RO121799B1

RO121799B1 - Utilizarea unui agent de blocare a receptorului limfotoxin-beta (lt-beta-r) la prepararea unei compoziţii farmaceutice pentru tratamentul condiţiilor imunologice

Info

Publication number: RO121799B1
Application number: RO98-00101A
Authority: RO
Inventors: Jeffrey L. Browning; Christopher D. Benjamin; Paula S. Hochman
Original assignee: Biogen Inc.
Priority date: 1995-07-21
Filing date: 1996-07-19
Publication date: 2008-05-30
Also published as: US20050037003A1; EP1488799A2; EA001200B1; JP2012041350A; DE69633624D1; BR9609716A; HK1010832A1; NO980172L; EA005734B1; EP0840616B1; HUP9802483A3; BG102265A; AU6591296A; PL186911B1; KR20040107513A; EA200000122A1; US6669941B1; KR19990035805A; US6403087B1; WO1997003687A1

Abstract

Invenţia se referă la utilizarea unei compoziţii selectate din grupul constând dintr-un LT-beta-R solubil, legat la unul sau mai multe domenii deproteină heteroloagă, un LT-beta-R solubil cuprinzând o secvenţă funcţională de aminoacizi selectaţi din aminoacizii din Secvenţa ID nr. 1 ?i un anticorp orientat împotriva unei polipeptide, a?a cum s-a prezentat în Secvenţa ID nr. 1,pentru tratarea unei boli imunologice, selectate dintr-un grup constând din scleroză multiplă, oftalmie simpatică, uveită, psoriazis, diabet zaharat dependent de insulină, artrită reumatoidă,respingerea de ţesut ?i respingerea de organ, la un animal.

Description

Invenția se referă la utilizarea unei compoziții selectate din grupul constând dintr-un LT-P-R solubil, legat la unul sau mai multe domenii de proteină heteroloagă, care blochează semnalizarea receptorului limfotoxină-β. Agenții de blocare ai receptorului limfotoxină-β sunt utili pentru tratarea bolilor imunologice, mediate de limfocit, și mai precis, pentru inhibarea răspunsurilor imune, mediate de celula Th1. Această invenție se referă la utilizarea de forme solubile ale domeniului extracelular ale receptorului limfotoxină-β, care acționează ca agenți de blocare ai receptorului limfotoxină-β. De asemenea, această invenție se referă la utilizarea de anticorpi dirijați fie împotriva receptorului limfotoxină-β, fie împotriva ligandului său, suprafața limfotoxinei, care acționează ca agenți de blocare ai receptorului limfotoxină-β.

în WO 94/13808, complexele heteromerice LT-α/β solubile (nelegate la membrană) cuprind subunități LT-β care s-au schimbat de la o formă legată la membrană la o formă solubilă. Peptidele LT-β solubile sunt definite prin secvența aminoacidă a limfotoxinei β, în care secvența este clivată la orice punct din capătul regiunii transmembranare (adică la aproximativ aminoacidul # 44) și prima regiune TNF (adică aminoacidul # 88) conform sistemului de numerotare al lui Browning et al., Cell, 72, pag. 846 - 56 (1993).

în The Journal of lmmunology,vo\A 54, nr.1, Jannuary, 1995, Baltimore, pag. 33-46, Browning et al., au prezentat și caracterizat diferite forme de limfotoxină de suprafață, cât și utilizarea de anticorpi specifici monoclonali și receptorii solubili.

Tabloul citokinelor eliberate la apariția unei provocări imune poate afecta alegerea ulterioară a căilor imune efectoare care sunt activate. Alegerea dintre mecanismele imune efectoare este mediată de limfocite T helper CD4-pozitive (celule T helper sau celule Th). CeluleleTh interacționează cu celule ce prezintă antigen (APC), care au fragmente peptidice ale antigenului străin, prelucrat în asociere cu molecule MHC din clasa II, pe suprafețele lor. Celulele Th sunt activate când recunosc epitopi particulari ai unui antigen străin, prezentat pe suprafața APC corespunzătoare, pentru care celulele Th exprimă un receptor specific. în schimb, celule Th activate secretă citokine (limfokine) care activează mecanisme imune, efectoare, corespunzătoare.

Celulele pot activa diverse mecanisme efectoare, incluzând activarea celulei T ucigașe, producerea de anticorp de către celula B și activarea macrofagelor. Alegerea mecanismelor efectoare este mediată în mare măsură de citokine care sunt produse de celulele Th activate.

Celulele se pot împărți, pe baza tabloului citokinelor produse de ele, în trei subgrupuri (Fitch et al., Ann. Rev. Immunol., 11, pag. 29-48 (1993). Aceste subgrupuri sunt numite ThO, Th1 și Th2. La șoarece, celule T helper nestimulate naive produc IL-2. Stimularea pe termen scurt conduce la celule precursoare ThO, care produc o gamă largă de citokine, incluzând IFN-Y, IL-2, IL-4, IL-5 și IL-10. Celule ThO stimulate cronic se pot diferenția în celule fie de tipul Th1, fie de tipul Th2, după cum se schimbă tabloul expresiei citokinei.

Unele citokine sunt eliberate de ambele celule Th1 șiTh2 (deexemplu, IL-3, GM-CSF și TNF). Alte citokine sunt produse exclusiv de unul sau altul dintre subgrupurile de celulă Th. Efectele specializate ale subgrupurilor de celule T helper au fost recunoscute întâi la șoareci. O subdiviziune similară a celulelor T helper există de asemenea la oameni (Romagnani et al., Ann. Rev. Immunol., 12, pag. 227-57 (1994).

Celulele Th1 produc LT-α, IL-2, și IFN-Z La oameni, imaginea Th1 a secreției citokinei s-a asociat, în general, cu imunitatea celulară și rezistența la infecție. Citokinele Th1 tind să activeze macrofage și anumite răspunsuri inflamatorii, cum ar fi hipersensibilitatea de tipul IV tip întârziat (vezi, mai jos). Citokinele Th1 joacă un rol important în respingerea celulară a grefelor de țesut și transplantelor de organ.

RO 121799 Β1

Celule Th2 produc citokinele IL-4, IL-5, IL-6 și IL-10. Citokinele Th2 cresc producția 1 de eozinofile și celule mastoide și inițiază expansiunea totală și maturarea celulelor B (Howard et al., T cell-derived cytokines and their receptors, Fundamental Immunology, 3 ed.lll Raven Press, New York (1993). De asemenea, citokinele Th2 intensifică producerea anticorpului, incluzând anticorpi IgE asociați cu răspunsuri alergice și anticorpi antigrefă. De 5 asememea, celule Th2 pot să participe în supresia imună și toleranța la antigeni persistenți.

Citokinele asociate, Th 1 - și Th2, joacă un rol în anumite răspunsuri de hipersensi- 7 bilitate - răspunsuri imune necorespunzătoare sau disproporționate, evocate la contact cu un antigen întâlnit anterior. Există patru tipuri recunoscute de hipersensibilitate (Roitt et al., 9 Immunology, pag.19.1-22.12 (Mosbylear Book Europe Ltd., ed.lll. 1993).

Tipul I hipersensibilitate imediată implică activarea celulei Th2 indusă de alergen 11 și eliberarea citokinei Th2. Citokina Th2 IL-4 stimulează celule B să sufere comutarea izotipului pentru a produce IgE, care activează celulele mastoide să producă reacții inflamatorii 13 acute, cum sunt cele care conduc la eczemă, astm și rinită.

Tipurile II și III de hipersensibilitate sunt cauzate de anticorpi IgG și IgM, dirijați 15 împotriva suprafeței celulei sau antigenilor specifici țesutului (Tip II) sau antigenilor solubili (Tip III). Aceste tipuri de reacții de hipersensibilitate sunt considerate a fi mediate de 17 celule Th.

Tipul IV, hipersensibilitate tip întârziat (DTH), este mediat de celula Th1. Reacțiile 19 DTH iau mai mult de 12 h pentru dezvoltare și sunt denumite mediate celulă, deoarece ele pot fi transferate între șoareci prin transferarea celulelor Th 1, dar nu și numai a serului. Răs- 21 punsurile DTH de Tip IV sunt clasificate în general, în trei tipuri: hipersensibilitate de contact, hipersensibilitate de tip tuberculină și hipersensibilitate granulomatoasă. 23

Numeroase răspunsuri mediate de celulă, care pot produce boală, pot fi induse la șoareci sănătoși, prin transferarea limfocitelor de la un șoarece îmbolnăvit (de exemplu, 25 diabet insulino-dependent și encefalită autoimună experimentală). Această caracteristică deosebește DTH de Tip IV de celelalte trei tipuri de hipersensibilitate, care sunt răspunsuri 27 imune umorale, cauzate inițial de anticorpi care pot fi transferați în celule fără ser.

De asemenea, celule T helper participă în reglarea schimbării izotipului de novo al 29 imunoglobulinei. Diferite subseturi Th pot influența proporția relativă a imunoglobulinelor, a unui izotip dat produs ca răspuns la provocare imună. De exemplu, citokina IL-4 Th2 poate 31 comuta celule V activate la izotipul lgG1 și suprima alte izotipuri. Așa cum s-a discutat mai sus, IL-4 activează, de asemenea, supraproducția IgE, în reacții de hipersensibilitate de Tip 33 I. Citokina IL-5 Th2 induce izotipul IgA. Aceste citokine Th2 efectuează comutarea izotipului și sunt contrabalansate de IFN-Y produs de celule Th1. 35

Imaginile diferențiale ale citokinelor secretate de celule Th1 și Th2 par să dirijeze un răspuns spre mecanisme efectoare imune diferite. Comutarea care activează fie un meca- 37 nism efector mediat de celulă, fie un mecanism efector umoral, este sensibilizată de supresia încrucișată dintre celule Th1 și celule Th2: IFN-7 produs de celule Th1 inhibă proliferarea 39 celulei Th2 și IL-10 secretat de celule Th2 pare să reducă secreția citokinei din celule Th1.

Depinzând de afinitățile relative ale citokinelor pentru țintele lor moleculare, circuitele 41 regulatoare negative Th1 și Th2 pot să amplifice efectele diferențelor concentrației mici dintre citokine Th1 și Th2. Un semnal amplificat citokină Th1 sau citokină Th2 poate declanșa 43 comutarea dintre mecanisme efectoare mediate de celulă sau umorale bazate pe schimbări mici în concentrațiile relative ale citokinelor Th1 și citokinelor Th2. Capacitatea de a controla 45 această comutare, prin modularea concentrațiilor relative ale citokinelor Th1 și Th2, va fi utilă pentru tratarea dezechilibrelor într-o diversitate de răspunsuri imune, dependentă de celulă 47 Th1 și Th2, care pot conduce la tulburări și boli imune.

RO 121799 Β1

Răspunsuri patologice Th1 sunt asociate cu un număr de condiții autoimune specifice de organ și sistemice, boli inflamatorii cronice'și reacții de hipersensibilitate de tip întârziat. Așa cum s-a discutat mai sus, răspunsuri Th1 contribuie de asemenea la răspunsuri celulare care duc la respingerea țesutului grefat și organului transplantat.

Tratamentul acestor diverse condiții imunologice bazate pe celulă Th1 au folosit, în general, până în prezent, agenți imunomodulatori și imunosupresivi, precum și un număr de medicamente cu mecanisme puțin caracterizate (de exemplu, aur sau penicilamină). în mod curent, sunt folosite trei tipuri generale de agenți imunosupresivi: steroizi, ciclosporină și azatioprină.

Steroizii sunt agenți antiinflamatori pleiotropici care suprimă microfagele activate și inhibă activitatea celulelor care prezintă antigen în moduri care inversează numeroase dintre efectele citokinei IFN-/Th1. Ciclosporină - un agent imunosupresiv potențial - suprimă producerea citokinei și reduce expresia receptorilor IL-2 pe limfocite în timpul activărilor. Azatioprina este un agent antiproliferativ care inhibă sinteza ADN. Acești agenți imunosupresivi nespecifici sunt necesari, în general, în doze ridicate, care cresc toxicitatea lor (de exemplu, nefro- și hepatotoxicitatea) și produc efecte secundare adverse. Astfel, ei sunt inadecvati pentru terapii de lungă durată.

Pentru a se adresa problemelor cauzate de tratamente convenționale cu agenți imunosupresivi nespecifici, numeroase strategii terapeutice curente vizează suprimarea sau activarea aspectelor selective ale sistemului imun. Un scop deosebit de atractiv este manipularea echilibrului dintre citokine Th1 și Th2, pentru a schimba echilibrul dintre mecanismele efectoare mediate celular și umoral.

Pentru a realiza o schimbare dintre mecanisme efectoare mediate celular și umoral, ar fi util să se poată modula activitatea unei molecule care poate schimba activitățile relative ale subclaselor de celule Th1 și Th2. Candidații pentru astfel de celule includ citokinele și receptorii lor. Date recente sugerează că LT-ot, IL-12, IFN-oc și IFN-Yfavorizează dezvoltarea răspunsurilor Th1, în timp ce IL-1 și IL-4 polarizează un răspuns spre un mecanism efector Th2 (Romagnani et al., Ann. Rev. Immunol., 12, pag. 227-57 (1994)).

Numeroase dintre citokinele celulei Th sunt regulatori ai dezvoltării și funcției imune și inhibarea producerii lor ar avea efecte dăunătoare asupra răspunsurilor mediate de celule diferite de celula T. Nu s-a identificat o țintă dorită și eficientă pentru modularea selectivă și alegerea dintre mecanismele efectoare Th1 și Th2.

Prezenta invenție rezolvă problemele enumerate mai sus, prin utilizarea de compoziții farmaceutice pentru tratarea bolilor imunologice, prin inhibarea semnalizării receptorului limfotoxină-β (LT^-R) folosind agenți de blocare ai receptorului limfotoxină-β. Mai precis, compozițiile care cuprind agenți de blocare ίΤ-β-R sunt utile pentru inhibarea răspunsurilor imune mediate de celula Th1, cum ar fi, de exemplu, sindromul inflamator al intestinului.

Utilizarea unei compoziții, conform invenției, constă în aceea că este selectată din grupul constând dintr-un ίΤ-β-R solubil, legat la unul sau mai multe domenii de proteină heteroloagă, un ίΤ-β-R solubil cuprinzând o secvență funcțională de aminoacizi selectați din aminoacizii din SECV. ID NR.1 și un anticorp orientat împotriva unei polipeptide, așa cum s-a prezentat în secvența SECV. ID NR. 1, pentru tratarea unei boli imunologice, selectată dintr-un grup constând din scleroză multiplă, oftalmie simpatică, uveită, psoriazis, diabet zaharat dependent de insulină, artrită reumatoidă, respingerea de țesut și respingerea de organ, la un animal.

într-o realizare preferată, utilizarea conform invenției este a unui agent de blocare a receptorului de limfotoxină-β (LT^-R) pentru prepararea unei compoziții farmaceutice pentru tratarea unor afecțiuni imunologice, selectate din grupul constând din scleroză multiplă, oftalmie simpatică, uveită, psoriazis, diabet zaharat dependent de insulină, artrită reumatoidă, respingerea de țesut și respingerea de organ, la un animal.

RO 121799 Β1 într-o realizare preferată, utilizarea conform invenției constă în aceea că agentul de 1 blocare LT-p-R este selectat din grupul constând din

a) un LT-β-R solubil, cuprinzând preferabil o secvență funcțională de aminoacizi 3 selectați dintre aminoacizii din SECV. ID NR. 1;

b) un anticorp orientat împotriva LT-P-R; și 5

c) un anticorp orientat contra ligandului LT de suprafață într-o altă realizare, utilizarea conform invenției, constă în aceea că agentul de 7 blocare LT-P-R cuprinde un anticorp orientat contra LT-P-R.

într-o altă realizare preferată, utilizarea conform invenției, constă în aceea că agentul 9 de blocare LT-p-R cuprinde un anticorp orientat contra LT-p-R.

într-o altă realizare preferată, utilizarea, conform invenției, constă în aceea că, pentru 11 prepararea unui medicament pentru tratarea artritei la un animal, în care compoziția farmaceutică cuprinde o cantitate eficientă dintr-o polipeptidă care cuprinde un domeniu solubil, 13 legat de ligand, al LT-p-R, legat la un domeniu Fc IgG 1 și un transportor acceptabil farmaceutic. 15

Sunt asigurate forme solubile ale domeniului extracelular al receptorului care acționează ca agenți de blocare LT-P-R. Utilizarea compozițiilor preferate ale acestei realizări 17 cuprind o proteină de fuziune recombinantă receptor limfotoxină-β, care are domeniul de legare ligand extracelular LT-p-R fuzionat la un domeniu al catenei grele a unei imuno- 19 globuline. Mai preferat, domeniul de legare ligand LT-P-R este fuzionat la un domeniu IgG Fc uman. 21

De asemenea, sunt asigurați anticorpi care acționează ca agenți de blocare LT-p-R. Utilizarea compozițiilor preferate ale acestei realizări cuprinde unul sau mai mulți anticorpi 23 dirijați împotriva receptorului limfotoxină-β. Mai preferat, anticorpul este un anticorp monoclonal. Alte compoziții preferate ale acestei realizări cuprind unul sau mai mulți anticorpi 25 îndreptați împotriva suprafeței limfotoxinei. Mai preferat, anticorpul este un anticorp monoclonal îndreptat împotriva limfotoxinei-p. 27

Această invenție furnizează un procedeu nou de căutare pentru selectarea agenților de blocare LT-p-R - cum ar fi forme solubile ale LT-P-R, anti-LT Abs și anti-LT-P-R Abs. 29 Acest procedeu de căutare implică realizarea testelor de citotoxicitate ale celulei tumorale care monitorizează semnalizarea LT-p-R. Testele utilizează sensibilitatea crescută a celule- 31 loradenocarcinomice față de semnalizarea LT-P-R indusă de ligand sau anticorp în prezența unui agent de activare LT-P-R (cum ar fi, LT-a1/p2) într-un test de citotoxicitate tumorală. 33

Agenții de blocare LT-p-R inhibă efectele citotoxice ale complexelor heteromerice LT α/β (sau altor agenți de activare LT-P-R) asupra celulelortumorale. Procedura folosită pentru 35 testarea agenților de testare LT-P-R probabili este exemplificată pentru cazul anticorpilor anti-LT-P-R (în prezența agenților de activare LT-P-R RT-a1/p2) și cuprinde următoarele 37 etape:

1) Celulele tumorale (de exemplu, celule adenocarcinomice umane HT29) sunt 39 cultivate câteva zile în mediu care conține IFN-Y și LT-a1/p2 purificate, în prezența sau absența unui anti-LT-P-R Ab particular de testat; 41

2) Celulele sunt tratate cu un colorant care colorează celulele vii; și

3) Numărul celulelor colorate este cuantificat pentru a determina fracția celulelor 43 tumorale omorâte în prezență de LT-a1/p2, IFN-Y și anticorpul test anti-LT-P-R din fiecare probă. Alternativ, numărul celulelor supraviețuitoare se poate determina prin oricare dintre 45 numeroasele teste binecunoscute, care măsoară viabilitatea celulară, cum arfi încorporarea detimidină-³Hîn ADN. Un anti-LT-p-R Ab (sau o combinație Ab) care scade procentul celule- 47 lor tumorale omorâte în acest test prin cel puțin 20% este un agent de blocare LT-P-R care este cuprins în domeniul acestei invenții, 49

RO 121799 Β1

Acest test citolitic se poate realiza folosind complexe heteromerice LT-α/β și alți agenți de activare LT-P-R fie singuri, fie în combinație. De asemenea, testul poate fi adaptat după cum este necesar, pentru a identifica noi agenți de blocare.

Invenția prezintă următoarele avantaje:

- agenții de blocare LT-P-R ai acestei invenții sunt capabili de inhibarea selectivă a mecanismelor efectoare imune Th 1 și nu dependente de celula Th2. Agenții de blocare LT-βR vor fi utili în tratarea condițiilor care sunt exacerbate de activitățile citokinelor de tip Th1 (de exemplu, IL-2 și IFN-y). Deoarece citokinele Th1 pot inhiba răspunsuri dependente de celula Th2, agenții de blocare LT-p-R pot de asemenea să stimuleze indirect anumite răspunsuri dependente de celula Th2, care sunt în mod normal inhibate de cascadele de citokină induse de Th1;

- capacitatea de a suprima selectiv răspunsurile celulei Th1 (sau de a stimula indirect Th2) va fi utilă pentru tratarea anomaliilor în diverse răspunsuri imune, mediate celular, incluzând diverse condiții autoimune și inflamatorii cronice, toleranța la antigen și respingerea celulară a grefelor de țesut și transplantelor de organe;

- așa cum s-a discutat mai sus, utilizarea condițiilor imunologice bazate pe celula Th1 folosește în general agenți imunomodulatori și imunosupresori care au efecte pleiotropice asupra unei varietăți largi de tipuri de celule și răspunsuri imunologice. Acești agenți imunosupresivi nespecifici sunt necesari în general în doze ridicate și adesea citotoxice care cauzează efecte secundare adverse;

- capacitatea de a schimba caracterul unui răspuns imunologic este susținută în studiul recent al diabetului la șoareci discutat mai sus (Katz et al., Science, 268, pag. 118588 (1995), și într-un model de transplant alogenic (Sayegh et al., J. Exp. Med., 181, pag. 1869-74 (1995). în ultimul studiu, o fuziune care blochează calea costimulatoare celulă T CD28-B7 s-a dovedit a induce toleranță la grefă renală. Toleranța s-a corelat cu o descreștere în citokinele Th2 in vivo. Aceste date arată că agenți de blocare LT-P-R ai acestei invenții vor fi utili în suprimarea respingerii celulare a grefelor de țesut și transplantelor de organ prin inhibarea eliberării citokinei mediate de celula Th1;

- agenții de blocare LT-p-R ai utilizării compozițiilor acestei invenții pot fi modificați pentru a obține un nivel dorit al semnalizării LT-P-R, depinzând de afecțiunea, tulburarea sau boala de tratat. Se are în vedere că nivelul absolut al semnalizării LT-P-R poate fi reglat cu finețe prin manipularea concentrației și afinităților agenților de blocare LT-P-R pentru țintele lor moleculare respective;

- în utilizarea compozițiilor care conțin molecule LT-P-R ce sunt administrate la un subiect, receptorul LT-β solubil poate concura efectiv cu receptorii LT-β ai suprafeței celulei pentru legarea liganzilor de suprafață LT. Capacitatea de a concura cu liganzi LT de suprafață depinde de concentrațiile relative ale moleculelor LT-P-R solubile și de suprafață celulară și de afinitățile lor relative pentru legare ligand;

- molecule LT-P-R solubile care găzduiesc mutații ce cresc sau descresc afinitatea de legare a acelui mutant LT-P-R solubil cu ligandul de suprafață LT se pot obține folosind tehnici ADN recombinant standard, binecunoscute celor cu pregătire în domeniu. Numere mari de molecule cu mutații dirijate în sit sau randomice se pot testa pentru capacitatea lor de a acționa ca agenți de blocare LT-P-R, folosind experimentarea de rutină și tehnicile descrise aici;

- anticorpi îndreptați împotriva fie a receptorului LT-β, fie una sau mai multe subunități ligand LT funcționează ca agenți de blocare LT-P-R. Capacitatea acestor anticorpi de a bloca semnalizarea receptor LT-β poate fi modificată prin mutație, modificare chimică sau prin alte metode care pot varia concentrația efectivă sau activitatea anticorpului eliberat la subiect;

RO 121799 Β1

- capacitatea de a micșora semnalizarea ίΤ-β-R fără inhibare completă poate fi 1 importantă pentru stabilirea sau menținrea nivelurilor reduse ale semnalizării ίΤ-β-R care sprijină funcția imună normală, în același timp inhibând răspunsurile mediate de celule Th1 3 care sunt exagerate sau anormale;

- distrugerea genei LT-α la un șoarece conduce la dezvoltarea aberantă a organului 5 limfoid periferic (De Togni et al., Science, 264, pag. 703-7 (1994)). La astfel de șoareci cărora le lipsesc nodulii limfatici și splinele, de obicei, dispare demarcația dintre regiunile 7 bogate în celule T și B din foliculi. Se presupune că acest fenotip este asociat cu pierderea semnalizării ίΤ-β-R indusă LT de suprafață, deoarece nu s-au observat fenotipuri similare 9 prin modularea activității TNF-R. Capacitatea de a bloca selectiv sau de a bloca parțial calea ίΤ-β-R poate fi astfel utilă în tratarea dezvoltării anormale a organului limfoid, asociată cu 11 lipsa sau supraexpresia semnalizării prin calea ίΤ-β-R;

- unele reacții asociate Th1 sunt componente critice ale unui număr de răspunsuri 13 imune mediate celular (Romagnani, S., Ann. Rev. Immunol., 12, pag.227-57 (1994)) și inhibarea absolută a activității celulei Th1 poate să nu fie dorită în anumite situații. De 15 exemplu, un șoarece poate rezista eficient unei infecții parazitare când poate fi ridicat un răspuns Th1 bun. Agenții infecțioși cum ar fi Listeria și Toxoplasma provoacă, de asemenea, 17 răspunsuri puternice de tip Th1. La oameni, răspunsurile Mycobacterium tuberculosis par a fi bazate pe Th1. Patogenicitatea leishmaniazei se corelează cu răspunsuri similare la 19 răspunsurile Th1 caracterizate la șoarece (Reed și Scott, Current Opinion in Immunol. 5, pag. 524-31 (1993); 21

- abilitatea de a influența nivelul inhibării Th1 prin blocarea semnalizării ίΤ-β-R poate fi important în maximizarea rezultatelor benefice care pot fi obținute cu agenți de blocare LT- 23 β-R ai acestei invenții.

în continuare, se prezintă descrierea pe scurt a desenelor care însoțesc invenția. 25

- Fig. 1, secvența porțiunii extracelulare a receptorului LT-β uman care codifică domeniul de legare ligand. 27

- Fig. 2, un receptor LT-β solubil murin, cuplat la domeniul lgG1 Fc uman (mLT^-RFc), blochează semnalizarea υΤ-β-R în celule de șoarece WEH1164 induse de ligand murin 29 solubil LT-α/β. Celulele WEH1164 sunt omorâte ca o funcție a creșterii concentrației ligandului LT (mLT-α/β). mLT^-R-Fc solubil (10 pg/ml) blochează această moarte a celulei indusă 31 de ligand LT. O proteină de fuziune receptor TNF murin (p55TNF-R-Fc) are un efect mic asupra blocării morții celulei activate LT-α/β. Creșterea s-a cuantificat după 3 zile prin 33 măsurarea densității optice (OD 550) a MTT reacționat, care este proporțională numărului celulelor. 35

- Fig. 3, un anticorp îndreptat împotriva ίΤ-β-R uman (BDA8 mAb) blochează interacțiunea dintre ligandul LT solubil și ίΤ-β-R pe suprafața unei celule umane. Creșterea celule- 37 lor tumorale WiDr este blocată printr-o combinație a IFN-Y și ligandul solubil ίΤ-α1/β2. Anticorpul BDA8 anti-LT^-R blochează capacitatea ligandului ίΤ-α1/β2 de a inhiba 39 creșterea celulelor tumorale WiDr. Simbolurile pline arată creșterea celulei în prezența mAb de control lgG1 (10 pg/ml). Simbolurile deschise prezintă efectele mAb BDA8 anti-LT^-R 41 (10 pg/ml).

- Fig. 4, un anticorp îndreptat împotriva LT-β (B9 mAb) blochează interacțiunea între 43 ligandul suprafeței celulei LT-α/β și receptorul solubil LT-β (hLT^-R -Fc; 2 pg/ml). Legarea la suprafață LT^-R-Fc s-a detectat folosind IgG de măgar antiuman marcat ficoeritrină și 45 analiza FACS. Media intensității fluorescentei a maximului rezultat este marcat ca număr canal. Linia punctată arată intensitatea medie a fluorescenței corespunzătoare cantității de 47 receptor legat în absența mAb B9.

RO 121799 Β1

- Fig. 5, efectele unui agent de blocare Ι-Τ-β-R (mLT-p-R-Fc) asupra urechii inflamate într-un model de hipersensibilitate de contact de tip întârziat, la un șoarece (DTH). Graficul prezintă creșterea în grosime a urechii măsurată la 24 h după provocarea antigen DNFB 0,2% pe urechile șoarecilor sensibilizați. Fiecare simbol reprezintă un experiment separat. Toate experimentele au utilizat 7-8 animale per punct, exceptând pe cele demarcate cu un diamant, care au folosit numai 4 animale per punct. Șoareci tratați cu tampon (PBS) și cu 20 mg/kg dintr-o proteină de fuziune IgG de control (LFA3-Fc) au servit drept controale negative. Șoareci tratați cu 8 mg/kg dintr-un mAb anti-VLA4 (PS/2 mAb), care inhibă inflamarea urechii DTH de contact, au servit drept controale pozitive.

- Fig. 6 este un grafic al schimbării greutății, observată la șoareci la 14 zile după tratamentul cu proteine de fuziune mLT^-R-lg și hLFA3-lg.

- Fig. 7 este un grafic al schimbării în lungimea colonului, observată la șoareci la 14 zile după tratamentul cu proteine de fuziune mLT^-R-lg și hLFA3-lg.

- Fig. 8 este durata de timp a greutății corporale a șoarecilor, care urmează injectării de celule T CD45RB^|OWCD4; TCD45RB^h'^9hCD4; CD45RB^high și în LT3R-1g; și CD45RB^hl9h și hLFA3-1g.

- Fig. 9 este o reprezentare grafică a mediei și deviațiilor standard ale greutăților corporale, observate după tratamentele din fig. 8 -10.

- Fig. 10 este o reprezentare a creșterii în grosime a tălpii piciorului a șoarecilor injectați, controale negative și pozitive și mU^R-1g.

în scopul ca invenția descrisă aici să fie înțeleasă în întregime, este dată următoarea descriere detaliată.

Termenul citokină se referă la o moleculă care mediază interacțiuni dintre celule. O limfokină este o citokină eliberată de limfocite.

Termenul celule T helper (Th) se referă la o subclasă funcțională de celule T care ajută la generarea celulelor T citotoxice și care cooperează cu celule B pentru stimularea producerii de anticorp. Celule T helper recunosc antigen în asociere cu molecule MHC de clasa II.

Termenul Th1 se referă la o subclasă de celule T helper, care produc LT-a, interferon-y și IL-2 (și alte citokine) și care declanșează reacții inflamatorii asociate cu un răspuns celular adică, non-imunoglobulinic, la o provocare.

Termenul Th2 se referă la o sublasă de celule T helper, care produc citokine, incluzând IL-4, IL-5, IL-6 și IL-10, care sunt asociate cu un răspuns imunoglobulinic (umoral) la o provocare imună.

Termenul mediat de celulă se referă la acele evenimente imunologice, care rezultă de la efectele directe ale celulelor T și produsele lor pentru producerea unui răspuns. Acest tip de răspuns este în general (dar nu exclusiv), asociat cu clasa Th de celule T. în această categorie nu vor fi incluse efectele helper ale celulelor T asupra diferențierii celulei B și expansiunii celulei B, care sunt asociate în general cu clasa Th2 a celulelor T.

Termenul hipersensibilitate de tip întârziat (DTH) se referă la un răspuns imunologic, care se caracterizează printr-un răspuns lent la un antigen cu efectul deplin, care se manifestă el însuși pe o perioadă de 1-3 zile. Acest răspuns lent este în contrast cu răspunsul relativ rapid, observat într-o reacție alergică mediată de imunoglobulină (umorală). Există trei tipuri de reacții DTH: reacții de hipersensibilitate de contact, hipersensibilitate de tip tuberculină și reacții granulomatoase.

Termenii răspuns imunoglobulinic sau răspuns umoral se referă la răspunsul imunologic al unui animal față de un antigen străin, prin care animalul produce anticorpi față de antigenul străin. Celulele T helper ale clasei Th2 sunt critice pentru producerea eficientă de anticorpi cu afinitate crescută.

RO 121799 Β1

Termenul “domeniu Fc al unui anticorp se referă la o parte a moleculei care cuprinde 1 domeniile de prindere CH2 și CH3, dar căruia îi lipsesc siturile de legare antigen. De asemenea, prin acest termen se înțeleg regiunile echivalente ale unui IgM sau anticorp de alt 3 izotip.

Termenul anticorp al receptorului anti-LT-β se referă la orice anticorp care se leagă 5 specific la cel puțin un epitop al receptorului LT-β.

Termenul anticorp anti-LT se referă la orice anticorp care se leagă specific la cel 7 puțin un epitop al LT-a, LT-β, sau la un complex LT-α/β.

Termenul semnalizare ίΤ-β-R se referă la reacțiile moleculare asociate cu calea 9 ίΤ-β-R și reacțiile moleculare ulterioare care rezultă de aici.

Termenul agent de blocare ίΤ-β-R se referă la un agent care poate micșora lega- 11 rea ligandului la LT^-R, gruparea ίΤ-β-Rla suprafața celulei, sau semnalizarea ίΤ-β-R, sau care poate influența cum este interpretat semnalul ίΤ-β-R în celulă. 13

Agentul de blocare ίΤ-β-R care acționează la etapa de legare ligand-receptor poate inhiba legarea ligandului LT la ίΤ-β-R prin cel puțin 20%. Un agent de blocare ίΤ-β-R care 15 acționează după etapa de legare ligand-receptor poate inhiba efectele citotoxice ale activării LT-β-R asupra unei celule tumorale prin cel puțin 20%. Exemplele de agenți de blocare LT-β- 17 R includ molecule ίΤ-β-R -Fc solubile și anticorpi anti-LT-a, anti-LT-β, anti-LT-α/β și antiLT-β-R . De preferință, anticorpii nu reacționează cu forma secretată a LT-a. 19

Termenul activitate biologică ίΤ-β-R se referă la: 1) capacitatea moleculei ίΤ-β-R sau a derivatului de a concura pentru legarea ligandului LT solubil sau de suprafață cu mole- 21 cule ίΤ-β-R solubile sau de suprafață; sau 2) capacitatea de a stimula un răspuns regulator imun sau activitate citotoxică cu o moleculă ίΤ-β-R nativă. 23

Termenii complex heteromeric LT-α/β și complex heteromeric LT se referă la o asociere stabilă între cel puțin o unitate LT-α și una sau mai multe subunități LT-β, incluzând 25 forme solubile, mutante, modificate și himerice ale uneia sau mai multor dintre subunități. Subunitățile se pot asocia prin interacțiuni electrostatice, Van der Waals sau covalente. De 27 preferință, complexele heteromerice LT-α/β au cel puțin două subunități LT-β adiacente și le lipsesc subunități LT-α adiacente. Când complexul heteromeric LT-α/β servește ca agent 29 de activare într-un test de creștere al celulei, complexul este de preferință solubil și are stoichiometrie LT-a1/a2. Complexelor heteromerice solubile le lipsește un domeniu 31 transmembranar și pot fi secretate de o celulă gazdă corespunzătoare, care a fost prelucrată prin inginerie să exprime subunități LT-α și/sau subunități LT-β (Crowe et al., J. Immunol. 33 Methods, 168, pag. 79-89 (1994)).

Termenul ligand LT se referă la un complex heteromeric LT sau la un derivat al 35 acestuia care se poate lega specific la receptorul LT-β.

Termenul domeniul de legare ligand LT^-R” se referă la porțiunea sau porțiuni ale 37 ίΤ-β-R care sunt implicate în recunoaștere specifică și interacțiune cu un ligand LT.

Termenii complex de suprafață LT-α/β și complex de suprafață LT se referă la un 39 complex care cuprinde subunități LT-α și subunități LT-β legate la membrană, incluzând forme mutante, modificate și himerice ale unuia sau mai multora dintre subunități, care este 41 dispus pe suprafața celulei. Ligand LT de suprafață se referă la un complex LT de suprafață sau la un derivat al acestuia, care se poate lega specific la receptorul LT-β. 43

Termenul subiect se referă la un animal sau la una sau mai multe celule derivate de la un animal. De preferință, animalul este un mamifer. Celulele pot fi în orice formă, 45 incluzând, dar nelimitat la celule păstrate în țesut, grupuri de celule, celule fixate, transfectate sau celule transformate și celule derivate de la un animal care a fost modificat fizic sau 47 fenotipic.

RO 121799 Β1

Limfotoxină-β: un membru al familiei TNF

Citokinele înrudite cu factorul necrozei tumorale (TNF) au apărut ca o familie mare de mediatori pleiotropici ai apărării gazdei și reglării imune. Membri ai acestei familii există în forme legate la membrană, care acționează local prin contact celulă-celulă sau ca proteine secretate care pot acționa asupra unor ținte îndepărtate. O familie paralelă a receptorilor înrudiți TNF reacționează cu aceste citokine și declanșează o diversitate de căi metabolice, incluzând moartea celulei, proliferarea celulei, diferențierea țesutului și răspunsuri proinflamatorii.

TNF, limfotoxina-α (LT-a, denumită, de asemenea, TNF-β) și limfotoxina-β (LT-β) sunt membri ai familiei de liganzi TNF, care includ, de asemenea, liganzi, pentru receptori Fas, CD27, CD30, CD40, OX-40 și 4-1BB (Smith et al., Ceti, 76, pag. 959-62 (1994)). Semnalizarea prin câțiva membrii ai familiei TNF — incluzând TNF, LT-a, LT-β și Fas — poate induce moartea celulei tumorale prin necroză sau apoptoză (moarte celulară programată), în celule care nu sunt tumorigenice, TNF și multe dintre interacțiunile ligand-receptor ale familiei TNF influențează dezvoltarea răspunsului imun și răspunsul la diverse provocări imune.

Majoritatea liganzilor familiei TNF sunt găsiți ca o formă legată la membrană pe suprafața celulei. TNF și LT-α sunt găsiți la oameni în ambele forme secretate și asociate la suprafața membranei. TNF de suprafață are o regiune transmembranară care este clivată proteolitic, pentru a genera forma secretată. în contrast, LT-α de suprafață este lipsită de o regiune transmembranară. LT-α asociat membranei este agățată la suprafața celulei ca un complex heteromeric cu LT-β, o polipeptidă transmembranară, înrudite într-un complex LTα/β. Majoritatea complexelor LT-α/β asociate membranei (LT de suprafață) au o stoichiometrie ίΤ-α1/β2 (Browning et al., Cell, 72, pag.847-56 (1993); Browning et al., J. Immunol., 154, pag.33-46 (1995)). Liganzii LT de suprafață nu leagă TNF-R cu afinitate ridicată și nu activează semnalizarea TNF-R. Alt receptor înrudit TNF, numit receptorul LT-β (LT^-R), leagă aceste complexe limfotoxină de suprafață cu afinitate ridicată (Crowe et al., Science, 264, pag. 707-10 (1994)).

Semnalizarea ίΤ-β-R, asemenea semnalizării TNF-R, are efecte antiproliferative și poate fi citotoxică pentru celulele tumorale. în cererea solicitanților cu numărul 08/378968 din Statele Unite, sunt dezvăluite compoziții și metode pentru stimularea selectivă a ίΤ-β-R, folosind agenți de activare LT^-R. Agenții de activare ίΤ-β-R sunt utili pentru inhibarea creșterii celulei tumorale pentru coactivarea căilor metabolice proinflamatoare sau imunoregulatoare induse TNF-R.

în celule netumorale, citokinele TNF și înrudite TNF sunt active într-o varietate largă de răspunsuri imune. Atât TNF, cât și liganzi LT-α se leagă la, și activează receptori TNF (p55 sau p60 și p75 sau p80; numite aici TNF-R). TNF și LT-α sunt produse de macrofage într-un răspuns timpuriu și rapid la infecție microbiană, care intensifică activitatea microbicidă a macrofagelor și neutrofilelor. TNF și LT-α produse de macrofage sau limfocite T citotoxice (CTL sau celule T ucigașe) se leagă la receptori TNF pe suprafețele celulelor țintă și declanșează moartea celulelor susceptibile.

Citokine TNF și citokine înrudite TNF pot, de asemenea, să inițieze cascadele inflamatoare în răspuns la infecție sau stres. Eliberarea de TNF, LT-α și IFN-y schimbă proprietățile de aderență dintre celulele endoteliale vasculare și anumite tipuri de limfocite. Aderența crescută facilitează migrarea fagocitului și leucocitului din fluxul sanguin în țesuturile înconjurătoare unui sit de inflamare. Reacții inflamatoare similare joacă un rol principal în respingerea celulară a grefelor de țesut și transplantelor de organ și în anumite tulburări imune.

RO 121799 Β1

Complexe limfotoxină de suprafață celulară (LT) s-au caracterizat în celule hibri- 1 dornice celulă T CD4⁺ (II-23.D7) care exprimă nivelurile ridicate de LT (Browning et al., J. Immunol., 147, pag. 1230-37 (1991); Androlewicz et al., J. Biol. Chem., 267, pag. 2542-47 3 (1992)). Expresia și rolurile biologice ale ίΤ-β-R, subunităților LT și complexelor de suprafață LT au fost revăzute în C.F. Ware et al., The ligands and receptors of the lymphotoxin 5 system, în Pathways for Cytolysis. Current Topics Microbiol. Immnunol., Springer-Verlag, pag. 175-218(1995). 7

Expresia LT-α este indusă și LT-α secretată primar de limfocite activate T și B și celule ucigașe naturale (NK). Printre subclasele celulei T helper, LT-α pare să fie produsă 9 de Th1, dar nu și de celule Th2. LT-α s-a detectat de asemenea în melanocite. Microglia și celule T în leziunile pacienților cu scleroză multiplă se pot colora cu antiseruri anti-LT-a. 11

Limfotoxină β (numită de asemenea p33) s-a identificat pe suprafața limfocitelor T, liniilor de celule T, liniilor de celule B și celulelor ucigașe activate limfokină (LAK). LT-β este 13 subiectul cererilor internaționale de brevet ale solicitanților, aflate în curs de rezolvare, PCT/US 91/04588, publicată pe 9 ianuarie 1992 ca WO 92/00329; și PCT/US 93/11669, 15 publicată pe 23 iunie 1994 ca WO 94/13808, care sunt încorporate aici prin referire.

Complexele LT de suprafață sunt exprimate inițial de limfocite activate T și B și celule 17 ucigașe naturale (NK), cum s-a definit prin analiză FACS sau imunohistologie, folosind anticorpi anti-LT-α sau proteine de fuziune solubile LT-3-R-Fc. De asemenea, au fost 19 descrise LT de suprafață pe clone de limfocite T citotoxice umane (CTL), limfocite mononucleare periferice activate (PML), limfocite sanguine periferice activate IL-2 (celule LAK), 21 limfocite B periferice activate cu mitogen de la Phytolacca americana sau anti-CD40 (PBL) și diverse tumori limfoide ale liniei de celule T și B. Angrenarea celulelor țintă purtătoare de 23 alloantigen induce specific expresia LT de suprafață prin clonele CD8⁺ și CD4⁺ CTL.

Receptorul LT-β, un membru al familiei de receptori TNF, se leagă specific la 25 suprafața liganzilor LT. ίΤ-β-R leagă complexe heteromerice LT (predominant ίΤ-α1β2 și ίΤ-α2/β1), dar nu leagă TNF sau LT-α (Crowe et al., Science, 264, pag. 707-10 (1994)). 27

Semnalizarea prin LT-p-R poate juca un rol în dezvoltarea organului limfoid periferic și în răspunsurile imune umorale. 29

Studii asupra expresiei ίΤ-β-R sunt în stadiile lor timpurii. S-au găsit mARN-uri LT-βR în splină umană, timus și alte organe principale. Imaginile expresiei ίΤ-β-R sunt similare 31 celor raportate de p55-TNF-R, cu excepția că ίΤ-β-R este absent pe celulele T sanguine periferice și linii de celule T. 33

Producerea complexelor LT solubile

Complexe heteromerice LT-α/β solubile cuprind subunități LT-β, care au fost 35 schimbate de la o formă legată la membrană la o formă solubilă. Aceste complexe sunt descrise în detaliu în cererea internațională a solicitanților, aflată în curs de rezolvare, 37 (PCT/US93/11669, publicată în 23 iunie 1994 ca WO 94/13808). Peptide solubile LT-β sunt definite prin secvența de aminoacizi a limfotoxinei-β, în care secvența este clivată la orice 39 punct dintre capătul regiunii transmembranare (adică la circa aminoacidul #44) și prima regiune de omologie TNF (adică la aminoacidul #88) conform sistemului de numerotare al 41 lui Browning et al., Cell, 72, pag. 847-56 (1993).

Polipeptide LT-β solubile pot fi produse prin scurtarea capătului N-terminal al LT-β, 43 pentru îndepărtarea cozii citoplasmice și regiunii transmembranare (Crowe et al., Science,

264, pag. 707-710 (1994)). Alternativ, domeniul transmembranar poate fi inactivat prin 45 deleție sau prin substituția resturilor aminoacide hidrofob normale, care cuprind un domeniu transmembranar cu unele hidrofile. în orice caz, se creează un profil hidropatic, substanțial 47 hidrofil, care reduce afinitatea lipidică și îmbunătățește solubilitatea apoasă. Ștergerea domeniului transmembranar este preferată față de substituția cu resturi aminoacide hidrofile, 49 deoarece se evită introducerea unor epitopi potențial imunogeni.

RO 121799 Β1

Domeniul transmembranar, șters sau inactivat, poate fi înlocuit cu, sau atașat la o secvență lider de tip I (de exemplu, liderul VCAM-1), astfel că proteina se secretă începând cu o secvență de oriunde, de la val 40 la pro 88. Polipeptide LT-β solubile pot să includă orice număr de secvențe lider binecunoscute la N-terminus. O astfel de secvență va permite peptidelor să fie exprimate și vizate pentru calea de secreție într-un sistem eucariotic. Vezi, de exemplu, Ernst et al., US 5082783 (1992).

Complexe heteromerice solubile LT-α/β se pot produce prin cotransfectarea unei celule gazdă adecvate cu ADN care codifică LT-α și LT-β solubilă (Crowe et al., L. Immunol. Methods, 168, pag. 79-89 (1994)). LT-β solubilă secretată în absența LT-α este strict oligomerizată. Cu toate acestea, când se coexprimă cu LT-α, se formează o structură de 70 kDa ca o structură trimerică care conține ambele proteine. De asemenea, este posibil să se producă complexe heteromerice solubile LT- α1/β2 prin transfectarea unei linii de celule care în mod normal exprimă numai LT-α (cum ar fi celulele RPMI 1788 discutate mai sus) cu o genă care codifică o polipeptidă solubilă LT-β.

Polipeptidele LT-α și LT-β pot fi sintetizate separat, denaturate, folosind detergenți blânzi, amestecate și renaturate prin îndepărtarea detergentului pentru formarea complexelor heteromerice LT amestecate care pot fi separate (vezi mai jos).

Purificarea complexelor LT-cr1//32

Complexele heteromerice solubile LT-α1 /β2 sunt separate de complexele coexpresiei care cuprind o stoichiometrie de subunitate diferită prin cromatografie, folosind TNF și receptori LT-β ca reactivi de purificare de afinitate. Receptorii TNF se leagă numai în fantele α/α ale complexelor LT. Receptorul LT-β se leagă cu afinitate ridicată la fantele β/β și cu afinitate scăzută la fantele α/β ale complexelor heteromerice LT-α/β. în conformitate, LT-a3 și ίΤ-α2/β1 se vor lega la TNF-R. De asemenea, ίΤ-β-R poate lega trimeri ίΤ-α2/β1 (în fantele α/β), dar nu leagă LT-a3. Suplimentar, ίΤ-β-R (dar nu TNF-R) leagă ίΤ-α1/β2 și LTβ (compoziția exactă a unor asemenea preparate este necunoscută, totuși, ele sunt agregate mari).

Reactivii de afinitate pentru receptor pot fi preparați fie ca un domeniu extracelular solubil (vezi de exemplu Loetscher et al., J. Biol. Chem., 266, pag. 18324-29 (1991)), fie ca proteine himerice cu domeniul de legare ligand cuplat la un domeniu Fc imunoglobulină (Loetscher et al., J. Biol. Chem., 266, pag. 18324-29 (1991); Crowe et al., Science, 264, pag. 707-710 (1994)). Receptorii sunt cuplați la matrice de afinitate prin reticulări chimice, folosind proceduri de rutină.

Există două scheme prin care ligandul LT-a1/p2 poate fi purificat folosind receptori și cromatografia de imunoafinitate. în prima schemă, un supernatant de la un sistem de expresie adecvat care coexprimă ambele forme Lt-α și forma scurtată LT-β se trece peste o coloană TNF-R. TNF-R va lega LT-a3 și trimeri ίΤ-α2/β1. Fluxul prin coloana TNF-R va conține ίΤ-β(η) și ίΤ-α1/β2.

în a doua schemă, toate formele care conțin LT-β (ίΤ-β(η), ίΤ-α1/β2 și ίΤ-α2/β1) sunt legate la și eluate dintr-o coloană LT^-R, folosind metode clasice precum chaotrop sau schimbare pH. (LT-a3 curge prin această coloană). Eluatul este neutralizat sau chaotropul îndepărtat și eluatul este trecut apoi peste o coloană TNF-R, care se leagă numai la trimeri ίΤ-α2/β1. Fluxul prin această coloană va conține ίΤ-β(η) și trimeri ίΤ-α1/β2.

în ambele cazuri, trimeri ίΤ-α1/β2 puri pot fi separați de LT-β prin filtrare ulterioară în gel și/sau proceduri cromatografice de schimb ionic cunoscute în domeniu.

Alternativ, diferite forme ale complexelor heteromerice LT-α/β se pot separa și purifica printr-o diversitate de mijloace cromatografice convenționale. De asemenea, se poate prefera să se combine o serie de scheme de purificare convențională cu una dintre etapele de purificare prin imunoafinitate descrise mai sus.

RO 121799 Β1

Căutare pentru agenți de blocare LT-fi-R 1 în una dintre realizările acestei invenții, agentul de blocare ίΤ-β-R cuprinde un anticorp (Ab) îndreptat împotriva Ι-Τ-β-R care inhibă semnalizarea Ι-Τ-β-R. De preferință, Ab 3 anti- ΙΤ-β-R este un anticorp monoclonal (mAb). Un astfel de mAb anti-LT^-R inhibitor este mAb BDA8. 5

Abs anti- Ι-Τ-β-R inhibitori și alți agenți de blocare Ι-Τ-β-R se pot identifica folosind metode de căutare care detectează capacitatea unuia sau mai multor agenți fie de a se lega 7 la Ι-Τ-β-R sau ligand LT, fie de a inhiba efectele semnalizării Ι-Τ-β-R asupra celulelor.

O metodă de căutare folosește efectele citotoxice ale semnalizării Ι,Τ-β-R asupra 9 celulelor tumorale care conțin ίΤ-β-R. Celulele tumorale sunt expuse la unul sau mai mulți agenți de activare Ι-Τ-β-R pentru a induce semnalizarea Ι-Τ-β-R. Agenți de activare Ι,Τ-β-R 11 includ complexe heteromerice LT-α/β (de preferință Ι_Τ-α1/β2 solubile) în prezența IFN-Y, sau un Ab anti- Ι-Τ-β-R care activează (vezi mai jos, de asemenea s-a descris în cererea în 13 curs de rezolvare a solicitanților în Statele Unite, 08/378968). Anticorpi și alți agenți care pot bloca semnalizarea LT-β-R sunt selectați pe baza capacității lor de a inhiba efectul citotoxic 15 al semnalizării ίΤ-β-R asupra celulelor tumorale în următoarea analiză:

1) Celule tumorale precum celule HT29 sunt cultivate timp de 3 - 4 zile într-o serie 17 de godeuri de cultură de țesut conținând mediu și cel puțin un agent de activare ίΤ-β-R, în prezența sau absența diluțiilor seriale ale agentului de testat; 19

2) S-a adăugat un colorant vital ca MTT, care măsoară funcția mitocondrială la amestecul de celule tumorale și s-a lăsat să reacționeze câteva ore; 21

3) Este determinată densitatea optică a amestecului din fiecare godeu la lungimea de undă 550 nm (DO 550). DO 550 este proporțională cu numărul celulelor tumorale care 23 rămân în prezența agentului de activare ίΤ-β-R și a agentului de blocare ίΤ-β-R test din fiecare godeu. Un agent sau o combinație de agenți care pot să reducă citoxicitatea celulei 25 tumorale activată ίΤ-β-R prin cel puțin 20% în această analiză este un agent de blocare LTβ-R în domeniul de protecție al acestei invenții. 27

Orice agent sau combinație de agenți care activează semnalizarea ίΤ-β-R se poate folosi în analiza de mai sus pentru identificarea agenților de blocare LT^-R. Agenți de 29 activare ίΤ-β-R care induc semnalizare ίΤ-β-R (cum arfi mAbs anti- LT^-R de activare) se pot selecta pe baza capacității lor - singuri sau în combinație cu alți agenți - de a potența 31 citotoxicitatea celulei tumorale, folosind analiza celulei tumorale descrisă mai sus.

Altă metodă pentru selectarea unui agent de blocare ίΤ-β-R este de a monitoriza 33 capacitatea agentului probabil de a interfera direct cu legarea receptor-ligand LT. Un agent sau combinație de agenți care pot bloca legarea receptor-ligand prin cel puțin 20% este un 35 agent de blocare ίΤ-β-R în domeniul acestei invenții.

Se poate folosi oricare dintre numeroasele analize care măsoară tăria legării recep- 37 tor-ligand pentru realizarea analizelor de competiție cu agenți de blocare ίΤ-β-R probabili.

Tăria legării dintre un receptor și ligand poate fi măsurată folosind o analiză imunoadsorpție 39 legată de enzima (ELISA) sau un radioimunotest (RIA). De asemenea, legarea specifică poate fi măsurată prin complexe anticorp-antigen marcate fluorescent și realizarea analizei 41 de sortare a celulelor activate prin fluorescență (FACS), sau prin realizarea altor asemenea metode de imunodetecție, toate tehnici care sunt binecunoscute în domeniu. 43

Interacțiunea legare ligand-receptor poate fi măsurată, de asemenea, cu instrumentul

BIAcore (Pharmacia Biosensor) care exploatează detectarea rezonanței plasmonului (Zhou 45 etal., Biochemistry, 32, p, 8193-98 (1993); Faegerstram și O'Shannessy, Surface plasmon resonance detection in affinity technologies, în HandbookofAffinity Chromatography, pag. 47

229-52, Marcel Dekker, Inc., New York (1993).

RO 121799 Β1

Tehnologia BIAcore permite legarea unui receptor la o suprafață de aur și să curgă ligand peste ea. Detecția rezonanței plasmonului dă cuantificarea directă a cantității de masă legată la suprafață în timp real. Această tehnologie are ca rezultat ambele constante on și off ale vitezei și astfel pot fi determinate direct constanta de disociere ligand-receptor și constanta de afinitate, în prezența sau absența agentului de blocare LT-P-R probabil.

Cu oricare dintre aceste tehnici sau altele pentru măsurarea interacțiunilor receptorligand, se poate evalua capacitatea unui agent de blocare LT-p-R, singur sau în combinație cu alți agenți, de a inhiba legarea liganzilor de suprafață sau LT solubili, la suprafață sau la molecule LT-P-R solubile. Asemenea analize pot fi folosite, de asemenea, pentru testarea agenților de blocare LT-p-R sau a derivațilorde astfel de agenți (de exemplu, fuziuni, himere, mutante și forme modificate chimic), singuri sau în combinație, pentru optimizarea capacității acelui agent modificat să blocheze activarea LT-P-R.

Producerea moleculelor LT-P-R solubile

Agenții de blocare LT-P-R dintr-o realizare a acestei invenții cuprind molecule receptor LT-β solubile. Fig. 1 arată secvența porțiunii extracelulare a LT-p-R umane, care codifică domeniul legare ligand. Folosind informația secvenței din fig. 1 și tehnici ADN recombinant binecunoscute în domeniu, pot fi donate fragmente funcționale care codifică domeniul legare ligand LT-P-R într-un vector și exprimate într-o gazdă corespunzătoare pentru a produce o moleculă LT-P-R solubilă. Molecule solubile LT-p-R care pot concura cu receptori LT-β nativi pentru legarea ligandului LT, conform analizelor descrise aici, sunt selectați ca agenți de blocare LT-p-R.

Un receptor LT-β solubil, care cuprinde secvențele de aminoacizi selectate dintre cele prezentate în fig. 1, se potate atașa la unul sau mai multe domenii ale proteinelor heteroloage (“domeniu de fuziune”) pentru creșterea stabilității in vivo a proteinei de fuziune receptor sau pentru modularea activității sale biologice sau localizării.

De preferință, proteine plasmatice stabile, care de obicei au un timp de înjumătățire în circulație mai mare de 20 h, sunt folosite pentru construcția proteinelor de fuziune receptor. Astfel de proteine plasmatice includ, dar nu sunt limitate la: imunoglobuline, albumină serică, lipoproteine, apolipoproteine și transferină. Secvențe care pot ținti molecula solubilă LT-P-R la un tip particular de celulă sau țesut se pot, de asemenea, atașa la domeniul de legare ligand LT-β-R, pentru a crea o proteină de fuziune solubilă LT-β-R, localizată specific.

Totul sau o porțiune funcțională a regiunii extracelulare LT-P-R (fig. 1), cuprinzând domeniul de legare ligand LT-P-R, se poate fuziona la o regiune constantă imunoglobulină ca domeniul Fc al unei catene grele lgG1 umană (Browning et al., J. Immunol., 154, pag. 33-46 (1995)). Proteine de fuziune solubile receptor lgG sunt preferabile și sunt reactivi imunologici comuni, și metode pentru construcția lor sunt cunoscute în domeniu (vezi US 5225538, încorporat aici prin referire).

Un domeniu legare ligand LT-P-R fucțional poate fi fuzionat la un domeniu Fc imunoglobulină (lg), derivat de la o clasă de imunoglobulină sau subclasă, alta decât lgG1. Domeniile Fc ale anticorpilor care aparțin la diferite clase lg sau subclase pot activa diverse funcțiuni efectoare secundare. Activarea se întâlnește când domeniul Fc se leagă de un receptor Fc înrudit. Funcțiuni efectoare secundare includ capacitatea de a activa sistemul complement, de a traversa placenta și de a lega diverse proteine microbiene. Proprietățile diferitelor clase și subclase de imunoglobuline sunt descrise de Roitt et al., Immunology, pag. 4.8 (Mosby-Year Book Europe Ltd., a 3-a ed. 1993).

Activarea sistemului complement inițiază cascade de reacții enzimatice care mediază inflamația. Produsele sistemului complement au o diversitate de funcțiuni, incluzând legarea bacteriilor, endocitoza, fagocitoza, citotoxicitatea, producerea de radicali liberi și solubilizarea complexelor imune.

RO 121799 Β1

Cascada enzimatică complement poate fi activată de domenii Fc antigenului legat 1 lgG1, lgG3 și anticorpilor IgM. Domeniul Fc al lgG2 pare a fi mai puțin eficient și domeniile Fc ale lgG4, IgA, IgD și IgE sunt ineficiente la activare complement. Astfel, se poate selecta 3 un domeniu Fc pe baza faptului că funcțiile sale efectoare secundare asociate sunt dorite pentru răspunsul imun particular, sau pentru boala de tratat cu proteina de fuziune LT-p-R- 5 Fc.

Dacă ar fi avantajos pentru a dăuna sau omorî celula vizată care poartă ligandul LT, 7 s-ar putea selecta un domeniu Fc activ, în special (lgG1), pentru a obține proteina de fuziune LT-P-R-Fc. Alternativ, dacă arfi de dorit să se țintească fuziunea LT-p-R-Fc la o celulă, fără 9 declanșarea sistemului complement, s-ar putea selecta un domeniu Fc lgG4 inactiv.

S-au descris mutații în domeniile Fc, care reduc sau elimină legarea la receptori Fc 11 și activarea complementului (S. Morrison, Annu. Rev. Immunol., 10, pag. 239-65 (1992). Acestea sau alte mutații se pot folosi singure sau în combinație, pentru optimizarea activității 13 domeniului Fc, folosit pentru construcția proteinei de fuziune LT-P-R-Fc.

Producerea unei proteine de fuziune LT-P-R umane, solubilă, cuprinzând secvențe 15 de legare ligand fuzionate la un domeniu Fc de imunoglobulină umane (hLT-P-R-Fc) este descrisă în exemplul 1. O linie CHO obținută conform exemplului 1, care secretă h LT-P-R- 17 Fc, este numită hLTP; R-hG1 CHO#14. O mostră a acestei linii s-a depozitat pe 21 iulie 1995 la ATCC (Rockville, MD), conform prevederilor Tratatului de la Budapesta și i s-a 19 atribuit numărul de acces ATCC CRL11965.

Producerea unei molecule de fuziune LT-p-R murină solubilă (m LT-P-R -Fc) este 21 descrisă în exemplul 2. O linie CHO obținută conform exemplului 2, care secretă m LT-P-R -Fc, este numită mLTP; R-hG1 CHO#1.3.BB”. O mostră a acestei linii s-a depozitat pe 21 23 iulie 1995 la ATCC (Rockville, MD), conform prevederilor Tratatului de la Budapesta și i s-a atribuit numărul de acces ATCC CRL11964. 25

Toate restricțiile asupra accesibilității pentru public a depozitelor ATCC de mai sus vor fi îndepărtate irevocabil la eliberarea unui brevet pentru această cerere. 27

Diferite resturi de aminoacizi, care formează punctul de joncțiune al proteinei de fuziune receptor-lg, pot modifica structura, stabilitatea și, în final, activitatea biologică a proteinei 29 de fuziune solubile receptor LT-β. Se pot adăuga unul sau mai mulți aminoacizi la Cterminusul fragmentului LT-p-R, pentru modificarea punctului de joncțiune cu domeniul 31 fuziunii selectate.

N-terminusul proteinei de fuziune LT-P-R poate fi, de asemenea, variat prin schimba- 33 rea poziției la care fragmenul ADN LT-P-R selectat este clivat la capătul său 5', pentru introducere în vectorul recombinant de expresie. Stabilitatea și activitatea fiecărei proteine de 35 fuziune LT-P-R poate fi testată și optimizată, folosind experimentarea de rutină și analizele pentru selectarea agenților de blocare LT-P-R, descrise aici. 37

Folosind secvențele domeniului de legare ligand LT-P-R, din domeniul extracelular prezentat în fig. 1, pot fi, de asemenea, construite variante ale secvenței aminoacide, pentru 39 modificarea afinității receptorului LT-β solubil sau proteinei de fuziune pentru ligand LT. Moleculele LT-P-R solubile ale acestei invenții pot concura pentru legare ligand LT de suprafață 41 LT cu receptori LT-β ai suprafeței celulare, endogeni. Este avut în vedere că orice moleculă solubilă, cuprinzând un domeniu de legare ligand LT-P-R, care poate concura cu receptori 43 LT-β ai suprafeței celulei pentru legarea ligandului LT, este un agent de blocare LT-p-R care intră în domeniul prezentei invenții. 45

RO 121799 Β1

Molecule solubile LT-fi-R ca agenți de blocare LT-J3-R

S-a obținut o proteină de fuziune imunoglobulină receptor LT-β umană solubilă (hLTβ-R-Fc), conform procedurilor din exemplul 1 și s-a testat pentru capacitatea sa de a bloca citotoxicitatea indusă de LT^-Rîn celule tumorale umane HT29. Tabelul 1 (exemplul 3) compară capacitatea receptorului solubil LT-β (hLT^-R-Fc) și a proteinelor de fuziune receptor TNF (p55-TNF-R-Fc) de a bloca efectele inhibitoare ale diverșilor TNF și liganzilor LT solubili asupra creșterii celulelor tumorale HT29.

Datele din tabelul 1 arată concentrațiile la care un receptor LT-β solubil (hLT^-R -Fc) poate bloca moartea celulei tumorale, cauzată de interacțiunea dintre ligandul ίΤ-α1/β2 și receptorii LT-β ai suprafeței celulei, cu 50%. Capacitatea de a bloca creșterea celulei tumorale cu cel puțin 20% identifică acest receptor LT-β solubil ca un agent de blocare LT-β-Ρ, conform acestei invenții. Cum ar fi de așteptat, proteina de fuziune solubilă TNF-R (p55-TNFR-Fc) a blocat complet inhibarea creșterii indusă TNF prin legare la TNF și împiedicarea interacțiunii sale cu receptorul de suprafață.

Proteina solubilă de fuziune TNF-R nu a avut nici un efect asupra efectelor antiproliferative mediate de ligandul LT (ίΤ-α1/β2). Prin contrast, proteina de fuziune ίΤ-β-R a blocat efectele ligandului LT, dar nu a afectat și efectele TNF sau LT-α. Astfel, proteinele solubile de fuziune umane LT-β-Ρ nu interferează cu activarea TNF-R de către TNF și liganzi LT-a.

Pentru a determina dacă semnalizarea LT-β-Ρ este de asemenea citotoxică pentru celule tumorale de șoareci și dacă proteinele solubile de fuziune ίΤ-β-R pot bloca citotoxicitatea indusă ίΤ-β-R, s-a realizat un experiment similar, folosind celule tumorale de șoarece. O proteină solubilă murină de fuziune LT^-R-Fc (mLT^-R -Fc; vezi, exemplul 2) s-a testat pentru capacitatea sa de a bloca moartea celulelor WEHI 164 de șoarece, tratate cu ligand LT (exemplul 4).

Fig. 2 arată efectele LT-β-Ρ solubil de murină (m LT-β-Ρ -Fc) asupra semnalizării LTβ-R induse de ligand LT în celule de șoarece WEHI 164. După cum a indicat această analiză, celule WEH1164 sunt omorâte prin tratament cu ligand ίΤ-α1/β2. Adăugarea de m LTβ-Ρ -Fc blochează moartea celulelor activate de ligand LT. Controlul proteinei de fuziune receptor TNF (p55TNF-R-Fc) are efect mic asupra blocării morții celulelor.

Aceste date arată că o proteină solubilă de fuziune ίΤ-β-R poate concura efectiv cu moleculele de suprafață ίΤ-β-R pentru legarea ligandului LT. Astfel, proteina solubilă de fuziune m LT^-R-Fc acționează ca un agent de blocare LT-β-Ρ la șoareci.

Sursă de anticorpi anti-LT-g-R umani în altă realizare a acestei invenții, anticorpi îndreptați împotriva receptorilor LT-β umani (Abs anti-LT-β-Ρ) funcționează ca agenți de blocare LT-β-Ρ. Abs anti- LT-β-Ρ ai acestei invenții pot fi policlonali sau monoclonali (mAbs) și pot fi modificați pentru a optimiza capacitatea lor de a bloca semnalizarea LT-β-Ρ, bioaccesibilitatea lor/'n vivo, stabilitatea sau alte trăsături dorite.

Seruri anticorp policlonal dirijate împotriva receptorului LT-β uman sunt preparate folosind tehnici convenționale, prin injectarea animalelor precum capre, iepuri, șobolani, hamsteri sau șoareci, subcutanat, cu o proteină de fuziune receptor LT-β uman Fc (exemplul 1) în adjuvant Freund complet, urmat de rapel intraperitoneal sau injectare subcutanată în Freund incomplet. Antiseruri policlonale care conțin anticorpii doriți îndreptați împotriva receptorului LT-β sunt căutați prin proceduri imunologice convenționale.

RO 121799 Β1

Anticorpi monoclonali de șoarece (mAbs) îndreptați împotriva unei proteine de 1 fuziune receptor LT-β uman Fcsunt preparați cum s-a descris în exemplul 5.0 linie celulară hibridom (BD.A8.AB9) care produce mAb BDA8 șoarece anti-LT^-R uman s-a depozitat pe 3 12 ianuarie 1995 la ATCC (Rockville, MD), conform prevederilor Tratatului de la Budapesta și i s-a atribuit numărul de acces ATCC HB11798. Toate restricțiile asupra accesibilității pen- 5 tru public a depozitelor ATCC vor fi irevocabil îndepărtate la acordarea unui brevet pentru această cerere. 7

De asemenea, pot fi obținute diverse forme ale anticorpilor anti-LT^-R, folosind tehnici ADN recombinant standard (Winter și Milstein, Nature, 349., pag. 293-99 (1991)). 9

De exemplu, pot fi construiți anticorpi himerici în care domeniul de legare antigen de la un anticorp animal este legat la un domeniu constant uman (de exemplu, Cabilly et al; 11 US 4816567; Morrison et al; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pag. 6851-55 (1984)). Anticorpii himerici reduc răspunsurile imunogene observate, provocate de anticorpi animali, când 13 se folosesc în tratamente clinice umane.

Suplimentar, pot fi sintetizați anticorpi umanizați care recunosc LT-β-Ρ. Anticorpii 15 umanizați sunt himere care conțin în cea mai mare parte secvențe IgG umane, în care au fost inserate regiuni responsabile pentru legare antigen specific (de exemplu, WO 94/04679). 17

Animalele sunt imunizate cu antiserul dorit; sunt izolați anticorpii corespunzători și porțiunea secvențelor regiunii variabile, responsabilă pentru legarea antigen specifică, sunt 19 îndepărtate. Apoi, regiunile de legare antigen derivate animal sunt donate în poziția corespunzătoare a genelor anticorpului uman din care au fost șterse regiunile de legare 21 antigen. Anticorpii umanizați minimalizează folosirea secvențelor heteroloage (inter-specie) în anticorpi umani și sunt mai puțin probabile să provoace răspunsuri imune în subiectul 23 tratat.

De asemenea, construcția diferitelor clase de anticorpi recombinanți anti-LT^-R 25 poate fi realizată prin obținerea de anticorpi himerici sau umanizați care conțin domeniile variabile anti-LT^-R și domeniile constante umane (CH1, CH2, CH3), izolate de la diferite 27 clase de imunoglobuline. De exemplu, anticorpi IgM anti-LT^-R, cu valențe ale sitului de legare antigen crescute, se pot produce recombinant prin donarea sitului de legare antigen 29 în vectori care conțin regiunile constante ale catenei μ umane (Arulanandam et al., J. Exp.

Med. 177, pag. 1439-50 (1993); Lane et al., Eur. J. Immunol., 22, pag. 2573-78(1993); 31

Traunecker et al., Nature, 339, pag. 68-70 (1989)).

Suplimentar, se pot folosi tehnici ADN recombinat standard, pentru modificarea acti- 33 vitățilorde legare ale anticorpilor recombinanți cu antigenii lor, prin modificarea resturiloraminoacide din vecinătatea siturilor de legare antigen. Afinitatea de legare antigen a unui 35 anticorp umanizat se poate crește prin mutageneză bazată pe modelare moleculară (Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SUA 86, pag. 10029-33 (1989); WO 94/04679). 37

Poate fi de dorit să se crească sau să se descrească afinitatea Abs anti-LT^-R pentru Ι_Τ-β-Ρ, depinzând de tipul de țesut vizat sau de schema de tratament particulară 39 avută în vedere. De exemplu, poate fi avantajos să se trateze un pacient cu niveluri constante ale Abs anti-LT^-R cu capacitate redusă de semnalizare pe calea LT-β, pentru trata- 41 mente semiprofilactice. La fel, Abs anti-LT^-R inhibitori cu afinitate crescută pentru ίΤ-β-R pot fi avantajoși pentru tratamente de scurtă durată. 43

Anticorpi anti- LT-fi-R ca agenți de blocare LT-fi-R

Anticorpii anti-LT^-Rcare acționează ca agenți de blocare ίΤ-β-R se pot selecta prin 45 testarea capacității lor de a inhiba citoxicitate indusă LT-β-Ρ în celule tumorale (exemplul 5).

RO 121799 Β1 într-o realizare preferată a acestei invenții, compozițiile și metodele cuprind mAb BDA8 de șoarece anti-(LT-P-R) uman. Fig. 3 arată că mAb BDA8 funcționează ca un agent de blocare LT-P-R, cum s-a definit prin această invenție. Celulele tumorale WiDr opresc creșterea în prezență de IFN-y și ligand Ι_Τ-α1/β2 solubil. Anticorpii de control (IgG 1) nu au nici un efect asupra acestei inhibări a creșterii. în contrast, mAb BDA8 anti-LT-P-R blochează capacitatea ligandului LT-a1/p2 solubil de a inhiba creșterea celulei WiDr. Astfel, un anticorp îndreptat împotriva LT-p-R uman poate funcționa ca un agent de blocare LT-p-R, cum s-a definit de către prezenta invenție.

Prin testarea altor anticorpi îndreptați împotriva receptorului LT-β uman, este de așteptat ca anticorpi anti-LT-P-R suplimentari care funcționează ca agenți de blocare LT-P-R să poată fi identificați folosind experimentarea de rutină și analizele descrise aici.

Sursă de anticorpi antiligand LT de suprafață

Altă realizare preferată a acestei invenții implică compoziții și metode care cuprind anticorpi îndreptați împotriva ligandului LT, care funcționează ca agenți de blocare LT-P-R. Așa cum s-a descris mai sus pentru Abs anti-LT-P-R, anticorpii ligand anti-LT, care funcționează ca agenți de blocare LT-p-R, pot fi policlonali sau monoclonali, și se pot modifica conform procedurilor de rutină, pentru modularea proprietăților lor de legare antigen și imunogenicității lor.

Anticorpii anti-LT ai acestei invenții pot fi provocați împotriva oricărei subunități dintre cele două subunități individuale LT, incluzând forme solubile, mutante, modificate și himerice ale subunității LT. Dacă subunități LT sunt folosite ca antigen, ele sunt de preferință subunități LT-β. Dacă sunt folosite subunități LT-α, este preferat ca anticorpii rezultați anti-LT-a să se lege la ligandul LT de suprafață și să nu reacționeze cu LT-α secretat sau să moduleze activitatea TNF-R (conform analizelor descrise în exemplul 3).

Alternativ, anticorpii îndreptați împotriva unui complex homomeric (LT-β) sau a unui complex heteromeric (LT-α/β), cuprinzând una sau mai multe subunități LT, pot fi provocați și selectați pentru activitate ca agenți de blocare LT-P-R. De preferință, complexele LT-a1/p2 sunt folosite ca antigen. Așa cum s-a discutat mai sus, este preferat ca anticorpii rezultați anti-LT-a1/p2 să se lege la ligandul LT de suprafață fără legare la LT-α secretat și fără afectarea activității TNF-R.

Producerea anticorpilor policlonali anti-LT-α umani este descrisă în cererea internațională a solicitanților, aflată în curs de rezolvare (WO 94/13808). Au fost descriși, de asemenea, anticorpi monoclonali anti-LT-α și anti-LT-β (Browning et al., J. Immunol. 154, pag. 33-46(1995).

S-au preparat anticorpi monoclonali de șoarece anti-LT-β uman cum s-a descris în exemplul 6. O linie celulară hibridomă (B9.C9.1), care produce mAb B9 de șoarece LT-P-R anti-uman, s-a depozitat pe 21 iulie 1995 la ATCC (Rockville, MD), conform prevederi lor Tratatului de la Budapesta și i s-a atribuit numărul de acces HB11962.

Anticorpii monoclonali de hamster anti-LT-α/β de șoarece s-au preparat cum s-a descris în exemplul 7. O linie celulară hibridomă (BB.F6.1), care produce mAb BB.F6 de hamster anti LT-α/β de șoarece, s-a depozitat pe 21 iulie 1995 la ATCC (Rockville, MD), conform prevederilor Tratatului de la Budapesta și i s-a atribuit numărul de acces ATCC HB11963.

Toate restricțiile asupra accesibilității pentru public a depozitelor ATCC de mai sus vor fi îndepărtate irevocabil la acordarea unui brevet pentru această cerere.

Anticorpi antiligand LT ca agenți de blocare LT-fi-R

S-a dezvoltat o analiză de sortare a celulelor activate fluorescent (FACS), pentru a căuta anticorpi îndreptați împotriva subunităților LT și complexelor LT care pot acționa ca agenți de blocare LT-P-R (exemplele 6 și 7). în acest test, proteina de fuziune solubilă

RO 121799 Β1

Ι-Τ-β-R -Fc s-a adăugat la celule 11-23 activate PMA, care exprimă complexe ET de 1 suprafață (Browning et al., J. Immunol. 154, pag. 33-46 (1995)), în prezența cantităților crescute ale anticorpului de testat. Un anticorp care poate inhiba interacțiunea receptor- 3 ligand LT-β cu cel puțin 20% este selectat ca un agent de blocare Ι-Τ-β-R .

Rezultatele acestei analize, realizate pentru testarea mAb B9 șoarece anti-LT-β 5 umană, sunt prezentate în fig. 4. Fig. 4 arată că mAb B9 anti-LT-β poate bloca selectiv legarea proteinelor solubile de fuziune ίΤ-β-R-Fc la suprafața liganzilor LT induși pe celule acti- 7 vate. Aceste rezultate confirmă că anticorpii îndreptați împotriva unei subunități ligand LT vor funcționa ca un agent de blocare ίΤ-β-R. 9

Analiza FACS, descrisă mai sus, s-a folosit, de asemenea, pentru a testa mAbs provocațiîn hamster împotriva unui complex solubil LT-α/β de șoarece (exemplul 7). Rezul- 11 țațele acestei analize realizată pentru a testa mAb BB.F6 de hamster anti-LT-α/β de șoarece sunt prezentate în tabelul 2 (exemplul 7). Tabelul 2 arată că mAb BB.F6 anti-LT-α/β poate 13 bloca efectiv legarea proteinelor de fuziune solubile mLT^-R-Fc (exemplul 2) la suprafața liganzilor LT exprimați pe un hibridom celulă T murină și este astfel un agent de blocare LT- 15 β-R conform acestei invenții.

Folosind mai degrabă un complex LT-α/β decât o subunitate LT ca un antigen pentru 17 imunizarea unui animal, se poate conduce mai eficient imunizarea, sau pot rezulta anticorpi care au afinități mai mari pentru ligandul LT de suprafață. Este de conceput că prin imunizare 19 cu complexul LT-α/β, anticorpii care recunosc resturile aminoacide pe ambele subunități LTα și LT-β (de exemplu, resturile care formează o fantă LT-α/β) se pot izola. Prin testarea 21 anticorpilor îndreptați împotriva complexelor heteromerice LT-α/β umană, este de așteptat ca anticorpi suplimentari anti-LT, care funcționează ca agenți de blocare ίΤ-β-R la oameni, 23 să poată fi identificați folosind experimentarea de rutină și analizele descrise aici.

Agenți de blocare L Τ-β-R inhibă hipersensibilitatea de contact mediată de celula Th1 25 la șoareci

Agenții de blocare ίΤ-β-R ai acestei invenții pot inhiba răspunsuri imune mediate de 27 celula Th1. Un asemenea răspuns mediat Th1 este hipersensibilitatea de tip întârziat (DTH;

Cherși Mosmann, J. Immunol. 138, pag. 3688-94 (1987); vezi, de asemenea, I.Roitt et al., 29 Immunology, pag. 22.1-22.12, Mosby-Year Book Europe Ltd., a lll-aed. (1993) pentru o discuție generală). DTH este evocat când celule Th1 sensibilizate antigen secretă citokine după 31 un contact secundar cu același antigen. Citokinele Th1 atrag și activează macrofage care eliberează molecule efector suplimentare ce declanșează reacții inflamatoare. 33

Reacțiile DTH sunt clasificate în trei tipuri diferite: hipersensibilitate de contact, hipersensibilitate de tip tuberculină și reacții granulomatoase. Cele trei tipuri de hipersensibilitate 35 (HS) pot fi deosebite prin viteza și natura răspunsului la antigen străin când el se aplică direct la, sau injectat sub pielea unui subiect sensibilizat. Reacția DTH este urmărită prin 37 măsurarea ratei și gradului la care se îngroașă pielea.

Reacții HS de tipul tuberculinei sunt reacții ale pielii care se întâlnesc la locul de 39 injectare a unui antigen străin de la un microorganism la care subiectul a fost expus anterior (de exemplu, Mycobacterium tuberculosis sau M. leprae). Această reacție a pielii, care este 41 maximă între 48 și 72 h, este frecvent folosită ca bază pentru teste diagnostice de sensibilitate față de microorganisme întâlnite anterior (de exemplu, testul pielii la tuberculină). Așa 43 cum se dezvoltă o leziune de tip tuberculină, ea poate deveni o reacție granulomatoasă dacă antigenul persistă în țesut. 45

Reacțiile granulomatoase sunt mai serioase clinic decât reacțiile DTH, deoarece ele pot duce la numeroase efecte patologice asociate cu boli mediate de celula Th1. Reacțiile 47 granulomatoase se întâlnesc când antigenii sau complexele comune eșuează în a fi îndepărtate de macrofage și continuă să stimuleze secreția citokinei Th1. Inflamația cronică 49

RO 121799 Β1 și agregarea macrofagelor activate la locul stimulului caracterizează reacțiile granulomatoase. Un miez de celule epiteliale și macrofage, care, de asemenea, poate fi înconjurat de limfocite și depuneri fibrotice, formează o structură întărită numită granulom. Uneori există moarte celulară extensivă în miezul granulomului (de exemplu, în țesutul pulmonar afectat de tuberculoză). întărirea în țesutul țintă al unei reacții granumomatoase are loc în circa 4 săptămâni.

Agenți care afectează frecvența formării granulomului pot fi identificați folosind șoareci infectați schizostosom (Amiri et al., Nature 356, pag. 604-607 (1992)). Viermii schizostozomi (gălbeze în sânge) pot produce o boală parazitară care conduce la formarea granuloamelorînjurulouălorschizostozomei depozitate în venulele portale ale ficatului infectat. Agenții care inhibă acest răspuns DTH mediat de celula Th1 pot descrește mărimea granulomului, sau frecvența sau rata formării granulomului în ficatul de șoarece infectat de schizostozomă. Reacția celulară la ouă de schizostozomă poate fi cercetată prin cuantificarea numărului și mărimii granuloamelor formate la șoareci tratați cu concentrații crescătoare ale unui probabil agent de blocare LT-P-R față de timp.

Hipersensibilitatea de contact (CHS) este o clasă a DTH în care pielea este organul țintă. în CHS, un răspuns inflamator este cauzat de aplicarea locală a unei haptene reactive pe piele. în general, alergenii conțin cel puțin o moleculă haptenă, care de obicei este prea mică pentru a fi antigenică prin ea însăși. Haptena penetrează epiderma și reacționează cu o proteină normală sub piele, pentru a produce un complex antigenic nou.

Reexpunerea unui subiect sensibilizat la haptenă declanșează răspunsul DTH. Conjugatul proteină purtătoare-haptenă, în combinație cu celule care prezintă antigen, activează mecanisme efectoare care declanșează eliberarea citokinelor (incluzând IL-2, IL-3, IFN-Yși GM-CSF). Cascada de citokine eliberate face să prolifereze celule T CD4+, imaginile expresiei a diverse molecule de aderență la suprafața celulei să se stingă și să atragă celule T și macrofage la piele la locul inflamării. Cascada citokină și vasodilatația care rezultă, infiltrarea celulară și edemul dermei și epidermei duc la umflarea și inflamarea țesutului țintă care se măsoară pentru îngroșări măsurabile ale pielii ca răspuns la reacții DTH.

Gradul la care o haptenă anume poate sensibiliza un individ depinde de o diversitate de factori. Acești factori includ cât de bine haptena poate penetra pielea și reacționa cu o proteină purtător gazdă, pentru a forma un conjugat. O haptenă care sensibilizează aproape toți indivizii este 2,4-dinitrofluorobenzen (DNFB).

Răspunsul CHS al pielii la o haptenă ca DNFB este un model animal clasic pentru imunitate mediată celular. Localizarea acestui răspuns CHS la urechea unui șoarece sensibilizat permite cuantificarea ușoară, de precizie și reproductibilă a răspunsului imun mediat de această celulă in vivo prin măsurarea grosimii urechii. Detaliile reacției CHS murină și histopatologia răspunsului inflamator indus DNFB au fost raportate (Chisholm et al., Eur. J. Immunol., 23, pag. 682-688 (1993)).

Capacitatea DNFB de a induce un răspuns de hipersensibilitate de contact în majoritatea indivizilor se poate folosi pentru a identifica agenți care reduc sau elimină răspunsurile inflamatorii asociate cu reacții DTH mediate de celula Th1. O proteină de fuziune solubilă LT-P-R-Fc murină inhibă efectiv răspunsurile hipersensibilității de contact induse DNFB la șoareci (exemplul 8). Șoarecii au fost sensibilizați inițial prin aplicarea DNFB la baza tălpii fiecărui picior 2 zile consecutive. La 5 zile după sensibilizarea inițială, s-a aplicat o doză subiritantă a DNFB în soluție purtătoare la suprafețele urechii stângi. S-a aplicat o soluție purtătoare, singură, la urechea dreaptă, ca un control.

RO 121799 Β1

Apoi, s-au injectat intravenos la șoareci (exemplul 8) concentrații crescătoare ale 1 agentului de blocare LT-P-R mLT-P-R-Fc (exemplul 2). Injecții numai cu tampon PBS sau a unei proteine de fuziune IgG umană (LFA3-Fc) au servit drept controale negative și injec- 3 tarea unui mAb anti-VLA4-specific (mAb PS/2) cunoscut a inhiba CHS a servit drept control pozitiv. La 24 h după provocare, s-a măsurat grosimea fiecărei urechi (provocată DNFB și 5 neprovocată). Inhibarea răspunsului inflamării urechii prin agentul de blocare LT-P-R s-a apreciat prin comparația grupurilor tratate cu grupurile lor de control negative. 7

Fig. 5 arată că mLT-P-R-Fc cauzează o reducere semnificativă în răspunsul inflamării urechii șoarecilor tratați DNFB comparativ cu animalele de control tratate DNFB neinhibate 9 (PBS și LFA3-Fc). LT-P-R solubil poate bloca această reacție CHS la fel de eficient ca inhibitorul mAb anti-VLA4-specific (mAb PS/2), care acționează prin blocarea influxului celu- 11 lelor T în locul provocării (Chisholm et al., Eur. J. Immunol., 23, pag. 682-88 (1993).

Aceste date arată că o proteină de fuziune solubilă LT-p-R, care acționează ca un 13 agent de blocare LT-p-R in vitro, poate, de asemenea, să inhibe eficient un răspuns imun mediat de celula Th 1 când se administrează la un animal. Agenții de blocare LT-p-R ai aces- 15 tei invenții, identificați in vitro, pot fi testați folosind acest test de umflare al urechii, sau alte analize DTH precum cele descrise mai sus, pentru a selecta agenți de blocare LT-p-R supli- 17 mentar, care vorfi utili pentru reducerea severității răspunsurilor imune asociate celulei Th1 in vivo. 19

Agenții de blocare LT-P-R nu inhibă un răspuns imunologic mediat de celula Th2 (umoral) 21

Așa cum s-a arătat mai sus, agenții de blocare LT-P-R ai acestei invenții pot inhiba un mecanism efector mediat de celula Th1 cum arfi sensibilitatea de contact de tip întârziat 23 (fig. 5). Acest răspuns mediat de celula Th1 este inhibat fără afectarea semnificativă a răspunsurilor dependente de celula Th 2. Efectul diferențial al agenților de blocare LT-p-R 25 asupra răspunsurilor imune mediate de celula Th1 s-au prezentat prin urmărirea unui răspuns imun dependent de celulă Th 2 cum ar fi un răspuns anticorp primar și comutarea 27 izotipului în prezența unui agent de blocare LT-P-R.

S-au injectat șoareci de 5 ori, în cursul unei perioade de 10 zile, fie cu proteină de 29 fuziune solubilă LT-P-R (mLT-P-R -Fc; exemplul 2), fie cu proteină de fuziune IgG de control (LFA3-Fc), sau au fost lăsați netratați. După a doua injectare, toți șoarecii s-au injectat în 31 baza cozii cu 100 pl de adjuvant Freund complet, conținând 100 pg de albumină. După 11 zile, s-au analizat titrurile anticorpului seric primar specific anti-ovalbumină, folosind o ELISA 33 specifică pentru izotipuri lgG1, lgG2a și IgM.

Fig. 6 prezintă efectul agentului de blocare LT-p-R de șoarece, mLT-p-R-Fc asupra 35 producerii de anticorp seric anti-ovalbumină la șoareci imunizați cu ovalbumină (exemplul 9). Administrarea agentului de blocare LT-P-R nu afectează semnificativ titrurile anticorpului 37 primar după imunizare ovalbumină. Prin comparație, interferarea semnalizării receptorului CD40 indusă ligand CD40 blochează complet răspunsul IgG specific antigen la șoareci 39 (Renshawetal., J. Exp. Med., 180, pag. 1889-1900 (1994)). CD40 este altă pereche ligand/ receptor din familia TNF. 41

Producerea imunoglobulinei totale și maturarea este clar dependentă de celula Th2.

Totuși, există, de asemenea, dovada că citokina IFN-Y Th1 participă, dar nu este absolut 43 necesară pentru comutarea la subclasa lgG2a (Huang et al., Science, 259, pag. 1742-45 (1993). Agentul de blocare LT-P-R , m LT-p-R-Fc nu inhibă comutarea lgG2a în aceste 45 experimente. Este posibil ca agenții de blocare LT-P-R ai acestei invenții să nu blocheze acest aspect umoral al unui răspuns mediat de celula Th.1. Suplimentar, răspunsurile proli- 47 feratoare ale limfocitelor de la șoarecii tratați m LT-P-R -Fc nu au descrescut (exemplul 10; fig. 7). 49

RO 121799 Β1

Aceste experimente arată că o terapie bazată pe administrarea agenților de blocare LT-P-R ai acestei invenții nu va afecta în mod advers funcțiunile producerii anticorpului dependent Th2 ale unui răspuns imun. Tabloul normal al răspunsului anticorp ilustrat în fig. 6 indică, de asemenea, că un tratament intensiv cu m Ι-Τ-β-R -Fc solubil nu a fost toxic la șoareci, indicând în plus natura terapeutică utilă a compozițiilor și metodelor menționate în această invenție.

Boli mediate de celula T helper

Numeroase afecțiuni autoimune organ-specifice par să implice răspuns Th1 patologic. Aceste date au fost revăzute (Modlin și Nutman, Current Opinion in Immunol., 5, pag. 511-17 (1993); Romagnani etal., Ann. Rev. Immunol., 12, pag. 227-57 (1994). Aceste afecțiuni autoimune organ-specifice includ: scleroză multiplă, diabet insulino-dependent, oftalmie simpatetică, uveite și psoriazis.

Diabetul mellitus insulino dependent este o boală autoimună în care celule pancreatice beta producătoare de insulină sunt distruse de leucocite care se infiltrează în insulele lui Langerhans. Diabetul poate fi indus rapid în șoareci diabetici neonatali neobezi (NOD) prin transferarea splenocitelor prediabetice activate. Recent, celule asemenea Th1 sau asemenea Th2, altfel similare genetic, s-au transferat la șoareci neonatali NOD. Numai celulele Th1 au indus rapid diabet și în aproape toți receptorii (Katz etal., Science 268, pag. 1185-88 (1995). Aceasta arată că agenții de blocare LT^-R ai acestei invenții, care pot inhiba efectele unui răspuns imun mediat de celula Th1 in vivo, vorfi utili pentru tratarea sau prevenirea diabetului insulino-dependent.

Câteva boli autoimune sistemice, incluzând diverse artritite, sunt asociate celulei Th1. Artrita reumatoidă și sindromul lui Sjorgren par ambele să implice celule ThO și Th1. în contrast, lupusul eritrematos sistemic (SLE) pare a avea un răspuns dominat Th0/Th2 aberant.

De asemenea, unele boli inflamatoare cronice par să aibă un răspuns de tip Th1 aberant, incluzând boala inflamatoare a intestinului, sarcoidoza plămânului și respingerea allogrefei. Boala inflamatorie a intestinului (IBD) la oameni cuprinde cel puțin 2 categorii, colita ulcerativă și boala lui Crohn. Ambele tulburări sunt considerate ca rezultând din tulburări imunopatologice asemănătoare celor autoimune. în unele modele șoarece ale IBD, este clar că unii agenți care blochează răspunsuri Th1 pot bloca dezvoltarea sau cursul bolii (F. Powrie et al., Immunity, 1:553, 1994) . Este posibil ca inhibarea componentei Th1 a răspunsului imun să aibă efecte benefice în IBD umană. Numeroase modele ale IBD au fost descrise și au fost revizuite (C. Elson et al., Gastroenterology, 109:1344 1995). Există cel puțin trei grupuri de modele, induse chimic, induse polimer/microbian și tipurile imunologice care folosesc șoareci mutanți.

într-un model folosit, comun, indus polimer/microbian, soluția dextran sulfat se introduce în apa de băut a șoarecilor, și la ingestie, stratul epitelial care mărginește intestinul este iritat, ducând la un răspuns imun profund la distrugere. Animalele dezvoltă colită care se manifestă ca diaree, sânge în scaun, pierderea greutății corporale și o scurtare a lungimii colonului, datorită expansiunii peretelui colonului.

Acest model induce o colită laterală stânga și displazie epitelială care poate duce la cancer, care sunt trăsăturile colitei ulcerative. Un al doilea model constă din transplantarea unui set selectat de celule T CD4 într-un șoarece scid, adică un șoarece căruia îi lipsesc celuleT și B(F. Powrie etal., International Immunology 5:1461-1471 1993; Morrissey et al., J. Exp. Med. 178: 237 1993). Ca celule selectate, numite celule CD45RB^hi, se extind și reconstituie șoarecele scid, mecanismele normale care previn apariția celulelor T autoreactive sunt disfuncționale și se dezvoltă celule autoreactive. La șobolani sunt observate celule reactive cu numeroase organite, în timp ce la șoareci, reactivitatea se întâlnește inițial

RO 121799 Β1 în intestin. Agenți care, fie alterează calea extinderii și dezvoltării celulelor autoreactive, fie 1 pot bloca capacitatea celulelor de a ataca intestinul, vor avea eficacitate în acest model. Mai mult, acest model imită, cel puțin parțial, dezvoltarea patologică a celulelor sistemului imun 3 autoreactiv, tratamentele ce pot bloca acest model pot să modifice comportamentul bolii la oameni. în acest model, anticorpi pentru TNF pot bloca boala (F. Powrie et al., Immunity, 1, 5

552 1994) și acești anticorpi s-au dovedit a fi eficienți în tratamentul bolii umane (Η. M. van Dullemen et al., Gastroenterology 109:109 1995). Astfel, acest model poate anticipa care 7 agenți pot fi utili terapeutic în IBD. Mai mult, că modelul CD45RB este un exemplu al unui proces de boală mediată Th1 și, în schimb, la șobolani, modelul duce la boală în numeroase 9 organe, eficacitatea LTPR-lg în acest sistem arată că LTPR-lg sau alte mijloace de blocare a interacțiunilor LTpR cu ligandul său poate fi benefică într-o gamă largă de boli imunologice 11 înrudite.

în general, contribuția exactă a auto-anticopilor față de celulele T specifice nu a fost 13 delimitată în aceste boli autoimune. Răspunsuri celulare pot aduce contribuții majore la patogenicitatea din aceste boli autoimune sistemice, considerate curenta fi conduse de anticorp 15 primar, de exemplu, diverse artritite.

Răspunsul imun normal la unii agenți infecțioși patogenici provoacă de asemenea, 17 un răspuns Th1 care poate deveni excesiv și se prezintă el însuși ca o problemă medicală. Exemple de reacții granulomatoase (o clasă a răspunsului DTH descris mai sus), ce duce 19 la probleme medicale severe, includ lepra, formarea granuloamelor în plămânii pacienților tuberculoși, sarcoidoza și schizostosomiaza (Roitt et al., Immunology, pag. 22.5-6 (Mosby- 21 Year Book Europe Ltd., a 3-a ed., 1993). Psoriazisul este, de asemenea, mediat probabil de celule Th1. 23

Celule T citolitice, adică CTL (celule T CD8 pozitive), se pot de asemenea, subîmpărți în populații asemenea Th1 șiTh2. Prin urmare, este posibil ca mai mult decât ce este 25 cunoscut în legătură cu grupurile Th să se aplice, de asemenea, la celule CD8+, care sunt implicate inițial în răspunsurile antivirale și în respingerea țesutului grefat. 27

Tratamente care folosesc agenți de blocare LT-fi-R

Compozițiile conform invenției se vor administra la o doză eficientă pentru tratarea 29 afecțiunii clinice particulare căreia i se adresează. Determinarea unei formulări farmaceutice preferate și a unui regim de dozare eficient terapeutic, pentru o aplicare dată, face parte din 31 pregătirea în domeniu, luată în considerare, de exemplu, starea și greutatea pacientului, durata tratamentului dorit și toleranța pacientului pentru tratament. Doze de circa 1 mg/kg 33 dintr-un LT-p-R solubil sunt de așteptat să fie corespunzătoare ca puncte de plecare pentru optimizarea dozelor de tratament. 35

Determinarea unei doze eficiente terapeutic poate fi cercetată, de asemenea, prin realizarea experimentelor in vitro, care măsoară concentrația agentului de blocare LT-P-R 37 necesar pentru acoperirea celulelor țintă (LT-p-R sau celule pozitive ligand LT depinzând de agentul de blocare) pentru 1 -14 zile. Analizele de legare receptor-ligand descrise aici pot fi 39 folosite pentru monitorizarea reacției de acoperire a celulelor. LT-P-R sau celule pozitive ligand LT pot fi separate de populații de limfocite activate, folosind FACS. Pe baza rezul- 41 țațelor acestor analize de legare in vitro, poate fi selectată o gamă de concentrații corespunzătoare ale agentului de blocare LT-P-R, pentru a se testa la animale, conform analizelor 43 descrise aici.

Administrarea moleculelor LT-p-R solubile, ligand anti-LT șiAbsanti-LT-p-Raleaces- 45 tei invenții, singure sau în combinație, incluzând forme incluzând forme izolate și purificate ale anticorpilor sau complexelor, sărurile lor sau derivați acceptabili farmaceutic ai acestora, 47 pot fi realizate folosind oricare dintre modurile convenționale acceptate, de administrare a agenților care prezintă activitate imunosupresoare. 49

RO 121799 Β1

Compozițiile farmaceutice folosite în aceste terapii pot să fie, de asemenea, într-o diversitate de forme. Acestea includ, de exemplu, forme de dozaj solide, semisolide și lichide, cum ar fi tablete, pilule, pudre, soluții lichide sau suspensii, supozitoare și soluții injectabile și infuzabile. Forma preferată depinde de modul intenționat de administrare și aplicare terapeutică. Modurile de administrare pot include administrarea orală, parenterală, subcutanată, intravenoasă, intraleziune sau topică.

Moleculele LT-P-R solubile, ligand anti-LT și Abs anti- LT-P-R pot, de exemplu, să fie plasate în formulări sterile izotonice, cu sau fără cofactori care stimulează absorbția sau stabilitatea. Formularea este de preferință, lichidă sau poate fi pudră liofilizată. De exemplu, moleculele LT-p-R solubile, ligand anti-LT și Abs anti-LT-P-R ale acestei invenții potfi diluate cu un tampon de formulare, care cuprinde 5,0 mg/ml acid citric monohidrat, 2,7 mg/ml cifrat trisodic, 41 mg/ml manitol, 1 mg/ml glicină și 1 mg/ml polisorbat 20. Această soluție poate fi liofilizată, stocată sub refrigerare și reconstituită înainte de administrare cu apă sterilă pentru injecții (USP). De asemenea, compozițiile vor include, de preferință, purtători convenționali acceptabili farmaceutic binecunoscuți în domeniu (vezi, de exemplu, Remington's Pharmaceutical Sciences, a 16-a ediție, 1980, MacPublishing Company). Asemenea purtători acceptabili farmaceutic pot să includă alți agenți medicali, purtători, purtători genetici, adjuvanți, excipienți etc., cum ar fi albumină serică umană sau preparate de plasmă. Utilizarea compozițiilor este, de preferință, sub forma unei doze unitare și acestea vor fi administrate, de obicei, o dată sau de mai multe ori într-o zi.

Compozițiile farmaceutice ale acestei invenții pot fi administrate, de asemenea, folosind microsfere, lipozomi, alte sisteme de eliberare microgranulate sau formulări cu eliberare prelungită, plasate în, lângă sau în comunicare în alt mod cu țesuturile afectate sau cu fluxul sanguin. Exemple corespunzătoare de purtători cu eliberare prelungită includ matrice polimerice semipermeabile sub forma articolelor, cum ar fi supozitoarele sau microcapsulele. Matrice cu eliberare prelungită implantabile sau microcapsulare includ polilactide (US 3773319; EP 58481), copolimeri ai acidului L-glutamic și etil-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymers, 22, pag. 547-56 (1985)); poli(2-hidroxietil-metacrilat) sau etilena acetat de vinii (Langeretal., J. Biomed. Mater. Res., 15, pag. 167-277 (1981); Langer, Chem. Tech., 12, pag. 98-105(1982).

Lipozomi care conțin molecule LT-P-R solubile, ligand anti-LT și Abs anti-LT-P-R ale acestei invenții, singure sau în combinație, pot fi preparate prin metode binecunoscute (vezi, de exemplu, DE 3218121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, pag. 3688-92 (1985); Hwang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77, pag. 4030-34 (1980);US 4485045 și 4544545). în mod obișnuit, lipozomii sunt mici (circa 200-800 Â) de tip unilamelar, în care conținutul lipidic este mai mare decât circa 30 mol.% colesterol. Proporția de colesterol este aleasă pentru a controla rata optimă a eliberării moleculei LT-P-R solubile, ligand anti-LT și Abs anti-LT-P-R.

Moleculele LT-P-R solubile, ligand anti-LT și Abs anti-LT-P-R ale acestei invenții pot fi atașate, de asemenea, la lipozomi care conțin alți agenți de blocare LT-P-R, agenți imunosupresivi sau citokine pentru modularea activității de blocare LT-p-R. Atașarea moleculelor LT-P-R, ligant anti-LT și Abs anti- LT-p-R la lipozomi poate fi realizată prin orice agent de reticulare cunoscut, cum ar fi agenți de reticulare heterobifuncționali, care s-au folosit pe larg pentru a cupla toxine sau agenți chemoterapeutici la anticorpi pentru eliberare țintită. Conjugarea la lipozomi se poate realiza, de asemenea, folosind agentul de reticulare dirijat carbohidrat, acid 4-(4-maleimidofenil)butiric hidrazidă (MPBH) (Duzgunes et al., J. Cell. Biochem. Abst. Suppl. 16E 77 (1992).

RO 121799 Β1

Cele ce urmează sunt exemple care ilustrează receptori solubili LT-β, ligand anti-LT 1 și anticorpi anti- LT-β-R ai acestei invenții și metode folosite pentru caracterizarea lor. Aceste exemple nu vor fi interpretate ca limitative; exemplele sunt incluse pentru scopurile ilustrării 3 prezentei invenții, care este limitată numai de revendicări.

Exemplul 1. Prepararea receptorilor LT-β solubili umani ca proteine de fuziune 5 imunoglobulină Fc

Secvența unei clone cADN umane izolate dintr-o bancă de secvențe umane 12p 7 transcrise derivate de la celulă somatică hibridă (Baens et al., Genomics, 16, pag. 214-18 (1993), intrat în GenBank și mai târziu s-a identificat ca secvență care codifică ίΤ-β-R. Sec- 9 vența acestei clone cADN ίΤ-β-R umane de lungime întreagă a fost accesibilă încă din 1992 ca GenBank intrare L04270. 11

Domeniul extracelular al ίΤ-β-R până la regiunea transmembranară (fig. 1) s-a amplificat prin PCR de la o clonă cADN, folosind primeri care au încorporat situri ale 13 enzimelor de restricție Notl și Sal 1 pe capătul 5' și respectiv 3’ (Browning et al., J. Immunol.,

154, pag. 33-46 (1995). Produsul amplificat s-a tăiat cu Notl și Sal1, s-a purificat și ligatîntr- 15 un vector pMDR901 liniarizat Notl, împreună cu un fragment Sal1 -Notl care codifică regiunea Fc a lgG1 umane. Vectorul rezultant a conținut gena dihidrofolat reductază și proteina de 17 fuziune ίΤ-β-R-Fc conduse de promotori separați.

Vectorul s-a electroporat în celule CHO dhfr' și clonele rezistente metrotrexat s-au 19 izolat prin proceduri standard. LT^-R-Fc s-a secretat în mediu și s-a folosit o analiză ELISA pentru selectarea liniilor producătoare a celui mai ridicat nivel al proteinei de fuziune recep- 21 tor. S-a crescut o linie de celule înalt producătoare la numere mari și s-a colectat mediul condiționat. Proteina de fuziune receptor LT-β s-a izolat prin cromatografie de afinitate Protein 23 A Sepharose Fast Flow (Pharmacia).

Exemplul 2. Prepararea receptorilor LT-β solubili murină ca proteine de fuziune 25 imunoglobulină Fc

S-a preparat o clonă cADN completă a mLT^-R prin ligarea unor fragmente 5' Notl/ 27 ApaLI și 3’ ApaLI/Notl din două izolate cADN parțiale izolate în situl pCDNA3 (InVitrogen,

San Diego, CA). Secvența acestei clone cADN este accesibilă ca GenBank intrare U29173. 29

Nu s-au remarcat diferențe ale secvenței de codificare când s-a comparat cu altă secvență intrată pentru mLT^-R găsită în GenBank intrare L38423. 31

S-a preparat o proteină de fuziune solubilă m ίΤ-β-R (hlgG1) prin amplificare PCR a clonei cADN mLT^-R de lungime întreagă ca o matriță și primerii 5'AACTGCAGCG GCC 33 GCCATGCGCCT-GCCC3' și 5'GACTTTGTCGA CCATTGCC TCCTG GCTCTGGGGG3'. Produsul amplificat s-a purificat și s-a tăiat cu Notl și Sal1 și s-a ligat cu un fragment Sal 17 35

Notl IgG 1 Fc uman în SAB132 liniarizat Notl și tratat fosfatază, pentru a forma JLB 122. Pentru expresie stabilă, caseta Notl care conține fragmentul m ίΤ-β-R s-a transferat în situl Notl 37 al pMDR901, formând PSH001 și vectorul s-a transfectat în celule CHO cum s-a descris (Browning etal., J. Immunol., 154, pag. 33-46 (1995)). Clonele celulare care secretă m LT- 39 β-R s-au identificat prin analiză ELISA. Proteina de fuziune receptor purificată s-a izolat din supernatantul de celule CHO prin cromatografie Protein A Sepharose Fast Flow 41 (Pharmacia).

Exemplul 3. Utilizarea L Τ-β-R -Fc uman solubil pentru blocarea interacțiunilor ligand 43 receptor LT-β

S-a testat hLT^-R -Fc pentru capacitatea sa de a bloca legarea ligandului LT la 45 receptorul LT-β în testul citotoxicității celulei tumorale descris mai sus. în acest test, o formă solubilă a a ligandului LT (hLT-a1/2), care activează semnalizarea LT^-R, se folosește 47 pentru a omorî celule tumorale umane. Inhibitori ai semnalizării LT-β-Η pot reduce citotoxicitatea celulei tumorale indusă ίΤ-β-Η. 49

RO 121799 Β1

Liganzi LT-a1/p2 solubili cuprind subunități scurtate sau modificate ale subunităților LT-β cărora le lipsește domeniul transmembranar funcțional. Liganzi LT-a1/p2 se leagă la și stimulează semnalizarea LT-p-R, precum și formele de suprafață ale ligandului LT (Browning et al., J. Immunol., 154, pag. 33-46 (1995)).

S-au preparat diluții seriale ale hLT-ot1/p2, hTNF sau hLT-α în 0,05 ml în plăci cu 96 godeuri și s-au adăugat 5000 celule HT29 tripsinizate (ATCC) în 0,05 ml mediu conținând 80 U/ml (unități antivirale) de hu-IFN-Y. După 4 zile, s-a măsurat reducerea mitocondrială a colorantului MTT, după cum urmează: s-au adăugat 10 pl de MTT, după 3 h, colorantul redus s-a dizolvat cu 0,09 ml de izopropanol cu 10 mM HCI și s-a măsurat O.D. la 550 nm. S-au adăugat în 10 μΙ formele receptor solubil sau IgG uman pur, înainte de adăugarea celulelor, pentru a da o concentrație finală de 5 pg/ml.

Tabelul 1 compară capacitatea himerelor hLT-P-R-Fc și p55-TNF-R-Fc(cu IgG uman drept control) pentru blocarea efectelor inhibitoare a diverse TNF și liganzi LT solubili asupra creșterii celulelor tumorale HT29.

Tabelul 1

Capacitatea proteinelor de fuziune LT-P-R și p55-TNF-R imunoglobulină de a bloca efectele inhibitoare ale diverșilor liganzi TNF și LT asupra creșterii HT29.

Concentrația agentului citotoxic (ng/ml) care rezultă în inhibarea 50% a creșterii în prezență de

Agent citotoxic	control hu-lgG	p55-TNF-R-Fc	LT-P-R-Fc
TNF	0,08	>10^b	0,08
LT-a	3	>1000	3
LT-a1/p2	5	5	>200

³ Fiecare agent citotoxic a fost preamestecat cu proteinele de fuziune 10 min înainte de adăugarea la celule. Concentrația finală a proteinei de fuziune a fost 5 pg/ml. ^b Concentrații mai mari nu s-au testat.

Datele din tabelul 1 arată că proteina de fuziune LT-P-R solubilă umană (hLT-P-R-Fc) poate bloca efectiv interacțiunea dintre ligand LT (LT-a1/p2) și receptorii LT-β de suprafață ai celulei și este astfel un agent de blocare LT-p-R conform acestei invenții.

După cum era de așteptat, proteina de fuziune TNF-R solubilă (p55-TNF-R-Fc) a blocat complet inhibarea creșterii indusă TNF prin legare la TNF și împiedicarea interacțiunii sale cu receptori TNF de suprafață. Acest receptor TNF solubil nu a avut nici un efect asupra efectelor antiproliferative mediate ligand LT. în contrast, LT-P-R a blocat efectele citotoxice induse ligand LT, dar nu acelea ale TNF sau LT-α. Proteinele fuziunii solubile LT-P-R umane nu interferează cu activarea TNF-R prin TNF și liganzi LT-a.

Exemplul 4. Utilizarea LT-P-R solubil murin pentru blocarea interacțiunilor ligand receptor de șoarece

Un receptor LT-β solubil murin cuplat la un domeniu Fc lgG1 uman (mLT-P-R -Fc; vezi, exemplul 2) s-a testat pentru capacitatea sa de a bloca interacțiunea ligand receptor LT-β la șoarece, folosind un test de citotoxicitate pe celule de șoarece (fig. 2). Testul de citotoxicitate s-a realizat pe celule WEHI 164, folosind în esență aceeași procedură cum s-a folosit în testul celulei HT29 descris în exemplul 3 (vezi, de asemenea, Browning și Ribolini, J. Immunol., 143, pag. 1859-67(1989).

RO 121799 Β1

Fig. 2 arată efectele mLT-3-R-Fc asupra semnalizării ίΤ-β-R induse ligand în celule 1

WEHI 164 de șoarece. Așa cum arată acest test, celulele WEHI 164 sunt omorâte prin tratarea lor cu ligand LT-α/β la concentrații în domeniu de la circa 1 la 100 pg/ml. mLT^-R 3

-Fc solubil (10 pg/ml) blochează moartea celulei activată de ligant LT. Adăugând o proteină de fuziune solubilă p55-TNF-R-Fc de șoarece sau anticorp de control IgG (fiecare la 10 5 pg/ml) a avut un efect mic sau nici un efect asupra morții celulelor. Aceste date arată că proteina de fuziune mLT^-R -Fc poate concura efectiv cu moleculele ίΤ-β-R de suprafață 7 pentru legarea ligandului LT. De asemenea, aceste date arată că citotoxicitatea indusă LTα/β este mediată ίΤ-β-R și poate fi inhibată prin mLT^-R-Fc solubil, care acționează ca un 9 agent de blocare ίΤ-β-R conform prezentei invenții.

Exemplul 5. Utilizarea anticorpilor anti-LT-fl-R umană pentru blocarea interacțiunilor 11 ligand-recptor LT-β

S-au preparat anticorpi monoclonali de șoarece (mAbs), îndreptați împotriva recep- 13 torului LT-β uman, prin imunizare intraperitoneală a șoarecilor RBF cu o proteină de fuziune hLT^-R-Fc derivată, celulă CHO atașată la bile Protein A Sepharose în absența adju- 15 vântului. în final, animalele s-au rapelat cu h ίΤ-β-R -Fc solubil, atât i.p. și i.v., s-au fuzionat celule splenice prin intermediul protocoalelor clasice și supernatanții hibridomului s-au 17 cercetat prin ELISA (Ling et al., J. Interferon and Cytokine Res., 15, pag. 53-59 (1995). Sau căutat supernatanții hibridomului, în plus, pentru capacitatea lor de a bloca legarea celule- 19 lor hibridomice activate 11-23, care exprimă ίΤ-α1/β2 la plăci acoperite ίΤ-β-R-Fc într-un test celular de rotire. S-au preparat mAbs puri prin purificare Protein A Sepharose 21 (Pharmacia) a IgG din supernatantele culturii. Pentru a determina dacă un mAb antireceptor LT-β ar putea bloca semnalizarea ίΤ-β-R prin legarea LT solubil, s-a realizat un test de cito- 23 toxicitate a celulei tumorale, folosind celule carcinomice umane WiDr. în testele de citotoxicitate, s-au preparat diluții seriale ale ίΤ-α1/β2 în 0,05 ml în plăci cu 96 godeuri și s-au 25 adăugat 10 pl dintr-o soluție 100 pg/ml conținând fie mAb lgG1 de șoarece de control, fie mAb anti receptor LT-β. Apoi, s-au adăugat 5000 celule WiDr tripsinizate (ATCC) la fiecare 27 godeu, în 0,05 ml de mediu conținând 50 U/ml (unități antivirale) de hu IFN-Y. După 4 zile, s-a măsurat reducerea mitocondrială a colorantului MTT, după cum urmează: s-au adăugat 29 10 pl de MTT și după 3 h, colorantul redus s-a dizolvat cu 0,09 ml de izopropanol cu 10 mM HCI și s-a măsurat O.D. la 550 nm. Cantitatea culorii purpurii este proporțională cu 31 cantitatea creșterii celulare.

Fig. 3 prezintă că mAb BDA8 anti- LT-β-Ρ acționează ca un agent de blocare ίΤ-β-R 33 conform acestei invenții. Celulele carcinomice umane WiDr își opresc creșterea în prezență de IFN-Y și ligand ίΤ-α1/β2 solubil (de la circa 0,05 la 50 ng/ml). Un anticorp de control lgG1 35 (10 pg/ml) nu are nici un efect asupra acestei inhibări a creșterii. în contrast, mAb BDA8 antiLT-β-R (10 pg/ml) restaurează capacitatea celulelor WiDr de a crește în prezența ligandului 37 solubil ίΤ-α1/β2.

Exemplul 6. Utilizarea anticorpilor anti-LT-β umani pentru blocarea interacțiunilor 39 receptor-ligand

S-au preparat mAbs anti-LT-β uman prin imunizarea șoarecilor RBF cu bile spălate 41 Protein A Sepharose-9E10-R-LT^, conținând circa 1-2 pg LT-β recombinant uman în CFA și urmat de un rapel al aceluiași material în IFA. La 8 săptămâni după ultimul rapel, șoarecii 43 au primit i.v. 30 pg de rLT-β solubil purificat (eluat acid de pe rășina 9E10) și 20 pg din același material solubil, două zile mai târziu. O zi după al doilea rapel i.v., celulele splenice 45 s-au fuzionat folosind protocoale clasice pentru a crea mAbs. Supernatante hibridomice s-au cercetat direct prin ELISA sau prin colorație FACS a celulelor 11-23 activate PMA. S-au 47 preparat mAbs puri prin purificare Protein A Sepharose Fast Flow a IgG din supernatanții culturii (Pharmacia). 49

RO 121799 Β1

S-a folosit un test FACS pentru selectarea anticorpilorîndreptați împotriva LT-β, care pot bloca efectiv legarea ligandului solubil LT-α/β la receptori LT-β pe suprafața unei celule, imitând astfel interacțiunea dintre cele 2 celule in vivo. în acest test, ίΤ-β-R -Fc solubili umani (2 pg/ml) s-au lăsat să se lege la ligandul TL de suprafață pe celule 11-23 activate PMA (Browning et al., J. Immunol., 154, pag. 33-46 (1995), în prezență de concentrații crescute ale mAb anti-LT-β de testat (0,02-20 pg/ml). Celulele s-au spălat și LT^-R-Fc legată s-a detectat prin reacție cu IgG de măgar anti-uman marcat ficoeritrină. Cantitatea marcajului fluorescent legat s-a determinat prin analiză FACS și s-a marcat media intensității fluorescenței.

Fig. 4 prezintă rezultatele testului FACS, care a măsurat capacitatea mAb B9 anti-LTβ de a bloca interacțiunea receptor ligand LT-β, cum s-a descris mai sus. Acest experiment arată că mAb B9 anti-LT-β (0,02-5 pg/ml) poate concura specific și eficient pentru legarea ligandului LT de suprafața celulei cu proteina de fuziune solubilă ίΤ-β-R (2 pg/ml) și, astfel, se califică precum un agent de blocare ίΤ-β-R, conform acestei invenții.

Exemplul 7. Utilizarea anticorpilor anti LT-α/β de șoarece pentru blocarea interacțiunilor receptor-ligand

S-au preparat complexe solubile LT-α/β de șoarece, cum s-a descris mai sus, pentru complexele LT-α/β solubile umane. Subunitatea solubilă LT-α de șoarece s-a obținut pe baza informației secvenței descrise anterior (Lawton et al., J. Immunol., 154, pag. 239-46 (1995). Complexele solubile TL-α/β murine s-au exprimat folosind sistemul de expresie baculovirus/celulă de insectă și complexele LT-α/β s-au izolat prin cromatografie de afinitate, folosind p55 TNF-R și coloane LT-a-R în esență, cum s-a descris mai sus pentru expresia și purificarea complexelor LT-α/β umane. S-au imunizat hamsteri armeni cu complex LT-α/β solubil murin, în esență cum s-a descris în exemplul 6. Celule splenice de hamster s-au fuzionat la linia de celule hibridoma P3X de șoarece cum s-a descris (Sanchez-Madrid et al., Methods of Enzymology, 121, pag. 239-44 (1986)). Hibridomii s-au grupat ca anti-mLT-a sau anti-mLT-β pe baza caracteristicilor lor de legare fie la complexul LT-α/β, fie la LT-α, respectiv. Celulele hibridomice s-au înmulțit și s-au purificat anticorpii din supernatantul culturii, folosind cromatografia de afinitate Protein A (Pharmacia).

Pentru a analiza dacă mAbs de hamster anti-LT-α și LT-β de șoarece ar putea bloca legarea ligand LT la mLT^-R, s-au folosit celule TIMI-4 (ATCC), o linie de celule T murină care exprimă ligandul LT de suprafață după activare PMA, timp de 7 h. mAbs hamster antimLT-a sau anti-mLT-β s-au preincubat cu celule, 30 min la 4°C și apoi s-au spălat de 2 ori. Celulele spălate s-au incubat cu 1 pg/ml de mLT^-R -Fc la 4°C. După 30 min celulele s-au spălat liber de mLT^-R-Fc nelegat și apoi s-au incubat 30 min cu 10 pg/ml IgG de măgar anti-uman marcat ficoeritrină pentru detectarea mLT^-R-Fc legat. Cantitatea marcajului fluorescent legat s-a determinat prin analiză FACS și s-a calculat media intensității fluorescenței.

Folosind această analiză, s-a dovedit că mAb de hamster anti-mLT-β ar putea bloca eficient legarea receptorului LT-β la ligandul LT de la suprafața celulei T. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 2.

Tabelul 2

Capacitatea anticorpului monoclonal anti LT-β de șoarece de a inhiba legarea mLT^RFc la ligandul LT murin de suprafață

	Anti-mLT-β (BB.F6)	Anti-mLT-α (AF.B3)
Conc.mAb (pg/ml)	MFCI^b	lnh^c %	MFCI^b	lnh^c %
0^a	6	-	6	-
0	85	0	85	0
0,01	71	18	84	2

RO 121799 Β1

Tabelul 2 continuare 1

	Anti-mLT-β (BB.F6)	Anti-mLT-α (AF.B3)
0,03	67	23	86	0
0,1	51	44	86	0
0,3	36	62	84	2
1,0	29	71	89	0
3,0	17	86	88	0
10,0	11	94	95	0
30,0	10	95	94	0
100,0	8	98	92	0

^a nici un receptor adăugat 11 ^b medie fluorescentă canal nr.

^c procentul inhibării 13

Exemplul 8. Agenți de blocare LT-fi-R inhibă hipersensibilitatea de contact mediată Th1 la șoareci 15

S-au sensibilizat inițial 20 șoareci Balb/c femele (Jackson Laboratories, Bar Harbor,

ME) prin aplicarea a 25 pl de 2, 4-dinitrofluorobenzen (DNFB) 0,5% în 4:1 v/v acetonă:ulei 17 de măsline la baza fiecărei tălpi a piciorului. La 24 h după sensibilizarea inițială s-a sensibilizat din nou fiecare șoarece cu 25 pl din aceeași soluție. Sensibilizările au fost realizate 19 în timp ce șoarecele a fost ținut neanesteziat în ziua 5 (128 h după sensibilizarea inițială) șoarecii s-au anesteziat cu 90:10 mg/kg ketamină: xiliazină (i.p.) și s-a aplicat o doză subiri- 21 tantă de 10 pl DNFB 0,2% la suprafețele dorsale și ventrale ale urechii stângi. Urechea a primit o aplicare similară de vehicul 4:1 v/v acetonă:ulei de măsline. 23

La 4 h după provocarea răspunsului imun, s-au administrat concentrații crescătoare de mLT-P-R-Fc (0,08-5,0 mg/kg; exemplul 2) la șoareci în 0,1 ml fosfat salin tamponat (PBS) 25 prin injecție intravenoasă. Injecțiile cu tampon PBS singur, sau 20 mg/kg dintr-o proteină de fuziune IgG umană (LFA3-Fc) (Miller et al., J. Exp. Med., 178, pag. 211-22 (1993)) au servit 27 drept controale negative. Injectarea a 8 mg/kg dintr-un mAb anti-VLA4 specific (mAb PS/2;

Chisol et al., Eur. J. Immunol., 23, pag. 682-88 (1993)), care este cunoscut a inhiba CHS 29 prin blocarea influxului de celule Tîn locul provocării, a servit drept control pozitiv. S-au tratat grupuri de 4 la 8 șoareci per concentrație de anticorpi. 31

La 24 h după provocare, șoarecii au fost din nou anesteziați cu ketamină: xilazină și s-a măsurat grosimea ambelor urechi cu un micrometru la o precizie de 10'⁴ inch. Răspunsul 33 inflamării urechii pentru fiecare șoarece a fost diferența dintre controlul său și grosimea urechii provocată DNFB. Răspunsuri inflamatorii tipice neinhibate ale urechii au fost 95-110 x 35

W⁴ inch. Inhibarea răspunsului de inhibare a urechii s-a apreciat prin comparația grupurilor tratate cu grupul lor de control negativ. Semnificația statistică a diferenței dintre grupurile de 37 tratament s-a evaluat folosind analiza într-un singur mod a variantei, urmată de prelucrarea pe calculator a diferenței semnificative corecte Tukey-Kramer (JMP, SAS Institute), folosind 39 p<0,05.

Fig. 5 arată că administrarea de concentrații crescute de mLT-p-Fc produce o 41 reducere semnificativă în răspunsul inflamării urechii al șoarecilor tratați DNFB comparat la animale de control tratate DNFB neinhibate (PBS și LFA3-Fc). LT-p-R solubilă (de la circa 43 1-5 mg/kg) poate bloca această reacție DTH de contact la fel de eficient ca inhibitorul mAb anti-VLA4 specific. Porțiunea acestei analize a urechii inflamate, care nu este inhibată, 45 rezultă probabil din infiltrarea nespecifică de granulocite.

RO 121799 Β1

Exemplul 9. Model IBD soluție dextran sulfat (DSS)

S-au tratat șoareci, așa cum s-a definitîn legenda figurii, cu hLFA3-lg, adică o proteină de fuziune Ig de control sau mLTPR-lg prin injecție intraperitoneală. în ziua 0, apa de băut a fost schimbată cu o soluție 5% dextran sulfat și șoarecii s-au lăsat pe această soluție o săptămână. O săptămână mai târziu, adică 2 săptămâni după începerea administrării DSS, șoarecii s-au sacrificat și s-au măsurat schimbarea greutății și lungimea intestinului gros (de la anus la cecum). Figura arată schimbările de greutate și lungimile intestinului după diferite tratamente. Lungimea scurtată a intestinului la fel de bine ca și pierderea în greutate sunt indicatoare ale IBD. S-a observat că tratamentul mLTPR-lg previne dramatic scurtarea intestinului și pierderea de greutate, indicând eficacitatea.

Fig. 6: Schimbarea greutății, observată la 14 zile post inițierea DSS în apă de băut după diverse tratamente. Veh=vehicul, LTBr și LFA3 se referă la proteinele de fuziune mLTpR-lg și hLFA3-lg care s-au administrat prin injectarea intraperitoneală a 100 pg o săptămână înaintea adăugării DSS, la momentul administrării DSS și o săptămână mai târziu (adică 3 injecții la -1,0 și 1 săptămână). Au existat 10 animale/grup.

Fig. 7: Lungimea colonului la 14 zile după administrare DSS, după diverse tratamente descrise în 6.

Exemplul 10. Model CD45RB^hi/scid al IBD

S-au izolat celule T CD4 pozitive de la șoareci C.8-17 femele, folosind tehnologia patului magnetic cum s-a descris mai devreme (E.Powrie et al., International Immunlogy, 5:1461-1471). Celulele CD4 s-au epuizat de celule TCD8 pozitive, apoi celulele B și monocitele s-au sortat prin sortarea celulelor activate fluorescente în populații CD45RB^hl și CD45RB¹™', de asemenea, cum s-a descris în esență mai sus. S-au injectat 5 x 10⁵ celule CD45RB intravenos în șoareci scid C.B-17 femele și a urmat greutatea corporală a șoarecilor. Se poate observa că animalele reconstituite cu celule CD45RB^|OW au câștigat greutate într-un mod normal. în contrast, animalele care au primit celule CD45RB^hl, eventual, au pierdut greutate și la 10 săptămâni au fost aproape moarte. Când șoarecii de control au pierdut în mare 20% din greutatea lor inițială, șoarecii s-au sacrificat și diferite organe s-au analizat prin histologie. De obicei, animalele îmbolnăvite au arătat cașectic, au avut diaree și colonii și cecumurile mărite dramatic. Animalele tratate cum s-a descris în legenda figurii cu hLFA3-lg au fost similare animalelor netratate, în timp ce animale tratate cu mLTPR-lg nu au suferit pierdere de greutate, au avut coloni de mărime relativ normală și le-au lipsit infiltratele inflamatoare masive, observate de obicei în colon. Fig. 8 arată durata de timp a pierderii greutății la animale injectate CD45RB^hi tratate în diferite moduri și fig. 9 arată greutățile corporale finale la 8 săptămâni postinjectare. Eficacitatea mLTBR-lg în două modele de IBD foarte diferite, adică modelele CD45RB și DSS, reprezintă dovada clară pentru un efect profund al acestui tratament asupra sistemului imun.

Fig. 8: Durata de timp a greutății corporale după injectarea celulelor T CD4 pozitive CD45RB în șoareci scid. Fiecare curbă reprezintă un animal și inscripțiile din tablouri se referă la care celule s-au injectat, adică, CD45RB^{hi saiJ low} și natura tratamentului. Animalele s-au tratat săptămânal cu 100 pg de proteină injectată intraperitoneal. Tratamentul a început 2 săptămâni înainte de injectarea celulelor și a continuat pe durata experimentului.

Fig. 9: Media și abaterile standard ale greutăților corporale observate după diverse tratamente la 10 săptămâni posttransplantare (5-6 animale per grup).

Exemplul 11. Un model SRBC al hipersensibilității de tip întârziat

S-au sensibilizat șoareci Balb/c femele prin injectare subcutanată a 2 x 10⁷ de eritrocite spălate de oaie (SRBC) în PBS. După 5 zile, șoarecii s-au provocat cu o injecție de 1 x 10⁸ SRBC în PBS în talpa piciorului drept (injecție subplantară). La diverse momente după

RO 121799 Β1 injectarea în talpa piciorului, s-a măsurat lungimea piciorului cu șublerul. Fig. 10 prezintă 1 răspunsul inflamator al șoarecilor tratați prin injectare intraperitoneală cu mLTpR-lg. Tratamentul cu mLTPR-lg fie la punctul sensibilizării, fie la ambele stadii sensibilizare sau pro- 3 vocare, a inhibat răspunsul DTH indus SRBC.

Fig. 10: Prezintă creșterea în grosimea piciorului, măsurată la 18 h postinjectare, cu 5 provocare SRBC. Tratamentele au fost cu o injecție de control negativă de PBS, un control pozitiv anticorp PS/2 care blochează interacțiunile VLA4 și, de aici, mișcarea celulelor și 7 mLTpR-lg (injecții intravenoase 100 pg) date fie imediat înaintea sensibilizării cu injectare subcutanată de SRBC, fie la momentul provocării, fie la ambele momente. 9

Lista de secvențe (1) informație generală: 11 (i) Solicitant: Browning, Jeffrey L.

BENJAMIN, Cristopher D. 13

Hochman, Paula S.

(ii) Titlul invenției: Receptori solubili limfotoxină-β și receptor anti-limfotoxină 15 și anticorpi ligand ca agenți terapeutici pentru tratamentul bolii imunologice (iii) Numărul de secvențe: 1 17 (iv) Adresă pentru corespondență:

(A) Adresant: James F. Haley, Jr. 19 (B) Strada: 1251 Avenue of the Americas (C) Oraș: New York 21 (D) Stat: New York (E) Țară: SUA 23 (F) Cod Poștal: 10020 (v) Forma citibilă pe computer:

(A) Tip mediu: Floppy disk 27 (B) Computer: compatibil IBM PC (C) Sistem de operare: pc-dos/ms-dos 29 (D) Software: Patentln Release #1.0, Versiune #1.30 (vi) Date curente ale cererii:

(A) Numărul cererii: 33 (B) Data depozitului: în același timp cu prezenta (C) Clasificare: 35 (vii) Date cerere anterioară: 37 (A) Numărul cererii: US 08/505606 (B) Data depozitului: 21-iulie-1995 39 (viii) Informație agent/mandatar: 41 (A) Nume: Haley, Jr., James F.

(B) Număr înregistrare: 27.794 43 (C) Referință/dosar număr: B191CIP PCT (ix) Informație pentru telecomunicare:

(A) Telefon: (212) 596-9000 47 (B) Telefax: (212) 596-9090 (C) Telex: 14-8367 49

RO 121799 Β1 (2) Informație pentru SECV. ID NR. 1:

(i) caracteristicile secvenței:

(A) Lungime: 197 aminoacizi (B) Tip: aminoacid (C) împletire:

(D) Topologie: liniară (ii) Tipul moleculei: peptidă (xi) Descrierea secvenței: SECV. ID NR. 1:

Ser Gin Pro Gin Ala Val Pro Pro Tyr Ala Ser Glu Asn Gin Thr Cys 1 5 10 15

Arg Asp Gin Glu Lys Glu Tyr Tyr Glu Pro Gin His Arg Ile Cys Cys 20 25 30

Ser Arg Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Val Ser Ala Lys Cys Ser Arg Ile 35 40 45

Arg Asp Thr Val Cys Ala Thr Cys Ala Glu Asn Ser Tyr Asn Glu His 50 55 60

Trp Asn Tyr Leu Thr Ile Cys Gin Leu Cys Arg Pro Cys Asp Pro Val

70 75 80

Met Gly Leu Glu Glu Ile Ala Pro Cys Thr Ser Lys Arg Lys Thr Gin 85 90 95

Cys Arg Cys Gin Pro Gly Met Phe Cys Ala Ala Trp Ala Leu Glu Cys 100 105 110

Thr His Cys Glu Leu Leu Ser Asp Cys Pro Pro Gly Thr Glu Ala Glu 115 120 125

Leu Lys Asp Glu Val Gly Lys Gly Asn Asn His Cys Val Pro Cys Lys 130 135 140

Ala Gly His Phe Gin Asn Thr Ser Ser Pro Ser Ala Arg Cys Gin Pro 145 150 155 160

His Thr Arg Cys Glu Asn Gin Gly Leu Val Glu Ala Ala Pro Gly Thr

165 170 175

Ala Gin Ser Asp Thr Thr Cys Lys Asn Pro Leu Glu Pro Leu Pro Pro 180 185 190

Glu Met Ser Gly Thr

Claims

1. Utilizare a unei compoziții selectate din grupul constând dintr-un LT-P-R solubil, 3 legat la unul sau mai multe domenii de proteină heteroloagă, un LT-P-R solubil cuprinzând o secvență funcțională de aminoacizi selectați din aminoacizii din SECV. ID NR. 1 și un anti- 5 corp orientat împotriva unei polipeptide, așa cum s-a prezentat în secvența SECV. ID NR. 1, pentru tratarea unei boli imunologice, selectată dintr-un grup constând din scleroză multiplă, 7 oftalmie simpatică, uveită, psoriazis, diabet zaharat dependent de insulină, artrită reumatoidă, respingerea de țesut și respingerea de organ, la un animal. 9

2. Utilizare a unui agent de blocare a receptorului de limfotoxină-β (LT-P-R), pentru prepararea unei compoziții farmaceutice pentru tratarea unor afecțiuni imunologice, selectate 11 din grupul constând din scleroză multiplă, oftalmie simpatică, uveită, psoriazis, diabetzaharat dependent de insulină, artrită reumatoidă, respingerea de țesut și respingerea de organ, la 13 un animal.

3. Utilizare conform revendicării 2, în care agentul de blocare LT-p-R este selectat 15 din grupul constând din:

a) un LT-p-R solubil, cuprinzând preferabil o secvență funcțională de aminoacizi 17 selectați dintre aminoacizii din SECV. ID NR. 1;

b) un anticorp orientat împotriva LT-p-R; și 19

c) un anticorp orientat contra ligandului LT de suprafață.

4. Utilizare conform revendicării 3, în care LT-P-R solubil este legat la unul sau mai 21 multe domenii de proteină heteroloagă.

5. Utilizare conform revendicării 2, în care agentul de blocare LT-P-R cuprinde un LT- 23 β-R solubil, cuprinzând o secvență funcțională de aminoacizi selectați din aminoacizii din SECV. IDNR. 1. 25

6. Utilizare conform oricăreia din revendicările 1, 3, 4 sau 5, în care LT-P-R solubil cuprinde un domeniu care se leagă de ligand LT-P-R, care se poate lega selectiv la un ligand 27 limfotoxină (LT) de suprafață, care cuprinde cel puțin o subunitate LT-β.

7. Utilizare conform oricăreia din revendicările 1, 3, 4 sau 5, în care LT-p-R solubil 29 cuprinde un domeniu extracelular al LT-p-R.

8. Utilizare conform oricăreia din revendicările 1 sau 3 - 7, în care LT-p-R solubil este 31 LT-p-R uman.

9. Utilizare conform revendicării 1 sau 4, în care domeniul proteinei heteroloage 33 cuprinde un domeniu Fc de imunoglobulină umană.

10. Utilizare conform revendicării 1 sau 4, în care domeniul proteinei heteroloage este 35 selectat din grupul de albumină serică, lipoproteine, apolipoproteine și transferină.

11. Utilizare conform revendicării 5, în care LT-P-R solubil cuprinde un domeniu Fc 37 al imunoglobulinei umane.

12. Utilizare conform revendicării 2, în care agentul de blocare LT-p-R cuprinde un 39 anticorp orientat contra LT-P-R.

13. Utilizare conform revendicării 2, în care agentul de blocare LT-p-R cuprinde un 41 anticorp orientat împotriva ligandului LT de suprafață, care cuprinde cel puțin o subunitate LT-β. ’ ’ 43

14. Utilizare conform revendicării 12 sau 13, în care anticorpul este un anticorp recombinant. 45

15. Utilizare conform revendicării 12 sau 13, în care anticorpul este un anticorp umanizat. 47

16. Utilizare conform revendicării 12 sau 13, în care anticorpul este un anticorp monoclonal. 49

RO 121799 Β1

17. Utilizare conform revendicării 16, în care anticorpul monoclonal cuprinde mAb B9 al LT-β anti-uman, produs de linia celulară hibridoma B9.C9.1 (Nr. de acces ATCC 11962).

18. Utilizare conform revendicării 16, în care anticorpul monoclonal cuprinde mAb BD A8 al ίΤ-β-R anti-uman, produs de linia celulară hibridoma BD.A8.AB9 (Nr. de acces ATCC:HB 11798).

19. Utilizare conform oricăreia din revendicările 2 - 18, în care compoziția este administrată într-o cantitate suficientă să acopere celulele ίΤ-β-R pozitive, pentru 1 la 14 zile.

20. Utilizare a unui ίΤ-β-R solubil, legat la unul sau mai multe domenii de proteină heteroloagă, pentru prepararea unei compoziții farmaceutice pentru tratarea de afecțiuni imunologice, selectate din grupul constând din scleroză multiplă, oftalmie simpatică, uveită, psoriazis, diabet zaharat dependent de insulina, artrită reumatoidă, respingerea de țesut și respingerea de organ, la un animal.

21. Utilizare conform revendicării 20, în care ίΤ-β-R solubil cuprinde un domeniu de legare a ligandului care se poate lega selectiv la un ligand LT de suprafață.

22. Utilizare conform revendicării 20, în care domeniul de proteină heteroloagă cuprinde un domeniu Fc de imunoglobulină umană.

23. Utilizare conform revendicării 20, în care domeniul solubil, legat de ligand, al LTβ-R, cuprinde SECV. ID NR. 1.

24. Utilizare a unei compoziții farmaceutice, pentru prepararea unui medicament pentru tratarea artritei reumatoide la un animal, în care compoziția farmaceutică cuprinde o cantitate eficientă dintr-o polipeptidă care cuprinde un domeniu solubil, legat de ligand, al LTβ-R, legat la un domeniu Fc lgG1 umană și un transportor acceptabil farmaceutic.

25. Utilizare a unei compoziții farmaceutice, pentru prepararea unui medicament pentru tratarea sclerozei multiple la un animal, în care compoziția farmaceutică cuprinde o cantitate eficientă dintr-o polipeptidă care cuprinde un domeniu solubil, legat de ligand, al LTβ-R, legat la un domeniu Fc lgG1 umană și un transportor acceptabil farmaceutic.

26. Utilizare conform revendicării 24 sau 25, în care domeniul solubil, legat de ligand, al ίΤ-β-R, cuprinde SECV. ID NR.1.