EA002966B1

EA002966B1 - СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ СИНДРОМА ВОСПАЛЕННОЙ ТОЛСТОЙ КИШКИ, СПОСОБ ВЫБОРА БЛОКАТОРА РЕЦЕПТОРА ЛИМФОТОКСИНА ( LT-b-R) И СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА ЧЕРЕЗ LT-b-R

Info

Publication number: EA002966B1
Application number: EA200000122A
Authority: EA
Inventors: Джеффри Л. Браунинг; Кристофер Д. Бенджамин; Паула С. Хохман
Original assignee: Байоджен, Инк.
Priority date: 1995-07-21
Filing date: 1996-07-19
Publication date: 2002-12-26
Also published as: US20050037003A1; EP1488799A2; EA001200B1; JP2012041350A; DE69633624D1; BR9609716A; RO121799B1; HK1010832A1; NO980172L; EA005734B1; EP0840616B1; HUP9802483A3; BG102265A; AU6591296A; PL186911B1; KR20040107513A; EA200000122A1; US6669941B1; KR19990035805A; US6403087B1

Abstract

Данное изобретение относится к способу лечения синдрома воспаленной толстой кишки у млекопитающего путем введения эффективного количества блокатора рецептора лимфотоксина-β (LT-β-R). Данное изобретение также относится к способу ингибирования передачи сигнала через LT-β-R без ингибирования передачи сигнала через TNF-R путем введения эффективного количества блокатора LT-β-R. Далее, изобретение также относится к способу скрининга для выбора растворимых рецепторов, антител и других агентов, которые блокируют передачу сигналов через рецепторы LT-β.

Description

Данное изобретение относится к способу лечения синдрома воспаленной толстой кишки у млекопитающего путем введения эффективного количества блокатора рецептора лимфотоксинаβ (ЬТ-β-Κ). Данное изобретение также относится к способу ингибирования передачи сигнала через ЬТ-β-Κ без ингибирования передачи сигнала через ΤΝΕ-Κ путем введения эффективного количества блокатора ЬТ-β-Κ. Далее, изобретение также относится к способу скрининга для выбора растворимых рецепторов, антител и других агентов, которые блокируют передачу сигналов через рецепторы ЬТ-β.

Предпосылки изобретения

Профиль цитокинов, высвобождаемых при иммунной стимуляции, может повлиять на последующий выбор активируемого иммунного эффекторного пути. Выбор между иммунными эффекторными механизмами опосредован ΟΌ4положительными хелперными Т-лимфоцитами (Т-хелперными клетками, или Тй-клетками). Тйклетки взаимодействуют с антигенпрезентирующими клетками (АПК), которые презентируют на своей поверхности пептидные фрагменты процессированного чужеродного антигена в комплексе с молекулами ГКГ класса II. Тй-клетки активируются, когда распознают определенные эпитопы чужеродного антигена, презентированные на поверхности подходящей АПК, на которые Тй-клетки экспрессируют специфичный рецептор. Активированные Тйклетки, в свою очередь, секретируют цитокины (лимфокины), которые запускают подходящие иммунные эффекторные механизмы.

Тй-клетки способны запускать различные эффекторные механизмы, включая активацию киллерных Т-клеток, активацию продукции Вклетками антител и активацию макрофагов. Выбор между иммунными эффекторными механизмами зависит в значительной степени от того, какие цитокины продуцируют активированные Тй-клетки.

Тй-клетки могут быть подразделены на три подгруппы на основании профилей секретируемых ими цитокинов (Ейсй е! а1., Апп. Кеу. 1ттипо1., 11, стр. 29-48 (1993)). Данные подгруппы называют Тй0, Тй1 и Тй2. У мышей нестимулированные наивные Т-хелперные клетки продуцируют 1Ь-2. Кратковременная стимуляция приводит к преобразованию в клеткипредшественники ТйО, которые продуцируют широкий спектр цитокинов, включая ΙΕΝ-γ, 1Ь2, 1Ь-4, 1Ь-5 и 1Ь-10. Длительно стимулируемые ТйО-клетки способны дифференцироваться либо в клеточный тип Тй1, либо в клеточный тип Тй2, после чего изменяется профиль экспрессируемых цитокинов.

Некоторые цитокины секретируются как Тй1-, так и Тй2-клетками (например, 1Ь-3, СМС8Е и ΕΝΕ). Другие цитокины продуцируются исключительно одной либо другой подгруппой Тй-клеток. Специализированные эффекты подгрупп Т-хелперных клеток впервые были выявлены у мышей. Сходное разделение применимо и к Т-хелперным клеткам человека (Котадпат е! а1., Апп. Кеу. 1ттипо1., 12, стр. 227-57 (1994)).

Тй-клетки продуцируют ЙТ-α. 1Ь-2 и ΙΕΝγ. У человека профиль секретируемых цитокинов Тй1 обычно связывали с клеточным иммунитетом и резистентностью к инфекции, цитокины Тй1 имеют тенденцию к активации макрофагов и запуску определенных видов воспалительного ответа, таких как гиперчувствительность IV типа (замедленного типа) (смотри ниже). Цитокины Тй1 играют важную роль в клеточном отторжении трансплантатов тканей и органов.

Тй2-клетки продуцируют цитокины 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-б и 1Ь-10. Цитокины Тй2 увеличивают продукцию эозинофилов и тучных клеток и стимулируют пролиферацию и созревание Вклеток (Но\\агй е! а1., Т се 11-йенуей су!окте§ апй 1йе1г гесер!ога. Еипйатеп1а1 1ттипо1оду, 3й ей., Кауеп Рге§8, Νον Уогк (1993)). Дитокины Тй2 также увеличивают продукцию антител, включая антитела 1дЕ, связанные с аллергическими реакциями, и антитела к трансплантату. Тй2-клетки могут также участвовать в супрессии иммунитета и толерантности к персистирующим антигенам.

Тй1- и Тй2-ассоциированные цитокины играют роль в развитии определенных видов реакций по типу гиперчувствительности - неадекватного или диспропорционального иммунного ответа, развивающегося при контакте с ранее встречавшимся антигеном. Выделяют четыре типа гиперчувствительности (Кой! е! а1., 1ттцпо1оду, стр. 19.1-22.12 (Мокйу-Уеаг Воок Еигоре Ь!й., 3й ей. 1993)).

Гиперчувствительность I типа (немедленного типа) включает в себя аллерген-индуцированные активацию Тй2-клеток и секрецию Тй2клетками цитокинов. Цитокин 1Ь-4, продуцируемый Тй2, стимулирует претерпевание Вклетками переключения изотипа на продукцию 1дЕ, который активирует тучные клетки с развитием острых воспалительных реакций, как, например, ведущие к развитию экземы, бронхиальной астмы и ринита.

Гиперчувствительность II и III типов вызывается антителами ЦС и ЦМ к клеточной поверхности или к специфическим тканевым антигенам (II тип) или к растворимым сывороточным антигенам (III тип). Считается, что данные типы реакций гиперчувствительности не опосредованы Тй-клетками.

Гиперчувствительность IV типа (замедленного типа) (ГЗТ) является опосредованной Тй1-клетками. Развитие реакций ГЗТ занимает более 12 ч, ио них говорят как о клеточно опосредованных, поскольку они могут быть перенесены от одной мыши к другой лишь путем переноса ТЫ -клеток, а не только сыворотки. Реакции ГЗТ IV типа обычно подразделяют на три типа: контактную, туберкулинового типа и гранулематозную гиперчувствительность.

Многие клеточно-опосредованные реакции, которые способны вызывать заболевание, можно индуцировать у здоровых мышей путем переноса лимфоцитов от больной мыши (например, инсулин-зависимый сахарный диабет и экспериментальный аутоиммунный энцефалит). Данное свойство отличает ГЗТ IV типа от остальных трех типов гиперчувствительности, которые представляют собой гуморальные иммунные реакции, вызываемые преимущественно антителами, которые могут быть перенесены в бесклеточной сыворотке.

Т-хелперные клетки также участвуют в регуляции переключения изотипа иммуноглобулина бе ηονο. Различные подгруппы Т11 могут влиять на соотношение иммуноглобулинов определенного изотипа, продуцируемых в ответ на иммунную стимуляцию. Например, цитокин 1Ь4, продуцируемый Т112. может переключать активированные В-клетки на изотип ЦС1 и подавлять другие изотипы. Как обсуждалось выше, 1Ь-4 также активирует избыточную продукцию 1дЕ в реакциях гиперчувствительности I типа. Цитокин 1Ь-5, продуцируемый Т112. индуцирует изотип 1дЛ. Данное влияние цитокинов, продуцируемых Т112. на переключение иэотипа уравновешено влиянием ΙΡΝ-γ, продуцируемого ТЫ -клетками.

Создается впечатление, что отличные профили цитокинов, секретируемых ТЫ- и Т112клетками, направляют реакцию по различным иммунным эффекторным механизмам. Переключение, которое активирует либо клеточноопосредованный, либо гуморальный эффекторный механизм, является чувствительным к процессам перекрестной супрессии между ТЫ- и Тй2-клетками: ΙΡΝ-γ, продуцируемый ТЫклетками, подавляет пролиферацию Тй2-клеток, а 1Ь-10, секретируемый Тй2-клетками, снижает секрецию цитокинов Тй1-клетками.

В зависимости от относительных аффинностей цитокинов к их молекулярным мишеням круги отрицательной регуляции ТЫ и Т112 могут умножать эффекты малых различий в концентрациях цитокинов, продуцируемых ТЫ- и Тй2-клетками. Возможность контролировать данное переключение путем изменения относительных концентраций цитокинов, продуцируемых ТЫ- и Тй2-клетками, была бы полезна для лечения дисбаланса при многих иммунных реакциях, зависимых от ТЫ- и Тй2-клеток, которые способны приводить к развитию иммунных нарушений и заболеваний.

Патологические реакции, опосредованные ТЫ, ассоциированы с рядом органоспецифиче ских и системных аутоиммунных состояний, хронических воспалительных заболеваний и реакций гиперчувствительности замедленного типа. Как обсуждалось выше, реакции, опосредованные ТЫ, также способствуют развитию клеточных реакций, приводящих к отторжению трансплантированных тканей и органов.

До сих пор лечение данных различных иммунных состояний, опосредованных ТЫклетками, заключается, главным образом, в применении иммуномодуляторов и иммуносупрессоров, равно как и ряда лекарственных средств с плохо изученными механизмами действия (например, золото или пеницилламин). Тремя основными применяемыми в настоящее время иммуносупрессорами являются стероиды, циклоспорин и азатиоприн.

Стероиды представляют собой плейотропные противовоспалительные средства, которые подавляют активированные макрофаги и ингибируют активность антиген-презентирующих клеток так, что обращают многие эффекты цитокина ΙΡΝ-γ, продуцируемого ТЫ. Циклоспорин - мощный иммуносупрессор - подавляет продукцию цитокинов и снижает экспрессию рецепторов к 1Ь-2 на лимфоцитах при их активации. Азатиоприн представляет собой противовоспалительное средство, которое ингибирует синтез ДНК. Обычно требуется введение высоких доз данных неспецифических иммуносупрессоров, что повышает их токсичность (например, нефро- и гепатотоксичность) и приводит к развитию нежелательных побочных эффектов. Таким образом, они являются неприменимыми в проведении длительных курсов лечения.

В порядке решения трудностей, вызываемых традиционными методами лечения с помощью неспецифических иммуносупрессоров, многие современные стратегии лечения направлены на подавление или активацию отдельных функций иммунной системы. Особенно привлекательной задачей является манипулирование балансом между цитокинами, продуцируемыми ТЫ и Тй2, в целях сдвигания баланса между клеточно-опосредованными и гуморальными эффекторными механизмами.

Для достижения сдвига между клеточноопосредованными и гуморальными эффекторными механизмами полезной была бы возможность модулирования активности молекулы, которая способна изменять относительные активности подклассов ТЫ- и Тй2-клеток. Кандидаты на роль таких молекул включают цитокины и рецепторы к ним. Последние данные позволяют предположить, что ЬТ-α, 1Ь-12, ΙΡΝ-α и ΙΡΝ-γ способствуют развитию ТЫ-опосредованных реакций, тогда как ТЫ-1 и ΙΤ-4 направляют ответ по Т112-опосредованному эффекторному механизму (Котадпаш е! а1., Αηη. Кет. ΙΜ№ϋηο1., 12, рр. 227-57 (1994)).

Многие из цитокинов Тй-клеток представляют собой плейотропные регуляторы развития и функционирования иммунной системы, и ингибирование их продукции окажет вредное действие на неопосредованные Т-клетками реакции. Желательная и эффективная мишень для избирательного модулирования выбора между Тй1 и Т12-опосредованными эффекторными механизмами не определена.

Суть изобретения

Настоящее изобретение относится к способу лечения синдрома воспаленной толстой кишки у млекопитающего, заключающемуся в том, что указанному млекопитающему вводят фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество блокатора рецептора лимфотоксина-β (ЬТ-β-Κ) и фармацевтически приемлемый носитель. Данное изобретение относится также к способу выбора блокатора ЬТ-β-Κ, включающий культивирование опухолевых клеток в присутствии эффективного количества, по крайней мере, одного стимулятора ЬТ-β-Κ и предполагаемого блокатора ЬТ-β-Κ и определение степени понижения противоопухолевой активности стимулятора ЬТ-β-Κ предполагаемым блокатором ЬТ-β-Κ. Данное изобретение также относится к способу ингибирования передачи сигнала через ЬТ-β-Κ без ингибирования передачи сигнала через ЮТΚ, включающий стадию введения субъекту эффективного количества блокатора ЬТ-β-Κ.

Краткое описание рисунков

Фиг. 1. Последовательность внеклеточной части рецептора к ЬТ-β человека, которая кодирует лигандсвязывающий домен.

Фиг. 2. Растворимый мышиный рецептор к ЬТ-β, присоединенный к Ре-домену 1дС1 человека (1иЬТ-|1-Р-Гс). блокирует передачу сигнала через ЬТ-β-Κ в клетках мышей 3ΕΗΙ 164, индуцированного растворимым мышиным ЬТ-α/β лигандом. Клетки 3ΕΗΙ 164 гибнут как функция повышения концентрации ЬТ-лиганда (тЬТ-α/β). Растворимый т^Т-β-Κ-Γс (10 мкг/мл) блокирует такую индуцированную ЬТлигандом клеточную гибель. Гибридный белок растворимого мышиного рецептора к Т№ (ρ55ТNΡ-Κ-Ρс) обладает небольшим эффектом на блокирование ЬТ-α/β -стимулированной клеточной гибели. Рост количественно оценивали по прошествии трех дней путем измерения оптической плотности (ОБ 550) прореагировавшей МТТ, которая пропорциональна количеству клеток.

Фиг. 3. Антитело к ЬТ-β-Κ человека (тАЬ ВБА8) блокирует взаимодействие между ЬТлигандом и ЬТ-β-Κ на поверхности клеток человека. Рост опухолевых клеток 31Бг блокируется комбинацией ΙΓΝ-γ и растворимого ЬТ-а.1/|12лиганда. Анти-ЬТ-β-Κ антитело ВБА8 блокирует способность ЬТ-а.1/|12-лиганда ингибировать рост опухолевых клеток 31Бг. Закрашенные значки показывают клеточный рост в присутствии контрольного тАЬ 1§С1 (10 мкг/мл). Незакрашенные значки показывают эффекты антиЬТ-β-Κ тАЬ ВБА8 (10 мкг/мл).

Фиг. 4. Антитело к ЬТ-β человека (тАЬ В9) блокирует взаимодействие между ЬТ-α/β лигандом на клеточной поверхности и растворимым рецептором к ЬТ-β (й^Т-β-Κ-Γс; 2 мкг/мл). Связавшийся с поверхностью ЬТ-β-ΚГс определяли, применяя меченые фикоэритрином ослиные антитела к 1дС человека и ГАС8анализ. Средняя интенсивность флюоресценции полученного пика отображена на графике как номер канала. Точечная линия показывает среднюю интенсивность флюоресценции, соответствующую количеству рецептора, связавшегося в отсутствие тАЬ В9.

Фиг. 5. Эффекты блокатора ЬТ-β-Κ (тЬТβ-Κ-Гс) на развитие отека уха в модели контактной гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у мышей. График иллюстрирует увеличение толщины уха, измеряемой в течение 24 ч после антигенной стимуляции ушей сенсибилизированных мышей 0,2% βΝΓΕ. Каждый значок представляет результат отдельного эксперимента. Во всех экспериментах использовали 7-8 животных на точку за исключением тех экспериментов, результат которых обозначен ромбом, и в которых использовали 4 животных на точку. Мыши, обрабатываемые буфером (РВ8) и 20 мг/кг контрольного гибридного белка 1дС (ЬГА3-Гс), служили в качестве отрицательных контролей. Мыши, обрабатываемые 8 мг/кг анти-УЬА4 тАЬ (тАЬ Р8/2), которое ингибирует развитие отека уха по механизму контактной ГЗТ, служили в качестве положительных контролей.

Фиг. 6 представляет собой графическое изображение изменения массы тела, наблюдавшегося у мышей через 14 дней после обработки гибридными белками тЬТ-|1-Р-1д и 11ЬГА3-[д.

Фиг. 7 представляет собой графическое изображение изменения длины толстого кишечника, наблюдавшегося у мышей через 14 дней после обработки гибридными белками тЬТ-βΚ-Ι§ и ЬЬГА3-1§.

Фиг. 8 представляет изменение массы тела мышей с течением времени после инъекции СБ45РВ^|^СБ4-положительных Т -клеток;

СБ45РВ¹ ^д11СБ4 -положительных Т-клеток;

СЭ45НВ' и ЬТ-β-Κ-Ι^; и СЭ45НВ' и 1ЬГА3^[&

Фиг. 9 представляет собой графическое изображение среднего и стандартного отклонений в массе тела, наблюдавшихся после обработок, описанных в аннотациях к фиг. 8-11.

Фиг. 10 представляет собой графическое изображение увеличения толщины подушечки на лапах мышей, которым были введены отри цательные и положительные контроля и шЬТ-βΚ-Ι§.

Подробное описание изобретения

В целях полнейшего понимания описываемого здесь изобретения приведено следующее подробное описание.

Термин цитокин относится к молекуле, которая опосредует взаимодействия между клетками. Лимфокин представляет собой цитокин, секретируемый лимфоцитами.

Термин Т-хелперные (Тй) клетки относится к функциональному подклассу Т-клеток, которые способствуют наработке цитотоксических Т-клеток и которые взаимодействуют с Вклетками, стимулируя продукцию антител. Хелперные Т-клетки распознают антиген, ассоциированный с молекулами ГКГ II класса.

Термин Тй1 относится к подклассу Тхелперных клеток, которые продуцируют ЬТ-α. интерферон-γ и 1Ь-2 (и другие цитокины) и которые вовлечены в воспалительные реакции, связанные с клеточным, т. е. не с иммуноглобулиновым ответом на иммунную стимуляцию.

Термин Тй2 относится к подклассу Тхелперных клеток, которые продуцируют цитокины, включая 1Ь-4. 1Ь-5. 1Ь-б и 1Ь-10. которые связаны с иммуноглобулин-опосредованным (гуморальным) ответом на иммунную стимуляцию.

Термин клеточно-опосредованный относится к тем реакциям в иммунной системе, которые развиваются в результате прямых эффектов Т-клеток и их продуктов с развитием ответа. Данный тип ответа главным образом (но не исключительно) связан с классом Тй1 Т-клеток. В данную категорию не входят хелперные эффекты Т-клеток на дифференцировку В-клеток и пролиферацию В-клеток, которые главным образом связаны с классом Тй2 Т-клеток.

Термин гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) относится к иммунному ответу, который характеризуется медленным развитием реакции на антиген с полным проявлением эффекта в течение 1-3-суточного периода. Данное медленное развитие реакции отличается от относительно быстрого развития реакции, наблюдаемого при иммуноглобулин-опосредованной (гуморальной) аллергической реакции. Существует три типа реакций ГЗТ: реакции по типу контактной гиперчувствительности, гиперчувствительности туберкулинового типа и гранулематозные реакции.

Термины иммуноглобулин-опосредованный ответ или гуморальный ответ относятся к иммунному ответу организма животного на чужеродный антиген, в ходе которого в организме животного продуцируются антитела на чужеродный антиген. Т-клетки класса Тй2 принципиально важны для эффективной продукции высокоаффинных антител.

Термин 'Рс-домен антитела относится к части молекулы, содержащей шарнир, СН2- и СНЗ-домены, но не содержащей антигенсвязывающие участки. Подразумевается, что термин также включает эквивалентные участки 1дМ или антитела другого изотипа.

Термин антитело к рецептору к ЬТ-β относится к любому антителу, которое специфично связывается, по крайней мере, с одним эпитопом рецептора к ЬТ-β.

Термин антитело к ЬТ относится к любому антителу, которое специфично связывается, по крайней мере, с одним эпитопом ЬТ-α. ЬТ-β или комплекса ЬТ-α/β.

Термин передача сигналов через ЬТ-β-К относится к молекулярным реакциям, связанным с ^Т-β-Κ-путем, и последующим реакциям, которые развиваются вследствие первых.

Термин блокатор ЬТ-β-Κ относится к агенту, который способен ослабить связывание лиганда с ЬТ-β-К. объединение ЬТ-β-Κ клеточной поверхности в кластеры или передачу сигналов через ЬТ-β-Κ. либо который способен повлиять на интерпретацию сигнала внутри клетки.

Блокатор ЬТ-β-Κ. который действует на стадии лиганд-рецепторного связывания, способен ингибировать связывание ЬТ-лиганда с ЬТβ-Κ. по крайней мере, на 20%. Блокатор ЬТ-β-Κ. который действует после стадии лигандрецепторного связывания, способен ингибировать цитотоксические эффекты стимуляции ЬТβ-Κ на опухолевую клетку, по крайней мере, на 20%. Примеры блокаторов ЬТ-β-Κ включают растворимые молекулы ЬТ-β-Κ-Ρο и Ай к ЬТ-α. ЬТ-β. ЬТ-α/β или ЬТ-β-Κ. Предпочтительно, антитела не вступают в перекрестные реакции с секретируемой формой ЬТ-α.

Термин биологическая активность ЬТ-βΚ относится к

1) способности молекулы ЬТ-β-Κ или производного конкурировать за связывание с растворимым или поверхностным ЬТ-лигандом с растворимыми или поверхностными молекулами ЬТ-β-Κ; или

2) способности стимулировать развитие иммунорегуляторного ответа или цитотоксической активности наподобие нативной молекулы ЬТ-β-Κ.

Термины гетеромерный комплекс ЬТ-α/β и гетеромерный комплекс ЬТ относятся к стойкому комплексу, по крайней мере, одной субъединицы ЬТ-α и одной или более субъединиц ЬТ-β. включая растворимые, мутантные, измененные и химерные формы одной или более субъединиц. Субъединицы могут объединяться посредством электростатических, вандерваальсовых или ковалентных взаимодействий. Предпочтительно, гетеромерный комплекс ЬТ-α/β содержит, по крайней мере, две соседние субъединицы ЬТ-β и не содержит соседних субъединиц ЬТ-α. Когда гетеромерный комплекс ЬТ-α/β служит в качестве стимулятора ЬТ-β-К в анализе клеточного роста, комплекс является, предпочтительно, растворимым и описывается стехиометрическим соотношением ЬТα1/β2. Растворимые гетеромерные комплексы ЬТ-α/β не содержат трансмембранного домена и могут быть секретированы подходящей клеткой-хозяином, которая экспрессирует субъединицы ЬТ-α. и/или ЬТ-β (Сго\\'с с! а1., 1. 1ттипо1. МеШобк, 168, стр. 78-89 (1994)).

Термин ЬТ-лиганд относится к гетеромерному комплексу ЬТ или его производному, который специфично связывается с рецептором к ЬТ-β.

Термин лиганд-связывающий домен ЬТβ-Κ относится к части или частям ЬТ-β-Κ, которые вовлечены в процесс специфичного распознавания и взаимодействия с ЬТ-лигандом.

Термины поверхностный комплекс ЬТα/β и поверхностный комплекс ЬТ относятся к комплексу, содержащему субъединицы ЬТ-α и мембранно-связанные субъединицы ЬТ-β включая мутантные, измененные и химерные формы одной или более субъединиц - которые экспрессируются на клеточной поверхности. Термин поверхностный ЬТ-лиганд относится к поверхностному комплексу ЬТ или его производному, который способен специфично связываться с рецептором к ЬТ-β.

Термин субъект относится к животному или к одной или более клеткам животного происхождения. Предпочтительно, животное представляет собой млекопитающее. Клетки могут находиться в любом виде, включая, но не ограничиваясь, клетки, оставленные в ткани, кластеры клеток, иммортализованные, трансфицированные или трансформированные клетки и клетки, полученные из животного, которое было физически или фенотипически изменено.

Лимфотоксин-β: Член семейства ΤΝΕ

Выяснилось, что цитокины, родственные фактору некроза опухоли (ЮТ), представляют собой большое семейство плейотропных медиаторов иммунной защиты и регуляции иммунной системы. Члены данного семейства существуют в мембранно-связанной форме, которая действует местно посредством межклеточных контактов, или в виде секретируемых белков, которые способны действовать на удаленные мишени. Параллельно семейство ТИР-родственных рецепторов взаимодействует с данными цитокинами и запускает разнообразные пути, включая клеточную гибель, клеточную пролиферацию, дифференцировку ткани и провоспалительные реакции.

Т№, лимфотоксин-α (ЬТ-α, также называемый ТИР-β) и лимфотоксин-β (ЬТ-β) являются членами семейства ТИР лигандов, которые также включают лиганды рецепторов Рак, ΟΌ27,

СП30, СЭ40, ОХ-40 И 4-1ВВ (8тйЬ е! а1., Се11, 76, стр. 959-62 (1994)). Передача через некоторых членов семейства ТИР - включая ТИР, ЬТα, ЬТ-β и Рак - может индуцировать гибель опухолевой клетки по механизму некроза или апоптоза (запрограммированной клеточной гибели). В неопухолевых клетках ТИР и многие лигандрецепторные взаимодействия в пределах семейства ТИР влияют на развитие иммунной системы и ответы на различные антигенные стимулы.

Большинство мембранно-связанных комплексов ЬТ-α/β (поверхностных ЬТ) отвечают стехиометрическому соотношению ЬТ-сН/!^ (Вго\\тппд е! а1., Се11, 72, стр. 847-56 (1993); Вто^шпд е! а1., 1. 1ттипо1., 154, стр. 33-46 (1995)). Поверхностные ЬТ-лиганды не связываются с ТИР-К с высокой аффинностью и не стимулируют передачу сигналов через ТИР-К. Другой ТИР-родственный рецептор, называемый рецептором к ЬТ-β (ЬТ-β-Κ), связывает данные поверхностные лимфотоксиновые комплексы с высокой аффинностью. (Сго\\'е е! а1., 8с1епее, 264, стр. 707-10 (1994)).

Передача сигналов через ЬТ-β-Κ, как и передача сигналов через ТИР-К, обладает антипролиферативным эффектом и может являться цитотоксической по отношению к опухолевым клеткам. В совместно поданной заявке на патент Соединенных Штатов № 0/378968 авторов настоящей заявки описаны композиции и способы для избирательной стимуляции ЬТ-β-Κ с применением стимуляторов ЬТ-β-Κ. Стимуляторы ЬТβ-Κ применимы для ингибирования роста опухолевых клеток без коактивации ТИР-Κиндуцированных провоспалительных и иммунорегуляторных путей.

Что касается воздействия на неопухолевые клетки, ТИР и ТИР-родственные цитокины стимулируют развитие широкого круга иммунных реакций. Как ТИР, так и ^Т-α-лиганды связываются и стимулируют ТИР-рецепторы (р55 или р60 и р75 или р80; называемые здесь ТИР-Κ). ТИР и ЬТ-α продуцируются макрофагами в ранней и быстрой реакции на бактериальную инфекцию, которая усиливает бактерицидную активность макрофагов и нейтрофилов. ТИР и ЬТ-α, продуцируемые макрофагами или цитотоксическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ или киллерными Т-клетками), связываются с рецепторами к ТИР на поверхности клеток-мишеней и запускают гибель восприимчивых клеток.

ТИР и ТИР-родственные цитокины способны также запускать воспалительные каскады в ответ на инфекцию или стресс. Выброс ТИР, ЬТ-α и 1РИ-у изменяет адгезивные свойства клеток сосудистого эндотелия и лимфоцитов определенных типов. Повышенная адгезивность облегчает миграцию фагоцитов и лейкоцитов из кровотока в ткани, окружающие очаг воспаления. Сходные воспалительные реакции играют основную роль в клеточном отторжении транс плантатов тканей и органов и при определенных иммунных нарушениях.

Лимфотоксиновые (ЬТ) комплексы клеточной поверхности были охарактеризованы на клетках СЭ4' Т-клеточной гибридомы (II23.Ό7), которые экспрессируют высокие уровни ЬТ (Вгохшпд е! а1., I. 1ттипо1., 147, стр. 123037 (1991); Апйго1е\\тсх е! а1., 1. Βίο1. Сйет., 267, стр. 2542-47 (1992)). Данные по экспрессии и биологической роли ЬТ-β-Κ, субъединиц ЬТ и поверхностных ЬТ комплексов приведены в обзоре С.Р. Ааге е! а1., Тйе 1фапйз апй гесер!огз ок 1йе 1утрйо!ох1п зуз!ет, в Ракхауз ког Су!о1уз1з, Сиггеп! Торюз М1сгоЫо1. 1ттипо1., 8ргтдег-Уег1ад, стр. 175-218 (1995).

Экспрессия ЬТ-α индуцируется, а ЬТ-α. секретируется преимущественно активированными Т- и В-лимфоцитами и естественными киллерами (ΝΚ). Оказывается, что среди подклассов Т-хелперных клеток ЬТ-α продуцируется Т111-. но не продуцируется ТЬ2-клетками. ЬТα также был определен в меланоцитах. АнтиЬТ-α антитела могут быть также сорбированы на клетки микроглии и Т-клетки в очагах рассеянного склероза.

Лимфотоксин-β (также называемый р33) был выявлен на поверхности Т-лимфоцитов, Тклеточных линий. В-клеточных линий и лимфокин-активированных киллерных (ЬАК) клеток. ЬТ-β является субъектом совместно поданных международных заявок авторов настоящей заявки РСТ/Ь8 91/04588, опубликованной 9 января 1992 года, как АО 92/00329; и РСТ/ϋδ 93/11669, опубликованной 23 июня 1994 года, как АО 94/13808, которые включены здесь в качестве ссылки.

Поверхностные ЬТ комплексы преимущественно экспрессируются активированными Ти В-лимфоцитами и естественными киллерами (ΝΚ), что может быть определено с помощью РАС8-анализа или в соответствии с иммуногистологическими методиками с применением анти-ЬТ-α антител или растворимых гибридных белков ΒΡ-β-ΒΡα Поверхностный ЬТ был также описан в клонах цитотоксических Тлимфоцитов (СТЬ) человека, на активированных периферических мононуклеарных лимфоцитах (РМЬ), на 1Ь-2-активированных периферических лимфоцитах крови (ЬАК-клетках), на периферических В-лимфоцитах (РВЬ), активированных митогеном фитолакки или активированных анти-СЭ40. и в различных лимфоидных опухолях из Т- и В-клеточных рядов. Контакт с аллоантиген-несущими клетками мишенями специфично индуцирует экспрессию поверхностного ЬТ клонами СЭ8' и СЭ4' СТЬ.

Рецептор к ЬТ-β, член ΤΝΡ-семейства рецепторов, специфически связывает поверхностные ЬТ-лиганды. ЬТ-β-В связывает гетеромерные комплексы ЬТ (преимущественно ^Т-α1/β2 и ^Т-α2/β1), но не связывает Т№ или ЬТ-α (Сгохе е! а1., 8с1епсе, 264, стр. 707-10 (1994)). Передача сигнала через ЬТ-β-Κ может играть роль в развитии периферических лимфоидных органов и в развитии гуморальных иммунных реакций.

Исследования экспрессии ЬТ-β-Κ находятся на ранних стадиях. мРНК, кодирующая ЬТ-βΚ, обнаружена в селезенке, тимусе и других важнейших органах человека. Характер экспрессии ЬТ-β-Κ сходен с таковым, показанным для р55-Т№-К за исключением того, что ЬТ-βΚ отсутствует на Т-клетках периферической крови и на Т-клеточных линиях.

Продукция растворимых ЬТ-комплексов

Растворимые гетеромерные комплексы ЬТα/Η содержат субъединицы ЬТ-а, которые преобразованы из мембранно-связанной в растворимую форму. Данные комплексы подробно описаны в совместно поданной международной заявке авторов настоящей заявки (РСТ/ϋδ 93/11669, опубликованной 23 июня 1994 года, как АО 94/13808). Растворимые ЬТ-а-пептиды определяются аминокислотной последовательностью лимфотоксина-а, где последовательность расщепляется в любой точке между концом трансмембранного фрагмента (т.е. приблизительно у аминокислотного остатка № 44) и первым ΤΝΡ-гомологичным фрагментом (т.е. у аминокислотного остатка № 88) в соответствии с системой нумерации Вгохшпд е! а1., Се11, 72, стр. 847-56 (1993).

Растворимые ЬТ-а-полипептиды могут быть получены путем усечения Ν-конца ЬТ-а с удалением цитоплазматического фрагмента и трансмембранного фрагмента (С го хе е! а1., 8аепсе, 264, стр. 707-10 (1994)). Альтернативно, трансмембранный домен может быть инактивирован путем делеции или замещения гидрофобных аминокислотных остатков, которые содержат трансмембранный домен в норме, гидрофильными остатками. В другом случае создается существенно гидрофильный профиль гидрофобности, который снижает сродство к липидам и повышает водорастворимость. Делеция трансмембранного домена является предпочтительной по сравнению с замещением гидрофильными аминокислотными остатками, поскольку это позволяет избежать внесения потенциально иммуногенных эпитопов.

Исключенный или инактивированный трансмембранный домен может быть замещен или присоединен к лидерной последовательности типа I (например, к лидерной последовательности УСАМ-1) таким образом, что последовательность секретируемого белка начинается с остатка, находящегося между уа140 и рго88. Растворимые ЬТ-а-полипептиды могут включать в себя любое количество хорошо известных лидерных последовательностей на Ν-конце. Такая последовательность позволит пептидам экс прессироваться и служить мишенью для каскада секреции в эукариотической системе. Смотри, например, Егпк! е! а1., патент Соединенных Штатов №5082783 (1992).

Растворимые гетеромерные комплексы ЬТа/а могут быть получены путем совместного трансфицирования подходящей клетки-хозяина ДНК, кодирующей ЬТ-а и растворимый ЬТ-а (Стоте е! а1., 1. 1ттипо1. Ме!йоб8, 168, стр. 7889 (1994)). Растворимый ЬТ-а, секретируемый в отсутствие ЬТ-а, сильно олигомеризован. Однако, когда он экспрессируется совместно с ЬТа, образуется тримерная структура массой 70 кДа, которая содержит оба белка. Также можно получить растворимые гетеромерные комплексы ЬТ-а1/а2 путем трансфицирования клеточной линии, которая в норме экспрессирует только ЬТ-а (такая, как линия КРМ1 1788, обсуждавшаяся выше), геном, кодирующим растворимый полипептид ЬТ-а.

Полипептиды ЬТ-α и ЬТ-а могут быть синтезированы по отдельности, денатурированы с использованием нестойких детергентов, смешаны вместе и ренатурированы путем удаления детергента с образованием смешанных гетеромерных комплексов ЬТ, которые могут быть выделены (смотри ниже).

Очистка комплексов ЬТ-а1/а2

Растворимые гетеромерные комплексы ЬТа1/а2 выделяют из совместно экспрессируемых комплексов с различными стехиометрическими соотношениями субъединиц по методу хроматографии, применяя рецепторы к Т№ и ЬТ-а в качестве реагентов для аффинной очистки. ТИРрецепторы связываются лишь с α/α-щелями комплексов ЬТ. Рецептор к ЬТ-а с высокой аффинностью связывается с а/а-щелями и с меньшей аффинностью с а/а-щелями гетеромерных комплексов ЬТ-а/а. Соответственно, ЬТ-а3 и ЬТ-а2/а1 будут связываться с ТИР-К. ЬТ-а-К также способен связывать тримеры ЬТ-а2/а1 (с а/а-щелями), но не способен связывать ЬТ-а3. В дополнение к этому, ЬТ-а-К (но не ТИР-К) связывает ЬТ-а1/а2 и ЬТ-ап (точный состав такого соединения неизвестен, однако, оно представляет собой крупные агрегаты).

Аффинные реагенты на основе рецепторов могут быть получены либо в виде растворимого внеклеточного домена (смотри, например, ЬоеЬсйег е! а1., 1. Βίο1. Сйет., 266, стр. 18324-29 (1991)), либо в виде химерных белков, состоящих из внеклеточного лиганд-связывающего домена, присоединенного к Ес-домену иммуноглобулина (ЬоеЬсйег е! а1., 1. Βίο1. Сйет., 266, стр. 18324-29 (1991); Стоте е! а1., 8с1епсе, 264, стр. 707-10 (1994)). Рецепторы связывают с аффинными матрицами посредством химического поперечного сшивания, применяя устоявшиеся методики.

Существуют две схемы, по которым ЬТа1/а2- лиганд может быть очищен с применением рецепторов и иммуноаффинной хроматографии. В соответствии с первой схемой супернатант из системы с подходящей экспрессией, экспрессирующей как ЬТ-а, так и усеченную форму ЬТ-а, пропускают через колонку с ТИРК. ТИР-К будет связывать ЬТ-а3 и тримеры ЬТа2/а1. Элюат, прошедший через колонку с ТИРК будет содержать ЬТ-а(п) и ЬТ-а1/а2.

В соответствии со второй схемой все ЬТ-асодержащие формы (ЬТ-а(п), ЬТ-а1/а2 и ЬТа2/а1) сажают на колонку с ЬТ-а-К и элюируют с нее, применяя классические методики изменения сйаоборйе или рН. (ЬТ-а3 элюируется сквозь колонку). Элюат нейтрализуют или удаляют сйаоборйе, а элюат затем пропускают через колонку с ТИР-К, который связывает лишь тримеры ЬТ-а2/а1. Элюат, прошедший через данную колонку, будет содержать ЬТ-а(п) и ЬТа1/а2.

В обоих случаях, чистые тримеры ЬТа1/а2 могут быть отделены от ЬТ-а с помощью последовательного выполнения методик гельфильтрации и/или ионообменной хроматографии, известных в данной области.

Альтернативно, различные формы гетеромерных комплексов ЬТ-а/а могут быть разделены и очищены в соответствии с множеством традиционных хроматографических методик. Также предпочтительным может являться объединение серии традиционных схем очистки с одной из стадий иммуноаффинной очистки, описанных выше.

Скрининг для поиска блокаторов ЬТ-β-Κ

В одном осуществлении данного изобретения блокатор ЬТ-β-Β содержит антитело (АЬ) к ЬТ-β-Ε, которое ингибирует передачу сигнала через ЬТ-β-Ρ.. Предпочтительно, анти-ЬТ-β-Ρ. АЬ представляет собой моноклональное антитело (тЛЬ). Одним из таких анти-ЬТ-β-Ρ тЛЬ является тАЬ ΒΌΑ8.

Ингибирующие анти-ЬТ-β-Β АЬ и другие блокаторы ЬТ-β-Β могут быть идентифицированы с применением методов скрининга, которые определяют способность одного или более агентов либо связываться с ЬТ-β-Β или с ЬТлигандом, либо ингибировать эффекты передачи сигнала через ЬТ-β-Ρ. на клетки.

В одном скрининговом методе применяются цитотоксические эффекты передачи сигнала через ЬТ-β-Ρ. на опухолевые клетки, экспрессирующие ЬТ-β-Κ Опухолевые клетки подвергают воздействию одного или более стимуляторов ЬТ-β-Ρ. с тем, чтобы вызвать передачу сигнала через ЬТ-β-Κ Стимуляторы ЬТ-β-Β вклю чают гетеромерные комплексы ЬТ-α/β (предпочтительно, растворимые ΕΤ-α1/β2) в присутствии ΙΕΝ-γ или стимулирующее анти-ЬТ-β-Κ ЛЬ (смотри ниже; также описанное в совместно поданной заявке на патент Соединенных Штатов № 08/378968 авторов настоящей заявки). Антитела и другие агенты, которые способны блокировать передачу сигнала через ЬТ-β-Κ выбирают, основываясь на их способности ингибировать цитотоксический эффект передачи сигнала через ЬТ-β-Κ. на опухолевые клетки в следующем анализе:

1) Опухолевые клетки, такие как клетки НТ29, культивируют в течение от трех до четырех суток в серии лунок для тканевой культуры, содержащих среду и, по крайней мере, один стимулятор ЬТ-β-Κ в присутствии или в отсутствие серийных разведений тестируемого агента;

2) К опухолевым клеткам добавляют витальный краситель, по которому определяют функцию митохондрий, такой как МТТ, и реакции дают протекать в течение нескольких часов;

3) Количественно определяют оптическую плотность смеси в каждой лунке при длине волны 550 нм (ОП 550). Значение ОП 550 пропорционально количеству опухолевых клеток, выживших в присутствии стимулятора ЬТ-β-Κ и тестируемого блокатора ЬТ-β-Κ в каждой лунке. Агент или комбинация агентов, которые в данном анализе способны уменьшить ЬТ-β-Κстимулированную цитотоксичность по отношению к опухолевым клеткам, по крайней мере, на 20%, являются блокаторами ЬТ-β-Κ, входящими в сферу данного изобретения.

Любой агент или комбинация агентов, которые стимулируют передачу сигнала через ЬТβ-Κ, могут быть применены в описанном выше анализе для идентификации блокаторов ЬТ-β-Κ. Стимуляторы ЬТ-β-Κ, которые индуцируют передачу сигнала через ЬТ-β-Κ (такие, как стимулирующие анти-ЬТ-β-Κ тЛЬ), могут быть выбраны на основании их способности - одного или в сочетании с другими агентами - потенциировать цитотоксичность по отношению к опухолевым клеткам с применением анализа выживаемости опухолевых клеток, описанного выше.

Другой способ выбора блокатора ЬТ-β-Κ представляет собой исследование способности предполагаемого агента непосредственно вмешиваться в процесс ЬТ-лиганд-рецепторного связывания. Агент или комбинация агентов, которые способны блокировать лиганд-рецепторное связывание, по крайней мере, на 20%, являются блокаторами ЬТ-β-Κ, входящими в сферу данного изобретения.

Для проведения анализа конкуренции с предполагаемыми блокаторами ЬТ-β-Κ может быть применена любая из ряда методик прове дения анализа, с помощью которого измеряют прочность лиганд-рецепторного связывания. Прочность связывания между рецептором и лигандом может быть измерена с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЬ18А) или радиоиммуноанализа (ΚΙΑ). Параметры специфичного связывания также могут быть измерены с помощью комплексов антигенантитело, меченых флюоресцентной меткой, или с помощью выполнения проведения анализа на клеточном сортере с возбуждением флюоресценции (ЕАС8) или путем постановки других подобных методик иммунологического анализа, каждая из которых представляет собой методику, хорошо известную в данной области.

Параметры лиганд-рецепторного связывания также могут быть измерены с помощью прибора В1Асоге (Рйаттас1а Вюкепкот), в котором используется явление р1актоп резонансного определения (2йои е! а1., Вюсйетщйу, 32, стр. 8193-98 (1993); Еаедетйгат апб О'811аппе55у 8игГа5е р1актоп гекопапсе бе!есбоп ίη аГГ1П1(у 1есйпо1од1е8, в НапбЬоок оГ АГйпйу СйготаЮдгарйу, стр. 229-52, Магсе1 Ьеккег, 1пс., №\ν Уотк (1993)).

Технология В1Асоге позволяет посадить рецептор на золотую поверхность и пропускать над ним лиганд. Р1актоп резонансное определение позволяет непосредственно количественно определить массу, связавшуюся с поверхностью за определенное время. Данная методика позволяет определить константы скорости как прямой, так и обратной реакции, и, таким образом, константа диссоциации и константа сродства комплекса лиганд-рецептор могут быть непосредственно определены в присутствии и в отсутствие предполагаемого блокатора ЬТ-β-Κ.

С помощью данных или иных методик для измерения параметров связи в комплексе рецептор-лиганд можно оценить способность блокатора ЬТ-β-Κ, одного или в сочетании с другими агентами, ингибировать связывание поверхностных или растворимых ЬТ-лигандов с поверхностными или растворимыми молекулами ЬТ-βΚ. Такие анализы также могут быть применены для тестирования блокаторов ЬТ-β-Κ или производных таких агентов (например, конденсированных, химерных, мутантных или химически модифицированных форм) - одних или в сочетании с другими агентами - для оптимизации способности данного модифицированного агента блокировать стимуляцию ЬТ-β-Κ.

Продукция растворимых молекул ЬТ-β-Κ

В одном осуществлении данного изобретения блокаторы ЬТ-β-Κ содержат растворимые молекулы рецептора к ЬТ-β.

Фиг. 1 показывает последовательность внеклеточного фрагмента человеческого ЬТ-βΚ, которая кодирует лиганд-связывающий домен. Применяя информацию последовательности, приведенную на фиг. 1, и методики получе ния рекомбинантной ДНК, хорошо известные в данной области, функциональные фрагменты, кодирующие лиганд-связывающий домен ЬТ-βЯ, могут быть клонированы в векторе и экспрессированы подходящим хозяином с получением растворимой молекулы ЬТ-β-Я. Растворимые молекулы ЬТ-β-Я, которые по данным описанных здесь анализов могут конкурировать с нативными рецепторами к ЬТ-β за связывание ЬТ-лиганда, отбирают как блокаторы ЬТ-β-Я.

Растворимый рецептор к ЬТ-β, содержащий аминокислотные последовательности, выбранные из таковых, приведенных на фиг. 1, может быть присоединен к одному или более гетерологичных белковых доменов (гибридных доменов) в целях увеличения устойчивости рецепторного гибридного белка ίη νίνο или в целях модулирования его биологической активности или локализации.

Предпочтительно, для создания рецепторных гибридных белков применяют стойкие белки плазмы - которые, как правило, имеют период полужизни в циркуляторном русле более чем 20 ч. Такие белки плазмы включают, но не ограничиваются: иммуноглобулины, сывороточный альбумин, липопротеины, алолипопротеины и трансферрин. Последовательности, которые способны нацеливать растворимую молекулу ЬТ-β-Я на определенную клетку или тип ткани, также могут быть присоединены к лигандсвязывающему домену ЬТ-β-Я в целях создания специфически локализованного растворимого гибридного белка ЬТ-β-Я.

Весь внеклеточный фрагмент ЬТ-β-Ρ или его функциональная часть (фиг. 1), содержащая лиганд-связывающий домен ЬТ-β-Я, может быть гибридизован с постоянным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, таким как Редомен тяжелой цепи 1дО1 человека (Βτο^ηίη§ с1 а1., 1. 1ттипо1., 154, стр. 33-46 (1995)). Растворимые гибридные белки рецептор-1§С являются предпочтительными и представляют собой распространенные иммунологические реагенты, а способы их создания известны специалистам в данной области (смотри, например, патент Соединенных Штатов № 5225538, включенный здесь в качестве ссылки).

Функциональный лиганд-связывающий домен ЬТ-β-Ρ может быть гибридизован с Рсдоменом иммуноглобулина (1д), относящегося к классу или подклассу иммуноглобулинов, отличному от 1дС 1. Рс-домены или антитела, относящиеся к различным классам или подклассам 1д, способны активировать различные вторичные эффекторные функции. Активация происходит, когда Рс-домен связывается сходным Рс-рецептором. Вторичные эффекторные функции включают способность активировать систему комплемента, проникать через плаценту и связывать различные белки микробного происхождения. Свойства различных классов или подклассов иммуноглобулинов описаны Яой1 с1 а1., 1ттипо1оду, стр. 4.8 (МокЬу-Уеат Воок Еигоре Ыб., 36 еб. 1993).

Активация системы комплемента запускает каскады ферментативных реакций, которые опосредуют воспаление. Продукты системы комплемента обладают множеством функций, включая связывание бактерий, эндоцитоз, фагоцитоз, цитотоксичность, продукцию свободных радикалов и солюбилизацию иммунных комплексов.

Ферментативный каскад системы комплемента может быть активирован Рс-доменами антиген-связанных антител классов 1дС1, 1дО3 и 1дМ. Выяснилось, что Рс-домен 1дО2 является менее эффективным, а Рс-домены 1дС4, 1дА, 1§ϋ и 1дЕ являются неэффективными для активации системы комплемента. Таким образом, Рс-домен выбирают на основании того, являются ли связанные с его применением вторичные эффекторные функции желаемыми при конкретной иммунной реакции или заболевании, которые лечат с помощью гибридного белка ЬТβ-Я-Рс.

Если предпочтительно будет повредить или убить ЬТ-лиганд-несущие клетки-мишени, для создания гибридного белка ΕΓ-β^^ можно выбрать особенно активный Рс-домен (1дС1). Альтернативно, если предпочтительно будет нацелить гибридный белок υΡ-β-Ε-Εε на клетку без активации системы комплемента, можно выбрать неактивный Рс-домен 1дС4.

Были описаны мутации в Рс-домене, которые снижают или прекращают связывание с Рсрецепторами и активацию системы комплемента (8. Моткоп, Аппи. Яеν. 1ттипо1., 10, стр. 23965 (1992)). Данные или другие мутации могут быть применены одни или в сочетании для оптимизации активности Рс-домена, применяемого для создания гибридного белка ЬТф-Я-Рс.

Получение растворимого человеческого гибридного белка ЬТ-β-Я, содержащего лигандсвязывающие последовательности, конденсированные с Рс-доменом человеческого иммуноглобулина описано в примере 1.

Одну линию СНО, созданную в соответствии с примером 1, которая секретирует й^Т-β-Я-Ρс, называют 11ЬТ|Ь Я-11С1 СНО#14. Образец данной линии был принят на хранение 21 июля 1995 года в Атепсап Туре СиНите Со11ес1юп (АТСС) (Яос^Ше, ΜΌ) в соответствии с положениями Будапештского договора (1Не Вибарей Тгеа1у) и ему был присвоен номер по каталогу АТСС СЯЫ1965.

Получение молекулы растворимого мышиного гибридного белка ^Т-β-Я(т^Т-β-Я-Ρс) описано в примере 2. Линию СНО, созданную в соответствии с примером 2, которая секретирует т^Т-β-Я-Ρс, называют тЬТ|Ь Я-11С1 СНО#1.3.ВВ. Образец данной линии был принят на хранение 21 июля 1995 года в Атепсап

Туре СиИите Со11сс11оп (АТСС) (КоскуШе, ΜΌ) в соответствии с положениями Будапештского договора (111е Вибарей Тгеа1у) и ему был присвоен номер по каталогу АТСС СКЫ1964.

Все ограничения доступности широкому кругу исследователей вышеуказанных хранилищ АТСС будут окончательно сняты по выдаче патента на данную заявку.

Различные аминокислотные остатки, образующие точку соединения в гибридном белке рецептор-1д могут изменять структуру, устойчивость и предельную биологическую активность растворимого ЬТ-β-рецепторного гибридного белка. На С-конец выбранного фрагмента ЬТ-β-К может быть добавлена одна или более аминокислот в целях модификации точки соединения выбранным доменом слияния.

Ν-конец гибридного белка ЬТ-β-Β также может быть модифицирован путем изменения положения, по которому выбранный фрагмент ДНК, кодирующей ЬТ-β-Β, расщепляется на 5'конце для вставки в рекомбинантный экспрессирующий вектор. Устойчивость и активность каждого гибридного белка ЬТ-β-Β могут быть протестированы и оптимизированы с помощью устоявшихся методик постановки эксперимента и анализов для выбора описываемых здесь блокаторов ЬТ-β-Β.

Применяя последовательности лигандсвязывающего домена ЬТ-β-Β во внеклеточном домене, показанном на фиг. 1, можно также создать варианты аминокислотных последовательностей с тем, чтобы модифицировать сродство растворимого рецептора к ЬТ-β или гибридного белка к ЬТ-лиганду. Растворимые молекулы ЬТβ-Β по данному изобретению способны конкурировать за связывание поверхностного ЬТлиганда с эндогенными рецепторами к ЬТ-β на клеточной поверхности. Представляется, что любая растворимая молекула, содержащая лиганд-связывающий домен ЬТ-β-Β, которая способна конкурировать с рецепторами к ЬТ-β на клеточной поверхности за связывание поверхностного ЬТ-лиганда, является блокатором ЬТβ-Β, который входит в сферу настоящего изобретения.

Растворимые молекулы ЬТ-β-Κ как блокаторы ЬТ-β-Κ

Растворимый гибридный белок, состоящий из рецептора к ЬТ-β и иммуноглобулина человека (ΗυΓ-β-Β-Γφ, получали в соответствии с методиками, приведенными в примере 1, и тестировали на предмет его способности блокировать ЬТ-β-Β-индуцированную цитотоксичность по отношению к человеческим опухолевым клеткам НТ29. В таблице 1 (пример 3) приводится сравнение способности растворимых гибридных белков рецептора к ЬТ-β (й^Т-β-Β-Εс) и рецептора к Т№ (ρ55-ΊΝΓ-Β-Γφ блокировать ингибирующие эффекты различных и рас творимых ЬТ-лигандов на рост опухолевых клеток НТ29.

Среди данных, изложенных в табл. 1, указаны концентрации, при которых растворимый рецептор к ЬТ-β (11^-()-^-60) способен предотвращать гибель опухолевых клеток, вызванную взаимодействием между ^Т-α1/β2-лигандом и рецепторами к ЬТ-β клеточной поверхности на 50%. Способность блокировать рост опухолевых клеток, по крайней мере, на 20% свидетельствует о данном растворимом рецепторе к ЬТ-β как о блокаторе ЬТ-β-Β по данному изобретению. Как и ожидалось, растворимый гибридный белок ^55^^^-60) полностью блокирует ΤΝΡ-индуцированное ингибирование роста путем связывания с и предотвращения его взаимодействия с поверхностным рецептором.

Растворимый гибридный белок Т№-И не влияет на опосредованные ЬТ-лигандом (ЬТα1/β2) антипролиферативные эффекты. В противоположность этому, гибридный белок ЬТ-βΒ блокировал эффекты ЬТ-лиганда, но не блокировал эффекты или ЬТ-α. Таким образом, растворимые гибридные белки ЬТ-β-Β человека не вмешиваются в процесс активации ТЖ-И и ЬТа-лигандами.

Для того, чтобы определить, является ли передача сигнала через ЬТ-β-Β также цитотоксической для опухолевых клеток у мышей, и способны ли растворимые гибридные белки ЬТβ-Β блокировать ^Т-β-Β-индуцированную цитотоксичность, проводили сходный эксперимент, применяя мышиные опухолевые клетки. Растворимый мышиный гибридный белок ЬТ-βΒ-Ес (т^Т-β-Β-Εс; смотри пример 2) тестировали на предмет его способности предотвращать гибель мышиных клеток \УЕН1 164, обработанных ЬТ-лигандом (пример 4).

На фиг. 2 показаны эффекты растворимого мышиного ЬТ-β-Β (111^-()-6-60) на ЬТ-лигандиндуцированную передачу сигнала через ЬТ-βΒ на мышиных клетках \УЕН1 164. Как показано данным анализом, клетки \УЕН1 164 гибнут при обработке растворимым ЕТ-а1/|)2-лигандом. Добавление т6Т-|)-6-6с блокирует ЬТ-лигандстимулированную клеточную гибель. Контрольный гибридный белок Т№-рецептора обладает слабым эффектом на блокирование клеточной гибели.

Эти данные показывают, что растворимый гибридный белок ЬТ-β-Β способен эффективно конкурировать с поверхностными молекулами ЬТ-β-Β за связывание ЬТ-лиганда. Таким образом, растворимый гибридный белок ^^^-60 действует у мышей как блокатор ЬТ-β-Β.

Источник антител к человеческому ЬТ-β-Κ

В другом осуществлении данного изобретения антитела к человеческому рецептору к ЬТ-β (анти-ЬТ-β-Β АЬ) функционируют как блокатор ЬТ-β-Β. Анти-ЬТ-β-Β АЬ по данному изобретению могут являться поликлональными или моноклональными (тАЬ) и могут быть модифицированы в целях оптимизации их способности блокировать передачу сигнала через ЬТβ-Κ, их биологической доступности ίη νίνο, устойчивости и других желаемых свойств.

Поликлональные антисыворотки к человеческому рецептору к ЬТ-β получают, применяя традиционные методики подкожного введения животным, таким как козы, кролики, крысы, хомяки, мыши, гибридного белка человеческого рецептора к ЬТ-β и Ес-домена иммуноглобулина (пример 1) в полном адъюванте Фройнда с последующим реиммунизирующим внутрибрюшинным или подкожным введением в неполном адъюванте Фройнда. Поликлональные антисыворотки, содержащие желаемые антитела к рецептору к ЬТ-β, тестируют с помощью традиционных иммунологических методик.

Мышиные моноклональные антитела (тАЬ) к гибридному белку человеческого рецептора к ЬТ-β и Ес-домена иммуноглобулина получают, как описано в примере 5. Гибридомная клеточная линия (ΒΌ.Α8.ΑΒ9), которая продуцирует мышиные тАЬ ΒΌΑ8 к человеческому ЬТ-β-Κ, была принята на хранение 12 января 1995 года в Атепсап Туре СиНиге Со11ес11оп (АТСС) (КоскпИе, ΜΌ) в соответствии с положениями Будапештского договора (111с ВибареЧ Тгеа1у) и ему был присвоен номер по каталогу АТСС НВ 11798. Все ограничения доступности широкому кругу исследователей вышеуказанных хранилищ АТСС будут окончательно сняты по выдаче патента на данную заявку.

Различные виды анти-ЬТ-β-Κ антител также могут быть созданы с применением стандартных методик рекомбинантной ДНК (^М1п1ег апб Μίΐκίοίη, №1Ц.1ге. 349, стр. 293-99 (1991)). Например, могут быть сконструированы химерные антитела, в которых антигенсвязывающий домен антитела животного сшит с постоянным доменом иммуноглобулина человека (например, СаЬШу е1 а1., И8 4816567; Моткоп е1 а1., Ргос. Наб. Асаб. 8ск И.8.А., 81, стр. 6851-55 (1984)). Химерные антитела снижают выраженность наблюдаемых иммуногенных реакций, вызываемых антителами животных, если последние применяют в клинических лечебных процедурах на человеке.

В дополнение к этому, могут быть синтезированы рекомбинантные гуманизированные антитела, которые распознают ЬТ-β-Κ. Гуманизированные антитела представляют собой химерные молекулы, содержащие в основном последовательности человеческого 1дС, в которые введены фрагменты, ответственные за специфичное связывание антигена (например, АО 94/04679). Животных иммунизируют желаемым антигеном, соответствующее антитела выделяют и удаляют часть последовательностей вариабельных доменов, ответственную за специфич ное связывание антигена. Антиген-связывающие фрагменты животного происхождения затем клонируют в подходящее положение генов человеческих антител, из которых были удалены антиген-связывающие фрагменты. Наличие гуманизированных антител сводит к минимуму применение гетерологичных (межвидовых) последовательностей в человеческих антителах, а индукция ими иммунного ответа у обрабатываемого субъекта менее вероятна.

Конструирование различных классов рекомбинантных анти-ЬТ-β-Κ антител может быть также усовершенствовано созданием химерных или гуманизированных антител, содержащих вариабельные домены анти-ЬТ-β-Κ антител и постоянные домены человеческих антител (СН1, СН2, СН3), выделенных из иммуноглобулинов различных классов. Например, антиЬТ-β-Κ 1дМ антитела с повышенной валентностью антиген-связывающего сайта могут быть рекомбинантно получены путем клонирования антиген-связывающего сайта в векторах, несущих ДНК, кодирующую постоянные домены μцепи человеческого 1дМ (Аги1апапбат е1 а1., 1. Ехр. Меб., 177, стр. 1439-50 (1993); Ьапе е1 а1., Еиг. 1. 1ттипо1., 22, стр. 2573-78 (1993); Тгаипескег е1 а1., ХаШге, 339, стр. 68-70 (1989)).

В дополнение к этому, стандартные методики рекомбинантной ДНК могут применяться для изменения значений сродства связывания рекомбинантных антител с антигенами путем замены аминокислотных остатков поблизости от антиген-связывающих сайтов. Сродство связывания гуманизированного антитела с антигеном может быть увеличено с помощью мутагенеза, основанного на молекулярном моделировании (Оиееп е1 а1., Ргос. Хаб. Асаб. 8с1. И.8.А., 86, стр. 10029-33 (1989); АО 94/04679).

Может оказаться желательным повысить или понизить сродство анти-ЬТ-β-Κ АЬ к ЬТ-βΚ в зависимости от типа ткани-мишени или конкретной предполагаемой схемы лечения. Например, может являться предпочтительной обработка пациента постоянными уровнями анти-ЬТ-β-Κ АЬ со сниженной способностью к передаче сигнала через ЬТ-β-путь в порядке полупрофилактического лечения. Кроме того, ингибирующие анти-ЬТ-β-Κ АЬ с повышенным сродством к ЬТ-β-Κ могут являться предпочтительными для кратковременных курсов лечения.

Анти-ЬТ-β-Κ антитела как блокаторы ЬТ-β-Κ

Анти-ЬТ-β-Κ антитела могут быть отобраны путем тестирования их способности ингибировать ^Т-β-Κ-индуцированную цитотоксичность, направленную на опухолевые клетки (пример 5).

В предпочтительном осуществлении данного изобретения композиции и способы содержат мышиные тАЬ к человеческому ЬТ-β-Κ ВЬА8. На фиг. 3 показано, что тАЬ ВЬА8 действует как блокатор ЬТ-β-Κ, что определено данным изобретением. Опухолевые клетки νίΌτ прекращают рост в присутствии ΙΡΝ-γ и растворимого ЬТ-а1/р2-лиганда. Контрольные антитела (1§С1) не влияют на данное ингибирование роста. В противоположность этому, антиЬТ-β-Β тАЬ ΒΌΆ8 блокирует способность растворимого ЬТ-а1/в2-лиганда ингибировать рост клеток νίΌτ. Таким образом, антитело к человеческому рецептору к ЬТ-β способно действовать как блокатор ЬТ-β-Β, что определено настоящим изобретением.

Тестируя другие антитела к человеческому рецептору к ЬТ-β, можно ожидать, что дополнительные анти-ЬТ-β-Β антитела, которые действуют как блокаторы ЬТ-β-Β у людей, могут быть идентифицированы с помощью устоявшихся методик постановки эксперимента и анализов, описанных здесь.

Источник антител к поверхностному ЬТлиганду

Другое предпочтительное осуществление данного изобретения содержит композиции и способы, которые включают в себя антитела к ЬТ-лиганду, которые действуют как блокаторы ЬТ-β-Β. Как описано выше для случая анти-ЬТβ-Β АЬ, антитела к ЬТ-лиганду, которые действуют как блокаторы ЬТ-β-Β, могут являться поликлональными или моноклональными и могут быть модифицированы в соответствии с устоявшимися методиками в целях модулирования их антиген-связывающих свойств и их иммуногенности.

Антитела к ЬТ по данному изобретению могут быть выработаны по отдельности к одной из двух субъединиц ЬТ, включая растворимые, мутантные, измененные и химерные формы субъединицы ЬТ. Если в качестве антигена применяют субъединицы ЬТ, они предпочтительно представляют собой субъединицы ЬТ-β. Если применяют субъединицы ЬТ-α. предпочтительно, чтобы полученные анти-ЬТ-α антитела связывались с поверхностным ЬТ-лигандом и не вступали в перекрестную реакцию с секретируемым ЬТ-α и не модулировали активность ТОТ-К. (в соответствии с анализами, описанными в примере 3).

Альтернативно, антитела к гомомерному (ЬТ-β) или гетеромерному (ЬТ-α/β) комплексу, содержащему одну или более субъединиц ЬТ, могут быть выработаны и протестированы на предмет ЬТ^-К.-блокирующей активности. Предпочтительно, комплексы ΕΡ-α1/β2 применяют в качестве антигена. Как обсуждалось выше, предпочтительно, чтобы полученные антиΕΡ-α1/β2 антитела связывались с поверхностным ЬТ-лигандом и не связывались с секретируемым ЬТ-α и не влияли на активность ТИТ.

Продукция поликлональных антител к человеческому ЬТ-α описана в совместно поданной заявке авторов настоящей заявки (ГУО

94/13808). Моноклональные анти-ЬТ-α и антиЬТ-β антитела также были описаны (Вготеп1пд с1 а1., I. 1ттипо1., 154, стр. 33-46 (1995)).

Мышиные тАЬ к человеческому ЬТ-β получали, как описано в примере 6. Гибридомная клеточная линия (В9.С9.1), которая продуцирует мышиные тАЬ В 9 к человеческому ЬТ-β-Β, была принята на хранение 21 июля 1995 г. в Атепсап Туре Сн11нгс Сойесйоп (АТСС) (ВоскуШе, МО) в соответствии с положениями Будапештского договора (Ше ВибареЧ Тгеа1у) и ей был присвоен номер по каталогу АТСО НВ11962.

Моноклональные антитела хомяка к мышиному ЬТ-α/β получали, как описано в примере 7. Гибридомная клеточная линия (ВВ.Р6.1), которая продуцирует тАЬ хомяка к мышиному ЬТ-α/β ВВ.Р6, была принята на хранение 21 июля 1995 года в Атепсап Туре СиИиге Со11есЬоп (АТСС) (ВоскуШе, МО) в соответствии с положениями Будапештского договора (Ше ВибареЧ Тгеа1у) и ей был присвоен номер по каталогу АТСС НВ11963.

Антитела к ЬТ-лиганду как блокаторы ЬТ-β-Κ

Проводили анализ на клеточном сортере с возбуждением флюоресценции (РАС8) в целях скрининга на предмет антител к субъединицам ЬТ или комплексам ЬТ, которые действуют как блокаторы ЬТ-β-В (примеры 6 и 7). В данном анализе растворимый гибридный белок ЬТ-β-ΒРс добавляют к активированным митогеном фитолакки клеткам 11-23 - которые экспрессируют поверхностные ЬТ-комплексы (Вго\\тнпд е! а1., I. 1ттипо1., 154, стр. 33-46 (1995)) - в присутствии возрастающих концентраций тестируемого антитела. Антитело, которое способно ингибироватъ взаимодействие рецептора к ЬТ-β и его лиганда, по крайней мере, на 20%, отбирают как блокатор ЬТ-β-Β.

Результаты данного анализа, проведенного в целях тестирования мышиных тАЬ В9 к человеческому ЬТ-β, приведены на фиг. 4. На фиг. 4 показано, что анти-ЬТ-β тАЬ В9 способно избирательно ингибировать связывание растворимых гибридных белков ΕΡ-β-Β^ с поверхностными ЬТ-лигандами, индуцированное на активированных клетках. Данные результаты подтверждают представление о том, что антитела к субъединице ЬТ-лиганда будут действовать как блокаторы ЬТ-β-Β.

Описанный выше РАС8-анализ также применяли для тестирования ЬТ, выработанных в организме хомяка к растворимому комплексу мышиных ЬТ-α/β (пример 7). Результаты данного анализа, проведенного в целях тестирования тАЬ хомяка к мышиному ЬТ-α/β ВВ.Р6, приведены в табл. 2 (пример 7). В табл. 2 пока зано, что анти-ЬТ-α/β тЛЬ ВВ.Е6 способны эффективно ингибировать связывание растворимых гибридных белков ΕΤ-β-Β-Ре (пример 2) с поверхностными ЬТ-лигандами, экспрессируемыми на клетках мышиной Т-клеточной гибридомы, и, таким образом, являются блокаторами ЬТ-β-Β по данному изобретению.

Предпочтительное применение комплекса ЬТ-α/β по сравнению с субъединицей ЬТ в качестве антигена для иммунизации животного может привести к более эффективной иммунизации или может привести к продукции антител, обладающих большим сродством к поверхностному ЬТ-лиганду. Представляется возможным, что в случае иммунизации комплексом ЬТ-α/β могут быть выделены антитела, которые распознают аминокислотные остатки на обеих субъединицах ЬТ-α и ЬТ-β (например, остатки, которые образуют щель в комплексе ЬТ-α/β). Тестируя антитела к человеческому гетеромерному комплексу ЬТ-α/β, можно ожидать, что дополнительные анти-ЬТ антитела, которые действуют как блокаторы ЬТ-β-В у людей, могут быть идентифицированы с помощью устоявшихся методик постановки эксперимента и анализов, описанных здесь.

Блокаторы ЬТ-β-Β ингибируют опосредованную Тй1-клетками контактную гиперчувствительность у мышей.

Блокаторы ЬТ-β-Κ по данному изобретению способны ингибировать опосредованные Тй1-клетками иммунные реакции. Одной такой опосредованной Тй1-клетками реакцией является гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ; Сйет апб Моктапп, 1. 1ттипо1., 138, стр. 3688-94 (1987); смотри также I. Вой! е! а1. 1ттипо1оду, стр. 22.1-22.12, МокЬу-Уеат Воок Еигоре Ь!б., 3б еб. (1993) для общего обсуждения). ГЗТ индуцируется, когда сенсибилизированные антигеном Т111-клетки секретируют цитокины после повторного контакта с тем же антигеном.

Цитокины, продуцируемые Тй1, являются аттрактантами и стимуляторами макрофагов, которые секретируют дополнительные эффекторные молекулы, которые запускают воспалительные реакции.

Реакции, протекающие по типу ГЗТ, подразделяют на три различных типа: контактную гиперчувствительность, гиперчувствительность туберкулинового типа и гранулематозные реакции. Три типа гиперчувствительности (ГЧ) можно различить по скорости и природе ответа на чужеродный антиген, когда его наносят непосредственно на кожу или вводят под кожу сенсибилизированного субъекта. За ходом реакции ГЗТ следят путем определения скорости и степени отека кожи.

Реакции ГЧ туберкулинового типа представляют собой кожные реакции, которые развиваются в месте введения чужеродного анти гена из микроорганизма, с которым субъект ранее контактировал (например, МусоЬас!етшт ШЬегсЫоЖ или М. 1ергае). Данную кожную реакцию, которая достигает своего максимума в интервале от 48 до 72 ч после введения антигена, зачастую применяют как базовую для диагностических тестов чувствительности к ранее встречавшимся микроорганизмам (например, туберкулиновый кожный тест). Если развивается повреждение туберкулинового типа, оно может перейти в гранулематозную реакцию при условии, что антиген будет персистировать в ткани.

Гранулематозные реакции являются клинически наиболее серьезными реакциями, протекающими по типу ГЗТ, поскольку они способны привести к развитию множества патологических эффектов, связанных с заболеваниями, опосредованными Тй1-клетками. Гранулематозные реакции развиваются в случае, если макрофаги оказываются неспособными элиминировать антигены или иммунные комплексы, и последние продолжают стимулировать секрецию цитокинов Тй1. Хроническое воспаление и скопление активированных макрофагов в месте нахождения стимулирующего агента характеризуют гранулематозные реакции.

Ядро из эпителиальных клеток и макрофагов, которое может быть окружено лимфоцитами и фиброзными отложениями, формирует твердое образование, называемое гранулемой. Иногда в центре гранулемы происходит интенсивная клеточная гибель (например, в пораженной туберкулезом ткани легкого). Формирование твердого образования в ткани-мишени гранулематозной реакции протекает в течение приблизительно 4 недель.

Агенты, которые влияют на частоту образования гранулем, могут быть идентифицированы с использованием инфицированных шистосомами мышей (Атт е! а1., Ха!иге, 356, стр. 604-607 (1992)). Гельминты шистосомы способны вызывать паразитарное заболевание, которое ведет к образованию гранулем вокруг яиц шистосом в воротных венулах инфицированной печени. Агенты, которые способны ингибировать данную опосредованную Тй1-клетками реакцию ГЗТ, способны снижать размер гранулем или частоту или скорость образования гранулем в инфицированной шистосомами печени мышей. Клеточная реакция на яйца шистосом может быть оценена с помощью определения изменения количества и размера гранулем, образующихся у мышей, обрабатываемых возрастающими концентрациями предполагаемого блокатора ЬТ-β-В с течением времени.

Контактная гиперчувствительность (КГЧ) представляет собой класс ГЗТ, в котором органом-мишенью является кожа. При КГЧ воспалительная реакция вызывается местным нанесением реактивного гаптена на кожу. Аллергены, как правило, состоят из, по крайней мере, одной молекулы гаптена, который обычно очень мал, чтобы являться антигеном самим по себе. Гаптен проникает через эпидермис и взаимодействует под кожей с нормальным белком с образованием нового антигенного комплекса.

Повторный контакт сенсибилизированного субъекта с гаптеном запускает реакцию ГЗТ. Конъюгат гаптена и белка-носителя в сочетании с антиген-презентирующими клетками активирует эффекторные механизмы, которые запускают секрецию цитокинов (включая 1Ь-2, 1Ь-3, ΙΕΝ-γ и СМ-СЗЕ). Каскад секретируемых цитокинов стимулирует пролиферацию СЭ4' Тклеток, изменение профилей экспрессии различных молекул адгезии клеточной поверхности и миграцию Т-клеток и макрофагов в очаг воспаления в коже. Активация цитокинового каскада и, как следствие, вазодилятация, клеточная инфильтрация и отек дермы и эпидермиса приводят к образованию припухлости и воспалению ткани-мишени, благодаря которым происходит измеримое утолщение кожи в процессе развития реакций ГЗТ.

Степень, до которой конкретный гаптен способен сенсибилизировать индивидуума, зависит от множества факторов. Данные факторы включают параметры прохождения гаптена через кожу и его взаимодействия с белкомносителем хозяина с образованием конъюгата. Один гаптен, который сенсибилизирует почти всех индивидуумов, представляет собой 2,4динитрофторбензол (ДНФБ).

Кожная реакция на гаптен, такой как ДНФБ, по типу КГЧ представляет собой классическую животную модель клеточно-опосредованного иммунитета. Локализация данной реакции КГЧ на ухе сенсибилизированной мыши позволяет просто, точно и воспроизводимо количественно оценивать данный клеточноопосредованный иммунный ответ ίη νινο путем измерения толщины уха. Данные об особенностях реакции КГЧ у мышей и гистопатологии ДНФБ-индуцированной воспалительной реакции были опубликованы (С11Ыю1т с1 а1., Еиг. I. 1ттипо1., 23, стр. 682-688 (1993)).

Способность ДНФБ вызывать реакцию контактной гиперчувствительности у большинства индивидуумов может быть применена для определения агентов, которые снижают или устраняют воспалительные реакции, связанные с опосредованными Тй1-клетками реакциями ГЗТ. Растворимый мышиный гибридный белок ΕΤ-β-Β-Ес эффективно ингибирует ДНФБиндуцированную реакцию контактной гиперчувствительности у мышей (пример 8). Первоначально мышей сенсибилизировали путем нанесения ДНФБ на нижнюю часть каждой задней лапы в течение двух дней подряд. Через пять дней после первичной сенсибилизации на поверхность левого уха наносили субирритантную дозу ДНФБ в растворе-носителе. Раствор носитель в отдельности наносили на правое ухо в качестве контроля.

Затем возрастающие концентрации блокатора ЬТ-β-Κ ιηΓΤ-β-Κ-Ес (пример 2) внутривенно вводили мышам (пример 8). Инъекции фосфатно-солевого буфера в отдельности или гибридного белка 1дС человека (ЬЕА3-Ес) служили в качестве отрицательных контролей, а инъекция тАЬ, специфичных к УЬА4, (шАЬ РЗ/2), которые ингибируют КГЧ, служила в качестве положительного контроля. Через двадцать четыре часа после иммунной стимуляции измеряли толщину каждого уха (ДНФБ-стимулированного и нестимулированного). Об ингибировании реакции отека уха блокатором ЬТ-β-Κ. судили по сравнению обрабатываемых групп с группой отрицательного контроля.

На фиг. 5 показано, что ιηΓΤ-β-Κ-Ес вызывает значительное уменьшение реакции отека уха у мышей, обработанных ДНФБ, по сравнению с ДНФБ-обработанными контрольными животными, не получившими инъекции ингибитора, (РВЗ и ЬЕА3-Ес). Растворимый ЬТ-β-Κ способен ингибировать данную реакцию КГЧ так же эффективно, как и ингибирующее тАЬ, специфичное к УЬА4, (тАЬ РЗ/2), которое действует путем ингибирования миграции Т-клеток в место действия стимула (С11Ыю1т с1 а1., Еиг. I. 1ттипо1., 23, стр. 682-688 (1993)).

Эти данные показывают, что растворимый гибридный белок ЬТ-β-Κ, который действует как блокатор ЬТ-β-Κ ίη νίΐτο, также способен эффективно ингибировать опосредованную Т111клетками иммунную реакцию, будучи введен в организм животного. Блокаторы ЬТ-β-Κ по данному изобретению, идентифицированные ίη νίΐτο, могут быть протестированы с помощью данного анализа отека уха или других анализов на ГЗТ, как описанные выше, для выбора дополнительных блокаторов ЬТ-β-Κ, которые были бы применимы для уменьшения тяжести связанных с Тй1-клетками иммунных реакций ίη νινο.

Блокаторы ЬТ-β-Κ не ингибируют опосредованный ТЬ2-клетками (гуморальный) иммунный ответ.

Как показано выше, блокаторы ЬТ-β-Κ по данному изобретению способны ингибировать опосредованный Тй1-клетками эффекторный механизм, такой как контактная гиперчувствительность замедленного типа (фиг. 5). Данная опосредованная Тй1-клетками реакция ингибируетея без оказания значительного влияния на зависимые от ТЬ2-клеток реакции. Дифференциальный эффект блокаторов ЬТ-β-Κ на опосредованные Тй1-клетками иммунные реакции был продемонстрирован с помощью наблюдения за зависимыми от ТЬ2-клеток реакциями такими как первичный гуморальный ответ и переключение изотипов - в присутствии блокатора ЬТ-β-Κ.

Мышам пять раз в течение десятидневного промежутка времени вводили либо растворимый гибридный белок ЬТ-β-Κ (тЬТ-β-Κ-Ρο; Пример 2). либо контрольный гибридный белок 1дС человека (ЬРА3-Рс). либо оставляли необработанными. После второго введения всем мышам вводили в основание хвоста 100 мкл полного адъюванта Фройнда, содержащего 100 мкг овальбумина. Через 11 дней анализировали первичные сывороточные титры антител, специфичных к овальбумину, с помощью ЕЫ8А. специфичного к изотипам 1дО1. 1дС2а и 1дМ.

На фиг. 6 показан эффект блокатора мышиного ЬТ-β-Κ тЬТ^-ГОРс на продукцию сывороточных антител к овальбумину у мышей, иммунизированных овальбумином (пример 9). Введение блокатора ЬТ-β-Κ не влияет значительно на первичные титры антител после иммунизации овальбумином. В качестве сравнения, вмешательство в процесс СЬ40-лигандиндуцированной передачи сигнала через рецептор СЬ40 полностью ингибирует антигенспецифичный 1дС ответ у мышей (Иепйшу е! а1.. I. Ехр. Мей.. 180. стр. 1889-1900 (1994)). СЬ40 представляет собой еще одну пару лиганд/рецептор из семейства ТИР.

Весь процесс продукции и созревания иммуноглобулинов, несомненно, является зависимым от Тй2-клеток. Однако, также очевидно, что продуцируемый ТЫ цитокин ΙΡΝ-γ принимает участие, но не является абсолютно необходимым для переключения на подкласс 1дО2а (Ниапд е! а1.. 8с1епсе. 259. стр. 1742-45 (1993)). Блокатор ЬТ-β-Κ ηΡΎ-β-Κ^ не ингибировал переключение на 1дО2а в данных экспериментах. Возможно, что блокаторы ЬТ-β-Κ по данному изобретению не ингибируют данное гуморальное направление опосредованной Тй1клетками реакции. В дополнение к этому, параметры пролиферативных реакций лимфоцитов из мышей, обработанных тЬТ^-К-Рс. не снижались (пример 10; фиг. 7).

Результаты данных экспериментов указывают на то, что лечение, основанное на введении блокаторов ЬТ-β-Κ по данному изобретению, не окажет неблагоприятного влияния на функции Тй2-зависимой продукции антител при развитии иммунного ответа. Нормальный профиль гуморального ответа, приведенный на фиг. 6, также указывает, что интенсивная обработка растворимым тЬТ^-К-Рс была нетоксичной для мышей, что далее указывает на применимую в терапии природу композиций и способов, изложенных далее в данном изобретении.

Заболевания, опосредованные Т-хелперными клетками

Оказывается, что во многие органоспецифичные аутоиммунные состояния вовлечен патологический ТЫ-ответ. По этим данным был составлен обзор (Моб11п апб МПтап. Сиггеп!. Ορίηίοη ίη 1ттипо1.. 5.. стр. 511-17 (1993);

Ротадпаш е! а1.. Апп. Вех. 1ттипо1.. 12. стр. 227-57 (1994)). Данные органо-специфичные аутоиммунные состояния включают в себя: рассеянный склероз, инсулин-зависимый сахарный диабет, симпатическая офтальмия, увеит и псориаз.

Инсулин-зависимый сахарный диабет представляет собой аутоиммунное заболевание, при котором инсулин-продуцирующие бетаклетки поджелудочной железы разрушены лейкоцитами, инфильтрующими островки Лангерганса. Диабет может быть с легкостью индуцирован у новорожденных не тучных диабетических (пеопа!а1 попойеке б1айейс) (ΝΟΌ) мышей путем переноса активированных преддиабетических спленоцитов. Недавно ТЫ- и Тй2подобные клетки, по другим признакам генетически идентичные, переносили новорожденным мышам ΝΟΌ. Быстрое развитие диабета индуцировали только ТЫ-клетки - причем почти у всех реципиентов (КаЬ е! а1.. 8с1епсе. 2б8. стр. 1185-88 (1995)). Данный факт указывает на то, что блокаторы ЬТ-β-Κ по данному изобретению - которые способны ингибировать эффекты опосредованной ТЫ-клетками имунной реакции ίη νίνο - будут применимы для лечения или предотвращения инсулин-зависимого сахарного диабета.

Некоторые системные аутоимунные заболевания, включая различные поражения кожи ревматического происхождения, являются ассоциированными с ТЫ-клетками. Оказывается, что в развитие как ревматоидного артрита, так и сухого кератоконъ-юнктивита, вовлечены Тй0и ТЫ-клетки. В противоположность этому, системная красная волчанка (СКВ) протекает по типу аберрантной реакции с преобладанием роли Т110/Т112.

Некоторые хронические воспалительные заболевания также протекают по типу аберрантной ТЫ-опосредованной реакции, включая синдром воспаленной (раздраженной) толстой кишки, саркоидоз легкого и отторжение аллотрансплантата. Синдром воспаленной (раздраженной) толстой кишки (СВТК) у людей включает в себя, по крайней мере, две категории: язвенный колит и болезнь Крона. Считается, что оба заболевания являются результатом иммунопатологических нарушений аутоиммунного типа. В некоторых моделях СВТК на мышах очевидно, что некоторые агенты, которые ингибируют ТЫ-опосредованные реакции, способны ингибировать развитие или течение заболевания (Р. Ро\хпе е! а1.. 1ттипйу 1:553 1994). Возможно, что ингибирование ТЫ-зависимого компонента иммунного ответа возымеют благоприятные эффекты при СВТК у человека. Многие модели СВТК были описаны и включены в обзоры (С. Е1коп е! а1.. Оа§!гоеп!его1оду 109:1344 1995). Существует, по крайней мере, три группы моделей: индуцированные химическим агентом, индуцированные полимерным/микробным аген том и модели иммунологического типа с использованием мутантных мышей.

В одной часто применяемой индуцированной полимерным/микробным агентом модели раствор декстрансульфата вводят мышам в питьевую воду, и после приема внутрь эпителиальная выстилка кишечника раздражается, что ведет к массивному иммунному ответу на повреждение. У животных развивается колит, который проявляется в виде диарреи, стула с кровью, потери массы тела и уменьшения длины кишечника благодаря утолщению стенки кишечника. В данной модели развиваются признаки язвенного колита: левосторонний колит и дисплазия эпителия, которая может привести к образованию злокачественной опухоли.

Вторая модель включает в себя трансплантацию отобранной группы СЭ4 Т-клеток мышам 8С1б, т.е. мышам, у которых отсутствуют Ти В-клетки (Ρ. Ро\тпе е! а1., ^1^^60^1 Iттиηο1ο§γ 5:1461-1471 1993; Мотккеу е! а1., 1. Ехр. Меб. 178:237 1993). Так как отобранные клетки, называемые СО45КВ¹- клетки, распространяются и заселяют лимфоидные органы мышей 8С1б, нормальные механизмы предотвращения возникновения аутореактивных Т-клеток не способны функционировать нормально, и аутореактивные клетки развиваются. У крыс наблюдается появление клеток, реактивных ко многим органам, тогда как у мышей реактивность наблюдается преимущественно к кишечнику. В данной модели эффективными будут являться либо агенты, которые изменяют характер распространения и развития аутореактивных клеток, либо агенты, которые ингибируют способность клеток атаковать клетки кишечника. Более того, поскольку данная модель, по крайней мере, частично имитирует патологическое развитие аутореактивных иммуно-компетентных клеток, обработка, с помощью которой ингибируется данная модель, фактически может иметь модифицирующий течение заболевания эффект у человека. В данной модели развитие заболевания может быть ингибировано с помощью антител к Т№ (Ρ. Ρο\ν№ е! а1., Iттишίу 1, 552 1994), и было обнаружено, что данные антитела эффективны в лечении заболеваний человека (Н.М. та η ОиНетем е! а1., 6а8ίгоеη!е^ο1οду 109:109 1995). Таким образом, с помощью данной модели можно предсказать, какие агенты могут найти терапевтическое применение при СВТК. Более того, поскольку модель СО45КВ является примером развития ТЫ-опосредованного заболевания, и фактически у крыс в данной модели развиваются заболевания многих органов, эффективность ЬТ-Р-РЯд в данной системе указывает на то, что ЬТ-Р-Кбд или другие средства, ингибирующие взаимодействие ЬТ-β-Κ со своим лигандом, могут оказать благоприятный эффект в лечении широкого круга родственных иммунных заболеваний.

Вообще, точный размер вклада аутоантител по сравнению со специфичными Т-клетками при данных аутоиммунных заболеваниях не был описан. Клеточные реакции могут вносить основной вклад в патогенез тех системных аутоиммунных заболеваний, которые в настоящее время считаются вызываемыми преимущественно антителами, например, различные поражения кожи ревматического происхождения.

Нормальный иммунный ответ на некоторые патогенные инфекционные агенты также включает в себя ТЫ-опосредованный ответ, который может стать избыточным и начать представлять медицинскую проблему сам по себе. Примеры гранулематозных реакций (класса реакции ГЗТ, описанного выше), которые ведут к развитию тяжелых проблем со здоровьем, включают в себя лепру, образование гранулем в легких больных туберкулезом, саркоидоз и шистосомоз (Κοί!! е! а1., Iттиηο1οду, стр. 22.56 (Мο8Ьу-Υеа^ Βοο1< Еигоре Ь!б., 3б еб. 1993)). Видимо, течение псориаза также опосредовано ТЫ-клетками.

Цитолитические Т-клетки, т.е. СТЬ (СЭ8положительные Т-клетки) также могут быть подразделены на ТЫ- и ТБ2-подобные популяции. Таким образом, возможно, что многое из того, что известно о группах ТБ также применимо и к СЬ8'- клеткам, которые преимущественно вовлечены в антивирусный ответ и реакцию отторжения трансплантированной ткани. Способы лечения с применением блокаторов

ЬТ-β-Κ

Композиции по данному изобретению будут вводиться в эффективной дозе для направленного лечения конкретного клинического состояния. Определение предпочтительного фармацевтического состава и терапевтически эффективной схемы приема лекарственного средства для данного применения проводят по методике, известной в данной области, принимая во внимание, например, состояние и массу тела пациента, объем желаемого лечения и переносимость пациентом такого лечения. Ожидается, что дозы растворимого ЬТ-β-Κ приблизительно в 1 мг/кг будут являться подходящими начальными точками для оптимизации терапевтических доз.

Определение терапевтически эффективной дозы также может быть проведено путем постановки экспериментов ίη νίίτο, с помощью которых измеряют концентрацию блокатора ЬТ-β-Κ, необходимую для того, чтобы покрыть клеткимишени (ЬТ-β-Κ- или ЬТ-лиганд-положительных клеток в зависимости от блокатора) на срок от 1 до 14 суток. Анализы лиганд-рецепторного связывания, описанные здесь, могут быть применены для контроля за реакцией покрытия клеток. ЬТ-β-Κ- или ЬТ-лиганд-положительные клетки могут быть отобраны из популяций активированных лимфоцитов с помощью РАС8.

На основании результатов данных анализов связывания ίη νίίτο можно выбрать интервал подходящих концентраций блокатора ЬТ-β-Κ для испытания на животных в соответствии с анализами, описанными здесь.

Введение растворимых молекул ЬТ-β-Κ ЛЬ к ЬТ-лиганду и к ЬТ-β-Κ по данному изобретению, одних или в сочетании, включая выделенные и очищенные формы антител или комплексов, их солей и их фармацевтически пригодных производных, может быть завершено с помощью любого общепринятого способа введения агентов, которые проявляют иммуносупрессивную активность.

Фармацевтические композиции, применяемые в данных способах лечения, также могут находиться во множестве форм. Они включают в себя, например, твердые, полутвердые и жидкие дозированные формы, такие как таблетки, пилюли, порошки, жидкие растворы или суспензии, суппозитории и растворы для инъекций и инфузий. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Способы введения могут включать пероральное, парентеральное, подкожное, внутривенное, внутриочаговое и местное введение.

Растворимые молекулы ЬТ-β-Κ ЛЬ к ЬТлиганду и к ЬТ-β-Κ по данному изобретению могут быть помещены, например, в стерильные изотонические составы, содержащие или не содержащие кофакторы, которые стимулируют поглощение или устойчивость. Состав является, предпочтительно, жидким или может представлять собой лиофилизированный порошок. Например, растворимые молекулы ЬТ-β-Κ ЛЬ к ЬТ-лиганду и к ЬТ-β-Κ по данному изобретению могут быть разбавлены буферным составом, содержащим 5,0 мг/мл моногидрата лимонной кислоты, 2,7 мг/мл трехзамещенного цитрата натрия, 41 мг/мл маннитола, 1 мг/мл глицина и 1 мг/мл полисорбата 20. Данный раствор может быть лиофилизирован, положен на хранение в замороженном состоянии, а объем может быть доведен до введения стерильным \Уа1ег-Бог1п_)ес1юп (И8Р).

Также композиции будут, предпочтительно, содержать традиционные фармацевтически пригодные носители, хорошо известные в данной области (смотри, например, КетшЦопР Рйагтасеи11са1 8с1епсек, 1б‘^ь Εάίίίοη, 1980, Мас РиЬйкЫпд Сотрапу). Такие фармацевтически пригодные носители могут включать другие лекарственные средства, носители, генетические носители (депейс саглегк), адъюванты, разбавители и т. д., такие как человеческий сывороточный альбумин или препараты плазмы. Композиции, предпочтительно, находятся в форме разовых доз и обычно будут вводиться один или более раз в сутки.

Фармацевтические композиции по данному изобретению могут также быть введены с применением микросфер, липосом, других систем доставки на основе микрочастиц или составов продолжительного высвобождения непосредственно в пораженные ткани, в их окружение или иным образом в контакт с пораженными тканями или с кровотоком. Показательные примеры носителей продолжительного высвобождения включают полупроницаемые полимерные матрицы в форме заостренных предметов, таких как суппозитории или микрокапсулы. Имплантируемые или микрокапсулярные матрицы продолжительного высвобождения включают полилактиды (патент СШЛ № 3773319; ЕР 58481), сополимеры Ь-глютаминовой кислоты и этил-Ь-глютамата (81бтап е1 а1., Вюро1утегк, 22, стр. 547-5б (1985)); поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или этиленвинилацетат (Ьапдег е1 а1., 1. Вютеб. Ма1ег. Кек., 15, стр. 167-277 (1981); Ьапдег, Сйет. Тесй., 12, стр. 98-105 (1982)).

Липосомы, содержащие растворимые молекулы ЬТ-β-Κ АЬ к ЬТ-лиганду и к ЬТ-β-Κ по данному изобретению, одни или в сочетании, могут быть получены в соответствии с хорошо известными способами (смотри, например, ΌΕ 3218121; Ерйеш е1 а1., Ргос. Паб. Асаб. 8ст и.8.А., 82, стр. 3688-92 (1985); Нмапд е1 а1., Ргос. №11. Асаб. 8ст и.8.А. 77, стр. 4030-34 (1980); патенты СШЛ № 4485045 и 4544545). Обычно липосомы относятся к типу небольших (приблизительно 200-800 ангстрем) однослойных липосом, содержание холестерина составляет более 30 мол.% от содержания липидов. Пропорцию содержания холестерина выбирают так, чтобы контролировать оптимальную скорость высвобождения растворимых молекул ЬТβ-Κ АЬ к ЬТ-лиганду и к ЬТ-β-Κ.

Растворимые молекулы ЬТ-β-Κ АЬ к ЬТлиганду и к ЬТ-β-Κ по данному изобретению также могут быть присоединены к липосомам, содержащим другие блокаторы ЬТ-β-Κ, иммуносупрессивные средства или цитокины для модулирования ЬТ-β-Κ-ингибирующей активности. Присоединение к липосомам молекул ЬТ-β-Κ, ЛЬ к ЬТ-лиганду и к ЬТ-β-Κ может быть проведено с помощью любого известного поперечно-сшивающего агента, такого как гетеробифункциональные агенты, которые широко применяли для присоединения токсинов или химиотерапевтических средств к антителам для направленной доставки. Конъюгация с липосомами также может быть проведена с помощью углевод-направленного поперечно-сшивающего реагента гидразида 4-(4-малеимидофенил)масляной кислоты (ГМФМ) (Ьихдипек е1 а1., 1. Се11. Вюсйет. АЬк1. 8ирр1. 16Е 77 (1992)).

Преимущества терапевтических композиций, содержащих блокаторы ЬТ-β-Κ

Блокаторы ЬТ-β-Κ по данному изобретению способны избирательно ингибировать за висимые от Тй1 - и Тй2-клеток иммунные эффекторные механизмы. Блокаторы ЬТ-β-Κ будут применимы в лечении состояний, которые обостряются благодаря активностям цитокинов, продуцируемых Тй1 (например, [И-2 и ΣΕΝ-γ). Поскольку цитокины, продуцируемые Тй1, способны ингибировать реакции, зависимые от Тй2-клеток, блокаторы ЬТ-β-Κ могут также косвенно стимулировать определенные реакции, зависимые от Тй2-клеток, которые в норме ингибируются Тй1-индуцированными цитокиновыми каскадами.

Способность избирательно подавлять клеточные реакции, опосредованные Тй1, (или косвенно стимулировать таковые, опосредованные Тй2), будет применима для лечения аномалий при разнообразных клеточно-опосредованных иммунных реакциях, включая различные аутоиммунные и хронические воспалительные состояния, толерантность к антигенам и клеточную реакцию отторжения трансплантатов тканей и органов.

Как обсуждалось выше, в лечении иммунных состояний с преобладающей ролью Тй1клеток обычно применяют иммуномодуляторы и иммуносупрессоры, которые обладают плейотропными эффектами на широкий круг типов клеток и иммунных реакций. Обычно требуется применение данных неспецифических иммуносупрессоров в высоких и зачастую цитотоксических дозах, что вызывает неблагоприятные побочные эффекты.

Наличие способности изменять характер иммунного ответа подтверждено недавними исследованиями сахарного диабета у мышей, что обсуждалось выше (КаЬ е! а1., 8с1епсе, 2б8, стр. 1185-88 (1995)), и модели аллогенной трансплантации (8ауедй е! а1., 1. Ехр. Мей., 181, стр. 18б9-74 (1995)). В последнем из них было показано, что гибридный белок, который ингибирует костимуляторный путь СЭ28-В7 Тклеток, вызывает толерантность к трансплантату почки. Толерантность коррелировала со снижением концентрации цитокинов, продуцируемых Тй1, и повышением концентрации цитокинов, продуцируемых Тй2, ίπ у1уо. Эти данные указывают на то, что блокаторы ЬТ-β-Κ по данному изобретению будут применимы для подавления клеточной реакции отторжения трансплантатов тканей и органов путем подавления секреции цитокинов Тй1-клетками.

Блокаторы ЬТ-β-Κ из композиций и способов по данному изобретению могут быть модифицированы с получением желаемого уровня передачи сигнала через ЬТ-β-Κ в зависимости от состояния, подвергающегося лечению нарушения или заболевания. Представляется, что абсолютный уровень передачи сигнала через ЬТ-β-Κ может быть точно настроен путем манипулирования концентрацией и значениями сродства блокаторов ЬТ-β-Κ к соответствующим им молекулярным мишеням.

Например, в одном осуществлении данного изобретения субъекту вводят композиции, содержащие растворимые молекулы ЬТ-β-Κ. Растворимый рецептор к ЬТ-β способен эффективно конкурировать с рецепторами к ЬТ-β клеточной поверхности за связывание поверхностных ЬТ-лигандов. Способность конкурировать за связывание поверхностных ЬТ-лигандов зависит от относительных концентраций растворимых молекул ЬТ-β-Κ и молекул ЬТ-β-Κ клеточной поверхности и от их относительных аффинностей к связыванию лиганда.

Растворимые молекулы ЬТ-β-Κ, несущие мутации, которые повышают или снижают сродство связывания данного мутантного растворимого ЬТ-β-Κ с поверхностным лигандом, могут быть получены с применением стандартных методик рекомбинантной ДНК, хорошо известных специалистам в данной области. Большие количества молекул с сайт-специфичными иди случайными мутациями могут быть протестированы на предмет их способности действовать как блокаторы ЬТ-β-Κ с применением устоявшихся методик постановки эксперимента и анализов, описанных здесь.

Сходным образом, в другом осуществлении данного изобретения антитела либо к рецептору к ЬТ-β, либо к одной или более субъединицам ЬТ-лиганда функционируют как блокаторы ЬТ-β-Κ. Способность данных антител ингибировать передачу сигнала через ЬТ-β-Κ может быть модифицирована с помощью мутации, химической модификации или других методов, с помощью которых можно изменять эффективную концентрацию или активность антител, введенных субъекту.

Способность снижать передачу сигнала через ЬТ-β-Κ без ее полного ингибирования может оказаться важной для установления или поддержания сниженных уровней передачи сигнала через ЬТ-β-Κ, которые поддерживают нормальное функционирование иммунной системы, при ингибировании реакций, опосредованных Тй1-клетками, когда те являются избыточными или аномальными.

Разрушения гена ЬТ-α у мышей приводит к отклонению от нормы в развитии периферических лимфоидных органов (Эе Тодш е! а1., 8аепсе, 2б4, стр. 703-7 (1994)). У таких мышей отсутствовали лимфатические узлы, а в их селезенке отсутствовало обычно четкое разделение между Т- и В-зонами в фолликулах. Авторы считают, что данный фенотип связан с утратой индуцированной поверхностным ЬТ-лигандом передачи сигнала через ЬТ-β-Κ, поскольку при модулировании активности ТОТ-И сходные фенотипы не наблюдались. Таким образом, способность избирательно или частично ингибировать может быть применена в ле чении аномалий развития лимфоидных органов, связанных с аномальной или избыточной экспрессией передачи сигнала через υΓ-β-Κ-путь.

Некоторые Тй1 -ассоциированные реакции являются принципиально важными компонентами ряда клеточно-опосредованных иммунных ответов (Вошадпаш е! а1., Апп. Κβν. Iттиηο1., 12, стр. 227-57 (1994)), и полное ингибирование Тй1 -клеточной активности при определенных обстоятельствах может быть нежелательным. Например, если может развиться значительный Тй1-ответ, мышь может эффективно противостоять паразитарной инфекции. Инфекционные агенты, такие как Ь|81епа и Тохор1а8та, также вызывают сильные ответы ТЫ-типа. У человека в ответе на инфекцию МусоЬас!егшт !иЬегси1о818 преобладающую роль играют Т11. Патогенность возбудителя лейшманиоза коррелирует с реакциями, сходными с Т11-ответами, охарактеризованными у мышей (Вееб апб 8сой, Сиггеп! Орююп ш Iттипо1., 5, стр. 524-31 (1993)).

Возможность оказывать влияние на уровень ингибирования Т11 путем ингибирования передачи сигнала через ЬТ-β-Κ может оказаться важной для получения предельно полезных результатов, которые только могут быть получены путем обработки блокаторами ЬТ-β-Κ по данному изобретению.

Далее следуют примеры, которые иллюстрируют растворимые молекулы ЬТ-β-Κ АЬ к ЬТлиганду и к ЬТ-β-Κ по данному изобретению и способы, примененные для их охарактеризования. Данные примеры не следует истолковывать как ограничивающие: примеры включены в целях иллюстрации, а настоящее изобретение ограничено лишь формулой изобретения.

Пример 1. Получение растворимых человеческих рецепторов к ЬТ-β в виде гибридных белков с Гс-доменом иммуноглобулина.

Последовательность из клона человеческой кДНК, выделенную из библиотеки человеческих транскрибируемых последовательностей 1 2р, взятой из гибридной соматической клетки (Ваеп8 е! а1., Сепотк8, 16, стр. 214-18 (1993)), ввели в СепВапк, а затем идентифицировали как последовательность, которая кодирует человеческий ЬТ-β-Κ. Последовательность данного полного клона кДНК человеческого ЬТ-β-Κ доступна с 1992 г. как ввод в СепВапк Ь04270.

Внеклеточный домен ЬТ-β-Κ до трансмембранного фрагмента (фиг. 1) амплифицировали с помощью РСВ с клона кДНК с применением праймеров, которые включали в себя сайты рестрикции Νθ!Ι и 8аИ на 5'- и 3'-концах соответственно (Вго^шпд е! а1., 1. Iттиπо1., 154, стр. 33-46 (1995)). Амплифицированный продукт вырезали с помощью №б и 8аП очищали и лигировали к ^^-линеаризованному вектору ρΜΌΚ901 вместе с ЗаИ-Шб-фрагментом. кодирующим Рс-домен человеческого ^01. Полученный вектор содержал ген дигидрофолатре дуктазы и ген гибридного белка ^Т-β-Κ-Γс, транскрипция которых запускалась отдельными промоторами.

Вектор электропорировали в клети СНО бЫг^- и выделяли метотрексат-резистентные клоны согласно стандартным методикам. ЬТ-|ЬВ-Гс секретировался в среду, и для выбора клеточных линий, продуцирующих наивысший уровень рецепторного гибридного белка, применяли ЕЫ8А. Клеточные линии с высоким уровнем продукции культивировали в больших количествах и кондиционную среду отбирали. Чистый гибридный белок рецептора к ЬТ-β выделяли по методу высокоскоростной аффинной хроматографии на Рго!ет А Зерйаго8е (Рйагташа).

Пример 2. Получение растворимых мышиных рецепторов к ЬТ-β в виде гибридных белков с Гс-доменом иммуноглобулина.

Полный клон кДНК тЬТ-β-Κ получали путем лигирования 5'-№и/АраЬЬ и 3'-АраЫ/ Коб-фрагментов из двух частичных изолятов кДНК в сайт Νθ!Ι ρС^NА3 ЦпУйгодеп, Зап Όίедо, СА). Последовательность данного клона кДНК доступна как ввод в СепВапк И29173. При сравнении с другой последовательностью, кодирующей тЬТ-β-Κ, находящейся в СепВапк под номером Ь38423, не было отмечено различий в кодирующих последовательностях.

Растворимый гибридный белок тЬТ-β-Κ (ЫдС1) получали путем амплификации с помощью РСК используя полный клон кДНК тЬТβ-Κ в качестве матрицы и праймеры 5'ААСТССАСССССССССАТСССССТСССС-3' и 5'-САСТТТСТССАССАТТССТССТСССТСТССССС-3'. Амплифицированный продукт очищали и вырезали с помощью Νθ!Ι 8аИ и лигировали с ЗабЖоП Рс-доменом человеческого ЦС1 в Νθ!Ι-линеаризованный и обработанный фосфатазой вектор 8АВ132 с получением !ЬВ122. В целях обеспечения устойчивой экспрессии в сайт №б рМБВ901 переносили кассету ΝθΙΙ, содержащую т^Т-β-Κ-Рс-фрагмент, с получением Р8Н001 и данным вектором трансфицировали клетки СНО, как было описано (Вго\\тнпд е! а1., 1. Iттиπо1., 154, стр. 33-46 (1995)). Клоны клеток, секретирующих тЬТ-βΚ-Гс, идентифицировали с помощью ЕЫ8А. Очищенный рецепторный гибридный белок выделяли из супернатанта клеток СНО по методу высокоскоростной аффинной хроматографии на Рго!ет А 8ер11аго8е (Рйагтааа).

Пример 3. Применение растворимого человеческого ЬТ-|ЬВ-Гс для ингибирования взаимодействия рецептора к ЬТ-β и его лиганда.

Растворимый 1ΕΓ-β-Κ-Γο тестировали на предмет его способности ингибировать связывание ЬТ-лиганда с рецептором к ЬТ-β с помощью анализа цитотоксичности, направленной на опухолевые клетки, описанного выше. В данном анализе растворимую форму ЬТ-лиганда (ЬТ α1/β2), которая стимулирует передачу сигнала через ЬТ-β-Κ, применяют для цитолиза человеческих опухолевых клеток. Ингибиторы передачи сигнала через ЬТ-β-Κ способны снижать ЬТβ-Κ-индуцированную цитотоксичность, направленную на опухолевые клетки.

Растворимые ^Т-α1/β2-лиганды состоят из усеченных или модифицированных субъединиц ЬТ-β без функционального трансмембранного домена. Растворимые ^Т-α1/β2-лиганды связываются с ЬТ-β-Κ и стимулируют передачу через него сигнала так же, как и поверхностные формы ЬТ-лиганда (Вго^шпд е! а1., 1. 1ттипо1., 154, стр. 33-46 (1995)).

Серийные разведения 1ΕΓ-α1/β2, 1ТИР или НЬТ-α готовили в 0,05 мл в 96-луночных планшетах и 5000 трипсинизированных клеток НТ29 (АТСС) вносили в 0,05 мл среды, содержащей 80 Ед/мл (в антивирусных единицах) 1ш1ИР-у. Через 4 дня содержание восстановленного митохондриями красителя МТТ измеряли следующим образом: добавляли 10 мкл МТТ и через 3 ч восстановленный краситель растворяли 0,09 мл изопропанола с 10 мМ НС1 и ОП измеряли на 550 нм. До внесения клеток добавляли растворимые формы рецептора или чистый человеческий 1дС в 10 мкл с получением конечной концентрации 5 мкг/мл.

В табл. 1 сравнивается способность ЬЬТ-βΚ-Рс и химерных молекул р55-ТИР-Р-Ес (с человеческим 1дС в качестве контроля) блокировать ингибирующие эффекты различных растворимых ТИР- и ЬТ-лигандов на рост опухолевых клеток НТ29.

Таблица 1. Способность белков ЬТ-β-Κ и р55-ТИР-Р, гибридизованных с иммуноглобулином, блокировать ингибирующие эффекты различных ТИР- и ЬТ-лигандов на рост НТ29.

Концентрация цитотоксического агента (нг/мл), приводящая к 50%-ному ингибированию роста.

В присутствии ^а

Цитотоксический агент	Контрольный Мдо		υΓ-β-Κ-Рс
ТИР	0,08	>10^Ь	0,08
ЬТ-α	3	>1000	3
υΓ-α1/β2	5	5	>200

^а Каждый цитотоксический агент предварительно смешивали с белками, гибридизованными с 1д, за 10 мин до добавления к клеткам. Конечная концентрация гибридного белка составила 5 мкг/мл.

^Ь Более высокие концентрации не тестировали.

Данные в табл. 1 указывают на то, что растворимый гибридный белок человеческого ЬТβ-Κ (1^4-(1-^-^0) способен эффективно ингибировать взаимодействие между ЬТ-лигандом (ЬТα1/β2) и рецепторами к ЬТ-β клеточной поверхности и, таким образом, является блокатором ЬТ-β-Κ по данному изобретению.

Как и ожидалось, растворимый гибридный белок ТИР-Κ (р55-ТИР-Р-Ес) полностью блокировал ТИР-индуцированное ингибирование роста путем связывания с ТИР и предотвращения его взаимодействия с поверхностными рецепторами к ТИР. Данный растворимый рецептор к ТИР не оказывает влияния на ЬТ-лигандопосредованные антипролиферативные эффекты. В противоположность этому, ^Т-β-Κ-Ес ингибировал ЬТ-лиганд-индуцированные цитотоксические эффекты, но не таковые, индуцированные ТИР или ЬТ-α. Таким образом, гибридные белки человеческого ЬТ-β-Κ не вмешиваются в активацию ТИР-Κ ТИР и лигандами ЬТ-α.

Пример 4. Применение растворимого мышиного ^Т-β-Р-Рс для ингибирования взаимодействия мышиного рецептора к ЬТ-β и его лиганда.

Растворимый мышиный рецептор к ЬТ-β, сшитый с Ре-доменом человеческого 1дС 1 (т^Т-β-Κ-Ес: смотри пример 2) тестировали на предмет его способности ингибировать связывание рецептора к ЬТ-β со своим лигандом с помощью анализа цитотоксичности, направленной на мышиные клетки (фиг. 2). Анализ цитотоксичности проводили на клетках \УЕН1 164, применяя, по существу, ту же методику, которая была применена в анализе на клетках НТ29, описанном в примере 3 (смотри также ΒΐΌ\νπίπ§ апб ШЬоНш, I. 1ттипо1., 143, стр. 1859-67 (1989)).

На фиг. 2 показаны эффекты т^Т-β-Κ-Ес на лиганд-индуцированную передачу сигнала через ЬТ-β-Κ на мышиных клетках \УЕН1 164. Как показано данным анализом, клетки \УЕН1 164 гибнут при обработке растворимым ЬТα1/β2-лигандом в концентрациях в интервале от 1 до 100 нг/мл. т^Т-β-Κ-Ес ингибирует ЬТлиганд-стимулированную клеточную гибель. Добавление растворимого мышиного гибридного белка рЗЗ-ТИЕ-Р.-Ес или контрольных антител 1дС (каждого по 10 μ/мл) обладает незначительным или не обладает эффектом на ингибирование клеточной гибели.

Эти данные показывают, что гибридный белок т^Т-β-Р-Рс способен эффективно конкурировать с поверхностными молекулами ЬТ-β-Κ за связывание ЬТ-лиганда. Эти данные также показывают, что ЬТ-α/β-индуцированная цитотоксичность является ^Т-β-Κ-опосредованной и может быть ингибировала растворимым тЬТ-βΚ-Рс, который действует как блокатор ЬТ-β-Κ по настоящему изобретению.

Пример 5. Применение антител к человеческому ЬТ-β-Κ для ингибирования взаимодействия рецептора к ЬТ-β и его лиганда.

Мышиные моноклональные антитела тАЬ к человеческому рецептору к ЬТ-β получали путем неоднократной внутрибрюшинной иммунизации мышей РВЕ гибридным белком ЬЬТ-β

Κ-Ес, полученным из клеток СНО, посаженным на гранулы Рго!ет А 8ербагозе в отсутствие адъюванта. В итоге животных повторно иммунизировали растворимым б^Т-β-Κ-Ес как внутрибрюшинно, так и внутривенно, клетки селезенки гибридизовали в соответствии с классическими методиками и супернатанты гибридом исследовали с помощью ЕЫ8А (Ыпд е! а1., 1п!егкегоп апй Су!ок1пе Кез., 15, стр. 53-59 (1995)). Супернатанты гибридом исследовали далее на предмет способности ингибировать связывание активированных клеток гибридомы 11-23 - которые экспрессируют поверхностный ΒΒα1/β2 - с покрытыми ΒΓ-β-ΚΈ планшетами в анализе клеточного пэннинга. Чистые тАЬ получали путем очистки 1§С из культуральных супернатантов на Рго!ет А 8ербагозе (Рбагтааа).

Для того, чтобы определить, способны ли тАЬ к рецептору к ЬТ-β ингибировать передачу сигнала через ЬТ-β-Κ, стимулированную связыванием растворимого ЬТ, может быть поставлен анализ цитотоксичности, направленной на опухолевые клетки, с применением клеток АЮг человеческой карциномы. В анализах цитотоксичности серийные разведения ΒΒα1/β2 готовили в 0,05 мл в 96-луночных планшетах и добавляли 10 мкл 100 мкг/мл раствора, содержащего либо контрольные мышиные тАЬ 1дС 1, либо тАЬ к рецептору к ЬТ-β. Затем в каждую лунку вносили 5000 трипсинизированных клеток АЮг (АТСС) в 0,05 мл среды, содержащей 50 ЕД/мл (в антивирусных единицах) 6ΙΕΝ-γ. Через 4 дня содержание восстановленного митохондриями красителя МТТ измеряли следующим образом: добавляли 10 мкл МТТ и через 3 ч восстановленный краситель растворяли 0,09 мл изопропанола с 10 мМ НС1 и ОП измеряли на 550 нм. Интенсивность пурпурной окраски пропорциональна интенсивности клеточного роста.

На фиг. 3 показано, что анти-ЬТ-β-Κ тАЬ ΒΩΛ8 действует как блокатор ЬТ-β-Κ по данному изобретению. Клетки АЮг человеческой карциномы прекращают рост в присутствии ΙΕΝ-γ и растворимого ЬТ^^-лиганда (от приблизительно 0,05 до 50 нг/мл). Контрольные антитела 1дС1 не оказывают влияния на данное ингибирование роста. В противоположность этому, анти-ЬТ-β-Κ тАЬ ВЭА8 (10 мг/мл) восстанавливают способность клеток АЮг расти в присутствии растворимого ^Т-α1/β2-лиганда.

Пример 6. Применение антител к человеческому ЬТ-β для ингибирования лигандрецепторного взаимодействия.

тАЬ к человеческому ЬТ-β получали путем иммунизации мышей ΚΒΕ промытыми гранулами Рго!ет А 8ерба^οзе-9Е10-^^Т-β, содержащими приблизительно 1-2 мкг человеческого рекомбинантного ЬТ-β в СЕА с последующей еще одной повторной иммунизацией тем же веществом в 1ЕА. Через восемь недель после последней иммунизации мышам внутривенно вводили 30 мкг очищенного растворимого гЬТ-β (сэлюированного кислотой со смолы 9Е10) и 20 мкг того же растворимого вещества через 2 суток. Через одни сутки после второй внутривенной иммунизации клетки селезенки гибридизовали в соответствии с классическими методиками с получением тАЬ. Супернатанты гибридом исследовали непосредственно методом ЕЬ18А или ЕАС8 окрашиванием РМА - активированных 11-23 клеток. Чистые тАЬ получали путем высокоскоростной очистки 1§С из культуральных супернатантов на Рго!ет А 8ербагозе (Рбагтааа).

ЕАС8-анализ применяли для выбора антител к ЬТ-β, которые способны эффективно ингибировать связывание растворимого ЬТ-α/β лиганда с рецепторами к ЬТ-β на клеточной поверхности - имитируя таким образом взаимодействие между двумя клетками ш у1уо. В данном анализе растворимому человеческому ЬТ-βΚ-Ес (2 мкг/мл) давали связаться с поверхностным ЬТ-лигандом на активированных митогеном фитолакки клетках 11-23 (Вгохшпд е! а1., 1. 1ттипо1., 154, стр. 33-46 (1995)) в присутствии возрастающих концентраций тестируемого анти-ЬТ-β тАЬ (0,02-20 мкг/мл). Клетки промывали и связавшийся ЬТ-β-Κ-Ес определяли путем реакции с мечеными фикоэритрином ослиными антителами к человеческому 1§С. Количество связавшейся флюоресцентной метки определяли с помощью ЕАС8-анализа и значение средней интенсивности флюоресценции наносили на график.

На фиг. 4 приведены результаты ЕАС8анализа, с помощью которого определяли способность анти-ЬТ-β тАЬ В 9 ингибировать взаимодействия рецептора к ЬТ-β и его лиганда, как описано выше. В данном эксперименте показано, что анти-ЬТ-β тАЬ В9 (0,02-5 мкг/мл) способны специфично и эффективно конкурировать с растворимым гибридным белком ЬТ-βΚ (2 мкг/мл) за связывание ЬТ-лиганда клеточной поверхности и, таким образом, могут быть квалифицированы как блокаторы ЬТ-β-Κ по данному изобретению.

Пример 7. Применение антител к мышиному ЬТ-α/β для ингибирования лигандрецепторного взаимодействия.

Растворимые комплексы мышиных ЬТα/а, получали, как описано для растворимых комплексов человеческих ЬТ-α/β. Растворимую мышиную субъединицу ЬТ-а получали, основываясь на информации по последовательности, описанной ранее (Ьах!оп е! а1., I. 1ттипо1., 154, стр. 239-46 (1995)). Растворимые комплексы мышиных ΕΤ-α/а экспрессировали, применяя систему экспрессии бакуловирус/клетка насекомого, а комплексы ЬТ-о/а выделяли по методу аффинной хроматографии, применяя колонки с человеческими р55 ТОТ-Н и ЬТ-а-Κ, по существу, так же, как описано выше для экспрессии и очистки комплексов человеческих ЬТ-а/а. Армянских хомяков иммунизировали очищенными растворимыми комплексами мышиных ЬТ-а/а, по существу, так же, как описано в примере 6. Спленоциты хомяка гибридизовали с мышиной клеточной линией гибридомы РЗХ, как было описано (ЬапсНех-Мабпб е! а1., Ме111обк оГ Епгуто1о§у, 121, стр. 239-44 (1986)). Гибридомы группировали как анти-тЬТ-а или анти-ЬТ-α на основании их характеристик связывания либо с комплексом ЬТ-а/а, либо лишь с ЬТ-α соответственно. Гибридомные клетки культивировали, а антитела выделяли в чистом виде из культурального супернатанта по методу аффинной хроматографии на Рго!ет А 8ерЬагоке (Рйагтааа).

Чтобы установить, способны ли тАЬ к мышиным ЬТ-α или ЬТ-β ингибировать связывание ЬТ-лиганда с тЬТ-а-Κ, авторы применяли клетки Т1М1-4 (АТСС), мышиную Т-клеточную линию, которая экспрессирует поверхностный ЬТ-лиганд через 7 ч после активации митогеном фитолакки. Анти-тЬТ-α и анти-тЬТ-β тАЬ хомяка предварительно инкубировали с клетками в течение 30 мин при 4°С и затем дважды промывали. Промытые клетки инкубировали с 1 мкг/мл тЬТ-|)-Р-1с при 4°С. Через 30 мин клетки отмывали от несвязавшегося тЬТ-|)-Р-1с и затем инкубировали в течение 30 мин с 10 мкг/мл меченых фикоэритрином ослиных антител к человеческому 1дС для определения связавшегося тЬТ-|)-Р-1с. Количество связавшейся флюоресцентной метки определяли с помощью 1АС8-анализа и рассчитывали среднее значение интенсивности флюоресценции.

С помощью данного анализа было обнаружено, что анти-тЬТ-а тАЬ хомяка способны эффективно ингибировать связывание растворимого рецептора к ЬТ-β с ЬТ-лигандом на поверхности Т-клеток. Результаты приведены в табл. 2.

Таблица 2. Способность моноклональных антител к мышиному ЬТ-β ингибировать связывание тЬТ-β-Κ-Ιο с мышиным поверхностным ЬТ-лигандом.

Концентрация тАЬ (мкг/мл)	анти-тЬТ-а (ВВ.16)	анти-тЬТ-а (А1.В3)
М1С1^Ь	% ИНГ^с	М1С1^Ь	% ИНГ^с
0^а	6	-	6	-
0	85	0	85	0
0,01	71	18	84	2
0,03	67	23	86	2
0,1	51	44	86	0
0,3	36	62	84	2
1,0	29	71	89	0
3,0	17	86	88	0
10,0	11	94	95	0
30,0	10	95	94	0
100,0	8	98	92	0

“рецептор не добавляли;

^Ьномер канала среднего значения флюоресценции; 'процент ингибирования.

Пример 8. Блокаторы ЬТ-β-Κ ингибируют опосредованную ТЫ-клетками контактную гиперчувствительность у мышей.

Самок мышей Ва1Ь/с массой 20 г Часккоп ЬаЬога!ог1ек, Ваг НагЬог, МЕ) первично сенсибилизировали путем нанесения 25 мкл 0,5% 2,4динитрофторбензола (ДНФБ) в 4:1 ацетоне: оливковом масле по обьему на нижнюю часть каждой задней лапы. Через двадцать четыре часа после первичной сенсибилизации авторы вновь сенсибилизировали каждую мышь 25 мкл того же раствора. Сенсибилизацию проводили, удерживая неанестезированную мышь. На 5 сутки (120 ч после первичной сенсибилизации) авторы анестезировали мышей 90:10 мг/кг кетамина:ксилазина (внутрибрюшинно) и наносили субирритантную дозу 10 мкл 0,2% ДНФБ на дорзальную и вентральную поверхности левого уха. На правое ухо сходным образом наносили носитель из 4:1 ацетона:оливкового масла по обьему.

Через четыре часа после стимулирования иммунного ответа авторы вводили возрастающие концентрации тЬТ-|)-Р-1с (0,08-5,0 мг/кг; пример 2) мышам в 0,1 мл фосфатно-буферного раствора (РВ8) с помощью внутривенной инъекции. Инъекции одного фосфатно-буферного раствора или 20 мг/кг гибридного белка человеческого 1дС (Ь1А3-1с) (МШег е! а1., Ь Ехр. Меб., 178, стр 211-22 (1993)) служили в качестве отрицательных контролей. Инъекция 8 мг/кг тАЬ, специфичного к УЬА4 (тАЬ Р8/2; СЫко1т е! а1., Еиг. Ь 1ттипо1., 23, стр. 682-88 (1993)) - которое является известным ингибитором КГЧ по механизму ингибирования миграции Т-клеток в место нанесения стимула - служила в качестве положительного контроля. Группы, состоящие из четырех-восьми мышей, обрабатывали концентрацией антитела.

Через 24 ч после стимулирования мышей вновь анестезировали кетамином:ксилазином и с помощью инженерного микрометра измеряли толщину обоих ушей с точностью до 10^-4 дюйма (2,54 х 10^-4 см). У каждой мыши наблюдались различия в интенсивности реакции отека уха между толщиной контрольного и ДНФБстимулированного уха. Результаты при типичной неингибированной реакции отека уха составляли 95-110 х 10^-4 дюйма (241,3 - 279,4 х 10⁴см). Об ингибировании реакции отека уха судили по сравнению обработанных групп с соответствующей им группой отрицательного контроля. Статистическую значимость различия между обработанными группами оценивали с помощью одностороннего дисперсионного анализа с последующим расчетом достоверно значимой разности Тикеу-Кгатег (1МР, 8А8 ΙπκΙί!и!е), используя значения р < 0,05.

На фиг. 5 показано, что введение возрастающих концентраций т^Т-β-К-Бс вызывает значительное уменьшение реакции отека уха у мышей, обработанных ДНФБ, по сравнению с ДНФБ-обработанными контрольными животными, не получавшими инъекции ингибитора, (РВ8 и ЬБЛ3-Бс). Растворимый υΓ-β-К (от приблизительно 1-5 мг/кг) способен ингибироватъ данную реакцию контактной ГЗТ так же эффективно, как и ингибирующее тАЬ, специфичное к УБА4. Та часть результатов, которая наблюдается в данном анализе отека уха, возможно, объясняется неспецифической гранулоцитарной инфильтрацией.

Пример 9. Модель СВТК вызванной раствором декстрансульфата (РДС).

Мышей обрабатывали так, как определено в аннотации к фиг. БЬБА3-1д, т.е. контрольным гибридным белком 1д, или [ηΓΎ-β-Β-Ι^ с помощью внутрибрюшинной инъекции. На 0 сутки питьевую воду заменили на 5% раствор декстрансульфата и мышей оставили на такой жидкости на одну неделю. Через одну неделю, т.е. через 2 недели после начала введения РДС, мышей забивали и измеряли изменения массы тела и длины толстого кишечника (от анального отверстия до слепой кишки). На фиг. 6 и 7 показаны значения изменения массы тела и длины толстого кишечника после различных обработок. Уменьшившаяся длина толстого кишечника, равно как и потеря в весе, указывают на развитие СВТК. Было замечено, что обработка 11^4-11-^-1^ решительно предотвращают уменьшение длины толстого кишечника и потерю в весе, что указывает на ее эффективность.

Фиг. 6. Изменение массы тела, наблюдавшееся у мышей через 14 дней после начала поения РДС после различных обработок. Нос = носитель, ЬТ-β-Β. и ЬБА3 относятся к гибридным белкам 11'44-11-^-18 и БЬБА3-1д, которые вводили путем внутрибрюшинной инъекции 100 мкг за 1 неделю до введения РДС, во время введения РДС и через 1 неделю (т.е. 3 инъекции на -1, 0 и 1 неделях). В каждой группе было по 10 животных.

Фиг. 7. Длина толстого кишечника, наблюдавшаяся на 14 день после различных обработок, описанных для фиг. 6.

Пример 10. Модель СВТК у СБ44В7 8с1б.

СЭ4-положительные Т-клетки выделяют из самок мышей С. В-17, применяя методику на основе магнитных гранул, как описано ранее (Р. Ро\\'пе е! а1., 1п!етпа!юпа1 1ттипо1оду, 5:14611471 (1993)). СЭЗ-клетки. очищенные от СЭ8положительных Т-клеток, В-клеток и моноцитов, затем сортировали с помощью сортировки клеток с возбуждением флюоресценции также, по существу, в соответствии с вышеописанными методиками, на СП45КВ¹¹¹®¹¹- и С^45ΒΒ^1οпопуляции. Самкам С.В-17 кс1б мышей внутри венно вводили 5 х 10⁵ СО45КВ-клеток и наблюдали за массой тела мышей. Может быть замечено, что животные, чьи лимфоидные органы заселяли СП45КВ^1о-клетки, нормально прибавляли в весе. В противоположность этому, животные, получившие инъекцию СП45КВ^ЫдЬклеток со временем теряли в весе и через 10 недель были близки к гибели. Когда контрольные мыши теряли приблизительно 20% исходной массы тела, мышей забивали и различные органы отбирали на гистологический анализ. Обычно больные животные выглядели кахектичными, страдали диарреей и имели сильно удлиненный толстый кишечник и слепую кишку. Животные, обрабатываемые, как описано в аннотации к фиг., БЬБА8-1д, находились в сходном с необрабатываемыми животными состоянии, тогда как обрабатываемые т^Т-β-К-Iд животные не теряли в весе, имели толстый кишечник относительно нормальных размеров и не имели массивных воспалительных инфильтратов, обычно наблюдавшихся в толстом кишечнике больных животных. На фиг. 8 показана потеря в весе у животных, которым различными способами вводили СП45ВВ^Ь1дЬ, а на фиг. 9 показаны конечные значения массы тела через 8 недель после инъекции. Эффективность введения тЬТ^-КИд в двух чрезвычайно различных моделях СВТК, т. е. в моделях введения СП45ВВ^ЫдЬ и РДС, создает полную очевидность сильного влияния данной обработки на иммунную систему.

Фиг. 8. Уменьшение массы тела с течением времени после инъекции ί.Ό45ΒΒ СЭ4положительных Т-клеток у мышей кс1б. Каждая кривая представляет результаты по одному животному, а надписи на панелях относятся к тому, какие клетки вводились, т.е. СП45КВ^Ь1дЬили СП45ВВ^1ои', и к способу обработки. Животное еженедельно обрабатывали 100 мкг вводимого внутрибрюшинно белка. Обработку начинали за 2 недели до инъекции клеток и продолжали в течение всего эксперимента.

Фиг. 9. Среднее и стандартное отклонение массы тела, наблюдавшиеся после различных обработок, через 10 недель после трансплантации (5-6 животных в группе).

Пример 11. Модель гиперчувствительности замедленного типа на ЭБ.

Самок мышей Ва1Ь/с сенсибилизировали путем подкожной инъекции 2 х 10⁷ отмытых эритроцитов барана (ЭБ) в РВ8. Через 5 суток мышей стимулировали путем инъекции 1 х 10⁸ЭБ в РВ8 в подошву правой лапы (субплантарная инъекция). Толщину подошвы измеряли с помощью кронциркуля через различные промежутки времени после инъекции в подошву. На фиг. 10 показана выраженность реакции отека подошвы у мышей, обработанных путем инъекции т^Т-β-К-Iд. Обработка т^Т-β-К-Iд либо на стадии сенсибилизации, либо на стадии как сен сибилизации, так и нанесения антигенного стимула, ингибировала ЭБ-индуцированную реакцию ГЗТ.

Фиг. 10. Показано увеличение толщины подошвы, измеренной через 18 ч после инъекции стимулирующих ЭБ. Виды обработки представляли собой либо отрицательный контроль в виде инъекции РВ8, либо положительный контроль в виде инъекции антител Р8/2, что ингибирует взаимодействия УЬА4 и, таким образом, миграцию клеток, либо инъекцию тЬТф-Ибд (внутривенные инъекции по 100 мкг), вводимые либо непосредственно перед сенсибилизирующей инъекцией ЭБ, либо во время нанесения антигенного стимула, либо в оба момента.

Список последовательностей (2) Информация по ПОСЛ. ИД. Ыо 1:

(I) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 197 аминокислот (Б) Тип: аминокислотная (B) Количество цепей:

(Г) Топология: линейная (II) Тип молекулы: пептид (XI) Описание последовательности: ПОСЛ. ИД. Ыо 1:

Зег 1

С1п

Рго

С1п

А1а 5

УаХ

Рго

Туг А1а Зег СХи Азп СХп ТНг

Суз

10

15

Агд

Азр

С1п

СХи

Ьуз

С1ц

Туг

СХи

Рго

С1п

Нхз

Агд

ХХе

Суз

20

25

30

Зег

Агд

Суз

Рго

СХу

ТЪг

Туг

УаХ

Зег

А1а

Ьуз

Суз

Зег

Агд

11е

35

40

45

Агд

Азр

ТНг

УаХ

Суз

А1а

тнг

Суз

А1а

СХи

Азп

Зег

Тут

Азп

СХи

Нхз

50

55

60

Тгр

Азп

Туг

Ьеи

ТНт

Не

Суз

С1п

Ьеи

Суз

Агд

Рго

Суз

Азр

Рго

Уа1

65

70

75

80

Мес

С1у

Ьеи

СХи

С1и

1Хе

А1а

Рго

Суз

ТНг

Зег

Ьуз

Аго

Ьуз

ТЬг

С1п

95

90

95

Суз

Агд

Суз

СХп

Рго

С1у

Мес

РНе

Суз

А1а

Тгр

А1а

Ьеи

СХи

Суз

100

105

110

ТНг

Нхз

Суз

С1и

Ьеи

Зег

Азр

Суз

Рго

С1у

ТНг

С1и

АХа

С1и

115

120

125

Ьеи

Ьуз

Азр

СХи

УаХ

СХу

Ьуз

СХу

Азп

Нхз

Суз

УаХ

Рго

Суз

Ьуз

130

135

140

А1а

СХу

НХЗ

РНе

С1п

Азп

ТИг

Зег

Рго

Зег

АХа

Агд

Суз

СХп

Рго

145

150

155

-

Нхз

ТИг

Агд

Суз

С1и

Азп

С1п

СХу

Ьеи

Уа1

<31и

АХа

А1а

Рго

СХу

ТНг

165

170

175

А1а

С1п

Зег

Азр

ТНг

Суз

Ьуз

Азп

Рго

Ьеи

СХи

Рго

Ьеи

Рго

190 185 190

С1и МеС Зег С1у ТНг

Claims

1. Способ лечения синдрома воспаленной толстой кишки у млекопитающего, заключающийся в том, что указанному млекопитающему вводят фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество блокатора рецептора лимфотоксина-β (ЬТ-βВ) и фармацевтически приемлемый носитель.

2. Способ выбора блокатора ЬТ-β-Β, включающий стадии

а) культивирования опухолевых клеток в присутствии эффективного количества, по крайней мере, одного стимулятора ЬТ-β-Β и предполагаемого блокатора ЬТ-β-Β (тестируемого агента);

б) добавления витального красителя к смеси опухолевых клеток и

в) измерения оптической плотности смеси для определения степени понижения противоопухолевой активности стимулятора ЬТ-β-Β предполагаемым блокатором ЬТ-β-Β, причем указанная степень понижения, составляющая, по крайней мере, 20%, свидетельствует о том, что тестируемый агент является блокатором ЬТβ-Β.

3. Способ ингибирования передачи сигнала через ЬТ-β-Β без ингибирования передачи сигнала через ΤNΡ-Β, включающий стадию введения субъекту эффективного количества блокатора ЬТ-β-Β.