0,061 pM foram adicionadas às PBMC ativadas (aproximadamente 100000 por poço).
[0245] Aproximadamente 2,5x106 de células-alvo Molm-13 foram tratadas com 0,125 mCi de 51Cr e incubadas por 90 minutas numa incubadora umidificada por CO2 a 5% a 37 °C. Após incubação, as células foram lavadas 3 vezes com meio de ensaio (RPMI com 10% de soro humano) e ressuspenso em 12,5 ml de meio de ensaio. Para esta suspensão, 50 pl foram dispensados por poço em placas de fundo em U com 96 poços (aproximadamente 10000 células por poço) para levar o volume total para 200 μΙ por poço, e a razão entre PBMC e célula-alvo para 10:1. Um controle de lise zero foi gerado pelas células-alvo apenas, omitindo as PBMC. Um controle de lise total foi gerado incluindo-se 0,20% de NP-40 como o tratamento com células-alvo apenas. Um controle de lise antecedente foi gerado pelas célulasalvo com PBMC na ausência de moléculas biespecíficas.
[0246] As placas foram incubadas por 4 horas a 37 °C, 5% de CO2 numa incubadora umidificada, após a qual as mesmas foram centrifugadas a 1000 rpm por 3 minutos, e 25 μΙ de sobrenadante foi transferido de cada poço para o poço correspondente de uma placa de amostra Luma de 96 poços. As placas de amostra foram permitidas a secar ao ar num cobertura de segurança química por 18 horas e, então, a radioatividade foi lida num contador de cintilação de microplacas TopCount (PerkinElmer) que usa um protocolo padrão.
[0247] A lise específica percentual foi calculada usando a fórmula: ((sinal em amostra tratada com fármaco - sinal antecedente de amostras com Células-Alvo apenas)/(sinal em poços de lise total - sinal antecedente de amostras com Células-Alvo apenas))x100.
[0248] As Figuras 3A, 3B e 3C mostram ensaios de liberação de cromo-51 com a linhagem celular Molm-13 medida em 4 horas
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200/236 usando 13 moléculas anti-CD123 x anti-CD3s biespecíficas diferentes (TRI123, TRI125, TRI126, TRI127, TRI128, TRI129, TRI130, TRI131, TRI132, TRI134, TRI137, TRI138 e TRI139) em dois experimentos independentes. Todas as moléculas anti-CD123 x anti-CD3s biespecíficas mostraram lise de célula-alvo eficaz em 4 horas na faixa entre 24 e 48% de lise específica máxima. Os valores de EC5o medidos na faixa 3 e 37 pM em 4 horas.
[0249] Os ensaios de citotoxicidade de célula T redirecionados também foram realizados com células CHO que expressam estavelmente proteína de CD123 de cinomolgo (TRI129 e TRI130) com (I) Molm-13 (células CD123+ humano) e células T humanas, (ii) Molm-13 (células CD123+ humano) e células T de cinomolgo e (iii) células CHO que expressam estavelmente células CD123 de cinomolgo e células T humanas. Os dados mostram que TRI129 e TRI130 são reativas cruzadas para células CD123+ e células T humanas e de cinomolgo.
[0250] Os resultados específicos confirmam que as moléculas biespecíficas que se ligam tanto a CD123 quanto a CD3s poderíam redirecionar a citotoxicidade de célula T contra uma linhagem de célula CD123(+).
EXEMPLO 4: PROLIFERAÇÃO DE CÉLULA T DEPENDENTE DE ALVO CONTRA A LINHAGEM DE CÉLULA CD123(+) POR MOLÉCULAS BIESPECÍFICAS ANTI-CD123 [0251] Para comparar a eficácia de diferentes moléculas de ligação a CD123 biespecíficas na indução de proliferação de célula T dependente de alvo, seis moléculas biespecíficas anti-CD123 x antiCD3s diferentes que incluem TRI123, TRI126, TRI129, TRI130, TRI132 e TRI139 foram testadas em dois experimentos independentes.
[0252] A proliferação de célula T foi avaliada por meio de citometria de fluxo usando uma linhagem de célula CD123(+), Molm13. As células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram isoladas do sangue humano usando métodos de separação de gradiente de densidade
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201/236 padrão. As células isoladas foram lavadas em tampão de solução salina. As células T foram adicionalmente isoladas usando um Pan T-cell Isolation Kit II de Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Alemanha) usando o protocolo do fabricante. As células Molm-13 foram irradiadas para prevenir a divisão celular usando um Sistema de Irradiação de Raios X Faxitron-CelIRad de Faxitron Bioptics LLC (Tucson, Arizona, EUA).
[0253] A proliferação foi avaliada etiquetando-se populações de célula T com CFSE. As células T etiquetadas com CFSE foram colocadas em placas de fundo em U com 96 poços a 120000 células/poço, respectivamente, com 30000 células tumorais Molm-13 /poço, para obter as razões entre célula T e célula tumoral aproximadas de 4:1. As concentrações de moléculas de teste na faixa de 2000 pM a 0,002 pM foram adicionadas às misturas celulares a um volume final de 200 μΙ/poço em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro AB humano, piruvato de sódio, antibióticos e aminoácidos não essenciais. As placas foram incubadas a 37 °C, 5% de CO2 em incubadoras umidificadas. Após 4 dias, as células foram etiquetadas com anticorpos para análise por citometria de fluxo em placas originais para minimizar perdas de célula, usando tampão de solução salina com 0,1% de albumina sérica bovina e EDTA 2 mM. Após centrifugação e remoção de sobrenadante, os péletes de célula foram ressuspensos com uma mistura dos anticorpos rotulados por matriz em volumes de 50 μΙ: CD5-PE, CD8-Pacific Blue, CD25-PE-Cy7, e 7AAD, e incubados por 30 min em gelo. As células foram lavadas duas vezes e ressuspensas em volumes de 120 μΙ imediatamente antes da aquisição de 50% de cada poço num citômetro de fluxo BD LSRII. Os arquivos de amostra foram analisados usando software FlowJo para calcular as porcentagens de células T CD4+ (CD8')ou CD8+ que foram submetidas a pelo menos uma divisão celular, de acordo com seu perfil CFSE, ligando-se sequencialmente dispersores diretos versus laterais, 7AAD', CD5+, células T CD4+ ou CD8+ (7AAD’, CD5+ CD8' ou 7AAD’ CD5+ CD8+,
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202/236 respectivamente). Os gráficos foram plotados usando GraphPad Prism 7.0.
[0254] A análise de divisão de populações de célula T (Figuras 4A e 4B) revelou um aumento significativo no percentual de células proliferativas na presença de células Molm-13. Todas as moléculas mostraram indução robusta de proliferação de célula T em baixas concentrações (10 pM), e a proliferação foi ligeiramente maior na população de célula T CD8+ (Figura 4B) do que de CD4+ (CD8‘) (Figura 4A). Os valores de EC5o foram determinados com TRI129, TRI130 e TRI139 tanto para populações de CD4 (Figura 4C) quanto de CD8 (Figura 4D) demonstrando potência semelhante para todas as três moléculas biespecíficas anti-CD123 x anti-CD3s.
[0255] Estes resultados confirmaram que as moléculas biespecíficas que se ligam tanto a CD123 quanto a CD3s poderíam induzir a proliferação de célula T dependente de alvo contra uma linhagem de célula CD123(+).
EXEMPLO 5: DETERMINAÇÃO DE
FARMACOCINÉTICA NUMA ESPÉCIE NÃO CLÍNICA REPRESENTATIVA [0256] Para determinar a farmacocinética numa espécie não clínica relevante, uma molécula anti-CD123 x anti-CD3 biespecífica é testada numa espécie de Primata Não Humano (NHP) (por exemplo, macacos cinomolgos) para a avaliação de farmacocinética (PK) e toxicologia da molécula anti-CD123 x anti-CD3. A reatividade cruzada do domínio de ligação a anti-CD123 para CD123 de NHP é testada por ELISA ou ensaios de ressonância plasmônica em superfície (semelhante ao Exemplo 2). Uma vez que há 85,7% de identidade de sequência entre CD123 de NHP e humano, a ligação equivalente é esperada. Os ensaios de PK e imunogenicidade podem ser desenvolvidos e usados para detectar e quantificar a molécula anti-CD123 x anti-CD3 na presença de soro de cino, assim como para avaliar a resposta de imunogenicidade em NHP. Mediante a conclusão bem-sucedida destas tarefas para justificar os macacos cinomolgos como uma espécie tox relevante para moléculas de alvejamento de CD123, um
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203/236 experimento de PK/tolerabilidade de única dose é realizado. O estudo pode ser realizado numa organização de pesquisa clínica (CRO) qualificada. Os resultados do estudo são examinados para parâmetros de PK e quaisquer eventos adversos incluindo eventos adversos inexplicáveis que não podem ser atribuídos ao mecanismo de ação do fármaco ou aos anticorpos antifármaco (ADA). Um toxicologista verifica e interpreta os resultados do estudo e sustenta o desenvolvimento continuado do chumbo. Os parâmetros de PK derivados deste estudo são usados para projetar estudos toxicológicos futuros em primatas não humanos e/ou estudos clínicos em pacientes humanos.
EXEMPLO 6: TESTE DE SEGURANÇA E TOLERABILIDADE NA ADMINISTRAÇÃO CLÍNICA HUMANA [0257] Para determinar a segurança e tolerabilidade em seres humanos de uma molécula biespecífica de chumbo que alveja CD123 e CD3, o teste clínico de fase 1 a seguir podería ser conduzido. O estudo primeiro em seres humanos de uma molécula biespecífica anti-CD123 x antiCD3 pode ser um estudo de escalação de dose para identificar a dose máxima tolerada (MTD) na administração em ser humano.
[0258] Conforme as moléculas anti-CD123 x antiCD3 biespecíficas são agonistas, a dose de partida é definida numa dose que produz o Nível de Efeito Biológico Antecipado Mínimo (MABEL) com base na atividade in vitro de anti-CD123 x anti-CD3. Os farmacocinéticos humanos (PK) são estimados usando valores de PK determinados em modelos não clínicos (camundongos ou primatas não humanos) e escalonamento alométrico para predizer uma dose que produz o MABEL. A molécula biespecífica é dosada usando infusão intravenosa ou injeção subcutânea. A escalação de dose segue um projeto de 3+3 padrão, com coortes de 12 doses antecipados (N=24 a 72 pacientes). A frequência de dose é dependente do PK observado em estudos não clínicos, mas poderíam ser semanais (QW), de duas em duas semanas (Q2W), de três em três semanas (Q3W), ou mensalmente (Q4W). A dosagem continua até que a progressão da doença (conforme definido pelos critérios de
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204/236 resposta com relação imune (IrRC) ou pelos critérios de resposta em tumores sólidos (RECIST)).
[0259] O ponto final primário do estudo é a segurança, definindo um MTD e quaisquer toxicidades limitantes de dose. Os pontos finais secundários é PK, imunogenicidade, e respostas objetivas em volume tumoral avaliado por critérios de irRC ou RECIST. Para os pacientes com malignidades hematológicas, os critérios adicionais podem ser avaliados, como a presença de doença residual mínima (situação MRD). Conforme adequado ou viável, as amostras de biomarcador são tiradas de sangues integrais assim como de linfonodos ou biópsias de medula óssea para monitorar os efeitos no sistema imune assim como efeitos no câncer ou na malignidade.
[0260] Os critérios de inclusão para um estudo de fase 1 podem ser amplos e permitem a inclusão de pacientes com doença refratária ou recidiva de múltiplas indicações em que a expressão de CD123 foi anteriormente mostrada como alta, como leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoide B, neoplasma dendrítico plasmocitoide blástico (BPDCN), e leucemia de célula capilar. Os pacientes que entram no estudo necessitam de evidência de expressão de CD123 a partir da análise imunoistoquímica (IHC) de amostras de biópsia arquivadas do tumor primário ou de uma biópsia prétratamento de um tumor recorrente de um sítio metastático.
[0261] Uma molécula anti-CD123 x anti-CD3 biespecífica é determinada para ser suficientemente segura se pacientes dosados na MTD ou níveis de dose abaixo da MTD mostram evidência de benefício clínico, seja de respostas objetivas dos critérios de irRC ou RECIST ou de alterações nos biomarcadores de soro potencialmente prognósticos, como CTC, PSA ou TAG72.
TABELA 7: SEQUÊNCIAS DE ISOFORMA DE CD123 HUMANO (CENTRO NACIONAL PARA INFORMAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS)
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Nome Sequência de Nucleotídeos (mRNA) Sequência de Aminoácidos (completa) SEQ ID NO (SEQ ID NO de Aminoácidos)
Isoforma 1 de CD123 NM_00218 3.3 NP_00217 4.1 GTCAGGTTCATGGTTA CGAAGCTGCTGACCCC AGGATCCCAGCCCGTG GGAGAGAAGGGGGTCT CTGACA GCCCCCACCCCTCCCC ACTGCCAGATCCTTATT GGGTCTGAGI I I CAGG GGTGGGGCCCCAGCT GGAGGT TATA AAAC AG CTC A ATC GGGGAGTACAACCTTC GG I I I CTCTTCGGGGA AAGCTGCI I ICAGCGC ACACG GGAAGATATCAGAAAC ATCCTAGGATCAGGAC ACCCCAGATCTTCTCAA CTGGAACCACGAAGGC TGI I I CTTCCACACAGTACI I I GATCTCCAI I IAAGCAG GCACCTCTGTCCTGCG TTCCGGAGCTGCGTTC CCGA TGGTCCTCCI I IGGCT MVLLWLTLLLIALP CLLQTKEDPNPPIT NLRMKAKAQQLT WDLNRNVTDIECV KDADYSMPAVNNS YCQF GAISLCEVTNYTVR VANPPFSTWILFPE NSGKPWAGAENL TCWIHDVDFLSCS WAVGPGAPADVQ YDLYL NVANRRQQYECL HYKTDAQGTRIGC RFDDISRLSSGSQ SSHILVRGRSAAF GIPCTDKFVVFSQI EILTP PNMTAKCNKTHSF MHWKMRSHFNRK FRYELQIQKRMQP VITEQVRDRTSFQL LNPGTYTVQIRAR ERVYE FLSAWSTPQRFEC DQEEGANTRAWR SEQ ID NO:205 (SEQ ID NO:206)
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CACGCTGCTCCTGATC GCCCTGCCCTGTCTCC TGCAAACGAAGGAAGA TCCAAA CCCACCAATCACGAAC CTAAGGATGAAAGCAA AGGCTCAGCAGTTGAC CTGGGACCTTAACAGA AATGTG ACCGATATCGAGTGTG TTAAAGACGCCGACTAT TCTATGCCGGCAGTGA ACAATAGCTATTGCCAG TTTG GAGCAA1 1 1 CCTTATGT GAAGTGACCAACTACA CCGTCCGAGTGGCCAA CCCACCATTCTCCACG TGGAT CCTCTTCCCTGAGAAC AGTGGGAAGCCTTGGG CAGGTGCGGAGAATCT GACCTGCTGGATTCAT GACGTG GA 1 1 1CTTGAGCTGCA GCTGGGCGGTAGGCC CGGGGGCCCCCGCGG ACGTCCAGTACGACCT GTACTTGA TSLLIALGTLLALVC VFVICRRYLVMQR LFPRIPHMKDPIGD SFQ NDKLVVWEAGKA GLEECLVTEVQVV QKT
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ACGTTGCCAACAGGCG TCAACAGTACGAGTGT CTTCACTACAAAACGGA TGCTCAGGGAACACGT ATCGG GTGTCG111CGATGAC ATCTCTCGACTCTCCAG CGGTTCTCAAAGTTCC CACATCCTGGTGCGGG GCAGG AGCGCAGCCTTCGGTA TCCCCTGCACAGATAA G 1 1 1G 1 CG 1C1 1 1 1CAC AGATTGAGATATTAACT CCAC CCAACATGACTGCAAA GTGTAATAAGACACATT CC1 1 1ATGCACTGGAAA ATGAGAAGTCA1 1 1 CAA TCG CAAA1 1 1 CGCTATGAGC TTCAGATACAAAAGAGA ATG C AG CCTGTAATC A CAGAACAGGTCAGAGA CAGA ACCTCCTTCCAGCTACT CAATCCTGGAACGTAC ACAGTACAAATAAGAG CCCGGGAAAGAGTGTA
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TGAAT TCTTGAGCGCCTGGAG CACCCCCCAGCGCTTC GAGTGCGACCAGGAGG AGGGCGCAAACACACG TGCCTG GCGGACGTCGCTGCTG ATCGCGCTGGGGACGC TGCTGGCCCTGGTCTG TGTCTTCGTGATCTGCA GAAGG TATCTGGTGATGCAGA GACTC1 1 1 CCCCGCAT CCCTCACATGAAAGAC CCCATCGGTGACAGCT TCCAAA ACGACAAGCTGGTGGT CTGGGAGGCGGGCAAA GCCGGCCTGGAGGAGT GTCTGGTGACTGAAGT ACAGGT CGTGCAGAAAACTTGA GACTGGGGTTCAGGGC TTGTGGGGGTCTGCCT CAATCTCCCTGGCCGG GCCAGG CGCCTGCACAGACTGG CTGCTGGACCTGCGCA CGCAGCCCAGGAATGG
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ACATTCCTAACGGGTG GTGGGC ATGGGAGATGCCTGTG TAAI I ICGTCCGAAGCT GCCAGGAAGAAGAACA GAACI I IGIGIGI I I AT TTCA TGATAAAGTGAI I I I I I I I I I I I IAACCCAAAA
Isoforma 2 de CD123 NM_00126 7713.1 NP_00125 4642.1 GTCAGGTTCATGGTTA CGAAGCTGCTGACCCC AGGATCCCAGCCCGTG GGAGAGAAGGGGGTCT CTGACA GCCCCCACCCCTCCCC ACTGCCAGATCCTTATT GGGTCTGAGI I I CAGG GGTGGGGCCCCAGCT GGAGGT TATA AAAC AG CTC A ATC GGGGAGTACAACCTTC GG I I I CTCTTCGGGGA AAGCTGCI I ICAGCGC ACACG GGAAGATATCAGAAAC ATCCTAGGATCAGGAC ACCCCAGATCTTCTCAA CTGGAACCACGAAGGC MVLLWLTLLLIALP CLLQTKEGGKPWA GAENLTCWIHDVD FLSCSWAVGPGAP ADVQYDLYLNVAN RRQQ YECLHYKTDAQGT RIGCRFDDISRLSS GSQSSHILVRGRS AAFGIPCTDKFVVF SQIEILTPPNMTAK CN KTHSFMHWKMRS HFNRKFRYELQIQ KRMQPVITEQVRD RTSFQLLNPGTYT VQIRARERVYEFLS AWSTP QRFECDQEEGAN SEQ ID NQ:207 (SEQ ID NQ:208)
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1G 1 1 1 TRAWRTSLLIALGT
C1 1CCACACAG1 AC 1 1 1 LLALVCVFVICRRY
GA 1 C1 CCA 1 1 1AAGCAG LVMQRLFPRIPHM
GCACCTCTGTCCTGCG KDPIGDSFQNDKL
TTCCGGAGCTGCGTTC VVWE
CCGA AGKAGLEECLVTE
IGGICCICCI 1 IGGCI CACGCTGCTCCTGATC GCCCTGCCCTGTCTCC TG CAAACGAAG GAAG G TGGGAA GCCTTGGGCAGGTGCG GAGAATCTGACCTGCT GGATTCATGACGTGGA TTTCTTG AG CTG CAG CT GGGCG GTAGGCCCGGGGGCC CCCGCGGACGTCCAGT ACGACCTGTACTTGAA CGTTGCCAACAGGCGT CAACAGT ACGAGTGTCTTCACTAC AAAACGGATGCTCAGG GAACACGTATCGGGTG TCG111CGATGACATCT CTCG ACTCTCCAGCGGTTCT CAAAGTTCCCACATCCT GGTGCGGGGCAGGAG VQVVQKT
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CGCAGCCTTCGGTATC CCCTGC ACAGATAAG111GTCGT C1 1 11CACAGATTGAGA TATTAACTCCACCCAAC ATGACTG CAAAGTGTAA TA AGACACATTCC1 1 1 ATG CACTGGAAAATGAGAA GTCA1 1 1 CAATCGCAAA TTTCG CTATGAG CTTCA GAT ACAAAAGAGAATGCAG CCTGTAATCACAGAACA GGTCAGAGACAGAACC TCCTTCCAG CTACTCAA TCCT GGAACGTACACAGTAC AAATAAGAGCCCGGGA AAGAGTGTATGAATTCT TGAGCGCCTGGAGCAC CCCCC AGCGCTTCGAGTGCGA CCAGGAGGAGGGCGC AAACACACGTGCCTGG CGGACGTCGCTGCTGA TCGCGCT GGGGACGCTGCTGGC CCTGGTCTGTGTCTTC
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GTGATCTGCAGAAGGT ATCTGGTGATGCAGAG ACTC1 1 1 CCCCGCATCCCTCACA TGAAAGACCCCATCGG TGACAGCTTCCAAAAC GACAAGCTGGTGGTCT GGGAGG CGGGCAAAGCCGGCCT GGAGGAGTGTCTGGTG ACTGAAGTACAGGTCG TGCAGAAAACTTGAGA CTGGGG TTC AG G G CTTGTG G G G GTCTGCCTCAATCTCC CTGGCCGGGCCAGGC GCCTGCACAGACTGGC TGCTGGA CCTGCGCACGCAGCCC AGGAATGGACATTCCT AACGGGTGGTGGGCAT GGGAGATGCCTGTGTA Al 11 CG TCCGAAGCTGCCAGGA AGAAGAACAGAAC1 1 1 GTGTG 1 1 1A1 1 1 CATGA TAAAGTGA1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 TTT AACCCAAAA
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EXEMPLO 7: ATIVAÇÃO DE CÉLULA T DEPENDENTE DE ALVO INDUZIDA CONTRA LINHAGEM DE CÉLULA CD123(+) POR MOLÉCULAS BIESPECÍFICAS ANTI-CD123 [0262] Para comparar a eficácia de moléculas de ligação a CD123 biespecíficas diferentes na indução de ativação de célula T dependente de alvo de células T CD4+ e CD8+, seis moléculas biespecíficas anti-CD123 x anti-CD3s diferentes incluindo TRI123, TRI126, TRI129, TRI130, TRI132 e TRI139 foram testadas em dois experimentos independentes.
[0263] A ativação de célula T foi avaliada por meio de citometria de fluxo usando uma linhagem de célula CD123(+), Molm-13. As células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram isoladas do sangue humano usando métodos de separação de gradiente de densidade padrão. As células isoladas foram lavadas em tampão de solução salina. As células T foram adicionalmente isoladas usando um Pan T-cell Isolation Kit II de Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Alemanha) usando o protocolo do fabricante.
[0264] As células T foram colocadas em placas de fundo em U com 96 poços a 120000 células/poço, respectivamente, com 30000 células tumorais Molm-13/poço, para obter razões entre célula T e célula tumoral aproximadas de 4:1. As concentrações de moléculas de teste na faixa de 2000 pM a 0,002 pM foram adicionadas às misturas celulares a um volume final de 200 μΙ/poço em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro AB humano, piruvato de sódio, antibióticos e aminoácidos não essenciais. As placas foram incubadas a 37 °C, 5% de CO2 em incubadoras umidificadas. Após 20 horas, as células foram etiquetadas com anticorpos para análise por citometria de fluxo em placas originais para minimizar as perdas de célula, usando tampão de solução salina com 0,1% de albumina sérica bovina e EDTA 2 mM. Após centrifugação e remoção de sobrenadante, os péletes de célula foram ressuspensos com uma mistura dos anticorpos rotulados por matriz em volumes de 50 μΙ: CD69-FITC, CD5-PE, CD8-Pacific Blue, CD4-APC, CD25
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PE-Cy7, e 7AAD e incubadas por 30 min em gelo. As células foram lavadas duas vezes e ressuspensas em volumes de 120 μΙ imediatamente antes da aquisição de 50% de cada poço num citômetro de fluxo BD LSRII. Os arquivos de amostra foram analisados usando software FlowJo para calcular as porcentagens de células T CD4+ (CD8')ou CD8+ que regularam para cima CD69 e CD25, ligando-se sequencialmente dispersador direto versus lateral, 7AAD’, células T CD5+, CD4+ ou CD8+ (7AAD’, CD5+ CD4+ ou 7AAD’ CD5+ CD8+, respectivamente). Os gráficos foram plotados usando GraphPad Prism 7.0.
[0265] A análise de células T ativada após 20 horas (Figura 5) revelou um aumento significativo na porcentagem de células T CD4+ e CD8+ ativadas na presença de células Molm-13. Todas as moléculas testadas induziram ativação máxima de células T na presença de células-alvo Molm-13 em baixas concentrações na faixa de 1 a 100 pM (Figura 5). Os valores de EC5o foram determinados com TRI129, TRI130 e TRI139 tanto para populações de CD4+ (Figura 5C) quanto de CD8+ (Figura 5D) CD25+ CD69+ que demostraram potência semelhante para todas as três moléculas biespecíficas anti-CD123 x anti-CD3s.
[0266] Estes resultados demonstraram que as moléculas biespecíficas que se ligam tanto a CD123 quanto a CD3s poderíam induzir a ativação de célula T dependente de alvo contra uma linhagem de célula CD123(+).
EXEMPLO 8: LIGAÇÃO DE PROTEÍNAS BIESPECÍFICAS A CD123 [0267] Para determinar a cinética e a afinidade das proteínas biespecíficas a CD123, das proteínas biespecíficas TRI-129 e TRI130 foram expressas por meio de transfecção transiente em células HEK293 e purificadas usando uma combinação de purificação por afinidade e purificação por exclusão de tamanho. O domínio extracelular de CD123 foi transientemente
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215/236 expresso com uma etiqueta de afinidade na terminação C e purificado usando uma combinação de purificação por afinidade e purificação por exclusão de tamanho. As análises foram realizadas usando um instrumento BIACORE™ T200 (Biacore Inc., Piscataway, NJ). O BIACORE™ T200 é um sistema de biossensor baseado em ressonância plasmônica superficial (SPR) que é projetado para fornecer dados de ligação cinética em tempo real.
[0268] Os estudos de ligação de SPR de moléculas biespecíficas a ectodomínio CD123 de monomérico (ECD) recombinante foram conduzidos a 25 °C em tampão HBS-EP+. O fragmento de Fcy IgG antihumana de cabra de fragmento AffiniPure F(ab’)2 específico (Jackson Immuno Research) a 20 pg/ml em acetato de sódio 10 mM (pH 4,5) foi imobilizado numa densidade de 3600 unidades de resposta (RU) na superfície de um chip de sensor de grau de pesquisa CM5 (R-1005-30, GE Healthcare) por meio de química de acoplamento de amina padrão. As moléculas biespecíficas a 200 nM em tampão HBS-EP+ foram capturadas pelo fragmento anti-Fc F(ab’)2 imobilizado numa taxa de fluxo de 30 μΙ/min para 120 s para chegar a uma resposta de 2000 RU estável. As concentrações diferentes de CD123 ECD (3 a 48 nM por diluições de 2 vezes, incluindo tampão como bloco bruto) foram escoadas nas moléculas biespecíficas capturadas a 30 μΙ/min por 120 s seguido por um período de dissociação de 300 s. A regeneração ideal foi obtida por uma injeção de glicina 10 mM (pH 1,7) numa taxa de fluxo de 30 μΙ/min por 15 s seguida por uma injeção de NaOH 50 mM a 30 μΙ/min por 15 s. Uma estabilização de dois minutos com tampão HBS-EP+ foi concluída antes da execução subsequente.
[0269] Os sensogramas obtidos a partir e medições de SPR cinéticas foram analisadas por meio do método de subtração dupla. O sinal da célula de fluxo de referência foi subtraído da resposta de ligação a analito obtida das células de fluxo com aglutinantes imobilizados ou capturados. As respostas de referência a tampão foram, então, promediadas a partir de múltiplas injeções. As respostas de referência a tampão promediadas
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216/236 foram, então, subtraídas das respostas de ligação a analito, e os dados de referência dupla finais foram analisados com software de Avaliação BIACORE™ T200 (2.0, GE Healthcare), ajustando globalmente os dados aos parâmetros cinéticos derivados (Tabela 8). Todos os sensogramas foram ajustados usando um modelo de ligação de um para um simples.
TABELA 8: PARÂMETROS CINÉTICOS DERIVADOS PARA MOLÉCULAS BIESPECÍFICAS aCD123 PARA CD123 ECD.
Molécula ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM)
TRI-129 1,79x105 2,05x10’3 11,4
TRI-130 1,72x105 4,72x10’4 2,7
[0270] Um exemplo da análise SPR de TRI-130 em concentrações de ECD diferentes na faixa de 3 nM a 48 nM é mostrado na Figura 6. As constantes de taxa termodinâmica e cinética de ligação foram calculadas usando o software de Avaliação BIACORE™. Por exemplo, a afinidade (KD) de TRI-130 para domínio extracelular (ECD) de CD123 foi determinada como 2,74x10'9 M com um ka de 1,72x105 M'1s'1 e um kd de 4,72x10'4 s'1. A afinidade de TRI-129 para o CD123 foi determinada como 1,14x10'8 M com um ka de 1,79x105 M'1s'1 e um kd de 2,05x10'3 s'1.
EXEMPLO 9: CALORIMETRIA DE VARREDURA DIFERENCIAL [0271] A estabilidade térmica do domínio de ligação a CD123 foi avaliada usando Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC). A DSC mede as alterações da capacidade térmica associadas à desnaturação térmica da molécula quando aquecida numa taxa constante. O valor de Tm (ponto intermediário de transição térmica) de scfv de domínio de ligação a CD123, que é uma medida de sua estabilidade, pode ser extraído da curva de fusão.
[0272] O estudo de estabilidade térmica de DSC foi
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217/236 conduzido usando um sistema de DSC MicroCai VP-Capillary (Malvern Instrument). Uma compatibilidade exata de tampão, PBS pH 7,4, foi usada como a referência. 500 ul de uma solução de 0,5 mg/ml de cada amostra de proteína com referência foi carregada no instrumento e aquecida de 25 °C para 100 °C numa taxa de um grau celsius por minuto. A curva de fusão foi analisada usando software de plataforma Origin 7 “MicroCai VP-Capillary DSC Automated Analysis Software”. Tm de cada transição de fusão foi calculado usando o método de “integração de cursos sem 2 estados”.
TABELA 9: AVALIAÇÃO DE ESTABILIDADE TÉRMICA DE DOMÍNIOS
Amostra Tmlnicial Tm1 (aCD3 scFv) Tm2 (aCD123 scFv e Fc CH2) Tm3 (Fc CH3)
TRI12 9 51,19 59,59 64,48 83,87
TRI13 0 53,19 59,59 65,71 84,64
EXEMPLO 10: ATIVIDADE FARMACOCINÉTICA [0273] Para determinar a atividade farmacocinética de moléculas biespecíficas, os camundongos de Balb/c fêmea foram injetados de modo intravenoso (IV) com 200 mg (~10 mg/kg) de TRI129 ou TRI130 (n=30 para cada molécula, TRI129 ou TRI130). Em cada ponto no tempo, o sangue foi coletado por perfuração cardíaca de 3 camundongos. Os pontos no tempo foram: 15 minutos, 2, 6, 24, 48, 72, 96, 168, 336 e 504 horas. O sangue foi procedido ao soro, foi aliquotado e congelado. As concentrações de TRI129 e TRI130 em amostras de soro foram determinadas por ensaio imunoabsorvente ligado por enzima (ELISA). As concentrações de soro ao longo do tempo foram usadas para determinar estimativas de parâmetro PK por análise não comportamental (NCA) e análise comportamental. Os perfis de concentração
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218/236 de soro ao longo do tempo foram analisados com software Phoenix 64. Os gráficos foram plotados usando GraphPad Prism 7.0. A análise de parâmetro de NCA dos dados resultantes é fornecida na Tabela 10.
TABELA 10: ANÁLISE DE PARÂMETRO DE NCA DOS DADOS
Biespecífico T1/2 Folga Volume AUC
TRI-129 229 horas (9,5 dias) 0,204 ml/h/kg 67,54 ml/kg 38750 h*pg/ml
TRI-130 301 horas (12,5 dias) 0,186 ml/h/kg 80,84 ml/kg 37309 h*pg/ml
[0274] A Figura 7 mostra curvas de concentração em função de tempo para moléculas biespecíficas TRI129 e TRI130.
EXEMPLO 11: EFICÁCIA IN VIVO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO ANTI-CD123 X ANTI-CD3 [0275] Para determinar se TRI129 e TRI130 são capazes de inibir o crescimento tumoral e de prolongar a sobrevivência in vivo, um modelo de roedor de leucemia mieloide aguda humana foi utilizado. As células MOLM-13/LUC foram comisturadas com as células T doadoras e matrigel e implantadas no flanco de camundongos NOD/SCID no dia 0 do estudo. Os animais foram tratados em grupos de 10 camundongos por grupo com células T de um doador com veículo, TRI129 ou TRI130 no estudo Dia 0, 4 e 8 em doses de 15, 3 e 0,6 pg de proteína num volume total de 200 μΙ. O crescimento tumoral foi medido com calibres ao longo do tempo durante o estudo e eventos de sobrevivência foram registrados cada vez que um camundongo chegou ao ponto final (volume tumoral >1500 mm3) e foi submetido à eutanásia. Conforme mostrado nas Figuras 8 e 9, havia impacto mínimo de TRI129 e TRI130 na ausência de células T doadoras e impacto mínimo de células T no crescimento tumoral pelas células T doadoras sozinha. A inibição significativa de crescimento tumoral foi vista após o tratamento tanto
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219/236 com TR1129 quanto com TR1130 em todas as doses testadas na presença de células T doadoras. Diferenças significativas na sobrevivência mediana de camundongos foram determinadas usando análise de sobrevivência de KaplanMeier com um teste log-rank para comparar curvas de sobrevivência. Conforme mostrado na Figura 10, a sobrevivência de camundongos tratados com todas as doses testadas de TRI129 e TRI130 na presença de células T humanas foi significativamente prolongada em relação a todos os grupos de controle. Nem a coimplantação de células T com o tratamento de veículo nem o tratamento de tumores com TRI129 ou TRI130 na ausência de células T humanas estendeu a sobrevivência em comparação com os camundongos implantados com células tumorais sozinhas e tratadas com veículo. Este resultado demonstrou que tanto TRI129 quanto TRI130 são capazes de conduzir a inibição de crescimento tumoral e de prolongar a sobrevivência num modelo de Xenoenxerto de leucemia mieloide aguda.
EXEMPLO 12: CITOTOXICIDADE DE TRI-130 É ESPECÍFICA A LINHAGENS CELULARES QUE EXPRESSAM CD123 [0276] Para confirmar a especificidade de TRI130 e comparar sua atividade citotóxica em linhagens de célula tumoral que expressa diferentes níveis de CD123, os ensaios de liberação de cromo-51 foram usados para quantificar a lise de célula-alvo induzida pelas células T. Os níveis de expressão de CD123 nas linhagens de células tumorais de AML de MOLM-13 e KG-1a positivas a CD123 foram comparados à linhagem de célula tumoral de linfoma de Daudi Burkitt negativa a CD123 por meio de citometria de fluxo. A expressão de CD123 foi detectada usando um anticorpo conjugado a ficoeritrina (PE) de CD123 humano comercialmente disponível. A expressão de CD123 positiva foi detectada em MOLM-13 e KG-1a, mas não em células Daudi. As células MOLM-13 e KG-1a expressaram 10000 e 2000 receptores em média por célula, respectivamente (dados não mostrados). As concentrações diferentes de TRI130 foram incubadas com linhagens de célula MOLM-13, KG-1a ou Daudi e células T humanas purificadas recentemente
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220/236 isoladas de sangue periférico humano, então, pré-ativadas com microesferas acopladas anti-CD3 x anti-CD28 por 24 horas. A citotoxicidade induzida por TRI130 apenas nas linhagens celulares que eram positivas para expressão de CD123 e demonstrou potência comparável entre as linhagens de célula tumoral de AML de MOLM-13 e KG-1a (Figura 12). A citotoxicidade foi medida como percentual de lise de célula tumoral específica, estimada com o uso de um ensaio de liberação de cromo-51 com pontos no tempo de 4 h e 24 h (dados não mostrados). Estes resultados confirmam que citotoxicidade de célula T redirecionada induzida por TRI130 é específica às células-alvo que expressam CD123 e demonstram citotoxicidade de TRI130 potente em linhagens de célula tumoral de AML que expressam diferentes níveis da proteína de CD123.
EXEMPLO 13: CITOTOXICIDADE INDUZIDA POR TRI130 COM CÉLULAS T VIRGENS EM RAZÕES ENTRE CÉLULA EFETORA E ALVO DIFERENTES [0277] Para examinar a atividade de citotoxicidade induzida por TRI130 em razões entre célula efetora e alvo diferentes, as células KG-1a que expressam níveis moderados de CD123 foram incubadas com concentrações diferentes de TRI130 e células T purificadas de cinco doadores humanos diferentes que não foram pré-ativados. As células-alvo KG-1a foram cultivadas com células T em razões entre célula efetora e alvo de 10:1, 5:1 e 1:1. A atividade citotóxica induzida por TRI130 em todas as razões entre célula efetora e alvo testadas foi comparável através de todos os cinco doadores (dados não mostrados). A citotoxicidade foi medida como percentual de lise de célula tumoral específica, que foi estimada usando um ensaio de liberação de cromo-51 de 24 horas. Estes resultados demonstraram citotoxicidade induzida por TRI130 potente em razões entre célula efetora e alvo diferentes com células T virgens e variabilidade mínima em atividade entre doadores normais.
EXEMPLO 14: FARMACOCINÉTICO DE DOSE ÚNICA E ESTUDO DE TOLERABILIDADE EM MACACOS CINOMOLGOS [0278] Um farmacocinético de dose única e estudo
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221/236 de tolerabilidade foi conduzido para determinar a tolerabilidade, imunogenicidade e características de farmacocinética seguindo a administração intravenosa de TRI130. O projeto do estudo é mostrado na Tabela 11. A via de administração intravenosa foi selecionada para o estudo como este é a via desejada para dosagem humana.
[0279] A ligação a NHP CD3s foi determinada usando o domínio de ligação a anti-CD3 num formato de fusão de scFv-Fc monoespecífico. O scFv-Fc anti-CD3 foi testado em células T de macacos cinomolgos chineses por meio de citometria de fluxo. Os níveis de ligação foram variáveis, com os macacos individuais mostrando níveis elevados, intermediários ou baixos de ligação em comparação com as células humanas (dados não mostrados).
TABELA 11: PROJETO EXPERIMENTAL DE ESTUDO FARMACOCINÉTICO EM MACACOS CINOMOLGOS
N2 do Grupo N2 de Machosa Material de Teste Dia e Tempo de Dosagemb Nível de Dose (mg/kg) Concentra ção de Dose (mg/ml) Volume de Dose (ml/kg)
1 3 Controle Dia 1 0 0 5
2 3 TRI130 Dia 1 0,25 0,05 5
3 3 TRI130 Dia 1: 2 h 0,5 0,1 5
4 3 TRI130 Dia 1: 24 h 1,0 0,2 5
a Os animais foram liberados do estudo no Dia 36.
b A dosagem para Grupos 1 e 2 foi iniciada consecutivamente, sem um atraso entre grupos. A dosagem foi atrasada por 2 horas do fim do terceiro animal no Grupo 2 e do início do primeiro animal no Grupo 3; A dosagem para o Grupo 4 foi atrasada por 24 horas do início da dosagem para o Grupo 1.
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222/236 [0280] Os parâmetros a seguir e os pontos finais foram avaliados no estudo de NHP de dose única: sinais clínicos, pesos corporais, consumo de alimentos, parâmetros de patologia clínica (hematologia, coagulação e química clínica), farmacocinéticos (PK), imunogenicidade, perfis de citocina e citometria de fluxo.
[0281] Os níveis de dose testados na faixa de dose humana máxima esperada a várias doses elevadas da dose humana esperada (Tabela 12). A dose ativa farmacologicamente antecipada (PAD) em seres humanos está na faixa de 0,4 mcg/kg com base no modelo de xenoenxerto in vivo (Exemplo 11), que é 625X abaixo da dose do Grupo 2. No entanto, com base nos ensaios de atividade in vitro (ativação de célula T, proliferação e liberação de citocina), há uma redução de 10 a 100 vezes na resposta de células T de cinomolgo a TRI130 em comparação com aquelas células T humanas. Portanto, a dose no Grupo 2 é esperada para ser -6,25 a 62,5X o equivalente biológico à PAD humana. Os Grupos 3 e 4 avaliam um excesso de 2 e 4 vezes a dose anterior.
[0282] TRI130 interage com CD3 nas células T, e com a molécula-alvo CD123 em populações de célula imune incluindo células dendríticas plasmacitoides (pDC) e basófilos, que expressam altos níveis de CD123, mas constituem menos que 1% de leucócitos circulantes. Os dados publicados que descrevem outros biespecíficos que alvejam CD123 notaram liberação de citocina significativa (Chichili et al. Sei Transi Med. maio de 2015, 27;7(289):289ra82).
[0283] Devido à expectativa para a liberação de citocina, este estudo foi conduzido em 2 fases. Na Fase I, dois animais sentinelas receberam TRI130 para determinar níveis de dose adequados para a Fase II, o que incluiría Grupos de tratamento 2 a 4. Um nível de dose de 0,05 mg/kg (inicialmente antecipada como o nível de dose intermediária de Fase II) foi escolhido para a primeira sentinela, e este animal foi monitorado de perto por sinais de síndrome de liberação de citocina, incluindo a coleta de
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223/236 observações pós-dose, temperaturas corporais, e amostras sanguíneas para análise de citocina. A dose foi bem tolerada, e 24 horas depois, um segundo animal sentinela foi dosada a 0,25 mg/kg (inicialmente antecipado como nível de dose alta de Fase II) que também foi bem tolerada.
[0284] Os níveis de dose para a Fase II foram selecionados numa tentativa de produzir respostas graduadas para TRI130, e incorporaram resultados das sentinelas da Fase I. Devido aos níveis de dose na Fase I foram bem tolerados por meio de animais sentinelas, sem observações clínicas anormais, níveis de liberação de citocina elevados, ou temperatura corporal aumentada, os níveis de dose de Fase II selecionados eram 0,25, 0,5 e 1 mg/kg, que eram 2500 vezes o equivalente de PAD humana esperado (Tabela 12). Ajustando-se esta margem em até 100 vezes de diferença na atividade, este estudo obteve doses até 25 vezes maiores do que PAD humana.
TABELA 12: EQUIVALENTES DE DOSE DE TRI130 EM COMPARAÇÃO COM A DOSE FARMACOLOGICAMENTE ATIVA (PAD) ESPERADA
N2 do Grupo Material de Teste Nível de Dose (mg/kg) Equivalente em Massa para PAD Esperada (—0,4 mcg/kg) Equivalência de Dose Ajustada com Base em Resposta de Cino
1 Controle 0 0 0
2 TRI130 0,25 625X 6,25X
3 TRI130 0,5 1250X 12,5X
4 TRI130 1 2500X 25X
FARMACOCINÉTICOS DE TRI130 DE DOSE ÚNICA EM
MACACOS CINOMOLGOS
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224/236 [0285] As concentrações séricas foram determinadas usando um método ELISA padrão usando o domínio extracelular de CD123 para capturar TRI130, e um anticorpo anti-ID biotinilado (5H5) que reconhece o domínio de ligação a anti-CD3 para detectar o TRI130 ligado. Para a maioria dos animais uma rápida queda na concentração de soro nos últimos pontos no tempo correspondeu à presença de anticorpos antifármacos (ADA). Um ELISA de ligação padrão que usa TRI130 +/- biotina foi usado para medir títulos de ADA em amostras séricas coletadas nos últimos pontos no tempo. Os títulos de ADA foram relativamente baixos para 7 dos 9 animais testados com TRI130, e valores de títulos tenderam a aumentar ao longo do tempo (dados não mostrados). No entanto, o título também pareceu diminuir com doses crescentes de TRI130, e o início do ADA foi mais tarde para doses maiores, o que significa que doses maiores não estavam correlacionadas com os níveis aumentados de imunogenicidade, conforme seria normalmente esperado. Devido ao fato de que TRI130 é uma proteína humana, a detecção de ADA nos últimos pontos no tempo em amostras séricas de NHP é considerada uma resposta normal, e a imunogenicidade em NHP não é preditiva de respostas humanas.
[0286] A análise não compartimentalizada (NCA) de concentrações de soro detectadas no ensaio de ELISA calculou uma meia vida terminal média para TRI130 de até 84 horas em animais dosados com 1 mg/kg (Tabela 13). Individualmente, um animal no grupo 4 teve acúmulo subcutâneo evidente de TRI130, enquanto um outro no grupo teve indução precoce significativa de ADA resultando numa meia vida muito mais curta. A amostragem esparsa e ponderação uniforme foram usadas para NCA, e as concentrações de soro claramente influenciadas por ADA foram excluídas da análise.
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TABELA 13: ESTIMATIVAS DE PARÂMETRO DE PK DE NCA PARA
ANIMAIS INDIVIDUAIS DOSADOS COM TRI130
NCA com escassa Amostragem Ponderação Uniforme
Parâmetro Unidades Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4
Rsq ajustado 0,964 0,992 0,983
HL Lambda z h 59,55 66,44 84,46
Tmáx h 0,25 0,25 0,25
Cmáx ug/ml 4,386 12,124 27,075
Cmáx/D kg*ug/ml/ug 0,018 0,024 0,027
Túltimo h 264 264 408
Cúltimo ug/ml 0,0573 0,317 0,309
AUCtotal h*ug/ml 143,7 515,8 1329,7
AUCINF h*ug/ml 148,6 546,2 1367,4
AUCINF/D h*kg*ug/ml/ug 0,594 1,092 1,367
Vz ml/kg 144,57 87,75 89,11
Cl ml/h/kg 1,683 0,915 0,731
MRTúltimo h 49,45 64,30 88,42
MRTINF h 59,41 80,75 100,58
Vss ml/kg 99,96 73,92 73,56
[0287] Além de NCA, a análise compartimentalizada
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226/236 foi executada para animais individuais e os grupos de tratamento, usando modelos de compartimento WinNonlin® 2 pré-compilados, com os esquemas de dosagem e ponderação adequados. Os resultados são mostrados na Figura 13 e foram semelhantes às estimativas de parâmetros de NCA, com a meia vida para um animal no grupo 4 (4003) sem ADA significativo ou dosagem subcutânea parcial, determinada para ser quase 89 horas. O animal 4002 no grupo 4 teve um aumento gradual nos níveis de fármaco de soro ao longo do tempo, e um Tmáx a 6 horas (Tabela 14); portanto, seus dados foram melhor ajustados usando um modelo de 2 compartimentos para dosagem extravascular, ao invés de dosagem de bolo IV.
[0288] As estimativas de parâmetro de PK determinadas usando NCA ou análise compartimentalizada, não eram semelhantes através dos grupos de tratamento nesta meia vida aumentada e a folga diminuída com doses crescentes, provavelmente devido à ligação mediada por alvo de TRI130.
TABELA 14: ANÁLISE COMPARTIMENTALIZADA PARA NHP DADA
UMA DOSE IV ÚNICA DE TRI130
Tratamento (Dose/ Via) ID de NHP V1 (ml/h) CL (ml/h /kg) V2 (ml/h) CLD2 (ml/h/ kg) AUC (h*pg /ml) HL Alfa (h) HL Beta (h) Cmáx (pg/ml ) Tmá X (h)
0,25 mg/kg IV 2001 59,32 2,463 24,36 4,427 101,5 2,56 8 24,7 9 4,22 0,25
0,25 mg/kg IV 2002 50,87 1,864 32,19 1,820 134,1 6,29 3 36,8 5 4,91 0,25
0,25 mg/kg IV 2003 61,16 1,470 43,41 3,341 170,1 4,85 9 53,4 6 4,09 0,25
Média de 56,54 1,917 32,7 3,028 130,4 4,32 35,4 4,42 0,25
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grupo 2 5
0,5 mg/kg IV 3001 41,66 4 0,874 25,19 3 1,293 572 7,56 9 58,9 9 12,0 0,25
0,5 mg/kg IV 3002 45,70 3 1,072 41,35 4 3,339 467 4,18 0 60,7 2 10,94 0,25
0,5 mg/kg IV 3003 38,93 9 1,058 28,97 3 2,692 473 3,96 6 47,9 8 12,84 0,25
Média de grupo 3 41,87 1,002 32,43 2,540 499 4,60 8 55,6 5 11,94 0,25
1 mg/kg IV 4101 27,93 0,926 22,08 16,53 3 1080 0,51 1 37,8 5 35,81 0,25
1 mg/kg IV *400 2 76,83 0,854 16,02 4 0,133 1172 46,2 112, 6 11,27 6
1 mg/kg IV 4003 48,22 0,706 25,34 0,492 1417 18,9 96 88,9 2 20,74 0,25
Média de grupo 4 39,31 0,826 45,2 5,22 74,22 4,15 5,6 74,22 2,17
*Recebida pelo menos parte d a SC de dose de TR 1130, e as estimativas de
parâmetro foram analisadas usando um modelo de SC
As médias de grupo foram analisadas usando o modelo pré-compilado nQ 7 WinNonlin® com amostragem esparsa e ponderação adequada
V1: Volume para o 1o (central) compartimento
CL: Folga do compartimento central ou 1o compartimento
V2: Volume para o 2o compartimento
CLD2: Folga do 2o compartimento
AUC: Área sob a curva de tempo de concentração
Alfa HL: Meia vida associada à macro constante Alfa
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Beta HL: Meia vida associada à macro constante Beta
Cmáx: Concentração máxima observada
TOLERABILIDADE DE TRI130 DE ÚNICA DOSE EM
MACACOS CINOMOLGOS [0289] Uma administração de dose única de TRI130 a macacos cinomolgos foi clinicamente bem tolerada em níveis de dose até e incluindo 1 mg/kg. Nestas doses, não houve observações clínicas relacionadas ao artigo de teste ou alterações nos pesos corporais, consumo de alimentos, química clínica ou parâmetros de coagulação.
[0290] Administração de TRI130 foi associada aos linfócitos diminuídos no sangue periférico (Figura 14). As diminuições transientes relacionadas a TRI130 em linfócitos foram observadas nos pontos de tempo pós-doses de 2 horas em todas as doses. Além disso, parece haver uma redução nas contagens de basófilos nos Grupos 2 e 3 por meio de medições hematológicas (Figura 15), com um tempo ligeiramente mais longo para retornar aos níveis de linha de base, em comparação com o controle de veículo (Grupo 1). A redução média em linfócitos e basófilos era menor em Grupo 4, e parte, devido a um animal que tinha uma resposta limitada e um animal que tinha injeção subcutânea ao invés de intravenosa evidente, portanto o Grupo 4 foi excluído dos dados médios de linfócito e basófilo mostrados nas Figuras 14 e 15. Todos os grupos dosados com TRI130 tiveram um aumento em neutrófilos em comparação com o grupo de controle de veículo (dados não mostrados). As alterações notadas com o painel hematológico voltaram principalmente para os níveis de linha de base em cerca de 1 semana após dosagem.
[0291] às alterações na química parâmetros de coagulação.
[0292]
A administração de TRI130 não foi associada clínica, incluindo CRP, ou com alterações em
As medições de citocina sérica indicaram um pico mínimo em algumas citocinas, incluindo as citocinas IL-10 e IL-2 de célula
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T e citocinas secundárias como MCP-1. Os níveis de pico de citocina detectados estavam em 2 ou 6 horas pós-dose. No total, um kit de citocina multiplex baseado em microesfera foi usado para determinar os níveis de 23 citocinas individuais, incluindo citocinas específicas a T (como IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-17, IFNy, TNFo), e citocinas que foram produzidas por meio de outros tipos de célula (como MCP-1). Exemplos de citocinas detectadas no estudo são apresentados na Tabela 15. Notavelmente, os níveis detectados na dose de 1 mg/kg eram menores que o grupo de dose intermediária e baixa, no entanto, o animal 4003, com mais parâmetros de farmacocinético de bolo IV normais tiveram respostas mais semelhantes aos outros grupos. O outro animal no Grupo 4 com uma dose subcutânea evidente (4002) teve resposta de pico atrasada para algumas citocinas, consistente com um Tmáx posterior. Em geral, os níveis de citocina retornaram para os níveis de linha de base em 96 horas após a dose. A secreção mínima de citocina não se traduziu em qualquer evento ou alterações pós-dose observáveis em peso corporal ou ingestão de alimento (conforme notado acima). A secreção de citocina é consistente com o mecanismo de ação de TRI130, que, quando a proteína-alvo (CD123) estiver presente, resultaria em alguma ativação de células T no sistema.
[0293] A administração de TRI130 por meio de injeção intravenosa (bolo lento) única foi bem tolerada em macacos cinomolgos em níveis de 0,25, 0,5 e 1 mg/kg. Com base nestes resultados, o nível de efeito adverso não observado (NOAEL) foi considerado como 1 mg/kg. A estimativa de meia vida do soro para TRI130 foi de 84 horas, com folga normal e volume de distribuição no grupo de dose elevada. As doses menores tiveram folga mais rápida e estimativas de meia vida mais curtas, sugerindo a ligação mediada por alvo de TRI130 às células-alvo em macacos cinomolgos. Estas observações serão confirmadas e estendidas até níveis de dose mais altos no estudo toxicológico de GLP de dose repetida de 28 dias em macacos cinomolgos.
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TABELA 15: MEDIÇÕES DE CITOCINA SÉRICA DE GRUPOS DE
DOSE EM TOLERABILIDADE PILOTO E PK
IL-2 (pg/ml) Número do Animal
Tempo (horas) 1001 1002 1003 2001 2002 2003 3001 3002 3003 4002** 4003 4101
-2 42,99 52,08 70,02 76,99 60,12 81,64 76,9 41,08 97,16 78,73 106,78 107,28
2* 55,76 51,55 53,32 246,18 159,64 221,29 166,71 86,29 192,19 109,13 223,75 137,68
6 82,8 60,68 58,67 190,48 117,8 178,14 115,89 74,43 136,17 107,15 157,95 164,69
24 69,55 55,59 69,55 143,35 78,45 119,31 88,21 56,5 139,8 137,23 103,91 120,8
48 50,47 58,67 62,33 91,49 54,72 99,24 74,84 41,08 102,32 89,56 88,89 120,57
96 40,83 60,84 63,64 69,51 62,99 75,07 74,84 36,36 101,84 83,33 79,99 136,56
IL-10 (pg/ml)
Tempo (horas) 1001 1002 1003 2001 2002 2003 3001 3002 3003 4002 4003 4101
-2 40,27 35,8 78,98 39,22 16,6 71,08 15,15 28,55 24,47 62,01 78,63
2 46,96 31,32 44,73 630,12 174,18 576,67 115,32 26,19 216,4 55,71 410,84 90,55
6 74,59 43,62 43,62 372,62 84,78 179,93 74,77 14,35 97,4 66,75 100,11 157,86
24 71,28 43,62 59,15 150,06 31,29 100,78 48,18 123,88 69,12 63,59 60,43
48 38,04 34,68 56,94 49,44 29,02 71,08 21,47 41,12 27,57 83,39 64,38
96 35,8 48,07 55,83 44,9 26,76 60,82 30,13 48,96 41,58 37,67 85,77
IL-1ra (pg/ml)
Tempo (horas) 1001 1002 1003 2001 2002 2003 3001 3002 3003 4002 4003 4101
-2 29,81 10,23 21,72 14,83 7,73 27,36 17,29 7,12 21,98 10,52 24,41 26,4
2 39,08 14,46 20,93 91,35 31,08 73,18 38,46 21,7 69,77 22,41 51,87 36,56
6 48,42 22,51 16,11 253,47 21,34 102,43 36,06 23,07 135,59 18,67 48,27 59,32
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24 33,55 10,66 18,14 101,05 13,27 26,61 59,08 7,7 96,11 20,97 21,69 18,1
48 15,29 10,66 20,14 15,99 21,72 21,34 8,56 2,69 21,7 11,99 21,83 20,11
96 11,09 15,29 13,21 13,27 6,1 15,21 11,13 5,08 14,51 9,63 12,14 26,11
IL-6 (pg/ml)
Tempo (horas) 1001 1002 1003 2001 2002 2003 3001 3002 3003 4002 4003 4101
-2 1,61
2 4,46 8,2 28,17 40,23 11,18 46,47 7,41 59,97 4,71 29,12 9,24
6 7,29 11,3 9,75 34,34 15,76 6,65 3,31 13,75 58,68
24 26,34 0,03 5,95 135,1 0,42 0,88
48
96 0,3
MCP-1 (pg/ml)
Tempo (horas) 1001 1002 1003 2001 2002 2003 3001 3002 3003 4002 4003 4101
-2 255,62 294,77 362,89 390,54 391,05 445,7 342,49 158,31 547,6 618,1 769,48 807,72
2 386,37 322,52 281,46 5860,97 1690,25 3737,21 1429,67 520,19 3744,09 918,3 5948,11 1144,13
6 563,16 393,99 316,14 2747,2 936,33 1720,26 669,27 491,71 1119,4 1063,89 1565,33 1972,29
24 484,46 346,71 378,37 1188,25 571,67 874,9 508,46 288,4 1126,98 1287,69 781,38 1043,59
48 285,74 398,27 379,72 518,2 435,71 634,29 358,73 211,71 672,02 789,58 706,93 1084,58
96 254,56 400,97 366,57 404,11 416,68 433,94 380,1 193,43 599,64 666,4 526,84 11 67,58
**o animal 4002 tinha uma concentração de soro de Tmáx de TRI130 a 6 h que sugeriu uma via de administração subcutânea, e indicada a um acúmulo mais lento de TRI130 no animal. Estes níveis de citocina em pico do animal foram um tanto atrasados em comparação com os outros animais.
EXEMPLO 15: EFICIÊNCIA TERAPÊUTICA DE TRI130 NUM MODELO DE CAMUNDONGO DE XENOENXERTO DISSEMINADO DE
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LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA (AML) [0294] Para examinar a eficiência terapêutica de TRI130 em camundongos com tumores disseminados estabelecidos, um modelo de roedor de leucemia mieloide aguda humana foi utilizado. As células MOLM-13 modificadas para expressar luciferase de vagalume foram usadas para permitir a quantificação de tumor por meio de imageamento bioluminescente. Para o estudo, 100000 células MOLM-13 Luc foram injetadas de modo intravenoso na veia de cauda lateral de 24 camundongos machos NSG. As células MOLM-13 Luc foram permitidas a se estabelecer nos camundongos por 4 dias antes da iniciação dos tratamentos. Os camundongos foram atribuídos nos 3 grupos de 8 camundongos cada. Um grupo não recebeu tratamentos adicionais como um controle. Os dois grupos restantes receberam 7 milhões de células T humanas com os primeiros tratamentos. Os tratamentos consistiram em controle de veículo de PBS ou TRI130 em 3 pg nos dias 4, 8 e 12. Os tratamentos foram administrados de modo intravenoso por meio da veia da cauda. Os tratamentos foram distribuídos em 0,2 ml de Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS) de Dulbecco que não contém molécula (controle de veículo) ou 3 pg de TRI130. A injeção incluiu 7 milhões de células T humanas purificadas para o tratamento do dia 4 apenas. O tratamento de TRI130 resultou numa redução significativa rápida em carga tumoral esquelética (Figura 16, Figura 17 e Tabela 16). A carga tumoral não esquelética residual expandiu os tratamentos de TRI130 a seguir. Mediante a necropsia e o fim do estudo, determinou-se que esta carga tumoral residual estava associada ao trato reprodutivo macho e observou-se que tanto no veículo quanto no grupo de TRI130 com a diferença principal entre o ser humano e a ausência de carga tumoral esquelética. O tratamento de tumores de MOLM-13 Luc disseminados estabelecidos em camundongos machos com TRI130 resultou numa redução significativa na carga tumoral, p<0,0001, em relação aos controles apenas de célula T (Tabela 16). Não houve diferença significativa entre os grupos de controle apenas de MOLM-13 Luc e de veículo.
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A distribuição de carga tumoral foi alterada pelo tratamento de TRI130 com sítios esqueléticos livres de sinal bioluminescente.
TABELA 16: COMPARAÇÃO ESTATÍSTICA DE VOLUME TUMORAL MÉDIO ATRAVÉS DO DIA 14
Análise ANOVA de Medições Repetidas de JMP com Método HSD de Tukey
Tratamento p-Valor
Veículo em função de 3 pg de TRI130 <0,0001*
Veículo em função de MOLM-13 apenas 0,5385
MOLM-13 apenas em função de 3 pg de TRI130 <0,0001*
* indica o valor p < 0,05 de diferença significativa
EXEMPLO 16: CONSTRUÇÃO DE UMA MOLÉCULA DO TIPO MGD006 ANTI-CD123 X ANTI-CD3 [0295] A fim de comparar a atividade de TRI130 para um outro formato biespecífico, um biespecífico anti-CD123 x anti-CD3 foi gerado contendo as sequências de domínio de ligação a CD123 e CD3 de MGD006 obtidas a partir do documento WO 2015/026892 (sequência de ácido nucleicos que corresponde a SEQ ID NOs: 2 e 4; sequências de aminoácidos correspondentes a SEQ ID Nos: 1 e 3) modificadas geneticamente no formato relatado em Chichili et al. Sei Transi Med. maio de 2015, 27;7(289):289ra82 com uma sequência Avidin-Flag-HIS adicionada para possibilitar a purificação. O construto do tipo MGD006 resultante é denominado como TRI168.
EXEMPLO 17: ATIVAÇÃO DE CÉLULA T HUMANA, CITOTOXICIDADE E LIBERAÇÃO DE CITOCINA EM RESPOSTA A TRI130 ETRI168 [0296] Para comparar a atividade de TRI130 e das proteínas TRI168 in vitro, as células T foram isoladas das células mononucleares de sangue periférico (PBMC) doadoras e incubadas com várias
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234/236 concentrações de TR1130 e TR1168 na presença de CD123+ células tumorais (MOLM-13).
[0297] A ativação de célula T foi avaliada após 24 horas de cultura por meio de citometria de fluxo. Após centrifugação e remoção de sobrenadante, os péletes de célula fora ressuspensos com uma mistura dos anticorpos marcados com corante a seguir em volumes de 50 pl: CD69-FITC, CD5-PE, CD8-Pacific Blue, CD4-APC, CD25-PE-Cy7, e 7AAD e incubadas por 30 min em gelo. As células foram lavadas duas vezes e ressuspensas em volumes de 120 pl imediatamente antes da aquisição de 50% de cada poço num citômetro de fluxo BD LSRII. Os arquivos de amostra foram analisados usando software FlowJo para calcular as porcentagens de células T CD4+ (CD8-) ou CD8+ que tinham CD69 e CD25 regulados para cima, ligando-se sequencialmente em dispersor direto versus lateral, 7AAD-, CD5+, células T CD4+ ou CD8+ (7AAD-, CD5+ CD4+ ou 7AAD- CD5+ CD8+, respectivamente). Os gráficos foram plotados usando GraphPad Prism 7.0. A ativação de célula T dependente de dose, semelhante induzida por TRI130 e TRI168 na presença de células-alvo CD123+ com ambos os doadores testados (Figura 18). A Figura mostra a porcentagem de células T CD4+ e CD8+ que eram positivas para CD69 e CD25. Os valores de EC50 foram determinados com TRI130 e TRI168 para ambas as populações de CD4+ e CD8+ CD25+ CD69+ que demonstram potência semelhante para ambas as moléculas. Nenhuma ativação de célula T foi observada na ausência de células-alvo CD123+ (Não mostrada).
[0298] A citotoxicidade de Molm-13 foi avaliada após 24 horas de cultura por meio de citometria de fluxo conforme descrito acima. Os arquivos de amostra foram analisados usando o software FlowJo para a citotoxicidade quantitativa ligando-se sequencialmente o dispersor direto versus lateral, células 7AAD-, CD5-. Os gráficos foram plotados usando GraphPad Prism 7.0. A citotoxicidade de Molm-13 dependente de dose, semelhante induzida por TRI130 e TRI168 com ambos os doadores testados (Figura 19). A Figura mostra o número total de células Molm-13 viáveis após 24 horas de
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235/236 cultura com células T, TR1130 e TR1168 purificadas.
[0299] Os níveis de um subconjunto de citocinas selecionado comumente produzido por células T ativadas incluindo IFNy, IL-2, TNFa e IL-10 foram medidos nos sobrenadantes de cultura de 24 horas usando ensaios de analito multiplexados. Os níveis de secreção de citocina mais elevados induzidos por TRI168 comparados a TRI130 com ambos os doadores testados na presença de células-alvo CD123+ Molm-13 (Figura 20).
[0300] As populações de célula imune normais que incluem células dendríticas plasmacitoides e basófilos que expressam altos níveis de CD123 estão presentes em amostras de PBMC e representam alvos para moléculas biespecíficas anti-CD123 x anti-CD3. Para examinar os níveis de secreção de citocina induzidas por TRI130 e TRI168 na ausência de células-alvo adicionadas de modo exógeno, as PBMC doadoras normais foram cultivadas por 24 horas com várias concentrações tanto das proteínas quanto das citocinas medidas nos sobrenadantes resultantes usando ensaios de analito multiplexado. Semelhante às culturas com células T e células MOLM-13 purificadas, os níveis mais elevados de IFNy, IL-2, TNFa e IL-10 induzidos por TRI168 são comparados a TRI130 (Figura 21).
[0301] Tomados juntos, estes resultados demonstram ativação de célula T in vitro comparável e citotoxicidade de células tumorais CD123+ adicionadas de modo exógeno com TRI130 e o biespecífico anti-CD123 x anti-CD3 do tipo MGD006. Notavelmente, TRI168 induz níveis muito mais altos de citocinas de célula T secretadas em culturas tanto de células T purificadas com células tumorais Molm-13 quanto de amostras de PBMC doadoras normais comparadas a TRI130. Na clínica, os fármacos que induzem ativação de célula T forte podem causar uma série de eventos adversos, denominados “síndrome de liberação de citocina” (CRS), devido à liberação de citocina excessiva. As citocinas liberadas causam uma resposta inflamatória sistêmica que pode levar às complicações que ameaçam a vida que podem limitar a administração de fármaco.
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EXEMPLO 18: CITOTOXICIDADE INDUZIDA POR TRI130 DE AMOSTRAS DE CÉLULA DE AML [0302] Para determinar se TRI130 é capaz de induzir a citotoxicidade em células de AML primárias, as amostras de PBMC de indivíduos com AML foram cultivadas por diversos duas com várias concentrações de TRI130. A citotoxicidade de células de AML foram avaliadas por meio de citometria de fluxo após quatro dias de cultura. Após centrifugação e remoção de sobrenadante, os péletes de célula foram ressuspensas com uma mistura que inclui os seguintes anticorpos marcados com corante em volumes de 50 pl: CD69-FITC, CD5-APC, CD19-Pacific Blue, CD25-PE-Cy7 e 7AAD, e incubadas por 30 min em gelo. As células foram lavadas duas vezes e ressuspensas em volumes de 120 pl imediatamente antes da aquisição de 50% de cada poço num citômetro de fluxo BD LSRII. Os arquivos de amostra foram analisados usando software FlowJo para a citotoxicidade quantitativa no compartimento de célula não B, não T ligando-se sequencialmente o disperser direto versus o lateral, células 7AAD-, CD5-, CD19-, CD25-. Os gráficos foram plotados usando GraphPad Prism 7.0. TRI130 induziu uma perda dependente de dose de amostras de célula de AML não B, não T em ambos os doadores testados (Figura 22). A Figura mostra o número total de células não T, não B viáveis após 96 horas de cultura. Os resultados semelhantes foram obtidos em 24 e 48 horas (dados não mostrados). Estes resultados demonstraram que TRI130 é capaz de induzir a citotoxicidade em culturas de amostras de PBMC de AML humana primária.

Claims (85)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Polipeptídeo recombinante caracterizado pelo fato de que compreende um domínio de ligação a CD123, em que o domínio de ligação a CD123 compreende (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 e (ii) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3, em que (a) a LCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:6 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:6 em pelo menos uma substituição de aminoácido;
    (b) a LCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:8 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:8 em pelo menos uma substituição de aminoácido;
    (c) a LCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NQ:10 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:10 em pelo menos uma substituição de aminoácido;
    (d) a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:12 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:12 em pelo menos uma substituição de aminoácido;
    (e) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:14 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:14 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (f) a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:16 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:16 em pelo menos uma substituição de aminoácido.
  2. 2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação a CD123 compreende:
    (a) a sequência de aminoácidos de LCDR1 conforme apresentado na SEQ ID NO:6;
    (b) a sequência de aminoácidos de LCDR2 conforme
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    2/29 apresentado na SEQ ID NO:8;
    (c) a sequência de aminoácidos de LCDR3 conforme apresentado na SEQ ID NQ:10;
    (d) a sequência de aminoácidos de HCDR1 conforme apresentado na SEQ ID NO:12;
    (e) a sequência de aminoácidos de HCDR2 conforme apresentado na SEQ ID NO:14; e (f) a sequência de aminoácidos de HCDR3 conforme apresentado na SEQ ID NO:16.
  3. 3. Polipeptídeo, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação a CD123 compreende:
    (I) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:2;e (ii) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:4.
  4. 4. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação a CD123 compreende:
    (I) a região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2; e (ii) a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4.
  5. 5. Polipeptídeo recombinante caracterizado pelo fato de que compreende um domínio de ligação a CD123, em que o domínio de ligação compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que
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    3/29 compreende LCDR1, LCDR2, LCDR3 e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3, e em que (I) (a) a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:28 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:28 em pelo menos uma substituição de aminoácido;
    (b) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:30 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:30 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (c) a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:32 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:32 em pelo menos uma substituição de aminoácido; ou (ii) (a) a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:36 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:36 em pelo menos uma substituição de aminoácido;
    (b) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:38 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:38 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (c) a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:40 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:40 em pelo menos uma substituição de aminoácido; ou (iii) (a) a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:44 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:44 em pelo menos uma substituição de aminoácido;
    (b) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:46 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:46 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (c) a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:48 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:48 em pelo menos uma substituição de aminoácido; ou (iv) (a) a HCDR1 compreende uma sequência de
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    4/29 aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NQ:100 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:100 em pelo menos uma substituição de aminoácido;
    (b) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NQ:102 ou uma sequência que difere da SEQ ID NQ:102 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (c) a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NQ:104 ou uma sequência que difere da SEQ ID NQ:104 em pelo menos uma substituição de aminoácido; ou (v) (a) a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NQ:108 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:108 em pelo menos uma substituição de aminoácido;
    (b) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NQ:110 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:110 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (c) a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:112 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:112 em pelo menos uma substituição de aminoácido; ou (vi) (a) a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:116 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:116 em pelo menos uma substituição de aminoácido;
    (b) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:118 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:118 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (c) a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NQ:120 ou uma sequência que difere da SEQ ID NQ:120 em pelo menos uma substituição de aminoácido; ou (vii) (a) a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:124 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:124 em pelo menos uma substituição de aminoácido;
    (b) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos
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    5/29 conforme apresentado na SEQ ID NO:126 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:126 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (c) a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:128 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:128 em pelo menos uma substituição de aminoácido.
  6. 6. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que (a) a LCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:22 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:22 em pelo menos uma substituição de aminoácido;
    (b) a LCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:24 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:24 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (c) a LCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:26 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:26 em pelo menos uma substituição de aminoácido.
  7. 7. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:22, a LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:24 e a LCDR3 compreende sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:26; e em que (i) (a) a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:28;
    (b) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NQ:30; e (c) a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:32; ou (ii) (a) a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:36;
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    6/29 (b) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:38; e (c) a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NQ:40; ou (ill) (a) a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:44;
    (b) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:46; e (c) a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:48; ou (iv) (a) a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NQ:100;
    (b) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NQ:102; e (c) a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NQ:104;
    ou (v) (a) a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NQ:108;
    (b) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:110; e (c) a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:112;
    ou (vi) (a) a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:116;
    (b) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:118; e (c) a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NQ:120;
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    7/29 ou (vii) (a) a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:124;
    (b) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:126; e (c) a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:128.
  8. 8. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de que (I) a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:18; e (ii) a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NQ:20, 34, 42, 98, 106, 114 ou 122.
  9. 9. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que (I) a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:18 e a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NQ:20; e (ii) a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:18 e a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:34;
    (iii) a região variável de cadeia leve de imunoglobulina
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    8/29 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:18 e a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:42;
    (iv) a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:18 e a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:98;
    (v) a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:18 e a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:106;
    (vi) a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:18 e a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:114; ou (vii) a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:18 e a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:122.
  10. 10. Polipeptídeo recombinante caracterizado pelo fato de que compreende um domínio de ligação a CD123, em que o domínio de ligação compreende (I) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 e (ii) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3, e em que (a) a LCDR1 tem uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:54 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:54 em pelo menos uma substituição de aminoácido;
    (b) a LCDR2 tem uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:56 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:56
    Petição 870190026083, de 19/03/2019, pág. 372/394
    9/29 em pelo menos uma substituição de aminoácido;
    (c) a LCDR3 tem uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:58 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:58 em pelo menos uma substituição de aminoácido;
    (d) a HCDR1 tem uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NQ:60 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:60 em pelo menos uma substituição de aminoácido;
    (e) a HCDR2 tem uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:61 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:61 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (f) a HCDR3 tem uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:62 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:62 em pelo menos uma substituição de aminoácido.
  11. 11. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que (a) a LCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:54;
    (b) a LCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:56;
    (c) a LCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:58;
    (d) a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NQ:60;
    (e) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:62; e (f) a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:64.
  12. 12. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que (I) a região variável de cadeia leve de imunoglobulina
    Petição 870190026083, de 19/03/2019, pág. 373/394
    10/29 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NQ:50; e (ii) a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:52.
  13. 13. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que (I) a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NQ:50; e (ii) a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende o aminoácido da SEQ ID NO:52.
  14. 14. Polipeptídeo recombinante caracterizado pelo fato de que compreende um domínio de ligação a CD123, em que o domínio de ligação a CD123 compreende (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 e (ii) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3, em que (a) a LCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NQ:70 ou uma sequência que difere da SEQ ID NQ:70 em pelo menos uma substituição de aminoácido;
    (b) a LCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:72 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:72 em pelo menos uma substituição de aminoácido;
    (c) a LCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:74 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:74 em pelo menos uma substituição de aminoácido;
    Petição 870190026083, de 19/03/2019, pág. 374/394
    11/29 (d) a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:76 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:76 em pelo menos uma substituição de aminoácido;
    (e) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:78 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:78 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (f) a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NQ:80 ou uma sequência que difere da SEQ ID NQ:80 em pelo menos uma substituição de aminoácido.
  15. 15. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que (a) a LCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NQ:70;
    (b) a LCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:72;
    (c) a LCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:74;
    (d) a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:76;
    (e) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:78; e (f) a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NQ:80.
  16. 16. Polipeptídeo, de acordo com as reivindicações 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação a CD123 compreende (I) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:66; e
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    12/29 (ii) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:68.
  17. 17. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que (i) a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:66; e (ii) a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:68.
  18. 18. Polipeptídeo recombinante caracterizado pelo fato de que compreende um domínio de ligação a CD123, em que o domínio de ligação a CD123 compreende (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 e (ii) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3, e em que (a) a LCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:86 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:86 em pelo menos uma substituição de aminoácido;
    (b) a LCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:88 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:88 em pelo menos uma substituição de aminoácido;
    (c) a LCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NQ:90 ou uma sequência que difere da SEQ ID NQ:90 em pelo menos uma substituição de aminoácido;
    (d) a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:92 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:92 em pelo menos uma substituição de aminoácido;
    (e) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos
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    13/29 conforme apresentado na SEQ ID NO:94 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:94 em pelo menos uma substituição de aminoácido; e (f) a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:96 ou uma sequência que difere da SEQ ID NO:96 em pelo menos uma substituição de aminoácido.
  19. 19. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que (a) a LCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:86;
    (b) a LCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:88;
    (c) a LCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NQ:90;
    (d) a HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:92;
    (e) a HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:94; e (f) a HCDR3 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:96.
  20. 20. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que (I) a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:82; e (ii) a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na
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    14/29
    SEQ ID NO:84.
  21. 21. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que (i) a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:82; e (ii) a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:84.
  22. 22. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que os polipeptídeos se ligam a CD123 humano com especificidade.
  23. 23. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação a CD123 compreende domínios pesado e leve variáveis humanos.
  24. 24. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação a CD123 é um fragmento variável de cadeia única (scFv).
  25. 25. Domínio de ligação a CD123, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada do referido scFv é amino-terminal à região variável de cadeia leve do referido scFv.
  26. 26. Domínio de ligação a CD123, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia leve do referido scFv é amino-terminal à região variável de cadeia pesada do referido scFv.
  27. 27. Domínio de ligação a CD123, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 226, caracterizado pelo fato de que o referido domínio de ligação é conjugado a um fármaco ou uma toxina.
  28. 28. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, uma região constante de imunoglobulina.
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    15/29
  29. 29. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, um segundo domínio de ligação.
  30. 30. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo compreende (I) o domínio de ligação a CD123, (li) uma região de articulação, (ill) uma região constante de imunoglobulina, (iv) um ligante de terminação carboxila e (v) o segundo domínio de ligação.
  31. 31. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo compreende, na ordem da terminação amino a carboxila, (I) o domínio de ligação a CD123, (li) a região de articulação, (ill) a região constante de imunoglobulina, (iv) o ligante de terminação carboxila e (v) o segundo domínio de ligação.
  32. 32. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo compreende, na ordem da terminação amino a carboxila, (I) o segundo domínio de ligação, (li) a região de articulação, (ill) a região constante de imunoglobulina, (iv) o ligante de terminação carboxila e (v) o domínio de ligação a CD123.
  33. 33. Polipeptídeo recombinante caracterizado pelo fato de que compreende, na ordem da terminação amino a carboxila, (I) um domínio de ligação a CD123 humano ou humanizado, (li) uma região de articulação, (ill) uma região constante de imunoglobulina, (iv) um ligante de terminação carboxila e (v) um segundo domínio de ligação humano ou humanizado que se liga especificamente a uma célula T, CD3, CD3s ou um complexo de receptor de célula T (TCR) ou um componente de um complexo de receptor de célula T.
  34. 34. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 33, caracterizado pelo fato de que (I) o domínio de ligação a CD123 compreende (a) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 e (b) uma região variável de cadeia pesada de
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    16/29 imunoglobulina que compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3; e (li) o segundo domínio de ligação compreende (a) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 e (b) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3.
  35. 35. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação a CD123 é um scFv e o segundo domínio de ligação é um scFv.
  36. 36. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 35, caracterizado pelo fato de que o ligante de terminação carboxila compreende ou consiste na SEQ ID NO:288.
  37. 37. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 36, caracterizado pelo fato de que a região constante de imunoglobulina compreende os domínios CH2 e CH3 imunoglobulina de lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, lgA2 ou IgD.
  38. 38. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a região constante de imunoglobulina compreende um domínio CH2 de lgG1 humano que compreende as substituições L234A, L235A, G237A e K322A, de acordo com o sistema de numeração EU.
  39. 39. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 38, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo não exibe ou exibe mínima atividade de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC) e/ou atividade de citotoxicidade dependente de complemento (CDC).
  40. 40. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 32, caracterizado pelo fato de que o segundo domínio de ligação se liga especificamente a uma célula T, CD3, CD3s ou um complexo de receptor de célula T (TCR) ou um componente de um complexo de receptor de célula T.
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    17/29
  41. 41. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 40, caracterizado pelo fato de que o segundo domínio de ligação compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina;
    em que a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é (a) pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos na SEQ ID NO:157; ou (b) pelo menos cerca de 94% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos na SEQ ID NO:158; e em que a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 82% idêntica, pelo menos cerca de 85% idêntica, pelo menos cerca de 87% idêntica, pelo menos cerca de 90% idêntica, pelo menos cerca de 92% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos na SEQ ID NO:159.
  42. 42. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o segundo domínio de ligação compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina;
    em que a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:157 ou da SEQ ID NO:158; e em que a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:159.
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  43. 43. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 40, caracterizado pelo fato de que o segundo domínio de ligação compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina;
    em que a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos na SEQ ID NO:160;
    e em que a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 82% idêntica, pelo menos cerca de 85% idêntica, pelo menos cerca de 87% idêntica, pelo menos cerca de 90% idêntica, pelo menos cerca de 92% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos na SEQ ID NO:161.
  44. 44. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o segundo domínio de ligação compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina;
    em que a região variável de cadeia leve de imunoglobulina compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:160; e em que a região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:161.
  45. 45. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 44, caracterizado pelo fato de que o segundo domínio de ligação compreende: (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 e (ii) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3, em
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    19/29 que a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 compreendem as sequências de aminoácidos apresentadas na SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:163 e SEQ ID NO:164, respectivamente, e a HCDR1, a HCDR2 e a HCDR3 compreendem as sequências de aminoácidos apresentadas na SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO:166 e SEQ ID NO:167, respectivamente.
  46. 46. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 40, caracterizado pelo fato de que o segundo domínio de ligação compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina derivada de um anticorpo monoclonal selecionado dentre CRIS-7, HuM291 e I2C.
  47. 47. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o segundo domínio de ligação é derivado de CRIS-7 e compreende: (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 e (ii) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3, em que (a) a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 têm as sequências de aminoácidos apresentadas na SEQ ID NO:168, SEQ ID NO:169 e SEQ ID NQ:170, respectivamente, e a HCDR1, a HCDR2 e a HCDR3 têm as sequências de aminoácidos apresentadas na SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO:172 e SEQ ID NO:173, respectivamente; ou (b) a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 têm as sequências de aminoácidos apresentadas na SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:163 e SEQ ID NO:164, respectivamente, e a HCDR1, a HCDR2 e a HCDR3 têm as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO:166 eSEQ ID NO:167, respectivamente.
  48. 48. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o segundo domínio de ligação é derivado de I2C e compreende: (i) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que
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    20/29 compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 e (ii) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3, em que (a) a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 têm as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 171, 172 e 173, respectivamente, e a HCDR1, a HCDR2 e a HCDR3 têm as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 174, 175 e 176, respectivamente; ou (b) a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 têm as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 176, 177 e 178, respectivamente, e a HCDR1, a HCDR2 e a HCDR3 têm as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 179, 180 e 181, respectivamente.
  49. 49. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o segundo domínio de ligação é derivado de HuM291 e compreende: (I) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende LCDR1, LCDR2 e LCDR3 e (ii) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3, em que (a) a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 têm as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 182, 183 e 184, respectivamente, e a HCDR1, a HCDR2 e a HCDR3 têm as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 185, 186 e 187, respectivamente; ou (b) a LCDR1, a LCDR2 e a LCDR3 têm as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 188, 189 e 190, respectivamente, e a HCDR1, a HCDR2 e a HCDR3 têm as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 191, 192 e 193, respectivamente.
  50. 50. Polipeptídeo caracterizado pelo fato de que compreende um domínio de ligação a CD123 e um domínio de ligação a CD3, em que (I) o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95%
    Petição 870190026083, de 19/03/2019, pág. 384/394
    21/29 idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NQ:130;
    (ii) o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:132;
    (iii) o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:134;
    (iv) o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:136;
    (ν) o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:138;
    (vi) o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NQ:140;
    (vii) o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95%
    Petição 870190026083, de 19/03/2019, pág. 385/394
    22/29 idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:142;
    (viii) o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:144;
    (ix) o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:146;
    (x) o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:148;
    (xi) o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:150;
    (xii) o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:152;
    (xiii) o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95%
    Petição 870190026083, de 19/03/2019, pág. 386/394
    23/29 idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:154; ou (xiv) o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 93% idêntica, pelo menos cerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica, pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:156.
  51. 51. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que (I) o polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NQ:130;
    (ii) o polipeptídeo compreende a sequênciade aminoácidos da SEQ ID NO:132;
    (iii) o polipeptídeo compreende a sequênciade aminoácidos da SEQ ID NO:134;
    (iv) o polipeptídeo compreende a sequênciade aminoácidos da SEQ ID NO:136;
    (v) o polipeptídeo compreende a sequênciade aminoácidos da SEQ ID NO:138;
    (vi) o polipeptídeo compreende a sequênciade aminoácidos da SEQ ID NQ:140;
    (vii) o polipeptídeo compreende a sequênciade aminoácidos da SEQ ID NO:142;
    (viii) o polipeptídeo compreende a sequênciade aminoácidos da SEQ ID NO:144;
    (ix) o polipeptídeo compreende a sequênciade aminoácidos da SEQ ID NO:146;
    (x) o polipeptídeo compreende a sequênciade aminoácidos da SEQ ID NO:148;
    Petição 870190026083, de 19/03/2019, pág. 387/394
    24/29
    (xi) o polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NQ:150; (xii) o polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:152; (xiii) o polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:154; ou (xiv) o polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:156. 52. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das
    reivindicações 29 a 51, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo induz citotoxicidade de célula T redirecionada (RTCC).
  52. 53. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 52, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo induz RTCC com um EC5o de cerca de 30 pM ou mais baixo.
  53. 54. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 53, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo de ligação a CD123 induz ativação de células T ou proliferação de células T.
  54. 55. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 54, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo induz lise dependente de células T de células que expressam CD123.
  55. 56. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 55, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo, quando ligado a uma proteína CD3 numa célula T, induz liberação de citocina reduzida a partir da referida célula T em comparação com um controle de anticorpo OKT3.
  56. 57. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 40 e 46, caracterizado pelo fato de que o segundo domínio de ligação compete pela ligação a CD3s com um anticorpo monoclonal selecionado dentre CRIS-7, HuM291 e I2C.
  57. 58. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das
    Petição 870190026083, de 19/03/2019, pág. 388/394
    25/29 reivindicações 29 a 58, caracterizado pelo fato de que o segundo domínio de ligação é um fragmento variável de cadeia única (scFv).
  58. 59. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 59, caracterizado pelo fato de que o segundo domínio de ligação é um domínio de ligação humanizado ou humano.
  59. 60. Polipeptídeo caracterizado pelo fato de que compreende, na ordem da terminação amino à terminação carboxila, (I) um domínio de ligação a CD123, (ii) uma região de articulação, (ill) uma região constante de imunoglobulina, (iv) um ligante de terminação carboxila e (v) um segundo domínio de ligação, em que o referido domínio de ligação a CD123 compreende uma sequência de aminoácidos conforme apresentado na SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:114ou SEQ ID NO:122.
  60. 61. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 60, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação a CD123 é um scFv que compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina; e em que a referida região variável de cadeia leve e a referida região variável de cadeia pesada são unidas por uma sequência de aminoácidos que compreende (Gly4Ser)n, em que n=1 a 5 (SEQ ID NO:214).
  61. 62. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 61, caracterizado pelo fato de que o segundo domínio de ligação é um scFv que compreende uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina e uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina; e em que a referida região variável de cadeia leve e a referida região variável de cadeia pesada são unidas por uma sequência de aminoácidos que compreende (Gly4Ser)n, em que n=1 a 5 (SEQ ID NO:214).
  62. 63. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 62, caracterizado pelo fato de que o ligante de terminação
    Petição 870190026083, de 19/03/2019, pág. 389/394
    26/29 carboxila compreende uma sequência de aminoácidos que compreende (Gly4Ser)n, em que n=1 a 7 (SEQ ID NO:314).
  63. 64. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que n=3 a 5.
  64. 65. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 64, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação a CD123 não é derivado de anticorpo murino 12F1.
  65. 66. Dímero caracterizado pelo fato de que compreende dois polipeptídeos idênticos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 65.
  66. 67. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 65, ou o dímero, de acordo com a reivindicação 66, e um carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
  67. 68. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 68, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica exibe uma meia-vida mais longa quando administrada a um indivíduo do que um polipeptídeo de scFv anti-CD123 x scFv anti-CD3 contendo scFvs idênticos.
  68. 69. Molécula de ácido nucleico isolada caracterizada pelo fato de que codifica o polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 65.
  69. 70. Molécula de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 69, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:97, SEQ ID NQ:105, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:147, SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:153
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    27/29 ou SEQ ID NO:155.
  70. 71. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de que compreende um segmento de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 65, em que o segmento de ácido nucleico está ligado de modo operacional a sequências reguladoras adequadas para expressão do segmento de ácido nucleico numa célula hospedeira.
  71. 72. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação
    71, caracterizado pelo fato de que o segmento de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:97, SEQ ID NQ:105, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:147, SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:151, SEQ ID NO:153 ou SEQ ID NO:155.
  72. 73. Célula hospedeira recombinante caracterizada pelo fato de que compreende o vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 71 ou 72.
  73. 74. Método para produzir um polipeptídeo de ligação a CD123, em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma célula hospedeira recombinante que compreende o vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 71 ou 72, sob condições em que o segmento de ácido nucleico seja expresso, produzindo, assim, o polipeptídeo de ligação a CD123.
  74. 75. Método, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira recombinante é uma linhagem de células hospedeiras CHO, HEK293 ou COS.
  75. 76. Método, de acordo com a reivindicação 74 ou 75,
    Petição 870190026083, de 19/03/2019, pág. 391/394
    28/29 caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, recuperar o polipeptídeo de ligação a CD123.
  76. 77. Método para induzir citotoxicidade de células T redirecionada (RTCC) contra uma célula que expressa CD123, em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende: colocar a referida célula que expressa CD123 em contato com o polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 65, em que o segundo domínio de ligação se liga especificamente a uma célula T, CD3, CD3s ou um complexo de receptor de célula T (TCR) ou um componente de um complexo de receptor de célula T; e em que o referido contato é sob condições em que RTCC contra a célula que expressa CD123 seja induzida.
  77. 78. Método para induzir lise dependente de células T de uma célula que expressa CD123, em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende: colocar a referida célula que expressa CD123 em contato com o polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 65, em que o segundo domínio de ligação se liga especificamente a uma célula T, CD3, CD3s ou um complexo de receptor de célula T (TCR) ou um componente de um complexo de receptor de célula T; e em que o referido contato é sob condições em que lise dependente de células T da célula que expressa CD123 seja induzida.
  78. 79. Método para tratar um distúrbio num indivíduo, em que o referido distúrbio é caracterizado pelo fato de que ocorre pela superexpressão de CD123, em que o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 65, ou do dímero, de acordo com a reivindicação 66.
  79. 80. Método, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é um câncer.
  80. 81. Método, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que o câncer é leucemia mieloide aguda (AML),
    Petição 870190026083, de 19/03/2019, pág. 392/394
    29/29 leucemia linfoide B, neoplasma dendrítico plasmocitoide blástico (BPDCN), leucemia de células pilosas, leucemia linfoblástica aguda, anemia refratária com blastos em excesso, síndrome mielodisplásica, leucemia mieloide crônica ou linfoma de Hodgkin.
  81. 82. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 65, ou o dímero, de acordo com a reivindicação 66, para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio num indivíduo, em que o referido distúrbio é caracterizado pelo fato de que ocorre pela superexpressão de CD123.
  82. 83. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 65, ou o dímero, de acordo com a reivindicação 66, para uso no tratamento de um distúrbio num indivíduo, em que o referido distúrbio é caracterizado pelo fato de que ocorre pela superexpressão de CD123.
  83. 84. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 82 ou 83, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é um câncer.
  84. 85. Polipeptídeo de ligação a CD123, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que o câncer é leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoide B, neoplasma dendrítico plasmocitoide blástico (BPDCN), leucemia de células pilosas, leucemia linfoblástica aguda, anemia refratária com blastos em excesso, síndrome mielodisplásica, leucemia mieloide crônica ou linfoma de Hodgkin.
  85. 86. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 65, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo se liga a CD123 de primata não humano com especificidade.
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