CZ17298A3 - Rozpustné receptory lymfotoxinu beta a protilátky proti receptoru lymfotoxinu a jeho ligandům a farmaceutický prostředek, který je obsahuje - Google Patents

Description

Rozpustné receptory lymfotoxinu beta a protilátky proti receptoru lymfotoxinu a jeho ligandům a farmaceutický prostředek, který je obsahuje (57) Anotace:

Řešení se týká farmaceutických přípravků a způsobů obsahujících agens blokující receptor lymfotoxinu-b, které blokuje signální dráhu receptoru lymfotoxinu-b. Agens blokující receptor lymfotoxinu-b je užitečné pro léčení imunologických onemocnění zprostředkovaných lymfocyty a zejména pro inhibici imunitní odpovědi zprostředkované Thl buňkami. Vynález se dále týká rozpustných forem extracelulární domény receptoru lymfotoxinu-b, které působí jako agens blokující receptor lymfotoxinu-b. Vynález se také týká použití protilátek, které působí jako agens blokující receptor lymfotoxinub, a které jsou namířeny buď proti receptoru lymfotoxinu-b nebo jeho ligandu, povrchovému lymfotoxinu. Vynález poskytuje nový způsob pro vyhledávání a testování rozpustných receptorů, protilátek a dalších agens, která blokují signální dráhu LT-b receptoru.

SQPQAVPPYA 8BNQTCRDQB KSYYBPQBRI CCSRCPPOTY VtAXCSMRD50

TVCXTCJLENS nmWYLTZ CQLCAPCDPV MGLtlIAPCT SKJUCTQCRCQ100

101 PGKFCAAWAL BCTHCJtLLSO CPPGTSABLK DBVGXGMNHC VPCKAGHPQN150

151 TSSPSARCQP HTRCENQGLV lAAPGTAQSD TTCIWUPI. PPEMSGT197

175 704/HK

Rozpustné receptorů přípravek, proti farmaceutický receptory lymfotoxinu-β a protilátky lymfotoxinu a jeho ligandům a který je obsahuje

Oblast techniky týká přípravků a způsobů, receptor lymfotoxinu-β, lymfotoxinu-β. Agens pro léčení lymfocyty, zprostředkované forem extracelulárnícn domén obsahuj ících které blokuje blokující receptor imunologických a zejména pro Thl buňkami.

Vynález se agens blokující signální dráhu lymfotoxinu-β je užitečné onemocnění zprostředkovaných potlačení imunitní odpovědi Vynález se týká rozpustných receptorů lymfotoxinu-β, které působí jako agens blokující receptory lymfotoxinu-β. Vynález se dále týká použití protilátek namířených proti receptorům lymfotoxinu-β nebo jejich ligandům, povrchovým agens blokující receptory poskytuje nový způsob receptorů, protilátek a dalších receptorovou signální dráhu.

které působí jako Vynález vyhledávání rozpustných činidel, které blokují LT-β lymfotoxinům, lymfotoxinu-β (LT-β).

pro

Dosavadní stav techniky

Spektrum cytokinů, které spuštění imunitní odpovědi, imunologických Výběr mezi zprostředkován (Th buňkami). antigen (APC), fragmenty molekulami rozpoznáj i se ovlivní začnou uvolňovat po následně výběr budou aktivovány, mechanismy je efektorových drah, které imunitními efektorovými

CD4-pozitivními pomahačskými T lymfocyty Th buňky interagují s buňkami prezentujícími které exponuji na svém povrchu peptidové cizorodý antigen ve spojení s Buňky jsou aktivovány, když nebo cizí antigen na vhodném nebo zpracovaný MHC II. třídy, určité epitopy * · · · • ·

APC, pro který Th

Aktivované Th

Th buňky které zahrnuj protilátek B efektorového mechanismu í aktivaci

T buněk, vyt v;

o o d 1 e toho,

Immunol.

Rev.

jaké

11:

29-48, 1983). Tyto podskupiny se nazývají ThO, Thl Např. u myši nestimulované naivní pomahačské T produkují IL-2. Krátkodobá stimulace vede k přeměně prekurzorovou buňku, která produkuje řadu cytokinů buftk včetně

IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-5 a IL-10. Trvale stimulované mohou diferencovat buď na Thl nebo Th2 buňky, v záv

3.

Lučně jednou podskupinou vliv pomahačských T buněk Podobné dělení pomahačských T (Romagnani a kol.,

Th byl rozpoznán

£) U Ώ ě Θ i ¹ J. j Θ

Ann. Rev. Immunol. 12:

227-257,

Thl buňky :inů odpovídající Thl buňkám je produkují LT-α, IL-2 a IFN-γ. Profil sekrece u lidí obecně spojován s buněčnou imunitou a odolnosti proti infekci. Cytokiny Thl buněk přispívají k aktivaci makrofágů a k určitému zánětlivé reakce, jako je např. přecitlivělost IV. tzv. pozdní přecitlivělost. Cytokiny typu Thl důležitou úlohu v buněčné odpovědi na tkáňový štěp, odhojeni štěpu nebo orgánového transplantátu.

typu typu, maj i a sice • · · *

buňky produkují cytokiny IL-4, IL-5, IL-6 a IL-10. Th2 buněk zvyšují produkci eosinofilů zrání rozvoj a cytokines

3rd ed.,

B buněk a žirných (Howard a and their

Raven

Press, produkci spojeny s štěou.

buněk a podporují plný kol., T-cell derived Fundamental Immunology,

1993) . Cytokiny Th2 typu také včetně protilátek IgE, které odpovědí a s protilátkami ] podílejí na imunosupresi a antigenu.

Cytokiny spojené s Thl a Th2 buňkami hrají r určitých typech přecitlivělosti (hypersenzitivity) ,

Th2 receptors,

New York, protilátek alergickou buňky perzistentnímu se nepřiměřená imunitní odpověď vyvolaná opakovaným kontaktem s již dříve rozpoznaným antigenem. Existují čtyři typy přecitlivělosti (Roitt a kol., Immunology, ss. 19.1-22.12, Mosby-Year Book Europe Ltd., 3rd ed., 1993).

Přecitlivělost I. typu, tzv. časná přecitlivělost, zahrnuje aktivaci Th2 buněk indukovanou alergenem a uvolnění cytokinů typu Th2. Cytokin IL-4 stimuluje B buňky

ekzému, astmatu nebo rýmě.

Přecitlivělost II. a III. typu je způsobena protilátkami IgG a IgM namířenými proti buněčnému povrchu nebo specifickým tkáňovým antigenům (II. typ) anebo rozpustným sérovým antigenům (III. typ). Má se za to, že tyto typy přecitlivělosti nezahrnují Th buňky.

Přecitlivělost IV. typu, tzv. pozdní přecitlivělost (DTH) je zprostředkována Thl buňkami. Reakce DTH se vyvíjí více než 12 hodin a popisuje se jako reakce zprostředkovaná buňkami, protože může být přenesena mezi pokusnými myšmi Thl buňkami, ale nikoliv samotným sérem. Odpověď IV. typu, tedy DTH, se rozděluje na 3 podtypy: kontaktní, tuberkulinovou a granulomatózní přecitlivělost.

• · · · • ·

Buňkami zprostředkované reakce, které způsobují nemoc, jsou indukovatelné u zdravých myši tím, že se do nich přenesou lymfocyty z nemocných myší (např. diabetes závislý na inzulínu, experimentální autoimunitní encefalitida). Tímto rysem se odlišuje DTH IV. typu od přecitlivělosti •jiných typů, které představují humorální imunitní odpověď zprostředkovanou primárně protilátkami, a tudíž j sou přenosné bezbuněčným sérem.

Pomahačské T buňky se izotypů imunoglobulinů de buněk ovlivňují relativní z regulaci změny subpopulace Th imunoglobulinů produkovaných jako odpověď na imunitní provokaci (setkání s antigenem). Tak např. cytokin IL-4 buněk Th2 může změnit aktivované B buňky na izotyp IgGl a potlačit jiné izotypy. IL-4 také aktivuje nadprodukci IgE u přecitlivělosti I. typu. Cytokin IL-5 buněk Th2 indukuje izotyp IgA. Vliv tohoto cytokinu na změny izotypů je udržován v rovnováze IFN-γ, produkovaným Thl buňkami.

Zdá se, že odlišné profily cytokinů secernovaných Thl

buď buněčné nebo humorální efektorové mechanismy, je dána křížovou supresí mezi Thl a Th2 buňkami. IFN-γ produkovaný Thl buňkami inhibuje proliferaci Th2 buněk a IL-10 secernovaný Th2 buňkami redukuje sekreci cytokinů Thl buněk.

Negativní regulační obvody Thl a Th2 buněk tak mohou znásobit, v závislosti na relativní afinitě cytokinů k jejich cílovým molekulám, vliv malých rozdílů v koncentraci cytokinů Thl a Th2 buněk. Zesílený cytokinový signál Thl nebo Th2 buněk může změnit buněčný nebo humorální imunitní efekťorový mechanismus, což závisí na malých změnách v relativních koncentracích cytokinů Thl nebo Th2 typu. Schopnost řídit takovou změnu tím, že se modulují er různými nemoci.

jako jso

druhy imunitních buňkami, která je pozdní buněčné t 22 g S O 2_ 3. 3 tL U.

Ošetřování různých imunologických stavů podmíněných Thl buňkami je založeno na užití imunomodulačních a imunosupresivních přípravků a mnoha dalších látek, u nichž je velmi málo známo o mechanismu účinku (např. zlato nebo penicilamin). Tři v současnosti nejužívanější imunosupresiva jsou steroidy, cyklosporin a azathioprin.

Steroidy jsou pleiotropní protizánětlivé látky, které potlačují aktivované makrofágy a inhibují aktivitu buněk prezentujících antigen, a to takovým způsobem, že ruší či otáčí účinek itN-γ, cytokinu Thl buněk. Cyklosporin, účinný imunosupresivní přípravek, potlačuje produkci cytokinů a snižuje expresi receptorů pro IL-2 v lymfocytech při jejich aktivaci. Azathioprin je přípravek s antiproliferačním účinkem, který inhibuje syntézu DNA. Tato nespecifická imunosupresiva jsou zpravidla podávána ve velkých dávkách, což zvyšuje jejich toxicitu (např. nefro- a hepatotoxicitu) a způsobuje četné vedlejší účinky, nejsou proto vhodná pro dlouhodobé léčení.

Aby se odstranily problémy způsobované léčbou konvenčními nespecifickými imunosupresivy, současné léčebné strategie směřuji k tomu, potlačit nebo aktivovat selektivní stránky imunitního systému. Zvláště přitažlivým cílem je ovlivnit rovnováhu mezi cytokiny Thl a Th2 typu, a • · · · • · · · • · posunu mezi buněčným a humorálním

Τ' .«« · · 'ΓΠ1' by bvlo dobré mít možnost modulovat

1.

Γ;

relat ivní jej ich

IL-12, zatímco ±FN-a a ItN-γ podporuji rozvoj odpovědi Thl typu, — 4 vsdou k ccíoovpcíí. TH2 θίθktorového rnechsíiismu (Romagna a kol., Ann. Rev. Immunol. 12: 221-25/, 1994).

cytokinů rh buněk jsou pleiotropními funkce imunitního systému, zastavení jej i by imunitní odpověď, která není bezprostředně závislá na T buňkácí

Požadované a účinné cíle oro selektivní modulováni výběru mezi efektorovými mechanismy Thl nebo

Th2 typu

Podstata vynálezi vynález imunologických onemocnění tak, přípravek že užívá látku blokující receptory lymfotoxinu-β (LT-β-Κ), a tím inhibuje signální dráhu receptoru lymfotoxinu-β. Přípravky a způsoby obsahující látku blokující LT-β-Ρ jsou zvláště vhodné pro inhibici imunitní odpovědi zprostředkované Thl buňkami, jako je např. zánětlivý střevní syndrom.

vynálezu poskytuje rozpustnou formu extracelulárni domény receptoru jako látka blokující vynálezu výhodně lymfotoxinu-β, který

Přípravek a způsob obsahují rekombinantní fúzní ]

ΤΤ-β-R.

lymfotoxinu-β, který má extracelulárni působí > podle protein doménu vázající ligand fúzovanou s konstantní doménou

· • · doména LT-β-Η vázající liga lidského IgG.

Jiné provedení vynálezu pusooi ja. prostředek mamířených protilátky přípravek blok;

poskytuje protilátky, které LT-β-Η. V tomto provedení jednu nebo více protilátek lymfotoxinu-β. Výhodněji ilátky. Další výhodný způsob v tomto provedení obsahuje jednu nebo /rohovému lymfotoxinu.

nr,^z více protilátek namířených

Výhodněji je protilátka lymfotoxinu-β.

Vynález dále poskytuje blokujících LT-β-Η, protilátky testování nový způsob testováni pro výběr jako jsou např. rozpustné a anti-LT-β-Η spočívá v buňkami, nádorovými

LT-β-Η. Test adenokarcinomových dráhy indukovaným ligandy

LT-β-Η inhibuj

LT-α/β v nádorových buňkách.

agens

LT-β-Η, anti-LT nový způsob cytotoxicity s signální lidských signální přítomnosti agens aktivujícího

Agens blokující LT-β-Η heteromerických komplexů aktivujících LT-β-Η) užitý k testování ukázán na příkladu účinek protilátky. Tento provedení testu který monitoruje zvýšenou citlivost signálům LT-β-Η nebo protilátkami v (např. LT-αΙ/β).

e cytotoxický (nebo jiných

Způsob testování agens domněle inhibujíčího LT-β-Η je anti-LT-^-R protilátek (v přítomnosti LT-α/β, agens aktivujícího ΣΤ-β-R), a skládá se z následujících kroků.

1) Nádorové buňky (např. HT29) se kultivují několik dní IFN-γ a čistý komplex LT-αΙ/βί neobsahuje testované agens, např.

2) Buňky jsou ošetřeny barvivém, živé buňky.

lidské adenokarcinomové buňky v médiu, které obsahuje a dále buď obsahuje či protilátku anti-LT-β-Η.

které barví pouze • · · ·

3'i Počet obarvenýcn ouněc se stanovila

X τ r~> ν' í f- /m rr. r> c; * ί

ΕΤ-α1/β2, IFN-γ a testované protilátky v každém vzorku.

Počet přežívajících buněk může být stanoven jakýmkoliv z několika známých způsobů měřicích životaschopnost baněk, jako je např. rychlost inkorpcrace H-thymidina do DNA. Protilátka anti-LT-β-Η (nebo kombinace protilátek), která snižuje procento odumřelých buněk v tomto testu nejméně o 20%, se dá považovat za agens blokující LT-β-Ρ ve smyslu tohoto vynálezu.

Tento cytolytický test se dá provádět s LT-α/β heteromerickými komplexy nebo jinými agens aktivujícími LT-β-Ρ, a to buď samotnými nebo kombinací více takových agens. Test se může také upravit podle požadavků na identifikaci nových agens blokujících LT-β-Ρ.

Aby bylo možné vynálezu plně porozumět, následuje podrobný popis vynálezu.

Termín cytokin v tomto textu znamená molekulu, která zprostředkovává interakci mezi buňkami.

Lymfokin je pak

Termín pomahačská T buňka (Th buňka) označuje funkční podtřídu T buněk, které pomáhají generovat cytotoxické T buňky a které spolupracují s B buňkami a stimulují tak tvorbu protilátek. Pomanačské T buňky rozpoznávají antigen ve spojení s molekulami MHC II. třídy.

Termín Thl se týká podtřídy pomahačských ± buněk, které produkuji LT-a, interferon-γ a IL-2 (a další cytokiny) a které vyvolávají zánětlivou reakci ve spojení s buněčnou (t.j. bez účasti imunoglobulinů) imunitní odpovědí.

Termín Th2 označuje podřídu pomahačských T buněk, které produkuji cytokiny včetně IL-4, IL-5, IL-6 a IL-10 a • · nebo buňkami

Π se imunitní odpovědí.

Termín buněčná vztahuje k takovým imunitní odpověď je imunologie kým \j ý- g Ί θ ýj V θ m η v ί ρΔ Η kategorie nespadá vliv pomahačský diferenciaci a expanzi B buněk, neboť í obecně spojovány s Th2 podtřídou T buněk.

V7s~e<

hir-.

rTermín přecitlivělost pozdního typu (delay hypersensitivity, DTH)” označuje imunitní odpověď, charakterizována pomalou odpovědi na dochází až 3 odpověď humorální, kontrastuje s relativně imunoglobulíny rychlou odpovědí při zprostředkované, aieraicKe reakci. Existují 3 typy DTH: konta' přecitlivělost tuberkulinovéno typu reakce.

humorální odoověď nebo odpověď se antigen, při

Termín obsahuj ící

Fc doména protilátky označuje ohybovou oblast, doménu CH2 část molekuly a CH o, ale izotypu.

Termín protilátka anti-LT-p-receptor jakoukoliv protilátku, která se specificky váže jednomu epitopu na receptoru LT-β.

• *

Termín protilátka anti-LT popisuje jakoukoliv protilátku, která se specificky váže k alespoň jednomu epitopu na LT-a, LT-β, nebo komplexu LT-α/β.

Temin signální dráha Ι/Γ-β-ΙΙ označuje molekulární reakce spojené s celou metabolickou cestou LT-β-Η a následné molekulární reakce, které k ni vedou.

Termín agens blokující LT-β-Η označuje takové agens, které zeslabí vazbu ligandu na LT-β-Η, shlukování LT-β-Η na buněčném povrchu nebo signální dráhu LT-β-Η, nebo které způsobí změnu v tom, jak je signál LT-β-Η dráhy interpretován v buňce. Agens blokující LT-β-Η, které působí v kroku vazby ligand-receptor, inhibuje vazbu LT ligandu na LT-β-Η alespoň o 20 %. Agens blokující LT-β-Η, které působí až za tímto krokem, inhibuje cytotoxický účinek aktivace LT-β-Η na nádorové buňky nejméně o 20 %. Příklady agens blokujícího LT-β-Η zahrnují rozpustné molekuly LT-p-R-Fc a protilátky anti-LT-a, anti-LT-β, anti-LT-α/β a anti-LT-β-Η. Výhodně protilátky nereagují křížově se sekretorickou formou LT-a.

Termín biologická aktivita LT-β-Η znamená 1) schopnost molekuly LT-β-Η nebo jejích derivátů soutěžit o rozpustný nebo povrchový LT ligand vážící se k rozpustné nebo povrchové molekule LT-β-Η, nebo 2) schopnost stimulovat regulační imunitní odpověď nebo obecně cytotoxickou aktivitu nativní molekulou LT-β-Η.

Termíny heteromerický komplex LT-α/β a LT heteromerický komplex popisují stabilní spojení alespoň jedné podjednotky LT-α a jedné nebo více podjednotek LT-β, včetně rozpustných, mutovaných, změněných a chimérických forem jedné nebo více podjednotek. Podjednotky se mohou spojovat elektrostatickými, van der Waalsovými nebo kovalentními interakcemi. Heteromerický komplex LT-α/β má výhodně dvě přilehlé podjednotky LT-β a postrádá přilehlé podjednotky LT-α. Když heteromerický komplex LT-α/β slouží • · • · · · • · • · • · • » jako aktivující agens pro ΤΤ-β-R v testu buněčného růstu, je komplex výhodně rozpustný a má stechiometrii ύΤ-αί/β2. Rozpustné heteromerické komplexy LT-α/β postrádají transmembránovou doménu a mohou být secernovány vhodnou hostitelskou buňkou, která byla upravena metodami genového inženýrství tak, aby exprimovala podjednotky LT-α a/nebo LT-β (Crowe a kol., J. Immunol. Methods 163: 79-89, 1994).

Termín LT ligand znamená LT heteromerický komplex nebo jeho derivát, který se specificky váže na receptor LT-β.

Termín doména ΤΤ-β-R vázající ligand popisuje část nebo části ΤΤ-β-R, které se účastní specifického rozpoznání a interakce s LT ligandem.

Termíny povrchový LT-α/β komplex a povrchový LT komplex označují komplex, skládající se z podjednotky LT-a a podjednotky LT-β navázané na membránu, včetně mutantních, pozměněných a chimérických forem jedné nebo více podjednotek, a který je prezentován na povrchu buňky. Povrchový LT ligand znamená povrchový LT komplex nebo jeho derivát, který se specificky váže na receptor LT-β.

Termín subjekt zde znamená zvíře nebo jednu či více buněk pocházejících ze zvířete. Výhodně je zvíře savcem. Buňky jsou v jakékoliv formě, včetně, ale ne výlučně, buněk obsažených ve tkáni, shluků buněk, imortalizovaných, transfekovaných nebo transformovaných buněk, a také buněk pocházejících ze zvířete, které bylo fyzikálně nebo fenotypově změněno.

Lymfotoxin-β: člen rodiny TNF

Cytokiny příbuzné s nádorovým nekrotickým faktorem (tumor necrosis factor, TNF) se objevily jako velká rodina pleiotropních mediátorů účastnících se imunitní regulace a hostitelské obranyschopnosti. Členové této rodiny se vyskytují ve formě vázané na membránu, která lokálně působí

prostřednictvím přímého mezibuněčného kontaktu, anebo ve formě sekretorického proteinu, který působí na vzdálené cíle. Rodina receptorů příbuzných TNF reaguje s těmito cytokiny a spouští tak různé metabolické dráhy včetně buněčné smrti, p-roliferace, diferenciace tkání a zánětlivé reakce.

TNF, lymfotoxin-a (LT-α, také zvaný TNF-β), a lymfotoxln-β (LT—β) jsou členy rodiny TNF ligandů, která zahrnuje také ligandy receptorů Fas, CD27, CD30, CD40, OX-40 a 4-1BB (Smith a kol., Cell 76: 959-962, 1994). Signální dráhy některých členů TNF rodiny, včetně TNF, LT-a , LT-β a Fas, mohou indukovat odumírání nádorových buněk tím, že způsobí nekrózu nebo apoptózu (programovanou buněčnou smrt). TNF a mnoho dalších interakcí ligand-receptor TNF rodiny ovlivňuje v netumorigenních buňkách vývoj imunitního systému a imunitní odpověď na různé antigeny.

Většina ligandů rodiny TNF se nalézá v podobě vázané na membránu na povrchu buněk. TNF a LT-α existují u člověka jak v sekretorické tak i povrchové, na membránu vázané formě. Povrchový TNF má transmembránovou oblast, která je proteolyticky štěpena, aby se vytvořila sekretorická forma. Naproti tomu LT-α postrádá zcela transmembránový úsek. Forma LT-α asociovaná s membránou je návázána k buněčnému povrchu jako heteromerický komplex s LT-β, příbuzným transmembránovým polypeptidem, a tvoří tak komplex LT-α/β.

Většina komplexů LT-α/β asociovaných s membránou (povrchových LT) má stechiometrii ΤΤ-α1/β2 (Browning a kol., Cell 72: 847-856, 1993, Browning a kol., J. Immunol. 154: 33-46, 1995). Povrchové LT ligandy se nevážou na TNF-R s vysokou afinitou a neaktivují signální dráhu TNF-R. Jiný receptor příbuzný TNF, zvaný LT-β receptor (LT-β -R) , váže tyto povrchové lymfotoxinové komplexy s vysokou afinitou (Crowe a kol., Science 264: 707-710, 1994).

Aktivace signální dráhy LT-β-Κ, podobně jako signální dráhy TNF-R, má antiproliferační účinek a může mít cytotoxický účinek na nádorové buňky. V již podané patentové přihlášce autorů předkládaného vynálezu (pořadové číslo ve Spojených Státech 08/378,968) jsou popsány přípravky a způsoby pro selektivní stimulaci LT-β-Η

.. Agens aktivující nádorových buněk, by dráhy i aktivaci

TNF-R.

TNF při různých typech imunitní odpovědi nebo

Jak ligandy TNF tak i LT-α se váží na aktivovaný receptor TNF (p55 nebe p60 a p75 nebo p80, zde nazývaný TNF-R) . TNF a LT-α jsou produkovány makrofágy při časné imunitní odpovědi nebo rychlé imunitní reakci na mikrobiální infekci, což zvyšuje baktericidní aktivitu makrofágů a neutrofilů. TNF a

LT-α produkované makrofágy nebo cytotoxickými T lymfocyty (žabí ječskými T buňkami, CTL) se váží na receptory TNF na povrchu cílových buněk a spouštějí mechanismus vedoucí k usmrcení citlivých buněk.

TNF a cytokiny příbuzné TNF také iniciují zánětlivou kaskádu jako odpověď na stres nebo infekci. Uvolnění TNF, LT-α nebo IFN-γ mění adhezivní vlastnosti mezi buňkami cévního endotelu a určitými typy lymfocytů. Zvýšená adheze usnadňuje migraci fagocytů a leukocytů z krevního řečiště do tkání obklopujících místo zánětu. Podobná zánětlivá reakce hraje hlavní úlohu v odhojování tkáňového štěpu nebo orgánového transplantátu, a také v některých imunologických poruchách.

Komplexy povrchových lymfotoxinů (LT) byly charakterizovány v hybridomových T buňkách CD4+ (11-23.D7), které exprimují vysokou hladinu LT (Browning a kol., J. Immunol. 147: 1230-1237, 1991, Androlewicz a kol., J. Biol.

Chem. 267: 2542-2547, 1992). Exprese a biologická funkce LT-β-Κ, LT podjednotek a povrchových LT komplexů jsou popsány v přehledu Ware, C.F.: The ligands and receptors of the lymphotoxin systém. In: Pathways for Cytolysis. Current Topics Microbiol. Immunol. Springer-Verlag, s.175-218, 1995.

Exprese LT-α je indukována a LT-α je primárně secernován aktivovanými T a B lymfocyty a zabiječskými (NK, natural killer) buňkami. LT-α je produkován v rámci pomahačských T buněk podskupinou Thl, ale nikoliv podskupinou Th2 buněk. LT-α byl také nalezen v melanocytech. Mikroglie a T buňky v lézich u pacientů s roztroušenou mozkomišni sklerózou reaguji pozitivně s antisérem anti-LT-cc.

Lymfotoxin-β (také zvaný p33) byl nalezen na povrchu T lymfocytů, linií T buněk, linii B buněk a zabiječských buněk aktivovaných lymfokinem (LAK). LT-β je předmětem již podaných patentových přihlášek stejných autorů jako předkládaný vynález PCT/US91/04588, publikovaný 9. ledna 1992 jako dokument WO 92/00329, a PCT/US93/11669, publikovaný 23. června 1994 jako WO 94/13808, na které se zde odkazuje.

Povrchové LT komplexy jsou exprimovány primárně aktivovanými T a B lymfocyty a zabiječskými buňkami, jak se dá ukázat analýzou pomoci FACS nebo imunohistologickou analýzou užitím protilátek anti-LT-α nebo rozpustných fúzních proteinů LT-^-R-Fc. Povrchové LT byly také nalezeny na klonech lidských cytotoxických T lymfocytů (CTL), v aktivovaných periferních mononukleárních lymfocytech (PML), lymfocytech periferní krve aktivovaných IL-2 (LAK), periferních B lymfocytech aktivovaných buď mitogenem z líčidla amerického (Phytolacca americiana} nebo anti-CD40 (PBL), a různých T a B buněk pocházejících z lymfoidních nádorů. Zapojení cílových buněk nesoucích alloantigen • · • · · · • ·

specificky indukuje expresi povrchových LT u klonů CD4 + a cD8 + W.

Receptor LT-β, člen rodiny receptorů TNF, specificky LT-p-R váže heteromerické LT váže oovrchové LT zprevazne liaandv a kol odpovědi.

Výzkum buněk.

ale neváže

707-710, roli ve ani TNF

1994).

vývoj i humorálni imunitní je teprve v počáteční fázi. mRNA slezině,

Profil exprese

LT-p-R j e podobný buňkách

Produkce rozpustných LT komplexů Rozpustné podjednotky LT-á, na membránu, heteromerické komplexy které byly změněny z ] rozpustné. Tyto podané mezinárodní o vynálezu (PCT/US93/11669, jako WO 94/13808). Rozpustné sekvencí aminokyselin lymfotoxinu-á, jehož štěpena kdekoliv mezi koncem transmembránového 44. aminokyselina) a prvním úsekem aminokyselina) , a kde číslování

Browninga a kol. (Cell na

LT-a/á obsahují původních, vázaných komplexy jsou podrobně přihlášce autorů oublikováno 23.

definovány sekvence je úseku (t.j.

TNF (t.j. 88.

odpovídá popisu dle 1993).

Rozpustné polypetidy LT-á vznikají z LT-á, čímž se oddělí cytoplazmatický homologním s aminokyselin 72: 847-856, odštěpením N-konce a transmembránový úsek (Crowe a kol., Science 264: 707-710, 1994). Jiným způsobem se může transmembránová doména inaktivovat delecí anebo substitucí hydrofobní aminokyseliny hydrofilni. V obou případech je tak vytvořen podstatně hydrofilni • · • · · · hydrccstický profil, který redukuje afinitu k lipidům a zleošuie rozpustnost ve vodě. Delece transmembránové domény je výhodnější než substituce, protože se tak zabrání vzniku nových potenciálně imunogenních epitopů.

Deletovaná nebo inaktivovaná transmembránová doména se může nahradit nebo připojit k zaváděči sekvenci I. typu (naoř. zaváděcí sekvence VCAM-1), takže sekvence secerncvaného proteinu začíná kdekoliv mezi aminokyselinami va!40 a pro88. Rozpustné polypetidy LT-á mohou na svém N-konoo obsahovat několik z mnoha známých zaváděcích sekvenci. Takové sekvence zajisti, že peptid je exprimován a zacílen do sekretorické metabolické dráhy v eukaryotickém systému (viz např. Ernst a kol., US Patent č. 5,082,783, 1992'

Heteromerické komplexy LT-a/á mohou vznikat kotransfekci vhodné hostitelské buňky DNA, která kóduje LT-α a rozpustný LT-á (Crowe a kol., J. Immunol. Methods 168: 78-89, 1994). Rozpustný LT-á, secernovaný v nepřítomnosti LT-α, je vysoce oligomerizovaný. Avšak je-li koexprimován s LT-α, vytváří se trimeru podobná struktura o velikosti 70 kD, která obsahuje oba proteiny. Heteromerické komplexy LT-al/á2 se mohou vytvářet tak, že se buněčná linie exprimujici pouze LT-α (např. RPMI 1788) transfekuje genem kódujícím rozpustný polypeptid LT-á.

Polypetidy LT-α a LT-á se mohou syntetizovat odděleně, denaturovat pomocí slabého detergentu, smíchat a pak společně renaturovat odstraněním detergentu, a tak vzniknou směsné heteromerické komplexy, které je možné dále separovat.

Purifikace komplexů LT-al/á2

Rozpustné heteromerické komplexy LT-al/á2 se oddělí chromatografii od koexprimovaných komplexů obsahujících podjednotky v jiné stechiometrii. Při chromatografii se • · • · · ·

použijí receptory TNE a LT-á jaro afinitní purifikační reagens. Receptor LT-á váže s vysokou afinitou pouze útvary á/á, s nitkou afinitou váže útvary α/á nebo heteromerické komplexy LT-a/á. Tudíž LT-a3 a LT-a2/ál se vyváži na TNF-R. LT-á-R může vázat také trimery LT-a2/ál (prostřednictvím α/á mista;, ale nemůže vázat LT-cc3. Navíc LT-á-R (ale nikoliv TNF-R; váže LT-al/á2 a LT-á(n) (přesné složeni těchto preparátů není známo, ale vytvářejí velké agregáty).

Receptorové afinitní reagens se dá připravit buď ve formě rozpustné extracelulární domény (viz např. Loetscher a kol., J. Bio!. Chem. 266: 18324-13329, 1991) nebo ve

formě	chimérických	proteinů	s doménou vázající
extra	celulárni ligand	spojenou s	Fc doménou imunoglobulinu
(v i z	Loetscher a kol	. , J. Bioi.	Chem. 266: 18324-18329,
1991,	Crowe a kol., S	cience 264:	707-710, 1994). Receptory

jsou navázány k afinitní matrici chemickým zesitěním užitím běžných postupů.

Existují dvě cesty, jak se mohou LT-al/á2 ligandy

purifikovat	pomocí receptorů	a	imunoafinitní
q F v a t o c: c s i θ	Podle prvního postu	;ou se	supe mat ant ze
systému, který	ΚΟΘΧΌΓΪΤΠΠή Θ js.k LT~	a tak	zkrácenou LT-á
formu, přečistí	přes kolonu s TNF-R,	přičemž TNF-R naváže

LT-a3 a LT-ct2/'ál trimery. V eluátu prošlém kolonou budou obsaženy LT-á(n) a LT-ctl/á2.

Podle druhého postupu jsou všechny formy obsahující LT-á (t.j. LT-á(n), LT-al/á2 a LT-ot2/ál) navázány a pak eluovány z kolony obsahující LT-á-R klasickým způsobem užitím chaotropního nebo pH činidla (LT-a3 proteče touto kolonou). Eluát je pak neutralizován nebo zbaven chaotropního činidla, a pak je purifikován přes kolonu obsahující TNF-R, který naváže pouze trimery LT-a2/ál. Výsledný eluát pak obsahuje pouze LT-á(n) a LT-al/á2 trimery.

V obou případecn, čisté LT-al/á2 trimery mohou být odděleny od LT-á následnou pelovou filtrací a/nebo iontoměničovou chromatografií v oboru známou.

Alternativně se mohou komplexů LT-a/á

ch roma t og ra f i c kých

te výhodné • ·

různé formy heteromerických a čistit řadou obvyklých kombinovat řadu obvyklých purifikačních postupů s jedním krokem imunoafinitního čištění popsaným výše.

Testování (vyhledávání) agens blokujícího LT-β-Η

V jednom provedení předkládaného vynálezu obsahuje agens blokující LT-β-Η protilátku namířenou proti LT-β-Η, která inhibuje signální dráhu ΤΤ-β-R. Výhodně je protilátka anti-LT-β-Η monoklonální protilátka. Jednou z protilátek s takovým inhibičnim účinkem je monoklonální protilátka BDA8.

Inhibiční protilátky anti-LT-β-Η a jiná agens blokující LT-β-Η lze identifikovat pomocí způsobu testování, který zjišťuje schopnost jednoho či více agens vázat se na LT-β-Η nebo LT ligand, nebo inhibovat vliv signální dráhy LT-β-Η na buňky.

Jeden způsob testování využívá cytotoxický účinek signální dráhy LT-β-Η na nádorové buňky nesoucí LT-β-Η. Nádorové buňky jsou vystaveny působení jednoho či více agens aktivujícího LT-β-Η, aby se indukovala signální dráha LT-β-Η. A.gens aktivující LT-β-Η zahrnuje jak heteromerické komplexy LT-α/β (výhodně rozpustný komplex LT-αΙ/βΣ) v přítomnosti IFN-γ nebo jakoukoliv aktivační protilátku anti-LT-β-Η (jak je také popsáno v již podané patentové přihlášce U.S. č. 08/378,968). Protilátky nebo jiná agens, která mohou blokovat cytotoxický účinek signální dráhy LT-β-Η na nádorové buňky jsou vybírány na základě následujícího testu.

• · • ·

1) Nádorové buňky, např. buňky HT25 jsou ivovány u médium a alesooň jedno auens aktivum to buď v přítomnosti nebo

Γ-β-R, testovaného agens, funkci mitochondrií, jako je např. MTu, se přidá k nádorovým buňkám a nechá

TO xa žde měřením

550 nm (OD úměrná oretrv přítomnosti agens aktivujícího LT-β-Η a testovaného blokujícího LT-β-Η. Agens nebo kombinace více agens.

agens

LT-β-Η ve smyslu předkládaného vynálezu, identifikaci agens

V tomto testu se blokuj ícího

LT-β-Η použít více acrens aktivuj ící

LT-β-Η, které

0:1 jakékoliv agens nebo kombinace signální dráhu LT-β-Η. Agens ndukuje signální dráhu LT-β-Η i protilátka anti-LT-β-Η) se schopnosti, ať samotného nebo v kombinaci s jinými agens, nádorových buněk, kterou lze otestovat také testem s nádorovými buňkami popsaným, výše .

způsobem jak testovat sledovat schopnost domnělého

Jiným agens blokující agens přímo reagovat

LT-β-Η je vazbě ve

LT ligand-receptor. Agens nebo kombinace více agens, které agens blokující LT-p-R ve

Kterýkoliv smyslu tohoto vynálezu, mnoha testů, které měří sílu vazby ligand-receptor, domnělým blokujícím ligandem se pak může se dá použít ke kompetitivnímu testu s

4

4444 44 ·

Specifická vazba komplexů protilátka-antige fluorescenčně aktivovaných buněk (FACS), nebo pomoc ή i ηθ imunodetekčni metody, což jsou všechno techniky dobře v oboru.

rezonance plasmonu (Zhou d kul., který

T'\

Vet aster

0'Shannessy, detection in affinity technologie

Af finity

Chromatografy,

Dekker,

Technologie nav receptor na zlatý povrch a nechat protékat ligand plasmonové rezonance přímo kvantitativně množství navázané hmoty v reálném čase. Výsledkem této techniky jsou rychlostní reakce, a tak se může přímo stanovit afinitní a disoc cl ítomnosti předpokládaného atíens bickuní'.

Kteroukoliv z těchto technik, nebo i pro měření schopnost agens, a to buď samotného anebo agens, blokovat vazbu povrchových nebo rozpustných LT ligandů na povrchové test lze také využít k testování aaens blokujících LT-B-R nebo jejich derivátů (fúznich, chimérických, mutovaných a chemicky pozměněných forem) , a to buď samotných nebo v kombinaci, aby se optimalizovala schopnost agens blokovat aktivaci LT-p-R.

• 99 ·· · 9 9 9 ··

9· · »* • 9 ·· • · 9 9· · ·

9 9 9*

9 9 4· · •9 •·

9 •9 •9 •9

Produkce rozpustných molekul ΤΤβ-κ

Agens blokující LT-β-Η pcdíe vynálezu obsahuje molekulu sekvenci extracelulárního kóduje doménu vážící ligand. Na (obr. 1) a využitím postupů rekombinantní DNA v oboru známých, je možné klonovat funkční fragment domény vá ve buňce, a tak produkovat

LT-p-R molekuly, které soutěží (k LT-β receptory o LT ligand v testu p< jsou vybrány jako agens blokující LT-β-Η. obsahuj icl uvedené na

Rozpustné

Rozpustné LT-β aminokyselin vybranou mohou připojit k jedné nebo více receptory doméně („fúzní doméně), aby se zvýšila in

VI vo receptorového fúzního proteinu, nebo aby se modulovala jeho biologická aktivita nebo lokalizace.

Výhodně jsou použity k vytvoření receptorových fúzních proteinů stabilní plazmatické proteiny, které mají po oběhu větší než 20 hodin. Takové plazmatické proteiny výčet není omezující) imunoglobuliny, sérový albumin, lipoproteiny, rozpustnou LT-β-Η molekulu na určitý také připojit k doméně scecificky lokalizovaný

Sekvence, buněčný nebo tkáňový typ, se mohou vázající ligand, aby se vytvořil extracelulární oblasti

ΙΤ-β-R obsahující doménu vázající ligand, se může fúzovat s konstantním úsekem imunoglobulinu, např. s

Fc doménou těžkého řetězce lidského IgGl (Browning a kol.

154: 33-46, 1995). Rozpustné fúzní proteiny jsou výhodné, jsou běžným imunologickým reag^ • · » · « · ·

« · ·· ·· » · · ·* • · · · « * - ·· « · · » · ·· ·*·-··

I · · 4 · · · ·· • » · · * * ·· ·· * * ·· jejich přípravy jsou v oboru dobře známy (viz např. U.S. patent č. 5,225,538, na který zde odkazujeme).

Fukční doména vázající ligand z LT-p-R se může fúzovat s Fc doménou imunoglobulinu (Ig) odvozeného z rmunoglobulinu jiné třídy či podtřídy než IgGl. Fc domény protilátek patřících do odlišných tříd nebo podtříd mohou aktivovat odlišné druhotné efektorové funkce. K aktivaci dojde, když se Fc doména naváže na vhodný receptor. Druhotné efektorové funkce zahrnují např. schopnost aktivovat komplement, křížově reagovat s placentou nebo vázat různé mikrobiální proteiny. Vlastnost různých tříd a podtříd imunoglobulinů jsou popsány v Roitt a kol., Immunology, s. 4.8, Mosby-Zear Book Europe Ltd., 3. vyd., 1993).

Aktivace komplementu iniciuje kaskádu enzymatických reakcí, které zprostředkovávají zánětlivou reakci. Jednotlivé produkty komplementu mají různé funkce včetně poutání bakterií, endocytózy, fagocytózy, cytotoxicity, produkce volných radikálů a solubilizace imunitních komplexů.

Enzymová kaskáda komplementu je aktivována Fc doménami protilátek IgGl, IgG3 a IgM s navázanými antigeny. Fc doména IgG2 se zdá být méně účinná a domény IqG4, IgA, IgD a IqE jsou zcela neúčinné v aktivaci komplementu. Takže se dá vybrat Fc doména v závislosti na tom, zda s ní spojená druhotná efektorová funkce je žádoucí pro určitou imunitní odpověď nebo nemoc, která je pomocí fůzního proteinu ύΤ-β-R-Fc léčena.

Pokud by bylo žádoucí poškodit nebo usmrtit cílové buňky nesoucí LT ligand, lze vybrat zvláště aktivní Fc doménu (IgGl) pro fúzni receptorový protein. Pokud by bylo žádoucí zacílit fúzni protein LT-p-R-Fc na buňku, aniž by se aktivoval komplement, vybere se neaktivní Fc doména IgG4.

• · · · · ·

eliminuji vazbu na Fc receptor a aktivaci komplementu, byly popsány íMorrison, S., Annu. Rev. Immunol. 10:239-265,

1992). Těchto mutací, ať už samotných nebo v kombinaci, lze £ C ΟΟκΊβΠΘ ,

nebo aktivity Fc domén užitých pro vytvoření fúzního proteinu ΤΤ-β-Κ-Εο.

Produkce rozpustného lidského fúzního proteinu obsahujícího sekvence vázající liaand fúzované s Fc doménou lidského imunoglobulinu (huT-p-R-Fc) je popsána v přikladu 1. Jedna linie buněk CHO vytvořená podle příkladu 1, která secernuje hLT-B-R-Fc, je nazvána „hLT ,R-hGl CHO 14. Vzorek byl deponován v Američan Tyoe Culture Collection (AJTCC, Rockville, MD) v souladu s Budapešťskou dohodou dne 21. července 1995 pod přístupovým číslem CRL11965.

Produkce rozpustného myšího fúzního proteinu ΤΤ-β-R (mLT-p-R-Fc) je popsána v příkladu 2. Buněčná linie CHO, která secernuje mLT-p-R-Fc je zvána mLT ,R-hGl CHO 1.3. BB. Vzorek této linie byl deponován v Američan Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) v souladu s Budapešťskou dohodou dne 21. července 1995 pod přístupovým číslem CRL11964.

Všechna omezení týkající se dostupnosti těchto deponovaných vzorků pro veřejnost budou zrušena, jakmile budou dány záruky udělení patentu pro tuto přihlášku.

Různá aminokyselinová rezidua tvořící spojovací bod ve fúznim proteinu receptor-Ig ovlivňuji strukturu, stabilitu a tedy i konečnou biologickou aktivitu rozpustného LT-β receptorového fúzního proteinu. Jedna nebo více aminokyselin se může přidat k C-konci vybraného fragmentu ΤΤ-β-R, a tak lze modifikovat spojovací bod ve vybrané fúzní doméně.

Také N-konec fúzního proteinu ΕΤ-β-R se může pozměnit tím, že se mění poloha, ve které je vybraný DNA fragment LT-B-R štěpen na svém 5'konci, aby mohl být vložen do « · · · · ·

rglcorabinsrícniho expresního vsKtoru. Stabilita a aktivita každého fúzního oiotsiiiu LT—B^—R se testuje a optimalizuje užitím rutinních testů a také pomocí testu pro výběr agens T) 1 q Vij i í c T,ψ — β — R _r ť 3 V ή 3 k ή £ ΏΩΌ S á P d Θ

Na základě sekvence domény ΝΙ-β-Κ vázající ligand uvnitř extraceluiární domény, která je ukázána na obr. 1, lze vytvářet různé sekvenční varianty, aby se modifikovala afinita rozpustného Lt-B recectoru nebo fúzního proteinu

LT-β-Κ podle vynálezu

Ή ligand.

ne

p ,-í q pf q η r, í m c rj é²¹ Q P Q ’^r Q Τ' \^r H''' — β — R předpokládat, že jakákoliv ro doménu LT-β-Κ vázající ligand, i p ,O p pl 7TT1 Χ'ο ,--ργ->+- r^, k·’ / T,T — R ŮŮ na povrchu buněk. Dá se zpustná molekula obsahující která soutěží s povrchovými navázání LT lioandů, ie blokující aqens ve smyslu předkládaného vynálezu.

Rozpustné molekuly LT-B-R jako agens blokující LT-β-Κ

Rozpustný lidský fúzní protein obsahující LT-β receptor a imunoglobulin íhLT-LT-B-R-Fc' byl vytvořen postupem popsaným v příkladu 1 a byla testována jeho schopnost blokovat cytotoxicitu lidských nádorovýcgh buněk

ukazují koncentrace, při kterých rozpustný LT-β receptor (hLT-LT-p-R-Fc) blokuje z 50 % odumírání nádorových buněk způsobené interakcí mezi ligandem ΣΤ-α1/β2 a LT-β receotory na buněčném povrchu. Schopnost blokovat růst nádorových buněk alespoň o 20 % charakterizuje LT-β receptory účinné jako agens blokující LT-β-Κ ve smyslu předkládaného vynálezu. Rozpustný fúzní protein s TNF-R Íp55-TNF-R-Fc) podle očekávání zcela blokoval inhibici růstu indukovanou ·· ···· • · povrchovým receptor ligandů ale lidský fúzni

Ni ú — iy p

TNF ani buňkami_z ab * es <

ma myši rozpustné ruzn

-β-R indukovanou LT-B-R.

r.

LT

Na obr je ukázán no β-R (mur-p-R-Fc) ligandem u myších na dráhu LT-B-R indukovanou LT /Λ

164 odumíraní oo ošetření (p55TNF-R-Fc) , použitý jako kontrola, měl jen malý viiv na

Τ.Τ-β-Ρ účinně kompetuje s povrchovými molekulami ηΤ-β-R o navázání

LT ligandu. Rozpustný fúzni protein mLT-B-P-Fc tedy působí

Zdroj protilátek proti lidskému LT~p~R

V jiném provedení tohoto vynálezu protilátky namířené proti lidskému LT-β receptoru (protilátka anti-LT-B-R) působí jako agens blokující LT-p-R. Protilátky anti-LT-p-R podle předkládaného vynálezu jsou buď polyklonální nebo monoklonální protilátky a lze je modifikovat tak, aby bylo • · dosaženo optimální schopnosti blokovat signální dráhu vivo biologickou dosažitelnost, stabilitu znaky.

sérum proti konvenčním

LT-p-R, jejich in nebo jiné žádoucí

Polyklonální připraví potkan, křeček nebo proteinem LT-p-R-Fc adjuvans, a intraperitoneální Freundovým požadované způsobem.

Myší proteinu LT-p-R-Fc se příkladu 5. Hybridomová buněčná lidskému LT-β receotoru se způsobem tak, že se koza, králík, myš subkutánr.ě injikuje lidským fúzním (příklad poté nebo

1) v následuje subkutánní kompletním druhá adjuvans.

protilátky monoklonální

Polyklonální se testuje injekce sérum

Freundově (spouštěcí) s neúplnými obsahuj ící obvyklým imunochemickým protilátky proti lidskému fúznímu připraví tak, jak je to popsáno v linie BD.A8.AB9 produkující myší monoklonální protilátku BDA8 namířenou proti lidskému LT-β-Ρ byla uložena v Američan Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) v souladu s Budapešťskou dohodou dne 12. ledna 1995 pod přístupovým číslem CRL11964. Všechna omezení dostupnosti pro veřejnost takto uloženého vzorku budou zrušena, jakmile budou dány záruky udělení patentu pro tuto přihlášku.

Různé formy protilátek anti-LT-B-R se mohou také připravit standardními technikami rekombinantní DNA (Winter a Milstein, Nátuře vytvořit chimérické vázající antiqen ze konstantní doménou (Cabily a kol., Proč. Nati. Acad. Sci.

349: 293-299, 1991). Například lze ve kterých jsou domény protilátky spojeny s lidskou kol., US 4,816,567, Morrison a protilátky, zvířecí

U.S.A. 81: 6851-6855, 1984).

Při klinickém použití bylo pozorováno, že chimérické protilátky redukují imunitní reakci vyvolanou zvířecími protilátkami použitými u člověka.

Kromě toho se moho syntetizovat i rekombinantní humanizované protilátky rozpoznáváj ící

LT-p-R.

• · · · • · · • · · · • · · · · · · • · ·

9·· • · •· • · •· •·

Humanizované protilátky jsou chimérické molekuly ob většinou sekvence lidského IqG, do nichž byly vloženy úseky, odpovídájlei za specifickou vazbu s antigenem (nap WO 94/04679). Zvířata se imunizují požadovaným, antigene se zodpovědný za antigenem. Úsek, odvozený ze za specifickou vazbu vhodného místa v genu lidské protilátky, antigenem, se pot oni odstraněna protilátky minimalizují užití heterolognich (mezidruhových) lidských protilátkách, a tudíž s mnohem pravděpodobností sekvenci v vyvolávají nežádoucí ímumtiní odpověď ošetřovaného.

Různé připravit třídy jako rekombinantních protilátek LT-β-κ se mohou chimérické nebo humanizované protilátky obsahuj ící (CH1, CH2, variabilní domény LT-B-R CH3) izolované z různých kO Π S13 Π i^- Ώ. Ί 0ΟΓΠθΏ.^τ·^Γ se zvýšenou valencí míst připravrr rekombinantní DNA tak, že se kl do vektoru, který obsahuje

J. Exp. Med.. 177:

J. Immunol. 22: 2573-78,

1993, Traunecker a kol.,

Navíc lze užít standardní techniky rekombinantní DNDA, aby se změnila afinita vazby rekombinantních protilátek s antigenem, a to tím, že se změní aminokyseliny sousedící s vazebným místem. Afinitu k antigenu protilátek lze zvýšit mutagenezí založenou humanizovaných na molekulárním modelování (Queen a kol., Proč. Nati. Acad.

U.S.A. 86:

10029-10033, 1989,

Je žádoucí zvýšit nebo snížit afinitu protilátek tkáně nebo • « · ·

tíylaktických důvodu je výhodné ošetřovat pacienta tak, dráze LT-B-R.

an β-Η se ,Τ-β-Η anti-LT-B-o ze

II \T myši buňkách cytotoxicitu monoklonální protilátku

LT-β-Η že

PUSODI j ako aaens smyslu detinovaném v tomto vynálezu

Nádorové buňky WiDr zastavují růst v přítomnosti IFN-γ nemá žádný vliv na inhibovat růst buněk

WiDr. Tskže

Očekává se, že se najdou další protilátky budou další vynálezu.

χλ ν'οΐ^- ί 1 -í z M i- V O J- -L způsoby a a testovat způsobem popsaným v předkládaném

Zdroj protilátek proti povrchovým LT ligandům

Jiné výhodné provedení vynálezu zahrnuje přípravky a způsoby, které obsahují protilátky, namířené proti LT

1igandům, které působí jako agens blokující LT-β-Η.

Stejně, • · • · · · • · • · • · ··· ··· ·· 'T i ] r) w individuálně proti jedné ze dvou podjednotek včetně rozpustných, mutovaných, změněných nebo podjedotek.

se je ooosa

-a e výhodné, když se výsledne homome r i c kým α/βΐ komplexům, se

Výhodně ai/B2 oroti protilátky puoliKOvány (Browning a kol., J.

testovat na antigen užit

Také monoklonálni anti-LT-α a anti-LT-β byl

Immunol. 154: 33-46 popsaným v příkladu 6. Hvoridomová buněčná linie

B9.C9.1 produkující myši proti-lidské monoklonálni protilátky anti-LT-β B9

Američan Type Culture Collection (ATCC, byla uložena v souladu s Budapešťskou dohodou dne 21. července 1995 pod

Křeččí procimyší monokionálni protilátky anti-LT-a1/β2 BB.F6 byly připraveny postupem popsaným v příkladu 7. Hybridomcvá buněčná linie BB.F6.1 produkující křeččí protimyši monokionálni protilátky anti-LT-al/pi BB.F6 byla uložena v Američan Type Culture Collection ÍATCC, Rockville, MD) v souladu s Budapešťskou dohodou dne 21. července 1995 pod přístupovým číslem HB11963. Všechna omezení dostupnosti pro veřejnost takto uloženého vzorku budou zrušena, jakmile budou dány záruky udělení patentu oro tuto přihlášku.

Protilátky anti-LT-ligand jako agens blokující LT-p-R

To 21” flourescenčně aktivovaných buněk (FACS) byl vyvinut ke sledováni e namířených proti LT podjednotkám a LT výběru protilátek komplexům, které mohou působit jako agens blokující LT-p-R (příklady 6 a 7). V tomto testu se přidají rozpustné lidské fúzní proteiny LT-p-R-Fc k buňkám 11-23, které exprimují povrchové LT komplexy (Browning a kol., J. Immunol. 154: 33-46, 1995), aktivovaným PMA, a to v přítomnosti zvyšujícího se množství testovaných protilátek. Protilátka, která inhibuje interakci ligandů s receptorem LT-β alespoň z 20 %, je pak vybrána jako agens blokující LT-p-R.

Výsledky takového testu, který sloužil k ověření monoklonálnich myších proti-lidských protilátek LT-β B9, jsou ukázány na obr. 4. Ukazuje se, že protilátka anti-LT-p-R B9 selektivně blokuje vazbu rozpustných fúzních proteinů LT-p-R-Fc a povrchových LT ligandů indukovanou na aktivovaných buňkách. Výsledky potvrzují, že protilátky namířené proti podjednotkám LT ligandů působí jako agens blokující LT-p-R.

FACS test popsaný výše byl také užit k testování křečcích monoklonálnich protilátek proti rozpustným myším komplexům LT-α/β (příklad 7). Výsledek tohoto testu • · • · « ·

protilátky BB.F6 (příklad /1 je ukázán v tab. 2. Ukazuje se, že monoklonální protilátka anti-LT-α/β BB.F6 účinně blokuje vazbu rozpustných fúznich proteinů ίΤ-β-Η-Εο (přiklad 2) a povrchových LT ligandů exprimovaných na myších hybridomových T buňkách, a tudíž je agens blokující ΙιΤ-β-R podle předkládaného vynálezu.

Použiti komplexů LT-α/β místo LT podjednotek jako antigenu pro imunizaci povede k účinnější imunizaci, anebo povede ke vzniku

LT ligandům. Lze pomocí komplexů LT-α/β rozpoznávají aminokyselinová rezidua o ro t i lidským heteromerickým komplexům ηΐ-α/β, které působí jako

Acens blokující Li-β—κ inhibuje kontaktní přecitlivělost zorostrecitovanou Tni ouňkami u mvší

Agens blokující LT-p-K podle předkládaného vynálezu může inhibovat imunitní odpověď zprostředkovanou buňkami Thl. Jeden takový typ představuje pozdní přecitlivělost, DTH (Cher a Mosmann, J. Immunol. 138: 3688-3694, 1987,

Roitt a kol., Immunology, s. 22.1-22.12, Mosby-Year Book Europe Ltd., 3. vydání, 1993). DTH je vyvolána, když Thl buňky citlivé k antigenu secernují cytokiny poté, co se znovu setkaly se stejným ant a aktivují makrofágy, které 1 molekuly, a ty spouští zánět·

Imunitní odpověď typu kontaktní, tuberkulinovou a Tyto 3 typy přecitlivělosti se odlišují rychlostí a ?

igenem. Thl cytokiny přitahují ivolňuji ještě další efektorové Livou odpověď.

DTH se rozděluje na 3 podtypy: granulomatózni přecitlivělost.

(hypersenzitivní reakce, HS) ovahou odpovědi na cizorodý • · • · · senzibil]. z ο va němu subjektu. Reakc pr<

ΓΓ!

-Λ Ί τ formou DTH reakci, ko τη k mnoha účinkům spojeným s nemocemi objevuje, kd‘ •t L rr může být vytváří pevnou strukturu zvanou granulom. Někdy dochá ]<

extenzivnímu odumírání buněk v

Látky ovlivňující frekvenci granulomů lze identifikovat pomocí myši infikovaných parazitem krevničkou

Parazitícká krevní motolice Scnizostoma způsobuje onemocněni vedoucí ke v z n i ku granulomů kolem motolice nakladených žilkách infikovaných

Agens _f ínhibujlei

Γ úl r í2.

se

Cl A rr·

Ύ', κ o n c e n trnčí

-S • ·

vzniká nový

Opakované spoušti DTH odpověď.

•/n 1Z. Ti ·.

n i- ~ ρ, ρηι p 1201 e i no vvm nos i čem * antigen, cvtokinů

Kaskáda uvolněných n·. rn no i n f i _L i^-ne.3 ^d^m otermc ^Q e odpověď na DTH ,7t

IJ téměř ,·—4 η

2,4-dinitrofluorobenzen (DNFB) • · • ·

Kožní reakce na hapten DNFB je klasickým zvířecím modelem buněčné (buňkami zprostředkované) imunity. Lokalizace této CHS odpovědi na ucho senzibilizované myši dovoluje snadno, přesně a reprodukovatelně kvantifikovat tuto buněčnou imunitní odpověď in vivo měřením tloušťky ucha. Podrobnosti CHS reakcí u myší a histopatologie zánětiivé odpovědi indukované DNFB byla popsána (Chisholm a kol., Eur. J. Immunol. 23: 682-688, 1993).

Schopnost DNFB větŠ2_n^w Ί GClinCU ΓΠύΖΘ které redukují nebo indukovat kontaktní přecitlivělost u být využita pro identifikaci látek, odpověď, buňkami.

zcela eliminují zánětlivou spojenou s DTH reakcí, zprostředkovanou Thl Rozpustný myši fúzni protein LT-p-R-Fc účinně inhibuj e odpověď kontaktní přecitlivělosti indukovanou DNFB u myši (příklad 8). Myši byly na počátku senzibilizovány aplikací DNFB do chodidla zadní nohy po dva následující dny. Pět dní poté byla aplikována podprahová dávka DNFB v roztoku nosiče na povrch, levého ucha. Samotný roztok nosiče byl pro kontrolu aplikován na pravé ucho.

Do myši pak byla vstřikována intravenózně rostoucí dávka agens blokujícího LT-β-Η (příklad 2, příklad 8). Injekce samotného pufru PBS nebo lidského fúzniho proteinu IgG LFA3-Fc sloužily jako negativní kontroly, a injekce monoklonální protilátky PS/2 specifické pro anti-VLA4, která inhibuje CHS, byla jako pozitivní kontrola. Po 24 hodinách byla změřena tloušťka každého ucha. Inhibice otoku ucha způsobená agens srovnáním s neošetřenou blokujícícm LT-β-Η byla posouzena skupinou a s negativní kontrolou.

Obr. 5 ukazuje, snížení otoku ucha iako že mLT-p-R-Fc způsobuje významné na aolikaci DNFB u mvší ve odoověď blokuje CHS monoklonální (PBS a stejně orotilátka PS/2 reakci

LFA3-FC). Rozpustný LT-β-Η účinně jako inhibitorová specifická pro anti-VLA4, která působí tak, že blokuje vstup T buněk do místa • · • «

Eur. J. Immunol. 23:

6b2-6bs, i9a3) .

Tyro údaje ukazují, že rozpustný fúzní protein LT-β-Η, který působí jako agens blokující LT-β-Η in vitro také účinně Inhiouje imunitní odpověď zprostředkovanou Thl buňkami po podáni zvířeti. Agens blokující LT-β-Η podle tohoto vynálezu, identifikované testem in vitro, se může testovat testem sledujícím otok ucha popsaným výše a může se tak vybrat další agens blokující LT-β-Η, které je ijŽÍrgďp.é CTO ΖΓΓ1Θ Š Θ ΓΊ í. S2_J_V Imm í t 0 OCÍOOVěci i 3Ό0ΊΘΠΘ S Tni buňkami ín vivo.

Lt-B-k e např.

odpověď u kázáno mechanismus zorostředkovaný Thl pozdní kontaktní přecitlivělost inhibována ani z k ovlivnění imunitní odpovědi na agens blokuj ic li v na

T‘h2 ukázán imunitní závislé na

Th2 buňkách, primární a změna v- í +- n za c? Ή ή rr o n o· hlíAlrnníníhri

LT-β-Κ.

myši buď rozpustným fúzním proteinem

LT-β—R oříklad 2} nebo kontrolním IaG fúzním

Po myši injikovány 100 μΐ kompletního Freundova κoΓθπ i ocasu. t^jo se 100 μρ ovalbuminu sledovány metodou ELISA ke titry primárních sérových protilátek specifických proti • · • · · ·

Obr. 6 ukazuje vliv acens blokujícího myší

LT-p-R

Podání ímLT- P-R-FO) na orodnkci orotlaiouminovvch protilátek v séru mysl imunizovaných ovaidum.inem (přiklad 9).

agens blokujícího pri mární on oronii receptoru Cu4G indukovaná 1 antiqenně specifickou odpověď neovlivnilo významně srovnán í si qnáln í ígandem CD40 úplně (Renshaw myš i

94) .

který patři do blokuje

CD4 0 je dalším z řady rodiny TNF.

na

Tti2 imunoglobulinů buňkách. Ale je cytokin IlN-v pro změnu na se účastní, ale přitom podtřídu imunoglobulmů není zcela ( Huang nezbytný a kol.,

Science 2o9:

17'42-1745,1993). Agens blokující (mLT-p-R-Fc) neinhibuje zrněnu

Je možné, vynálezu že agens blokující neblokuje na IgGla

LT-p-R humoráiní

LT-β-Η v těchto pokusech.

buňkami. Kromě podle předkládaného stránku odpovědi toho, proiiferační odpověď iymfocytů u myši ošetřených mLT-p-R-Fc nebyla snížena (příklad 10, obr. 7).

Tyto pokusy ukazují, že terapie založená na podávání.

agens blokujícího LT-p-R podle vynálezu neovlivňuje nepříznivě produkci protilátek v imunitní odpovědi zprostředkované Th2 buňkami. Normální profil protílátkové odpovědi, ukázaný na obr. 6, také ukazuje, že intenzivní ošetřováni myší mLT-p-R-tc není pro ně toxické, a dále ukazuje terapeutickou užitečnost přípravků podle vynálezu. Onemocněni zprostředkovaná pomanačskýmí T buňkami

Mnoho orgánově specifických autoimunitních stavů zahrnuje pato logickou odpověď Thl buněk. Přehledy z poslední doby přinášejí Modli.n a Nutman, Current Opinion in Immunol. 5: 511-517, 1993, Romagnani a kol., Ann. Rev.

Immunol. 12: 227-257, 1994. K orgánově specifickým autoimunitním stavům patři: roztroušená. mozkomišní

skleróza, diabetes rnellývus závislý na ) nz.ulínu, svrioazizzá oftalmie. nveirida a luoonka.

Diaoet.es meilir.us závisl·/ na miirin·: ^e autozmunzrni nemoc, při které jsou nera ouňuy pankreatu produkuiící inzulín zničeny infiltraci leukccwl: oe Lvcerwyých ostrůvků. Diaoetes může být scaoco inourovýn a novorozezýcn neobéznicn diabetických (NGD1 myší *in. že se přenesou aktivované prediabetické splenocyty. Bečev podobné Thl a T h z. b u 1. í není, j i Od \ o e nez c < v ve 1. m 1 oo cl ρ ρ n e , by ! y o r 9 a e s e a v do novorozených NOD myší. Pouze Thl buňky i noc kovaly rvchle diabetes téměř a všem při.ňemců (Katz' a. kel., Science 26S: 1185-1188, 1995) . To ukazuje, že agens blokující LT-β-Ρ pod 1 e vynáiezn, krere vivc íivwe vMv imynícrý ooooveoi z o ro s z r se co va a s mi omsa~· , ouce uz.:r.ecne oro léčení nebo prevenci diabetů závis léno na inzulínu.

Některá systémová autoimunitní onemocnění, včetně různých artritid, jsou spojená s Thl buňkami. Revmatoidní artritida a Sjorgrenův syndrom zahrniýl také ThO a Thl buňky. Naproti tomu systémový lupus ervthematosus (SLE1 je spojen s aberatní ThíýTll dominannni odcověci.

λΤο /ř α r r> Π Ω Ω ⁿ Ί Ω k Ω 7. á Π éΓ ί Ί \^TA O7' 9Ϊ7ΩΩ ΠΘ7 ’ V⁵J kΩ 7 7 ~ ^Ί ~~ Ω Ω aberantní odpověď Thl rvou, včetně zánět.Livé střevní choroby, olicní sarkoidózv a oono^ení allošhěpu. Zánětlivá choroba střev (Tnflammatory bowel disease. IBD) u člověka zahrnuje alespoň dvě kategorie, ulcerickou kolitidu a Crohnovu nemoc. Obě choroby jsou důsledkem imunopatolopické poruchy podobné autoimunitním poruchám.. U myšího modelu IBD je zřejmé, že některé látky blokující Tni odpověď mohou blokovat rozvoj nebo průběh nemoci (Powrie, F. a kol·., Immunity 1: 553, 1994) . Je možné, že inhibice Thl složky munitní odpovědi by mohla mít prospěšný vliv také na lidskou IBD. Mnoho modelů IBD bylo již popsáno a uvádí je v přehledu Elson, C. a kol. íGastroentero loqy 109: 1344 ,

1995). Existují nejméně 3 skupiny modelů, modely chemicky • · · · • · indukované, modely indukované ί m 11 r o> - r a n ó m r α i

... sz - Lis.- L

U jednoho všeobecně užívaného polymery nebo mikroorganismy, ro z to k dextransulfátu do epiteliáiní výstelka imunitní odpovědi vyvine která se iko průjem, krev ve stolici, ztráta tělesné hmotnosti stmevni sténv.

levostrannou vé s t až k rakovině, kolitida.

Druhý model představuje

T buněk CD4 do

F.

International.

Immunology 5:

, Morrissey

Med. 178:

vyb rané buňky, z vana myši. j normální mechanismus zabraňující vzniku autoreaktivních '>· tudí ž se se objevují buňky reagující s mnoha orgány, zatímco u mvši excanze primárně a vývoje ve střevě. Látky, nud* zrněni mono u zablokovat schopnost buněk naoadat budou účinné v tomto modelu. Avšak jelikož do jisté míry napodobuje patologický rozvoj autoreaktivních buněk model, bude systému, ošetření, teré plně blokuje pravděpodobně jen modifikovat průběh nemoci u tento modelu protilátky proti TNF blokují nemoc (Powrie a kol. Immunity 1: 552, 1994) byly účinné při ošetřeni člověka (van

Dullemen, H.M. a užít pro předpověď a testováni těch láte k, které mohou být • · · ·

terapeuticky účinné chorobného procesu v BDH. Model CD45RB je pří klát zprostředkovaného Thl buňkami ř skutečně u potkanů vede k onemocnění LT-p-R-Ig v tomto modelovém systému nebo jiné prostředky, blokující ligandem, mohou být prospěšné v imunologických onemocnění.

Obecně nebyl dosud přesně autoprotilátek ve srovnání se spec mnoha orgánů. Účinnost ukazuje, že LT-p-R-Ig interakce ui —β—v s celé řadě příbuzných těchto autoimunitních chorob. Buněčná odpověď tvoří zřejmě hlavní příspěvek k patogeničnosti při těchto systémových autoimunitních nemocech, které jsou v současnosti považovány za primárně způsobené protilátkami, např. různé artritidy.

Normální imunitní odpověď na některá patogenní infekční agens také vyvolá odpověď Thl buněk, která může být nadměrná a představuje sama značný problém. Příklady granulomatózních reakcí (třída DTH reakcí popsaných výše), které vedou k vážným zdravotním problémům, zahrnují lepru, tvorbu granulomů v plicích tuberkulózních pacientů, sarkoidózu a schizostomiázu (Roitt a kol., Immunology, s. 22.5-22.6, Mosby-Year Book Europe Ltd., 3. vydáni, 1993). Lupénka je pravděpodobně také zprostředkována Thl buňkami.

Cytolytické T buňky, t.j. CTL (CD8 pozitivní T buňky, CD8+) se dělí také do dvou subpopulací podobných Thl a Th2 buňkám. Je proto možné, že to, co je známo o Th skupinách, platí také pro CD8+ buňky, které se primárně účastní antivirové imunitní odpovědi a odhojení štěpu.

Léčení podáváním agens blokujícího ΕΤ-β-R

Přípravky podle vynálezu se budou podávat v účinné dávce k léčení určitých klinických stavů. Určení výhodného farmaceutického přípravku a terapeuticky účinné dávky a režimu pro určité použití je plně zvládnutelné v rámci « « · · · * současného stavu oboru, např. v závislosti na hmotnosti pacienta, rozsahu požadovaného léčeni, toleranci pacienta. Dávky v hodnotě 1 mg/kg rozpustného ΤΤ-β-R jsou vhodným výchozím bodem pro optimalizaci léčebných dávek.

Vhodné terapeuticky účinné dávky se také mohou stanovit provedením pokusů in vitro, ve kterých se měří koncentrace agens blokujícího LT-p-R potřebná k vysycení povrchu cílových buněk (v závislosti na agens buď buňky pozitivní na LT-p-R nebo LT ligand) během 1 až 14 dnů. Test založený na sledování vazby ligand-receptor popsaný zde se může použít ke sledování reakce vysycování povrchu buněk. Buňky pozitivní na LT-β-Η nebo LT ligand se dají separovat od populace aktivovaných lymfocytů pomoci FACS. Na základě výsledků testů in vitro lze stanovit vhodný rozsah koncentrací agens blokujícího LT-β-Η pro další testování na zvířatech způsobem popsaným ve vynálezu.

Podávání rozpustných molekul LT-β-Η, protilátek anti-LT-ligand a anti-LT-β-Η podle vynálezu, samotných nebo kombinovaných, včetně izolovaných a purifikovaných forem protilátek nebo komplexů, jejich solí nebo farmaceuticky přijatelných derivátů, lze provádět obvyklými způsobem pro podávání látek s imunosupresivní aktivitou.

Farmaceutické přípravky pro tuto· terapii mohou být v různých formách. To znamená např. tuhé, polotuhé nebo tekuté dávkovači formy jako např. tablety, pilulky, prášky, roztoky nebo suspenze, čípky, injekční a infúzní roztoky. Výhodná forma závisí na požadovaném způsobu podávání a terapeutickém použití. Způsoby podávání zahrnují aplikační cestu parenterální, perorální, subkutánní, intravenózní, topickou a intralézní (do poškozeného místa).

Rozpustné molekuly LT-β-Η, ligandy anti-LT a protilátky anti-LT-β-Η podle vynálezu se mohou např. přidat do sterilního izotonického přípravku, buď s anebo bez kofaktorů stimulujících příjem nebo stabilitu. Přípravek je • 4··

• · ·· *· • * · • · • « «· * * t> « · ν· · · výhodně tekutý nebo lyofilizovaný prášek. Přípravek se z rozpustných molekul ΕΤ-β-R, ligandů anti-LT a protilátek anti-LT-p-R podle vynálezu vytvoří např. tak, že se naředí pufrem, který obsahuje 5,0 mg/ml monohydrátu kyseliny citrónové, 2,7 mg/ml trinatrium-citrátu, 41 mg/ml manitolu, 1 mg/ml glycinu a 1 mg/ml polysorbátu 20. Tento roztok se lyofílizuje, uskladní zamražený a rekonstituuje před použitím sterilní vodou pro injekce.

Přípravek také výhodně obsahuje obvyklé farmaceuticky přijatelné nosiče, dobře známé v oboru (viz např. Remington Pharmaceutical Sciences, 16. vyd., 1980, Mac Publishing Company). Takové farmaceuticky přijatelné nosiče zahrnují další medicinální agens, nosiče, genetické nosiče, adjuvans, excipienty a další, např. lidský sérový albumin nebo preparáty z plazmy. Přípravek je výhodně v podobě jednotkové dávky a podává se jedenkrát nebo vícekrát denně.

Farmaceutický přípravek podle vynálezu lze podávat také pomocí mikrosfér, lipozomů nebo jiných mikročásticových systémů anebo retardet umístěných přímo v ovlivňovaném orgánu, v jeho blízkosti anebo v jiném spojení s ním, nebo v krevním oběhu. Vhodným příkladem takové lékové formy s prodlouženým uvolňováním léčiva je semipermeabilní polymerní matrice formovaná do tvaru čípků nebo mikrotobolek. Implantovatelné nebo v mikrotobolkách použitelné matrice zahrnuji polylaktidy (U.S. patent č. 3,773,319, EP 58,481) kopolymery kyseliny L-glutamové a etyl-L-glutamátu (Sidman a kol., Biopolymers 22: 547-556,

1985), poly-2-hydroxyetylmetakrylátu nebo etylvinylacetátu (Langer a kol., J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277, 1981,

Langer, Chem. Těch. 12: 98-105, 1982).

Lipozomy obsahující rozpustné molekuly LT-p-R, ligandy anti-LT a protilátky anti-LT-p-R podle vynálezu, samotné nebo v kombinacích, se připraví dobře známým způsobem (viz např. DE 3,218,121, Epstein a kol·., Proč. Nati. Acad. Sci.

U.S.A. 82: 3688-3692, 1985, Hwang a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 77: 4030-4034, 1980, U.S. patenty č. 4,485,045 a 4,544,545). Lipozomy jsou obvykle malého (200 až 800 Angstrom) jednovrstevného typu, a obsah lipidů je vyšší než 30 % (molárních) cholesterolu. Podíl cholestrolu se vybere tak, že řídí optimální míru uvolňování rozpustných molekul

ΕΤ-β-R, protilátek anti-LT-ligand a anti-LT-p-R.

Rozpustné molekuly LT-p-R, ligandy anti-LT a protilátky anti-LT-p-R podle vynálezu se mohou připojit k lipozomům obsahujícím jiná agens blokující ΕΤ-β-R, imunosupresiva nebo cytokiny modulující aktivitu blokující

LT-p-R.

Navázání rozpustných molekul

LT-p-R, ligandů anti-LT a zesíťovacím protilátek činidlem anti-LT-p-R se provede známým zesíťovacím činidlem, jako např.

heterobifunkčním které se užívá pro navázání toxinů nebo chemoterapeutických agens na protilátky pro cílené podávání. Konjugace s lipozomy se dá také uskutečnit užitím zesíťovacího činidla zacíleného na sacharidy 4-(4-maleimidofenyl)hydrazidu kyseliny máselné, MPBH (Duzgunes a kol., J. Cell. Biochem. Abst. Suppl. 16E 77, 1992) .

Výhody terapeutických přípravků obsahujících agens blokující LT-p-R

Agens blokující LT-p-R podle vynálezu je schopné selektivně inhibovat imunitní efektorový mechanismus zprostředkovaný Thl buňkami, ale nikoliv mechanismus zprostředkovaný Th2 buňkami. Agens blokující LT-p-R bude užitečné pro léčení stavů, které jsou exacerbovány aktivitami cytokinů Thl typu (např. IL-2 a IFN-γ) . Protože Thl cytokiny inhibují imunitní odpověď závislou na Th2 buňkách, agens blokující LT-p-R tak může nepřímo stimulovat určité odpovědi závislé na Th2, které jsou normálně inhibovány kaskádou cytokinů indukovanou Thl buňkami.

· • · · · β

• 4

Schopnost selektivně potlačovat buněčnou odpověď Thl (nebo nepřímo stimulovat Th2) je užitečná pro léčení abnormalit různých typů buněčné imunitní odpovědi, včetně různých autoimunitních a chronických zánětlivých stavů, tolerance antigenu a buněčného odhojení tkáňového štěpu nebo orgánového transplantátu.

Jak bylo zmíněno již výše, léčení imunologických stavů zprostředkovaných Thl buňkami využívá imunomodulační a imunosupresivní agens, která široké spektrum buněčných typů imunosuoresivní

3.

nespecifická vyžadována ve které způsobují vysokých a často řadu vedlejších účinků.

agens jsou zpravidla i cytotoxických dávkách,

Schopnost měnit charakter imunitní odpovědi je podporována nedávnou studií diabetů u myší (Katz a kol., Science 268: 1185-1188, 1995) a u modelu allogeníno transplantátu (Saegh a kol., J. Exp. Med. 181: 1869.1874,

1995). Ve studii Saegha (viz výše) je ukázáno, že fúzní protein, blokující kostimulační dránu T buněk CD28-B/, indukuje toleranci ke štěpu z ledviny. Tolerance korelovala se snížením Thl cytokinů a se zvýšením Th2 cytokinů in vivo. Tyto údaje ukazují, že agens blokující ύΤ-β-R podle vynálezu bude užitečné v potlačení odhojení tkáňového štěpu nebo orgánového transplantátu tím, že innibuje uvolňování cytokinů zprostředkované Thl buňkami.

Agens blokující ύΤ-β-R v přípravku a způsobu podle vynálezu se může modifikovat, aby se dosáhlo požadované úrovně signální dráhy ύΤ-β-R v závislosti na stavu, poruše nebo nemoci, která je léčena. Lze předvídat, že absolutní úroveň signální dráhy LT-β-Η může být jemně nastavena tím, že se budou měnit koncentrace a afinity (k příslušným molekulárním cílům) činidel blokujících LT-β-Κ.

Například v jednom provedeni vynálezu je přípravek obsahující rozpustné molekuly LT-β-Η podán subjektu.

• · ······ ·· «· • · ·· · · « · · · · • 9 · · · · * · · • · ·· · · · · · · · · • · «··· · · · ··· · · · ·· · · · * ··

Rozpustný receptor LT-β-Η účinně soutěži s receptory LT-β na povrchu buněk o navázání povrchových ligandu. Schopnost kompetice s povrchovými ligandy je závislá na relativních koncentracích rozpustných LT-β-Η a molekul LT-β-Η na buněčném povrchu, a také na jejich relativních afinitách pro vázáni ligandu.

Rozpustné molekuly nesoucí mutace, které zvyšují nebo snižují vazebnou afinitu daného mutantního rozpustného LT-β-Η k povrchovému ligandu, se mohou vytvořit technikami rekombinantní DNA, odborníkovi dobře známými. Velký počet molekul s místně cílenými nebo náhodnými mutacemi se může testovat na svou schopnost působit jako agens blokující

ΤΤ-β-R užitím rutinních pokusů a způsobů popsaných v předkládaném vynálezu.

Podobně v jiném provedeni vynálezu protilátky namířené proti LT-β receptorům nebo proti jedné či více podjednotkám LT ligandu působí jako agens blokující LT-β-Η. Schopnost těchto protilátek blokovat signální dráhu receptoru LT-β se může modifikovat mutací, chemickou modifikací nebo jiným způsobem, který může změnit účinné koncentrace nebo aktivity protilátky podané subjektu.

Schopnost snížit aktivitu signální dráhy LT-β-Η, aniž by se úplně inhibovala, může být důležitá pro ustanovení nebo udržení redukované hladiny která podporuje normální imunitní signální dráhy LT-β-Η, funkci zatímco inhibuje odpovědi zprostředkované Thl buňkami, které převyšují normální úroveň nebo jsou jinak abnormální.

Poškození genu LT-α u myši vede k aberantnímu vývoji periferních lymfoidních orgánů (DeTongi a kol., Science

264: 703-707, 1994). Takovéto myši postrádají lymfatické uzliny a v jejich slezinách chybí ve folikulecn obvykle zcela jasná hranice mezi oblastmi bohatými na B buňky a T buňky. Věříme, že tento fenotyp je spojen se ztrátou signální dráhy LT-β-Η indukované povrchovými LT, protože • · · ·

podobné fenotypy nebyly pozorovány, když se modulovala aktivita TNF-R. Schopnost selektivně nebo částečně blokovat dráhu LT-p-R může být užitečná prc léčení abnormálního vývoje lymfoidních orgánů, který je způsoben chybnou nebo nadměrnou expresi v signální dráze LT-p-R.

Některé reakce spojené s Thl jsou kritickými složkami řady forem imunitní odpovědi zprostředkovaných buňkami (Romagnani, S., Ann. Rev. Immunol. 12: 227-257, 1994), a proto úplná inhibice aktivity Thl buněk může být za určitých okolností nežádoucí. Např. myš je účinně odolná k parazitární infekci, pokud je aktivována dobrá Thl odpověď. Infekční agens jako např. Listeria a Toxoplasma vyvolávají silnou odpověď Thl typu. U člověka je odpověď vyvolaná Mycobacterium tuberculosis také založena na Thl typu. Patogenicita leishmanióz koreluje s odpověďmi podobnými Thl odpovědi u myší (Reed a Scott, Current Opinion in Immunol. 5: 524-531, 1993).

Schopnost ovlivňovat míru Thl inhibice blokováním signální dráhy LT-p-R je důležitá pro maximalizaci prospěšných výsledků, kterých lze dosáhnou léčením, při němž se použije agens blokující LT-p-R podle předkládaného vynálezu.

Následující příklady ilustrují rozpustné LT-p receptory, anti-LT ligandy a protilátky anti-LT-p-R podle vynálezu a způsoby použité pro jejich charakterizaci. Tyto příklady nejsou žádným způsobem omezující, jejich účelem je osvětlit a ilustrovat vynález. Předkládaný vynález je omezen pouze uvedenými nároky.

Popis obrázků

Claims (2)

1. Obr. 1. Sekvence extracelulární části lidského receptoru LT-p, která kóduje doménu vážící ligand.

   • · · ·

   Obr.
2. 2. Rozpustný myši LT-β receptor spojený s doménou Fc lidského IgGl (mLT-p-R-Fc) blokuje ΕΤ-β-R signální dráhu u myších buněk WEHI po indukci myším ligandem LT-α/β. Buňky WEHI 164 odumírají v závislosti na rostoucí koncentraci LT ligandu (mLT-α/β). Rozpustný mLT-p-R-Fc v koncentraci 10 mg/1 blokuje ligandem indukované odumírání. Rozpustný myší TNF receptorový fúzni protein (p55TNF-R-Fc) má jen malou účinnost v blokování odumírání buněk po aktivaci LT-α/β. Růst byl kvantifikován po třech dnech měřením optické hustoty (OD 550) po reakci MTT, což je úměrné počtu buněk.

   Obr.3. Monoklonální protilátka namířená proti lidskému LT-p-R (BDA8) blokuje interakci mezi rozpustným LT ligandem a LT-p-R na povrchu lidských buněk. Růst nádorových buněk WiDr je blokován kombinaci IFN-γ a rozpustného ligandu LT-al/p2. Protilátka BDA8 blokuje schopnost ligandu LT-al/p2 inhibovat růst nádorových buněk WiDr. Plné symboly v grafu ukazují růst kontrolních buněk v přítomnosti IgGl mAb (10 μς/l). Prázdné symboly ukazují vliv anti-LT-p-R protilátky BDA8 (10 μρ/l).

   Obr. 4. Monoklonální protilátka namířená proti lidskému LT-β (B9) blokuje interakci mezi povrchovým ligandem LT-α/β a rozpustným LT-β receptorem (hLT-p-R-Fc, 2 gg/ml). Povrchově vázaný LT-p-R-Fc byl detekován pomocí oslí protilidské protilátky IgG značené fykoerytrinem a následnou analýzou na třídiči buněk (FACS). Průměrná intenzita fluorescence výsledného vrcholu je vynesena v grafu jako číslo kanálu. Čárkovaná čára ukazuje průměrnou intenzitu fluorescence odpovídající množství vázaných receptoru bez přítomnosti B9.

   Obr. 5. Vliv agens blokujícího LT-p-R (mLT-p-R-Fc) na otok ucha u myšího modelu kontaktní pozdní přecitlivělosti (DTH). Graf ukazuje zvětšení tloušťky ucha měřené 24 hodin po vnesení antigenu 0,2% DFNB do ucha senzibilizované myši. Každý symbol představuje samostatný pokus. Ve všech • · · · pokusech bylo užito 7 až 8 myši na jedno měřeni kromě těch, která jsou označena kosočtvercem, v nichž byla užita jen 4 zvířata. Jako negativní kontrola sloužily myši ošetřené pufrem (PBS) a nebo kontrolním fúzním proteinem IgG LFA3-Fc >20 mg/kg) . Myši ošetřené monokionálni protilátkou anti-VLA.4 (PS/2 mAb) v koncentraci 8 mg/kg, která inhibuje otok ucha způsobený kontaktní DTH, sloužily jako pozitivní kontroly.

   Obr. 6. Graf ukazuje změny hmotnosti pozorované u myší 14 dní po ošetření fúzním proteinem mLT-p-R-lg a hLFA3-lg.

   Obr. 7. Graf ukazuje délku tlustého střeva pozorovanou 14 dni po ošetřeni fúzním proteinem mLT-p-R-lg a hLFA3-lg.

   Obr. 8. Časový průběh tělesné hmotnosti myší po injekci CD45RB^ní2Ky CD4 pozitivních T buněk, CD45RB^vy“^<y CD4 pozitivních T buněk, CD45RB^vysoky a inLTPR-lg, CD45RB^vy3CKy a hLFA3-lg.

   Obr. 9. Grafická reprezentace průměrů a směrodatných odchylek tělesné hmotnosti pozorované v pokusech zobrazených na obr. 8 až 11.

   Obr. 10. Graf ukazuje zvýšení tloušťky chodidel zadních končetin myší po injekci negativní a pozitivní kontroly a mLTPRlg.

   Příklady provedeni vynálezu

   Příklad 1

   Příprava rozpustných lidských LT-β receptorů v podobě fúzních proteinů s imunoglobulinovým Fc

   Sekvence cDNA lidského klonu izolovaná z lidské knihovny 12p transkribovaných sekvencí odvozená ze somatických hybridních buněk (Baens a kol., Genomics 16: 214-218, 1993) byla vložena do GenBank a teprve později byla identifikována jako sekvence kódující lidský ύΤ-β-R.

   • · · · • · ♦

   Úplná sekvence cDNA lidského ΣΤ-β-R je dostupná od r. 1992 v Gen Bank pod položkou č. L04270.