CN102727888B - 一种抗人t淋巴细胞cd3表面抗原单克隆抗体在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体在制备治疗糖尿病肾病药物上的用途，进一步讲，涉及抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。本发明所述的抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体为抗人T淋巴细胞CD3表面抗原的单克隆抗体。经动物实验和临床试验证实，抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体对糖尿病肾病具有良好的治疗效果。

Description

一种抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体的应用，进一步讲，涉及抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。

背景技术

糖尿病肾病(Diabetic Nephrology，DN)是糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)的常见的主要的严重微血管并发症，主要指糖尿病性肾小球硬化症，是一种以血管损害为主的肾小球病变。早期多无症状，血压可正常或偏高。其发生率随着糖尿病的病程延长而增高。糖尿病肾病早期肾体积增大，肾小球滤过率增加，呈高滤过状态，以后逐渐出现间隙蛋白尿或微量白蛋白尿，随着病程的延长出现持续蛋白尿、水肿、高血压、肾小球滤过率降低，进而肾功能不全、尿毒症，是糖尿病主要的死亡原因之一。

糖尿病肾病(DN)的发病机制相当复杂，近年来针对其研究很多，但其发病机制尚未完全阐明。肾内血流动力学改变直接参与DN的发生，表现为肾小球毛细血管收缩、肾小球毛细血管内压升高等。影响肾内血流动力学改变的因素有很多，一氧化氮(NO)在其中起到关键作用，NO具有强大的血管活性，具有扩张血管、降低血压的作用。糖尿病患者常有脂代谢紊乱，脂代谢紊乱则是肾脏损害的一个加重因素。

糖尿病患者神经病变也是一种常见且严重的糖尿病并发症，会导致糖尿病死亡的危险性增加。目前，欧洲的研究者报告说，攻击人体自身神经细胞的所谓自身抗体与糖尿病患者神经病变的发展有关。在一组I型或胰岛素依赖性糖尿病患者中，一半以上的患者具有神经自身抗体，Dr.Viktoria Granberg说，这些患者出现神经病变的危险性比没有自身抗体的患者要高7倍以上。瑞典Malmo University Hospital的Granberg及其同事得出结论说，这些观察结果表明I型糖尿病的神经病变可能有自身免疫的背景。他们的研究发表在本月的《DiabetesCare》杂志上，在对41名1型糖尿病患者的神经功能进行检查后，研究人员在随访的13至14年期间针对神经功能又检查了3次以上。第3次检查即大约第6年时，抽取患者血样并进行神经自身抗体的分析。共23名患者(56％)身上可以找到神经自身抗体的证据。该23名患者中，心脏自主神经功能测试至少有一次为异常结果的患者比例高于没有自身抗体的1型糖尿病忠者，第三次检查时前者比例为74％，后者为39％，第四次检查时前者为71％，后者为25％。第一次和第二次检查时两组之间没有差异。研究者称，随访期间，有神经自身抗体的受试者出现心脏神经病变的危险性是其他受试者的7.5倍。上述试验结果表明，神经自身抗体在1型糖尿病患者神经功能紊乱的发生和进展过程中起关键作用。

有学者应用免疫组化的方法，发现糖尿病肾病肾组织中巨噬细胞和普通白细胞在中度肾小球硬化中显著增加，广泛浸润。有学者分析糖尿病肾病及未发展成肾病的糖尿病患者血清内新喋呤的量(一种细胞免疫激活物)及用间接免疫荧光区分白细胞抗原CD3、CD4、CD8、CD22、CD25的抗原，结果证明临床肾病期的DN患者伴有外周血单核细胞激活物(CD25.H αA-DR)的过度表达。而激活的淋巴细胞在DN发病的主要作用与淋巴细胞产生细胞内糖昔酶相关该酶能分解肾小球基底膜上皮细胞肝素硫酸盐的酶，从而使GMB的硫酸肝素糖蛋白丢失。

近年来发现，糖尿病肾病的发生与自身免疫紊乱有关。抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体可抑制糖尿病肾病发生的自身免疫紊乱，从而对糖尿病肾病产生有益的治疗作用。

发明内容

本发明的首要发明目的在于提供抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。

为完成本发明之目的，采用的技术方案为：

本发明涉及抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。

其中，所述的抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体为抗人T淋巴细胞CD3表面抗原的单克隆抗体。

所述的抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体选自鼠源抗体、兔源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人源性抗体也称为完全人源化抗体、小分子抗体。

所述人源化抗体是指将鼠源单克隆抗体分子的互补决定区序列移植到人抗体可变区框架中而制成的单克隆抗体。此抗体可明显降低由鼠源单克隆抗体所致的人抗鼠抗体反应(HAMA反应)。

小分子抗体包括：Fab(由完整的轻链和Fd构成)，Fv(由VH和VL构成)、ScFv(单链抗体，VH和VL之间由一连接肽连接而成)、单域抗体(仅由VH组成)、最小识别单位(MRU，由一个CDR组成)以及超变区多肽、双链抗体、三链抗体、微型抗体等几种类型。小分子抗体的优势为：

1.制备方法较其他基因工程抗体简单；

2.免疫原性要比原来的McAb弱得多。如果将改形抗体构建成小分子抗体，更有可能消除其免疫原性；

3.由于分子量小，小分子抗体更容易通过血管壁，穿透实体瘤，有利于肿瘤的治疗；

4.由于没有Fc段，不能与非靶细胞的Fc受体结合，更能集中到达肿瘤部位，同时由于没有Fc调节IgG的分解代谢，在体内半寿期短，周转快，有利于放射免疫成像检查肿瘤；

5.分子小，能与分布于病毒表面凹槽的抗原结合，有利于病毒性疾病的治疗；

6.在小分子抗体基因的3端接上适当的酶基因或毒素蛋白基因，即可大量产生酶连抗体或免疫毒素连抗体；

7.在大肠杆菌中表达，可发酵生产抗体。从而降低成本，使抗体治疗得以普及。

在各种小分子抗体中，单域抗体(VH)和最小识别单位(MRU)显然不含有完整的抗原结合位点，因而作为抗体分子其特异性和亲合力较低。Fab、Fv及ScFv具有完整抗原结合位点，也是本发明所优选的技术方案。

其中，本发明中提到的鼠源抗体、兔源抗体、人源化抗体、人源性抗体也称为完全人源化抗体、小分子抗体、抗体融合蛋白、双特异性抗体可采用已知的制备方法制备。

本发明的抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体可以单位剂量形式给药，给药途径可为静脉注射或滴注、肌肉注射等。

给药剂型可以是液体剂型。液体剂型可以是溶液剂、注射剂(包括冻干制剂)、靶向制剂。

这些制剂是按照本领域的技术人员所熟知的方法制备的。为制造液体剂型所用的溶剂例如有水等。含有本发明化合物的制剂中还可有其他助剂，防腐剂等。

为将本发明药物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物可用任何公知的给药方法给药。

本发明药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明药物的每天的合适剂量范围为0.001-1mg/Kg体重，优选为0.01-0.1mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。使用本发明的抗体的疗程为1～4周，本领域技术人员可依据患者的病情调整该抗体的用法及用量。

本发明的药物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的药物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

本发明通过研究发现，抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体可在作用于免疫系统，抑制免疫从而治疗糖尿病肾病，通过临床试验证实，该抗体对于糖尿病肾病具有良好的治疗效果。

具体实施方式

本发明的具体实施方式仅限于解释和说明本发明的内容，并不对本发明的技术方案构成限制。

实施例1抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体的制备

1：免疫

取Sigma人T淋巴细胞CD3表面抗原免疫BALB/c小鼠5次。

2：细胞融合

取免疫鼠脾细胞与与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。

3：初筛

细胞融合后14-18天，对融合细胞进行ELISA初筛，然后将ELISA阳性的克隆转入24孔板培养。

4：克隆化

将初筛阳性的克隆进行3次克隆化培养。

5：复筛

将24孔板的上清进行ELISA复筛，用western blot的方法检测阳性克隆上清中抗体与抗原反应的特异性。获得了一株稳定分泌对人T淋巴细胞CD3表面抗原高亲和力、高特异性的抗体杂交瘤细胞株。

5：腹水制备

在细胞株鉴定合格后，收集合格杂交瘤细胞加于PBS(PH值7.4)或生无菌理盐水中，200万-500万/只小鼠进行腹腔注射。杂交瘤细胞注入小鼠腹腔后5-7天即可产生腹水。用无菌注射器抽取约2-5ml/只。隔天抽取一次，每只小鼠抽取三次。取腹水后置4℃过夜。离心500rpm×10min。取上清获得单克隆抗体。

实验例1动物实验

1.材料与方法

1.1动物模型与实验设计

健康成年雄性Wistar大鼠，体重180～220g，以65mg/kg腹腔内一次性注射链脲佐菌素(STZ)。若造模大鼠血糖值达到16.7mmol/L以上则造模成功。

随机分为糖尿病模型对照组(NS)、抗人T淋巴细胞C D 3表面抗原单克隆抗体组，每组10只。NS组灌胃生理盐水10mL/kg，抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体组静脉注射0.02mg/只，连续给药12天。

1.2NO的测定

用硝酸还原酶法，分别检测血清和肾组织匀浆NO含量。试剂盒由南京建成生物工程公司提供，具体操作按试剂盒说明书进行。

1.3血脂(胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白)的测定

试剂盒由卫生部上海生物制品研究所提供，采用AU800全自动生化分析仪检测。

1.4统计方法

各参数以χ±s表示，均数间比较采用ANOVA，两两比较时用LSD检验。全部统计在SPSS10.0软件上进行。

2结果

2.1对糖尿病大鼠NO的影响

治疗组血清和肾脏组织中的NO水平明显高于NS组(P＜0.05)。见表1。

表1：各组大鼠血、肾一氧化氮的比较(x±s)

分组	n	NO(μmol L-1)	K·NO(μmol gp-1)
				NS	10	90.55±11.10	0.78±0.25
CD3	10	105.75±17.14*	0.85±0.32*

注：与NS组比较，*P＜0.05

2.2对糖尿病大鼠血脂的影响

治疗组的TC、TG均显著低于NS组(P＜0.05，或P＜0.01)。治疗组的HDL值比NS组略高、LDL比NS组略低，但统计学无显著差异。如表2所示。

表2各组大鼠血脂的比较(x±s)

分组	n	TC(mmol·L-1)	TG(mmol·L-1)	HDL(mmol·L-1)	LDL/(mmol·L-1)
						NS	10	1.50±0.15	1.15±0.27	0.72±0.96	0.48±0.18
CD3	10	1.19±0.12*	0.70±0.12**	0.74±0.21*	0.28±0.06*

注：与NS组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3讨论

DN的发病机制目前尚不十分清楚，现多认为DN的发生和发展是多因素综合的结果，其中血流动力学改变是一个重要因素。NO是一种脂溶性、具有高反应活性的自由基气体和生物信使分子，具有广泛的生物活性。NO在DN中的有利作用包括维持周身血压，避免高血压加重肾脏损害；增加毛细血管血流；拮抗血管紧张素II(ATII)的作用；抑制血小板聚集；抑制血小板衍化生长因子(PDGF)β链表达。本研究中抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体能够提高DN大鼠血清和肾脏组织中NO水平，其作用机制可能是通过提高NO含量，提高NO血管活性，改善血流动力学，从而有效抑制肾血流动力学异常对肾脏的损伤，起到治疗DN的作用。

实验例2临床试验

1材料与方法

1.1一般资料

1998年1月到1999年12月兰州军区总医院患者84例，均符合美国糖尿病协会1997年糖尿病诊断标准，并符合MogensenIV期诊断分期标准(持续性蛋白尿或临床DN)，即持续蛋白尿＞0.5g/24h，或有肾病综合症的临床特点。排除原发性肾病、高血压肾病等其他继发性肾小球疾病、合并感染、严重肝病、心脑血管病及近期有糖尿病急性并发症和血液系统疾病患者。

89例患者随机分为2组，对照组42例，男性24例，女性18例；试验组44例，男性28例，女性16例。

1.2治疗方法

两组均在原有胰岛素控制血糖、饮食控制基础上，对照组以尿毒清颗粒(广州康臣药业)口服，每次1袋，每日3次。试验组以抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克降抗体静脉注射或滴注5mg/d/人。连续治疗12d。

1.3检测方法

所有患者治疗前后抽取空腹静脉血，以Hitachi7180全自动生化分析仪检测血肌酐、尿素氮、血脂，收集24h尿量，以免疫比浊法测定24h尿蛋白排泄量。

1.4统计学处理

利用SPSS 13.0软件，比较采用配对(治疗前后组内比较)和非配对t检验(治疗后组间比较)，均以P＜0.05为有统计学差异。

2结果

2.1基线情况

两组患者治疗前年龄、性别、病程、空腹血糖(FPG)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、血脂(TG)、24h尿蛋白排泄量(UPE)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)等情况均无显著差异(P＞0.05)。

2疗效

经12d治疗后，与治疗前比较，对照组各观察指标改善程度均有显著差异(P＜0.05)，治疗组血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)和24h尿蛋白排泄量(UPE)改善程度有极显著差异(P＜0.01)。与对照组比较，治疗组血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)和24h尿蛋白排泄量(UPE)改善程度有显著差异(P＜0.05)，但血脂(TG)两组间未见明显差异，见表3。

表32组治疗前后疗效情况

P＜0.05，ΔP＞0.05。

2.3不良反应

治疗期间观察到的不良反应有皮疹(对照组0例，治疗组4例)，发烧(对照组1例，治疗组6例)，腹泻(对照组1例，治疗组4例)，均症状较轻，未影响继续治疗。

3讨论

通过临床试验证实，抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体对于糖尿病肾病具有良好的治疗效果。

Claims (3)

1.抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体在制备治疗用于mogensenIV期糖尿病肾病药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体选自鼠源抗体、兔源抗体、人源化抗体、人源性抗体、小分子抗体、抗体融合蛋白、双特异性抗体。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体的制备方法为：

（1）免疫：取Sigma人T淋巴细胞CD3表面抗原免疫BALB/c小鼠5次；

（2）细胞融合：取免疫鼠脾细胞与与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞进行融合；

（3）初筛：细胞融合后14～18天，对融合细胞进行ELISA初筛，然后将ELISA阳性的克隆转入24孔板培养；

（4）克隆化：将初筛阳性的克隆进行3次克隆化培养；

（5）复筛：将24孔板的上清进行ELISA复筛，用western blot的方法检测阳性克隆上清中抗体与抗原反应的特异性；获得了一株对人T淋巴细胞CD3表面抗原高亲和力、高特异性的抗体杂交瘤细胞株；

（6）腹水制备：在细胞株鉴定合格后，收集合格杂交瘤细胞加于PH值7.4的PBS或生无菌理盐水中，200万～500万/只小鼠进行腹腔注射；杂交瘤细胞注入小鼠腹腔后5-7天即可产生腹水；用无菌注射器抽取约2～5ml/只，隔天抽取一次，每只小鼠抽取三次；取腹水后置4℃过夜，离心500rpm×10min，取上清获得单克隆抗体。