JP3887011B2 - IFN−γインヒビターによる炎症性腸疾患の処置 - Google Patents
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Description
I.発明の分野
本発明は、インターフェロン−ガンマ(IFN−γ)インヒビターを投与することによる炎症性腸疾患の予防または処置に関するものである。
II.背景および関連技術の説明
炎症性腸疾患(IBD)は、潰瘍性大腸炎(UC)およびクローン病の総称であり、これらは二つの異なった疾病として考えられているが、多くの共通する特徴を持ち、恐らくは少なくとも幾つかの病理学的機作を共有している。UCとCDに対する診断基準には充分な重複があるため、所定の患者がいずれの病気であるのかを述べるのは時に困難である。しかしながら、典型的に見られる病変の型は、位置がそうであるように、異なっている。UCは殆ど結腸に、直腸の近位に出現し、特徴的病変は粘膜の表在性潰瘍である。CDは腸の随所に出現し得、時には胃、食道および十二指腸を含み、その病変は通常、著しい線状裂溝として描写される。
これらの疾病の原因は知られておらず、初期病変は明確に定義されていない。しかしながら、表面上皮の斑状壊死、腺窩に隣接する白血球の巣状蓄積、ならびに上皮内リンパ球および或る種のマクロファージサブセットの増加が、特にクローン病における推定的初期変化として記載されている。
IBDの現行の治療は、通常、スルファサラジン、コルチコステロイド、6−メルカプトプリン/アザチオプリン、またはシクロスポリンのような抗炎症または免疫抑制剤の投与を含み、これらは通常、部分的な結果をもたらすに過ぎない。抗炎症/免疫抑制治療がもし失敗したならば、結腸切除が防御の最後の手段である。CD患者の約30%は、診断後一年以内に手術が必要となる。その後は、この割合は、年当り約5%である。悪いことにCDは再発率の高いことが特徴であって、最初の手術後、毎年約5%の患者が二回目の手術が必要となる。UCの場合、手術に頼るさらなる理由は、潰瘍性大腸炎の診断の10−15年後から、結腸直腸癌に進む危険性が極めて増加することが知られている事である。これは恐らく、形質転換の危険率を増大させる、上皮に対する損傷とこれに続く再生の再発性サイクルによるものであろう。したがって、UC患者における癌の発症に対する予防として人工肛門形成が用いられる。
IBDは、かなり一般的であって、人口100000人につき70−170例の範囲の罹患率であると主張されている。現在の処置の明らかな欠点に鑑み、この疾病の基礎となっている免疫学的根拠のより良い理解に基づく非外科手術的取り組みに対する多大な医学的必要性が存在する。
IBDにおける粘膜免疫系の性格の最近の総説が、P.ブラントザーグ等、19−40頁、胃腸疾患の免疫学、T.T.マクドナルド編、イミュノロジー・アンド・メディスン・シリーズ、19巻、クルワー・アカデミック・パブリッシャーズ、1992にある。
IBDの開始の手段となる因子を同定するために幾つかの試みがなされた。UCにおける遺伝的に決定されたムチン欠損、ならびにクローン病における腸透過性の亢進および/または粘膜IgA系の欠陥に関する報告がある。さらに、UCまたはCDにずれかに関連する感染性生物を同定するための不断の試みがなされているが、あまり成功していない。最近の、かなり議論のある学説によれば、CDは、多巣性の腸梗塞につながり、それにより初期病変の出現を惹起する、局所の血栓形成傾向を特徴とする血管疾患であるかも知れない。全体的にみて、IBDをもたらす最初の傷害の性質は同定されるべきままである。しかしながら、様々な免疫病理学的機作による腸の粘膜免疫系の機能亢進が、確立されたIBD病変を惹起し得るという確固とした証拠がある。
腸の免疫系は、腸が、抗原性の可能性がある莫大な量の物質(食物蛋白)をそのいずれとも反応することなく吸収し、且つ、異常な、複製する生物と反応する能力を失うことなく、正常な腸内細菌叢のごとき非病原性生物との反応を調節せねばならないという点で、特異である。この種の選択的反応を可能にする調節機作は、全くと言ってよい程わかっていない。さらに、IBDが異常に持続性の抗原に対する適切な免疫反応の結果起こるのか、または正常な抗原に対する不適切な反応の結果起こるのかもまた明らかでない。
小腸の主要なリンパ球組織は、いわゆるパイエル板(PP)である。リンパ節と違ってPPは輸入リンパ管の被膜を持たない。PP上の上皮は通常の腸上皮の陰窩および絨毛を欠き、M細胞と呼ばれる細胞を含む濾胞関連上皮(FAE)と呼称される。これらは抗原がPP中に運ばれる主要な経路であって、ピノサイトーシスによる腸管腔からの抗原の直接サンプリングを可能にする。抗原は上皮から輸送され、下部領域の免疫適格性B細胞、マクロファージ、および樹状細胞に提示される。結腸は、リンパ様濾胞と呼ばれる類似のリンパ様機構を持っている。リンパ様濾胞はPPと同一ではないが、やはりM細胞を含む特殊な上皮を持っており、恐らくは抗原提示部位として機能しているのであろう。
上皮の下には、固有層と呼ばれる組織があり、これは絨毛の中核を形成し、粘膜リンパ系高内皮と選択的に結合するホーミングレセプターを持つリンパ球が濃密に浸潤している。B細胞は、腸の固有層のリンパ球の約50%を含んでいるが、一方リンパ球の他の半分は、その殆どがCD4+でもあるCD3+T細胞である。正常な腸においては、固有層のB細胞の殆どはIgA+であるが、IgM−、IgG−およびIgD−発現細胞もまた見いだされる。腸内に分泌される免疫グロブリンは殆どIgAであり、分泌されるIgAの殆どがIgA−1イソタイプであるリンパ節とは対照的に、その半分はIgA−2である。IgA抗体が大量にあることは、恐らく固有層内部の免疫学的ホメオスタシスにとって重要であろう。IgA抗体は補体活性化といったような強力なエフェクター機能を欠き、故に、局所で産生されたまたは血清由来のIgG抗体により誘発される非特異的生物学的増幅機作を遮断することができる。
既に述べたように、CD3+T細胞は、固有層のリンパ球のほぼ半分を占めている。この表現型はヒトPP、特に高内皮性小静脈(HEV)を取り巻く濾胞間領域においても優勢である。これに対してCD8+Tリンパ球は、人間の上皮で優位を占めている。
誘導的および抑制的免疫調節機作が腸においてどの様に達成されるかは明らかでないが、固有層および上皮、ならびに組織化されたリンパ上皮小節および大型のリンパ系凝集塊、例えばPPが、恐らく全て複雑な様式で関わっているのであろう。
確立された粘膜IBD病変は、UCおよびCDのいずれにおいても、免疫グロブリン産生細胞が優勢となっている。しかしながら、IgA−およびIgM−発現細胞の数は正常粘膜と比較して数倍に増加するに過ぎないが、IgG−産生免疫細胞の数は、不釣合いに増加している。実際の数は疾病の重篤度に依存するが、UCおよびCDはいずれも、腸粘膜および末梢血の両者における特異的IgGイソタイプのレベルの選択的増加を含む劇的なIgG産生の増加、およびその結果としてのIgA/IgG比の著明な低下を特徴とする[R.P.マクダーモット等、Gastroenterology、96巻764−768頁(1989)]。
IgG産生の選択的な増加は、1または数個の抗原に対する免疫反応、ならびにサイトカインおよびその他の調節因子、例えばB細胞の異なる集団において免疫グロブリン産生を調節するトランスフォーミング成長因子β(TGF−β)の平衡を反映しているのかも知れないということが試験的に示唆されている[D.K.ポドルスキー、NEW England J.Med.、325巻928−937頁(1992)]が、現在の所この現象に対する満足できる説明はない。
T細胞集団の主たるサブセットの変化もまたIBDにおいて観察されている。CDにおいては、正常(CD45RAマーカーを欠く)およびEL−2R発現亢進(活性化)細胞より記憶細胞の方が多いという証拠がある。固有層のCD4+T細胞はUCにおいてCD8+T細胞に比較して増加しているようである。或る種のサイトカインの発現がIBDにおいて増大することが観察されている。これは、組織および循環の両方におけるインターロイキン1(IL−1)、インターロイキン6(IL−6)の発現増大、インターロイキン2(IL−2)およびそのレセプターの発現の変化を包含している[Y.R.マヒーダ等、Gut、30巻838−838頁(1989);K.クスガミ等、Gastroenterology、97巻1−9頁(1989);M.リグムスキー等、Gut、31巻686−689頁(1990)]。奇妙なことには、CDと診断された或る患者由来の組織に低レベルのIL−2およびIL−2レセプターが報告されている(クスガミ等、上記)。IL−1レセプターアンタゴニストは兎の大腸炎モデルにおいて炎症の重篤度を低減させるとの記載がある[F.コミネリ等、J.Clin.Invest.、86巻972−980頁(1990)]。UCおよびCDの両者における人間の白血球抗原複合体DR(HLA−DR)の上皮発現の著明な強化は、種々のサイトカインが活性化されたT細胞から局所的に放出されるとの提言を導いた[W.S.セルビー等、Clin.Exp.Immunol.、53巻614−618頁(1983);P.ブラントザーグ等、Ann.Gastroenterol.Hepatol.、21巻201−220頁(1985);T.O.ログナム等、Gut、23巻123−133頁(1982);S.フェイス等、Clin.Exp.Immunol.、605−612頁(1987)]。IFN−γおよび腫瘍壊死因子α(TNF−α)はいずれも腸の上皮上の上皮HLA−DRを増強することができるが、IBD病変におけるIFN−γの産生の立証では困難に遭遇した[T.T.マクドナルド、Clin.Exp.Immunol.、81巻301−305頁(1990)]。これに反して、UCおよびCD病変の両者について、TNF−αを産生する細胞の数の増加が観察されている(マクドナルド等、上記)。
結論として、IBDにおける相対的に低下したIgA産生および著しいIgG産生細胞の増加は、局所免疫防御機作の確立を反映しているかも知れないが、これらの変化の原因となる因子はまだ決定されていない。同様に、或る種のサイトカインおよびサイトカインレセプターがIBDの発症の際の役割を果たしているかも知れないという示唆にも拘らず、それらの個々の役割および複雑な相互作用はよく理解されていない。
潰瘍性大腸炎(UC)およびクローン病(CD)を包含する炎症性腸疾患(IBD)の予防または処置のための方法を提供することが本発明の目的である。
IFN−γインヒビターおよびIBDの開始または進行に関与する標的に対するさらなる特異性を含む二重特異性分子を提供することがもう一つの目的である。
IgA産生免疫細胞のパーセンテージの低下を含む疾患、例えばIBDの予防または処置に好適な薬用組成物の製造におけるIFN−γインヒビターの使用方法を提供することがさらに別の目的である。
これらのおよびさらなる本発明の目的は当業者にとって明らかであろう。
発明の要約
本発明は、IFN−γ産生の増大はIBD患者の腸における炎症、上皮上のHLA−DRの発現の増大、およびIgA:IgG比の変化に奏功するという前提に基づくものである。IFN−γは恐らく、IgAを産生するB細胞、とりわけ腸のIgA発現B細胞の約50%を構成するCD5+B細胞を選択的に殺すことにより、IgAサブタイプの免疫グロブリンの相対量を減少させる。しかしながら、このまたは他の何らかの理論によって拘束されることは意図されていない。
一つの態様において本発明は、炎症性腸疾患、例えば潰瘍性大腸炎またはクローン病に罹患しているまたは発症のおそれのある患者に治療的または予防的有効量のIFN−γインヒビターを投与することからなる方法に関するものである。IFN−γインヒビターは、例えば、抗IFN−γ抗体、IFN−γレセプターポリペプチド、抗IFN−γレセプター抗体、またはIFN−γ変異体由来のアミノ酸配列であってよい。この方法は人間および人間以外の動物、例えば哺乳動物、げっ歯類などの処置を包含する。
特定の態様において、IFN−γインヒビターは所望により安定な血漿蛋白と融合したIFN−γレセプターの細胞外ドメインを含む。安定な血漿蛋白は好ましくは免疫グロブリンであり、融合は好ましくは少なくとも免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域ならびにCH2およびCH3ドメインを含む。
別の態様において本発明は、IFN−γインヒビターアミノ酸配列およびIBDの開始または進行に関与する標的を結合することのできるさらなるアミノ酸配列を含む二重特異性分子に関するものである。前記と全く同様に、このIFN−γインヒビターはIFN−γレセプター、抗IFN−γ抗体、抗IFN−γレセプター抗体およびIFN−γ変異体であってよく、さらなるアミノ酸配列は好ましくは第一の特異性を提供するものとは異なるIFN−γインヒビター、IL−1インヒビター、TNF−αインヒビター、CD11a/18インヒビター、CD11b/18(VLA−4)インヒビター、またはL−セレクチンインヒビターに由来する。
特定の態様において、二重特異性分子は二重特異性免疫アドヘジンである。
さらなる態様において本発明は、本発明に係る二重特異性分子をコードしているヌクレオチド配列、係るヌクレオチド配列を含む発現ベクター、該発現ベクターにより形質転換された組み替え宿主細胞、および、コードされた二重特異性分子が発現されるよう係る宿主細胞を培養する方法に関するものである。
さらに別の態様において本発明は、IgA産生リンパ球のパーセンテージの低下を含む疾病の予防または処置のための薬用組成物の製造におけるIFN−γインヒビターの使用に関するものである。
不適当なレベル、場所、または発達段階でのIFN−γの産生は、幾つかの自己免疫および炎症性疾患ならびに移植片拒絶の病因に関連している。即ち、IFN−γは新たに診断された糖尿病の子供および多発性筋炎の患者の筋生検に存在した。さらにこれは、多発性硬化症および乾癬のような自己免疫疾患の増悪を惹起することが判明した。抗IFN−γ抗体は、マウスにおける致命的な免疫複合体糸球体腎炎を伴う狼瘡様疾病の進行を遅延させ、エンドトキシンの誘発する致死性を阻害し、そして単独または免疫抑制剤との組合せで同種移植片拒絶を阻害することが示された。マウスIFN−γレセプター細胞外部分および免疫グロブリン分子の定常ドメインからなる融合蛋白が作成され、自己免疫疾患、慢性炎症、遅延型過敏症および同種移植片拒絶に対する治療に有用であると提唱された[C.クルシュナー等、J.Biol.Chem.、267巻9354−9360頁(1992);Z.デムビック等、1992年インターフェロン系のISIR学会、トロント、オンタリオ、カナダ、1992年9月28日−10月2日、J.of Interferon Research、12巻追補1、1992年9月、抄録7−3頁]。しかしながら、IFN−γがIBDの進行に主要な役割を果たす場所は提唱されておらず、そして、前述のように、IBD病変におけるIFN−γの産生を立証する試みは成功しなかった。
【図面の簡単な説明】
図1 (A)IFNγR−IgG免疫アドヘジンの模式的構造。IFNγR(陰を付した棒)はヒトまたはマウスIFN−γレセプターの細胞外部分を示し、IgG−1(細い線)はヒトIgG−1重鎖のヒンジ領域ならびにCH2およびCH3定常ドメインを示す。推定的N結合グリコシル化部位の位置を示す(正方形の四角形)。(B−D)IFNγ−IgGのサブユニット構造。マウス(1、2列)またはヒト(3、3列)IFNγR−IgGの一過性発現を指令するベクターにより、HEK293細胞をトランスフェクトした。蛋白を培養上清から回収し、S.アウレウスの蛋白Aによる親和クロマトグラフィーによって精製した。10mMジチオトレイトール(DTT)による還元なし(−)または有り(+)でSDSポリアクリルアミド電気泳動を実施した。この蛋白をクマシーブルーで染色(B)またはイントロセルロース紙上にエレクトロブロッティングし、ヒトIgG Fcに対する抗体と共に(C)またはマウス(1、2列)またはヒト(3、4列)[125I]IFN−γ(10nM)単独(1、3列)、または1μM非標識ヒトもしくはマウスIFN−γ(2、4列)と共に(D)インキュベートした。ブロットを、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体および4−クロロナフトール(C)またはオートラジオグラフィー(D)によって発色させた。
図2 IFN−γに対するIFNγR−IgGの結合。ヒト(A)またはマウス(B)IFNγR−IgGを抗IgG Fc抗体で被覆した微量定量ウェルに固定し、漸増濃度のそれぞれ組替えヒトまたはマウス[125I]IFN−γと共にインキュベートした。飽和データのスキャッチャード分析を挿入図に示す。IFNγR−IgGを除外することにより非特異結合を決定し、これは典型的には結合全体の10%未満であった。データは、三重になされた代表実験からのものである。
図3 インビトロでのIFNγR−IgGによるIFN−γの阻害。(A)hIFNγR−IgGによる、ヒトHeLa細胞におけるICAM−1発現のhIFN−γ誘導の阻害(塗りつぶした丸)。(B)mIFNγR−IgGによる、マウスL929細胞におけるクラスI MHC抗原H2−KkのmIFN−γ誘導の阻害(白抜きの丸)。(C)生存または脳心筋炎ウイルス(EMCV)に感染したヒトA549細胞によって測定された、hIFNγR−IgGによるhIFN−γ抗ウイルス活性の阻害。(D)EMCVに感染したマウスL929細胞の生存によって測定された、mIFNγR−IgGによるmIFN−γ抗ウイルス活性の阻害。各図のデータは、重複の数が1(A、B)または4(C、D)である二つの実験からの平均値±SDである。それぞれの図において、負の対照としてCD4−IgG(白抜きの四角形)(A、B)、またはmIFNγR−IgG(C)、またはhIFNγR−IgG(d)を使用した。
図4 IFNγR−IgGによるマウスのリステリア症モデルにおけるIFN−γの阻害。マウスに媒質(白抜きの棒)、CD4−IgG200μg(陰を付した棒)、またはmIFNGR−IgG20μg(塗りつぶした棒)を注射し、その後直ちに4x104の生存しているリステリア・モノサイトジェネスを注射した。3日後、脾臓および肝臓のホモジネートを24時間継代培養し、コロニー形成単位(CFU)を計数した。データは代表的実験からの平均値±SEM(1群につきn=4のマウス)である。
図5は、銀染色により可視化したヒト胎児小腸の凍結切片中のグリコサミノグリカン(GAG)の量を示す図である。
発明の詳細な説明
I.定義
「炎症性腸疾患(IBD)」は、「潰瘍性大腸炎(UC)」および「クローン病(CD)」の総称として用いられる。UCおよびCDは一般に二つの異なった疾病として考えられているが、表面上皮の斑状壊死、腺窩に隣接する白血球の巣状蓄積、ならびに上皮内リンパ球(IEL)および或る種のマクロファージサブセットの増加、といったこれらの共通する性格が、単一の疾病群としてのこれらの処置を正当付ける。
「免疫グロブリンA(IgA)のパーセンテージの低下」という語は、IgA産生免疫細胞のパーセンテージの低下、またはIgAを産生するそれらの能力の低下、または他のいずれの因子に起因するとに拘らず、他のクラスの抗体、即ちIgG、IgM、IgD、IgE、とりわけIgGと比較した時の患者の体内のIgAクラスの抗体の相対量の低下を指すのに用いられる。処置されるべき状態がIBDであるならば、この低下は腸内部で起こる。
免疫インターフェロンとしても知られるインターフェロンγ(IFN−γ)はインターフェロンファミリーの一員であり、インターフェロンαおよびβに特徴的な抗ウイルスおよび抗増殖性を表わすが、これらのインターフェロンとは対照的にpH2で不安定である。IFN−γは元々リンパ球のマイトジェン誘導時に産生された。ヒトIFN−γの組み替え産生はグレイ、ゲッデルおよび共同研究者等によって最初に報告され[グレイ等、Nature、295巻503−508頁(1982)]、米国特許第4762791、4929544、4727138および4925793号の主題である。大腸菌において産生されたグレイおよびゲッデルの組み替えヒトIFN−γは146のアミノ酸からなり、この分子のN末端部分は配列CysTyrCysで始まっていた。後に、天然のヒトIFN−γ(即ちヒト末梢血リンパ球のマイトジェン誘導およびその後の精製によって産生されたもの)は、グレイ等、上記により指定されたCysTyrCysのN末端を欠くポリペプチドであることが判明した。本明細書中使用される「インターフェロンガンマ」または「IFN−γ」とは、容認されているインターフェロンガンマ検定、例えば適当なセルライン中でのウイルス複製の阻害(ヒトIFN−γに対してはヒト肺癌腫セルラインA549における脳心筋炎ウイルス複製の阻害)、クラスII抗原の誘導、熱不安定性、他の抗ウイルス、抗腫瘍もしくは免疫調節検定、またはガンマインターフェロンに対する免疫反応性は持っているがαまたはβインターフェロンに対する免疫反応性は持たない抗体による中和、による検定において生物活性であることが知られる全ての型(ヒトおよびヒト以外の動物)のインターフェロンγを多様に意味し、且つ、天然の供給源から得られ、化学合成され、または組み替えDNA技術により産生されるとに拘らず、成熟、pro、metまたはdes(1−3)(desCysTyrCysIFN−γとも呼ばれる)型のヒトインターフェロンγの包含を意味する。そのcDNAおよびアミノ酸配列を含む組み替えヒトインターフェロンガンマ(hIFN−γ)の製造の完全な説明は、上記引用の米国特許(例えば米国特許第4762791号)に示される。様々に末端切除された誘導体を包含するCysTyrCys欠失組み替えヒトIFN−γは、例えば欧州公開No.146354号に開示されている。動物を包含するヒト以外の動物のインターフェロン、例えば哺乳動物のIFN−γは、例えば欧州公開No.88622号に開示されている。この用語は、当分野で知られまたは将来利用できるようになるとに拘らず、係るインターフェロンの様々にグルコシル化された型ならびにその他の変異体および誘導体を包含する。係る変異体の例は、対立遺伝子、および、残基が除去され、挿入されそして/または置換されている位置指定突然変異生成の産物である(例えば上記引用の欧州公開No.146354号を参照されたい)。
互換的に用いられる表現「ヒトインターフェロンガンマ」、「ヒトIFN−γ」および「hIFN−γ」は、グレイ等、上記、のヒトIFN−γの全長(146アミノ酸)、この全長種の最初の3個のN末端アミノ酸を欠く天然ヒトIFN−γ(desCysTyrCysヒトIFN−γ)、およびそれらのアミノ酸配列変異体(但し、係る変異体をコードしているヌクレオチド配列は緊縮条件下で該天然アミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列の相補物とハイブリダイズすることができ、且つそれらはIFN−γの生物学的作用を示す能力を保持している)からなる一群のポリペプチド分子を指す。この定義は特に、天然供給源由来の、インビトロで合成により産生された、または組み替えDNA技術の方法を包含する遺伝学的操作により得られたヒトIFN−γを包含する。該アミノ酸配列変異体は、天然ヒトIFN−γアミノ酸配列の任意のドメイン、好ましくはレセプター結合ドメインと、好ましくは少なくとも約65%の配列相同性、より好ましくは少なくとも約75%の配列相同性、さらに好ましくは少なくとも約85%の配列相同性、最も好ましくは少なくとも約90%の配列相同性を共有する。この定義は特に、天然ヒトIFN−γおよびそのアミノ酸配列変異体の様々にグリコシル化されたおよびグリコシル化されていない型を包含する。
「天然ヒトインターフェロンガンマ」、「天然ヒトIFN−γ」および「天然hIFN−γ」という表現は、ヒトの末梢血リンパ球のマイトジェン誘導およびこれに続く精製から産生される成熟143アミノ酸天然ヒトIFN−γ、および天然に存在する任意のそのフラグメントまたは誘導体(但し、これはIFN−γの生物学的作用を示す)を指すのに用いられる。この定義は特に天然に存在するIFN−γの対立遺伝子を包含する。
「インターフェロンガンマインヒビター」および「IFN−γインヒビター」という表現は、互換的に用いられ、阻害の達成される機作に関わりなく天然IFN−γとそのレセプターとの相互作用を阻害しそれにより少なくとも炎症性腸疾患のインビトロモデルにおける天然IFN−γの病原性効果を遮断ことができるポリペプチドまたは有機分子を意味する。IFN−γインヒビターは特に、標準的な競合的結合検定において、天然IFN−γとの結合、または天然IFN−γレセプターとの結合(IFN−γアンタゴニスト)のいずれかによって天然IFN−γがその天然レセプターと結合するのを阻害することのできる分子を包含する。天然IFN−γと結合することによりIFN−γの作用を遮断するIFN−γインヒビターは、IFN−γレセプター、および(遮断)抗IFN−γ抗体を包含するが、これらに限定される訳ではない。これとは別に、IFN−γアンタゴニストは、天然IFN−γレセプター、例えば或る種のIFN−γ誘導体および抗IFN−γレセプター抗体を結合はするが活性化しないことによって作用することができる。
「インヒビター」という語は、サイトカイン、例えばIL−1、またはTNF−α;CD11a/18;CD1b/18(VLA−4);L−セレクチンのような他の分子に関連して類似的に使用される。
IFN−γレセプターは、人間[M.アグエットおよびG.マーリン、J.Exp.Med.、165巻988−999頁(1987);D.ノヴィック等、J.Biol.Chem.、262巻8483−8487頁(1987);J.カルデロン等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85巻4837−4841頁(1988)]およびマウス[M.バス等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85巻6282−6286頁(1988)]の異なる細胞型から精製され、細胞特異的なグリコシル化に起因する幾らかの構造的不均質性を示す90−95kDaの一本鎖の膜内在性糖蛋白として性格付けられた。ヒトIFN−γレセプターの一次配列は、λgt11で調製されたラジュ細胞発現ライブラリー由来の2.1kbヒトIFN−γレセプターcDNAをクローニングし、発現させ、そして配列決定したアグエット等、Cell、55巻273−280頁(1988)によって明らかにされた。マウスインターフェロンガンマ(IFN−γ)レセプターに対するcDNAのクローニングおよび発現は、P.W.グレイ等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86巻8497−8501頁(1989)によって報告された。「インターフェロンガンマレセプター」および「IFN−γレセプター」という語は互換的に用いられ、任意の動物種由来の任意の天然に存在する(天然)IFN−γレセプター、ならびに係るレセプターのアミノ酸配列およびグリコシル化変異体(但し、係る変異体をコードしているヌクレオチド配列は緊縮条件下で天然IFN−γレセプターをコードしているヌクレオチド配列の相補物とハイブリダイズすることができ、且つそれらはIFN−γと結合する能力を保持している)からなる一群のポリペプチド分子を指す。このアミノ酸配列変異体は、同じ(ヒトまたは非ヒト)動物種由来の天然IFN−γレセプターアミノ酸配列の任意のドメイン、好ましくはリガンド結合ドメインと、好ましくは少なくとも約65%の配列相同性、より好ましくは少なくとも約75%の配列相同性、さらに好ましくは少なくとも約85%の配列相同性、最も好ましくは少なくとも約90%の配列相同性を共有する。IFN−γレセプター(時にはIFN−γ結合蛋白と呼称される)は、例えば、1987年10月14日公開のEP240975号;1990年5月23日公開のEP369413号;1990年10月24日公開のEP393502号;1991年3月13日公開のEP416652号に開示されている。
互換的に使用される「ヒトインターフェロンガンマレセプター」および「ヒトIFN−γレセプター」という表現は、アグエット等、上記、により報告されたアミノ酸配列を有する全長の天然ヒトIFN−γレセプターおよびそのアミノ酸配列変異体(但し、係る変異体をコードしている核酸は緊縮条件下で該天然アミノ酸配列をコードしている核酸の相補物とハイブリダイズすることができ、且つそれらはIFN−γと結合する能力を保持している)からなる一群のポリペプチド分子を指す。この定義は特に、天然供給源由来の、インビトロで合成により産生された、または組み替えDNA技術の方法を包含する遺伝学的操作により得られた天然の全長ヒトIFN−γレセプターの可溶性型を包含する。該アミノ酸配列変異体は、天然全長ヒトIFN−γレセプターアミノ酸配列の任意のドメイン、好ましくはリガンド(IFN−γ)結合ドメインと、好ましくは少なくとも約65%の配列相同性、より好ましくは少なくとも約75%の配列相同性、さらに好ましくは少なくとも約85%の配列相同性、最も好ましくは少なくとも約90%の配列相同性を共有する。この定義は特に、任意の天然ヒトIFN−γレセプターおよびそのアミノ酸配列変異体の様々にグルコシル化されたおよびグリコシル化されていない型と包含する。
「緊縮条件」とは、20%ホルムアミド、5xSSC(150mM NaCl、15mMクエン酸三ナトリウム)、50mM燐酸ナトリウム(pH7.6)、5xデンハート溶液、10%硫酸デキストラン、および20μg/mlの変性させた剪断鮭精子DNAからなる溶液中42℃での一夜インキュベーションである。
「天然ヒトインターフェロンガンマレセプター」または「天然ヒトIFN−γレセプター」という語は、アグエット等、上記、により開示された成熟全長天然ヒトIFN−γレセプター、および任意の天然に存在するそのフラグメントまたは対立遺伝子変異体のような誘導体(但しこれはIFN−γと結合する能力を保持している)を指すのに用いられる。
「IFN−γ生物活性」を表わす変異体とも呼称される「生物活性な」IFN−γ変異体は、天然に存在するIFN−γ分子のエフェクター機能を共有し、これはさらに抗原機能を有していてよいが、その必要がある訳ではない。エフェクター機能は、天然IFN−γ分子のレセプター結合、任意の抗ウイルス、抗菌、細胞毒性、抗腫瘍、または免疫調節活性を包含する。抗原機能とは本質的には、天然に存在するIFN−γ分子に対して作成された抗体と交差反応することのできるエピトープまたは抗原部位の所有を意味する。「IFN−γ生物活性」を阻害する分子はIFN−γのエフェクター機能を阻害する。
「アミノ酸」および「アミノ酸類」という語は全ての天然に存在するL−α−アミノ酸を指す。アミノ酸は一文字または三文字表記により表示される:
Asp D アルパラギン酸 Ile I イソロイシン
Thr T スレオニン Leu L ロイシン
Ser S セリン Tyr Y チロシン
Glu E グルタミン酸 Phe F フェニルアラニン
Pro P プロリン His H ヒスチジン
Gly G グリシン Lys K リジン
Ala A アラニン Arg R アルギニン
Cys C システイン Trp W トリプトファン
Val V バリン Gln Q グルタミン
Met M メチオニン Asn N アスパラギン
これらのアミノ酸は側鎖の化学的組成および性質に従って分類することができる。これらは大きく二つの群、荷電および非荷電に分類される。これらの群の各々はアミノ酸をより正確に分類するため亜群に分けられる:
I.荷電アミノ酸
酸性残基:アスパラギン酸、グルタミン酸。
塩基性残基:リジン、アルギニン、ヒスチジン。
II.非荷電アミノ酸
親水性残基:セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン。
脂肪族残基:グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン。
非極性残基:システイン、メチオニン、プロリン。
芳香族残基:フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン。
「アミノ酸配列変異体」という語は、天然アミノ酸配列と比較してそのアミノ酸配列に若干の相違がある分子を指す。
「相同性」とは、配列を並列させ、必要ならば間隙を入れて最大の相同パーセントを達成させた時の、天然アミノ酸配列中の残基と同一である候補アミノ酸配列中の残基のパーセンテージとして定義される。並列のための方法およびコンピュータープログラムは当分野で良く知られている。
置換変異体は、天然配列中少なくとも1個のアミノ酸残基を除去し、代わりに異なったアミノ酸を同じ位置に挿入した変異体である。置換は、分子中ただ1個のアミノ酸が置換されている単一、または2もしくはそれ以上のアミノ酸が同一分子内で置換されている多重であってよい。
挿入変異体は、天然配列中、特定の位置のアミノ酸と直接隣接して1またはそれ以上のアミノ酸が挿入されている変異体である。或るアミノ酸に直接隣接して、とは、当該アミノ酸のα−カルボキシまたはα−アミノ官能基のいずれかと結合していることを意味する。
除去変異体とは、天然アミノ酸配列中1またはそれ以上のアミノ酸が除去されている変異体である。通常、除去変異体は当該分子の特定の領域で1またはそれ以上のアミノ酸が除去されている。
「グリコシル化変異体」という語は、天然のグリコシル化プロフィルとは異なったグリコシル化プロフィルを有する糖蛋白を指すのに用いられる。ポリペプチドのグリコシル化は典型的にはN結合またはO結合のいずれかである。N結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列アスパラギン−X−セリンおよびアスパラギン−X−スレオニン[ここでXはプロリン以外の任意のアミノ酸である]が、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。O結合グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も普通にはセリンまたはスレオニンへの、糖N−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの一つの結合を指すが、5−ヒドロキシプロリンまたは5−ヒドロキシリジンもまたO−結合グリコシル化に含まれ得る。天然のIFN−γレセプター蛋白と比較した、IFN−γレセプター蛋白中に存在する炭水化物部分の位置および/または性質のいかなる相違も本発明の範囲内にある。
「安定な血漿蛋白」とは、それらの天然の環境において循環中長時間の半減期、即ち約20時間以上の半減期を示す、典型的には約30ないし約2000残基を有する蛋白である。好適な安定な血漿蛋白の例は、免疫グロブリン、アルブミン(例えばヒト血清アルブミン、HSA)、リポ蛋白、アポリポ蛋白およびトランスフェリンである。
抗体(Ab)および免疫グロブリン(Ig)は同じ構造的性格を有する糖蛋白である。抗体が特異的抗原に対する結合特異性を示すのに対し、免疫グロブリンは抗体および抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両者を包含する。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系によって低レベルで、そして骨髄腫によって高レベルで産生される。
天然の抗体および免疫グロブリンは通常、二つの同一の軽(L)鎖および二つの同一の重(H)鎖から成る約150000ダルトンのヘテロ四量体糖蛋白である。各々の軽鎖は1個のジスルフィド共有結合によって重鎖に結合しているが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンイソタイプの重鎖間で相違する。各々の重および軽鎖はさらに、規則的な間隙の鎖内ジスルフィド橋を有する。各重鎖は一方の端に可変ドメイン(VH)、続いて幾つかの定常ドメインを持っている。各軽鎖は一方の端に可変ドメイン(VL)および他方の端に定常ドメインを持っている。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと並列し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並列している。特定のアミノ酸残基は軽鎖および重鎖の可変ドメインの間に界面を形成していると信じられている[クロチア等、J.Mol.Biol.、186巻651−663頁(1985);ノヴォトニーおよびヘイバー、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、82巻4592−4596頁(1985)]。
変化性は抗体の可変領域全体に均等に分布してはいない。それは、軽鎖および重鎖可変領域のいずれにおいても、相補性決定領域(CDR)または超可変領域と呼ばれる三つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク(FR)と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、主にβシートコンフィギュレーションを採り、このβシート構造をつなぎ且つ幾つかの場合にはこのβシート構造の一部を形成しているループを形成する3個のCDRによって結合している4個のFR領域を各々含んでいる。各鎖のCDRはFR領域により極めて近位に保持されており、他の鎖由来のCDRと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与している[E.A.カバット等、Sequences of Proteins of Immunological Interest、ナショナル・インスティテュート・オブ・ヘルス、ベセスダ、MD(1987)を参照されたい]。定常ドメインは抗体を抗原に結合させるのに直接関わってはいないが、例えば抗体依存性細胞毒性への抗体の参加といった様々なエフェクター機能を表わす。
抗体のパパイン消化は、それぞれ1個の抗原結合部位を有するFabフラグメントと呼ばれる2個の等しい抗原結合フラグメント、および、その名称が、容易に結晶化するその能力を反映している、残りの「Fc」フラグメントを産む。ペプシン処理は、2個の抗原結合部位を持ち、なお抗原と交差反応できるF(ab')2フラグメントを生成する。
「Fv」は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、1個の重鎖および1個の軽鎖可変ドメインが緊密に非共有結合的に結び付いた二量体で構成される。それぞれの可変ドメインのCDR3個が相互作用してVH−VL二量体の表面上の抗原結合部位を規定するのはこのコンフィギュレーションにおいてである。集合的にこの6個のCDRは抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、たとえ1個の可変ドメイン(または或る抗原に特異的なわずか3個のCDRを含むに過ぎないFvの半分)でも、結合部位全体より親和性は低いものの、抗原を認識し結合する能力を持っている。
Fabフラグメントはさらに、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメイン(CH1)を含む。Fab'フラグメントは、重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端に、抗体のヒンジ領域由来の1またはそれ以上のシステインを含む数個の残基が加わっているという点でFabフラグメントと異なっている。Fab'−SHとは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持っているFab'に対する本明細書中での表記である。最初F(ab')2抗体フラグメントは、間にヒンジのシステインを有するFab'フラグメントの対として生成された。その他の、抗体フラグメントの化学的結合物もまた知られている。
任意の脊椎動物種由来の抗体(免疫グロブリン)の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパおよびラムダ(λ)と呼ばれる二つの明確に識別できる型の一つに割り当てることができる。
重鎖の定常域のアミノ酸配列に応じて免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。5つの主要な免疫グロブリンのクラス:IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMがあり、これらの幾つかはさらにサブクラス(イソタイプ)、例えばIgG−1、IgG−2、IgG−3、およびIgG−4;IgA−1およびIgA−2に分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、デルタ、イプシロン、γ、およびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元コンフィギュレーションは良く知られている。IgA−1およびIgA−2はIgAの単量体サブクラスであって、通常、二量体またはより大きなポリマーの形をとっている。腸の免疫細胞は、主としてポリマーのIgA(二量体およびより高次のポリマーを包含してポリIgAとも呼称される)を産生する。係るポリIgAは「ジョイニング」または「J」鎖と呼ばれるジスルフィド結合したポリペプチドを含み、5個のサブユニットを含むJ鎖含有ポリマーIgM(ポリIgM)と共に腺上皮を通って運搬され得る。
「抗体」という語は、本明細書中では最も広い意味に用いられ、特に、対応するポリペプチド、例えばIFN−γまたはIFN−γレセプターと免疫学的に反応する単一のモノクローナル抗体、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント並びに係る性質を有する多エピトープ特異性を有する抗IFN−γおよび抗IFN−γレセプター抗体組成物を包含する。
本明細書中使用される「モノクローナル抗体」という語は、実質上均質な抗体の集団、即ち、その集団を構成する個々の抗体が、少量で存在し得る天然に起こる可能性のある突然変異を除いては同一である、集団から得られる抗体(上記定義による)を指す。モノクローナル抗体は極めて特異性が高く、単一の抗原部位に対するものである。さらに、典型的には異なる決定基(エピトープ)に対する異なった抗体を含む普通の(ポリクローナル)抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。特異性に加え、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンにより汚染されないハイブリドーマ培養によって合成されるという点で有利である。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型とは、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小の配列を含む免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント(例えばFv、Fab、Fab'、F(ab')2またはその他の、抗体の抗原結合部分配列)である。大抵は、ヒト化抗体は、受容者の相補性決定領域(CDR)由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギといった非ヒト種(ドナー抗体)のCDR由来の残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン(受容者抗体)である。幾つかの例においては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、受容者の抗体にも導入されたCDRまたはフレームワーク配列にも見いだされない残基を含むことがある。これらの修飾は、抗体の挙動をさらに洗練されたそして最適なものとするためになされる。
「二重特異性分子」という句は、二つの特異性を有するポリペプチドの定義に使用される。二つの特異性(「結合ドメイン」)を提供するアミノ酸配列は、互いに直接融合し、または「リンカー」を用いて連結することができる。リンカーは、二つの結合ドメインのそれぞれの天然レセプターもしくはリガンドに結合する能力またはその形成が係る架橋剤によりもたらされる結合を損なうことなく、二つの結合ドメインを連結することのできる共有結合架橋剤の残基であってよい。係る試薬の選択に対する指針およびそれらの製造方法を含む共有結合架橋剤の簡潔な総説は、H.タエ・Jr.、Meth.Enzymol.、580−609頁(1983)およびこれに引用されている参考文献により提供される。入手し得る多彩な架橋剤から特定の目的のために最も好適な試薬を選択することは、当業者の技量に充分足ることである。一般に、ゼロ長、ホモまたはヘテロ二価架橋剤が本発明に係る二重特異性分子の製造に好ましい。ゼロ長架橋剤は、外因性物質の導入なしに二つの結合ドメインの直接的コンジュゲーションを誘導する。ジスルフィド結合の形成を触媒する物質はこの範疇に属する。もう一つの例は、カルボキシおよび一級アミノ基の縮合を誘導してアミド結合を形成させる、カルボジイミド、クロロ蟻酸エチル、ウッドワード試薬K1、カルボニルジイミダゾール等の試薬である。ホモ二価試薬は2個の等しい官能基を持つが、一方ヘテロ二価試薬は2個の異なる官能基を含む。ヘテロ二価架橋剤の大半は一級アミンに反応する基およびチオールに反応する基を含んでいる。チオール結合に対するホルミルのための新規なヘテロ二価リンカーが、N.D.ハインデル等、Bioconjugate Chem.、2巻247−430頁(1991)]により開示された。好ましい態様においてこの共有結合架橋剤は、ジスルフィド(−S−S−)、グリコール(−CH[OH]−CH[OH]−)、アゾ(−N=N−)、スルホン(−S[=O2]−)、またはエステル(−C[=O]−O−)橋を形成することのできる試薬から選択される。別の試みにおいては結合ドメインはそれらのオリゴ糖を介して結合する。ポリペプチドリガンド上のオリゴ糖のアルデヒドへの化学的または酵素的酸化は、当該分子上に、例えばアミン、ヒドラジン、ヒドラジド、またはセミカルバジドを含む化合物と反応することができる特異な官能基を生成させる。グリコシル化部位はポリペプチド分子において充分明確であるため、酸化されたオリゴ糖部分を介した選択的結合は、他の結合法よりも均一な生成物を産むであろうし、リガンドのレセプター結合性への望ましくない作用が少ないと予想される。炭水化物を目的とするヘテロ二価架橋剤4−(4−N−マレイミドフェニル)酪酸ヒドラジドHCl(MPBH)が、例えばシャモウ等、J.Biol.Chem.、267巻15916−15922頁(1992)に記載された。MPBH(生成物#22302)はピアス・ケミカル・カンパニー、ロックフォード、イリノイから、類似構造を有する他の試薬、例えば4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシヒドラジドHCl(M2C2H;生成物#22304)、および3−(2−ピリジルチオ)プロピオニルヒドラジド(PDPH;生成物#2230)と共に購入できる。種々の連結した配列、例えば架橋剤による二つ以上の結合配列の結合は可能であり、且つ本発明の範囲内にあることが理解されるであろう。
さらなる態様において本発明に係る二重特異性分子では、結合ドメインがポリペプチドリンカー配列によって接続され、したがってそれらのレセプター/リガンドに一本鎖多価ポリペプチド分子として提示される。ポリペプチドリンカーは「スペーサー」として機能するが、この機能は、機能的結合ドメインを分離してそれらが適正な三次コンホメーションを独立してとることができるようにすることである。ポリペプチドリンカーは通常約5および約25の間の残基からなり、好ましくは少なくとも約10、より好ましくは少なくとも約15のアミノ酸を含み、そして、全体として親水性の、比較的体系的でない領域を供するアミノ酸残基で構成される。殆どまたは全く二次構造の無いアミノ酸配列の連結はうまくいく。所望ならば、特異的開裂試薬(例えばプロテアーゼ)により認識される1またはそれ以上の特異な開裂部位をこのポリペプチドリンカーに入れておくことができる。スペーサー中の特異的アミノ酸は様々であるが、システインは避けるべきである。スペーサー配列は、通常天然の二価リガンドにおいて二つのレセプター結合ドメインを連結するアミノ酸配列の三次構造に似ていてよい。これはさらに、螺旋構造のような所望の構造をとるよう設計することもできる。好適なポリペプチドリンカーは、例えば、係るリンカーを含む多価蛋白の製造方法のように、WO88/09344号(1988年12月1日公開)に開示されている。
さらなる特定の態様において、結合ドメインは両親媒性ヘリックスによって連結される。遺伝子調節蛋白中に繰り返し出現するアミノ酸ロイシン(Leu)のコピーが、二量体を形成させるために二つの蛋白分子を「ジッパーのように閉じる」歯として働くことが知られている。ロイシンジッパーは、蛋白C/EBPの小セグメントが仮説上のαヘリックスに合致した際に最初に発見された。驚くべき事に、この蛋白の7アミノ酸毎に存在するロイシンは、柱状に並んでいた。続いてさらに二つのC/EBP関連蛋白が同定され、同様の機能を有することが示された。これらのうちの一方GCN4は酵母由来の遺伝子調節蛋白であり、他方はプロトオンコジーンjunの産物である。ジッパー領域はそれらが結び付く際に平行に結合、即ち向かい合う分子上のロイシンは同位置に並ぶことがわかった。さらに、同一でない蛋白もジッパーのように閉じてヘテロ二量体を供する事が示された。このようなロイシンジッパーは本発明の範囲内の二重特異性分子の製造に特に適している。別法として、この両親媒性ヘリックスの配列は、P.パックおよびA.プラックサン、Biochemistry、31巻1579−1584頁(1992)により本質的に記載されるように、4ヘリックス束のデザインから取得することもできる。本発明の目的のためのリンカーとして働くことのできる分子、例えばロイシンジッパーについてのさらなる詳細に関しては、例えばW.H.ランドシュクルツ等、Science、240巻1759−1764頁(1988);E.K.オシア等、Science、243巻538−542頁(1989);S.L.マクナイト、Scientific American、54−64頁、1991年4月;T.シュミット−ドール等、Biochemistry、30巻9657−9664頁(1991);A.ブロンデルおよびH.ベドゥエル、Protein Engineering、4巻457−461頁(1991)、P.パックおよびA.プラックサン、上記、ならびにこれらの論文に引用されている文献を参照されたい。
好ましい態様において、リンカーは、好ましくは二重特異性免疫アドヘジンを生成する免疫グロブリン配列を含む。
本明細書中使用される「免疫アドヘジン」という語は、ヘテロローガスな蛋白(「アドヘジン」)の結合特異性を免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能と結び付ける抗体様分子を指す。構造的には、免疫アドヘジンは、抗体の抗原認識および結合部位以外の所望結合特異性を有する(即ち「ヘテロローガスな」)アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合からなる。免疫アドヘジン分子のアドヘジン部分は、典型的には少なくともレセプターまたはリガンドの結合部位を含む隣接するアミノ酸配列である。免疫アドヘジン中の免疫グロブリン定常ドメイン配列は、IgG−1、IgG−2、IgG−3、またはIgG−4サブタイプ、IgA(IgA−1およびIgA−2を包含する)、IgE、IgDまたはIgMといった任意の免疫グロブリンから得ることができる。
本明細書中使用される「二重特異性免疫アドヘジン」という句は、少なくとも二つの結合特異性を持ち、その一方が抗体の抗原結合部位であり得る免疫アドヘジンを指す。二重特異性免疫アドヘジンは一般にヘテロ多量体、特にヘテロ二量体、ヘテロ三量体またはヘテロ四量体として、本質的にはWO89/02922号(1989年4月6日公開)またはEP314317号(1989年5月3日公開)に開示されるように組み立てることができる。本発明に係る二重特異性分子中の二つの所望特異性を提供する結合ドメインが、好ましくは免疫グロブリンの可変ドメインにとって代わるのに対し、これらを免疫グロブリン重鎖および軽鎖配列の間に挿入して、キメラ重鎖を含む免疫グロブリンを得ることもできる。この態様において、結合配列は、ヒンジおよびCH2ドメインの間、またはCH2およびCH3ドメインの間のいずれかにおいて、免疫グロブリンの各アームにある免疫グロブリン重鎖の3'末端に融合する。類似の組み立て物がH.R.フーゲンブーム等、Mol.Immunol.、28巻1027−1037頁(1991)により報告されている。
「二重特異性抗体」という語は、本明細書中で、二つの異なる抗原結合部位を含む抗体分子の表現に用いられる。二重特異性抗体は、二重特異性免疫アドヘジンについて上に記載したように、ヘテロ多量体、とりわけヘテロ二量体、ヘテロ三量体またはヘテロ四量体として組み立てることができる。
「(免疫グロブリン)軽鎖結合部位を欠く免疫グロブリン重鎖定常ドメイン配列」という表現は、軽鎖がそこに通常連結する配列要素が除去されまたは係る結合がもはや不可能であるに充分変化(突然変異)している免疫グロブリン重鎖定常ドメイン配列を指すのに用いられる。好ましい態様においてはCH1ドメイン全体が除去されるが、軽鎖が通常ジスルフィド結合するまたは非共有結合的に相互作用する部分が除去される限り、免疫グロブリン定常ドメインのより短い末端切除もまた好適である。別法として、免疫グロブリン重鎖定常ドメインの軽鎖結合領域を突然変異(置換または挿入による)させて、これがもはや免疫グロブリン軽鎖と共有結合または非共有結合しないようにすることもできる。
「をコードしている核酸分子」、「をコードしているDNA配列」、および「をコードしているDNA」という語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、ポリペプチド鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。DNA配列はこのようにしてアミノ酸配列をコードしている。
核酸は、これが他の核酸配列と機能的関係になるよう位置する時「機能的に結合」している。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのDNAは、もしそれがポリペプチドの分泌に参加するプレ蛋白として発現されるならば、該ポリペプチドをコードしているDNAと機能的に結合しており;プロモーターまたはエンハンサーは、もしそれが該配列の転写に影響するならば、コード化配列と機能的に結合しており;リボゾーム結合部位は、もしそれが翻訳を促進するような位置にあるならば、コード化配列と機能的に結合している。一般に、「機能的に結合」とは、結合しているDNA配列が隣接しており、そして、分泌リーダーの場合は隣接し且つ読み取り相内にあることを意味する。しかしながらエンハンサーは隣接している必要が無い。結合は、簡便な制限部位でのライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合は、常法に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。
「複製可能な発現ベクター」及び「発現ベクター」という語は、それに外来DNA断片を挿入することのできる、通常二本鎖のDNA断片を指す。外来DNAとは、宿主細胞中に天然に見いだされないDNAであるヘテロローガスなDNAとして定義される。この外来またはヘテロローガスなDNAを適当な宿主細胞中に運搬するために、ベクターが使用される。いったん宿主細胞に入ると、ベクターは宿主染色体DNAとは独立して複製することができ、このベクターおよびその挿入された(外来)DNAのコピーを幾つか生成させることができる。さらにベクターは、この外来DNAをポリペプチドに翻訳させるのに必要な要素を含んでいる。このようにして、この外来DNAによりコードされている多数のポリペプチド分子を迅速に合成することができる。
本発明の文脈において、「細胞」、「セルライン」、および「細胞培養」という表現は互換的に用いられ、係る表記はすべて子孫を包含する。全ての子孫は、故意または偶然の突然変異のため、DNA含量が正確に同一ではあり得ないこともまた理解されるであろう。最初に形質転換された細胞中でスクリーニングされたのと同じ機能または生物学的性質を有する、突然変異体の子孫が包含される。
「形質転換」とは、生物内部にDNAを導入して、該DNAを染色体外要素としてまたは染色体への組み込みによって複製可能とすることを意味する。
「トランスフェクション」とは、コード化配列が実際に発現されるか否かに拘らず、宿主細胞によって発現ベクターが取り込まれることを指す。
「形質転換された宿主細胞」および「形質転換された」という語は、細胞中へのDNAの導入を意味する。該細胞は「宿主細胞」と呼称され、前核生物または真核生物細胞であってよい。典型的な前核生物宿主細胞は大腸菌の種々の菌株を包含する。典型的な真核生物宿主細胞は哺乳動物、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞またはヒト胚腎臓293細胞である。導入されたDNAは通常、挿入されたDNA断片を含むベクターの形をとっている。導入されるDNA配列は宿主細胞と同じ種由来、もしくは宿主細胞とは異なる種由来であってよく、または幾らかの外来および幾らかのホモローガスDNAを含むハイブリッドDNA配列であってよい。
「オリゴヌクレオチド」とは、既知の方法[例えば1988年5月4日公開のEP266032号に記載のような固相技術を用いたホスホトリエステル、亜燐酸、もしくはホスホルアミダート化学、またはフレーラー等、Nucl.Acids Res.、14巻5399頁(1986)に記載のようなデオキシヌクレオシドH−ホスファナート中間体による]により化学合成された、短い一本鎖または二本鎖ポリデオキシヌクレオチドである。これらはその後ポリアクリルアミドゲル上で精製される。
「ライゲーション」とは、二つの二本鎖核酸フラグメント間にホスホジエステル結合を形成する過程を指す(マニアティス等、モレキュラー・クローニング:ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、1982、146頁)。別途記載の無い限り、ライゲーションは、ほぼ当モル量のライゲーションされるべきDNAフラグメント0.5μgにつき10単位のT4DNAリガーゼ(「リガーゼ」)という条件および既知の緩衝液を用いて達成することができる。DNAの「消化」とは、そのDNAの或る位置にのみ作用する酵素でDNAを触媒的に開裂することを指す。このような「制限酵素」は特異的な「制限部位」を認識する。本発明において用いられる様々な制限酵素は市販品を入手でき、酵素の供給者により確立されたそれらの制限条件、補助因子およびその他の要件が用いられた。一般に、約1μgのプラスミドまたはDNAフラグメントを緩衝溶液約20μl中の酵素約2単位と共に使用する。特定の制限酵素のための適当な緩衝液および基質の量は製造者により明記されている。37℃で約1時間のインキュベーション時間が通常用いられるが、供給者の指示に従って変更することができる。インキュベーションの後、蛋白をフェノールおよびクロロホルムでの抽出によって除去し、消化された核酸をエタノールを用いる沈澱により水性画分から取り出す。制限酵素による消化の後、稀に末端5'燐酸の細菌アルカリホスファターゼ加水分解を行なって、制限部位への別のDNAフラグメントの挿入を妨げるDNAフラグメントの2個の制限開裂した末端の「環化」または閉鎖ループの形成を防止する。別途記載の無い限り、プラスミドの消化後に5'末端脱燐酸化は行なわない。脱燐酸化のための方法および試薬は常套的である(マニアティス等、上記、133−134頁)。
II.IFN−γインヒビターの有用性
A.抗IFN−γおよび抗IFN−γレセプター抗体
天然のIFN−γの様々な生物活性を遮断する抗IFN−γ抗体(しばしば「中和抗体」と称する)は当分野で知られており、例えば以下の出版物に開示されている:A.ビリョウ、Immunol.Today、9巻37−40頁(1988);H.ヘレマン等、J.Exp.Med.、171巻1853−1859頁(1990);S.ランドルフォ等、Science、229巻176−179頁(1985);R.H.ディドレイク等、Transplantation、45巻222−223頁(1988)、C.O.ジェイコブ等、J.Exp.Med.、166巻789−803頁(1987);V.W.ヨング等、Natl.Acad.Sci.USA、88巻7016−7020頁(1991)]。
天然IFN−γがそのレセプターに結合するのを阻害し、それによりIFN−γの生物活性を遮断する、天然IFN−γレセプターに対する抗体は、例えば、1990年5月23日公開のEP369413号;1990年10月24日公開のEP393502号;1991年3月13日公開のEP416652号;1987年10月14日公開のEP240975号;および1990年1月30日登録の米国特許第4897264号に開示されている。
以下は、係る抗体の作成に使用することのできる、或る、普通に用いられる技術についての簡潔な記載である。これらのおよび類似の技術のさらなる詳細は、一般的な教科書、例えばキャビリー等、米国特許第4816567号;メイジおよびラモイ、上記;サムブルック等、モレキュラー・クローニング:ア・ラボラトリー・マニュアル、第二版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク、1989;およびカレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、アウスベル等編、グリーン・パブリッシング・アソシエイツ・アンド・ウィレイ−インターサイエンス、1991に見いだされる。
IFN−γの生物学的作用のアンタゴニストとして働く抗IFN−γおよび抗IFN−γレセプター抗体は、当分野で知られる任意の方法により生成することができる。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、コーラーおよびミルシュタイン、Nature、256巻495頁(1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって、または組み替えDNA法[キャビリー等、上記]によって作成することとができる。
ハイブリドーマ法においては、マウスまたはその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを、皮下、腹腔内、または筋肉内経路によりヒトIFN−γまたはIFN−γレセプター蛋白で免疫して、免疫に使用された蛋白と特異的に結合する抗体を生成させるまたは生成させることのできるリンパ球を導く。別法として、リンパ球はインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる[J.ゴディング、モノクローナル・アンティボディーズ:プリンシプルズ・アンド・プラクティス、59−103頁(アカデミック・プレス、1986)]。
このように製造されたハイブリドーマ細胞を播種し、好ましくは、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する物質を1またはそれ以上含有する適当な培養基中で増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞がヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRTまたはHPRT)を欠いているならば、このハイブリドーマのための培養基は典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含有し(HAT培地)、これらの物質がHGPRT欠失細胞の増殖を防止する。
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支持し、そしてHAT培地のような培地に対し感受性である。これらの中でも好ましい骨髄腫セルラインは、マウス骨髄腫ライン、例えばソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、USAから入手し得るMOPC−21およびMPC−11マウス腫瘍から誘導されるセルライン、およびアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、メリーランド、USAから入手し得るSP−2細胞である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫セルラインもまたヒトモノクローナル抗体の生産のために記載されている。コズボア、J.Immunol.、133巻3001頁(1984)。ブロデュア等、モノクローナル・アンティボディ・プロダクション・テクニークス・アンド・アプリケーションズ、51−63頁(マーセル・デッカー・Inc.、ニューヨーク、1987)。
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養基をIFN−γまたはIFN−γレセプターに対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(RIA)または酵素結合免疫吸着検定(ELISA)によって測定する。本発明に係る方法および組成物に使用するためのモノクローナル抗体は、被験試料中に存在するIFN−γまたはIFN−γレセプターを選択的に免疫沈降させ、または結合検定においてIFN−γもしくはIFN−γレセプターに選択的に結合し、そしてインビトロもしくはインビボの炎症性腸疾患モデルにおいてIFN−γの有害な効果を遮断することができるものである。
ハイブリドーマ細胞が、所望の特異性、親和性、および活性の抗体を産生すると同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準法により増殖させることができる(J.ゴディング、上記)。この目的のための好適な培養基は、例えばダルベッコの改良イーグル培地またはRPMI−1640培地である。さらに、このハイブリドーマ細胞は動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、培養基、腹水、または血清から、常套的免疫グロブリン精製法、例えば蛋白A−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和クロマトグラフィーにより適当に分離される。モノクローナル抗体の精製方法は当分野で良く知られており、例えば「カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、上記、の単元11.11、およびそこに引用されている文献に開示されている。
ハイブリドーマ上清中に存在する特異抗体の量は、固相ラジオイムノアッセイ(RIA)または直接的酵素結合免疫吸着検定(ELISA)のいずれかによって定量することができる。固相ラジオイムノアッセイでは、連続希釈した抗血清を、予めIFN−γまたはIFN−γレセプターで被覆した微量定量ウェル中でインキュベートする。結合した抗体を125I標識した抗免疫グロブリン抗体を用いて検出する。次いで抗血清中の特異抗体の量を、既知濃度の特異抗体で作成した検量線から決定する。未知の抗血清および標準抗体を平行して検定する。アイソトープ測定に用いられるRIA法、およびELISA法のためのプロトコルは、例えば「カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、上記、のV項目、およびそこに引用されている文献に開示されている。
本発明方法において有用なモノクローナル抗体をコードしているDNAは、常法を用いて容易に分離し配列決定される(例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子と特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによる)。上記のハイブリドーマ細胞は係るDNAの好ましい供給源の役割を有する。分離されたなら、このDNAを発現ベクター中に入れ、次いでこれをサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、またはこの場合以外免疫グロブリン蛋白を産生しない骨髄腫細胞といった宿主細胞中にトランスフェクトさせて、組み替え宿主細胞でのモノクローナル抗体の合成を得る。
B.天然IFN−γの生物活性を阻害するIFN−γ変異体
IFN−γの組み替え産生はグレイ、ゲッデルおよび共同研究者等によって最初に報告され[グレイ等、Nature、295巻503−508頁(1982)]、米国特許第4762791、4929544、4727138、および4925793号の主題となっている。様々に末端切除された誘導体を包含する、最初の3個のN末端アミノ酸(CysTyrCys)を欠失する組み替えIFN−γポリペプチドは、例えば欧州公開第146354号に開示されている。IFN−γを包含する非ヒト動物インターフェロンは、例えば欧州公開第88622号に開示されている。組み替えヒトガンマインターフェロン(rhIFN−γ、アクチミューン(商標)、ジェネンテク、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア)は、食細胞の機能不全に起因する重篤な再発性の皮膚、リンパ節、肝臓、肺、および骨の感染を特徴とする慢性肉芽腫症の処置のための免疫調節薬としてFDAの認可を受けており、市販品を入手できる。
任意の天然または組み替えIFN−γ種のアミノ酸配列、グリコシル化変異体および共有結合誘導体を、当分野で知られる方法によって製造することができる。一般に、IFN−γをコードしているDNAの特定の領域または部位が突然変異生成の標的とされ、したがってこれを達成するために用いられる一般法を位置指定突然変異生成と称する。この突然変異は、制限エンドヌクレアーゼ(DNAを特定の位置で開裂する)、ヌクレアーゼ(DNAを減成する)および/またはポリメラーゼ(DNAを合成する)のようなDNA修飾酵素を用いて施される。DNAの制限エンドヌクレアーゼ消化とその後のライゲーションは、サムブルック等、上記、の15.3項に記載されるように、除去を生成させるために使用することができる。
オリゴヌクレオチド指定突然変異生成は、IFN−γの置換変異体の製造に好ましい方法である。これは、本発明に従って使用することができる除去および挿入変異体を簡便に製造するのにも使用することができる。この技術はアーデルマン等[DNA、2巻183頁(1983)]により記載されるように、当分野で良く知られている。オリゴヌクレオチドは、クレア等[Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA、75巻5765頁(1978)]により記載されているような当分野で良く知られる技術を用いて容易に合成される。この技術に使用するための一本鎖鋳型の生成は、サムブルック等、上記、の4.21−4.41項に記載されている。
PCR突然変異生成もまた本発明方法に使用できるIFN−γ変異体の作成に好適である。PCR技術は、例えば1987年7月28日登録の米国特許第4683195号、サムブルック等、モレキュラー・クローニング:ア・ラボラトリー・マニュアル、第二版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク、1989、の14項、またはカレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、アウスベル等編、グリーン・パブリッシング・アソシエイツ・アンド・ウィレイ−インターサイエンス、1991の15章に開示されている。
本発明に係るIFN−γ変異体をコードしているDNAは、さらなるクローニングおよび発現のために、複製可能な発現ベクター中に挿入される。多くのベクターが入手可能であり、適当なベクターの選択は、1)それがDNA増幅(クローニング)のために使用されるのかまたは発現のために使用されるのか、2)該ベクター中に挿入されるDNAの大きさ、および3)該ベクターにより形質転換される宿主細胞、に依存するであろう。各ベクターは、その機能およびそれが適合する宿主細胞に応じて種々の構成成分を含んでいる。ベクターの構成成分は一般に、1またはそれ以上の以下のもの:シグナル配列、複製起点、1またはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーターおよび転写ターミネーター配列、を含むがこれらに限定される訳ではない。
好適なベクターは標準的組み替えDNA法を用いて製造される。分離されたプラスミドおよびDNAフラグメントを開裂し、修復し、そして所望ベクターが生成されるよう特定の順序にライゲーションする。
ライゲーションの後、外来遺伝子が挿入されたベクターを適当な宿主細胞中に導入する。形質転換された細胞を、該ベクター上のtetおよび/またはamp耐性遺伝子の存在のためにそれらが耐性とされた抗生物質、通常テトラサイクリン(tet)またはアンピシリン(amp)上で増殖させることにより選択する。ライゲーション混合物が真核動物宿主細胞中に導入されたならば、形質転換された細胞は上記のDHFR/MTX系によって選択することができる。形質転換された細胞を培地中で増殖させ、次いでプラスミドDNA(プラスミドとは、目的とする外来遺伝子にライゲーションされたベクターを指す)を分離する。次にこのプラスミドDNAを制限地図作成および/またはDNA配列決定によって分析する。DNA配列決定は一般に、メシング等、Nucleic Acids Res.、9巻309頁(1981)の方法またはマクサム等、Methods of Enzymology、65巻499頁(1980)の方法のいずれかによって実施する。
多細胞生物は、IFN−γ変異体を製造するための宿主として好ましい。無脊椎動物および脊椎動物のいずれの細胞培養も使用できるが、脊椎動物細胞培養、特に哺乳動物培養が好ましい。多細胞真核生物に加えて、糸状菌または酵母のような真核微生物がIFN−γ変異体の製造に好適である。サッカロミセス・セレビシアエ、またはパン酵母が、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用される。大量のDNAの迅速な生成、位置指定突然変異生成に使用される一本鎖DNA鋳型の生成、多くの突然変異体の同時スクリーニング、そして生成された突然変異体のDNA配列決定のために、前核生物は特に有用である。好適な前核生物宿主細胞は様々な大腸菌菌株を包含するが、これらに限定される訳ではない。
本発明に係るIFN−γアミノ酸配列変異体の製造に好適な技術および材料のさらなる詳細は、例えば1992年4月28日登録の米国特許第5108901号、および欧州公開第146354号に開示されている。
天然IFN−γおよびそのアミノ酸配列変異体のグリコシル化変異体もまた当分野で既知の技術により製造される。ポリペプチドのグリコシル化は典型的にはN結合またはO結合のいずれかである。O結合グリコシル化部位は、例えば1またはそれ以上のセリンまたはスレオニン残基をポリペプチドのアミノ酸配列に付加、またはこれらで置換することにより修飾することができる。容易にするため、変化は通常DNAレベルで、本質的にはアミノ酸配列変異体の製造のための既知の技術を用いて施す。
IFN−γまたはそのアミノ酸配列変異体へのグリコシドの化学的または酵素的結合もまた炭水化物置換基の数またはプロフィルを修飾または増大させるのに使用することができる。これらの方法は、それらがO結合(またはN結合)グリコシル化ができるポリペプチドの生成を必要としない点で有利である。使用される結合様式に応じて糖は、(a)アルギニンおよびヒスチジン、(b)遊離カルボキシ基、(c)遊離ヒドロキシ基、例えばシステインのもの、(d)遊離スルフヒドリル基、例えばセリン、スレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのもの、(e)芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンのもの、または(f)グルタミンのアミド基に結合させることができる。これらの方法はWO87/05330(1987年9月11日公開)、およびアプリンおよびリストン、CRC Crit.Rev.Biochem.、259−306頁(1981)に記載されている。
IFN−γまたはそのアミノ酸配列変異体上に存在する炭水化物部分はさらに、化学的または酵素的に除去することができる。化学的脱グリコシル化はトリフルオロメタンスルホン酸または同等の化合物への暴露を必要とする。この処理は、結合糖を除く殆どまたは全ての糖の開裂をもたらすが、ポリペプチドは無傷で残る。化学的脱グリコシル化はハキムディン等、Arch.Biochem.Biophys、259巻52頁(1987)およびエッジ等、Anal.Biochem.、118巻131頁(1981)により記載されている。炭水化物部分はソタクラ等、Meth.Enzymol.、138巻350頁(1987)に記載のような種々のエンドおよびエキソグリコシダーゼ変異体によって除去することができる。グリコシル化は、ダスキン等、J.Biol.Chem.、257巻3105頁(1982)により記載のようにツニカマイシンによって抑制される。ツニカマイシンは蛋白−N−グリコシダーゼ結合の形成を遮断する。
グリコシル化変異体は適当な宿主細胞を選択することによっても生成させることができる。例えば酵母は、哺乳動物系とは有意に異なったグリコシル化を導入する。同様に、セレクチン変異体の供給源とは異なる種(例えばハムスター、マウス、昆虫、豚、牛または羊)または組織(例えば肺、肝、リンパ系、間葉性または表皮性)起源を有する哺乳動物細胞が、変異体グリコシル化を導入する能力について常套的にスクリーニングされる。
IFN−γアミノ酸配列およびグリコシル化変異体の共有結合誘導体の使用は本発明の範囲内にある。このような修飾は、IFN−γ変異体の標的アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応することのできる有機誘導体形成試薬と反応させることによって、または、選択された組み替え宿主細胞に機能する翻訳後修飾の機作を利用することによって、導入する。共有結合誘導体は、生物活性なIFN−γ変異体を、そのレセプターに結合する対応天然IFN−γの質的能力は保持しているが、生物活性を欠く、または他の性質、即ちこの分子の半減期、安定性等を改善する誘導体に変える際に有用である。このような修飾は当分野における通常の知識の範囲内にあり、過度の実験をすることなく実施される。或る種の翻訳後誘導体は、発現されたポリペプチドへの、組み替え宿主細胞の作用の結果である。しばしばグルタミンおよびアスパラギン残基は、対応するグルタミン酸およびアスパラギン酸残基に翻訳後脱アミド化される。別法として、これらの残基は緩和な酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの型も本発明の範囲内にある。その他の翻訳後修飾は、プロリンおよびリジンのヒドロキシ化、セリンおよびスレオニン残基のヒドロキシ基の燐酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化[T.E.クレイトン、プロテインズ:ストラクチャー・アンド・モレキュラー・プロパティーズ、W.H.フリーマン・Co.、サンフランシスコ、79−86頁(1983)]、N末端アミンのアセチル化、ならびに若干の例におけるIFN−γのC末端カルボキシのアミド化を包含する。その他の共有結合誘導体は、米国特許第4640835;4496689;4301144;4670417;4791192、4179337、または5116964号に開示される手法による、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン類のような非蛋白ポリマーに共有結合させたIFN−γを包含する。
IFN−γ変異体の或る特定の群は、免疫グロブリンのような安定な血漿蛋白に対する天然IFN−γの生物学的作用に拮抗する、隣接するIFN−γアミノ酸配列の融合を含む。このような融合蛋白(例えば免疫アドヘジン類)の構造および組み立ては、IFN−γレセプターに関して下に詳説される。IFN−γ−安定血漿蛋白の融合は同様の手法でなされる。
様々な種、例えばヒトおよびマウス由来のIFN−γのレセプター結合ドメインが同定されている[例えば、S.C.ロード等、Mol.Immunol.、26巻637−640頁(1989);C.フェイヴァー等、Mol.Immunol.、26巻17−25頁(1989);M.A.ジャープおよびM.J.ホワード、J.Immunol.、145巻3304−3309頁(1990);H.I.マガジンおよびH.M.ジョンソン、Biochemistry、30巻5784−5789頁(1991)を参照されたい]。
C.IFN−γレセプター。
天然の供給源から精製されたまたは組み替えDNA技術により生成されたIFN−γレセプターは当分野で知られており、例えば以下の刊行物に開示されている:M.アグエットおよびG.マーリン、J.Exp.Med.、165巻988−999頁(1987);D.ノヴィック等、J.Biol.Chem.、262巻8483−8487頁(1987);J.カルデロン等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85巻4837−4841頁(1988);M.バス等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85巻6282−6286頁(1988);アグエット等、Cell、55巻273−280頁(1988);P.W.グレイ等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86巻8497−8501頁(1989)。
天然(ヒトまたは非ヒト)IFN−γレセプターのアミノ酸配列およびグリコシル化変異体ならびに共有結合修飾は、IFN−γについて上に記載された同じ一般技術に従って作成することができる。
天然IFN−γに結合することのできるIFN−γレセプターアミノ酸配列は、上記定義による安定な血漿蛋白配列に連結させることもできる。安定な血漿蛋白配列は、例えば免疫グロブリン配列、好ましくは免疫グロブリン定常ドメイン配列であってよい。得られる分子は一般にIFN−γレセプター−免疫グロブリンキメラ、またはより近年では免疫アドヘジンと呼ばれる。
通常、IFN−γレセプターのリガンド(IFN−γ)結合ドメインの隣接アミノ酸配列のC末端が、可変領域の代わりに免疫グロブリン定常領域の隣接アミノ酸配列のN末端と融合するが、N末端融合もまた可能である。
典型的には、このような融合は少なくとも、免疫グロブリン重鎖の定常領域の機能的に活性なヒンジ、CH2およびCH3ドメインを保存する。融合はさらに、定常ドメインのFc部分のC末端、または重鎖のCH1もしくは軽鎖の対応領域のN末端に直接行なわれる。これは通常、適当なDNA配列を組み立て、それを組替え細胞培養中で発現させることによって達成する。別法として、免疫アドヘジンを既知の方法に従って合成することもできる。
融合がなされる正確な部位は重要でない。個々の部位は良く知られており、免疫アドヘジンの生物活性、分泌または結合特性を最適とするために選択することができる。
好ましい態様において、IFN−γのための結合部位を含む隣接アミノ酸配列のC末端を、N末端において、免疫グロブリン、例えば免疫グロブリンG1(IgG−1)のエフェクター機能を有する抗体(特にFcドメイン)のC末端部分に融合させる。上に述べたように、重鎖定常領域全体を結合部位を含む配列に融合させることは可能である。しかしながら、より好ましくは、ヒンジ領域中パパイン開裂部位のすぐ上流で始まる配列(これはIgG Fcを化学的に規定し、重鎖定常領域の最初の残基を114とする時の残基216[コベット等、上記]、または他の免疫グロブリンの類似部位である)を融合に使用する。免疫アドヘジンにおいては免疫グロブリン軽鎖がヘテロローガス蛋白−重鎖融合蛋白の効果的な分泌に必要であるとかつて考えられていたが、IgG1重鎖全体を含んでいる免疫アドヘジンでも、軽鎖の不在下で有効に分泌されることが判明した。軽鎖は不必要であるため、本発明に係る免疫アドヘジンの組み立てに用いられる免疫グロブリン重鎖定常ドメイン配列は、軽鎖結合部位がなくてもよい。これは、軽鎖が通常結合する免疫グロブリン重鎖配列要素を除去、または係る結合がもはや不可能となる程充分変化させることによって達成することができる。このように、IFN−γレセプター−免疫グロブリンキメラの或る態様においては、CH1ドメインを全く除去することができる。
特に好ましい態様において、IFN−γレセプターの細胞外ドメインを含むアミン酸配列を、IgG−1、IgG−2、IgG−3、またはIgG−4重鎖のヒンジ領域およびCH2、CH3;またはCH1、ヒンジ、CH2およびCH3ドメインと融合させる。典型的な構造の組み立て物を実施例1に開示する。
幾つかの態様においては、IFN−γレセプター−免疫グロブリン分子(免疫アドヘジン)は、単量体、二量体または多量体、特に二量体または四量体として組み立てられる。一般にこのような組み立てられた免疫アドヘジンは、対応する免疫グロブリンと類似の、既知の単位構造を有するであろう。基本となる4本鎖単位(二つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖の対の二量体)は、IgG、IgAおよびIgEが存在する形である。四本鎖単位は高分子量免疫グロブリンにおいて反復されている。IgMは一般に、ジスルフィド結合によりつながっている基本的四本鎖単位の五量体として存在する。IgAグロブリン、そして時にIgGグロブリンもまた血清中で多量体の形で存在し得る。多量体の場合、各々の四本鎖単位は同じであっても異なっていてもよい。
IFN−γレセプター−免疫グロブリンキメラの免疫グロブリン部分全体が同じ免疫グロブリン由来である必要はない。異なった免疫グロブリンの様々な部分を結び付けることができ、免疫アドヘジン分子の性質を最適なものとするために、天然免疫グロブリンの変異体および誘導体を、IFN−γに関して上に記載されたように作成することができる。例えば、IgG−1のヒンジがIgG−3のヒンジに置き換えられた免疫アドヘジン組み立て物は機能的であることが判明し、IgG−1重鎖全体を含む免疫アドヘジンに匹敵する薬動力学を示した。
IFN−γレセプター−免疫グロブリン免疫アドヘジンは、免疫グロブリン分子には通常存在しない二つの異なる結合ドメインを含み得る。特定の態様において、この二つの結合ドメインはIFN−γレセプター由来の二つの異なったIFN−γ結合アミノ酸配列である。別の態様においては、一方の結合ドメインのみがIFN−γレセプター由来であり、他方は免疫グロブリン分子には通常存在しない別のポリペプチド配列である。第二の結合ドメインは、好ましくはIBDの開始または進行に関与するポリペプチドを結合することのできるアミノ酸配列である。この第二の結合配列は、好ましくは第二のIFN−γインヒビター、IL−1インヒビター、TNF−αインヒビター、CD11a/18インヒビター、CD11b/18インヒビター、またはL−セレクチンインヒビター由来であって、且つ、IFN−γ、IL−1、TNF−α、CD11a/18、CD11b/18、L−セレクチン、もしくはそれぞれのレセプター/リガンドに対する抗体の抗体−抗原結合部位を含み得、または、例えばIL−1レセプターもしくは1型もしくは2型TNF−αレセプター(TNF−R1またはTNF−R2)アミノ酸配列であってよい。キメラ免疫グロブリン分子中の両方の結合ドメインが異なった結合特異性の抗体由来である場合、その構造は通常二重特異性抗体と呼ばれる。
単一および二重特異性免疫アドヘジンの可能な構造を例示する図式は、係る組み立て物における免疫グロブリンの単量体ならびにヘテロおよびホモ多量体の組み立てに利用し得る様々な構造の鎖または基本単位といったように、例えば1992年5月26日登録の米国特許第5116964号に開示されている。
二重特異性免疫アドヘジンおよび抗体は、1990年2月21日公開のEP355068号、および1991年5月2日公開のPCT出願公開No.WO91/05871号にも開示されている。
或る場合には、三量体の二重変異性免疫アドヘジンの製造が有利となり得、この場合、Y型の免疫グロブリンの一方のアームにおいては第一の重鎖定常ドメイン(CH1)が除去または変更されて、免疫グロブリン軽鎖に共有結合する能力が取り除かれており(即ち、軽鎖結合部位が除去または不活性化されている)、他方のアームにおいては、CH1ドメイン内の軽鎖結合部位が保存され、免疫グロブリン軽鎖に共有結合している。各アームにおいて重鎖定常ドメイン配列は、互いに異なった「結合ドメイン」と融合している(重鎖可変ドメインが置き替わっている)。一方の結合ドメインはIFN−γアンタゴニスト由来であり、これに対し他方の結合ドメインは、前記のサイトカインアンタゴニストから選択することができる。得られる構造は、第一の結合ドメインに融合した免疫グロブリン重鎖定常ドメイン配列および異なる結合ドメインに融合し免疫グロブリン軽鎖に共有結合している第二の免疫グロブリン重鎖定常ドメイン配列で構成される、二つの異なった結合特異性を有する三量体(ヘテロ三量体)である。
ヘテロ三量体の2またはそれ以上を互いに共有結合させて多量体構造を提供することができる。一般に、組み立てられたこれらの二重特異性免疫アドヘジンは既知の単位構造を有するであろう。三本鎖単位を高分子量免疫グロブリンと同様に反復させることができる。
別の態様において、IFN−γレセプターアミノ酸配列を抗体重鎖の3'末端に融合させることによって二つの特異性を有する融合蛋白を作成することができ、ここでこの抗体は、例えば抗IFN−γ抗体、または上で言及したその他の抗体のいずれかであってよい。IFN−γレセプターアミノ酸配列は、例えば免疫グロブリン重鎖のヒンジおよびCH2ドメインの間、またはCH2およびCH3ドメインの間のいずれかに挿入することができる。次いで、キメラ免疫グロブリン重鎖−IFN−γレセプター遺伝子を、所望抗体の軽鎖を産生する免疫グロブリン軽鎖分泌トランスフェクトーマセルライン中に導入することができる。同様の構造の組み立てはH.R.フーゲンブーム、Mol.Immunol.、28巻1027−1037頁(1991)により報告されている。
抗体配列へのIFN−γレセプターアミノ酸配列の融合からなる、二重の特異性を有する線状融合蛋白は、本質上、トローネッカー等、EMBO、10巻3655−3659頁(1991)による記載のように製造することができる。
トローネッカー等は、FvCD3、C−カッパおよびCD4の2個のN末端ドメインを含む一本鎖ポリペプチドを設計し、ジャヌシン(CD4−FvCD3−Cカッパ)と命名した。この二重特異性線状分子は抗カッパ親和カラムを用いて精製された。IFN−γレセプターアミノ酸配列を含む線状分子は類似の手法で作成することができる。
免疫グロブリンおよびその或る種の変異体は既知であり、多くが組み替え細胞培養で製造されている。例えば、米国特許4745055号;EP256654号;フォークナー等、Nature、298巻286頁(1982);EP120694号;EP125023号;モリソン、J.Immun.、123巻793頁(1979);ケーラー等、Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA、77巻2197頁(1980);ラソ等、Cancer Res.、41巻2073頁(1981);モリソン等、Ann.Rev.Immunol.、2巻239頁(1984);モリソン、Science、229巻1202頁(1985);モリソン等、Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA、81巻6851頁(1984);EP255694号;EP266663号;およびWO88/03559号を参照されたい。再構築された免疫グロブリン鎖もまた知られており(例えば米国特許4444878号;WO88/03565号;およびEP68763号ならびにこれらに引用されているる論文を参照されたい)、蛋白工学により生成される合成抗体結合部位(Fv類似体)もまた知られている[例えばJ.S.ハストン等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85巻5879−5883頁(1988)、および1992年2月25日登録のUS5091513号を参照されたい]。
本発明に係るIFN−γレセプター免疫グロブリン免疫アドヘジンの(重鎖)定常ドメイン配列を提供する免疫グロブリンの選択は、主としてそれらを組み立てる動機に応じた選択の問題である。もしIFN−γレセプターの血漿半減期の延長が考慮の対象であるならば、インビボ半減期が7日間であるIgG−3と対照的にインビボ半減期が全て21日であることから、免疫グロブリンIgG−1、IgG−2およびIgG−4イソタイプが良い候補物質である。或る状況において有利または不利となり得るさらなる相違は、例えば補体活性化の点である。IgG−1、IgG−2およびIgG−3は全て補体を活性化するが、IgG−2はIgG−1よりも補体活性化の点で有意に弱く、且つ単核球または好中球上のFcレセプターに結合せず、一方IgG−3はIgG−1より良好な補体活性化を示す。IgG−1は4個の血清学的に定義されるアロタイプ部位を有するに過ぎず、うち2個(G1m1および2)はFc部分にあり、これらの部位のうち2個(G1m1および17)については一つのアロタイプが非免疫原性である。これと対照的に、IgG−3には12個の血清学的に定義されるアロタイプがあり、その全てがFc部分であり、うち3個(G3m5、11および21)のみが非免疫原性であるアロタイプを有する。したがって、反復されるそして長期間の治療適用のためには、IgG−1由来定常ドメイン配列を有する免疫アドヘジンが好ましい。二重特異性免疫アドヘジン分子の2本のアームに、異なるクラスまたはイソタイプ由来の免疫グロブリンを使用することが可能である。二重特異性分子の同じアームで、または単一もしくは二重特異性免疫アドヘジンの両アームで、種々の免疫グロブリンクラスまたはイソタイプ由来の配列を結合させることもまた可能である。
IFN−γレセプター−免疫グロブリンキメラは、上に詳説した組み替えDNA工学の標準的技術によって製造することができる。もう一つの選択肢は、エンジェルズ等、Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.、28巻716頁(1989)に記載の方法の一つを用いて、該キメラをコードしている遺伝子を化学合成することである。これらの方法は、トリエステル、亜燐酸、ホスホルアミダイトおよびH−ホスホナート法、PCRおよびその他の自己プライマー法、ならびに固相支持体上のオリゴヌクレオチド合成を包含する。
その他の安定な血漿蛋白を含む融合蛋白を、当分野で知られる方法によって作成することができる。例えば、安定な血漿蛋白としてヒト血清アルブミン(HSA)のN末端フラグメントを含む融合蛋白が、1990年11月28日公開のEP399666号に開示されている。
D.IFN−γインヒビターの選択
本発明方法の遂行に有用なIFN−γインヒビターは、幾つかのインビトロおよびインビボの方法によって試験することができる。
結合検定
IFN−γに結合するインヒビターの能力(例えばIFN−γレセプターまたは抗IFN−γ抗体の場合)は、例えば、本質的にはA.アシュケナージ等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88巻10535−10539頁(1991)により記載されるように、平衡結合分析によって試験することができる。この方法によれば、IFN−γインヒビター候補物質を、ヤギ抗ヒトIgG Fc抗体で被覆した微量定量ウェルに固定し、検出し得る標識を施したIFN−γと共にインキュベートする。同様の方法が、1990年10月24日公開のEP393502号の実施例5Bおよび5Cに記載されている。別法としてまたはさらに、結合親和性を、例えばM.ファウントゥラキス等、J.Biol.Chem.、265巻13268−13275頁(1990)により開示されるような競合的結合検定で試験することができる。本発明の目的のために定義されるような、IFN−γのそのレセプターへの結合を阻害する(例えばIFN−γ変異体および抗IFN−γレセプター抗体)IFN−γインヒビターの能力は、類似の手法で試験することができる。標識が放射性であるならば、結合はγまたはβシンチレーションカウンターにより定量することができる。
IFN−γ生物活性検定
IFN−γインヒビターがIFN−γの生物活性を遮断する能力は、任意の常套的なIFN−γ作用のインビトロ検定で試験することができる。例えば、IFN−γによる特異的抗原の発現の誘導を遮断するインヒビターの能力は、実施例2に本質上記載のようにして検定できる。検定の別の群(抗ウイルス検定)では、ウイルス感染に対するIFN−γの防御効果を遮断するインヒビター候補物質の能力を試験する。特定の抗ウイルス検定を実施例2に開示する。別法としてまたはさらに、例えば後の実施例2に開示されるように、IFN−γインヒビターが内因性IFN−γを遮断する能力を試験するために、宿主免疫反応モデルを使用することができる。この同じ実施例は、IFN−γインヒビターの作用を試験するための好適なマウスモデルをも開示している。
IBDのインビトロモデル
IBDのインビトロモデルがT.マクドナルドおよび共同研究者等により開発され、C.P.ブレガーおよびT.マクドナルドにより「イムノロジー・オブ・ガストロインテスティナル・ディジーズ」、上記、の8章に記載され、これより先にT.マクドナルドおよびJ.スペンサー、J.Exp.Med.、167巻1341−1349頁(1988)により報告されている。このモデルでは、妊娠15−20週の段階にあるTリンパ球を含むヒト胎児腸組織(小腸または大腸)の小さな外植片(直径1−2mm)を培養する。ヒト胎児の腸は、組織、上皮細胞の更新、および腸細胞機能を維持しつつ、組織培養中で数週間維持することができる。外植片中の全てのT細胞は、アメリカヤマゴボウマイトジェンまたはモノクローナル抗CD3抗体の存在下で培養することにより活性化することができる。外植片全体の外観はT細胞活性化の結果としての大きな変化を示す。T細胞活性化の結果としての小腸外植片の変化は、クローン病の初期段階に見られる粘膜の変化を思わせ、結腸外植片に見られる杯状細胞の涸渇もまた潰瘍性大腸炎の特徴である。このモデルはT細胞と腸上皮の相互作用の研究に使用することができ、特に、IFN−γの分泌といったT細胞活性化に対する反応、そしてT細胞活性化時またはその前にIFN−γインヒビター候補物質を投与することによるIFN−γ分泌の遮断を観察するために使用することができる。
IBDの動物モデル
IBDの動物モデルの最初の群は、幾つかの型のIBDを思わせる疾病を自然発症する動物を含む。自然発症動物モデルは、C3H/HeJマウス、ジャパニーズ・ワルツィング・マウス、豚の赤痢およびC.ディフィシレにより惹起される馬大腸炎、ならびにコットントップタマリンを包含する。これらの動物が罹患する疾病は、近年五つの型に分けられ、うち二つがUCに似ている。これらのモデルのうちではタマリンが好ましく、何故ならこの動物の大部分は何らかの型の腸疾患を持ち、その多くが、UC患者がそうであるように、腸癌を併発するためである。
もう一つの試みでは、エタノール、酢酸、ホルマリン、免疫複合体、トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)、細菌生成物またはカラギーナンといった様々な刺激物を用いて急性または慢性の炎症を作り出す。この種のモデルはJ.ワレスおよび共同研究者等によって開発された[モリス等、Gastroenterology、96巻795頁(1989)]。
第三の試みによると、形質転換した動物がIBDのモデルに使用される。強直性脊椎炎の人間の患者は殆どがHLA−B27の遺伝子をも有する。このような患者はIBDを発症する危険性が高いことが観察されている。関節疾患に加えて脊椎関節症のモデルにしようと試みられたHLA−B27形質転換ラットもまた腸の慢性炎症の徴候を示し、これは、同一ではないがCDと数多くの類似点を持っていた。したがって、HL−B27形質転換ラットはIBDのモデルに使用することができる。
もう一つの好適な形質転換動物も出るはIL−10「ノックアウト」マウスに基づくものである。IL−10はTH2細胞により産生され、B細胞を刺激して抗体を産生し、マクロファージをダウンレギュレートしてIL−1、IL−6、IL−8およびTNF−αの産生を低下させ、そしてマクロファージからB細胞へと抗原提示のバランスを変える。IL−10はさらにIFN−γの産生を低下させ、これによりTH1細胞およびナチュラルキラー細胞の活性を低下させる。生まれた時から抗IL−10抗体で処置されたマウス(週に3回i.p.投与)は、体重または主要組織の構造の変化を示さない。BおよびT細胞の数および比率もまた正常である。しかしながら、IgA産生に劇的な低下があり、IgG−2aおよびIgG−2bの濃度は上昇する。さらに、マーカーLy−1を有する特異なB細胞集団である腹膜B細胞の殆ど完全な涸渇が観察された。これらのB細胞は骨髄から絶えず誘導され、体細胞突然変異を受けない限られた免疫グロブリンレパートリーを有し、そして血漿中に見いだされるIgMの多くを司っている。これら特異なB細胞の涸渇は、抗IL−10抗体処置マウスにおいて産生されるIFN−γのレベルの上昇に起因しているかも知れない。この事は、IFN−γを抗IL−10抗体と同時に投与すればLy−1B細胞が生き残るという観察によって支持される。
通常、本発明の目的にとって好適なアンタゴニストのスクリーニングは、IBDのインビトロおよびインビボモデルで得られる結果が最も決定的である前記検定の組合せを包含する。
E.薬用組成物
本明細書中の二重特異性分子を包含する本発明に係るIFN−γインヒビターは、通常、当分野で知られる方法によって投与型に調合された薬用組成物として通常投与される;例えば、レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ、マック・パブリッシング・カンパニー、イーストン、ペンシルベニア、15版、1975、を参照されたい。非経口投与のためには、このアンタゴニストを適当な薬学上許容し得る媒質および所望によりその他の薬学上許容し得る添加物と混合して、典型的には注射用溶液、懸濁液または乳液の形に調合する。典型的な媒質は、食塩水、デキストロース溶液、リンガー液等を包含するが、非水性媒質を使用することもできる。
IFN−γレセプターアミノ酸配列およびアンタゴニスト抗IFN−γレセプター抗体を含む薬用組成物ならびに好適な用量および用量率は、例えば1990年5月23日公開のEP369413号;1990年10月24日公開のEP393502号;1991年3月13日公開のEP416652号;1987年10月14日公開のEP240975号;および1990年1月30日登録の米国特許第4897264号に開示されている。
IFN−γ変異体の製剤は好ましくは液体であり、通常は、常套的安定剤および/または賦形剤を含む生理食塩水溶液またはデキストロース溶液である。IFN−γ組成物は凍結乾燥粉末としても提供され得る。IFN−γを含有する薬用組成物は、例えば1988年2月23日登録のUS4727138号、1988年8月9日登録のUS4762791号、1990年5月15日登録のUS4925793号、1990年5月29日登録のUS4929553号、1989年8月8日登録のUS4855238号に開示されている。典型的な製剤は、pH5.0でIFN−γ(20x106U)1.0または0.2mg/ml、琥珀酸0.27mg/ml、および琥珀酸二ナトリウム六水塩0.73ml/注射を含有し得る。好ましいIFN−γ製剤および用量範囲は1992年9月29日に登録のUS5151265号に開示されている。抗IFN−γレセプター抗体についての製剤および用量は同様であって、過度の実験をすることなく決定できる。
それぞれの特定のIFN−γインヒビターに対する実際の用量は、処置すべき病態、問題の患者の病的状態および臨床的寛容、活性および生物学的半減期を包含する使用される調製物の性質等に依存するであろう。臨床医が臨床経験に従って用量を調節するであろうことは理解されるであろう。
本発明に係るインヒビターは、処置すべき疾病を発症する危険性のあることがわかっている患者に予防的に、または該疾病の発症後に適用することができる。係る患者は、例えば少なくとも過去に1回炎症性腸疾患と診断され、恐らくは処置を受けているが、投与の時点では無症候性である患者である。
本発明に係るIFN−γインヒビターは、IgA/IgG比の低下を特徴とする状態、例えば炎症性腸疾患の処置に恐らくは有用である他の治療薬と組み合わせて投与することができる。これら他の治療薬とは、スルファサラジン、コルチコステロイド、6−メルカプトプリン/アザチオプリンのような抗炎症剤;シクロスポリン、プロスタグランジンインヒビターのような免疫抑制剤;スーパーオキシドジスムターゼ;IL−1レセプターアンタゴニスト;抗ELAM−1(E−セレクチン)抗体;好酸球に結合するVCAM−1のインヒビター;抗CD18抗体であってよい。投与は同時または連続的であってよく、1またはそれ以上のIFN−γインヒビターと組み合わせた、1またはそれ以上のこれらのおよび類似の治療薬を含む製剤の投与を包含する。別法として、このようなさらなる治療薬が本発明に係る融合ポリペプチド(二重特異性免疫アドヘジン、抗体、線状分子)に含まれていてもよい。
本発明のさらなる詳細を以下の非限定的実施例に開示する。
実施例1 ヒトおよびマウスIFN−γレセプター−免疫アドヘジンの組み立て
IFN−γレセプター(IFNγR)免疫アドヘジンは、ヒトおよびマウスIFNγRをそれぞれコードしているプラスミドpRK−H−γRまたはpRK−M−γR[V.C.ギブズ等、Mol.Cell.Biol.、11巻5860−5866頁(1991)]、および、CD4−IgG−1をコードしているプラスミドpRKCD42Fc1[R.A.バイルン等、Nature、344巻667−670頁(1990)]から組み立てた。簡潔に述べると、このCD4−IgG−1組み立て物は、重−軽鎖結合に含まれるシステイン残基後のIgG−1ヒンジの最初の残基であるアスパラギン酸216(アミノ酸114を重鎖定常領域の最初の残基とみなす[カバット等、上記])で始まり、残基441で終わるヒトIgG−1配列に融合した成熟ヒトCD4蛋白の残基1−180で構成されている。この分子は、ヒトIgG−1のヒンジおよびFc(CH2およびCH3)ドメインに結合したCD4 V1およびV2ドメインを含んでおり、CD42Fc1と称する。
ヒトまたはマウスIFNγRをコードしている相補的DNA(cDNA)フラグメント(それぞれその天然サイン配列を有する)を、各々のプラスミドをClaIおよびHindIIIで消化することによって生成させる。プラスミドpRKCD42Fc1をClaIおよびNheIで消化してCD4配列の大半を除去する一方で、ヒトIgG−1重鎖ヒンジ領域ならびにCH2およびCH3ドメイン配列を保存する。各IFNγR配列をIgG−1配列の5'に挿入することにより、そして同じ読み取り方向で、それぞれのClaI部位をライゲーションすることにより、そしてHindIIIおよびNheI部位を平滑化およびライゲーションすることにより、中間体プラスミドを組み立てた。次に、残ったCD4配列および各IFNγRの貫膜および細胞内部分をコードしている配列をオリゴヌクレオチド指定除去突然変異生成により除去して、各IFNγRの細胞外部分およびIgG−1ヒンジの間の正確な連結点を作り出した。この連結点には、ヒトまたはマウスIFNγRのグリシン231またはアスパラギン酸216に対するコドンおよびヒトIgG−1重鎖のさらなる226コドンがある。したがって、成熟hIFNγR−IgG−1およびmIFNγR−IgG−1ポリペプチドはそれぞれ448および44アミノ酸長である。所望の連結点の両側の18塩基に対し相補的な合成オリゴヌクレオチドをプライマーとし、そして上記中間体プラスミドを鋳型として使用し、A.アシュケナージ等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88巻10535−10539頁(1991)による記載のようにして、欠失突然変異株を誘発した。最終的構造をDNA配列決定により確認した。
IFNγR−IgG−1免疫アドヘジン(IFNγR−IgGとも称する)を、燐酸カルシウム沈澱法の改良法を用いて一過性トランスフェクションによりヒト胚腎(HEK)293細胞で発現させた[S.A.マースターズ等、J.Biol.Chem.、267巻5747−5750頁(1992)]。蛋白AへのIgG−1 Fcドメインの結合を利用するスタフィロコッカス・アウレウス蛋白A上の親和クロマトグラフィーにより、一段階で、無血清細胞培養上清から免疫アドヘジンを精製した。結合した蛋白を50mMクエン酸ナトリウム(pH3)/20%(w/v)グリセロールで溶出し、溶出した液のプールを0.05容量の3MトリスHClpH8ないし9で中和した。このように処理されたIFNγR−IgG−1は95%以上純粋であった。得られた組み立て物は、ヒト(h)またはマウス(m)IFNγRの細胞外部分とIgG−1重鎖のヒンジ領域ならびにCH2およびCH3ドメインとの融合からなる(図1A)。
本発明者等は免疫アドヘジンのサブユニット構造をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって調べた(図1B−D)。非還元条件下では、相対的分子量(Mr)160−220kDaの際立ったバンドがヒトおよびマウス両者のIFNγR−IgG−1に観察され;還元条件下ではこのバンドはなく65−90kDaの新たなバンドが現われた(図1B)。この事は、各IFNγR−IgG−1がジスルフィド結合したホモ二量体として分泌されることを示すものである。IFNγR領域には5個[M.アグエット等、Cell、55巻273−280頁(1988);F.コファーノ等、J.Biol.Chem.、265巻4064−4071頁(1990);R.W.グレイ等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86巻8497−8501頁(1989);S.ヘミ等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86巻9901−9905頁(1989);C.S.クマー等、J.Biol.Chem.、264巻17939−17946頁(1989);S.ミュンロおよびT.マニアティス、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86巻9248−9252頁(1989)]、IgG−1領域には1個[R.A.バイルン、1990、上記]、可能性あるN結合グリコシル化部位があるため、広範囲のMrは恐らく免疫アドヘジンの実質的なグリコシル化によるものであろう。ポリクローナル抗IgG Fc抗体を用いたウェスタンブロットは、IFNγR−IgG−1として160−220kDaのバンドの存在を確認した。抗IgG抗体との免疫反応性は還元時に低下したが、これは恐らくFc部分のジスルフィド安定化ドメイン構造の崩壊によるものであろう(図1C)。[125I]標識したヒトまたはマウスIFN−γを用いたリガンドブロットは同じMrバンドを明らかにし、これはそれぞれの種由来の過剰のコールドIFN−γの存在下において標識されなかった(図1D)。これらの結果は、両方のIFNγR−IgG−1分子に、IgG−1重鎖およびIFN−γと特異的に結合する機能的レセプタードメインが存在することを証明している。ヒトおよびマウスIFN−γレセプターはアミノ酸レベルで約50%が同一であり、どちらもIFN−γと種特異的に結合する[D.S.フィンブルーム等、J.Immunol.、135巻300−305頁(1985);U.ユーサー等、Int.J.Cancer、36巻103−108頁(1991)]。
実施例2 IFN−γインヒビター活性の試験
1.検定
IFNγ結合検定
本質上記載のようにして[アッシュケナージ等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88巻10535−10539頁(1991)]IFN−γに対するIFNγR−IgGの結合を分析した。各々のIFNγR−IgG(1μg/ml)をヤギ抗ヒトIgG Fc抗体で被覆した微量定量ウェル上に固定した。ヒトまたはマウスIFNγR−IgGを、1%牛血清アルブミン(BSA)を含有する燐酸緩衝化食塩水(PBS)中で、組替[125I]標識化ヒト(h)またはマウス(m)IFN−γ(ラクトペルオキシダーゼを用いて非活性20−30μCi/μgに放射性ヨウ素化)と、24℃で1時間インキュベートした。非特異結合はIFNγR−IgGを除くことにより決定した。
遺伝子発現のIFN−γ誘導の検定
IFNγによる特異抗原の発現の誘導を遮断するIFNγR−IgGの能力を試験することにより、インビトロでのIFNγR−IgGの生物活性を評価した。ヒトHeLa細胞またはマウスL929細胞を30%密集となるまで増殖させ、それぞれ10ng/mlのhIFN−γまたはmIFN−γと共に37℃/5%CO2で48時間インキュベートした。それぞれの種由来のIFNγR−IgG、または負の対照としてのCD4−IgGもまた培養に加えた。次に、ヒトの細胞によるICAM−1およびマウス細胞によるクラスI MHC抗原H−2Kkの発現を、特異的なフルオレセイン化した抗体を用いてフローサイトメトリーによって分析した。分析の直前にヨウ化プロピジウムを加えて非生存細胞を除外した。
IFNγ抗ウイルス活性検定
さらに、細胞の脳心筋炎ウイルス(EMCV)感染に対するIFN−γの防御効果を遮断するIFNγR−IgGの能力を、免疫アドヘジンのインビトロ阻害活性の指標として試験した。本発明者等は、かつて記載された方法の変法を用いた[ルビンシュタイン等、J.Virol.、37巻755−758頁(1981)]。ヒトA549またはマウスL929細胞を微量定量皿に蒔(2x104細胞/ウェル)37℃/5%CO2で24時間インキュベートした。次に、組み替えヒトまたはマウスIFN−γを、ヒトまたはマウスIFNγR−IgGと共に0.125または0.5ng/mlの濃度で加え、インキュベーションを24時間続けた。次いでEMCVを、ウェル当り1感染多重度単位で細胞に加えた。18−24時間後に細胞の生存をクリスタルバイオレット排除により定量した。
マウスリステリア症
内因性IFN−γをインビボで遮断するIFNγR−IgGの能力を、マウスのリステリア・モノサイトジェネス感染を用いた宿主免疫反応モデルで研究した[バッハミアおよびシュライバー、Proc.Natl.Acad.Sci・USA、82巻7404−7408頁(1985);ファーバーおよびピーターキン、Microbiological Reviews、55巻476−511頁(1991)]。偶発的なウイルスによる感染が無いとされている雌性C57BL/6xDBA/2F.(BDF1)マウスをチャールズ・リバー(ポーティッジ、MI)から6週齢で入手した。L.モノサイトジェネスは過去の記載[ハーク−フレンチョ等、Infect.Immun.、57巻3014−3021頁(1989)]のように維持した。対数期の細菌を20%グリセロールを含有するトリプトン燐酸ブロス中に懸濁し、アリコートとして−70℃で保存した。マウスに、媒質、負の対照としてのCD4−IgG、またはmIFNγR−IgGを腹腔内(i.p.)注射で投与した。その後直ちに、発熱物質を含まないPBS0.2mlに入れた4x104の新たに融解した細菌を、各マウスに外側尾静脈から静脈内(i.v.)注射により投与した。3日後、マウスを安楽死させ、脾臓および肝臓を摘出し、滅菌水1mlを入れた別々の滅菌した組織破砕器でホモジナイズした。ホモジネートを連続希釈し寒天上に蒔いた。プレートを37℃で24時間インキュベートし、その後細菌コロニーを数えた。
接触感受性のためのマウスモデル
内因性IFN−γをインビボで遮断するIFNγR−IgGの能力を、接触感受性のためのマウスモデルを用いてさらに研究した。Balb/cマウス(チャールズ・リバー、ポーティッジ、MI)をケタミン/キシラジンのi.p.注射により麻酔した。腹部の3x3cmの正方形部分を剃毛し、ここに2,4−ジニトロ−1−フルオロベンゼン(DNFB)200μgを局所適用した(感作)。5日後、DNFB20μgを左耳介の両側に局所適用し、一方で希釈剤を右耳介の両側に適用した(チャレンジ)。10時間後、このマウスに2μCiの[125I]UdRを外側尾静脈からi.v.注射した。16時間後、マウスを安楽死させ、毛の生え際で耳介を切り取り、リンパ球増殖および耳介への遊走の指標として[125I]放射性を計数した。IgG、免疫アドヘジン、またはモノクローナル抗体で処置したマウスに、感作の30分前およびチャレンジの30分前に媒質または薬品をi.v.注射した。
2.結果
IFN−γへのIFNγR−IgGの結合
本発明者等は、IFN−γへのヒトおよびマウス免疫アドヘジンの結合を、平衡結合分析によって研究した(図2)。各IFNγR−IgGは、オートロガスな種由来の[125I]標識IFN−γへの特異的且つ飽和し得る結合を示した。スキャッチャード分析は、[125I]hIFN−γとhIFNγR−IgGについて1.5nM、[125I]mIFN−γとmIFNγR−IgGについて3.3nMの解離定数(Kd)値を示した。競合的結合検定(データは示されていない)は、hIFNγR−IgGに対するhIFN−γの結合のmIFN−γによる阻害、またはmIFNγR−IgGに対するmIFN−γの結合のhIFN−γによる阻害は有意でない事を示した。これらの結果は、各免疫アドヘジンはIFN−γと種特異的に結合することを示し、これは過去の報告と符号する[フィンブルーム等、J.Immunol.、135巻300−305頁(1985);ユーサー等、Int.J.Cancer、36巻103−108頁(1985)]。IFNγR−IgGのIFN−γ結合親和性は、組み替え可能IFNγRについて報告されたものに匹敵する[ファウントゥラキス等、J.Biol.Chem.、265巻13268−13275頁(1990)]。故に、IgG重鎖へのIFNγR細胞外ドメインの付着はIFN−γの結合を妨げない。
IFNγR−IgGはインビトロでIFNγを遮断する。
本発明者等は、IFN−γの免疫調節および抗ウイルス効果を阻害するヒトおよびマウスIFNγR−IgGの能力を培養細胞上で試験した(図3)。ヒトHeLa細胞におけるhIFN−γによるICAM−1の誘導はhIFNγR−IgGによって完全に遮断することができ、約13nMの免疫アドヘジンで半最大阻害(IC50)であった。対照的に、負の対照として使用されたCD4−IgGは効果がなかった(図3A)。同様に、マウスL929細胞におけるmIFN−γによるクラスI MHC抗原H−2Kkの誘導はmIFNγR−IgGによって完全に遮断することができ、IC50は約10nM、一方CD4−IgGは効果がなかった(図3B)。脳心筋炎ウイルス(EMCV)の細胞変性作用はIFN−γの添加により防止できる。EMCVに感染したヒトA549細胞において、hIFNγR−IgGはhIFN−γの抗ウイルス効果を完全に遮断し、IC50は約8nMであった(図3C)。同様に、mIFNγR−IgGはEMCVに感染したマウスL929細胞においてmIFN−γの抗ウイルス効果を遮断し、IC50は約10nMであった(図3D)。実施された全ての実験において、他方の種由来のIFNγR−IgGは抗ウイルス活性に及ぼす有意な効果が無く、この事は、免疫アドヘジンおよびIFN−γの間の相互作用の種選択性を追認するものである。これらの結果は、IFN−γとその細胞表面レセプターの相互作用を有効且つ完全に遮断し、その結果細胞に働くサイトカインの生物学的作用をインビトロで遮断するIFNγR−IgGの能力を立証するものである。
IFNγR−IgGはIFN−γをインビボで遮断する。
IFNγR−IgGが内因性IFN−γをインビボで中和する能力を評価するため、本発明者等は、IFN−γが中心的役割を果たすことが知られている(バッハミア等、上記;ファーバー等、上記)リステリア・モノサイトジェネス感染に対する宿主免疫反応のためのマウスモデルを使用した。マウスに媒質、CD4−IgG、またはmIFNγR−IgG(200μg)をi.p.注射で投与し、直後にL.モノサイトジェネスのLD50i.v.チャレンジを行なった。3日後、マウスの脾臓および肝臓中の細菌コロニー形成単位(CFU)の数を測定した。CD4−IgGはいずれの臓器においてもCFUの数に有意な影響を及ぼさなかったのに対し、IFNγR−IgGによる処置は脾臓および肝臓の両者においてCFUの数に10倍の増加をもたらした(図4)。感染後7日間にわたる細菌負荷の連続的分析(データは示されていない)は、IFNγR−IgGが感染の程度に影響し、速度には影響しないことを示した。これらの結果は、L.モノサイトジェネス感染に対する内因性IFN−γの作用がIFNγR−IgGによって有効に阻害されることを示し、したがって、この免疫アドヘジンがIFN−γの生物活性をインビボで遮断する能力を立証している。
不適当なIFN−γ産生の望ましくない結果をインビボで阻害するIFNγR−IgGの能力を試験するための適切なモデルは、マウスにおける接触感受性である。この免疫反応は、感作されたT細胞と抗原との相互作用に基づいており、IFN−γ、TNF−αおよびIL−1といったサイトカインが重要な役割を果たす、不適切な細胞性免疫がもたらす組織の傷害を示す[P.W.アシュケナージ(1988)、エフェクター・アンド・レギュラトリー・メカニズム・イン・ディレイド−タイプ・リード、E.F.エリスおよびN.F.アトキンソン編、C.V.モスビー、セントルイス;エンクおよびキャッツ、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89巻1398−1402頁(1992);ベリスト等、J.Immunol.、143巻1530−1536頁(1989);ピグエット等、J.Exp.Med.、173巻673−679頁(1991)]。本発明者等は腹部への局所適用によりマウスをハプテンDNTPに対して感作した。5日後、一方の耳介に局所適用することによりマウスをDNFPでチャレンジし、他方の耳介には希釈剤を適用した。10時間後、マウスに[125I]UdRのi.v.注射を施した。アイソトープ注射の16時間後、マウスを安楽死させ、耳介を切り取り、リンパ球の増殖および抗原接触部位への遊走の指標として[125I]の取り込みについて分析した。mIFNγR−IgGの注射(感作およびチャレンジ時に200μg i.v.)は反応の約44%の阻害をもたらした(第1表)。
50μgという低用量において、低い阻害が観察された(26%)。接触感受性の顕現にはIFN−γと共に他のサイトカインが関わっているため、IFNγR−IgGによる反応の阻害は完全ではなかったようである。事実、用量50μgのTNFレセプター免疫アドヘジンによる処置[TNFR1−IgG;A.アシュケナージ等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88巻10535−10539頁(1991)]は50μgのIFNγR−IgGと類似の阻害を与え、さらに、二つの免疫アドヘジンの組合せ(各々50μg)はほぼ相加的な反応阻害をもたらした(第1表)。比較のため本発明者等は抗IFN−γおよび抗TNF−αモノクローナル抗体の効果を試験した。個別にまたは組み合わせて投与した場合のこれらの抗体による阻害の程度は、IFNγRおよびTNFR免疫アドヘジンで観察されたものに匹敵した(第1表)。これらの結果は、接触感受性反応に対するIFN−γの寄与はIFNγR−IgGによって有効に阻害されることを示し、したがって、さらに、IFN−γの生物活性をインビボで遮断するこの免疫アドヘジンの能力を立証するものである。
結論として、各IFNγR−IgG免疫アドヘジンは、組み替え可溶性IFN−γレセプターに匹敵してナノモル親和性をもって種特異的にIFN−γに結合した。培養細胞において、IFNγR−IgGは、IFN−γの誘導するICAM1およびMHCクラスI抗原の発現ならびにIFN−γ抗ウイルス活性を完全に遮断することができた。マウスにおいては、IFNγR−IgGは、細菌感染に対する反応の際そして接触感受性の顕現の際に主要なサイトカインとして産生されるIFN−γの機能を阻害した。このようにIFNγR−IgGはインビトロおよびインビボの両方でIFN−γの特異的且つ効果的なインヒビターである。
実施齢3 腸の損傷の阻害
炎症性腸疾患に特徴的な腸の損傷を防ぐIFN−γレセプター−IgG−1キメラの能力を胎児腸外植片のモデルで試験した。このモデルではヒト胎児腸外植片をスタフィロコッカスのエクステロトキシンB(SEB)で刺激する。これにより、Vβ3を発現する固有相T細胞が活性化され、局所の細胞性免疫反応が腸の損傷を惹起するが、これは上皮の増殖の亢進および活性化マクロファージによるプロテアーゼおよびエンドグリコシダーゼの放出に起因するマトリックスのグリコサミノグリカンの損失として観察される。この後者の現象は、腸の潰瘍の形成における重要なステップであると信じられている。
ヒト小腸を、外科手術終了後2時間以内にメディカル・リサーチ・カウンスル・フィータル・ティシュー・バンクから入手した。この研究は、ハックニー・アンド・ディストリクト・ヘルス・オーソリティーの倫理委員会により承認された条件の下で実施された。
15.3週齢の胎児の小腸(回腸)を2mm2の外植片に切り取り、次いでこれらを、ヒドロコーチゾンを除く外はオートラップ等[ローゼンツヴァイクおよびカンワー、Lab.Invest.、47巻177−184頁(1982)]に従って改変した無血清CMRL−1066培地7ml(フロー・ラボラトリーズ・Inc.、マクリーン、VA)中、95%酸素、5%CO2雰囲気下に37℃で4日間、スタフィロコッカスのエンテロトキシンB(SEB)と共に培養した(1皿につき7ml中20個)。
別個の培養を準備し、抗IL−2抗体(細胞培養上清100μl。抗体約100−200ng/mlに相当するに過ぎない。)、およびヒトIFN−γレセプター−IgG−1キメラを実施例1に記載のように調製した。これらをSEBと同時に添加した。4日間の培養期間の終了時に、この組織を液体窒素中で急速冷凍し、−70℃で保存した。
凍結した切片を6μmの切片に切り、固有相のグリコサミノグリカン(GAG)の存在および分布を銀染色により可視化した[クレイン等、Histochem.J.、25巻291−298頁(1993);クレイン等、J.Cell.Sci.、102巻81−832頁(1992)]。特に、カルシウムおよびマグネシウムを含まないpH1−2の燐酸緩衝化食塩水で百分の一に希釈した5nmの金コンジュゲート化したポリ−L−リジンプローブ(バイオセル・リサーチ・ラボラトリーズ、カーディフ、U.K.)でアニオン部位を可視化した。このプローブを切片に60分間適用し、脱イオン水で洗い流し、銀エンハンサー(バイオセル)を用いて室温で15分間発色させた。スライドはメイヤーのヘマラム中で対比染色し、アパシー媒質に封入した。
GAGを定量するため、光学的集積デンシトメーター上で複数の視野をスキャンした。単位は任意に選択した。数値が高いほど良く染色し組織中のGAGの量が多い。
SEBで処置された外植片において、活性化T細胞はリンホカインを分泌し、これが固有相のマクロファージを活性化する。次いでこれらが、細胞外マトリックスを減成するメタロプロテイナーゼを分泌する。
図5に開示されるデータは、IFN−γレセプター−IgG−1キメラがこの系において腸の損傷の防止に有効であったことを示している。この試験には少量の抗IL−2抗体が含まれていたが、別の実験で抗IL−2抗体はこの系において無効であることが判明しているため、この効果は明らかにIFN−γ−IgG−1キメラに帰せられるものであった。
以上の記載は特定の好ましい態様を示すものであるが、本発明はこれに限定されないことが理解できるであろう。本発明の包括的概念から逸脱することなく、開示される態様に種々の修飾を施し得ることが、当業者には理解できるであろう。係る修飾は全て本発明の範囲内にあることを意図している。
Claims (24)
- 炎症性腸疾患の処置のための、インターフェロン−ガンマ(IFN−γ)インヒビターを含有する医薬組成物。
- 炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である、請求項1に記載の医薬組成物。
- 炎症性腸疾患がクローン病である、請求項1に記載の医薬組成物。
- IFN−γインヒビターが抗IFN−γ抗体、抗IFN−γレセプター抗体、IFN−γレセプターまたはIFN−γ変異体由来のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の医薬組成物。
- IFN−γインヒビターがIFN−γと結合することのできるIFN−γレセプターアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の医薬組成物。
- 該IFN−γレセプターアミノ酸配列がIFN−γレセプターの細胞外部分である、請求項5に記載の医薬組成物。
- 該IFN−γレセプターアミノ酸配列が安定な血漿蛋白と融合している、請求項6に記載の医薬組成物。
- 該安定な血漿蛋白が免疫グロブリンである、請求項7に記載の医薬組成物。
- 該免疫グロブリンがIgA、IgG、IgE、またはIgMクラスのものである、請求項8に記載の医薬組成物。
- 該IFN−γレセプターアミノ酸配列が免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合している、請求項9に記載の医薬組成物。
- IFN−γレセプターの細胞外部分がそのC末端で、重鎖定常ドメインを含む免疫グロブリン配列のN末端と融合している、請求項10に記載の医薬組成物。
- 該免疫グロブリン配列がIgG重鎖のヒンジおよびFc部分から構成される、請求項11に記載の医薬組成物。
- 該IgGがIgG−1またはIgG−3イソタイプのものである、請求項12に記載の医薬組成物。
- 該安定な血漿蛋白がアルブミン、リポ蛋白、アポリポ蛋白またはトランスフェリンである、請求項7に記載の医薬組成物。
- 前記IFN−γインヒビターアミノ酸配列が炎症性腸疾患の開始または進行に関与する標的と結合することのできるさらなるアミノ酸配列に融合して融合蛋白を形成しており、前記さらなるアミノ酸配列がIFN−γレセプター以外のIFN−γインヒビター、IL−1インヒビター、TNF−αインヒビター、CD11a/18インヒビター、CD11b/18(VLA−4)インヒビター、およびL−セレクチンインヒビターよりなる群から選ばれるポリペプチド由来である、請求項1ないし14のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記融合蛋白が、第一の免疫グロブリン定常ドメイン配列への、IFN−γインヒビターアミノ酸配列の融合、および、第二の免疫グロブリン定常ドメイン配列への、IBDの開始または進行に関与する標的と結合することのできるさらなるアミノ酸配列の融合を含む、請求項15に記載の医薬組成物。
- 該IFN−γインヒビターアミノ酸配列および該さらなるアミノ酸配列の各々が、そのC末端で、IgG−1、IgG−2またはIgG−3免疫グロブリンのヒンジ領域およびCH2およびCH3ドメインを少なくとも含む免疫グロブリン重鎖定常ドメイン配列のN末端と融合している、請求項16に記載の医薬組成物。
- 該融合がジスルフィド結合している、請求項17に記載の医薬組成物。
- 該融合の少なくとも一方が免疫グロブリン軽鎖に結合している、請求項18に記載の医薬組成物。
- 請求項15に記載の融合蛋白をコードしているヌクレオチド配列。
- 請求項20に記載のヌクレオチド配列を含み適当な宿主細胞中でこれを発現することのできる、複製可能な発現ベクター。
- 請求項21に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
- 請求項22に記載の宿主細胞を培養することを含む、コードされた融合蛋白を発現させる方法。
- 宿主細胞培養から融合蛋白を回収することをさらに含む、請求項23に記載の方法。
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