CN1891716B - 一种无丝裂原活性抗cd3小分子抗体的设计方法 - Google Patents
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Abstract
本发涉及一种构建无丝裂原性抗人CD3小分子抗体的设计方法和用途。本发明通过缺失抗体结构中包含Fc受体结合位点的CH1、CH2区域，构建成小分子(minibody)结构的抗CD3抗体。获得的抗体可以与人T淋巴细胞表面的CD3抗原特异性结合并能诱导产生免疫抑制功能，同时没有明显的促丝裂原活性。本发明的抗体可用于器官移植中急性排斥反应的预防和治疗；和I型糖尿病、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症等自身免疫性疾病的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一种构建无丝裂原活性的抗CD3抗体的设计方法。通过缺失抗体结构中包含Fc受体结合位点的CH1、CH2区域，构建成小分子(minibody)结构的抗CD3抗体。获得的抗体可以与T细胞表面的CD3抗原特异性结合并能诱导产生免疫抑制功能，同时没有明显的促丝裂原活性。
背景技术
1986年，美国FDA批准鼠源抗CD3单抗OKT3进入市场，用于器官移植时的抗排异反应，也是到目前为止唯一被批准上市的靶向CD3抗体。国外已广泛用于肾移植，也可用于肝、心脏、胰、骨髓等多种器官移植中，在防治急性排斥反应的发生中效果显著。近年来的研究发现，抗CD3抗体在治疗T细胞介导的自身免疫病方面也有良好的应用前景。(1)但是由于抗CD3抗体的免疫原性和丝裂原性，抗CD3单克隆抗体(anti-CD3 McAb)临床应用过程中会产生严重的毒副作用，其一是由于抗体的免疫原性引起产生人抗小鼠抗体(HAMA)，使得抗体的再次使用受到限制；其二是由抗体丝裂原活性引起的细胞因子释放综合症，以TNF、IFN-γ、IL-6等炎性细胞因子为主。主要表现为发热(73％)、寒战(57％)、震颤(10％)、胸痛和胸闷(14％)、呼吸困难(21％)、恶心呕吐(13％)、腹泻(20％)、瘙痒以及血压变化等相关症状，常在首次注射后45～60分钟出现，持续数小时。其中严重者会发生肺水肿(＜5％)，个别严重者会导致死亡。(2，3)
一直以来，抗CD3抗体引发毒性的机理一直是研究的热点。研究提示，抗CD3抗体与细胞表面Fc受体(FcRs)的相互作用是导致抗CD3抗体毒性的重要原因。(4，5，6)研究证实，去除抗体中含Fc受体结合位点的Fc段后得到的Fab/F(ab)2结构的抗CD3抗体在体内保持诱导免疫抑制活性的同时，毒副作用大大降低。(7)鼠IgA不与人IgA受体(CD89)相互作用，因此，鼠源IgA型的抗人CD3抗体T3/4.A无丝裂原活性，而在肾移植排斥治疗中，疗效与OKT3相似。(8)晶体结构显示，抗体与Fc受体结合的主要位点为位于抗体CH2 Domain的234、235、237位氨基酸，同时受297位氨基酸(Asn)糖基化水平的影响。通过基因工程技术，针对这些位点进行定点突变，获得了一系列无丝裂原活性的抗体：在234和235位进行点突变(将缬氨酸Val突变为丙氨酸Ala)的人源化IgG1型抗体hOKT3γ(Ala-Ala)；在234和237位进行点突变(将缬氨酸Val突变为丙氨酸Ala)的人源化IgG2型抗体HuM291；在297位进行点突变(将天冬酰胺Asn突变为丙氨酸Ala)，通过降低其糖基化水平导致Fc受体结合活性丧失的IgG1型抗体YTH12.5(又名ChAglyCD3)等均已经进入临床试验，疗效显著，同时没有检测到明显的细胞因子释放，毒副作用显著降低。(9，10，11)
1993年，Quiocho FA等构建了小分子抗体(minibody)，在减小抗体分子量的同时，保持了抗体的天然双价结构。(12)缺失抗体中含有Fc受体结合位点的CH1 domain和CH2 domain构建Minibody结构小分子抗体的方法，为设计新型的无丝裂原活性抗CD3抗体提供了新的思路。
近年来，本实验室在抗CD3抗体方面做了一系列的工作，获得了抗人CD3的鼠单抗(命名为YCD3)。经过生物学实验证明，该单抗能识别人外周血单个核细胞(PBMC)表面CD3抗原分子以及Jurkat、HPB-All等T淋巴瘤细胞系表面的CD3抗原分子；同时体外实验证明该抗体具有一定的免疫抑制功能。本发明尝试通过计算机辅助设计微型抗体minibody，缺失含Fc受体结合位点的CH1和CH2功能域，设计新型无丝裂原活性的抗CD3抗体。
发明内容
本发明提出采用缺失抗体结构中包含Fc受体结合位点的CH1、CH2区域，构建成minibody结构的新型无丝裂原活性的抗CD3抗体。构建的新型抗体可以与T细胞上的CD3抗原特异性结合并诱导产生免疫抑制功能，同时没有明显的促丝裂原活性。该抗体可以用于治疗需要免疫抑制功能的疾病，并且治疗时比原先的CD3抗体毒副作用更小，具有良好的应用前景。
基于上述思路，本发明将本实验室保存的YCD3单抗的可变区基因通过Linker拼接成单链抗体(scFv)，进而与人IgG1的CH3 domain通过改进的人IgG绞链区(m-hinge)相连，形成minibody单体结构(scFv-mhinge-CH3)，通过绞链区的二硫键形成二聚体结构，构建成无丝裂原活性的minibody结构的抗CD3抗体。
附图说明
图1抗CD3抗体重链计算机模拟结构
图2抗CD3抗体轻链计算机模拟结构
图3抗CD3抗体scFv结构
图4minibody结构的抗CD3抗体的单体结构
图5minibody结构的抗CD3抗体的二聚体结构
图6minibody结构的抗CD3抗体基因结构、构建图
图7minibody结构的抗CD3抗体克隆载体的酶切鉴定
图8minibody结构的抗CD3抗体基因测序图
图9minibody结构的抗CD3抗体Western-Blot鉴定
图10FACS检测minibody结构的抗CD3抗体识别PBMC表面CD3抗原分子
图11minibody结构的抗CD3抗体刺激PBMC实验结果
图12minibody结构的抗CD3抗体混合淋巴细胞实验(MLC)结果
图13ELISPOT检测minibody结构的抗CD3抗体刺激PBMC后IFN-γ的释放
图14ELISPOT检测minibody结构的抗CD3抗体刺激PBMC后IL-2的释放
具体实施方式
以下具体说明以本室保存的YCD3抗体基因为基础构建无丝裂原活性的minibody结构的抗CD3抗体的过程，同时通过生物学实验验证了该新型抗体的活性。必须指出，本方法不仅仅局限于本室保存的YCD3抗体基因，其他CD3抗体基因以及希望去除丝裂原活性的其他抗体基因均可以应用本方法制备出无丝裂原活性的新型抗体。
Mini-CD3的设计和功能鉴定
根据YCD3抗体的可变区基因以及CD3抗原分子ε链的晶体结构，利用Octane2图形工作站对抗体的可变区结构进行模拟，通过结合自由能、识别功能域(Domain)、参与作用的区域以及形成的分子间氢键等的判别，对构建mini-CD3抗体所需要的Linker以及Hinge进行了选择和优化，设计出新型的无丝裂原活性的minibody结构的抗CD3(mini-CD3)抗体。利用PCR方法合成编码mini-CD3抗体的DNA，酶切鉴定和测序后插入到表达载体PCMV163中，在CHO细胞中表达得到mini-CD3抗体。利用FACS、刺激PBMC、MLC以及ELISPOT等实验验证了该抗体的生物学活性。
上述过程分以下几步：
(1)计算机辅助分析，设计mini-CD3，对Linker和Hinge进行了选择和优化
(2)PCR合成编码mini-CD3抗体的DNA
(3)构建mini-CD3抗体的表达载体
(4)mini-CD3抗体在CHO细胞中的表达
(5)FACS鉴定mini-CD3对PBMC表面CD3抗原分子的特异性识别
(6)3H掺入法测定mini-CD3抗体在体外对PBMC的刺激活性
(7)3H掺入法测定mini-CD3抗体在体外对MLC的抑制活性
(8)ELISPOT测定mini-CD3抗体体外刺激PBMC引起的细胞因子释放
1.1 材料
含有YCD3抗体可变区基因的载体T-VH-YCD3、T-VK-YCD3
含有人IgG1 Fc段基因的载体T-Fc-IgG1
表达载体PCMV163
各种内切酶均购自NEB公司
高保真Taq酶pyrobest购自Takala公司
PCR产物凝胶回收试剂盒购自Omega公司
辣根过氧化物酶标记的羊抗人Fc抗体(HRP-GAH-Fc)
FITC-GAH-Fc
标准CD3抗体购自B&D公司
3H-TdR购自北京原子能研究所
ELISPOT试剂盒购自UCYTECH公司
InsightII2000程序包(MSI)
1.2 方法
1.2.1 计算机辅助分析
通过Kabat分析确定YCD3抗体可变区基因编码蛋白序列的FR、CDR区。利用http://www.expasy.ch提供的同源模建方法分别构建YCD3抗体轻、重链可变区空间构象。利用柔韧性连接肽G4S经分子对接将YCD3的轻、重链进行连接构建YCD3的scFv空间结构。
利用距离几何学、计算机图形学技术考察轻链C-端的残基走向、柔韧性程度，合理改造人IgG1绞链区，获得新的连接肽。通过改造的绞链区(m-hinge)将scFv与人IgG1的CH3连接，构建mini-CD3抗体。通过同源模建、分子对接方法搭建mini-CD3抗体，借助结合自由能、距离几何对其进行理论评价。
1.2.2 PCR合成编码mini-CD3抗体的DNA
根据mini-CD3抗体的基因结构，利用Biosun软件设计出相应的引物P1～P8(如下)，由博润生物技术公司合成，用去离子水将引物稀释为5×10-5mol/L。
P1：cccaagcttgccgccaccatggattgggtgtggaccttg Hind III
P2：cgacccgccaccgccagagccacctccgcctgaaccgcctccacctgaggagactgtga
P3：ggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcgggtcgcaaattgttctcac
P4：ccgctcgaggtttatttccaactt Xho I
P5：ccgctcgagcccaaatcttgtgacaaaactcatacatgcccaccgtgc Xho I
P6：acatgcccaccgtgcggcggtggatcatctggaggcggatctggc
P7：ggcggtggatcatctggaggcggatctggcggccagccccgagaa
P8：gctctagattatttacccggagacagggag Xba I
(1)Over-lap PCR方法合成mini-CD3抗体基因scFv部分
利用引物P1&P2，以T-VH-YCD3为模板，利用高保真酶pyrobest扩增出YCD3抗体的重链可变区基因，PCR反应条件：94℃变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环；72℃延伸10min，然后降至4℃。扩增产物取3μL用1％的琼脂糖电泳检测，利用Omega公司的PCR产物凝胶回收试剂盒回收目的片段VH-YCD3，1％的琼脂糖电泳检测定量。
利用引物P3&P4，以T-VK-YCD3为模板，利用高保真酶pyrobest扩增出YCD3抗体的轻链可变区基因，PCR反应条件：94℃变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环；72℃延伸10min，然后降至4℃。扩增产物取3μL用1％的琼脂糖电泳检测，利用Omega公司的PCR产物凝胶回收试剂盒回收目的片段VK-YCD3，1％的琼脂糖电泳检测定量。
分别取目的片段VH-YCD3、VK-YCD3各10ng，加入dNTP、PCR-buffer、pyrobest酶，用去离子水稀释至50μL混悬液，按如下反应条件在PCR仪上反应：94℃变性4min；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，7个循环；72℃延伸10min，然后降至4℃。反应结束后，在原PCR管中补加引物P1&P4，按如下反应条件PCR扩增：94℃变性4min；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，25个循环；72℃延伸10min，然后降至4℃。扩增产物取3μL用1％的琼脂糖电泳检测，利用Omega公司的PCR产物凝胶回收试剂盒回收目的片段scFv-YCD3。
(2)将scFv-YCD3定向克隆入pcDNA3.1(+)载体中
载体以及目的片段的酶切：取载体pcDNA3.1(+)和目的片段scFv-YCD3各2μg，按如下酶切体系37℃酶切2h，用Omega公司的PCR产物凝胶回收试剂盒回收目的片段。
按克分子数比例1∶10取经过酶切的载体和目的片段，按如下条件进行连接反应，16℃连接过夜：
连接产物转化JM109感受态：取10μL连接产物加入100～150μL感受态细胞中，混匀，冰浴30min。放入42℃水浴热休克90s，迅速转入冰浴，2min后加入预热的800μL无抗性的LB培养基，37℃恒温水浴培养1h。取100μL转化菌涂布于含有抗生素的LB半固体培养皿中；待表面液体晾干后，将平板倒置，37℃孵箱培养过夜(12-18h)。平板上长出直径3-5毫米的菌落。挑取单克隆，用菌落PCR方法初筛阳性克隆，用酶切方法鉴定。将得到的阳性克隆命名为pcDNA-scFv(YCD3)。
(3)逐步延伸PCR法扩增mhinge-CH3基因
以T-Fc-IgG1为模板，引物P7&P8，按如下条件扩增片段1：94℃变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环；72℃延伸10min，然后降至4℃。扩增产物取3μL用1％的琼脂糖电泳检测，利用Omega公司的PCR产物凝胶回收试剂盒回收片段1。以片段1为模板，引物P6&P8，扩增得到片段2；以片段2为模板，引物P5&P8，扩增得到目的片段mhinge-CH3基因。利用内切酶Xho I和Xba I将mhinge-CH3基因定向克隆入pcDNA-scFv(YCD3)，得到含有mini-CD3基因的载体pcDNA-mini-CD3。交由诺赛生物技术公司测序。
1.2.3 将mini-CD3抗体基因克隆入表达载体
利用抗体重链前端内切酶位点Pvu II(核苷酸序列为CTGCAG，编码氨基酸为GlnLeu)和全长基因末尾的Xba I内切酶位点，将mini-CD3抗体基因定向克隆入表达载体PCMV163中。
1.2.4 Mini-CD3抗体在CHO中稳定表达及鉴定
(1)Mini-CD3抗体在CHO中稳定表达
(2)Mini-CD3抗体Western-blot鉴定
10％SDS-PAGE电泳，40v转印2小时，5％脱脂奶粉4℃封闭过夜。PBST(0.1％Tween20，10mmol/L PBS，pH7.4)洗涤三遍，加入HRP-GAH-Fc作为二抗(1∶500)，37℃1小时，PBST洗涤三遍，用ECL显色。
1.2.5 Mini-CD3抗体体外功能鉴定
(1)FACS鉴定
PBMC分离：取正常人外周血，用肝素钠抗凝，生理盐水2倍稀释后小心加入等体积的淋巴细胞分离液(ρ＝1.077g/mL)，2000rpm离心20min，取中间单个核细胞层，生理盐水洗两遍，用含100mL/L FCS的RPMI1640制备成浓度为1×106/mL的单个核细胞悬液备用。
FACS样品制备：正常人外周血单个核细胞(PBMC)，用含20mL/L FCS，0.2g/L叠氮钠的10mmol/L PBS洗3次，加入mini-CD3(10μg/mL)，以标准抗CD3抗体(B&D公司)为阳性对照，以PBS为阴性对照，冰浴振荡30min，6000rpm离心30s收细胞，将细胞洗三遍；加入FITC-GAH，冰浴振荡20min，用FACS Calibur流式细胞仪检测mini-CD3的反应性。
(2)3H掺入法测定
刺激活性实验
取PBMC悬液，按每孔100μL(1×105个细胞)接种于96孔板中。按终浓度为1μg/mL、0.2μg/mL、0.04μg/mL、0.008μg/mL、0.0016μg/mL分别加入抗体mini-CD3以及YCD3单抗，以PBC为阴性对照。37℃、5％CO2孵箱培养72h。在培养结束前16h，按每孔0.5μCi掺入3H-TdR。培养结束后，测定CPM值。
混合淋巴细胞培养实验
取两人份的PBMC，分别用含10％人AB血清的RPMI1640调整至1×106/mL的单细胞悬液。分别取两人份的PBMC各100μL(即1×105个细胞)，接种于圆底96孔板中，进行双向混合淋巴细胞培养；同时加入不同浓度的mini-CD3抗体(2μg/mL、0.4μg/mL、0.08μg/mL、0.016μg/mL、0.0032μg/mL)，同时设相同浓度的YCD3抗体对照组。37℃、5％CO2孵箱培养5d。在培养结束前16h，按每孔0.5μCi掺入3H-TdR。培养结束后，测定CPM值。实验中用含10％人AB血清的RPMI1640作为阴性对照。按如下公式计算抑制率。
(3)ELISPOT
取PBMC悬液调整至1×105/mL，按每孔100μL(1×104个细胞)接种于96孔板中(试剂盒中自带)。按ELISPOT试剂盒说明书中实验步骤操作，测定不同浓度(1μg/mL、100ng/mL、10ng/mL)mini-CD3抗体以及YCD3刺激PBMC引起的IFN-gamma、IL-2等细胞因子的分泌。以10μg的PHA做为阳性对照、含10％FBS的RPMI1640作阴性对照。
1.3 结果
1.3.1 新型Mini-CD3抗体的合理设计
以Kabat数据库提供的抗体可变区基因FR、CDR分类方法，抗体YCD3轻链可变区基因及相应的氨基酸序列如下：
其中下划线部分依次为信号肽、CDR1、CDR2和CDR3。
抗体YCD3重链可变区基因及相应的氨基酸序列如下：
其中下划线部分依次为信号肽、CDR1、CDR2和CDR3。
以蛋白质结构数据库PDB中已知结构抗体重、轻链为模板，理论构建YCD3重、轻链基因的空间结构(分别见图1、图2)。
借助通用连接肽G4S：
将抗体YCD3重、轻链进行连接构建scFv单链抗体，通过同源模建构建scFv初始空间构象。依次选择CVFF、AMBER力场，经最陡下降(优化步骤8000步，收敛判据
)、共轭梯度(优化步骤20000步，收敛判据
)对scFv空间构象进行最小化处理。图3给出了经同源模建、力学优化获得的稳定YCD3的scFv空间结构。
利用计算机图形学技术、距离几何学对抗体YCD3的scFv C-端构象进行分析，合理设计柔韧性强、不影响整体构象、改造的人IgG绞链区作为连接肽：
将scFv与人IgG1的CH3(序列如下)连接，
设计mini-CD3抗体。Mini-CD3抗体全序列如下：
下划线部分依次为重链可变区基因信号肽及CDR1、CDR2、CDR3，Linker，轻链可变区基因CDR1、CDR2、CDR3，铰链区。利用同源模建原理从理论上搭建mini-CD3抗体空间构象(图4)，在CVFF、AMBER力场下，选择最陡下降(优化步骤8000步，收敛判据
)、共轭梯度(优化步骤20000步，收敛判据)对获得的构象进行优化。图5给出了常温稳定的mini-CD3抗体理论结构。
利用距离几何学、计算机图形学技术，结合图5，从理论上评判了二硫键形成条件。结果显示，m-hinge、CH3区的Cys侧链暴露在同向外侧；同时，相对于其它残基侧链，巯基未与之形成分子内氢键，具备形成二硫键的可能。
1.3.2 Mini-CD3抗体全基因合成
根据抗体的基因结构以及我们设计的抗体全基因构建方法(见图6)合成mini-CD3抗体全基因：
分别以T-VH-YCD3、T-VK-YCD3为模板，以P1&P2、P3&P4为引物PCR扩增目的基因VH-YCD3、VK-YCD3，大小分别为480bp(含酶切位点、信号肽、重链可变区及Linker)和372bp(含Linker、轻链可变区及酶切位点)(图7A、B)，与预期一致。
以VH-YCD3、VK-YCD3为模板，P1&P4为引物，采用overlap-PCR的方法扩增出大小为807bp(含5’端酶切位点、重链信号肽、重链可变区、Linker、轻链可变区及3’端酶切位点)的scFv-YCD3基因(图7C)。将scFv-YCD3基因定向克隆到载体pcDNA3.1(+)中，经菌落PCR鉴定以及酶切鉴定得到了阳性克隆pcDNA-scFv(YCD3)。
分别以P7&P8、P6&P8、P5&P8为引物，通过三轮延伸PCR，最后扩增得到大小为404bp(含5’端酶切位点、铰链区mhinge、人IgG1-CH3以及3’端酶切位点)的mhinge-CH3基因(图7D)，与预期相符。定向克隆到载体pcDNA-scFv(YCD3)中，得到含mini-CD3基因的载体pcDNA-mini-CD3，酶切鉴定正确(图7E)。交由公司测序(图8)，序列比对如下，核苷酸序列及氨基酸序列全部正确：
核苷酸序列比对：
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氨基酸序列比对：
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GQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSAY
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YDYDGFAYWGQGTTLTV QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSAS
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SSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYY
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CQQWSSNPPTFGSGTKLEINLEPKSCDKTHTCPPC QPREPQVYTLPPSR
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DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKS
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RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Sbjct：361 RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 392
1.3.3 Mini-CD3抗体表达载体构建
利用抗体重链前端内切酶位点Pvu II(核苷酸序列为CTGCAG，编码氨基酸为GlnLeu)和全长基因末尾的Xba I内切酶位点，将mini-CD3抗体基因定向克隆入表达载体PCMV163中，得到表达载体PCMV163-miniCD3。
1.3.4 Mini-CD3抗体稳定表达及鉴定
将表达载体稳定转染CHO细胞后，加压筛选，得到了稳定表达株。Western-blot鉴定，还原条件下为40kD(图9)。结果显示，抗体在细胞内经表达加工，最后形成双价的二聚体结构，与计算机辅助分析预测的结果一致。
1.3.5 Mini-CD3抗体功能鉴定
(1)mini-CD3对PBMC表面CD3抗原分子的特异性识别
间接免疫荧光法证明，mini-CD3与外周血单个核细胞反应的阳性率与标准CD3抗体的细胞反应谱基本相符(图10)，结果表明，制备的mini-CD3可特异性识别CD3抗原分子。
(2)mini-CD3抗体在体外对PBMC的刺激活性
实验结果(图11)显示，YCD3抗体对PBMC具有很强的刺激活性，当抗体在很低浓度时(1.6ng/mL)，即表现出刺激活性(增殖倍数为3左右)，而且刺激活性随抗体浓度的升高而增强；而经过改构的新型无丝裂原活性的mini-CD3抗体则未见明显的刺激活性，当抗体浓度达到1μg/mL时，仍没有刺激活性。
(3)mini-CD3抗体在体外对MLC的抑制活性
双向混合淋巴细胞培养实验结果显示(图12)，改构后的新型无丝裂原活性的mini-CD3抗体具有较好的抑制活性，且抑制作用随抗体浓度升高而增强。
(4)mini-CD3抗体刺激PBMC引起的细胞因子释放
ELISPOT结果(图13、14)分别显示，YCD3单抗刺激后，PBMC分泌了大量的IFN-γ、IL-2细胞因子；而改构后的新型无丝裂原活性的mini-CD3抗体刺激后则未见明显的细胞因子释放。
结合FACS实验、刺激实验以及MLC实验分析，改构后的抗体在保持良好的识别抗原活性和免疫抑制活性的同时，丧失了对PBMC的刺激活性以及刺激PBMC后引起细胞因子释放的活性。提示，该新型的mini-CD3抗体在保持良好的免疫抑制活性的同时，无丝裂原活性。
参考文献
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Claims (4)
1.一种无丝裂原活性的抗CD3抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示.
2.权利要求1所述抗体，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：2，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：4。
3.权利要求1所述抗体，其绞链区氨基酸序列为SEQ ID NO：8。
4.权利要求1所述抗体在制备急性排斥反应防治药物及T细胞介导的自身免疫病防治药物中的应用。
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