PL186911B1

PL186911B1 - Zastosowania LT-beta-R-Fc oraz białka fuzyjnego LT-beta-R

Info

Publication number: PL186911B1
Application number: PL96324622A
Authority: PL
Inventors: Jeffrey L. Browning; Christopher D. Benjamin; Paula S. Hochman
Original assignee: Biogen Inc
Priority date: 1995-07-21
Filing date: 1996-07-19
Publication date: 2004-03-31
Also published as: EE04419B1; JP2007254488A; HUP9802483A3; MX9800624A; HUP9802483A2; KR100493980B1; US6669941B1; JPH11510488A; US20110046073A1; NZ313441A; US6403087B1; SK286409B6; EE9800013A; NO980172D0; EP1488799A3; JP4174563B2; NZ503818A; FI980122L; ES2225889T3; CN1195294A

Abstract

1. Zastosowanie LT-ß-R-Fc do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do ha- mowania reakcji odpornosciowej zachodzacej przez limfocyty Th1 u zwierzecia, zwlasz- cza do leczenia choroby autoagresyjnej, odrzucenia przeszczepu tkankowego, odrzucenia przeszczepu narzadowego, nadwrazliwosci typu póznego albo przewleklych chorób za- palnych, przy czym kompozycja farmaceutyczna zawiera farmaceutycznie dopuszczalny nosnik oraz LT-ß-R-Fc w skutecznej ilosci. 46. Zastosowanie fuzji receptora limfotoksyny-ß z domena Fc immunoglobuliny (LT-ß-R-Fc) do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia albo zmniejszania zaawansowania, ciezkosci albo skutków choroby autoagresyjnej zwiazanej z komórkami Th1 u zwierzecia, przy czym kompozycja farmaceutyczna zawiera farmaceutycznie do- puszczalny nosnik oraz LT-ß-R-Fc w terapeutycznie skutecznej ilosci. 53. Zastosowanie bialka fuzyjnego LT-ß-R w terapeutycznie skutecznej ilosci do wytwa- rzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby zapalnej jelita grubego. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zatem zastosowanie skutecznej ilości LT-P-R-Fc wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania reakcji odpornościowej zachodzącej przez limfocyty Thl u zwierzęcia, zwłaszcza do leczenia choroby autoagresyjnej, odrzucenia przeszczepu tkankowego, odrzucenia przeszczepu narządowego, nadwrażliwości typu późnego albo przewlekłych chorób zapalnych. Korzystnym czynnikiem hamującym LT-p-R w zastosowaniu według wynalazku jest czynnik hamujący obejmujący rozpuszczalny LT-P-R, zawierający funkcjonalną sekwencję aminokwasową wybraną z aminokwasów Identyfikatora Sekw. nr 1. Korzystnie rozpuszczalny ΙΤ-β-R obejmuje domenę wiążącą ligand, która może wybiórczo wiązać się z powierzchniowym ligandem limfotoksyny (LT) obejmującym co najmniej jedną podjednostką LT-jl. Również korzystnie rozpuszczalny ΙΤ-β-R obejmuje zewnątrzkomórkową domenę ΙΤ-β-R. W szczególności rozpuszczalny LT-P-R jest ludzkim LT-P-R.

Ponadto korzystnie w zastosowaniu według wynalazku LT-P-R-Fc obejmuje domenę Fc ludzkiej immunoglobuliny. Korzystnie domena Fc immunoglobuliny obejmuje domenę Fc przeciwciała rekombinowanego. Również korzystnie domena Fc immunoglobuliny obejmuje domenę Fc przeciwciała humanizowanego. Ponadto korzystnie domena Fc immunoglobuliny obejmuje domenę Fc przeciwciała monoklonalnego. Korzystniej przeciwciało monoklonalne obejmuje mAb B9 przeciwko ludzkiemu LT-p, wytworzone przez linię komórkową hybrydomaB9.C9.1 (Nr dostępu ATCC 11962) albo mAb BDA8 przeciwko ludzkiemu LT-p-R, wytworzone przez linię komórkową hybrydoma BD.A8.AB9 (Nr dostępu ATCC HB11798).

W zastosowaniu według wynalazku korzystnie reakcja odpornościowa zachodząca przez limfocyty Thl przyczynia się do komórkowego odrzucenia tkanki u zwierzęcia, po przeszczepieniu przeszczepu tkankowego, odrzucenia narządu u zwierzęcia, po przeszczepieniu przeszczepu narządowego oraz zaburzenia autoagresyjnego u zwierzęcia. Korzystniej zaburzenie autoagresyjne jest narządowo-swoiste. Najkorzystniej narządowo-swoiste zaburzenie autoagresyjne jest wybrane z grupy składającej się ze stwardnienia rozsianego, cukrzycy insulinozależnej, współczulnego zapalenia oka, zapalenia jagodowki oraz łuszczycy. Ponadto korzystniej zaburzenie autoagresyjne jest ogólnoustrojowe. Najkorzystniej ogólnoustrojowe zaburzenie autoagresyjne jest wybrane z grupy składającej się z reumatoidalnego zapalenia stawów i zespołu Sjogrena. Tak więc w zastosowaniu według wynalazku korzystnie zaburzeniem autoagresyjnym jest reumatoidalne zapalenie stawów, stwardnienie rozsiane, łuszczyca albo cukrzyca insulinozależna.

Ponadto w zastosowaniu według wynalazku reakcja odpornościowa zachodząca przez limfocyty Thl jest hamowana bez hamowania odpowiedzi odpornościowej zależnej od limfocytów Th2. Zarazem korzystnie reakcja odpornościowa zachodząca przez limfocyty Thl przyczynia się do wystąpienia u zwierzęcia nadwrażliwości typu późnego. Korzystniej nadwrażliwość typu późnego jest nadwrażliwością typu tuberkulinowego, ziaminiakowego albo jest nadwrażliwością kontaktową.

186 911

W zastosowaniu według wynalazku reakcja odpornościowa zachodząca przez limfocyty

Thl przyczynia się do wystąpienia u zwierzęcia przewlekłej choroby zapalnej. Korzystniej przewlekłą chorobą zapalną jest choroba zapalna jelita grubego, choroba Crohn'a albo wrzodziejące zapalenie okrężnicy. W zastosowaniu według wynalazku kompozycja jest podawana w ilości wystarczającej do opłaszczenia komórek LT-p-R-jpozytywnych na okres od 1 do 14 dni.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie skutecznej ilości fuzji receptora limfotoksyny-β z domeną Fc immunoglobuliny (LT-P-R-Fc) wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia albo zmniejszania zaawansowania, ciężkości albo skutków choroby autoagresyjnej związanej z komórkami Thl u zwierzęcia. Korzystnie ΙΤ-β-R-Fc obejmuje rozpuszczalny receptor litnfotoksyny-β (LT-P-R), zawierający funkcjonalną sekwencję aminokwasową wybraną z aminokwasów Identyfikatora Sekw'. nr 1. Również korzystnie LT-P-R-Fc obejmuje rozpuszczalny receptor limfotoksyny-β posiadający domenę wiążącą ligand, która wybiórczo wiąże się z powierzchniowym ligandem LT obejmującym co najmniej jedną podjednostką LT-β. Ponadto korzystnie LT-[P-R-Fc obejmuje domenę Fc ludzkiej immunoglobuliny. Korzystnie chorobą autoagresyjną związaną z komórkami Thl jest reumatoidalne zapalenie stawów, stwardnienie rozsiane albo cukrzyca insulinozależna.

Ponadto przedmiotem wynalazku jest zastosowanie białka fuzyjnego LT-p-R w terapeutycznie skutecznej ilości do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby zapalnej jelita grubego. Korzystnie białko fuzyjne jest fuzją. LT-P-R i domeny Fc immunoglobuliny.

Niniejszym opisano również przeciwciała skierowane przeciwko receptorowi limfotoksyny-P, które działająjako środki blokujące LT-P-R oraz sposoby badania przesiewowego do selekcji środków blokujących LT-P-R, takich jak rozpuszczalne postacie LT-P-R, przeciwciała przeciwko LT i przeciwko LT-p-R. Sposoby badania przesiewowego obejmują wykonywanie testów cytotoksyczności wobec komórek nowotworowych, które monitorują sygnalizację przez LT-P-R. Test taki korzysta ze zwiększonej czułości ludzkich komórek gruczolakoraka na sygnalizację przez LT-P-R wywołaną przez ligand albo przeciwciało w obecności środków aktywujących LT-P-R (takich jak LT-al/a2) w teście cytotoksyczności wobec nowotworu.

Środki blokujące LT-P-R hamują efekty cytotoksyczne kompleksów heteromerycznych LT-a/p (albo innych środków aktywujących LT-P-R) wobec komórek nowotworowych. Procedura zastosowana do badania potencjalnych środków blokujących LT-P-R pokazana została na przykładzie przeciwciał przeciwko LT-P-R (w obecności środków aktywujących LT-P-R, LT-al/p2) i obejmuje następujące etapy:

1) komórki nowotworowe (np. ludzkie komórki gruczolakoraka HT29) hoduje się przez kilka dni w pożywce zawierającej IFN-γ i oczyszczone LT-al/p2 w obecności albo pod nieobecność konkretnego badanego przeciwciała przeciwko LT-P-R;

2) komórki traktuje się barwnikiem, który zabarwia żywe komórki; i

3) oblicza się liczbę żywych komórek, w celu określenia frakcji komórek nowotworowych zabitych w obecności LT-al/p2, IFN-y i badanego przeciwciała przeciwko LT-P-R. Alternatywnie, liczba żywych komórek może być obliczone w jednym z wielu dobrze znanych testów, które mierzą żywotność komórek, takich jak wbudowywanie ³H-tymidyny do dNa. Przeciwciało przeciwko LT-P-R (albo kombinacja przeciwciał), które zmniejsza procent komórek nowotworowych zabitych w teście o co najmniej 20% jest środkiem blokującym LT-p-R.

Ten test cytolizy może być wykonany przy użyciu heteromerycznych kompleksów LT-a/p i innych środków aktywujących LT-p-R, samych albo w kombinacji. Test może być zaadaptowany do identyfikacji nowych środków blokujących LT-P-R.

Krótki opis rysunków.

Figura 1. Sekwencja części zewnątrzkomórkowej ludzkiego receptora LT-P, która koduje domenę wiążącą ligand.

Figura 2. Rozpuszczalny mysi receptor LT-(3 sprzężony z domeną Fc IgGl (mLT-p-R-Fc) blokuje sygnalizację w mysich komórkach WEHI 164 wywołaną rozpuszczalnym mysim ligandem LT-a/p. Komórki WEHI 164 są niszczone jako funkcja rosnącego stężenia ligandu LT (mLT-a/p). Rozpuszczalny mlT-jl-R-Lc (10 |ig/ml) blokuje tę śmierć komórkową wywołaną ligandem LT. Rozpuszczalne białko fuzyjne mysiego receptora TNF (p55ENL-R-Lc) ma znikomy wpływ na blokowanie śmierci komórkowej wywołanej LT-a/p. Wzrost oznaczano ilościowo po trzech

186 911 dniach przez pomiar gęstości optycznej (OD 550) produktu reakcji MIT, który jest proporcjonalny do liczby komórek.

Figura 3. Przeciwciało skierowane przeciwko ludzkiemu LT-P-R (BDA8 mAb) blokuje oddziaływanie pomiędzy rozpuszczalnym ligandem LT i LT-P-R na powierzchni komórki ludzkiej. Wzrost komórek nowotworowych WiDr jest blokowany przez kombinację IFN-γ rozpuszczalnego ligandu LT-al/p2. Przeciwciało przeciwko LT-P-R, BDA8, blokuje zdolność ligandu ΕΓ-α1/β2 do hamowania wzrostu komórek nowotworowych WiDr. Symbole wypełnione pokazują wzrost komórek w obecności kontrolnego przeciwciała monoklonalnego IgGl (10 pg/ml). Puste symbole pokazują wpływ przeciwciała monoklonalnego przeciwko LT-P-R BDA8 (10 pg/ml).

Figura 4. Przeciwciało skierowane przeciwko ludzkiej LT-P (B9) blokuje oddziaływanie pomiędzy ligandem powierzchniowym LT-a/p i rozpuszczalnym receptorem LT-β (hLT-p-R-Fc;

Lig/ml). LT—P-R-Fc związany z powierzchnią wykrywano przy użyciu oślich przeciwciał przeciwko ludzkim IgG znakowanych fikoerytryną i analizy FACS. Średnie natężenie fluorescencji powstałego szczytu wykreślono jako numer kanału. Linia przerywana pokazuje średnie natężenie fluorescencji odpowiadające ilości receptora związanego pod nieobecność przeciwciała B9.

Figura 5. Wpływ środka blokującego LT-P-R (mLT-p-R-Fc) na obrzęk ucha w mysim modelu kontaktowej nadwrażliwości typu późnego (DTH). Wykres pokazuje wzrost grubości ucha mierzony 24 godziny po ekspozycji ucha uczulonej myszy na 0,2% antygen DNFB. Każdy symbol pokazuje osobne doświadczenie. Wszystkie doświadczenia wykorzystywały 7-8 zwierząt na punkt czasowy, z wyjątkiem oznaczonego rombami, w którym stosowano tylko cztery zwierzęta na punkt. Myszy leczono buforem (PBS) oraz 20 mg/kg kontrolnego białka fuzyjnego IgG (LFA3-Fc) służącego jako kontrola negatywna. Myszy traktowane 8 mg/kg przeciwciała przeciwko VLA4 (PS/2), które hamowało obrzęk ucha w kontaktowym DTH, służyły jako kontrola dodatnia.

Figura 6. Wykres zmian ciężaru obserwowany u myszy 14 dni po leczeniu białkiem fuzyjnym mLT-(P-R-lg i hLFA3-lg.

Figura 7. Wykres zmian długości okrężnicy obserwowany u myszy 14 dni po leczeniu białkiem fuzyjnym mLT-P-R-lg i hLFA3-lg.

Figura 8. Przebieg w czasie ciężaru ciała myszy po wstrzyknięciu limfocytów T CD45RB^l0WCD4-pozytywnych, limfocytów T CD4 5 RB^hlghCD4-pozytywnych; limfocytów T CD45RBh^gh-pozytywnych oraz LTpR-lg i CD45RBh'^gl1 -pozytywnych oraz hLFA3-lg.

Figura 9. Wykres średniej i odchylenia standartowego ciężaru ciała obserwowanego po leczeniu opisanym na Figurach 8-11.

Figura 10. Wykres zwiększenia grubości poduszki łapy myszy, której wstrzyknięto kontrolę negatywną i pozytywną wraz z mLTpR-lg.

W celu lepszego zrozumienia wynalazku dołączono poniższy szczegółowy opis.

Określenie „cytokina” dotyczy cząsteczki zapewniającej oddziaływanie pomiędzy komórkami. „Limfokina” jest cytokiną wydzielaną przez limfocyty.

Określenie „limfocyt T pomocniczy (Th)” oznacza funkcjonalną podklasę limfocytów T, która pomaga generować limfocyty T cytotoksyczne, i która kooperuje z limfocytami B w celu pobudzenia wytwarzania przeciwciał. Limfocyty T pomocnicze rozpoznają antygen w połączeniu z cząsteczkami MHC klasy II.

Określenie „Thl” dotyczy podklasy limfocytów T pomocniczych, które wytwarzająLT-a, interferon-γ i IL-2 (oraz inne cytokiny), oraz które wywołują reakcje zapalne związane z komórkową, tj. nie-immunoglobulinową reakcją na ekspozycję.

Określenie „Th2” dotyczy podklasy limfocytów T pomocniczych, które wytwarzają cytokiny, w tym IL-4, IL-5, IL-6 i IL-10, które są związane z immunoglobulinową (humoralną) reakcją na ekspozycję immunologiczną.

Określenie „komórkowe” dotyczy takich zjawisk immunologicznych, które wynikają z bezpośredniego wpływu limfocytów T i ich produktów wywołujących reakcję. Ten rodzaj odpowiedzi jest ogólnie (choć nie wyłącznie) związany z klasą Thl limfocytów T. Do tej kategorii nie są zaliczane efekty pomocnicze limfocytów T wobec różnicowania limfocytu B i ekspansji limfocytów B, które zwykle związane są z klasą Th2 limfocytów T.

186 911

Określenie „nadwrażliwość typu późnego (DTH)” dotyczy odpowiedzi odpornościowej charakteryzującej się powolną odpowiedzią na antygen, z pełnym efektem manifestującym się w ciągu 1-3 dni. Ta powolna odpowiedź jest przeciwieństwem względnie szybkiej odpowiedzi obserwowanej w reakcjach alergicznych, zachodzących dzięki immunoglobulinom (reakcjach humoralnych). Występują. trzy rodzaje reakcji DTH: nadwrażliwość kontaktowa, nadwrażliwość typu tuberkulinowego i reakcja ziaminiakowa.

Określenie „odpowiedź immunoglobulinowa” albo „odpowiedź humoralna” dotyczy odpowiedzi odpornościowej zwierzęcia na obcy antygen, podczas której zwierzę wytwarza przeciwciała przeciwko obcemu antygenowi. Limfocyty T pomocnicze klasy Th2 są kluczowe dla wydajnego wytwarzania przeciwciał o wysokim powinowactwie.

Określenie „domena Fc” przeciwciała oznacza część cząsteczki obejmującą zawias, domeny CH2 i CH3, ale pozbawioną miejsc wiązania antygenu. Określenie obejmuje również równoważne regiony IgM albo innego izotypu przeciwciał.

Określenie „przeciwciało przeciwko receptorowi LT-P” dotyczy każdego przeciwciała, które swoiście wiąże się z przynajmniej jednym epitopem receptora LT-p.

Określenie „przeciwciało przeciwko LT” dotyczy każdego przeciwciała, które swoiście wiąże się z przynajmniej jednym epitopem LT-α, LT-P albo kompleksu LT-a/p.

Określenie „sygnalizacja przez LT-P-R” dotyczy reakcji cząsteczkowych związanych ze szlakiem LT-P-R i następującymi potem reakcjami cząsteczkowymi, które z nich wynikają.

Określenie „środek blokujący LT-p-R” dotyczy czynnika, który może zmniejszać wiązanie ligandu z LT-p-R, grupowanie LT-P-R na powierzchni komórki albo może wpływać na to jak będzie w komórce interpretowany sygnał z LT-p-R.

Środek blokujący LT-p-R, który działa na etapie wiązania się ligandu z receptorem może hamować wiązanie ligandu LT z LT-P-R o co najmniej 20%. Środek blokujący LT-p-R, który działa po etapie wiązania ligandu z receptorem może hamować efekty cytotoksyczne aktywacji LT-P-R wobec komórki nowotworowej o co najmniej 20%. Przykłady środków blokujących LT-P-R obejmują rozpuszczalne cząsteczki LT-P-R-Fc i przeciwciała przeciwko LT-a, przeciwko LT-P, przeciwko LT-a/p i przeciwko LT-P-R. Przeciwciała nie reagują krzyżowo z wydzielniczą postacią LT-a.

Określenie „aktywność biologiczna LT-P-R” dotyczy: 1) zdolności cząsteczki LT-P-R albo pochodnej do współzawodniczenia z rozpuszczalnymi albo powierzchniowymi cząsteczkami LT-P-R o wiązanie z rozpuszczalnym albo powierzchniowym ligandem LT; albo 2) zdolności do pobudzania regulującej odpowiedzi odpornościowej albo reakcji cytotoksycznej wspólnie z natywną cząsteczką LT-P-R.

Określenia „heteromeryczny kompleks LT-α/β” i „heteromeryczny kompleks LT” dotyczą stabilnego połączenia pomiędzy przynajmniej jedną podjednostką LT-α i jedną lub wieloma podjednostkami LT-p, w tym postaci rozpuszczalnych, zmutowanych, zmienionych albo chimerycznych jednej lub wielu podjednostek. Podjednostki mogą łączyć się przez oddziaływania elektrostatyczne, van der Waalsa albo kowalencyjne. Korzystnie, heteromeryczny kompleks LT-a/p zawiera przynajmniej dwie sąsiadujące podjednostki LT-P i pozbawiony jest sąsiadujących podjednostek LT-a. Gdy heteromeryczny kompleks LT-α/β służy jako środek aktywujący LT-P-R w teście proliferacji komórek, kompleks jest korzystnie rozpuszczalny i ma wzór stechiometryczny LT-al/p2. Rozpuszczalne kompleksy heteromeryczne LT-a/p pozbawione są domeny śródbłonowej i mogą być wydzielane przez odpowiednią komórkę gospodarza, którego zmieniono w taki sposób, by wyrażał podjednostki LT-a i/lub LT-p (Crowe i in., J. Immunol. Meth., 168:79-89 (1994)).

Określenie „ligand LT” dotyczy kompleksu heteromerycznego LT albo jego pochodnej, które mogą się wiązać swoiście z receptorem LT-p.

Określenie „domena wiążąca ligand LT-p-R” dotyczy jednej albo wielu części LT-P-R, które są związane ze swoistym rozpoznawaniem ligandu LT i oddziaływaniem z nim.

Określenia „kompleks powierzchniowy LT-α/β” oraz „kompleks powierzchniowy LT” dotyczą kompleksu obejmującego podjednostki LT-α i związane z błoną LT-P, w tym zmutowane, zmienione albo chimeryczne postaci jednej albo wielu podjednostek, które są ujawnio186 911 ne na powierzchni komórki. „Ligand powierzchniowy LT” dotyczy kompleksu powierzchniowego LT albo jego pochodnej, które mogą wiązać się swoiście z receptorem LT-β.

Określenie „osobnik” dotyczy zwierzęcia, albo jednej lub wielu komórek pochodzących ze zwierzęcia. Korzystnie, zwierzęciem jest ssak. Komórki mogą występować w dowolnej postaci, w tym, choć nie wyłącznie, komórek zawartych w tkance, skupiska komórek oraz komórek pochodzących od zwierzęcia, które zostało zmienione fizycznie albo fenotypowo.

Cytokiny pokrewne czynnikowi martwicy nowotworu (TNF) występują jako wielka rodzina plejotropowych mediatorów regulacji odporności i obrony gospodarza. Członkowie tej rodziny występują w postaci związanej z błoną, gdzie działają miejscowo przez oddziaływanie komórki z komórką, albo jako białka wydzielnicze, które działają na odległe cele. Równoległa rodzina receptorów TNF oddziaływa z tymi cytokinami i wyzwala wiele różnych szlaków, w tym śmierci komórkowej, proliferacji, różnicowania tkanek i reakcji pro-zapalnych.

TNF, limfotoksyna-a (LT-a, zwana również TNF-β) i limfotoksyna-p (LT-β) są członkami rodziny ligandów TNF, która obejmuje również ligandy receptorów Fas, CD27, CD30, CD40, OX-40 i4-lBB (Smith i in., Celi, 76:959-62 (1994)). Sygnalizacja przez niektórych z członków rodziny TNF, w tym TNF, LT-α, LT-P i Fas, może wywołać śmierć komórki nowotworowej przez martwicę albo apoptozę (zaprogramowaną śmierć komórki). W komórkach nienowotworowych, oddziaływanie TNF i wielu ligandów z rodziny TNF wpływa na rozwój układu odpornościowego i reakcje wobec różnych ekspozycji.

Większość ligandów rodziny TNF spotyka się w postaci związanej z błoną na powierzchni komórki. U ludzi, TNF i LT-α spotyka się zarówno w postaci rozpuszczalnej jak i związanej. Powierzchniowy TNF posiada region śródbłonowy, który jest przecinany proteolitycznie z wytworzeniem postaci rozpuszczalnej. W przeciwieństwie, powierzchniowa LT-a pozbawiona jest regionu śródbłonowego. LT-α związana z błoną jest zakotwiczona do powierzchni komórki jako heteromeryczny kompleks z LT-P, pokrewnym polipeptydem śródbłonowym, w kompleksie LT-a/p.

Większość kompleksów LT-a/p związanych z błoną ( „LT powierzchniowa”) ma stosunek stechiometryczny L,T-al/p2 (Browning i in., Celi, 72:847-56 (1993); Browning i in., J. Immunol., 154:33-46 (1995)). Ligandy powierzchniowe LT nie wiążą TNF-R z wysokim powinowactwem, i nie aktywują sygnalizacji przez TNF-R. Inny receptor pokrewny TNF, zwany receptorem LT-P (LT-p-R) wiąże te kompleksy limfotoksyny powierzchniowej z wysokim powinowactwem (Crowe i in., Science, 264:707-10 (1994)).

Sygnalizacja przez LT-p-R, podobnie jak sygnalizacja przez TNF-R, działa antyproliferacyjnie i może być cytotoksyczna dla komórek nowotworowych. W równoległym zgłoszeniu patentowym USA, nr 08/378,968) ujawnione są kompozycje i sposoby wybiórczego pobudzania LT-P-R przy użyciu środków aktywujących LT-p-R. Środki aktywujące LT-P-R są przydatne do hamowania wzrostu komórek nowotworowych bez równoczesnej aktywacji pro-zapalnych albo immunoregulujących szlaków wywołanych TNF-R.

W komórkach nie-nowotworowych, TNF i cytokiny pokrewne TNF są aktywne w licznych reakcjach odpornościowych. Zarówno TNF jak i LT-a wiążą się i aktywują receptory TNF (p55 albo p60 i p75 albo p80; zwane tu „TNF-R”). TNF i LT-α są wytwarzane przez makrofagi we wczesnej i szybkiej odpowiedzi na zakażenie drobnoustrojami, co zwiększa aktywność bakteriobójczą granulocytów obójętnochłonnych i makrofagów wobec drobnoustrojów. TNF i LT-α wytworzone przez makrofagi albo limfocyty T cytotoksyczne (CTL albo „niszczące limfocyty T”) wiążą się z receptorami TNF na powierzchni komórki docelowej i wyzwalają śmierć podatnych komórek.

TNF i pokrewne cytokiny mogą również zapoczątkowywać kaskady zapalne w odpowiedzi na zakażenie albo stres. Uwolnienie TNF, LT-α i IFN-y zmienia właściwości adhezji pomiędzy komórkami śródbłonka naczyń i pewnymi rodzajami limfocytów. Zwiększona adhezja ułatwia fagocytozę i migrację leukocytów z krwiobiegu do tkanek otaczających miejsce zmienione zapalnie. Podobne reakcje zapalne odgrywają główną rolę w komórkowym odrzucaniu przeszczepów tkankowych i narządowych oraz pewnych zaburzeniach odpornościowych.

Kompleksy limfotoksyny (LT) powierzchniowej scharakteryzowano u komórek hybrydoma CD4+ (11-23.D7), które wyrażają LT na wysokim poziomie (Browning i in., J. Immu12

186 911 nol., 147:1230-47 (1991); Androlewicz i in., J. Biol. Chem., 267:2542-47 (1992)). Ekspresja i działanie biologiczne LT-P-R, podjednostek LT i kompleksów powierzchniowych LT opisano ostatnio w Ware i in., „The ligands and receptors of the lymphotoxin system”, w Pathways for Cytolysis, Current Topics Microbiol. Immunol., Springer-Verlag, str. 175-218 (1995).

Ekspresja LT-α i jej wydzielenie indukowane są głównie w aktywowanych limfocytach T i B oraz naturalnych komórkach niszczących (NK). Wśród podklas limfocytów T pomocniczych, LT-α wydaje się być wytwarzana przez limfocyty Th1, ale nie Th2. LT-α wykryto również w melanocytach. Mikroglej i limfocyty T w zmianach u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym mogą być również znakowane surowicą odpornościową przeciwko LT-α.

Limfotoksynę-P (zwaną również p33) stwierdzono na powierzchni limfocytów T, linii limfocytów T, linii limfocytów B i komórkach niszczących aktywowanych limfokiną (LAK). LT-P jest przedmiotem równoległego zgłoszenia międzynarodowego PCT/US91/04588, opublikowanego 9 stycznia 1992 jako WO 92/00329 i PCT/US93/11669, opublikowanego 23 czerwca 1994 jako WO 94/13808, które załączono tu jako odnośnik.

Kompleksy powierzchniowe LT są głównie wyrażane przez aktywowane limfocyty B i T oraz naturalne komórki niszczące (NK), co stwierdzono analizą FACS oraz immunohistologią przy użyciu przeciwciał przeciwko LT-α albo rozpuszczalnych białek fuzyjnych LT-p-R-Fc. LT powierzchniowa opisana została na klonach ludzkich limfocytów T cytotoksycznych (CTL), aktywowanych jednojądrzastych limfocytach obwodowych (PmL), limfocytach krwi obwodowej aktywowanych IL-2 (LAK), obwodowych limfocytach B aktywowanych mitogenem barwinka albo przeciwciałem przeciwko CD40 (PBL) oraz różnych liniach nowotworów limfoidalnych z limfocytów T i B. Zastosowanie komórek docelowych niosących alloantygen wywołuje ekspresję powierzchniową LT na powierzchni klonów CTL CD8+ i CD4+.

Receptor LT-P, członek rodziny receptorów TNF wiąże swoiście ligandy powierzchniowe LT. LT-P-R wiąże kompleksy heteromeryczne LT (głównie υϊ-α1/ρ2 i Εϊα2/ρ1), ale nie wiąże TNF ani LT-α (Crowe i in., Science, 264:707-10 (1994)). Sygnalizacja przez LT-P-R może odgrywać rolę w rozwoju obwodowych narządów limfatycznych oraz odpowiedzi humoralnej. Badania ekspresji LT-P-R znajdują się na wczesnych etapach mRNA LT-P-R stwierdzono w ludzkiej śledzionie, grasicy i innych głównych narządach. Wzorzec ekspresji LT-P-R jest podobny do opisywanego dla p55-TNF-R, z takim wyjątkiem, że LT-P-R nie występuje na obwodowych limfocytach T i liniach limfocytów T.

Rozpuszczalne kompleksy heteromeryczne LT-α/β obejmują podjednostki LT-P, które zmieniono ze związanych z błoną w postać rozpuszczalną. Kompleksy te opisane są szczegółowo w równoległym zgłoszeniu międzynarodowym (PCT/US93/11669, opublikowanym 23 czerwca 1994 jako WO 94/13808). Rozpuszczalne peptydy LT-P określone są sekwencją aminokwasową LT-P, w której wycięto sekwencję w dowolnym punkcie pomiędzy końcem regionu śródbłonowego (tj. około aminokwasu nr 44) i pierwszym regionem homologii z TNF (tj. około aminokwasu nr 88), według systemu numeracji Browning i in., Cell, 72:847-56 (1993)).

Rozpuszczalne peptydy LT-P mogą być wytwarzane przez okrojenie końca N LT-P, w celu usunięcia ogona cytoplazmatycznego i regionu śródbłonowego (Crowe i in., Science, 264:707-10 (1994)). Alternatywnie, domena śródbłonowa może być inaktywowana przez delecję, albo zastąpienie normalnie hydrofobowymi resztami aminokwasowymi, które obejmują domenę śródbłonową wraz z domenami hydrofilowymi. W innym przypadku, tworzony jest zasadniczo hydrofilowy profil hydropatyczny, który zmniejsza powinowactwo lipidowe i zwiększa rozpuszczalność w wodzie. Delecja domeny śródbłonowej jest korzystniejsza niż zastąpienie hydrofobowych reszt aminokwasowych hydrofilowymi, ponieważ unika się wprowadzania potencjalnie immunogennych epitopów^.

Usunięta albo inaktywowana domena śródbłonowa może być zastąpiona albo połączona z sekwencją liderową typu I (np. sekwencją liderową VCAM-1) w taki sposób, że białko jest wydzielane począwszy do dowolnej sekwencji pomiędzy va140 ipro88. Rozpuszczalne polipeptydy LT-P mogą obejmować dowolną liczbę dobrze znanych sekwencji liderowych na końcu N. Taka sekwencja powinna umożliwić ekspresję i kierowanie peptydów do szlaku wydzielniczego w układzie eukariotycznym (patrz, Ernst i in., opis patentowy USa nr 5,082,783 (1992)).

186 911

Rozpuszczalne heteromeryczne kompleksy LT-α/β mogą być wytwarzane przez równoczesne transfekowanie odpowiedniej komórki gospodarza DNA kodującym LT-a i rozpuszczalną LT-β (Crowe i in., J. Immunol. Methods, 168:79-89 (1994)). Rozpuszczalna LT-β wydzielana pod nieobecność LT-α jest silnie oligomeryczna. Jednakże, gdy następuje równoczesna ekspresja z LT-α, tworzą się trimeryczne struktury wielkości 70 kDa, które zawierają oba białka. Możliwe jest również wytworzenie rozpuszczalnych heteromerycznych kompleksów LT-al/p2 przez transfekowanie linii komórkowej, która normalnie wyraża tylko LT-a (takiej jak komórki RPMI 1788 dyskutowane powyżej) genem kodującym rozpuszczalny peptyd LT-p.

Polipeptydy LT-a i LT-β mogą być osobno syntetyzowane, denaturowane łagodnymi detergentami, mieszane ze sobą i renaturowane przez usunięcie detergentu z wytworzeniem mieszanych kompleksów heteromerycznych LT, które mogą być oddzielane (patrz, niżej).

Rozpuszczalne kompleksy heteromeryczne rozdziela się od kompleksów współwyrażanych, obejmujących różne stosunki stechiometryczne podjednostek przez chromatografię z użyciem receptorów TNF i LT-P jako odczynników do oczyszczania przez powinowactwo. Receptory TNF wiążą się z wysokim powinowactwem ze szczelinami a/a kompleksów LT. Receptor LT wiąże się z wysokim powinowactwem ze szczelinami p/p i z niższym powinowactwem ze szczelinami a/p kompleksów heteromerycznych LT-a/p. LT-a3 i LT-a2/pi wiążą się z TNF-R. LT-P-R może również wiązać trimery LT-a2/pl (przez szczelinę a/p), ale nie może wiązać LT-a3. Oprócz tego, LT-P-R (ale nie TNF-R) wiąże L>al/p2 i LT-Pn (dokładny skład takich preparatów jest nieznany, jednakże stanowią one wielkie agregaty).

Odczynniki powinowactwa receptorów mogą być wytworzone jako rozpuszczalna domena zewnątrzkomorkowa (patrz, przykładowo Loetscher i in., J. Biol. Chem., 266:18324-29 (1991)) albo jako białka chimeryczne z domeną zewnątrzkomorkową wiążącą antygen sprzęgniętą z domeną Fc immunoglobuliny (Loetscher i in., J. Biol. Chem., 266:18324-29 (1991), Crowe i in., Science, 264:707-710 (1994)). Receptory sprzęgnięte są z matrycami powinowactwa sieciowaniem chemicznym przy użyciu rutynowych procedur.

Istnieją dwa schematy, przez które ligand LT-al/p2 może być oczyszczony przy użyciu receptorów i chromatografii powinowactwa immunologicznego. W pierwszym schemacie, nadsącz z odpowiedniego układu ekspresyjnego równocześnie wyrażającego LT-α i okrojoną postać LT-P przepuszczany jest przez kolumnę TNF-R. TNF-R wiąże trimery LT-a3 i LT-a2/pl. Nadsącz wypływający z kolumny TNF-R zawiera LT-P(n) i LT-al-p2.

W drugim schemacie, wszystkie postacie zawierające LT-P (LT-P(n), LT-al/'(32 i LT-a2/pl) wiązane są i eluowane z kolumny LT-fP-R przy użyciu klasycznych metod takich jak stosowanie substancji chaotropowych albo zmiana pH (LT-a3 przepływa przez tę kolumnę). Eluat neutralizuje się albo usuwa substancję chaotropową, po czym eluat przepuszcza się przez kolumnę TNF-R, która wiąże wyłącznie trimery LTiaP^Z/pi. Zawartość opuszczająca kolumnę zawiera trimery LT-P (n) i 1,Τ-αί/[Ρ2.

W obu przypadkach czyste trimery LT-al/p2 mogą być oddzielone od LT-P przez następującą potem filtrację żelową i/lub procedurę chromatografii jonowymiennej znaną w stanie techniki.

Alternatywnie, różne postacie kompleksów heteromerycznych LT-a/p mogą być oddzielone i oczyszczone różnymi konwencjonalnymi metodami chromatograficznymi. Może być również korzystne skojarzenie szeregu konwencjonalnych schematów oczyszczania z jednym lub wieloma etapami oczyszczania przez powinowactwo immunologiczne, opisanymi wyżej.

Środek blokujący LT-P-R może obejmować przeciwciało (Ab) skierowane przeciwko LT-P-R, które hamuje sygnalizację przez LT-P-R. Przeciwciało przeciwko LT-P-R może być przeciwciałem monoklonalnym (mAb). Jednym z takich monoklonalnych przeciwciał przeciwko LT-P-R jest BDA8.

Hamujące przeciwciała przeciwko LT-P-R oraz inne środki blokujące LT-p-R mogą być zidentyfikowane przy użyciu metod przesiewowych, które wykrywają zdolność jednego lub wielu środków do wiązania z LT-P-R albo ligand LT, albo do hamowania efektów sygnalizacji LT-P-R na komórkę.

Jedna z metod przesiewowych wykorzystuje efekty cytotoksyczne sygnalizacji LT-P-R na komórki nowotworowe niosące LT-P-R. Komórki nowotworowe eksponowane są na jeden

186 911 lub wiele środków aktywujących LT-P-R w celu wywołania sygnalizacji LT-P-R. Środki aktywujące LT-P-R obejmują kompleksy heteromeiyczne LT-a/p (korzystnie rozpuszczalną LT-al/p2) w obecności IFN-y, albo inaktywujące przeciwciało przeciwko LT-P-R (patrz, niżej; opisane również w równoległym zgłoszeniu UsA nr 08/378,968).

Przeciwciała i inne środki, które mogą blokować sygnalizację przez LT-P-R wybrane są w oparciu o ich zdolność do hamowania efektu cytotoksycznego sygnalizacji LT-P-R na komórkę nowotworową w następujący sposób:

1) komórki nowotworowe takie jak ludzkie komórki gruczolakoraka HT29, hoduje się przez 3-4 dni w szeregu studzienek hodowlanych w pożywce zawierającej przynajmniej jeden środek aktywujący LT-p-R, w obecności albo pod nieobecność kolejnych rozcieńczeń środka badanego;

2) dodaje się barwnika, który mierzy funkcje mitochondrialne,np. MTT, pozostawia się do reakcji na kilka godzin; i

3) mierzy się gęstość optyczną mieszaniny w każdej studzience przy długości fali świetlnej równej 550 nm (OD 550). OD 550 jest proporcjonalna do liczby komórek nowotworowych pozostających w obecności środka aktywującego FT--P^'R i środka blokującego LT-P-R w każdej ze studzienek. Środek albo kombinacja środków, które mogą zmniejszyć cytotoksyczność wobec komórek nowotworowych aktywowaną przez LT-P-R o co najmniej 20% jest środkiem blokującym LT-p-R w zakresie wynalazku.

Dowolny środek albo kombinacja środków, które aktywują sygnalizację LT-p-R może być zastosowana w powyższym teście w celu identyfikacji środków blokujących LT-p-R. Środki aktywujące LT-P-R, które wywołują sygnalizację przez LT-P-R. (takie jak aktywujące przeciwciała przeciwko LT-P-R) mogą być wyselekcjonowane w oparciu o ich zdolność, samych albo w kombinacji do innymi środkami, do nasilania cytotoksyczności wobec komórek nowotworowych, w teście z komórkami nowotworowymi opisanym powyżej.

Innym sposobem selekcji środków blokujących LT-P-R jest monitorowanie zdolności domniemanego środka do bezpośredniego zakłócania wiązania ligandu LT z receptorem. Środek albo kombinacja środków, która blokuje wiązanie ligandu z receptorem przynajmniej w około 20% jest środkiem blokującym LT-P-R w zakresie wynalazku.

Dowolny spośród licznych testów mierzących siłę wiązania ligandu z receptorem może być zastosowany do wykonania testu kompetycyjnego z domniemanymi środkami blokującymi LT-P-R. Siła wiązania pomiędzy receptorem i ligandem może być zmierzona przy użyciu enzymatycznego testu immunosorpcyjnego (ELISA) albo testu radioimmunologicznego (RIA). Wiązanie właściwe może być również zmierzone przez znakowanie fluorescencyjne kompleksów przeciwciała z antygenem i wykonanie analizy sortowania komórek aktywowanego fłuorescencją (FACS), albo przez wykonanie innych sposobów wykrywania immunologicznego, które to sposoby są znane w stanie techniki.

Oddziaływanie wiązania pomiędzy receptorem i ligandem może być również zmierzone przy użyciu urządzenia BIAcore (Pharmacia Biosensor), który wykorzystuje wykrywanie przy użyciu rezonansu plazmowego (Zhou i in., Biochemistry 32:8193-98 (1993); Faergstram i 0'Shannessy, „Surface plasmon resonance detection in affinity technologies” w Handbook of Affinity Chromatography, str. 229-52, Marcel Dekker, Inc., New York (1993)).

Technologia BIAcore umożliwia wiązanie receptora z podłożem ze złota i przepływ ligandu ponad nim. Wykrywanie rezonansem plazmowym daje bezpośrednie oznaczenie ilościowe masy związanej z powierzchnią w czasie rzeczywistym. Technika ta daje prędkość wiązania i dysocjacji, stąd stałądysocjacji ligandu z receptorem i stałą powinowactwa można oznaczyć bezpośrednio w obecności i pod nieobecność domniemanego środka blokującego LT-P-R.

Przy użyciu którejkolwiek z tych i innych technik do mierzenia oddziaływania receptora z ligandem, można zbadać zdolność środka blokującego LT^-p-R samego albo w kombinacji z innymi środkami do hamowania wiązania ligandów LT powierzchniowych albo rozpuszczalnych z cząsteczkami LT-p-R powierzchniowymi albo rozpuszczalnymi. Testy takie można również zastosować do badania środków blokujących LT-P-R albo pochodnych takich związków (np. fuzji, chimer, mutantów i postaci zmienionych chemicznie), samych albo w kombinacji, do optymalizacji zdolności zmienionego środka do blokowania aktywacji LT-P-R.

186 911

Środki blokujące LT-p-R obejmują rozpuszczalne cząsteczki receptora LT-p. Figura 1 pokazuje sekwencję części zewnątrzkomórkowej ludzkiego LT-P-R, która koduje domenę wiążącą ligand. Przy użyciu informacji o sekwencji na Figurze 1 i technik rekombinacji DNA znanych dobrze w stanie techniki, można klonować funkcjonalne fragmenty kodujące domenę wiążącą ligand LT-p-R do wektora i poddawać ekspresji w odpowiednim gospodarzu, w celu wytwarzania rozpuszczalnej cząsteczki LT-p-R. Rozpuszczalne cząsteczki LT-P-R, które mogą współzawodniczyć z natywnymi receptorami LT-P o wiązanie ligandu LT w oparciu o opisane tu testy są selekcjonowane jako środki blokujące LT-P-R.

Rozpuszczalny receptor LT-P obejmujący sekwencję aminokwasowe wybrane z sekwencji pokazanej na Figurze 1, może być przyłączony do jednej albo wielu heterologicznych domen białkowych („domeny fuzyjne”) w celu zwiększenia stabilności in vivo białka fuzyjnego receptora, albo w celu modulowania jego aktywności biologicznej albo lokalizacji.

Stabilne białka osocza, które zwykle mają okres półtrwania w krążeniu powyżej 20 godzin, są stosowane do konstruowania fiizyjnych białek receptora. Takie białka osocza obejmują, choć nie są ograniczone do immunoglobulin, albumin surowicy, lipoprotein, apoipoprotein i transferyn.

Sekwencje, które mogą kierować rozpuszczalną cząsteczką LT-P-R do konkretnego rodzaju komórki albo tkanki mogą być również przyłączone do domeny wiążącej ligand LT-P-R, tworząc swoiście zlokalizowane rozpuszczalne białko fuzyjne LT-p-R. Wszystkie albo funkcjonalne części regionu zewnątrzkomórkowego LT-P-R (Figura 1) obejmujące domenę wiążącą ligand LT-P-R mogą być poddane fuzji z regionem stałym immunoglobuliny, takim jak domena Fc łańcucha ciężkiego ludzkiej IgGl (Browning i in., J. Immunol., 154:33-46 (1995)). Rozpuszczalne białka fhzyjne receptora z IgG są korzystne, i są powszechnymi odczynnikami immunologicznymi, zaś metody ich konstruowania są znane w stanie techniki (patrz, patent USA nr 5,225,538, załączony tu jako odnośnik).

Funkcjonalna domena wiążąca ligand LT-P-R może być poddana fuzji z domeną Fc immunoglobuliny (Ig) pochodzącą z klasy albo podklasy immunoglobulin innej niż IgGl. Domeny Fc przeciwciał należących do różnych klas albo podklas Ig mogą aktywować inne wtórne funkcje efektorowe. Aktywacja zachodzi gdy domena Fc związana jest przez receptor Fc. Wtórne funkcje efektorowe obejmują zdolność do aktywacji układu dopełniacza, przekraczanie łożyska oraz wiązania różnych białek drobnoustrojów, właściwości różnych klas i podklas immunoglobulin opisano w Roitt i in., Immunology, str. 4.8 (Mosby-Year Book Europe Ltd., wyd. 3, 1993).

Aktywacja układu dopełniacza zapoczątkowuje kaskady reakcji enzymatycznych, które biorą udział w zapaleniu. Produkty układu dopełniacza mają szereg działań, w tym wiązanie bakterii, endocytoza, fagocytoza, cytotoksyczność, wytwarzanie wolnych rodników i rozpuszczalność kompleksów immunologicznych.

Kaskada enzymów dopełniacza może być aktywowana przez domeny Fc przeciwciał IgGl, IgG3 albo IgM. Domena Fc IgG2 wydaje się być najmniej skuteczna, zaś domeny Fc przeciwciał IgG4, IgA, Igd i IgE są nieskuteczne pod względem aktywacji dopełniacza. Tak więc można wybrać domenę Fc w oparciu o to czy wtórne funkcje immunologiczne są pożądane dla konkretnej odpowiedzi odpornościowej albo choroby leczonej białkiem fuzyjnym LT-P-R.

Jeżeli mogłoby być korzystne uszkadzanie albo niszczenie komórek niosących ligand LT, można wybrać szczególnie aktywną domenę Fc (IgCll), tworząc białko fuzyjne LT-p-R-Fc. Alternatywnie, jeżeli byłoby pożądane kierowanie fuzji LT-P-R-Fc na komórki bez wyzwalania układu dopełniacza, powinna być wybrana nieczynna domena Fc IgG4.

Opisano mutacje domen Fc, które zmniejszają albo eliminują wiązanie z receptorem Fc i aktywację dopełniacza (Morrison i in., Annu. rev. Immunol., 10:239-65 (1992)). Można zastosować te i inne mutacje, same i w kombinacji, w celu optymalizacji aktywności domeny Fc stosowanej do konstruowania białka fuzyjnego LT-P-R-Fc.

Wytwarzanie rozpuszczalnego ludzkiego białka fuzyjnego LI—P-R obejmującego sekwencję domeny wiążącej ligand poddaną fuzji z domeną Fc ludzkiej immunoglobuliny (hLT P-R-Fc) opisano w Przykładzie 1. Jedną z wytworzonych linii komórek CHO, z Przykładu 1, która wydzielała hLT-p-R-Fc nazwano „hLTp.-R-hGl CHO# 14”. Próbkę tej linii zdeponowano 21 lip16

186 911 ca 1995 w American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD), według postanowień Traktatu Budapeszteńskiego i oznaczono ją numerem ATCC CRL11965.

Wytwarzanie rozpuszczalnej cząsteczki fuzyjnej mysiego LT-P-R (mLT-P-R-Fc) opisano w Przykładzie 2. Linia CHO wytworzona według Przykładu 2, która wydzielała mLT-P-R-Fc nazwana była „mLTp,-R-hGl CHO#1.3.BB”. Próbkę tej linii zdeponowano 21 lipca 1995 w American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD), według postanowień Traktatu Budapeszteńskiego i oznaczono ją numerem ATCC CRL11964.

Wszystkie ograniczenia dostępności publicznej do depozytów ATCC zostaną niezwłocznie usunięte po udzieleniu patentu na to zgłoszenie.

Różne reszty aminokwasowe tworzące punkt łączenia białka fuzyjnego receptora z Ig mogą zmieniać strukturę, stabilność i aktywność biologiczną rozpuszczalnego białka fuzyjnego receptora LT-p. Jeden lub wiele aminokwasów można dodać na końcu C wybranego fragmentu LT-p-R w celu zmodyfikowania punktu połączenia z wybraną domeną fużyjną.

Koniec N białka fuzyjnego LT-P-R może również być zmieniany przez zmianę pozycji, w której wybrany fragment DNA LT-P-R odcina się na końcu 5' w celu wprowadzenia do rekombinowanego wektora ekspresyjnego. Stabilność i aktywność każdego z białek fuzyjnych może być badana i optymalizowana przy użyciu rutynowych doświadczeń i testów w celu selekcji środków blokujących LT-P-R.

Stosując sekwencje domeny wiążącej ligand LT-P-R w domenie zewnątrzkomórkowej pokazanej na Figurze 1, odmiany sekwencji aminokwasowej mogą być również konstruowane w celu modyfikacji powinowactwa rozpuszczalnego receptora LT-β albo białka fuzyjnego dla ligandu LT. Rozpuszczalne cząsteczki LT-P-R mogą współzawodniczyć o wiązanie ligandu powierzchniowego z endogennymi receptorami powierzchniowymi LT-p. Przewiduje się również, że dowolna cząsteczka rozpuszczalna obejmująca domenę wiążącą ligand LT-p-R jest środkiem blokującym LT-P-R, znajdującym zastosowanie zgodnie z wynalazkiem.

Rozpuszczalne ludzkie białko fuzyjne receptora LT-β i immunoglobuliny (hLT-P-R-Fc) zostało wytworzone według procedur w Przykładzie 1 i badane na zdolność blokowania cytotoksyczności wobec ludzkich komórek HT29. Tablica 1 (Przykład 3) porównuje zdolność białek fuzyjnych rozpuszczalnego receptora LT-β (hLT-P-R-Fc) i receptora TNF (p55-TNF-R-Fc) do blokowania efektów hamujących różnych TNF i rozpuszczalnych ligandów LT wobec wzrostu komórek nowotworowych.

Dane w Tablicy 1 wskazują, że stężenie przy którym rozpuszczalny receptor LT-β (hLTP-R-Fc) może blokować śmierć komórkową wywołaną przez oddziaływanie pomiędzy ligandem LT-al/p2 i receptorom powierzchniowym LT-β o 50%. Zdolność do blokowanie wzrostu komórek nowotworowych o co najmniej 20% identyfikuje ten rozpuszczalny receptor LT-p jako środek blokujący LT-P-R. Jak oczekiwano, rozpuszczalne białko fuzyjne TNF-R (p55TNF-R-Fc) całkowicie blokowało zahamowanie wzrostu wywołane TNF przez wiązanie z TNF i zapobieganie jego oddziaływania z receptorem powierzchniowym. Rozpuszczalne białko fuzyjne TNF-R nie wykazywało efektu na wpływ antyproliferacyjny wywołany ligandem LT (LT-al/p2). W przeciwieństwie, białko fuzyjne Π-β-R blokowało wpływ wywołany ligandem LT, ale nie TNF albo LT-α. Tak więc rozpuszczalne ludzkie białka fuzyjne LT-P-R nie zakłócają aktywacji TNF-R przez TNF i ligandy LT-a.

W celu określenia czy sygnalizacja przez LT-p-R jest również cytotoksyczna wobec komórek nowotworowych myszy, oraz czy rozpuszczalne białka fuzyjne LT-P-R mogą blokować cytotoksyczność wywołaną LT-p-R, wykonano podobny eksperyment na myszach. Rozpuszczalne mysie białko fuzyjne LT-P-R-Fc (mLT-[P-RT'C; patrz Przykład 2) badano na jego zdolność do blokowania śmierci mysich komórek WEłH 164 traktowanych ligandem LT (Przykład 4).

Figura 2 pokazuje wpływ rozpuszczalnego mysiego LT-P-R-Fc (mLT-P-R-Fc) na sygnalizację przez LT-P-R wywołaną ligandem LT w mysich komórkach WEHI 164. Jak pokazuje to test, komórki WEHI 164 są niszczone przez traktowanie rozpuszczalnym ligandem LT-al/p2. Dodanie mLT-P-R-Fc blokuje śmierć komórek wywołaną ligandem LT. Kontrolne białko fuzyjne receptora TNF (p55TNF-R-Fc) wykazywało niewielki wpływ na blokowanie śmierci komórek.

186 911

Dane te pokazują, że rozpuszczalne białko fuzyjne LT-P-R może skutecznie współzawodniczyć z cząsteczkami powierzchniowymi LT-P-R o wiązanie ligandu LT. Rozpuszczalne białko fuzyjne mLT-P-R-Fc działa więc jako środek blokujący LT-P-R u myszy.

Przeciwciała skierowane przeciwko ludzkiemu receptorowi LT-P (przeciwciała przeciwko LT-P-R) również działają jako środki blokujące LT-P-R. Przeciwciała przeciwko LT-P-R mogą być poliklonalne albo monoklonalne (mAb) i mogą być modyfikowane w celu optymalizacji ich zdolności do blokowania sygnalizacji LT-P-R, ich dostępności biologicznej in vivo, stabilności i innych pożądanych cech.

Surowice poliklonalne skierowane przeciwko ludzkiemu receptorowi LT-p są wytwarzane przy użyciu konwencjonalnych technik przez wstrzyknięcie podskórne zwierzętom, takim jak kozy, króliki, szczury, chomiki albo myszy, białka fuzyjnego ludzkiego receptora LT-P z Fc (Przykład 1) w kompletnym adiuwancie Freund'a, a następnie wstrzyknięcie dawki przypominającej dootrzewnowej albo podskórnej w kompletnym adiuwancie Freund'a. Poliklonalne surowice odpornościowe zawierające pożądane przeciwciała skierowane przeciwko receptorowi LT-P są badane przesiewowo konwencjonalnymi procedurami immunologicznymi.

Mysie przeciwciała monoklonalne (mAb) skierowane przeciwko białku fuzyjnemu ludzkiego receptora LT-P i Fc, są wytwarzane jak to opisano w Przykładzie 5. Linia komórkowa hybrydoma (BD.A8.AB9), która wytwarza mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkim LT-P-R, BDA8, zdeponowano 12 stycznia 1995 w American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD), według postanowień Traktatu Budapeszteńskiego i oznaczono ją numerem ATCC HB11798. Wszystkie ograniczenia dostępności publicznej do depozytów ATCC zostaną niezwłocznie usunięte po udzieleniu patentu na to zgłoszenie.

Różne postacie przeciwciał przeciwko LT-P-R mogą być również wytworzone przy użyciu standardowych technik rekombinacji DNA (Winter i Milstein, Nature 349:193-99 (1991)). Przykładowo, mogą zostać skonstruowane „chimeryczne” przeciwciała, w których domena wiążąca antygen z przeciwciała zwierzęcego jest połączona z ludzką domena stałą (np. Cabilly i in., US 4,816,567; Morrison i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-55 (1984)) Przeciwciała chimeryczne zmniejszają obserwowaną odpowiedź odpornościową wywoływaną przez przeciwciała zwierzęce, podczas stosowania w ludzkim leczeniu klinicznym.

Oprócz tego, mogą być syntetyzowane rekombinowane „przeciwciała humanizowane” które rozpoznają LT-P-R. Przeciwciała humanizowane są chimerami obejmującymi większość sekwencji ludzkiej IgG, w której wprowadzono region odpowiadający za swoiste wiązanie antygenu (np. WO 94/04679).

Zwierzęta immunizuje się pożądanym antygenem, izoluje się odpowiednie przeciwciała i usuwa się z nich część sekwencji regionu zmiennego odpowiedzialnego za wiązanie antygenu. Następnie uzyskany ze zwierzęcia region wiążący antygen klonuje się w odpowiednim położeniu w genach ludzkiego przeciwciała, w których usunięto miejsce wiązania antygenu. Przeciwciała humanizowane minimalizują zastosowanie sekwencji heterologicznych (międzygatunkowych) w przeciwciałach ludzkich i raczej nie wywołują odpowiedzi odpornościowej u leczonych osobników.

Konstruowanie różnych klas rekombinowanych przeciwciał przeciwko LT-P-R może być również osiągnięte przez wytwarzanie przeciwciał chimerycznych albo humanizowanych obejmujących domeny zmienne przeciwko LT-p-R i ludzkie domeny stałe (CHI, CH2 i CH3) izolowane z różnych podklas immunoglobulin. Przykładowo, przeciwciała IgM przeciwko LT-p-R o podwyższonej wartościowości miejsc wiązania może być wytworzone rekombinacyjnie przez klonowanie miejsca wiązania antygenu do wektorów niosących ludzkie regiony stałe łańcucha μ (Arulanandam i in., J. Exp. Med., 177:1439-50 91993); Lane i in., Eur. J. Immunol., 22:2573-78 (1993); Trauneckeri in., Nature 339:68-70 (1989)).

Oprócz tego, standardowe techniki rekombinowanego DNA mogą być zastosowane aby zmienić powinowactwa rekombinowanych przeciwciał do ich antygenów, przez zmianę reszt aminokwasowych w sąsiedztwie miejsc wiązania antygenu. Powinowactwo wiązania antygenu przeciwciał humanizowanych może być zwiększone przez mutagenezę w oparciu o modelowanie molekularne (Queen i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-33 (1989); Wo 94/04679).

186 911

Może być pożądane zwiększenie albo zmniejszenie powinowactwa przeciwciał przeciwko LT-f-R do LT^-R, zależnie od docelowego rodzaju tkanek albo konkretnych przewidywanych schematów leczenia. Przykładowo, może być korzystne leczenie pacjenta stałym poziomem przeciwciał przeciwko LT-p-R o zmniejszonej zdolności do sygnalizacji przez szlak LT-β dla celów semi-profilaktycznych. Podobnie, hamujące przeciwciała przeciwko LT-P-R o zwiększonym powinowactwie mogą być korzystniejsze w krótkotrwałym leczeniu.

Przeciwciała przeciwko LT^-R, które działają jako środki blokujące LT-P-R mogą być wyselekcjonowane przez badanie ich zdolności do hamowania cytotoksyczności wobec komórek nowotworowych wywołanej LT^-R (Przykład 5).

Niniejszym opisano również przeciwciało monoklonalne przeciwko LT^-R, BDA8. Figura 3 pokazuje że BDA8 działają jako środki blokujące LT-P-R jak to zdefiniowano w wynalazku. Komórki nowotworowe WiDr przestają rosnąć w obecności IFN-y i rozpuszczalnego ligandu LT-(xl/^2. Przeciwciała kontrolne nie wykazują wpływu na to zahamowanie wzrostu.

W przeciwieństwie, przeciwciała przeciwko LT^-R, BDA8, blokują zdolność rozpuszczalnego ligandu LT-al/ji2 do hamowania wzrostu komórek WiDr. Tak więc przeciwciało skierowane przeciwko ludzkiemu LT^-R może działać jako środek blokujący LT^-R.

Przez badanie innych przeciwciał skierowanych przeciwko ludzkiemu receptorowi LT-β, oczekuje się, że można zidentyfikować dodatkowe przeciwciała przeciwko LT^-R, które działająjako środki blokujące LT-ji-R u ludzi stosując rutynowe doświadczenia i opisane tu testy.

Przeciwciała skierowane przeciwko ligandowi LT również mogą działać jako środki blokujące LT-[LR. Jak to opisano wyżej dla przeciwciał przeciwko Ι.Τ-β-Κ, przeciwciała przeciwko ligandowi LT, które działają jako środki blokujące LT-P-R mogą być poliklonalne albo monoklonalne, i mogą być modyfikowane według rutynowych procedur w celu modulowania ich zdolności wiązania antygenu i ich immunogenności.

Przeciwciała przeciwko LT mogą być wywołane przeciwko jednej z dwóch podjednostek LT osobno, w tym przeciwko rozpuszczalnym, zmutowanym, zmienionym i chimerycznym postaciom podjednostki LT. Jeżeli podjednostki LT stosowane są jako antygen, korzystnie są podjednostkami LT-β. Jeżeli stosowane są podjednostki LT-α, powstałe przeciwciała przeciwko LT-α będą wiązały się z ligandem powierzchniowym LT, ale nie będą reagowały krzyżowo z wydzielniczą LT-α albo nie modulowały aktywności TNF-R (w oparciu o testy opisane w Przykładzie 3).

Alternatywnie, przeciwciała skierowane przeciwko homomerycznym (LT-β) albo heteromerycznym (LT-α/β) kompleksom obejmującym jedną lub wiele podjednostek LT skierowane były przeciwko i badane przesiewowo na aktywność jako środki blokujące LT^-R. Kompleksy ΤΤ-α1/β2 są stosowane jako antygen. Jak to dyskutowano powyżej, korzystne jest aby powstałe przeciwciała przeciwko ΤΤ-α1/β2 wiązały się z powierzchniowym ligandem LT bez wiązania się z wydzielniczą LT-α i bez wpływu na aktywność TNF-R.

Wytwarzanie poliklonalnych przeciwciał przeciwko ludzkiej LT-α opisane jest w równoległym zgłoszeniu (WO 94/13808). Opisano również przeciwciała monoklonalne przeciwko LT-α i LT-β (Browning i in., J. Immunol., 15-4:33-46 (1995)).

Mysie przeciwciała monoklonalne przeciwko ludzkiej LT-β wytworzono jak to opisano w Przykładzie 6. Linia komórkowa hybrydoma (B9.C9.1), która wytwarza mysie przeciwciała monoklonalne B9 przeciwko ludzkiemu LT-P-R została zdeponowana 21 lipca 1995 w American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD), według postanowień Traktatu Budapeszteńskiego i oznaczono ją numerem ATCC HB11962.

Chomicze przeciwciała monoklonalne przeciwko mysiej LT-α/β wytworzono jak to opisano w Przykładzie 7. Linia komórkowa hybrydoma (BB.F6.1), która wytwarza chomicze przeciwciała monoklonalne BB.F6 przeciwko mysiej LT-α/β została zdeponowana 21 lipca 1995 w American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD), według postanowień Traktatu Budapeszteńskiego i oznaczono ją numerem ATCC HB11963.

Opracowano test oparty na sortowaniu komórek wzbudzanym fluorescencją (FACS), w celu poszukiwania przeciwciał skierowanych przeciwko podjednostkom LT i kompleksom LT,

186 911 które mogą działać jako środki blokujące LT-p-R (Przykłady 6 i 7). W teście tym, rozpuszczalne ludzkie białko fuzyjne IT-p-R-Fc dodano do komórek 11-23 pobudzanych pMa, które wyrażają powierzchniowe kompleksy LT (Browning i in., J. Immunol., 15-4:33-46 (1995)), w obecności rosnących , stężeń badanego przeciwciała. Przeciwciało, które może hamować oddziaływanie receptora LT-β z ligandem o co najmniej 20% jest selekcjonowane jako środek blokujący LT-p-R.

Wyniki tego testu, wykonanego aby zbadać mysie przeciwciała monoklonalne B9 przeciwko LT-β, pokazano na Figurze 4. Figura 4 pokazuje, że przeciwciało monoklonalne B9 przeciwko LT-β może wybiórczo blokować wiązanie rozpuszczalnych białek fuzyjnych LT---R-Fc z ligandem powierzchniowym LT indukowanym na pobudzonych komórkach. Wyniki te potwierdzają, ze przeciwciała skierowane przeciwko podjednostce ligandu LT będą działać jako środki blokujące LT---R.

Test FACS opisany wyżej zastosowano również do badania przeciwciał monoklonalnych wywołanych u chomika przeciwko rozpuszczalnemu kompleksowi mysiej LT-a/p (Przykład 7). Wyniki tego testu wykonanego w celu zbadania chomiczych przeciwciał monoklonalnych BB.F6 przeciwko mysiemu kompleksowi LT-a/p pokazano na Tablicy 2 (Przykład 7). Tablica 2 pokazuje, że BB. F6 przeciwko LT-a/p może skutecznie blokować wiązanie rozpuszczalnych białek fuzyjnych mLT---R-Fc (Przykład 2) z powierzchniowymi ligandami wyrażanymi na mysich komórkach hybrydoma z limfocytów T, a więc jest środkiem blokującym LT---R.

Stosowanie kompleksu LT-a/p raczej zamiast podjednostki LT jako antygenu do immunizacji zwierzęcia może prowadzić do bardziej skutecznej immunizacji, albo może spowodować powstanie przeciwciał o wyższym powinowactwie do ligandu powierzchniowego LT. Przekonujące jest, że przez immunizację kompleksem LT-a/p, można wyizolować przeciwciała, które rozpoznają reszty aminokwasowe na podjednostkach LT-α i LT-p (np. resztach, które tworzą szczelinę LT-a/p). Przez badanie przeciwciał skierowanych przeciwko kompleksom heteromerycznym ludzkiej LT-a/p oczekuje się, że można zidentyfikować dodatkowe przeciwciała przeciwko LT, które działają jako środki blokujące LT---R u ludzi, stosując rutynowe doświadczenia i opisane tu testy'.

Środki blokujące LT---R mogą hamować komórkową reakcję odpornościową zależną od Th 1. Jedną z takich reakcji jest nadwrażliwość typu późnego (DTH; Cher i Mosmann, J. Immunol., 138:3688-94 (1987); patrz również I. Roitt i in., Immunology, str. 22.1-22.12, MosbyYear Book Europę Ltd., wyd. 3 (1993)). DTH jest wywoływana gdy uczulone antygenem limfocyty Thl wydzielają cytokiny po powtórnym zetknięciu się z tym samym antygenem. Cytokiny Thl przyciągają i pobudzają makrofagi, które wyzwalają reakcję zapalną.

Reakcje DTH sklasyfikowano w trzech różnych rodzajach: nadwrażliwość kontaktowa, nadwrażliwość typu tuberkulinowego i reakcje ziaminiakowe. Trzy rodzaje nadwrażliwości (HS) mogą być rozpoznane na podstawie prędkości i właściwości odpowiedzi na obcy antygen, gdy jest on wprowadzany bezpośrednio albo pośrednio na skórę uczulonego osobnika. Reakcję DTH śledzi się przez pomiar prędkości i wielkości obrzęku skóry'.

Reakcje HS typu tuberkulinowego są reakcjami skórnymi, które następują w miejscu wstrzyknięcia obcego antygenu z drobnoustroju, na który uprzednio eksponowano osobnika (np. Mycobacterium tuberculosis albo M. leprae). Te reakcje skórne, które występują po maksimum 48-72 godzinach, są często stosowane do diagnostycznych testów wrażliwości w kierunku uprzednio napotkanych mikroorganizmów (np. skórny test tuberkulinowy). Gdy rozwija się zmiana typu tuberkulinowego, staje się ona zmianą ziaminiakową jeżeli antygen pozostaje w tkance.

Reakcje ziaminiakowe są klinicznie najpoważniejszymi reakcjami DTH ponieważ mogą prowadzić do wielu stanów patologicznych związanych z chorobami zależnymi od limfocytów Thl. Reakcje ziaminiakowe występują gdy antygeny albo kompleksy immunologiczne nie zostaną usunięte z makrofagów i w sposób ciągły pobudzają wydzielanie cytokin Thl. Przewlekły stan zapalny i agregacja pobudzonych makrofagów w miejscu bodźca charakteryzuje reakcję ziaminiakową.

Rdzeń komórek nabłonkowatych i makrofagów, które mogą być również otoczone przez limfocyty i złogi włókniste, tworzą twardą strukturę zwaną ziaminiakiem. Czasami w rdzeniu

186 911 ziaminiaka występuje silne zamieranie komórek (np. w zajętej ziaminiakami tkance płuc). Twardnienie w tkance zajętej reakcją ziaminiakową następuje po około 4 tygodniach.

Środki, które wpływają na częstość tworzenia ziaminiaków mogą być zidentyfikowane przy użyciu myszy zarażonych nicieniami schistosoma (Amiri i in., Nature 356:604-607 (1992)). Robaki schistosoma powodują chorobę pasożytniczą prowadzącą do tworzenia ziaminiaków wokół jaj schistosoma złożonych w żyłkach wrotnych zakażonej wątroby. Środki hamujące tę odpowiedź DTH zależną od Thl mogą zmniejszyć wielkość ziaminiaka albo częstość albo prędkość tworzenia ziaminiaka w wątrobach zakażonych myszy. Reakcja komórkowa na jaja schistosoma może być oceniona przez obliczenie liczby i wielkości ziaminiaków powstałych w organizmie myszy leczonych rosnącymi stężeniami domniemanego środka blokującego LT-P-R w czasie.

Nadwrażliwość kontaktowa (CHS) jest klasą DTH, w której narządem docelowym jest skóra. W CHS reakcja zapalna spowodowana jest przez miejscowe zastosowanie haptenu na skórę. Alergeny zwykle zawierają przynajmniej jedną cząsteczkę haptenu, która jest zwykle zbyt mała aby być antygenowa sama przez się. Hapten penetruje do naskórka i reaguje z białkami normalnie występującymi w skórze tworząc nowy kompleks antygenowy.

Ponowna ekspozycja uczulonego osobnika na hapten wyzwala reakcję DTH. Koniugat haptenu z białkiem, w kombinacji z komórkami prezentującymi antygen, aktywuje mechanizmy efektorowe, które wyzwalają uwolnienie cytokin (w tym IL-2, IL-3, IFN-y i GM-CSF). Kaskada uwolnionych cytokin powoduje proliferację limfocytów T CD4+, zmianę wzorca ekspresji różnych cząsteczek adhezji powierzchniowej i przyciąganie limfocytów - i makrofagów do skóry w miejsce stanu zapalnego. Kaskada cytokin i powstałe rozszerzenie naczyń, naciek komórkowy i obrzęk skóry i naskórka prowadzi do zgrubienia i stanu zapalnego tkanki docelowej, co powoduje mierzalne zgrubienie skóry w odpowiedzi na reakcje DTH.

Stopień w jakim konkretny hapten uczula osobnika zależy od różnych czynników. Czynniki te obejmują łatwość penetracji haptenu do skóry i reakcji z białkami nośnikowymi tworząc koniugat. Haptenem, który uczula niemal wszystkich osobników jest 2,4-dinitrofluorobenzen (DNFB).

Reakcja CHS skóry na hapten taki jak DNFB jest klasycznym modelem zwierzęcym dla odporności komórkowej. Umiejscowienie tej reakcji CHS na uchu uczulonej myszy umożliwia łatwe, dokładne i powtarzalne obliczenia odpowiedzi odpornościowej zależnej od komórek in vivo, przez zmierzenie grubości ucha. Szczegóły mysiej reakcji CHS i histopatologii reakcji zapalnej wywołanej DNFB opisano w Chisholm i in., Eur. J. Immunol., 23:682-688 (1993).

Zdolność DNFB do wywołania reakcji nadwrażliwości kontaktowej u większości osobników może być zastosowana do identyfikacji środków zmniejszających albo eliminujących te reakcje zapalne związane z reakcjami DTH zależnymi od limfocytów Thl. Rozpuszczalne białko fuzyjne mysiego LT-P-R-Fc skutecznie hamuje odpowiedź nadwrażliwości typu późnego wywołaną DNFB u myszy (Przykład 8). Myszy uczulano wstępnie przez nałożenie DNFB na wnętrze każdej z łap tylnych przez dwa kolejne dni. Pięć dni po początkowym uczuleniu, dawkę niższą niż drażniąca DNFB w roztworze nośnika nałożono na powierzchnię lewego ucha. Roztwór nośnikowy sam nałożono na prawe ucho jako kontrolę.

Myszom wstrzykiwano uprzednio rosnące dawki środka blokującego mLT-P-R-Fc (Przykład 2) dożylnie (Przykład 8). Wstrzykniecie samego bufora PBS albo białka fuzyjnego ludzkiej IgG (LFA3-Fc) służyło jako kontrola negatywna, zaś wstrzyknięcie przeciwciała monoklonalnego przeciwko VLA4 (PS/2), które jak wiadomo hamuje CHS, służyło jako kontrola pozytywna. 24 godziny później mierzono grubości każdego ucha (eksponowanego na DNFB i nie eksponowanego). Zahamowanie obrzęku ucha przez środek blokujący LT-P-R oceniano przez porównanie grup leczonych z ich grupami kontroli negatywnej.

Figura 5 pokazuje, że mUT-P-R-Fc powoduje istotne zmniejszenie obrzęku ucha u myszy traktowanych DNFB w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi traktowanymi DNFB (PBS i LLA3-Lc). Rozpuszczalne LT-p-R może blokować reakcję CHS tak skutecznie jak przeciwciało przeciwko VLA4 (PS/2), które działa przez blokowanie napływu limfocytów do miejsca ekspozycji (Chisholm i in., Eur. J. Immunol., 23:682-88 (1993)).

Dane te pokazują, że rozpuszczalne białko fuzyjne LT-P-R, które działa jako środek blokujący LT-P-R in vitro może również skutecznie hamować odpowiedź odpornościową zależną

186 911 od limfocytów Thl po podaniu zwierzęciu. Środki blokujące LT-P-R zidentyfikowane in vitro mogą być badane przy użyciu testu obrzęku ucha, albo innego testu DTH jak te opisane powyżej, w celu selekcji dodatkowych środków blokujących LT-P-R, które byłyby przydatne do zmniejszania ciężkości odpowiedzi odpornościowych związanych z limfocytami Thl in vivo.

Jak pokazano wyżej, środki blokujące LT-P-R znajdujące zastosowanie w wynalazku mogą hamować mechanizm efektorowy zależny od Thl, jak nadwrażliwość typu późnego (Figura 5). Ta odpowiedź zależna od Thl jest hamowana bez istotnego wpływu na odpowiedzi zależne od Th2. Zróżnicowany wpływ środków blokujących LT-P-R na odpowiedź odpornościową zależną od Thl pokazano przez śledzenie odpowiedzi odpornościowej zależnej od Th2, takiej jak pierwotna odpowiedź przeciwciał i przełączanie izotypów, w obecności środków blokujących LT-P-R.

Myszom wstrzyknięto pięciokrotnie w trakcie dziesięciu dni rozpuszczalne białko fuzyjne LT-P-R (mLT-P-R-Fc, Przykład 2) albo kontrolne białko fuzyjne IgG (LFA3-Fc) albo pozostawiono bez leczenia. Po drugim wstrzyknięciu, wszystkim myszom wstrzyknięto w podstawę ogona 100 |il kompletnego adiuwantu Freund'a zawierającego 100 pg albuminy jaja kurzego. Po 11 dniach analizowano miana pierwotnych przeciwciał swoistych wobec albuminy jaja kurzego przy użyciu ELISA swoistego wobec izotypów IgGl, Igg2a i IgM.

Figura 6 pokazuje wpływ środka blokującego mysi LT-p-R, mLT-P-R-Fc na wytwarzanie surowiczych przeciwciał przeciwko albuminie jaja kurzego u myszy immunizowanych tą albuminą (Przykład 9). Podawanie środka blokującego LT-P-R nie wpływało znacząco na miana pierwotnych przeciwciał przeciwko albuminie jaja kurzego po immunizacji. Dla porównania, zakłócanie sygnalizacji przez receptor CD40 wywołanej przez ligand CD40 całkowicie blokuje swoistą dla antygenu odpowiedź przeciwciał IgG u myszy (Renshaw i in., J. Exp. Med., 180:1889-1900 (1994)). CD40jest inną parą ligand/receptor w rodzinie TNF.

Całkowite wytwarzanie immunoglobuliny i dojrzewanie jest wyraźnie zależne od limfocytów Th2. Jednakże, istnieją dowody, że cytokina Thl, IFN-y, uczestniczy choć nie jest absolutnie niezbędna do przełączania podklasy IgG2a (Huang i in., Science, 259:1742-45 (1993)). Środek blokujący mLT-p-R-Fc nie hamuje przełączania IgG2a w tych doświadczeniach. Możliwe jest, że środki blokujące LT-P-R zastosowane zgodnie z wynalazkiem nie blokują aspektu humoralnego odpowiedzi odpornościowej zależnej od limfocytów Thl. Oprócz tego, nie była zmniejszona odpowiedź proliferacyjna limfocytów pochodzących od myszy leczonych mLT-βR-FC (Przykład 10; Figura 7).

Doświadczenia te wskazują, że terapia oparta na podawaniu środków blokujących LT-P-R nie wpływa negatywnie na zależne od Th2 wytwarzanie przeciwciał jako funkcję odpowiedzi odpornościowej. Normalny wzorzec odpowiedzi przeciwciał pokazany na Figurze 6 również wskazuje, że intensywne leczenie rozpuszczalnym mLT-P-R-Fc nie było toksyczne dla myszy, dalej wskazując na przydatną terapeutycznie naturę kompozycji i sposobów przedstawionych w wynalazku.

Wiele narządowo-swoistych stanów autoagresyjnych wydaje się zachodzić obejmować patologiczną odpowiedź Thl. Dane te podsumowano w Modlin i Nutman, Curr. Opin. Immunology, 5:511-17 (1993); Romagnani i in., Ann. Rev. Immunol., 12:227-57 (1994). Te autoagresyjne choroby narządowe obejmują: stwardnienie rozsiane, cukrzycę insulinozależną, współczulne zapalenie oka, zapalenie jagodowki i łuszczycę.

Cukrzyca insulinozależna jest chorobą autoagresyjną, w której komórki beta wysepek trzustkowych, wytwarzające insulinę, są niszczone przez leukocyty naciekające do wysepek Langerhansa. Cukrzyca rozwija się gwałtownie u noworodków nie otyłych diabetycznych myszy (NOD) przez przeniesienie pobudzonych splenocytów prediabetycznych. Ostatnio, przeniesiono do noworodków myszy NOD limfocyty przypominające Thl albo Th2, jednakże genetycznie spokrewnione. Wyłącznie limfocyty Thl wywołały gwałtowną cukrzycę i niemal u wszystkich biorców (Katz i in., Science, 268:1185-88 (1995)). Wskazuje to, że środki blokujące LT-P-R, które mogą hamować wpływ in vivo reakcji odpornościowej zależnej od limfocytów Thl, powinny być przydatne do leczenia albo zapobiegania cukrzycy insulinozależnej.

Niektóre choroby autoagresyjne, w tym różne zapalenia stawów, są związane z limfocytami Thl. Reumatoidalne zapalenie stawów i zespół Sjogrena obejmują, jak się zdaje, limfo22

186 911 cyty ThO i Thl. W przeciwieństwie, układowy toczeń rumieniowaty (SLE) wydaje się obejmować zaburzoną odpowiedź zdominowaną przez Th0/Th2.

Niektóre przewlekłe choroby zapalne również wydają się obejmować zaburzoną odpowiedź typu Thl, w tym choroba zapalna jelita grubego, sarkoidoza płuc i odrzucanie przeszczepu. Choroba zapalna jelita grubego (IBD) u ludzi obejmuje przynajmniej dwie kategorie: wrzodziejące zapalenie okrężnicy i chorobę Crohn'a. Obie choroby uważa się za powstałe w wyniku immunopatologicznych zaburzeń autoagresyjnych. W niektórych modelach IBD okazało się, że niektóre środki, które blokują odpowiedź Thl mogą blokować rozwój choroby albo jej przebieg (Powrie i in., Immunity 1:553 (1994)). Możliwe, że zahamowanie składnika Thl odpowiedzi odpornościowej powinno mieć dobroczynny wpływ na ludzką IBD. Opisano wiele modeli IBD i podsumowano je w Elson i in., Gastroenterology 109:1344 (1995). Istnieją co najmniej trzy grupy modeli, wywołane chemicznie, wywołane polimerem/drobnoustrojem i immunologiczne wykorzystujące zmutowane myszy.

W jednym z powszechnie stosowanych modeli wywołanych polimerem/drobnoustrojem, do wody pitnej dla myszy dodaje się siarczan dekstranu w celu pogłębienia odpowiedzi odpornościowej na uszkodzenie. Zwierzęta rozwijają zapalenie okrężnicy, które manifestuje się jako rozwolnienie, krew w stolcu, utrata ciężaru ciała i skrócenie okrężnicy z powodu poszerzenia ściany okrężnicy. Model ten wywołuje lewostronne zapalenie okrężnicy i dysplazję nabłonkową, która może prowadzić do raka, co stanowi cechy wrzodziejącego zapalenia okrężnicy.

Drugi model obejmuje przeszczepienie wybranego zestawu limfocytów T CD4+ myszom SCID, tj. myszom pozbawionym limfocytów T i B (Powrie i in., International Immunology 5:1461-1471, 1993; Morrissey i in., J. Exp. Med, 178:237, 1993). Gdy wybrane komórki, zwane CD45RB^hl namnażają się i odtwarzają w myszy SCID, normalne mechanizmy zapobiegające pojawieniu się autoagresyjnych limfocytów T są nieczynne i rozwijają się komórki autoagresyjne. U szczurów, obserwuje się komórki reaktywne w wielu narządach, podczas gdy u myszy występują głównie w jelicie grubym. Środki, które zmieniają sposób w jaki rozwijają się i namnażają komórki autoagresyjne oraz środki które blokują zdolność komórek do atakowania jelita grubego powinny być skuteczne w tym modelu. Ponadto, jeżeli ten model przynajmniej częściowo naśladuje patologiczny rozwój autoagresyjnych komórek układu odpornościowego, leczenie, które blokuje ten model może mieć działanie modyfikujące chorobę u ludzi. W modelu tym, przeciwciała przeciwko TNF potrafią zablokować chorobę (Powrie i in., Immunity 1: 552, 1994) i wykazano, że przeciwciała te są skuteczne w leczeniu choroby ludzkiej (van Dullemen i in., Gastroenterology 109:109, 1995). Tak więc model ten może pokazać, które środki mogą być przydatne terapeutycznie w IBD. Ponadto, ponieważ model CD45RB jest przykładem procesu chorobowego wywołanego przez limfocyty Thl, zaś u szczurów model prowadzi do powstania choroby w wielu narządach, skuteczność LTpR-Ig w tym układzie wskazuje, że LTpR-Ig albo inne sposoby blokowania oddziaływania L-pR z jego ligandem mogą być dobroczynne w wielu pokrewnych chorobach autoagresyjnych.

Ogólnie, bezpośredni udział auto-przeciwciał wobec swoistych limfocytów T nie został określony w tych chorobach autoagresyjnych. Reakcje komórkowe mogą mieć główny udział w patogenezie tych chorób autoagresyjnych uważanych do tej pory za napędzane przede wszystkim przeciwciałami, np. różnych zapaleniach stawów.

Normalna odpowiedź odpornościowa na niektóre patogenne czynniki zakaźne również wywołuje odpowiedź Thl, która staje się nadmierna i stanowi sama przez się problem medyczny. Przykłady reakcji ziaminiakowych (rodzaju reakcji DTH opisanych wyżej), które prowadzą do ciężkich problemów medycznych obejmują trąd, tworzenie ziaminiaków w płucach pacjentów z gruźlicą, sarkoidozę i zakażenie schistosoma (Roitt i in., Immunology, str. 22.5-6 (Mosby-Year Book Europe Ltd., wyd. 3, 1993)). Wydaje się, że łuszczyca jest również wywoływana przez limfocyty Thl.

Limfocyty T cytolityczne, tj. CTL (limfocyty T CD8-pozytywne) mogą być podzielone na populacje przypominające Thl i Th2. Stąd możliwe jest, że większość tego co wiadomo o grupach Th odnosi się również do limfocytów CD8+, które są głównie związane z reakcjami przeciwwirusowymi i odrzucanie przeszczepu.

186 911

Kompozycje zawierające czynniki, które blokują sygnalizację przez receptor limfotoksyny-β powinny być podawane w skutecznych dawkach do leczenia konkretnego stanu klinicznego. Określenie korzystnej farmaceutycznie postaci i skutecznego terapeutycznie schematu dawkowania dla danego zastosowania leży w zakresie biegłości w dziedzinie, przykładowo, stan i ciężar pacjenta, nasilenie pożądanego leczenia i tolerancja pacjenta na leczenie. Oczekuje się, że dawki około 1 mg/kg rozpuszczalnego LT-P-R są odpowiednimi punktami wyjścia do optymalizacji dawki leczniczej.

Określenie dawki skutecznej terapeutycznie może być również osiągnięte przez wykonanie doświadczeń in vitro, które mierzą stężenie środka blokującego LT-P-R wymaganego do opłaszczenia komórek docelowych (komórek LT-P-R- albo ligand LT-pozytywnych zależnie od środka blokującego) przez 1 do 14 dni. Opisane tu testy wiązania receptora z ligandem mogą być zastosowane do śledzenia reakcji opłaszczania komórek. Komórki LT-P-R- albo LTpozytywne mogą być oddzielone od pobudzonych limfocytów przy użyciu FACS. W oparciu 0 wyniki testów in vitro, można wybrać szeroki zakres stężeń środków blokujących LT-p-R do badania na zwierzętach w oparciu o opisane tu testy.

Podawanie rozpuszczalnych cząsteczek LT-P-R, przeciwciał przeciwko ligandowi LT i LT-P-R, samych albo w kombinacji, w tym izolowanych i oczyszczonych postaci przeciwciał albo kompleksów, ich soli albo pochodnych dopuszczalnych farmaceutycznie, może być osiągnięte przy użyciu dowolnego z konwencjonalnych sposobów podawania środków wykazujących aktywność immunosupresyjny.

Kompozycje farmaceutyczne zastosowane w tym leczeniu mogą być w różnych postaciach. Obeemują one przykładowo, stałe, półstałe i ciekłe postacie dawkowania, takie jak, tabletki, pigułki, proszki, roztwory ciekłe i zawiesiny, czopki i roztwory do wstrzyknięć i wlewów. Konkretne postacie zależą od zamierzonego sposobu podawania i zastosowania terapeutycznego. Sposoby podawania mogą obejmować podawanie doustne, pozajelitowe, podskórne, dożylne, domiejscowe albo miejscowe.

Rozpuszczalne cząsteczki LT-P-R, przeciwciała przeciwko ligandowi LT i LT-P-R mogą być, przykładowo, umieszczone w sterylnych, izotonicznych postaciach dawkowania, z lub bez kofaktorów ułatwiających wychwyt albo stabilność. Postać jest korzystnie płynna albo może być liofilizowanym proszkiem. Przykładowo, rozpuszczalne cząsteczki LT-P-R, przeciwciała przeciwko ligandowi LT i LT-p-R mogą być rozcieńczone buforem zawierającym 5,0 mg/ml monohydratu kwasu cytrynowego, 2,7 mg/ml cytrynianu trisodu, 41 mg/ml mannitolu, 1 mg/ml glicyny i 1 mg/ml polisorbate 20. Roztwór może być liofilizowany, przechowywany w zamrożeniu i odtworzony przed podaniem sterylną wodą do wstrzyknięć (USP).

Kompozycje powinny również korzystnie zawierać konwencjonalne dopuszczalne farmaceutycznie nośniki dobrze znane w stanie techniki (patrz, przykładowo Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd. 16, 1980, Mac Publishing Company). Takie dopuszczalne farmaceutycznie nośniki mogą obejmować inne środki medyczne, nośniki, nośniki genetyczne, adiuwanty, zarobki itp., takie jak albumina surowicy ludzkiej albo preparaty osocza. Kompozycje mogą być w postaci dawek jednostkowych, które mogą być podawane raz albo wiele razy dziennie.

Kompozycje farmaceutyczne mogą być podawane w postaci mikrosfer, liposomów albo układu podawania drobnocząsteczkowego albo w preparatach do przedłużonego uwalniania umieszczonych, w pobliżu albo w innym połączeniu z zajętą tkanką albo w krwiobiegu. Odpowiednie przykłady nośników do przedłużonego uwalniania obejmują półprzepuszczalne matryce polimerowe w postaci ukształtowanych artykułów takich jak czopki albo mikrokapsułki. Możliwe do wszczepienia albo mikrokapsułkowe matryce do przedłużonego uwalniania obejmują polilaktydy (opis patentowy USA nr 3,773,319; EP 58,481), kopolimery kwasu L-glutaminowego ietylo-Lglutaminianu (Sidman i in., Biopolymers 22:547-56 (1985); poli(2-hydroksyetylo-metakrylan) albo etylenooctan winylu (Langer iin., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981); Langer Chem. Tech., 12:98-105 (1982)).

Liposomy zawierające rozpuszczalne cząsteczki LT-p-R, przeciwciała przeciwko ligandowi LT i LT-P-R same albo w kombinacji mogą być wytworzone znanymi sposobami (patrz, DE 3,218,121; Epstein i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, str. 4030-34 (1980); opis patento24

186 911 wy USA nr 4,485,045 i 4,544,545). Zwykle liposomy są typu małych (200-800 Aengstromów) jednobłonowych pęcherzyków, w których zawartość lipidu jest większa niż około 30% (mol.) cholesterolu. Proporcja cholesterolu jest dobrana w celu kontrolowania optymalnej prędkości uwalniania rozpuszczalnej cząsteczki LT-P-R, przeciwciała przeciwko ligandowi LT i LT-P-R.

Rozpuszczalna cząsteczka LT-P-R, przeciwciało przeciwko ligandowi LT i LT-P-R mogą być również przyłączane do liposomów zawierających środek blokujący LT-P-R, lek immunosupresyjny albo cytokiny w celu modulowania aktywności blokowania LT-P-R. Przyłączanie cząsteczek LT-P-R, przeciwciał przeciwko ligandowi LT i LT-P-R do liposomów można osiągnąć dowolnym znanym środkiem sieciującym takim jak środki sieciujące heterobifunkcjonalne, które szeroko stosuje się do sprzęgania toksyn albo środków chemoterapeutycznych do przeciwciał w celu ukierunkowanego podawania. Sprzęganie z liposomami może być również osiągnięte przy użyciu odczynnika sieciującego hydrazydu kwasu 4-(4-maleimidofenylo)masłowego (MPBH) (Duzgunes i in., J. Cell. Biochem. Abst. Suppl. 16E 77 (1992)).

Środki blokujące LT-P-R są zdolne do wybiórczego hamowania mechanizmów efektorowych odporności zależnych od limfocytów Thl, ale nie od Th2. Środki blokujące LT-P-R są przydatne do leczenia stanów, które są zaostrzane przez aktywność cytokin typu Thl (np. IL-2 i IFN-y). Ponieważ cytokiny Thl mogą hamować reakcje zależne do limfocytów Th2, środki blokujące LT-P-R mogą również pośrednio pobudzać pewne reakcje zależne od limfocytów Th2, które są normalnie hamowane przez kaskady cytokin wywołanych przez Thl.

Zdolność do wybiórczego tłumienia odpowiedzi limfocytów Thl (albo pośrednio pobudzania Th2) powinna być przydatna do leczenia zaburzeń w różnych komórkowych reakcjach odpornościowych, w tym różnych stanów autoagresyjnych i przewlekłych stanów zapalnych, tolerancji na antygen i komórkowych mechanizmów odrzucania przeszczepu tkankowego i narządowego.

Jak to dyskutowano powyżej, leczenie stanów odporności zależnej od limfocytów Thl zwykle obejmuje podawanie środków immunomodulacyjnych i immunosupresyjnych, które wykazują plejotropowy efekt na różne rodzaje komórek i różne reakcje odpornościowe. Te nieswoiste środki immunosupresyjne są zwykle konieczne w wysokich i często toksycznych dawkach, które wywołują szkodliwe efekty uboczne.

Zdolność do zmiany charakteru odpowiedzi odpornościowej wsparta została ostatnio badaniami nad cukrzycą mysią dyskutowaną powyżej (Katz i in., Science 268:1185-88 (1995)), oraz modelem przeszczepu allogenicznego (Sayegh i in., J. Exp. Med., 181:1869-74 (1995)). W tym ostatnim badaniu wykazano, że białko fuzyjne, które blokowało szlak kostymulacji limfocytów T CD28-B7, wywoływało tolerancję na przeszczep nerki. Tolerancja korelowała z obniżeniem cytokin Thl i wzrostem cytokin Th2 in vivo. Dane te wskazują, że środki blokujące LT-P-R powinny być przydatne do tłumienia komórkowego odrzucania przeszczepów tkankowych i narządowych przez hamowanie uwalniania cytokin przez limfocyty Thl.

Środki blokujące LT-P-R mogą być modyfikowane w celu uzyskania pożądanego poziomu sygnalizacji przez LT-P-R zależnie od leczonego stanu, zaburzenia albo choroby. Przewiduje się, że absolutny poziom sygnalizacji przez ΙΤ-β-R może być precyzyjnie dostrajany przez manipulację stężeniem i powinowactwem środków blokujących LT-P-R do ich celów cząsteczkowych.

Przykładowo, osobnikowi podaje się kompozycję zawierającą rozpuszczalne cząsteczki LT-P-R. Rozpuszczalny receptor LT-P może skutecznie współzawodniczyć z powierzchniowymi receptorami LT o wiązanie z powierzchniowym ligandem LT. Zdolność do współzawodnictwa z powierzchniowymi ligandami LT zależy od względnego stężenia rozpuszczalnych i powierzchniowych cząsteczek LT-P-R oraz ich względnych powinowactw do ligandu.

Rozpuszczalne cząsteczki LT-P-R niosące mutacje zwiększające albo zmniejszające powinowactwo wiązania tych mutantów rozpuszczalnych LT-P-R z powierzchniowym ligandem LT można wytworzyć stosując standardowe techniki rekombinowanego DNA dobrze znane specjalistom w dziedzinie. Liczne cząsteczki o mutacjach kierowanych albo przypadkowych mogą być badane pod względem ich zdolności do działania jako środki blokujące LT-P-R przy zastosowaniu standardowych doświadczeń i opisanych tu technik.

186 911

Podobnie przeciwciała skierowane przeciwko receptorowi LT-β albo jednemu albo wielu podjednostkom ligandu LT działają jako środki blokujące LT-β-Κ. Zdolność tych przeciwciał do blokowania sygnalizacji przez receptor LT-P-R może być modyfikowana przez mutację, modyfikację chemiczną albo innymi sposobami, które mogą zmieniać stężenie skuteczne albo aktywność przeciwciała podawanego osobnikowi.

Zdolność do zmniejszania sygnalizacji LT-P-R bez całkowitego zahamowania może być istotna dla ustalenia albo utrzymania zmniejszonego poziomu sygnalizacji przez LT^-R, która podtrzymuje normalne funkcje odporności, hamując reakcje zależne od limfocytów Thl, które są nadmierne albo nienormalne.

Zniszczenie genu LT-α u myszy prowadzi do zaburzonego rozwoju obwodowych narządów limfatycznych (De Togni i in., Science 264:703-7 (1994)). Myszy takie nie posiadają węzłów chłonnych, zaś ich śledziony pozbawione są wyraźnego odgraniczenia pomiędzy regionami bogatymi w limfocyty T i limfocyty B w grudkach. Uważa się, ze ten fenotyp związany jest z utratą sygnalizacji przez LT-P-R indukowanego przez LT, ponieważ nie obserwowano podobnych fenotypów przy modulowaniu aktywności TNF-R. Zdolność do wybiórczego albo częściowego blokowania szlaku LT-P-R może być więc przydatna w leczeniu nienormalnego rozwoju narządów limfatycznych, związanego z niewłaściwą albo nadmierną ekspresją sygnalizacji przez szlak LT^-R.

Niektóre reakcje związane z Thl są kluczowymi składnikami licznych komórkowych reakcji odpornościowych (Romagnani, Ann. Rev. Immunol., 12:str 227-57 (1994)) zaś całkowite zahamowanie aktywności limfocytów Thl może być niekorzystne w pewnych okolicznościach. Przykładowo, mysz potrafi skutecznie bronić się przed infekcją pasożytniczą, gdy możliwa jest odpowiedź limfocytów Thl. Czynniki zakaźne takie jak Listeria albo Toksoplazma również wywołują silną odpowiedź typu Thl. U ludzi reakcja na Mycobacterium tuberculosis wydaje się opierać na Thl. Patogeneza leishmaniozy koreluje z odpowiedzią podobną jak reakcje Thl scharakteryzowane u myszy (Reed i Scott, Curr. Opin. Immunol., 5:524-31 (1993)).

Zdolność do wpływania na poziom zahamowania Thl przez blokowanie sygnalizacji υΓ-β-R może być istotna dla maksymalizacji korzystnych wyników, które można osiągnąć przez leczenie środkami blokującymi υΓ-β-R.

Poniżej zamieszczono przykłady, które ilustrują rozpuszczalne receptory LT-β, przeciwciała przeciwko ligandowi LT i LT-P-R oraz sposoby stosowane do ich charakteryzacji. Przykłady te nie powinny być uważane za ograniczające. Przykłady zamieszczono w celu ilustracji, zaś wynalazek ograniczany jest jedynie zastrzeżeniami.

Przykład 1

Wytwarzanie rozpuszczalnych ludzkich receptorów LT-β jako białek fuzyjnych z Fc immunoglobuliny.

Sekwencję klonu ludzkiego cDNA wyizolowaną z biblioteki ludzkich sekwencji 12p pochodzących z hybrydy komórek somatycznych (Baens i in., Genomics 16:214-18 (1993)) wprowadzono do GenBank i stwierdzono, że jest to sekwencja kodująca ludzki LT^-R. Sekwencja tego klonu cDNA ludzkiego LT-p-R pełnej długości jest dostępna od 1992 roku jako nr dostępu L04270 GenBank.

Domenę zewnątrzkomórkową LT-P-R do regionu śródbłonowego (Figura 1) amplifikowano przez PGR z klonu cDNA przy użyciu starterów, które wbudowywały miejsca restrykcyjne Notl i Sali na końcach, odpowiednio, 5' i 3' (Browning i in., J. Immunol., 154:33-46 (1995)). Amplifikowany produkt cięto Notl i Sali, oczyszczono i poddano ligacji z wektorem pMDR901 linearyzowanym Notl wraz z fragmentem Notl-Sall kodującym region Fc ludzkiej IgGl. Powstały wektor zawierał gen reduktazy di-hydrofolianowej oraz białko fuzyjne LT^-R napędzane osobnym promotorem.

Wektor wprowadzono przez elektroporację do komórek CHO dhfr i wyizolowano klony oporne na metotreksat procedurami standartowymi. LT-P-R-Fc wydzielane było do pożywki i zastosowano test ELISA do selekcji linii komórkowych wytwarzających najwyższe poziomy białka fuzyjnego. Linie komórkową wytwarzającą znaczne ilości hodowano w znacznej liczbie i zbierano pożywkę uwarunkowaną. Czyste białko fuzyjne receptora LT-β wyizolowano przez chromatografię powinowactwa na kolumnie Sepharose-białko A Fast Flow (Pharmacia).

186 911

Przykład 2

Wytwarzanie rozpuszczalnego mysiego receptora LT-p jako białko fuzyjne z Fc immunoglobuliny. Kompletny klon cDNA mLT-p-R wytworzono przez poddanie ligacji fragmentów 5' Notl/ApaLI i 3' ApaLI/NotI z dwóch częściowych izolatów cDNA w miejscu NotI pCDNA3 (InVitrogen, San Diego, CA). Sekwencja tego klonu cDNA jest dostępna jako nr dostępu L38423 GenBank. Białko fuzyjne rozpuszczalnego mLT-p-R (hIgG1) wytworzono przez amplifikację klonu cDNA mLT-p-R pełnej długości jako matrycy i starterów 5'AaCTGCAGCGGCCGCCATG CGCCTGCCC3' i 5'GACTETGTCGACCAEEGCTCCTGGCTCTGGGGG3'. Amplifikowany produkt oczyszczono i cięto NotI i SaII i poddawano ligaj i z fragmeneem NoIl/SaII Fc k^C^d do linearyzowanego NotI i traktowanego fosfatazą SAB132 tworząc JLB 122. W celu stabilnej ekspresji, kasetę NotI zawierąjącą fragment LE-P-R-Lc przeniesiono do miejsca NotI pMDR901 tworząc pSSH001 po czym wektor przeniesiono do komórek CHO jak to opisano (Browning i in., J. Immunol., 154:33-46 (1995)). Klony komórek wydzielające LE-p-R-Lc zidentyfikowano przez ELISA. Oczyszczone białko fuzyjne izolowano z nadsączu komórek CHO przez kolumnę chromatograficzną Białka A Sepharoza Fast Fkiw.

Przykład 3

Zastosowanie rozpuszczalnego ludzkiego LT-P-R-Lc do blokowania oddziaływania receptor- ligand LT-p.

Rozpuszczalne hLT-p-R-Fc badano na jego zdolność do blokowania wiązania ligandu LT z receptorem LT-p w teście cytotoksyczności komórek nowotworowych, jak to opisano wyżej. W teście tym, rozpuszczalna postać ligandu LT (hLT-a1/p2), która aktywuje sygnalizację przez LT-p-R stosuje się do zabijania komórek nowotworowych. Inhibitory sygnalizacji LT-p R potrafią zmniejszać cytotoksyczność wobec komórek nowotworowych. Rozpuszczalne ligandy FT-al/[ł2 obejmują okrojone albo zmodyfikowane podjednostki LT-p pozbawione funkcjonalnej domeny śródbłonowej. Rozpuszczalne ligandy LT-a1/p2 wiążą. się i pobudzają sygnalizację LT-p-R jak również postaci powierzchniowe liganu LT (Browning i in., I. Immunol., 154:33-46 (1995)). Szeregowe rozcieńczenia hLT-a1/p2, hTNF albo hLT-α wykonano w 0,05 ml w płytkach 96studzienkowych i dodano 5000 trypsynizowanych komórek HT29 (ATCC) w 0,05 ml pożywki zawierającej 80 U/ml (jednostek przeciwwirusowych) huIFN-γ. Po 4 dniach, mitochondrialna redukcję barwnika MIT mierzono w następujący sposób: 10 pl MTT dodano i po 3 godzinach zredukowany barwnik rozpuszczono w 0,09 ml izopropanolu z 10 mM HCl i mierzono gęstość optyczną przy długości 550 nm. Rozpuszczalna postać receptora albo czyste ludzkie IgG dodano w 10 pl przed dodaniem komórek dając stężenie 5 pg/ml.

Tabela 1 porównuje zdolność chimer hLT-p-R-Fc i p55-ENL-R-Lc (z ludzkim IgG jako kontrolą) do blokowania efektów hamujących różnych rozpuszczalnych ligandów TNF i LT na wzrost komórek nowotworowych HT29. '

Tabela 1

Zdolność białek fuzyjnych LT-P-R i póó-TNF-R z immunoglobuliną do blokowania hamującego wpływu różnych ligandów TNF albo LT na wzrost HT29.

Stężenie środka cytotoksycznego (ng/ml) powodujące 50% zahamowanie wzrostu w obecności a

środka cytotoksycznego	kontroli hu-IgG	β55-ENL-R-Fc	LT-p-R-Fc
TNF	0,08	>10b	0,08
LT-a	3	>1000	3
LT-a 1/(32	5	5	>200

a Każdy ze środków cytotoksycznych mieszano uprzednio z białkiem fuzyjnym Ig 10 minut przed dodaniem do komórek. Stężenie końcowe białka fuzyjnego wynosiło 5 pg/ml ^b Najwyższego stężenia nie badano

186 911

Dane na Tablicy 1 wskazują, że rozpuszczalne białko fuzyjne LT-P-R (hLT-p-R-Fc) może skutecznie blokować oddziaływanie pomiędzy ligandem LT (ΤΤ-α1/β2) i receptorami LT-β na powierzchni komórki, a więc jest środkiem blokującym LT-P-R. Jak oczekiwano, rozpuszczalne białko fuzyjne TNF-R (p55-TNF-R-Fc) całkowicie blokowało zahamowanie wzrostu wywołane TNT, przez związanie TNF i uniemożliwienie oddziaływania z receptorami powierzchniowymi TNF. Rozpuszczalny receptor TNF nie wykazuje efektu na działanie antyproliferacyjne wywołane ligandem LT. W przeciwieństwie, ΙΤ-β-R-Fc blokowało efekty cytotoksyczne wywołane ligandem LT, ale nie wywołane TNF albo LT-a. Rozpuszczalne białka fuzyjne LT-P-R nie zakłóca aktywacji TNF-R przez TNF albo ligandy LT-a.

Przykład 4

Zastosowanie rozpuszczalnego mysiego LT-p-R-Fc do blokowania oddziaływania mysiego receptora LT-β z ligandem.

Rozpuszczalny mysi receptor LT-β sprzęgnięty z domeną Fc ludzkiego IgGl (mLT-P-R-Fc; patrz, Przykład 2) badano na jego zdolność do blokowania oddziaływania receptora LT-β z ligandem u myszy przy użyciu testu cytotoksyczności na komórkach mysich (Figura 2). Test cytotoksyczności wykonano na komórkach WEHI 164 stosując zasadniczo taką samą procedurę co w teście z komórkami HT29 opisanym w Przykładzie 3 (patrz, Browning i Ribolini, J. Immunol., 143:1859-67(1989)).

Figura 2 pokazuje wpływ mLT-P-R-Fc na sygnalizację przez LT-P-R wywołaną ligandem w komórkach WEHI 164. Jak pokazuje test, komórki wEHi 164 są niszczone przez działanie na nie ligandem LT-α/β w stężeniach od około 1 do 100 ng/ml. Rozpuszczalne mLT-P-R-Fc (10 μ/ml) blokuje śmierć komórkową wywołaną ligandem LT. Dodanie rozpuszczalnego mysiego białka fuzyjnego p55-TNF-R-Fc albo przeciwciał kontrolnych IgG (po 10 μ/ml) nie miało wpływu albo miało niewielki wpływ na blokowanie śmierci komórek. Dane te pokazują, że białko fuzyjne mLT-P-R-Fc może skutecznie współzawodniczyć z powierzchniowymi cząsteczkami LT-P-R o wiązanie ligandu LT. Dane te pokazują również, że cytotoksyczność wywołana LT-μ/β zachodzi przez LT-P-R i może być zahamowana przez rozpuszczalne mLTβ-R-Fc, które dziaiająjako środki blokujące LT-P-R.

Przykład 5

Zastosowanie przeciwciał przeciwko ludzkiemu LT-P-R do blokowania oddziaływania receptora LT-β z ligandem.

Mysie przeciwciała monoklonalne (mAb) skierowane przeciwko ludzkiemu receptorowi LT-β wytworzono przez dootrzewnową immunizację myszy RBF powtarzanymi wstrzyknięciami białka fuzyjnego hLT-P-R-Fc pochodzącego z komórek CHO, sprzęgniętego z perełkami Sepharozy - białka A pod nieobecność adiuwantu. Zwierzętom podano końcową dawkę przypominającą rozpuszczalnego mLT-P-R-Fc, i.p i i.v., splenocyty poddano fuzji w oparciu o klasyczny protokół i poszukiwano nadsączy hybrydoma przy użyciu testu ELISA (Ling i in., J. Interferon and Cytokine Res., 15:53-59 (1995)). Nadsącze hybrydoma przeszukiwano dalej w kierunku ich zdolności do blokowania wiązania aktywowanych komórek hybrydoma 11-23, które wyrażają na powierzchni LT-o1/P2, z płytkami pokrytymi LT-p-R-Fc w teście panningu komórkowego, czyste mAb wytworzono przez oczyszczanie na Sepharozie z białkiem A (Pharmacia) IgG z nadsączu hodowlanego. W celu określenia, czy mAb przeciwko receptorowi LT-β może blokować sygnalizację LT-p-R przez wiązanie z rozpuszczalnym LT, test cytotoksyczności komórek nowotworowych wykonano stosując komórki raka WiDr. W teście cytotoksyczności, szereg rozcieńczeń LT-al/p2 wytworzono w 0,05 ml w płytce 96-studzienkowej i dodawano po 10 (il roztworu 100 pg/ml zawierającego kontrolne mysie mAb IgGl albo mAb przeciwko receptorowi LT-β. 5000 trypsynizowanych komórek WiDr (ATCC) dodano do każdej ze studzienek w 0,05 ml pożywki zawierającej 50 U/ml (jednostki przeciwwirusowe) hu-IFN-γ. Po 4 dniach, mitochondrialną redukcję barwnika MTT mierzono w następujący sposób: 10 pl MTT dodano i po 3 godzinach zredukowany barwnik rozpuszczono w 0,09 ml izopropanolu z 10 mM HC1 i mierzono gęstość optyczną przy długości 550 nm. Ilość purpurowego zabarwienia jest proporcjonalna do ilości komórek.

Figura 3 pokazuje, że mAb BDA8 przeciwko Lt-P-R działa jako środek blokujący LT-P-R. Ludzkie komórki raka WiDr przestawały rosnąć w obecności iFN-y i rozpuszczalnego ligandu

186 911

LT-al/p2 (od 0,05 do 50 ng/ml). Przeciwciało kontrolne IgGl (10 pg/ml) nie wykazywało wpływu na zahamowanie wzrostu. W przeciwieństwie, mAb BDA8 przeciwko LT-P-R (10 pg/ml) przywracało zdolność komórek WiDr do wzrostu w obecności rozpuszczalnego ligandu LT-al/p2.

Przykład 6

Zastosowanie przeciwciał przeciwko ludzkiej LT-P do blokowania oddziaływania receptora z ligandem mAb przeciwko ludzkiej LT-P wytworzono przez immunizowanie myszy RBF perełkami Sepharozy-białka A z 9E10-rLT-(P zawierającymi około 1-2 pg ludzkiego rekombinowanego LT-P w CFA, a następnie dawką przypominającą tego samego materiału w IFA. 8 tygodni później myszom podano i.v. 30 ng oczyszczonego rozpuszczalnego rLT-P (eluowane kwasem z żywicy 9E10) i 20 (ig tego samego rozpuszczalnego materiału w 2 dni później. Dzień po drugiej dawce przypominającej, splenocyty poddano fuzji stosując klasyczne protokoły w celu wytworzenia mAb. Nadsącza hybrydoma badano przesiewowo przy użyciu ELISA albo FACS, znakując komórki Π-23 pobudzone PMA. Czyste mAb wytworzono przez oczyszczenie na kolumnie Sepharoza-białko A Fast Flow z nadsączy hodowlanych (Pharmacia).

Test FACS zastosowano w celu selekcji przeciwciał skierowanych przeciwko LT-P, które mogły skutecznie blokować wiązanie rozpuszczalnego ligandu LT-a/p z receptorami LT-P na powierzchni komórki, naśladując oddziaływanie in vivo. W tym teście rozpuszczalne ludzkie LT-P-R-Fc (2 pg/ml) poddano wiązaniu z ligandem powierzchniowym LT na pobudzanych PMA komórkach --23 (Browning i in., J. Immunol., 154:33-46 (1995)) w obecności rosnących stężeń badanego przeciwciała przeciwko LT-P (0,02-20 pg/ml). Komórki płukano zaś związane LT-p-R-Fc wykrywano przez reakcję z oślimi przeciwciałami przeciwko ludzkim IgG znakowanymi fikoerytryną. Ilość związanego znacznika fluorescencyjnego oznaczano analizą FACS i wykreślano średnie natężenie fluorescencji.

Figura 4 pokazuje wyniki testu FACS, który mierzy zdolność przeciwciała B9 przeciwko LT-P do blokowania oddziaływania receptor ligand LT-P jak to opisano wyżej. Doświadczenie to pokazuje, że B9 przeciwko LT-P (0,02-5 pg/ml) może swoiście i skutecznie współzawodniczyć z rozpuszczalnym białkiem fuzyjnym LT-P-R (2 pg/ml) o wiązanie z ligandem powierzchniowym LT, a więc kwalifikuje się jako środek blokujący LT-P-R.

Przykład 7 .

Zastosowanie przeciwciał przeciwko mysiej LT-a/p do blokowania oddziaływania receptora z ligandem.

Rozpuszczalne mysie kompleksy LT-a/p wytworzono, jak opisano wyżej dla ludzkich rozpuszczalnych kompleksów LT-a/p.

Rozpuszczalne mysie podjednostki LT-P wytworzono w oparciu o informację o sekwencji opisaną uprzednio (Lawton i in., J. Immunol., 154:239-46 (1995)). Rozpuszczalne mysie kompleksy LT-a/p poddano ekspresji przy użyciu układu ekspresyjnego bakulowirusa/komórek owadzich i izolowano kompleksy LT-a/p przez chromatografię powinowactwa przy użyciu kolumn z ludzkim p55 TNF-R i LT-P-R zasadniczo jak to opisano wyżej dla ekspresji i oczyszczania ludzkich kompleksów LT-a/p. Chomiki armeńskie immunizowano oczyszczonym mysim kompleksem LT-a/p jak to opisano w Przykładzie 6. Splenocyty chomoków poddano fuzji z mysią linią hybrydoma P3X jak to opisano (Sanchez-Madrid i in., Methods in Enzymology, 121:239-44 (1986)). Hybrydoma pogrupowano jako przeciwko mLT-P i przeciwko mLT-a w oparciu o ich charakterystyki wiązania z kompleksem LT-a/p albo z samą LT-α. Komórki hybrydoma namnożono i oczyszczono przeciwciała z nadsączy hodowlanych stosując chromatografię powinowactwa z białkiem A (Pharmacia).

W celu określenia, czy chomicze mAb przeciw-mysie przeciwko LT-α i LT-P mogą blokować wiązanie ligandu LT z mLT-P-R, zastosowano komórki TIMI-4 (ATCC), mysią linię limfocytów T, które wyraża powierzchniowy ligand LT po aktywacji PMA przez 7 godzin. Chomicze mAb przeciwko mLT-a albo mLT-p inkubowano z komórkami przez 30 minut w4°C a następnie płukano dwukrotnie. Płukane komórki inkubowano z 1pg/ml mLT-P-R-Fc w 4°C. Po 30 minutach komórki płukano z niezwiązanego mL-T-P^-R-Fc i inkubowano przez 30 minut z 10 pg/ml oślego przeciwciała przeciwko ludzkim IgG znakowanego fikoerytryną w celu

186 911 wykrycia związanego mLT-e-R-Fc. Ilość związanego znacznik fluorescencyjnego określano analiząFACS i obliczano średnie natężenie fluorescencji.

Stosując tę analizę stwierdzono, że chomicze mAb przeciwko mLT-e-R mogą skutecznie blokować wiązanie rozpuszczalnego receptora LT-β z powierzchniowym ligandem LT na limfocytach T. Wyniki przedstawiono na tabela 2.

Tabela 2

Zdolność przeciwciała monoklonalnego przeciwko mysiemu LT-β do hamowania wiązania mLT-e-R-Fc z mysim ligandem powierzchniowym LT.

	przeciwko mLT-β (BB.F6)	przeciwko mLT-α (AF.B3)
Stęż. mAb (pg/ml)	MFCI b	% zaham.c	MFCI b	% zaham.c
0	6		6
0	85	0	85	0
0,01	71	18	84	2
0,03	67	23	86	0
0,1	51	44	86	0
0,3	36	62	84	2
1,0	29	71	89	0
3,0	17	86	88	0
10,0	11	94	95	0
30,0	10	95	94	0
100,0	8	98	92	0

a bez dodania receptora ^b średni fluorescencja kanał nr c procent zahamowania

Przykład 8

Środki blokujące Ι.Τ-β-1< hamują kontaktową nadwrażliwość zależną od Th1 u myszy.

g samice myszy Balb/c (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) uczulano przez nałożenie 25 pl 0,5% 2,4-dinitrofluorobenzenu (DNBF) w mieszaninie 4:1 acetonu i oliwy na wnętrze każdej z łap tylnych. 24 godziny później ponownie uczulano każdą z myszy 25 pl tego samego roztworu. Uczulanie przeprowadzano na myszach nie znieczulonych. Dnia 5 (120 godzin po początkowym uczulaniu), myszy znieczulono dootrzewnowo mieszaniną 90:10 mg/kg ketaminy:ksylazyny i nałożono dawkę niższą niż drażniąca 10 pl 0,2% DNFB na powierzchnie brzuszną i grzbietową lewego ucha. Prawe ucho otrzymało podobną dawkę nośnika, mieszaniny 4:1 acetonu:oliwy.

Cztery godziny po ekspozycji, podawano rosnące dawki mLI^-R-Fc (0,08-5,0 mg/kg; Przykład 2) w 0,1 ml roztworu soli buforowanym fosforanem (PBS) przez wstrzykniecie dożylne. Wstrzyknięcia samego buforu PBS albo 20 mg/kg białka fuzyjnego ludzkiego IgG (LFA3-Fc) (Miller i in., J. Exp. Med., 178:211-22 (1993)) służyły jako kontrola negatywna. Wstrzyknięcie 8 mg/kg przeciwciała monoklonalnego przeciwko VLA4 (PS/2; Chisholm i in., Eur. J. Immunol.. 23:682-88 (1993)), które jak wiadomo hamuje CHS przez zablokowanie napływu limfocytów T do miejsca ekspozycji, służyło jako kontrola pozytywna. Na każde stężenie przeciwciała użyto czterech do ośmiu myszy.

186 911 godziny po ekspozycji, myszy ponownie, znieczulono ketamina:ksylazyną i mierzono grubość ucha śrubą mikrometryczną z dokładnością do 10⁴ cala. Obrzęk ucha dla każdej z myszy stanowił różnicę grubości pomiędzy jej uchem kontrolnym i eksponowanym na DNFB. Typowy obrzęk ucha, nie poddanego hamowaniu, wynosił 95-110 x 10- cala. Zahamowanie obrzęku ucha oceniano przez porównanie grup leczonych z ich grupą kontroli negatywnej. Istotność statystyczna różnicy pomiędzy grupami leczenia badana była analizą wariancji a następnie obliczeniem wierności różnicy statystycznej Turkey-Kramera (JMP, SAS Institute) przy wartości p<0,05. Figura 5 pokazuje, że podawanie rosnących stężeń mLT-p-R-Fc powoduje istotne zmniejszenie odpowiedzi obrzękowej ucha u myszy traktowanych DNFB w porównaniu z niehamowanymi zwierzętami kontrolnymi traktowanymi DNFB (PBS wobec LFA3-Fc). Rozpuszczalny LT-P-R (od 1 do 5 mg/kg) mógł zablokować reakcję kontaktowej DTH tak skutecznie, jak przeciwciało monoklonalne przeciwko VLA-4. Część obrzęku ucha w tym teście nie jest hamowana prawdopodobnie z powodu nieswoistego nacieku granulocytamego.

Przykład 9

Model IBD z roztworem siarczanu dekstranu (DSS).

Myszy traktowano jak to opisano na legendzie do Figury, stosując hLFA3-Ig, tj. kontrolne białko fuzyjne Ig albo mLTPR0Ig przez wstrzyknięcie dootrzewnowe. Dnia 0, wodę pitną zamieniono na roztwór 5% siarczanu dekstranu i pozostawiono myszy z tym płynem przez tydzień. Po tygodniu, tj. 2 tygodnie po rozpoczęciu podawania DSS, myszy zabito i mierzono zmiany ciężaru i długość jelita grubego (od odbytu do kątnicy). Figura pokazuje zmiany ciężaru ciała i długości jelita grubego po różnym leczeniu. Skrócone jelito grube jak również utrata ciężaru ciała wskazuje na IBD. Obserwowano, że leczenie LTpR-Ig dramatycznie zapobiega przed skróceniem okrężnicy i utratą ciężaru, co wskazuje na skuteczność.

Figura 6: Zmiana ciężaru ciała obserwowana 14 dni po rozpoczęciu podawania DSS w wodzie pitnej po różnym leczeniu. Veh=nośnik, LTBr i LFA3 odnoszą się do białek fuzyjnych mLTpR-Ig i hLFA3-Ig, które podawano przez wstrzyknięcie dootrzewnowe w dawce 100 pg na tydzień przed podaniem DSS, w momencie podania DSS i tydzień później (tj. 3 wstrzyknięcia w -1, 0 i 1 tygodniu), W grupie było po 10 zwierząt.

Figura 7: Długość okrężnicy w 14 dni po podaniu DSS po różnym leczeniu opisanym w 6. Przykład 10

Model IBD z wykorzystaniem CD45RB^hl/scid.

Limfocyty T CD4-pozytywne wyizolowano od samic C.B-17 przy użyciu technologii perełek magnetycznych, jak to opisano wcześniej (Powrie i in., International Immunology 5:14611471, 1993). Limfocyty T CD4 pozbawione zanieczyszczeń limfocytów CD8, limfocytów B i monocytów sortowano następnie na FACS na populacje CD45RB^hlgl1 i CD45RB^low, zasadniczo jak to opisano wyżej. 5 x 105 komórek CD45RB wstrzyknięto dożylnie samicom C.B-17 scid i badano ciężar ciała. Obserwowano, że zwierzęta odtworzone limfocytami CD45RB^k)Wprzybierały na wadze w normalny sposób. W przeciwieństwie, zwierzęta otrzymujące limfocyty CD45RBh^|gh traciły na wadze, zaś w 10 tygodniu były bliskie śmierci. Gdy myszy kontrolne osiągnęły niemal 20% swojego początkowego ciężaru, zabito je i analizowano histologicznie różne narządy. Typowe chore zwierzę wyglądało kachektycznie, miało biegunkę i dramatycznie powiększoną okrężnicę i kątnicę. Zwierzęta leczone w sposób opisany na legendzie do figur przy użyciu mLTpR-Ig nie traciły na wadze, miały względnie normalne okrężnicę i nie miały masywnych nacieków obserwowanych zwykle w okrężnicy. Figura 8 pokazuje przebieg czasowy utraty ciężaru przez zwierzęta, którym wstrzyknięto CD45RBh^|gh leczone różnymi sposobami, zaś Figura 9 pokazuje końcowy ciężar ciała w 8 tygodni po wstrzyknięciu. Skuteczność mLTpR-Ig w dwóch różnych modelach IBD, tj. modelach CD45RB i DSS, stanowi silny dowód na wyraźny wpływ tego leczenia na układ odpornościowy.

Figura 8: Przebieg czasowy ciężaru ciała po wstrzyknięciu limfocytów T CD4-pozytywnych CD45RB myszom scid. Każda krzywa przedstawia jedno zwierzę, zaś dopiski na panelu dotyczą tego, które komórki wstrzyknięto tj. CD45RBh'gh czy CD45RBl^)w, oraz natury leczenia. Zwierzęta leczono co tydzień przez wstrzyknięcie dootrzewnowe 100 pg białka. Leczenie rozpoczęto 2 tygodnie przed wstrzyknięciem komórek i prowadzono przez czas trwania doświadczenia.

186 911

Figura 9: Średnia i odchylenie standardowe ciężarów ciała obserwowanych po różnym leczeniu w 10 tygodni po przeszczepieniu (5-6 zwierząt na grupę).

Przykład 11

Model SRBC nadwrażliwości typu późnego.

Samice Balb/c uczulano przez podskórne wstrzyknięcie 2 x 10⁷ płukanych erytrocytów owcy (SRBC) w PBS). Po 5 dniach, myszy poddano ekspozycji przez wstrzyknięcie 1 x 10⁸ SRBC w PBS w poduszkę prawej łapy (wstrzyknięcie poddłoniowe). W różnym czasie po wstrzyknięciu do poduszki, mierzono grubość poduszki. Figura 10 pokazuje odpowiedź obrzękową łapy u myszy leczonych dootrzewnowym wstrzyknięciem mLTpR-Ig. Leczenie mLTpR-Ig w momencie uczulania albo w momencie uczulania i momencie ekspozycji hamowało odpowiedź DTH wywołaną SRBC.

Figura 10: Pokazano wzrost grubości poduszki łapy 18 godzin po wstrzyknięciu ekspozycji SRBC. Leczeniem było wstrzyknięcie PBS jako kontrola negatywna, wstrzyknięcie przeciwciała PS/2, które blokowało oddziaływanie VLA4, a więc również migrację komórek, i mLTPR-Ig (100 pq we wstrzyknięciu dożylnym) podawane bezpośrednio przed wstrzyknięciem uczulającym SRBC, w momencie ekspozycji albo w obu momentach.

186 911 (1) INFORMACJE OGÓLNE (i) ZGŁASZAJĄCY: BROWNING, Jeffrey L.

BENJAMIN, Christopher D. HOCHMAN, Paula S.

(ii) TYTUŁ WYNALAZKU:

(iii) LICZBA SEKWENCJI: 1 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) ADRESAT: James F. Haley, Jr.

(B) ULICA: 1251 Avenue of the Americas (C) MIASTO: Nowy Jork (D) STAN: Nowy Jork (E) PAŃSTWO: USA (F) KOD POCZTOWY: 10020 (v) POSTAĆ AKCEPTOWANA PRZEZ KOMPUTER:

(A) RODZAJ NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: Kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: PatentIn rel.#1.0, wer. 1.3 (vi) DANE DOTYCZĄCE OBECNEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZGŁOSZENIA: ZGŁOSZENIE RÓWNOLEGŁE (C) KLASYFIKACJA:

(vii) DANE DOTYCZĄCE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/505 606 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 21 czerwca 1995 (viii) INFORMACJA O RZECZNIKU:

(A) NAZWISKO: HALEY, Jr. James F.

(B) Nr REJESTRACYJNY: 27,794 (C) Nr SPRAWY: B191CIP PCT (ix) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:

(A) TELEFON: (212) 596-9000 (B) TELEFAKS: (212) 596-9090 (C) TELEX: 14-8367 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr: 1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 197 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:

(D) TOPOLOGIA: liniowa (li) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd

186 911

	(ix)	OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW.	Nr 1:
Ser 1	Gln Pro	Gln ALa Val Pro Pro Tyr A.a Ser du 5 10	Asn Gln Thr Cys 15
Arg	Asp Gln	du Lys Glu Tyr Tyr Tlu Pro Gln HPs 20 25	Arg Ile Cys Cys 30
Ser	Arg CCy 35	Pro Pro Gly Thr Tyr Val Ser Ala Lys 40	Cys See Arg Ile 45
Arg	Asp -br 50	Val Cys Ala Thr Cys Ala Glu Ann eer 55 60	yyr Ain du Hśs
Trp 65	Asn Tyr	Leu Thr Ile Cys Gln Llu <Cy Arg Pro 70 75	Cys Alp Ppo Val 80
Met	Gly Lee	Glu Glu Ile Ala Pro Cys -tir Ser Lys 85 90	Arg LLy Thr dn 95
Cys	Arg Cyy	Gln Pro Gly Met Phe CCy AAa Ala Trp 100 105	Ala L^ei du CCy 110
Thr	His Cys 115	Glu Leu Leu Ser Asp Ccs Pro Pro Gly 120	Thr Glu Ala du 155
Leu	Lys Asp 130	du Val Gly Lys Gyy Asn Asn His (C/s 135 140	Val Pro CCy Lys
Ala 145	dy His	Phe Gln Asn Thr Ser Ser Pro Ser Ala 150 155	Arg CC/s Gln Pro ISO
His	Thr Arg	Ccs Glu Asn G1a nly Geu Vay Glu ALe 165 170	Ala Vao Gly Thr 175
Ala	Gln Ser	Asp Thr Tłrr Cyss Lyo Asn Pro Leu du 180 185	Pro Leu Pro Pro 190

Glu Met Ser Gly Thr 195

186 911

Średnia intensywność fluorescencji Wzrost komórek (absorbancj? MTT przy 550nm.

-O- BDA8

FIG. 3

Stężenie LDjLl/^2 ng/ml

[LTpR-Fc ] = 2 gg/ml

FIG. 4

Stężenie mAb B9 gg/ml mlgGI

186 911

Obrzęk ucha x 10 cala

FIG.5

VeH -DSS VeH +DSS LTBr +DSS LFA3 +DSS

186 911

ŚREDNIA DŁUGOŚĆ wcm

FIG. 7

DŁUGOŚĆ OKRĘŻNICY

186 911

Ochronny wpływ mLT-^-R-Ig na mysi model IBD oparty na CD45RB high

Procent początkowego ciężaru ciała

2468 10 2468 10

135-	+ CD45RB high rt	135-	+ CD45RB high
125-		125-
115-		115-
105-	K/	105-
95-		95-
85-	+ mLTpR-lg -.-~,—	85-	+ hLFA3-lg ^^8*6 -,-,---,—

Tygodnie po przeszczepieniu

FIG. 8

186 911

WPŁYW mLT-p-R NA CIĘŻAR CIAŁA MYSZY PO 10 TYGODNIACH OD PRZESZCZEPIENIA KOMÓREK CD45RBhi

SŁUPKI CZARNE = KOMÓRKI +CD45RB hi 35 SŁUPKI ZAKRESKOWANE = KOMÓRKI +CD45RB Iow

LECZENIE

O □

W

H

O s

N

Z

U (4

o.

KONTROLA

| mLTBR-lg | ^FIG. ⁹ kontrola hLFA3-lg

PRZYROST OBRZĘKU PODUSZKI ŁAPY (mm)

REAKCJA mLT-p-R-hIgG1 na DTH w mysim modelu sRBC z użyci«mi samic Balb

p < o.o5 * Fi

P < 0.005 **

P < 0.00005 ***

FIG. 10

186 911

SQPQAVPPYA SENQTCRDQE KEYYEPQHRI CCSRCPPGTY VSAKCSRIRD 50

TYCATCAENS YNEHWNYLTI CQLCRPCDPV MGLEEIAPCT SKRKTQCRCQ 100

101 PGMFCAAWAL ECTHCELLSD CPPGTEAELK DEVGKGNNHC VPCKAGHFQN 150

151 TSSPSARCQP HTRCENQGLV EAAPGTAQSD TTCKNPLEPL PPEMSGT 197

FIG. 1 ε

c o

m m

N

Łj

O.

kontrola

-O- +mp55 TNF-R-Fc

-o- -wnLTP-R-Fc

RQ2puszjŁsąXo.Y receptor =10 gg/ml

Stężenie mLTc*/^ ng/ml

FIG. 2

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie LT-P-R-Fc do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do hamowania reakcji odpornościowej zachodzącej przez limfocyty Thl u zwierzęcia, zwłaszcza do leczenia choroby autoagresyjnej, odrzucenia przeszczepu tkankowego, odrzucenia przeszczepu narządowego, nadwrażliwości typu późnego albo przewlekłych chorób zapalnych, przy czym kompozycja farmaceutyczna zawiera farmaceutycznie dopuszczalny nośnik oraz LT-P-R-Fc w skutecznej ilości.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że czynnik hamujący LT-P-R obejmuje rozpuszczalny LT-P-R, zawierający funkcjonalną sekwencję aminokwasową wybraną z aminokwasów Identyfikatora Sekw. nr 1.
3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że rozpuszczalny LT-P-R obejmuje domenę wiążącą ligand, która może wybiórczo wiązać się z powierzchniowym liganiem limfotoksyny (LT) obejmującym co najmniej jedną podjednostkąLT-p.
4. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że rozpuszczalny LT-p-R obejmuje zewnątrzkomórkową domenę LT-P-R.
5. Zastosowanie według któregokolwiek z zastrz. 3 albo 4, znamienne tym, że rozpuszczalny LT-p-R jest ludzkim LT-P-R.
6. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że LT-P-R-Fc obejmuje domenę Fc ludzkiej immunoglobuliny.
7. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że domena Fc immunoglobuliny obejmuje domenę Fc przeciwciała rekombinowanego.
8. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że domena Fc immunoglobuliny obejmuje domenę Fc przeciwciała humanizowanego.
9. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że domena Fc immunoglobuliny obejmuje domenę Fc przeciwciała monoklonalnego.
10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że przeciwciało monoklonalne obejmuje mAb B9 przeciwko ludzkiemu LT-P, wytworzone przez linię komórkową hybrydoma B9.C9.1 (Nr dostępu ATCC 11962).
11. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że przeciwciało monoklonalne obejmuje mAb BDA8 przeciwko ludzkiemu LT-P-R, wytworzone przez linię komórkową hybrydoma BD.A8.AB9 (Nr dostępu ATCC HB11798).
12. Zastosowanie według któregokolwiek z zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4 albo 6 albo 7 albo 8 albo 9 albo 10 albo 11, znamienne tym, że reakcja odpornościowa zachodząca przez limfocyty Thl przyczynia się do komórkowego odrzucenia tkanki u zwierzęcia, po przeszczepieniu przeszczepu tkankowego.
13. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że reakcja odpornościowa przyczynia się do komórkowego odrzucenia tkanki u zwierzęcia, po przeszczepieniu przeszczepu tkankowego.
14. Zastosowanie według któregokolwiek zastrz. 1 albo 2 albo3 albo 4 albo 6 albo 7 albo 8 albo 9 albo 10 albo 11, znamienne tym, że reakcja odpornościowa zachodząca przez limfocyty Thl przyczynia się do odrzucenia narządu u zwierzęcia, po przeszczepieniu przeszczepu narządowego.
15. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że reakcja odpornościowa zachodząca przez limfocyty Thl przyczynia się do odrzucenia narządu u zwierzęcia, po przeszczepieniu przeszczepu narządowego.
16. Zastosowanie według któregokolwiek zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4 albo 6 albo 7 albo 8 albo 9 albo 10 albo 11, znamienne tym, że reakcja odpornościowa zachodząca przez limfocyty Thl przyczynia się do zaburzenia autoagresyjnego u zwierzęcia.

186 911
17. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że zaburzenie autoagresyjne jest narządowo-swoiste.
18. Zastosowanie według zastrz. 17, znamienne tym, że narządowo-swoiste zaburzenie autoagresyjne jest wybrane z grupy składającej się ze stwardnienia rozsianego, cukrzycy insulinozależnej, współczulnego zapalenia oka, zapalenia jagodowki oraz łuszczycy.
19. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że zaburzenie autoagresyjne jest ogólnoustrojowe.
20. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że ogólnoustrojowe zaburzenie autoagresyjne jest wybrane z grupy składającej się z reumatoidalnego zapalenia stawów i zespołu Sjogrena.
21. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że zaburzeniem autoagresyjnym jest reumatoidalne zapalenie stawów.
22. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że zaburzeniem autoagresyjnym jest stwardnienie rozsiane.
23. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że zaburzeniem autoagresyjnym jest łuszczyca.
24. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że zaburzeniem autoagresyjnym jest cukrzyca insulinozależna.
25. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że reakcja odpornościowa zachodząca przez limfocyty Thl przyczynia się do zaburzenia autoagresyjnego u zwierzęcia.
26. Zastosowanie według zastrz. 25, znamienne tym, że zaburzenie autoagresyjne jest narządowo-swoiste.
27. Zastosowanie według zastrz. 26, znamienne tym, że narządowo-swoiste zaburzenie autoagresyjne jest wybrane z grupy składającej się ze stwardnienia rozsianego, cukrzycy insulinozależnej, współczulnego zapalenia oka, zapalenia jagodowki oraz łuszczycy.
28. Zastosowanie według zastrz. 25, znamienne tym, że zaburzenie autoagresyjne jest ogólnoustrojowe.
29. Zastosowanie według zastrz. 28, znamienne tym, że ogólnoustrojowe zaburzenie autoagresyjne jest wybrane z grupy składającej się z reumatoidalnego zapalenia stawów i zespołu Sjogrena.
30. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4 albo 6 albo 7 albo 8 albo 9 albo 10 albo 11, znamienne tym, że reakcja odpornościowa zachodząca przez limfocyty Thl jest hamowana bez hamowania odpowiedzi odpornościowej zależnej od limfocytów Th2.
31. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że reakcja odpornościowa zachodząca przez limfocyty Thl jest hamowana bez hamowania odpowiedzi odpornościowej zależnej od limfocytów Th2.
32. Zastosowanie według któregokolwiek z zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4 albo 6 albo 7 albo 8 albo 9 albo 10 albo 11, znamienne tym, że reakcja odpornościowa zachodząca przez limfocyty Thl przyczynia się do wystąpienia u zwierzęcia nadwrażliwości typu późnego.
33. Zastosowanie według zastrz. 32, znamienne tym, że nadwrażliwość typu późnego jest nadwrażliwością typu tuberkulinowego.
34. Zastosowanie według zastrz. 32, znamienne tym, że nadwrażliwość typu późnego jest nadwrażliwością typu ziaminiakowego.
35. Zastosowanie według zastrz. 32, znamienne tym, że nadwrażliwość typu późnego jest nadwrażliwością kontaktową.
36. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że reakcja odpornościowa zachodząca przez limfocyty Thl przyczynia się do wystąpienia u zwierzęcia nadwrażliwości typu późnego.
37. Zastosowanie według zastrz. 36, znamienne tym, że nadwrażliwość typu późnego jest wybrana z grupy składającej się z nadwrażliwości typu tuberkulinowego, nadwrażliwości typu ziaminiakowego oraz nadwrażliwości kontaktowej.
38. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4 albo 6 albo 7 albo 8 albo 9 albo 10 albo 11, znamienne tym, że reakcja odpornościowa zachodząca przez limfocyty Thl przyczynia się do wystąpienia u zwierzęcia przewlekłej choroby zapalnej.

186 911
39. Zastosowanie według zastrz. 38, znamienne tym, że przewlekłą chorobą zapalną jest choroba zapalna jelita grubego.
40. Zastosowanie według zastrz. 38, znamienne tym, że przewlekłą chorobą zapalną jest choroba Crohn'a.
41. Zastosowanie według zastrz. 38, znamienne tym, że przewlekłą chorobą zapalną jest wrzodziejące zapalenie okrężnicy.
42. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że reakcja odpornościowa zachodząca przez limfocyty Thl przyczynia się do wystąpienia u zwierzęcia przewlekłej choroby zapalnej.
43. Zastosowanie według zastrz. 42, znamienne tym, że przewlekła choroba zapalna jest wybrana z grupy składającej się z choroby zapalnej jelita grubego, choroby Crohn'a, oraz wrzodziejącego zapalenia okrężnicy.
44. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4 albo 6 albo 7 albo 8 albo 9 albo 10 albo 11, znamienne tym, że kompozycja jest podawana w ilości wystarczającej do opłaszczenia komórek LT-P-R-pozytywnych na okres od 1 do 14 dni.
45. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że kompozycja jest podawana w ilości wystarczającej do opłaszczenia komórek LT-P-R-pozytywnych na okres od 1 do 14 dni.
46. Zastosowanie fuzji receptora limfotoksyny-β z domeną Fc immunoglobuliny (LT-βR-Fc) do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia albo zmniejszania zaawansowania, ciężkości albo skutków choroby autoagresyjnej związanej z komórkami Thl u zwierzęcia, przy czym kompozycja farmaceutyczna zawiera farmaceutycznie dopuszczalny nośnik oraz LT-P-R-Fc w terapeutycznie skutecznej ilości.
47. Zastosowanie według zastrz. 46, znamienne tym, że LT---R-Fc obejmuje rozpuszczalny receptor limfotoksyny-β (LT---R), zawierający funkcjonalną sekwencję aminokwasową wybraną z aminokwasów Identyfikatora Sekw'. nr 1.
48. Zastosowanie według zastrz. 47, znamienne tym, że LT-P-R-Fc obejmuje rozpuszczalny receptor limfotoksyny-p posiadający domenę wiążącą ligand, która wybiórczo wiąże się z powierzchniowym ligandem LT obejmującym co najmniej jedną podjednostkę LT-p.
49. Zastosowanie według zastrz. 47, znamienne tym, że LT-P-R-Fc obejmuje domenę Fc ludzkiej immunoglobuliny.
50. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 46 albo 47 albo 48 albo 49, znamienne tym, że chorobą autoagresyjną. związaną z komórkami Thl jest reumatoidalne zapalenie stawów.
51. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 46 albo 47 albo 48 albo 49, znamienne tym, że chorobą autoagresyjną związaną z komórkami Thl jest stwardnienie rozsiane.
52. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. 46 albo 47 albo 48 albo 49, znamienne tym, że chorobą autoagresyjną związaną z komórkami Thl jest cukrzyca insulinozależna.
53. Zastosowanie białka fuzyjnego ΕΓ-β-R w terapeutycznie skutecznej ilości do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby zapalnej jelita grubego.
54. Zastosowanie według zastrz. 53, znamienne tym, ze białko fuzyjne jest fuzją LT---R i domeny Fc immunoglobuliny.

-rzedmiotem wynalazku są zastosowania LT-P-R-Fc oraz białka fuzyjnego LT---R. LT β-R-Fc oraz białko fuzyjne LT---R są „środkami blokującymi receptor limfotoksyny-β”, które blokują sygnalizację za pośrednictwem receptora limfotoksyny-β Środki blokujące receptor limfotoksyny-p są przydatne w leczeniu chorób immunologicznych, w których biorą udział limfocyty, w szczególności do hamowania odpowiedzi odpornościowej wywołanej limfocytami Thl. Wynalazek jest oparty na rozpuszczalnych postaciach domeny zewnątrzkomórkowej receptora limfotoksyny-β, które działają jako środki blokujące receptor limfotoksyny-β. Niniejszym przedstawiono również zastosowania przeciwciał skierowanych przeciwko receptorowi limfotoksyny-p albo jego ligandowi, limfotoksynie powierzchniowej, które działają jako środki blokujące receptor limfotoksyny-p. Ponadto opisano sposoby badania przesiewowego w celu

186 911 wykrywania receptorów rozpuszczalnych, przeciwciał oraz innych czynników, które blokują sygnalizację przez receptor limfotoksyny-β.

Wzorzec cytokin uwalnianych podczas rozpoczęcia odpowiedzi odpornościowej może wpływać na następujący potem wybór, który ze szlaków efektorowych odporności zostanie aktywo wany. Wybór pomiędzy mechanizmami efektorowymi odporności zachodzi dzięki CD4-dodatnim pomocniczym limfocytom T (limfocyty T pomocnicze albo limfocyty Th). Limfocyty Th oddziaływają z komórkami prezentującymi antygen (APC), które pokazują na swej powierzchni fragmenty peptydowe przetworzonego obcego antygenu w powiązaniu z cząsteczkami MHC klasy Π. Limfocyty Th są aktywowane gdy rozpoznają konkretne epitopy na pokazywanych na odpowiedniej powierzchni APC obcych antygenach, dla których limfocyty Th wyrażają swoisty receptor. Aktywowane limfocyty Th z kolei, wydzielają odpowiednie cytokiny (limfokiny), które aktywują odpowiednie mechanizmy efektorowe odporności.

Limfocyty Th mogą aktywować różne mechanizmy efektorowe, w tym aktywację limfocytów T cytotoksycznych, wytwarzanie przeciwciał przez limfocyty B i aktywację makrofagów'. Wybór pomiędzy mechanizmami efektorowymi zachodzi w większości przez to, które cytokiny są wytwarzane przez aktywowane limfocyty Th.

Limfocyty Th dzielą się na trzy podgrupy, w zależności od ich profilu wydzielania cytokin (Fitch i in., Ann. Rev. Immunol., 11:29-48 (l993)). Podgrupy te są zwane ThO, Thl i Th2. U myszy, niepobudzone „naiwne” limfocyty Th wydzielają lL-2. Krótkotrwałe pobudzenie prowadzi do powstania komórek prekursorowych ThO, które wytwarzają szeroką gamę cytokin, w tym IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-5 i IL-10. Przewlekle pobudzane limfocyty ThO mogą różnicować się w rodzaj Thl albo Th2, przy czym zmienia się profil wyrażanych cytokin.

Niektóre cytokiny są uwalniane przez zarówno Thl jak iTh2 (np. IL-3, GM-CSF i TNF). Inne cytokiny są wytwarzane wyłącznie przez jedną albo drugą podgrupę limfocytów Th. Wyspecjalizowane efekty podgrup limfocytów T pomocniczych po raz pierwszy zaobserwowano u myszy. Podobne podtypy limfocytów T pomocniczych występują również u ludzi (Romagnani i in., Ann. Rev. Immunol., 12:227-57 (1994)).

Limfocyty Thl wytwarzają LT-a, IL-2 i IFN-y. U ludzi, profil wydzielania cytokin Thl wiąże się ogólnie z odpornością komórkową i opornością na zakażenie. Cytokiny Thl aktywują raczej makrofagi i niektóre reakcje zapalne takie jak nadwrażliwość typu IV, „typu późnego” (patrz niżej). Cytokiny Thl odgrywają istotną rolę w komórkowych zjawiskach odrzucania przeszczepów tkankowych i narządowych.

Limfocyty Th2 wytwarzają cytokiny IL-4, IL-5, IL-6 i IL-10. Cytokiny Th2 zwiększają tworzenie granulocytów kwasochłonnych i komórek tucznych i ułatwiają pełną ekspansję i dojrzewanie limfocytów B (Howard i in., „T-cell derived cytokines and their receptors”, Fundamental Immunology, wyd. 3, Raven Press, New York (1993)). Cytokiny Th2 zwiększają również wytwarzanie przeciwciał, w tym przeciwciał IgE związanych z reakcjami alergicznymi i przeciwciałami przeciwko przeszczepowi. Limfocyty Th2 mogą również brać udział w tłumieniu odporności i tolerancji na przetrwałe antygeny.

Cytokiny związane z Thl i Th2 odgrywają rolę w pewnych reakcjach nadwrażliwości - nieodpowiednich albo nieproporcjonalnych reakcjach odpornościowych wywołanych przez kontakt z uprzednio spotkanym antygenem. Istnieją cztery uznane typy nadwrażliwości (Roitt i in., Immunology, 19.1-22.12 (Mosby-Year Book Europę Ltd., wyd. 3 1993)).

Typ I „nadwrażliwości natychmiastowej” obejmuje wywołaną alergenem aktywację limfocytów Th2 i wydzielenie cytokin Th2. Cytokina Th2, IL-4, pobudza limfocyty B do przełączenia izotypów w kierunku wytwarzania IgE, które aktywują komórki tuczne do wywoływania ostrych reakcji zapalnych, takich jak prowadzące do wyprysku, astmy albo kataru.

Typ II i III nadwrażliwości są powodowane przez IgG i IgM skierowane przeciwko antygenom powierzchniowym komórki i swoistym tkankowo (Typ II) albo antygenom rozpuszczonym w surowicy (Typ III). Uważa się, że te typy nadwrażliwości nie są wywoływane przez limfocyty Th.

Typ IV nadwrażliwości „typu późnego” (DTH) zachodzi przez limfocyty Thl. Reakcje DTH rozwijają się w ciągu ponad 12 godzin i określane są jako „komórkowe”, ponieważ mogą być przeniesione z myszy na mysz przez przeniesienie limfocytów Th 1, ale nie samej su6

186 911 rowicy. Reakcje typu IV DTH są ogólnie podzielone na trzy rodzaje: nadwrażliwość kontaktową, typu tuberkulinowego i ziaminiakową

Wiele reakcji komórkowych, które mogą powodować chorobę, można indukować u zdrowych myszy przez przeniesienie limfocytów z myszy chorej (np. cukrzycę insulinozależną i doświadczalne autoagresyjne zapalenie mózgu). Cecha ta różni DTH typu IV od innych trzech typów nadwrażliwości, które są reakcjami humoralnymi spowodowanymi przede wszystkim przeciwciałami, które można przenieść w bezkomórkowej surowicy.

Limfocyty T pomocnicze biorą również udział w regulacji przełączania izotypów immunoglobulin de novo. Różne podtypy Th mogą wpływać na względną proporcję immunoglobulin danego izotypu wytworzonego w odpowiedzi na ekspozycję na antygen. Przykładowo, cytokina Th2, IL-4, może przełączać aktywowane limfocyty B w kierunku izotyp IgGl i hamować inne izotypy. Jak to dyskutowano powyżej, IL-4 aktywuje również nadprodukcję IgE w reakcjach nadwrażliwości typu I. Cytokina Th2, IL-5, indukuje izotyp IgA. Ten wpływ cytokiny Th2 na przełączanie izotypów jest równoważony przez IFN-γ wydzielany przez limfocyty Thl.

Zróżnicowany wzorzec cytokin wydzielanych przez limfocyty Thl i Th2 wydaje się kierować odpowiedź w kierunku różnych mechanizmów efektorowych odporności. Przełączenie, które aktywuje mechanizm efektorowy humoralny albo komórkowy jest wzmacniane przez wzajemne hamowanie pomiędzy limfocytami Thl i Th2: IFN-y wytworzony przez limfocyty Thl hamuje proliferację limfocytów Th2, zaś wydzielana przez Th2 IL-10 wydaje się zmniejszać wydzielanie cytokin przez limfocyty Thl.

Zależnie od względnego powinowactwa cytokin do ich celów cząsteczkowych, ujemne sprzężenia zwrotne Thl i Th2 mogą wzmacniać efekty małych różnic stężeń pomiędzy cytokinami Thl i Th2. Wzmocniony sygnał cytokiny Thl albo Th2 może wyzwalać przełączenie pomiędzy mechanizmami efektorowymi komórkowymi albo humoralnymi, w zależności od małych zmian we względnym stężeniu cytokin Thl i Th2. Zdolność do kontrolowania tego przełączenia przez modulowanie względnych stężeń cytokin Thl albo Th2 powinna być przydatna do leczenia zaburzeń, które mogą prowadzić do zaburzeń i chorób odpornościowych.

Patologiczne reakcje Thl związane są z licznymi stanami autoagresyjnymi narządowoswoistymi i układowymi, przewlekłymi stanami zapalnymi i reakcjami nadwrażliwości typu późnego. Jak to dyskutowano powyżej, reakcje Thl przyczyniają się również do reakcji komórkowych prowadzących do odrzucania przeszczepów tkankowych i narządowych.

Do leczenia tych różnych stanów odporności zależnych od limfocytów Thl do tej pory stosowano środki immunomodulujące i immunosupresyjne, jak również wiele leków o słabo zdefiniowanym mechanizmie działania (np. złoto albo penicylamina). Obecnie stosuje się zasadniczo trzy leki immunosupresyjne: steroidy, cyklosporynę i azatioprynę.

Steroidy sąplejotropowymi lekami przeciwzapalnymi, które hamują makrofagi i hamują aktywność komórek prezentujących antygen, w sposób odwracający większość działań IFN-y, cytokiny Thl. Cyklosporyna, silny lek immunosupresyjny, hamuje wytwarzanie cytokin i zmniejsza ekspresję receptorów IL-2 na limfocytach podczas ich aktywacji. Azatiopryna jest silnym środkiem antyproliferacyjnym, który hamuje syntezę DNA. Te nieswoiste środki immunosupresyjne są zwykle wymagane w dużych dawkach, co zwiększa ich toksyczność (np. nefro- i hepatotoksyczność) i powoduje szkodliwe efekty uboczne. Są więc nieprzydatne do długotrwałego leczenia.

W celu przezwyciężenia tych problemów powodowanych przez konwencjonalne leczenie nieswoistymi lekami immunosupresyjnymi, wiele współczesnych strategii leczniczych dotyczy hamowania albo aktywowania wybranych aspektów układu odpornościowego. Szczególnie atrakcyjnym celem jest manipulacja równowagą pomiędzy cytokinami Thl i Th2 w celu przesunięcia równowagi pomiędzy mechanizmami efektorowymi komórkowymi i humoralnymi.

W celu osiągnięcia przesunięcia pomiędzy mechanizmami efektorowymi komórkowymi i humoralnymi, przydatne byłoby modulowanie aktywności cząsteczki, która potrafi zmieniać względną aktywność podklas limfocytów Thl i Th2. Kandydaci na takie cząsteczki obejmują cytokiny i ich receptory. Ostatnie dane wskazują, że LT-α, IL-12, IFN-a i IFN-y sprzyjają rozwojowi odpowiedzi Thl, podczas gdy IL-1 i IL-4 kierują odpowiedź w kierunku mechanizmów efektorowych Th2 (Romagni i in., Ann. Rev. Immunol. 12:227-57 (1994)).

186 911

Wiele z cytokin limfocytów Th jest plejotropowymi regulatorami rozwoju i działania odporności, zaś hamowanie ich wytwarzania powinno mieć szkodliwy wpływ na reakcje odpornościowe nie związane z limfocytami T. Nie został zidentyfikowany pożądany i skuteczny cel dla wybiórczego modulowania wyboru pomiędzy mechanizmami efektorowymi Thl i Th2.

Obecny wynalazek stanowi rozwiązanie dla opisanego wyżej problemu przez zastosowania czynników blokujących receptor limfotoksyny-β do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych do leczenia chorób odpornościowych, przez hamowanie sygnalizacji przez receptor limfotoksyny-β (LT-P-R). Konkretniej, kompozycje farmaceutyczne obejmujące środki blokujące receptor limfotoksyny-β są przydatne do hamowania reakcji odpornościowych zachodzących przez Thl, takich jak przykładowo, choroby zapalne jelita grubego.

W ogólności dostarczone jest zastosowanie rozpuszczalnych postaci domeny zewnątrzkomórkowej receptora limfotoksyny-β działające jako środki blokujące receptor limfotoksyny-β. W niniejszym wynalazku znajduje zastosowanie rekombinowane białko fuzyjne receptora limfotoksyny-p, które posiada zewnątrzkomórkową domenę LT^-R wiążącą ligand poddaną fuzji z domeną stałą łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, w szczególności z domeną Fc.