ES2225889T3

ES2225889T3 - Receptores solubles de la linfotoxina-beta, anticuerpos contra el receptor de la linfotoxina y anticuerpos ligandos, como agentes terapeuticos para el tratamiento de enfermedades inmunologicas.

Info

Publication number: ES2225889T3
Application number: ES96925393T
Authority: ES
Inventors: Jeffrey L. Browning; Christopher D. Benjamin; Paula S. Hochman
Original assignee: Biogen Inc
Current assignee: Biogen Inc
Priority date: 1995-07-21
Filing date: 1996-07-19
Publication date: 2005-03-16
Anticipated expiration: 2016-07-19
Also published as: US7951371B2; JP2012041350A; HUP9802483A2; US20110250200A1; DK0840616T3; MX9800624A; CA2227477A1; KR20040107513A; EE9800013A; BG63330B1; SK286409B6; US7427403B2; US6669941B1; SK6898A3; JP2007254488A; NO20083842L; US5925351A; HU227508B1; HUP9802483A3; CN1895670A

Abstract

ESTA INVENCION ESTA RELACIONADA CON COMPOSICIONES Y METODOS CONSISTENTES EN "AGENTES BLOQUEANTES DEL RECEPTOR DE LINFOTOXINA BE}", QUE BLOQUEAN LA SEÑALIZACION DEL RECEPTOR DE LINFOTOXINA BE}. LOS AGENTES BLOQUEANTES DEL RECEPTOR DE LINFOTOXINA BE} SON UTILES PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES INMUNOLOGICAS MEDIADAS POR LOS LINFOCITOS Y, MAS CONCRETAMENTE, PARA LA INHIBICION DE LAS RESPUESTAS INMUNES MEDIADAS POR CELULAS TH 1. ESTA INVENCION ESTA RELACIONADA CON FORMAS SOLUBLES DEL CAMPO DE ACTIVIDAD EXTRACELULAR DEL RECEPTOR DE LINFOTOXINA BE} QUE ACTUAN COMO AGENTES BLOQUEANTES DEL RECEPTOR DE LINFOTOXINA BE}. ESTA INVENCION TAMBIEN ESTA RELACIONADA CON EL EMPLEO DE ANTICUERPOS DIRIGIDOS CONTRA EL RECEPTOR DE LINFOTOXINA BE} O SU LIGANDO, LINFOTOXINA DE SUPERFICIE, QUE ACTUAN COMO AGENTES BLOQUEANTES DEL RECEPTOR DE LINFOTOXINA BE}. TAMBIEN SE PROPORCIONA UN NUEVO METODO DE SCREENING PARA SELECCIONAR RECEPTORES SOLUBLES, ANTICUERPOS Y OTROS AGENTES QUE BLOQUEAN LA SEÑALIZACION DEL RECEPTOR LT BE}.

Description

Receptores solubles de la linfotoxina-\beta, anticuerpos contra el receptor de la linfotoxina y anticuerpos ligandos,como agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades inmunológicas.

Campo técnico de la invención

Esta invención se refiere a composiciones y métodos que comprenden "agentes bloqueantes de receptor de linfotoxina \beta", que bloquean la señalización de receptor de linfotoxina \beta. Los agentes bloqueantes de receptor de linfotoxina \beta son útiles para tratar enfermedades inmunológicas mediadas por linfocitos, y más particularmente para inhibir respuestas inmunes mediadas por células Th1. Esta invención se refiere a formas solubles del dominio extracelular del receptor de linfotoxina \beta que actúan como agentes bloqueantes de receptor de linfotoxina \beta. Esta invención se refiere también al uso de anticuerpos dirigidos contra el receptor de linfotoxina \beta o su ligando, la linfotoxina de superficie, que actúan como agentes bloqueantes de receptor de linfotoxina \beta. Se proporciona un nuevo método de examen para seleccionar receptores solubles, anticuerpos y otros agentes que bloquean la señalización de receptor de LT-\beta.

Antecedentes de la invención

El patrón de citocinas liberadas al inicio de una exposición inmune puede afectar a la elección posterior de cuáles rutas efectoras inmunes se activan. La elección entre los mecanismos efectores inmunes está mediada por los linfocitos T auxiliares CD4 positivos (células T auxiliares o células Th). Las células Th interactúan con células presentadoras de antígenos (APC), que presentan fragmentos peptídicos de antígeno extraño procesado en asociación con moléculas MHC de clase II en sus superficies. Las células Th se activan cuando reconocen epítopos particulares de un antígeno extraño presentados en la superficie de APC apropiada para la que las células Th expresan un receptor específico. Las células Th activadas, a su vez, secretan citocinas (linfocinas) que activan mecanismos efectores inmunes apropiados.

Las células Th pueden activar diversos mecanismos efectores incluyendo la activación de células T asesinas, la producción de anticuerpos de células B y la activación de macrófagos. La elección entre mecanismos efectores está mediada en gran medida por cuáles citocinas se producen por las células Th activadas.

Las células Th pueden dividirse en tres subgrupos basados en sus patrones de secreción de citocinas (Fitch et al., Ann. Rev. Immunol., 11, pág. 29-48 (1993)). Estos subgrupos se denominan Th0, Th1 y Th2. En el ratón, las células T auxiliares "primarias" no estimuladas producen IL-2. La estimulación a corto plazo conduce a células precursoras Th0, que producen un amplio intervalo de citocinas incluyendo IFN-\gamma, IL-2, IL-4, IL-5 e IL-10. Las células Th0 estimuladas crónicamente pueden diferenciarse en los tipos celulares Th1 o Th2, a consecuencia de lo cual cambia el patrón de expresión de citocinas.

Algunas citocinas se liberan tanto por células Th1 como Th2 (por ejemplo IL-3, GM-CSF y TNF). Otras citocinas se preparan exclusivamente por uno u otro de los subgrupos de células Th. Los efectos especializados de los subgrupos de células T auxiliares se reconocieron por primera vez en el ratón. Existe también una subdivisión similar de las células T auxiliares en seres humanos (Romagnani et al. Ann. Rev. Immunol., 12, pág. 227-257 (1994)).

Las células Th1 producen LT-\alpha, IL-2 e IFN-\gamma. En los seres humanos, el patrón Th1 de secreción de citocinas se ha asociado generalmente a inmunidad celular y a resistencia a la infección. Las citocinas Th1 tienden a activar macrófagos y ciertas respuestas inflamatorias tales como hipersensibilidad de tipo IV "de tipo retardado" (véase a continuación). Las citocinas Th1 desempeñan un papel importante en el rechazo celular de injertos de tejido y transplantes de órganos.

Las células Th2 producen las citocinas IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10. Las citocinas Th2 aumentan la producción de eosinófilos y mastocitos y promueven la expansión y maduración completas de las células B (Howard et al., "T cell-derived cytokines and their receptors", Fundamental Immunology, 3ª ed., Raven Press, Nueva York (1993)). Las citocinas Th2 potencian también la producción de anticuerpos, incluyendo los anticuerpos IgE asociados a respuestas alérgicas y a anticuerpos anti-injerto. Las células Th2 pueden participar también en la supresión inmune y en la tolerancia a antígenos persistentes.

Las citocinas asociadas a Th1 y Th2 desempeñan un papel en ciertas respuestas de hipersensibilidad, respuestas inmunes inapropiadas o desproporcionadas provocadas tras el contacto con un antígeno encontrado previamente. Existen cuatro tipos reconocidos de hipersensibilidad (Roitt et al., Immunology, pág. 19.1-22.12 (Mosby-Year Book Europe Ltd., 3ª ed., 1993)).

La "hipersensibilidad inmediata" de tipo I implica la activación de células Th2 inducida por alergenos y la liberación de citocina Th2. La citocina Th2 IL-4 estimula las células B a experimentar un cambio de isotipo para producir IgE, que activa los mastocitos para producir reacciones inflamatorias agudas tales como las que conducen a eccema, asma y rinitis.

Las hipersensibilidades de tipos II y III están causadas por anticuerpos IgG e IgM dirigidos contra antígenos de superficie celular o de tejido específico (tipo II) o antígenos séricos solubles (tipo III). No se cree que estos tipos de reacciones de hipersensibilidad estén mediadas por células Th.

La hipersensibilidad de tipo IV "de tipo retardado" (HTR) está mediada por células Th1. Las reacciones de HTR tardan más de 12 horas para desarrollarse y se designan como "mediadas por célula" porque pueden transferirse entre ratones transfiriendo células Th1 pero no suero solo. Las respuestas de HTR de tipo IV se clasifican generalmente en tres tipos: hipersensibilidad de contacto, de tipo tuberculina y granulomatosa.

Muchas respuestas mediadas por células que pueden causar enfermedad son inducibles en ratones sanos mediante la transferencia de linfocitos de un ratón enfermo (por ejemplo diabetes insulinodependiente y encefalitis autoinmune experimental). Este rasgo distingue la HTR de tipo IV de los otros tres tipos de hipersensibilidad, que son respuestas inmunes humorales causadas principalmente por anticuerpos que pueden transferirse en suero exento de células.

Las células T auxiliares participan también en la regulación del cambio de isotipo de inmunoglobulina de novo. Diferentes subconjuntos de Th pueden influir en la proporción relativa de inmunoglobulinas de un isotipo dado en respuesta a la exposición inmune. Por ejemplo, la citocina Th2 IL-4 puede cambiar células B activadas al isotipo IgG1 y suprimir otros isotipos. Como se discutió anteriormente, la IL-4 activa también la sobreproducción de IgE en reacciones de hipersensibilidad de tipo I. La citocina Th2 IL-5 induce el isotipo IgA. Estos efectos de citocina de Th2 sobre el cambio de isotipo se contrarrestan por la IFN-\gamma producida por células Th1.

Los patrones diferenciales de citocinas secretadas por células Th1 y Th2 parecen dirigir la respuesta hacia diferentes mecanismos efectores inmunes. El cambio que activa un mecanismo efector mediado por célula o humoral se sensibiliza por supresión cruzada entre células Th1 y Th2: la IFN-\gamma producida por células Th1 inhibe la proliferación de células Th2 y la IL-10 secretada por células Th2 parece reducir la secreción de citocina de células Th1.

Dependiendo de las afinidades relativas de las citocinas por sus dianas moleculares, los circuitos reguladores negativos de Th1 y Th2 pueden amplificar los efectos de pequeñas diferencias de concentración entre las citocinas Th1 y Th2. Una señal de citocina Th1 o Th2 amplificada puede desencadenar el cambio entre mecanismos efectores basados en célula o humorales basándose en pequeños cambios en las concentraciones relativas de las citocinas Th1 y Th2. La capacidad de controlar este cambio modulando las concentraciones relativas de citocinas Th1 y Th2 sería útil para tratar desequilibrios en una serie de respuestas inmunes dependientes de células Th1 y Th2 que pueden conducir a trastornos y enfermedades inmunes.

Las respuestas patológicas de Th1 están asociadas a una serie de afecciones autoinmunes específicas de órganos y sistémicas, enfermedades inflamatorias crónicas y reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado. Como se discutió anteriormente, las respuestas Th1 contribuyen también a respuestas celulares que conducen al rechazo de tejido injertado y órganos transplantados.

El tratamiento de estas diversas afecciones inmunológicas basadas en células Th1 ha empleado generalmente hasta la fecha agentes inmunomodulatorios e inmunosupresores así como una serie de fármacos con mecanismos mal caracterizados (por ejemplo oro o penicilamina). Son tres agentes inmunosupresores generales utilizados actualmente esteroides, ciclosporina y azatioprina.

Los esteroides son agentes antiinflamatorios pleiotrópicos que suprimen los macrófagos activados e inhiben la actividad de células presentadoras de antígeno en modos que invierten muchos de los efectos de la citocina Th1 IFN-\gamma. La ciclosporina, un potente agente inmunosupresor, suprime la producción de citocina y reduce la expresión de receptores de IL-2 en linfocitos durante su activación. La azatioprina es un agente antiproliferativo que inhibe la síntesis de ADN. Estos agentes inmunosupresores no específicos se requieren generalmente en dosis altas que aumentan su toxicidad (por ejemplo nefro- y hepatotoxicidad) y causan efectos secundarios adversos. Son por tanto inadecuados para terapias a largo plazo.

Para enfrentarse a los problemas causados por los tratamientos convencionales con agentes inmunosupresores no específicos, muchas estrategias terapéuticas actuales se dirigen a suprimir o activar aspectos selectivos del sistema inmune. Es un objetivo especialmente atractivo la manipulación del equilibrio entre citocinas Th1 y Th2 para desplazar el equilibrio entre mecanismos efectores mediados por célula y humorales.

Para conseguir un desplazamiento entre los mecanismos efectores mediados por célula y humorales, sería útil poder modular la actividad de una molécula que pueda desplazar las actividades relativas de las subclases celulares Th1 y Th2. Los candidatos para dichas moléculas incluyen las citocinas y sus receptores. Datos recientes sugieren que LT-\alpha, IL-12, IFN-\alpha e IFN-\gamma favorecen el desarrollo de respuestas Th1, mientras que IL-1 e Il-4 polarizan una respuesta hacia un mecanismo efector Th2 (Romagnani et al., Ann. Rev. Immunol., 12, pág. 227-257 (1994)).

Muchas de las citocinas de células Th son reguladores pleiotrópicos del desarrollo y función inmunes, e inhibir su producción tendría efectos nocivos sobre respuestas no mediadas por células T. No se ha identificado todavía una diana deseable y eficaz para modular selectivamente la elección entre mecanismos efectores Th1 y Th2.

Sumario de la invención

La presente invención resuelve el problema designado anteriormente proporcionando composiciones farmacéuticas que pueden utilizarse para tratar enfermedades inmunológicas inhibiendo la señalización del receptor de linfotoxina \beta (LT-\beta-R) utilizando agentes bloqueantes de receptor de linfotoxina \beta. Más particularmente, las composiciones que comprenden agentes bloqueantes de LT-\beta-R son útiles para inhibir respuestas inmunes mediadas por células Th1 tales como, por ejemplo, síndrome inflamatorio intestinal.

En una realización, se proporcionan formas solubles del dominio extracelular del receptor de linfotoxina \beta que actúan como agentes bloqueantes de LT-\beta-R. Las composiciones y métodos preferidos de esta realización comprenden una proteína de fusión recombinante receptor de linfotoxina \beta que tiene el dominio de unión a ligando extracelular de LT-\beta-R condensado con un dominio de cadena pesada constante de inmunoglobulina. Más preferiblemente, el dominio de unión a ligando de LT-\beta-R está condensado con un dominio Fc de IgG humana.

En otra realización de esta invención, se proporcionan anticuerpos que actúan como agentes bloqueantes de LT-\beta-R. Las composiciones y métodos preferidos de esta realización comprenden uno o más anticuerpos dirigidos contra el receptor de linfotoxina \beta. Más preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. Otras composiciones y métodos preferidos de esta realización comprenden uno o más anticuerpos dirigidos contra linfotoxina de superficie. Más preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal dirigido contra linfotoxina \beta.

Esta invención proporciona además un nuevo proceso de examen para seleccionar agentes bloqueantes de LT-\beta-R, tales como formas solubles de LT-\beta-R, Ab anti-LT y Ab anti-LT-\beta-R. Este proceso de examen implica realizar ensayos de citotoxicidad de células tumorales que monitorizan la señalización de LT-\beta-R. El ensayo hace uso de la sensibilidad aumentada de las células de adenocarcinoma humano ante la señalización de LT-\beta-R inducida por ligando o anticuerpo en presencia de un agente activador de LT-\beta-R (tal como LT-\alpha1/\beta2) en un ensayo de citotoxicidad tumoral.

Los agentes bloqueantes de LT-\beta-R inhiben los efectos citotóxicos de complejos heteroméricos LT-\alpha/\beta (u otros agentes activadores de LT-\beta-R) sobre células tumorales. El procedimiento utilizado para ensayar los supuestos agentes bloqueantes de LT-\beta-R se ejemplifica para el caso de anticuerpos anti-LT-\beta-R (en presencia de los agentes activadores de LT-\beta-R LT-\alpha1/\beta2) y comprende las siguientes etapas:

1) Se cultivan células tumorales (por ejemplo células de adenocarcinoma humano HT29) durante varios días en medio que contiene IFN-\gamma, y se purifica LT-\alpha1/\beta2 en presencia o ausencia del Ab anti-LT-\beta-R particular que se está ensayando;

2) se tratan las células con un tinte que tiñe las células vivas; y

3) se cuantifica el número de células teñidas para determinar la fracción de células tumorales matadas en presencia de LT-\alpha1/\beta2, IFN-\gamma y el Ab anti-LT-\beta-R de ensayo en cada muestra.

Como alternativa, puede determinarse el número de células supervivientes mediante cualquiera de una serie de ensayos bien conocidos que miden la viabilidad celular, tales como la incorporación de ^{3}H-timidina al ADN. Un Ab anti-LT-\beta-R (o una combinación de Ab) que reduce el porcentaje de células tumorales matadas en este ensayo en al menos un 20% es un agente bloqueante de LT-\beta-R dentro del alcance de esta invención.

Este ensayo citolítico puede realizarse utilizando complejos heteroméricos de LT-\alpha/\beta y otros agentes activadores de LT-\beta-R, solos o en combinación. El ensayo puede adaptarse también como sea necesario para identificar nuevos agentes bloqueantes de LT-\beta-R.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. La secuencia de la porción extracelular del receptor de LT-\beta humana que codifica el dominio de unión a ligando.

Figura 2. Un receptor de LT-\beta soluble de múrido acoplado al dominio Fc de IgG1 humana (mLT-\beta-R-Fc) bloquea la señalización de LT-\beta-R en células WEHI 164 de ratón inducida por ligando soluble LT-\alpha/\beta de múrido. Las células WEHI 164 mueren en función del aumento de la concentración de ligando LT (mLT-\alpha/\beta). La mLT-\beta-R-Fc soluble (10 \mug/ml) bloquea esta muerte celular inducida por ligando LT. Una proteína de fusión de receptor de TNF soluble de múrido (p55TNF-R-Fc) tiene poco efecto sobre el bloqueo de la muerte celular activada por LT-\alpha/\beta. Se cuantificó el crecimiento después de tres días midiendo la densidad óptica (DO 550) del MTT reaccionado, que es proporcional al número de células.

Figura 3. Un anticuerpo dirigido contra el LT-\beta-R humano (mAb BDA8) bloquea la interacción entre el ligando LT soluble y LT-\beta-R sobre la superficie de una célula humana. El crecimiento de células tumorales WiDr se bloquea mediante una combinación de IFN-\gamma y ligando LT-\alpha1/\beta2 soluble. El anticuerpo BDA8 anti-LT-\beta-R bloquea la capacidad de LT-\alpha1/\beta2 de inhibir el crecimiento de células tumorales WiDr. Los símbolos oscuros muestran el crecimiento celular en presencia de mAb control de IgG1 (10 \mug/ml). Los símbolos claros muestran los efectos de mAb BDA8 anti-LT-\beta-R (10 \mug/ml).

Figura 4. Un anticuerpo dirigido contra la LT-\beta humana (mAb B9) bloquea la interacción entre el ligando LT-\alpha/\beta de superficie celular y el receptor soluble de LT-\beta (hLT-\beta-R-Fc, 2 \mug/ml). El LT-\beta-R-Fc unido a la superficie se detectó utilizando IgG de asno antihumana marcada con ficoeritrina y análisis de FACS. Se representa la intensidad media de fluorescencia del pico resultante como número de canal. La línea de puntos muestra la intensidad media de fluorescencia correspondiente a la cantidad de receptor unida en ausencia del mAb B9.

Figura 5. Efectos de un agente bloqueante de LT-\beta-R (mLT-\beta-R-Fc) sobre el hinchamiento de oreja en un modelo de hipersensibilidad de contacto de tipo retardado en ratón (HTR). La gráfica muestra el aumento del grosor de la oreja medido 24 horas después de la exposición a antígeno DNFB al 0,2% de las orejas de ratones sensibilizados. Cada símbolo representa un experimento separado. Todos los experimentos utilizaron 7-8 animales por punto, excepto aquellos marcados con un rombo que utilizaron sólo 4 animales por punto. Los ratones tratados con tampón (PBS) y con 20 mg/kg de una proteína de fusión de IgG control (LFA3-Fc) sirvieron como controles negativos. Los ratones tratados con 8 mg/kg de un mAb anti-VLA4 (mAb PS/2), que inhibe el hinchamiento de oreja por HTR de contacto, sirvieron como controles positivos.

Figura 6. Es un gráfico del cambio de peso observado en los ratones 14 días después del tratamiento con proteínas de fusión mLT-\betaR-1g y hLFA3-1g.

Figura 7. Es una gráfica del cambio de longitud del colon observado en ratones 14 días después del tratamiento con proteínas de fusión mLT-\betaR-1g y hLFA3-1g.

Figura 8. Es un curso temporal del peso corporal de ratones después de la inyección de células T CD4 positivas CD45RB^{bajo}; células T CD4 positivas CD45RB^{alto}; CR45RB^{alto} y LT\betaR-1g; y CD45RB^{alto} y hLFA3-1g.

Figura 9. Es una representación gráfica de la media y las desviaciones típicas de los pesos temporales observados después de los tratamientos de las Figuras 8-11.

Figura 10. Es una representación del aumento del grosor de la almohadilla de pata de ratones inyectados con controles negativos y positivos y mLT\betaR/1g.

Descripción detallada de la invención

Para que la invención descrita en la presente memoria pueda entenderse completamente, se da a conocer la siguiente descripción detallada.

El término "citocina" designa una molécula que media interacciones entre células. Una "linfocina" es una citocina liberada por linfocitos.

La expresión "células T auxiliares (Th)" designa una subclase funcional de células T que ayudan a generar células T citotóxicas y que cooperan con células B para estimular la producción de anticuerpos. Las células T auxiliares reconocen antígenos en asociación con moléculas MHC de clase II.

El término "Th1" designa una subclase de células T auxiliares que producen LT-\alpha, interferón-\gamma e IL-2 (y otras citocinas) y que desencadenan reacciones inflamatorias asociadas a una respuesta celular, concretamente no de inmunoglobulina, ante una exposición.

El término "Th2" designa una subclase de células T auxiliares que producen citocinas, incluyendo IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10, que están asociadas a una respuesta de inmunoglobulina (humoral) ante una exposición inmune.

La expresión "mediado por célula" designa aquellos eventos inmunológicos que son el resultado de los efectos directos de células T y sus productos para producir una respuesta. Este tipo de respuesta está asociado generalmente (pero no exclusivamente) con la clase Th1 de células T. No estarían incluidos en esta categoría los efectos auxiliares de células T sobre la diferenciación de células B y la expansión de células B, que están asociados generalmente a la clase Th2 de células T.

La expresión "hipersensibilidad de tipo retardado (HTR)" designa una respuesta inmunológica que se caracteriza por una lenta respuesta ante un antígeno, manifestándose el efecto completo durante un intervalo de 1-3 días. Esta lenta respuesta está en contraposición con la respuesta relativamente rápida observada en una reacción alérgica mediada por inmunoglobulina (humoral). Existen tres tipos de reacciones de HTR: hipersensibilidad de contacto, hipersensibilidad de tipo tuberculina y reacciones granulomatosas.

Las expresiones "respuesta de inmunoglobulina" o "respuesta humoral" designan las respuestas inmunológicas de un animal ante un antígeno extraño a consecuencia de las cuales el animal produce anticuerpos contra el antígeno extraño. La clase Th2 de células T auxiliares es crítica para una producción eficaz de anticuerpos de alta afinidad.

La expresión "dominio Fc" de un anticuerpo designa una parte de la molécula que comprende la bisagra, dominios CH2 y CH3, pero que carece de los sitios de unión a antígeno. El término se pretende que incluya también las regiones equivalentes de una IgM u otro isotipo de anticuerpo.

La expresión "anticuerpo anti-receptor de LT-\beta" designa cualquier anticuerpo que se una específicamente al menos a un epítopo del receptor de LT-\beta.

La expresión "anticuerpo anti-LT" designa cualquier anticuerpo que se una específicamente al menos a un epítopo de LT-\alpha, LT-\beta o un complejo LT-\alpha/\beta.

La expresión "señalización de LT-\beta-R" significa reacciones moleculares asociadas a la ruta de LT-\beta-R y reacciones moleculares posteriores que son el resultado de las mismas.

La expresión "agente bloqueante de LT-\beta-R" designa un agente que puede reducir la unión de ligando a LT-\beta-R, el agrupamiento de LT-\beta-R en la superficie celular o la señalización de LT-\beta-R, o que puede influir en cómo se interpreta la señal de LT-\beta-R en la célula.

Un agente bloqueante de LT-\beta-R que actúa en la etapa de unión de ligando-receptor puede inhibir la unión de ligando LT a LT-\beta-R en al menos un 20%. Un agente bloqueante de LT-\beta-R que actúa tras la etapa de unión de ligando-receptor puede inhibir los efectos citotóxicos de la activación de LT-\beta-R sobre una célula tumoral en al menos un 20%. Los ejemplos de agentes bloqueantes de LT-\beta-R incluyen moléculas de LT-B-R-Fc soluble y Ab anti-LT-\alpha, anti-LT-\beta, anti-LT-\alpha/\beta y anti-LT-\beta-R. Preferiblemente, los anticuerpos no reaccionan de forma cruzada con la forma secretada de LT-\alpha.

La expresión "actividad biológica de LT-\beta-R" designa: 1) la capacidad de la molécula de LT-\beta-R o derivado de competir por la unión de ligando LT soluble o de superficie con moléculas de LT-\beta-R solubles o de superficie; o

2) la capacidad de estimular una respuesta reguladora inmune o actividad citotóxica junto con una molécula de LT-\beta-R nativa.

Las expresiones "complejo heteromérico LT-\alpha/\beta" y "complejo heteromérico LT" designan una asociación estable entre al menos una subunidad LT-\alpha y una o más LT-\beta, incluyendo formas solubles, mutantes, alteradas y quiméricas de una o más de las subunidades. Las subunidades pueden asociarse mediante interacciones electrostáticas, de van der Waals o covalentes. Preferiblemente, el complejo heteromérico LT-\alpha/\beta tiene al menos dos subunidades LT-\beta adyacentes y carece de subunidades LT-\alpha adyacentes. Cuando el complejo heteromérico LT-\alpha/\beta sirve como agente activador de LT-\beta-R en un ensayo de crecimiento celular, el complejo es preferiblemente soluble y tiene la estequiometría LT-\alpha1/\beta2. Los complejos heteroméricos LT-\alpha/\beta solubles carecen de un dominio transmembrana y pueden secretarse por una célula hospedadora apropiada que se ha modificado por ingeniería genética para expresar subunidades LT-\alpha y/o LT-\beta (Crowe et al., J. Immunol. Methods, 168, pág. 79-89 (1994)).

La expresión "ligando LT" designa un complejo heteromérico LT o un derivado del mismo que puede unirse específicamente al receptor de LT-\beta.

La expresión "dominio de unión del ligando de LT-\beta-R" designa la porción o porciones de LT-\beta-R que están implicadas en el reconocimiento específico e interacción con un ligando LT.

Las expresiones "complejo LT-\alpha/\beta de superficie" y "complejo LT de superficie" designan un complejo que comprende subunidades LT-\alpha y LT-\beta unidas a membrana, incluyendo formas mutantes, alteradas y quiméricas de una o más de las subunidades, que se presentan en la superficie celular. "Ligando LT de superficie" designa un complejo LT de superficie o derivado del mismo que puede unirse específicamente al receptor de LT-\beta.

El término "sujeto" designa un animal, o a una o más células derivadas de un animal. Preferiblemente, el animal es un mamífero. Las células pueden estar en cualquier forma, incluyendo pero sin limitación células retenidas en tejido, agrupaciones celulares, células inmortalizadas, transfectadas o transformadas y células derivadas de un animal que se han alterado física o fenotípicamente.

Linfotoxina-\beta: Un miembro de la familia del TNF

Las citocinas relacionadas con el factor de necrosis tumoral (TNF) han surgido como una gran familia de mediadores pleiotrópicos de la defensa de hospedadores y la regulación inmune. Los miembros de esta familia existen en formas unidas a membrana que actúan localmente mediante contacto célula-célula o en forma de proteínas secretadas que pueden actuar sobre dianas distantes. Una familia paralela de receptores relacionados con TNF reacciona con estas citocinas y desencadena una serie de rutas incluyendo muerte celular, proliferación celular, diferenciación de tejido y respuestas proinflamatorias.

El TNF, la linfotoxina-\alpha (LT-\alpha, también llamada TNF-\beta) y la linfotoxina-\beta (LT-\beta) son miembros de la familia de ligandos del TNF, que incluye también los ligandos de receptores Fas, CD27, CD30, CD40, OX-40 y 4-1BB (Smith et al., Cell, 76, pág. 959-962 (1994)). La señalización por diversos miembros de la familia del TNF, incluyendo TNF, LT-\alpha, LT-\beta y Fas, puede inducir la muerte de células tumorales mediante necrosis o apoptosis (muerte celular programada). En células no tumorigénicas, el TNF y muchas de las interacciones ligando-receptor de la familia del TNF influyen en el desarrollo del sistema inmune y en las respuestas ante diversas exposiciones inmunes.

La mayoría de los ligandos de la familia del TNF se encuentran en forma unida a membrana en la superficie celular. El TNF y la LT-\alpha se encuentran tanto en forma secretada como de superficie asociada a membrana en seres humanos. El TNF de superficie tiene una región transmembrana que se escinde proteolíticamente para generar la forma secretada. En contraposición, la LT-\alpha de superficie carece de una región transmembrana. La LT-\alpha asociada a membrana está unida a la superficie celular en forma de un complejo heteromérico con LT-\beta, un polipéptido transmembrana relacionado, en un complejo LT-\alpha/\beta.

La mayoría de los complejos LT-\alpha/\beta asociados a membrana ("LT de superficie") tienen una estequiometría LT-\alpha1/\beta2 (Browning et al., Cell, 72, pág. 847-856 (1993); Browning et al., J. Immunol. 154, pág. 33-46 (1995)). Los ligandos LT de superficie no se unen a TNF-R con alta afinidad, y no activan la señalización de TNF-R. Otro receptor relacionado con TNF, denominado el receptor LT-\beta (LT-\beta-R) se une a estos complejos de linfotoxina de superficie con alta afinidad (Crowe et al., Science, 264, pág. 707-710 (1994)).

La señalización de LT-\beta-R, como la señalización de TNF-R, tiene efectos antiproliferativos y puede ser citotóxica para células tumorales. En la solicitud de patente de Estados Unidos de los solicitantes en tramitación junto con la presente número de serie 08/378.968, se dan a conocer composiciones y métodos para estimular selectivamente el LT-\beta-R utilizando agentes activadores de LT-\beta-R. Los agentes activadores de LT-\beta-R son útiles para inhibir el crecimiento de células tumorales sin la coactivación de las rutas proinflamatorias o inmunoregulatorias inducidas por el TNF-R.

En células no tumorales, el TNF y las citocinas relacionadas con el TNF son activas en una amplia variedad de respuestas inmunes. Tanto los ligandos TNF como LT-\alpha se unen a y activan receptores de TNF (p55 o p60 y p75 y p80; denominados en la presente memoria "TNF-R"). El TNF y la LT-\alpha se producen mediante macrófagos en una respuesta temprana y rápida ante la infección microbiana, que potencia la actividad microbicida de macrófagos y neutrófilos. El TNF y la LT-\alpha producidos mediante macrófagos o linfocitos T citotóxicos (CTL o "células T asesinas") se unen a receptores de TNF en las superficies de células diana y desencadenan la muerte de las células sensibles.

El TNF y las citocinas relacionadas con el TNF pueden iniciar también cascadas inflamatorias en respuesta a la infección o al estrés. La liberación de TNF, LT-\alpha e IFN-\gamma cambia las propiedades de adhesión entre las células endoteliales vasculares y ciertos tipos de linfocito. El aumento de adhesión facilita la migración de fagocitos y leucocitos de la corriente sanguínea a los tejidos circundantes de un sitio de inflamación. Reacciones inflamatorias similares desempeñan un papel importante en el rechazo celular de injertos de tejidos y transplantes de órganos y en ciertos trastornos inmunes.

Los complejos de linfotoxina (LT) de superficie celular se han caracterizado en células de hibridoma de células T CD4^{+} (II-23.D7) que expresan altos niveles de LT (Browning et al., J. Immunol., 147, pág. 1230-1237 (1991); Androlewicz et al., J. Biol. Chem., 267, pág. 2542-2547 (1992)). La expresión y los papeles biológicos del LT-\beta-R, las subunidades LT y los complejos LT de superficie se han revisado en C.F. Ware et al., "The ligands and receptors of the lymphotoxin system", en Pathways for Cytolysis, Current Topics Microbiol. Immunol., Springer-Verlag, pág. 175-218 (1995).

Se induce la expresión de LT-\alpha y se secreta LT-\alpha principalmente por linfocitos T y B activados y células asesinas naturales (NK). Entre las subclases de células T auxiliares, LT-\alpha parece producirse por células Th1 pero no Th2. La LT-\alpha se ha detectado también en melanocitos. Las microglías y células T en lesiones de pacientes de esclerosis múltiple pueden teñirse también con antisueros anti-LT-\alpha.

La linfotoxina \beta (también denominada p33) se ha identificado en la superficie de linfocitos T, estirpes de células T, estirpes de células B y células asesinas activadas por linfocina (LAK). La LT-\beta es el objeto de las solicitudes internacionales de los solicitantes en tramitación junto con la presente PCT/US91/04588, publicada el 9 de enero de 1992 como WO 92/00329; y PCT/US93/11669, publicada el 23 de junio de 1994 como WO 94/13808.

Los complejos LT de superficie se expresan principalmente por linfocitos T y B activados y células asesinas naturales (NK) como se define por análisis FACS o inmunohistología utilizando anticuerpos anti-LT-\alpha o proteínas de fusión de LT-\beta-R-Fc soluble. La LT de superficie se ha descrito también en clones de linfocito T citotóxico humano (CTL), linfocitos mononucleares periféricos activados (PML), linfocitos de sangre periférica activados con IL-2 (células LAK), linfocitos B periféricos (PBL) activados con mitógeno de fitolaca o anti-CD40, y diversos tumores linfoides de estirpes de células T y B. La implicación de células diana que portan aloantígenos induce específicamente la expresión de LT de superficie por clones de CTL CD8+ y CD4+.

El receptor de LT-\beta, un miembro de la familia de receptores de TNF, se une específicamente a ligandos LT de superficie. El LT-\beta-R se une a complejos heteroméricos LT (principalmente LT-\alpha1/\beta2 y LT-\alpha2/\beta1), pero no se une a TNF ni a LT-\alpha (Crowe et al.,Science 264, pág. 707-710 (1994)). La señalización con LT-\beta-R puede desempeñar un papel en el desarrollo de órganos linfoides periféricos y en respuestas inmunes humorales.

Los estudios sobre la expresión de LT-\beta-R están en sus etapas iniciales. Se encuentran ARNm de LT-\beta-R en bazo, timo humano y otros órganos importantes. Los patrones de expresión de LT-\beta-R son similares a los reseñados para p55-TNF-R, excepto porque el LT-\beta-R falta en células T de sangre periférica y estirpes de células T.

Producción de complejos L/T solubles

Los complejos heteroméricos LT-\alpha/\beta solubles comprenden subunidades LT-\beta que han cambiado de una forma unida a membrana a una forma soluble. Estos complejos se describen con detalle en la solicitud de patente internacional de los solicitantes en tramitación junto con la presente (PCT/US93/11669, publicada el 23 de junio de 1994 como WO 94/13808). Los péptidos LT-\beta solubles se definen por la secuencia aminoacídica de la linfotoxina-\beta, en la que la secuencia se escinde en cualquier punto entre el final de la región transmembrana (concretamente aproximadamente en el aminoácido nº 44) y la primera región de homología con TNF (concretamente en el aminoácido nº 88) según el sistema de numeración de Browning et al., Cell, 72, pág. 847-856 (1993).

Pueden producirse polipéptidos LT-\beta solubles truncando la terminación N de la LT-\beta para retirar la cola citoplasmática y la región transmembrana (Crowe et al., Science, 264, pág. 707-710 (1994)). Como alternativa, el dominio transmembrana puede inactivarse mediante deleción, o mediante sustitución de los residuos aminoacídicos normalmente hidrófobos que comprenden un dominio transmembrana con los hidrófilos. En cualquier caso, se crea un perfil de hidropatía sustancialmente hidrófilo que reducirá la afinidad lipídica y mejorará la solubilidad acuosa. Se prefiere la deleción del dominio transmembrana frente a la sustitución por residuos aminoacídicos hidrófilos porque evita introducir epítopos potencialmente inmunogénicos.

El dominio transmembrana eliminado o inactivado puede reemplazarse por o unirse a una secuencia líder de tipo I (por ejemplo la líder VCAM-1) de tal modo que la proteína se secreta empezando por una secuencia en cualquier lugar entre val40 y pro88. Los polipéptidos LT-\beta solubles pueden incluir cualquier número de secuencias líder bien conocidas en la terminación N. Dicha secuencia permitirá expresar los péptidos y dirigirlos a la ruta de secreción en un sistema eucarótico. Véase, por ejemplo, Ernst et al., patente de Estados Unidos nº 5.082.783 (1992).

Los complejos heteroméricos LT-\alpha/\beta pueden producirse cotransfectando una célula hospedadora adecuada con ADN que codifica LTA-\alpha y LT-\beta soluble (Crowe et al., J. Immunol. Methods, 168, pág. 79-89 (1994)). La LTA-\beta soluble secretada en ausencia de LT-\alpha está altamente oligomerizada. Sin embargo, cuando se coexpresa con LT-\alpha, se forma una estructura de tipo trimérico de 70 kDa que contiene ambas proteínas. También es posible producir complejos heteroméricos LT-\alpha1/\alpha2 solubles mediante la transfección de una estirpe celular que expresa normalmente sólo LT-\alpha (tales como las células RPMI 1788 discutidas anteriormente) con un gen que codifica un polipéptido LT-\beta soluble.

Los polipéptidos LT-\alpha y LT-\beta pueden sintetizarse separadamente, desnaturalizase utilizando detergentes suaves, mezclarse conjuntamente y renaturalizarse retirando el detergente para formar complejos LT heteroméricos mixtos que pueden separarse (véase a continuación).

Purificación de complejos LT-\alpha1/\beta2

Los complejos heteroméricos LT-\alpha1/\beta2 solubles se separan de los complejos de coexpresión que comprenden una estequiometría de subunidades diferente mediante cromatografía utilizando receptores de TNF y LTA-\beta como reactivos de purificación por afinidad. Los receptores de TNF se unen sólo a las hendiduras \alpha/\alpha de los complejos LT. El receptor de LT-\beta se une con alta afinidad a las hendiduras \beta/\beta, y con menor afinidad a las hendiduras \alpha/\beta de complejos heteroméricos LT-\alpha/\beta. En consecuencia, LT-\alpha3 y LT-\alpha2/\beta1 se unirán al TNF-R. El LT-\beta-R puede unirse también a trímeros LT-\alpha2/\beta1 (en las hendiduras \alpha/\beta), pero no puede unirse a LT-\alpha3. Además, el LT-\beta-R (pero no el TNF-R) se une a LT-\alpha1/\beta2 y LT-\betan (la composición exacta de dicha preparación es desconocida, sin embargo, son agregados grandes).

Los reactivos de afinidad por receptor pueden prepararse en forma de un dominio extracelular soluble (véanse por ejemplo Loetscher et al., J. Biol. Chem., 266, pág. 18324-18329 (1991)), o en forma de proteínas quiméricas con el dominio de unión a ligando extracelular acoplado a un dominio Fc de inmunoglobulina (Loetscher et al., J. Biol. Chem., 266, pág. 18324-18329 (19991); Crowe et al., Science 264, pág. 707-710 (1994)). Los receptores se acoplan a matrices de afinidad mediante reticulación química utilizando procedimientos rutinarios.

Existen dos esquemas mediante los que puede purificarse el ligando LT-\alpha1/\beta2 utilizando receptores y cromatografía de inmunoafinidad. En el primer esquema, se pasa un sobrenadante de un sistema de expresión apropiado que coexpresa tanto LT-\alpha como la forma LT-\beta truncada por una columna de TNF-R. El TNF-R se unirá a trímeros LT-\alpha3 y a LT-\alpha2/\beta1. El flujo a través de la columna de TNF-R contendrá LT-\beta(n) y LT-\alpha1/\beta2.

En el segundo esquema, todas las formas que contienen LT-\beta (LT-\beta(n), LT-\alpha1/\beta2 y LT-\alpha2/\beta1) se unen a y se eluyen de una columna de LT-\beta-R utilizando métodos clásicos tales como con un agente caotrófico o por cambio de pH. (LT-\alpha3 fluye a través de esta columna). El eluido se neutraliza o se retira el agente caotrófico, y se pasa el eluido después a través de una columna de TNF-R, que se une sólo a trímeros LT-\alpha2/\beta1. El flujo a través de esta columna contendrá trímeros LT-\beta(n) y LT-\alpha1/\beta2.

En ambos casos, los trímeros LT-\alpha1/\beta2 puros pueden separarse de LT-\beta mediante una posterior filtración en gel y/o procedimientos de intercambio iónico conocidos en la técnica.

Como alternativa, pueden separarse y purificarse diferentes formas de complejos heteroméricos LT-\alpha/\beta mediante una serie de medios cromatográficos convencionales. Puede ser preferible también combinar una serie de esquemas de purificación convencionales con una de las etapas de inmunopurificación descritas anteriormente.

Examen de agentes bloqueantes de LT-\beta-R

En una realización de esta invención, el agente bloqueante de LT-\beta-R comprende un anticuerpo (Ab) dirigido contra LT-\beta-R que inhibe la señalización de LT-\beta-R. Preferiblemente, el Ab anti-LT-\beta-R es un anticuerpo monoclonal (mAb). Es uno de dichos mAB anti-LT-\beta-R el mAb BDA8.

Los Ab inhibidores anti-LT-\beta-R y otros agentes bloqueantes de LT-\beta-R pueden identificarse utilizando métodos de examen que detectan la capacidad de uno o más agentes de unirse al ligando de LT-\beta-R o LT, o de inhibir los efectos de la señalización de LT-\beta-R sobre las células.

Un método de examen hace uso de los efectos citotóxicos de la señalización de LT-\beta-R sobre células tumorales que portan el LT-\beta-R. Las células tumorales se exponen a uno o más agentes activadores de LT-\beta-R para inducir la señalización de LT-\beta-R. Los agentes activadores de LT-\beta-R incluyen complejos heteroméricos LT-\alpha/\beta (preferiblemente LT-\alpha1/\beta2 soluble) en presencia de IFN-\gamma o un Ab anti-LT-\beta-R activador (véase a continuación, descrito también la solicitud de patente de Estados Unidos de los solicitantes en tramitación junto con la presente número de serie 08/378.968). Los anticuerpos y otros agentes que pueden bloquear la señalización de LT-\beta-R se seleccionan basándose en su capacidad de inhibir el efecto citotóxico de la señalización de LT-\beta-R sobre células tumorales en el siguiente ensayo:

1) Se cultivan células tumorales tales como células HT29 durante 3 a 4 días en una serie de pocillos de cultivo de tejido que contienen medios y al menos un agente activador de LT-\beta-R en presencia o ausencia de diluciones en serie del agente que se está ensayando;

2) se añade un tinte de tinción in vivo que mide la función mitocondrial tal como MTT a la mezcla de células tumorales y se hace reaccionar durante varias horas;

3) se cuantifica la densidad óptica de la mezcla en cada pocillo con luz de 550 nm de longitud de onda (DO 550). La DO 550 es proporcional al número de células tumorales restantes en presencia del agente activador de LT-\beta-R y el agente bloqueante de LT-\beta-R de ensayo en cada pocillo. Un agente o combinación de agentes que puedan reducir la citotoxicidad de células tumorales activada por LT-\beta-R en al menos un 20% es un agente bloqueante dentro del alcance de esta invención.

Puede utilizarse cualquier agente o combinación de agentes que activen la señalización de LT-\beta-R en el ensayo anterior para identificar agentes bloqueantes de LT-\beta-R. Los agentes activadores de LT-\beta-R que inducen la señalización de LT-\beta-R (tales como mAb anti-LT-\beta-R activadores) pueden seleccionarse basándose en su capacidad, solos o en combinación con otros agentes, de potenciar la citotoxicidad de células tumorales utilizando el ensayo de células tumorales descrito anteriormente.

Es otro método para seleccionar un agente bloqueante de LT-\beta-R monitorizar la capacidad del supuesto agente de interferir directamente con la unión ligando LT-receptor. Un agente o combinación de agentes que puedan bloquear la unión ligando-receptor en al menos un 20% es un agente bloqueante de LT-\beta-R dentro del alcance de esta invención.

Puede utilizarse cualquiera de una serie de ensayos que miden la fuerza de la unión ligando-receptor para realizar ensayos competitivos con supuestos agentes bloqueantes de LT-\beta-R. La fuerza de la unión entre un receptor y un ligando puede medirse utilizando un ensayo de inmunosorción ligado a enzima (ELISA) o un radioinmunoensayo (RIA). La unión específica puede medirse también mediante complejos anticuerpo-antígeno marcados fluorescentemente y realizando análisis de separación celular activada por fluorescencia (FACS), o realizando otros de dichos métodos de inmunodetección, todos los cuales son técnicas bien conocidas en la técnica.

La interacción de unión ligando-receptor puede medirse también con el instrumento BIAcore (Pharmacia Biosensor) que explota la detección de resonancia de plasmón (Zhou et al., Biochemistry, 32, pág. 8193-8198 (1993); Faegerstram y O'Shannessy, "Surface plasmon resonance detection in affinity technologies" en Handbook of Affinity Chromatography, pág. 229-252, Marcel Dekker, Inc., Nueva York (1993)).

La tecnología BIAcore permite unir un receptor a una superficie de oro y hacer fluir ligando sobre él. La detección de resonancia de plasmón proporciona una cuantificación directa de la cantidad de masa unida a la superficie a tiempo real. Esta técnica proporciona tanto las constantes de asociación como de disociación, y por tanto pueden determinarse directamente una constante de disociación ligando-receptor y una constante de afinidad en presencia y ausencia del supuesto agente bloqueante de LT-\beta-R.

Con cualquiera de éstas u otras técnicas para medir las interacciones receptor-ligando puede evaluarse la capacidad de un agente bloqueante de LT-\beta-R, solo o en combinación con otros agentes, de inhibir la unión de ligandos LT de superficie o solubles a moléculas de LT-\beta-R de superficie o soluble. Dichos ensayos pueden utilizarse también para ensayar agentes de bloqueo de LT-\beta-R o derivados de dichos agentes (por ejemplo fusiones, quimeras, mutantes y formas químicamente alteradas), solas o en combinación, para optimizar la capacidad de ese agente alterado de bloquear la activación de LT-\beta-R.

Producción de moléculas de LT-\beta-R soluble

Los agentes bloqueantes de LT-\beta-R en una realización de esta invención comprenden moléculas de receptor de LT-\beta soluble. La Figura 1 muestra la secuencia de la porción extracelular del LT-\beta-R humano, que codifica el dominio de unión a ligando. Utilizando la información de secuencia de la figura 1 y técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica, pueden clonarse fragmentos funcionales que codifican el dominio de unión a ligando del LT-\beta-R en un vector y expresarse en un hospedador apropiado para producir una molécula de LT-\beta-R soluble. Las moléculas de LT-\beta-R soluble que pueden competir con los receptores de LT-\beta nativos por la unión del ligando LT según los ensayos descritos en la presente memoria se seleccionan como agentes bloqueantes de LT-\beta-R.

Un receptor de LT-\beta soluble que comprende secuencias aminoacídicas seleccionadas de las mostradas en la Figura 1 puede unirse a uno o más dominios proteicos heterólogos ("dominio de fusión") para aumentar la estabilidad in vivo de la proteína de fusión de receptor o para modular su actividad biológica o localización.

Preferiblemente, se utilizan proteínas plasmáticas estables, que tienen típicamente una semivida mayor de 20 horas en la circulación, para construir las proteínas de fusión de receptor. Dichas proteínas plasmáticas incluyen, pero sin limitación: inmunoglobulinas, seroalbúmina, lipoproteínas, apolipoproteínas y transferrina. Pueden unirse también secuencias que pueden orientar la molécula de LT-\beta-R soluble a un tipo de célula o tejido particular al dominio de unión al ligando del LT-\beta-R para crear una proteína de fusión de LT-\beta-R soluble específicamente localizada.

Toda o una parte funcional de la región extracelular del LT-\beta-R (Figura 1) que comprende el dominio de unión al ligando del LT-\beta-R puede condensarse con una región constante de inmunoglobulina como el dominio Fc de la cadena pesada de IgG1 humana (Browning et al., J. Immunol., 154, pág. 33-46 (1995)). Las proteínas de fusión de receptor-IgG solubles son preferibles, son reactivos inmunológicos comunes y los métodos para su construcción son conocidos en la técnica (véase por ejemplo la patente de Estados Unidos nº 5.225.538 incorporada a la presente memoria como referencia).

Puede condensarse un dominio de unión al ligando del LT-\beta-R funcional a un dominio Fc de inmunoglobulina (Ig) derivado de una clase o subclase de inmunoglobulina distinta de IgG1. Los dominios Fc de anticuerpos que pertenecen a diferentes clases o subclases de Ig pueden activar diversas funciones efectoras secundarias. La activación ocurre cuando el dominio Fc se une por un receptor de Fc análogo. Las funciones efectoras secundarias incluyen la capacidad de activar el sistema de complemento, de cruzar la placenta y de unirse a diversas proteínas microbianas. Las propiedades de las diferentes clases y subclases de inmunoglobulinas se describen en Roitt et al., Immunology, pág. 4.8 (Mosby-Year Book Europe Ltd., 3ª ed., 1993).

La activación del sistema de complemento inicia la cascada de reacciones enzimáticas que media la inflamación. Los productos del sistema de complemento tienen una variedad de funciones, incluyendo la unión de bacterias, endocitosis, fagocitosis, citotoxicidad, producción de radicales libres y solubilización de complejos inmunes.

La cascada enzimática de complemento puede activarse mediante los dominios Fc de anticuerpos IgG1, IgG3 e IgM unidos a antígenos. El dominio Fc de IgG2 parece ser menos eficaz, y los dominios Fc de IgG4, IgA, IgD e IgE son ineficaces para activar el complemento. Por tanto, puede seleccionarse un dominio Fc basándose en si sus funciones efectoras secundarias asociadas son deseables para la respuesta inmune o enfermedad particular que se está tratando con la proteína de fusión de LT-\beta-R-Fc.

Si fuera ventajoso dañar o matar la célula diana que porta el ligando LT, podría seleccionarse un dominio Fc especialmente activo (IgG1) para preparar la proteína de fusión de LT-\beta-R-Fc. Como alternativa, si fuera deseable orientar la fusión LT-\beta-R-Fc a una célula sin desencadenar el sistema de complemento, podría seleccionarse un dominio Fc de IgG4 inactivo.

Se han descrito mutaciones en los dominios Fc que reducen o eliminan la unión a receptores de Fc y la activación del complemento (S. Morrison, Annu. Rev. Immunol., 10, pág. 239-265 (1992)). Estas y otras mutaciones pueden utilizarse, solas o en combinación, para optimizar la actividad del dominio Fc utilizado para construir la proteína de fusión de LT-\beta-R-Fc.

Se describe en el ejemplo 1 la producción de una proteína de fusión de LT-\beta-R soluble humano que comprende secuencias de unión a ligando condensadas con un dominio Fc de inmunoglobulina humana (hLT-\beta-R-Fc). Una estirpe de CHO preparada según el ejemplo 1 que secreta hLT-\beta-R-Fc se denomina "hLT\beta;R-hG1 CHO nº 14". Se depositó una muestra de esta estirpe el 21 de julio de 1995 en la American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) según las provisiones del Tratado de Budapest, y se le asignó el número de acceso ATCC CRL11965.

Se describe en el ejemplo 2 la producción de una molécula de fusión de LT-\beta-R soluble de múrido (mLT-\beta-R-Fc). Una estirpe celular de CHO preparada según el ejemplo 2 que secreta mLT-\beta-R-Fc se denomina "mLT\beta;R-hG1 CHO nº 1.3.BB". Se depositó una muestra de esta estirpe el 21 de julio de 1995 en la American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) según las provisiones del Tratado de Budapest, y se le asignó el número de acceso ATCC CRL11964.

Todas las restricciones sobre la disponibilidad al público de los depósitos ATCC anteriores se retirarán irrevocablemente tras la concesión de una patente sobre esta solicitud.

Diferentes residuos aminoacídicos que forman el punto de unión de la proteína de fusión de receptor-Ig pueden alterar la estructura, estabilidad y en último caso actividad biológica de la proteína de fusión de receptor de LT-\beta soluble. Pueden añadirse uno o más aminoácidos a la terminación C del fragmento de LT-\beta-R seleccionado para modificar el punto de unión con el dominio de fusión seleccionado.

La terminación N de la proteína de fusión de LT-\beta-R puede variarse también cambiando la posición en la que se escinde el fragmento de ADN de LT-\beta-R seleccionado en su extremo 5' para la inserción en el vector de expresión recombinante. La estabilidad y actividad de cada proteína de fusión de LT-\beta-R puede ensayarse y optimizarse utilizando experimentación de rutina y los ensayos para seleccionar agentes bloqueantes de LT-\beta-R descritos en la presente memoria.

Utilizando las secuencias del dominio de unión al ligando del LT-\beta-R en el dominio extracelular mostrado en la figura 1, pueden construirse también variantes de secuencia aminoacídica para modificar la afinidad del receptor de LT-\beta soluble o de la proteína de fusión por el ligando LT. Las moléculas de LT-\beta-R soluble de esta invención pueden competir por la unión de ligando LT de superficie con receptores de LT-\beta endógenos de superficie celular. Se considera que cualquier molécula soluble que comprenda un dominio de unión al ligando del LT-\beta-R que pueda competir con receptores de LT-\beta de superficie celular por la unión del ligando LT es un agente bloqueante del LT-\beta-R que entra dentro del alcance de la presente invención.

Moléculas de LT-\beta-R soluble como agentes bloqueantes del LT-\beta-R

Se preparó una proteína de fusión de receptor de LT-\beta soluble humana-inmunoglobulina (hLT-\beta-R-Fc) según los procedimientos del ejemplo 1 y se ensayó su capacidad de bloquear la citotoxicidad inducida por el LT-\beta-R en células tumorales HT29 humanas. La Tabla 1 (ejemplo 3) compara la capacidad de las proteínas de fusión de receptor de LT-\beta (hLT-\beta-R-Fc) y receptor de TNF (p55-TNF-R-Fc) solubles para bloquear los efectos inhibidores de diversos ligandos TNF y LT solubles sobre el crecimiento de células tumorales HT29.

Los datos en la tabla 1 indican las concentraciones a las que el receptor de LT-\beta soluble (hLT-\beta-R-Fc) puede bloquear la muerte de células tumorales causada por la interacción entre el ligando LT-\alpha1/\beta2 y los receptores de LT-\beta de superficie celular en un 50%. La capacidad de bloquear el crecimiento de células tumorales en al menos un 20% identifica a este receptor de LT-\beta soluble como un agente bloqueante de LT-\beta-R según esta invención. Como se esperaba, la proteína de fusión de TNF-R soluble (p55-TNF-R-Fc) bloqueaba completamente la inhibición del crecimiento inducido por TNF mediante su unión a TNF y evitando su interacción con el receptor de superficie.

La proteína de fusión de TNF-R soluble no tenía efecto sobre los efectos antiproliferativos mediados por ligando LT (LT-\alpha1/\beta2). En contraposición, la proteína de fusión de LT-\beta-R bloqueaba los efectos del ligando LT pero no los efectos de TNF o LT-\alpha. Así, las proteínas de fusión de LT-\beta-R humanas solubles no interfieren con la activación de TNF-R por ligandos TNF y LT-\alpha.

Para determinar si la señalización de LT-\beta-R es también citotóxica para células tumorales en ratones, y si las proteínas de fusión de LT-\beta-R soluble pueden bloquear la citotoxicidad inducida por LT-\beta-R, se realizó un experimento similar utilizando células tumorales de ratón. Se ensayó en una proteína de fusión de LT-\beta-R-Fc soluble de múrido (mLT-\beta-R-Fc; véase el ejemplo 2) su capacidad de bloquear la muerte de células WEHI 164 de ratón tratadas con ligando LT (ejemplo 4).

La figura 2 muestra los efectos del LT-\beta-R soluble de múrido (mLT-\beta-R-Fc) sobre la señalización de LT-\beta-R inducida por ligando LT en células WEHI 164 de ratón. Como indica este ensayo, las células WEHI 164 se matan mediante tratamiento con ligando LT-\alpha1/\beta2 soluble. La adición de mLT-\beta-R-Fc bloquea la muerte celular activada por ligando LT. La proteína de fusión de receptor de TNF control (p55TNF-R-Fc) tiene poco efecto sobre el bloqueo de la muerte celular.

Estos datos muestran que una proteína de fusión de LT-\beta-R soluble puede competir eficazmente con moléculas de LT-\beta-R de superficie por la unión del ligando LT. La proteína de fusión mLT-\beta-R-Fc soluble actúa así como agente bloqueante de LT-\beta-R en ratones.

Fuente de anticuerpos anti-LT-\beta-R humano

En otra realización de esta invención, los anticuerpos dirigidos contra el receptor de LT-\beta humano (Ab anti-LT-\beta-R) funcionan como agentes bloqueantes de LT-\beta-R. Los Ab anti-LT-\beta-R de esta invención pueden ser policlonales o monoclonales (mAb) y pueden modificarse para optimizar su capacidad de bloquear la señalización de LT-\beta-R, su biodisponibilidad in vivo, estabilidad u otros rasgos deseados.

Se preparan sueros de anticuerpos policlonales dirigidos contra el receptor de LT-\beta humano utilizando técnicas convencionales mediante la inyección a animales tales como cabras, conejos, ratas, hámsteres o ratones por vía subcutánea con una proteína de fusión de receptor de LT-\beta humano-Fc (Ejemplo 1) en adyuvante completo de Freund, seguido de inyección de refuerzo intraperitoneal o subcutánea en adyuvante incompleto de Freund. Los antisueros policlonales que contienen los anticuerpos deseados dirigidos contra el receptor de LT-\beta se examinan mediante procedimientos inmunológicos convencionales.

Se preparan anticuerpos monoclonales de ratón (mAb) dirigidos contra una proteína de fusión de receptor de LT-\beta-Fc como se describe en el ejemplo 5. Se depositó una estirpe de células de hibridoma (BD.A8.AB9), que produce el mAb BDA8 de ratón anti-LT-\beta-R humano, el 12 de enero de 1995 en la American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) según las provisiones del Tratado de Budapest, y se le asignó el número de acceso ATCC HB11798. Todas las restricciones sobre la disponibilidad al público de los depósitos ATCC anteriores se retirarán irrevocablemente tras la concesión de una patente sobre esta solicitud.

Pueden prepararse también diversas formas de anticuerpos anti-LT-\beta-R utilizando técnicas de ADN recombinante estándar (Winter y Milstein, Nature, 349, pág. 293-299 (1991)). Por ejemplo, pueden construirse anticuerpos "quiméricos" en los que el dominio de unión a antígeno de un anticuerpo animal se liga a un dominio constante humano (por ejemplo Cabilly et al., documento US 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, pág. 6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos reducen las respuestas inmunogénicas observadas desencadenadas por anticuerpos animales cuando se utilizan en tratamientos clínicos humanos.

Además, pueden sintetizarse "anticuerpos humanizados" recombinantes que reconocen el LT-\beta-R. Los anticuerpos humanizados son quimeras que comprenden en su mayor parte secuencias de IgG humana en las que se han insertado las regiones responsables de la unión específica a antígeno (por ejemplo, documento WO 94/04679). Los animales se inmunizan con el antígeno deseado, se aíslan los correspondientes anticuerpos y se retira la porción de secuencias de región variable responsable de la unión específica a antígeno. Las regiones de unión a antígeno derivadas de animal se clonan después en la posición apropiada de los genes de anticuerpo humano en los que se han eliminado las regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos humanizados minimizan el uso de secuencias heterólogas (interespecies) en anticuerpos humanos, y es menos probable que desencadenen respuestas inmunes en el sujeto tratado.

La construcción de diferentes clases de anticuerpos anti-LT-\beta-R recombinantes puede conseguirse también preparando anticuerpos quiméricos o humanizados que comprenden los dominios variables anti-LT-\beta-R y los dominios constantes humanos (CH1, CH2, CH3) aislados de diferentes clases de inmunoglobulinas. Por ejemplo, pueden producirse recombinantemente anticuerpos IgM anti-LT-\beta-R con valencias de sitio de unión a antígeno aumentadas mediante la clonación del sitio de unión a antígeno en vectores que portan las regiones constantes de la cadena \mu humana (Arulanandam et al., J. Exp. Med., 177, pág. 1439-1450 (1993); Lane et al., J. Eur. Immunol., 22, pág. 2573-2578 (1993); Trauenecker et al., Nature, 339, pág. 68-70 (1989).

Además, pueden utilizarse técnicas de ADN recombinante estándar para alterar las afinidades de unión de anticuerpos recombinantes con sus antígenos alterando los residuos aminoacídicos en la proximidad de los sitios de unión a antígeno. La afinidad de unión a antígeno de un anticuerpo humanizado puede aumentar mediante mutagénesis basada en modelización molecular (Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, pág. 10029-10033 (1989); documento WO 94/04679).

Puede ser deseable aumentar o reducir la afinidad de Ab anti-LT-\beta-R por el LT-\beta-R dependiendo del tipo de tejido diana o del esquema de tratamiento particular considerado. Por ejemplo, puede ser ventajoso tratar un paciente con niveles constantes de Ab anti-LT-\beta-R con una capacidad reducida de señalización mediante la ruta LT-\beta para tratamientos semiprofilácticos. Igualmente, pueden ser ventajosos Ab anti-LT-\beta-R inhibidores con afinidad aumentada por el LT-\beta-R para tratamientos a corto plazo.

Anticuerpos anti-LT-\beta-R como agentes bloqueantes de LT-\beta-R

Los anticuerpos anti-LT-\beta-R que actúan como agentes bloqueantes de LT-\beta-R pueden seleccionarse ensayando su capacidad de inhibir la citotoxicidad inducida por LT-\beta-R en células tumorales (ejemplo 5).

En una realización preferida de esta invención, las composiciones y métodos comprenden el mAb EDA8 de ratón anti-LT-\beta-R humano. La figura 3 muestra que el mAb BDA8 actúa como agente bloqueante de LT-\beta-R como se define por esta invención. Las células tumorales WiDr dejan de crecer en presencia de IFN-\gamma y ligando LT-\alpha1/\beta2 soluble. Los anticuerpos control (IgG1) no tienen efecto sobre esta inhibición del crecimiento. En contraposición, el mAb BDA8 anti-LT-\beta-R bloquea la capacidad del ligando LT-\alpha1/\beta2 soluble de inhibir el crecimiento de células WiDr. Por tanto, un anticuerpo dirigido contra LT-\beta-R humano puede funcionar como agente bloqueante de LT-\beta-R como se define por la presente invención.

Al ensayar otros anticuerpos dirigidos contra el receptor de LT-\beta humano, se espera que puedan identificarse anticuerpos anti-LT-\beta-R adicionales que funcionen como agentes bloqueantes de LT-\beta-R en seres humanos utilizando experimentación de rutina y los ensayos descritos en la presente memoria.

Fuente de anticuerpos anti-ligando LT de superficie

Otra realización preferida de esta invención implica composiciones y métodos que comprenden anticuerpos dirigidos contra el ligando LT que funcionan como agentes bloqueantes de LT-\beta-R. Como se describe anteriormente para los Ab anti-LT-\beta-R, los anticuerpos anti-ligando LT que funcionan como agentes bloqueantes de LT-\beta-R pueden ser policlonales o monoclonales, y pueden modificarse según procedimientos rutinarios para modular sus propiedades de unión a antígeno y su inmunogenicidad.

Los anticuerpos anti-LT de esta invención pueden crearse contra una cualquiera de las dos subunidades de LT individualmente, incluyendo formas solubles, mutantes, alteradas y quiméricas de la subunidad LT. Si se utilizan subunidades LT como antígeno, son preferiblemente subunidades LT-\beta. Si se utilizan subunidades LT-\alpha, se prefiere que los anticuerpos anti-LT-\alpha resultantes se unan a ligando LT de superficie y no reaccionen de forma cruzada con LT-\alpha secretada ni modulen la actividad de TNF-R (según los ensayos descritos en el ejemplo 3).

Como alternativa, pueden crearse anticuerpos dirigidos contra un complejo homomérico (LT-\beta) o heteromérico (LT-\alpha/\beta) que comprenden una o más subunidades LT y examinarse su actividad como agentes bloqueantes de LT-\beta-R. Preferiblemente, se utilizan complejos LT-\alpha1/\beta2 como antígeno. Como se discutió anteriormente, se prefiere que los anticuerpos anti-LT-\alpha1/\beta2 resultantes se unan a ligando LT de superficie sin unirse a LT-\alpha secretada y sin afectar a la actividad de TNF-R.

La producción de anticuerpos policlonales anti-LT-\alpha humana se describe en la solicitud de los solicitantes en tramitación junto con la presente (WO 94/13808). Se han descrito también anticuerpos monoclonales anti-LT-\alpha y anti-LT-\beta (Browning et al., J. Immunol., 154, pág. 33-46 (1995)).

Se prepararon mAb de ratón anti-LT\beta humana como se describe en el ejemplo 6. Se depositó una estirpe celular de hibridoma (B9.C9.1) que produce el mAb B9 de ratón anti-LT-\beta-R humano el 21 de julio de 1995 en la American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) según las provisiones del Tratado de Budapest, y se le asignó el número de acceso ATCC HB11962.

Se prepararon anticuerpos monoclonales de hámster anti-LT-\alpha/\beta de ratón como se describe en el ejemplo 7. Se depositó una estirpe celular de hibridoma (BB.F6.1) que produce al mAb BB.F6 de hámster anti-LT-\alpha/\beta de ratón el 21 de julio de 1995 en la American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) según las provisiones del Tratado de Budapest, y se le asignó el número de acceso ATCC HB11963.

Anticuerpos anti-ligando LT como agentes bloqueantes de LT-\beta-R

Se desarrolló un ensayo de separación celular activada por fluorescencia (FACS) para examinar los anticuerpos dirigidos contra subunidades LT y complejos LT que pueden actuar como agentes bloqueantes de LT-\beta-R (ejemplos 6 y 7). En este ensayo, se añade la proteína de fusión LT-\beta-R-Fc soluble humana a células II-23 activadas con PMA, que expresan complejos LT de superficie (Browning et al., J. Immunol., 154, pág. 33-46 (1995)), en presencia de cantidades crecientes del anticuerpo de ensayo. Se selecciona como agente bloqueante de LT-\beta-R un anticuerpo que pueda inhibir la interacción receptor LT-\beta-ligando en al menos un 20%.

Los resultados de este ensayo realizado para ensayar el mAb B9 anti-LT-\beta humana se muestran en la Figura 4. La Figura 4 muestra que el mAb B9 anti-LT-\beta puede bloquear selectivamente la unión de proteínas de fusión LT-\beta-R-Fc solubles a ligandos LT de superficie inducida en células activadas. Estos resultados confirman que los anticuerpos dirigidos contra una subunidad de ligando LT funcionarán como agente bloqueante de LT-\beta-R.

Se utilizó también el ensayo de FACS descrito anteriormente para ensayar mAb creados en hámster contra un complejo LT-\alpha/\beta soluble de ratón (Ejemplo 7). Los resultados de este ensayo realizado para ensayar el mAb BB.F6 anti-LT-\alpha/\beta de ratón se muestran en la Tabla 2 (ejemplo 7). La Tabla 2 muestra que el mAb BB.F6 anti-LT-\alpha/\beta puede bloquear eficazmente la unión de proteínas de fusión mLT-\beta-R-Fc solubles (ejemplo 2) a ligandos LT de superficie expresados en un hibridoma de células T de múrido, y es por tanto un bloqueante de LT-\beta-R según esta invención.

Utilizar un complejo LT-\alpha/\beta en lugar de una subunidad de LT como antígeno para inmunizar un animal puede conducir a una inmunización más eficaz, o puede dar como resultado anticuerpos que tienen mayores afinidades por el ligando LT de superficie. Es concebible que al inmunizar con el complejo LT-\alpha/\beta puedan aislarse anticuerpos que reconozcan residuos aminoacídicos tanto en las subunidades LT-\alpha como LT-\beta (por ejemplo residuos que formen una hendidura LT-\alpha/\beta). Al ensayar anticuerpos dirigidos contra complejos heteroméricos LT-\alpha/\beta humanos, se espera que puedan identificarse anticuerpos anti-LT adicionales que funcionen como agentes bloqueantes de LT-\beta-R utilizando experimentación de rutina y los ensayos descritos en la presente memoria.

Los agentes bloqueantes de LT-\beta-R inhiben la hipersensibilidad de contacto mediada por células Th1 en ratón

Los agentes bloqueantes de LT-\beta-R de esta invención pueden inhibir las respuestas inmunes mediadas por células Th1. Una de dichas respuestas mediadas por Th1 es la hipersensibilidad de tipo retardado (HTR); Cher y Mosmann, J. Immunol., 138, pág. 3688-3694 (1987); véase también I. Roitt et al., Immunology, pág. 22.1-22.12, Mosby-Year Book Europe Ltd., 3ª ed. (1993) para una discusión general). La HTR se provoca cuando células Th1 sensibilizadas con antígeno secretan citocinas después de un contacto secundario con el mismo antígeno. Las citocinas Th1 atraen y activan macrófagos que liberan moléculas efectoras adicionales que desencadenan reacciones inflamatorias.

Las reacciones de HTR se clasifican en tres tipos diferentes: hipersensibilidad de contacto, hipersensibilidad de tipo tuberculina y reacciones granulomatosas. Los tres tipos de hipersensibilidad (HS) pueden distinguirse por la velocidad y la naturaleza de la respuesta ante un antígeno extraño cuando se aplica directamente o se inyecta por debajo de la piel de un sujeto sensibilizado. La reacción de HTR se monitoriza midiendo la velocidad y el grado en el que se engrosa la piel.

Las reacciones de HS de tipo tuberculina son reacciones cutáneas que ocurren en el sitio de inyección de un antígeno extraño de un microorganismo al que se ha expuesto previamente el sujeto (por ejemplo Mycobacterium tuberculosis o M. leprae). Esta reacción cutánea, que es máxima a entre 48 y 72 horas, se utiliza frecuentemente como base para ensayos de sensibilidad de diagnóstico ante microorganismos encontrados anteriormente (por ejemplo el ensayo cutáneo de tuberculina). A medida que se desarrolla una lesión de tipo tuberculina, puede convertirse en una reacción granulomatosa si el antígeno persiste en el tejido.

Las reacciones granulomatosas son las reacciones de HTR clínicamente más graves porque pueden conducir a muchos de los efectos patológicos asociados a enfermedades mediadas por células Th1. Las reacciones granulomatosas ocurren cuando los antígenos o complejos inmunes no consiguen eliminarse de los macrófagos y continúan estimulando la secreción de citocina Th1. La inflamación crónica y la agregación de macrófagos activados en el sitio del estímulo caracterizan las reacciones granulomatosas.

Un núcleo de células epiteliales y macrófagos, que puede estar rodeado también por linfocitos y deposiciones fibróticas, forma una estructura endurecida denominada un granuloma. A veces, hay una muerte celular extendida en el núcleo del granuloma (por ejemplo en tejido pulmonar afectado por tuberculosis). El endurecimiento del tejido diana de una reacción granulomatosa ocurre en aproximadamente 4 semanas.

Los agentes que afectan a la frecuencia de formación de granuloma pueden identificarse utilizando ratones infectados con esquistosomas (Amiri et al., Nature, 356, pág. 604-607 (1992)). Los gusanos esquistosomas (duelas sanguíneas) pueden causar una enfermedad parasitaria que conduce a la formación de un granuloma alrededor de los huevos de esquistosoma depositados en vénulas portal del hígado infectado. Los agentes que inhiben esta respuesta de HTR mediada por células Th1 pueden reducir el tamaño del granuloma o la frecuencia o velocidad de formación del granuloma en hígados de ratón infectados con esquistosoma. La reacción celular a los huevos de esquistosoma puede evaluarse cuantificando el número y el tamaño de granulomas formados en ratones tratados con concentraciones crecientes de un supuesto agente bloqueante de LT-\beta-R a lo largo del tiempo.

La hipersensibilidad de contacto (HSC) es una clase de HTR en la que la piel es el órgano diana. En la HSC, la respuesta inflamatoria está causada por la aplicación local de un hapteno reactivo sobre la piel. Los alergenos comprenden generalmente al menos una molécula de hapteno, que es habitualmente demasiado pequeña para ser antigénica por sí misma. El hapteno penetra en la epidermis y reacciona con una proteína normal bajo la piel produciendo un nuevo complejo antigénico.

La reexposición de un sujeto sensibilizado al hapteno desencadena la respuesta de HTR. El conjugado hapteno-proteína vehículo, en combinación con células presentadoras de antígeno, activa mecanismos efectores que desencadenan la liberación de citocinas (incluyendo IL-2, IL-3, IFN -\gamma y GM-CSF). La cascada de citocinas liberadas causa la proliferación de células T CD4+, el cambio de los patrones de expresión de diversas moléculas de adhesión a superficie celular, y la atracción de células T y macrófagos hacia la piel en el sitio de inflamación. La cascada de citocinas y la resultante vasodilatación, infiltración celular y edema de la dermis y epidermis conduce al hinchamiento e inflamación del tejido diana, que da cuenta del engrosamiento mensurable de la piel en respuesta a reacciones de HTR.

El grado en que un hapteno particular puede sensibilizar a un individuo depende de una variedad de factores. Estos factores incluyen lo bien que los haptenos penetran en la piel y reaccionan con una proteína vehículo para formar un conjugado. Un hapteno que sensibiliza a casi todos los individuos es el 2,4-dinitrofluorobenceno (DNFB).

La respuesta de HSC cutánea ante un hapteno tal como DNFB es un modelo animal clásico de inmunidad mediada por célula. La localización de esta respuesta HSC en la oreja de una ratón sensibilizado permite una cuantificación sencilla, exacta y reproducible de esta respuesta inmune mediada por célula in vivo midiendo el grosor de la oreja. Se han reseñado los detalles de la reacción de HSC de múrido y la histopatología de la respuesta inflamatoria inducida por DNFB (Chisholm et al., Eur. J. Immunol. 23, pág. 682-688 (1993)).

La capacidad del DNFB de inducir una respuesta de hipersensibilidad de contacto en la mayoría de los individuos puede utilizarse para identificar agentes que reducen o eliminan las respuestas inflamatorias asociadas a reacciones de HTR mediadas por células Th1. Una proteína de fusión LT-\beta-R-FC soluble de múrido inhibe eficazmente las respuestas de hipersensibilidad de contacto inducidas por DNFB en ratones (Ejemplo 8). Los ratones se sensibilizaron inicialmente aplicando DNFB a la parte inferior de cada pata trasera en dos días consecutivos. Cinco días después de la sensibilización inicial, se aplicó una dosis subirritante de DNFB en solución vehículo a las superficies de la oreja izquierda. Se aplicó solución vehículo sola a la oreja derecha como control.

Se inyectaron después por vía intravenosa concentraciones crecientes del agente bloqueante de LT-\beta-R mLT-\beta-R-Fc (Ejemplo 2) a los ratones (Ejemplo 8). Las inyecciones de tampón PBS solo, o de una proteína de fusión de IgG humana (LFA3-Fc) sirvieron como controles negativos, y la inyección de un mAb específico anti-VLA4 (mAb PS/2) conocido por inhibir la HSC sirvió como control positivo. 24 horas después de la exposición, se midió el grosor de cada oreja (expuesta y no expuesta a DNFB). La inhibición de la respuesta de hinchamiento de la oreja por el agente bloqueante de LT-\beta-R se evaluó comparando los grupos tratados con sus grupos control negativos.

La Figura 5 muestra que la mLT-\beta-R-Fc causa una reducción significativa de la respuesta de hinchamiento de la oreja de ratones tratados con DNFB en comparación con animales control tratados con DNFB no inhibidos (PBS y LFA3-Fc). El LT-\beta-R soluble puede bloquear esta reacción de HSC tan eficazmente como el inhibidor mAb específico anti-VLA4 (mAb PS/2), que actúa bloqueando el influjo de células T al sitio de exposición (Chisholm et al., Eur. J. Immunol., 23, pág., 682-688 (1993)).

Estos datos muestran que una proteína de fusión de LT-\beta-R soluble que actúa como agente bloqueante de LT-\beta-R in vitro puede inhibir también eficazmente una respuesta inmune mediada por células Th1 cuando se administra a un animal. Los agentes bloqueantes de LT-\beta-R de esta invención identificados in vitro pueden ensayarse utilizando este ensayo de hinchamiento de oreja, u otros ensayos de HSC tales como los descritos anteriormente, para seleccionar agentes bloqueantes de LT-\beta-R adicionales que serán útiles para reducir la gravedad de las respuestas inmunes asociadas a células Th1 in vivo.

Los agentes bloqueantes de LT-\beta-R no inhiben una respuesta inmunológica mediada por células Th2 (humoral)

Como se muestra anteriormente, los agentes bloqueantes de LT-\beta-R de esta invención pueden inhibir un mecanismo efector mediado por células Th1 tal como hipersensibilidad de contacto de tipo retardado (Figura 5). Esta respuesta mediada por células Th1 se inhibe sin afectar significativamente a las respuestas dependientes de células Th2. Se mostró el efecto diferencial de agentes bloqueantes de LT-\beta-R sobre respuestas inmunes mediadas por células Th1 monitorizando una respuesta inmune dependiente de células Th2, tal como una respuesta de anticuerpo primario y cambio de isotipo, en presencia de un agente bloqueante de LT-\beta-R.

Se inyectaron los ratones cinco veces en el transcurso de un periodo de diez días con proteína de fusión de LT-\beta-R soluble (mLT-\beta-R-Fc, Ejemplo 2) o proteína de fusión de IgG control (LFA3-Fc), o se dejaron sin tratar. Después de la segunda inyección, se inyectaron todos los ratones en la base de la cola con 100 \mul de adyuvante completo de Freund que contenía 100 \mug de ovoalbúmina. Después de 11 días, se analizaron las titulaciones de anticuerpo sérico primario específico anti-albúmina utilizando un ELISA específico de los isotipos IgG1, IgG2a e IgM.

La Figura 6 muestra el efecto del agente bloqueante de LT-\beta-R de ratón mLT-\beta-R-Fc sobre la producción de anticuerpo sérico anti-ovoalbúmina en ratones inmunizados con ovoalbúmina (Ejemplo 9). Administrar el agente bloqueante de LT-\beta-R no afecta significativamente a las titulaciones de anticuerpo primario después de la inmunización con ovoalbúmina. En comparación, la interferencia con la señalización del receptor CD40 inducida por ligando de CD40 bloquea completamente la respuesta de IgG específica de antígeno en ratones (Renshaw et al., J. Exp. Med., 180, pág. 1889-1900 (1994)). El CD40 es otro par ligando/receptor de la familia de TNF.

La producción y maduración de inmunoglobulina total es claramente dependiente de células Th2. Sin embargo, existen también evidencias de que la citocina Th1 IFN-\gamma participa en, pero no es absolutamente necesaria para, el cambio a la subclase IgG2a (Huang et al., Science, 259, pág. 1742-1745 (1993)). El agente bloqueante de LT-\beta-R mLT-\beta-R-Fc no inhibió el cambio a IgG2a en estos experimentos. Es posible que los agentes bloqueantes de LT-\beta-R de esta invención no bloqueen este aspecto humoral de una respuesta mediadas por células Th1. Además, las respuestas proliferativas de linfocitos de ratones tratados con mLT-\beta-R-Fc no se redujeron (Ejemplo 10;
Figura 7).

Estos experimentos indican que una terapia basada en administrar los agentes bloqueantes de LT-\beta-R de esta invención no afectará adversamente a las funciones de producción de anticuerpos dependientes de Th2 de una respuesta inmune. El patrón normal de respuesta de anticuerpo ilustrado en la Figura 6 indica también que un tratamiento intensivo con mLT-\beta-R-Fc soluble no era tóxico para los ratones, indicando adicionalmente la naturaleza terapéutica de las composiciones y métodos indicados en esta invención.

Enfermedades mediadas por células T auxiliares

Muchas afecciones autoinmunes específicas de órganos parecen implicar una respuesta Th1 patológica. Estos datos se han revisado (Modlin y Nutman, Current Opinion in Immunol., 5, pág. 511-517 (1993); Romagnani et al., Ann. Rev. Immunol., 12, pág. 227-257 (1994)). Estas afecciones autoinmunes específicas de órganos incluyen: esclerosis múltiple, diabetes insulinodependiente, oftalmia simpática, uveitis y psoriasis.

La diabetes mellitus insulinodependiente es una enfermedad autoinmune en la que las células pancreáticas beta productoras de insulina se destruyen por leucocitos que se infiltran en los islotes de Langerhans. La diabetes puede inducirse rápidamente en ratones diabéticos no obesos (NOD) neonatos mediante la transferencia de esplenocitos prediabéticos activados. Recientemente, se transfirieron células de tipo Th1 o Th2, por lo demás genéticamente similares, a ratones NOD neonatos. Sólo las células Th1 indujeron rápidamente la diabetes, y en casi todos los receptores (Katz et al., Science, 268, pág. 1185-1188 (1995)). Esto indica que los agentes bloqueantes de LT-\beta-R de esta invención, que pueden inhibir los efectos de una respuesta inmune mediada por células Th1 in vivo, serán útiles para tratar o prevenir diabetes insulinodependiente.

Diversas enfermedades autoinmunes sistémicas, incluyendo diversas artritis, están asociadas a células Th1. Tanto la artritis reumatoide como el síndrome de Sjögren parecen implicar tanto células Th0 como Th1. En contraposición, el lupus sistémico eritematoso (LSE) parece tener una respuesta dominada por Th0/Th2 aberrante.

Algunas enfermedades inflamatorias crónicas parecen tener también una repuesta de tipo Th1 aberrante, incluyendo enfermedad inflamatoria intestinal, sarcoidosis pulmonar y rechazo de aloinjerto. La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) en seres humanos comprende al menos dos categorías, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn. Ambos trastornos se cree que son el resultado de trastornos inmunopatológicos de tipo autoinmune. En algunos modelos de ratón de EII, resulta evidente que algunos agentes que bloquean las respuestas de Th1 pueden bloquear el desarrollo o el transcurso de la enfermedad (F. Powrie et al., Immunity, 1: 553, 1994). Es posible que la inhibición del componente Th1 de la respuesta inmune tuviera efectos beneficiosos en la EII humana. Se han descrito y revisado muchos modelos de EII (C. Elson et al., Gastroenterology 109: 1344, 1995). Existen al menos tres grupos de modelos, inducido químicamente, inducido por polímero/microbios y tipos inmunológicos que utilizan ratones mutantes.

En un modelo inducido por polímero/microbios utilizado habitualmente, se introduce una solución de sulfato de dextrano en el agua de bebida de ratones y, tras la ingestión, se irrita el recubrimiento epitelial del intestino conduciendo a una profunda respuesta inmune ante la lesión. Los animales desarrollan colitis que se manifiesta como diarrea, sangre en las heces, pérdida de peso corporal y acortamiento de la longitud del colon debido a la expansión de la pared del colon. Este modelo induce una colitis del lado izquierdo y displasia alveolar que puede conducir a cáncer, que son rasgos de la colitis ulcerosa.

Un segundo modelo consiste en transplantar un conjunto seleccionado de células T CD4 a un ratón scid, concretamente un ratón que carece de células T y B (F. Powrie et al., International Immunology 5: 1461-1471, 1993; Morrisey et al., J. Exp. Med. 178: 237, 1993). A medida que las células seleccionadas, denominadas células CD45RB^{alto}, se expanden y reconstituyen en el ratón scid, los mecanismos normales que evitan la aparición de células T autorreactivas son disfuncionales, y se desarrollan células autorreactivas. En ratas, se observan células reactivas con muchos órganos, mientras que en el ratón la reactividad aparece principalmente en el intestino. Los agentes que alteran el modo en que se expanden y se desarrollan las células autorreactivas, o los agentes que pueden bloquear la capacidad de las células de atacar al intestino tendrán eficacia en este modelo. Además, ya que este modelo imita al menos parcialmente el desarrollo patológico de células autorreactivas del sistema inmune, los tratamientos que bloquean este modelo pueden tener realmente un comportamiento modificador de la enfermedad en seres humanos. En este modelo, los anticuerpos contra TNF pueden bloquear la enfermedad (F. Powrie et al., Immunity 1, 552, 1994) y estos anticuerpos se han encontrado eficaces en el tratamiento de enfermedades humanas (H.M. van Dullemen et al., Gastroenterology 109: 109, 1995). Por tanto, este modelo puede prever cuáles agentes pueden ser terapéuticamente útiles en la EII. Además, ya que el modelo CD45RB es un ejemplo de un proceso patológico mediado por Th1, y de hecho en ratas el modelo conduce a enfermedad en muchos órganos, la eficacia de la LT\betaR-Ig en este sistema indica que la LT\betaR-Ig u otros medios de bloquear las interacciones del LT\betaR con su ligando pueden ser beneficiosos en un amplio intervalo de enfermedades inmunológicas relacionadas.

En general, la contribución exacta de los autoanticuerpos frente a células T específicas no se ha delineado en estas enfermedades autoinmunes. Las respuestas celulares pueden hacer contribuciones importantes a la patogenicidad en aquellas enfermedades autoinmunes sistémicas que se cree actualmente que están dirigidas principalmente por anticuerpos, por ejemplo las diversas artritis.

La respuesta inmune normal ante algunos agentes infecciosos patogénicos desencadena también una respuesta Th1 que puede hacerse excesiva y presentar asimismo un problema médico. Los ejemplos de reacciones granulomatosas (una clase de respuesta de HTR descrita anteriormente) que conducen a problemas médicos graves incluyen lepra, formación de granulomas en los pulmones de pacientes de tuberculosis, sarcoidosis y esquistosomiasis (Roitt et al., Immunology, pág. 22.5-6 (Mosby-Year Book Europe Ltd., 3ª ed., 1993). La psoriasis está también probablemente mediada por células Th1.

Las células T citolíticas, concretamente CTL (células T CD8 positivas) pueden subdividirse también en poblaciones de tipo Th1 y Th2. Por lo tanto, es posible que mucho de lo conocido respecto a los grupos Th se aplique también a células CD8+, que están implicadas principalmente en respuestas antivirales y de rechazo de tejido injertado.

Tratamientos utilizando agentes bloqueantes de LT-\beta-R

Las composiciones de esta invención se administrarán a una dosis eficaz para tratar la afección clínica particular destinataria. La determinación de una formulación farmacéutica preferida y un régimen de dosificación terapéuticamente eficaz para una aplicación dada está dentro de las habilidades de la técnica teniendo en consideración, por ejemplo, la afección y peso del paciente, la extensión del tratamiento deseado y la tolerancia del paciente al tratamiento. Se espera que dosis de aproximadamente 1 mg/kg de LT-\beta-R soluble sean puntos de partida adecuados para optimizar las dosis de tratamiento.

La determinación de una dosis terapéuticamente eficaz puede evaluarse también realizando experimentos in vitro que miden la concentración del agente bloqueante de LT-\beta-R necesario para recubrir células diana (células positivas de LT-\beta-R o ligando LT dependiendo del agente bloqueante) durante 1 a 14 días. Los ensayos de unión receptor-ligando descritos en la presente memoria pueden utilizarse para monitorizar la reacción de recubrimiento celular. Las células positivas de LT-\beta-R o ligando LT pueden separarse de las poblaciones de linfocitos activados utilizando FACS. Basándose en los resultados de estos ensayos de unión in vitro, puede seleccionarse un intervalo de concentraciones de agente bloqueante de LT-\beta-R adecuado para ensayar en animales según los ensayos descritos en la presente memoria.

La administración de las moléculas de LT-\beta-R soluble, ligando anti-LT y Ab anti-LT-\beta-R de esta invención, solos o en combinación, incluyendo las formas aisladas y purificadas de los anticuerpos o complejos, sus sales o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos, puede conseguirse utilizando cualquiera de los modos de administración aceptados convencionalmente de agentes que exhiben actividad inmunosupresora.

Las composiciones farmacéuticas utilizadas en estas terapias pueden estar también en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación sólida, semisólida y líquida tales como comprimidos, píldoras, polvos, soluciones o suspensiones líquidas, supositorios y soluciones inyectables e infundibles. La forma preferida depende del modo de administración y de la aplicación terapéutica pretendidos. Los modos de administración pueden incluir administración oral, parenteral, subcutánea, intravenosa, intralesional o tópica.

Las moléculas de LT-\beta-R soluble, ligando anti-LT y Ab anti-LT-\beta-R de esta invención pueden disponerse, por ejemplo, en formulaciones estériles isotónicas con o sin cofactores que estimulen la captación o estabilidad. La formulación es preferiblemente líquida, o puede ser un polvo liofilizado. Por ejemplo, las moléculas de LT-\beta-R soluble, ligando anti-LT y Ab anti-LT-\beta-R de esta invención pueden diluirse con un tampón de formulación que comprende ácido cítrico monohidratado 5,0 mg/ml, citrato trisódico 2,7 mg/ml, manitol 41 mg/ml, glicina 1 mg/ml y polisorbato 20 1 mg/ml. Esta solución puede liofilizarse, almacenarse con refrigeración y reconstituirse antes de la administración con agua estéril para inyecciones (USP).

Las composiciones incluirán también preferiblemente vehículos farmacéuticamente convencionales bien conocidos en la técnica (véase por ejemplo Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, 1980, Mac Publishing Company). Dichos vehículos farmacéuticamente aceptables pueden incluir otros agentes medicinales, vehículos, vehículos genéticos, adyuvantes, excipientes, etc. tales como seroalbúmina humana o preparaciones plasmáticas. Las composiciones están preferiblemente en forma de una dosis unitaria y se administrarán habitualmente una o más veces al día.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse también utilizando microesferas, liposomas, otros sistemas de suministro microparticulados o formulaciones de liberación sostenida dispuestos en, cerca de o en comunicación de otro modo con, los tejidos afectados o la corriente sanguínea. Los ejemplos adecuados de vehículos de liberación sostenida incluyen matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos conformados tales como supositorios o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida implantables o microcapsulares incluyen polilactidas (patente de EE.UU. nº 3.773.319, documento EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de etilo (Sidman et al., Biopolymers, 22, pág. 547-556 (1985)), poli-(metacrilato de 2-hidroxietilo) o acetato de etilenvinilo (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15, pág. 167-277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12, pág., 98-105 (1982)).

Pueden preparase liposomas que contienen moléculas de LT-\beta-R soluble, ligando anti-LT y Ab anti-LT-\beta-R de esta invención, solos o en combinación, mediante métodos bien conocidos (véanse, por ejemplo, los documentos DE 3.218.121, Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, pág. 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pág. 4030-4034 (1980); patentes de EE.UU. nº 4.485.045 y 4.544.545). Normalmente los liposomas son de tipo unilamelar pequeño (aproximadamente 200-800 angstroms) en los que el contenido lipídico es mayor de aproximadamente un 30% en moles de colesterol. La proporción de colesterol se selecciona para controlar la velocidad óptima de liberación de moléculas de LT-\beta-R soluble, ligando anti-LT y Ab anti-LT-\beta-R.

Las moléculas de LT-\beta-R soluble, ligando anti-LT y Ab anti-LT-\beta-R de esta invención pueden unirse también a liposomas que contienen otros agentes bloqueantes de LT-\beta-R, agentes inmunosupresores o citocinas para modular la actividad bloqueante de LT-\beta-R. La unión de moléculas de LT-\beta-R, ligando anti-LT y Ab anti-LT-\beta-R a liposomas puede conseguirse mediante cualquier agente reticulante conocido tales como agentes reticulantes heterobifuncionales que se han utilizado ampliamente para acoplar toxinas o agentes quimioterapéuticos a anticuerpos para suministro orientado. La conjugación a liposomas puede conseguirse también utilizando el reactivo reticulante dirigido a carbohidratos hidrazida del ácido 4-(4-maleimidofenil)butírico (MPBH) (Duzgunes et al., J. Cell. Biochem. Abst. Suppl. 16E 77 (1992)).

Ventajas de las composiciones terapéuticas que comprenden agentes bloqueantes de LT-\beta-R

Los agentes bloqueantes de LT-\beta-R de esta invención son capaces de inhibir selectivamente mecanismos efectores inmunes dependientes de células Th1 y no de Th2. Los agentes bloqueantes de LT-\beta-R serán útiles en el tratamiento de afecciones que se exacerban por las actividades de las citocinas de tipo Th1 (por ejemplo IL-2 e IFN-\gamma). Debido a que las citocinas Th1 pueden inhibir las respuestas dependientes de células Th2, los agentes bloqueantes de LT-\beta-R pueden estimular también indirectamente ciertas respuestas dependientes de células Th2 que están normalmente inhibidas por las cascadas de citocinas inducidas por Th1.

La capacidad de suprimir selectivamente respuestas de células Th1 (o de estimular indirectamente Th2) será útil para tratar anormalidades en diversas respuestas inmunes mediadas por células, incluyendo diversas afecciones autoinmunes e inflamatorias crónicas, tolerancia a antígenos y rechazo celular de injertos de tejido y transplantes de órganos.

Como se discutió anteriormente, el tratamiento de afecciones inmunológicas basadas en células Th1 emplea generalmente agentes inmunomoduladores e inmunosupresores que tienen efectos pleiotrópicos sobre una amplia variedad de tipos celulares y respuestas inmunológicas. Estos agentes inmunosupresores no específicos son necesarios generalmente en dosis altas y a menudo citotóxicas que causan efectos secundarios adversos.

La capacidad de desplazar el carácter de una respuesta inmunológica está apoyado en el reciente estudio de diabetes de ratón discutido anteriormente (Katz et al., Science, 268, pág. 1185-1188 (1995)), y en un modelo de transplante alogénico (Sayegh et al., J. Exp. Med., 181, pág., 1869-1874 (1995)). En este último estudio, se mostró que una proteína de fusión que bloquea la ruta coestimuladora de células T CD28-B7 inducía tolerancia a injerto renal. La tolerancia se correlacionaba con una reducción de las citocinas Th1 y un aumento de las citocinas Th2 in vivo. Estos datos indican que los agentes bloqueantes de LT-\beta-R de esta invención serán útiles para suprimir el rechazo celular de injertos de tejido y transplantes de órganos mediante la inhibición de la liberación de citocinas mediadas por células Th1.

Los agentes bloqueantes de LT-\beta-R de las composiciones y métodos de esta invención pueden modificarse para obtener un nivel deseable de señalización de LT-\beta-R dependiendo de la afección, trastorno o enfermedad que se esté tratando. Se cree que el nivel absoluto de señalización de LT-\beta-R puede someterse a ajuste fino mediante la manipulación de la concentración y de las afinidades de los agentes bloqueantes de LT-\beta-R por sus respectivas dianas moleculares.

Por ejemplo, en una realización de esta invención, se administran composiciones que comprenden moléculas de LT-\beta-R soluble a un sujeto. El receptor de LT-\beta soluble puede competir eficazmente con receptores de LT-\beta de superficie celular por la unión de ligandos LT de superficie. La capacidad de competir con ligandos LT de superficie depende de las concentraciones relativas de las moléculas de LT-\beta-R soluble y de superficie celular, y de sus afinidades relativas por la unión a ligando.

Pueden prepararse moléculas de LT-\beta-R soluble que albergan mutaciones que aumentan o reducen la afinidad de unión de ese LT-\beta-R soluble mutante con el ligando LT de superficie utilizando técnicas de ADN recombinante estándar bien conocidas por los expertos en la técnica. Puede ensayarse en un gran número de moléculas con mutaciones dirigidas a sitio o aleatorias su capacidad de actuar como agentes bloqueantes de LT-\beta-R utilizando experimentación de rutina y las técnicas descritas en la presente memoria.

De forma similar, en otra realización de esta invención, anticuerpos dirigidos contra el receptor de LT-\beta o una o más de las subunidades del ligando LT funcionan como agentes bloqueantes de LT-\beta-R. La capacidad de estos anticuerpos de bloquear la señalización de receptor de LT-\beta puede modificarse mediante mutación, modificación química o mediante otros métodos que puedan variar la concentración eficaz o actividad del anticuerpo suministrado al sujeto.

La capacidad de reducir la señalización de LT-\beta-R sin inhibirla completamente puede ser importante para establecer o mantener niveles reducidos de señalización de LT-\beta-R que apoyen una función inmune normal, inhibiendo respuestas mediadas por células Th1 que sean exageradas o anormales.

La disrupción del gen LT-\alpha en un ratón conduce a un desarrollo aberrante de los órganos linfoides periféricos (De Togni et al., Science, 264, p-ag, 703-707 (1994)). Dichos ratones carecían de nódulos linfáticos y sus bazos carecían de la demarcación habitualmente clara entre regiones ricas en células T y células B en los folículos. Los inventores creen que este fenotipo está asociado a la pérdida de la señalización de LT-\beta-R inducida por LT de superficie debido a que no se han observado fenotipos similares al modular la actividad TNF-R. La capacidad de bloquear selectiva o parcialmente la ruta de LT-\beta-R puede ser por tanto útil en el tratamiento del desarrollo de órganos linfoides anormales asociado a una expresión alterada o sobreexpresión de la señalización mediante la ruta de LT-\beta-R.

Algunas reacciones asociadas a Th1 son componentes críticos de una serie de respuestas inmunes mediadas por célula (Romagnani, S., Ann. Rev. Immunol., 12, pág. 227-257 (1994)), y la inhibición absoluta de la actividad de células Th1 puede no ser deseable en ciertas circunstancias. Por ejemplo, un ratón puede resistir eficazmente una infección parasitaria cuando puede organizarse una buena respuesta Th1. Agentes infecciosos tales como Listeria y Toxoplasma desencadenan también fuertes respuestas de tipo Th1. En seres humanos, las respuestas a Mycobacterium tuberculosis parecen estar basadas en Th1. La patogenicidad por leishmaniasis se correlaciona con respuestas similares a las respuestas Th1 caracterizadas en ratón (Reed y Scott, Current Opinion in Immunol., 5, pág. 524-531 (1993)).

La capacidad de influenciar en el nivel de inhibición de Th1 bloqueando la señalización de LT-\beta-R puede ser importante para maximizar los resultados beneficiosos que pueden conseguirse mediante tratamientos con los agentes bloqueantes de LT-\beta-R de esta invención.

Los siguientes son ejemplos que ilustran los receptores de LT-\beta solubles, ligando anti-LT y anticuerpos anti-LT-\beta-R de esta invención y los métodos utilizados para caracterizarlos.

Ejemplo 1 Preparación de receptores de LT-\beta soluble humana como proteínas de fusión con Fc de inmunoglobulina

Se introdujo la secuencia de un clon de ADNc humano aislado de una biblioteca de secuencias transcritas de 12p humano derivadas de un híbrido de células somáticas (Baens et al., Genomics, 16, pág. 214-218 (1993)) en GenBank, y se identificó después como la secuencia que codifica el LT-\beta-R humano. La secuencia de este clon de ADNc del LT-\beta-R humano completo ha estado disponible desde 1992 con la entrada GenBank L04270.

Se amplificó por PCR el dominio extracelular de LT-\beta-R hasta la región transmembrana (Figura 1) a partir de un clon de ADNc utilizando cebadores que incorporaban sitios de enzimas de restricción NotI y SalI a los extremos 5' y 3', respectivamente (Browning et al., J. Immunol., 154, pág. 33-46 (1995)). El producto amplificado se cortó con NotI y SalI, se purificó y se ligó a un vector pMDR901 linealizado con NotI junto con un fragmento SalI-NotI que codifica la región Fc de IgG1 humana. El vector resultante contenía el gen de dihidrofolato reductasa y la proteína de fusión LT-\beta-R-Fc dirigidos por promotores separados.

Se electroporó el vector en células CHO dhfr- y se aislaron los clones resistentes a metotrexato como mediante procedimientos estándar. Se secretó la LT-\beta-R-Fc al medio y se utilizó un ensayo ELISA para seleccionar las estirpes celulares productoras del mayor nivel de proteína de fusión de receptor. Se cultivó en gran medida una estirpe celular de alta producción y se recogió el medio acondicionado. La proteína de fusión de receptor de LT-\beta pura se aisló mediante cromatografía de afinidad Protein A Sepharose Fast Flow (Pharmacia).

Ejemplo 2 Preparación de receptores de LT-\beta soluble de múrido en forma de proteína de fusión con Fc de inmunoglobulina

Se preparó un clon de ADNc completo de mLT-\beta-R ligando fragmentos 5' NotI/ApaLI y 3' ApaLI/NotI de dos aislamientos parciales de ADNc en el sitio NotI de pCDNA3 (InVitrogen, San Diego, CA). La secuencia de este clon de ADNc está accesible con la entrada GenBank U29173. No se observaron diferencias de secuencia de codificación cuando se compararon con otra entrada de secuencia para mLT-\beta-R encontrada en la entrada GenBank L38423.

Se preparó una proteína de fusión de mLT-\beta-R (hIgG1) soluble mediante amplificación por PCR del clon de ADNc de mLT-\beta-R completo como molde y los cebadores 5' AACTGCAGCGGCCGCCATGCGCCTGCCC 3' y 5' GACTTTGTCGACCATTGCTCCTGGCTCTGGGGG 3'. Se purificó el producto amplificado, se cortó con NotI y SalI y se ligó con un fragmento Sal/NotI de Fc de IgG1 humana en SAB132 linealizado con NotI y tratado con fosfatasa para formar JLB 122. Para expresión estable, el módulo NotI que contiene el fragmento de mLT-\beta-R-Fc se transfirió al sitio NotI de pMDR901 formando PSH001, y el vector se transfectó en células CHO como se ha descrito (Browning et al., J. Immunol., 154, pág. 33-46 (1995)). Se identificaron los clones celulares que secretan mLT-\beta-R-Fc mediante análisis ELISA. Se aisló la proteína de fusión de receptor purificada de sobrenadantes de células CHO mediante cromatografía Protein A Sepharose Fast Flow (Pharmacia).

Ejemplo 3 Uso de LT-\beta-R-Fc soluble humana para bloquear interacciones receptor de lt-\beta-ligando

Se ensayó en hLT-\beta-R-Fc su capacidad de bloquear la unión de ligando LT al receptor de LT-\beta en el ensayo de citotoxicidad de célula tumoral descrito anteriormente. En este ensayo, se utiliza una forma soluble del ligando LT (hLT-\alpha1/\beta2), que activa la señalización de LT-\beta-R, para matar células tumorales humanas. Los inhibidores de la señalización de LT-\beta-R pueden reducir la citotoxicidad de células tumorales inducida por LT-\beta-R.

Los ligandos LT-\alpha1/\beta2 solubles comprenden subunidades de LT-\beta truncadas o modificadas que carecen de un dominio transmembrana funcional. Los ligandos LT-\alpha1/\beta2 solubles se unen a y estimulan la señalización de LT-\beta-R, así como las formas de superficie de ligando LT (Browning et al., J. Immunol., 154, pág. 33-46 (1995)).

Se prepararon diluciones en serie de hLT-\alpha1/\beta2, hTNF o hLT-\alpha en 0,05 ml en placas de 96 pocillos, y se añadieron 5000 células HT29 tripsinizadas (ATCC) en 0,05 ml de medio que contenía 80 U/ml (unidades antivirales) de hu-IFN-\gamma. Después de 4 días, se midió la reducción mitocondrial del tinte MTT como sigue: se añadieron 10 \mul de MTT y después de 3 horas se disolvió el tinte reducido con 0,09 ml de isopropanol con HCl 10 mM, y se midió la D.O. a 550 nm. Se añadieron formas de receptor soluble o IgG humana pura en 10 \mul antes de la adición de las células, proporcionando una concentración final de 5 \mug/ml.

La Tabla 1 compara la capacidad de quimeras hLT-\beta-R-Fc y p55-TNF-R-Fc (con IgG humana como control) de bloquear los efectos inhibidores de diversos ligandos TNF y LT solubles sobre el crecimiento de células tumorales HT29.

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TABLA I

Capacidad de las proteínas de fusión con inmunoglobulina LT-\beta-R y p55-TNF-R de bloquear los efectos inhibidores de diversos ligandos TNF y LT sobre el crecimiento de HT29 Concentración de agente citotóxico (ng/ml) resultante en un 50% de inhibición del crecimiento en presencia de^{a}

Agente citotóxico	Control hu-IgG	p55-TNF-R-Fc	LT-\beta-R-Fc
TNF	0,08	>10^{b}	0,08
LT-\alpha	3	>1000	3
LT-\alpha1/\beta2	5	5	>200

\begin{minipage}[t]{145mm}^{a} Se premezcló cada agente citotóxico con las proteínas de fusión con Ig durante 10 minutos antes de la adición a las células. La concentración final de proteína de fusión fue de 5 \mu/ml. \end{minipage}
^{b}No se ensayaron concentraciones mayores

Los datos en la Tabla 1 indican que la proteína de fusión de LT-\beta-R soluble humano (hLT-\beta-R-Fc) puede bloquear eficazmente la interacción entre el ligando LT (LT-\alpha1/\beta2) y los receptores de LT-\beta de superficie celular, y es por tanto un agente bloqueante de LT-\beta-R según esta invención.

Como se esperaba, la proteína de fusión de TNF-R soluble (p55-TNF-R-Fc) bloqueaba completamente la inhibición del crecimiento inducido por TNF mediante la unión a TNF y evitando su interacción con receptores de TNF de superficie. Este receptor de TNF soluble no tenía efecto sobre los efectos antiproliferativos mediados por ligando LT. En contraposición, la LT-\beta-Fc-R bloqueaba los efectos citotóxicos inducidos por ligando LT pero no los de TNF o LT-\alpha. Por tanto, las proteínas de fusión de LT-\beta-R soluble humano no interfieren con la activación del TNF-R mediante ligandos TNF y LT-\alpha.

Ejemplo 4 Uso de LT-\beta-R-Fc soluble de múrido para bloquear interacciones receptor de LT-\beta de ratón-ligando

Se ensayó en un receptor de LT-\beta soluble de múrido acoplado a un dominio Fc de IgG1 humana (mLT-\beta-R-Fc; véase el ejemplo 2) su capacidad de bloquear la interacción receptor de LT-\beta-ligando en ratón utilizando un ensayo de citotoxicidad en células de ratón (Figura 2). Se realizó el ensayo de citotoxicidad en células WEHI 164 utilizando esencialmente el mismo procedimiento que se utilizó en el ensayo de células HT29 descrito en el ejemplo 3 (véase también Browning y Ribolini, J. Immunol., 143, pág. 1859-1867 (1989)).

La Figura 2 muestra los efectos de mLT-\beta-R-Fc sobre la señalización de LT-\beta-R-Fc inducida por ligando en células WEHI 164 de ratón. Como indica este ensayo, las células WEHI 164 se mataron tratándolas con ligando LT-\alpha/\beta a concentraciones en el intervalo de aproximadamente 1 a 100 ng/ml. La mLT-\beta-R-FC soluble (10 \mug/ml) bloquea la muerte celular activada por ligando LT. Añadir una proteína de fusión p55-TNF-R-Fc soluble de ratón o anticuerpos control de IgG (cada uno a 10 \mug/ml) tuvo poco o ningún efecto sobre el bloqueo de la muerte celular. Estos datos muestran que la proteína de fusión mLT-\beta-R-Fc puede competir eficazmente con las moléculas de LT-\beta-R de superficie por la unión a ligando LT. Estos datos muestran también que la citotoxicidad inducida por LT-\alpha/\beta está mediada por LT-\beta-R y puede inhibirse mediante mLT-\beta-R-Fc soluble que actúa como agente bloqueante de LT-\beta-R según la presente invención.

Ejemplo 5 Uso de anticuerpos anti-LT-\beta-R humano para bloquear interacciones receptor de LT-\beta-ligando

Se prepararon anticuerpos monoclonales de ratón (mAb) dirigidos contra el receptor de LT-\beta humano mediante inmunización intraperitoneal repetida de ratones RBF con una proteína de fusión hLT-\beta-R-Fc derivada de células CHO unida a perlas de Protein A Sepharose en ausencia de adyuvante. Finalmente, los animales se reforzaron con hLT-\beta-R-Fc soluble, tanto i.p. como i.v., se condensaron células de bazo mediante protocolos clásicos y se examinaron los sobrenadantes de hibridoma mediante ELISA (Ling et al., J. Interferon and Cytokine Res., 15, pág., 53-59 (1995)). Se examinó en los sobrenadantes de hibridoma adicionalmente su capacidad de bloquear la unión de células de hibridoma II-23 activadas, que expresan LT-\alpha1/\beta2 de superficie, a placas recubiertas con LT-\beta-R-Fc en un ensayo de selección celular. Se prepararon los mAb puros mediante purificación con Protein A Sepharose (Pharmacia) de IgG de sobrenadantes de cultivo.

Para determinar si un mAb anti-receptor de LT-\beta podría bloquear la señalización de LT-\beta-R iniciada por la unión de LT soluble, se realizó un ensayo de citotoxicidad de células tumorales utilizando células de carcinoma humano WiDr. En los ensayos de citotoxicidad, se prepararon diluciones en serie de LT-\alpha1/\beta2 en 0,05 ml en placas de 96 pocillos, y se añadieron 10 \mul de una solución 100 \mug/ml que contenía mAb de IgG1 de ratón control o mAb anti-receptor de LT-\beta. Se añadieron después 5000 células WiDr tripsinizadas (ATCC) a cada pocillo en 0,05 ml de medio que contenía 50 U/ml (unidades antivirales) de hu-IFN-\gamma. Después de 4 días, se midió la reducción mitocondrial del tinte MTT como sigue: se añadieron 10 \mul de MTT y después de 3 horas se disolvió el tinte reducido con 0,09 ml de isopropanol con HCl 10 mM, y se midió la D.O. a 550 nm. La cantidad de color púrpura es proporcional a la cantidad de crecimiento celular.

La Figura 3 muestra que el mAb BDA8 anti-LT-\beta-R actúa como agente bloqueante de LT-\beta-R según esta invención. Las células de carcinoma WiDr humano dejan de crecer en presencia de IFN-\gamma y ligando LT-\alpha1/\beta2 soluble (de aproximadamente 0,05 a 50 ng/ml). Un anticuerpo control de IgG1 (10 \mug/ml) no tiene efecto sobre esta inhibición del crecimiento. En contraposición, el mAb BDA8 anti-LT-\beta-R (10 \mug/ml) restaura la capacidad de las células WiDr de crecer en presencia de ligando LT-\alpha1/\beta2 soluble.

Ejemplo 6 Uso de anticuerpos anti-LT-\beta humana para bloquear interacciones receptor-ligando

Se prepararon mAb anti-LT-\beta humana inmunizando ratones RBF con perlas lavadas de Protein A Sepharose-9E10-rLT-\beta que contenían aproximadamente 1-2 \mug de LT-\beta recombinante humana en CFA, y se continuó con un refuerzo del mismo material en TFA. Ocho semanas después del último refuerzo, se administraron i.v. a los ratones 30 \mug de rLT-\beta soluble purificada (ácido eluido de la resina 9E10) y 20 \mug del mismo material soluble 2 días después. Un día después del segundo refuerzo i.v., se condensaron las células de bazo utilizando protocolos clásicos para crear mAb. Se examinaron directamente los sobrenadantes de hibridoma mediante ELISA o tinción por FACS de células II-23 activadas con PMA. Se prepararon los mAb puros mediante purificación en Protein A Sepharose Fast Flow de IgG de sobrenadantes de cultivo (Pharmacia).

Se utilizó un ensayo FACS para seleccionar anticuerpos dirigidos contra LT-\beta que puedan bloquear eficazmente la unión de ligando LT-\alpha/\beta soluble a receptores de LT-\beta en la superficie de una célula, imitando así la interacción entre dos células in vivo. En este ensayo, se dejó unir LT-\beta-R-Fc soluble humana (2 \mug/ml) a ligando LT de superficie en células II-23 activadas con PMA (Browning et al., J. Immunol., 154, pág. 33-46 (1995)) en presencia de concentraciones crecientes del mAb anti-LT-\beta de ensayo (0,02-20 \mug/ml). Las células se lavaron y se detectó el LT-\beta-R-FC unido mediante reacción con IgG de asno anti-humana marcada con ficoeritrina. Se determinó la cantidad de marcaje fluorescente unido mediante análisis FACS y se representó la intensidad media de fluorescencia.

La Figura 4 muestra los resultados de un ensayo FACS que midió la capacidad del mAb B9 anti-LT-\beta de bloquear interacciones receptor de LT-\beta-ligando como se describe anteriormente. Este experimento muestra que el mAb B9 anti-LT-\beta (0,02-5 \mug/ml) puede competir específica y eficazmente por la unión de ligando LT de superficie celular con la proteína de fusión de LT-\beta-R soluble (2 \mug/ml), y por tanto lo califica como agente bloqueante de LT-\beta-R según esta invención.

Ejemplo 7 Uso de anticuerpos anti-LT-\alpha/\beta de ratón para bloquear interacciones receptor-ligando

Se prepararon complejos LT-\alpha/\beta solubles de ratón como se describe anteriormente para complejos LT-\alpha/\beta solubles humanos. La subunidad LT-\beta soluble de ratón se preparó basándose en la información de secuencia descrita anteriormente (Lawton et al., J. Immunol., 154, pág. 239-246 (1995)). Los complejos de LT-\alpha/\beta soluble de múrido se expresaron utilizando el sistema de expresión de baculovirus/célula de insecto, y los complejos LT-\alpha/\beta se aislaron mediante cromatografía de afinidad utilizando columnas p55 TNF-R y LT-\beta-R esencialmente como se describe anteriormente para la expresión y purificación de complejos LT-\alpha/\beta humanos. Se inmunizaron hámsteres enanos grises con complejo LT-\alpha/\beta soluble de múrido purificado esencialmente como se describe en el ejemplo 6. Se condensaron células de bazo de hámster con la estirpe celular de hibridoma P3X como se ha descrito (Sánchez-Madrid et al., Methods of Enzymology, 121. pág. 239-244 (1986)). Se agruparon los hibridomas como anti-MLT-\beta o anti-MLT-\alpha basándose en sus características de unión al complejo LT-\alpha/\beta o al LT-\alpha solo, respectivamente. Las células de hibridoma se expandieron, y se purificaron los anticuerpos del sobrenadante de cultivo utilizando cromatografía de afinidad con proteína A (Pharmacia).

Para evaluar si los mAb de hámster anti-LT-\alpha y LT-\beta de ratón podían bloquear la unión de ligando LT a mLT-\beta-R, los inventores utilizaron células TIMI-4 (ATCC), una estirpe de células T que expresa ligando LT de superficie después de la activación con PMA durante 7 horas. Se preincubaron mAb anti-MLT-\alpha o anti-MLT-\beta de hámster con las células durante 30 minutos a 4ºC, y después se lavaron dos veces. Las células lavadas se incubaron con 1 \mug/ml de MLT-\beta-R-Fc a 4ºC. Después de 30 minutos, se lavaron las células de mLT-\beta-R-Fc no unida y después se incubaron durante 30 minutos con 10 \mug/ml de IgG de asno anti-humana marcada con ficoeritrina para detectar la mLT-\beta-R-Fc unida. Se determinó la cantidad de marcaje fluorescente unido por análisis FACS y se calculó la intensidad media de fluorescencia.

Utilizando este análisis, se encontró que el mAb anti-MLT-\beta de hámster podía bloquear eficazmente la unión de receptor de LT-\beta soluble a ligando LT de superficie de células T. Los resultados se muestran en la tabla 2.

TABLA 2 Capacidad del anticuerpo monoclonal anti-LT-\beta de ratón de inhibir la unión de mLT-\beta-R-Fc a ligando LT de superficie de múrido

1

Ejemplo 8 Agentes bloqueantes de LT-\beta-R inhiben la hipersensibilidad de contacto mediada por Th1 en ratón

Se sensibilizaron inicialmente ratones Balb/c hembra de 20 g (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) aplicando 25 \mul de 2,4-dinitrofluorobenceno (DNFB) al 0,5% en acetona:aceite de oliva 4:1 v/v a la parte inferior de cada pata trasera. Veinticuatro horas después de la sensibilización inicial, se sensibilizó de nuevo cada ratón con 25 \mul de la misma solución. Las sensibilizaciones se realizaron sujetando sin anestesiar al ratón. El día 5 (120 horas después de la sensibilización inicial), se anestesiaron los ratones con 90:10 mg/kg de ketamina/xilazina (i.p.) y se aplicó una dosis subirritante de 10 \mul de DNFB al 0,2% a las superficies dorsal y ventral de la oreja izquierda. La oreja derecha recibió una aplicación similar de vehículo acetona:aceite de oliva 4:1 v/v.

Cuatro horas después de la exposición a la respuesta inmune, se administraron concentraciones crecientes de mLT-\beta-R-Fc (0,08-5,0 mg/kg; ejemplo 2) a los ratones en 0,1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) mediante inyección intravenosa. Las inyecciones de tampón PBS solo o 20 mg/kg de una proteína de fusión de IgG humana (LFA3-Fc) (Miller et al., J. Exp. Med., 178, pág. 211-222 (1993)) sirvieron como controles negativos. La inyección de 8 mg/kg de un mAb específico anti-VLA4 (mAb PS/2; Chisolm et al., Eur. J. Immunol., 23, pág. 682-688 (1993)), que es conocido por inhibir la HSC bloqueando el influjo de células T al sitio de exposición, sirvió como control positivo. Se trataron grupos de cuatro a ocho ratones por cada concentración de anticuerpo.

Veinticuatro horas después de la exposición, se anestesiaron de nuevo los ratones con ketamina:xilazina y se midió el grosor de oreja de ambas orejas con un micrómetro industrial hasta una exactitud de 10^{-4} cm. La respuesta de hinchamiento de oreja para cada ratón era la diferencia entre su grosor de oreja de control y expuesta a DNFB. Las respuestas de hinchamiento de oreja no inhibida típicas fueron de 241-279 x 10^{-4} cm. La inhibición de la respuesta de hinchamiento de oreja se evaluó comparando grupos tratados con su grupo control negativo. La significación estadística de la diferencia entre los grupos de tratamiento se evaluó utilizando un análisis de varianza de un factor seguido de computación de la diferencia honradamente significativa de Tukey-Kramer (JMP, SAS Institute) utilizando p<0,05.

La Figura 5 muestra que la administración de concentraciones crecientes de mLT-\beta-R-Fc causa una reducción significativa de la respuesta de hinchamiento de oreja de ratones tratados con DNFB en comparación con animales control tratados con DNFB no inhibidos (PBS y LFA3-Fc). El LT-\beta-R soluble (de aproximadamente 1-5 mg/kg) puede bloquear esta reacción de HTR de contacto tan eficazmente como el inhibidor mAb específico anti-VLA4. La porción de este ensayo de hinchamiento de oreja que no está inhibida es probablemente el resultado de infiltración granulocítica "no específica".

Ejemplo 11 Modelo de EII por solución de sulfato de dextrano (SSD)

Se trataron los ratones como se define en la leyenda de la figura con hLFA3-Ig, concretamente con una proteína de fusión de Ig control o mLT\betaR-Ig mediante inyección intraperitoneal. El día 0, se cambió el agua de bebida a una solución de sulfato de dextrano al 5% y los ratones se dejaron con este fluido durante una semana. Una semana después, concretamente 2 semanas después de empezar la administración de SSD, se sacrificaron los ratones y se midieron el cambio de peso y la longitud del intestino grueso (del ano al ciego). La Figura __ muestra los cambios de peso y longitud del intestino después de diversos tratamientos. La longitud acortada del intestino así como la pérdida de peso son indicativos de EII. Se observó que el tratamiento con mLT\betaR-Ig previene drásticamente el acortamiento del colon y la pérdida de peso, indicando eficacia.

Figura 6

Cambio de peso observado 14 días después de la iniciación de SSD en el agua de bebida después de diversos tratamientos. Veh: vehículo, LTBr y LFA3 designan proteínas de fusión MLT\betaR-Ig y hLFA3-IG que se administraron mediante inyección intraperitoneal de 100 \mug 1 semana antes de añadir la SSD, en el punto de administración de la SSD y 1 semana después (concretamente 3 inyecciones a -1, 0 1 y semana). Había 10 animales por grupo.

Figura 7:

Longitud del colon 14 días después de la administración de SSD después de los diversos tratamientos descritos en 6.

Ejemplo 10 Modelo CD45RB^{alto}/scid de EII

Se aislaron células T CD4 positivas de ratones hembra C.B-17 utilizando tecnología de perlas magnéticas como la descrita anteriormente (F. Powrie et al., International Immunology 5: 1461-1471, 1993). Las células CD4 desprovistas de células T CD8 positivas, células B y monocitos se separaron después mediante separación celular activada por fluorescencia en poblaciones CD45RB^{alto} y CD45RB^{bajo} también esencialmente como se describe anteriormente. Se inyectaron 5 x 10^{5} células CD45RB por vía intravenosa a ratones scid C.B-17 hembra y se vigiló el peso corporal de los ratones. Puede observarse que los animales reconstituidos con células CD45RB^{bajo} ganaron peso de manera normal. En contraposición, los animales que recibieron células CD45RB^{alto} perdieron eventualmente peso y a las 10 semanas estaban casi muertos. Cuando los ratones control habían perdido aproximadamente un 20% de su peso de partida, se sacrificaron los ratones y se analizaron por histología diversos órganos. Los animales típicamente enfermos parecían caquécticos, tenían diarrea y colones y ciegos drásticamente alargados. Los animales tratados como se describe en la leyenda de la figura con hLFA3-Ig eran similares a los animales no tratados, mientras que los animales tratados con mLT\betaR-Ig no habían experimentado pérdida de peso, tenían colones de tamaño relativamente normal y carecían de los infiltrados inflamatorios masivos observados típicamente en el colon. La Figura 8 muestra el transcurso temporal de la pérdida de peso en animales inyectados con CD45RB^{alto} tratados de diversas formas y la figura 9 muestra los pesos corporales finales 8 semanas después de la inyección. La eficacia de la MLT\betaR-Ig en dos modelos muy diferentes de IIE, concretamente los modelos CD45RB y SSD, representa una fuerte evidencia de un profundo efecto de este tratamiento sobre el sistema inmune.

Figura 8:

Transcurso temporal del peso corporal después de la inyección de células T CD4 positivas CD45RB en ratones scid. Cada curva representa un animal y las inscripciones en los paneles designan cuáles células se inyectaron, concretamente CD45RB^{\text{alto o bajo}} y la naturaleza del tratamiento. Los animales se trataron semanalmente con 100 \mug de proteína inyectada por vía intraperitoneal. El tratamiento empezó 2 semanas antes de la inyección de las células y continuó durante el transcurso del experimento.

Figura 9:

Desviaciones media y típica de los pesos corporales observados después de diversos tratamientos 10 semanas después del transplante (5-6 animales por grupo)

Ejemplo 11: Un modelo de hipersensibilidad de tipo retardado en SRBC

Se sensibilizaron ratones Balb/C hembra mediante la inyección subcutánea de 2 x 10^{7} glóbulos rojos de oveja lavados (SRBC) en PBS. Después de 5 días, los ratones se expusieron a una inyección de 1 x 10^{8} SRBC en PBS en la almohadilla de la pata derecha (inyección subplantar). Se midió varias veces con un calibre el grosor de la almohadilla de la pata después de la inyección en la almohadilla de la pata. La Figura 10 muestra la respuesta de hinchamiento de la almohadilla de la pata en ratones tratados mediante inyección intraperitoneal con mLT\betaR-Ig. El tratamiento con mLT\betaR-Ig en el punto de sensibilización o tanto en las etapas de sensibilización como de exposición inhibió la respuesta de HTR inducida por SRBC.

Figura 10:

Se muestra el aumento del grosor de la almohadilla de la pata medido 18 h después de la inyección con exposición a SRBC. Los tratamientos fueron una inyección control negativa de PBS, un anticuerpo control positivo PS/2 que bloquea las interacciones de VLA4 y por tanto el tráfico celular y mLT\betaR-Ig (inyecciones intravenosas de 100 \mug) administrada inmediatamente antes de la inyección subcutánea sensibilizante de SRBC en el punto de exposición o en ambos momentos.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: BROWNING, Jeffrey L.

\hskip3.9cm

BENJAMIN, Christopher, D.

\hskip3.9cm

HOCHMAN, Paula S.

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: RECEPTORES DE LINFOTOXINA-\beta SOLUBLES Y ANTICUERPOS ANTI-RECEPTOR DE LINFOTOXINA Y LIGANDO COMO AGENTES TERAPÉUTICOS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES INMUNOLÓGICAS

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 1

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(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A): DESTINATARIO: James F. Haley, Jr.

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(B): CALLE: 1251 Avenue of the Americas

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(C): CIUDAD: Nueva York

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(D): ESTADO: Nueva York

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(E): PAÍS: EE.UU.

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(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 10020

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(v): FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA

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(A): TIPO DE MEDIO: disquete

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(B): ORDENADOR: Compatible con PC IBM

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: Patentln Release nº 1.0, versión 1.30.

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: SIMULTÁNEAMENTE CON LA PRESENTE

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/505.606

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 21 de julio de 1995

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(viii): INFORMACIÓN DE REPRESENTANTE/AGENTE:

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(A): NOMBRE: HALEY, Jr., James F.

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 27.794

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(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: B191CIP PCT

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(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

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(A): TELÉFONO: (212) 596-9000

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(B): TELEFAX: (212) 596-9090

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(C): TÉLEX: 14-8367

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 197 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): TIPO DE CADENA:

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(iii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1:

2

Claims

1. Uso de un agente bloqueante de receptor de linfotoxina beta (LT-\beta-R) para la preparación de una composición farmacéutica para tratar afecciones inmunológicas seleccionadas del grupo de esclerosis múltiple, oftalmia simpática, uveitis, psoriasis, enfermedad inflamatoria intestinal, artritis reumatoide, rechazo de tejidos y rechazo de órganos en un animal.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que el agente bloqueante de LT-\beta-R se selecciona del grupo que consiste en:

(a) un receptor de linfotoxina \beta soluble que comprende preferiblemente una secuencia funcional de aminoácidos seleccionada de los aminoácidos de SEC Nº ID 1;

(b) un anticuerpo dirigido contra el receptor de LT-\beta; y

(c) un anticuerpo dirigido contra el ligando LT de superficie.

3. El uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que el agente bloqueante de LT-\beta-R comprende un anticuerpo monoclonal dirigido contra el receptor de LT-\beta.

4. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el agente bloqueante de LT-\beta-R comprende el mAb BDA8 anti-LT-\beta-R humano.

5. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el agente bloqueante de LT-\beta-R comprende un anticuerpo monoclonal dirigido contra el ligando LT de superficie.

6. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el agente bloqueante de LT-\beta-R comprende mAb B9 anti-LT-\beta humano.

7. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el agente bloqueante de LT-\beta-R es una proteína de fusión de LT-\beta-R.

8. El uso según la reivindicación 7, en el que la proteína de fusión de LT-\beta-R comprende adicionalmente una secuencia funcional de aminoácidos seleccionada de los aminoácidos de SEC ID Nº 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. El uso según la reivindicación 7, en el que la proteína de fusión de LT-\beta-R comprende un dominio de unión a ligando de LT-\beta-R que puede unirse selectivamente a un ligando LT de superficie.

10. El uso según la reivindicación 7, en el que la proteína de fusión de LT-\beta-R comprende adicionalmente uno o más dominios de proteína heteróloga.

11. El uso según la reivindicación 10, en el que dicho dominio de proteína heteróloga comprende un dominio Fc de inmunoglobulina humana.

12. El uso según la reivindicación 11, en el que dicho dominio de proteína heteróloga se selecciona del grupo de seroalbúmina, lipoproteínas, apolipoproteínas y transferrina.