EA005734B1 - Способ лечения ревматоидного артрита - Google Patents

Способ лечения ревматоидного артрита Download PDF

Info

Publication number
EA005734B1
EA005734B1 EA200200503A EA200200503A EA005734B1 EA 005734 B1 EA005734 B1 EA 005734B1 EA 200200503 A EA200200503 A EA 200200503A EA 200200503 A EA200200503 A EA 200200503A EA 005734 B1 EA005734 B1 EA 005734B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cells
soluble
ligand
receptor
cell
Prior art date
Application number
EA200200503A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200200503A1 (ru
Inventor
Джеффри Л. Браунинг
Кристофер Д. Бенджамин
Паула С. Хохман
Original Assignee
Байоджен, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Байоджен, Инк. filed Critical Байоджен, Инк.
Publication of EA200200503A1 publication Critical patent/EA200200503A1/ru
Publication of EA005734B1 publication Critical patent/EA005734B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/08—Antibacterial agents for leprosy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/10—Anthelmintics
    • A61P33/12—Schistosomicides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y10S930/143—Lymphotoxin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)

Abstract

Данное изобретение относится к способу лечения ревматоидного артрита у млекопитающего путем введения эффективного количества блокатора рецептора лимфотоксина-β (LT-β-R), в частности растворимого LT-β-R, слитого с Fc-доменом человеческого Ig.

Description

Данное изобретение относится к способу лечения ревматоидного артрита у млекопитающего путем введения эффективного количества блокатора рецептора лимфотоксина-β (ЬТ-β-Κ). Блокаторы рецепторов к лимфотоксину-β применимы для лечения лимфоцит-опосредованных иммунологических заболеваний и, более конкретно, для ингибирования иммунных ответов, опосредованных Тй1-клетками.
Данное изобретение также относится к способу лечения ревматоидного артрита у млекопитающего путем введения растворимого рецептора лимфотоксина-β, содержащего Бе-домен 1д человека.
Предпосылки изобретения
Профиль цитокинов, высвобождаемых при иммунной стимуляции, может повлиять на последующий выбор активируемого иммунного эффекторного пути. Выбор между иммунными эффекторными механизмами опосредован СЦ4-положительными хелперными Т-лимфоцитами (Т-хелперными клетками, или Тй-клетками). Тй-клетки взаимодействуют с антиген-презентирующими клетками (АПК), которые презентируют на своей поверхности пептидные фрагменты процессированного чужеродного антигена в комплексе с молекулами ГКГ класса II. Тй-клетки активируются, когда распознают определенные эпитопы чужеродного антигена, презентированные на поверхности подходящей АПК, на которые Тй-клетки экспрессируют специфичный рецептор. Активированные Тй-клетки, в свою очередь, секретируют цитокины (лимфокины), которые запускают подходящие иммунные эффекторные механизмы.
Тй-клетки способны запускать различные эффекторные механизмы, включая активацию киллерных Т-клеток, активацию продукции В-клетками антител и активацию макрофагов. Выбор между иммунными эффекторными механизмами зависит в значительной степени от того, какие цитокины продуцируют активированные Тй-клетки.
Тй-клетки могут быть подразделены на три подгруппы на основании профилей секретируемых ими цитокинов (Бйей е! а1., Апп. Кеу. 1ттипо1., 11, стр. 29-48 (1993)). Данные подгруппы называют ТйО, Тй1 и Тй2. У мышей нестимулированные наивные Т-хелперные клетки продуцируют 1Ь-2. Кратковременная стимуляция приводит к преобразованию в клетки-предшественники ТйО, которые продуцируют широкий спектр цитокинов, включая ШЫ-у, 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-5 и 1Ь-10. Длительно стимулируемые ТйО-клетки способны дифференцироваться либо в клеточный тип Тй1, либо в клеточный тип Тй2, после чего изменяется профиль экспрессируемых цитокинов.
Некоторые цитокины секретируются как Тй1-, так и Тй2-клетками (например, 1Ь-3, СМ-С8Б и ТЫБ). Другие цитокины продуцируются исключительно одной либо другой подгруппой Тй-клеток. Специализированные эффекты подгрупп Т-хелперных клеток впервые были выявлены у мышей. Сходное разделение применимо и к Т-хелперным клеткам человека (Котадпаш е! а1., Апп. Кеу. 1ттипо1., 12, стр. 227-57 (1994)).
Тй-клетки продуцируют ЙТ-α. 1Ь-2 и ШЫ-у. У человека профиль секретируемых цитокинов Тй1 обычно связывали с клеточным иммунитетом и резистентностью к инфекции. Цитокины Тй1 имеют тенденцию к активации макрофагов и запуску определенных видов воспалительного ответа, таких как гиперчувствителъность IV типа (замедленного типа) (смотри ниже). Цитокины Тй1 играют важную роль в клеточном отторжении трансплантатов тканей и органов.
Тй2-клетки продуцируют цитокины 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-б и 1Й-10. Цитокины Тй2 увеличивают продукцию эозинофилов и тучных клеток и стимулируют пролиферацию и созревание В-клеток (Но^агб е! а1., Т се11-6епуе6 су1окшс5 апб 1йе1г гесерЮге. Бип6атеп!а1 1ттипо1оду, 36 е6., Кауеп Ргс55, Ыс\у Уогк (1993)). Цитокины Тй2 также увеличивают продукцию антител, включая антитела 1дЕ, связанные с аллергическими реакциями, и антитела к трансплантату. Тй2-клетки могут также участвовать в супрессии иммунитета и толерантности к персистирующим антигенам.
Тй1- и Тй2-ассоциированные цитокины играют роль в развитии определенных видов реакций по типу гиперчувствительности - неадекватного или диспропорционального иммунного ответа, развивающегося при контакте с ранее встречавшимся антигеном. Выделяют четыре типа гиперчувствительности (Кой! е! а1., 1ттипо1оду, стр. 19.1-22.12 (Мокйу-Уеаг Воок Еигоре Ы6., 36 е6. 1993)).
Гиперчувствительностъ I типа (немедленного типа) включает в себя аллерген-индуцированные активацию Тй2-клеток и секрецию Тй2-клетками цитокинов. Цитокин ГЕ-4, продуцируемый Тй2, стимулирует претерпевание В-клетками переключения изотипа на продукцию !дЕ, который активирует тучные клетки с развитием острых воспалительных реакций, как, например, ведущие к развитию экземы, бронхиальной астмы и ринита.
Гиперчувствительность II и III типов вызывается антителами и ^М к клеточной поверхности или к специфическим тканевым антигенам (II тип) или к растворимым сывороточным антигенам (III тип). Считается, что данные типы реакций гиперчувствительности не опосредованы Тй-клетками.
Гиперчувствительность IV типа (замедленного типа) (ГЗТ) является опосредованной Тй1-клетками. Развитие реакций ГЗТ занимает более 12 ч, и о них говорят как о клеточно-опосредованных, поскольку они могут быть перенесены от одной мыши к другой лишь путем переноса Тй1-клеток, а не только сыворотки. Реакции ГЗТ IV типа обычно подразделяют на три типа: контактную, туберкулинового типа и гранулематозную гиперчувствительность.
- 1 005734
Многие клеточно-опосредованные реакции, которые способны вызывать заболевание, можно индуцировать у здоровых мышей путем переноса лимфоцитов от больной мыши (например, инсулинзависимый сахарный диабет и экспериментальный аутоиммунный энцефалит). Данное свойство отличает ГЗТ IV типа от остальных трех типов гиперчувствительности, которые представляют собой гуморальные иммунные реакции, вызываемые преимущественно антителами, которые могут быть перенесены в бесклеточной сыворотке.
Т-хелперные клетки также участвуют в регуляции переключения изотипа иммуноглобулина йс ηονο. Различные подгруппы Тй могут влиять на соотношение иммуноглобулинов определенного изотипа, продуцируемых в ответ на иммунную стимуляцию. Например, цитокин 1Ь-4, продуцируемый Тй2, может переключать активированные В-клетки на изотип 1дС 1 и подавлять другие изотипы. Как обсуждалось выше, 1Ь-4 также активирует избыточную продукцию 1дЕ в реакциях гиперчувствительности I типа. Цитокин 1Ь-5, продуцируемый Тй2, индуцирует изотип 1д-А. Данное влияние цитокинов, продуцируемых Тй2, на переключение изотипа уравновешено влиянием ΙΕΝ-γ, продуцируемого Тй1-клетками.
Создается впечатление, что отличные профили цитокинов, секретируемых Тй1- и Тй2-клетками, направляют реакцию по различным иммунным эффекторным механизмам. Переключение, которое активирует либо клеточно-опосредованный, либо гуморальный эффекторный механизм, является чувствительным к процессам перекрестной супрессии между ТЫ- и Тй2-клетками:
ΙΕΝ-γ, продуцируемый Тй1-клетками, подавляет пролиферацию Тй2-клеток, а 1Ь-10, секретируемый Тй2-клетками, снижает секрецию цитокинов Тй1-клетками.
В зависимости от относительных аффинностей цитокинов к их молекулярным мишеням круги отрицательной регуляции ТЫ и Тй2 могут умножать эффекты малых различий в концентрациях цитокинов, продуцируемых ТЫ- и Тй2-клетками. Возможность контролировать данное переключение путем изменения относительных концентраций цитокинов, продуцируемых ТЫ- и Тй2-клетками, была бы полезна для лечения дисбаланса при многих иммунных реакциях, зависимых от ТЫ- и Тй2-клеток, которые способны приводить к развитию иммунных нарушений и заболеваний.
Патологические реакции, опосредованные ТЫ, ассоциированы с рядом органоспецифических и системных аутоиммунных состояний, хронических воспалительных заболеваний и реакций гиперчувствительности замедленного типа. Как обсуждалось выше, реакции, опосредованные ТЫ, также способствуют развитию клеточных реакций, приводящих к отторжению трансплантированных тканей и органов.
До сих пор лечение данных различных иммунных состояний, опосредованных ТЫ-клетками, заключается, главным образом, в применении иммуномодуляторов и иммуносупрессоров, равно как и ряда лекарственных средств с плохо изученными механизмами действия (например, золото или пеницилламин). Тремя основными применяемыми в настоящее время иммуносупрессорами являются стероиды, циклоспорин и азатиоприн.
Стероиды представляют собой плейотропные противовоспалительные средства, которые подавляют активированные макрофаги и ингибируют активность антиген-презентирующих клеток так, что обращают многие эффекты цитокина ΙΕΝ-γ, продуцируемого ТЫ. Циклоспорин - мощный иммуносупрессор подавляет продукцию цитокинов и снижает экспрессию рецепторов к 1Ь-2 на лимфоцитах при их активации. Азатиоприн представляет собой противовоспалительное средство, которое ингибирует синтез ДНК. Обычно требуется введение высоких доз данных неспецифических иммуносупрессоров, что повышает их токсичность (например, нефро- и гепатотоксичность) и приводит к развитию нежелательных побочных эффектов. Таким образом, они являются неприменимыми в проведении длительных курсов лечения.
В порядке решения трудностей, вызываемых традиционными методами лечения с помощью неспецифических иммуносупрессоров, многие современные стратегии лечения направлены на подавление или активацию отдельных функций иммунной системы. Особенно привлекательной задачей является манипулирование балансом между цитокинами, продуцируемыми ТЫ и Тй2, в целях сдвигания баланса между клеточно-опосредованными и гуморальными эффекторными механизмами.
Для достижения сдвига между клеточно-опосредованными и гуморальными эффекторными механизмами полезной была бы возможность модулирования активности молекулы, которая способна изменять относительные активности подклассов ТЫ- и Тй2-клеток. Кандидаты на роль таких молекул включают цитокины и рецепторы к ним. Последние данные позволяют предположить, что ЬТ-α, 1Ь-12, ΙΕΝ-α и ΙΕΝ-γ способствуют развитию Тй1-опосредованных реакций, тогда как 1Ь-1 и 1Ь-4 направляют ответ по Тй2-опосредованному эффекторному механизму (Котадпаш с1 а1., Αηη. Ест. 1ттипо1., 12, стр. 227-57 (1994)).
Многие из цитокинов Тй-клеток представляют собой плейотропные регуляторы развития и функционирования иммунной системы, и ингибирование их продукции окажет вредное действие на неопосредованные Т-клетками реакции. Желательная и эффективная мишень для избирательного модулирования выбора между Тй1- и Тй2-опосредованными эффекторными механизмами не определена.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к способу лечения ревматоидного артрита у млекопитающего, предусматривающему введение указанному млекопитающему фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество блокатора рецептора лимфотоксина-β (ЬТ-β-Κ.) и фармацевтически приемлемый носитель.
- 2 005734
Настоящее изобретение также относится к способу лечения ревматоидного артрита у млекопитающего, предусматривающему введение указанному млекопитающему эффективного количества растворимого ЬТ-β-Κ, слитого с Ге-доменом человеческого 1д.
Краткое описание фигур
Фиг. 1. Последовательность внеклеточной части рецептора к ЬТ-β человека, которая кодирует лигандсвязывающий домен.
Фиг. 2. Растворимый мышиный рецептор к ЬТ-β, присоединенный к Гс-домену 1дС 1 человека (тЬТ-β-Κ-Γο), блокирует передачу сигнала через ЬТ-β-Κ в клетках мышей \УЕН1 164, индуцированного растворимым мышиным ЬТ-аф-лигандом. Клетки \УЕН1 164 гибнут как функция повышения концентрации ЬТ-лиганда (шЬТ-α/β). Растворимый шЬТ-β-Κ-Γο (10 мкг/мл) блокирует такую индуцированную ЬТ-лигандом клеточную гибель. Гибридный белок растворимого мышиного рецептора к ΪΝΓ (р55Т№Κ-Гс) обладает небольшим эффектом на блокирование ЬТ-аф-стимулированной клеточной гибели. Рост количественно оценивали по прошествии 3 дней путем измерения оптической плотности (ΘΌ 550) прореагировавшей МТТ, которая пропорциональна количеству клеток.
Подробное описание изобретения
В целях полнейшего понимания описываемого здесь изобретения приведено следующее подробное описание.
Термин цитокин относится к молекуле, которая опосредует взаимодействия между клетками. Лимфокин представляет собой цитокин, секретируемый лимфоцитами.
Термин Т-хелперные (ТЕ) клетки относится к функциональному подклассу Т-клеток, которые способствуют наработке цитотоксических Т-клеток и которые взаимодействуют с В-клетками, стимулируя продукцию антител. Хелперные Т-клетки распознают антиген, ассоциированный с молекулами ГКГ II класса.
Термин ТЫ относится к подклассу Т-хелперных клеток, которые продуцируют ЬТ-α, интерферон-γ и 1Ь-2 (и другие цитокины) и которые вовлечены в воспалительные реакции, связанные с клеточным, т. е. не с иммуноглобулиновым ответом на иммунную стимуляцию.
Термин Т112 относится к подклассу Т-хелперных клеток, которые продуцируют цитокины, включая 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6 и 1Ь-10, которые связаны с иммуноглобулин-опосредованным (гуморальным) ответом на иммунную стимуляцию.
Термин клеточно-опосредованный относится к тем реакциям в иммунной системе, которые развиваются в результате прямых эффектов Т-клеток и их продуктов с развитием ответа. Данный тип ответа, главным образом (но не исключительно), связан с классом ТЫ Т-клеток. В данную категорию не входят хелперные эффекты Т-клеток на дифференцировку В-клеток и пролиферацию В-клеток, которые, главным образом, связаны с классом Т112 Т-клеток.
Термин гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) относится к иммунному ответу, который характеризуется медленным развитием реакции на антиген с полным проявлением эффекта в течение 13-суточного периода. Данное медленное развитие реакции отличается от относительно быстрого развития реакции, наблюдаемого при иммуноглобулин-опосредованной (гуморальной) аллергической реакции. Существует три типа реакций ГЗТ: реакции по типу контактной гиперчувствителъности, гиперчувствительности туберкулинового типа и гранулематозные реакции.
Термины иммуноглобулин-опосредованный ответ или гуморальный ответ относятся к иммунному ответу организма животного на чужеродный антиген, в ходе которого в организме животного продуцируются антитела на чужеродный антиген. Т-клетки класса Т112 принципиально важны для эффективной продукции высокоаффинных антител.
Термин Гс-домен антитела относится к части молекулы, содержащей шарнир, СН2- и СН3домены, но не содержащей антигенсвязывающие участки. Подразумевается, что термин также включает эквивалентные участки 1дМ или антитела другого изотипа.
Термин антитело к рецептору к ЬТ-β относится к любому антителу, которое специфично связывается, по крайней мере, с одним эпитопом рецептора к ЬТ-β.
Термин антитело к ЬТ относится к любому антителу, которое специфично связывается, по крайней мере, с одним эпитопом ЬТ-а, ЬТ-β или комплекса ЬТ-α/β.
Термин передача сигналов через ЬТ-β-Κ относится к молекулярным реакциям, связанным с ЬТ-βΚ-путем, и последующим реакциям, которые развиваются вследствие первых.
Термин блокатор ЬТ-β-Κ относится к агенту, который способен ослабить связывание лиганда с ЬТ-β-Κ, объединение ЬТ-β-Κ клеточной поверхности в кластеры или передачу сигналов через ЬТ-β-Κ либо который способен повлиять на интерпретацию сигнала внутри клетки.
Блокатор ЬТ-β-Κ, который действует на стадии лиганд-рецепторного связывания, способен ингибировать связывание ЬТ-лиганда с ЬТ-β-Κ, по крайней мере, на 20%. Блокатор ЬТ-β-Κ, который действует после стадии лиганд-рецепторного связывания, способен ингибировать цитотоксические эффекты стимуляции ЬТ-β-Κ на опухолевую клетку, по крайней мере, на 20%. Примеры блокаторов ЬТ-β-Κ включа
- 3 005734 ют растворимые молекулы ΕΤ-β-Κ-Ее и ЛЬ к ЬТ-α, ЬТ-β, ЬТ-α/β или ЬТ-β-Κ. Предпочтительно, антитела не вступают в перекрестные реакции с секретируемой формой ЬТ-α.
Термин биологическая активность ЬТ-β-Κ относится к
1) способности молекулы ЬТ-β-Κ или производного конкурировать за связывание с растворимым или поверхностным ЬТ-лигандом с растворимыми или поверхностными молекулами ЬТ-β-Κ; или
2) способности стимулировать развитие иммунорегуляторного ответа или цитотоксической активности наподобие нативной молекулы ЬТ-β-Κ.
Термины гетеромерный комплекс ЬТ-α/β и гетеромерный комплекс ЬТ относятся к стойкому комплексу, по крайней мере, одной субъединицы ЬТ-α и одной или более субъединиц ЬТ-β, включая растворимые, мутантные, измененные и химерные формы одной или более субъединиц. Субъединицы могут объединяться посредством электростатических, вандерваальсовых или ковалентных взаимодействий. Предпочтительно, гетеромерный комплекс ЬТ-α/β содержит, по крайней мере, две соседние субъединицы ЬТ-β и не содержит соседних субъединиц ЬТ-α. Когда гетеромерный комплекс ЬТ-α/β служит в качестве стимулятора ЬТ-β-Κ в анализе клеточного роста, комплекс является, предпочтительно, растворимым и описывается стехиометрическим соотношением ^Τ-α1/β2. Растворимые гетеромерные комплексы ЬТ-α/β не содержат трансмембранного домена и могут быть секретированы подходящей клеткойхозяином, которая экспрессирует субъединицы ЬТ-β и/или ЬТ-β (Сго\ус е! а1., 1. 1ттипо1. МеШобз, 168, стр. 78-89 (1994)).
Термин ЬТ-лиганд относится к гетеромерному комплексу ЬТ или его производному, который специфично связывается с рецептором к ЬТ-β.
Термин лигандсвязывающий домен ЬТ-β-Κ относится к части или частям ЬТ-β-Κ, которые вовлечены в процесс специфичного распознавания и взаимодействия с ЬТ-лигандом.
Термины поверхностный комплекс ЬТ-α/β и поверхностный комплекс ЬТ относятся к комплексу, содержащему субъединицы ЬТ-α и мембранно-связанные субъединицы ЬТ-β, включая мутантные, измененные и химерные формы одной или более субъединиц, которые экспрессируются на клеточной поверхности. Термин поверхностный ЬТ-лиганд относится к поверхностному комплексу ЬТ или его производному, который способен специфично связываться с рецептором к ЬТ-β.
Термин субъект относится к животному или к одной или более клеткам животного происхождения. Предпочтительно, животное представляет собой млекопитающее. Клетки могут находиться в любом виде, включая, но не ограничиваясь, клетки, оставленные в ткани, кластеры клеток, иммортализованные, трансфицированные или трансформированные клетки и клетки, полученные из животного, которое было физически или фенотипически изменено.
Лимфотоксин-β: Член семейства Т№.
Выяснилось, что цитокины, родственные фактору некроза опухоли (ТЫР), представляют собой большое семейство плейотропных медиаторов иммунной защиты и регуляции иммунной системы. Члены данного семейства существуют в мембранно-связанной форме, которая действует местно посредством межклеточных контактов, или в виде секретируемых белков, которые способны действовать на удаленные мишени. Параллельно семейство ТЫР-родственных рецепторов взаимодействует с данными цитокинами и запускает разнообразные пути, включая клеточную гибель, клеточную пролиферацию, дифференцировку ткани и провоспалительные реакции.
ТЫР, лимфотоксин-α (ЬТ-α, также называемый ТЫР-β) и лимфотоксин-β (ЬТ-β) являются членами семейства ТЫР лигандов, которые также включают лиганды рецепторов Раз, СЭ27, СОЗО, СЭ40, ОХ-40 и 4-1ВВ (Χιηίΐΐι е! а1., Се11, 76, стр. 959-62 (1994)). Передача через некоторые члены семейства ТЫР, включая ТЫР, ЬТ-α, ЬТ-β и Раз, может индуцировать гибель опухолевой клетки по механизму некроза или апоптоза (запрограммированной клеточной гибели). В неопухолевых клетках ТЫР и многие лигандрецепторные взаимодействия в пределах семейства ТЫР влияют на развитие иммунной системы и ответы на различные антигенные стимулы.
Большинство мембранно-связанных комплексов ЬТ-α/β (поверхностных ЬТ) отвечают стехиометрическому соотношению ЬТ-Ш^ (Бго^шпд е! а1., Се11, 72, стр. 847-56 (1993); Вго^шпд е! а1., I. 1ттипо1., 154, стр. 33-46 (1995)). Поверхностные ЬТ-лиганды не связываются с ТЫР-Κ с высокой аффинностью и не стимулируют передачу сигналов через ТЫР-Κ. Другой ТЫР-родственный рецептор, называемый рецептором к ЬТ-β (ЬТ-β-Κ), связывает данные поверхностные лимфотоксиновые комплексы с высокой аффинностью (Сго\\'е е! а1., 8е1епее, 264, стр. 707-10 (1994)).
Передача сигналов через ЬТ-β-Κ, как и передача сигналов через ТЫР-Κ, обладает антипролиферативным эффектом и может являться цитотоксической по отношению к опухолевым клеткам. В совместно поданной заявке на патент Соединенных Штатов, серийный номер 0/378968, авторов настоящей заявки описаны композиции и способы для избирательной стимуляции ЬТ-β-Κ с применением стимуляторов ЬТ-β-Κ. Стимуляторы ЬТ-β-Κ применимы для ингибирования роста опухолевых клеток без коактивации ΤЫР-Κ-индуцированных провоспалительных и иммунорегуляторных путей.
- 4 005734
Что касается воздействия на неопухолевые клетки, ΤΝΡ и ΤΝΡ-родственные цитокины стимулируют развитие широкого круга иммунных реакций. Как ΤΝΡ, так и ΕΤ-α-лиганды связываются и стимулируют ΤΝΡ-рецепторы (р55 или р60 и р75 или р80; называемые здесь ΤΝΡ-Κ). ΤΝΡ и БТ-α продуцируются макрофагами в ранней и быстрой реакции на бактериальную инфекцию, которая усиливает бактерицидную активность макрофагов и нейтрофилов. ΤΝΡ и ΕΤ-α, продуцируемые макрофагами или цитотоксическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ или киллерными Т-клетками), связываются с рецепторами к ΤΝΡ на поверхности клеток-мишеней и запускают гибель восприимчивых клеток.
ΤΝΡ и ΤΝΡ-родственные цитокины способны также запускать воспалительные каскады в ответ на инфекцию или стресс. Выброс ΤΝΡ, ΕΤ-α и ΙΡΝ-γ изменяет адгезивные свойства клеток сосудистого эндотелия и лимфоцитов определенных типов. Повышенная адгезивность облегчает миграцию фагоцитов и лейкоцитов из кровотока в ткани, окружающие очаг воспаления. Сходные воспалительные реакции играют основную роль в клеточном отторжении трансплантатов тканей и органов и при определенных иммунных нарушениях.
Лимфотоксиновые (ΕΤ) комплексы клеточной поверхности были охарактеризованы на клетках СЭ4' Т-клеточной гибридомы (11-23.Ό7), которые экспрессируют высокие уровни ΕΤ (Бго^шид е! а1., 1. 1ттипо1., 147, стр. 1230-37 (1991); Апбго1с\\'1сх е! а1., 1. Вю1. Сйет., 267, стр. 2542-47 (1992)). Данные по экспрессии и биологической роли ΕΤ-β-Κ, субъединиц ΕΤ и поверхностных ΕΤ комплексов приведены в обзоре С.Р. \Уаге е! а1., Τίκ йдапбз апб гесер!огз о£ 1Не 1утрйо!охш зуз!ет, в РаШ^ауз £ог СуЮ1уы5. Сштеп! Τορ^с8 МюгоЬю1. 1ттипо1., 8ргшдег-Уег1ад, стр. 175-218 (1995).
Экспрессия ΕΤ-α индуцируется, а ΕΤ-α секретируется преимущественно активированными Т- и Влимфоцитами и естественными киллерами (ΝΚ). Оказывается, что среди подклассов Т-хелперных клеток ΕΤ-α продуцируется Τ111-, но не продуцируется ТЬ2-клетками. ΕΤ-α также был определен в меланоцитах. Анти-ΕΤ-α антитела могут быть также сорбированы на клетки микроглии и Т-клетки в очагах рассеянного склероза.
Лимфотоксин-β (также называемый р33) был выявлен на поверхности Т-лимфоцитов, Т-клеточных линий, В-клеточных линий и лимфокин-активированных киллерных (БАК) клеток. ΕΤ-3 является субъектом совместно поданных международных заявок авторов настоящей заявки РСТ/и891/04588, опубликованной 9 января 1992 года, как \УО92/00329; и РСТ/и893/11669, опубликованной 23 июня 1994 года, как ^094/13808, которые включены здесь в качестве ссылки.
Поверхностные ΕΤ комплексы преимущественно экспрессируются активированными Т- и В-лимфоцитами и естественными киллерами (ΝΚ), что может быть определено с помощью РАС8-анализа или в соответствии с иммуногистологическими методиками с применением анти-ΕΤ-α антител или растворимых гибридных белков ΕΤ-βα-Κ-Рс. Поверхностный ΕΤ был также описан в клонах цитотоксических Тлимфоцитов (СЕБ) человека, на активированных периферических мононуклеарных лимфоцитах (РМБ), на 1Б-2-активированных периферических лимфоцитах крови (ЕАК-клетках), на периферических Влимфоцитах (РВБ), активированных митогеном фитолакки или активированных анти-СЭ40, и в различных лимфоидных опухолях из Т- и В-клеточных рядов. Контакт с аллоантиген-несущими клетками мишенями специфично индуцирует экспрессию поверхностного ΕΤ клонами С.П8' и С.П4' СТБ.
Рецептор к ΕΤ-β, член ΤΝΡ-семейства рецепторов, специфически связывает поверхностные ΕΤлиганды. ΕΤ-β-Κ связывает гетеромерные комплексы ΕΤ (преимущественно ΕΤ-α1/β2 и ΕΤ-α2/β1), но не связывает ΤΝΡ или ΕΤ-α (Сго^е е! а1., 8с1епсе, 264, стр. 707-10 (1994)). Передача сигнала через ΕΤ-β-Κ может играть роль в развитии периферических лимфоидных органов и в развитии гуморальных иммунных реакций.
Исследования экспрессии ΕΤ-β-Κ находятся на ранних стадиях. мРНК, кодирующая ΕΤ-β-Κ, обнаружена в селезенке, тимусе и других важнейших органах человека. Характер экспрессии ΕΤ-β-Κ сходен с таковым, показанным для ρ55-ΤΝΡ-Κ, за исключением того, что ΕΤ-β-Κ отсутствует на Т-клетках периферической крови и на Т-клеточных линиях.
Продукция растворимых ΕΤ-комплексов.
Растворимые гетеромерные комплексы ΕΤ-α/а содержат субъединицы ΕΤ-а, которые преобразованы из мембранно-связанной в растворимую форму. Данные комплексы подробно описаны в совместно поданной международной заявке авторов настоящей заявки (РСТ/и893/11669, опубликованной 23 июня 1994 года, как \УО94/13808). Растворимые ΕΤ-а-пептиды определяются аминокислотной последовательностью лимфотоксина-а, где последовательность расщепляется в любой точке между концом трансмембранного фрагмента (т.е. приблизительно у аминокислотного остатка Ио 44) и первым ΤΝΡ-гомологичным фрагментом (т.е. у аминокислотного остатка № 88) в соответствии с системой нумерации Вго\\'1йпд е! а1., Се11, 72, стр. 847-56 (1993).
Растворимые ΕΤ-а-полипептиды могут быть получены путем усечения Ν-конца ΕΤ-а с удалением цитоплазматического фрагмента и трансмембранного фрагмента (Сго\уе е! а1., 8аепсе, 264, стр. 707-10 (1994)). Альтернативно, трансмембранный домен может быть инактивирован путем делеции или замещения гидрофобных аминокислотных остатков, которые содержат трансмембранный домен в норме,
- 5 005734 гидрофильными остатками. В другом случае создается существенно гидрофильный профиль гидрофобности, который снижает сродство к липидам и повышает водорастворимость. Делеция трансмембранного домена является предпочтительной по сравнению с замещением гидрофильными аминокислотными остатками, поскольку это позволяет избежать внесения потенциально иммуногенных эпитопов.
Исключенный или инактивированный трансмембранный домен может быть замещен или присоединен к лидерной последовательности типа I (например, к лидерной последовательности УСАМ-1) таким образом, что последовательность секретируемого белка начинается с остатка, находящегося между уа140 и рго88. Растворимые ЬТ-а-полипептиды могут включать в себя любое количество хорошо известных лидерных последовательностей на Ν-конце. Такая последовательность позволит пептидам экспрессироваться и служить мишенью для каскада секреции в эукариотической системе. Смотри, например, Εγπκϊ е! а1., патент Соединенных Штатов № 5082783 (1992).
Растворимые гетеромерные комплексы ЬТ-а./а могут быть получены путем совместного трансфицирования подходящей клетки-хозяина ДНК, кодирующей ЬТ-α и растворимый ЬТ-а (Сго\ус е! а1., 1. 1ттипо1. МсРюФ. 168, стр. 78-89 (1994)). Растворимый ЬТ-а, секретируемый в отсутствие ЬТ-β, сильно олигомеризован. Однако, когда он экспрессируется совместно с ЬТ-α, образуется гримерная структура массой 70 кДа, которая содержит оба белка. Также можно получить растворимые гетеромерные комплексы ЬТ-а1/а2 путем трансфицирования клеточной линии, которая в норме экспрессирует только ЬТ-α (такая, как линия ΚΡΜΙ 1788, обсуждавшаяся выше), геном, кодирующим растворимый полипептид ЬТ-а.
Полипептиды ЬТ-α и ЬТ-а могут быть синтезированы по отдельности, денатурированы с использованием нестойких детергентов, смешаны вместе и ренатурированы путем удаления детергента с образованием смешанных гетеромерных комплексов ЬТ, которые могут быть выделены (смотри ниже).
Очистка комплексов ЬТ-а1/а2.
Растворимые гетеромерные комплексы ЬТ-а1/а2 выделяют из совместно экспрессируемых комплексов с различными стехиометрическими соотношениями субъединиц по методу хроматографии, применяя рецепторы к ΕΝΕ и ЬТ-а в качестве реагентов для аффинной очистки. Т№-рецепторы связываются лишь с α/α-щелями комплексов ЬТ. Рецептор к ЬТ-а с высокой аффинностью связывается с а/а-щелями и с меньшей аффинностью с α/а-щелями гетеромерных комплексов ЬТ-α/ή. Соответственно, ЬТ-а.3 и ЬТ-а.2/а1 будут связываться с Т№-К ЬТ-а-Κ также способен связывать тримеры ЬТ-а2/а1 (с а/а-щелями), но не способен связывать ЬТ-а.3. В дополнение к этому, ЬТ-а-Κ (но не Т№-К) связывает ЬТ-α. 1/а2 и ЬТ-ап (точный состав такого соединения неизвестен, однако, оно представляет собой крупные агрегаты).
Аффинные реагенты на основе рецепторов могут быть получены либо в виде растворимого внеклеточного домена (смотри, например, ЬоеЬсЕег е! а1., 1. Бю1. СЕет., 266, стр. 18324-29 (1991)), либо в виде химерных белков, состоящих из внеклеточного лигандсвязывающего домена, присоединенного к Есдомену иммуноглобулина (ЬоеФсЕег е! а1., I. Бю1. СЕет., 266, стр. 18324-29 (1991); Сго\\'е е! а1., 8с1епсе, 264, стр. 707-10 (1994)). Рецепторы связывают с аффинными матрицами посредством химического поперечного сшивания, применяя устоявшиеся методики.
Существуют две схемы, по которым ЬТ-а1/а2-лиганд может быть очищен с применением рецепторов и иммуноаффинной хроматографии. В соответствии с первой схемой супернатант из системы с подходящей экспрессией, экспрессирующей как ЬТ-α, так и усеченную форму ЬТ-а, пропускают через колонку с Т№-К. ΪΝΕ-К будет связывать ЬТ-а3 и тримеры ЬТ-а2/а1. Элюат, прошедший через колонку с Т№-К, будет содержать ЬТ-а(п) и ЬТ-а/а2.
В соответствии со второй схемой все ЬТ-а-содержащие формы (ЬТ-а(п), ЬТ-а1/а2 и ЬТ-а2/а1) сажают на колонку с ЬТ-а-Κ и элюируют с нее, применяя классические методики изменения сЕао!горЕе или рН (ЬТ-а3 элюируется сквозь колонку). Элюат нейтрализуют или удаляют сЕаоЕорЕе, а элюат затем пропускают через колонку с Т№-К, который связывает лишь тримеры ЬТ-а2/а1. Элюат, прошедший через данную колонку, будет содержать ЬТ-а(п) и ЬТ-а1/а2.
В обоих случаях чистые тримеры ЬТ-а1/а2 могут быть отделены от ЬТ-а с помощью последовательного выполнения методик гель-фильтрации и/или ионообменной хроматографии, известных в данной области.
Альтернативно, различные формы гетеромерных комплексов ЬТ-а/а могут быть разделены и очищены в соответствии с множеством традиционных хроматографических методик. Также предпочтительным может являться объединение серии традиционных схем очистки с одной из стадий иммуноаффинной очистки, описанных выше.
Скрининг для поиска блокаторов ЬТ-β-Κ.
В одном осуществлении данного изобретения блокатор ЬТ-β-Κ содержит антитело (АЕ) к ЬТ-β-Κ, которое ингибирует передачу сигнала через ЬТ-β-Κ. Предпочтительно, анти-ЬТ-β-Κ АЕ представляет собой моноклональное антитело (тАЕ). Одним из таких анти-ЬТ-β-Κ тАЕ является тАЕ ΒΌΑ8.
Ингибирующие анти-ЬТ-β-Κ АЕ и другие блокаторы ЬТ-β-Κ могут быть идентифицированы с применением методов скрининга, которые определяют способность одного или более агентов либо связываться с ЬТ-β-Κ или с ЬТ-лигандом, либо ингибировать эффекты передачи сигнала через ЬТ-β-Κ на клетки.
- 6 005734
В одном скрининговом методе применяются цитотоксические эффекты передачи сигнала через ЬТ-β-Β на опухолевые клетки, экспрессирующие ЬТ-β-Κ Опухолевые клетки подвергают воздействию одного или более стимуляторов ЬТ-β-Β с тем, чтобы вызвать передачу сигнала через ЬТ-β-Β. Стимуляторы ЬТ-β-Β включают гетеромерные комплексы ЬТ-α/β (предпочтительно, растворимые ЬТ-α 1/β2) в присутствии ΙΕΝ-γ или стимулирующее анти-ЬТ-β-Β ЛЬ (смотри ниже; также описанное в совместно поданной заявке на патент Соединенных Штатов серийный номер 08/378968 авторов настоящей заявки). Антитела и другие агенты, которые способны блокировать передачу сигнала через ЬТ-β-Β, выбирают, основываясь на их способности ингибировать цитотоксический эффект передачи сигнала через ЬТ-β-Β на опухолевые клетки в следующем анализе:
1) опухолевые клетки, такие как клетки НТ29, культивируют в течение от 3 до 4 суток в серии лунок для тканевой культуры, содержащих среду и, по крайней мере, один стимулятор ЬТ-β-Β в присутствии или в отсутствие серийных разведении тестируемого агента;
2) к опухолевым клеткам добавляют витальный краситель, по которому определяют функцию митохондрий, такой как МТТ, и реакции дают протекать в течение нескольких часов;
3) количественно определяют оптическую плотность смеси в каждой лунке при длине волны 550 нм (ОП 550). Значение ОП 550 пропорционально количеству опухолевых клеток, выживших в присутствии стимулятора ЬТ-β-Β и тестируемого блокатора ЬТ-β-Β в каждой лунке. Агент или комбинация агентов, которые в данном анализе способны уменьшить ^Т-β-Β-стимулированную цитотоксичность по отношению к опухолевым клеткам, по крайней мере, на 20%, являются блокаторами ЬТ-β-Β, входящими в сферу данного изобретения.
Любой агент или комбинация агентов, которые стимулируют передачу сигнала через ЬТ-β-Β, могут быть применены в описанном выше анализе для идентификации блокаторов ЬТ-β-Κ Стимуляторы ЬТ-β-Κ, которые индуцируют передачу сигнала через ЬТ-β-Β (такие, как стимулирующие анти-ЬТ-β-Β тАЬ), могут быть выбраны на основании их способности - одного или в сочетании с другими агентами - потенциироватъ цитотоксичность по отношению к опухолевым клеткам с применением анализа выживаемости опухолевых клеток, описанного выше.
Другой способ выбора блокатора ЬТ-β-Β представляет собой исследование способности предполагаемого агента непосредственно вмешиваться в процесс ЬТ-лиганд-рецепторного связывания. Агент или комбинация агентов, которые способны блокировать лиганд-рецепторное связывание, по крайней мере, на 20%, являются блокаторами ЬТ-β-Β, входящими в сферу данного изобретения.
Для проведения анализа конкуренции с предполагаемыми блокаторами ЬТ-β-Β может быть применена любая из ряда методик проведения анализа, с помощью которого измеряют прочность лигандрецепторного связывания. Прочность связывания между рецептором и лигандом может быть измерена с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ЕБ18А) или радиоиммуноанализа (ША). Параметры специфичного связывания также могут быть измерены с помощью комплексов антиген-антитело, меченных флюоресцентной меткой, или с помощью выполнения проведения анализа на клеточном сортере с возбуждением флюоресценции (ЕАС8), или путем постановки других подобных методик иммунологического анализа, каждая из которых представляет собой методику, хорошо известную в данной области.
Параметры лиганд-рецепторного связывания также могут быть измерены с помощью прибора В1Асоге (Рйаттас1а Вюкеикот), в котором используется явление р1актои резонансного определения (Ζΐιοιι е1 а1., ВюсйетЕйу, 32, стр. 8193-98 (1993); Еаедетйтат апб О'811аппе55у ЗшГаке р1актои гекоиаисе бе1ес1юи ίη ηΓΓίηίΙν 1ес1то1още5. в НаибЬоок оГ АГГтйу СНготаЮщарНу, стр. 229-52, Магсе1 Эеккег. 1ис., Уотк (1993)).
Технология В1Асоге позволяет посадить рецептор на золотую поверхность и пропускать над ним лиганд. Р1актои резонансное определение позволяет непосредственно количественно определить массу, связавшуюся с поверхностью за определенное время. Данная методика позволяет определить константы скорости как прямой, так и обратной реакции, и, таким образом, константа диссоциации и константа сродства комплекса лиганд-рецептор могут быть непосредственно определены в присутствии и в отсутствие предполагаемого блокатора ЬТ-β-Β.
С помощью данных или иных методик для измерения параметров связи в комплексе рецепторлиганд можно оценить способность блокатора ЬТ-β-Κ, одного или в сочетании с другими агентами, ингибировать связывание поверхностных или растворимых ЬТ-лигандов с поверхностными или растворимыми молекулами ЬТ-β-Β. Такие анализы также могут быть применены для тестирования блокаторов ЬТ-β-Β или производных таких агентов (например, конденсированных, химерных, мутантных или химически модифицированных форм), одних или в сочетании с другими агентами, для оптимизации способности данного модифицированного агента блокировать стимуляцию ЬТ-β-Κ
Продукция растворимых молекул ЬТ-β-Β.
В одном осуществлении данного изобретения блокаторы ЬТ-β-Β содержат растворимые молекулы рецептора к ЬТ-β.
Фиг. 1 показывает последовательность внеклеточного фрагмента человеческого ЬТ-β-Κ, которая кодирует лигандсвязываюший домен. Применяя информацию последовательности, приведенную на фиг. 1,
- 7 005734 и методики получения рекомбинантной ДНК, хорошо известные в данной области, функциональные фрагменты, кодирующие лигандсвязывающий домен ЬТ-β-Κ, могут быть клонированы в векторе и экспрессированы подходящим хозяином с получением растворимой молекулы ЬТ-β-Κ. Растворимые молекулы ЬТ-β-Κ, которые по данным описанных здесь анализов могут конкурировать с нативными рецепторами к ЬТ-β за связывание ЬТ-лиганда, отбирают как блокаторы ЬТ-β-Κ.
Растворимый рецептор к ЬТ-β, содержащий аминокислотные последовательности, выбранные из таковых, приведенных на фиг. 1, может быть присоединен к одному или более гетерологичных белковых доменов (гибридных доменов) в целях увеличения устойчивости рецепторного гибридного белка ίη νίνο или в целях модулирования его биологической активности или локализации.
Предпочтительно, для создания рецепторных гибридных белков применяют стойкие белки плазмы, которые, как правило, имеют период полужизни в циркуляторном русле более чем 20 ч. Такие белки плазмы включают, но не ограничиваются ими, иммуноглобулины, сывороточный альбумин, липопротеины, аполипопротеины и трансферрин. Последовательности, которые способны нацеливать растворимую молекулу ЬТ-β-Κ на определенную клетку или тип ткани, также могут быть присоединены к лигандсвязывающему домену ЬТ-β-Κ в целях создания специфически локализованного растворимого гибридного белка ЬТ-β-Κ.
Весь внеклеточный фрагмент ЬТ-β-Κ или его функциональная часть (фиг. 1), содержащая лигандсвязывающий домен ЬТ-β-Κ, могут быть гибридизованы с постоянным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, таким как Ре-домен тяжелой цепи 1дС1 человека (Вто^шпд е! а1., 1. 1ттипо1., 154, стр. 33-46 (1995)). Растворимые гибридные белки рецептор-1д-С являются предпочтительными и представляют собой распространенные иммунологические реагенты, а способы их создания известны специалистам в данной области (смотри, например, патент Соединенных Штатов № 5225538, включенный здесь в качестве ссылки).
Функциональный лигандсвязывающий домен ЬТ-β-Κ может быть гибридизован с Рс-доменом иммуноглобулина (1д), относящегося к классу или подклассу иммуноглобулинов, отличному от 1дС 1. Рсдомены или антитела, относящиеся к различным классам или подклассам 1д, способны активировать различные вторичные эффекторные функции. Активация происходит, когда Рс-домен связывается сходным Рс-рецептором. Вторичные эффекторные функции включают способность активировать систему комплемента, проникать через плаценту и связывать различные белки микробного происхождения. Свойства различных классов или подклассов иммуноглобулинов описаны Κοίΐΐ е! а1., 1ттипо1оду, стр. 4.8 (МокЬуУеат Воок Еигоре Ыб., 36 еб. 1993).
Активация системы комплемента запускает каскады ферментативных реакций, которые опосредуют воспаление. Продукты системы комплемента обладают множеством функций, включая связывание бактерий, эндоцитоз, фагоцитоз, цитотоксичность, продукцию свободных радикалов и солюбилизацию иммунных комплексов.
Ферментативный каскад системы комплемента может быть активирован Рс-доменами антигенсвязанных антител классов 1дС1, 1дС3 и 1дМ. Выяснилось, что Рс-домен 1дС2 является менее эффективным, а Рс-домены 1дС4, 1дА, Ι§Ό и 1дЕ являются неэффективными для активации системы комплемента. Таким образом, Рс-домен выбирают на основании того, являются ли связанные с его применением вторичные эффекторные функции желаемыми при конкретной иммунной реакции или заболевании, которые лечат с помощью гибридного белка ^Т-β-Κ-Рс.
Если предпочтительно будет повредить или убить ЬТ-лиганд-несущие клетки-мишени, для создания гибридного белка ^Т-β-Κ-Рс можно выбрать особенно активный Рс-домен (1дС1). Альтернативно, если предпочтительно будет нацелить гибридный белок ^Т-β-Κ-Рс на клетку без активации системы комплемента, можно выбрать неактивный Рс-домен 1дС4.
Были описаны мутации в Рс-домене, которые снижают или прекращают связывание с Рсрецепторами и активацию системы комплемента (8. МоггЬоп. Аппи. Рет. 1ттипо1., 10, стр. 239-65 (1992)). Данные или другие мутации могут быть применены одни или в сочетании для оптимизации активности Рс-домена, применяемого для создания гибридного белка ^Т-β-Κ-Рс.
Получение растворимого человеческого гибридного белка ЬТ-β-Κ, содержащего лигандсвязывающие последовательности, конденсированные с Рс-доменом человеческого иммуноглобулина (й^Т-β-Κ-Рс), описано в примере 1. Одну линию СНО, созданную в соответствии с примером 1, которая секретирует й^Т-β-Κ-Рс, называют 11ЬТ|Ь В-11С1 СНС#14. Образец данной линии был принят на хранение 21 июля 1995 года в Атепсап Туре СиИите Со11ес!юп (АТСС) (ВосктШе, ΜΌ) в соответствии с положениями Будапештского договора (!йе Вибарек! Ттеа!у), и ему был присвоен номер по каталогу АТСС СИЫ1965.
Получение молекулы растворимого мышиного гибридного белка ЬТ-β-Κ (11^^()-^-^0) описано в примере 2. Линию СНО, созданную в соответствии с примером 1, которая секретирует т^Т-β-Κ-Рс, называют тЬТ|Ь Κ-ΗΟ1 СНО#1.3.ВВ. Образец данной линии был принят на хранение 21 июля 1995 года в Атепсап Туре СиНите Со11ес!юп (АТСС) (ИосктШе, ΜΌ) в соответствии с положениями Будапештского договора (!йе Вибарек! Ттеа!у), и ему был присвоен номер по каталогу АТСС СЬЬ11964.
Все ограничения доступности широкому кругу исследователей вышеуказанных хранилищ АТСС будут окончательно сняты по выдаче патента на данную заявку.
- 8 005734
Различные аминокислотные остатки, образующие точку соединения в гибридном белке рецептор-1д могут изменять структуру, устойчивость и предельную биологическую активность растворимого ЬТ-βрецепторного гибридного белка. На С-конец выбранного фрагмента ЬТ-β-Κ может быть добавлена одна или более аминокислот в целях модификации точки соединения выбранным доменом слияния.
Ν-конец гибридного белка ЬТ-β-Κ также может быть модифицирован путем изменения положения, по которому выбранный фрагмент ДНК, кодирующей ЬТ-β-Κ, расщепляется на 5'-конце для вставки в рекомбинантный экспрессирующий вектор. Устойчивость и активность каждого гибридного белка ЬТ-β-Κ могут быть протестированы и оптимизированы с помощью устоявшихся методик постановки эксперимента и анализов для выбора описываемых здесь блокаторов ЬТ-β-Κ.
Применяя последовательности лигандсвязывающего домена ЬТ-β-Κ во внеклеточном домене, показанном на фиг. 1, можно также создать варианты аминокислотных последовательностей с тем, чтобы модифицировать сродство растворимого рецептора к ЬТ-β или гибридного белка к ЬТ-лиганду. Растворимые молекулы ЬТ-β-Κ по данному изобретению способны конкурировать за связывание поверхностного ЬТ-лиганда с эндогенными рецепторами к ЬТ-β на клеточной поверхности. Представляется, что любая растворимая молекула, содержащая лигандсвязывающий домен ЬТ-β-Κ, которая способна конкурировать с рецепторами к ЬТ-β на клеточной поверхности за связывание поверхностного ЬТ-лиганда, является блокатором ЬТ-β-Κ, который входит в сферу настоящего изобретения.
Растворимые молекулы ЬТ-β-Κ как блокаторы ЬТ-β-Κ.
Растворимый гибридный белок, состоящий из рецептора к ЬТ-β и иммуноглобулина человека (йЬТ-β-Κ-Εο), получали в соответствии с методиками, приведенными в примере 1, и тестировали на предмет его способности блокировать ^Т-β-Κ-индуцированную цитотоксичность по отношению к человеческим опухолевым клеткам НТ29. В таблице (пример 3) приводится сравнение способности растворимых гибридных белков рецептора к ЬТ-β (йЬТ-β-Κ-Ρο) и рецептора к Т№ (ρ55-ΊΝΓ-Κ-Ρο) блокировать ингибирующие эффекты различных Т№- и растворимых ЬТ-лигандов на рост опухолевых клеток НТ29.
Среди данных, изложенных в таблице, указаны концентрации, при которых растворимый рецептор к ЬТ-β (йЬТ-β-Κ-Ρο) способен предотвращать гибель опухолевых клеток, вызванную взаимодействием между ^Т-α1/β2-лигандом и рецепторами к ЬТ-β клеточной поверхности, на 50%. Способность блокировать рост опухолевых клеток, по крайней мере, на 20% свидетельствует о данном растворимом рецепторе к ЬТ-β как о блокаторе ЬТ-β-Κ по данному изобретению. Как и ожидалось, растворимый гибридный белок ТОТ-Я (ρ55-ТNΡ-Κ-Ρс) полностью блокирует Т№-индуцированное ингибирование роста путем связывания с и предотвращения его взаимодействия с поверхностным рецептором.
Растворимый гибридный белок ТNΡ-Κ не влияет на опосредованные ЬТ-лигандом (ЕТ-а1/|12) антипролиферативные эффекты. В противоположность этому, гибридный белок ЬТ-β-Κ блокировал эффекты ЬТ-лиганда, но не блокировал эффекты или ЬТ-α. Таким образом, растворимые гибридные белки ЬТ-β-Κ человека не вмешиваются в процесс активации и ЬТа-лигандами.
Для того чтобы определить, является ли передача сигнала через ЬТ-β-Κ также цитотоксической для опухолевых клеток у мышей и способны ли растворимые гибридные белки ЬТ-β-Κ блокировать ЬТ-β-Κиндуцированную цитотоксичность, проводили сходный эксперимент, применяя мышиные опухолевые клетки. Растворимый мышиный гибридный белок ЬТ-β-Κ-Ρο (тЬТ-β-Κ-Ρο; смотри пример 2) тестировали на предмет его способности предотвращать гибель мышиных клеток ΑΕΗΙ 164, обработанных ЬТлигандом (пример 4).
На фиг. 2 показаны эффекты растворимого мышиного ЬТ-β-Κ (тЬТ-β-Κ-Ρο) на ЬТ-лиганд-индуцированную передачу сигнала через ЬТ-β-Κ на мышиных клетках ΑΕΗΙ 164. Как показано данным анализом, клетки ΑΕΗΙ 164 гибнут при обработке растворимым ЬТ-Щ^-лигандом. Добавление тЕТ-β-Κ-Ρο блокирует ЬТ-лиганд-стимулированную клеточную гибель. Контрольный гибридный белок рецептора обладает слабым эффектом на блокирование клеточной гибели.
Эти данные показывают, что растворимый гибридный белок ЬТ-β-Κ способен эффективно конкурировать с поверхностными молекулами ЬТ-β-Κ за связывание ЬТ-лиганда. Таким образом, растворимый гибридный белок ЬТ-β-Κ-Ρο действует у мышей как блокатор ЬТ-β-Κ.
Источник антител к человеческому ЬТ-β-Κ.
В другом осуществлении данного изобретения антитела к человеческому рецептору к ЬТ-β (антиЬТ-β-Κ АЬ) функционируют как блокатор ЬТ-β-Κ. Анти-ЬТ-β-Κ АЬ по данному изобретению могут являться поликлональными или моноклональными (тАЬ) и могут быть модифицированы в целях оптимизации их способности блокировать передачу сигнала через ЬТ-β-Κ, их биологической доступности ίη νίνο, устойчивости и других желаемых свойств.
Поликлональные антисыворотки к человеческому рецептору к ЬТ-β получают, применяя традиционные методики подкожного введения животным, таким как козы, кролики, крысы, хомяки, мыши, гибридного белка человеческого рецептора к ЬТ-β и Рс-домена иммуноглобулина (пример 1) в полном адъюванте Фройнда с последующим реиммунизирующим внутрибрюшинным или подкожным введением в
- 9 005734 неполном адъюванте Фройнда. Поликлональные антисыворотки, содержащие желаемые антитела к рецептору к ЬТ-β, тестируют с помощью традиционных иммунологических методик.
Гибридомная клеточная линия (ΒΌ.Λ8.ΛΒ9), которая продуцирует мышиные шЛЬ ΒΌΆ8 к человеческому ЬТ-β-Κ, была принята на хранение 12 января 1995 года в Атспсап Туре Си1!иге СоИесОоп (АТСС) (ВоскуШе, ΜΌ) в соответствии с положениями Будапештского договора (1йе Вибарек! Тгеа1у), и ей был присвоен номер по каталогу АТСС НВ 11798. Все ограничения доступности широкому кругу исследователей вышеуказанных хранилищ АТСС будут окончательно сняты по выдаче патента на данную заявку.
Различные виды анти-ЬТ-β-Κ антител также могут быть созданы с применением стандартных методик рекомбинантной ДНК (^1п1ег апб М1к!еш, ЫаФге, 349, стр. 293-99 (1991)). Например, могут быть сконструированы химерные антитела, в которых антигенсвязывающий домен антитела животного сшит с постоянным доменом иммуноглобулина человека (например, СаЬШу е! а1., И8 4816567; Моглкоп е! а1., Ргос. Ыаб. Асаб. 8ск И.8.А., 81, стр. 6851-55 (1984)). Химерные антитела снижают выраженность наблюдаемых иммуногенных реакций, вызываемых антителами животных, если последние применяют в клинических лечебных процедурах на человеке.
В дополнение к этому, могут быть синтезированы рекомбинантные гуманизированные антитела, которые распознают ЬТ-β-Κ. Гуманизированные антитела представляют собой химерные молекулы, содержащие, в основном, последовательности человеческого 1дО, в которые введены фрагменты, ответственные за специфичное связывание антигена (например, XVО 94/04679). Животных иммунизируют желаемым антигеном, соответствующие антитела выделяют и удаляют часть последовательностей вариабельных доменов, ответственную за специфичное связывание антигена. Антигенсвязывающие фрагменты животного происхождения затем клонируют в подходящее положение генов человеческих антител, из которых были удалены антигенсвязывающие фрагменты. Наличие гуманизированных антител сводит к минимуму применение гетерологичных (межвидовых) последовательностей в человеческих антителах, а индукция ими иммунного ответа у обрабатываемого субъекта менее вероятна.
Конструирование различных классов рекомбинантных анти-ЬТ-β-Κ антител может быть также усовершенствовано созданием химерных или гуманизированных антител, содержащих вариабельные домены анти-ЬТ-β-Κ антител и постоянные домены человеческих антител (СН1, СН2, СН3), выделенных из иммуноглобулинов различных классов. Например, анти-ЬТ-β-Κ 1дМ антитела с повышенной валентностью антигенсвязывающего сайта могут быть рекомбинантно получены путем клонирования антигенсвязывающего сайта в векторах, несущих ДНК, кодирующую постоянные домены μ-цепи человеческого 1дМ (Аги1апапбат е! а1., 1. Ехр. Меб., 177, стр. 1439-50 (1993); Ьапе е! а1., Еиг. 1. 1ттипо1., 22, стр. 2573-78 (1993); Тгаипескег е! а1., Ха!иге, 339, стр. 68-70 (1989)).
В дополнение к этому, стандартные методики рекомбинантной ДНК могут применяться для изменения значений сродства связывания рекомбинантных антител с антигенами путем замены аминокислотных остатков поблизости от антигенсвязывающих сайтов. Сродство связывания гуманизированного антитела с антигеном может быть увеличено с помощью мутагенеза, основанного на молекулярном моделировании (Онеен е! а1., Ргос. Ыа!1. Асаб. 8ск И.8.А., 86, стр. 10029-33 (1989); νθ 94/04679).
Может оказаться желательным повысить или понизить сродство анти-ЬТ-β-Κ АЬ к ЬТ-β-Κ в зависимости от типа ткани-мишени или конкретной предполагаемой схемы лечения. Например, может являться предпочтительной обработка пациента постоянными уровнями анти-ЬТ-β-Κ АЬ со сниженной способностью к передаче сигнала через ЬТ-β-путь в порядке полупрофилактического лечения. Кроме того, ингибирующие анти-ЬТ-β-Κ АЬ с повышенным сродством к ЬТ-β-Κ могут являться предпочтительными для кратковременных курсов лечения.
Анти-ЬТ-β-Κ антитела как блокаторы ЬТ-β-Κ.
Анти-ЬТ-β-Κ антитела могут быть отобраны путем тестирования их способности ингибироватъ ЬТβ-Κ-индуцированную цитотоксичностъ, направленную на опухолевые клетки.
В предпочтительном осуществлении данного изобретения композиции и способы содержат мышиные тАЬ к человеческому ЬТ-β-Κ ΒΌΛ8. Показано, что тАЬ ΒΌΛ8 действует как блокатор ЬТ-β-Κ, что определено данным изобретением. Опухолевые клетки νίΌτ прекращают рост в присутствии ΙΡΝ-γ и растворимого ^Т-α1/β2-лиганда. Контрольные антитела (1§С1) не влияют на данное ингибирование роста. В противоположность этому, анти-ЬТ-β-Κ тАЬ ВЬА8 блокирует способность растворимого ЬТα1/β2-.Γππ·ι^Η ингибировать рост клеток νίΌτ. Таким образом, антитело к человеческому рецептору к ЬТ-β способно действовать как блокатор ЬТ-β-Κ, что определено настоящим изобретением.
Тестируя другие антитела к человеческому рецептору к ЬТ-β, можно ожидать, что дополнительные анти-ЬТ-β-Κ антитела, которые действуют как блокаторы ЬТ-β-Κ у людей, могут быть идентифицированы с помощью устоявшихся методик постановки эксперимента и анализов, описанных здесь.
Источник антител к поверхностному ЬТ-лиганду.
Другое предпочтительное осуществление данного изобретения содержит композиции и способы, которые включают в себя антитела к ЬТ-лиганду, которые действуют как блокаторы ЬТ-β-Κ. Как описано выше для случая анти-ЬТ-β-Κ АЬ, антитела к ЬТ-лиганду, которые действуют как блокаторы ЬТ-β-Κ,
- 10 005734 могут являться поликлональными или моноклональными и могут быть модифицированы в соответствии с устоявшимися методиками в целях модулирования их антигенсвязывающих свойств и их иммуногенности.
Антитела к ЬТ по данному изобретению могут быть выработаны по отдельности к одной из двух субъединиц ЬТ, включая растворимые, мутантные, измененные и химерные формы субъединицы ЬТ. Если в качестве антигена применяют субъединицы ЬТ, они предпочтительно представляют собой субъединицы ЬТ-β. Если применяют субъединицы ЬТ-β, предпочтительно, чтобы полученные анти-ЬТ-α антитела связывались с поверхностным ЬТ-лигандом, и не вступали в перекрестную реакцию с секретируемым ЬТ-α, и не модулировали активность ТИЕ-К (в соответствии с анализами, описанными в примере 3).
Альтернативно, антитела к гомомерному (ЬТ-β) или гетеромерному (ЬТ-α/β) комплексу, содержащему одну или более субъединиц ЬТ, могут быть выработаны и протестированы на предмет ЬТ-β-Κблокирующей активности. Предпочтительно, комплексы ΕΎ-αΙ/βΣ применяют в качестве антигена. Как обсуждалось выше, предпочтительно, чтобы полученные 34^1-^-(/.1/112 антитела связывались с поверхностным ЬТ-лигандом, и не связывались с секретируемым ЬТ-α, и не влияли на активность ТИЕ-К.
Продукция поликлональных антител к человеческому ЬТ-α описана в совместно поданной заявке авторов настоящей заявки (νθ 94/13808). Моноклональные анти-ЬТ-α и анти-ЬТ-β антитела также были описаны (Вто^шид е! а1., 1. 1ттипо1., 154, стр. 33-46 (1995)).
Гибридомная клеточная линия (В9.С9.1), которая продуцирует мышиные тЛЬ В9 к человеческому ЬТ-β-Κ, была принята на хранение 21 июля 1995 года в Ашепсаи Туре Си1!иге Со11еейоп (АТСС) (КоекуШе, МО) в соответствии с положениями Будапештского договора (!йе Вибарек! Тгеа!у), и ей был присвоен номер по каталогу АТСС НВ11962.
Гибридомная клеточная линия (ВВ.Е6.1), которая продуцирует тАЬ хомяка к мышиному ЬТ-α/β ВВ.Е6, была принята на хранение 21 июля 1995 года в Атепсап Туре СиНите Со11есйоп (АТСС) (КоскуШе, МО) в соответствии с положениями Будапештского договора (!йе Вибарек! Тгеа!у), и ей был присвоен номер по каталогу АТСС НВ 11963.
Все ограничения доступности широкому кругу исследователей вышеуказанных хранилищ АТСС будут окончательно сняты по выдаче патента на данную заявку.
Антитела к ЬТ-лиганду как блокаторы ЬТ-β-Κ.
Проводили анализ на клеточном сортере с возбуждением флюоресценции (ЕАС8) в целях скрининга на предмет антител к субъединицам ЬТ или комплексам ЬТ, которые действуют как блокаторы ЬТ-β-Κ. В данном анализе растворимый гибридный белок ΕΓ-β-Κ^ добавляют к активированным митогеном фитолакки клеткам 11-23, которые экспрессируют поверхностные ЬТ-комплексы (Вто^шид е! а1., 1. 1ттипо1., 154, стр. 33-46 (1995)), в присутствии возрастающих концентраций тестируемого антитела. Антитело, которое способно ингибировать взаимодействие рецептора к ЬТ-β и его лиганда, по крайней мере, на 20%, отбирают как блокатор ЬТ-β-Κ.
Результаты данного анализа, проведенного в целях тестирования мышиных тАЬ В9 к человеческому ЬТ-β, показывают, что анти-ЬТ-β тАЬ В9 способно избирательно ингибировать связывание растворимых гибридных белков ^Т-β-Κ-Ес с поверхностными ЬТ-лигандами, индуцированное на активированных клетках. Данные результаты подтверждают представление о том, что антитела к субъединице ЬТлиганда будут действовать как блокаторы ЬТ-β-Κ.
Описанный выше ЕАС8-анализ также применяли для тестирования ЬТ, выработанных в организме хомяка к растворимому комплексу мышиных ЬТ-α/β. Результаты данного анализа, проведенного в целях тестирования тАЬ хомяка к мышиному ЬТ-α/β ВВ.Е6, показывают, что анти-ЬТ-α/β тАЬ ВВ.Е6 способны эффективно ингибировать связывание растворимых гибридных белков ΕΕβ-Κ^ (пример 2) с поверхностными ЬТ-лигандами, экспрессируемыми на клетках мышиной Т-клеточной гибридомы, и, таким образом, являются блокаторами ЬТ-β-Κ по данному изобретению.
Предпочтительное применение комплекса ЬТ-α/β по сравнению с субъединицей ЬТ в качестве антигена для иммунизации животного может привести к более эффективной иммунизации или может привести к продукции антител, обладающих большим сродством к поверхностному ЬТ-лиганду. Представляется возможным, что в случае иммунизации комплексом ЬТ-α/β могут быть выделены антитела, которые распознают аминокислотные остатки на обеих субъединицах, ЬТ-α и ЬТ-β (например, остатки, которые образуют щель в комплексе ЬТ-α/β). Тестируя антитела к человеческому гетеромерному комплексу ЬТ-α/β, можно ожидать, что дополнительные анти-ЬТ антитела, которые действуют как блокаторы ЬТ-β-Κ у людей, могут быть идентифицированы с помощью устоявшихся методик постановки эксперимента и анализов, описанных здесь.
Блокаторы ЬТ-β-Κ ингибируют опосредованную Тй1-клетками контактную гиперчувствительность у мышей.
Блокаторы ЬТ-β-Κ по данному изобретению способны ингибировать опосредованные Тй1-клетками иммунные реакции. Одной такой опосредованной Тй1-клетками реакцией является гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ; Сйет апб Моктапп, 1. 1ттипо1., 138, стр. 3688-94-(1987); смотри также I. ^01 е! а1., 1ттипо1оду, стр. 22.1-22.12, МокЬу-Уеат Воок Еигоре Ь!б., 3б еб. (1993) для общего обсужде
- 11 005734 ния). ГЗТ индуцируется, когда сенсибилизированные антигеном ТЫ-клетки секретируют цитокины после повторного контакта с тем же антигеном.
Цитокины, продуцируемые ТЫ, являются аттрактантами и стимуляторами макрофагов, которые секретируют дополнительные эффекторные молекулы, которые запускают воспалительные реакции.
Реакции, протекающие по типу ГЗТ, подразделяют на три различных типа: контактную гиперчувствительность, гиперчувствительность туберкулинового типа и гранулематозные реакции. Три типа гиперчувствительности (ГЧ) можно различить по скорости и природе ответа на чужеродный антиген, когда его наносят непосредственно на кожу или вводят под кожу сенсибилизированного субъекта. За ходом реакции ГЗТ следят путем определения скорости и степени отека кожи.
Реакции ГЧ туберкулинового типа представляют собой кожные реакции, которые развиваются в месте введения чужеродного антигена из микроорганизма, с которым субъект ранее контактировал (например, МусоЬас1ег1пт 1иЬегси1о818 или М. 1ергае). Данную кожную реакцию, которая достигает своего максимума в интервале от 48 до 72 ч после введения антигена, зачастую применяют как базовую для диагностических тестов чувствительности к ранее встречавшимся микроорганизмам (например, туберкулиновый кожный тест). Если развивается повреждение туберкулинового типа, оно может перейти в гранулематозную реакцию при условии, что антиген будет персистировать в ткани.
Гранулематозные реакции являются клинически наиболее серьезными реакциями, протекающими по типу ГЗТ, поскольку они способны привести к развитию множества патологических эффектов, связанных с заболеваниями, опосредованными ТЫ-клетками. Гранулематозные реакции развиваются в случае, если макрофаги оказываются неспособными элиминировать антигены или иммунные комплексы, и последние продолжают стимулировать секрецию цитокинов ТЫ. Хроническое воспаление и скопление активированных макрофагов в месте нахождения стимулирующего агента характеризуют гранулематозные реакции.
Ядро из эпителиальных клеток и макрофагов, которое может быть окружено лимфоцитами и фиброзными отложениями, формирует твердое образование, называемое гранулемой. Иногда в центре гранулемы происходит интенсивная клеточная гибель (например, в пораженной туберкулезом ткани легкого). Формирование твердого образования в ткани-мишени гранулематозной реакции протекает в течение приблизительно 4 недель.
Агенты, которые влияют на частоту образования гранулем, могут быть идентифицированы с использованием инфицированных шистосомами мышей (Атт е! а1., №1иге. 356, стр. 604-607 (1992)). Гельминты шистосомы способны вызывать паразитарное заболевание, которое ведет к образованию гранулем вокруг яиц шистосом в воротных венулах инфицированной печени. Агенты, которые способны ингибировать данную опосредованную ТЫ-клетками реакцию ГЗТ, способны снижать размер гранулем или частоту или скорость образования гранулем в инфицированной шистосомами печени мышей. Клеточная реакция на яйца шистосом может быть оценена с помощью определения изменения количества и размера гранулем, образующихся у мышей, обрабатываемых возрастающими концентрациями предполагаемого блокатора ЬТ-β-Κ с течением времени.
Контактная гиперчувствительность (КГЧ) представляет собой класс ГЗТ, в котором органоммишенью является кожа. При КГЧ воспалительная реакция вызывается местным нанесением реактивного гаптена на кожу. Аллергены, как правило, состоят из, по крайней мере, одной молекулы гаптена, который обычно очень мал, чтобы являться антигеном самим по себе. Гаптен проникает через эпидермис и взаимодействует под кожей с нормальным белком с образованием нового антигенного комплекса.
Повторный контакт сенсибилизированного субъекта с гаптеном запускает реакцию ГЗТ. Конъюгат гаптена и белка-носителя в сочетании с антиген-презентирующими клетками активирует эффекторные механизмы, которые запускают секрецию цитокинов (включая 1Ь-2, 1Ь-3, ΙΓΝ-γ и ОМ-С8Г). Каскад секретируемых цитокинов стимулирует пролиферацию С'.П4' Т-клеток, изменение профилей экспрессии различных молекул адгезии клеточной поверхности и миграцию Т-клеток и макрофагов в очаг воспаления в коже. Активация цитокинового каскада и, как следствие, вазодилятация, клеточная инфильтрация и отек дермы и эпидермиса приводят к образованию припухлости и воспалению ткани-мишени, благодаря которым происходит измеримое утолщение кожи в процессе развития реакций ГЗТ.
Степень, до которой конкретный гаптен способен сенсибилизировать индивидуума, зависит от множества факторов. Данные факторы включают параметры прохождения гаптена через кожу и его взаимодействия с белком-носителем хозяина с образованием конъюгата. Один гаптен, который сенсибилизирует почти всех индивидуумов, представляет собой 2,4-динитрофторбензол (ДНФБ).
Кожная реакция на гаптен, такой как ДНФБ, по типу КГЧ представляет собой классическую животную модель клеточно-опосредованного иммунитета. Локализация данной реакции КГЧ на ухе сенсибилизированной мыши позволяет просто, точно и воспроизводимо количественно оценивать данный клеточно-опосредованный иммунный ответ ίη νίνο путем измерения толщины уха. Данные об особенностях реакции КГЧ у мышей и гистопатологии ДНФБ-индуцированной воспалительной реакции были опубликованы (СЫзйо1т е! а1., Еиг. 1. 1ттипо1., 23, стр. 682-688 (1993)).
- 12 005734
Способность ДНФБ вызывать реакцию контактной гиперчувствительности у большинства индивидуумов может быть применена для определения агентов, которые снижают или устраняют воспалительные реакции, связанные с опосредованными ТЫ-клетками реакциями ГЗТ. Растворимый мышиный гибридный белок ЬТ-Р-К-Ес эффективно ингибирует ДНФБ-индуцированную реакцию контактной гиперчувствительности у мышей. Первоначально мышей сенсибилизировали путем нанесения ДНФБ на нижнюю часть каждой задней лапы в течение 2 дней подряд. Через 5 дней после первичной сенсибилизации на поверхность левого уха наносили субирритантную дозу ДНФБ в растворе-носителе. Раствор-носитель в отдельности наносили на правое ухо в качестве контроля.
Затем возрастающие концентрации блокатора ЬТ-β-Κ тЬТ-р-К-Ес (пример 2) внутривенно вводили мышам. Инъекции фосфатно-солевого буфера в отдельности или гибридного белка 1дС человека (ЬЕЛ3Ес) служили в качестве отрицательных контролей, а инъекция тАЬ, специфичных к УБЛ4, (тАЬ Р8/2), которые ингибируют КГЧ, служила в качестве положительного контроля. Через 24 ч после иммунной стимуляции измеряли толщину каждого уха (ДНФБ-стимулированного и нестимулированного). Об ингибировании реакции отека уха блокатором ЬТ-β-Κ судили по сравнению обрабатываемых групп с группой отрицательного контроля.
Показано, что тЬТ-в-К-Ес вызывает значительное уменьшение реакции отека уха у мышей, обработанных ДНФБ, по сравнению с ДНФБ-обработанными контрольными животными, не получившими инъекции ингибитора, (РВ8 и ЬЕА3-Ес). Растворимый ЬТ-β-Κ способен ингибировать данную реакцию КГЧ так же эффективно, как и ингибирующее тАЬ, специфичное к УЬА4 (тАЬ Р8/2), которое действует путем ингибирования миграции Т-клеток в место действия стимула (СЕЫюЕп е! а1., Еиг. 1. 1ттипо1., 23, стр. 682-688 (1993)).
Эти данные показывают, что растворимый гибридный белок ЬТ-β-Κ, который действует как блокатор ЬТ-β-Κ ίη νίίτο, также способен эффективно ингибировать опосредованную ТЫ-клетками иммунную реакцию, будучи введен в организм животного. Блокаторы ЬТ-β-Κ по данному изобретению, идентифицированные ίη νίίτο, могут быть протестированы с помощью данного анализа отека уха или других анализов на ГЗТ, как описанные выше, для выбора дополнительных блокаторов ЬТ-β-Κ, которые были бы применимы для уменьшения тяжести связанных с ТЫ-клетками иммунных реакций ίη νίνο.
Блокаторы ЬТ-β-Κ не ингибируют опосредованный ТЪ2-клетками (гуморальный) иммунный ответ.
Как показано выше, блокаторы ЬТ-β-Κ по данному изобретению способны ингибировать опосредованный ТЫ-клетками эффекторный механизм, такой как контактная гиперчувствительность замедленного типа. Данная опосредованная ТЫ -клетками реакция ингибируется без оказания значительного влияния на зависимые от Т118-клеток реакции. Дифференциальный эффект блокаторов ЬТ-β-Κ на опосредованные ТЫ-клетками иммунные реакции был продемонстрирован с помощью наблюдения за зависимыми от Т112-клеток реакциями, такими как первичный гуморальный ответ и переключение изотипов, в присутствии блокатора ЬТ-β-Κ.
Мышам 5 раз в течение десятидневного промежутка времени вводили либо растворимый гибридный белок ЬТ-β-Κ (тЕТ-р-Р-Ес: пример 2), либо контрольный гибридный белок 1дО человека (ЬЕА3ЕС), либо оставляли необработанными. После второго введения всем мышам вводили в основание хвоста 100 мкл полного адъюванта Фройнда, содержащего 100 мкг овальбумина. Через 11 дней анализировали первичные сывороточные титры антител, специфичных к овальбумину, с помощью ЕЫ8А. специфичного к изотипам 1дО1, 1дС2а и 1дМ.
Показан также эффект блокатора мышиного ЬТ-β-Κ шЕТ-Р-Е-Ес на продукцию сывороточных антител к овальбумину у мышей, иммунизированных овальбумином. Введение блокатора ЬТ-β-Κ не влияет значительно на первичные титры антител после иммунизации овальбумином. В качестве сравнения, вмешательство в процесс СЭ40-лиганд-индуцированной передачи сигнала через рецептор СЭ40 полностью ингибирует антиген-специфичный 1д-0 ответ у мышей (Еепйипт е! а1., Е Ехр. Мей., 180, стр. 18891900 (1994)). СЭ40 представляет собой еще одну пару лиганд/рецептор из семейства ТЛЕ.
Весь процесс продукции и созревания иммуноглобулинов, несомненно, является зависимым от Т112клеток. Однако также очевидно, что продуцируемый ТЫ цитокин ГЕЛ-у принимает участие, но не является абсолютно необходимым для переключения на подкласс 1§С2а (Ниапд е! а1., 8аепсе, 259, стр. 174245 (1993)). Блокатор ЬТ-β-Κ шЬТ-Р-К-Ес не ингибировал переключение на 1дС2а в данных экспериментах. Возможно, что блокаторы ЬТ-β-Κ по данному изобретению не ингибируют данное гуморальное направление опосредованной ТЫ-клетками реакции. В дополнение к этому, параметры пролиферативных реакций лимфоцитов из мышей, обработанных тБ-Т-Р-К-Ес, не снижались.
Результаты данных экспериментов указывают на то, что лечение, основанное на введении блокаторов ЬТ-β-Κ по данному изобретению, не окажет неблагоприятного влияния на функции ТЪ2-зависимой продукции антител при развитии иммунного ответа. Нормальный профиль гуморального ответа также указывает, что интенсивная обработка растворимым шЬТ-Р-К-Ес была нетоксичной для мышей, что далее указывает на применимую в терапии природу композиций и способов, изложенных далее в данном изобретении.
- 13 005734
Заболевания, опосредованные Т-хелперными клетками.
Оказывается, что во многие органоспецифичные аутоиммунные состояния вовлечен патологический ТЫ-ответ. По этим данным был составлен обзор (Μοάίη апб ΝιιΙιηαη. Сиггеп! Ορίηίοη ίη 1ттипо1., 5, стр. 511-17 (1993); Кота^ат е1 а1., Αηη. Кеу. Iттиηο1., 12, стр. 227-57 (1994)). Данные органоспецифичные аутоиммунные состояния включают в себя рассеянный склероз, инсулинзависимый сахарный диабет, симпатическую офтальмию, увеит и псориаз.
Инсулинзависимый сахарный диабет представляет собой аутоиммунное заболевание, при котором инсулин-продуцирующие бета-клетки поджелудочной железы разрушены лейкоцитами, инфильтрующими островки Лангерганса. Диабет может быть с легкостью индуцирован у новорожденных нетучных диабетических (ηеοηаΐа1 ηοηοЬе5е ШаЬейс) (ΝΟΌ) мышей путем переноса активированных преддиабетических спленоцитов. Недавно ТЫ- и Т112-подобные клетки, по другим признакам генетически идентичные, переносили новорожденным мышам ΝΟΌ. Быстрое развитие диабета индуцировали только ТЫклетки, причем почти у всех реципиентов (Как е1 а1., Заенсе, 268, стр. 1185-88 (1995)). Данный факт указывает на то, что блокаторы ЬТ-β-Κ по данному изобретению, которые способны ингибировать эффекты опосредованной ТЫ-клетками иммунной реакции ίη νίνο, будут применимы для лечения или предотвращения инсулинзависимого сахарного диабета.
Некоторые системные аутоиммунные заболевания, включая различные поражения кожи ревматического происхождения, являются ассоциированными с ТЫ-клетками. Оказывается, что в развитие как ревматоидного артрита, так и сухого кератоконъюнктивита вовлечены ТйО- и ТЫ-клетки. В противоположность этому, системная красная волчанка (СКВ) протекает по типу аберрантной реакции с преобладанием роли ТЮ/Т112.
Некоторые хронические воспалительные заболевания также протекают по типу аберрантной ТЫопосредованной реакции, включая синдром воспаленной (раздраженной) толстой кишки, саркоидоз легкого и отторжение аллотрансплантата. Синдром воспаленной (раздраженной) толстой кишки (СВТК) у людей включает в себя, по крайней мере, две категории: язвенный колит и болезнь Крона. Считается, что оба заболевания являются результатом иммунопатологических нарушений аутоиммунного типа. В некоторых моделях СВТК на мышах очевидно, что некоторые агенты, которые ингибируют ТЫопосредованные реакции, способны ингибировать развитие или течение заболевания (Е. Ро\гпе е1 а1., 1ттиш1у 1:553 1994). Возможно, что ингибирование ТЫ-зависимого компонента иммунного ответа возымеет благоприятные эффекты при СВТК у человека. Многие модели СВТК были описаны и включены в обзоры (С. ΕΗοη е1 а1., СаЧгоеЩегокду 109:1344 1995). Существует, по крайней мере, три группы моделей: индуцированные химическим агентом, индуцированные полимерным/микробным агентом и модели иммунологического типа с использованием мутантных мышей.
В одной часто применяемой индуцированной полимерным/микробным агентом модели раствор декстрансульфата вводят мышам в питьевую воду, и после приема внутрь эпителиальная выстилка кишечника раздражается, что ведет к массивному иммунному ответу на повреждение. У животных развивается колит, который проявляется в виде диарреи, стула с кровью, потери массы тела и уменьшения длины кишечника благодаря утолщению стенки кишечника. В данной модели развиваются признаки язвенного колита: левосторонний колит и дисплазия эпителия, которая может привести к образованию злокачественной опухоли.
Вторая модель включает в себя трансплантацию отобранной группы С'.П4 Т-клеток мышам зс16, т.е. мышам, у которых отсутствуют Т- и В-клетки (Е. Ρο\νι® е1 а1., Ιη^η·^^·^ Iттиηο1οду 5:1461-1471 1993; Μοιτίδ^ν е1 а1., 1. Εχρ. Меб. 178:237 1993). Так как отобранные клетки, называемые СЭ45КВы-клетками, распространяются и заселяют лимфоидные органы мышей зс1б, нормальные механизмы предотвращения возникновения аутореактивных Т-клеток не способны функционировать нормально и аутореактивные клетки развиваются. У крыс наблюдается появление клеток, реактивных ко многим органам, тогда как у мышей реактивность наблюдается преимущественно к кишечнику. В данной модели эффективными будут являться либо агенты, которые изменяют характер распространения и развития аутореактивных клеток, либо агенты, которые ингибируют способность клеток атаковать клетки кишечника. Более того, поскольку данная модель, по крайней мере, частично имитирует патологическое развитие аутореактивных иммунокомпетентных клеток, обработка, с помощью которой ингибируется данная модель, фактически может иметь модифицирующий течение заболевания эффект у человека. В данной модели развитие заболевания может быть ингибировано с помощью антител к Т№ (Е. Ρο\νΛ е1 а1., 1ттипЦу 1, 552 1994), и было обнаружено, что данные антитела эффективны в лечении заболеваний человека (Н.М. νаη ОиНетеи е1 а1., СаЛгоеШегокду 109:109 1995). Таким образом, с помощью данной модели можно предсказать, какие агенты могут найти терапевтическое применение при СВТК. Более того, поскольку модель СЭ45КВ является примером развития ТЫ-опосредованного заболевания и фактически у крыс в данной модели развиваются заболевания многих органов, эффективность ЬТ-в-К-1д в данной системе указывает на то, что ЬТ-в-КЛд или другие средства, ингибирующие взаимодействие ЬТ-β-Κ со своим лигандом, могут оказать благоприятный эффект в лечении широкого круга родственных иммунных заболеваний.
- 14 005734
Вообще, точный размер вклада аутоантител по сравнению со специфичными Т-клетками при данных аутоиммунных заболеваниях не был описан. Клеточные реакции могут вносить основной вклад в патогенез тех системных аутоиммунных заболеваний, которые в настоящее время считаются вызываемыми преимущественно антителами, например различные поражения кожи ревматического происхождения.
Нормальный иммунный ответ на некоторые патогенные инфекционные агенты также включает в себя Тй1-опосредованный ответ, который может стать избыточным и начать представлять медицинскую проблему сам по себе. Примеры гранулематозных реакций (класса реакции ГЗТ, описанного выше), которые ведут к развитию тяжелых проблем со здоровьем, включают в себя лепру, образование гранулем в легких больных туберкулезом, саркоидоз и шистосомоз (ΒοίΙΙ с1 а1., 1ттипо1оду, стр. 22.5-6 (МокЬу-Уеаг Воок Еигоре и<к. 36 еб. 1993)). Видимо, течение псориаза также опосредовано Тй1-клетками.
Цитолитические Т-клетки, т.е. СТЙ (СЭЗ-положительные Т-клетки) также могут быть подразделены на Тй 1 - и Тй2-подобные популяции. Таким образом, возможно, что многое из того, что известно о группах Тй, также применимо и к СО8+-клеткам, которые преимущественно вовлечены в антивирусный ответ и реакцию отторжения трансплантированной ткани.
Способы лечения с применением блокаторов ЙТ-β-Ρ.
Композиции по данному изобретению будут вводиться в эффективной дозе для направленного лечения конкретного клинического состояния. Определение предпочтительного фармацевтического состава и терапевтически эффективной схемы приема лекарственного средства для данного применения проводят по методике, известной в данной области, принимая во внимание, например, состояние и массу тела пациента, объем желаемого лечения и переносимость пациентом такого лечения. Ожидается, что дозы растворимого ЙТ-β-Ρ приблизительно в 1 мг/кг будут являться подходящими начальными точками для оптимизации терапевтических доз.
Определение терапевтически эффективной дозы также может быть проведено путем постановки экспериментов ίη уйго, с помощью которых измеряют концентрацию блокатора ΚΓ-β-Κ, необходимую для того, чтобы покрыть клетки-мишени (ЬТ-β-Κ- или ЙТ-лиганд-положительных клеток в зависимости от блокатора) на срок от 1 до 14 суток. Анализы лиганд-рецепторного связывания, описанные здесь, могут быть применены для контроля за реакцией покрытия клеток. ЙТ-β-Ρ- или ЙТ-лиганд-положительные клетки могут быть отобраны из популяций активированных лимфоцитов с помощью РАСБ. На основании результатов данных анализов связывания ίη уйго можно выбрать интервал подходящих концентраций блокатора ЙТ-β-Ρ для испытания на животных в соответствии с анализами, описанными здесь.
Введение растворимых молекул ЙТ-ββ-Ρ АЬ к ЙТ-лиганду и к ЙТ-В-Р по данному изобретению, одних или в сочетании, включая выделенные и очищенные формы антител или комплексов, их солей и их фармацевтически пригодных производных, может быть завершено с помощью любого общепринятого способа введения агентов, которые проявляют иммуносупрессивную активность.
Фармацевтические композиции, применяемые в данных способах лечения, также могут находиться во множестве форм. Они включают в себя, например, твердые, полутвердые и жидкие дозированные формы, такие как таблетки, пилюли, порошки, жидкие растворы или суспензии, суппозитории и растворы для инъекций и инфузий. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Способы введения могут включать пероральное, парентеральное, подкожное, внутривенное, внутриочаговое и местное введение.
Растворимые молекулы ЙТ-β-Ρ АЬ к ЙТ-лиганду и к ЙТ-β-Ρ по данному изобретению могут быть помещены, например, в стерильные изотонические составы, содержащие или не содержащие кофакторы, которые стимулируют поглощение или устойчивость. Состав является, предпочтительно, жидким или может представлять собой лиофилизированный порошок. Например, растворимые молекулы ЙТ-β-Ρ АЬ к ЙТ-лиганду и к ЙТ-β-Ρ по данному изобретению могут быть разбавлены буферным составом, содержащим 5,0 мг/мл моногидрата лимонной кислоты, 2,7 мг/мл трехзамещенного цитрата натрия, 41 мг/мл маннитола, 1 мг/мл глицина и 1 мг/мл полисорбата 20. Данный раствор может быть лиофилизирован, положен на хранение в замороженном состоянии, а объем может быть доведен до введения стерильным \Уа1ег-Рог-1п)ес1юп (ИБР).
Также композиции будут, предпочтительно, содержать традиционные фармацевтически пригодные носители, хорошо известные в данной области (смотри, например, РетшЦопА Рйагтасеийса1 Баепсек, 164й Ебйюп, 1980, Мас РиЬйкЫпд Сотрапу). Такие фармацевтически пригодные носители могут включать другие лекарственные средства, носители, генетические носители (депейс сатега), адъюванты, разбавители и т. д., такие как человеческий сывороточный альбумин или препараты плазмы. Композиции, предпочтительно, находятся в форме разовых доз и обычно будут вводиться 1 или более раз в сутки.
Фармацевтические композиции по данному изобретению могут также быть введены с применением микросфер, липосом, других систем доставки на основе микрочастиц или составов продолжительного высвобождения непосредственно в пораженные ткани, в их окружение или иным образом в контакт с пораженными тканями или с кровотоком. Показательные примеры носителей продолжительного высвобождения включают полупроницаемые полимерные матрицы в форме заостренных предметов, таких как
- 15 005734 суппозитории или микрокапсулы. Имплантируемые или микрокапсулярные матрицы продолжительного высвобождения включают полилактиды (патент США № 3773319; ЕР 58481), сополимеры Ьглютаминовой кислоты и этил-Ь-глютамата (816таи е! а1., Вюро1утегк, 22, стр. 547-5б (1985)); поли(2гидроксиэтилметакрилат) или этиленвинилацетат (Ьапдег е! а1., I. Вюте6. Ма!ег. Кек., 15, стр. 167-277 (1981); Ьапдег, Сйет. Теей., 12, стр. 98-105 (1982)).
Липосомы, содержащие растворимые молекулы ЬТ-β-Κ АЬ к ЬТ-лиганду и к ЬТ-β-Κ по данному изобретению, одни или в сочетании, могут быть получены в соответствии с хорошо известными способами (смотри, например, ЭЕ 3218121; Ерк!еш е! а1., Ргос. Ыа!1. Аса6. 8с1. И.8.А., 82, стр. 3688-92 (1985); Н\гапд е! а1., Ргос. Ыа!1. Аса6. 8сг И.8.А. 77, стр. 4030-34 (1980); патенты США №№ 4485045 и 4544545). Обычно липосомы относятся к типу небольших (приблизительно 200-800 А) однословных липосом, содержание холестерина составляет более 30 мол.% от содержания липидов. Пропорцию содержания холестерина выбирают так, чтобы контролировать оптимальную скорость высвобождения растворимых молекул ЬТ-β-Κ АЬ к ЬТ-лиганду и к ЬТ-β-Κ.
Растворимые молекулы ЬТ-β-Κ АЬ к ЬТ-лиганду и к ЬТ-β-Κ по данному изобретению также могут быть присоединены к липосомам, содержащим другие блокаторы ЬТ-β-Κ, иммуносупрессивные средства или цитокины для модулирования ^Т-β-Κ-ингибирующей активности. Присоединение к липосомам молекул ЬТ-β-Κ, АЬ к ЬТ-лиганду и к ЬТ-β-Κ может быть проведено с помощью любого известного поперечно-сшивающего агента, такого как гетеробифункциональные агенты, которые широко применяли для присоединения токсинов или химиотерапевтических средств к антителам для направленной доставки. Конъюгация с липосомами также может быть проведена с помощью углеводнаправленного поперечносшивающего реагента гидразида 4-(4-малеимидофенил)масляной кислоты (ГМФМ) (Эихдипек е! а1., I. Се11. Вюсйет. АЬк!. 8ирр1. 16Е 77 (1992)).
Преимущества терапевтических композиций, содержащих блокаторы ЬТ-β-Κ.
Блокаторы ЬТ-β-Κ по данному изобретению способны избирательно ингибировать зависимые от Тй1- и Тй2-клеток иммунные эффекторные механизмы. Блокаторы ЬТ-β-Κ будут применимы в лечении состояний, которые обостряются благодаря активностям цитокинов, продуцируемых Тй1 (например, 1Ь-2 и ШЫ-у). Поскольку цитокины, продуцируемые Тй1, способны ингибировать реакции, зависимые от Тй2клеток, блокаторы ЬТ-β-Κ могут также косвенно стимулировать определенные реакции, зависимые от Тй2-клеток, которые в норме ингибируются Тй1-индуцированными цитокиновыми каскадами.
Способность избирательно подавлять клеточные реакции, опосредованные Тй1 (или косвенно стимулировать таковые, опосредованные Тй2), будет применима для лечения аномалий при разнообразных клеточно-опосредованных иммунных реакциях, включая различные аутоиммунные и хронические воспалительные состояния, толерантность к антигенам и клеточную реакцию отторжения трансплантатов тканей и органов.
Как обсуждалось выше, в лечении иммунных состояний с преобладающей ролью Тй1-клеток обычно применяют иммуномодуляторы и иммуносупрессоры, которые обладают плейотропными эффектами на широкий круг типов клеток и иммунных реакций. Обычно требуется применение данных неспецифических иммуносупрессоров в высоких и зачастую цитотоксических дозах, что вызывает неблагоприятные побочные эффекты.
Наличие способности изменять характер иммунного ответа подтверждено недавними исследованиями сахарного диабета у мышей, что обсуждалось выше (Ка1х е! а1., 8с1епсе, 268, стр. 1185-88 (1995)), и модели аллогенной трансплантации (8ауедй е! а1., I. Ехр. Ме6., 181, стр. 1869-74 (1995)). В последнем из них было показано, что гибридный белок, который ингибирует костимуляторный путь СЭ28-В7 Тклеток, вызывает толерантность к трансплантату почки. Толерантность коррелировала со снижением концентрации цитокинов, продуцируемых Тй1, и повышением концентрации цитокинов, продуцируемых Т112, 1п у1уо. Эти данные указывают на то, что блокаторы ЬТ-β-Κ по данному изобретению будут применимы для подавления клеточной реакции отторжения трансплантатов тканей и органов путем подавления секреции цитокинов Тй1-клетками.
Блокаторы ЬТ-β-Κ из композиций и способов по данному изобретению могут быть модифицированы с получением желаемого уровня передачи сигнала через ЬТ-β-Κ в зависимости от состояния, подвергающегося лечению нарушения или заболевания. Представляется, что абсолютный уровень передачи сигнала через ЬТ-β-Κ может быть точно настроен путем манипулирования концентрацией и значениями сродства блокаторов ЬТ-β-Κ к соответствующим им молекулярным мишеням.
Например, в одном осуществлении данного изобретения субъекту вводят композиции, содержащие растворимые молекулы ЬТ-β-Κ. Растворимый рецептор к ЬТ-β способен эффективно конкурировать с рецепторами к ЬТ-β клеточной поверхности за связывание поверхностных ЬТ-лигандов. Способность конкурировать за связывание поверхностных ЬТ-лигандов зависит от относительных концентраций растворимых молекул ЬТ-β-Κ и молекул ЬТ-β-Κ клеточной поверхности и от их относительных аффинностей к связыванию лиганда.
- 16 005734
Растворимые молекулы ЬТ-β-Κ, несущие мутации, которые повышают или снижают сродство связывания данного мутантного растворимого ЬТ-β-Κ с поверхностным лигандом, могут быть получены с применением стандартных методик рекомбинантной ДНК, хорошо известных специалистам в данной области. Большие количества молекул с сайт-специфичными или случайными мутациями могут быть протестированы на предмет их способности действовать как блокаторы ЬТ-β-Κ с применением устоявшихся методик постановки эксперимента и анализов, описанных здесь.
Сходным образом, в другом осуществлении данного изобретения антитела либо к рецептору к ЬТββ, либо к одной или более субъединицам ЬТ-лиганда функционируют как блокаторы ЬТ-β-Κ. Способность данных антител ингибироватъ передачу сигнала через ЬТ-β-Κ может быть модифицирована с помощью мутации, химической модификации или других методов, с помощью которых можно изменять эффективную концентрацию или активность антител, введенных субъекту.
Способность снижать передачу сигнала через ЬТ-β-Κ без ее полного ингибирования может оказаться важной для установления или поддержания сниженных уровней передачи сигнала через ЬТ-β-Κ, которые поддерживают нормальное функционирование иммунной системы, при ингибировании реакций, опосредованных ТЫ-клетками, когда те являются избыточными или аномальными.
Разрушения гена ЬТ-α у мышей приводит к отклонению от нормы в развитии периферических лимфоидных органов (Ие Тодш с1 а1., 8с1епсе, 264, стр. 703-7 (1994)). У таких мышей отсутствовали лимфатические узлы, а в их селезенке отсутствовало обычно четкое разделение между Т- и В-зонами в фолликулах. Авторы считают, что данный фенотип связан с утратой индуцированной поверхностным ЬТ-лигандом передачи сигнала через ЬТ-β-Κ, поскольку при модулировании активности ТИГ-Κ сходные фенотипы не наблюдались. Таким образом, способность избирательно или частично ингибировать ЬТ-βΚ-путь может быть применена в лечении аномалий развития лимфоидных органов, связанных с аномальной или избыточной экспрессией передачи сигнала через ^Т-β-Κ-путъ.
Некоторые ТЕ1-ассоциированные реакции являются принципиально важными компонентами ряда клеточно-опосредованных иммунных ответов (Κотад^^аη^ е1 а1., Апп. Κν. 1ттипо1., 12, стр. 227-57 (1994)), и полное ингибирование ТЕ1-клеточной активности при определенных обстоятельствах может быть нежелательным. Например, если может развиться значительный ТЫ-ответ, мышь может эффективно противостоять паразитарной инфекции. Инфекционные агенты, такие как Ыйепа и Тохор1а§та, также вызывают сильные ответы ТЫ-типа. У человека в ответе на инфекцию МусоЬасЮпиш 1иЬегси1о515 преобладающую роль играют ТЫ. Патогенность возбудителя лейшманиоза коррелирует с реакциями, сходными с ТЫ-ответами, охарактеризованными у мышей Щееб апб 8сой, Сиггеп! Ор1шоп ш 1ттипо1., 5, стр. 524-31 (1993)).
Возможность оказывать влияние на уровень ингибирования Т111 путем ингибирования передачи сигнала через ЬТ-β-Κ может оказаться важной для получения предельно полезных результатов, которые только могут быть получены путем обработки блокаторами ЬТ-β-Κ по данному изобретению.
Далее следуют примеры, которые иллюстрируют растворимые молекулы ЬТ-β-Κ АЬ к ЬТ-лиганду и к ЬТ-β-Κ по данному изобретению и способы, примененные для их охарактеризования. Данные примеры не следует истолковывать как ограничивающие: примеры включены в целях иллюстрации, а настоящее изобретение ограничено лишь формулой изобретения.
Пример 1. Получение растворимых человеческих рецепторов к ЬТ-β в виде гибридных белков с Гсдоменом иммуноглобулина.
Последовательность из клона человеческой кДНК, выделенную из библиотеки человеческих транскрибируемых последовательностей 12р, взятой из гибридной соматической клетки (Ваепз е1 а1., Сепоткк, 16, стр. 214-18 (1993)), ввели в СепВапк, а затем идентифицировали как последовательность, которая кодирует человеческий ЬТ-β-Κ. Последовательность данного полного клона кДНК человеческого ЬТ-β-Κ доступна с 1992 года как ввод в СепВапк Ь04270.
Внеклеточный домен ЬТ-β-Κ до трансмембранного фрагмента (фиг. 1) амплифицировали с помощью РСК с клона кДНК с применением праймеров, которые включали в себя сайты рестрикции ИоЙ и 8а11 на 5'- и 3'-концах соответственно (Вго^шпд е1 а1., I. 1ттипо1., 154, стр. 33-46 (1995)). Амплифицированный продукт вырезали с помощью ИоЙ и 8а11, очищали и лигировали к ИоП-линеаризованному вектору ρΜΌΚ901 вместе с 8а11-ИоЙ-фрагментом, кодирующим Гс-домен человеческого 1дС1. Полученный вектор содержал ген дигидрофолатредуктазы и ген гибридного белка Ρ^β-Κ.-^, транскрипция которых запускалась отдельными промоторами.
Вектор электропорировали в клети СНО бШг- и выделяли метотрексат-резистентные клоны согласно стандартным методикам. ΕΡ-β-Κ.-Τ: секретировался в среду, и для выбора клеточных линий, продуцирующих наивысший уровень рецепторного гибридного белка, применяли ЕЬ18А. Клеточные линии с высоким уровнем продукции культивировали в больших количествах и кондиционную среду отбирали. Чистый гибридный белок рецептора к ЬТ-β выделяли по методу высокоскоростной аффинной хроматографии на Рго!ет А Зерйагоке (Рйагташа).
- 17 005734
Пример 2. Получение растворимых мышиных рецепторов к ЬТ-β в виде гибридных белков с Рсдоменом иммуноглобулина.
Полный клон кДНК тЬТ-β-Κ получали путем лигирования 5'-Ыо!1/Ара11- и 3'-Ара11/Мо11фрагментов из двух частичных изолятов кДНК в сайт ЫоП рСЬМА3 (ГпУйгодеп, 8ап П1едо, СА). Последовательность данного клона кДНК доступна как ввод в СепВапк И29173. При сравнении с другой последовательностью, кодирующей тЬТ-β-Κ, находящейся в СепВапк под номером Ь38423, не было отмечено различий в кодирующих последовательностях.
Растворимый гибридной белок тЬТ-β-Κ (ЫдС1) получали путем амплификации с помощью РСК, используя полный клон кДНК тЬТ-β-Κ в качестве матрицы и праймеры 5'-ААСТ6СА6С66СС6ССАТ6С6ССТ6ССС-3' и 5'-6АСТТТ6ТС6АССАТТ6СТССТ66СТСТ66666-3'. Амплифицированный продукт очищали и вырезали с помощью ЫоП/8а11 и активировали с 8а11/ЫоД Рс-доменом человеческого 1дС1 в ЫоП-линеаризованный и обработанный фосфатазой вектор 8АВ132 с получением !ЬВ122. В целях обеспечения устойчивой экспрессии в сайт Ыо11/рМОР901 переносили кассету Ыо1к содержащую тЬТ-βΚ-Рс-фрагмент, с получением Р8Н001 и данным вектором трансфицировали клетки СНО, как было описано (Вго^шпд е! а1., 1. 1ттипо1., 154, стр. 33-46 (1995)). Клоны клеток, секретирующих т^Τ-β-Κ-Рс, идентифицировали с помощью ЕЬ18А. Очищенный рецепторный гибридный белок выделяли из супернатанта клеток СНО по методу высокоскоростной аффинной хроматографии на Рго!еш А 8ерйагозе (Рйагтас1а).
Пример 3. Применение растворимого человеческого ^-β-Κ^ для ингибирования взаимодействия рецептора к ЬТ-β и его лиганда.
Растворимый й^Τ-β-Κ-Рс тестировали на предмет его способности ингибировать связывание ЬТлиганда с рецептором к ЬТ-β с помощью анализа цитотоксичности, направленной на опухолевые клетки, описанного выше. В данном анализе растворимую форму ЬТ-лиганда (ЬТ^^), которая стимулирует передачу сигнала через ЬТ-β-Κ, применяют для цитолиза человеческих опухолевых клеток. Ингибиторы передачи сигнала через ЬТ-β-Κ способны снижать ^Τ-β-Κ-индуцированную цитотоксичность, направленную на опухолевые клетки.
Растворимые ^Τ-α1/β2-лиганды состоят из усеченных или модифицированных субъединиц ЬТ-β без функционального трансмембранного домена. Растворимые ^Т-α1/β2-лиганды связываются с ЬТ-β-Κ и стимулируют передачу через него сигнала так же, как и поверхностные формы ЬТ-лиганда (Вго\ушпд е! а1., 1. Гттипок, 154, стр. 33-46 (1995)).
Серийные разведения ЬИТ-α 1/β2, йТЫР или йЬТ-α готовили в 0,05 мл в 96-луночных планшетах и 5000 трипсинизированных клеток НТ29 (АТСС) вносили в 0,05 мл среды, содержащей 80 Ед./мл (в антивирусных единицах) йи-1ЫР-у. Через 4 дня содержание восстановленного митохондриями красителя МТТ измеряли следующим образом: добавляли 10 мкл МТТ и через 3 ч восстановленный краситель растворяли 0,09 мл изопропанола с 10 мМ НС1 и ОП измеряли на 550 нм. До внесения клеток добавляли растворимые формы рецептора или чистый человеческий 1д-С в 10 мкл с получением конечной концентрации 5 мкг/мл.
В таблице ниже сравнивается способность й^Τ-β-Κ-Рс и химерных молекул р55-ТЫР-В.-Рс (с человеческим 1дС в качестве контроля) блокировать ингибирующие эффекты различных растворимых ТЫР- и ЬТ-лигандов на рост опухолевых клеток НТ29.
Способность белков ЬТ-β-Κ и р55-ТЫР-В, гибридизованных с иммуноглобулином, блокировать ингибирующие эффекты различных ТЫР- и ЬТ-лигандов на рост НТ29.
Концентрация цитотоксического агента (нг/мл), приводящая к 50%-ному ингибированию роста. В присутствии а.
Цитотоксический агента Контрольный ЫдС р55-ΤЫР-Κ-Рс ЬТ^-ЮРс
ТЫР 0,08 >10 0,08
ЬТ-α 3 >1000 3
Ε^αΤ/βΣ 5 5 >200
а Каждый цитотоксический агент предварительно смешивали с белками, гибридизованными с 1д, за 10 мин до добавления к клеткам. Конечная концентрация гибридного белка составила 5 мкг/мл.
Ь Более высокие концентрации не тестировали.
Данные в таблице указывают на то, что растворимый гибридный белок человеческого ЬТ-β-Κ (йЬТβ-Κ-Рс) способен эффективно ингибироватъ взаимодействие между ЬТ-лигандом (^Τ-α1/β2) и рецепторами к ЬТ-β клеточной поверхности и, таким образом, является блокатором ЬТ-β-Κ по данному изобретению.
Как и ожидалось, растворимый гибридный белок ТЫР-Κ (р55-ТЫР-К-Рс) полностью блокировал ТЫР-индуцированное ингибирование роста путем связывания с ТЫР и предотвращения его взаимодействия с поверхностными рецепторами к ТЫР. Данный растворимый рецептор к ТЫР не оказывает влияния на ЬТ-лиганд-опосредованные антипролиферативные эффекты. В противоположность этому, ^Τ-ββ-Κ-Рс ингибировал ЬТ-лиганд-индуцированные цитотоксические эффекты, но не таковые, индуцированные
- 18 005734
Т^ или ЬТ-α. Таким образом, гибридные белки человеческого ЬТ-β-Κ не вмешиваются в активацию ΊΝΕ-Κ. ΊΝΕ и лигандами ЬТ-α.
Пример 4. Применение растворимого мышиного ЬТ-в-К-Гс для ингибирования взаимодействия мышиного рецептора к ЬТ-β и его лиганда.
Растворимый мышиный рецептор к ЬТ-β, сшитый с Рс-доменом человеческого 1дО1 (тЬТ-в-К-Гс: смотри пример 2) тестировали на предмет его способности ингибироватъ связывание рецептора к ЬТ-β со своим лигандом с помощью анализа цитотоксичности, направленной на мышиные клетки (фиг. 2). Анализ цитотоксичности проводили на клетках ЮЕИ1 164, применяя, по существу, ту же методику, которая была применена в анализе на клетках НТ29, описанном в примере 3 (смотри также Вгошпшд апй К1Ьо11П1, I. 1ттипо1., 143, стр. 1859-67 (1989)).
На фиг. 2 показаны эффекты т^Т-β-К-Рс на лиганд-индуцированную передачу сигнала через ЬТ-β-Κ на мышиных клетках ЮЕИ1 164. Как показано данным анализом, клетки ЮЕИ1 164 гибнут при обработке растворимым ^Т-α1/β2-лигандом в концентрациях в интервале от 1 до 100 нг/мл. т^Т-β-К-Рс ингибирует ЬТ-лиганд-стимулированную клеточную гибель. Добавление растворимого мышиного гибридного белка р55-Т№'-К-Рс или контрольных антител 1дО (каждого по 10 μ/мл) обладает незначительным или не обладает эффектом на ингибирование клеточной гибели.
Эти данные показывают, что гибридный белок т^Т-β-К-Рс способен эффективно конкурировать с поверхностными молекулами ЬТ-β-Κ за связывание ЬТ-лиганда. Эти данные также показывают, что ЬТα/β-индуцированная цитотоксичность является ^Т-β-К-опосредованной и может быть ингибирована растворимым т^Т-β-К-Рс, который действует как блокатор ЬТ-β-Κ по настоящему изобретению.
Перечень последовательностей (2) Информация по 5ЕО Ю. ΝΟ: 1:
(I) Характеристики последовательности:
(A) Длина: 197 аминокислот (Б) Тип: аминокислотная (B) Количество цепей:
(Г) Топология: линейная (II) Тип молекулы: пептид (XI) Описание последовательности: 8ЕО Ю ΝΟ: 1:
Зег <31п Рго С1п А1а Уа1 Рго Рго Туг А1а Зег С1и Азп С1п ТЬг Суз
1 5 10 15
Агд Азр <31п С1и Ьуз С1и Туг Туг С1и Рго С1п ΗΪ3 Агд 11е Суз Суз
20 25 30
Зег Агд Суз Рго Рго С1у ТЬг Туг Уа1 Зег А1а Ьуз Суз Зег Агд 11е
35 40 45
Агд Азр ТЬг Уа1 Суз А1а ТЬг Суз А1а <31и Азп Зег Туг Азп С1и ΗΪ8
50 55 60
Тгр Азп Туг Ьеи ТЬг Не Суз С1п Ьеи Суз Агд Рго Суз Азр Рго Уа1
65 70 75 80
МеБ С1у Ьеи С1и <31и 11е А1а Рго Суз ТЬг Зег Ьуз Агд Ьуз ТЬг С1п
85 90 95
Суз Агд Суз С1п Рго С1у МеЬ РЬе Суз А1а А1а Тгр А1а Ьеи С1и Суз
100 105 110
ТЬг ΗΪ8 Суз С1и Ьеи Ьеи Зег Азр Суз Рго Рго С1у ТЬг С1и А1а С1и
115 120 125
Ьеи Ьуз Азр <31и Уа1 С1у Ьуз С1у Азп Азп Н1з Суз Уа1 Рго Суз Ьуз
130 135 140
А1а С1у ΗΪ3 РЬе С1п Азп ТЬг Зег Зег Рго Зег А1а Агд Суз С1п Рго
145 150 155 160
Ηίβ ТЬг Агд Суз (31и Азп <31п С1у Ьеи Уа1 С1и А1а А1а Рго С1у ТЬг
165 170 175
А1а С1п Зег Азр ТЬг ТЬг Суз Ьуз Азп Рго Ьеи С1и Рго Ьеи Рго Рго
180 185 190
С1и МеЬ Зег С1у ТЬг
195
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (11)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ лечения ревматоидного артрита у млекопитающего, предусматривающий введение указанному млекопитающему фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество блокатора рецептора лимфотоксина-β (ЬТ-β-Κ) и фармацевтически приемлемый носитель.
    - 19 005734
  2. 2. Способ лечения ревматоидного артрита у млекопитающего, предусматривающий введение указанному млекопитающему растворимого рецептора лимфотоксина-β, дополнительно содержащего Есдомен человеческого иммуноглобулина.
  3. 3. Способ по п.1, согласно которому блокатор ЬТ-β-Κ выбран из группы, состоящей из растворимого рецептора лимфотоксина-β, антитела против рецептора лимфотоксина-β и антитела против поверхностного ЬТ-лиганда.
  4. 4. Способ по п.3, согласно которому растворимый рецептор лимфотоксина-β содержит связывающий лиганд ЬТ-β-Κ домен, который способен селективно связываться с поверхностным ЬТ-лигандом.
  5. 5. Способ по п.4, согласно которому растворимый рецептор лимфотоксина-β содержит Ес-домен имммуноглобулина человека.
  6. 6. Способ по п.3, согласно которому блокатор ЬТ-β-Κ представляет собой моноклональное антитело против рецептора лимфотоксина-β.
  7. 7. Способ по п.6, согласно которому моноклональное антитело представляет собой антитело ΒΏΑ8 против человеческого ЬТ-β-Κ.
  8. 8. Способ по п.3, согласно которому блокатор ЬТ-β-Κ представляет собой моноклональное антитело против поверхностного ЬТ-лиганда.
  9. 9. Способ по п.8, согласно которому антитело направлено против субъединицы ЬТ-лиганда.
  10. 10. Способ по п.8, согласно которому моноклональное антитело представляет собой антитело В9 против человеческого ЬТ-β-Κ.
  11. 11. Способ по п.8, согласно которому блокатор ЬТ-β-Κ представляет собой моноклональное антитело против мышиного поверхностного ЬТ-лиганда.
EA200200503A 1995-07-21 1996-07-19 Способ лечения ревматоидного артрита EA005734B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/505,606 US5925351A (en) 1995-07-21 1995-07-21 Soluble lymphotoxin-β receptors and anti-lymphotoxin receptor and ligand antibodies as therapeutic agents for the treatment of immunological disease

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200200503A1 EA200200503A1 (ru) 2002-12-26
EA005734B1 true EA005734B1 (ru) 2005-06-30

Family

ID=24011046

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA199800144A EA001200B1 (ru) 1995-07-21 1996-07-19 Фармацевтическая композиция, способ лечения, способ ингибирования иммунного ответа
EA200200503A EA005734B1 (ru) 1995-07-21 1996-07-19 Способ лечения ревматоидного артрита
EA200000122A EA002966B1 (ru) 1995-07-21 1996-07-19 СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ СИНДРОМА ВОСПАЛЕННОЙ ТОЛСТОЙ КИШКИ, СПОСОБ ВЫБОРА БЛОКАТОРА РЕЦЕПТОРА ЛИМФОТОКСИНА ( LT-b-R) И СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА ЧЕРЕЗ LT-b-R

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA199800144A EA001200B1 (ru) 1995-07-21 1996-07-19 Фармацевтическая композиция, способ лечения, способ ингибирования иммунного ответа

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200000122A EA002966B1 (ru) 1995-07-21 1996-07-19 СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ СИНДРОМА ВОСПАЛЕННОЙ ТОЛСТОЙ КИШКИ, СПОСОБ ВЫБОРА БЛОКАТОРА РЕЦЕПТОРА ЛИМФОТОКСИНА ( LT-b-R) И СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА ЧЕРЕЗ LT-b-R

Country Status (29)

Country Link
US (6) US5925351A (ru)
EP (2) EP0840616B1 (ru)
JP (3) JP4174563B2 (ru)
KR (2) KR100493980B1 (ru)
CN (3) CN1895670A (ru)
AT (1) ATE279205T1 (ru)
AU (1) AU715407B2 (ru)
BG (1) BG63330B1 (ru)
BR (1) BR9609716A (ru)
CA (1) CA2227477A1 (ru)
CZ (1) CZ298277B6 (ru)
DE (1) DE69633624T2 (ru)
DK (1) DK0840616T3 (ru)
EA (3) EA001200B1 (ru)
EE (1) EE04419B1 (ru)
ES (1) ES2225889T3 (ru)
FI (1) FI980122A (ru)
HK (1) HK1010832A1 (ru)
HU (1) HU227508B1 (ru)
MX (1) MX9800624A (ru)
NO (2) NO327163B1 (ru)
NZ (2) NZ313441A (ru)
PL (1) PL186911B1 (ru)
PT (1) PT840616E (ru)
RO (1) RO121799B1 (ru)
SI (1) SI0840616T1 (ru)
SK (1) SK286409B6 (ru)
TR (1) TR199800091T1 (ru)
WO (1) WO1997003687A1 (ru)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5925351A (en) * 1995-07-21 1999-07-20 Biogen, Inc. Soluble lymphotoxin-β receptors and anti-lymphotoxin receptor and ligand antibodies as therapeutic agents for the treatment of immunological disease
EP1723967A3 (en) * 1996-10-25 2007-01-10 Biogen Idec MA, Inc. Soluble lymphotoxin-beta receptors, anti-lymphotoxin receptor antibodies and anti-lymphotoxin ligand antibodies as therapeutic agents for the treatment of immunological diseases
US7255854B1 (en) * 1996-10-25 2007-08-14 Biogen, Inc. Use of lymphotoxin-β receptor blocking agents for the treatment of antibody mediated immunological diseases
EE05213B1 (et) * 1996-10-25 2009-10-15 Biogen, Incorporated Lmfotoksiin- β retseptori (LT- β-R) blokeeriva agensi kasutamine ja LT- β-R-i blokeerivat agensit ning CD40L-i blokeerivat agensit sisaldav farmatseutiline kompositsioon
DE69838061T2 (de) * 1997-04-18 2008-03-13 Biogen Idec Ma Inc., Cambridge Typ ii tgf-beta receptor/immunoglobulin konstante domäne fusionsproteine
US7118742B2 (en) * 1997-07-07 2006-10-10 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Ligand for herpes simplex virus entry mediator and methods of use
PT1051187E (pt) * 1998-01-30 2004-03-31 Biogen Inc Tratamento de linfomas foliculares usando inibidores da via da linfotoxina (lt)
US7060667B1 (en) * 1998-01-30 2006-06-13 Biogen Idec Ma, Inc. Treatment of follicular lymphomas using inhibitors of the LT pathway
CN1200733C (zh) * 1998-10-09 2005-05-11 拜奥根有限公司 阻断淋巴毒素β与其受体结合的物质在制备药物中的应用
TR200504220T2 (tr) * 1998-12-17 2007-04-24 Biogen Idec Ma Inc. Aktif limfotoksin-beta reseptör imunoglobülin şimeAktif limfotoksin-beta reseptör imunoglobülin şimerik proteinlerinin yüksek düzey ifadesi ve saflaştrik proteinlerinin yüksek düzey ifadesi ve saflaştırılması için bir yöntem.ırılması için bir yöntem.
BR0012006A (pt) * 1999-06-28 2002-03-12 Basf Ag Método para evitar inflamações, doenças autoimunes e crescimento de tumor, e, uso de substâncias que suprimem a ativação mediada por ltbr
US6346247B1 (en) 1999-10-28 2002-02-12 Promega Corporation Prevention and treatment of autoimmune disease with luminally administered polyclonal antibodies
CN1547590A (zh) * 2000-10-13 2004-11-17 ¸ 人源化抗-LT-β-R抗体
KR20080085082A (ko) * 2000-12-07 2008-09-22 일라이 릴리 앤드 캄파니 Ｇｌｐ-1 융합 단백질
WO2002083162A1 (en) * 2001-04-13 2002-10-24 University Of Chicago Use of a cd8+ t cell inhibitory agent in the presence of a cd4+ t cell inhibitory agent for inhibition of transplant rejection
US7265208B2 (en) * 2001-05-01 2007-09-04 The Regents Of The University Of California Fusion molecules and treatment of IgE-mediated allergic diseases
WO2003011322A1 (en) * 2001-08-02 2003-02-13 Genset S.A. Agonists and antagonists of genoxin for use in the treatment of metabolic disorders
EP1578920A4 (en) * 2002-02-08 2007-11-21 Wyeth Corp COMPOSITION AND METHOD FOR MODULATING AN INFLAMMATORY REACTION
TW200416044A (en) * 2002-07-01 2004-09-01 Biogen Inc Humanized anti-lymphotoxin β receptor antibodies
US20060147448A1 (en) * 2002-10-31 2006-07-06 Jennifer Gommerman Treatment of immunological renal disorders by lymphotoxin pathway inhibitors
EP1583503A4 (en) * 2002-12-20 2006-08-09 Biogen Idec Inc POLYVALENT LYMPHOTOXIN BETA RECEPTOR AGONISTS AND THERAPEUTIC USE THEREOF
AU2003303339A1 (en) * 2002-12-20 2004-07-22 Biogen Idec Ma Inc. Lymphotoxin beta receptor agents in combination with chemotherapeutic agents
WO2005000898A2 (en) * 2003-06-27 2005-01-06 Biogen Idec Ma Inc. Use of hydrophobic-interaction-chromatography or hinge-region modifications for the production of homogeneous antibody-solutions
US20050266004A1 (en) * 2003-12-08 2005-12-01 Jill Giles-Komar Anti-human lymphotoxin alpha antibodies, compositions, methods and uses
AU2005227322A1 (en) * 2004-03-23 2005-10-06 Biogen Idec Ma Inc. Receptor coupling agents and therapeutic uses thereof
CN101035568A (zh) * 2004-08-03 2007-09-12 比奥雷克西斯技术股份有限公司 使用包含glp－1的运铁蛋白融合蛋白的组合治疗
WO2006074399A2 (en) * 2005-01-05 2006-07-13 Biogen Idec Ma Inc. Multispecific binding molecules comprising connecting peptides
WO2006135660A2 (en) * 2005-06-10 2006-12-21 University Of Chicago Therapies involving lymphotoxin beta receptor
WO2007041694A2 (en) * 2005-10-04 2007-04-12 The Johns Hopkins University Compositions and methods for treating inflammation
WO2007109733A2 (en) 2006-03-21 2007-09-27 The Johns Hopkins University Diagnostic and prognostic markers and treatment strategies for multiple sclerosis
WO2008012629A2 (en) * 2006-07-24 2008-01-31 Biorexis Pharmaceutical Corporation Exendin fusion proteins
RU2486201C2 (ru) * 2006-10-12 2013-06-27 Дженентек, Инк. Антитела к лимфотоксину-альфа
KR20090071652A (ko) * 2006-10-20 2009-07-01 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 가용성 림프독소-베타-수용체를 이용한 탈수초성 장애의 치료
US8338376B2 (en) * 2006-10-20 2012-12-25 Biogen Idec Ma Inc. Compositions comprising variant LT-B-R-IG fusion proteins
WO2008083169A2 (en) * 2006-12-26 2008-07-10 The Johns Hopkins University Compositions and methods for the treatment of immunologic disorders
CA2680792A1 (en) * 2007-03-15 2008-09-18 Biogen Idec Ma Inc. Treatment of autoimmune disorders
NZ581742A (en) 2007-06-08 2012-09-28 Biogen Idec Inc Biomarkers for predicting anti-tnf responsiveness or non-responsiveness
US20120003235A1 (en) * 2008-12-31 2012-01-05 Biogen Idec Ma Inc. Anti-lymphotoxin antibodies
JP6952685B2 (ja) 2015-06-05 2021-10-20 アイバイオ・インコーポレイテッドＩｂｉｏ， Ｉｎｃ． 線維症の治療において使用するためのエンドスタチン断片およびバリアント
WO2019238966A1 (en) * 2018-06-15 2019-12-19 Universität Bern LIGANDS TO LIGHT OR ITS RECEPTOR LTßR FOR USE IN HAEMATOLOGIC MALIGNANCIES
WO2020229546A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Regulatory t cells targeted by lymphotoxin alpha blocking agent and uses thereof

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) * 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4338397A (en) * 1980-04-11 1982-07-06 President And Fellows Of Harvard College Mature protein synthesis
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4485045A (en) * 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
DE3218121A1 (de) 1982-05-14 1983-11-17 Leskovar, Peter, Dr.-Ing., 8000 München Arzneimittel zur tumorbehandlung
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) * 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4758549A (en) * 1983-12-13 1988-07-19 Kabushiki Kaisha Mayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Lymphokine, monoclonal antibody specific to the lymphokine and their production and uses
US4959457A (en) * 1984-05-31 1990-09-25 Genentech, Inc. Anti-lymphotoxin
NZ212207A (en) * 1984-05-31 1991-07-26 Genentech Inc Recombinant lymphotoxin
GB8529014D0 (en) 1985-11-25 1986-01-02 Biogen Nv Enhanced secretion of heterologous proteins
US4822605A (en) * 1986-02-18 1989-04-18 Exovir, Inc. Compositions and methods employing the same for the treatment of viral and cancerous skin lesions and the like
US4849509A (en) * 1987-02-20 1989-07-18 The Wistar Institute Monoclonal antibodies against melanoma-associated antigens and hybrid cell lines producing these antibodies
CA2001756A1 (en) 1988-10-31 1991-04-30 Seiichi Uesugi New human lymphotoxin n-end deletion mutant
US5225538A (en) * 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US7030080B2 (en) * 1990-06-27 2006-04-18 Biogen, Inc. Lymphotoxin-β, lymphotoxin-β complexes, pharmaceutical preparations and therapeutic uses thereof
US5670149A (en) * 1990-06-27 1997-09-23 Biogen, Inc. Lymphotoxin-β, Lymphotoxin-β complexes, pharmaceutical preparations and therapeutic uses thereof
DE69132629T2 (de) * 1990-06-27 2002-04-18 Biogen, Inc. Oberflächenkomplexbildung von lymphotoxin
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
EP0672143B1 (en) * 1992-12-04 2008-06-04 Biogen Idec MA Inc. Lymphotoxin-beta, lymphotoxin-beta complexes, pharmaceutical preparations and therapeutic uses thereof
US5747023A (en) 1994-07-01 1998-05-05 Genentech, Inc. Cancer therapy using lymphotoxin
US5876950A (en) 1995-01-26 1999-03-02 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibodies specific for different epitopes of human GP39 and methods for their use in diagnosis and therapy
US6312691B1 (en) * 1996-01-26 2001-11-06 Jeffrey L. Browning Lymphotoxin-α/β complexes and anti-lympotoxin-β receptor antibodies as anti-tumor agents
CA2211443A1 (en) 1995-01-26 1996-08-01 Biogen, Inc. Lymphotoxin-.alpha./.beta. complexes and anti-lymphotoxin-beta receptor antibodies as anti-tumor agents
GB9514518D0 (en) 1995-07-15 1995-09-13 Sod Conseils Rech Applic Guanidine salt inhibitors of NO synthase and cyclooxygenase
US5925351A (en) * 1995-07-21 1999-07-20 Biogen, Inc. Soluble lymphotoxin-β receptors and anti-lymphotoxin receptor and ligand antibodies as therapeutic agents for the treatment of immunological disease
US6291207B1 (en) 1995-07-28 2001-09-18 Northwestern University Herpes virus entry receptor protein
EE05213B1 (et) 1996-10-25 2009-10-15 Biogen, Incorporated Lmfotoksiin- β retseptori (LT- β-R) blokeeriva agensi kasutamine ja LT- β-R-i blokeerivat agensit ning CD40L-i blokeerivat agensit sisaldav farmatseutiline kompositsioon
US7255854B1 (en) * 1996-10-25 2007-08-14 Biogen, Inc. Use of lymphotoxin-β receptor blocking agents for the treatment of antibody mediated immunological diseases
GB9622660D0 (en) 1996-10-31 1997-01-08 Biocine Spa Immunogenic detoxified mutant toxin
CA2229449A1 (en) 1997-04-25 1998-10-25 Takeda Chemical Industries, Ltd. Novel receptor protein and its use
US7060667B1 (en) * 1998-01-30 2006-06-13 Biogen Idec Ma, Inc. Treatment of follicular lymphomas using inhibitors of the LT pathway
CN1200733C (zh) * 1998-10-09 2005-05-11 拜奥根有限公司 阻断淋巴毒素β与其受体结合的物质在制备药物中的应用
TR200504220T2 (tr) * 1998-12-17 2007-04-24 Biogen Idec Ma Inc. Aktif limfotoksin-beta reseptör imunoglobülin şimeAktif limfotoksin-beta reseptör imunoglobülin şimerik proteinlerinin yüksek düzey ifadesi ve saflaştrik proteinlerinin yüksek düzey ifadesi ve saflaştırılması için bir yöntem.ırılması için bir yöntem.
CN1547590A (zh) * 2000-10-13 2004-11-17 ¸ 人源化抗-LT-β-R抗体
TW200416044A (en) * 2002-07-01 2004-09-01 Biogen Inc Humanized anti-lymphotoxin β receptor antibodies
AU2003303339A1 (en) * 2002-12-20 2004-07-22 Biogen Idec Ma Inc. Lymphotoxin beta receptor agents in combination with chemotherapeutic agents
EP1583503A4 (en) * 2002-12-20 2006-08-09 Biogen Idec Inc POLYVALENT LYMPHOTOXIN BETA RECEPTOR AGONISTS AND THERAPEUTIC USE THEREOF
AU2005227322A1 (en) * 2004-03-23 2005-10-06 Biogen Idec Ma Inc. Receptor coupling agents and therapeutic uses thereof
WO2007146414A2 (en) 2006-06-15 2007-12-21 Biogen Idec Ma Inc. Combination therapy employing lymphotoxin beta receptor binding molecules in combination with second agents

Also Published As

Publication number Publication date
US7951371B2 (en) 2011-05-31
JP2012041350A (ja) 2012-03-01
HUP9802483A2 (hu) 1999-02-01
US20110250200A1 (en) 2011-10-13
DK0840616T3 (da) 2005-01-31
MX9800624A (es) 1998-04-30
CA2227477A1 (en) 1997-02-06
KR20040107513A (ko) 2004-12-20
EE9800013A (et) 1998-06-15
BG63330B1 (bg) 2001-10-31
SK286409B6 (sk) 2008-09-05
US7427403B2 (en) 2008-09-23
US6669941B1 (en) 2003-12-30
SK6898A3 (en) 2000-10-09
JP2007254488A (ja) 2007-10-04
NO20083842L (no) 1998-03-23
US5925351A (en) 1999-07-20
HU227508B1 (en) 2011-07-28
HUP9802483A3 (en) 2004-08-30
CN1895670A (zh) 2007-01-17
FI980122A0 (fi) 1998-01-20
NO980172L (no) 1998-03-23
US20050037003A1 (en) 2005-02-17
KR100493980B1 (ko) 2005-11-11
JPH11510488A (ja) 1999-09-14
AU715407B2 (en) 2000-02-03
CZ298277B6 (cs) 2007-08-15
PT840616E (pt) 2004-12-31
EP0840616A1 (en) 1998-05-13
WO1997003687A1 (en) 1997-02-06
PL324622A1 (en) 1998-06-08
TR199800091T1 (xx) 1998-04-21
DE69633624D1 (de) 2004-11-18
BR9609716A (pt) 1999-07-06
CN1607005A (zh) 2005-04-20
SI0840616T1 (en) 2005-04-30
NO327163B1 (no) 2009-05-04
EA199800144A1 (ru) 1998-08-27
KR100557258B1 (ko) 2006-03-10
EA002966B1 (ru) 2002-12-26
EP1488799A2 (en) 2004-12-22
BG102265A (en) 1998-09-30
EA001200B1 (ru) 2000-12-25
NZ503818A (en) 2001-08-31
PL186911B1 (pl) 2004-03-31
ES2225889T3 (es) 2005-03-16
CZ17298A3 (cs) 1999-05-12
EE04419B1 (et) 2005-02-15
AU6591296A (en) 1997-02-18
RO121799B1 (ro) 2008-05-30
KR19990035805A (ko) 1999-05-25
EA200000122A1 (ru) 2000-06-26
HK1010832A1 (en) 1999-07-02
NO980172D0 (no) 1998-01-14
US20110046073A1 (en) 2011-02-24
CN1146441C (zh) 2004-04-21
DE69633624T2 (de) 2006-03-09
EP0840616B1 (en) 2004-10-13
EA200200503A1 (ru) 2002-12-26
US6403087B1 (en) 2002-06-11
JP4174563B2 (ja) 2008-11-05
CN1195294A (zh) 1998-10-07
US8455445B2 (en) 2013-06-04
NZ313441A (en) 2000-07-28
FI980122A (fi) 1998-03-19
ATE279205T1 (de) 2004-10-15
EP1488799A3 (en) 2012-07-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA005734B1 (ru) Способ лечения ревматоидного артрита
US5700466A (en) Method of ameliorating or preventing septic shock using a monoclonal antibody specific to cachectin/tumor necrosis factor
CZ291047B6 (cs) Farmaceutický prostředek obsahující antagonisty faktoru růstu vaskulárních endoteliálních buněk
JP2010235621A (ja) リンホトキシン（ｌｔ）経路のインヒビターを使用する濾胞性リンパ腫の処置
KR100584704B1 (ko) 면역 질환을 치료하기 위한 치료제로서의 가용성 림포톡신-베타 수용체, 항림포톡신 수용체 항체 및 항림포톡신 리간드 항체
JP2002527403A (ja) リンホトキシンβ経路の遮断によるウイルス誘導性全身性ショックおよび呼吸窮迫の逆転
KR100204733B1 (ko) 인체 4-1비비 분자에 특이성이 있고 면역억제 효과를 갖는 모노클로날 항체
US4686281A (en) Novel synthetic peptide, process for its preparation and medicaments containing it
AU748656B2 (en) Soluble lymphotoxin-beta receptors and anti-lymphotoxin receptor and ligand antibodies, as therapeutic agents for the treatment of immunological disease

Legal Events

Date Code Title Description
TC4A Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU