KR100557258B1 - 면역학적 질병의 치료를 위한 치료제로서 가용성림포톡신-베타 수용체 및 항-림포톡신 수용체 및 리간드항체 - Google Patents

면역학적 질병의 치료를 위한 치료제로서 가용성림포톡신-베타 수용체 및 항-림포톡신 수용체 및 리간드항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 림포톡신-β 시그널링을 차단하는 "림포톡신-β 수용체 차단제"를 포함하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 림포톡신-β 수용체 차단제는 림프구-매개된 면역 질병을 치료하는데 유용하며, 특히 Th1 세포-매개된 면역 응답을 억제하는데 유용하다. 본 발명은 림포톡신-β 수용체 차단제로 작용하는 림포톡신-β 수용체 세포외 영역의 가용성 형태에 관한 것이다. 본 발명은 또한 림포톡신-β 수용체 차단제로 작용하는 림포톡신-β 수용체 또는 이의 리간드, 표면 림포톡신에 대해 유도되는 항체의 사용에 관한 것이다. 본 발명은 LT-β 수용체 시그널링을 차단하는 가용성 수용체, 항체 및 기타 제제를 선택하는 신규의 스크리닝 방법을 제공한다.

Description

면역학적 질병의 치료를 위한 치료제로서 가용성 림포톡신-베타 수용체 및 항-림포톡신 수용체 및 리간드 항체{SOLUBLE LYMPHOTOXIN-BETA RECEPTORS AND ANTI-LYMPHOTOXIN RECEPTOR AND LIGAND ANTIBODIES, AS THERAPEUTIC FOR THE TREATMENT OF IMMUNOLOGICAL DISEASE}
도 1. 리간드 결합 영역을 암호하는 인체 LT-β 수용체의 세포외 부분의 서열.
도 2. 인체 IgG1 Fc 영역(mLT-β-R-Fc)에 커플링된 가용성 쥐 LT-β 수용체가 가용성 쥐 LT-α/β 리간드에 의해서 유도된 마우스 WEHI 164 세포에서 LT-β-R 시그널링을 차단한다. WEHI 164 세포는 LT 리간드(mLT-α/β) 농도의 증가 작용으로 치사된다. 가용성 mLT-β-R-Fc(10㎍/㎖)는 상기 LT 리간드-유도된 세포 사멸을 차단하다. 가용성 쥐 TNF 수용체 융합 단백질(p55TNF-R-Fc)는 LT-α/β-활성화된 세포 사멸을 차단하는 효과가 거의 없다. 반응된 MMT의 광학 밀도(OD 550)를 측정하므로서 3일 후에 증식을 정량화하며, 이는 세포수와 비례한다.
도 3. 인체 LT-β-R(BDA8 mAb)에 대해 유도된 항체는 인체 세포 표면상에 가용성 LT 리간드 및 LT-β-R 사이의 상호 작용을 차단한다. WiDr 종양 세포의 증식은 IFN-γ 및 가용성 LT-α1/β2 리간드의 조합에 의해서 차단된다. 항-LT-β-R 항체 BDA8은 WiDr 종양 세포의 증식을 억제하는 LT-α1/β2 리간드의 능력을 차단 한다. ■은 IgG1 대조군 mAb(10㎍/㎖)의 존재하에 세포 증식을 나타낸다. □은 항-LT-β-R mAb BDA8(10㎍/㎖)의 효과를 보여준다.
도 4. 인체 LT-β(B9 mAb)에 대해 유도된 항체는 세포 표면 LT-α/β 리간드 및 가용성 LT-β 수용체 사이의 상호 작용을 차단한다(hLT-β-R-Fc; 2㎍/㎖). 피코에르트린-표지된 당나귀 항-인체 IgG 및 FACS 분석을 사용하여 표면 결합된 LT-β-R-Fc를 검출하였다. 결과 피크의 평균 형광 강도를 채널수로 플롯하였다. 점선은 B9 mAb의 부재하에 결합된 수용체의 양에 해당하는 평균 형광 강도를 보여준다.
도 5. 쥐 접촉성 지연형 과민증 모델(DTH)에서 귀 종창에 대한 LT-β-R 차단제(mLT-β-R-Fc)의 효과. 그래프는 감작된 쥐의 귀에 0.2% DNFB 항원을 투여한지 24 시간 후 측정한 귀의 두께의 증가를 보여준다. 각 부호는 별도의 실험을 나타낸다. 모든 실험은 ◇로 구분된 것(각 점에서 4마리 동물만을 사용)들을 제외하고는 각 점에서 7-8마리 동물을 이용하였다. 완충액(PBS) 및 음성 대조군으로 제공된 20mg/kg의 대조군 IgG 융합 단백질(LFA3-Fc)을 사용하여 마우스를 처리하였다. 양성 대조군으로 제공된 8mg/kg의 항-VLA4 mAb(PS/2 mAb)를 사용하여 마우스를 처리하였으며, 이는 접촉성 DTH 귀 종창을 억제하였다.
도 6. mLT-βR-lg 및 hLFA3-lg 융합 단백질로 처리한 후 14일에 마우스에서 관찰된 중량 변화의 그래프이다.
도 7. mLT-βR-lg 및 hLFA3-lg 융합 단백질로 처리한 후 14일에 마우스에서 관찰된 결장 길이의 변화 그래프이다.
도 8. CD45RB저CD4 양성 T 세포; CD45RB고CD4 양성 T 세포; CD45RB고와 LTβR-lg; 및 CD45RB고와 hLFA3-lg를 주입한 후에 쥐의 시간 경과에 따른 체중을 보여준다.
도 9. 도 8-11에서와 같이 처리한 후에 관찰된 체중의 평균 및 표준 편차를 그래프로 나타낸 것이다.
도 10. 음성 및 양성 대조군 및 mLTβR-lg를 주입한 마우스의 발바닥(footpad)의 증가를 나타낸 것이다.
본 발명은 "림포톡신-β 수용체 차단제"를 포함하는 조성물 및 방법에 관한 것으로, 림포톡신-β 수용체 시그널링을 차단한다. 림포톡신-β 수용체 차단제는 림프구-매개된 면역학적 질병을 치료하는데 사용되며, 특히 Th1 세포-매개된 면역 응답을 억제하는데 유용하다. 본 발명은 림포톡신-β수용체 차단제로서 작용하는 림포톡신-β 수용체 세포외 영역의 가용성 형태에 관한 것이다. 본 발명은 림포톡신-β 수용체 또는 이의 리간드, 표면 림포톡신에 대해 유도된 항체의 용도에 관한 것으로, 이 항체는 림포톡신-β 수용체 차단제로서 작용한다. 본 발명은 LT-β 수용체 시그날화를 차단하는 가용성 수용체, 항체 및 기타 제제를 선별하는 신규의 스크리닝 방법을 제공한다.
면역성 검사 개시에서 방출되는 시토킨의 패턴은 면역 작동 인자 경로를 활성화시키는 연속적인 선별에 영향을 줄 수 있다. 면역 작동 인자의 메카니즘사이의 선택은 CD-양성 헬퍼 T 림프구(T 헬퍼 세포 또는 Th 세포)에 의해 매개된다. Th 세포는 항원-현존 세포(APCs)와 상호작용을 하며, 이는 표면에 MHC 클래스 II 분자와 관련하여 처리된 이종 항원의 펩티드 단편을 표시한다. Th 세포는 특이 수용체를 발현시키는 적절한 APC 표면상에 나타난 이종 항원의 특정 에피토프를 인식하는 경우에 활성화된다. 이어서, 활성화된 Th 세포는 적절한 면역 작동 인자 메카니즘을 활성화시키는 시토킨(림포킨)을 분비한다.
Th 세포는 킬러 T 세포 활성, B 세포 항체 생성 및 대식 세포 활성을 비롯한 다양한 작동인자 메카니즘을 활성화시킬 수 있다. 작동 인자 메카니즘 사이의 선택은 대개 활성화된 Th 세포에 의해 형성되는 시토킨에 의해서 매개된다.
Th 세포는 시토킨 분비 패턴에 따라 3개의 아군으로 분류할 수 있다.(Fitch 등, Ann. Rev. Immunol., 11, 29면~48면(1993)). 이들 아군을 Th0, Th1 및 Th2로 명명한다. 마우스에서, 비-자극된 "순수" T 헬퍼 세포는 IL-2를 생성한다. 단 기간의 자극으로 Th0 전구 세포를 유도하며, 이는 IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-5 및 IL-10을 비롯하여 광범위한 시토킨을 생성한다. 만성적으로 자극된 Th0 세포는 Th1 및 Th2 세포 형태로 분화될 수 있으며, 이로 인해 시토킨 발현 패턴이 변한다.
일부 시토킨은 Th1 및 Th2 세포에 의해서 방출된다(예, IL-3, GM-CSF 및 TNF). 기타 시토킨은 오직 하나 또는 기타 Th 세포 아군에 의해서 제조된다. T 헬퍼 세포 아군의 특정 효과가 마우스에서 우선 인식되었다. T 헬퍼 세포의 유사한 분할이 인체에도 존재한다(Romagnani 등, Ann. Rev. Immunol., 12, 227면~57면 (1994)).
Th1 세포는 LT-α, IL-2 및 IFN-γ을 생성한다. 인체에서, 시토킨 분비의 Th1 패턴은 일반적으로 세포 면역성 및 감염에 대한 내성과 관련이 있다. Th1 시토킨은 Type IV "지연형" 과민증과 같은 대식 세포 및 특정 염증성 응답을 활성화시키는 경향이 있다(후술). Th1 시토킨은 조직 이식 및 기관 이식의 세포 거부반응에 중요한 역할을 한다.
Th2 세포는 시토킨 IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10을 생성한다. Th2 시토킨은 호산성 및 비만 세포 형성을 증가시키고, B 세포의 최대 팽창 및 성숙을 촉진한다(Howard 등, "T-세포 유래된 시토킨 및 이의 수용체", Fundamental Immunology, 3판., Raven Press, New York(1993)). Th2 시토킨은 또한 알레르기 반응과 관련이 있는 IgE 항체 및 항-이식 항체를 비롯하여 항체의 생성을 증가시킨다. Th2 세포는 지속성 항원에 대한 내성 및 면역 억제에 관여할 수 있다.
Th1-관련 시토킨 및 Th2- 관련 시토킨은 특정 과민성 응답에 중요한 역할을 한다--부적당하거나 불균형한 면역 응답은 이전에 조우한 항원과의 접촉을 유발한다. 4개의 인지된 과민증 형태가 있다(Roitt 등, Immunology, 19.1면~22.12면 (Mosby-Year Book Europe Ltd., 3판. 1993)).
형태 I "즉각적인 과민증"은 알레르기 항원-유도된 Th2 세포 활성 및 Th2 시토킨 방출을 포함한다. Th2 시토킨 IL-4는 IgE를 생성하는 아이소타입 전환을 수 행하도록 B 세포를 자극시키며, 이는 습진, 천식 및 비염에 이르게 하는 것들과 같이 급성 염증 반응을 형성하는 비만 세포를 활성화시킨다.
형태 II 및 III 과민증은 세포 표면 또는 특이 조직 항원(형태 II) 또는 가용성 혈청 항원(형태 III)에 대해 작용하는 IgG 및 IgM 항체에 의해서 유발된다. 이들 형태의 과민성 반응은 Th 세포에 의해서 매개된 것으로는 생각되지 않는다.
형태 IV "지연형" 과민증(DTH)은 Th1 세포 매개된 것이다. DTH 반응은 진행을 위해서 12 시간 이상이 소요되며, 혈청 단독이 아닌 Th1 세포를 전달하므로서 마우스들 사이에 반응이 전달될 수 있기 때문에 "세포-매개된" 것으로 언급할 수 있다. 형태 IV DTH 응답은 일반적으로 3가지 형태로 분류된다: 접촉성, 투베르쿨린-형 및 육아종성 과민증.
질병을 유발할 수 있는 다수의 세포-매개된 응답은 질병이 있는 마우스로부터 림프구를 전달하므로서 건강한 쥐에서 유도가능하다(예, 인슐린-의존성 당뇨병 및 실험적 자가면역 뇌염). 상기 특징은 형태 IV DTH를 기타 3가지 형태의 과민성 형태와 구별시키며, 이는 무세포 혈청에 전달될 수 있는 항체에 의해서 우선적으로 유발되는 체액성 면역 응답이다.
T 헬퍼 세포는 또한 처음부터 면역글로블린 아이소타입 전환의 조절에 관여한다. 상이한 Th 서브세트는 면역성 검사에 응답하여 형성된 소정의 아이소타입의 면역 글로블린의 상대적 비율에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, Th2 시토킨 IL-4는 활성화된 B 세포를 IgG1 아이소타입로 전환시키고 기타 아이소타입를 억제할 수 있다. 전술한 바와 같이, IL-4는 또한 형태 I 과민성 반응에서 IgE 과형성을 활성 화시킨다. Th2 시토킨 IL-5는 IgA 아이소타입를 유도한다. 아이소타입 전환에 대한 Th2 시토킨의 영향은 Th1 세포에 의해 생성되는 IFN-γ에 의해 상쇄된다.
Th1 및 Th2 세포에 의해 분비된 시토킨의 차등 형태는 상이한 면역 작동 인자 메카니즘에 대한 반응에 관여하는 것으로 나타난다. 세포-매개된 메카니즘 또는 체액 작동인자 메카니즘을 활성화시키는 전환은 Th1 및 Th2 세포 사이에 교차-억압에 의해서 감작된다: Th1 세포에 의해서 생성되는 IFN-γ는 Th2세포 증식을 억제하며 Th2 세포-분비된 IL-10은 Th1 세포로부터의 시토킨 분비를 감소시키는 것으로 보인다.
분자 표적에 대한 시토킨의 상대적인 친화도와 관련하여, Th1 및 Th2 음성 조절 회로는 Th1 및 Th2 시토킨 사이의 작은 농도 차이의 효과를 증폭시킬 수 있다. 증폭된 Th1 또는 Th2 시토킨 시그널은 Th1 및 Th2 시토킨의 상대적 농도의 작은 변화에 근거한 세포-매개된 또는 체액 작동인자 메카니즘사이의 전환을 개시시킬 수 있다. Th1 및 Th2 시토킨의 상대적 농도를 조정하므로서 상기 전환을 조절할 수 있는 능력은 가벼운 증상 및 질병을 면역시킬 수 있는 다양한 Th1 및 Th2 세포-의존성 면역 응답에서 불균형을 치료하는데 유용하다.
임상 병리학적 Th1 응답은 수 많은 기관-특이 및 전신 자가 면역 증상, 만성적 염증 질병, 및 지연형 과민 반응과 관련되어 있다. 전술한 바와 같이, Th1 응답은 또한 이식된 조직 및 이식된 기관 거부 반응을 유도하는 세포 응답에 기여한다.
현재까지 각종 Th1 세포계 면역 증상의 치료에는 일반적으로 불안전하게 특 성화된 메카니즘을 갖는 다수의 의약품 뿐만 아니라 면역 조절 인자 및 면역 억제제를 사용해왔다(예, 금 또는 페니실아민). 현재 사용되고 있는 3가지 일반적인 면역 억제제는 스테로이드, 시클로스포린 및 아자티오프린이다.
스테로이드는 활성화된 대식세포를 억압하고 Th1 시토킨 IFN-γ의 여러 효과를 역전시키는 방식으로 항원 현존 세포의 활성을 억제하는 다면발현 항-염증제이다. 유효한 면역 억제제인 시클로스포린은 시토킨 생성을 억제하고 활성과정에서 림프구상에 IL-2 수용체의 발현을 감소시킨다. 아자티오프린은 DNA 합성을 억제하는 항증식제이다. 이들 비-특이 면역 억제제는 일반적으로 독성(예, 신장 독성 및 간독성)을 증가시키고 부작용을 유발하는 고 용량을 요한다. 따라서 장기간의 치료에는 적당하지 않다.
비-특이 면역 억제제를 사용한 통상적인 치료에 의해서 유발되는 문제를 해결하기 위해서, 다수의 현 치료적 전략은 면역 시스템의 선택적인 측면의 억압 또는 활성화를 지향한다. 특히 눈에 띄는 목표는 세포-매개된 메카니즘 및 체액 작동인자 메카니즘 사이의 균형을 이동시키기 위해서 Th1 및 Th2 시토킨사이의 균형을 조작하는 것이다.
세포 매개된 메카니즘 및 체액 작동인자 메카니즘 사이의 이동을 달성하기 위해서, Th1 및 Th2 세포 서브클래스의 상대적인 활성을 이동시킬 수 있는 분자의 활성을 조절할 수 있는 능력이 유용하다. 상기 분자의 예는 시토킨 및 이의 수용체를 포함한다. 최근 자료는 LT-α, IL-12, IFN-α 및 INF-γ가 Th1 응답을 진전시키는 반면, IL-1 및 IL-4는 Th2 작동 인자 메카니즘에 대한 응답에 편중되게 한 다는 것을 제안한다(Romagnani 등, Ann. Rev. Immunol., 12, p227-57 (1994)).
다수의 Th 세포 시토킨은 면역 진전 및 기능의 다면 발현 조절 인자이며, 이의 생성을 억제하면 비-T 세포 매개된 응답에 대한 유해한 영향을 갖는다. Th1 및 Th2 작동 인자 메카니즘 사이의 선택을 선별적으로 조절하기 위한 바람직하고 효과적인 표적은 동정되지 않았다.
발명의 개요
본 발명은 림포톡신-β 수용체 차단제를 사용하여 림포톡신-β 수용체(LT-β-R) 시그널링을 억제하므로서 면역 질환을 치료하는 약학적 조성물 및 방법을 제공하여 상기 언급된 문제들을 해결한다. 특히, LT-β-R 차단제를 포함하는 조성물 및 방법은 Th1 세포-매개된 면역 응답(예, 염증성 장 증후군)을 억제하는데 유용하다.
본 발명의 일양태에서는, LT-β-R 차단제로 작용하는 림포톡신-β 수용체 세포외 영역의 가용성 형태를 제공한다. 상기 일양태의 바람직한 조성물 및 방법은 재조합 림포톡신-β 수용체 융합 단백질을 포함하며, 상기 융합 단백질은 면역 글로블린의 불변 중쇄 영역에 융합된 LT-β-R 세포외 리간드 결합 영역을 갖는다.
특히 LT-β-R 리간드 결합 영역은 인체 IgG Fc 영역에 융합시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 일양태에서, LT-β-R 차단제로 작용하는 항체를 제공한다. 본 일양태의 바람직한 조성물 및 방법은 림포톡신-β 수용체에 대하여 유도된 하나 이상의 항체를 포함한다. 특히, 항체는 모노클로날 항체인 것이 바람직하다. 본 일양태의 기타 바람직한 조성물 및 방법은 표면 림포톡신에 대하여 유도된 하나이상의 항체를 포함한다. 특히, 항체는 림포톡신-β에 대하여 유도된 모노클로날 항체인 것이 바람직하다.
추가로 본 발명은 LT-β-R 차단제(예, LT-β-R, 항-LT Abs 및 항-LT-β-R Abs의 가용성 형태)를 선별하는 신규의 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 스크리닝 방법은 LT-β-R 시그널링을 모니터하는 종양 세포의 세포독성 분석을 수행하는 것을 포함한다. 종양 세포 독성 분석에서 LT-β-R 활성제(예, LT-α1/β2의 존재하에) 리간드-유도된 또는 항체-유도된 LT-β-R 시그널링에 대한 인체 선암 세포의 증가된 감도을 이용하여 분석한다.
LT-β-R 차단제는 종양 세포상의 LT-α/β 이종체 복합체(또는 기타 LT-β-R 활성제)의 세포 독성 효과를 억제한다. 추정 LT-β-R 차단제를 시험하는데 사용하는 과정은 항-LT-β-R 항체(LT-β-R 활성제 LT-α1/β2의 존재하에)의 경우에 예시되었으며 하기의 단계를 포함한다:
1) 종양 세포(예, HT29 인체 선암 세포)를 수일동안 IFN-γ를 함유하는 배지에서 배양하고 분석할 특정 항-LT-β-R Ab의 존재 또는 부재하에 LT-α1/β2를 정제하는 단계;
2) 생세포를 착색시키는 염료로 세포를 처리하는 단계; 및
3) 각 시료에서 LT-α1/β2, IFN-γ 및 시험 항-LT-β-R Ab의 존재하에 사멸된 종양 세포의 분획을 결정하기 위해서 염색된 세포의 수를 정량화하는 단계. 대 안적으로, DNA로의 3H-티미딘의 삽입과 같은 세포 생존성을 측정하는 임의의 다수의 공지된 분석을 사용하여 다수의 생존 세포를 측정할 수 있다. 상기 분석에서 사멸된 종양 세포의 백분율을 20% 이상 감소시키는 항-LT-β-R Ab(또는 Ab 조합)은 본 발명에 속하는 LT-β-R 차단제이다.
상기 세포 융해 분석은 LT-α/β이종체 복합체 및 기타 LT-β-R 활성제(단독 또는 조합)를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 분석은 또한 신규의 LT-β-R 차단제의 동정이 요구될 때 적용할 수 있다.
본 발명의 상세한 설명
본 명세서에 개시된 내용을 명확하게 이해할 수 있도록, 하기에 상세히 설명하였다.
"시토킨"은 세포 사이의 상호 작용을 매개하는 분자를 의미한다. "림포킨"은 림프구에 의해서 방출되는 시토킨이다.
"T 헬퍼 (Th) 세포"는 세포 독성 T 세포를 형성하도록 보조하고, 항체 생성을 자극하도록 B 세포와 함께 작용하는 T 세포의 기능적 서브클래스를 의미한다.
헬퍼 T 세포는 클래스 II MHC 분자와 관련된 항원을 인식한다.
"Th1"은 LT-α, 인터페론-γ 및 IL-2( 및 기타 시토킨)을 생성하고, 항원 투여에 응답하는 세포(즉, 비-면역글로블린)와 관련된 염증 반응을 유도하는 T 헬퍼 세포의 서브클래스를 의미한다.
"Th2"는 면역 항원 투여에 대한 면역 글로블린(체액) 응답과 관련된 IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10을 비롯한 시토킨을 생성하는 T 헬퍼 세포의 서브클래스를 의미한다.
"세포 매개된"은 응답을 형성하는 T 세포 및 이의 생성물의 직접적인 효과로부터 생기는 면역학적 작용을 의미한다. 상기 응답의 형태는 일반적으로(그러나 독점적이지 않음) T 세포의 Th1 서브클래스와 관련되어 있다. B 세포 분화 및 B 세포 팽창에 대한 T 세포의 헬퍼 효과는 이 부류에 속하지 않으며, 일반적으로 T 세포의 Th2 클래스와 관련이 있다.
"지연형 과민증(DTH)"은 1-3일 후에 명백해지는 완전한 효과로 항원에 서서히 응답하므로서 특성화되는 면역 응답을 의미한다. 이러한 느린 응답은 면역글로블린-매개된(체액) 알레르기 반응에서 보여지는 상대적으로 빠른 응답과 대조적이다. DTH 반응의 3가지 형태가 있다: 접촉성 과민증, 투베르쿨린-형 과민증 및 육아종성 반응.
"면역글로블린 응답" 또는 "체액성 응답"은 동물이 이종 항원에 대해 항체를 생성하게 하는 이종 항원에 대한 동물의 면역학적 응답을 의미한다. T 헬퍼 세포의 Th2 클래스는 고 친화 항체의 생성 효율에 중요하다.
항체의 "Fc 영역"은 힌지(hinge), CH2 및 CH3 영역을 포함하나 항원 결합 부위가 부족한 분자의 일부분을 의미한다. 이 용어는 또한 IgM 또는 기타 항체 아이소타입의 해당 부분을 포함하는 것을 의미한다.
"항-LT-β 수용체 항체"는 LT-β 수용체의 하나 이상의 에피토프에 특이저으로 결합하는 임의의 항체를 의미한다.
"항-LT 항체"는 LT-α, LT-β 또는 LT-α/β 복합체의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 임의의 항체를 의미한다.
"LT-β-R 시그널링"은 LT-β-R 경로와 관련된 분자 반응 및 이로부터 생성되는 연속적인 분자 반응을 의미한다.
"LT-β-R 차단제"는 LT-β-R에 대한 리간드 결합, 세포 표면 LT-β-R 클러스트형성 또는 LT-β-R 시그널링을 감소시킬 수 있거나, 또는 LT-β-R 시그널이 세포내에서 판독되는 방식에 영향을 줄 수 있는 제제를 의미한다.
리간드-수용체 결합의 단계에서 작용하는 LT-β-R 차단제는 20% 이상 LT-β-R에 대한 LT 리간드 결합을 억제할 수 있다. 리간드-수용체 결합의 단계 이후 작용하는 LT-β-R 차단제는 20% 이상 종양 세포상에 LT-β-R 활성의 세포 독성 효과를 억제할 수 있다. LT-β-R 차단제의 예는 가용성 LT-β-R-Fc 분자, 및 항-LT-α, 항-LT-β, 항-LT-α/β 및 항-LT-β-R Abs를 포함한다. 항체는 LT-α의 분비된 형태와 교차 반응하지 않는 것이 바람직하다.
"LT-β-R 생물학적 활성"은 1) 가용성 또는 표면 LT 리간드 결합을 위해 가용성 또는 표면 LT-β-R 분자와 경쟁하는 LT-β-R 분자 또는 유도체의 능력; 또는 2) 본래의 LT-β-R 분자와 공동으로 면역 조절 응답 또는 세포 독성 활성을 자극하는 능력을 의미한다.
"LT-α/β 이종체 복합체" 및 "LT 이종체 복합체"는 하나 이상의 서브 유니트의 가용성, 변이, 변형 및 키메라 형태를 비롯한, 하나 이상의 LT-α 및 하나 이상의 LT-β 서브유니트 사이의 안정한 관계를 의미한다. 서브유니트는 정전기, 반데르발스, 또는 공유결합 상호 작용을 통하여 연결된다. LT-α/β 이종체 복합체는 2개 이상의 이웃한 LT-β 서브유니트를 갖으며 이웃한 LT-α 서브유니트가 부족한 것이 바람직하다. LT-α/β 이종체 복합체가 세포 증식 분석에서 LT-β-R 활성제로 제공되는 경우, 복합체는 가용성인 것이 바람직하며 화학양론적 LT-α1/β2를 갖는다. 가용성 LT-α/β이량체 복합체는 트랜스막(transmembrane) 영역이 부족하고, LT-α 및/또는 LT-β 서브유니트를 발현하도록 유전자 조작을 한 적당한 숙주세포에 의해서 분비될 수 있다(Crowe 등, J. Immunol. Methods, 168, 79면~89면(1994)).
"LT 리간드"는 LT-β 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 LT 이종체 복합체 또는 이의 유도체를 의미한다.
"LT-β-R 리간드 결합 영역"은 LT 리간드의 특이적 인지 및 LT 리간드와의 상호 작용을 포함하는 LT-β-R의 부분(들)을 의미한다.
"표면 LT-α/β 복합체" 및 "표면 LT 복합체"는 세포 표면에 나타나는 하나 이상의 서브유니트의 변이, 변형 및 키메라 형태를 비롯하여, LT-α 및 막-결합 LT-β 서브유니트를 포함하는 복합체를 의미한다. "표면 LT 리간드"는 LT-β 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 표면 LT 복합체 또는 이의 유도체를 의미한다.
"검체"는 동물, 또는 동물에서 유래된 하나 이상의 세포를 의미한다. 동물은 포유동물인 것이 바람직하다. 세포는 조직에 보유된 세포; 세포 클러스터; 무한 증식된, 형질감염된 또는 형질전환된 세포; 및 물리적으로 또는 표현형으로 변형된 동물에서 유래된 세포를 비롯한 임의의 형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것 은 아니다.
림포톡신-β: TNF계의 구성원
종양 괴사 인자(TNF)-관련된 시토킨은 숙주 방어 및 면역 조절의 다면발현 조절 인자의 거대 계로서 나타난다. 상기 계의 구성원은 세포-세포 접촉을 통하여 국부적으로 작용하는 막-결합 형태로, 또는 거리가 있는 표적에 작용할 수 있는 분비된 단백질로서 존재한다. TNF-관련된 수용체의 상사한 계는 이들 시토킨과 반응하며, 세포 사멸, 세포 증식, 조직 분화 및 염증전 질병을 비롯한 각종 경로를 촉발시킨다.
TNF, 림포톡신-α(LT-α, 또는 TNF-β라고 칭함) 및 림포톡신-β(LT-β)는 리간드의 TNF계의 구성원이며, Fas, CD27, CD30, CD40, OX-40 및 4-1BB 수용체에 대한 리간드를 포함한다(Smith 등, Cell, 76, 959면~62면(1994)). TNF, LT-α, LT-β 및 Fas를 비롯한 TNF계의 몇가지 구성원에 의한 시그널링은 괴사 또는 고사에 의해 종양 세포 사멸을 유발할 수 있다(계획된 세포 사멸). 비-종양원 세포에서, TNF 및 다수의 TNF계 리간드-수용체 상호 작용은 면역 시스템 진전에 영향을 주며 각종 면역 항원 투여에 응답한다.
대부분의 TNF계 리간드는 세포 표면상에 막-결합 형태로 발견된다. TNF 및 LT-α는 인체에서 분비 형태 및 막-연관된 표면 형태로 발견된다. 표면 TNF는 분비된 형태를 형성하기 위해서 단백질 분해효소로 분열시킨 트랜스막 부분을 갖는다. 대조적으로, 표면 LT-α은 트랜스막이 부족하다. LT-α/β 복합체에서, 막-연관된 LT-α는 관련 트랜스막 폴리펩티드인 LT-β와의 이종체 복합체로서 세포 표 면에 결합된다.
대부분의 막-연관 LT-α/β 복합체("표면 LT")는 LT-α1/β2 화학량론을 갖는다(Browning 등, Cell, 72, 847면~856면(1993); Browning 등, J. Immunol., 154, p.33-46 (1995)). 표면 LT 리간드는 고 친화도를 갖는 TNF-R과 결합하지 않으며, TNF-R 시그널링을 활성화시키지 않는다. LT-β 수용체(LT-β-R)라고 칭하는 또 다른 TNF-관련 수용체는 고 친화도를 갖는 이들 표면 림포톡신 복합체를 결합시킨다(Crowe 등, Science, 264, 707면~710면(1994)).
TNF-R 시그널링과 같은 LT-β-R 시그널링은 항-증식 효과를 갖으며, 종양 세포에 대해 세포독성이 될 수 있다. 본 출원인의 동시계류중인 미국 출원 일련 번호 08/378,968에서, LT-β-R 활성화제를 사용하여 LT-β-R를 선택적으로 자극시키는 조성물 및 방법을 개시하고 있다. LT-β-R 활성제는 TNF-R-유도된 염증전 또는 면역 조절 경로를 동시 활성화시키지 않고 종양 세포 증식을 억제하는데 유용하다.
비-종양 세포에서, TNF 및 TNF-관련 시토킨은 각종 면역 응답에서 활성을 갖는다. TNF 및 LT-α 리간드는 TNF 수용체에 결합하여 이를 활성화시킨다(p55 또는 p60 및 p75 또는 p80; 본원에서는 "TNF-R"로 칭함). 대식 세포 및 호중구의 살균 작용을 증가시키는 미생물 감염에 초기의 신속한 응답에서 대식세포에 의해 TNF 및 LT-α가 생성된다. 대식세포 또는 세포 독성 T 림프구(CTLs 또는 "킬러 T 세포")에 의해서 제조된 TNF 및 LT-α는 표적 세포 표면상의 TNF 수용체에 결합하여 감수세포의 사멸을 개시한다.
TNF 및 TNF-관련 시토킨은 또한 감염 또는 스트레스에 응답하는 염증성 증배 계를 개시한다. TNF, LT-α 및 IFN-γ의 방출은 혈관 내피 세포 및 특정 림프구 형태 사이의 유착 특성을 변화시킨다. 증가된 유착은 혈류에서 염증 부위의 주변 조직으로 식세포 및 백혈구 이동을 용이하게 한다. 유사한 염증 반응은 조직 이식 및 기관 이식, 및 특정 면역 질환에서의 세포 거부시 중요한 역할을 한다.
세포 표면 림포톡신(LT) 복합체는 LT를 고농도로 발현하는 CD4+ T 세포 하이브리도마 세포에서 특성화된다(Browing 등, J. Immunol., 147, 1230면~1237면(1991); Androlewicz 등, J. Biol. Chem., 267, 2542면~2547면 (1992)). LT-β-R, LT 서브유니트 및 표면 LT 복합체의 발현 및 생물학적 역할은 C.F. Ware 등의 문헌["The ligands and receptors of the lymphotoxin system", in Pathways for Cytolysis, Current Topics Microbiol Immunol, Springer-Verlag, 175면~218면 (1995)]에 검토되어 있다.
활성화된 T 및 B 림프구 및 선천 킬러(NK) 세포에 의해서 LT-α 발현이 유도되고 LT-α가 주로 분비된다. T 헬퍼 세포 서브클래스 중에서, LT-α는 Th2 세포가 아니라 Th1 세포에 의해서 생성되는 것으로 보인다. LT-α는 또한 멜라닌 세포에서 검출된다. 다중 경화증 환자의 병변에서 소교세포 및 T 세포를 또한 항-LT-α 항혈청으로 염색할 수 있다.
림포톡신-β(또한 p33으로 칭함)은 T 림프구, T 세포주, B 세포주 및 림포킨-활성화된 킬러(LAK) 세포의 표면에서 동정되었다. LT-β는 출원인의 동시계류중인 1992년 1월 9일 WO 92/00329로 공개된 국제 출원 PCT/US91/04588; 및 1994년 6 월 23일에 WO94/13808로 공개된 PCT/US93/11669의 주제이며, 본원에서 참고로 인용하였다.
표면 LT 복합체는 항-LT-α 항체 또는 가용성 LT-β-R-Fc 융합 단백질을 사용하여 FACS 분석 또는 면역 조직학에 의해서 규정된 바와 같이 활성화된 T 및 B 림프구 및 선천 킬러(NK) 세포에 의해 주로 발현된다. 표면 LT는 또한 인체 세포 독성 T 림프구(CTL) 클론, 활성화된 말초 단핵 림프구(PML), IL-2-활성화된 말초 혈액 림프구(LAK 세포), 아메리카자리공 미토겐-활성화된 또는 항-CD40-활성화된 말초 B 림프구(PBL) 및 T 및 B 세포 정렬의 각종 림프구 종양에서 나타난다. 동종 항원-보유 표적 세포의 특히 CD8+ 및 CD4+ CTL 클론에 의해서 표면 LT 발현을 유도한다.
TNF계 수용체의 구성원인 LT-β 수용체는 표면 LT 리간드에 특이적으로 결합한다. LT-β-R는 LT 이종체 복합체(LT-α1/β2 및 LT-α2/β1이 우세)에 결합하나 TNF 또는 LT-α에는 결합하지 않는다(Crowe 등, Science, 264, 707면~710면(1994)). LT-β-R에 의한 시그널링은 말초 림프양의 기관 발육 및 체액 면역 응답에서 중요한 역할을 한다.
LT-β-R 발현에 대한 연구는 초기 단계에 있다. LT-β-R mRNA는 인체 비장, 흉선 및 기타 주기관에서 발견된다. LT-β-R 발현 패턴은 LT-β-R이 말초 혈액 T 세포 및 T 세포주가 부족하다는 것 외에는 p55-TNF-R에 대해 보고된 것과 유사하다.
가용성 LT 복합체의 생성
가용성 LT-α/a 이종체 복합체는 막-결합 형태에서 가용성 형태로 변하는 LT-a 서브유니트를 포함한다. 이들 복합체는 출원인의 동시계류중인 국제 출원(PCT/US93/11669, WO 94/13808로 1994년 6월 23일에 공개)에 상세히 기술되어 있다. 가용성 LT-a 펩티드는 림포톡신-a의 아미노산 서열에 의해서 규정되며, 상기 서열은 Browning 등의 문헌[Cell, 72, 847면-856면 (1993)]의 넘버링 시스템에 따라 트랜스막 부분의 말단(즉, 약 아미노산 #44) 및 제 1 TNF 상동 부분(즉, 아미노산 #88)사이의 임의의 점에서 분열된다.
가용성 LT-
Figure 112004050545018-pat00001
폴리펩티드는 세포질 꼬리 및 트랜스막 부분을 제거하기 위해서 LT-
Figure 112004050545018-pat00002
의 N-말단을 잘라내므로서 생성할 수 있다(Crowe 등, Science, 264, 707면~710면 (1994)). 또한, 트랜스막 영역은 결실, 또는 트랜스막 영역을 포함하는 정상적 소수성 아미노산 잔기의 친수성 잔기로의 치환에 의해 불활성화 될 수 있다. 또 다른 경우에, 지방 친화도를 감소시키고 수성 용해도를 증가시키는 거의 친수성인 수료법 프로파일을 고안한다. 트랜스막 영역의 결실은 유효한 면역원성 에피토프의 유입을 방지할 수 있으므로 친수성 아미노산 잔기로 치환하는 것보다 바람직하다.
결실된 또는 불활성화된 트랜스막 영역을 형태 I 리더 서열(예, VCAM-1 리더)로 대치 또는 결합시켜 val40에서 pro88 사이의 임의의 서열로 시작하는 단백질을 분비할 수 있다. 가용성 LT-a 폴리펩티드는 N-말단에 임의의 수의 공지된 리더 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열은 펩티드를 발현시키고 진핵 시스템의 분비 경 로를 표적화할 수 있다. 참조: Eunst 등, 미국 특허 제 5,082,783 (1992).
적당한 숙주 세포를 LT-α 및 가용성 LT-
Figure 112004050545018-pat00003
를 암호하는 DNA로 동시-형질감염시키므로서 가용성 LT-α/
Figure 112004050545018-pat00004
이종체 복합체를 생성할 수 있다(Crowe 등, J. Immunol. Method, 168, 79면~89면 (1994)). LT-α의 부재하에 분비되는 가용성 LT-
Figure 112004050545018-pat00005
는 고도로 올리고머화되어 있다. 그러나, LT-α와 동시 발현될 때, 두 개의 단백질을 모두 포함하는 70kDa의 삼량체-유사 구조가 형성된다. 또한 LT-α만을 정상적으로 발현하는 세포주(예, 전술한 RPMI 1788 세포)를 가용성 LT-
Figure 112004050545018-pat00006
폴리펩티드를 암호하는 유전자로 형질감염시키므로서 가용성 LT-α1/
Figure 112004050545018-pat00007
2 이종체 복합체를 생성하는 것이 가능하다.
LT-α 및 LT-
Figure 112004050545018-pat00008
폴리펩티드를 별도로 합성하고, 순한 세정제를 사용하여 변성시키고, 함께 혼합한 후 세정제를 제거시켜 재생시켜 분리할 수 있는 혼합된 LT 이종체 복합체를 형성할 수 있다(후술).
LT-α1/
Figure 112004050545018-pat00009
2 복합체의 정제
친화 정제 시약으로서 TNF 및 LT-
Figure 112004050545018-pat00010
수용체를 사용하여 크로마토그래피에 의해 상이한 서브유니트 화학양론을 포함하는 동시발현 복합체로부터 가용성 LT-α1/
Figure 112004050545018-pat00011
2 이종체 복합체를 분리한다. TNF 수용체는 단지 LT 복합체의 α/α 틈새 내에서만 결합한다. LT-
Figure 112004050545018-pat00012
수용체는
Figure 112004050545018-pat00013
/
Figure 112004050545018-pat00014
틈새에 고 친화도로 결합하고, 이종체 LT-α/
Figure 112004050545018-pat00015
복합체의 α/a 틈새에는 낮은 친화도로 결합한다. 따라서, LT-α3 및 LT-α2/
Figure 112004050545018-pat00016
1은 TNF-R에 결합할 것이다. LT-
Figure 112004050545018-pat00017
-R은 또한 LT-α2/
Figure 112004050545018-pat00018
1 삼량체(α/
Figure 112004050545018-pat00019
틈내)에 결합할 수 있으나 LT-α3에는 결합할 수 없다. 또한, LT-a-R(TNF-R은 아님)는 LT-α1/
Figure 112004050545018-pat00020
2 및 LT-
Figure 112004050545018-pat00021
n에 결합한다(그러나, 상기 제제의 정확한 조성은 알려지지 않았으나 거대 집합체이다).
수용체 친화 시약은 가용성 세포외 영역(참고 Loetscher 등, J. Biol. Chem., 266, 18324면-18929면 (1991)), 또는 면역글로블린 Fc 영역에 커플링된 세포외 리간드 결합 영역을 갖는 키메라 단백질(Loetscher 등, J. Biol. Chem., 266 18324면~18329 (1991); Crowe 등, Science, 264, 707면~710면 (1994))로서 제조될 수 있다. 수용체는 일상적인 과정을 사용한 화학 교차-결합에 의해 친화 매트릭스에 커플링된다.
수용체 및 면역-친화 크로마토그래피를 사용하여 LT-α1/
Figure 112004050545018-pat00022
2 리간드를 정제할 수 있는 2가지 계획안이 있다. 제 1 계획안에서, LT-α 및 끝이 절단된 LT-
Figure 112004050545018-pat00023
형태를 모두 동시 발현하는 적당한 발현 시스템으로부터의 상등액을 TNF-R 칼럼상으로 통과시킨다. TNF-R은 LT-α3 및 LT-α2/
Figure 112004050545018-pat00024
1 삼량체에 결합할 것이다. TNF-R 칼럼을 통과한 흐름에는 LT-
Figure 112004050545018-pat00025
(n) 및 LT-α1/
Figure 112004050545018-pat00026
2을 포함할 것이다.
제 2 계획안에서, 모든 LT-
Figure 112004050545018-pat00027
-함유 형태(LT-
Figure 112004050545018-pat00028
(n), LT-α1/
Figure 112004050545018-pat00029
2 및 LT-α2/
Figure 112004050545018-pat00030
1)는 카오트로프(chaotrophe) 또는 pH 변화와 같은 고전적인 방법을 사용하여 LT-
Figure 112004050545018-pat00031
-R 칼럼에 결합시킨 후 용출시킨다. (LT-α3은 상기 칼럼을 통하여 흐른다). 상기 용출물은 중화시키거나 또는 카오트로프를 제거한 후, 용출물을 TNF-R 칼럼상으로 통과시키며, 이는 LT-α2/
Figure 112004050545018-pat00032
1 삼량체에만 결합한다. 상기 칼럼을 통한 흐름 은 LT-
Figure 112004050545018-pat00033
(n) 및 LT-α1/
Figure 112004050545018-pat00034
2 삼량체를 포함할 것이다.
2가지의 모든 경우에, 순수 LT-α1/
Figure 112004050545018-pat00035
2 삼량체는 당업계에 공지되어 있는 연속되는 겔 여과 및/또는 이온 교환 크로마토그래피 과정에 의해서 LT-
Figure 112004050545018-pat00036
로부터 분리될 수 있다.
또한, LT-α/
Figure 112004050545018-pat00037
이종체 복합체의 상이한 형태를 각종 통상적인 크로마토그래피 수단에 의해서 분리 및 정제할 수 있다. 또한 일련의 통상적인 정제 계획안을 전술한 면역 친화 정제 단계중 하나와 조합하는 것이 바람직할 수 있다.
LT-β-R 차단제를 위한 스크리닝
본 발명의 일양태에서, LT-β-R 차단제는 LT-β-R 시그널링을 억제하는 LT-β-R에 대해 유도된 항체(Ab)를 포함한다. 항-LT-β-R Ab는 모노클로날 항체(mAb)인 것이 바람직하다. 상기 억제자 항-LT-β-R mAb는 BDA8 mAB이다.
억제자 항-LT-β-R Abs 및 기타 LT-β-R 차단제는 LT-β-R 또는 LT 리간드에 결합하거나, 또는 세포에 LT-β-R 시그널링 효과를 억제하는 하나 이상의 제제의 능력을 검출하는 스크리닝 방법을 사용하여 동정할 수 있다.
하나의 스크리닝 방법은 LT-β-R을 갖는 종양 세포상에 LT-β-R 시그널링의 세포 독성 효과를 이용한다. 종양 세포는 LT-β-R 시그널링을 유도하는 하나 이상의 LT-β-R 활성제에 노출된다. LT-β-R 활성제는 IFN-γ의 존재하에 LT-α/β 이종체 복합체(바람직하게는 LT-α1/β2) 또는 활성화 항-LT-β-R Ab를 포함한다(참고; 출원인의 동시계류중인 미국 출원 일련 번호 08/378,968에 개시). LT-β-R 시 그널링을 차단할 수 있는 항체 및 기타 제제는 하기 분석에서 종양 세포의 LT-β-R 시그널링의 세포 독성 효과를 억제하는 능력을 기준으로 하여 선택한다:
1) HT29 세포와 같은 종양 세포는 시험할 제제의 일련의 희석액의 존재 또는 부재하에 배지 및 하나 이상의 LT-β-R 활성제를 함유하는 일련의 조직 배양 웰에서 3 내지 4일 동안 배양한다;
2) MTT와 같은 미토콘드리아 작용을 측정하는 생체 착색 염료를 종양 세포 혼합물에 첨가하고 몇시간 동안 반응시킨다;
3) 각 웰의 혼합물의 광학 밀도를 550nm 파장(OD 550)의 빛에서 정량화하였다. OD 550은 각 웰에서 LT-β-R 활성화제 및 시험 LT-β-R 차단제의 존재하에 남아 있는 종양 세포의 수에 비례한다. 상기 분석에서 LT-β-R-활성화된 종양 세포의 세포독성을 20% 이상 감소시킬 수 있는 제제 및 제제의 조합물은 본 발명의 범주에 속하는 LT-β-R 차단제이다.
LT-β-R 시그널링을 활성화시킬 수 있는 임의의 제제 또는 제제의 조합물은 LT-β-R 차단제를 동정하기 위해서 상기 분석에 사용할 수 있다. LT-β-R 시그널링을 유도하는 LT-β-R 활성제(예, 항-LT-β-R mAbs의 활성화)는 전술한 종양 세포 분석을 사용하여 종양 세포의 세포 독성을 유효화시키는 능력(단독 또는 기타 제제와의 조합물에서)을 기준으로 선택한다.
LT-β-R 차단제를 선택하는 또 다른 방법은 LT 리간드-수용체 결합으로 직접적으로 방해하는 추정 제제의 능력을 모니터하는 것이다. 리간드-수용체 결합을 20% 이상 차단할 수 있는 제제 또는 제제의 조합물은 본 발명의 범주에 속하는 LT- β-R 차단제이다.
리간드-수용체 결합의 강도를 측정할 수 있는 수 많은 분석중 하나를 사용하여 추정 LT-β-R 차단제와 경쟁적 분석을 할 수 있다. 수용체 및 리간드 사이의 결합 강도는 효소-결합된 면역 흡착 분석(ELISA) 또는 방사능 면역 분석(RIA)을 사용하여 측정할 수 있다. 특정 결합은 항체-항원 복합체를 형광 물질로 표지하고, 형광-활성화된 세포 분류(FACS)분석을 수행하여 측정하거나, 또는 기타 이러한 면역 검출 방법을 수행하여 측정하며, 이는 당업계에 공지된 기술이다.
리간드-수용체 결합 상호 작용은 또한 플라즈몬 공명 감지를 이용한 BIAcore 장치(파마시아 바이오센서)를 사용하여 측정할 수 있다(Zhou 등, Biochemistry, 32, 8193면~8198면 (1993); Faegerstram 및 O'Shannessy, "Surface plasmon resonance detection in affinity technologies", in Handbook of Affinity Chromatography, 229면~252면, Marcel Dekker, Inc., New York (1993)).
BIAcore 기술은 금 표면에 수용체를 결합시키고 이를 통해 리간드를 흐르게 한다. 플라즈몬 공명 감지는 실제 시간동안 표면에 결합한 질량을 직접 정량한다. 이 기술은 결합 속도 상수 및 분리 속도 상수를 산출하며, 따라서 리간드-수용체 해리 상수 및 친화 상수는 추정 LT-β-R 차단제의 존재 또는 부재하에 직접 측정할 수 있다.
수용체-리간드 상호 작용을 측정하는 이들 또는 기타 기술 중 임의의 것을 사용하여, 표면 또는 가용성 LT-β-R 분자에 대해 표면 또는 가용성 LT 리간드의 결합을 억제하는 LT-β-R 차단제(단독 또는 기타 제제와의 조합물)의 능력을 평가 할 수 있다. 이러한 분석은 LT-β-R 활성을 차단하는 변형된 제제의 능력을 최대화 하기 위해서 LT-β-R 차단제 또는 이들 제제의 유도체(예, 융합, 키메라, 변이체 및 화학적으로 변형된 형태)를, 단독 또는 조합하여, 시험하는데 사용할 수 있다.
가용성 LT-β-R 분자의 생성
본 발명의 일양태에서 LT-β-R 차단제는 가용성 LT-β 수용체 분자를 포함한다. 도 1은 인체 LT-β-R의 세포외 부분의 서열을 보여주며, 이 서열은 리간드 결합 영역을 암호한다. 도 1의 서열 정보 및 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여, LT-β-R 리간드 결합 영역을 암호하는 기능적 단편을 벡터내로 클론하고 적당한 숙주에서 발현시켜 가용성 LT-β-R 분자를 생산할 수 있다. 본원에서 기술한 분석에 따라 LT 리간드 결합을 위한 선천 LT-β 수용체와 경쟁할 수 있는 가용성 LT-β-R 분자를 LT-β-R 차단제로서 선택한다.
도 1에 나타난 것들로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가용성 LT-β 수용체는 수용체 융합 단백질의 생체내 안정성을 증가시키거나, 또는 이의 생물학적 활성이나 집적을 조절하기 위해서 하나 이상의 이종 구조 단백질 영역("융합 영역")에 결합시킬 수 있다.
순환에서 통상 20 시간 이상의 반감기를 갖는 안정한 혈장 단백질은 수용체 융합 단백질을 구조화하는데 사용하는 것이 바람직하다. 혈장 단백질은 면역글로블린, 혈청 알부민, 리포단백질, 아포리포단백질 및 트랜스페린을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 세포 또는 조직 형태에 가용성 LT-β-R 분자를 표적 할 수 있는 서열을 LT-β-R 리간드 결합 영역에 결합시켜 특이적으로-집적된 가용성 LT-β-R 융합 단백질을 형성할 수 있다.
LT-β-R 리간드 결합 영역을 포함하는 LT-β-R 세포외 지역(도 1)의 전부 또는 기능적인 부분은 인체 IgG1 중쇄의 Fc 영역과 같은 면역글로블린 불변부에 융합시킬 수 있다(Browning 등, J. Immunol, 154, 33면~46면) (1995)). 가용성 수용체-IgG 융합 단백질이 바람직하며, 이는 일반의 면역 시약이며, 이의 구조화 방법은 당업계에 공지되어 있다(참고로 인용한 미국 특허 제 5,225,538 호).
기능적 LT-β-R 리간드 결합 영역은 IgG1이외의 면역글로블린 클래스 또는 서브클래스로부터 유도된 면역글로블린(Ig) Fc 영역에 융합시킬 수 있다. 상이한 Ig 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 Fc 영역은 다른 종류의 2차 작동인자 기능을 활성화시킨다. Fc 영역이 동일한 기원의 Fc 수용체에 의해서 결합되는 경우 활성화된다. 2차 작동 인자 기능은 보체 시스템을 활성화시키고, 태반을 교차시키고, 각종 미생물 단백질을 결합시키는 능력을 포함한다. 면역글로블린의 상이한 클래스 및 서브클래스의 특성은 Roitt 등의 문헌 Immunology, p4.8에 개시되어 있다(Mosby-Year Book Europe Ltd., 3판. 1993).
보체 시스템의 활성은 염증을 매개하는 증배계의 효소적 반응을 개시한다. 보체 시스템의 생성물은 박테리아 결합, 세포내 이입, 식작용, 세포독성, 자유 라디칼 생성 및 면역 복합체의 가용화를 비롯한 각종 기능을 갖는다.
보체 효소 증배계는 항원 결합된 IgG1, IgG3 및 IgM 항체의 Fc 영역에 의해 활성화될 수 있다. IgG2의 Fc 영역은 덜 효과적인 것으로 보여지며, IgG4, IgA, IgD 및 IgE는 보체를 활성화시키는데 효과적이지 못하다. 따라서, 연관된 2차 작동 인자 기능이 LT-β-R-Fc 융합 단백질로 처리된 특정 면역 응답 또는 질병에 바람직한지의 여부를 기준으로하여 Fc 영역을 선택할 수 있다.
LT 리간드를 보유하는 표적 세포를 손상 또는 치사시키는 것이 유리한 경우, LT-β-R-Fc 융합 단백질을 제조하는데 특히 활성 Fc 영역(IgG1)을 선택할 수 있다. 또한, 보체계를 촉발하지 않고 세포에 LT-β-R-Fc 융합을 표적화시키는 것이 바람직한 경우, 불활성 IgG4 Fc 영역을 선택할 수 있다.
Fc 수용체에 결합 및 보체 활성을 감소 또는 제거시키는 Fc 영역에서의 변이가 개시되어 있다(S. Morrison, Annu. Rev. Immunol., 10, 239면~265면 (1992)). LT-β-R-Fc 융합 단백질을 구조화시키는데 사용되는 Fc 영역의 활성을 최적화시키기 위해서 단독 또는 조합하여 이들 또는 기타 변이체를 사용할 수 있다.
인체 면역 글로블린 Fc 영역(hLT-β-R-Fc)에 융합된 리간드 결합 서열을 포함하는 가용성 인체 LT-β-R 융합 단백질의 제조는 실시예 1에 개시되어 있다. hLT-β-R Fc를 분비하는 실시예 1에 따라 제조된 하나의 CHO주를 "hLTβ;R-hG1 CHO#14"라고 명명한다. 이 주의 시료는 부다페스트 조약에 따라서 미국 모식균 배양소(ATCC)(매릴랜드, 록빌)에 1995년 7월 21에 기탁된 것이며, ATCC 수탁 번호 CRL11965로 지정되었다.
가용성 쥐 LT-β-R 융합 분자(mLT-β-R-Fc)의 제조는 실시예 2에 개시되어 있다. mLT-β-R-Fc를 분비하는 실시예 2에 따라 제조된 CHO주는 "mLTβ;R-hG1 CHO#1.3. BB"로 명명한다. 이 주의 시료는 부다페스트 조약에 따라 미국 모식균 배양소(ATCC)(매릴랜드, 록빌)에 1995년 7월 21에 기탁되었으며, 수탁 번호 CRL11964로 지정되었다.
상기 ATCC 기탁물의 대중의 이용에 대한 제한은 본 출원에 대한 특허가 승인되면 확실히 소멸된다.
수용체-Ig 융합 단백질의 접합점을 형성하는 상이한 아미노산 잔기는 가용성 LT-β 수용체 융합 단백질의 구조, 안정성 및 궁극적인 생물학적 활성을 변화시킬 수 있다. 하나 이상의 아미노산을 선택된 LT-β-R 단편의 C-말단에 첨가하면 선택된 융합 영역의 접합점을 변형시킬 수 있다.
LT-β-R 융합 단백질의 N-말단은 선택된 LT-β-R DNA 단편을 재조합 발현 벡터내로 삽입하기 위해 5' 말단에서 분열되는 위치를 변경하므로서 다양하게 할 수 있다. 각 LT-β-R 융합 단백질의 안정성 및 활성은 일반적인 실험을 사용하여 시험 및 최적시키고, LT-β-R 차단제를 선택하기 위한 분석은 본원에 개시하였다.
도 1에 나타난 세포외 영역내에 있는 LT-β-R 리간드 결합 영역 서열을 사용하여, LT 리간드를 위한 가용성 LT-β 수용체 또는 융합 단백질의 친화도를 변형시키기 위해서 아미노산 서열 변형체를 구조화할 수 있다. 본 발명의 가용성 LT-β-R 분자는 표면 LT 리간드 결합을 위해 내인성 세포 표면 LT-β 수용체와 경쟁할 수 있다. LT 리간드 결합을 위해 세포 표면 LT-β 수용체와 경쟁할 수 있는 LT-β-R 리간드 결합 영역을 포함하는 임의의 가용성 분자는 본 발명의 범주에 속하는 LT-β-R 차단제라는 것에 주목하였다.
LT-β-R 차단제로서 가용성 LT-β-R 분자
가용성 인체 LT-β 수용체-면역글로블린 융합 단백질(hLT-β-R-Fc)을 실시예 1의 과정에 따라 제조하고, 인체 HT29 종양 세포에서 LT-β-R-유도된 세포독성을 차단하는 능력을 시험하였다. 표 1(실시예 3)은 HT29 종양 세포 증식상에 각종 TNF 및 가용성 LT 리간드의 억제적인 효과를 차단시키는 가용성 LT-β 수용체(hLT-β-R-Fc) 및 TNF 수용체(p55-TNF-R-Fc) 융합 단백질의 능력을 비교한다.
표 1의 자료는 가용성 LT-β 수용체(hLT-β-R-Fc)가 LT-α1/β2 리간드와 세포 표면 LT-β 수용체 사이의 상호 작용에 의해 유발되는 종양 세포 사멸을 50%까지 차단할 수 있는 농도를 나타낸다. 종양 세포 증식을 20% 이상 차단하는 능력은 본 발명에 따른 LT-β-R 차단제로서의 가용성 LT-β 수용체를 확인시켜준다. 예상한 바와 같이, 가용성 TNF-R 융합 단백질(p55-TNF-R-Fc)은 TNF에 결합하고 표면 수용체와의 상호 작용을 방지하므로서 TNF-유도된 증식 억제를 완전히 차단한다.
가용성 TNF-R 융합 단백질은 LT 리간드(LT-α1/β2)-매개된 항-증식 효과에 영향을 주지 않는다. 대조적으로, LT-β-R 융합 단백질은 LT 리간드 효과를 차단하나, TNF 또는 LT-α의 효과는 차단하지 않는다. 따라서, 가용성 인체 LT-β-R 융합 단백질은 TNF 및 LT-α 리간드에 의해서 TNF-R 활성을 방해하지 않는다.
마우스에서 LT-β-R 시그널링이 종양 세포에 세포독성인지의 여부, 및 가용성 LT-β-R 융합 단백질이 LT-β-R-유도된 세포독성을 차단할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해서, 유사한 실험을 마우스 종양 세포를 사용하여 수행하였다. LT 리간드로 처리한 마우스 WEHI 164 세포의 사멸을 차단하는 능력에 대해 가용성 쥐 LT-β-R-Fc 융합 단백질(mLT-β-R-Fc; 실시예 2 참고)을 시험하였다(실시예 4).
도 2는 마우스 WEHI 164 세포에서 LT 리간드-유도된 LT-β-R 시그널링에 대한 가용성 쥐 LT-β-R(mLT-β-R-Fc)의 효과를 보여준다. 상기 분석에서 나타난 바와 같이, WEHI 164 세포는 가용성 LT-α1/β2 리간드로 처리하면 치사된다. mLT-β-R-Fc의 첨가로 LT 리간드-활성화된 세포 사멸을 차단한다. 대조 TNF 수용체 융합 단백질(p55TNF-R-Fc)을 조절하는 것은 세포 사멸을 차단시키는데 거의 영향이 없다.
이들 자료는 가용성 LT-β-R 융합 단백질이 LT 리간드 결합을 위해 표면 LT-β-R 분자와 효과적으로 경쟁할 수 있다는 것을 보여준다. 따라서, 가용성 mLT-β-R-Fc 융합 단백질은 쥐에서 LT-β-R 차단제로서 작용한다.
항-인체 LT-β-R 항체의 공급원
본 발명의 또 다른 일양태에서, 인체 LT-β 수용체에 대해 유도된 항체(항-LT-β-R Abs)는 LT-β-R 차단제로서 작용한다. 본 발명의 항-LT-β-R Abs는 폴리클로날 또는 모노클로날(mAbs)일 수 있으며, LT-β-R 시그널링을 차단하는 능력, 생체내 생이용도, 안정성, 또는 기타 원하는 특징을 최적화시키기 위해서 변형할 수 있다.
인체 LT-β 수용체에 대해 통제하는 폴리클로날 항체 혈청은 염소, 토끼, 래트, 햄스터 또는 마우스와 같은 동물에게 피하주사로 완전 프로인트 보조액내의 인체 LT-β 수용체-Fc 융합 단백질(실시예 1)을 주입한 후, 불완전 프로인트를 복강내 또는 피하 주사로 추가자극시키는 통상적인 기술을 사용하여 제조할 수 있다. LT-β 수용체에 대해 유도된 원하는 항체를 포함하는 폴리클로날 항혈청은 통상적 인 면역 과정에 의해 스크리닝된다.
인체 LT-β 수용체-Fc 융합 단백질을 통제하는 마우스 모노클로날 항체(mAbs)는 실시예 5에서 개시된 바와 같이 제조한다. 쥐 항-인체 LT-β-R mAb BDA8을 생성하는 하이브리도마 세포주(BD.A8.AB9)는 부다페스트 조약에 따라서 미국 모식균 배양소(ATCC)(매릴랜드, 록빌)에 1995년 1월 12일에 기탁된 것이며, ATCC 수탁 번호 HB11798로 지정되었다. 상기 ATCC 기탁물의 대중의 이용에 대한 제한은 본 출원에 대한 특허가 승인되면 확실히 제거된다.
각종 형태의 항-LT-β-R 항체는 또한 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여(Winter and Milstein, Nature, 349, 293면~299면 (1991))제조할 수 있다. 예를 들어, "키메라" 항체는 동물 항체로부터의 항원 결합 영역이 인체 불변 영역에 결합되도록 구조화시킬 수 있다(예, Cabilly 등, 미국 4,816,567 호; Morrison 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851면~6855 (1984)). 키메라 항체는 인체 임상적 치료에 사용되는 경우, 동물 항체에 의해 유도되는 관찰된 면역원성 응답을 감소시킨다.
추가로, LT-β-R를 인식하는 재조합 "인체화된 항체"를 합성할 수 있다. 인체화된 항체는 특이 항원-결합에 관여하는 지역을 삽입한 인체 IgG 서열을 주로 포함하는 키메라이다(예, WO 94/04679). 원하는 항원으로 동물을 면역시키고, 해당 항원을 분리하고, 및 특이 항원 결합에 관여하는 가변부 서열의 일부분을 제거한다. 이어서, 동물-유도된 항원 결합부를 항원 결합부가 결실된 인체 항체 유전자의 적당한 위치로 클론시킨다. 인체화된 항체는 인체 항체에서 이종(종과 종 사이 의) 서열의 사용을 최소화하고, 처리한 검체에 면역 응답을 덜 유도해낸다.
재조합 항-LT-β-R 항체의 상이한 클래스의 구조화는 상이한 클래스의 면역글로블린으로부터 불리한 항-LT-β-R 가변 영역 및 인체 불변 영역(CH1, CH2, CH3)을 포함하는 키메라 또는 인체화된 항체를 제조하므로서 수행할 수 있다. 예를 들어, 증가된 항원 결합 부위 수가를 갖는 항-LT-β-R IgM 항체는 인체 μ쇄 불변부를 운반하는 벡터내로 항원 결합 부위를 클론하므로서 재조합하여 생성된다.(Arulanandam 등, J. Exp. Med., 177, 1439면~1450면 (1993); Lane 등, Ear, J. Immunol., 22, 2573면~2578면 (1993); Traunecker 등, Nature, 339, 68면~70면 (1989)).
또한, 표준 재조합 DNA 기술은 항원 결합 부위의 부근에서 아미노산 잔기를 변경하므로서 항원에 대한 재조합 항체의 결합 친화력을 변경하는데 사용할 수 있다. 인체화된 항체의 항원 결합 친화도는 분자 모델링을 근거로 한 변이유발에 의해서 증가될 수 있다(Queen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 10029면~10033면 (1989); WO 94/04679).
표적화된 조직 형태 또는 예정된 특정 치료 계획에 따라 LT-β-R에 대한 항-LT-β-R Abs의 친화도를 증가 또는 감소시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 반(semi)-예방적인 치료를 위한 LT-β 경로를 통해 신호하는 능력을 감소시킨 항-LT-β-R Abs의 일정 농도로 환자를 치료하는 것이 유리하다. 유사하게, LT-β-R에 대해 증가된 친화도를 갖는 억제자 항-LT-β-R Abs는 단기간의 치료에 유리할 수 있다.
LT-β-R 차단제로서 항-LT-β-R 항체
LT-β-R 차단제로 작용하는 항-LT-β-R 항체는 종양 세포의 LT-β-R-유도된 세포 독성을 억제하는 능력을 시험하므로서 선택할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일양태에서, 조성물 및 방법은 항-인체 LT-β-R mAb BDA8을 포함한다. 도 3은 mAb BDA8이 본 발명에 의해서 규정된 LT-β-R 차단제로 작용한다는 것을 보여준다. WiDr 종양 세포는 IFN-γ 및 가용성 LT-α1/β2 리간드의 존재하에 증식을 중지시킨다. 대조군 항체(IgG1)는 증식 억제에 영향을 주지 않는다. 대조적으로, 항-LT-β-R mAb BDA8은 WiDr 세포 증식을 억제하는 가용성 LT-α1/β2 리간드의 능력을 차단한다. 따라서, 인체 LT-β-R에 대하여 유도된 항체는 본 발명에 의해서 규정된 LT-β-R 차단제로서 작용한다.
인체 LT-β 수용체에 대해 유도된 기타 항체를 시험하므로서, 인체에서 LT-β-R 차단제로 작용하는 추가의 항-LT-β-R 항체를 일상적인 실험 및 본원에 개시된 분석을 사용하여 동정할 수 있을 것으로 예상한다.
항-표면 LT 리간드 항체의 공급원
본 발명의 또 다른 바람직한 일양태는 LT-β-R 차단제로 작용하는 LT 리간드에 대해 유도된 항체를 포함하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 항-LT-β-R Abs에 대해 전술한 바와 같이, LT-β-R 차단제로 작용하는 항-LT 리간드 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있으며, 항원 결합 특성 및 이의 면역원성을 조정하는 일반적인 과정에 따라 변형시킬 수 있다.
본 발명의 항-LT 항체는 LT 서브유니트의 가용성, 변이, 변형 및 키메라 형 태를 비롯한 각각 2개의 LT 서브유니트중 하나에 대해 증가될 수 있다. LT 서브유니트가 항원으로 사용되는 경우, 이는 LT-β 서브유니트인 것이 바람직하다. LT-α 서브유니트가 사용되는 경우, 생성 항-LT-α 항체는 표면 LT 리간드에 결합하고, 분비된 LT-α와 교차-반응시킬 수 없거나, 또는 TNF-R 활성을 조절할 수 없다(실시예 3에 개시된 분석에 따라서).
또한, 하나 이상의 LT 서브유니트를 포함하는 동종체(LT-β) 또는 이종체(LT-α/β) 복합체에 대하여 유도되는 항체는 LT-β-R 차단제로서의 활성을 위해 증가되고 스크리닝된다. LT-α1/β2 복합체는 항원으로 사용되는 것이 바람직하다. 전술한 바와 같이, 생성 항-LT-α1/β2 항체는 분비된 LT-α에 결합되지 않고TNF-R 활성에 영향을 주지 않으면서 표면 LT 리간드에 결합하는 것이 바람직하다.
폴리클로날 항-인체 LT-α 항체의 제조는 출원인이 공계류중인 출원(WO 94/13808)에 개시되어 있다. 모노클로날 항-LT-α 및 항-LT-β 항체가 또한 개시되어 있다(Browning 등, J. Immunol., 154, 33면~46면 (1995)).
마우스 항-인체 LT-β mAbs는 실시예 6에 개시된 바와 같이 제조하였다. 마우스 항-인체 LT-β-R mAb B9를 생성하는 하이브리도마 세포주(B9. C9. 1)는 부다페스트 조약에 따라 미국 모식균 배양소(ATCC)(매릴랜드, 록빌)에 1995년 7월 21에 기탁되었으며, 수탁 번호 HB11962로 지정되었다.
모노클로날 햄스터 항-마우스 LT-α/β 항체는 실시예 7에 개시한 방법으로 제조하였다. 햄스터 항-마우스 LT-α/β mAb BB.F6을 생성하는 하이브리도마 세포주(BB. F6.1)는 부다페스트 조약에 따라 미국 모식균 배양소(ATCC)(매릴랜드, 록 빌)에 1995년 7월 21에 기탁되었으며, 수탁 번호 HB11963으로 지정되었다.
상기 ATCC 기탁물의 대중의 이용에 대한 제한은 본 출원에 대한 특허가 승인되면 확실히 제거된다.
LT-β-R 차단제로서 항-LT 리간드 항체
형광-활성화된 세포 분류(FACS) 분석은 LT-β-R 차단제로 작용할 수 있는 LT 서브유니트 및 LT 복합체에 대하여 유도된 항체를 스크리닝하기 위해서 개발되었다(실시예 6 및 7). 이 분석에서, 시험 항체의 증가량의 존재하에 표면 LT 복합체를 발현시키는 PMA-활성화된 II-23 세포에 가용성 인체 LT-β-R-Fc 융합 단백질을 첨가한다(Browning 등, J. Immunol. 154, 33면~46면(1995)). LT-β 수용체-리간드 상호작용을 20% 이상 억제할 수 있는 항체를 LT-β-R 차단제로서 선택한다.
마우스-항-인체 LT-βmAb B9를 시험하기 위해서 수행된 상기 분석의 결과는 도 4에 나타나있다. 도 4는 항-LT-β mAb B9가 활성화된 세포에서 유도되는 표면 LT 리간드에 가용성 LT-β-R-Fc 융합 단백질의 결합을 선택적으로 차단할 수 있다. 이들 결과는 LT 리간드 서브유니트에 대해 유도된 항체가 LT-β-R 차단제로 작용한다는 것을 확인해준다.
상기 개시된 FACS 분석은 또한 가용성 마우스 LT-α/β 복합체에 대해 햄스터에서 증가된 mAbs를 시험하기 위해서 사용하였다(실시예 7). 햄스터 항-마우스 LT α/β mAb BB.F6을 시험하기 위해 수행된 상기 분석의 결과는 표 2에 나타나있다(실시예 7). 표 2는 항-LT-α/β mAb BB. F6이 쥐 T 세포 하이브리도마상에 발현된 표면 LT 리간드에 가용성 mLT-β-R-Fc 융합 단백질(실시예 2)의 결합을 효과 적으로 차단할 수 있고, 따라서 본 발명에 따른 LT-β-R 차단제라는 것을 보여준다.
동물을 면역화시키는 항원으로서 LT 서브유니트 보다는 LT-α/β 복합체를 사용하는 것이 더 효과적인 면역법이 되도록 하거나, 또는 표면 LT 리간드에 높은 친화도를 갖는 항체를 형성할 수 있다. LT-α/β 복합체로 면역화시키므로서, LT-α 및 LT-β 서브유니트(예, LT-α/β 틈을 형성하는 잔기)상에 아미노산 잔기를 인식하는 항체를 분리할 수 있다. 인체 LT-α/β 이종체 복합체에 대해 유도된 항체를 시험하므로서, 인체에서 LT-β-R 차단제로 작용하는 추가의 항-LT 항체를 일반적인 실험 및 본원에서 기술한 분석을 사용하여 동정할 수 있을 것으로 예상한다.
LT-β-R 차단제는 마우스에서 Th1 세포-매개된 접촉성 과민증을 억제한다
본 발명의 LT-β-R 차단제는 Th1 세포-매개된 면역 응답을 억제할 수 있다. 이러한 Th1-매개된 응답은 지연형 과민증(DTH; Cher 및 Mosmann, J. Immunol., 138, 3688면~3694면 (1987); 일반적인 사항은 I. Roitt 등, Immunology, pp. 22.1면~22.12면, 모스비-이어 북 유럽 리미티드, 3판 (1993)을 참조할 것). 항원-감작된 Th1 세포가 동일한 항원과의 2차 접촉후 시토킨을 분비하는 경우, DTH가 발생한다. 상기 Th1 시토킨은 염증 반응을 촉발하는 추가의 작동인자 분자를 방출하는 대식세포를 유인하여 활성화시킨다.
DTH 반응은 상이한 3가지 유형, 즉 접촉성 과민증, 투베르쿨린형 과민증 및 육아종성 반응으로 분류된다. 외래 항원을 감작된 검체에 직접 또는 피하 주입하는 경우, 이 외래 항원에 대한 응답의 속도와 특성으로 상기한 3가지 유형의 과민증(HS)을 구별할 수 있다. DTH 반응은 상기 피부가 두꺼워 지는 속도와 정도를 측정하므로써 모니터한다.
투베르쿨린형 HS 반응은 검체가 이전에 노출된 미생물(예를 들어, 미코박테리움 투베르쿨로시스(mycobacterium tuberculosis) 또는 엠. 레프래(M. leprae))로부터 유래한 외래 항원의 주입 위치에서 발생하는 피부 반응이다. 최대 48 내지 72 시간 동안의 상기 피부 반응은 이미 조우한 미생물에 대한 진단 감도 테스트(예를 들어, 투베르쿨린 피부 테스트)의 기초로 종종 사용된다. 항원이 조직 내에 유지되는 경우, 투베르쿠린형 장애가 진전됨에 따라, 육아종성 반응으로 될 수 있다.
육아종성 반응은 임상적으로 가장 심각한 DTH 반응인데, 그 이유는 육아종성 반응이 Th1 세포-매개된 질병과 관련된 다수의 병리학적 결과를 초래할 수 있기 때문이다. 항원 또는 면역 복합체가 대식 세포에 의해 제거되지 않고, 계속하여 Th1 시토킨 분비를 자극하는 경우에 육아종성 반응이 발생한다. 상기 자극 위치에서 만성 염증 및 활성화된 대식 세포의 집합은 육아종성 반응을 특징으로 한다.
또한, 림프구 및 섬유증 침전물에 의해 둘러싸일 수 있는 외피 세포 및 대식 세포의 코어는 육아종이라는 경화된 조직을 형성한다. 때로, 상기 육아종의 코어 내에 광범위한 세포 사멸이 존재한다(예를 들어, 결핵-영향받은 폐 조직). 육아종성 반응의 표적 조직 내에서의 경화는 약 4주일 내에 발생한다.
육아종 형성의 빈도에 영향을 미치는 제제는 주혈흡충-감염된 마우스를 이용하여 확인할 수 있다(참조: Amiri 등, Nature, 356, 604면-607면 (1992)). 주혈흡 충 연충(혈액 흡충)은 감염된 간의 문맥(門脈) 내에 쌓인 주혈흡충 알 주위에 육아종 형성을 초래하는 기생체 질환을 유발한다. 상기 Th1 세포-매개된 DTH 응답을 억제하는 제제는 육아종의 크기를 감소시키거나 주혈흡충-감염된 마우스 간 내에서 육아종 형성의 빈도나 속도를 감소시킬 수 있다. 주혈흡충 알에 대한 세포성 반응은 시간이 경과함에 따라 추정적인 LT-β-R 차단제의 농도를 증가시키면서 처리한 마우스 내에 형성된 육아종의 수와 크기를 정량하므로써 평가할 수 있다.
접촉성 과민증(CHS)은 피부가 표적 장기인 DTH의 부류이다. CHS에서, 염증성 응답은 피부위에 반응성 햅텐을 국소 적용하므로써 유발된다. 일반적으로 알레르기 유발원은 하나 이상의 햅텐 분자를 포함하며, 이는 일반적으로 너무 작아 스스로 항원성이 없다. 상기 햅텐은 외피를 투과하여 피부 아래의 정상적인 단배질과 반응하므로써 신규한 항원성 복합체를 생성한다.
상기 햅텐에 대한 감작된 검체의 재노출은 DTH 반응을 촉발시킨다. 항원 존재 세포와 함께 햅텐-담체 단백질 접합체는 시토킨(IL-2, IL-3, IFN-γ 및 GM-CSF를 포함함)의 방출을 촉발하는 작동인자 메카니즘을 활성화한다. 방출된 시토킨의 증배계는 CD4+ T 세포의 증식, 여러 가지 세포 표면 유착 분자의 발현 패턴의 변화 및 염증 위치에서 피부에 대한 T 세포 및 대식 세포의 활성화를 야기시킨다. 상기 시토킨 증배계 및 이의 결과로 발생하는 혈관 확장, 진피와 표피의 세포성 침윤과 부종은 표적 조직의 종창 및 염증을 초래하며, 이는 DTH 반응에 대한 응답으로 측정가능한 피부 두께 증가를 설명한다.
특정 햅텐이 개체를 감작할 수 있는 정도는 여러 가지 요인에 따라 달라진 다. 이들 요인들중에는 상기 햅텐이 얼마나 양호하게 피부를 투과하여 숙주 캐리어 단백질과 반응하므로써 접합체를 형성할 수 있느냐 하는 것도 포함된다. 거의 모든 개체를 감작하는 한 햅텐은 2,4-디니트로플루오로벤젠(DNFB)이다.
DNFB와 같은 햅텐에 대한 피부 CHS 응답은 세포-매개된 면역성에 대한 전통적인 동물 모델이다. 감작된 마우스 귀로의 상기 CHS 응답 한정은 귀 두께를 측정하므로써 생체 내에서 이 세포-매개된 반응의 용이하고, 정확하며, 재생할 수 있는 정량을 가능하게 한다. 쥐 CHS 반응 및 DNFB-유도된 염증성 반응의 조직 병리학에 대한 자세한 설명은 Chisholm 등의 문헌[Eur. J. Immunol., 23, 682면~688면 (1993)]에 기재되어 있다.
대부분의 개체에서 접촉성 과민증을 유도할 수 있는 DNFB의 능력을 이용하여 Th1 세포-매개된 DTH 반응과 관련된 염증성 응답을 감소 또는 제거하는 제제를 확인할 수 있다. 가용성 쥐의 LT-β-R-Fc 융합 단백질은 마우스에서 DNFB-유도된 접촉성 과민증 반응을 효과적으로 억제한다(실시예 8). 마우스를 연속 2일에 각 뒷 발바닥에 DNFB를 적용하므로써 초기 감작시켰다. 초기 감작하고 5일이 경과된후, 담체 용액내의 DNFB의 하위 자극량을 좌측 귀의 표면에 적용한다. 우측 귀에는 대조용으로 캐리어 용액만을 적용한다.
그후, LT-β-R 차단제 mLT-β-R-Fc(실시예 2)의 농도를 증가시키면서 마우스에게 정맥내 주입한다(실시예 8). PBS 완충액만의 주입 또는 인간 IgG 융합 단백질(LFA3-Fc)의 주입은 음성 대조용으로 작용하였으며, CHS를 억제하는 것으로 공지된 항-VLA4-특이성 mAb(PS/2 mAb)의 주입은 양성 대조용으로 작용하였다. 항원 투여하 고 24시간이 경과한 후, 각 귀(DNFB-투여한쥐 및 DNFB-투여하지 않은 귀)의 두께를 측정한다. LT-β-R 차단제에 의한 귀 종창 반응의 억제는 그들의 음성 대조군과 처리군을 비교하여 판단하였다.
도 5는 mLT-β-R-Fc가 억제되지 않은 DNFB-처리된 대조용 동물(PBS 및 LFA3-Fc)과 비교한 DNFB-처리된 마우스의 귀 팽창 반응에서 현저한 감소를 야기시키는 것을 나타내고 있다. 가용성 LT-β-R 은 투여 위치 내로 T 세포의 유입을 차단하므로써 작용하는 억제제 항-VLA4-특이성 mAb(PS/2 mAb) 만큼 효과적으로 상기 CHS 반응을 차단할 수 있다(Chisholm 등, Eur. J. Immunol., 23, 682면~688면 (1993)).
이들 자료는 시험관 내에서 LT-β-R 차단제로 작용하는 가용성 LT-β-R 융합 단백질이 동물에 투여되는 경우, Th1 세포-매개된 면역 응답도 효과적으로 억제할 수 있음을 보여준다. 시험관 내에서 확인된 본 발명의 LT-β-R 차단제는 상기한 귀 종창 분석 또는 상기한 바와 같은 기타의 DTH 분석을 이용하여 테스트하므로써 생체 내에서 Th1 세포-관련 면역 반응의 심화을 완화시키는데 유용할 추가의 LT-β-R 차단제를 선택할 수 있다.
LT-β-R 차단제는 Th2 세포-매개된 (체액) 면역학적 응답을 억제하지 않는다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 LT-β-R 차단제는 접촉성 지연형 과민증과 같이 Th1 세포-매개된 작동인자 메카니즘을 억제할 수 있다(도 5). 이 Th1 세포-매개된 응답은 Th2 세포-의존성 반응에 현저한 영향을 미치지 않으면서 억제된다. Th1 세포 매개된 면역 반응에 대한 LT-β-R 차단제의 차별적인 효과는 초기 항체 반응 및 아이소타입 전환과 같이 LT-β-R 차단제의 존재 하에서 Th2 세포-의존성 면역 반응을 조사하므로써 확인된다.
마우스는 10일 동안에 걸쳐 가용성 LT-β-R 차단제(mLT-β-R-Fc; 실시예 2) 또는 대조용 IgG 융합 단백질(LFA3-Fc)로 5회 주입하거나, 미처리 상태로 방치한다. 제 2 주입후, 모든 마우스는 꼬리 기저부에 난알부민 100 ㎍을 함유하는 프로인트 완전 보조제 100 ㎕를 주입한다. 11일 후, 초기 혈청 항-난알부민-특이성 항체 역가는 IgG1, IgG2a 및 IgM 아이소타입에 특이적인 ELISA를 이용하여 분석한다.
도 6은 난알부민으로 면역화한 마우스에서 혈청 항-난알부민 항체 형성에 대한 마우스 LT-β-R 차단제 mLT-β-R-Fc의 효과를 나타내고 있다(실시예 9). LT-β-R 차단제의 투여는 난알부민 면역화후 초기 항체 역가에 현저한 영향을 미치지 않는다. 비교해보면, CD40 리간드-유도된 CD40 수용체 시그널링의 방해는 마우스에서 항원-특이성 IgG 응답을 완전히 차단한다(Renshaw 등, J. Exp. Med., 180, 1889면~1900면 (1994)). CD40은 TNF류에 속하는 다른 리간드/수용체 쌍이다.
총 면역글로블린 생성 및 성숙은 명백히 Th2 세포-의존성이다. 그러나, Th1 시토킨 IFN-γ가 참여한다는 증거도 있으나, IgG2a 서브클래스에 대한 전환을 위해 절대적으로 필요한 것은 아니다(Huang 등, Science, 259, 1742면~1745면 (1993)). LT-β-R 차단제 mLT-β-R-Fc는 이들 실험에서 IgG2a 전환을 억제하지 않는다. 본 발명의 LT-β-R 차단제는 Th1 세포-매개된 응답의 체액적 양상을 차단하지 않는다. 또한, mLT-β-R-Fc-처리된 마우스로부터 취한 림프구의 증식성 응답은 감소되지 않는다(실시예 10; 도 7).
이들 실험은 본 발명의 LT-β-R 차단제의 투여에 기초한 치료법이 면역 반응의 Th2 의존성 항체 생성 기능에 유해한 영향을 미치지 않음을 보여주고 있다. 또한, 도 6에 예시된 항체 반응의 정상적인 패턴은 가용성 mLT-β-R-Fc를 이용한 집중 처리가 마우스에게 무해함을 나타내고 있는데, 이는 본 발명의 조성물 및 방법의 유용한 치료적 성질을 추가로 나타내는 것이다.
T 헬퍼 세포-매개된 질병
다수의 기관-특이성 자가면역 질환은 병리학적 Th1 반응에 연루되는 것으로 생각된다. 이들 자료는 문헌(Modlin 및 Nutman, Current Opinion in Immunol., 5, 511면~517면 (1993); Romagnani 등, Ann. Rev. Immunol., 12, 227면~257면 (1994))에 기재되어 있다. 이들 기관-특이성 자가면역 질환의 예로는 다발성 경화증, 인슐린-의존성 당뇨병, 교감성 안염, 방광염 및 건선을 들 수 있다.
인슐린-의존성 당뇨병은 인슐린-생성 베타 췌장 세포가 랑게르한스섬 내로의 백혈구 침윤에 의해 파괴되는 자가면역 질병이다. 당뇨병은 활성화된 전당뇨성 비장세포를 전이시키므로써 신생 비비만 당뇨성(NOD) 마우스에서 신속하게 유도될 수 있다. 최근에, 유전적으로 유사한 Th1-유사 세포 또는 Th2-유사 세포는 신생 NOD 마우스내로 전이되었다. Th1 세포만 거의 모든 수용자 내에서 신속하게 당뇨병을 유도하였다(Katz 등, Science, 268, 1185면~1188면 (1995)). 이는 생체 내에서 Th1 세포-매개된 면역 응답 효과를 억제할 수 있는 본 발명의 LT-β-R 차단제가 인슐린-의존성 당뇨병의 치료 또는 예방에 유용함을 의미하는 것이다.
여러 가지 관절염을 포함하는 몇몇 전신성 자가면역 질병은 Th1 세포와 관련 되어 있다. 류마티스성 관절염 및 스조르그렌 증후군(Sjorgren's syndrome)은 둘 다 Th0 및 Th1에 연루되는 것으로 생각된다. 대조적으로, 전신성 루프스 낭창(SLE)은 비정상적인 Th0/Th2 우세한 반응을 보유하는 것으로 생각된다.
또한, 몇몇 만성 염증성 질병도 비이상적인 Th1 유형의 응답을 보유하는 것으로 생각되는데, 이들의 예로는 염증성 장 질환, 폐 유육종증 및 타가이식 거부 반응을 들 수 있다. 인간의 염증성 장 질환(IBD)은 2개 이상의 카테고리, 즉 궤양성 대장염 및 크론병을 포함한다. 상기 질병 둘 다는 면역병리학적 자가면역 유사 질병으로 생각된다. IBD의 몇몇 마우스 모델에서, Th1 응답을 차단하는 몇몇 제제가 상기 질병의 발병 또는 진전을 차단할 수 있음은 명백하다(F. Powrie 등, Immunity 1: 553 (1994)). 면역 반응의 Th1 성분의 억제는 인간 IBD에서 유익한 효과를 나타낼 수 있다. IBD의 다수의 모델은 문헌[참조: Elson 등, Gastroenterology 109: 1344 (1995)]에 기재되어 있다. 상기 모델에는 3개 이상의 모델 군, 즉 화학적으로 유도된 유형, 중합체/미생물-유도된 유형 및 돌연변이 마우스를 이용하는 면역학적 유형이 존재한다.
보편적으로 사용되는 중합체/미생물-유도된 모델에서, 덱스트란 설페이트 용액은 마우스의 식수내에 투입되고, 소화시, 소화관의 외피 내면(lining)은 자극되어 손상에 대한 충분한 면역 반응을 유도한다. 상기 동물에서는 설사, 변기내의 혈흔, 체중 감소 및 결장 벽의 확장에 기인한 결장 길이의 단축으로 확인되는 대장염이 발병한다. 이 모델은 좌측 대장염 및 궤양성 대장염을 특징으로 하는 암을 유발할 수 있는 외피 형성 장애를 유발한다.
다른 모델은 선택된 한 세트의 CD4 T 세포를 스키드(scid) 마우스, 즉 T 및 B 세포가 결핍된 마우스내로 이식하는 것으로 이루어 진다(F. Powrie 등, International Immunology 5; 1461-1471 (1993); Morrissey 등, J. Exp. Med. 178: 237 (1993)). CD45RBhi라 칭하는 선택된 세포는 팽창하고, 스키드 마우스를 재구성하기 때문에, 자가반응성 T 세포의 출현을 방지하는 정상적인 메카니즘의 기능은 장애를 일으키고, 자가반응성 세포는 발육한다. 래트내에서, 다수의 기관과 반응성인 세포가 관찰되지만, 마우스에서의 반응성은 장 내에서 주로 발생한다. 자가반응성 세포가 팽창하고, 발육하는 방식을 변경하는 제제 또는 장을 공격할 수 있는 세포의 능력을 차단할 수 있는 제제가 본 모델에서 효과적일 것이다. 또한, 본 모델이 자가반응성 면역계 세포의 병리학적 발육을 적어도 부분적으로 모방하기 때문에, 본 모델을 차단하는 처리는 실제로 인간의 행동을 변경시키는 질병을 보유할 수 있을 것이다. 본 모델에서, TNF에 대한 항체는 질병을 차단하며(F. Powrie 등, Immunity 1, 552 (1994)), 이들 항체는 인간 질병의 치료에 효과가 있는 것으로 확인되었다(H. M. van Dullemen 등, Gastroenterology 109: 109 (1995)). 따라서, 본 모델은 IBD에서 치료학적으로 유용한 제제를 예견할 수 있다. 또한, CD45RB 모델은 Th1 매개된 질병 과정의 한 예이기 때문에, 실제로 쥐에서 상기 모델은 다수의 장기에서 질병을 유발하며, 이 체계 내에서 LTβR-Ig의 효과는 LTβR-Ig 또는 LTβR과 그의 리간드와의 상호작용을 차단하는 다른 수단이 관련된 광범위한 면역학적 질병에서 유익할 수 있다는 것을 의미하는 것이다.
일반적으로, 자가-항체 대 특이성 T 세포의 정확한 기여는 이들 자가 면역 질병에서 기술되어 오지 않았다. 세포성 응답은 초기 항체가 유도될 것이라 생각되는 이들 전신성 자가 면역 질병(예를 들어, 각종 관절염)에서 병원성에 대해 주요한 기여를 할 수 있다.
또한, 몇몇 병원성 감염제에 대한 정상적인 면역 반응은, 과도하여 그 자체가 의학적인 문제일 수 있는 Th1 응답을 이끌어 낸다. 심한 의학적 문제를 유도하는 육아종성 반응(전술한 DTH 응답의 클래스)의 예로는 나병, 결핵 환자의 폐에서 육아종의 형성, 유육종증 및 주혈흡충증을 들 수 있다(Roitta 등, Immunology, 22 5~6(모스비-이어 북 유럽 리미티드, 3판 1993)). 또한, 건선도는 Th1 세포에 의해 매개되는 것으로 생각된다.
또한, 세포용해성 T 세포, 즉 CTL(CD8 양성 T 세포)은 Th1- 및 Th2-유사 군집으로 하위 분류된다. 따라서, Th 군과 관련하여 공지된 많은 군집은 일차적으로 항비루스 및 이식된 조직 거부 반응에 연루된 CD8+ 세포에 적용할 수 있다.
LT-β-R 차단제를 이용한 치료
본 발명의 조성물은 언급한 특정 임상 질환을 치료하기 위한 효과적인 양으로 투여된다. 소정의 적용을 위해 바람직한 약학 제제의 결정 및 치료학적으로 효과적인 투여 방법은 당업자에게는 공지된 사항으로 예를 들어, 환자의 상태와 체중, 바람직한 치료 정도 및 치료에 대한 환자의 용인 등을 고려한다. 치료 양을 최적화하기에 적합한 최초 투여량은 가용성 LT-β-R 약 1 mg/kg으로 생각된다.
또한, 치료학적 유효 투여량의 측정은 1 내지 14일 동안 표적 세포(차단제에 따라 LT-β-R 또는 LT 리간드-양성 세포)를 코팅하는데 필요한 LT-β-R 차단제의 농도를 측정하는 시험관내 실험을 실시함으로써 평가할 수 있다. 본 명세서에 기술한 수용체-리간드 결합 분석을 이용하여 세포 코팅 반응을 조사할 수 있다. LT-β-R 또는 LT 리간드-양성 세포는 FACS를 이용하는 활성화된 림프구 군집으로부터 분리할 수 있다. 이들 시험관내 결합 분석 결과에 기초하여, 적합한 LT-β-R 차단제 농도 범위를 선택하여 본 명세서에 기술한 분석에 따라 동물에서 테스트할 수 있다.
본 발명의 가용성 LT-β-R 분자, 항-LT 리간드 및 항-LT-β-R Abs는 단독으로 또는 항체 또는 복합체의 분리된 형태 또는 정제된 형태, 그들의 염 또는 이의 약학적으로 허용가능한 유도체 등과 조합하여 면역억제 활성을 나타내는 제제의 통상적으로 허용되는 임의의 투여 방법을 이용하여 투여할 수 있다.
또한, 이들 치료법에 사용된 약학 조성물은 여러 가지 형태일 수 있다. 예를 들어, 이들은 고체, 반고체 및 액체 투여 형태, 예를 들어 정제, 알약, 산제, 액체 용액 또는 현탁액, 좌약 및 주사 또는 주입가능한 용액을 들 수 있다. 바람직한 형태는 의도하는 투여 경로 및 치료학적 적용에 따라 달라진다. 투여 경로의 예로는 경구, 비경구, 피하, 정맥내, 병소내 또는 국소 투여를 들 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 LT-β-R 분자, 항-LT 리간드 및 항-LT-β-R Abs는 흡수 또는 안정성을 촉진하는 보조인자와 함께 또는 단독으로 멸균 등장 제제 내에 위치시킬 수 있다. 상기 제제는 액체가 바람직하나, 동결건조된 분말일 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 가용성 LT-β-R 분자, 항-LT 리간드 및 항-LT-β-R Abs는 시 트르산 일수화물 5.0 mg/㎖, 시트르산 삼나트륨 2.7 mg/㎖, 만니톨 41 mg/㎖, 글리신 1 mg/㎖ 및 1 mg/㎖의 폴리소르베이트 20을 포함하는 제제 완충액으로 희석할 수 있다. 상기 용액은 동결건조할 수 있으며, 냉장 저장할 수 있으며, 멸균 주사용수(USP)를 이용하여 투여전에 재구성할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 당업계에 널리 알려진 통상적인 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것이 바람직하다(맥 출판사에서 1980년에 출판한 레밍톤 약학 (16판)). 이러한 약학적으로 허용가능한 담체는 인간 혈청 알부민 또는 혈장 제제와 같은 기타 약제, 담체, 유전 담체, 보조제, 부형제 등을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 단위 투여 형태가 바람직하며, 1일 1회 이상 투여할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 미소구, 리포좀, 기타 미립자 전달 시스템 또는 서방형 제제로 투여할 수 있는데, 영향받은 조직 또는 혈류위치, 그 근처와 소통할 수 있는 위치 또는 그 위치의 근처에 투여한다. 서방형 담체의 적합한 예로는 좌약 또는 마이크로캡슐과 같은 성형된 제품 형태의 반투과성 중합체 매트릭스를 들 수 있다. 이식가능한 또는 마이크로캡슐 서방형 매트릭스로는 폴리락티드(미국 특허 3,773,319; 유럽 특허 58,481), L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트의 공중합체(Sidman 등, Biopolymers, 22, 547면∼556면 (1985)); 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 에틸렌 비닐 아세테이트(Langer 등, J. Biomed. Mater. Res., 15, 167면∼277면 (1981); Langer, Chem. Tech., 12, 98면∼105면 (1982))를 들 수 있다.
본 발명의 가용성 LT-β-R 분자, 항-LT 리간드 및 항-LT-β-R Abs를 단독 또 는 함께 조합하여 함유하는 리포좀은 널리 공지된 방법으로 제조할 수 있다[참조: 예를 들어, DE 3,218,121; Epstein 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 3688면∼3692면 (1985); Hwang 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 4030면∼4034면 (1980); 미국 특허 4,485,045 및 4,544,545]. 보편적으로 리포좀은 작은(약 200-800 Å) 단층형이며, 이의 지방 함량은 약 30 몰% 이상의 콜레스테롤이다. 콜레스테롤의 분율을 적절히 선택하므로써 가용성 LT-β-R 분자, 항-LT 리간드 및 항-LT-β-R Abs 방출의 최적 속도를 조절한다.
또한, 본 발명의 가용성 LT-β-R 분자, 항-LT 리간드 및 항-LT-β-R Abs는 기타 LT-β-R 차단제, 면역억제제 또는 시토킨을 함유하는 리포좀에 부착하여 LT-β-R 차단 활성을 조절할 수 있다. 리포좀에 대한 가용성 LT-β-R 분자, 항-LT 리간드 및 항-LT-β-R Abs의 부착은 표적화된 전달을 위해 항체에 독소 또는 화학치료제를 커플링하기 위해 널리 사용되는 이종 2작용기 가교결합제와 같은 임의의 공지된 가교결합제를 이용하여 수행할 수 있다. 또한, 리포좀에 대한 접합은 탄수화물-유도된 가교 시약 4-(4-말레이미도페닐)부티르산 하이드라지드(MPBH)를 이용하여 수행할 수 있다(Duzgunes 등, J. Cell. Biochem. Abst. Suppl. 16E 77 (1992)).
LT-β-R 차단제를 포함하는 치료 조성물의 잇점
본 발명의 LT-β-R 차단제는 Th1 세포 의존성 면역 작동인자 메카니즘을 선택적으로 억제할 수 있으나, Th2 세포-매개된 면역 작동인자 메카니즘은 억제할 수 없다. LT-β-R 차단제는 Th1 형 시토킨(예를 들어, IL-2 및 TFN-γ)의 활성에 의해 악화되는 질환을 치료하는데 유용할 것이다. Th1 시토킨이 Th2 세포-의존성 응답을 억제할 수 있기 때문에, LT-β-R 차단제도 Th1-유도된 시토킨 증배계에 의해 정상적으로 억제되는 특정 Th2 세포-의존성 응답을 간접적으로 자극할 수 있다.
Th1을 선택적으로 억제할 수 있는 (또는 Th2를 간접적으로 자극할 수 있는) 능력은 여러 가지 자가면역 질병 및 만성 염증성 질환, 항원 용인 및 조직 이식편 및 기관 이식물에 대한 세포성 거부 반응을 포함하는 다양한 세포-매개된 면역 반응에서의 이상을 치료하는데 유용할 것이다.
전술한 바와 같이, Th1 세포계 면역학적 질환은 일반적으로 여러 가지 세포 유형 및 면역학적 반응에 대한 다면성 효과를 보유하는 면역 조절제 및 면역 억제제를 사용하여 치료한다. 이들 비특이성 면역 억제제는 일반적으로 유해한 부작용을 야기시키는 높은 투여량 및 종종 세포독성 투여량을 필요로 한다.
면역학적 응답의 특징을 변경시킬 수 있는 능력은 상기한 마우스 당뇨병의 최근 연구(Katz 등, Science, 268, 1185면∼1188면 (1995)) 및 동종이인자형 이식 모델(Sayegh 등, J. Exp. Med., 181, 1869면∼1874면 (1995))에 의해 지지된다. 후자의 연구에서, CD28-B7 T 세포 동시자극성 경로를 차단하는 융합 단백질은 신장 이식 용인을 유도하는 것으로 확인되었다. 상기 용인은 생체 내에서 Th1 시토킨의 감소 및 Th2 시토킨의 증가와 관련되어 있다. 이들 자료는 본 발명의 LT-β-R 차단제가 Th1 세포-매개된 시토킨 방출을 억제하므로써 조직 이식편 및 장기 이식물의 세포성 거부 반응을 억제하는데 유용할 것이라는 것을 의미한다.
본 발명의 조성물과 방법의 LT-β-R 차단제는 치료하려는 질환, 장애 또는 질병에 따라 개질하여 LT-β-R 시그널링의 바람직한 수준을 획득할 수 있다. LT-β -R 시그널링의 절대 수준은 그들 각각의 분자 표적에 대한 LT-β-R 차단제의 농도 및 친화성을 조작하므로써 미세 조절하도록 강구할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 한 구체예에서, 가용성 LT-β-R 분자를 포함하는 조성물이 검체에 투여된다. 상기 가용성 LT-β 수용체는 표면 LT 리간드를 결합하기 위해 세포 표면 LT-β 수용체와 효과적으로 경쟁한다. 표면 LT 리간드와 경쟁할 수 있는 능력은 가용성 LT-β-R 분자와 세포 표면 LT-β-R 분자의 상대적인 농도 및 그들의 리간드 결합에 대한 상대적 친화성에 따라 달라진다.
변종 가용성 LT-β-R의 표면 LT 리간드와의 결합 친화성을 증가 또는 감소시키는 돌연변이를 보유하는 가용성 LT-β-R 분자는 당업자에게 공지된 표준 재조합 DNA 기법을 이용하여 제조할 수 있다. 위치 지시된 또는 무작위 돌연변이를 보유하는 다수의 분자는 본 명세서에 기술한 통상적인 실험 및 기법을 이용하여 LT-β-R 차단제로서 작용하는 그들의 능력에 대해 테스트할 수 있다.
유사하게, 본 발명의 다른 구체예에서, LT-β 수용체 또는 하나 이상의 LT 리간드 서브유니트에 대해 유도된 항체는 LT-β-R 차단제로서 작용한다. 이들 항체의 LT-β 수용체 시그널링을 차단할수 있는 이들 항체의 능력은 돌연변이, 화학적 변경 또는 검체에 전달된 항체의 유효 농도 또는 활성을 변화시킬 수 있는 기타 방법에 의해 변경시킬 수 있다.
LT-β-R 시그널링을 완전히 억제하지 않고 LT-β-R 시그널링을 감소시킬 수 있는 능력은 과장되었거나 비정상적인 Th1-세포 매개된 응답을 억제하면서 정상적인 면역 기능을 지지하는 LT-β-R 시그널링의 감소된 수준을 확립 또는 유지하기 위해 중요할 수 있다.
마우스 내에서 LT-α 유전자의 파괴는 비정상적인 주변 림프성 기관 발육을 유도한다(De Togni 등, Science, 264, 703면∼707면 (1994)). 이러한 마우스는 림프 결절이 결핍되어 있고, 그들의 비장은 여포 내에서 T 세포 풍부 영역과 B 세포 풍부 영역사이의 통상적으로 투명한 분획이 결핍되어 있다. 본 발명자들은 이러한 표현형이 표면 LT-유도된 LT-β-R 시그널링의 상실과 관련이 있는 것으로 생각하였는데, 그 이유는 유사한 표현형이 TNF-R 활성을 조절하므로써 관찰되지 않기 때문이다. 따라서, 선택적으로 또는 부분적으로 LT-β-R 경로를 차단할 수 있는 능력은 LT-β-R 경로에 의한 시그널링의 오발현 또는 과발현과 관련된 비정상적인 림프성 기관 발육을 치료하는데 유용할 수 있다.
몇몇 Th1-관련된 반응은 세포-매개된 다수의 면역 반응의 중요한 성분이며(Romagnani, S., Ann. Rev. Immunol., 12, 227면∼257면 (1994)), Th1 세포 활성의 절대 억제는 특정 환경 하에서 바람직하지 않을 수 있다. 예를 들어, 마우스는 양호한 Th1 반응이 개시될 수 있는 경우, 기생충 반응을 효과적으로 억제할 수 있다. 또한, 리스테리아 또는 톡소플라즘과 같은 감염제도 강한 Th1계 반응을 유도한다. 인간에서, 미코박테리움 투베르쿨로시스(mycobacterium tuberculosis) 반응은 Th1 계인 것으로 생각된다. 레슈마니아증 병원성은 마우스에서 특징적인 Th1 반응과 유사한 반응과 관련되어 있다(Reed 및 Scott, Current Opinion in Immunol., 5, 524면∼531면 (1993)).
LT-β-R 시그널링을 차단하므로써 Th1 억제의 수준에 영향을 미칠 수 있는 능력은 본 발명의 LT-β-R 차단제를 이용하는 치료에 의해 획득될 수 있는 이로운 결과를 최대화하는데 중요할 수 있다.
이하, 본 발명의 가용성 LT-β 수용체, 항-LT 리간드 및 항-LT-β-R 항체 및 이들을 특정화하는데 사용되는 방법을 예시하는 실시예를 기술한다. 이들 실시예는 단지 예시만을 목적으로 하는 비제한적인 것이며, 본 발명은 첨부하는 특허 청구의 범위에 의해서만 한정된다.
실시예
실시예 1
면역글로불린 Fc 융합 단백질로서 가용성 인체 LT-β 수용체의 제조
체세포 하이브리드(Baens 등, Genomics, 16, pp. 214-18 (1993))로부터 유도한 인체 12p 전사된 서열의 라이브러리에서 분리된 인체 cDNA 클론의 서열은 진뱅크 내로 도입하고, 후에 인체 LT-β-R을 암호화하는 서열로 동정하였다. 이 전장 인체 LT-β-R cDNA 클론의 서열은 1992년 이래 진뱅크 엔트리 L04270으로 사용할 수 있다.
횡막 영역까지의 LT-β-R의 외세포성 영역(도 1)은 5' 및 3' 단부 각각에 NotI 및 SalI 제한 효소 위치를 혼입한 프라이머를 이용하여 cDNA 클론으로부터 PCR로 증폭하였다(Browning 등, J. Immunol., 154, 33면∼46면 (1995)). 상기 증폭된 생성물은 NotI 및 SalI으로 절단하고, 정제하고, 인체 IgG1의 Fc 영역을 암호화하는 SalI-NotI 단편과 함께 NotI-선형화된 벡터 pMDR901내로 연결하였다. 생성된 벡터는 별도의 촉진 인자로부터 유도된 디히드로폴레이트 리덕타제 유전자 및 LT- β-R-Fc 융합 단백질을 함유하였다.
상기 벡터는 전기적 천공법으로 CHO dhfr- 세포내로 도입하고, 메토트렉세이트-내성 클론을 표준 방법에 따라 분리하였다. 상기 LT-β-R-Fc는 배지 내로 분비되었으며, ELISA 분석법을 이용하여 최고 수준의 수용체 융합 단백질을 생성하는 세포주를 선택하였다. 고생성 세포주는 다수로 증식하였으며, 처리된 배지를 수집하였다. 순수한 LT-β 수용체 융합 단백질은 단백질 A 세파로즈 패스트 플로우 친화성 크로마토그래피(파마시아)를 이용하여 분리하였다.
실시예 2
면역글로블린 Fc 융합 단백질로서 가용성 쥐 LT-β 수용체의 제조
mLT-β-R의 완전한 cDNA 클론은 2개의 부분 cDNA 분리체로부터 취한 5' NotI/ApaLI 및 3' ApaLI/NotI 단편을 pCDNA3(미국, 캘리포니아, 샌디에고에 소재하는 인비드로겐)의 NotI 위치내로 연결하므로써 제조하였다. 상기 cDNA 클론의 서열은 진뱅크 엔트리 U29173으로 사용할 수 있었다. 진뱅크 엔트리 L38423에서 확인된 mLT-β-R에 대한 다른 서열 엔트리와 비교시, 암호 서열 차이점은 발견할 수 없었다.
가용성 mLT-β-R(hIgG1) 융합 단백질은 주형으로 전장 mLT-β-R cDNA 클론을 이용하고, 프라이머로서 5'AACTGCAGCGGCCGCCATGCGCCTGCCC3' 및 5'GACTTTGTCGACCATTGCTCCTGGCTCTGGGGG3' 을 이용하는 PCR 증폭으로 제조하였다. 증폭된 생성물은 정제하고, NotI 및 SalI로 절단하고, SalI/NotI 인체 IgG1 Fc 단편 과 함께 NotI-선형화되고, 포스파타제-처리된 SAB132 내로 연결하여 JLB 122 를 형성하였다. 안정한 발현을 위해, mLT-β-R-Fc 단편을 함유하는 NotI 카세트는 PSH001을 형성하는 pMDR901의 NotI 위치내로 이전하고, 상기 벡터는 CHO 세포내로 형질감염하였다(Browning 등, J, Immunol., 154, pp. 33면∼46면 (1995)). mLT-β-R-Fc를 분비하는 세포 클론은 ELISA 분석법으로 동정하였다. 정제된 수용제 융합 단백질은 단백질 A 세파로즈 패스트 플로우 크로마토그래피(파마시아)를 이용하여 CHO 세포 상청액으로부터 분리하였다.
실시예 3
LT-β 수용체-리간드 상호작용을 차단하기 위한 가용성 인체 LT-β-R-Fc의 이용
가용성 hLT-β-R-Fc는 상기한 종양 세포 세포독성 분석에서 LT-β 수용체에 결합하는 LT 리간드를 차단할 수 있는 능력에 대해 테스트하였다. 이 분석에서, LT-β-R 시그널링을 활성화하는 LT 리간드의 가용성 형태(hLT-α1/β2)는 인체 종양 세포를 사멸시키는데 사용한다. LT-β-R 시그널링의 억제제는 LT-β-R-유도된 종양 세포 세포 독성을 감소시킬 수 있다.
가용성 LT-α1/β2 리간드는 기능적 횡막 영역이 결핍된 절단(truncation) 또는 변형된 LT-β 서브유니트를 포함하였다. 가용성 LT-α1/β2 리간드는 LT-β-R 뿐만 아니라 LT 리간드의 표면 형태에 결합하고, LR-β-R 시그널링 뿐만 아니라 LT 리간드의 표면 형태를 자극한다(Browning 등, J. Immunol., 154, 33면∼46면 (1995)).
hLT-α1/β2, hTNF 또는 hLT-α의 일련의 희석물은 96웰 평판에서 0.05 ㎖내에서 제조하였으며, 5000개의 트립신 처리된 HT29 세포(ATCC)를 hu-IFN-γ 80 U/㎖(항비루스 유니트)를 함유하는 0.05 ㎖ 배지내에 첨가하였다. 4일후, 염료 MTT의 미토콘드리아 감소를 하기와 같이 측정하였다: MTT 10 ㎕를 첨가하고, 3시간 후, 감소된 염료를 10 mM HCl과 함께 이소프로판올 0.09 ㎖를 이용하여 용해시키고, 550 nm에서 광학 밀도를 측정하였다. 가용성 수용체 형태 또는 순수한 인체 IgG를 상기 세포의 첨가 이전에 10 ㎕ 첨가하여 최종 농도를 5 ㎍/㎖로 하였다.
하기 표 1은 HT29 종양 세포 증식에 대한 여러 가지 가용성 TNF 및 LT 리간드의 억제 효과를 차단할 수 있는 hLT-β-R-Fc 및 p55-TNF-R-Fc 키메라(대조용으로서 인체 IgG와 함께)의 능력을 비교한다.
HT29 증식에 대해 여러 가지 TNF 및 LT 리간드의 억제 효과를 차단할 수 있는 LT-β-R 및 p55-TNF-R 면역글로블린 융합 단백질의 능력
50% 성장 억제를 야기하는 세포독성 제제의 농도(ng/㎖)
세포독성 제제 hu-IgG 대조용의 존재 하에서a p55-TNF-R-Fc의 존재 하에서a LT-β-R-Fc의 존재 하에서a
TNF 0.08 ＞10b 0.08
LT-α 3 ＞1000 3
LT-α1/β2 5 5 ＞200
a 각각의 세포독성 제제는 상기 세포에 첨가하기 이전에 10분 동안 Ig 융합 단백질과 예비 혼합함. 융합 단백질의 최종 농도는 5㎍/㎖임. b 더 높은 농도는 테스트하지 않음.
상기 표 1의 자료로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 가용성 인체 LT-β-R 융합 단백질(hLT-β-R-Fc)는 LT 리간드(LT-α1/β2)와 세포 표면 LT-β 수용체와의 상호작용을 효과적으로 차단할 수 있었으며, 따라서 이는 본 발명에 따른 LT-β-R 차단제였다.
예상되는 바와 같이, 가용성 TNF-R 융합 단백질(p55-TNF-R-Fc)은 TNF에 결합하고, 표면 TNF 수용체와 그의 상호작용을 예방하므로써 TNF-유도된 증식 억제를 완전히 차단하였다. 이 가용성 TNF 수용체는 LT 리간드-매개된 항-증식 효과에 대한 영향이 없었다. 대조적으로, LT-β-R-Fc는 LT 리간드-유도된 세포독성 효과를 차단하였으나, TNF 또는 LT-α 유도된 세포독성 효과는 차단하지 않았다. 따라서, 가용성 인체 LT-β-R 융합 단백질은 TNF 및 LT-α 리간드에 의한 TNF-R 활성화를 방해하지 않았다.
실시예 4
마우스 LT-β 수용체-리간드 상호작용을 차단하기 위한 가용성 쥐 LT-β-R-Fc의 이용
인체 IgG1 Fc 영역(mLT-β-R-Fc; 실시예 2 참조)에 커플링된 가용성 쥐 LT-β 수용체는 마우스 세포에 대한 세포독성 분석법을 이용하여 마우스 내에서 LT-β 수용체-리간드 상호작용을 차단할 수 있는 능력에 대해 테스트하였다(도 2). 상기 세포독성 분석은 실시예 3에 기술된 HT29 세포 분석에서 사용되었던 것과 본질적으로 동일한 방법을 이용하여 WEHI 164 세포에 대해 수행하였다[참조: Browning 및 Ribolini, J. Immunol., 143, 1859면∼1867면 (1989)].
도 2는 마우스 WEHI 164 세포에서 리간드-유도된 LT-β-R 시그널링에 대한 mLT-β-R-Fc의 효과를 나타낸다. 이 분석에서 확인할 수 있는 바와 같이, WEHI 164 세포는 이들을 약 1 내지 100 ng/㎖ 범위의 농도로 LT-α/β 리간드로 처리하므로써 치사시켰다. 가용성 mLT-β-R-Fc(10 μ/㎖)는 LT-리간드 활성화된 세포 사멸을 차단하였다. 마우스 가용성 p55-TNF-R-Fc 융합 단백질 또는 IgG 대조용 항체(각각 10 μ/㎖)를 첨가하는 것은 세포 사멸을 차단하는데 거의 영향이 없거나 또는 전혀 없었다. 이들 자료로부터 확인할 수 있는 바와 같이, mLT-β-R-Fc 융합 단백질은 LT 리간드 결합에 대해 표면 LT-β-R 분자와 효과적으로 경쟁할 수 있다. 또한, 이들 자료로부터 확인할 수 있는 바와 같이, LT-α/β-유도된 세포독성은 LT-β-R-매개되며, 본 발명에 따른 LT-β-R 차단제로 작용하는 가용성 mLT-β-R-Fc에 의해 억제될 수 있다.
실시예 5
LT-β 수용체-리간드 상호작용을 차단하기 위한 항-인체 LT-β-R 항체의 이용
인체 LT-β 수용체에 대해 유도된 마우스 단일클론 항체(mAbs)는 보조제 부재하에서 단백질 A 세파로즈 비드에 부착된 CHO 세포-유도된 hLT-β-R-Fc 융합 단백질을 이용하여 반복적으로 RBF 마우스를 복막내 면역화하므로써 제조하였다. 동물은 최종적으로 가용성 hLT-β-R-Fc를 이용하여 복막내 및 정맥내로 추가 항원 자극하고, 비장 세포는 전통적인 방법으로 융합하고, 하이브리도마 상등액은 ELISA로 선별하였다(Ling 등, J. Interferon and Cytokine Res., 15, 53면∼59면 (1995)). 하이브리도마 상등액은 세포 패닝(panning) 분석법에서 LT-β-R-Fc 코팅된 평판에 대한 표면 LT-α1/β2를 발현하는 활성화된 II-23 하이브리도마 세포의 결합을 차 단할 수 있는 능력에 대해 추가 선별하였다. 순수한 mAbs는 배양 상청액으로부터 IgG의 단백질 A 세파로즈 정제(파마시아)에 의해 제조하였다.
가용성 LT의 결합에 의해 개시된 LT-β-R 시그널링을 항-LT-β 수용체 mAb가 차단할 수 있는가를 확인하기 위해, WiDr 인체 암세포를 이용하여 종양 세포의 세포독성 분석법을 수행하였다. 상기 세포독성 분석에서, LT-α1/β2의 일련의 희석물은 96웰 평판 내의 0.05 ㎖에서 제조하였으며, 대조용 마우스 IgG1 mAb 또는 항-LT-β 수용체 mAb를 함유하는 100 ㎍/㎖ 용액중 10 ㎕를 첨가하였다. 이어서, 5000 트립신 처리된 WiDr 세포(ATCC)를 각 웰의 hu-IFN-γ 50 U/㎖(항비루스 유니트)를 함유하는 배지 0.05 ㎖내에 첨가하였다. 4일 후, 염료 MTT의 미토콘드리아 감소는 하기와 같이 측정하였다: MTT 10 ㎕를 첨가하고, 3시간 후, 감소된 염료를 10 mM HCl과 함께 이소프로판올 0.09 ㎖를 이용하여 용해시키고, 550 nm에서 광학 밀도를 측정하였다. 자주색의 양은 세포 증식량과 비례하였다.
도 3은 항-LT-β-R mAb BDA8이 본 발명에 따른 LT-β-R 차단제로 작용함을 나타내고 있다. 인체 WiDr 암세포는 IFN-γ 및 가용성 LT-α1/β2 리간드(약 0.05 내지 50 ng/㎖)의 존재하에서 성장이 정지하였다. IgG1 대조용 항체(10 ㎍/㎖)는 이 성장 억제에 영향을 미치지 않았다. 대조적으로, 항-LT-β-R mAb BDA8(10 ㎍/㎖)은 가용성 LT-α1/β2 리간드의 존재 하에서 성장할 수 있는 WiDr 세포의 능력을 회복하였다.
실시예 6
수용체-리간드 상호작용을 차단하기 위한 항-인체 LT-β 항체의 이용
항-인체 LT-β mAbs는 CFA 내의 약 1 내지 2 ㎍의 인체 재조합 LT-β를 함유하는 세척된 단백질 A 세파로즈-9E10-rLT-β 비드를 이용하여 RBF 마우스를 면역화하고, 이어서 IFA 내의 동일물로 1회 추가 항원 자극하여 제조하였다. 최종 항원 자극하고 8주가 경과한후, 마우스에게 정제된 가용성 rLT-β(9E10 수지로부터 산 용출함) 30 ㎍을 정맥내 주입하고, 2일 후에 동일한 가용성 물질 20 ㎍을 주입하였다. 두 번째 정맥내 추가 항원 자극하고 1일이 경과한후, 비장 세포는 전통적인 방법으로 융합하여 mAbs를 생성하였다. 하이브리도마 상청액은 ELISA 또는 PMA-활성화된 II-23 세포의 FACS 염색으로 직접 선별하였다. 순수한 mAbs는 배양 상청액으로부터 IgG의 단백질 A 세파로즈 패스트 플로우 정제(파마시아)에 의해 제조하였다.
FACS 분석법은 세포 표면 상에서 LT-β 수용체에 대한 가용성 LT-α/β 리간드의 결합을 효과적으로 차단할 수 있고, 따라서 생체 내에서 두 세포 사이의 상호작용을 모방하는 LT-β에 대해 유도된 항체를 선택하는데 사용하였다. 이 분석법에서, 가용성 인체 LT-β-R-Fc(2 ㎍/㎖)는 농도가 증가하는(0.02 내지 20 ㎍/㎖) 테스트 항-LT-β mAb의 존재하에서 PMA-활성화된 II-23 세포 상의 표면 LT 리간드에 대한 결합이 가능하였다(Browning 등, J. Imminol., 154, 33면∼46면 (1995)). 상기 세포를 세척하고, 결합된 LT-β-R-Fc는 피코에리트린-표지된 당나귀 항-인체 IgG와의 반응에 의해 검출하였다. 결합된 형광 표지의 양은 FACS 분석으로 측정하였으며, 평균 형광 강도를 플롯하였다.
도 4는 상기한 바와 같이 LT-β 수용체-리간드 상호작용을 차단할 수 있는 항-LT-β mAb B9의 능력을 측정한 FACS 분석법의 결과를 나타낸다. 이 실험으로 확인할 수 있는 바와 같이, 항-LT-β mAb B9(0.02 내지 5 ㎍/㎖)는 가용성 LT-β-R 융합 단백질(2 ㎍/㎖)과의 세포 표면 LT 리간드 결합을 특이적이고, 효과적으로 경쟁하였으며, 따라서 본 발명의 LT-β-R 차단제로서 적격이었다.
실시예 7
수용체-리간드 상호작용을 차단하기 위한 항-마우스 LT-α/β 항체의 이용
가용성 마우스 LT-α/a 복합체는 가용성 인체 LT-α/β 복합체에 대해 기술한 것과 같이 제조하였다. 가용성 마우스 LT-a 서브유니트는 이미 기술한 서열 정보에 기초하여 제조하였다(Lawton 등, J. Immunol., 154, 239면∼246면 (1995)). 가용성 쥐 LT-α/a 복합체는 바쿨로비루스/곤충 세포 발현 시스템을 이용하여 발현시키고, LT-α/a 복합체는 인체 주로 LT-α/a 복합체의 발현 및 정제에 대해 상기한 바와 같이 인체 p55 TNF-R 및 LT-a-R 칼럼을 이용하여 친화성 크로마토그래피를 이용하여 분리하였다. 아르메니안 햄스터는 주로 실시예 6에 기술한 방법으로 정제된 쥐의 가용성 LT-α/β 복합체를 이용하여 면역화하였다. 햄스터 비장 세포는 문헌[참조: Sanchez-Madrid 등, Methods of Enzymology, 121, 239면∼244면 (1986)]에 기재된 바와 같이 마우스 P3X 하이브리도마 세포주에 융합시켰다. 하이브리도마는 LT-α/a 복합체 또는 LT-α단독 각각에 대한 그들의 결합 특성을 기초하여 항-mLT-a 또는 항-mLT-α로 분류하였다. 하이브리도마 세포는 팽창했고, 항체는 단백질A 친화성 크로마토그래피(파마시아)를 이용하여 배양 상등액으로부터 정제했다.
햄스터 항-마우스 LT-α 및 LT-β mAbs가 mLT-a-R에 대한 LT 리간드 결합을 차단할 수 있는가를 평가하기 위해, 본 발명자들은 7시간 동안 PMA 활성화후 표면 LT 리간드를 발현하는 쥐의 T 세포주인 TIMI-4 세포(ATCC)를 이용하였다. 햄스터 항-mLT-α 또는 항-mLT-β mAbs는 4℃에서 30분 동안 상기 세포와 함께 예비배양하였으며, 이어서 2회 세척하였다. 세척된 세포는 mLT-β-R-Fc 1 ㎍/㎖와 함께 4℃에서 배양하였다. 30분 후, 세포는 미결합 mLT-β-R-Fc 없이 세척하였으며, 이어서 피코에리트린-표지된 당나귀 항-인체 IgG 10 ㎍/㎖와 함께 30분 동안 배양하여 결합된 mLT-β-R-Fc를 검출하였다. 결합된 형광 표지의 양은 FACS 분석법으로 측정하였으며, 평균 형광 강도를 계산하였다.
이 분석을 이용하여, 햄스터 항-mLT-a mAb는 T 세포 표면 LT 리간드에 대한 가용성 LT-β 수용체 결합을 효과적으로 차단함을 확인하였다. 결과는 하기 표 2에 나타냈다.
쥐의 표면 LT 리간드에 대한 mLT-β-R-Fc 결합을 억제할 수 있는 항-마우스 LT-β 모노클로날 항체의 능력
항-mLT-a(BB.F6) 항-mLT-α(AF.B3)
mAb 농도 (㎍/㎖) MFCIb 억제율(%) MFCIb 억제율(%)
0 6 - 6 -
0 85 0 85 0
0.01 71 18 84 2
0.03 67 23 86 0
0.1 51 44 86 0
0.3 36 62 84 2
1.0 29 71 89 0
3.0 17 86 88 0
10.0 11 94 95 0
30.0 10 95 94 0
100.0 8 98 92 0
a 수용체 첨가하지 않음 b 평균 형광 채널 번호
실시예 8
LT-β-R 차단제는 마우스에서 Th1-매개된 접촉성 과민증을 억제한다.
체중이 20 g인 Balb/c 암컷 마우스(미국, 메인, 하버, 바에 소재하는 잭슨 레버래토리즈)는 4:1 v/v 아세톤:올리브유 내에 0.5% 2,4-디니트로플루오로벤젠(DNFB) 25 ㎕를 뒷 발바닥에 적용하여 초기 감작시켰다. 초기 감작 24시간후, 본 발명자들은 동일한 용액 25 ㎕를 이용하여 재감작하였다. 감작은 마취하지 않은 마우스를 감금한 상태에서 수행하였다. 5일(초기 감작후 120 시간이 경과)후, 본 발명자들은 90:10 mg/kg 케타민:크실라진을 이용하여 (복막내)마취시키고, 하위 자극량으로 0.2% DNFB 10 ㎕를 좌측 귀의 전면과 이면에 적용하였다. 우측 귀에는 4:1 v/v 아세톤:올리브유 비히클을 유사하게 적용하였다.
면역 응답을 유도하고 4 시간이 경과한후, 본 발명자들은 인산염 완충처리된 염수(PBS) 0.1 ㎖내의 mLT-β-R-Fc의 농도를 증가시키면서(0.08 내지 5.0 mg/kg; 실시예 2) 정맥내 주입하였다. PBS 완충액 단독 또는 인체 IgG 융합 단백질(LFA3-Fc)(Miller 등, J. Exp. Med., 178, 211면∼222면 (1993))의 주입은 음성 대조용으로 사용하였다. 항원 투여 위치 내로 T 세포의 유입을 차단하므로써 CHS를 억제하는 것으로 공지된 항-VLA4-특이성 mAb[PS/2 mAb; Chisolm 등, Eur. J. Immunol., 23, 682면∼688면 (1993)] 8 mg/kg의 주입은 양성 대조용으로 사용하였다. 4 내지 8 마리의 마우스로 이루어진 군들은 항체 농도에 따라 처리하였다.
항원 투여후 24 시간이 경과한후, 마우스는 케타민:크실라진을 이용하여 다시 마취시키고, 정확도가 10-4 인치인 마이크로미터를 이용하여 양쪽 귀의 두께를 측정하였다. 각 마우스에 대한 귀 종창 반응은 그의 대조용- 및 DNFB-투여된 귀 두께의 차이만큼이었다. 전형적으로 억제되지 않은 귀 종창 반응은 95 내지 110 x 10-4 인치였다. 귀 종창 반응의 억제는 그들의 음성 대조군과 처리군을 비교하여 판단하였다. 처리군 사이의 차이의 통계학적 중요성은 p＜0.05를 이용하는 터키-크라머 아니스트리 시그니피컨트 디퍼런스(Tukey-Kramer Honestly Significant Difference; JMP, SAS 인스티튜트)의 연산을 수반하는 변이의 일방향 분석을 이용하여 평가하였다.
도 5는 농도를 증가시키면서 수행하는 mLT-β-R-Fc의 투여는 억제되지 않은 DNFB-처리된 대조용 동물(PBS 및 LFA3-Fc)과 비교하여 DNFB-처리된 마우스의 귀 종 창 반응의 현저한 감소를 야기시킴을 나타내고 있다. 가용성 LT-β-R(약 1 내지 5 mg/kg)은 억제제인 항-VLA4-특이성 mAb 만큼 효과적으로 상기 접촉성 DTH 반응을 차단할 수 있었다. 억제되지 않은 상기 귀 종창 분석의 분율은 "비특이성" 과립구 침윤에 기인하는 것으로 생각된다.
실시예 9
덱스트란 설페이트 용액(DSS) IBD 모델
마우스는 도면의 설명 부분에서 기술한 바와 같이 hLFA3-Ig를 이용하여 처리하는데, 즉 대조용 Ig 융합 단백질 또는 mLTβR-Ig를 정맥내 주입하였다. 0일에, 식수를 5% 덱스트란 설페이트 용액으로 변경하였으며, 마우스는 1주일 동안 상기 유체에 방치하였다. 1주일후, 즉 DSS 투여를 개시하고 2주일이 경과한후, 마우스를 희생시키고, 중량 변화 및 대장 길이(항문에서 맹장까지)를 측정하였다. 도 __은 여러 가지 처리를 수행한 후의 중량 변화 및 대장 길이를 나타낸다. 짧아진 장 길이 뿐만 아니라 중량 손실은 IBD의 지표이다. mLTβR-Ig 처리는 효율을 나타내는 중량 손실 및 결장 단축을 현저히 예방하는 것으로 보여졌다.
도 6: 각종 처리후 식수 내의 DSS 투여를 개시하고 14일이 경과한후 관찰된 중량 변화. Veh 는 비히클을 의미하며, LTBr 및 LFA3은 DSS를 첨가하기 1주일전, DSS 투여시 및 1주일후(즉, -1, 0 및 1주에 3회 주입)에 100 ㎍을 정맥내 주입으로 투여한 mLTβR-Ig 및 hLFA3-Ig 융합 단백질을 의미한다. 1개군은 10마리의 동물로 구성되었다.
도 7: 도 6의 각종 처리후 DSS를 투여하고 14일이 경과한후의 결장 길이.
실시예 10
IBD의 CD45RB hi /스키드 모델
CD4 양성 T 세포는 이미 기술한 자기 비드 기법을 이용하여 C.B-17 암컷 마우스로부터 분리하였다(F. Powrie 등, International Immunology 5: 1461-1471 (1993)). 이어서, CD8 양성 T 세포, B 세포 및 단핵구가 결실된 CD4 세포는 역시 주로 이미 기술한 바와 같이 CD45RBhi 및 CD45RBlow 군집으로 분류되는 형광 활성화된 세포에 의해 분류하였다. 5 x 105 CD45RB 세포는 C.B-17 스키드 마우스 내로 정맥내 주입하였으며, 상기 마우스의 체중을 측정하였다. CD45RBlow 세포로 재구성된 동물은 정상적인 방법으로 중량을 수득하였다. 대조적으로, CD45RBhi 세포를 수용한 동물은 결국 중량을 상실하였으며, 10주에 거의 죽은 상태였다. 대조용 마우스는 최초 체중의 약 20%를 상실하는 경우, 희생시켜, 조직학적으로 각종 장기를 분석하였다. 전형적으로, 악액질성으로 보이는 질병을 앓고 있는 동물은 설사가 있었으며, 결장 및 맹장이 현저하게 커졌다. 도면의 설명 부분에서 기술한 바와 같이 hLFA3-Ig로 처리한 동물은 미처리한 동물과 유사한 반면, mLTβR-Ig으로 처리한 동물은 체중이 감소되지 않았으며, 결장의 크기도 비교적 정상이었으며, 결장에서 전형적으로 관찰되는 다량의 염증성 침윤물이 결핍되었다. 도 8은 각종 방법으로 처리한 CD45RBhi 주입한 동물에서 체중 손실의 시간 추이를 나타내고 있으며, 도 9는 주사하고 8주후의 최종 체중을 나타내고 있다. 두 개의 매우 상이한 IBD 모델, 즉 CD45RB 및 DSS 모델에서 mLTβR-Ig의 효능은 면역계에서 상기 처리의 현저한 효과에 대한 강력한 증거가 된다.
도 8: CD45RB CD4 양성 T 세포를 스키드 마우스 내로 주입한 후의 체중의 시간 추이. 각 곡선은 한 동물을 의미하며, 패널내의 내용은 주사된 세포, 즉 CD45RBhi 또는 low 및 처리의 특성을 의미한다. 동물은 주 단위로 복막내 주입된 단백질 100 ㎍으로 처리하였다. 처리는 세포의 주입 2주 전에 개시하였으며, 실험 전기간에 걸쳐 계속 실시하였다.
도 9: 이식 10주 후에 여러 가지 처리를 수행한후 관찰된 체중의 평균 및 표준 편차(1군당 5 내지 6마리의 동물).
실시예 11
지연형 과민증의 SRBC 모델
balb/c 암컷 마우스는 PBS 내의 2 x 107 세척된 양 적혈구(SRBC)를 피하 주입하여 감작하였다. 5일후, 마우스는 PBS 내의 1 x 108 SRBC를 우측 발 바닥에 주입(발바닥하 주입)하여 항원 투여하였다. 발바닥하 주입후 여러 번에 걸쳐 칼리퍼스로 발바닥의 두께를 측정하였다. 도 10은 mLTβR-Ig를 이용하여 복막내 주입하므로써 처리한 마우스에서의 발바닥 종창 반응을 나타내고 있다. 감작시, 또는 감작시와 항원 투여 단계에서 수행한 mLTβR-Ig를 이용한 처리는 SRBC 유도된 DTH 반응을 억제하였다.
도 10: 본 도면은 SRBC를 주입하고 18시간이 경과한 후 측정한 발바닥 두께증가를 나타내고 있다. PBS의 음성 대조용 주입, VLA4 상호작용을 차단하고 세포 트래피킹(trafficking)하는 양성 대조용 항체 PS/2 및 SRBC의 피하 주입으로 인한 감작 직전 또는 항원 투여시 또는 상기 시기 둘 다에 부여된 mLTβR-Ig(100 ㎍ 정맥내 주입)으로 처리하였다.
본원 발명에서의 림포톡신-β 수용체 차단제를 사용하여 림포톡신-β-수용체(LT-β-R) 시그널을 억제하므로서 면역질환을 치료하는 약학적 조성물 및 방법은 종래 기술에서의 문제점, 즉 독성이 높고, 부작용을 유발시키며 고용량의 사용등을 요하는 문제점을 해결하는 효과를 얻고 있습니다.
서 열 목 록
(1) 일반정보:
(i) 출원인: 제프리 엘. 브라우닝, 크리스토퍼 디. 벤자민, 폴라 에스. 호크만
(ii) 발명의 명칭: 면역학적 질병의 치료를 위한 치료제로서 가용성 림포톡신-베타 수용체 및 항-림포톡신 수용체 및 리간드 항체
(iii) 서열의 수: 1
(iv) 서신 주소:
(A) 수신인: 제임스 에프. 할리, 쥬니어
(b) 거리: 애비뉴 오브 더 아메리카스 1251
(C) 도시: 뉴욕
(D) 주: 뉴욕
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호: 10020
(v) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 운영 체계: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: 페이턴트인 릴리즈 #1.0, 버전 #1.30
(vi) 현 출원 자료
(A) 출원 번호:
(B) 출원일: 동시 첨부
(C) 분류:
(vii) 전 출원 자료:
(A) 출원 번호: 미국 08/505,606
(B) 출원일: 1995년 7월 21일
(viii) 대리인 정보:
(A) 성명: 제임스 에프. 할리 쥬니어
(B) 등록 번호: 27,794
(C) 참조 번호: B191CIP PCT
(ix) 통신 정보:
(A) 전화: (212) 596 9000
(B) 팩스: (212) 596 9090
(C) 텔렉스: 14-8367
(2) 서열 번호 1에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 197 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄의 수:
(D) 형태: 직쇄상
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(xi) 서열 번호 1:
[서열 1]
Figure 112004050545018-pat00038

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  15. 동물에서의 면역학적 질환을 억제하는데 효과적인 림포톡신-β수용체(LT-β-R) 차단제와 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물에 있어서, 상기 LT-β-R 차단제가 1개 이상의 이종 단백질 영역에 융합된 가용성 LT-β-R, 서열 번호 1의 아미노산으로부터 선택된 아미노산의 작용성 서열을 포함하는 가용성 LT-β-R 및 서열 번호 1을 포함하는 폴리펩티드에 대해 유도된 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 지연형 과민질환(DTH), 자가면역질환 및 만성 염증질환으로 구성된 군으로부터 선택된 면역학적 질환 치료용 약학 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 가용성 LT-β-R이 하나 이상의 LT-β 서브유니트를 포함하는 표면 LT 리간드에 선택적으로 결합할 수 있는 리간드 결합 영역을 포함하 는 것인 약학 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 상기 가용성 LT-β-R이 LT-β-R의 세포 외 영역을 포함하는 것인 약학 조성물.
  18. 제15항에 있어서, 상기 가용성 LT-β-R이 인간 LT-β-R인 약학 조성물.
  19. 제15항에 있어서, 상기 이종의 단백질 영역이 인체 면역글로블린 Fc 영역을 포함하는 것인 약학 조성물.
  20. 제15항에 있어서, 상기 이종의 단백질 영역이 혈청 알부민, 리포단백질, 아포리포단백질 및 트랜스페린으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 약학 조성물.
  21. 제15항에 있어서, 상기 항체가 재조합형 항체, 인간화(humanized) 항체 및 모노클로날 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 약학 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 모노클로날 항체가 항-인체 LT-β-R mAb BDA8인 약학 조성물.
  23. 제21항에 있어서, 모노클로날 항체가 항-인체 LT-β-R mAb B9인 약학 조성 물.
  24. 제15항에 있어서, 상기 지연형 과민질환이 투베르쿨린-형의 과민증, 접촉 과민증 및 육아종성 반응으로 구성된 군으로부터 선택되는 약학 조성물.
  25. 제15항에 있어서, 자가 면역 질환이 건선, 류마티스성 관절염, 인슐린-의존성 당뇨병, 다발성 경화증, 교감성 안염 및 방광염으로 구성된 군에서 선택되는 약학 조성물.
  26. 제15항에 있어서, 만성염증질환이 비염증성 배변증후군, 크론스 질환(Crohn's disease), 포도막염 및 결장염으로 구성된 군에서 선택되는 약학 조성물.
  27. a) 하나 이상의 LT-β-R 활성화제의 유효량 및 추정 LT-β-R 차단제의 존재하에 종양 세포를 배양하는 단계; 및
    b) 추정 LT-β-R 차단제가 LT-β-R 활성화제의 항-종양 활성을 감소시키는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는 제15항에서의 상기 LT-β-R 차단제를 선택하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, LT-β-R 활성화제가 LT-α/β 이종체 복합체를 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, LT-α/β 이종체 복합체가 LT-α1/β2 화학량론을 갖는 방법.
  30. 제27항에 있어서, LT-β-R 활성화제가 LT-β-R 시그널링을 자극하는 항-LT-β-R 항체를 포함하는 방법.
KR1020047017609A 1995-07-21 1996-07-19 면역학적 질병의 치료를 위한 치료제로서 가용성림포톡신-베타 수용체 및 항-림포톡신 수용체 및 리간드항체 KR100557258B1 (ko)

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