CN116648262A - 具有改善的胞质溶胶穿透活性的抗原结合分子 - Google Patents

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CN116648262A CN202180087099.1A CN202180087099A CN116648262A CN 116648262 A CN116648262 A CN 116648262A CN 202180087099 A CN202180087099 A CN 202180087099A CN 116648262 A CN116648262 A CN 116648262A
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Abstract

本发明提供具有改善的胞质溶胶穿透能力的抗原结合分子(例如抗体)或其抗原结合片段(抗体片段)，所述分子在选自由轻链可变区中CDRL1、CDRL2和CDRL3组成的组中的至少一个上包含氨基酸置换；以及包含所述抗原结合分子的药物组合物；将抗原结合分子特异性递送到靶细胞的胞质溶胶中的方法；通过使用抗原结合分子以靶细胞特异性方式去除、抑制或激活胞质溶胶抗原的方法；以及用于诊断、预防或治疗受试者疾病的药物组合物，所述药物组合物包含所述抗原结合分子。

Description

具有改善的胞质溶胶穿透活性的抗原结合分子
技术领域
本公开涉及具有改善的胞质溶胶穿透能力的抗原结合分子(例如抗体)，以及在轻链可变区中选自由CDRL1、CDRL2和CDRL3组成的组中的至少一个上包含氨基酸突变的胞质溶胶穿透性抗原结合分子，或其抗原结合片段(抗体片段)；以及包含所述抗原结合分子的药物组合物；将抗原结合分子特异性递送到靶细胞的胞质溶胶中的方法；通过使用抗原结合分子以靶细胞特异性方式去除、抑制或激活胞质溶胶抗原的方法；以及用于诊断、预防或治疗受试者疾病的药物组合物，所述药物组合物包含所述抗原结合分子。
背景技术
抗体是以高亲和力特异性结合抗原的蛋白质。已知从低分子量化合物到蛋白质的各种分子都可以是抗原。自从开发了单克隆抗体生产技术以来，抗体修饰技术不断进步，很容易获得识别特定分子的抗体。
抗体作为药物引起了人们的关注，因为它们在血浆中高度稳定，副作用较小。抗体不仅与抗原结合并表现出激动或拮抗作用，而且还会诱导由效应细胞介导的细胞毒活性(也称为效应功能)，包括ADCC(抗体依赖性细胞毒性)、ADCP(抗体依赖性细胞吞噬作用)和CDC(补体依赖性细胞毒性)。利用这些抗体功能，已经开发出用于癌症、免疫疾病、慢性疾病、感染等的药物(Nat Rev Drug Discov.2018年3月；17(3):197-223.(NPL 1))。
同时，抗体药物靶向的抗原限于细胞膜上的抗原或细胞外的抗原，因为全长IgG分子具有高分子量(约150kDa)并且通常不表现出细胞渗透性。因此，作为允许抗体作用于细胞内抗原的技术，开发并报道了胞内抗体(在细胞内表达的抗体或抗体片段)、通过与细胞穿透肽(CPP)融合产生的抗体-CPP复合物、蛋白质转染法等(MAbs.2011 1月-2月；3(1):3-16.(NPL 2))。
已知一些天然存在的全长抗体具有细胞穿透能力。例如，据报道，从系统性红斑狼疮(SLE)患者和MRL-mpj/lpr狼疮模型小鼠中鉴定出的抗DNA自身抗体显示出细胞穿透能力(Sci Rep.2015年7月9日；5:12022。(NPL 3)，Mol Immunol.2015年10月；67(2Pt B):377-87.(NPL 4))。除了细胞穿透能力外，一些抗DNA抗体还显示DNA水解活性或DNA修复抑制活性并表现出细胞毒性(WO 2012135831(PTL 1),Sci Rep.2014年8月5日；4:5958(NPL)5))。还有关于通过将从具有从核内体逃逸到胞质溶胶中的能力的SLE模型小鼠分离的抗体人源化并将其与可结合活化的Ras的重链可变区结合制备的抗体的报告(WO2016013871A1(PTL2))。
引用列表
专利文献
[PTL 1]WO 2011/135831
[PTL 2]WO2016/013871A1
非专利文献
[NPL 1]Nat Rev Drug Discov.2018Mar；17(3):197-223.
[NPL 2]MAbs.2011Jan-Feb；3(1):3-16.
[NPL 3]Sci Rep.2015Jul 9；5:12022.
[NPL 4]Mol Immunol.2015Oct；67(2Pt B):377-87.
[NPL 5]Sci Rep.2014Aug 5；4:5958
发明内容
技术问题
迄今为止开发的大多数抗体疗法不能靶向胞质溶胶分子，因为它们仅靶向表面暴露或分泌的分子，因此需要开发一种通过细胞膜递送抗体的方法。在一个非限制性实施方案中，本发明的一个目的是提供一种抗原结合分子(例如抗体)，其将被有效地特异性递送至靶细胞的胞质溶胶，一种包含该抗原结合分子的药物组合物，该抗原结合分子的使用方法、抗原该结合分子的制备方法、以及将该抗原结合分子特异性地递送到靶细胞的胞质溶胶中的方法。
问题的解决方案
本发明源于上述需要，并且提供了具有改善的细胞质通透性的抗原结合分子(例如抗体)，并且证实了抗原结合分子或抗体具有改善的对细胞质的通透性。在一个非限制性实施方案中，本发明涉及具有增强的胞质溶胶穿透能力或活性的抗原结合分子(例如抗体)或其片段，其包含含有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，并且在选自CDRL1、CDRL2和CDRL3，优选选自CDRL1和CDRL3的至少一个中包含一个或多个氨基酸置换。
在一个非限制性实施方案中，本发明人已经鉴定出具有改善或增强的胞质溶胶穿透能力或活性同时在以下方面具有优异特性的抗原结合分子(抗体)：(1)抗体表达水平，(2)减少的细胞外基质(ECM)-结合谱(这改善了体内半衰期或药代动力学)，和/或(3)由较低的聚集趋势指示的良好的物理化学性质。
一方面，本公开提供：
[1]一种胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中轻链可变区在选自CDRL1、CDRL2和CDRL3的至少一个中包含一个或多个氨基酸置换。
[2][1]的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区在SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列中的Kabat编号位置24至34和89至97处包含一个或多个氨基酸置换。
[3][2]的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区在SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列中的Kabat编号位置24至32和93至97处包含一个或多个氨基酸置换。
[4][3]的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中所述一个或多个氨基酸置换选自由以下组成的组(根据Kabat编号的位置)：
在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列中，
(a)用A、D、E、F、G、H、I、L、N、Q、R、S、T、V或Y置换第24位的氨基酸K；
(b)用A、D、E、F、I、M、N、T、V或Y置换第25位的氨基酸S；
(c)用A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、R、T或V置换第26位的氨基酸S；
(d)用A、D、E、F、H、I、L、M、S或Y置换第27位的氨基酸Q；
(e)用D置换第27a位的氨基酸S；
(f)用I、P、Q、T或V置换第27b位的氨基酸L；
(g)用A、D、E、I、M、N、S、W或Y置换第27c位的氨基酸F；
(h)用A、D、E、F、H、N或Q置换第27d位的氨基酸N；
(i)用A、D、E、I、L、M、N、P、Q、T、V或Y置换第27e位的氨基酸S；
(j)用A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V、W或Y置换第27f位的氨基酸R；
(k)用E、H、I、Q、S、V、W或Y置换第28位的氨基酸T；
(l)用A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y置换第29位的氨基酸R；
(m)用A、D、E、F、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y置换第30位的氨基酸K；
(n)用D、M、S或T置换第31位的氨基酸N；
(o)用D、E、G、H或Q置换第32位的氨基酸Y；
(p)用H、I、T或Y置换第89位的氨基酸Q；
(q)用E、F或N置换第91位的氨基酸Y；
(r)用I、L、M、N、P、Q、S、T、V或W置换第93位的氨基酸Y；
(s)用A、D、E、F、G、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y置换第94位的氨基酸H；
(t)用A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y置换第95位的氨基酸M；
(u)用A、D、E、F、G、H、K、M、N、P、Q、S、T或V置换第96位的氨基酸Y；和
(v)用A、D、E、G、H、K、P、Q、R、S或V置换第97位的氨基酸T。
[4A][4]的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中轻链可变区中的CDRL1和CDRL3中的每一个包含两个或更多个选自[4](a)至(v)中定义的组的氨基酸置换。
[5][1]至[4A]中任一项的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中与没有所述置换且包含具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的轻链可变区的参考抗体或其片段相比，所述氨基酸置换增强了抗体或其片段的胞质溶胶穿透活性。
[5A][1]至[5]中任一项的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其与没有所述置换且包含具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的轻链可变区的参考抗体或其片段相比表现出至少1％、5％、8％、10％、12％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或500％或1000％增强的胞质溶胶穿透活性，优选如参考实施例1中所述使用Split Nluc测定确定的。
[5B][1]至[5A]中任一项所述的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中所述胞质溶胶穿透活性是通过所述抗体或其片段穿透细胞膜和/或在所述抗体或者其片段穿透细胞膜后的核内体逃逸介导的。
[5C][1]至[5B]中任一项的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其表现出相对于参考抗体的一种或多种特性，其中一种或多种特性选自由以下组成的组：
(a)相对于参考抗体增加的抗体表达水平；
(b)相对于参考抗体，对细胞外基质(ECM)的减少的结合活性，优选通过参考实施例2中描述的方法确定；和
(c)相对于参考抗体改善的物理化学性质，优选地如通过尺寸排阻色谱法(SEC)分析所确定的更高的单体峰百分比所示。
[6][1]至[5C]中任一项的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中轻链可变区包含一个、两个、三个或更多个选自由以下组成的组的氨基酸置换(根据Kabat编号的位置)：
在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列中，
(a)用N置换第24位的氨基酸K；
(b)用E置换第27位的氨基酸Q；
(c)用D置换第27a位的氨基酸S；
(d)用D或E置换第27d位的氨基酸N；
(e)用D或E置换第27e位的氨基酸S；
(f)用D、H、K、L、S或V置换第27f位的氨基酸R；
(g)用D置换第28位的氨基酸T；
(h)用E、G、M或S置换第29位的氨基酸R；
(i)用L或Q置换第30位的氨基酸K；
(j)用E置换第32位的氨基酸Y；
(k)用H、I、T或Y置换第89位的氨基酸Q；
(l)用E、F或N置换第91位的氨基酸Y；
(m)用E置换第93位的氨基酸Y；
(n)用E、P或Q置换第94位的氨基酸H；
(o)用D、N或P置换第95位的氨基酸M；
(p)用E或P置换第96位的氨基酸Y。
[6A][6]的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中轻链可变区中的CDRL1和CDRL3中的每一个包含两个或更多个选自[6](a)至(p)中定义的组的氨基酸置换。
[7][6]的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中轻链可变区包含选自由以下组成的组的氨基酸置换(根据Kabat编号的位置)的组合：
(a)S27eD/R27fK；
(b)S27eD/R27fH；
(c)N27dE/S27eD；
(d)S27eD/T28D；
(e)S27eD/R29E；
(f)S27eD/R29S；
(g)K24N/S27eD；
(h)N27dD/R27fK；
(i)N27dE/R27fK；
(j)R27fK/T28D；
(k)R27fK/R29E；
(l)R27fK/R29S；
(m)K24N/R27fK；
(n)K24N/N27dD；
(o)N27dD/T28D；
(p)N27dD/R29E；
(q)N27dD/R29S；
(r)S27eD/Q89H；
(s)N27dD/Q89H；
(t)R27fK/Q89H；
(u)S27eD/Y91E；
(v)N27dD/Y91E；
(w)R27fK/Y91E；
(x)Q89H/H94P；
(y)Y91E/H94P；
(z)H94P/M95N；
(aa)H94P/M95D；
(bb)H94P/M95P；
(cc)H94E/Y96P；
(dd)H94E/M95N；
(ee)H94E/M95D；
(ff)H94E/M95P；
(gg)N27dE/R27fK/Q89H/H94E/M95P；
(hh)N27dE/R27fK/Q89Y/H94E/M95P；
(ii)N27dE/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
(jj)N27dE/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
(kk)N27dE/R27fS/Q89H/H94E/M95P；
(ll)N27dE/R27fS/Q89Y/H94E/M95P；
(mm)N27dE/R27fS/Y91E/H94E/M95P；
(nn)N27dE/R27fS/Y91F/H94E/M95P；
(oo)N27dE/R27fS/Q89H/H94Q/M95P；
(pp)N27dE/R27fS/Q89Y/H94Q/M95P；
(qq)N27dE/R27fS/Y91E/H94Q/M95P；
(rr)N27dE/R27fS/Y91F/H94Q/M95P；
(ss)N27dE/R27fV/Q89H/H94E/M95P；
(tt)N27dE/R27fV/Q89Y/H94E/M95P；
(uu)N27dE/R27fV/Y91E/H94E/M95P；
(vv)N27dE/R27fV/Y91F/H94E/M95P；
(ww)N27dE/R29S/Q89H/H94E/M95P；
(xx)N27dE/R29S/Q89Y/H94E/M95P；
(yy)N27dE/K30L/Q89H/H94E/M95P；
(zz)N27dE/K30L/Q89Y/H94E/M95P；
(aaa)S27eD/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
(bbb)S27eD/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
(ccc)S27eD/R27fK/Y91E/H94Q/M95P；
(ddd)S27eD/R27fK/Y91F/H94Q/M95P；
(eee)S27eD/R27fK/Y91E/H94Q；
(fff)S27eD/R27fK/Y91F/H94Q；
(ggg)S27eE/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
(hhh)S27eE/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
(iii)S27eE/R27fK/Y91E/H94Q/M95P；
(jjj)S27eE/R27fK/Y91F/H94Q/M95P；
(kkk)R27fS/R29S/Q89H/H94E/M95P；
(lll)R27fS/R29S/Q89Y/H94E/M95P；
(mmm)R27fS/R29S/Y91E/H94E/M95P；
(nnn)R27fS/R29S/Y91F/H94E/M95P；
(ooo)R27fS/R29S/Q89H/H94Q/M95P；
(ppp)R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P；
(qqq)R27fS/R29S/Y91E/H94Q/M95P；
(rrr)R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P；
(sss)N27dE/R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P；和
(ttt)N27dE/R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P。
[8][1]至[7]中任一项的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中轻链可变区包含人框架区(FR)。
[8A][8]的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中轻链可变区包含根据Kabat编号的第2位的氨基酸I和/或第3位的氨基酸Q。
[8B][8]的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中轻链可变区包含人Vκ1FR1序列。
[8C][8]的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中轻链可变区包含人Vκ3FR3序列。
[8D][8]的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中轻链可变区包含人Vκ1FR1、人Vκ1FR2和人Vκ3FR3序列。
[8E][8]的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中轻链可变区包含一个、两个、三个或四个包含在SEQ ID NO:123中的FR结构域(FR1、FR2、FR3和FR4)。
[8F][2]至[8E]中任一项的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中轻链可变区进一步包含CDRL2中的一个、两个、三个或更多个氨基酸置换。
[9][1]至[8F]中任一项的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中轻链可变区还包含一个、两个、三个或更多个选自由以下组成的组的氨基酸置换(根据Kabat编号的位置)：
在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的CDRL2中
(a)用A、G、I、T或V置换第50位的氨基酸W；
(b)用F或I置换第52位的氨基酸S；
(c)用N或Y置换第53位的氨基酸T；和
(d)用K或V置换第54位的氨基酸R。
[10][9]的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中轻链可变区包含选自由以下组成的组的氨基酸置换(根据Kabat编号的位置)的组合：
在SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中的
(a)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50A/Y91F/H94Q；
(b)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50G/Y91F/H94Q；
(c)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/Y91F/H94Q；
(dL2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50T/Y91F/H94Q；
(e)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50V/Y91F/H94Q；
(f)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52F/Y91F/H94Q；
(g)L21/V3Q/S27eD/R27fK/S521/Y91F/H94Q：
(h)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53N/Y91F/H94Q；
(i)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53Y/Y91F/H94Q；
(j)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/R54K/Y91F/H94Q；
(k)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/S52F/Y91F/H94Q；
(I)I2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/T53N/Y91F/H94Q；和
(m)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/R54V/Y91F/H94Q。
[11-1][1]至[10]中任一项的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其包含具有选自由SEQ ID NO：14-150和161-173组成的组的氨基酸序列的轻链可变区。
[11-2][11-1]的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其包含具有选自由SEQID NO：123-150组成的组的氨基酸序列的轻链可变区。
[11-3][11-1]的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其包含具有选自由SEQID NO：161-173组成的组的氨基酸序列的轻链可变区。
[11A][1]至[11-3]中任一项的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其为Fab或scFv的形式。
[11B][1]至[11A]中任一项的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，还包含重链可变区，任选地含有SEQ ID NO：158的氨基酸的重链可变区。
[11C][1]至[11B]中任一项的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其是多功能抗体。
[11D][11C]的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其包含细胞表面抗原结合结构域、胞质溶胶抗原结合结构域和胞质溶胶穿透性结构域；其中胞质溶胶穿透性结构域包含[1]至[11A]中任一项的轻链可变区。
[12]一种核酸，其编码[1]至[11D]中任一项的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段。
[13]包含[12]的核酸的载体。
[14]宿主细胞，其包含[12]的核酸或[13]的载体。
[15][1]至[11D]中任一项所述的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段的制备方法，其包括以下步骤：a)在适于抗体或其片段的表达的条件下培养[14]所述的宿主细胞和b)回收所述抗体或其片段。
[16]用于将生物活性分子递送到细胞质中的组合物或药物组合物，其包含[1]至[11D]中任一项的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段。
[17][16]的组合物或药物组合物，其中所述生物活性分子是选自由肽、蛋白质、毒素、抗体、抗体片段、RNA、DNA、小分子药物、纳米颗粒和脂质体组成的组中的至少一种；其中生物活性分子与胞质溶胶穿透性抗体或抗原结合片段缀合或融合。
[18][1]至[11D]中任一项的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段和生物活性分子的免疫缀合物。
[19][18]的免疫缀合物，其中所述生物活性分子选自由肽、蛋白质、毒素、抗体、抗体片段、RNA、DNA、小分子药物、纳米颗粒和脂质体组成的组。
[20]递送[1]至[11D]中任一项的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段或[18]或[19]的免疫缀合物穿过细胞膜并将其置于细胞质中的方法。
[21]通过使用[1]至[11D]中任一项的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段靶向、抑制或激活胞质溶胶抗原的方法，其中该抗体或其片段特异性结合胞质溶胶抗原。
[21A]使样品细胞中的胞质溶胶抗原成像的方法，包括使[1]至[11D]中任一项的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段与样品细胞接触，其中所述抗体或其片段被标记并特异性结合所述胞质溶胶抗原。
[22]产生胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段的方法，其中该方法包括：
(a)提供包含具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的轻链可变区的亲本胞质溶胶穿透性抗原结合分子；
(b)在亲本胞质溶胶穿透性抗原结合分子的轻链可变区中选自CDRL1和CDRL3的至少一个中引入一个或多个氨基酸置换；和
(c)鉴定和/或选择包含一个或多个氨基酸置换的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其与亲本胞质溶胶穿透性抗原结合分子相比表现出增强的胞质溶胶穿透能力。
[22A][22]的方法，还包括鉴定和/或选择胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其相对于亲本抗体表现出一种或多种特性，其中所述一种或多种特性选自由以下组成的组：
(a)增加的抗体表达水平；
(B)降低的与细胞外基质(ECM)的结合活性，优选通过参考实施例2中描述的方法确定；和
(c)改善的物理化学性质，优选地如通过尺寸排阻色谱法(SEC)分析确定的更高的单体峰百分比所示。
[23][22]至[22A]中任一项的方法，还包括：
(d)获得表达载体，其包含编码通过[22]的方法产生的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段的基因和可操作地连接的合适的启动子；
(e)将载体引入宿主细胞并培养宿主细胞以允许产生胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段；和
(f)从宿主细胞培养物中回收胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段。
[24][22]至[23]中任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸置换位于SEQ IDNO：4所列氨基酸序列中Kabat编号位置24至34和89至97。
[25][24]的方法，其中所述一个或多个氨基酸置换位于SEQ ID NO：4所示氨基酸序列中的Kabat编号位置24至32和93至97。
[26][22]至[25]中任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸置换选自由以下组成的组(根据Kabat编号的位置)：
在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列中，
(a)用A、D、E、F、G、H、I、L、N、Q、R、S、T、V或Y置换第24位的氨基酸K；
(b)用A、D、E、F、I、M、N、T、V或Y置换第25位的氨基酸S；
(c)用A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、R、T或V置换第26位的氨基酸S；
(d)用A、D、E、F、H、I、L、M、S或Y置换第27位的氨基酸Q；
(e)用D置换第27a位的氨基酸S；
(f)用I、P、Q、T或V置换第27b位的氨基酸L；
(g)用A、D、E、I、M、N、S、W或Y置换第27c位的氨基酸F；
(h)用A、D、E、F、H、N或Q置换第27d位的氨基酸N；
(i)用A、D、E、I、L、M、N、P、Q、T、V或Y置换第27e位的氨基酸S；
(j)用A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V、W或Y置换第27f位的氨基酸R；
(k)用E、H、I、Q、S、V、W或Y置换第28位的氨基酸T；
(l)用A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y置换第29位的氨基酸R；
(m)用A、D、E、F、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y置换第30位的氨基酸K；
(n)用D、M、S或T置换第31位的氨基酸N；
(o)用D、E、G、H或Q置换第32位的氨基酸Y；
(p)用H、I、T或Y置换第89位的氨基酸Q；
(q)用E、F或N置换第91位的氨基酸Y；
(r)用I、L、M、N、P、Q、S、T、V或W置换第93位的氨基酸Y；
(s)用A、D、E、F、G、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y置换第94位的氨基酸H；
(t)用A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y置换第95位的氨基酸M；
(u)用A、D、E、F、G、H、K、M、N、P、Q、S、T或V置换第96位的氨基酸Y；和
(v)用A、D、E、G、H、K、P、Q、R、S或V置换第97位的氨基酸T。
[26A][26]的方法，其中轻链可变区中的CDRL1和CDRL3中的每一个包含两个或更多个选自[26](a)至(v)中定义的组的氨基酸置换。
[27][22]至[26]中任一项的方法，其中与没有所述置换且包含具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的轻链可变区的参考抗体或其片段相比，所述一个或多个氨基酸置换增强了抗体或其片段的胞质溶胶穿透活性。
[28][22]至[27]中任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸置换选自由以下组成的组(根据Kabat编号的位置)：
在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列中，
(a)用N置换第24位的氨基酸K；
(b)用E置换第27位的氨基酸Q；
(c)用D置换第27a位的氨基酸S；
(d)用D或E置换第27d位的氨基酸N；
(e)用D或E置换第27e位的氨基酸S；
(f)用D、H、K、L、S或V置换第27f位的氨基酸R；
(g)用D置换第28位的氨基酸T；
(h)用E、G、M或S置换第29位的氨基酸R；
(i)用L或Q置换第30位的氨基酸K；
(j)用E置换第32位的氨基酸Y；
(k)用H、I、T或Y置换第89位的氨基酸Q；
(l)用E、F或N置换第91位的氨基酸Y；
(m)用E置换第93位的氨基酸Y；
(n)用E、P或Q置换第94位的氨基酸H；
(o)用D、N或P置换第95位的氨基酸M；
(p)用E或P置换第96位的氨基酸Y。
[28A][28]的方法，其中轻链可变区中的CDRL1和CDRL3中的每一个包含两个或更多个选自[28](a)至(p)中定义的组的氨基酸置换。
[29][22]至[28]中任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸置换包括选自由以下组成的组的氨基酸置换的组合(根据Kabat编号的位置)：
(a)S27eD/R27fK；
(b)S27eD/R27fH；
(c)N27dE/S27eD；
(d)S27eD/T28D；
(e)S27eD/R29E；
(f)S27eD/R29S；
(g)K24N/S27eD；
(h)N27dD/R27fK；
(i)N27dE/R27fK；
(j)R27fK/T28D；
(k)R27fK/R29E；
(l)R27fK/R29S；
(m)K24N/R27fK；
(n)K24N/N27dD；
(o)N27dD/T28D；
(p)N27dD/R29E；
(q)N27dD/R29S；
(r)S27eD/Q89H
(s)N27dD/Q89H；
(t)R27fK/Q89H；
(u)S27eD/Y91E；
(v)N27dD/Y91E；
(w)R27fK/Y91E；
(x)Q89H/H94P；
(y)Y91E/H94P；
(z)H94P/M95N；
(aa)H94P/M95D；
(bb)H94P/M95P；
(cc)H94E/Y96P；
(dd)H94E/M95N；
(ee)H94E/M95D；
(ff)H94E/M95P；
(gg)N27dE/R27fK/Q89H/H94E/M95P；
(hh)N27dE/R27fK/Q89Y/H94E/M95P；
(ii)N27dE/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
(ji)N27dE/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
(kk)N27dE/R27fS/Q89H/H94E/M95P；
(lI)N27dE/R27fS/Q89Y/H94E/M95P；
(mm)N27dE/R27fS/Y91E/H94E/M95P；
(nn)N27dE/R27fS/Y91F/H94E/M95P；
(oo)N27dE/R27fS/Q89H/H94Q/M95P；
(pp)N27dE/R27fS/Q89Y/H94Q/M95P；
(qq)N27dE/R27fS/Y91E/H94Q/M95P；
(rr)N27dE/R27fS/Y91F/H94Q/M95P；
(ss)N27dE/R27fV/Q89H/H94E/M95P；
(tt)N27dE/R27fV/Q89Y/H94E/M95P；
(uu)N27dE/R27fV/Y91E/H94E/M95P；
(vv)N27dE/R27fV/Y91F/H94E/M95P；
(ww)N27dE/R29S/Q89H/H94E/M95P；
(xx)N27dE/R29S/Q89Y/H94E/M95P；
(yy)N27dE/K30L/Q89H/H94E/M95P；
(zz)N27dE/K30L/Q89Y/H94E/M95P；
(aaa)S27eD/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
(bbb)S27eD/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
(ccc)S27eD/R27fK/Y91E/H94Q/M95P；
(ddd)S27eD/R27fK/Y91F/H94Q/M95P；
(eee)S27eD/R27fK/Y91E/H94Q；
(fff)S27eD/R27f/Y91F/H94Q；
(ggg)S27eE/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
(hhh)S27eE/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
(iii)S27eE/R27fK/Y91E/H94Q/M95P；
(jjj)S27eE/R27fK/Y91F/H94Q/M95P；
(kkk)R27fS/R29S/Q89H/H94E/M95P
(lll)R27fS/R29S/Q89Y/H94E/M95P；
(mmm)R27fS/RR29S/Y91E/H94E/M95P；
(nnn)R27fS/R29S/Y91F/H94E/M95P；
(ooo)R27fS/R29S/Q89H/H94Q/M95P；
(ppp)R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P；
(qqq)R27fS/R29S/Y91E/H94Q/M95P；
rrr)R27fS/R29S/Y91F/94Q/M95P；
(sss)N27dE/R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P；和
(ttt)N27dE/R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P。
[30][22]至[29]中任一项的方法，还包括用人框架区(FR)替换轻链可变区的框架区(FR)。
[30A][30]的方法，其中轻链可变区包含根据Kabat编号的第2位的氨基酸I和/或第3位的氨基酸Q。
[30B][30]的方法，其中轻链可变区包含人Vκ1 FR1序列。
[30C][30]的方法，其中轻链可变区包含人Vκ3 FR3序列。
[30D][30]的方法，其中轻链可变区包含人Vκ1 FR1、人Vκ1 FR2和人Vκ3 FR3序列。
[30E][30]的方法，其中轻链可变区包含一个、两个、三个或四个包含在SEQ IDNO：123中的FR结构域(FR1、FR2、FR3和FR4)。
[30F][22]至[30]中任一项的方法，还包括在轻链可变区的CDRL2中引入一个、两个、三个或更多个氨基酸置换。
[31][22]至[30F]中任一项的方法，还包括引入一个、两个、三个或更多个选自由以下组成的组的氨基酸置换(根据Kabat编号的位置)：
在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的CDRL2中
(a)用A、G、I、T或V置换第50位的氨基酸W；
(b)用F或I置换第52位的氨基酸S；
(c)用N或Y置换第53位的氨基酸T；和
(d)用K或V置换第54位的氨基酸R。
[32][22]至[31]中任一项的方法，其中引入轻链可变区的氨基酸置换包括选自由以下组成的组的氨基酸置换的组合(根据Kabat编号的位置)：
在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列中
(a)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50A/Y91F/H94Q；
(b)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50G/Y91F/H94Q；
(c)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/Y91F/H94Q；
(d)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50T/Y91F/H94Q；
(e)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50V/Y91F/H94Q；
(f)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52F/Y91F/H94Q；
(g)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52I/Y91F/H94Q；
(h)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53N/Y91F/H94Q；
(i)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53Y/Y91F/H94Q；
(j)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/R54K/Y91F/H94Q；
(k)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/S52F/Y91F/H94Q；
(l)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/T53N/Y91F/H94Q；和
(m)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/R54V/Y91F/H94Q。
[33-1][22]至[32]中任一项所述的方法，其中所述胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段包含具有选自SEQ ID NO:14-150和161-173的氨基酸序列的轻链可变区。
[33-2][33-1]的方法，其中胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段包含具有选自由SEQ ID NO：123-150组成的组的氨基酸序列的轻链可变区。
[33-3][33-1]的方法，其中胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段包含具有选自由SEQ ID NO：161-173组成的组的氨基酸序列的轻链可变区。
[34][22]至[33-3]中任一项所述的方法，其中所述胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段是Fab或scFv的形式。
[35][22]至[33-3]中任一项所述的方法，其中所述胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段进一步包含重链可变区，任选地含有SEQ ID NO:158的氨基酸的重链可变区。
在另一个非限制性实施方案中，本发明涉及多功能抗原结合分子(抗体或其抗原结合片段)，其包含胞质溶胶穿透性结构域、细胞表面抗原结合结构域和/或胞质溶胶抗原结合结构域的组合，其可以以靶细胞特异性方式递送到胞质溶胶中。在一个非限制性实施方案中，每个结构域都源自抗体。在一个非限制性实施方案中，预期这些抗原结合分子结合细胞表面抗原，从而以靶细胞特异性方式进行内化并转移到胞质溶胶中。
具体而言，本公开包括下述双功能或多功能抗原结合分子的实施方案，例如：
[36]一种抗原结合分子，其包含细胞表面抗原结合结构域、胞质溶胶抗原结合结构域和胞质溶胶穿透性结构域，其中所述胞质溶胶穿透性结构域包含[1]至[11-3]中任一项的轻链可变区。
[36A][36]所述的抗原结合分子，其不与在细胞表面表达的不同于上述细胞表面抗原的抗原结合。
[36B][36]所述的抗原结合分子，其中，所述胞质溶胶抗原结合结构域和胞质溶胶穿透性结构域不与在细胞表面表达的不同于上述细胞表面抗原的抗原结合。
[36C][36]或[36B]的抗原结合分子，其中胞质溶胶抗原结合结构域和胞质溶胶穿透性结构域不结合在细胞表面表达的抗原。
[36D][36]至[36C]中任一项所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合分子是多功能抗体或多功能抗体衍生物。
[37]包含第一和第二Fab区的抗原结合分子，其中
(a)第一Fab区与细胞表面抗原特异性结合，并且
(b)第二Fab区包含(i)一对特异性结合胞质溶胶抗原的重链可变区(VH)和[1]至[11-3]中任一项的轻链可变区(VL)。
[38]一种抗原结合分子，其包含第一和第二Fab区以及单链单元，其中
(a)第一Fab区特异性结合细胞表面抗原，
(b)第二Fab区具有胞质溶胶穿透能力，并且
(c)单链单元特异性结合胞质溶胶抗原，并且
其中第二Fab区包含[1]至[11-3]中任一项的轻链可变区(VL)。
[39]一种抗原结合分子，其包含第一和第二Fab区以及单链单元，其中
(a)第一Fab区特异性结合胞质溶胶抗原，
(b)第二Fab区具有胞质溶胶穿透能力，并且
(c)单链单元特异性结合细胞表面抗原，并且
其中第二Fab区包含[1]至[11-3]中任一项的轻链可变区(VL)。
[40]一种抗原结合分子，其包含第一和第二Fab区以及单链单元，其中
(a)第一和第二Fab区包含(i)一对特异性结合细胞表面抗原的重链可变区(VH)和[1]至[11-3]中任一项的轻链可变区(VL)，和
(b)单链单元特异性结合胞质溶胶抗原。
[41]一种抗原结合分子，其包含第一、第二、第三和第四Fab区和Fc区，其中
(a)选自第一、第二、第三和第四Fab区的一个Fab区特异性结合细胞表面抗原，
(b)除(a)之外的三个Fab区包含(i)一对特异性结合胞质溶胶抗原的重链可变区和[1]至[11-3]中任一项的轻链可变区，
(c)Fc区包含第一Fc亚基和第二Fc亚基，
(d)第一Fab区重链的C端融合到第一Fc亚基的N端，第二Fab区重链的C端融合到第二Fc亚基的N端，第三Fab区重链的C端融合到第一Fab区重链的N端，和第四Fab区重链的C端融合到第二Fab区重链的N端。
[42]一种抗原结合分子，其包含[1]至[11-3]中任一项的轻链可变区和Fc区，其中所述Fc区包含一个或多个氨基酸改变以增强抗原结合分子的多聚体的形成，并且其中与包含不含有一个或多个氨基酸改变的亲本Fc区的抗原结合分子相比，该抗原结合分子具有提高的胞质溶胶穿透能力。
[43]一种抗原结合分子，其包含第一和第二Fab区以及Fc区，其中
(a)第一Fab区特异性结合细胞表面抗原，
(b)第二Fab区包含(i)一对特异性结合胞质溶胶抗原的重链可变区(VH)和[1]至[11]中任一项的轻链可变区(VL)，和
(c)Fc区包含一个或多个氨基酸改变以增强抗原结合分子多聚体的形成。
[44][37]至[43]中任一项所述的抗原结合分子，其中包含[1]至[11-3]中任一项所述的轻链可变区的Fab区不结合细胞表面表达的不同于细胞表面抗原的抗原。
[45][37]至[44]中任一项所述的抗原结合分子，其中，细胞表面抗原是在靶细胞上特异性表达的抗原，并且其中抗原结合分子被特异性地递送到靶细胞的胞质溶胶中。
[46]药物组合物，其包含[37]至[45]中任一项的抗原结合分子和药学上可接受的载体。
[47]一种将[37]至[45]中任一项的抗原结合分子特异性地递送到靶细胞的胞质溶胶中的方法，其中，细胞表面抗原是在靶细胞上特异性表达的抗原。
[48]一种通过使用[37]至[45]中任一项的抗原结合分子以靶细胞特异性方式去除、抑制或激活胞质溶胶抗原的方法，其中细胞表面抗原是在靶细胞上特异性表达的抗原。
[49]一种用于诊断、预防或治疗受试者疾病的药物组合物，其中患病细胞表达[37]至[45]中任一项的抗原结合分子特异性结合的细胞表面抗原和胞质溶胶抗原，并且其中所述药物组合物包含[37]至[45]中任一项的抗原结合分子和药学上可接受的载体。
附图说明
[图1]图1显示了代表性hT4VL.FRv04变体的尺寸排阻色谱(SEC)色谱图。高单体峰百分比和尖锐的对称峰形(窄峰宽)表明具有良好的物理化学性质。表6中列出的所有突变变体都显示出更好的单体峰百分比和更尖锐的峰形，如图1所示。
[图2]图2显示在ASGPR表达HeLa细胞系(HeLa/ASGPR/BirA细胞)中双功能抗体的胞质溶胶运输的成像分析结果。具有抗ASGPR抗体(AGA0078)的双功能分子形式的选定抗体显示出比具有抗KLH抗体(IC17＝对照)的双功能分子形式的抗体更高的Alexa488荧光强度。这表明所选的双功能抗体可以通过ASGPR依赖性方式递送到HeLa/ASGPR/BirA细胞中，支持通过Split-NanoLuc测定法观察到的受体依赖性胞质溶胶运输(由ASGPR Ab介导的表达ASGPR的细胞特异性胞质溶胶运输)。
[图3]图3显示了在细胞表面固有表达IL6R的HepG2细胞中包含hT4VL变体和抗IL6R重链的双功能抗体的胞质溶胶运输的Split Nluc测定的结果。
[图4]图4是表示本发明的抗原结合分子的构思的示意图。在图4中，双功能抗体形式的抗原结合分子被显示以举例说明本公开的抗原结合分子的靶细胞特异性递送的构思。
[图5]图5是显示作为本公开的抗原结合分子的分子形式的示例的多价抗体的分子形式的示意图。
[图6]图6是显示本公开的抗原结合分子的示例性分子形式的示意图。抗原结合分子包含第一和第二Fab区。
[图7]图7是显示本公开的抗原结合分子的示例性分子形式的示意图。抗原结合分子包含第一和第二Fab区和单链单元。
[图8]图8是显示本公开的抗原结合分子的示例性分子形式的示意图。抗原结合分子包含第一和第二单域抗体可变区和单链单元。
[图9]图9是显示本公开的抗原结合分子的示例性分子形式的示意图。抗原结合分子具有DVD-Ig(注册商标)的分子形式。
[图10]图10是显示本公开的抗原结合分子的示例性分子形式的示意图。抗原结合分子包含第一、第二和第三Fab区。
[图11]图11是显示本公开的抗原结合分子的示例性分子形式的示意图。抗原结合分子包含第一、第二、第三和第四Fab区。
[图12]图12显示优化的抗体变体3D8H/hT4VL.FRv40563与包含相同野生型人IgG1恒定区的亲本3D8抗体(3D8H/hT4VL)的PK比较。
[图13]图13显示了包含胞质溶胶穿透性结构域(FRv40563)和细胞表面抗原结合结构域(抗ASGPR抗体，AGA0078)的双功能抗体的PK。FRv40563n//AGA0078p与其对照抗体FRv40563n//IC17p相比显示出更快的清除率，表明双功能抗体FRv40563n//AGA0078p可以通过ASGPR依赖性方式递送至肝脏。此外，FRv40563n//AGA0078p显示出比IC17n//AGA0078p更快的清除率。这可以支持体内ASGPR依赖性胞质溶胶运输。
具体实施方式
1.定义
用于本文目的的“受体人框架”是包含源自人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架，定义如下。“源自”人免疫球蛋白框架或人共有构架的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以包含氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸改变的数量是10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、或者2个或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
术语“抗原结合分子”在其最广义上是指特异性结合抗原决定簇的分子。在一个实施方案中，抗原结合分子是抗体、抗体片段、抗体的抗原结合片段或抗体衍生物。
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)或“每单位量配体的分析物结合量”表示。亲和力可以通过本领域已知的常用方法测量，包括本文所述的那些。以下描述用于测量亲和力的具体说明性和示例性实施方案。
“亲和力成熟”抗体是指与不具有此类改变的亲本抗体相比，在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，此类改变导致抗体对抗原的亲和力的改善。
“结合活性”是指分子(例如，抗体)的一个或多个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。在本文中，“结合活性”并不严格限于结合对成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用。例如，当结合对的成员能够进行单价结合和多价结合时，结合活性是每个结合强度的总和。分子X对其配偶体Y的结合活性通常可以用解离常数(KD)或“每单位量配体的结合分析物量”来表示。以下描述用于测量亲和力的具体说明性和示例性实施方案。
本文的术语“抗体”以最广义使用，包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多功能抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
如本文所用，“激动剂”抗原结合分子或“激动剂”抗体是显著增强其所结合的抗原的生物学活性的抗体。
如本文所用，“阻断性”抗原结合分子或“阻断性”抗体或“拮抗剂”抗原结合分子或“拮抗剂”抗体是显著抑制(部分地或完全地)其结合的抗原的生物学活性的抗体。
术语“抗体片段”和“抗原结合片段”是指完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv(VH和VL)、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；由抗体片段形成的多功能抗体和多特异性抗体。
与参考抗体“结合相同表位的抗体”是指在竞争测定中阻断参考抗体与其抗原结合50％或更多的抗体，反之，参考抗体在竞争测定中阻断抗体与其抗原结合50％或更多。本文提供了示例性竞争测定。
术语“嵌合”抗体是指其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源自不同来源或物种的抗体。
抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。抗体主要分为五类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
本文所用的术语“细胞毒剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于放射性同位素(例如，211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212Pb和Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如甲氨蝶呤、阿霉素、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，例如核酸分解酶；抗生素；毒素，例如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；以及下文公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。
“效应子功能”是指归因于抗体Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(如B细胞受体)的下调；和B细胞活化。
药剂(例如药物制剂)的“有效量”，是指在必要的剂量和时间段内达到所需治疗或预防效果的有效量。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，其包含至少一部分恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)或甘氨酸-赖氨酸(残基Gly446-Lys447)可以存在也可以不存在。除非另有说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基编号按照EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991中所述。
在本文中，Fc区或恒定区内的氨基酸改变或置换可以由EU编号系统和氨基酸的组合表示。例如，S424N代表在EU编号中位置424从丝氨酸(Ser)到天冬酰胺(Asn)的置换。EU424N代表在EU编号中位置424从氨基酸(任何类型)到天冬酰胺(Asn)的置换。
术语“Fc受体”或“FcR”是指结合抗体Fc区的受体。Fc受体是免疫细胞例如自然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞的表面上的一种蛋白质。Fc受体与附着在受感染细胞或入侵病原体上的抗体的Fc(可结晶片段)区结合，刺激吞噬细胞或细胞毒性细胞，从而通过抗体介导的吞噬作用或抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用破坏微生物或受感染的细胞。在一些实施方案中，FcR是天然人FcR。在一些实施方案中，FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，并且包括FcγRI，FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括那些受体的等位基因变体和可变(alternatively)剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，其主要区别在于其细胞质结构域。激活受体FcγRIIA在其细胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见，例如，Daeron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR在例如以下的文献中进行了综述：Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel等人,Immunomethods 4:25-34(1994)；和de Haas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。本文中的术语“FcR”涵盖其他FcR，包括将来将要被鉴定的那些。
术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))以及免疫球蛋白稳态的调节。测量与FcRn结合的方法是已知的(参见例如Ghetie和Ward.,Immunol.Today 18(12):592-598(1997)；Ghetie等人,Nature Biotechnology,15(7):637-640(1997)；Hinton等人,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216(2004)；WO 2004/92219(Hinton等人)。
可以例如在转基因小鼠或表达人FcRn的转染的人细胞系中，或在施用具有变体Fc区的多肽的灵长类动物中测定与人FcRn的体内结合和人FcRn高亲和力结合多肽的血浆半衰期。WO 2000/42072(Presta)描述了与FcR结合增加或减少的抗体变体。另见，例如，Shields等人J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
本文中的术语“包含Fc区的抗体”是指包含Fc区的抗体。Fc区的C端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)或C端甘氨酸-赖氨酸(残基446-447)可以被去除，例如，在抗体的纯化过程中或通过编码抗体的核酸的重组工程化。因此，包含具有根据本公开的Fc区的抗体的组合物可包含具有G446-K447、具有G446但不具有K447、所有G446-K447被去除的抗体，或上述三种类型抗体的混合物。
本文中的术语“Fc结构域的亚基”和“Fc亚基”表示形成二聚Fc区的两个多肽之一，换言之，能够稳定的自我缔合的包含免疫球蛋白重链的C端恒定区的多肽。例如，IgG的Fc结构域的亚基包含IgG CH2-和IgG CH3-恒定结构域。
“增强第一Fc亚基和第二Fc亚基缔合的修饰”是肽主链的工程化或Fc结构域亚基上的翻译后修饰，其减少或防止多肽与相同种类的多肽缔合，该多肽包含能够形成同源二聚体的Fc结构域亚基。本文中使用的缔合增强修饰包括单独的修饰，每个修饰是对需要缔合的两个Fc结构域亚基之一(即Fc结构域的第一和第二亚基)进行的，所述修饰彼此互补，从而增强两个Fc结构域亚基的缔合。例如，缔合增强修饰可以改变Fc结构域中一个或两者的结构或电荷，以使其缔合在空间或静电方面是理想的。因此，(异)二聚化发生在包含第一Fc结构域亚基的多肽和包含第二Fc结构域亚基的多肽之间，这些多肽可能是不同的，因为融合到每个亚基的其他成分(例如，抗原结合部分)是不相同。在一些实施方案中，缔合增强修饰包括Fc结构域内的氨基酸突变，特别是氨基酸置换。在某个实施方案中，缔合增强修饰在Fc结构域的两个亚基中的每一个中包含不同的氨基酸突变，特别是氨基酸置换。
在一个实施方案中，上述修饰是所谓的“杵臼(knob-into-hole)”修饰，包括在Fc结构域的两个亚基之一中的“杵”修饰和在Fc结构域的两个亚基中的另一个中的“臼”修饰。例如在美国专利号5,731,168中；美国专利号7,695,936；Ridgway等人,Prot Eng 9,617-621(1996)和Carter,JImmunol Meth 248,7-15(2001)中描述了杵臼技术。通常，该方法包括在第一多肽的界面处引入突起(杵)，并在第二多肽的界面处引入相应的空腔(臼)，以便突起可以填充到空腔中以增强异二聚体形成，同时防止同二聚体形成。可以通过用较大的侧链(例如酪氨酸(thyrosin)或色氨酸)置换来自第一多肽界面的氨基酸的小侧链来构建突起。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)置换较大的氨基酸侧链，可以在第二多肽的界面处产生与突起具有相同或更小尺寸的互补空腔。
“框架”或“FR”是指高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常以以下顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然的抗体结构基本相似的结构或具有包含本文定义的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换地使用，并且是指其中已引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的次数。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，但可以包含突变。本文中包括具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。
“人抗体”指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于由人或人细胞生成或来源于利用人抗体库或其它人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”是代表在人免疫球蛋白VL或VH框架序列选择中最常见的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。通常，序列亚组是Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,NIHPublication 91-3242,Bethesda MD(1991),第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，该亚组是上述Kabat等人中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是上述Kabat等人的亚组III。
“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个且通常为两个可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些FR。人源化抗体可任选地包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体例如非人抗体的“人源化形式”是指已经过人源化的抗体。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指在序列上高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上定义的环(“高变环”)和/或包含抗原接触残基(“抗原接触”)的抗体可变结构域的每个区域。通常，抗体包含六个HVR：VH中的三个(H1，H2，H3)和VL中的三个(L1，L2，L3)。本文中的示例性HVR包括：
(a)出现在氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)处的高变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；
(b)出现在氨基酸残基24-34(CDRL1)，50-56(CDRL2)，89-97(CDRL3)，31-35b(CDRH1)，50-65(CDRH2)和95-102(CDRH3)处的CDR(Kabat等人，Sequences of ProteinsofImmunological Interest,第五版.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991))；
(c)出现在氨基酸残基27c-36(L1)，46-55(L2)，89-96(L3)，30-35b(H1)，47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原接触(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；和
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)，47-56(L2)，48-56(L2)，49-56(L2)，26-35(H1)，26-35b(H1)，49-65(H2)，93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另有说明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如FR残基)在本文中根据Kabat等人编号,见上文。
“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒剂)缀合的抗体。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如牛、羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人类和非人类灵长类动物如猴子)、兔子和啮齿动物(例如小鼠和鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”抗体是已经从其自然环境的组分中分离出来的抗体。在一些实施方案中，通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如离子交换或反相HPLC)将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。关于抗体纯度评估方法的综述，参见例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“分离的”核酸是已经从其自然环境的组分中分离出来的核酸分子。分离的核酸包括包含在通常含有该核酸分子的细胞中的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置。
“编码胞质溶胶穿透性抗原结合分子的分离的核酸”是指一种或多种编码胞质溶胶穿透性抗原结合分子的核酸分子，包括携带在单一载体或分离载体上的核酸分子，和存在于宿主细胞内单个位点或多个位点的核酸分子。在TR胞质溶胶穿透性抗原结合分子是抗体的情况下，“编码胞质溶胶穿透性抗原结合分子的分离的核酸”是编码抗体的重链和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括携带在单一载体或分离载体上的核酸分子，以及存在于宿主细胞内单个位点或多个位点的核酸分子。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即构成该群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体(例如，包含天然发生突变或在单克隆抗体制备过程中产生)之外，此类变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群中获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本公开要使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有所有或一部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物，此类方法和其他用于制备单克隆抗体的示例性方法在本文中有所描述。
“裸抗体”是指未缀合异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
“天然的抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然的IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二硫化物键合的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N端到C端，每条重链都有可变区(VH)，也称为可变重结构域或重链可变结构域，后面跟着三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端到C端，每条轻链都有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，其后是恒定轻(CL)结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以被分配到称为κ和λ的两种类型中的一种。
术语“胞质溶胶穿透性抗原结合分子”或“胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段”是指抗原结合分子或胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其可穿透活细胞的胞质溶胶。穿透进入胞质溶胶的方式没有特别限制，抗原结合分子可以通过胞吞过程被摄取，然后通过核内体逃逸，或者可以经历其他过程。核内体逃逸以外的实例包括抗原结合分子直接穿透细胞膜的情况。相同的抗原结合分子可以通过两种方式穿透入胞质溶胶，即核内体逃逸和直接穿透细胞膜。已经报道了能够通过核内体逃逸以外的方法穿透胞质溶胶的抗原结合分子(例如，WO 2013102659)。在一个实施方案中，胞质溶胶穿透性抗原结合分子是抗体或抗体衍生物。在另一个实施方案中，胞质溶胶穿透性抗原结合分子包含胞质溶胶穿透性结构域。
术语“胞质溶胶穿透性结构域”和“具有胞质溶胶穿透能力/活性的区域”可互换使用，指允许穿透到活细胞胞质溶胶中的结构域。不希望受理论的限制，穿透到胞质溶胶的方式没有特别限制，可以是通过胞吞过程的摄取和随后的核内体逃逸，或者可以通过其他过程。从核内体中逃逸的方式没有特别限制。例如，转移到胞质溶胶中是通过核内体(酸性pH)中的胞质溶胶穿透性结构域与核内体膜相互作用以在核内体膜上形成孔来实现的。核内体逃逸以外的实例包括抗原结合分子直接穿透细胞膜的情况。相同的抗原结合分子可以通过两种方式穿透胞质溶胶，即核内体逃逸和直接穿透细胞膜。在一个实施方案中，胞质溶胶穿透性结构域具有核内体逃逸能力和细胞膜穿透能力中的一种或两种。在一个实施方案中，胞质溶胶穿透性结构域不具有被胞吞摄取的能力。在另一个实施方案中，胞质溶胶穿透性结构域具有被胞吞摄取的能力。胞质溶胶穿透性结构域可以是任何类型，只要其具有胞质溶胶穿透能力即可，但在一个优选实施方案中，胞质溶胶穿透性结构域是抗体或其片段。在胞质溶胶穿透性结构域是抗体或其片段的情况下，胞质溶胶穿透性结构域包括抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)的组合的全部或部分；或者单域抗体可变区，例如重链抗体可变区(重链抗体重链可变区:VHH)、抗体重链可变区(VH)、抗体轻链可变区(VL)，以及免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)的可变区(VNAR)。具有胞质溶胶穿透能力的抗体或其片段的实例包括，例如，包含显示胞质溶胶穿透能力的轻链可变区的Cytotransmab(NatCommun.2017年5月10日；8：15090)。胞质溶胶穿透性结构域的其他实例是“scFv(单链Fv)”、“单链抗体”、“Fv”、“scFv2(单链Fv2)”、“Fab”或“F(ab')2”，胞质溶胶穿透性结构域可以与具有细胞穿透活性的肽部分或核酸部分组合使用。具有细胞穿透活性的肽部分的实例包括细胞穿透肽(CPP)、蛋白质转导结构域(PTD)等(参见，例如，WO 2017156630)。具有细胞穿透活性的核酸部分的实例包括具有硫代磷酸酯主链的寡核酸(参见例如WO 2015031837)。
感兴趣结构域是否为胞质溶胶穿透性结构域(感兴趣结构域是否具有胞质溶胶穿透能力)可以通过本领域技术人员已知的各种方法来检查。例如，可以通过将感兴趣结构域与不具有胞质溶胶穿透能力的分子(例如，抗原结合分子)融合，将融合分子与细胞接触，然后查看融合分子是否在细胞的胞质溶胶中检测到来进行评估。已知有多种方法用于检测胞质溶胶中感兴趣分子的存在，例如，分别在以下参考实施例1和3中描述的使用splitNanoLuc(注册商标)系统的测定和使用荧光显微镜的成像分析是已知的。BirA测定和使用split GFP系统的测定也可用于检测胞质溶胶中感兴趣分子的存在。
在一个实施方案中，胞质溶胶穿透性结构域可以与细胞表面抗原和/或胞质溶胶抗原相互作用。
抗原结合分子的“胞质溶胶-运输”能力是指抗原结合分子运输到胞质溶胶的能力，术语“穿透”、“运输(traffic)”或“运输(traffick)”可互换使用。抗原结合分子的术语“胞质溶胶穿透能力/活性“胞质溶胶运输能力/活性”、“细胞质渗透性”和“对细胞质的渗透性”在本文中可互换地使用，以指抗原结合分子将自身从核内体转移到胞质溶胶中或运输到胞质溶胶的能力。
抗原结合分子(抗体)的“降低的细胞外基质(ECM)结合”或“较低的ECM结合”是指与参考抗体相比，抗原结合分子与ECM的结合降低。ECM(细胞外基质)是一种细胞外成分，存在于体内的不同部位。因此，已知与ECM强烈结合的抗体在血液中具有较差的动力学(较短的半衰期)(WO2012093704 A1)。因此，优选选择包含增强胞质溶胶穿透活性但不增加ECM结合的氨基酸置换的抗原结合分子作为出现在抗体文库中的抗原结合分子变体。
可以参考WO2012093704 A1通过以下程序评估每种抗体与ECM(细胞外基质)的结合：将ECM无酚红(BD Matrigel#356237)用TBS稀释至2mg/mL，并将5微升添加至在冰上冷却的ECL测定板(L15XB-3、MSD KK、高结合)的每个孔的中心。然后，将包被的板密封并在4℃下放置过夜。第二天在室温下进行测定。将150微升的ECL封闭缓冲液(补充有0.5％BSA和0.05％吐温20的PBS)添加到包被板的每个孔中，并将板在室温下静置2小时或更长时间。接下来，去除封闭缓冲液。每个抗体样品用ACES-T稀释至9微克/毫升，并用ECLDB(补充有0.1％BSA和0.01％吐温20的PBS)进一步稀释至3微克/毫升。将50微升稀释的抗体溶液加入每个孔中并在30℃下以600rpm振荡孵育1小时。然后通过轻敲倒置板取出样品。接下来，将50微升戊二醛添加到每个孔中以固定样品，并在室温下孵育10分钟。然后用PBS-T(补充有0.05％吐温20的PBS)洗涤孔三次。用ECLDB将二抗稀释至1微克/毫升，并将50微升二抗溶液添加到板的每个孔中。将板密封并在30℃下以600rpm避光孵育1小时。接下来，去除二抗溶液。用PBS-T再次洗涤板三次，然后加入READ缓冲液(MSD KK)，该缓冲液以150微升/孔加入，然后使用Sector Imager2400(MSD KK)立即检测发光信号。
术语抗原结合分子的“较低聚集趋势”是指与参考抗原结合分子相比，抗原结合分子彼此之间的自缔合，即单体之间的相互作用减少。对于每个变体，使用UPLC(Acquity H-Class bio，Waters)通过尺寸排阻色谱(SEC)分析评估聚集谱。50mM磷酸盐/300mM NaCl(pH7.0)用于运行缓冲液，BEH200柱(Waters，#186005225)用作分析柱。通过220nM UV吸收记录色谱图。使用Empower3软件(Waters)处理数据，并计算单体峰百分比和单体峰半峰的全宽。高单体峰百分比和尖锐的对称峰形(窄峰宽)被认为是良好的物理化学性质。
“融合(Fuse)/融合(fusing)/融合(fusing)”是指组分(例如Fab区和Fc结构域亚基)直接连接在一起或经由一个或多个肽接头通过肽键连接在一起。
术语“包装插页”用于指通常包含在治疗产品商业包装中的说明，其中包含有关使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、联合治疗、禁忌症和/或警告的信息。
相对于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在将所述序列进行比对并在必要时引入空位以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守置换视为序列同一性的一部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定百分比氨基酸序列同一性的比对可以用本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)软件或GENETYX(注册商标)(Genetyx Co.,Ltd.)。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在被比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，源代码已与用户文档一起提交给美国版权局，华盛顿特区，20559，其以美国版权注册号TXU510087被注册。ALIGN-2程序可从Genentech,Inc.,南旧金山，加利福尼亚州公开获得，或者可以从源代码编译。应编译ALIGN-2程序以在UNIX操作系统上使用，包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设定并且不会发生变化。
在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A相对于、和或针对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(可以备选地表述为给定氨基酸A相对于、和或针对给定氨基酸序列B具有或包括特定％氨基酸序列同一性)计算如下：
100乘以分数X/Y
其中X是序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，其中Y是B中氨基酸残基的总数。将理解，在氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等的情况下，A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有特别说明，本文使用的所有％氨基酸序列同一性值均如前段所述使用ALIGN-2计算机程序获得。
术语“药物制剂”是指这样的制剂，其形式允许包含在其中的活性成分的生物活性是有效的，并且不包含对该制剂将要施用至其的受试者具有不可接受的毒性的额外成分。
“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分以外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所用，“治疗(treatment")”(及其语法变体，例如“治疗(treat")”或“治疗(treating)”)是指临床干预以试图改变被治疗个体的自然过程，并且可以用于预防或在临床病理学过程期间进行。治疗的理想效果包括，但不限于，防止疾病发生或复发，缓和症状，减轻疾病的任何直接或间接病理学后果，预防转移，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和缓和或改善的预后。在一些实施方案中，本公开的抗原结合分子用于延迟疾病的发生或减缓疾病的进展。
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007))。单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域来分别筛选互补VL或VH结构域的文库，从而分离结合特定抗原的抗体。参见，例如，Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等，Nature 352：624-628(1991)。
本文所用的术语”载体”是指能够使与其相连的另一个核酸增殖的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入到已引入该载体的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们可操作连接的核酸的表达。这样的载体在本文中称为“表达载体”。
如本文所用，短语“实质上降低”、“实质上增加”或“实质上不同”是指两个数值之间足够高的差异程度(通常一个与分子相关，另一个与参考/比较物分子相关)使得本领域技术人员会认为这两个值之间的差异在通过所述值(例如，KD值)测量的生物学特性的背景下具有统计学显著性。
如本文所用，术语“实质上相似”、“实质上未改变”或“实质上相同”是指两个数值之间足够高的相似性程度(例如,一个与本公开的抗原分子相关，另一个与参考/比较物抗原结合分子相关)使得本领域技术人员会认为这两个值之间的差异在通过所述值(例如，KD值)测量的生物学特性的背景下几乎没有或没有生物学和/或统计学显著性。
本文使用的表述“实质上未检测到”是指某物处于或低于本领域技术人员已知的标准检测技术(例如，蛋白质印迹、毛细管免疫测定、荧光显微镜成像等)中的检测限，这意味着完全未检测到某物，或者即使检测到检测水平也接近背景或噪音。具体地，例如，当本公开的抗原结合分子的测量与阴性对照的测量值实质上类似或实质上相同时(例如，没有统计显著性)，则本公开的抗原结合分子被称为基本上未被检测到。
表述“实质上未递送”是指在用于检测递送的标准检测技术中实质上未检测到某物的递送。例如，对于递送到细胞的胞质溶胶中，当本公开的抗原结合分子或其复合物的量在已经与抗原结合分子或其复合物接触的细胞的胞质溶胶中与没有这种接触的细胞的胞质溶胶中的量实质上相似或实质上相同时(例如，没有统计学显著性)，抗原结合分子被认为实质上没有被递送到细胞的胞质溶胶中。
类似地，表述实质上不去除、抑制或活化是指在用于检测它们的标准检测技术中实质上检测不到去除、抑制、活化。例如，对于胞质溶胶抗原的去除、抑制、活化，在使用本公开的抗原结合分子或其复合物的情况下进行的测量与对照的测量实质上相似或实质上相同(例如，没有统计显著性)时，可以说胞质溶胶抗原实质上没有被去除、抑制或活化。
II.组合物和方法
在一个方面，本公开部分基于以下发现：包含轻链可变区的抗原结合分子(例如抗体)与已经存在的胞质溶胶穿透性抗体轻链可变区(h3D8抗体的VL：WO2016/013870中公开的hT4VL)相比具有改善的胞质溶胶穿透能力或活性。本公开内容还部分基于以下发现：具有改善的胞质溶胶穿透性抗体的抗原结合分子(抗体)进一步表现出改善的表达水平、降低的ECM(细胞外基质)结合和/或改善的由较低的聚集趋势指示的物理化学性质。在某些实施方案中，本文提供的胞质溶胶穿透性抗原结合分子(抗体)或其片段包含轻链可变区，该可变区包含hT4VL.FRv4(SEQ ID NO：4)的CDRL1、CDRL2和CDRL3，其与hT4VL的区别仅在于具有人Vκ3(VK3)FR3代替人Vκ1FR3，并且在选自CDRL1、CDRL2和CDRL3，优选CDRL1和CDRL3的至少一个中包含一个或多个氨基酸置换。在另一个方面，本文提供的多功能抗原结合分子包含胞质溶胶穿透性抗体或抗体片段、结合细胞表面抗原的抗体或抗体片段、和/或结合胞质溶胶抗原的抗体或抗体片段的组合。多功能抗原结合分子以靶细胞特异性方式递送到胞质溶胶中。在某些实施方案中，本文提供的多功能抗原结合分子包含细胞表面抗原结合结构域、胞质溶胶抗原结合结构域和包含上述轻链可变区的胞质溶胶穿透性结构域。本公开的抗原结合分子例如可用于诊断、预防或治疗由胞质溶胶抗原引起的疾病。
A-1示例性胞质溶胶穿透性抗原结合分子(抗体)
在一个实施方案中，本公开的抗原结合分子是具有改善的(增强的)胞质溶胶穿透能力(活性)的抗原结合分子。在一个实施方案中，与已经存在的细胞穿透抗体相比，本公开的胞质溶胶穿透性抗原结合分子更有效地递送(易位)至细胞质(cytol)。在一个实施方案中，与相同量的已经存在的胞质溶胶穿透性抗体的情况相比，当将固定量的本公开的胞质溶胶穿透性抗原结合分子施用于受试者或与细胞接触时，更大量的抗原结合分子被递送至靶细胞的胞质溶胶。在一个实施方案中，与已经存在的细胞穿透抗体相比，本公开的抗原结合分子进一步表现出改善的表达水平、降低的ECM(细胞外基质)结合和/或通过较低的聚集趋势指示的改善的物理化学性质。
在一个优选的实施方案中，本公开的胞质溶胶穿透性抗原结合分子包含轻链可变区，该可变区包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3(即，包含在SEQ IDNO：4中所示氨基酸序列中的CDRL1、CDRL2和CDRL3)，其中轻链可变区在选自CDRL1、CDRL2和CDRL3中的至少一个中包含一个或多个氨基酸置换。在一个进一步优选的实施方案中，轻链可变区在选自CDRL1和CDRL3的至少一个中包含一个或多个氨基酸置换。
在一个优选的实施方案中，轻链可变区在SEQ ID NO:4所示氨基酸序列中的Kabat编号位置24至34和89至97处包含一个或多个氨基酸置换。更优选地，一个或多个氨基酸置换位于SEQ ID NO:4所示氨基酸序列中的Kabat编号位置24至32和93至97处。
在一个优选的实施方案中，本公开的抗原结合分子的轻链可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸置换(根据Kabat编号的位置)：
在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列中，
(a)用A、D、E、F、G、H、I、L、N、Q、R、S、T、V或Y置换第24位的氨基酸K；
(b)用A、D、E、F、I、M、N、T、V或Y置换第25位的氨基酸S；
(c)用A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、R、T或V置换第26位的氨基酸S；
(d)用A、D、E、F、H、I、L、M、S或Y置换第27位的氨基酸Q；
(e)用D置换第27a位的氨基酸S；
(f)用I、P、Q、T或V置换第27b位的氨基酸L；
(g)用A、D、E、I、M、N、S、W或Y置换第27c位的氨基酸F；
(h)用A、D、E、F、H、N或Q置换第27d位的氨基酸N；
(i)用A、D、E、I、L、M、N、P、Q、T、V或Y置换第27e位的氨基酸S；
(j)用A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V、W或Y置换第27f位的氨基酸R；
(k)用E、H、I、Q、S、V、W或Y置换第28位的氨基酸T；
(l)用A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y置换第29位的氨基酸R；
(m)用A、D、E、F、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y置换第30位的氨基酸K；
(n)用D、M、S或T置换第31位的氨基酸N；
(o)用D、E、G、H或Q置换第32位的氨基酸Y；
(p)用H、I、T或Y置换第89位的氨基酸Q；
(q)用E、F或N置换第91位的氨基酸Y；
(r)用I、L、M、N、P、Q、S、T、V或W置换第93位的氨基酸Y；
(s)用A、D、E、F、G、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y置换第94位的氨基酸H；
(t)用A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y置换第95位的氨基酸M；
(u)用A、D、E、F、G、H、K、M、N、P、Q、S、T或V置换第96位的氨基酸Y；和
(v)用A、D、E、G、H、K、P、Q、R、S或V置换第97位的氨基酸T。
在一个优选实施方案中，与没有置换并且包含具有SEQ ID NO:4中所述氨基酸序列的轻链可变区的参考抗体或其片段相比，本公开的轻链可变区中的上述一个或多个氨基酸置换增强了抗体或其片段的胞质溶胶穿透活性。在一个进一步优选的实施方案中，与没有置换且包含具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的轻链可变区的参考抗体或其片段相比，本公开的抗体或其片段表现出至少1％、5％、8％、10％、12％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或500％或1000％增强的胞质溶胶穿透活性，优选如参考实施例1中所述使用Split Nluc测定确定的。在一个实施方案中，胞质溶胶穿透活性由抗体或其片段穿透进入细胞膜和/或核内体逃逸介导。
在一个优选的实施方案中，本公开的轻链可变区包含一个、两个、三个或更多个选自由以下组成的组的氨基酸置换(根据Kabat编号的位置)：
在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列中，
(a)用N置换第24位的氨基酸K；
(b)用E置换第27位的氨基酸Q；
(c)用D置换第27a位的氨基酸S；
(d)用D或E置换第27d位的氨基酸N；
(e)用D或E置换第27e位的氨基酸S；
(f)用D、H、K、L、S或V置换第27f位的氨基酸R；
(g)用D置换第28位的氨基酸T；
(h)用E、G、M或S置换第29位的氨基酸R；
(i)用L或Q置换第30位的氨基酸K；
(j)用E置换第32位的氨基酸Y；
(k)用H、I、T或Y置换第89位的氨基酸Q；
(l)用E、F或N置换第91位的氨基酸Y；
(m)用E置换第93位的氨基酸Y；
(n)用E、P或Q置换第94位的氨基酸H；
(o)用D、N或P置换第95位的氨基酸M；和
(p)用E或P置换第96位的氨基酸Y。
在一个优选的实施方案中，本公开的轻链可变区包含自由以下组成的组的氨基酸置换的组合(根据Kabat编号的位置)：
(a)S27eD/R27fK；
(b)S27eD/R27fH；
(c)N27dE/S27eD；
(d)S27eD/T28D；
(e)S27eD/R29E；
(f)S27eD/R29S；
(g)K24N/S27eD；
(h)N27dD/R27fK；
(i)N27dE/R27fK；
(j)R27fK/T28D；
(k)R27fK/R29E；
(l)R27fK/R29S；
(m)K24N/R27fK；
(n)K24N/N27dD；
(o)N27dD/T28D；
(p)N27dD/R29E；
(q)N27dD/R29S；
(r)S27eD/Q89H；
(s)N27dD/Q89H；
(t)R27fK/Q89H；
(u)S27eD/Y91E；
(v)N27dD/Y91E；
(w)R27fK/Y91E；
(x)Q89H/H94P；
(y)Y91E/H94P；
(z)H94P/M95N；
(aa)H94P/M95D；
(bb)H94P/M95P；
(cc)H94E/Y96P；
(dd)H94E/M95N；
(ee)H94E/M95D；
(ff)H94E/M95P；
(gg)N27dE/R27fK/Q89H/H94E/M95P；
(hh)N27dE/R27fK/Q89Y/H94E/M95P；
(ii)N27dE/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
(jj)N27dE/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
(kk)N27dE/R27fS/Q89H/H94E/M95P；
(ll)N27dE/R27fS/Q89Y/H94E/M95P；
(mm)N27dE/R27fS/Y91E/H94E/M95P；
(nn)N27dE/R27fS/Y91F/H94E/M95P；
(oo)N27dE/R27fS/Q89H/H94Q/M95P；
(pp)N27dE/R27fS/Q89Y/H94Q/M95P；
(qq)N27dE/R27fS/Y91E/H94Q/M95P；
(rr)N27dE/R27fS/Y91F/H94Q/M95P；
(ss)N27dE/R27fV/Q89H/H94E/M95P；
(tt)N27dE/R27fV/Q89Y/H94E/M95P；
(uu)N27dE/R27fV/Y91E/H94E/M95P；
(vv)N27dE/R27fV/Y91F/H94E/M95P；
(ww)N27dE/R29S/Q89H/H94E/M95P；
(xx)N27dE/R29S/Q89Y/H94E/M95P；
(yy)N27dE/K30L/Q89H/H94E/M95P；
(zz)N27dE/K30L/Q89Y/H94E/M95P；
(aaa)S27eD/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
(bbb)S27eD/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
(ccc)S27eD/R27fK/Y91E/H94Q/M95P；
(ddd)S27eD/R27fK/Y91F/H94Q/M95P；
(eee)S27eD/R27fK/Y91E/H94Q；
(fff)S27eD/R27fK/Y91F/H94Q；
(ggg)S27eE/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
(hhh)S27eE/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
(iii)S27eE/R27fK/Y91E/H94Q/M95P；
(jjj)S27eE/R27fK/Y91F/H94Q/M95P；
(kkk)R27fS/R29S/Q89H/H94E/M95P；
(lll)R27fS/R29S/Q89Y/H94E/M95P；
(mmm)R27fS/R29S/Y91E/H94E/M95P；
(nnn)R27fS/R29S/Y91F/H94E/M95P；
(ooo)R27fS/R29S/Q89H/H94Q/M95P；
(ppp)R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P；
(qqq)R27fS/R29S/Y91E/H94Q/M95P；
(rrr)R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P；
(sss)N27dE/R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P；和
(ttt)N27dE/R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P。
在一个优选的实施方案中，本公开的轻链可变区包含人框架区(FR(s))。在某些实施方案中，轻链可变区根据Kabat编号包含位置2的氨基酸I和/或位置3的氨基酸Q。
在一个优选的实施方案中，本公开的轻链可变区可包含人Vκ1、Vκ2或Vκ3FR1序列。更优选地，轻链可变区包含人Vκ1FR1序列。在一个优选的实施方案中，轻链可变区可包含人Vκ1、Vκ2或Vκ3FR2序列。更优选地，轻链可变区包含人Vκ1FR2序列。在一个优选的实施方案中，轻链可变区可包含人Vκ1、Vκ2或Vκ3FR3序列。更优选地，轻链可变区包含人Vκ1FR3序列。在一个进一步优选的实施方案中，轻链可变区包含人Vκ1FR1、人Vκ1FR2和人Vκ3FR3序列。
在一个优选的实施方案中，本公开的轻链可变区包含一个、两个、三个或四个包含在SEQ ID NO:123中的FR结构域(FR1、FR2、FR3和FR4)。
在一个优选实施方案中，本发明的轻链可变区还包括CDRL2中的一个、两个、三个或更多个氨基酸置换。在一个优选的实施方案中，一个、两个、三个或更多个氨基酸置换位于SEQ ID NO:4所示氨基酸序列中的Kabat编号位置50-56。在一个具体的实施方案中，CDRL2中一个、两个、三个或更多个氨基酸置换选自由以下组成的组(根据Kabat编号的位置)：
在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列中，
(a)用A、G、I、T或V置换第50位的氨基酸W；
(b)用F或I置换第52位的氨基酸S；
(c)用N或Y置换第53位的氨基酸T；和
(d)用K或V置换第54位的氨基酸R。
在一些实施方案中，本公开的轻链可变区包含自由以下组成的组的氨基酸置换的组合(根据Kabat编号的位置)：
在SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中的
(a)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50A/Y91F/H94Q；
(b)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50G/Y91F/H94Q；
(c)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/Y91F/H94Q；
(d)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50T/Y91F/H94Q；
(e)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50V/Y91F/H94Q；
(f)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52F/Y91F/H94Q；
(g)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52I/Y91F/H94Q；
(h)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53N/Y91F/H94Q；
(i)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53Y/Y91F/H94Q；
(j)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/R54K/Y91F/H94Q；
(k)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/S52F/Y91F/H94Q；
(l)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/T53N/Y91F/H94Q；和
(m)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/R54V/Y91F/H94Q。
在一个优选的实施方案中，本公开的胞质溶胶穿透性抗原结合分子包含具有选自由SEQ ID NO：14-150和161-173组成的组的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，产生的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段包含具有选自由SEQ ID NO：123-150组成的组的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，产生的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段包含具有选自由SEQ ID NO：161-173组成的组的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个进一步优选的实施方案中，本发明的胞质溶胶穿透性抗原结合分子可以是scFv(单链Fv)、单链抗体、Fv、scFv2(单链Fv2)、Fab或F(ab')2的形式。在一个进一步优选的实施方案中，本公开的胞质溶胶穿透性抗原结合分子可以是Fab或scFv的形式。
在一个优选实施方案中，本公开的胞质溶胶穿透性分子还包含重链可变区。本公开的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段还可以包含单域抗体可变区，例如VHH。
A-2具有胞质溶胶穿透能力的示例性多功能抗原结合分子
在一些实施方案中，本公开的胞质溶胶穿透性抗原结合分子是多功能抗原结合分子(抗体)。在一个实施方案中，多功能抗原结合分子包含细胞表面抗原结合结构域、胞质溶胶抗原结合结构域和包含上述轻链可变区的胞质溶胶穿透性结构域。
在一个优选的实施方案中，本发明的多功能抗原结合分子不与细胞表面表达的不同于前述细胞表面抗原的抗原结合。在一个优选的实施方案中，胞质溶胶抗原结合结构域和/或胞质溶胶穿透性结构域(i)不结合在细胞表面上表达并且不同于上述细胞表面抗原的抗原；或(ii)不与细胞表面表达的任何抗原结合。
已知一种已经存在的细胞穿透抗体Tmab4(重链：3D8，轻链：hT4VL)通过细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)依赖性胞吞作用摄取到细胞内核内体中，在核内体的酸性pH下经历轻链的结构变化并开始与核内体膜相互作用以在膜上产生孔，从而实现向胞质溶胶的易位(J Control Release.2016年8月10日；235:165 -175)。另据报道，与HSPG结合减少的抗体(Tmab4-03(重链：3D8，轻链：hT4VL.03))已失去通过胞吞作用摄取的能力，同时在pH5.5下保持成孔能力。(J Control Release.2016年8月10日；235:165-175)。这意味着Tmab4-03，就目前的形式而言，无法以细胞特异性方式实现易位到细胞中。此外，预期通过Tmab4与核内体膜上分子相互作用的膜变形对于允许在核内体膜中形成孔至关重要(PNAS,2011年10月108；41；16883-16888)。因此，在一个实施方案中，希望有与核内体膜相互作用的多价胞质溶胶穿透性结构域，以提高胞质溶胶穿透能力。
另一方面，如上所述，Tmab4通过在上皮细胞上普遍表达的HSPG进行胞吞，因此，难以以靶细胞特异性方式递送胞质溶胶抗原结合抗体。换句话说，预期在全身施用后胞质溶胶抗原结合抗体向靶组织的递送将是低的。鉴于此，在一个实施方案中，本发明人想到利用单价胞质溶胶穿透性结构域抑制非特异性摄取，添加靶细胞表面结合结构域以提高靶标特异性，同时，创造抗体和核内体膜以多价方式发生相互作用的条件，以保持或改善胞质溶胶穿透能力。
不同于上述已经存在的抗体，在一个实施方案中，本公开的胞质溶胶穿透性抗原结合分子包含细胞表面抗原结合结构域、胞质溶胶抗原结合结构域和胞质溶胶穿透性结构域。因此，在一个实施方案中，对于本公开的胞质溶胶穿透性抗原结合分子，预期其结合靶细胞上的细胞表面抗原，从而以靶细胞特异性方式经历胞吞，然后易位本身从核内体进入胞质溶胶。在一个实施方案中，与已经存在的胞质溶胶穿透性抗体相比，本公开的胞质溶胶穿透性抗原结合分子被更有选择性地递送到靶细胞的胞质溶胶中。在一个实施方案中，与相同量的已经存在的胞质溶胶穿透性抗体的情况相比，当将固定量的本公开的胞质溶胶穿透性抗原结合分子施用或与受试者接触时，更大量的抗原结合分子被递送至靶细胞的胞质溶胶。在一个实施方案中，本公开的胞质溶胶穿透性抗原结合分子被特异性递送到靶细胞的胞质溶胶中，而实质上不被递送到不表达所述抗原结合分子所特异性结合的细胞表面抗原的细胞。在一个实施方案中，当本公开的胞质溶胶穿透性抗原结合分子用作药物时，与已经存在的胞质溶胶穿透性抗体相比，胞质溶胶穿透性抗原结合分子发挥更强的药效和/或引起较小的副作用。在一个实施方案中，与包含已有的胞质溶胶穿透性抗体的药物组合物相比，包含本公开的胞质溶胶穿透性抗原结合分子的药物组合物可以以更小的施用量和/或更少的施用次数发挥药效。
在一个进一步优选的实施方案中，本公开的多功能胞质溶胶穿透性抗原结合分子可以是下述分子形式1至8中的任一种。
1.包含第一和第二Fab区的胞质溶胶穿透性抗原结合分子(图4和图6)
在本公开的一个优选实施方案中，胞质溶胶穿透性抗原结合分子包含第一和第二Fab区。
在某个实施方案中，(a)第一Fab区特异性结合细胞表面抗原；(b)第二Fab区包含一对特异性结合胞质溶胶抗原的重链可变区(VH)和具有胞质溶胶穿透能力的轻链可变区(VL)。
在另一个特定实施方案中，(a)第一Fab区包含一对特异性结合细胞表面抗原的重链可变区(VH)和具有胞质溶胶穿透能力的轻链可变区(VL)，(b)所述第二Fab区包括一对特异性结合胞质溶胶抗原的重链可变区(VH)和具有胞质溶胶穿透能力的轻链可变区(VL)。
这些实施方案中的胞质溶胶穿透性抗原结合分子可进一步包含Fc区，并且Fc区可包含增强第一Fc亚基和第二Fc亚基的缔合的修饰。
这些实施方案中的胞质溶胶穿透性抗原结合分子所包含的具有胞质溶胶穿透能力的轻链可变区(VL)如“A-1示例性胞质溶胶穿透性抗原结合分子(抗体)”中所定义。
2.包含第一和第二Fab区和单链单元的胞质溶胶穿透性抗原结合分子(图7)
在本公开的一个优选实施方案中，胞质溶胶穿透性抗原结合分子包含第一和第二Fab区和单链单元。
在某个实施方案中，(a)第一Fab区特异性结合细胞表面抗原；(b)第二Fab区具有胞质溶胶穿透能力；(c)单链单元特异性结合胞质溶胶抗原。
在另一个特定的实施方案中，(a)第一Fab区特异性结合胞质溶胶抗原；(b)第二Fab区具有胞质溶胶穿透能力；(c)单链单元特异性结合细胞表面抗原。
在又一个特定的实施方案中，(a)第一Fab区特异性结合细胞表面抗原；(b)第二Fab区特异性结合胞质溶胶抗原；(c)单链单元具有胞质溶胶穿透能力。
在又一个特定实施方案中，(a)第一和第二Fab区包含一对特异性结合细胞表面抗原的重链可变区(VH)和具有胞质溶胶穿透能力的轻链可变区(VL)。
在某个实施方案中，单链单元融合至(i)第一Fab区的重链可变区(VH)的N端和/或第二Fab区的重链可变区(VH)的N端；(ii)第一Fab区的轻链可变区(VL)的N端和/或第二Fab区的轻链可变区的N端；或(iii)第一Fab区的轻链恒定区(CL)的C端和/或第二Fab区的轻链恒定区(CL)的C端。
这些实施方案中的胞质溶胶穿透性抗原结合分子可进一步包含含有第一Fc亚基和第二Fc亚基的Fc区，并且单链单元可融合至(i)第一Fc亚基的C端或(ii)第二Fc亚基的C端。第一Fc亚基和第二Fc亚基可以是IgG抗体的重链恒定区CH2和CH3结构域，并且可以包含增强第一Fc亚基和第二Fc亚基缔合的修饰。
在这些实施方案中的胞质溶胶穿透性抗原结合分子中包含的单链单元可以是单域抗体可变区或单链抗体(scFv)。单域抗体可变区的实例包括但不限于重链抗体可变区(VHH)、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)和免疫球蛋白新抗原受体(VNAR)的可变区。
这些实施方案中的胞质溶胶穿透性抗原结合分子所包含的具有胞质溶胶穿透能力的轻链可变区(VL)如“A-1示例性胞质溶胶穿透性抗原结合分子(抗体)”中所定义。这些实施方案中的胞质溶胶穿透性抗原结合分子中包含的具有胞质溶胶穿透能力的Fab区和具有胞质溶胶穿透能力的单链单元还包含具有胞质溶胶穿透能力的轻链可变区。
3.胞质溶胶抗原结合分子包含第一和第二单域抗体可变区和单链单元(图8)。
在本公开的一个优选实施方案中，胞质溶胶穿透性抗原结合分子包含第一和第二单域-抗体可变区和单链单元。
在某个实施方案中，(a)第一单域抗体可变区特异性结合细胞表面抗原；(b)第二单域抗体可变区具有胞质溶胶穿透能力；(c)单链单元特异性结合胞质溶胶抗原。在某个实施方案中，单链单元融合到第一单域抗体可变区的N端和/或第二单域抗体可变区的N端。
这些实施方案中的胞质溶胶穿透性抗原结合分子可进一步包含含有第一Fc亚基和第二Fc亚基的Fc区，并且单链单元可融合至(i)第一Fc亚基的C端或(ii)第二Fc亚基的C端。第一Fc亚基和第二Fc亚基可以是IgG抗体的重链恒定区CH2和CH3结构域，并且可以包含增强第一Fc亚基和第二Fc亚基缔合的修饰。
在这些实施方案中的胞质溶胶穿透性抗原结合分子中包含的单链单元可以是单域抗体可变区或单链抗体(scFv)。单域抗体可变区的实例包括但不限于重链抗体可变区(VHH)、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)和免疫球蛋白新抗原受体(VNAR)的可变区。
这些实施方案中的胞质溶胶穿透性抗原结合分子中包含的具有胞质溶胶穿透能力的单域抗体可变区包含如A-1示例性胞质溶胶穿透性抗原结合分子(抗体)中所定义的具有胞质溶胶穿透能力的轻链可变区(VL)。
4.具有DVD-Ig(注册商标)的分子形式的胞质溶胶穿透性抗原结合分子(图9)
在一个优选的实施方案中，本公开的胞质溶胶穿透性抗原结合分子包含第一和第二多肽链并且具有称为DVD-Ig(注册商标)的分子形式。
在某个实施方案中，(a)第一多肽链包含第一VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是特异性结合胞质溶胶抗原的第一重链可变区，VD2是特异性结合细胞表面抗原的第二重链可变区，C为重链恒定区CH1，X1为CH1以外的接头，X2为Fc区，并且n为0或1；
(b)第二多肽链包含第二VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是特异性结合胞质溶胶抗原的第一轻链可变区，VD2是特异性结合细胞表面抗原的第二轻链可变区，C是轻链恒定区CL，X1是除CL之外的接头，X2不包含Fc区，并且n是0或1。在另一个特定的实施方案中，(a)第一多肽链包含第一VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是具有胞质溶胶穿透能力的第一重链可变区，VD2是特异性结合细胞表面抗原的第二重链可变区，C为重链恒定区CH1，X1为除CH1之外的接头，X2为Fc区，并且n为0或1；(b)第二多肽链包含第二VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1为具有胞质溶胶穿透能力的第一轻链可变区，VD2为特异性结合细胞表面抗原的第二轻链可变区，C为轻链恒定区CL，X1为除CL之外的接头，X2不包含Fc区，并且n为0或1。
在又一个特定实施方案中，(a)第一多肽链包含第一VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是特异性结合细胞表面抗原的第一重链可变区，VD2为特异性结合胞质溶胶抗原的第二重链可变区，C为重链恒定区CH1，X1为除CH1之外的接头，X2为Fc区，并且n为0或1；(b)第二多肽链包含第二VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是特异性结合细胞表面抗原的第一轻链可变区，VD2是具有胞质溶胶穿透能力的第二轻链可变区，C为轻链恒定区CL，X1为除CL之外的接头，X2不包含Fc区，并且n为0或1。
这些实施方案中的胞质溶胶穿透性抗原结合分子所包含的具有胞质溶胶穿透能力的轻链可变区如A-1示例性胞质溶胶穿透性抗原结合分子(抗体)中所定义。
5.包含第一、第二和第三Fab区的胞质溶胶穿透性抗原结合分子(图10)
在一个优选的实施方案中，本公开的胞质溶胶穿透性抗原结合分子包含第一、第二和第三Fab区。
在某个实施方案中，(a)第一Fab区特异性结合细胞表面抗原；(b)第二和第三Fab区包含一对特异性结合胞质溶胶抗原的重链可变区和具有胞质溶胶穿透能力的轻链可变区；(c)Fc区包含第一Fc亚基和第二Fc亚基；(d)第一Fab区重链的C端融合到第一Fc亚基的N端，第二Fab区重链的C端融合到第二Fc亚基的N端,并且第三Fab区重链的C端融合到第二Fab区重链的N端。
在另一特定实施方案中，(a)第一和第三Fab区包含一对特异性结合胞质溶胶抗原的重链可变区和具有胞质溶胶穿透能力的轻链可变区；(b)第二Fab区特异性结合细胞表面抗原；(c)Fc区包含第一Fc亚基和第二Fc亚基；(d)第一Fab区重链的C端融合到第一Fc亚基的N端，第二Fab区重链的C端融合到第二Fc亚基的N端,并且第三Fab区重链的C端融合到第二Fab区重链的N端。
在又一特定实施方案中，(a)第一Fab区和第二Fab区包含一对特异性结合胞质溶胶抗原的重链可变区和具有胞质溶胶穿透能力的轻链可变区；(b)第三Fab区特异性结合细胞表面抗原；(c)Fc区包含第一Fc亚基和第二Fc亚基；(d)第一Fab区重链的C端融合到第一Fc亚基的N端，第二Fab区重链的C端融合到第二Fc亚基的N端,并且第三Fab区重链的C端融合到第二Fab区重链的N端。
在某个实施方案中，第一Fab区和/或第二Fab区包含选自以下的任意一个交换：(i)Fab轻链可变区(VL)和Fab重链可变区(VH)之间的交换；(ii)Fab轻链恒定区(CL)和Fab重链恒定区(CHl)之间的交换；和(iii)Fab轻链(VL-CL)和Fab重链(VH-CH1)之间的交换，并且第一Fab区和第二Fab区不包含相同的交换。
在这些实施方案中，第一Fc亚基和第二Fc亚基可以是IgG抗体的重链恒定区CH2和CH3结构域，并且可以包含增强第一Fc亚基和第二Fc亚基缔合的修饰。
这些实施方案中的胞质溶胶穿透性抗原结合分子所包含的具有胞质溶胶穿透能力的轻链可变区(VL)如A-1示例性胞质溶胶穿透性抗原结合分子(抗体)中所定义。
6.胞质溶胶穿透性抗原结合分子包含第一、第二、第三和第四Fab区(图11)。
在一个优选的实施方案中，本公开的胞质溶胶穿透性抗原结合分子包含第一、第二、第三和第四Fab区。
在某个实施方案中，(a)选自第一、第二、第三和第四Fab区的一个Fab区特异性结合细胞表面抗原；(b)除了(a)之外的三个Fab区包含一对特异性结合胞质溶胶抗原的重链可变区和具有胞质溶胶穿透能力的轻链可变区；(d)Fc区包含第一Fc亚基和第二Fc亚基；(e)第一Fab区重链的C端融合到第一Fc亚基的N端，第二Fab区重链的C端融合到第二Fc亚基的N端,第三Fab区重链的C端融合到第一Fab区重链的N端，并且第四Fab区重链的C端融合到第二Fab区重链的N端。
在另一个特定的实施方案中，(a)选自第一、第二、第三和第四Fab区的两个Fab区特异性结合细胞表面抗原；(b)除了(a)之外的两个Fab区包含一对特异性结合胞质溶胶抗原的重链可变区和具有胞质溶胶穿透能力的轻链可变区；(d)Fc区包含第一Fc亚基和第二Fc亚基；(e)第一Fab区重链的C端融合到第一Fc亚基的N端，第二Fab区重链的C端融合到第二Fc亚基的N端,第三Fab区重链的C端融合到第一Fab区重链的N端，并且第四Fab区重链的C端融合到第二Fab区重链的N端。
在另一个特定的实施方案中，(a)选自第一、第二、第三和第四Fab区的三个Fab区特异性结合细胞表面抗原；(b)除了(a)之外的一个Fab区包含一对特异性结合胞质溶胶抗原的重链可变区和具有胞质溶胶穿透能力的轻链可变区；(d)Fc区包含第一Fc亚基和第二Fc亚基；(e)第一Fab区重链的C端融合到第一Fc亚基的N端，第二Fab区重链的C端融合到第二Fc亚基的N端,第三Fab区重链的C端融合到第一Fab区重链的N端，并且第四Fab区重链的C端融合到第二Fab区重链的N端。
在某个实施方案中，第一Fab区和/或第二Fab区包含选自以下的任意一个交换：(i)Fab轻链可变区(VL)和Fab重链可变区(VH)之间的交换；(ii)Fab轻链恒定区(CL)和Fab重链恒定区(CHl)之间的交换；(iii)Fab轻链(VL-CL)和Fab重链(VH-CH1)之间的交换，并且第一Fab区和第二Fab区不包含相同的交换。
在另一个特定实施方案中，第三Fab区和/或第四Fab区包含选自以下的任意一个交换：(i)Fab轻链可变区(VL)和Fab重链可变区(VH)之间的交换；(ii)Fab轻链恒定区(CL)和Fab重链恒定区(CHl)之间的交换；(iii)Fab轻链(VL-CL)和Fab重链(VH-CH1)之间的交换，并且第三Fab区和第四Fab区不包含相同的交换。
在这些实施方案中，第一Fc亚基和第二Fc亚基可以是IgG抗体的重链恒定区CH2和CH3结构域，并且可以包含增强第一Fc亚基和第二Fc亚基缔合的修饰。
这些实施方案中的胞质溶胶穿透性抗原结合分子所包含的具有胞质溶胶穿透能力的轻链可变区(VL)如A-1示例性胞质溶胶穿透性抗原结合分子(抗体)中所定义。
7.胞质溶胶穿透性抗原结合分子，其包含增强多聚体形成的改变的Fc区(图5)
在一个优选的实施方案中，本公开的胞质溶胶穿透性抗原结合分子包含具有胞质溶胶穿透能力的区域和Fc区，该Fc区包含一个或多个氨基酸改变以增强抗原结合分子的多聚体的形成，其中，与包含亲本Fc区(其不包含一个或多个氨基酸改变)的胞质溶胶穿透性抗原结合分子相比，所述抗原结合分子具有提高的胞质溶胶穿透能力。胞质溶胶穿透性抗原结合分子还可以包含细胞表面抗原结合结构域和胞质溶胶抗原结合结构域。
在某个实施方案中，胞质溶胶穿透性抗原结合分子包含第一和第二Fab区以及Fc区，并且(a)第一Fab区特异性结合细胞表面抗原；(b)第二Fab区包括一对特异性结合胞质溶胶抗原的重链可变区(VH)和具有胞质溶胶穿透能力的轻链可变区(VL)；(c)Fc区包含一个或多个氨基酸改变以增强抗原结合分子的多聚体的形成。与包含亲本Fc区(其不包含一个或多个氨基酸改变)的胞质溶胶穿透性抗原结合分子相比，包含此类改变的Fc区的胞质溶胶穿透性抗原结合分子具有提高的胞质溶胶穿透能力，并且可允许形成包含多个胞质溶胶穿透性抗原结合分子的胞质溶胶穿透性抗原结合分子的多聚体复合物。
多聚体可以是二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或六聚体。氨基酸改变可以是组合E345R/E430G/S440Y或组合T437R/K248E(数字代表根据EU编号的置换位置)。
在这些实施方案中，第一Fc亚基和第二Fc亚基可以是IgG抗体的重链恒定区CH2和CH3结构域，并且可以包含增强第一Fc亚基和第二Fc亚基缔合的修饰。
这些实施方案中的胞质溶胶穿透性抗原结合分子所包含的具有胞质溶胶穿透能力的轻链可变区(VL)如A-1示例性胞质溶胶穿透性抗原结合分子(抗体)中所定义。
8.与异源部分缀合的胞质溶胶穿透性抗原结合分子
在一个方面，本公开的抗原结合分子是缀合至异源部分的胞质溶胶穿透性抗原结合分子。在一个实施方案中，本公开的胞质溶胶穿透性抗原结合分子包含细胞表面抗原结合结构域和胞质溶胶穿透性结构域，并且不包含胞质溶胶抗原结合结构域。在一个优选的实施方案中，本发明的胞质溶胶穿透性抗原结合分子不与在细胞表面上表达并且不同于前述细胞表面抗原的抗原结合。在一个优选的实施方案中，胞质溶胶穿透性结构域和/或异源部分(i)不结合在细胞表面上表达并且不同于上述细胞表面抗原的抗原；(ii)不与细胞表面表达的任何抗原结合。
在一个方面，如上所述，本发明人想到利用单价胞质溶胶穿透性结构域抑制非特异性摄取，添加靶细胞表面结合结构域以提高靶标特异性，同时，创造抗体和核内体膜以多价方式发生相互作用的条件，以保持或改善胞质溶胶穿透能力。
在一个实施方案中，本公开的胞质溶胶穿透性抗原结合分子包含细胞表面抗原结合结构域和胞质溶胶穿透性结构域。因此，在一个实施方案中，对于本公开的胞质溶胶穿透性抗原结合分子，预期其结合靶细胞上的细胞表面抗原，从而以靶细胞特异性方式经历胞吞，然后易位本身从核内体进入胞质溶胶，从而将异源部分传递到胞质溶胶中。
在一个实施方案中，与已经存在的胞质溶胶穿透性抗体相比，本公开的胞质溶胶穿透性抗原结合分子被更有选择性地递送到靶细胞的胞质溶胶中，使得本公开的胞质溶胶穿透性抗原结合分子可以更有选择性地将异源部分递送到靶细胞的胞质溶胶中。在一个实施方案中，与缀合到已经存在的胞质溶胶穿透性抗体的相同量的异源部分的情况相比，当将固定量的本公开的胞质溶胶穿透性抗原结合分子施用或与受试者接触时，更大量的缀合到胞质溶胶穿透性抗原结合分子的异源部分被递送至靶细胞的胞质溶胶。在一个实施方案中，缀合到本公开的胞质溶胶穿透性抗原结合分子的异源部分被特异性递送到靶细胞的胞质溶胶中，而实质上不被递送到不表达抗原结合分子所特异性结合的细胞表面抗原的细胞。
在一个实施方案中，当本公开的胞质溶胶穿透性抗原结合分子用作药物时，与缀合到已经存在的胞质溶胶穿透性抗体的异源部分相比，缀合到胞质溶胶穿透性抗原结合分子的异源部分发挥更强的药效和/或引起较小的副作用。在一个实施方案中，与包含缀合到已有的胞质溶胶穿透性抗体的异源部分的药物组合物相比，包含缀合到胞质溶胶穿透性抗原结合分子的异源部分的药物组合物可以以更小的施用量和/或更少的施用次数发挥药效。
在一个实施方案中，胞质溶胶穿透性抗原结合分子包含第一和第二Fab区，其中(a)第一Fab区特异性结合细胞表面抗原，和(b)第二Fab区具有细胞质穿透能力，并且其中抗原结合分子缀合至异源部分。在一个优选的实施方案中，异源部分缀合至抗原结合分子的L链的C-端(优选地，生物素化的C-端)。
在一个实施方案中，与胞质溶胶穿透性抗原结合分子缀合的异源部分是肽、核酸、化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素、细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素。在一个实施方案中，异源部分是肽。
A-3
在进一步的方面，根据上述任一实施方案的抗原结合分子可包含下述任何特征。
术语“抗原结合结构域”和“(抗体的)抗原结合片段”在本文中可互换使用，指抗原结合分子(抗体)的一部分，该部分包含特异性结合并互补于抗原的全部或部分的区域。如果抗原具有高分子量，则抗原结合结构域可以仅结合抗原的特定部分。该特定部分称为“表位”。抗原结合结构域可以具有一个或多个抗体可变结构域。在一个优选的实施方案中，所述抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)的组合的全部或部分；或单域抗体可变区，例如重链抗体可变区(VHH)、抗体重链可变区(VH)、抗体轻链可变区(VL)和免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)的可变区(VNAR)。抗原结合结构域的其他实例是“scFv(单链Fv)”、“单链抗体”、“Fv”、“scFv2(单链Fv2)”、“Fab”或“F(ab')2”等。
本文所用术语“单域抗体”、“单域抗体可变区”、“一域抗体”、“一域抗体可变区”不受结构限制，只要该结构域本身能发挥抗原结合活性即可。已知典型的抗体，例如IgG抗体，在通过VH和VL的配对形成可变区的状态下显示抗原结合活性，而单域抗体自身的结构域结构可以自行发挥抗原结合活性而不与另一个结构域配对。通常，单域抗体的分子量相对较低，以单体形式存在。
单域抗体的实例包括但不限于先天性缺乏轻链的抗原结合分子，例如骆驼科动物的VHH和鲨鱼VNAR(免疫球蛋白新抗原受体可变区：IgNAR)，以及包含抗体VH结构域的全部或部分或抗体VL结构域的全部或部分的抗体片段。作为包含抗体VH或VL结构域的全部或部分的抗体片段的单域抗体的实例包括但不限于源自人抗体VH或人抗体VL的人工制备的单域抗体，如在美国专利号6,248,516B1等中所描述的。在本发明的一些实施方案中，一个单域抗体具有三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。
单域抗体可以从能够产生单域抗体的动物或通过免疫能够产生单域抗体的动物获得。能够产生单域抗体的动物的实例包括但不限于骆驼科动物和携带能够产生单域抗体的基因的转基因动物。骆驼科的动物包括骆驼、驼马(lamas)、羊驼、单峰骆驼和大羊驼(guanacos)等。携带能够产生单域抗体的基因的转基因动物的实例包括但不限于：国际公开号WO2015/143414和美国专利公开号US2011/0123527A1中描述的转基因动物。可以将从动物获得的单域抗体的框架序列转化为人种系序列或与其相似的序列，以获得人源化单域抗体。人源化单域抗体(例如，人源化VHH)也是本发明的单域抗体的一个实施方案。“人源化”单域抗体是指包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在一个实施方案中，在人源化单域抗体中，所有或实质上所有的CDR对应于非人抗体的CDR，并且所有或实质上所有的FR对应于人抗体的FR。即使在人源化抗体中一部分FR残基不对应于来自人抗体的FR残基的情况下，这也被认为是实质上所有FR对应于来自人抗体的FR的情况的一个实例。例如，要将VHH(单域抗体的一个实施例)人源化，部分FR残基必须是与人类抗体中的残基不对应的残基(C Vincke等人，The Journal of Biological Chemistry 284,3273-3284)。
可以通过ELISA、淘选等从包含单域抗体的多肽文库中获得单域抗体。包含单域抗体的多肽文库的实例包括但不限于从各种动物或人类获得的幼稚抗体文库(例如，Methodsin Molecular Biology 2012 911(65-78)和Biochimica et Biophysica Acta-Proteinsand Proteomics 2006 1764：8(1307-1319))，通过免疫各种动物获得的抗体文库(例如，Journal of Applied Microbiology 2014 117：2(528-536))，以及从各种动物或人类的抗体基因制备的合成抗体文库(例如，Journal of Biomolecular Screening2016 21：1(35-43)，Journal of Biological Chemistry 2016 291：24(12641-12657)和AIDS 2016 30:11(1691-1701))。
本文所用的表述“特异性结合/结合”是指特异性结合分子之一在其实质上不结合除其一种或多种结合配偶体分子之外的分子的条件下显示结合。当抗原结合结构域对抗原中包含的多个表位中的特定表位具有特异性时，也使用该表达。抗原结合结构域所结合的表位包含在多种不同的抗原中时，具有该抗原结合结构域的抗原结合分子可以与包含该表位的各种抗原结合。
本公开的抗原结合分子中的“细胞表面抗原结合结构域”可以结合存在于细胞表面表达的抗原中的表位。“细胞表面抗原”表示由细胞表达并存在于细胞表面以使得抗原结合结构域可以接近它的抗原结构。在一个实施方案中，本公开的胞质溶胶穿透性抗原结合分子包含细胞表面抗原结合结构域，因此特异性掺入表达细胞表面抗原的细胞(靶细胞)中。这使得能够将胞质溶胶穿透性抗原结合分子特异性递送至靶细胞。在一个实施方案中，细胞表面抗原结合结构域可以具有一个或多个抗体可变结构域，并且可以是如上文“抗原结合结构域”示例的任何形式。
本公开的抗原结合分子中的“胞质溶胶抗原结合结构域”可以结合存在于在胞质溶胶中表达的抗原中的表位。“胞质溶胶抗原”表示由细胞表达并存在于胞质溶胶中的抗原结构。胞质溶胶抗原可以是蛋白质、核酸如DNA或RNA，或在细胞器如细胞核和线粒体中表达的分子。本公开的胞质溶胶抗原结合分子包含胞质溶胶抗原结合结构域，因此可以与靶细胞的胞质溶胶中的胞质溶胶抗原结合，从而可以中和、抑制或活化等抗原的功能。在一个实施方案中，胞质溶胶抗原结合结构域可以具有一个或多个抗体可变结构域，并且可以是如上文“抗原结合结构域”例示的任何形式。在一个进一步的实施方案中，胞质溶胶抗原结合结构域可以是酶或shRNA等。
此处，短语“抗原结合分子具有改善(增强的)胞质溶胶穿透能力(活性)”是指，使抗原结合分子与细胞接触后任意时间点的细胞的胞质溶胶中的a)抗原结合分子的量相比于在同一时间点存在于细胞的胞质溶胶中的b)参考抗原结合分子的量增加至少1％、5％、8％、10％、12％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或500％或1000％或更多。在一个实施方案中，参考抗原结合分子包含轻链可变区，所述轻链可变区包含在SEQ ID NO：4所示氨基酸序列中含有的CDRL1、CDRL2和CDRL3且在CDRL2、CDRL2和CDRL3中没有任何置换。在一个实施方案中，参考抗原结合分子包含具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，当在任意时间点存在于胞质溶胶中的抗原结合分子的量由HRP发光信号或荧光信号或发光信号表示时，a)使抗原结合分子与细胞接触后的任意时间点的HRP发光信号强度或荧光信号强度或发光信号强度是b)在同一时间点通过参考抗原结合分子获得的HRP发光信号强度或荧光信号强度或发光信号强度的0.01倍或以上、0.05倍或以上、0.08倍或以上、0.1倍或以上、0.12倍或以上、0.15倍或以上、0.18倍或以上、0.2倍或以上、0.25倍或以上、0.3倍或以上、0.35倍或以上、0.4倍或以上、0.5倍或以上、0.6倍或以上、0.7倍或以上、0.8倍或以上、0.9倍或以上、1倍或以上、2倍或以上、5倍或以上或10倍或以上。在一个实施方案中，当使用包括表达生物素连接酶(BirA)的细胞的方法时，在任意时间点胞质溶胶中存在的胞质溶胶穿透性抗原结合分子的量可以通过HRP发光信号表示。在不同的实施方案中，当使用成像分析(例如实施例4中描述的方法)时，可以通过荧光信号来表示任意时间点胞质溶胶中存在的胞质溶胶穿透性抗原结合分子的量。在不同的实施方案中，当使用分裂蛋白系统(如参考实施例1中描述的方法)时，可以通过发光信号来表示任意时间点胞质溶胶中存在的胞质溶胶穿透性抗原结合分子的量。在一个实施方案中，参考抗原结合分子包含轻链可变区，所述轻链可变区包含在SEQ ID NO：4所示氨基酸序列中含有的CDRL1、CDRL2和CDRL3并且在CDRL2、CDRL2和CDRL3中没有任何置换。在一个实施方案中，参考抗原结合分子包含具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，当说胞质溶胶穿透性抗原结合分子以靶细胞特异性方式递送到胞质溶胶中时，其意指，在允许胞质溶胶穿透性抗原结合分子与靶细胞和非靶细胞接触之后任意时间点的a)非靶细胞的胞质溶胶中存在的胞质溶胶穿透性抗原结合分子的量相比于b)在同一时间点存在于靶细胞的胞质溶胶中的胞质溶胶穿透性抗原结合分子的量更少或实质上减少。在一个优选实施方案中，在使胞质溶胶穿透性抗原结合分子与非靶细胞接触后，从非靶细胞的胞质溶胶中实质上检测不到本公开的胞质溶胶穿透性抗原结合分子。在一个优选的实施方案中，细胞是来源于表达或不表达细胞表面抗原的Hela细胞系、CHO细胞系、MDCK细胞或HepG2细胞系的细胞。可以自由选择与细胞接触的胞质溶胶穿透性抗原结合分子的量，但对于上述a)的胞质溶胶穿透性抗原结合分子的量和对于上述b)的胞质溶胶穿透性抗原结合分子的量是一样的。可通过任何方法，包括孵育，使胞质溶胶穿透性抗原结合分子与细胞接触。
在一个实施方案中，在从允许胞质溶胶穿透性抗原结合分子与细胞接触的时间起0小时、0.25小时、0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、6.5小时、7小时、7.5小时、8小时、8.5小时、9小时、9.5小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时和/或16小时后测量胞质溶胶穿透性抗原结合分子的量。存在于胞质溶胶中的胞质溶胶穿透性抗原结合分子的量在使胞质溶胶穿透性抗原结合分子与细胞接触后可仅测量一次或测量两次或更多次。通过多次测量胞质溶胶中存在的胞质溶胶穿透性抗原结合分子的量，可以观察胞质溶胶中存在的胞质溶胶穿透性抗原结合分子的量随时间的变化。
在一个优选的实施方案中，在允许胞质溶胶穿透性抗原结合分子与靶细胞和非靶细胞接触后的任意时间点的a)非靶细胞的胞质溶胶中存在的胞质溶胶穿透性抗原结合分子的量是b)同一时间点存在于靶细胞的胞质溶胶中的胞质溶胶穿透性抗原结合分子的量的50％或更少、40％或更少、30％或更少、20％或更少、10％或更少、或5％或更少。
在一个实施方案中，当在任意时间点胞质溶胶中存在的胞质溶胶穿透性抗原结合分子的量由HRP发光信号或荧光信号或发光信号表示时，a)在允许所述胞质溶胶穿透性抗原结合分子与所述非靶细胞和靶细胞接触之后的任意时间点的非靶细胞的HRP发光信号强度或荧光信号强度或发光信号强度为b)靶细胞在同一时间点的HRP发光信号强度或荧光信号强度或发光信号强度的0.5倍或以下、0.4倍或以下、0.3倍或以下、0.2倍或以下、0.1倍或以下、或0.05倍或以下。在一个实施方案中，当使用包括表达生物素连接酶(BirA)的细胞的方法时，在任意时间点胞质溶胶中存在的胞质溶胶穿透性抗原结合分子的量可以通过HRP发光信号表示。在不同的实施方案中，当使用成像分析(如实施例4和参考例3中描述的方法)时，在任意时间点胞质溶胶中存在的胞质溶胶穿透性抗原结合分子的量可以通过荧光信号表示。在不同的实施方案中，当使用分裂(split)蛋白系统(如参考实施例1中描述的方法)时，可以通过发光信号来表示任意时间点胞质溶胶中存在的胞质溶胶穿透性抗原结合分子的量。
在本发明的一个工作实施方案中，肽接头可用于融合细胞表面抗原结合结构域和胞质溶胶穿透性结构域，细胞表面抗原结合结构域和胞质溶胶抗原结合结构域，胞质溶胶穿透性结构域和胞质溶胶抗原结合结构域，细胞表面抗原结合结构域和Fc亚基，胞质溶胶穿透性结构域和Fc亚基，胞质溶胶抗原结合结构域和Fc亚基。此外，肽接头可用于具有下述分子形式1至7的抗原结合分子，以将一个Fab区融合到另一个Fab区并将Fab区融合到Fc亚基。例如，包括可自由选自Arg、Ile、Gln、Glu、Cys、Tyr、Trp、Thr、Val、His、Phe、Pro、Met、Lys、Gly、Ser、Asp、Asn、Ala等，特别是Gly、Ser、Asp、Asn、Ala，尤其是Gly和Ser，尤其是Gly的氨基酸。
合适的肽接头可以由本领域技术人员容易地选择，合适的可以选自具有不同长度的那些，例如1个氨基酸(Gly等)到21个氨基酸，2个氨基酸到15个氨基酸，或3个氨基酸到12个氨基酸(例如4个氨基酸到10个氨基酸，5个氨基酸到9个氨基酸，6个氨基酸到8个氨基酸，或7个氨基酸到8个氨基酸)。
肽接头的实例包括但不限于甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS：SEQ ID NO：184)n和(GGGS：SEQ ID NO：175)n，其中n是至少为1的整数)，甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和常规技术中熟知的其他柔性接头。
其中，甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物正受到关注，因为这些氨基酸相对非结构化，很容易在组分之间起中性连接作用(tether)。
由甘氨酸-丝氨酸聚合物组成的柔性接头的实例包括但不限于，
Ser
Gly-Ser(GS)
Ser-Gly(SG)
Gly-Gly-Ser(GGS)
Gly-Ser-Gly(GSG)
Ser-Gly-Gly(SGG)
Gly-Ser-Ser(GSS)
Ser-Ser-Gly(SSG)
Ser-Gly-Ser(SGS)
Gly-Gly-Gly-Ser(GGGS:SEQ ID NO:175)
Gly-Gly-Ser-Gly(GGSG:SEQ ID NO:176)
Gly-Ser-Gly-Gly(GSGG:SEQ ID NO:177)
Ser-Gly-Gly-Gly(SGGG:SEQ ID NO:178)
Gly-Ser-Ser-Gly(GSSG:SEQ ID NO:179)
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(GGGGS:SEQ ID NO:180)
Gly-Gly-Gly-Ser-Gly(GGGSG:SEQ ID NO:181)
Gly-Gly-Ser-Gly-Gly(GGSGG:SEQ ID NO:182)
Gly-Ser-Gly-Gly-Gly(GSGGG:SEQ ID NO:183)
Gly-Ser-Gly-Gly-Ser(GSGGS:SEQ ID NO:184)
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(SGGGG:SEQ ID NO:185)
Gly-Ser-Ser-Gly-Gly(GSSGG:SEQ ID NO:186)
Gly-Ser-Gly-Ser-Gly(GSGSG:SEQ ID NO:187)
Ser-Gly-Gly-Ser-Gly(SGGSG:SEQ ID NO:188)
Gly-Ser-Ser-Ser-Gly(GSSSG:SEQ ID NO:189)
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(GGGGGS:SEQ ID NO:190)
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SGGGGG:SEQ ID NO:191)
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(GGGGGGS:SEQ ID NO:192)
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SGGGGGG:SEQ ID NO:193)
(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(GGGGS:SEQ ID NO:194))n
(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(SGGGG:SEQ ID NO:195))n[其中n是1或更大的整数]
应当注意，本领域技术人员可以根据目的适当地选择肽接头的长度和序列。
本文描述的氨基酸序列中包含的氨基酸可以进行翻译后修饰(例如，通过焦谷氨酰化将N-端谷氨酰胺修饰成焦谷氨酸是本领域技术人员所熟知的)。自然地，这种具有翻译后修饰的氨基酸的序列也包括在本文描述的氨基酸序列中。
B.抗体
在本公开的又一方面，根据上述任一实施方案的抗原结合分子是抗体，并且在一个优选的实施方案中，是单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗原结合分子是抗体片段(抗原结合片段)，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、双抗体或F(ab')2片段。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如，完整的IgG1抗体或本文定义的其他抗体类别或同种型的全长抗体。
在进一步的方面，根据任何上述实施方案的抗体可以单独或组合并入下文第1至7项中描述的任何特征。
1.抗体的结合活性和亲和力
在某些实施方案中，本文提供的抗体的结合活性或亲和力是1μM或更小、100nM或更小、10nM或更小、1nM或更小、0.1nM或更小、0.01nM或更小，或0.001nM或更小(例如，10-8M或更小，例如，10-8M至10-13M，和例如，10-9M至10-13M)的解离常数(KD)。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv和scFv片段，以及下文描述的其他片段。对于某些抗体片段的综述，请参见Hudson等人,Nat Med 9,129-134(2003)。对于scFv片段的综述，请参见例如Pluckthun，在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg andMoore eds.,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)中；另参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med9,129-134(2003)；和Hollinger等人.，Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。三体(triabody)和四体(tetrabody)也描述于Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)。
单域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见，例如，美国专利号6,248,516B1)。
如本文所述，抗体片段可通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生。
3.嵌合抗体和人源化抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体被描述在例如美国专利4816567中；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)).。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物，例如猴子的可变区)和人恒定区。在进一步的实例中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中类别或亚类已从亲本抗体改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，非人抗体被人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR例如CDR(或其部分)源自非人抗体，并且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含至少一部分人恒定区。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，HVR残基所源自的抗体)的相应残基置换，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法在例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中进行了综述，并在例如Riechmann等人，Nature332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337,7,527,791,6,982,321,和7,087,409；Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)嫁接)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“表面重塑”)；Dall'Acqua等人,Methods36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；和Osbourn等人,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”方法)中有进一步描述。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。
5.文库衍生抗体
本公开的抗体可以通过筛选具有所需活性的抗体的组合文库来分离。例如，本领域已知用于产生噬菌体展示文库并筛选这种文库以获得具有所需结合特性的抗体的多种方法。这些方法在例如Hoogenboom等人的Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien et al.，ed.，Human Press，Totowa，NJ，2001)中进行了综述，并在例如McCafferty等人Nature348:552-554；Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks and Bradbury,in Methods in MolecularBiology 248:161-175(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)中进一步被描述。
6.多功能抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多功能抗体。多功能抗体是在至少两个不同位点具有彼此不同功能的单克隆抗体。例如，多功能抗体是具有两种功能的单克隆抗体，即(i)结合特异性和(ii)结合特异性以外的功能。结合特异性以外的功能的实例包括胞质溶胶穿透能力。在一个实施方案中，多功能抗体是双功能抗体(具有抗原结合特异性和胞质溶胶穿透能力两种功能)。在一个实施方案中，多功能抗体是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。多特异性抗体是在至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。在一个实施方案中，多功能抗体具有针对抗原的结合特异性和胞质溶胶穿透能力。在一个实施方案中，多功能抗体具有针对至少两种不同抗原的结合特异性和胞质溶胶穿透能力。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达两个具有不同特异性的免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein和Cuello，Nature 305：537(1983))，WO 93/08829，和Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991)),和”杵臼”工程化(见，例如，美国专利号5,731,168)。多特异性抗体也可以通过工程化静电控制效应(electrostatic steeringeffect)来制备，用于制备抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004A1)；交联两个或多个抗体或片段(参见例如美国专利号4,676,980和Brennan等人，Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术制备双特异性抗体片段(参见，例如，Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；并使用单链Fv(scFv)二聚体(参见，例如Gruber等人，J.Immunol.,152:5368(1994))；和制备三特异性抗体，如在Tutt等人Tutt etal.J.Immunol.147:60(1991)中所述。
应当理解，为了制备多功能抗体，可以使用与上述制备多特异性抗体的技术类似的技术。
具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体”，也包括在本文中(参见例如US 2006/0025576A1)。
本文的抗体或片段还包括“双重作用Fab(Dual Acting Fab)”或“DAF”(例如，参见US 2008/0069820)。
7.抗体变体
在某些实施方案中，考虑了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能需要改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性，例如胞质溶胶穿透能力。抗体的氨基酸序列变体可通过将适当修饰引入编码抗体的核苷酸序列或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或置换。可以进行缺失、插入和置换的任意组合以达到最终构建体，条件是最终构建体具有所需的特征，例如抗原结合。
a)置换、插入和缺失变体
在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。感兴趣的置换突变位点包括HVR和FR。保守置换显示在表1的“优选的置换”标题下。表1中“示例性置换”标题下提供了更实质性的变化，并且如下文参考氨基酸侧链类别进一步描述。可将氨基酸置换引入感兴趣的抗体中，并针对所需的活性筛选产物，例如保留的/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。
[表1]
原始残基 示例性置换 优选的置换
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp，Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
氨基酸可以根据共同的侧链特性进行分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His，Lys，Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守置换将需要将其中一类的成员换成另一类。
一种类型的置换变体涉及置换亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗体将在某些生物学特性(例如增加的亲和力、降低的免疫原性)上具有修饰(例如改进)和/或将实质上保留亲本抗体的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术如本文所述的那些方便地产生。简言之，一个或多个HVR残基被突变并且变体抗体展示在噬菌体上并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。
可以在HVR中进行改变(例如，置换)，例如，以改善抗体亲和力。此类改变可在HVR“热点”中进行，即由在体细胞成熟过程中以高频率经历突变的密码子编码的残基(参见，例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))，和/或接触抗原的残基，测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建和从二级文库重新选择的亲和力成熟已在例如Hoogenboom等人in Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人,ed.,HumanPress,Totowa,NJ,(2001))中进行了描述。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法中的任何方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后创建一个次级(secondary)文库。然后对文库进行筛选以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及HVR导向的方法，其中几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)是随机的。参与抗原结合的HVR残基可以特异性鉴定的，例如使用丙氨酸扫描诱变或建模。特别是CDR-H3和CDR-L3常常是被靶向的。
在某些实施方案中，置换、插入或缺失可发生在一个或多个HVR内，只要此类改变不会实质上降低抗体结合抗原的能力即可。例如，可以在HVR中进行实质上不降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文提供的保守置换)。例如，此类改变可能在HVR中的抗原接触残基之外。在以上提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR或未改变，或包含不超过一个、两个或三个氨基酸置换。
如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述，一种用于鉴定可能靶向诱变的抗体残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”。在该方法中，一个残基或一组靶残基(例如，带电荷的残基，如arg、asp、his、lys和glu)被鉴定并被中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换，以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在显示对初始置换功能敏感性的氨基酸位置处引入进一步的置换。或者/另外，可以分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点。这样的接触残基和相邻残基可以作为置换候选者被靶向或消除。可以筛选变体以确定它们是否包含所需的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围从一个残基到包含一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括将增加抗体血浆半衰期的酶(例如用于ADEPT)或多肽融合到抗体的N-或C-端。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，本文提供的抗体被改变以增加或减少抗体被糖基化的程度。抗体糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点而方便地完成。
在抗体包含Fc区的情况下，可以改变与其附接的碳水化合物。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的双触角寡糖，其通常通过N-连接附接到Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等人.TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在双触角寡糖结构的“主干”中附接到GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本公开的抗体中的寡糖进行修饰以产生具有某些改进特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供了具有碳水化合物结构的抗体变体，该碳水化合物结构缺少(直接或间接)附接到Fc区的岩藻糖。例如，此类抗体中岩藻糖的量可以为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。岩藻糖的量是通过计算Asn297处糖链内岩藻糖相对于附接到Asn297的所有糖结构(例如，复杂的、杂交的和高甘露糖结构)的总和的平均量来确定的，例如通过MALDI-TOF质谱法测量，例如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区第297位左右的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，由于抗体中的微小序列变异，Asn297也可能位于位置297上游或下游约+/-3个氨基酸，即位置294和300之间。这种岩藻糖基化变体可能具有改善的ADCC功能。参见，例如，美国专利公开号US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷”抗体变体相关的出版物的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人.J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人.Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括蛋白岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US2003/0157108 A1,Presta,L；和WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其是在实施例11中)和敲除细胞系，例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8，敲除CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等人.Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
抗体变体进一步提供有二等分的寡糖，例如，其中附接到抗体Fc区的双触角寡糖被GlcNAc二等分。此类抗体变体可能具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利号6,602,684(Umana等人)；和US2005/0123546(Umana等人)。还提供了在附接到Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可能具有改善的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764(Raju,S)。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区，从而产生Fc区变体。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如，人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其包含在一个或多个氨基酸位置处的氨基酸改变(例如置换)。
在某些实施方案中，本公开涵盖具有一些但不是所有效应子功能的抗体，这使其成为其中抗体体内半衰期很重要但某些效应子功能(例如补体和ADCC)是不必要的或有害的应用的期望候选物。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的减少/耗竭。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464页的表3总结了造血细胞上的FcR表达。在美国专利号5,500,36中描述了评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例(参见，例如Hellstrom,I.等人Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人,Proc.Nat'lAcad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M等人，J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性测定方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACT1TM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA；和CytoTox 96(注册商标)非放射性细胞毒性测定(Promega,威斯康星州麦迪逊))。用于此类测定的有用效应子细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者或另外地，例如在诸如Clynes等人PNAS(USA)95:652-656(1998)中公开的动物模型中体内评估感兴趣分子的ADCC活性。还可以进行C1q结合测定以确认抗体不能结合C1q并因此缺乏CDC活性。参见，例如，WO2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以进行CDC测定(参见，例如，Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。FcRn结合和体内清除率/半衰期测定也可以使用本领域已知的方法进行(参见，例如，Petkova,S.B.等人，Int'l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
效应子功能降低的抗体包括Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个置换的抗体(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个位置发生置换的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其中残基265和297被置换为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。
描述了与FcR结合增加或减少的某些抗体变体。(另见，例如，美国专利号6,737,056；WO 2004/056312，和Shields等人J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)
在某些实施方案中，抗体变体包含具有改进ADCC的一个或多个氨基酸置换的Fc区，例如在Fc区的位置298、333和/或334处(残基的EU编号)的置换。
在一些实施方案中，Fc区发生改变，导致改变的(即，增加的或减少的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利号6194551、WO 99/51642、WO2011/091078和Idusogie等人J.Immunol.164:4178-4184(2000)中描述的。
具有增加的半衰期和增加的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体，其负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24:249(1994))在US2005/0014934A1(Hinton等人)中有所描述。这些抗体包含Fc区，其中具有增加Fc区与FcRn结合的一个或多个置换。这样的Fc变体包括在以下一个或多个Fc区残基处具有置换的那些：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc区残基434的置换(美国专利号7,371,826)。
另参见Duncan&Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351关于Fc区变体的其他实例。
d)半胱氨酸工程化抗体变体
在某些实施方案中，可能需要产生半胱氨酸工程化抗体，例如“thioMAbs”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基置换。在具体实施方案中，置换的残基出现在抗体的可及位点。通过用半胱氨酸置换那些残基，反应性硫醇基团因此位于抗体的可及位点并且可用于将抗体缀合至其他部分，例如药物部分或接头-药物部分，以产生免疫缀合物，如本文进一步描述的。在某些实施方案中，以下残基中的任何一个或多个可被半胱氨酸置换：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸工程化抗体可以如例如美国专利号7,521,541中所述产生。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，可进一步修饰本文提供的抗体以包含本领域已知且容易获得的额外非蛋白质部分。适用于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1、3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇由于其在水中的稳定性而在制备中可能具有优势。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支化的或未支化的。附接到抗体上的聚合物数量可能不同，如果附接了不止一个聚合物，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可以基于考虑来确定，包括但不限于待改善的抗体的特定性质或功能、抗体衍生物是否将在限定条件下用于治疗等。
在另一个实施方案中，提供了抗体和可以通过暴露于辐射而被选择性加热的非蛋白质部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA102：11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长，并且包括但不限于不伤害普通细胞但将非蛋白质部分加热至抗体-非蛋白质部分附近的细胞被杀死的温度的波长。
C.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物产生抗体，例如，如美国专利号4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供了编码本文所述抗原结合分子的分离的核酸。该核酸可编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在进一步的实施方案中，提供了包含该核酸的一个或多个载体(例如表达载体)。在进一步的实施方案中，提供了包含该核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，已用以下转化)：(1)含有核酸的载体，所述核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)含有编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体，和含有编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp2/0细胞)。在一个实施方案中，提供了制备本公开的抗原结合分子的方法，其中所述方法包括，在适合表达抗原结合分子的条件下，培养如上文所提供的包含编码抗原结合分子的核酸的宿主细胞，并且任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗原结合分子。
对于本公开的抗原结合分子的重组生产，分离例如如上所述编码抗原结合分子的核酸，将其插入一个或多个载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序此类核酸。
当本公开的抗原结合分子是抗体时，用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，抗体可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还参见Charlton，Methods in Molecular Biology，卷248(B.K.C.Lo，编辑，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，第245-254页，其描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达)。在表达后，抗体可以以可溶级分从细菌细胞糊状物中分离，并且可进一步纯化。
除原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母是抗体编码载体的合适克隆或表达宿主，包括糖基化途径已被“人源化”的真菌和酵母菌株，从而产生具有部分或完全人的糖基化模式的抗体。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)和Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株，其可与昆虫细胞结合使用，特别是用于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的转染。
还可利用植物细胞培养物作为宿主。参见，例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(其描述了用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可将脊椎动物细胞用作宿主。例如，适应于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是：由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚胎肾系(如Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977)中描述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(TM4细胞，例如，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所描述的)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述；MRC 5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。对于适合抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，卷248(B.K.C.Lo，编，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。
D.测定
本文提供的抗原结合分子可以通过本领域已知的各种测定来鉴定、筛选或表征它们的物理/化学性质和/或生物活性。
1.结合活性和亲和力的测量
在一个实施方案中，为了测量抗体的结合活性或亲和力，使用了利用BIACORE(注册商标)T200或BIACORE(注册商标)4000(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)的配体捕获方法，其测量依赖于表面等离子体共振分析原理。BIACORE(注册商标)控制软件用于设备的操作。在一个实施方案中，根据制造商的说明使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare，乌普萨拉，瑞士)将用于配体捕获的分子，例如抗标签抗体、抗IgG抗体、蛋白A等固定到涂有羧甲基葡聚糖的传感器芯片(GE Healthcare,乌普萨拉，瑞士)上。配体捕获分子在适当的pH值下用10mM乙酸钠溶液稀释，并以适当的流速和适当的注射时间注射。结合活性使用含有0.05％聚山梨酯20(也称为吐温(注册商标)-20)的缓冲液作为测量缓冲液，流速为10-30微升/分钟，测量温度优选为在25℃或37℃下。对于通过使配体捕获分子捕获抗体作为配体进行的测量，注入抗体以捕获目标量的抗体，然后注射使用测量缓冲液制备的抗原和/或Fc受体(分析物)的系列稀释液。对于使配体捕获分子捕获抗原和/或Fc受体作为配体进行的测量，注射抗原和/或Fc受体以捕获其目标量，然后注入使用测量缓冲液制备的抗体(分析物)的系列稀释液。
在一个实施方案中，使用BIACORE(注册商标)评估软件分析测量结果。例如，通过使用1:1结合模型同时拟合缔合和解离的传感图来进行动力学参数分析，并且可以计算缔合速率(kon或ka)、解离速率(koff或kd)和平衡解离常数(kd)。对于结合活性弱的情况，特别是解离速度快、动力学参数难以计算的情况，可采用稳态模型计算平衡解离常数(KD)。作为关于结合活性的附加参数，“每单位配体量的结合分析物的量”可以通过将特定浓度下结合的分析物(RU)的量除以捕获的配体的量来计算。
2.胞质溶胶中抗原结合分子的测量
在一个实施方案中，在使抗原结合分子与细胞接触后的任意时间点测量胞质溶胶中的抗原结合分子。抗原结合分子和细胞之间的接触可以通过包括孵育在内的任何方法实现。当抗原结合分子通过孵育与细胞接触时，孵育的持续时间以及孵育后和测量胞质溶胶中的抗原结合分子之前的时间段是任意选择的。例如，存在于胞质溶胶内的抗原结合分子在与细胞接触后仅测定一次的情况下，将抗原结合分子与细胞分别孵育1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时，然后除去含有抗原结合分子的培养基，并立即测定胞质溶胶中的抗原结合分子。例如，在抗原结合分子与细胞接触后测量存在于胞质溶胶内的抗原结合分子2次以上的情况下，将抗原结合分子与细胞孵育1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时，然后去除含有抗原结合分子的培养基，并使用不含抗原结合分子的新培养基进一步孵育0小时,0.25小时、0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、6.5小时、7小时、7.5小时、8小时、8.5小时、9小时、9.5小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时和/或16小时，然后，可以测量胞质溶胶中的抗原结合分子。通过在使抗原结合分子与细胞接触后的任意时间点检测胞质溶胶中的抗原结合分子，还可以检测或评估抗原结合分子的胞质溶胶穿透能力。因此应理解，本公开还提供了一种用于检测抗原结合分子的胞质溶胶穿透能力的方法。
a)BirA测定
在一个实施方案中，通过使用标记的生物素结合蛋白质检测生物素化的Avi标签和抗原结合分子的融合，可以在BirA测定中评估任意时间点存在于胞质溶胶中的抗原结合分子的量。生物素标记的Avi标签使用抗生物素蛋白-过氧化物酶偶联物和适当的底物进行测量。例如，当使用链霉亲和素-HRP检测生物素化Avi标签时，胞质溶胶中存在的抗原结合分子的量可以用HRP发光信号强度来表示。BirA测定是本领域技术人员广为人知的方法，例如在WPR Verdurmen等人，Journal of Controlled Release 200(2015)13-22和本公开的实施例中有所描述。本领域技术人员可以适当选择用于确定胞质溶胶中存在的抗原结合分子的量的测定的条件，因此没有特别限制。生物素化的Avi标签和胞质溶胶中的抗原结合分子的融合可以进一步用可以被检测或测量的另一种标记物质标记。具体地，放射性标记和荧光标记是已知的。BirA测定中标记的生物素结合蛋白的检测(例如，对于链霉亲和素-HRP的情况检测HRP发光信号)可以通过本领域技术人员已知的方法适当地进行。具体地，蛋白质印迹法或毛细管免疫测定法(ProteinSimple，Inc.)等是已知的。
b)荧光显微镜成像
在另一实施方案中，可以通过使用与抗原结合分子结合的标记蛋白质进行检测来评估在任意时间点存在于胞质溶胶中的抗原结合分子的量。例如，当抗原结合分子包含IgG抗体时，存在于胞质溶胶中的抗原结合分子可以使用标记的抗IgG抗体来检测。关于标记，例如，放射性标记和荧光标记是已知的。标记抗原结合分子的检测可以通过本领域技术人员公知的方法适当地进行。例如，标记的抗原结合分子可以通过使用荧光显微镜对荧光信号成像来检测，如本文和本公开的实施例中所述。
c)Split-GFP
在另一个实施方案中，可以通过检测Split-GFP互补系统中的GFP荧光信号来评估在任意时间点存在于胞质溶胶中的抗原结合分子的量。具体方法是本领域技术人员已知的并且描述于例如WO 2016/013870中。具体来说，当绿色荧光蛋白(GFP)分裂成片段1-10和片段11时，显示荧光的GFP特征被去除，但如果两个片段靠近并相互结合，则可以恢复荧光显示特征(Cabantous等人，2005年)。为了利用这一点，GFP1-10的片段在胞质溶胶中表达，GFP11的片段融合到抗原结合分子的任意位点。如果在该方法中观察到GFP荧光，则表明两个GFP片段结合在一起，即抗原结合分子存在于胞质溶胶中。
d)改善的分裂蛋白系统
在另一个实施方案中，在任意时间点存在于胞质溶胶中的抗原结合分子的量可以通过检测分裂蛋白系统中的发光和/或荧光信号来评估。在一个实施方案中，分裂蛋白系统包含(i)包含线粒体外膜蛋白和发光蛋白的第一片段的肽，和(ii)发光蛋白的第二片段，其中所述发光蛋白的所述第一片段和所述第二片段一起包含所述发光蛋白质的全补体。在分裂蛋白系统中，发光蛋白的第一片段和第二片段不具有发光特征，但是当肽中包含的发光蛋白的第一片段与第二片段结合时，发光显示特征被恢复。报道了使用Nanoluc互补评估胞质溶胶穿透能力的方法(Schaub等人，Cancer Res.(2015)75(23):5023，Dixon等人，ACSChem Biol.(2016)11(2):400)，但这些方法的背景发光和/或荧光信号仍然很高。鉴于这些，在一个实施方案中，本发明人想到在分裂蛋白系统中使用线粒体外膜蛋白以降低背景信号。
在一个实施方案中，分裂发光蛋白是split NanoLuc(注册商标)。NanoLuc是一种小的19kDa荧光素酶，由深海发光虾工程化而成。split NanoLuc测定利用NanoLuc，它被切割成两个亚基——一个小的1.3kDa小BiT(SmBiT)(SEQ ID NO：202)和一个更大的18kDa大BiT(LgBiT)(SEQ ID NO：203)。通过使用NanoLuc活细胞测定系统(Promega)，在活细胞中观察到LgBiT和SmBiT的互补性作为底物上的酶促反应的发光。在split NanoLuc测定中，HeLa细胞经过基因改造以在细胞内稳定表达NanoLuc LgBiT。通常，NanoLuc LgBiT可以表达为游离胞质溶胶蛋白。然而，在一个实施方案中，当NanoLuc-LgBiT栓留(thered)到胞质溶胶内的细胞内结构，例如线粒体外膜时。本发明人惊奇地发现，与NanoLuc LgBiT表达为游离胞质溶胶蛋白时相比，NanoLuc LgBiT与线粒体外膜的栓留(tethering)导致背景信号显著降低和更好的测定灵敏度。另一方面，SmBiT缀合物可以融合到抗原结合分子上的任意位点。优选地，抗原结合分子是抗体并且发光蛋白的第二片段融合到抗体重链的C端。抗原结合分子-SmBiT缀合物穿透到胞质溶胶，从而与NanoLuc LgBiT互补形成荧光素酶，其可通过增强发光来检测。
在一个实施例中，本公开提供了改善的分裂蛋白系统，其包含(i)包含线粒体外膜蛋白和发光蛋白的第一片段的肽，和(ii)发光蛋白的第二片段，其中所述发光蛋白的第一片段和第二片段一起包含发光蛋白的完整互补物。在另一个实施例中，本公开提供了一种用于改善的分裂蛋白系统的肽，其中该肽包含线粒体外膜蛋白和发光蛋白的第一片段，并且其中第一片段和发光蛋白的第二片段一起包含完整的发光蛋白。
发光蛋白的第一片段的实例是NanoLuc Large BiT(LgBiT)。发光蛋白的第二片段的实例是NanoLuc SmBiT(SmBiT)。在进一步的实施方案中，包含线粒体外膜蛋白和发光蛋白的第一片段的肽还包含绿色荧光蛋白(GFP)或其变体。优选地，包含线粒体外膜蛋白、发光蛋白的第一片段和GFP变体的肽包含SEQ ID NO：196的氨基酸序列。
改善的分裂蛋白系统中使用的线粒体外膜蛋白可以是定位于线粒体外膜上的任何蛋白。线粒体外膜蛋白可以是，例如，AKAP1、BAK1、FIS1、CYB5B、FISS、FUNDC1、GDAP1、MARC1、MARC2、MFN1、MFN2、MFN3、MIEF1、MIEF2、MID49、MID51、MIGA1、MIGA2、MIRO1、MIRO2、MSTO1、MTX1、MTX2、MTX3、PGAM5、PLD6、RAB32、RMDN3、SYNJ2BP、TOM5、TOM6、TOM7、TOM20、TOM22、TOM34、TOM70、TSPO和/或UBP30。
在优选的实施方案中，线粒体外膜蛋白是额外的线粒体激酶锚定蛋白1(AKAP1；也称为A-激酶锚定蛋白1)。在优选实施方案中，线粒体外膜蛋白包含SEQ ID NO：197的氨基酸序列。在优选实施方案中，包含发光蛋白第一片段的肽包含SEQ ID NO：196的氨基酸序列(AKAP1-eGFP-NanoLuc LgBit)。
在一个实施方案中，本公开提供了编码包含线粒体外膜蛋白和荧光蛋白的第一片段的肽的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述核酸或所述载体的细胞、或包含所述蛋白质、核酸、载体或细胞的试剂盒。在进一步的实施方案中，本公开提供了一种用于检测存在于胞质溶胶中的靶分子的方法，其包括(i)提供包含核酸的细胞，所述核酸编码包含线粒体外膜蛋白和荧光蛋白的第一片段的肽，(ii)提供与荧光蛋白的第二片段缀合的靶分子，(iii)使(i)的细胞和(ii)的靶分子接触，以及(iv)检测(iii)的细胞中的发光信号，其中荧光蛋白的第一片段和第二片段一起包含荧光蛋白的完整互补物。与除了(i)的肽不包含线粒体外膜蛋白之外相同的方法相比，本文提供的方法具有较低的背景发光信号。在优选的实施方案中，靶分子是胞质溶胶穿透性抗原结合分子。
在另一个实施方案中，在改善的分裂蛋白系统中，可以使用位于胞质溶胶内的任何细胞内结构上的任何蛋白代替线粒体外膜蛋白。定位于细胞内结构上的蛋白质的实例是核外膜蛋白，并且核外膜蛋白可以是定位于核外膜上的任何蛋白质。细胞核外膜蛋白可以是，例如，NUP37、NUP43、NUP96、NUP85、NUP88、NUP107、NUP133、NUP160、NUP214和/或NUP358。
E.抗原结合分子的生产方法，抗原结合分子的筛选方法，胞质溶胶抗原的成像方法
1.生产抗原结合分子的方法
在一个方面，本公开提供了生产本公开的抗原结合分子的方法。
在一个实施方案中，生产方法包括：
(a)获得表达载体，其包含编码抗原结合分子的基因和可操作连接的合适的启动子，
(b)将载体引入宿主细胞并培养宿主细胞以产生抗原结合分子，和
(c)从宿主细胞培养物中回收抗原结合分子。
在一个实施方案中，该方法还包括：
(d)获得表达载体，其包含编码所产生的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段的基因和可操作地连接的合适的启动子；
(e)将载体引入宿主细胞并培养宿主细胞以允许产生胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段；和
(f)从宿主细胞培养物中回收胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段。
在另一个实施方案中，该生产方法包括：
(a)提供亲本胞质溶胶穿透性抗原结合分子；
(b)在亲本胞质溶胶穿透性抗原结合分子的轻链可变区中选自CDRL1和CDRL3的至少一种中引入一个或多个氨基酸置换；和
(c)鉴定和/或选择包含一个或多个氨基酸置换的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其与亲本胞质溶胶穿透性抗原结合分子相比表现出增强的胞质溶胶穿透能力。在一个优选的实施方案中，亲本胞质溶胶穿透性抗原结合分子包含轻链可变区，该可变区包含具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3。在另一个优选的实施方案中，亲本胞质溶胶穿透性抗原结合分子包含具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，引入亲本胞质溶胶穿透性抗原结合分子的轻链可变区的一个或多个氨基酸置换位于SEQ ID NO：4所示氨基酸序列中的Kabat编号位置24至34和89至97。在一个优选的实施方案中，一个或多个氨基酸置换位于SEQ ID NO：4所示氨基酸序列中的Kabat编号位置24至32和93至97。
在一个实施方案中，引入亲本胞质溶胶穿透性抗原结合分子的轻链可变区的一个或多个氨基酸置换选自由以下组成的组(根据Kabat编号的位置)：
在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列中，
(a)用A、D、E、F、G、H、I、L、N、Q、R、S、T、V或Y置换第24位的氨基酸K；
(b)用A、D、E、F、I、M、N、T、V或Y置换第25位的氨基酸S；
(c)用A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、R、T或V置换第26位的氨基酸S；
(d)用A、D、E、F、H、I、L、M、S或Y置换第27位的氨基酸Q；
(e)用D置换第27a位的氨基酸S；
(f)用I、P、Q、T或V置换第27b位的氨基酸L；
(g)用A、D、E、I、M、N、S、W或Y置换第27c位的氨基酸F；
(h)用A、D、E、F、H、N或Q置换第27d位的氨基酸N；
(i)用A、D、E、I、L、M、N、P、Q、T、V或Y置换第27e位的氨基酸S；
(j)用A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V、W或Y置换第27f位的氨基酸R；
(k)用E、H、I、Q、S、V、W或Y置换第28位的氨基酸T；
(l)用A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y置换第29位的氨基酸R；
(m)用A、D、E、F、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y置换第30位的氨基酸K；
(n)用D、M、S或T置换第31位的氨基酸N；
(o)用D、E、G、H或Q置换第32位的氨基酸Y；
(p)用H、I、T或Y置换第89位的氨基酸Q；
(q)用E、F或N置换第91位的氨基酸Y；
(r)用I、L、M、N、P、Q、S、T、V或W置换第93位的氨基酸Y；
(s)用A、D、E、F、G、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y置换第94位的氨基酸H；
(t)用A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y置换第95位的氨基酸M；
(u)用A、D、E、F、G、H、K、M、N、P、Q、S、T或V置换第96位的氨基酸Y；和
(v)用A、D、E、G、H、K、P、Q、R、S或V置换第97位的氨基酸T。
在一个实施方案中，与没有置换并且包含具有SEQ ID NO:4中所述氨基酸序列的轻链可变区的参考抗体或其片段相比，引入亲本胞质溶胶穿透性抗原结合分子的轻链可变区中的一个或多个氨基酸置换增强了抗体或其片段的胞质溶胶穿透活性。
在一个实施方案中，引入亲本胞质溶胶穿透性抗原结合分子的轻链可变区的一个或多个氨基酸置换选自由以下组成的组(根据Kabat编号的位置)：
在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列中，
(a)用N置换第24位的氨基酸K；
(b)用E置换第27位的氨基酸Q；
(c)用D置换第27a位的氨基酸S；
(d)用D或E置换第27d位的氨基酸N；
(e)用D或E置换第27e位的氨基酸S；
(f)用D、H、K、L、S或V置换第27f位的氨基酸R；
(g)用D置换第28位的氨基酸T；
(h)用E、G、M或S置换第29位的氨基酸R；
(i)用L或Q置换第30位的氨基酸K；
(j)用E置换第32位的氨基酸Y；
(k)用H、I、T或Y置换第89位的氨基酸Q；
(l)用E、F或N置换第91位的氨基酸Y；
(m)用E置换第93位的氨基酸Y；
(n)用E、P或Q置换第94位的氨基酸H；
(o)用D、N或P置换第95位的氨基酸M；和
(p)用E或P置换第96位的氨基酸Y。
在一个实施方案中，引入亲本胞质溶胶穿透性抗原结合分子的轻链可变区的一个或多个氨基酸置换包含选自由以下组成的组的氨基酸置换的组合(根据Kabat编号的位置)：
(a)S27eD/R27fK；
(b)S27eD/R27fH；
(c)N27dE/S27eD；
(d)S27eD/T28D；
(e)S27eD/R29E；
(f)S27eD/R29S；
(g)K24N/S27eD；
(h)N27dD/R27fK；
(i)N27dE/R27fK；
(j)R27fK/T28D；
(k)R27fK/R29E；
(l)R27fK/R29S；
(m)K24N/R27fK；
(n)K24N/N27dD；
(o)N27dD/T28D；
(p)N27dD/R29E；
(q)N27dD/R29S；
(r)S27eD/Q89H
(s)N27dD/Q89H；
(t)R27fK/Q89H；
(u)S27eD/Y91E；
(v)N27dD/Y91E；
(w)R27fK/Y91E；
(x)Q89H/H94P；
(y)Y91E/H94P；
(z)H94P/M95N；
(aa)H94P/M95D；
(bb)H94P/M95P；
(cc)H94E/Y96P；
(dd)H94E/M95N；
(ee)H94E/M95D；
(ff)H94E/M95P；
(gg)N27dE/R27fK/Q89H/H94E/M95P；
(hh)N27dE/R27fK/Q89Y/H94E/M95P；
(ii)N27dE/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
(jj)N27dE/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
(kk)N27dE/R27fS/Q89H/H94E/M95P；
(ll)N27dE/R27fS/Q89Y/H94E/M95P；
(mm)N27dE/R27fS/Y91E/H94E/M95P；
(nn)N27dE/R27fS/Y91F/H94E/M95P；
(oo)N27dE/R27fS/Q89H/H94Q/M95P；
(pp)N27dE/R27fS/Q89Y/H94Q/M95P；
(qq)N27dE/R27fS/Y91E/H94Q/M95P；
(rr)N27dE/R27fS/Y91F/H94Q/M95P；
(ss)N27dE/R27fV/Q89H/H94E/M95P；
(tt)N27dE/R27fV/Q89Y/H94E/M95P；
(uu)N27dE/R27fV/Y91E/H94E/M95P；
(vv)N27dE/R27fV/Y91F/H94E/M95P；
(ww)N27dE/R29S/Q89H/H94E/M95P；
(xx)N27dE/R29S/Q89Y/H94E/M95P；
(yy)N27dE/K30L/Q89H/H94E/M95P；
(zz)N27dE/K30L/Q89Y/H94E/M95P；
(aaa)S27eD/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
(bbb)S27eD/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
(ccc)S27eD/R27fK/Y91E/H94Q/M95P；
(ddd)S27eD/R27fK/Y91F/H94Q/M95P；
(eee)S27eD/R27fK/Y91E/H94Q；
(fff)S27eD/R27fK/Y91F/H94Q；
(ggg)S27eE/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
(hhh)S27eE/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
(iii)S27eE/R27fK/Y91E/H94Q/M95P；
(jjj)S27eE/R27fK/Y91F/H94Q/M95P；
(kkk)R27fS/R29S/Q89H/H94E/M95P
(lll)R27fS/R29S/Q89Y/H94E/M95P；
(mmm)R27fS/R29S/Y91E/H94E/M95P；
(nnn)R27fS/R29S/Y91F/H94E/M95P；
(ooo)R27fS/R29S/Q89H/H94Q/M95P；
(ppp)R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P；
(qqq)R27fS/R29S/Y91E/H94Q/M95P；
(rrr)R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P；
(sss)N27dE/R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P；和
(ttt)N27dE/R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P。
在一个实施方案中，该方法进一步包括用人框架区(FR)替换轻链可变区的框架区(FR)。
在一个实施方案中，该方法进一步包括引入根据Kabat编号在位置2处的氨基酸L被I置换和/或在位置3处的氨基酸V被Q置换。
在一个优选的实施方案中，轻链可变区的FR1序列被人Vκ1、Vκ2或Vκ3FR1序列替换，更优选地被人Vκ1FR1序列替换。在一个优选的实施方案中，轻链可变区的FR2序列被人Vκ1、Vκ2或Vκ3FR2序列替换，更优选地被人Vκ1FR2序列替换。在一个优选的实施方案中，轻链可变区的FR3序列被人Vκ1、Vκ2或Vκ3FR3序列替换，更优选地被人Vκ3FR3序列替换。在一个实施方案中，轻链可变区包含人Vκ1FR1、人Vκ1FR2和人Vκ3FR3序列。
在一个实施方案中，具有改善的胞质溶胶穿透能力的抗体的轻链可变区包含一个、两个、三个或四个包含在SEQ ID NO:123中的FR结构域(FR1、FR2、FR3和FR4)。
在一个实施方案中，该方法进一步包括在亲本胞质溶胶穿透性抗原结合分子的轻链可变区的CDRL2中引入一个、两个、三个或更多个氨基酸置换。在一个优选的实施方案中，在CDRL2中引入的置换选自由以下组成的组(根据Kabat编号的位置)：
在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的CDRL2中
(a)用A、G、I、T或V置换第50位的氨基酸W；
(b)用F或I置换第52位的氨基酸S；
(c)用N或Y置换第53位的氨基酸T；和
(d)用K或V置换第54位的氨基酸R。
在一个优选的实施方案中，引入亲本胞质溶胶穿透性抗原结合分子的轻链可变区的氨基酸置换包含选自由以下组成的组的氨基酸置换的组合(根据Kabat编号的位置)：
在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列中
(a)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50A/Y91F/H94Q；
(b)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50G/Y91F/H94Q；
(c)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/Y91F/H94Q；
(d)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50T/Y91F/H94Q；
(e)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50V/Y91F/H94Q；
(f)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52F/Y91F/H94Q；
(g)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52I/Y91F/H94Q；
(h)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53N/Y91F/H94Q；
(i)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53Y/Y91F/H94Q；
(j)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/R54K/Y91F/H94Q；
(k)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/S52F/Y91F/H94Q；
(l)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/T53N/Y91F/H94Q；和
(m)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/R54V/Y91F/H94Q。
在一个实施方案中，产生的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段包含具有选自由SEQ ID NO：14-150和161-173组成的组的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，产生的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段包含具有选自由SEQ ID NO：123-150组成的组的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，产生的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段包含具有选自由SEQ ID NO：161-173组成的组的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，产生的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段是Fab或scFv的形式。在一个实施方案中，产生的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段进一步包含重链可变区。
2.胞质溶胶穿透性抗原结合分子的筛选方法
在一个方面，本公开提供了筛选胞质溶胶穿透性抗原结合分子的方法。
在一个实施方案中，筛选方法包括：
(a)提供包含具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的轻链可变区的亲本胞质溶胶穿透性抗原结合分子；
(b)在亲本胞质溶胶穿透性抗原结合分子的轻链可变区中选自CDRL1和CDRL3的至少一个中引入一个或多个氨基酸置换；和
(c)鉴定和/或选择包含一个或多个氨基酸置换的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其与亲本胞质溶胶穿透性抗原结合分子相比表现出增强的胞质溶胶穿透能力。
在一个实施方案中，该方法还包括：
(c)获得表达载体，其包含编码所产生的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段的基因和可操作地连接的合适的启动子；
(d)将载体引入宿主细胞并培养宿主细胞以允许产生胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段；和
(e)从宿主细胞培养物中回收胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段。
3.胞质溶胶抗原成像方法
在另一方面，本公开提供了使胞质溶胶抗原成像的方法，包括使用本公开的抗原结合分子，通过上述生产方法产生的抗原结合分子，或通过上述筛选方法鉴定为合适分子的胞质溶胶穿透性抗原结合分子。
在另一个方面，本公开提供了本公开的抗原结合分子，通过上述生产方法生产的抗原结合分子，或通过上述筛选方法鉴定为合适分子的胞质溶胶穿透性抗原结合分子，用于对样品细胞中的胞质溶胶抗原进行成像。
在另一方面，本发明提供了本发明的抗原结合分子，通过上述生产方法生产的抗原结合分子，或通过上述筛选方法鉴定为合适分子的胞质溶胶穿透性抗原结合分子在制备用于对胞质溶胶抗原成像的试剂中的用途。
在这些方面的某些实施方案中，待使用的抗原结合分子被标记。
F.免疫缀合物
本公开还提供免疫缀合物，其包含缀合至生物活性分子的本文抗原结合分子。在一个实施方案中，生物活性分子选自由肽、蛋白质、毒素、抗体、抗体片段、RNA、DNA、小分子药物、纳米颗粒和脂质体组成的组。在一个实施方案中，免疫缀合物包含本文的缀合至一种或多种细胞毒剂的抗原结合分子，所述细胞毒剂例如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素，细菌，真菌，植物或动物来源的酶活性毒素)或其片段)或放射性同位素。
G.将抗原结合分子特异性递送到靶细胞的胞质溶胶中的方法和增强胞质溶胶穿透性抗原结合分子的胞质溶胶穿透能力的方法
在一个方面，本公开提供了将抗原结合分子特异性递送到靶细胞的胞质溶胶中的方法，在该方法中，抗原结合分子结合的细胞表面抗原是在靶细胞上特异性表达的抗原。在一个实施方案中，该方法包括使抗原结合分子与靶细胞接触。在一个实施方案中，抗原结合分子是多功能抗原结合分子，其包含胞质溶胶穿透性抗体或抗体片段、结合细胞表面抗原的抗体或抗体片段、和/或结合胞质溶胶抗原的抗体或抗体片段的组合。在某个实施方案中，上述方法实质上不将抗原结合分子递送至不表达细胞表面抗原的细胞。在某个实施方案中，抗原结合分子与靶细胞特异的细胞表面抗原结合，从而特异性地被靶细胞内化并转移到胞质溶胶中。在某个实施方案中，抗原结合分子形成多聚体，并表现出高胞质溶胶穿透能力。
在另一方面，本公开提供了与亲本胞质溶胶穿透性抗原结合分子相比增强胞质溶胶穿透性抗原结合分子的胞质溶胶穿透能力的方法，该方法包括向Fc区引入一个或多个氨基酸改变用于增强多聚体的形成，其中亲本胞质溶胶穿透性抗原结合分子包含亲本Fc区(其不包含一个或多个氨基酸改变)。
在另一个方面，本公开提供了一种将异源部分特异性地递送到靶细胞的胞质溶胶中的方法，其中异源部分与抗原结合分子缀合，所述抗原结合分子包含细胞表面抗原结合结构域和胞质溶胶穿透性结构域。优选地，在一个实施方案中，抗原结合分子包含第一和第二Fab区，其中(a)第一Fab区特异性结合细胞表面抗原，和(b)第二Fab区具有胞质溶胶穿透能力，并且其中抗原结合分子缀合至异源部分。更优选地，抗原结合分子是双功能抗体并且不包含胞质溶胶抗原结合结构域。在一个实施方案中，抗原结合分子所结合的细胞表面抗原是在靶细胞上特异性表达的抗原。在一个实施方案中，该方法包括使所述缀合至异源部分的抗原结合分子与靶细胞接触。在一个优选的实施方案中，该方法包括将异源部分特异性地递送到靶细胞的胞质溶胶中。在一个优选的实施方案中，该方法实质上不将异源部分递送至不表达细胞表面抗原的细胞。
H.靶向胞质溶胶抗原的方法
在某个实施方案中，本公开的抗原结合分子具有提高的去除或抑制靶细胞中胞质溶胶抗原的能力。因此，本文提供的抗原结合分子可用于在蛋白质水平上敲低靶细胞中的胞质溶胶抗原。本文使用的术语“敲低”是指某种蛋白质的表达量或丰度降低。具体而言，当胞质溶胶抗原在蛋白质水平被敲低时，每个细胞的胞质溶胶抗原量就会减少。在另一个特定的实施方案中，本公开的抗原结合分子具有提高的活化靶细胞中的胞质溶胶抗原的能力。
I.用于诊断和检测的方法和组合物
在某个实施方案中，本文提供的抗原结合分子可用于检测生物样品中靶细胞中胞质溶胶抗原的存在。本文使用的术语“检测/检测(detection/detecting)”包括定量或定性检测。
在一个实施方案中，提供了用于诊断方法或检测方法的抗原结合分子。在进一步的方面，提供了检测生物样品中靶细胞中胞质溶胶抗原的存在的方法。在某个实施方案中，该方法包括在抗原结合分子与胞质溶胶抗原结合所允许的条件下允许本文所述的抗原结合分子与生物样品接触，并检测抗原结合分子和胞质溶胶抗原之间是否形成复合物。这样的方法可以是体外方法或体内方法。在不同的实施方案中，本公开的抗原结合分子可用于通过成像或此类方法检测胞质溶胶抗原。
在某些实施方案中，提供了本公开的标记的抗原结合分子。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(例如荧光、发色、电子致密、化学发光和放射性标记)，以及间接检测的部分，例如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用。示例性标记包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰(dansyl)、伞形酮、荧光素酶，例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)，荧光素，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖类氧化酶，例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶，诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，与使用过氧化氢氧化染料前体的酶结合的那些，例如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶，生物素/亲和素，自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基等。
J.药物制剂
本文所述的抗原结合分子的药物制剂通过将具有所需纯度的这种抗原结合分子与一种或多种任选的药学上可接受的载体混合以冻干制剂或水溶液的形式来制备(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.Ed.(1980))。药学上可接受的载体通常在所用剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂，其包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯(alkyl paraben)，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性药学上可接受的载体还包括间质药物分散剂，如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(HYLENEX(注册商标),Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。在一方面中，sHASEGP与一个或多个另外的葡糖胺聚糖酶例如软骨素酶组合。
示例性冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和WO2006/044908中描述的那些，后者的制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文的制剂还可以包含针对所治疗的特定适应症所必需的多于一种活性成分，优选地那些具有互补活性且不会相互产生不利影响的活性成分。此类活性成分以对预期目的有效的量合适地组合存在。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如，分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。此类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.Ed.(1980)中。
可制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗原结合分子的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质为成形制品的形式，例如薄膜或微胶囊。
用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌可以容易地实现，例如通过无菌过滤膜过滤。
K.治疗方法和组合物
在一个方面，本文提供的抗原结合分子可用于治疗方法。
在一个实施方案中，提供了用作药物的本公开的抗原结合分子。在某些实施方案中，提供了用于治疗方法的本公开的抗原结合分子。在这些实施方案之一中，该方法还包括向受试者施用有效量的至少一种另外的治疗剂(例如，如下所述的那些)的步骤。根据上述任一实施方案的“受试者”优选为人。
在另一个方面，本公开提供了本公开的抗原结合分子在制造或制备药物中的用途。在这样的实施方案之一中，该方法还包括向受试者施用有效量的至少一种另外的治疗剂(例如，如下所述的那些)的步骤。根据上述任一实施方案的“受试者”可以是人。
在进一步的方面，本公开提供包含本文提供的任一抗原结合分子的药物制剂，例如用于任一上述治疗方法。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任一抗原结合分子和药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任一抗原结合分子和至少一种另外的治疗剂。
本公开的抗原结合分子(和任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果需要局部治疗，病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。可以通过任何合适的途径给药，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了各种给药方案，包括但不限于在不同时间点的单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。
本公开的抗原结合分子将以符合良好医疗实践的方式配制、给药和施用。在这方面要考虑的因素包括正在治疗的特定疾病、正在治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用时间安排，以及医生已知的其他因素。抗原结合分子不需要但任选地与目前用于预防或治疗所讨论病症的一种或多种药剂一起配制。此类其他药剂的有效量取决于制剂中存在的抗原结合分子的量、病症或治疗的类型以及上文讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或本文所述剂量的约1％至99％，或以经验/临床确定为合适的任何剂量和任何途径使用。
为了预防或治疗疾病，本公开的抗原结合分子的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型，当本公开的抗原结合分子是抗体时抗体的类型，疾病的严重程度和病程，抗原结合分子是出于预防目的还是治疗目的施用，既往治疗，患者的临床病史和对抗原结合分子的应答，以及主治医师的判断。一次或在一系列治疗中适当地向患者施用抗原结合分子。根据疾病的类型和严重程度，大约1微克/千克至15毫克/千克(例如0.1毫克/千克至10毫克/千克)的抗原结合分子可以作为向患者施用的初始候选剂量，无论例如，通过一次或多次单独施用，或通过连续输注。根据上述因素，一个典型的每日剂量范围可能从约1微克/千克至100毫克/千克或更多。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病况，治疗通常会持续直到出现所需的疾病症状抑制。抗原结合分子的一种示例性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一个或多个剂量。这样的剂量可以间歇地施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约二至约二十，或例如约六剂抗原结合分子)。可以施用初始较高负荷剂量，然后施用一个或多个较低剂量。这种治疗的进展很容易通过常规技术和分析进行监测。
应当理解，任何上述制剂或治疗方法都可以使用本公开的免疫缀合物代替抗原结合分子或除抗原结合分子之外使用本公开的免疫缀合物进行。
L.制品
在本公开的另一个方面，提供了含有用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料的制品。所述制品包括容器和容器上的标签或与容器相关联的包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由多种材料例如玻璃或塑料制成。容器容纳组合物，该组合物本身或与有效治疗、预防和/或诊断病症的另一种组合物组合，并且可以具有无菌入口(例如，容器可以是静脉注射溶液袋或具有可通过皮下注射针刺穿塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性成分是本公开的抗原结合分子。标签或包装插页表明该组合物用于治疗所选择的病况。此外，该制品可以包括(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本公开的抗原结合分子；和(b)含有组合物的第二容器，其中所述组合物含有进一步的细胞毒性剂或其他治疗剂。本公开的该实施方案中的制品可进一步包括包装插页，所述包装插页说明该组合物可用于治疗特定病况。替代地或另外地，制品可以进一步包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包含药学上可接受的缓冲液，例如可抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。它可以进一步包括从商业和用户角度看需要的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
应当理解，任何上述制品可以包括本公开的免疫缀合物来代替抗原结合分子或除了抗原结合分子之外包括本公开的免疫缀合物。
实施例
以下是本公开的方法和组合物的实施例。应当理解，鉴于上面提供的一般性描述，可以实践各种其他实施方案。
尽管为了清楚理解的目的，已经通过说明和示例的方式对上述发明进行了一些详细描述，但是这里的描述和实施例不应被解释为限制本公开的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用明确地全部并入。
实施例1：改善亲本轻链可变区(VL)hT4VL.FRv4胞质溶胶运输能力和抗体表达水 平的综合诱变方法
本发明提供了胞质溶胶穿透性抗体，特别是轻链可变区(VL)，与先前报道的胞质溶胶穿透性抗体h3D8，特别是WO2016013870中公开的h3D8的VL(即hT4VL)相比，具有改善的细胞质通透性；并且确认了抗原结合分子或抗体对细胞质具有改善的通透性。
本发明人首先将hT4VL(SEQ ID NO：174)的每个框架(FR)转换为表2中列出的人Vκ 1或V κ 3种系序列。结果，就表达产量、由单个SEC峰揭示的聚集谱和胞质溶胶穿透活性的组合而言，与hT4VL的区别仅在于具有人Vκ3(VK3)FR3的hT4VL.FRv4(SEQ ID NO：4)最终被选为最佳VL候选物以进一步改进。随后，选择hT4VL.FRv4(SEQ ID NO：4)作为亲本VL，将半胱氨酸以外的氨基酸修饰全面引入CDRL1和CDRL3的所有位置，寻找能够提高胞质溶胶运输能力和抗体表达水平的突变。编码VL变体的基因与轻链恒定区(KT0，SEQ ID NO：12)结合，并使用Expi293细胞系(Thermo Fisher，卡尔斯巴德，CA，USA)连同重链表达载体(3D8H-SG1.SmBiTb，SEQ ID NO：13)瞬时表达。表达和纯化通过本领域技术人员已知的方法进行。变体的表达水平总结于表3中。与具有hT4VL.FRv4的亲本抗体相比具有改善的表达水平的变体以粗体显示。为评估胞质溶胶运输能力，本发明人进行了如参考实施例1中所述的Split Nanoluc(Split Nluc)测定。
[表2]
hT4VL的框架架变体的列表。
设计名称 FR1 FR2 FR3 SEQ ID No.
hT4VL.FRv1 VK3 VK1 VK1 1
hT4VL.FRv2 VK3(I2L，L4M) VK1 VK1 2
hT4VL.FRv3 VK1(I2L，Q3V) VK3 VK1 3
hT4VL.FRv4 VK1(I2L，Q3V) VK1 VK3 4
hT4VL.FRv5 VK3 VK3 VK1 5
hT4VL.FRv6 VK3(I2L，L4M) VK3 VK1 6
hT4VL.FRv7 VK3 VK1 VK3 7
hT4VL.FRv8 VK3(I2L，L4M) VK1 VK3 8
hT4VL.FRv9 VK3 VK3 VK3 9
hT4VL.FRv10 VK3(I2L，L4M) VK3 VK3 10
hT4VL.FRv11 VK1(I2L，Q3V) VK3 VK3 11
hT4VL VK1(I2L，Q3V) VK1 VK1 174
[表3]
[表4]
实施例2：具有改善胞质溶胶穿透和其他特性的氨基酸突变的hT4VL.FRv4的变体
基于实施例1的结果，选择多个变体以引入进一步的氨基酸突变(表5)并测试Ab表达水平、胞质溶胶运输能力和细胞外基质(ECM)结合。具有低ECM结合的抗体被认为更有利，因为高ECM结合可能会使抗体药代动力学恶化(US2014/0080153)。如参考实施例2中所述进行ECM结合研究。结果总结于表5和表6-1和6-2中。与亲本抗体hT4VL.FRv4相比，具有更好抗体表达水平、更高split Nanoluc信号和更低ECM结合的变体以粗体显示。在第27、27a、27d、27e和28位(Kabat编号)酸性残基(D或E)似乎更优，第27f位(Kabat编号)的赖氨酸或丝氨酸，以及第94位(Kabat编号)的脯氨酸或谷氨酰胺似乎是各自位置上有前途的氨基酸残基。重要的是，表6-1和6-2中列出的大多数组合变体显示出比亲本Ab(hT4VL.FRv4)更好的概况。特别是，与其他组合相比，突变组合S27eD/R27fK,N27dE/R27fK,N27dD/Q89H,R27fK/Y91E,H94E/M95P,N27dE/R27fK/Q89Y/H94E/M95P, N27dE/R27fK/Y91F/H94E/M95P,N27dE/R27fS/Q89Y/H94E/M95P, N27dE/R27fS/Q89Y/H94Q/M95P,S27eD/R27fK/Y91F/H94Q/M95P,S27eD/R27fK/Y91F/H94Q, 和S27eE/R27fK/Y91F/H94Q/M95P(Kabat编号)显示更高SplitNluc信号，同时显示低ECM结合。
[表5]
选择的变体单个氨基酸突变
[表6-4]
具有两个或更多氨基酸突变组合的变体
[表6-2]
具有两个或更多氨基酸突变组介的变体
实施例3：具有FR1突变的变体
在之前的报道中，hT4VL是一种人源化VL，它在人VK1的FR1中具有两个非人胚系残基(第2位亮氨酸和第3位缬氨酸，对应于小鼠VK1的FR1)，其中小鼠第2位残基亮氨酸被报道为胞质溶胶运输活性所必需的(Dong-Ki Choi等人，mAbs 6:6,1402--1414；2014年11月/12月；WO2016013870)。在本申请的实施例1和实施例2中，在FR重选期间使用相同的修饰的人VK1 FR1。
选择实施例2中鉴定的28个变体，以在FR1中另外引入第2位亮氨酸至异亮氨酸的置换(L2I)和第3位缬氨酸至谷氨酰胺的置换(V3Q)(即小鼠残基回复突变为人VK1 FR1的相应人残基)，使得变体具有野生型人种系VK1 FR1序列(表7)。我们设想这种具有完全人VK1FR1的抗体变体更接近人类种系，因此具有较低的免疫原性风险。针对表7中所示的变体评估了Ab表达水平、胞质溶胶运输能力、ECM结合以及SEC(尺寸排阻色谱)谱。
对于每个变体，使用UPLC(Acquity H-Class bio，Waters)通过尺寸排阻色谱(SEC)分析评估聚集谱。50mM磷酸盐/300mM NaCl(pH 7.0)用于运行缓冲液，BEH200柱(Waters，#186005225)用作分析柱。通过220nM UV吸收记录色谱图。使用Empower3软件(Waters)处理数据，并计算单体峰百分比和单体峰的半峰全宽。高单体峰百分比和尖锐的对称峰形(窄峰宽)被认为是良好的物理化学性质。SEC分析结果总结在表7中(与原始hT4VL相比显示出更好谱的变体以粗体显示)。虽然原始hT4VL的单体峰百分比低于70％并且由于其峰形不对称而无法计算峰宽，但表7中列出的所有突变变体都显示出更好的单体峰百分比和更尖锐的峰形，如图1所示。
值得注意的是，与需要VK1 FR1的非人种系残基来保持其胞质溶胶运输能力的hT4VL的情况相反，具有L2I/V3Q突变的变体(对应于野生型全人VK1 FR1序列)令人惊讶地表现出改善或强的胞质溶胶运输能力(表7)，和改善的Ab表达水平，较低的ECM结合，以及更好的SEC(尺寸排阻色谱)谱。
基于所有结果，选择hT4VL.FRv40563(L2I/V3Q/S27eD/R27fK/Y91F/H94Q,SEQ IDNO:145)作为模板抗体用于进一步的CDRL2优化。作为对CDRL2区域进行综合诱变的结果，与模板抗体相比，几种突变(如W50A/G/I/T/V、S52F/I、T53N/Y、R54K/V和这些组合)显著改善了Split Nluc信号，同时保持了低ECM结合(表8)。
[表7]
[表8]
实施例4：包含胞质溶胶穿透性结构域和细胞表面抗原结合结构域的双功能抗体 的制备；和ASGPR表达细胞系中双功能抗体的胞质溶胶运输的成像分析
尝试从实施例3中鉴定的胞质溶胶穿透性抗体和针对细胞表面抗原的抗体构建双功能和多价抗体，以便如WO2020022262中所报道以细胞表面抗原依赖性方式将双功能抗体特异性递送至靶细胞的胞质溶胶。
进行成像分析以评估双功能抗体以受体依赖性方式的胞质溶胶穿透能力。使用Expi293细胞系(Thermo Fisher，卡尔斯巴德，CA，USA)瞬时表达抗体，并通过本领域技术人员已知的方法纯化。表9所列抗体用于制备表10中所列双功能抗体。双功能抗体通过本领域技术人员已知的方法制备。为了靶向ASGPR，使用了抗ASGPR抗体AGA0078(VH：SEQ ID NO：159，VL：SEQ ID NO：156)。
在成像分析中，使用参考例3中描述的ASGPR表达HeLa细胞系(HeLa/ASGPR/BirA)。HeLa/ASGPR/BirA细胞在含有10％ FBS(Sigma Aldrich，目录号172012-500ML)、青霉素-链霉素(Gibco，目录号15140-122)、750微克/毫升遗传霉素(Thermo Fisher Scientific，目录号10131-027)和100微克/毫升zeocin(Thermo Fisher Scientific，目录号R25001)的Eagle最低必需培养基(Minimum Essential Medium Eagle)(Sigma，目录号M4655-500ML)中培养。将HeLa/ASGPR/BirA悬浮液以50微升/孔(6x103个细胞/孔)接种在BioCoat胶原蛋白I多孔板96孔黑色/透明(Corning，目录号354649)中。然后，将细胞在加湿的5％CO2、37℃培养箱中培养过夜。去除培养物上清液后，将细胞与3μM抗体在50微升/孔的培养基中在加湿的5％CO2、37℃培养箱中孵育3小时。孵育后，细胞在200mM甘氨酸(Wako Pure ChemicalIndustries，目录号077-00735)-HCl(Wako Pure Chemical Industries，目录号083-01095)、150mM NaCl(Wako Pure Chemical Industries，目录号191-01665)，pH 2.5中洗涤两次。然后，细胞用4％多聚甲醛-磷酸盐缓冲液(Nacalai Tesque，目录号09154-56)在室温下固定15分钟，并用含有0.5％Triton X-100(Bio-Rad，目录号161-0407)和5％FBS的PBS透化。透化所用的溶液也用于后续的二抗孵育和洗涤步骤。将细胞与1/500稀释的山羊抗人IgG-AF488(SouthernBiotech，目录号2040-30)和1/2000稀释的Hoechst 33342(ThermoFisher Scientific，目录号H3570)在室温下孵育30分钟。洗涤两次后，使用Operetta CLSHigh-Content Analysis System(Perkin Elmer)对细胞进行成像分析。Alexa488的荧光强度通过使用Harmony软件(Perkin Elmer)进行评估。
结果，在实施例3中选择的具有抗ASGPR抗体(AGA078)的双功能分子形式的抗体显示出比具有抗KLH抗体(IC17)的双功能分子形式更高的Alexa488荧光强度(图2)。这表明双功能抗体可以通过ASGPR依赖性方式递送到HeLa/ASGPR/BirA细胞中，支持通过实施例3中的Split-NanoLuc测定观察到的受体依赖性胞质溶胶运输。
[表9]
[表10]
用于成像分析中的双功能抗体和对照抗体的列表
实施例5：使用非3D8重链确认胞质溶胶运输能力
尽管上述实施例1-4使用了相同的3D8重链(SEQ ID NO：13)，本发明人进一步评估了实施例1-4中新鉴定的轻链(VL)变体当与其他非3D8重链结合时是否仍保留其胞质溶胶运输能力。为此，使用抗IL6R重链AL1W8P226(SEQ ID NO:151)作为对照以与实施例1-4中鉴定的VL变体组合。制备包含抗IL6R重链和实施例1-4中鉴定的VL变体的双功能抗体，并使用在细胞表面固有表达IL6R的HepG2细胞通过Split Nluc测定测试胞质溶胶运输能力。结果，与二价抗-IL6R抗体(重链SEQ ID NO:152，轻链SEQ ID NO:153)以及包含AL1W8P226和阴性对照轻链IC17L的抗体(SEQ ID NO:154)相比，包含VL变体和AL1W8P226的抗体显示出更高的Split Nluc信号，表明VL变体表现出胞质溶胶运输活性，靶细胞(IL6R)特异性胞质溶胶运输可以通过IL6R结合介导(图3)。
实施例6：优化变体的抗体药代动力学(PK)概况
如实施例2和实施例3所示，本发明人成功鉴定了具有显著改善的物理化学性质(例如可能影响抗体PK的ECM结合和SEC谱)的细胞穿透性抗体。对所选变体之一3D8H/hT4VL.FRv40563(VH：SEQ ID NO：158，VL：SEQ ID NO：145)进行小鼠静脉内施用测试。抗体施用后，随时间采集血液品并获得血浆。然后通过ELISA方法测量血浆中施用抗体的浓度。使用WinNonlin ver 7.0(Certara)分析血浆中抗体浓度的时程数据以计算抗体清除率(CL)。结果，与3D8(3D8H/hT4VL)相比，新鉴定的变体(3D8H/hT4VL.FRv40563)的抗体PK概况得到显著改善(图12)。此外，还评估了包含胞质溶胶穿透性结构域(FRv40563)和细胞表面抗原结合结构域(抗ASGPR抗体，AGA0078)的双功能抗体的PK。ASGPR主要在肝脏中表达，二价抗ASGPR抗体显示出非常快的消除。如图13所示，FRv40563n//AGA0078p与其对照抗体FRv40563n//IC17p相比显示出更快的清除率，表明双功能抗体FRv40563n//AGA0078p可以通过ASGPR依赖性方式递送至肝脏。此外，FRv40563n//AGA0078p显示出比IC17n//AGA0078p更快的清除率。这可以支持体内ASGPR依赖性胞质溶胶运输。
参考实施例1：SplitNanoLuc测定以评估胞质溶胶运输能力
(1)split NanoLuc测定的构思
NanoLuc是一种小的19kDa荧光素酶，由深海发光虾设计而成。split NanoLuc测定利用NanoLuc，其被切割成两个亚基——一个小的1.3kDa小BiT(SmBiT)和一个更大的18kDa大BiT(LgBiT)。通过使用NanoLuc活细胞测定系统(Promega)，在活细胞中观察到LgBiT和SmBiT的互补性作为底物上的酶促反应的发光。在split NanoLuc测定中，HeLa细胞经过基因改造以在细胞内稳定表达NanoLuc LgBiT。NanoLuc LgBiT要么表达为游离的胞质溶胶蛋白，要么栓留在胞质溶胶内的细胞内结构上，例如线粒体外膜。与NanoLuc LgBiT表达为游离胞质溶胶蛋白时相比，NanoLuc LgBiT与线粒体外膜的拴留导致显著降低的背景信号和更好的测定灵敏度。尽管通过GFP测定，栓留的NanoLuc-LgBiT具有总体较低的表达。SmBiT与测试的抗体融合或缀合。抗体-SmBiT缀合物穿透到胞质溶胶中将补充NanoLuc LgBiT以形成荧光素酶，这可以通过发光的增强来检测。
(2)细胞系构建
为了产生稳定表达人ASGPR的HeLa细胞，使用Lipofectamine 3000(Invitrogen)分别以2:1的比例用编码人ASGPR-H1(SEQ ID NO:198)和ASGPR-H2(SEQ ID NO:199)亚基的质粒转染细胞。将ASGPR-H1和ASGPR-H2克隆到使用CAG启动子并编码新霉素抗生素抗性基因的质粒pCXND3中。通过在FACSAria III(BD)上进行细胞分选，抗生素抗性细胞进一步富集以实现ASGPR的高表达。然后通过限制性稀释和平板法分离富集的细胞，并通过显微镜鉴定为单细胞克隆(Solentim，cell-Metric CLD)。为了生成同时表达ASGPR和eGFP-NanolucLgBiT的细胞，以及表达ASGPR和AKAP1-eGFP-NanoLuc LgBiT的细胞，将稳定表达ASGPR的HeLa细胞使用Cell Line Optimization 4D-NucleofectorTM X Kit(Lonza)和4D-Nucleofector Core unit和4D-Nucleofector X unit(Lonza)进行核转染，使用预设的HeLa核转染程序。LgBiT构建体被克隆到使用CAG启动子并编码zeocin抗生素抗性基因的质粒pCXZD1中。第一个是与eGFP的C端缀合的NanoLuc LgBit(eGFP-NanoLuc LgBit；SEQ IDNO：200)。第二个是缀合至eGFP的N端的额外的线粒体激酶锚定蛋白1(AKAP1)(AKAP1-eGFP-NanoLuc LgBit；SEQ ID NO：196)。通过在FACSAria III(BD)上进行细胞分选，进一步富集抗生素抗性细胞以获得eGFP的高表达。然后通过限制性稀释和平板法分离富集的细胞，并通过显微镜鉴定为单细胞克隆(Solentim，cell-Metric CLD)。
将HeLa细胞在最低必需培养基(Gibco)的标准培养基中培养，该培养基含有10％v/v胎牛血清、1％v/v MEM非必需氨基酸溶液(Gibco)，1％丙酮酸钠(Gibco)和1％v/v青霉素-链霉素(Gibco)。用补充有1mg/mL遗传霉素(G418硫酸盐)(Gibco)的标准培养基培养表达脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的HeLa克隆。表达ASGPR和eGFP-NanoLuc LgBiT或ASGPR和AKAP1-eGFP-NanoLuc LgBiT的HeLa细胞在标准培养基中培养，该培养含1mg/mL遗传霉素和600微克/毫升Zeocin(Invivogen)。所有细胞类型均在加湿的5％CO2、37℃培养箱中培养。
(3)测定设置条件
表达ASGPR和eGFP-NanoLuc LgBiT的HeLa细胞(以下称为HeLa-Nluc)，以及表达ASGPR和AKAP1-eGFP-Nanoluc LgBiT的HeLa细胞(以下称为HeLa-AKAP1_Nluc)用DPBS，无钙，无镁(Gibco)冲洗。然后在室温下用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)对细胞进行胰蛋白酶消化，直至从培养瓶中分离出来。后在含有10％FBS的过量培养基中中和胰蛋白酶。通过在4℃下以200x g离心5分钟使细胞沉淀，并用冷却的Opti-MEM(Gibco)冲洗两次。细胞以1x106个细胞/mL的浓度悬浮在冷却的Opti-MEM中，并在使用前冷藏长达30分钟。待测抗体在组氨酸缓冲液20mM His-HCl+150mM NaCl(Nacalai Tesque)中稀释至测试浓度的11倍。在室温下制备来自NanoLuc Live Cell Assay System(Promega，Cat#N2011)的5倍底物。将1x105个细胞以100微升/孔(Perkin Elmer，Cat#6005688)转移，并将10微升的11倍抗体直接加入细胞中并通过移液器混合。然后在混合后立即将5倍底物添加到细胞和抗体混合物中。
立即将板放入预热的37℃发光板读数器(Promega，Glomax Explorer)中。每5分钟进行一次两步读取循环，持续12个循环——在读取发光之前，以400rpm振荡板1分钟。表4-8中总结了参考缓冲液孔的倍数变化。与亲本抗体相比显示出更好倍数变化的变体以粗体显示。
参考实施例2：抗体的细胞外基质(ECM)结合的表征
参考WO2012093704 A1通过以下程序评估每种抗体与ECM(细胞外基质)的结合：用TBS将ECM无酚红(BD Matrigel#356237)稀释至2mg/mL，并将5微升添加至在冰上冷却的ECL测定板(L15XB-3、MSD KK、高结合)的每个孔的中心。然后，将包被的板密封并在4℃下放置过夜。第二天在室温下进行测定。将150微升的ECL封闭缓冲液(补充有0.5％BSA和0.05％吐温20的PBS)添加到包被板的每个孔中，并将板在室温下静置2小时或更长时间。接下来，去除封闭缓冲液。每个抗体样品用ACES-T稀释至9微克/毫升，并用ECLDB(补充有0.1％BSA和0.01％吐温20的PBS)进一步稀释至3微克/毫升。将50微升稀释的抗体溶液加入每个孔中并在30℃下以600rpm振荡孵育1小时。然后通过轻敲倒置板取出样品。接下来，将50微升戊二醛添加到每个孔中以固定样品，并在室温下孵育10分钟。然后用PBS-T(补充有0.05％吐温20的PBS)洗涤孔三次。用ECLDB将二抗稀释至1微克/毫升，并将50微升二抗溶液添加到板的每个孔中。将板密封并在30℃下以600rpm避光孵育1小时。接下来，去除二抗溶液。用PBS-T再次洗涤板三次，然后加入READ缓冲液(MSD KK)，该缓冲液以150微升/孔加入，然后使用Sector Imager2400(MSD KK)立即检测发光信号。
参考实施例3：用于成像分析的细胞系构建
为了产生稳定表达人ASGPR的HeLa细胞(HeLa/ASGPR)，使用Lipofectamine 3000(Theromo Fisher Scientific)分别以2:1的比例用编码人ASGPR-H1(SEQ ID NO：198)和ASGPR-H2(SEQ ID：199)蛋白亚基的质粒转染细胞。将ASGPR-H1和ASGPR-H2克隆到使用CAG启动子并编码新霉素抗生素抗性基因的质粒pCXND3中。通过在FACSAria III(BecktonDickinson)上进行细胞分选，抗生素抗性细胞进一步富集以实现ASGPR的高表达。然后通过限制性稀释和平板法分离富集的细胞，并通过显微镜(Solentim，cell-Metric CLD)鉴定为单细胞克隆。
将编码BirA蛋白(SEQ ID NO：201)的基因克隆到使用CAG启动子并编码zeocin抗生素抗性基因的质粒pCXZD1中。使用Lipofectamine3000(Thermo Fisher Scientific)用pCXZD1 BirA质粒转染HeLa/ASGPR细胞。通过在FACSAria IIu分选仪(Beckton Dickinson)上进行细胞分选，抗生素抗性细胞进一步富集以实现BirA的高表达。然后通过限制稀释和平板法分离富集的细胞，并通过显微镜鉴定为单细胞克隆。然后扩增选定的克隆。使用FACSVerse(Beckton Dickinson)与抗ASGPR抗体和山羊抗人IgG-Alexa Fluor 647(SouthernBiotech，目录号2040-31)的流式细胞术分析证实了ASGPR表达。BirA表达也通过使用Simple Western Wes(Protein Simple)的毛细管免疫测定法得到证实。这种稳定表达ASGPR和BirA的HeLa细胞系(HeLa/ASGPR/BirA)用于成像分析。
为了测定，HeLa/ASGPR/BirA细胞在含有10％ FBS(Sigma Aldrich，目录号172012-500ML)、青霉素-链霉素(Gibco，目录号15140-122)、750微克/毫升遗传霉素(Thermo Fisher Scientific，目录号10131-027)和100微克/毫升zeocin(Thermo FisherScientific，目录号R25001)的Eagle最低必需培养基(Sigma，目录号M4655-500ML)中培养。
序列表
<110> 中外制药株式会社
<120> 具有改善的胞质溶胶穿透活性的抗原结合分子
<130> C1-A2028P
<150> JP 2020-213219
<151> 2020-12-23
<160> 203
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 1
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 2
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 2
Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 3
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 3
Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 4
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 4
Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
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<211> 113
<212> PRT
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<220>
<223> 人工合成的序列
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Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 6
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 6
Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 7
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 8
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 8
Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 9
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 9
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 10
Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 11
Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 12
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 13
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Asn Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Lys Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Tyr Lys Arg Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Val Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Glu
450 455 460
Glu Ile Leu
465
<210> 14
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 14
Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Asn Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 15
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 15
Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Glu Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 16
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 16
Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Asp Leu Phe Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 17
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 17
Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asp Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 18
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 18
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Glu Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 19
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Asp
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 20
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65 70 75 80
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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<223> 人工合成的序列
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 30
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 32
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 33
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<211> 113
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 34
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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<223> 人工合成的序列
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<223> 人工合成的序列
<400> 37
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 38
Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 39
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 40
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Lys
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 41
Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
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100 105 110
Lys
<210> 42
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 42
Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
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35 40 45
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100 105 110
Lys
<210> 43
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 43
Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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Lys
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 44
Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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65 70 75 80
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100 105 110
Lys
<210> 45
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 45
Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
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65 70 75 80
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Lys
<210> 46
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 46
Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
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35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
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Tyr Tyr Tyr His Asp Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
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Lys
<210> 47
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<223> 人工合成的序列
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Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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20 25 30
Lys Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
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100 105 110
Lys
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 106
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<223> 人工合成的序列
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<223> 人工合成的序列
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<220>
<223> 人工合成的序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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<223> 人工合成的序列
<400> 129
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<220>
<223> 人工合成的序列
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Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 131
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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<223> 人工合成的序列
<400> 132
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 133
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Glu Ser
20 25 30
Ser Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
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Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 134
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Glu Ser
20 25 30
Val Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Gln
85 90 95
Tyr Tyr Tyr Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 135
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 135
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Glu Ser
20 25 30
Val Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Phe Tyr Tyr Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 136
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 136
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Glu Ser
20 25 30
Arg Thr Ser Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
Tyr Tyr Tyr Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 137
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Glu Ser
20 25 30
Arg Thr Ser Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Gln
85 90 95
Tyr Tyr Tyr Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 138
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Glu Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Leu Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
Tyr Tyr Tyr Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 139
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Glu Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Leu Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Gln
85 90 95
Tyr Tyr Tyr Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 140
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 140
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Asp
20 25 30
Lys Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Glu Tyr Tyr Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 141
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 141
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Asp
20 25 30
Lys Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Phe Tyr Tyr Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 142
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 142
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Asp
20 25 30
Lys Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Lys
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 143
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Asp
20 25 30
Lys Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
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50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
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100 105 110
Lys
<210> 144
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 144
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Asp
20 25 30
Lys Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
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50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
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100 105 110
Lys
<210> 145
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 145
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Asp
20 25 30
Lys Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
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100 105 110
Lys
<210> 146
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 146
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Glu
20 25 30
Lys Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
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65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
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100 105 110
Lys
<210> 147
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 147
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Glu
20 25 30
Lys Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Phe Tyr Tyr Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 148
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Glu
20 25 30
Lys Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
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Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
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100 105 110
Lys
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 149
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Glu
20 25 30
Lys Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Phe Tyr Tyr Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 150
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 150
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Glu Ser
20 25 30
Ser Thr Ser Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr Gln
85 90 95
Tyr Tyr Tyr Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 151
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 151
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Leu Asp Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Gly Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Val His Thr Thr Ala Arg Ala Met Gly Val Pro Lys Trp Ala
100 105 110
Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 152
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 152
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Ser Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 153
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 153
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 154
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 154
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 155
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 155
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Lys Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 156
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 156
Ala Val Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Pro Val Ser Ala Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Gly Asn Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Leu Gly Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Val Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Ile Val Gly Thr Ser Ser
85 90 95
Met Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 157
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 157
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Ser Phe Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Thr
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys
100 105
<210> 158
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 158
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
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35 40 45
Ser Ala Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Asn Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 159
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 159
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Tyr Ile Gly
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Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr
65 70 75 80
Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Phe
85 90 95
Ala Ser Ser Ser Gly Tyr Tyr Gly Tyr Phe Asn Leu Trp Gly Pro Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 160
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 160
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gln Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Asn Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile Asp Pro Ser Tyr Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Leu Tyr Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 161
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 161
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Asp
20 25 30
Lys Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Phe Tyr Tyr Gln Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 162
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Asp
20 25 30
Lys Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Phe Tyr Tyr Gln Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 163
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Asp
20 25 30
Lys Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ile Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Phe Tyr Tyr Gln Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 164
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Asp
20 25 30
Lys Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 165
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Asp
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Phe Tyr Tyr Gln Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 166
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Asp
20 25 30
Lys Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Phe Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Phe Tyr Tyr Gln Met Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 167
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Asp
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Lys Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ile Thr Arg Glu Ser Gly Val
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Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 168
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
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100 105 110
Lys
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 170
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Asp
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100 105 110
Lys
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 171
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Asp
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Lys
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 172
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Asp
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Lys
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 173
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Asp
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100 105 110
Lys
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 174
Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Lys
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 175
Gly Gly Gly Ser
1
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 176
Gly Gly Ser Gly
1
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 177
Gly Ser Gly Gly
1
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 178
Ser Gly Gly Gly
1
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 179
Gly Ser Ser Gly
1
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 180
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 181
Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 182
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 182
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 183
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 183
Gly Ser Gly Gly Gly
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 184
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 185
Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 186
Gly Ser Ser Gly Gly
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 187
Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 188
Ser Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 189
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 189
Gly Ser Ser Ser Gly
1 5
<210> 190
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 190
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 191
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 191
Ser Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 192
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 192
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 193
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 193
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 194
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 194
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 195
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 195
Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 196
<211> 433
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 196
Met Ala Ile Gln Phe Arg Ser Leu Phe Pro Leu Ala Leu Pro Gly Met
1 5 10 15
Leu Ala Leu Leu Gly Trp Trp Trp Phe Phe Ser Arg Lys Lys Ser Arg
20 25 30
Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val
35 40 45
Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu
50 55 60
Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys
65 70 75 80
Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu
85 90 95
Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln
100 105 110
His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg
115 120 125
Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val
130 135 140
Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile
145 150 155 160
Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn
165 170 175
Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly
180 185 190
Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val
195 200 205
Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro
210 215 220
Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser
225 230 235 240
Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val
245 250 255
Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Asp Ile
260 265 270
Ser Gly Gly Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Glu Gln
275 280 285
Thr Ala Ala Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser
290 295 300
Ser Leu Leu Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile
305 310 315 320
Val Arg Ser Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile
325 330 335
Pro Tyr Glu Gly Leu Ser Ala Asp Gln Met Ala Gln Ile Glu Glu Val
340 345 350
Phe Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu
355 360 365
Pro Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Leu Asn
370 375 380
Tyr Phe Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys
385 390 395 400
Ile Thr Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu
405 410 415
Arg Leu Ile Thr Pro Asp Gly Ser Met Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn
420 425 430
Ser
<210> 197
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 197
Met Ala Ile Gln Phe Arg Ser Leu Phe Pro Leu Ala Leu Pro Gly Met
1 5 10 15
Leu Ala Leu Leu Gly Trp Trp Trp Phe Phe Ser Arg Lys Lys
20 25 30
<210> 198
<211> 299
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 198
Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Thr Lys Glu Tyr Gln Asp Leu
1 5 10 15
Gln His Leu Asp Asn Glu Glu Ser Asp His His Gln Leu Arg Lys Gly
20 25 30
Pro Pro Pro Pro Gln Pro Leu Leu Gln Arg Leu Cys Ser Gly Pro Arg
35 40 45
Leu Leu Leu Leu Ser Leu Gly Leu Ser Leu Leu Leu Leu Val Val Val
50 55 60
Cys Val Ile Gly Ser Gln Asn Ser Gln Leu Gln Glu Glu Leu Arg Gly
65 70 75 80
Leu Arg Glu Thr Phe Ser Asn Phe Thr Ala Ser Thr Glu Ala Gln Val
85 90 95
Lys Gly Leu Ser Thr Gln Gly Gly Asn Val Gly Arg Lys Met Lys Ser
100 105 110
Leu Glu Ser Gln Leu Glu Lys Gln Gln Lys Asp Leu Ser Glu Asp His
115 120 125
Ser Ser Leu Leu Leu His Val Lys Gln Phe Val Ser Asp Leu Arg Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Gln Met Ala Ala Leu Gln Gly Asn Gly Ser Glu Arg Thr
145 150 155 160
Cys Cys Pro Val Asn Trp Val Glu His Glu Arg Ser Cys Tyr Trp Phe
165 170 175
Ser Arg Ser Gly Lys Ala Trp Ala Asp Ala Asp Asn Tyr Cys Arg Leu
180 185 190
Glu Asp Ala His Leu Val Val Val Thr Ser Trp Glu Glu Gln Lys Phe
195 200 205
Val Gln His His Ile Gly Pro Val Asn Thr Trp Met Gly Leu His Asp
210 215 220
Gln Asn Gly Pro Trp Lys Trp Val Asp Gly Thr Asp Tyr Glu Thr Gly
225 230 235 240
Phe Lys Asn Trp Arg Pro Glu Gln Pro Asp Asp Trp Tyr Gly His Gly
245 250 255
Leu Gly Gly Gly Glu Asp Cys Ala His Phe Thr Asp Asp Gly Arg Trp
260 265 270
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275 280 285
Leu Asp Lys Ala Ser Gln Glu Pro Pro Leu Leu
290 295
<210> 199
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 199
Met His His His His His His Ala Lys Asp Phe Gln Asp Ile Gln Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ser Glu Glu Asn Asp His Pro Phe His Gln Gly Glu Gly Pro
20 25 30
Gly Thr Arg Arg Leu Asn Pro Arg Arg Gly Asn Pro Phe Leu Lys Gly
35 40 45
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65 70 75 80
Cys Val Thr Gly Ser Gln Ser Ala Gln Leu Gln Ala Glu Leu Arg Ser
85 90 95
Leu Lys Glu Ala Phe Ser Asn Phe Ser Ser Ser Thr Leu Thr Glu Val
100 105 110
Gln Ala Ile Ser Thr His Gly Gly Ser Val Gly Asp Lys Ile Thr Ser
115 120 125
Leu Gly Ala Lys Leu Glu Lys Gln Gln Gln Asp Leu Lys Ala Asp His
130 135 140
Asp Ala Leu Leu Phe His Leu Lys His Phe Pro Val Asp Leu Arg Phe
145 150 155 160
Val Ala Cys Gln Met Glu Leu Leu His Ser Asn Gly Ser Gln Arg Thr
165 170 175
Cys Cys Pro Val Asn Trp Val Glu His Gln Gly Ser Cys Tyr Trp Phe
180 185 190
Ser His Ser Gly Lys Ala Trp Ala Glu Ala Glu Lys Tyr Cys Gln Leu
195 200 205
Glu Asn Ala His Leu Val Val Ile Asn Ser Trp Glu Glu Gln Lys Phe
210 215 220
Ile Val Gln His Thr Asn Pro Phe Asn Thr Trp Ile Gly Leu Thr Asp
225 230 235 240
Ser Asp Gly Ser Trp Lys Trp Val Asp Gly Thr Asp Tyr Arg His Asn
245 250 255
Tyr Lys Asn Trp Ala Val Thr Gln Pro Asp Asn Trp His Gly His Glu
260 265 270
Leu Gly Gly Ser Glu Asp Cys Val Glu Val Gln Pro Asp Gly Arg Trp
275 280 285
Asn Asp Asp Phe Cys Leu Gln Val Tyr Arg Trp Val Cys Glu Lys Arg
290 295 300
Arg Asn Ala Thr Gly Glu Val Ala
305 310
<210> 200
<211> 402
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 200
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Asp
225 230 235 240
Ile Ser Gly Gly Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Glu
245 250 255
Gln Thr Ala Ala Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val
260 265 270
Ser Ser Leu Leu Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg
275 280 285
Ile Val Arg Ser Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile
290 295 300
Ile Pro Tyr Glu Gly Leu Ser Ala Asp Gln Met Ala Gln Ile Glu Glu
305 310 315 320
Val Phe Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile
325 330 335
Leu Pro Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Leu
340 345 350
Asn Tyr Phe Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys
355 360 365
Lys Ile Thr Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp
370 375 380
Glu Arg Leu Ile Thr Pro Asp Gly Ser Met Leu Phe Arg Val Thr Ile
385 390 395 400
Asn Ser
<210> 201
<211> 321
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 201
Met Lys Asp Asn Thr Val Pro Leu Lys Leu Ile Ala Leu Leu Ala Asn
1 5 10 15
Gly Glu Phe His Ser Gly Glu Gln Leu Gly Glu Thr Leu Gly Met Ser
20 25 30
Arg Ala Ala Ile Asn Lys His Ile Gln Thr Leu Arg Asp Trp Gly Val
35 40 45
Asp Val Phe Thr Val Pro Gly Lys Gly Tyr Ser Leu Pro Glu Pro Ile
50 55 60
Gln Leu Leu Asn Ala Lys Gln Ile Leu Gly Gln Leu Asp Gly Gly Ser
65 70 75 80
Val Ala Val Leu Pro Val Ile Asp Ser Thr Asn Gln Tyr Leu Leu Asp
85 90 95
Arg Ile Gly Glu Leu Lys Ser Gly Asp Ala Cys Ile Ala Glu Tyr Gln
100 105 110
Gln Ala Gly Arg Gly Arg Arg Gly Arg Lys Trp Phe Ser Pro Phe Gly
115 120 125
Ala Asn Leu Tyr Leu Ser Met Phe Trp Arg Leu Glu Gln Gly Pro Ala
130 135 140
Ala Ala Ile Gly Leu Ser Leu Val Ile Gly Ile Val Met Ala Glu Val
145 150 155 160
Leu Arg Lys Leu Gly Ala Asp Lys Val Arg Val Lys Trp Pro Asn Asp
165 170 175
Leu Tyr Leu Gln Asp Arg Lys Leu Ala Gly Ile Leu Val Glu Leu Thr
180 185 190
Gly Lys Thr Gly Asp Ala Ala Gln Ile Val Ile Gly Ala Gly Ile Asn
195 200 205
Met Ala Met Arg Arg Val Glu Glu Ser Val Val Asn Gln Gly Trp Ile
210 215 220
Thr Leu Gln Glu Ala Gly Ile Asn Leu Asp Arg Asn Thr Leu Ala Ala
225 230 235 240
Met Leu Ile Arg Glu Leu Arg Ala Ala Leu Glu Leu Phe Glu Gln Glu
245 250 255
Gly Leu Ala Pro Tyr Leu Ser Arg Trp Glu Lys Leu Asp Asn Phe Ile
260 265 270
Asn Arg Pro Val Lys Leu Ile Ile Gly Asp Lys Glu Ile Phe Gly Ile
275 280 285
Ser Arg Gly Ile Asp Lys Gln Gly Ala Leu Leu Leu Glu Gln Asp Gly
290 295 300
Ile Ile Lys Pro Trp Met Gly Gly Glu Ile Ser Leu Arg Ser Ala Glu
305 310 315 320
Lys
<210> 202
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 202
Val Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Glu Glu Ile Leu
1 5 10
<210> 203
<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 203
Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Glu Gln Thr Ala Ala
1 5 10 15
Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu Leu
20 25 30
Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val Arg Ser
35 40 45
Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu
50 55 60
Gly Leu Ser Ala Asp Gln Met Ala Gln Ile Glu Glu Val Phe Lys Val
65 70 75 80
Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu Pro Tyr Gly
85 90 95
Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Leu Asn Tyr Phe Gly
100 105 110
Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr Val
115 120 125
Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu Ile
130 135 140
Thr Pro Asp Gly Ser Met Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Ser
145 150 155

Claims (15)

1.一种胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中轻链可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸置换(根据Kabat编号的位置)：
在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列中，
(a)用A、D、E、F、G、H、I、L、N、Q、R、S、T、V或Y置换第24位的氨基酸K；
(b)用A、D、E、F、I、M、N、T、V或Y置换第25位的氨基酸S；
(c)用A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、R、T或V置换第26位的氨基酸S；
(d)用A、D、E、F、H、I、L、M、S或Y置换第27位的氨基酸Q；
(e)用D置换第27a位的氨基酸S；
(f)用I、P、Q、T或V置换第27b位的氨基酸L；
(g)用A、D、E、I、M、N、S、W或Y置换第27c位的氨基酸F；
(h)用A、D、E、F、H、N或Q置换第27d位的氨基酸N；
(i)用A、D、E、I、L、M、N、P、Q、T、V或Y置换第27e位的氨基酸S；
(j)用A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V、W或Y置换第27f位的氨基酸R；
(k)用E、H、I、Q、S、V、W或Y置换第28位的氨基酸T；
(l)用A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y置换第29位的氨基酸R；
(m)用A、D、E、F、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y置换第30位的氨基酸K；
(n)用D、M、S或T置换第31位的氨基酸N；
(o)用D、E、G、H或Q置换第32位的氨基酸Y；
(p)用H、I、T或Y置换第89位的氨基酸Q；
(q)用E、F或N置换第91位的氨基酸Y；
(r)用I、L、M、N、P、Q、S、T、V或W置换第93位的氨基酸Y；
(s)用A、D、E、F、G、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y置换第94位的氨基酸H；
(t)用A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y置换第95位的氨基酸M；
(u)用A、D、E、F、G、H、K、M、N、P、Q、S、T或V置换第96位的氨基酸Y；和
(v)用A、D、E、G、H、K、P、Q、R、S或V置换第97位的氨基酸T。
2.根据权利要求1所述的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中与没有所述置换且包含具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的轻链可变区的参考抗体或其片段相比，所述一个或多个氨基酸置换增强了所述抗体或其片段的胞质溶胶穿透活性。
3.根据权利要求1或2所述的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中轻链可变区中的CDRL1和CDRL3中的每一个包含两个或更多个选自权利要求1(a)至(v)中定义的组的氨基酸置换。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含选自由以下组成的组的氨基酸置换(根据Kabat编号的位置)的组合：
(a)S27eD/R27fK；
(b)S27eD/R27fH；
(c)N27dE/S27eD；
(d)S27eD/T28D；
(e)S27eD/R29E；
(f)S27eD/R29S；
(g)K24N/S27eD；
(h)N27dD/R27fK；
(i)N27dE/R27fK；
(j)R27fK/T28D；
(k)R27fK/R29E；
(l)R27fK/R29S；
(m)K24N/R27fK；
(n)K24N/N27dD；
(o)N27dD/T28D；
(p)N27dD/R29E；
(q)N27dD/R29S；
(r)S27eD/Q89H；
(s)N27dD/Q89H；
(t)R27fK/Q89H；
(u)S27eD/Y91E；
(v)N27dD/Y91E；
(w)R27fK/Y91E；
(x)Q89H/H94P；
(y)Y91E/H94P；
(z)H94P/M95N；
(aa)H94P/M95D；
(bb)H94P/M95P；
(cc)H94E/Y96P；
(dd)H94E/M95N；
(ee)H94E/M95D；
(ff)H94E/M95P；
(gg)N27dE/R27fK/Q89H/H94E/M95P；
(hh)N27dE/R27fK/Q89Y/H94E/M95P；
(ii)N27dE/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
(jj)N27dE/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
(kk)N27dE/R27fS/Q89H/H94E/M95P；
(ll)N27dE/R27fS/Q89Y/H94E/M95P；
(mm)N27dE/R27fS/Y91E/H94E/M95P；
(nn)N27dE/R27fS/Y91F/H94E/M95P；
(oo)N27dE/R27fS/Q89H/H94Q/M95P；
(pp)N27dE/R27fS/Q89Y/H94Q/M95P；
(qq)N27dE/R27fS/Y91E/H94Q/M95P；
(rr)N27dE/R27fS/Y91F/H94Q/M95P；
(ss)N27dE/R27fV/Q89H/H94E/M95P；
(tt)N27dE/R27fV/Q89Y/H94E/M95P；
(uu)N27dE/R27fV/Y91E/H94E/M95P；
(vv)N27dE/R27fV/Y91F/H94E/M95P；
(ww)N27dE/R29S/Q89H/H94E/M95P；
(xx)N27dE/R29S/Q89Y/H94E/M95P；
(yy)N27dE/K30L/Q89H/H94E/M95P；
(zz)N27dE/K30L/Q89Y/H94E/M95P；
(aaa)S27eD/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
(bbb)S27cD/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
(ccc)S27eD/R27fK/Y91E/H94Q/M95P；
(ddd)S27eD/R27fK/Y91F/H94Q/M95P；
(eee)S27eD/R27fK/Y91E/H94Q；
(fff)S27eD/R27fK/Y91F/H94Q；
(ggg)S27eE/R27fK/Y91E/H94E/M95P；
(hhh)S27eE/R27fK/Y91F/H94E/M95P；
(iii)S27eE/R27fK/Y91E/H94Q/M95P；
(jjj)S27eE/R27fK/Y91F/H94Q/M95P；
(kkk)R27fS/R29S/Q89H/H94E/M95P；
(lll)R27fS/R29S/Q89Y/H94E/M95P：
(mmm)R27fS/R29S/Y91E/H94E/M95P；
(nnn)R27fS/R29S/Y91F/H94E/M95P；
(ooo)R27fS/R29S/Q89H/H94Q/M95P；
(ppp)R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P；
(qqq)R27fS/R29S/Y91E/H94Q/M95P；
(rrr)R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P；
(sss)N27dE/R27fS/R29S/Q89Y/H94Q/M95P；和
(ttt)N27dE/R27fS/R29S/Y91F/H94Q/M95P。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含人框架区(FR)。
6.根据权利要求5所述的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含根据Kabat编号的第2位的氨基酸I和/或第3位的氨基酸Q。
7.根据权利要求5所述的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含一个、两个、三个或四个包含在SEQ ID NO：123中的FR结构域(FR1、FR2、FR3和FR4)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区进一步包含CDRL2中的一个、两个、三个或更多个氨基酸置换。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区还包含一个、两个、三个或更多个选自由以下组成的组的氨基酸置换(根据Kabat编号的位置)：
在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的CDRL2中
(a)用A、G、I、T或V置换第50位的氨基酸W；
(b)用F或I置换第52位的氨基酸S；
(c)用N或Y置换第53位的氨基酸T；和
(d)用K或V置换第54位的氨基酸R。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含选自由以下组成的组的氨基酸置换(根据Kabat编号的位置)的组合：
在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列中的
(a)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50A/Y91F/H94Q；
(b)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50G/Y91F/H94Q；
(c)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/Y91F/H94Q；
(d)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50T/Y91F/H94Q；
(e)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50V/Y91F/H94Q；
(f)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52F/Y91F/H94Q；
(g)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/S52I/Y91F/H94Q；
(h)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/T53N/Y91F/H94Q；
(i)L2T/V3Q/S27eD/R27fK/T53Y/Y91F/H94Q；
(j)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/R54K/Y91F/H94Q；
(k)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/S52F/Y91F/H94Q；
(l)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/T53N/Y91F/H94Q；和
(m)L2I/V3Q/S27eD/R27fK/W50I/R54V/Y91F/H94Q
11.根据权利要求1至10中任一项所述的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其包含具有选自由SEQ ID NO：14-150和161-173组成的组的氨基酸序列的轻链可变区。
12.根据权利要求11所述的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中所述胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段包含具有选自由SEQ ID NO：123-150组成的组的氨基酸序列的轻链可变区。
13.根据权利要求11所述的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段，其中所述胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段包含具有选自由SEQ ID NO：161-173组成的组的氨基酸序列的轻链可变区。
14.一种多功能抗体，其包含细胞表面抗原结合结构域、胞质溶胶抗原结合结构域和胞质溶胶穿透性结构域，其中所述胞质溶胶穿透性结构域包含权利要求1至13中任一项所述的轻链可变区。
15.用于将生物活性分子递送到细胞质中的组合物或药物组合物，其包含权利要求1至13中任一项所述的胞质溶胶穿透性抗体或其抗原结合片段或权利要求14所述的多功能抗体。
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