CZ298277B6 - Farmaceutický přípravek obsahující agens blokující receptory lymfotoxinu-beta - Google Patents

Abstract

Řešení se týká farmaceutických přípravkůobsahujících "agens blokující receptor lymfotoxinu-.beta.", např. rozpustných forem extracelulární domény receptoru lymfotoxinu-.beta. nebo protilátek namířených buď proti receptoru lymfotoxinu-.beta., nebo jeho ligandu, povrchovému lymfotoxinu, které blokuje signální dráhu receptoru lymfotoxinu-.beta.. Agens blokující receptor lymfotoxinu-.beta. je užitečné pro léčení imunologických onemocnění zprostředkovaných lymfocyty a zejména pro inhibici imunitní odpovědi zprostředkované Th1 buňkami.

Description

Oblast techniky

Vynález sc týká přípravků a způsobů, obsahujících „agens blokující receptor lymfotoxinu-β. které blokuje signální dráhu lymfotoxinu-β. Agens blokující receptor lymfotoxinu-β je užitečné pro léčení imunologických onemocnění zprostředkovaných lymfocyty. a zejména pro potlačeni imunitní odpovědi zprostředkované Thl buňkami. Vynález sc týká rozpustných forem extraio celulámích domén receptorů lymfotoxinu-β, které působí jako agens blokující receptory lymfotoxinu-β. Vynález se dále týká použití protilátek namířených proti recept ořům lymfotoxinu-β nebo jejich ligandúm, povrchovým lymfotoxinúm. které působí jako agens blokující receptory lymfotoxinu-β (LT-β). Vynález poskytuje nový způsob pro vyhledávání rozpustných receptorů. protilátek a dalších činidel, které blokují LT-β receptorovou signální dráhu.

Dosavadní stav techniky

Spek trém cytokinů. které se začnou uvolňovat po spuštění imunitní odpovědi, ovlivní následně 20 výběr imunologických efektorových drah, které budou aktivovány. Výběr mezi inninitnínii cfaktorovým i mechanismy jc zprostředkován CD4-pozilivními pomahačskými T lymfocyty (Th buňkami). Tli buňky interagují s buňkami prezentujícími antigen (APC). které exponují na svém povrchu peptidové fragmenty nebo zpracovaný cizorodý antigen ve spojeni s molekulami MI1C II. třídy. Buňky jsou aktivovány, když rozpoznají určité epitopy nebo cizí antigen na vhod25 ném povrchu APC. pro který’ Th buňky exprimují specifický receptor. Aktivované Th naopak scccrnuji cytokiny (lymťokiny), které aktivují příslušný imunitní efektorový mechanismus.

Th buňky mohou aktivoval různé efektorovc mechanismy, které zahrnují aktivaci zabiječských T buněk, vytváření protilátek B buňkami anebo aktivaci makro fágů. Výběr efektorového mecha30 nismu je zprostředkován do značné míry tím. jaké cytokiny jsou produkovány aktivovanými Th buňkami.

Buňky se děli do třech podskupin podle toho, jaké cytokiny scccrnují (Eitch a kol., Ann. Rev. Immunol. 11: 29-48, 1983). Tyto podskupiny sc nazývají ThO, ThI a Th2, Např. u myši nesti35 nnilované ..naivní pomahačskc T buňky produkují 11-2. Krátkodobá stimulace vede k přeměně na ThO prekurzorovou buňku, která produkuje řadu cytokinu včetně IFN-γ. 1L-2, IL—4, IL 5 a IL-10. Trvale stimulované ThO se mohou diferencovat buď na Thl. nebo Th2 buňky, v závislosti na změně typu exprimovaných cytokinů.

Některé cytokiny jsou uvolňovány jak Th 1, tak i Th2 buňkami (např. IL—3, GM-CSF a ΤΝΓ). Jiné cytokiny jsou vytvářeny výlučně jednou podskupinou Th buněk. Specializovaný vliv pomalí ačských T buněk byl rozpoznán poprvé u myší. Podobné dělení pomahačských T buněk existuje také u člověka (Roniagnani a kol.. Ann, Rev. Immunol. 12: 227 257. 1994).

Thl buňky produkují LT-α, IL—2 a IFN-γ. Profil sekrece cytokinů odpovídající Ihl buňkám je u lidí obecně spojován s buněčnou imunitou a odolností proti infekci. Cytokiny Thl buněk přispívají k aktivaci makrofágů a k určitému typu zánětlivé reakce, jako je např. přecitlivělost IV. typu, tzv. pozdní přecitlivělost. Cytokiny typu Thl mají důležitou úlohu v buněčné odpovědi na tkáňový štěp, a sice odhojení štěpu nebo orgánového transplantátu.

Th2 buňky produkují cytokiny IL^L IL-5, 11-6 a IL-10. Cytokiny TI12 buněk zvyšují produkci eosinofllů a žírných buněk a podporují plný rozvoj a zrání B buněk (Howard a kol., T-cell derived cytokines and their receptors. Fudnamental Immunology, 3^rd ed., Raven Press. New

York, 1993). Cytokiny Th2 typu také zvyšuji produkci protilátek včetně protilátek IgL. které jsou

CZ 298277 Β6 spojeny s alergickou odpovědí a s protilátkami proti štěpu, Th2 buňky se podílejí na imunosupresi a toleranci k perzistentnímu antigenu.

Cytokiny spojené s Thl a Th2 buňkami hrají roli při určitých typech přecitlivělosti (hypersenzitivity). což je nepřiměřená imunitní odpověď vyvolaná opakovaným kontaktem s již dříve rozpoznaným antigenem. Existují čtyři typy přecitlivělosti (Roitt a kol.. Immunology. ss. 19.1-22.12. Mosby-Year Book Europe Ltd., 3^rd eď„ 1993).

Přecitlivělost I, typu. tzv. „časná přecitlivělost, zahrnuje aktivaci Hi2 buněk indukovanou alergenem a uvolnění cytokinů typu Th2. Cytokin IL—4 stimuluje B buňky ke změně izotypů na produkci IgE. což aktivuje žírné buňky, a vzniká tak akutní zánětlivá reakce, která vede např. k ekzému, astmatu nebo rýmě.

Přecitlivělost II. a ÍIL typu je způsobena protilátkami IgG a IgM namířenými proti buněčnému povrchu nebo specifickým tkáňovým antigenům (II. typ) anebo rozpustným sérovým antigen ům (111. typ). Má se za to. žc tyto typy přecitlivělosti nezahrnují Th buňky.

Přecitlivělost IV, typu, tzv. „pozdní přecitlivělost“ (DPH) je zprostředkována Thl buňkami. Reakce DTH se vyvíjí více než 12 hodin a popisuje sc jako reakce „zprostředkovaná buňkami, protože může být přenesena mezi pokusnými myšmi Thl buňkami, ale nikoliv samotným šerem. Odpověď IV. typu, ledy DTH. se rozděluje na 3 podtypy: kontaktní, tuberkulinovou a granulomatózní přecitlivělost.

Buňkami zprostředkované reakce, které způsobují nemoc, jsou indukovatelné u zdravých myší tím. že se do nich přenesou lymfoeyty z nemocných myší (např. diabetes závislá na inzulínu, experimentální aulo imunitní encefalitida) Tímto rysem se odlišuje DTH IV. typu od přecitlivělosti jiných typů, které představují humorální imunitní odpověď zprostředkovanou primárně protilátkami, a tudíž jsou přenosné bezbuněčným šerem.

Pomahačské T buňky se také podílejí na regulaci změny izotypů imunoglobulinii de novo. Odlišné subpopulace Th buněk ovlivňují relativní zastoupení izotypů imunoglobulinů produkovaných jako odpověď na imunitní provokaci (setkání s antigenem). Tak např. cytokin 11.--1 buněk Th2 může změnit aktivované B buňky na izotyp IgGl a potlačit jiné izolypy. 1L-4 také aktivuje nad produkt i IgE u přecitlivělosti 1. typu. Cytokin IL 5 buněk Th2 indukuje izotyp IgA. Vliv tohotocytokinů na změny izotypů je udržován v rovnováze lFN-γ, produkovaným Thl buňkami.

Zdá se. žc odlišné profily cytokinů secernovaných Thl a Th2 buňkami směrují odpověď k různým imunitním efektorovým mechanismům. Citlivost změny, která aktivuje buď buněčné, nebo humorální efektorové mechanismy, jc dána křížovou supresí mezi Tlil a Th2 buňkami. ΙΕΝ-γ produkovaný Thl buňkami inhibujc proliferaci Th2 buněk a IL-10 secernovaný TI12 buňkami redukuje sekreci cytokinů Thl buněk.

Negativní regulační obvody Thl a Th2 buněk tak mohou znásobit, v závislosti na relativní afinitě cytokinů k jejich cílovým molekulám, vliv malých rozdílů v koncentraci cytokinů Th 1 a Th2 buněk. Zesílený cytokinový signál Thl nebo Th2 buněk může změnit buněčný nebo humorální imunitní efektorový mechanismus, což závisí na malých změnách v relativních koncentracích cytokinů Thl nebo Th2 typu. Schopnost řídit takovou změnu tím, že sc modulují koncentrace cytokinů Thl nebo Th2 typu* je užitečná pro ovlivňování nerovnováhy mezi různými druhy imunitních odpovědí zprostředkovaných Thl a Th2 buňkami, která je příčinou imunologických poruch a nemocí.

Patologické reakce Thl buněk jsou spojeny s mnoha orgánově specifickými a systémovými autoirnunitními stavy, jako jsou např. chronická zánětlivá onemocnění a pozdní přecitlivělost.

Reakce typu Thl také přispívá k buněčné imunitě, která způsobuje odhojení štěpu nebo orgánového transplantátu.

Ošetřování různých imunologických stavů podmíněných Thl buňkami je založeno na užití imunomodulačních a imunosupresivnich přípravků a mnoha dalších látek, u nichž je velmi málo známo o mechanismu účinku (např. zlato nebo pcnicilamin). Tři v současnosti nejužívanější imu5 nosupresiva jsou steroidy, cyklosporin a azathioprin.

Steroidy jsou pleiotropní protizánětlivé látkv, které potlačují aktivované makrofágy a inhibují aktivitu buněk prezentujících antigen, a to takovým způsobem, že ruší či otáčí účinek IFN-v, cytokinů Thl buněk. Cyklosporin, účinný imunosupresivní přípravek, potlačuje produkci cyto10 kinů a snižuje expresi receptorů pro 11. -2 v lymfocytcch při jejich aktivaci. Azathioprin je přípravek s antiproliferačním účinkem, který inhibuje syntézu DNA. Tato nespecifická inwnosupresiva jsou zpravidla podávána ve velkých dávkách, což zvyšuje jejich toxicitu (např. nefro- a hepatotoxicitu) a způsobuje četné vedlejší účinky, nejsou proto vhodná pro dlouhodobé léčení.

Aby se odstranily problémy způsobované léčbou konvenčními nespecifickými imunosupresivy. současné léčebné strategie směřují ktomu, potlačit nebo aktivovat selektivní stránky imunitního systému. Zvláště přitažlivým cílem je ovlivnit rovnováhu mezi cytokiny Th 1 a Th2 typu, a tím ovlivnit rovnováhu mezi buněčným a humorálním imunitním mechanismem.

Ktomu, aby došlo k posunu mezi buněčným a humorálním imunitním mechanismem, by bylo dobré mít možnost modulovat aktivitu těch molekul, které mohou změnit relativní aktivity jednotlivých podtříd Thl a T112 buněk. Mezi kandidáty lakových molekul patří cytokiny a jejich receptory. Současní poznatky předpokládají, že LT-α, 1L 12, IFN-a a IFN—γ podporují rozvoj odpovědi Thl typu, zatímco IL-1 a 1L-4 vedou k odpovědi Th2 efektorového mechanismu 25 (Romagnani a kol., Ann. Rev. Immunol. 12: 225-257. 1994).

Mnohé z cytokinů Th buněk jsou pleiotropními regulátory' rozvoje a funkce imunitního systému, zastavení jejich produkce by proto mohlo mít škodlivý vliv na imunitní odpověď, která není bezprostředně závislá na T buňkách. Požadované a účinné cíle pro selektivní modulování výběru to mezi efektorovými mechanismy Thl nebo Th2 typu nebyly dosud identifikovány.

Podstata vynálezu h Předkládaný vynález poskytuje farmaceutický přípravek a způsob léčení imunologických onemocnění tak. že užívá látku blokující receptory lymfotoxinu-β (ΕΤ-β-R), a tím inhibuje signální dráhu receptorů lymfotoxinu-β. Přípravky a způsoby obsahující látku blokující LT β-R jsou zvláště vhodné pro inhibici imunitní odpovědi zprostředkované Thl buňkami, jako je např. zánět I i vý střevní syndrom.

Jedno provedení vynálezu poskytuje rozpustnou formu extracclulární domény receptorů lymfotoxinu-β, který' působí jako látka blokující ΕΤ-β-R. Přípravek a způsob podle vynálezu výhodně obsahují rekombinantní fúzní protein receptorů lymfotocinu-β. který má extracclulární doménu LT β-R vázající ligand fúzovanou s konstantní doménou těžkého řetězce imunoglobulinu. 45 Výhodněji je extracelulární doména LT-β-R vázající ligand fúzována s Fc doménou lidského

IgG.

Jiné provedení vynálezu poskytuje protilátky, které působí jako agens blokující ΕΤ-β-R. V tomto provedení prostředek a způsob obsahují jednu nebo více protilátek namířených proti recepto50 rum lymfotoxinu-β. Výhodněji protilátky jsou monok tonální protilátky. Další výhodný přípravek a způsob v tomto provedení obsahuje jednu nebo více protilátek namířených proti povrchovému lymfotoxinu. Výhodněji jc protilátka monoklonální protilátka proti lymfotoxinu-β.

- j CZ 298277 B6

Vynález dále poskytuje nový způsob testování pro výběr agens blokujících Ι.Τ-β-R, jako jsou např. rozpustné formy LT-p-R, anti-LT protilátky a anti—[ .T—[3—R protilátky. Tento nový způsob testování spočívá v provedení testu cytotoxicity s nádorovými buňkami, který monitoruje signální dráhu LT-p-R. fest využívá zvýšenou citlivost lidských adenokarcinomových buněk k signálům 5 LT-β R signály dráhy indukovaným ligandy nebo protilátkami v přítomnosti agens aktivujícího ΕΤ-β-R (např. LT^il/β).

Agens blokující LI-β-R inhibuje cytotoxický účinek heteronierických komplexů LT-α/β (nebo jiných látek aktivujících LT-p-R) v nádorových buňkách. Způsob testování užitý k testování io agens domněle inhibujícího LT-p-R je ukázán na příkladu anti-LΤ-β-R protilátek (v přítomnosti LT-α/β, agens aktivujícího LT-β R), a skládá se z následujících kroků.

1) Nádorové buňky (např. lidské adenokarcinomové buňky HT29) se kultivují několik dní v médiu, které obsahuje IFN-γ a čistý komplex LT-al/p2 a dále bud' obsahuje, či neobsahuje testované agens, např. protilátku anti-LT p-R.

2) Buňky jsou ošetřeny barvivém, které barví pouze živé buňky.

3) Počet obarvených buněk je kvantifikován, aby se stanovila frakce nádorových buněk odum2o řelých v přítomnosti Ι.Τ-α1/β2. IFN-γ a testované protilátky v každém vzorku.

Počet přežívajících buněk může být stanoven jakýmkoliv z několika známých způsobů měřících Životaschopnost buněk, jako je např. rychlost inkorporace H-thymidinu do DNA. Protilátka anti-LT-p-R (nebo kombinace protilátek), která snižuje procento odumřelých buněk v tomto 25 testu nejméně o 20 %, se dá považovat za agens blokující LT-p-R ve smyslu tohoto vynálezu.

Tento cytolytický test se dá provádět s LT-α/β heterorncrickýnii komplexy nebo jinými agens aktivujícími ΤΤ-β-R, a to buď samotnými, nebo kombinací více takových agens. fest se může také upravit podle požadavků na identifikaci nových agens blokujících LT β R.

Aby bylo možné vynálezu plně porozumět, následuje podrobný popis vynálezu.

Termín „cylokin“ v tomto textu znamená molekulu, která zprostředkovává interakci mezi buňkami. „Lymfokin je pak cytokin uvolňovaný lymfocyty.

Termín „pomahačská I buňka (Tj buňka)’’ označuje funkční pod třídu T buněk, které pomáhají generovat cytotoxické T buňky a které spolupracují s B buňkami a stimulují tak tvorbu protilátek. Pomahačské T buňky rozpoznávají antigen ve spojení s molekulami MHC II. třídy .

κι Termín „ThI sc týká podtřídy pomahačských I buněk, které produkují LT-a, interfcron-γ a II -2 (a další cytokiny) a které vy volávají zánětlivou reakci ve spojení s buněčnou (tj. bez účasti imunoglobulinů) imunitní odpovědí.

Termín ..1112” označuje podtrídu pomahačských T buněk, které produkují cytokiny včetně IL-L 45 IL-5, IL-6 a 1L-10 a které jsou spojeny s imunoglobulinovou. tj. humorální imunitní odpovědí.

Termín „buněčná” nebo „buňkami zprostředkovaná“ se vztahuje k takovým imunologickým jevům, kdy výsledná imunitní od poved' je výsledkem přímého vlivu T buněk a jejich produktů. Tento typ odpovědi jc obecně (ale ne výlučně) spojen s Th 1 podtřídou T buněk. Do této kategorie 50 nespadá vliv pomahačských T buněk na diferenciaci a expanzi B buněk, neboť tyto aktivity jsou obecně spojovány s Th2 podtřídou T buněk.

Termín „přecitlivělost pozdního typu (delayed type hypersensitivity, DTH)“ označuje imunitní odpověď, která je charakterizována pomalou odpovědí na antigen a při které dochází k plnému ,4_ projevu po období 1 až 3 dnů. Pomalá odpověď kontrastuje s relativně rychlou odpovědí při humorální, imunoglobuliny zprostředkované, alergické reakci. Existují 3 typy DUL kontaktní přecitlivělost, přecitlivělost tuberkulinového typu a granulomatózní reakce.

Termín „humorální odpověď nebo „iinunoglobulinová odpověď se týká imunitní odpovědi zvířete na cizorodý antigen, při které zvíře produkuje protilátky namířené proti cizorodému antigenu. ΊΊ12 podtřída pomahačských T buněk je nezbytná pro účinnou produkci vysokoafinitních protilátek, io Termín „Fc doména protilátky označuje část molekuly obsahující ohybovou oblast, doménu CH2 a CH3, ale neobsahuje místo vážící antigen. Termín jc také použit k označení odpovídající oblasti IgM nebo protilátky jiného izotypu.

Termín „protilátka anti-ET-[3-receptor popisuje jakoukoliv protilátku, která sc specificky váže 15 k alespoň jednomu epítopu na rcccptoru LT --β.

Termín „protilátka anti-LT“ popisuje jakoukoliv protilátku, která se specificky váže k alespoň jednomu epítopu na LT-α, LT-β, nebo komplexu ΕΤ-α/β.

2o Termín „signální dráha LT β R“ označuje molekulární reakce spojená s celou metabolickou cestou ΕΤ-β-R a následné molekulární reakce, ktcrc k ní vedou.

Termín „agens blokující LT β-R” označuje takové agens, které zeslabí vazbu ligandu na ΕΤ-βR, shlukování LT-p-R na buněčném povrchu nebo signální dráhu ΕΤ-β-R. nebo které způsobí 25 změnu v tom. jak je signál ΕΤ-β-R dráhy interpretován v buňce. Agens blokující, které působí v kroku vazby ligand -receptor, inhibuje vazbu LT ligandu na LT β-R alespoň o 20 %. Agens blokující ΕΤ-β-R, které působí až za tímto krokem, inhibuje cytotoxický účinek aktivace ΕΤ-βR na nádorové buňky nejméně o 20 %. Příklady agens blokujícího ΕΤ-β-R zahrnují rozpustné molekuly LT-β R-Fc a protilátky anti LT-a, anti-LT-β, anti -L Ι-α/β a anti-LT-β R. Výhod3o ně protilátky nereagují křížově se sekretorickou formou LT-a.

Termín „biologická aktivita LT β-Κ znamená 1) schopnost molekuly ΕΤ-β R nebo jejích derivátů soutěžit o rozpustný nebo povrchový LT ligand vážící sc k rozpustné nebo povrchové molekule ΕΤ-β-R, nebo 2) schopnost stimulovat regulační imunitní odpověď nebo obecně cytoto.xickou aktivitu nativní molekulou ΕΓ-β-R.

Termíny „hctcromerický komplex LT α/β“ a .4 1 hctcromerický komplex“ popisují stabilní spojení alespoň jedné podjednotky LT-α a jedné nebo více podjednotek LT-β. včetně rozpustných. mutovaných, změněných a chimérických forem jedné nebo více podjednotek. Podjednotky io se mohou spojovat elektrostatickými, van der Waalsovými nebo kovalentními interakcemi. Heteromcrický komplex ΕΤ-α/β má výhodně dvě přilehlé podjednotky LT-β a postrádá přilehlé podjednotky LT-α. Když hetcrorncrický komplex LT-a/β slouží jako aktivující agens pro Ι.Τβ-R v testu buněčného růstu, je komplex výhodně rozpustný a má stechiometrii LT α!/β2. Rozpustné heteromerieke komplexy LT-α/β postrádají transmembránovou doménu a mohou být 45 secernovány vhodnou hostitelskou buňkou, která byla upravena metodami genového inženýrství tak, aby cxprimovala podjednotky LT-α a/nebo LT-β (Crowe a kol., J. Immunol. Methods 168: 79-89,1994).

Termín „ET ligand“ znamená LT heteromerický komplex nebo jeho derivát, který sc specificky 50 váže na receptor LT-β.

Termín „doména LT-(3-R vázající ligand“ popisuje část nebo části LT-p-R. které se účastní specifického rozpoznání a interakce s LT ligandem.

- 5 C/. 298277 B6

Termíny ..povrchový LT-α/β komplex“ a ..povrchový LT komplex“ označují komplex, skládající se z podjednotky LT-α a podjednotky LT-β navázané na membránu, včetně mutantních, pozměněných a chimérických forem jedné nebo více podjednotek, a který Je prezentován na povrchu buňky. „Povrchový LT ligand znamená povrchový LT komplex nebo jeho derivát, který sc specificky váže na receptor LT-β,

Termín „subjekt zde znamená zvíře nebo jednu či více buněk pocházejících ze zvířete. Výhodně je zvíře savcem. Buňky jsou v jakékoliv formě, včetně, ale ne výlučně, buněk obsažených ve tkáni, shluků buněk, imortalizovaných, transfekovaných nebo transformovaných buněk, a také buněk pocházejících ze zvířete, které bylo fyzikálně nebo fenotypovč změněno.

Lymfotoxin-β: člen rodiny TNF

Cytokiny příbuzné s nádorovým nekrotickým faktorem (tumor neerosis factor. TNF) se objevily jako velká rodina pleiotropních mediátorů účastnících se imunitní regulace a hostitelské obranyschopnosti. Členové této rodiny se vyskytují vc formě vázané na membránu, která lokálně působí prostřednictvím přímého mezi buněčného kontaktu, anebo ve formě sckrctorického proteinu, který působí na vzdálené cíle. Rodina receptoru příbuzných TNF reaguje s těmito cytokiny a spouští tak různé metabolické dráhy včetně buněčné smrti, prolifcrace, diferenciace tkání a zánětlivé reakce.

TNF, lymfotoxin-a (LT-α, také zvaný TNF-β), a lymfotoxin-β (LT-β) jsou členy rodiny TNF ligandů. která zahrnuje také ligandy receptoru Fas, CD27, CD30. CD40, OX-40 a 4-1BB (Smith a kol.. Cell 76: 959-962. 1994). Signální dráhy některých členů TNF rodiny, včetně TNF. LT-a, LT-β a Fas, mohou indukovat odumírání nádorových buněk tím, žc způsobí nekrózu nebo apoptózu (programovanou buněčnou smrt). TNF a mnoho dalších interakcí ligand-receptor TNF rodiny ovlivňuje v netumorigenních buňkách vývoj imunitního systému a imunitní odpověď na různé antigeny.

Většina ligandů rodiny TNF se nalézá v podobě vázané na membránu na povrchu buněk. TNF a LT-α existují u člověka jak v sekretoriekc. tak i povrchové, na membránu vázané formě. Povrchový TNF má transmembránovou oblast, která je protcolyticky štěpena, aby se vytvořila sekretorická forma. Naproti tomu LT—(X postrádá zcela transmembránový úsek. Forma LT-α asociovaná s membránou je navázána k buněčnému povrchu jako heteromerický komplex s LT-β, příbuzným transmembránovýni polypeptidem, a tvoří tak komplex LT -α/β.

Většina komplexů LT α/β asociovaných s membránou (povrchových LT) má stechiomctrii ΕΤ-α1/β2 (Browninga kol.. Cell 72: 847-856, 1993, Browning a kol.. J. Immunol. 154: 33—46, 1995). Povrchové LT ligandy se nevážou na TNF-R s vysokou afinitou a neaktivují signální dráhu TNF-R. Jiný receptor příbuzný TNF. zvaný LT-β receptor (LT-β-Κ), váže tyto povrchové lymfotoxinové komplexy s vysokou afinitou (Crowe a kok, Science 264: 707-710, 1994).

Aktivace signální dráhy LT-β-Κ podobně jako signální dráhy TNF-R, má antiproliferační účinek a může mít cytotoxický účinek na nádorové buňky. V již podané patentové přihlášce autorů předkládaného vynálezu (pořadové číslo ve Spojených Státech 08/378,968) jsou popsány přípravky a způsoby pro selektivní stimulaci LT-p-R užitím agens aktivujících LT-β-R. Agens aktivující LT-β-R je užitečné pro inhibici růstu nádorových buněk, aniž by současné vedlo k aktivaci zánětIivé reakce nebo imunoregulační dráhy indukované JNF-R.

TNF a cytokiny příbuzné TNF jsou v ncnádorových buňkách aktivní při různých typech imunitní odpovědi. Jak ligandy TNF tak i LT-α se váží na aktivovaný receptor TNF (p55 nebo p60 a p75 nebo p80, zde nazývaný TNF-R). TNF a I T o. jsou produkovány makrofágy při časné imunitní odpovědi nebo rychlé imunitní reakci na mikrobiální infekci, což zvyšuje baktericidní aktivitu

-6CZ 298277 B6 makrofágú a ncutrofilů. TNF a LT-α produkované makrofágy nebo cytotoxickými T lymfocyty (zabíječskými T buňkami. C I L) se váží na receptory T\1 na povrchu cílových buněk a spouštějí mechanismus vedoucí k usmrcení citlivých buněk.

TNF a cytokiny příbuzné ΓΝF také iniciují zánětlivou kaskádu jako odpověď na stres nebo infekci. Uvolnění TNF, LT-α nebo IFN-γ mění adhezivní vlastnosti mezi buňkami cévního endotelu a určitými typy lymfocytů. Zvýšená adhczc usnadňuje migraci fagocytů a leukocytů z krevního řečiště do tkání obklopujících místo zánětu. Podobná zánětlivá reakce hraje hlavni úlohu v odhojování tkáňového štěpu nebo orgánového transplantátu, a také v některých imunologických io poruchách.

Komplexy povrchových lymfotoxinů (LT) byly charakterizovány v hybridomových T buňkách CD4+ (II 23.1)7), které exprimují vysokou hladinu LT (Brovvning a kol.. .1. Immunol. 147: 1230-1237, 1991. Androlevvicz' a kol., .1. Biol. Chem.267: 2542-2547, 1992). Exprese i? a biologická funkce LT-p-R, LT podjednotek a povrchových L I komplexů jsou popsány v přehledu Ware, C. F.: Thc ligands and rcceptors of the lymphotoxin systém. In: Pathvvays for Cytolysis. Current Topics Microbiol. Immunol. Springer-Verlag, s. 175-218, 1995.

Exprese LT-α jc indukována a LTa- je primárně seccrnován aktivovanými T a B ly mfocyty a zabíječskými (NK, ..naturel killer“) buňkami. LT-α je produkován v rámci pomahačskych

T buněk podskupinou Th 1, ale nikoliv podskupinou Th2 buněk. LT-α byl také nalezen v melanocytech. Mikroglie a T buňky v lezích u pacientů s roztroušenou mozkomíšní sklerózou reagují pozitivně s antisérem anti- LT-ot.

Lymfotoxin-β (také zvaný p33) byl nalezen na povrchu T lymfocytů, linii T buněk, linií B buněk a zabijcčských buněk aktivovaných lyrnfokinem (LAK). LT- β jc předmětem již podaných patentových přihlášek stejných autorů jako předkládaný vy nález PCT/US91 /04588, publikovaný 9. ledna 1992 jako dokument WO 92/00329 a PCT/US93/11669. publikovaný 23. června 1994 jako WO 94/13808, na které sc zde odkazuje.

Povrchové LT komplexy jsou exprimovány primárně aktivovanými 1 a B lymfocyty a zabij českými buňkami, jak se dá ukázal analýzou pomoci FACS nebo imunohistologickou analýzou užitím protilátek anti LT—cx nebo rozpustných fúzních proteinů ΕΤ-β-R--Fc. Povrchové LT byly také nalezeny na klonech lidských cytotoxických 1 lymfocytů (CIL), v aktivovaných periferních 35 mononuklcárních lymfocytcch (PML), lymfocylech periferní krve aktivovaných IL 2 (LAK), periferních B lymfocylech aktivovaných buď mitogenem z líčidla amerického (Phytokicca americiana). nebo anti-CD40 (PBL), a různých 1 a B buněk pocházejících z lynifoidnícli nádorů. Zapojení cílových buněk nesoucích alloantígen specificky indukuje expresi povrchových LT u klonů CD4+ a CD8+ CTL.

4(1

Receptor 11 -β, člen rodiny rcceptorů TNF, specificky váže povrchové LT ligandv. I .T—β R váže hctcromerické LT komplexy (převážně LT -α!/β2 a LT-a2/pl), ale neváže ani TNF ani LT-cc (Crowc a kol., Science 264: 707-710, 1994). Signální dráha LT-p-R hraje důležitou roli ve vývoji periferních lymfoidních orgánů a v humorální imunitní odpovědi.

Výzkum exprese ΕΤ-β-R jc teprve v počáteční fázi. ntRNA pro LT-p-R byla nalezena v lidské slezině, brzlíku i dalších hlavních orgánech. Profil exprese LT-β R je podobný profilu p55TNF-R, ale LT-p- R chybí na T buňkách periferní krve a na liniích T buněk.

5d Produkce rozpustných LT komplexů

Rozpustné heteromerické komplexy Llwa obsahuji podjednotky LT á. které byly změněny z původních, vázaných na membránu, na rozpustné. Ty lo komplexy jsou podrobně popsány v již podané mezinárodní přihlášce autorů předkládaného vynálezu (PCT/US93/11669, publikováno

-7CZ 298277 B6

23. června 1994 Jako WO 94/13808). Rozpustné peptidy I.T-á jsou definovány sekvencí aminokyselin lymfotoxinu-á, jehož sekvence je štěpena kdekoliv mezi koncem transmembránovcho úseku (tj. 44. aminokyselina) a prvním úsekem homologním s TNE (tj. 88. aminokyselina), a kde číslování aminokyselin odpovídá popisu dle Browninga a kol. (Cell 72: 847-856, 1993).

Rozpustné polypeptidy LT —á vznikají odštěpením N-koncc z LT-á, čímž se oddělí cytoplazmatický a transmembránový úsek (Crowc a kol., Science 264: 707-710, 1994). Jiným způsobem se může transmembránová doména inaktivovat dclecí anebo substitucí hydrofobní aminokyseliny hydro Í1 lni. V obou případech je tak vytvořen podstatně hydrofllni hydropatický profil, který redukuje afinitu k lipidům a zlepšuje rozpustnost ve vodě. Delece transmembránové domény je výhodnější než substituce, protože se tak zabrání vzniku nových potenciálně imunogennich epitopů.

Dclctovaná nebo inaktivovaná transmembránová doména se může nahradit nebo připojit k zaváděcí sekvenci I. typu (např. zaváděcí sekvence VCAM-1), takže sekvence secernováného proteinu začíná kdekoliv mezi aminokyselinami val40 a pro88. Rozpustné polypeptidy LT-á mohou na svém N-konci obsahovat několik z mnoha známých zaváděcích sekvencí, l akové sekvence zajistí, že peptid jc exprimován a zacílen do sekretorieke metabolické dráhy v eukaryotickém systému (viz např. Ernst a kol., Patent US 5 082 783, 1992).

I leteromcrické komplexy 1.1 aá mohou vznikat kotransfckcí vhodné hostitelské buňky DNA, která kóduje LT-α a rozpustný LT á (Crowe a kol., J. Immunol. Mcthods 168: 78-89, 1994). Rozpustný LT-á, secernovaný v nepřítomnosti LT-α, je vysoce oligomerizovaný. Avšak je-li koexprimován s LT-α, vytváří se trimeru podobná struktura o velikosti 70 kD, která obsahuje oba proteiny. Hctcromerické komplexy LT—otl/á2 se mohou vytvářet tak, že se buněčná linie exprimující pouze LT-α (např. RPMI 1788) transfekuje genem kódujícím rozpustný polypeptid LT-á.

Polypeptidy LT-α a LT-á sc mohou syntetizovat odděleně, denaturovat pomocí slabého detergentu. smíchat a pak společně renaturovat odstraněním detergentu, a tak vzniknou směsné heteromerické komplexy, které jc možné dále separovat.

Purifikacc komplexů LT-al/á2

Rozpustné heteromerieke komplexy LT-al/á2 se oddělí chromatografií od koexprimovaných komplexů obsahujících podjednotky v jiné stcchiomctrii. Při chromatografií se použijí receptory TNF a LT-á jako afinitní purífikační reagens. Receptor LT á váže s vysokou afinitou pouze útvary á/á, s nízkou afinitou váže útvary α/á nebo heteromerieke komplexy LT-a/á. Tudíž I.Ta3 a LT-<x2/ál se vyváží na TNF-R. LT á R může vázat také trimery LT-a2/ál (α/á místa), ale nemůže vázat LT-a3. Navíc LT—á—R (ale nikoliv TNF-R) váže LT-α 1 /á2 a LT-á(n) (přesné složení těchto preparátů není známo, ale vytvářejí velké agregáty).

Receptorovc afinitní reagens se dá připravit buď ve formě rozpustné extracclulární domény (viz např. Loetscher a kol., .1. Biol. Chem. 266: 18324-18329, 1991). nebo ve formě chimérických proteinu s doménou vázající extracelulární ligand spojenou s Fc doménou imunoglobulinu (viz Loetscher a kol., J. Biol. Chem. 266: 18324-Γ8329, 1991. Crowe a kol., Science 264: 707710, 1994). Receptory jsou navázány k afinitní matrici chemickým zesílením užitím běžných postupů.

Existují dvě cesty, jak se mohou LT-al/á2 ligandy purifikovat pomocí receptorů a imunoaflnitní chromatografie. Podle prvního postupu se supematant ze systému, který' koexprimujc jak LT-a, tak zkrácenou LT á formu, přečistí přes kolonu s TNF-R, přičemž TNF-R naváže LT-a3 a LT—cc2/á 1 trimery'. V eluátu prošlém kolonou budou obsaženy LT-á(n) a LT-al/á2.

-8C Z 2MB277 B6

Podle druhého postupu jsou všechny formy obsahující LT-á (tj. LT-á(n), LT-al/á2 a LT—ct2/á I navázány a pak eluovány z kolony obsahující LT-á-R klasickým způsobem užitím chaotropního nebo pH činidla (LT-a.3 proteče touto kolonou). Lluat je pak neutralizován nebo zbaven chaotropního činidla, a pak je purifíkován přes kolonu obsahující TNF-R, který naváže pouze trimery LT-a2/ál. Výsledný eluát pak obsahuje pouze LT-á(n) a LT-al/á2 trimery.

V obou případech, čisté LT-allal trimery mohou být odděleny od LT-á následnou gelovou filtrací a/nebo iontoměničovou chromatografií v oboru známou.

Alternativně se mohou různé formy hetcronierických komplexů LT-a/á separovat a čistit řadou obvyklých chromatografie kých způsobů. Je výhodné kombinovat řadu obvyklých purifikačních postupů s jedním krokem imunoafinitního čištění popsaným výše.

Testování (vyhledávání) agens blokujícího ΕΤ-β-R

V jednom provedení předkládaného vynálezu obsahuje agens blokující L’l'-p-R protilátku namířenou proti ί.Τ-β-R, která inhibuje signální dráhu LT-p-R. Výhodně je protilátka anti-LT β-R monoklonální protilátka. Jednou z protilátek s takovým inhibičnim účinkem je monoklonální protilátka BDA8.

Inhibiční protilátky anti-LT-β R a jiná agens blokující LT-p-R lze identifikovat pomocí způsobu testování, který zjišťuje schopnost jednoho či více agens vázat sc na LT β R. nebo LT ligand, nebo inhibovat vliv signální dráhy LT-p-R na buňky.

Jeden způsob testování využívá cytotoxický účinek signální dráhy ΕΤ-β-R na nádorové buňky nesoucí LT-p-R. Nádorové buňky jsou vystaveny působení jednoho či více agens aktivujícího LT β-R, aby se indukovala signální dráha LT β-R. Agens aktivující LT-p-R zahrnuje jak heteromerieke komplexy LT-α/β (výhodně rozpustný komplex LT-α Ι/β2) v přítomnosti IFN-γ nebo jakoukoliv aktivační protilátku anti -LT-p-R (jak je také popsáno v již podané patentové přihlášce US 08/ 378,968), Protilátky nebo jiná agens. která mohou blokovat cytotoxický účinek signální dráhy LT-p-R na nádorové buňky jsou vy bírány na základě následujícího testu.

1) Nádorové buňky, např. buňky HT29 jsou kultivovány 3 až 4 dni v sadách jamek pro tkáňové kultury obsahujících médium a alespoň jedno zagens aktivujících LT-p-R, a to buď v přítomností, nebo nepřítomnosti testovaného agens, které je použito v sériovém ředění.

2) Barva vhodná pro vitální barvení, která reaguje na funkci mitochondrií, jako jc např, Μ I I . se přidá k nádorovým buňkám a nechá několik hodin reagovat

3) Optická hustota v každé jamce se kvantifikuje měřením při vlnové délce 550 nm (OD 550). Hodnota OD 550 jc úměrná počtu nádorových buněk, které přetrvávají v přítomnosti agens aktivujícího LT-p-R a testovaného agens blokujícího LT-p-R. Agens nebo kombinace více agens, které snižuje cytotoxicitu nádorových buněk aktivovaných LT-p-R alespoň o 20 % v tomto testu se považuje za agens blokující LT-β R ve smyslu předkládaného vynálezu.

V tomto testu se může pro identifikaci agens blokujícího LT—β R použít jakékoliv agens nebo kombinace více agens aktivujících signální dráhu LT-p-R. Agens aktivující LT-P-R, které indukuje signální dráhu LT-p-R (jakoje např. monoklonální protilátka anti Ll-p-R) sc vybere na základě své schopnosti, ať samotného nebo v kombinaci s jinými agens, podporovat cytotoxicitu nádorových buněk, kterou lze otestovat také testem s nádorovými buňkami popsanými výše.

-9CZ 298277 B6

Jiným způsobem jak testovat agens blokující LT-P-Rje sledovat schopnost domnělého agens přímo reagovat ve vazbě LT ligand-receptor. Agens nebo kombinace více agens. které sníží vazbu ligand-rcceptor alespoň o 20 %, je agens blokující LT β R ve smyslu tohoto vynálezu.

Kterýkoliv z mnoha testů, které měří sílu vazby ligand-receptor. se dá použít kc kompetitivnímu testu s domnělým blokujícím agens. Síla vazby mezi reccptorem a Iigandem se pak může stanovit pomocí ELISA (enzyme-linkcd immunoadsorption assay) nebo radioimunotestu (R1A). Specifická vazba sc dá také měřit pomocí fluorescenčně značených komplexů protilátka—antigen využitím třídění fluorescenčně aktivovaných buněk (FACS), nebo pomocí jiné imunodetekční io metody, což jsou všechno techniky dobře známé v oboru.

Interakce ligand-receptor sc také dá měřit přístrojem BIAcorc (Pharmacia Biosensor), který využívá detekce rezonance plasmou ti (Zhou a kol., Biochemistry 32: 8139 98. 1993. Faegerstram a O'Shanncssy. Surface Plasmon resonance dctection in affinity technologies. In: Handbook of 15 Affinity Chromatografy, s. 229-252. Marcel Dek ker, lne., New York. 1993).

Technologie užívající BIAcore umožňuje navázal receptor na zlatý povrch a nechal protékat ligand kolem. Detekce plasmonové rezonance přímo kvantitativně hodnotí množství navázané hmoty v reálném čase. Výsledkem použití této techniky jsou rychlostní konstanty pro oba směry 20 reakce, a tak se muže přímo stanovit afinitní a disociační konstanta pro vazbu ligand-receptor v přítomnosti a nepřítomnosti předpokládaného agens blokujícího LT-p-R.

Kteroukoliv z těchto technik, nebo i jiným postupem pro měření interakcí ligand-receptor, lze hodnotit schopnost agens. a to buď samotného, anebo kombinace více agens, blokovat vazbu 25 povrchových nebo rozpustných LT ligandů na povrchové nebo rozpustné LT-p-R molekuly.

Takový test lze také využít k testování agens blokujících LT-p-R nebo jejich derivátů (fúzních. chimérických, mutovaných a chemicky pozměněných forem), a to bud¹ samotných, nebo v kombinaci. aby se optimalizovala schopnost agens blokovat aktivaci LT β R.

Produkce rozpustných molekul LT-p-R

Agens blokující LT-p-R podle jednoho provedení tohoto vynálezu obsahuje molekulu LT β receptorů. Obr. 1 ukazuje sekvenci extracciulárního úseku lidského L.T- β R, která kóduje doménu vážící ligand. Na základě znalosti sekvence (obr. 1) a využitím postupů rekombinantní DNA 35 v oboru dobře známých, je možné klonovat funkční fragment domény vázající ligand do vektoru a pak exprimovat ve vhodné hostitelské buňce, a tak produkovat rozpustnou LT-p-R molekulu. Rozpustné ΤΤ-β-R molekuly, které soutěží (kompetují) s nativními LT-β R receptory o l.T ligand v testu popsaném výše jsou vybrány jako agens blokující LΤ-β-R.

κι Rozpustné LT-β receptory obsahující sekvenci aminokyselin vybranou ze sekvence uvedené na obr. I se mohou připojit k jedné nebo více heterologní proteinové doméně („fúzní doméně“), aby se zvýšila in vivo stabilita receptorového fúzního proteinu, nebo aby se modulovala jeho biologická aktivita nebo lokalizace.

Výhodně jsou použity k vytvoření receptářových fúzních proteinů stabilní plazmatické proteiny, které mají poločas oběhu větší než 20 hodin. Takové plazmatické proteiny jsou např. (ale výčet není omezující) imunoglobuliny, sérový albumin, lipoproteiny. apolipoproteiny a transferin. Sekvence, které zacílí rozpustnou LT-p-R molekulu na určitý buněčný nebo tkáňový typ, se mohou také připojit k doméně vázající ligand, aby sc vytvořil specificky lokalizovaný rozpustný fúzní 50 protein LT β-R.

Buď celý, nebo funkční úsek z c.xt racci uláni í oblasti LT-p-R obsahující doménu vázající ligand, se může fúzovat s konstantním úsekem imunoglobulinu. např. s I^;c doménou těžkého řetězec lidského IgG 1 (Browning a kol.. J. Immunol. 154: 33 46. 1995). Rozpustné fúzní proteiny

- 10CZ 298277 B6 rcceptor-lgG jsou výhodné, jsou běžným imunologickým reagens a způsoby jejich přípravy jsou v oboru dobře známy (viz např. patent US 5 225 538, na který zde odkazujeme).

Funkční doména vázající ligand z ΕΤ-β-R sc může fúzovat s Fc doménou imunoglobuiinu (Ig) odvozeného z imunoglobuiinu jiné třídy či podtřídy než IgG I. Fc domény protilátek patřících do odlišných tříd nebo podtříd mohou aktivovat odlišné druhotné efektorové funkce. K aktivaci dojde, když se Fc doména naváže na vhodný receptor. Druhotné efektorové funkce zahrnují např. schopnost aktivovat komplement. křížově reagovat s placentou nebo vázat různé mikrobiální proteiny. Vlastnost různých tříd a podtříd iminoglobulinů jsou popsány v Roitt a kol., Immunology, s. 4.8, Mosby-Zcar Book Europe Ltd., 3. vyd., 1993).

Aktivace komplementu iniciuje kaskádu enzymatických reakcí, které zprostředkovávají zánětIL vou reakci. Jednotlivé produkty komplementu mají různé funkce včetně poutání bakterií, endocytózy. fagocytózy, cytotoxicity. produkce volných radikálů a solubilizace imunitních komplexů.

Enzymová kaskáda komplementu je aktivována Fc doménami protilátek IgGl, IgG3 a IgM s navázanými antigeny, Fc doména lgG2 se zdá být méně účinná a domény lgG4. IgA. IgD a IgE jsou zcela neúčinné v aktivaci komplementu. T akže se dá vybral Fc doména v závislosti na lom, zda s ní spojená druhotná efektorová funkce je žádoucí pro určitou imunitní od po věd' nebo nemoc, která je pomocí fuzního proteinu LT-p-R-Fc léčena.

Pokud by bylo žádoucí poškodit nebo usmrtit cílové buňky nesoucí LT ligand, lze vybrat zvláště aktivní Fc doménu (IgGl) pro fúzní receptorový protein. Pokud by bylo žádoucí zacílit fúzní protein ΕΤ-β-R Fc na buňku, aniž bv se aktivoval komplement, vvbere se neaktivní Fc doména lgG4.

Mutace v Fc doméně, které redukují nebo zcela eliminují vazbu na Fc receptor a aktivaci komplementu. byly popsány (Morrison, S., Annu. Rcv. lmmunol. 10:239-265. 1992). Těchto mutací, ať už samotných nebo v kombinaci, lze využít k optimalizaci aktivity Fc domén užitých pro vytvoření fuzního proteinu LΤ-β-R-Fc.

Produkce rozpustného lidského fúzního proteinu obsahujícího sekvence vázající ligand fúzované s Fc doménou lidského imunoglobuiinu (hLT β-R-Fc) je popsána v příkladu 1. Jedna linie buněk CHO vytvořená podle příkladu 1, která secernuje ΗΕΤ-β-R-Fc, je nazvána „hLT, R-hGl CHO 14. Vzorek byl deponován v Američan Type Culture Collection (ATCC, Rockville. MD) v souladu s Budapešťskou dohodou dne 21. července 1995 pod přístupovým číslem CRL11965.

Produkce rozpustného myšího fúzního proteinu ΕΤ-β-R (mLT-p-R-Fc) je popsána v příkladu 2. Buněčná linie CHO. která secernuje mLT-p-R-Fc je zvána „mLT. R-hGl CHO 1.3. BB Vzorek této linie byl deponován v Američan Type Culture Collection (ATCC. Rockville, MD) v souladu s Budapešťskou dohodou dne 21. července 1995 pod přístupovým číslem CRLI1964.

Všechna omezení týkající se dostupnosti těchto deponovaných vzorků pro veřejnost budou zrušena, jakmile budou dány záruky udělení patentu pro tuto přihlášku.

Různá aminokyselinová rezidua tvořící spojovací bod ve fúzním proteinu receptor-lg ovlivňují strukturu, stabilitu a tedy i konečnou biologickou aktivitu rozpustného LT-β receptorového fúzního proteinu. Jedna nebo více aminokyselin se může přidat k C-konci vybraného fragmentu Ι.Τβ-R, a tak lze modifikovat spojovací bod ve vybrané fúzní doméně.

Také N-konec fúzního proteinu ΕΤ-β-R sc může pozměnit tím, že se mění poloha, ve které je vybraný DNA fragment ΕΤ-β-R štěpen na svém 5'konci. aby mohl být vložen do rckombinantního expresního vektoru. Stabilita a aktivita každého fúzního proteinu LT- β R se testuje a optiCZ 29X277 B6 malizuje užitím rutinních testů a také pomocí testu pro vyber agens blokujících LT-p-R. tak. jak je popsán zde.

Na základě sekvence domény ΕΤ-β-R vázající ligand uvnitř extracclulámí domény, která je ukázána na obr. 1, lze vytvářet různé sekvenční varianty, aby se modifikovala afinita rozpustného LT-β receptorů nebo fúzního proteinu pro LT ligand. Rozpustné molekuly Ι.Τ-β-R podle vynálezu mohou soutěžit o navázání povrchového LT ligandu s endogenními receptory LT-β R na povrchu buněk. Dá se předpokládat, že jakákoliv rozpustná molekula obsahující doménu LT-βR vázající ligand, která soutěží s povrchovými buněčnými receptory LT-β o navázání LT ligandů. je blokující agens ve smyslu předkládaného vynálezu.

Rozpustné molekuly LT-p-R jako agens blokující LT-p-R

Rozpustný lidský fúzní protein obsahující LT-β rcccptor a imunoglobulin (hLT-p R--Fc) byl vytvořen postupem popsaným v příkladu 1 a byla testována jeho schopnost blokovat cytotoxicitu lidských nádorových buněk HT29 indukovanou LT-β-R. Tabulka 1 (příklad 3) srovnává schopnost fúzních proteinů obsahujících rozpustný LT β receptor (hl ,T—β—R—Fc) a TNF receptor (p55-TNF-R-Fc) blokovat inhibiční účinek různých TNF a rozpustných LT ligandu na růst nádorových buněk HT29. Údaje v lab. 1 ukazují koncentrace, při kterých rozpustný LT β receplor (hLΤ-β-R-Fc) blokuje z 50 % odumírání nádorových buněk způsobené interakcí mezi Iigandem LT-ctl/p2 a LT-β receptory na buněčném povrchu. Schopnost blokovat růst nádorových buněk alespoň o 20 % charakterizuje LT-β receptory účinné jako agens blokující LT-p-R ve smyslu předkládaného vynálezu. Rozpustný fúzní protein sTNF R (p55-TNF-R-Fc) podle očekávání zcela blokoval inhibici růstu indukovanou TNF tím. žc navázal TNF a zabránil tak jeho interakci s povrchovým reccptorem.

Rozpustný fúzní protein TNF-R neměl žádaný účinek na ant i pro life rač ní působení zprostředkované LT ligandem (LΤ-α1/β2). Naopak, fúzní protein LT -β-R blokoval vliv LT ligandu, ale neovlivnil TNF ani LT-α. Takže rozpustný lidský fúzní protein LT-p-R neovlivňuje aktivaci TNF R ani TNF ani LT-tx lígandy .

Obdobné pokusy byly provedeny s myšími nádorovými buňkami, aby se zjistilo, jestli signální dráha Ll-p-R má cytotoxický účinek na nádorové buňky my ši a jestli rozpustné fúzní proteiny LT-p-R blokují cytotoxicitu indukovanou L/Γ—β—R, Rozpustný myší fúzní protein mLT-p-R-Fc (viz příklad 2) byl testován, jak blokuje odumírání myších buněk WFUI 164. ošetřených LT ligandem (příklad 4).

Na obr. 2 je ukázán vliv rozpustného myšího LT-p-R (mLT β-R-Fc) na signální dráhu LT-p-R indukovanou LT ligandem u myších buněk linie WEH1 164. Jak ukazuje tento test, buňky WEH1 164 odumírají po ošetření rozpustným ligandem LT-al/p2. Přidání niL'1 -β-R-Fc blokuje odumírání buněk aktivované LT ligandem. TNL reccptorový fúzní protein (p55TNF-R-Fc), použitý jako kontrola, mel jen malý vliv na odumírání buněk.

Údaje ukazují, že rozpustný fúzní protein LT-p-R účinně kompetuje s povrchovými molekulami LT-p-R o navázání L I ligandu. Rozpustný fúzní protein mLT β-R-Fc tedy působí jako agens blokující L'F—β—R u myší.

Zdroj protilátek proti lidskému LT-β- R

V jiném provedení tohoto vynálezu protilátky namířené proti lidskému LL-p receptorů (protilátka anti-LT-p-R) působí jako agens blokující LT -β-R. Protilátky anti-LT-p-R podle předkládaného vynálezu jsou bud' polyklonální, nebo monoklonální protilátky a lze je modifikovat

Ί _ tak, aby bylo dosaženo optimální schopnosti blokovat signální dráhu LT- p-R, jejich in vivo biologickou dosažitelnost, stabilitu nebo jiné žádoucí znaky,

Polyklonální sérum proti lidskému Ι.Τ-β rcccptoru se připraví konvenčním způsobem tak. že se koza, králík, potkan, křeček nebo myš subkutánně injikuje lidským fúzním proteinem LT-p-RFc (příklad 1) v kompletním Freundově adjuvans, a pote následuje druhá (spouštěcí) intrapcritoneální nebo subkutánní injekce s neúplným Freundovým adjuvans. Polyklonální sérum obsahující požadované protilátky se testuje obvyklým imunochemickým způsobem.

Myší monoklonální protilátky proti lidskému fúznímu proteinu LT-β -R-Fc se připraví tak, jak je to popsáno v příkladu 5. Hybridomová buněčná linie BD.A8.AB9 produkující myší monoklonální protilátku BDA8 namířenou proti lidskému LT p-R byla uložena v Američan Type Culturc Collection (ATCC Rockvillc. MD) v souladu s Budapešťskou dohodou dne 12. ledna 1995 pod přístupovým číslem CRL11964. Všechna omezení dostupnosti pro veřejnost takto uloženého vzorku budou zrušena, jakmile budou dány záruky udělení patentu pro tuto přihlášku.

Různé formy protilátek anti-LT-p-R sc mohu také připravit standardními technikami rekombinantní DNA (Winter a Milstein. Nátuře 349: 293-299, 1991). Například lze vytvořit chimérické protilátky, ve kterých jsou domény vázající antigen ze zvířecí protilátky spojeny s lidskou konstantní doménou (Cabilv a kol.. US 4 816 567, Morrison a kol.. Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 81: 6851-6855. 1984). Při klinickém použití bylo pozorováno, že chimérické protilátky redukují imunitní reakci vyvolanou zvířecími protilátkami použitými u člověka.

Kromě toho se mohou syntetizovat i rekombinantní „humanizované protilátky rozpoznávající LT-p-R. Humanizované protilátky jsou chimérické molekuly obsahující většinou sekvence lidského IgG, do nichž byly vloženy úseky, odpovídající za specifickou vazbu s antigenem (např. WO 94/04679). Zvířata se imunizují požadovaným antigenem, odpovídající protilátka se pak izoluje a odstraní se variabilní úsek zodpovědný za specifickou vazbu s antigenem. Úsek, odvozený ze zvířecí molekuly, zodpovědný za specifickou vazbu s antigenem, se potom klonuje do vhodného místa v genu lidské protilátky, ze kterého byla odstraněna oblast specificky vážící antigen. Humanizované protilátky minimalizují užití heterologních (mezidruhových) sekvencí v lidských protilátkách, a tudíž s mnohem menší pravděpodobností vy volávají nežádoucí imunitní odpovčd¹ ošetřovaného.

Různé třídy rekombinantních protilátek L T-p-R se mohou připravit jako chimérické nebo humanizované protilátky obsahující variabilní domény LT-p-R a konstantní domény (CH 1, CH2, CH3) izolované z různých tříd imunoglobulinu. Tak např. protilátky anti-LΤ-β-R-lgM sc zvýšenou valencí míst vázajících antigen lze připravit metodami rekombinantní DNA tak. že se klonuje místo vázající antigen do vektoru, který obsahuje konstantní oblast lidského μ řetězce (Arulanandam a kol., J. Exp. Med.. 177: 1439-1450, 1993. Lané a kol.. Eur. J. lmmunol. 22; 2573 78, 1993, Traunccker a kol.. Nátuře 339: 68-70. 1989).

Navíc lze užít standardní techniky rekombinantní DNA, aby se změnila afinita vazby rckombinantních protilátek s antigenem, a to tím, že sc změní aminokyseliny sousedící s vazebným místem. Afinitu k antigenu u humanizovaných protilátek lze zvýšit mutagenezí založenou na molekulárním modelování (Queen a kol.. Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 86: 10029-10033, 1989, WO 94/04679),

Jc žádoucí zvýšit nebo snížit afinitu protilátek anti-LT-p-R k LT-p-R v závislosti na typu cílové tkáně nebo v závislosti na předpokládaném léčebném postupu. Tak např. z profylaktických důvodů je výhodné ošetřovat pacienta tak. že se použije konstantní hladina anti lJ p R se sníženou schopností přenášet signál v signální dráze LT-p-R. Inhibiční anti-LT-p-R sc zvýšenou afinitou k LT-p-R jsou zase výhodné pro krátkodobé ošetřování.

Protilátky anti-LT-p-R jako agens blokující ΕΤ-β-R

Protilátky anti-LT-p-R, které jsou účinné jako agens blokující LT-p-R jsou vybírány tak, že se testuje jejich schopnost inhibovat v nádorových buňkách cytotoxicitu indukovanou ΕΤ-β-R (pří5 klad 5),

Přípravky a způsoby ve výhodném provedení tohoto vynálezu obsahují myší monoklonální protilátku BDA8 namířenou proti lidskému LT-p-R. Obr. 3 ukazuje, že protilátka BDA8 působí jako agens blokující LT-β R ve smyslu definovaném v tomto vynálezu. Nádorové buňky WiDr io zastavují růst v přítomnosti IFN- γ a rozpustného ligandu ΕΤ-Ια/β2. Kontrolní protilátka IgG 1 nemá žádný vliv na inhibici růstu, naproti tomu protilátka BDA8 (myší protiIidská anti -LT-P-R) blokuje schopnost rozpustného ligandu LT- 1(ζ/β2) blokuje schopnost rozpustného ligandu LT1 α/β2 inhibovat růst buněk WiDr. Takže protilátky namířené proti lidskému LT-p-R jsou účinné jako agens blokující ΕΤ-β-R ve smyslu předkládaného vynálezu.

Očekává se, že se najdou další protilátky anti LT-β-Β s funkcí blokujícího agens u člověka, pokud se budou další protilátky proti lidskému ΕΤ-β-R vyhledávat a testovat rutinními způsoby a způsobem popsaným v předkládaném vy nálezu.

Zdroj protilátek proti povrchovým LT ligandům

Jiné výhodné provedení vynálezu zahrnuje přípravky a způsoby, které obsahují protilátky, namířené proti LT ligandům, které působí jako agens blokující ΕΤ-β-R. Stejně, jak sc popisuje výše pro protilátky anti-LT-p-R, protilátky proti LT ligandům, účinné jako agens blokující LT-p-R. 25 jsou polyklonální nebo monoklonální protilátky, a mohou se modifikovat rutinními postupy, aby se modulovaly jejich vazebné vlastnosti a imunogcničnosl.

Protilátky anti-LT podle předkládaného vynálezu mohou být namířeny individuálně proti jedné ze dvou podjednotek LT, a to včetně rozpustných, mutovaných, změněných nebo chimérických w forem LT podjednotek. Pokud se užije podjednotek LT-a. je výhodné. když se výsledné antiLT-a protilátky váží s povrchovým ET ligandem a nereagují křížově sc secernováným LT-α ani nemodulují aktivitu TNF R (podle testu popsaného v příkladu 3).

Protilátky, namířené proti homomcrickým (ΕΊ-β) nebo heteromerickým (L l-tx/β) komplexům. 35 složeným z jedné nebo více LT podjednotek, sc mohou vytvořit a testovat na aktivitu blokující

ΕΤ-β-R. Výhodně je jako antigen užit komplex LT-al/p2. Jak bylo již zmíněno výše, jc výhodné, když sc výsledné anti-LT-al/p2 protilátky váží s povrchovým LT ligandem a nereagují křížově se sečernováným LT-α ani nemodulují aktivitu TNF-R.

to Produkce polyklonálních proti—lidských protilátek LT-α jc popsána v již podané patentové přihlášce WO 94/13808. Také monoklonální protilátky anti-LT-α a anti ΕΤ-β byly publikovány (Browning a kol., J. Immunol. 154: 33 46. 1995).

Myší proti lidské monoklonální protilátky anti-LT-β byly připraveny postupem popsaným 45 v příkladu 6. Hybridomová buněčná linie B9.C9.1 produkující myší proti—lidské monoklonální protilátky antí-LT-β B9 byla uložena v Američan Type Culture Colleetion (ATCC, Rockville.

MD) v souladu s Budapešťskou dohodou dne 21. července 1995 pod přístupovým číslem HB1 1962.

Křečci proti myší monoklonální protilátky anti-LT-α Ι/β2 BB.F6 byly připraveny postupem popsaným v příkladu 7. Hybridová buněčná linie BB.F6.I produkující křečci proti myší monoklonální protilátky αηΐί-ΕΤ-αΙ/βΖ BB.F6 byla uložena v Američan Type Culture Colleetion (ATCC, Rockville, MD) v souladu s Budapešťskou dohodou dne 21. července 1995 pod přístu- 14CZ 298277 B6 povým číslem HB1I963. Všechna omezení dostupnosti pro veřejnost takto uloženého vzorku budou zrušena, jakmile budou dány záruky udělení patentu pro tuto přihlášku.

Protilátky anti-LG-ligand jako agens blokující LT—β—R s

Test způsobem třídění fluorescenčně aktivovaných buněk (FACS) byl vyvinut ke sledování a výběru protilátek namířených proti LT pod jednotkám a LT komplexům, které mohou působit jako agens blokující LT-p-R (příklady 6 a 7). V tomto testu se přidají rozpustné lidské fúzní proteiny ΤΤ-β-R Fc k buňkám 11-23, které exprimují povrchové LT komplexy (Browning io a kol.. J. Immunol. 154: 33 46. 1995), aktivovaným RNA, a to v přítomnosti zvyšujícího se množství testovaných protilátek. Protilátka, která inhibuje interakci ligandu s receptorem LT—β alespoň z 20 %, je pak vybrána jako agens blokující LT -β-R.

Výsledky takového testu, který sloužil k ověření monoklonálních myších proti—lidských proti15 látek LT-p B9, jsou ukázány na obr. 4. Ukazuje se. že protilátka anti-LT-p-R B9 selektivně blokuje vazbu rozpustných fuzních proteinů ΤΤ-β-R-Fc a povrchových LT ligandu indukovanou na aktivovaných buňkách. Výsledky potvrzují, že protilátky namířené proti podjedu otkám LT ligandu působí jako agens blokující LT-p-R.

FACS test popsaný výše byl také užit k testování křeččích monoklonálních protilátek proti rozpustným myším komplexům LT cx/p (příklad 7). Výsledek tohoto testu protilátky BB.F6 (příklad 7) je ukázán v tab. 2. Ukazuje sc, že monoklonální protilátka anti-LT-α/β BB.F6 účinně blokuje vazbu rozpustných fuzních proteinů LT β-R-Fc (příklad 2) a povrchových LT ligandů exprlinovaných na myších hybridomových T buňkách, a tudíž je agens blokující LT-p-R podle předklá25 daného vynálezu.

Použití komplexů LT-α/β místo LT podj cd notě k jako antigenu pro imunizaci povede k účinnější imunizaci, anebo povede ke vzniku protilátek s vyšší afinitou k povrchovým LT ligandům. Lze si dobře představit, že imunizace pomocí komplexů LT-α/β povede k izolaci protilátek, které roz30 poznávají aminokyselinová rezidua jak podjednotek LT-α tak i LT-β (tj. rezidua, která tvoří štěp

LT α1/β2). Dá sc očekávat, že další protilátky anti-LT namířené proti lidským hctcromerickým komplexům LT-α/β, které působí jako agens blokující ΤΤ-β-R u člověka, se naleznou užitím rutinních testů a testů popsaných v tomto vynálezu.

Agens blokující ΤΤ-β-R inhibuje kontaktní přecitlivělost zprostředkovanou Thl buňkami u myší

Agens blokující LT β-R podle předkládaného vynálezu může inhibovat imunitní odpověď zprostředkovanou buňkami Thl. Jeden takový typ představuje pozdní přecitlivělost, DTH (Cher a Mosmann, J. Immunol. 138: 3688 3694, 1987, Roitl a kol., lmmunology. s. 22.1-22.12, 40 Mosby-Year Book Europe Ltd., 3. vydání. 1993). DTH jc vyvolána, když Thl buňky citlivé k antigenu secernují cytokiny poté, co se znovu setkaly se stejným antigenein. Thl cytokiny přitahují a aktivují makro fágy, které uvolňují ještě další efekt ořové molekuly, a ty spouští zánětlivou odpověď.

Imunitní odpověď typu DTH sc rozděluje na 3 podtypy: kontaktní, tuberkulinovou a granulomatózní přecitlivělost. Tyto 3 typy přecitlivělosti (hvpersenzitivní reakce. HS) sc odlišují rychlostí a povahou odpovědi na cizorodý antigen. když je aplikován přímo na kůži nebo do podkoží senzibilizovanému (aktivovanému setkáním santigenem) subjektu. Reakce DTH se dá sledovat měřením rychlosti a míry zesílení kůže.

HS reakce tuberkulinového typu jsou kožní reakce, které se objevují na kůži v místě vpichu po injekci cizorodého mikrobiálního antigenu, kterému byl již předtím subjekt vystaven (např, Mycobacterium tuberculasix nebo M. leprae). Tato kožní reakce, která dosahuje maxima mezi 48 a 72 hodinami, sc často užívá jako diagnostický test vnímavosti k antigenu, se který m se

-15CZ 298277 B6 subjekt již dříve setkal (např. tuberkulinový kožní test). Po rozvinutí lézí tuberkulinového typu může nastat granulomatózní reakce, pokud antigen přetrvává ve tkáni.

Granulomatózní reakce jsou klinicky nejzávažnéjší formou DTH reakcí, protože vedou k mnoha 5 patologickým účinkům spojeným s nemocemi zprostředkovanými I hl buňkami. Granulomatózní reakce se objevuje, když se antigeny nebo imunní komplexy neoddělí od makrofágů a stále stimulují sekreci. Thl cytokinů. Chronický zánět a shlukování makrofágů v místě podnětu je charakteristické pro granulomatózní reakci.

io Jádro tvořené epitelovými buňkami a makrofágy, které může být obklopeno ještě lymfocyty a vláknitými depozity, vytváří pevnou strukturu zvanou granulom. Někdy dochází k extenzivnímu odumírání buněk v jádře granulomu (např. v plicní tkáni ovlivněné tuberkulózou). Ke ztvrdnutí cílové tkáně při granulomatózní reakci dojde během 4 týdnů.

i5 Látky ovlivňující frekvenci tvorby granulomů lze identifikovat pomocí my ší infikovaných parazitem krevničkou (Schizo.stoma sp.). Parazitická krevní motolice Schizoxtomu způsobuje onemocnění vedoucí ke vzniku granulomů kolem vajíček motolice nakladených v portál nich žilkách infikovaných jater. Agens. inhibující DTH reakci zprostředkovanou Thl buňkami, bud¹ zmenší velikost granulomu, nebo zmenší frekvenci vzniku granulomů v infikovaných myších játrech.

Buněčná reakce na vajíčka motolice se dá kvantifikovat sledováním časového průběhu počtu a velikosti granulomů vzniklých v myších, ošetřených předpokládaným agens blokujícím LT—β—R v rostoucí koncentraci.

Kontaktní přecitlivělost (CHS) je třída DTH, kde cílovým orgánem je kůže. Zánétlivá odpověď 25 u CHS se vyvolá lokální aplikaci reaktivního haptenu na kůži. Alergeny obecně obsahují alespoň jednu haptenovou molekulu, která je příliš malá na to. aby sama byla antigenní, Hapten proniká epidermis a reaguje s normálními proteiny pod kůží, kde tak vzniká nový antigenní komplex.

Opakované setkání citlivého subjektu s haptenem spouští DTH odpověď. Konjugát tvořený 30 haptenem a proteinovým nosičem, ve spojení s buňkami prezentujícími antigen, aktivuje efektorový mechanismus, který spouští uvolnění cytokinů včetně IE-2. IL 3. IFN-γ a GM-CSF. Kaskáda uvolněných cytokinů způsobí, že T buňky CD4+ začnou proliterovat, změní se profil exprese různých povrchových adhezivních molekul a změní se také míra, s jakou jsou T buňky a makrofágy přitahovány na místo zánětu v kůži. Kaskáda cytokinů a následná vazodilatacc. 35 buněčná infiltrace a cdém dermis a epidermis vedou k otoku a zánětu cílové tkáně, což způsobí měřitelné zesíleni kůže jako odpověď na DTH reakci.

Míra senzibilizacc jedince určitým haptenem jc závislá na mnoha faktorech. Tyto faktory zahrnují např. to. Jak dobře proniká hapten pokožkou, a jak vytváří konjugát s hostitelovým protcino40 vým nosičem. Jeden z haptenů, který' scnzibilizujc téměř každého jedince je 2,4-dinitrofluorobenzen (DNFB).

Kožní reakce na hapten DNFB je klasickým zvířecím modelem buněčné (buňkami zprostředkované) imunity. Lokalizace této CHS odpovědi na ucho senzibilizované myši dovoluje snadno, 45 přesně a reprodukovatelně kvantifikovat tuto buněčnou imunitní odpověď in vivo měřením tloušťky ucha. Podrobnosti CHS reakcí u myší a hislopatologie zánětlivc odpovědi indukované DNFB byla popsána (Chishohn a kol.. Eur. J. Immunol. 23: 682 688. 1993).

Schopnost DNFB indukoval kontaktní přecitlivělost u většiny jedinců může být využita pro iden5ϋ tiílkaci látek, které redukují nebo zcela eliminují zánčtlivou odpověď, spojenou s DTH reakcí, zprostředkovanou Thl buňkami. Rozpustný myší fúzní protein ΕΤ-β R-Fc účinně inhibujc odpověď kontaktní přecitlivělosti indukovanou DNFB u myší (příklad 8). Myši byly na počátku senzibilizovány aplikací DNFB do chodidla zadní nohy po dva následující dny. Pět dní poté byla aplikována podprahová dávka DNFB v roztoku nosiče na povrch levého ucha. Samotný roztok 5? nosiče by l pro kontrolu aplikován na pravé ucho.

- 16CZ 298277 B6

Do myší pak byla vstřikována intravenózně rostoucí dávka agens blokujícího LT-β—R (příklad 2, příklad 8). Injekce samotného pufru PBS nebo lidského fúzního proteinu IgG l,FA3-Fc sloužily jako negativní kontroly, a injekce monoklonální protilátky PS/2 specifické pro anti-VLA4. která inhibuje CHS, byla jako pozitivní kontrola. Po 24 hodinách byla změřena tloušťka každého ucha.

Inhibicc otoku ucha způsobená agens blokujícím LΤ-β-R byla posouzena srovnáním s neošetrenou skupinou a s negativní kontrolou.

Obr. 5 ukazuje, že mLΤ-β-R-Fc způsobuje významné snížení otoku ucha jako odpověď na apli10 kaci DNFB u myší ve srovnání s kontrolami (PBS a LFA3-Fc). Rozpustný LΤ-β-R blokuje CHS reakci stejně účinně jako inhibitorová monoklonální protilátka PS/2 specifická pro anti-VLA4, která působí tak, že blokuje vstup T buněk do místa působení antigenu (Chisholm a kol.. Eur. J. Immunol. 23: 682-688, 1993).

Tyto ú d aj e u k azuj í, že roz p u st ný f ú zn í prote i n L T- β- R, kte rý p ů so b í j a k o age n s b 1 o kuj í c í L I - βR in vitro také účinně inhibuje imunitní odpověď zprostředkovanou Tlil buňkami po podání zvířeti. Agens blokující LT β-R podle tohoto vynálezu, identifikované testem in vitro. sc může testovat testem sledujícím otok ucha popsaným výše a může se tak vybrat další agens blokující L Τ-β-R. které je užitečné pro zmenšení síly imunitní odpovědi spojené s Thl buňkami in vivo.

Agens blokující LT-β-R neinhibuje imunitní odpověď zprostředkovanou Th2 buňkami (huniorální)

Agens blokující LT—β—R podle vynálezu, jak je ukázáno výše, inhibuje efektorový mechanismus 25 zprostředkovaný Thl buňkami, jako je např. pozdní kontaktní přecitlivělost (obr. 5). lato odpověď zprostředkovaná Thl buňkami jc inhibována aniž by došlo k ovlivnění imunitní odpovědi závislé na Th2 buňkách. Odlišný vliv agens blokujícího LT-β-Β na imunitní odpověď závislou na Tli2 buňkách byl ukázán sledováním imunitní odpovědi závislé na Th2 buňkách, jako je např. primární protilátková odpověď a změna izotypu, v přítomnosti agens blokujícího LT β R.

Během desetidenního období byly myši pětkrát injikovány bud rozpustným fúzním proteinem ΕΤ-β-R (ml,Τ-β-R Fc, příklad 2), nebo kontrolním IgG fúzním proteinem (LFA3 Fc) anebo byly ponechány bez ošetření. Po druhé injekci byly všechny myši injikovány 100 μΙ kompletního Freundova adjuvans se 100 pg ovalbuminu ke kořeni ocasu. Po 11 dnech byly sledovány meto35 dou EL1SA titrv primárních sérových protilátek specifických proti ovalbuminu izotypu IgG 1.

IgG2 a IgM.

Obr. 6 ukazuje vliv agens blokujícího myší LT-β-R (mΕΤ-β-R Fc) na produkci protialbuminovýcli protilátek v séru myší imunizovaných ovalbumineni (příklad 9). Podání agens blokujícího 40 LT-β- R neovlivnilo významně titry primárních protilátek. Pro srovnání signální dráha receptoru

CD40 indukovaná ligandem GD40 úplně blokuje antigennč specifickou odpověď IgG u myší (Renshaw a kol., J. Exp. Med. 180: 1889 -1900, 1994). CD40 jc dalším z řady párů ligand/rcceptor, který patří do rodiny TNF.

Celková produkce imunoglobulinů a jejich zrání jsou jasně závislé na Th2 buňkách. Aleje takc zřejmé, že Thl cytokin IFN-γ sc účastní, ale přitom není zcela nezbytný pro změnu na podtřídu imunoglobulinů lgG2a (Ikiang a kol.. Science 259: 1742-1745, 1993). Agens blokující ΕΤ-β-R (mLT-p-R-Fc) neinhibuje změnu na IgG2a v těchto pokusech. Je možné, žc agens blokující LT-β- R podle předkládaného vynálezu neblokuje humorální stránku odpovědi zprostředkované 5o Thl buňkami. Kromě toho, proliferační odpověď lymfocytů u myší ošetřených mLT-[3-R-Fc nebyla snížena (příklad 10, obr. 7).

- 17CZ 298277 B6

Tylo pokusy ukazují, že terapie založená na podávání agens blokujícího LΤ-β-R podle vynálezu neovlivňuje nepříznivě produkci protilátek v imunitní odpovědi zprostředkované Th2 buňkami.

Normální profil proti látkové odpovědi, ukázaný na obr. 6, také ukazuje, že intenzivní ošetřování myší mLT-[3-R Fc není pro ně toxickém, a dále ukazuje terapeutickou užitečnost přípravků podle vynálezu. Onemocnění zprostředkovaná pomahačskými 1 buňkami.

Mnoho orgánově specifických autoimunitních stavů zahrnuje patologickou odpověď Thl buněk. Přehledy z poslední doby přinášejí Modlin a Nutman, Current Opinion in Immunol. 5: 511-517, 1993, Romagnani a kol.. Ληη. Rev. Immunol. 12: 227-257. 1994. K orgánově specifickým 10 autoimunitním stavům patří: roztroušená mozkomíšní skleróza, diabetes mellitus závislý na inzulínu. sympatická oftalmie. uveitida a lupénka.

Diabetes mellitus závislý na inzulínu je autoimunitní nemoc, při které jsou beta buňky pankreatu produkující inzulín zničeny infiltrací leukocytu do Langerhansových ostrůvků. Diabetes může 15 být snadno indukován u novorozených ..neobézních diabetických^ (NOD) myší tím, že se přenesou aktivované prcdiabctické splenocyty. Buňky podobné Thl a Th2 buňkám, jinak geneticky velmi podobné, byly přeneseny do novorozených NOD myší. Pouze Thl buňky indukovaly rychle diabetes téměř u všech příjemců (Katz a kok. Science 268; 1185-118, 1995), To ukazuje, žc agens blokující ΕΤ-β-R podle vynálezu, které in vivo inhibujc vliv imunitní odpovědi zpro20 střed kované Thl buňkami, bude užitečná pro léčení nebo prevenci diabetů závislého na inzulínu.

Některá systémová autoimunitní onemocnění, včetně různých artritid, jsou spojená s Th I buňkami. Revmatoidní artritida a Sjorgcnův syndrom zahrnují také ThO a Tlil buňky. Naproti tomu systémový lupus crythematosus (SLE) jc spojen s aberantní Th0/Th2 dominantní odpovědí.

Některá chronická zánětlivá onemocnění vykazují také aberantní odpověď Thl typu, včetně zánčtlivé střevní choroby, plícní sarkoidózy a odhojení alloštěpu. Zánětlivá choroba střev (Inflammatory bowel disease, IBD) u člověka zahrnuje alespoň dvě kategorie, ulcerickou kolitidu a Crohnovu nemoc. Obě choroby jsou důsledkem imunopatologické poruchy podobné autoimu30 nitním poruchám. U myšího modelu IBD je zřejmé, že některé látky blokující ThI odpověď mohou blokovat rozvoj nebo průběh nemoci (Powrie, F. a kol., lmmunity 1: 553. 1994). Je možné, že inhibice Thl složky munitní odpovědi by mohla mít prospěšný vliv také na lidskou IBD. Mnoho modelů IBD bylo již popsáno a uvádí je v přehledu Elson. C. a kol. (Gastroenterology 109: 1344. 1995). Existují nejméně 3 skupiny modelů, modely chemicky indukované. 35 modely indukované polymery' nebo mikroorganizmy a modely imunologické užívající mutované myši.

U jednoho všeobecně užívaného modelu, indukovaného polymery nebo mikroorganizmy, se přidá roztok dextransulfátu do vody k pití myším, a po strávení je epiteliální výstelka střeva 4d podrážděna, což vede k výrazné imunitní odpovědi na poškození. U zvířat se vyvine kolitida, která sc manifestuje jako průjem, krev ve stolici, ztráta tělesné hmotnosti a zkrácení tlustého střeva díky expanzi střevní stěny. Tento model indukuje levostrannou kolitidu a epiteliální displázii, která může vest až k rakovině, což se charakterizuje jako ulcerická kolitida.

Druhý model představuje transplantace vybrané skupiny T buněk CD4 do myší SOD. tj. myší, které nemají B a T buňky (Powrie, F. a kol., International. lmmunology 5: 1461 1471, 1993. Morrissey a kol., J. Exp. Med. 178: 237-1993). Když vybrané buňky, zvané CD45RB^VV>, expanduji a rekonstituují imunitní systém SOD myši, jc normální mechanismus zabraňující vzniku autorcaktivních buněk nefunkční, a tudíž sc vyvinou autoreaktivní buňky. IJ potkanů se objevují 50 buňky reagující s mnoha orgány, zatímco u myší reagují primárně vc střevě. Látky, které buď změní způsob expanze a vývoje autorcaktivních buněk, nebo které mohou zablokovat schopnost buněk napadat střevo, budou účinné v tomto modelu. Avšak jelikož tento model do jisté míry napodobuje patologický rozvoj autorcaktivních buněk imunitního systému, ošetření, které plně blokuje tento model, bude pravděpodobně jen modifikovat průběh nemoci u člověka. U modelu 55 protilátky proti TNF blokují nemoc (Powrie a kol. lmmunity 1: 552, 1994) a tyto protilátky byly

- 18CZ 298277 B6 účinné při ošetření člověka (van Dullcmen, Η. M. a kol.. Gastroenterology 109: 109, 1995),

Tento model se dá užít pro předpověď a testování těch látek, které mohou být terapeuticky účinné v BDH. Model CD45RB je příklad chorobného procesu zprostředkovaného Thl buňkami a skutečné u potkanů vede k onemocnění mnoha orgánů. Účinnost LT-p-R-lg v tomto modelovém systému ukazuje, žc ΤΤ-β-R Ig nebo jiné prostředky, blokující interakce ΤΤ-β-R s ligandem.

mohou být prospěšné v celé řade příbuzných imunologických onemocnění.

Obecně nebyl dosud přesně zjištěn příspěvek autoprotilátek ve srovnání sc specifickými T buňkami u těchto autoimunitních chorob. Buněčná odpověď tvoří zřejmě hlavní příspěvek io k patogeničnosti při těchto systémových autoimunitních nemoccch. které jsou v současnosti považovány za primárně způsobené protilátkami, např. různé artritidy.

Normální imunitní odpověd¹ na některá patogenní infekční agens také vyvolá odpověď Thl buněk, která může být nadměrná a představuje sama značný problém. Příklady granulomatózních 15 reakcí (třída DTH reakcí popsaných výše), které vedou k vážným zdravotním problémům, zahrnují lepru, tvorbu granulomů v plicích luberkulózních pacientů, sarkoidózu a schizostomiázu (Roitt a kol., Immunology, s. 22.5-22.6, Mosby-Year Book Europe Ltd., 3. vydání. 1993). Lupen kaje pravděpodobně také zprostředkována Thl buňkami.

Cytolytické T buňky, tj. CTT (CD8 pozitivní T buňky, CD8+) se dělí také do dvou subpopulací podobných Thl a Th2 buňkám. Je proto možné, že to, co je známo o Th skupinách, platí také pro CD8+ buňky, které se primárně účastní antivirové imunitní odpovědi a odhojení štěpu.

Léčení podáváním agens blokujícího ΤΤ-β-R

Přípravky podle vynálezu se budou podávat v účinné dávce k léčení určitých klinických stavů. Určení výhodného farmaceutického přípravku a terapeuticky' účinné dávky a režimu pro určité použití je plně zvládnutelné v rámci současného stavu oboru, např. v závislosti na hmotnosti pacienta, rozsahu požadovaného léčení, toleranci pacienta. Dávkv v hodnotě 1 mg/kg rozpust30 něho LT-p-R jsou vhodným výchozím bodem pro optimalizaci léčebných dávek.

Vhodné terapeuticky účinné dávky sc také mohou stanovit provedením pokusů in v Hro, ve kterých se měří koncentrace agens blokujícího LT β-R potřebná kvysycení povrchu cílových buněk (v závislosti na agens buď buňky pozitivní na LT-p-R, nebo LT ligand) během I až 14 35 dnů. Test založený na sledování vazby ligand-receptor popsaný zde se může použít ke sledování reakce vysycování povrchu buněk. Buňky pozitivní na ΤΤ-β-R nebo LT ligand se dají separovat od populace aktivovaných lymfocytú pomocí FACS. Na základě výsledků testů in vitro lze stanovit vhodný rozsah koncentrací agens blokujícího ΤΤ-β-R pro další testování na zvířatech způsobem popsaným ve vynálezu.

Podávání rozpustných molekul 1./Γ—β R, protilátek anti-LT ligand a antmLT-β R podle vynálezu. samotných nebo kombinovaných, včetně izolovaných a puri Ukovaných forem protilátek nebo komplexů, jejich solí nebo farmaceuticky přijatelných derivátů, lze provádět obvyklým způsobem pro podávání látek s imunosupresivní aktivitou.

Farmaceutické přípravky pro tuto terapii mohou být v různých formách. To znamená např. tuhé, polotuhc nebo tekuté dávkovači formy jako např. tablety, pilulky, prášky, roztoky nebo suspenze, čípky, injekční a infúzní roztoky. Výhodná forma závisí na požadovaném způsobu podávání a terapeutickém použití. Způsoby podávání zahrnují aplikační cestu parenteráhií. perorální, sub5d kutánní, intravenózní, topickou a intralczní (do poškozeného místa).

Rozpustné molekuly LT β-R. ligandy anti-LT a protilátky anti-LT-β R podle vynálezu se mohou např. přidat do sterilního izotonického přípravku, buď s. anebo bez kofaktorů stimulujících příjem nebo stabilitu. Přípravek jc výhodně tekutý nebo lyollIizovaný prášek. Přípravek se

- 19CZ 29X277 B6 z rozpustných molekul LT-β R, ligandu anti-LT a protilátek anti -LT-p-R podle vynálezu vytvoří např, tak. že se naředí pufrem. který obsahuje 5.0 mg/ml monohydrátu kyseliny citrónové. 2,7 mg/ml trinatrium-citrátu, 41 mg/ml manitolu, 1 mg/ml glycinu a 1 mg/ml polysorbátu

20, Tento roztok se lyofilizu je, uskladní zamražený a rekonstituuje před použitím sterilní vodou pro injekce.

Přípravek také výhodně obsahuje obvyklé farmaceuticky přijatelné nosiče, dobře známé v oboru (viz např. Remington Phannaceutical Sciences, 16, vyd,, 1980, Mac Publishing Company), Takové farmaceuticky přijatelné nosiče zahrnují další medicinální agens. nosiče, genetické nosiče, adjuvans, excipicnty a další, např. lidský sérový albumin nebo preparáty z plazmy. Přípravek je výhodně v podobě jednotkové dávky a podává se jedenkrát nebo vícekrát denně.

Farmaceutický přípravek podle vynálezu lze podávat také pomocí mikrosfér, lipozomů nebo jiných mikročásticových systémů anebo retardet umístěných přímo v ovlivňovaném orgánu, jeho blízkosti anebo v jiném spojení s ním, nebo v krevním oběhu. Vhodným příkladem takové lékové formy s prodlouženým uvolňováním léčiva je semipermeabilní polymerni matrice formovaná do tvaru čípků nebo mikrotobolek. Implantovatclnc nebo v mikrotobolkách použitelné matrice zahrnují polyaktidy (patent US 3 773 319, LP 58,481) kopolymery kyseliny L-glutamové a ethyl—L— glutamátu (Sidman a kol., Biopolymcrs 22: 547-556, 1985), poly-2-hydroxyethylmetakrylátu nebo cthylvinylacetátu (Langer a kol., J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277, 1981, Langer. Chem. Těch. 12:98-105. 1982).

Li pozorný obsahující rozpustné molekuly ΕΤ-β-R, ligandy anti—LT a protilátky anti-LT-p-R podle vynálezu, samotné nebo v kombinacích, se připraví dobře známým způsobem (viz např. DE 3.218.121, Epstein a kol.. Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 82: 3688-3692, 1985. Hwang a kol.. Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 77: 4030-4034. 1980. patenty US 4 485 045 a US 4 544 545). Lipozomy jsou obvykle malého (200 až 800 Angstrom) jednovrstevného typu, a obsah lipidů je vyšší než 30 % (molárních) cholesterolu. Podíl cholesterolu se vybere tak, že řídí optimální míru uvolňování rozpustných molekul LT β-R, protilátek anti LT ligand a anti-LT-β- R.

Rozpustné molekuly ΙΤ-β-R. ligandy anti-LT a protilátky anti-LT β-R podle vynálezu se mohou připojit k lipozomům obsahujícím jiná agens blokující ΕΤ-β-R. imunosupresiva nebo cytokiny modulující aktivitu blokující LT -β-R. Navázáni rozpustných molekul LT β R, ligandu anti-LT a protilátek anti—l.T—β—R sc provede známým zcsítovacím činidlem jako např. Iieterobifunkčním zesilovacím činidlem, které sc užívá pro navázání toxinů nebo chemoterapcutických agens na protilátky pro cílené podávání. Konjugace s lipozomy se dá také uskutečnit užitím zesilovacího činidla zacíleného na sacharidy 4-(4-maleimidofcnyl)hydrazinu kyseliny máselné, MPBH (Duzgunes a kol., J. Cell. Biocliem. Abst, Suppl. 16E, ΊΊ. 1992).

Výhody terapeutických přípravků obsahujících agens blokující LT β-R

Agens blokující LT-p-R podle vynálezu je schopné selektivně ínhiboval imunitní efektorový mechanismus zprostředkovaný Tlil buňkami, ale nikoliv mechanismus zprostředkovaný Th2 buňkami. Agens blokující ΤΤ-β-R bude užitečné pro léčení stavu, které jsou exacerbovány aktivitami cytokinů Tlil typu (např. IL-2 a IFN-γ). Protože Th 1 cytokiny inhibují imunitní odpověď závislou na Th2 buňkách, agens blokující ΕΤ-β-R tak může nepřímo stimulovat určité odpovědi závislé na Th2. které jsou normálně inhibovány kaskádou cytokinů indukovanou Th 1 buňkami.

Schopnost selektivně potlačovat buněčnou odpověd Tli 1 (nebo nepřímo stimulovat Th2)jc užitečná pro léčení abnormalit různých typů buněčné imunitní odpovědi, včetně různých auto imunitních a chronických zánětlivých stavů, tolerance antigenů a buněčného odhojení tkáňového štěpu nebo orgánového transplantátu.

- 20 ( Z 298277 B6

Jak bylo zmíněno již výše, léčení imunologických stavu zprostředkovaných Thl buňkami využívá imunoniodulační a imunosupresivní agens. která mají pleiotropní účinek na široké spektrum buněčných typu a imunitních odpovědí. Tato nespecifická imunosupresivní agens jsou zpravidla vyžadována ve vysokých a často i cytotoxických dávkách, které způsobují řadu vedlejších účinků.

Schopnost měnit charakter imunitní odpovědi je podporována nedávnou studií diabetů u myší (Katz a kol.. Science 268: I 185-1188. 1995) a u modelu a I logem ho transplantátu (Saegh a kol., J. Exp. Med. 181; 1869,1874. 1995). Ve studiu Saegha (viz výše) je ukázáno, žc fúzní protein. io blokující kostimulační dráhu T buněk CD28-B7, indukuje toleranci ke štěpu z. ledviny. Tolerance korelovala se snížením Thl cytokinů a se zvýšením Th2 cytokinů in vivo. lyto údaje ukazují, žc agens blokující LT—β—R podle vynálezu bude užitečné v potlačení odbojem tkáňového štěpu nebo orgánového transplantátu tím, že inhibuje uvolňování cytokinů zprostředkované Thl buňkami.

Agens blokující LT β -R v přípravku a způsobu podle vynálezu se může modifikoval, aby se dosáhlo požadované úrovně signální dráhy LT-p-R v závislosti na stavu, poruše nebo nemoci, která je léčena. Lze předvídat, žc absolutní úroveň signální dráhy LT-β-Κ může být jemně nastavena tím, že se budou měnit koncentrace a afinity (k příslušným molekulárním cílům) Čin i20 del blokujících LT β-R.

Například v jednom provedení vynálezu je přípravek obsahující rozpustné molekuly ΕΤ-β-R podán subjektu, Rozpustný rcceptor ΕΤ-β-R účinně soutěží s receptory LT-β na povrchu buněk o navázání povrchových ligandu. Schopnost kompcticc s povrchovými ligandy je závislá na rela25 tivních koncentracích rozpustných LT-β-Κ a molekul ΕΤ-β-R na buněčném povrchu, a také na jejich relativních afinitách pro vázání ligandu.

Rozpustné molekuly nesoucí mutace, které zvyšují nebo snižují vazebnou afinitu daného mutanl· ního rozpustného LT-p-R k povrchovému ligandu. se mohou vytvořit technikami rekombinantní 30 DNA, odborníkovi dobře známými. Velký počet molekul s místně cílenými nebo náhodnými mutacemi se může testovat na svou schopnost působit jako agens blokující ΕΤ-β-R užitím rutinních pokusů a způsobů popsaných v předkládaném vynálezu.

Podobně v jiném provedení vynálezu protilátky namířené proti LT β receptorúm nebo oproti 35 jedné či více podjednotkám LT ligandu působí jako agens blokující LT β-R. Schopnost těchto protilátek blokovat signální dráhu receptorů LT-β se může modifikovat mutací, chemickou modifikací nebo jiným způsobem, který může změnit účinné koncentrace nebo aktivitv protilátky podané subjektu.

Schopnost snížit aktivitu signální dráhy LI -β-R, aniž by se úplně inhibovala, může být důležitá pro ustanovení nebo udržení redukované hladiny signální dráhy LT-β-Κ. která podporuje normální imunitní funkci zatímco inhibuje odpovědi zprostředkované Thl buňkami, které převyšují normální úroveň nebo jsou jinak abnormální.

Poškození genu LT-a u myši vede k aberantnímu vývoji periferních lymfoidních orgánů (DeTongi a kol.. Science 264; 703-707, 1994), Takovéto myši postrádají lynifatické uzliny a v jejich slezinách chybí ve folikulech obvykle zcela jasná hranice mezi oblastmi bohatými na B buňky a T buňky. Věříme, že tento fenotyp je spojen se ztrátou signální dráhy ΕΤ-β-R indukované povrchovými LT. protože podobné fenotypy nebyly pozorovány, když se modulovala akti50 vita TNE-R. Schopnost selektivně nebo částečně blokovat dráhu LT-p-R může být užitečná pro léčení abnormálního vývoje lymfoidních orgánů, který je způsoben chybnou nebo nadměrnou expresí v signální dráze L I-β-R.

CZ 293277 B6

Některé reakce spojené s ThI jsou kritickými složkami řady forem imunitní odpovědi zprostředkovaných buňkami (Romagnani. S.. Ann. Rev. Immunol, 12: 227-257. 1994), a proto úplná inhibiec aktivita Thl buněk míižc být za určitých okolností nežádoucí. Např. myš je účinně odolná k parazitární infekci, pokud je aktivována dobrá Thl odpověď. Infekční agens jako např. Listenu 5 a Toxoplasma vyvolávají silnou odpověď Th 1 typu. U člověka je od po věd' vyvolaná Mycobacterium luberculosis také založena na Thl typu. Patogenicita leishmanióz koreluje s odpověďmi podobnými Thl odpovědi u myší (Reed a Scott. Current Opinion in Immunol. 5: 524-531, 1993).

Schopnost ovlivňovat míru Thl inhibiee blokováním signální dráhy LT β R je důležitá pro io maximalizaci prospěných výsledků, kterých lze dosáhnout léčením, při němž se použije agens blokující LT-p-R podle předkládaného vynálezu.

Následující příklady ilustrují rozpustné LT-β receptory, anti-LT ligandy a protilátky anti-LT-βR podle vynálezu a způsoby použité pro jejich charakterizaci. Tyto příklady nejsou žádným způis sobem omezující, jejich účelem jc osvětlit a ilustrovat vy nález. Předkládaný vynález je omezen pouze uvedenými nároky.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. I. Sekvence extracelulární části lidského receptoru LT-β, která kóduje doménu vážící ligand.

Obr. 2. Rozpustný myší LT-β receptor spojený s doménou Fc lidského IgGI (mLT-β R-Fc) 25 blokuje LT-p-R signální dráhu u myších buněk WEII1 po indukci myším ligandem LT-α/β.

Buňky WEHI 164 odumírají v závislosti na rostoucí koncentraci LT ligandu (m LT-α/β). Rozpustný mLT-p-R-Fc v koncentraci 10 mg/1 blokuje ligandem indukované odumírání. Rozpustný myší TNF receptorový fúzní protein (p55TNF-R-Fc) má jen malou účinnost v blokování odumírání buněk po aktivaci LT-α/β. Růst byl kvantifikován po třech dnech měřením optické hustoty 30 (OD 550) po reakci MTT. což je úměrné počtu buněk.

Obr. 3. Monoklonální protilátka namířená proti lidskému Ι/Γ-β-R (BDA8) blokuje interakci mezi rozpustným LT ligandem a LT-p-R na povrchu lidských buněk. Růst nádorových buněk WiDr je blokován kombinací IFN γ a rozpustného ligandu LT-al/p2. Protilátka BDA8 blokuje 35 schopnost ligandu LT-al/p2 inhibovat růst nádorových buněk WiDr. Plné symboly v grafu ukazují růst kontrolních buněk v přítomnosti IgG 1 mAb (IOpg/l). Prázdné symboly ukazují vliv anti-LT-p-R protilátky BDA8 (10 pg/l).

Obr. 4. Monoklonální protilátka namířená proti lidskému Ι.Τ-β (B9) blokuje interakci mezi povr40 chovým ligandem LT α/β a rozpustným LT-β receptorem (hLT-p-R Fc. 2 pg/ml). Povrchově vázaný LΤ-β-R-Fc byl detekován pomocí oslí protilidské protilátky IgG značené fykoerytrinem a následnou analýzou na třídiči buněk (FACS). Průměrná intenzita fluorescence výsledného vrcholu je vynesena v grafu jako číslo kanálu. Čárkovaná čára ukazuje průměrnou intenzitu fluorescence odpovídající množství vázaných receptoru bez přítomnosti B9.

Obr. 5. Vliv agens blokujícího ΕΤ-β-R (mLT β-R-Fc) na otok ucha u myšího modelu kontaktní pozdní přecitlivělosti (DTH). Graf ukazuje zvětšení tloušťky ucha měřené 24 hodin po vnesení antigenú 0,2% DFNB do ucha senzibilizované myši. Každý symbol představuje samostatný pokus. Ve všech pokusech bylo užito 7 až 8 myší na jedno měření kromě těch, která jsou oz.na50 cena kosočtvercem, v nichž by la užita jen 4 zvířata. Jako negativní kontrola sloužily myši ošetřené pufrem (PBS) a nebo kontrolním fúzním proteinem IgG LFA3-Fc (20 mg/kg). Myši ošetřené monoklonální protilátkou anti-VLA4 (PS/2 mAb) v koncentraci 8 mg/kg, která inhibuje otok ucha způsobený kontaktní DTH, sloužily jako pozitivní kontroly.

- 22 CZ 298277 B6

Obr. 6. Graf ukazuje změny hmotnosti pozorované u myší 14 dní po ošetření fúzním proteinem mLT-p-R-lga hLFA3-lg*

Obr. 7. Graf ukazuje délku tlustého střeva pozorovanou 14 dní po ošetření fúzním proteinem s ιηΕΤ-β-R-lg a hLFA3 dg.

Obr. 8. Časový průběh tělesné hmotnosti myší po injekci CD45RB^,1!/,'^> CD4 pozitivních I buněk. CD45RB^vvwkv CD4 pozitivních T buněk, CD45RB^s,’^kv a inLJ pR-lg, CD45RB'^>sokva hLFA3 Ig.

ίο Obr. 9. Grafická reprezentace průměrů a směrodatných odchylek tělesné hmotnosti pozorované v pokusech zobrazených na obr. 8 až 11.

Obr. 10. Graf ukazuje zvýšení tloušťky chodidel zadních končetin myší po injekci negativní a pozitivní kontroly a mLTpRlg.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava rozpustných lidských LT β receptorů v podobě fúzních proteinů s imunoglobulínovým Fc

Sekvence cDNA lidského klonu izolovaná z lidské knihovny I2p transkribovaných sekvencí odvozená ze somatických hybridních buněk (Bacns a kol., Genomics 16: 214-218, 1993) byla vložena do Gen Bank a teprve později byla identifikována jako sekvence kódující lidský LT β-R. Úplná sekvence eDNA lidského ΕΤ-β-R je dostupná od r. 1992 v Gen Bank pod položkou č. L04270,

Extracelulámí doména L I-β-R až po transmembránovou oblast (obr. 1) byla amplifikována metodou PCR zcDNA klonu pomocí primerů obsahujících místa pro restrikční enzyme Notl a Sall na svých 5' a .3' koncích (Browning a kol.. J. Iinmuno. 154: 33-46, 1995). Amplifikovaný produkt byl naštěpen Notl a Sall, přečištěn a ligován (vložen) do Notl Iinearizováného vektoru .b pMDR90l, společně s fragmentem Sall—Notl kódujícím Fc úsek lidského IgGl. Výsledný vektor obsahoval gen dihydrofolátreuktázy a fúzního proteinu LΤ-β-R-Fc, každý se zvláštním promotorem.

Vektor byl elektroporací vnesen do buněk CHOdhfr- a standardním způsobem byly izolovány to klony rezistantní vůči metotrcxátu. ΕΤ-β-R-FC byl scccrnován do média a test EL JSA byl užit k výběru buněčných linií produkujících nejvyšší hladinu receptorovcho fúzního proteinu. Vysokoprodukční buněčná linie byla poté kultivována ve velkém a upravené médium sc sbíhalo. Čistý LT-β rcccptorový fúzní protein byl získán přečištěním pomocí afinitní chromatografie s protein— A-sefarózou (Pharmac ia).

Příklad 2

Příprava rozpustných myších LT β receptorů v podobě fúzních proteinů s imunoglobuliliovým 50 Fc

Úplný eDNA klon myšího mLT β-R byl připraven ligací fragmentů 5'Notl/AaLi a 3'ApaLi/NotI ze dvou částečných izolátů cDNA do Notl místa vektoru pCDNA3 (InVitrogen, San Diego, CA).

Sekvence tohoto dDNA klonuje přístupná v GenBank jako položka č. L29173. Žádno rozdíly

-23CZ 298277 B6 v sekvenci nebyly nalezeny při porovnání s jinou sekvencí mLl-[3--R nalezenou v Gen Bank pod číslem L38423^ '

Rozpustný fúzní protein (hlgG 1) byl připraven tak. že pomocí PCR se amplifíkoval klon s úplnou 5 cDNA mLT-[3-R s primery 5'AACTGCAGCAGCGGCCCGCCATGCGCCTGCC'C 3' a 5'GACTTTGTCGACCATTGCTCCTGGCTC TGGGG Amplifikovaný produkt byl přečištěn a naštěpen Not 1 a Sall a ligován společně sc Sall/Notl fragmentem Fc lidského IgGl do Notl linearizovaného a fosfatázou ošetřeného vektoru SAB132, čímž vznikl vektor JLB122. Notl kazeta obsahující mLT-β-R I c byla pro stálou expresi přenesena do Notl místa plazmidů io pMDR901, a tak vznikl vektor PSHOOL který byl transfekován do CHO buněk, jak bylo publikováno (Browning a kol. J. lmmunol. 154: 33^16, 1995). Buněčné klony secernující mLT-P-R-Fc byly identifikovány testem LI JSA. Čistý LT-β receptorový fúzní protein byl získán přečištěním ze supematantu CHO buněk pomocí afinitní chromatografie s protcin-A-safcrózou (Pharmacia).

Příklad 3

Použití rozpustného lidského LT-β- Fc pro blokování interakce LT-β receptorú s 1 igandy

Rozpustné lidské hLT—β—R Fc byly testovány na schopnost blokovat vazbu LT ligandú k LT-β receptorúm v testu cytotoxicity nádorových buněk, popsané výše. V tomto testu rozpustné formy LT ligandú (hLΤ-α1/β2), které aktivují signální dráhu LT-β-Κ. se užijí k usmrcení nádorových buněk. Inhibitory signální dráhy snižují cytotoxicitu nádorových buněk indukovanou LT-p-R.

Rozpustné hLT—<χΙ/β2 obsahují zkrácené nebo modifikované podjednotky LT-β postrádající funkční tramsrnembránovou doménu. Rozpustné ligandy hLT αΙ/β2 se váží na ΤΤ-β-R, a tím stimulují signální dráhu LT-p-R, stejně jako povrchové formy ligandú (Browning a kol., .1. lmmunol.. 154: 33-46. 1995). Byly připraveny sériové ředicí řady hLT -al/p2, hTNF a hLT— 30 a. po 0,05 ml v mikrotitrační destičce s 96 jamkami a bylo přidáno 5000 buněk HT29 (ATCC) ošetřených trypsinem v 0,05 ml média obsahujícího 80 U/nil (antivirových jednotek) hu-IFN-γ, Po 4 dnech byla měřena mitochondriální redukce MTT následujícím způsobem: Přidalo se 10 μΐ MTT a po 3 hodinách se redukované barvivo naředilo 0,09 ml isopropanolu s ΙΟπιΜ HCI a měřila se O.D. při 500 nm. Rozpustné recepturové formy čistého lidského IgG sc přidaly 35 v 10 μΙ před přidáním buněk tak, aby výsledná koncentrace byla 5 pg/ml.

Tab. 1 srovnává schopnost hLT-β-R-Fc a p55-TNF-R-Fc chimér (a s lidským IgG jako kontrolou) blokovat inhibiční působení různých rozpustných TNF a LT ligandú na růst nádorových buněk 11129.

Tabulka 1 Koncentrace cytotoxického agans vedoucí k 50% inhibici růstu v přítomnosti agensf

cycotoxické agens	hu-IgG	kont co1a	p55-TNF-R-Fc	LT-p-R-Fc
TNT	0,	08	>10b	0,08
LT-a	3		>1000	3
ΤΤ-α1/β2	5		5	>200

Každé cvtotoxické agens bylo smícháno s Ig fúzním proteinem 10 minut před přidáním 15 k buňkám. Výsledná koncentrace fúzního proteinu byla 5 pg/ml.

^h Vyšší koncentrace nebyly testovány

- 24 CZ 298277 B6

Údaje v lab. 1 ukazují, že rozpustný lidský fúzní protein h Ι,Τ-β-R-Fc účinně blokuje interakcí mezi LT ligandy (α!/β2) a buněčnými povrchovými LT-β receptory, a tudíž je agens blokující

LT-p-R podle předkládaného vynálezu.

Rozpustný fúzní protein LT β - (p55-TNF-R-Fc) podle očekávání úplně blokoval TNE-indukovanou inhibici růstu tím, že navázal TNF, a tak zabránil jeho interakci s povrchovými TNF receptory. Rozpustný TNF receptor neovlivňoval nijak antiproliferační účinek způsobený LT ligandem. Naopak LT-β R Fc blokoval cytotoxický účinek indukovaný LT ligandem, ale neovlivnil účinek TNF ani L T-α. Rozpustný lidský fúzní protein ΕΤ-β-R ne interferuje s aktivací TNF-R působením NTF a LT-α ligandů.

Příklad 4

Použití rozpustného myšího ΕΤ-β-R-Fc pro blokování interakce myších LT-β rcccptorů s ligandy

Rozpustný myší LT β receptor spojený s lidskou Fc doménou IG1 (mLT-p-R-Fc, viz příklad 2) byl testován na schopnost blokovat interakci LT ligandů a LT β receptorů u myší v testu cytotoxicity myších buněk (obr. 2), Test cytotoxicity byl proveden na buňkách WEHI 164 v podstatě shodným způsobem, který byl použit v testu s HT29 buňkami v příkladu 3 (viz také Browning a Ribolini. J. Immunol. 143: 1859-1867, 1989).

Obr. 2 ukazuje vliv mLT-p-R-Fc na ligandem indukovanou signální dráhu v myších buňkách WEHI 164. Buňky WEHI 164 jsou usmrceny po ošetření L F-ct/β ligandem v koncentraci v rozmezí od 1 do 100 ng/ml. Rozpustný mLT-p-R-Fc (10 μΙ/ml) blokuje LI ligandem aktivovanou buněčnou smrt. Přidání rozpustného myšího fúzního proteinu p55-TNF-R-Fc nebo kontrolní IgG protilátky (vše 10 μμ/ηι!) má malý nebo žádný vliv na blokování buněčné smrti. Údaje ukazuji, že rozpustný fúzní protein mLT-p-R-Fc účinné soutěží s povrchovými molekulami LTβ-R o navázání LT ligandů. Tyto výsledky také ukazují, že cytotoxicita indukovaná LT-α/Β je prostředkovaná LT-p-R a je inhibována rozpustným mLT-p-R-Fc, který působí jako agens blokující LT β R podle předkládaného vynálezu.

Příklad 5

Použití protilátek proti lidskému Ι,Τ-β-R pro blokování interakce LT-β receptorů s ligandem

Myší monoklonální protilátky namířené proti lidským LT β receptorúm byly připraveny opakovanou intraperitoneální imunizací RBF myší fúzním proteinem, získaným z CHO buněk, nachytaným na perličky protein-A-saferózy (Phamiaeia) v nepřítomnosti adjuvans. Zvířata byla nakonec stimulována rozpustným hLT-p-R-Fc, jak i.p. tak i.v., buňky sleziny pak byly fúzovány podle klasického způsobu. Supernatanty z hybridomú byly testovány použitím ELIS A testu (Ling a kol., J. Interferon and Cytokine Res. 15: 53 59, 1995). Supernatanty z hybridomú byly dále testovány na svou schopnost blokovat vázání aktivovaných hybridomových buněk II-3. které exprimují povrchový LT—αΙ/β2. k destičkám povlečeným LT β-R-Fc způsobem „rýžování buněk (cell panning assay). Čisté monoklonální protilátky byly získány přečištěním IgG ze supernatantu pomocí protein--A-safarózy (Pharmacia).

Pro stanovení, zda monoklonální protilátka anti-LT-p-R může blokovat signální dráhu Ι,Τ-β-R iniciovanou navázáním rozpustných LT, byl proveden test cytotoxicity s lidskými karcinomovými buňkami WÍDr.

- 25 CZ 298277 B6

Byly připraveny sériové ředicí řady ΕΤ-α1/β2 po 0,05 ml v mikrotitrační destičce s 96 jamkami a bylo přidáno 10 μΙ roztoku obsahujícího 100 pg/ml bud' kontrolní myší protilátky IgGl, nebo myší monoklonální protilátky anti-LΤ-β-R. Do každé jamky sc pak přidalo 5000 buněk WiDr 5 (ATCC) ošetřených trypsinem v 0,05 ml média obsahujícího 50 IJ/ml (antivirových jednotek) hu-IFN-γ. Po 4 dnech byla měřena mitochondriální redukce MTT následujícím způsobem. Přidalo se 10 μΐ MTT a po 3 hodinách se redukované barvivo naředilo 0,09 ml isopropanolu s lOmM HCI a měřila se O.d. při 550 nm. Množství červeného barvívaje úměrné míře buněčného růstu.

Obr. 3 ukazuje, že monoklonální protilátka BDA8 anti-LT-β R působí jako agens blokující LT β-R podle vynálezu. Lidské karcinomové buňky WiDr přestávají růst v přítomnosti IFN-γ a rozpustného LT -α1/β2 ligandu (v rozmezí 0,05 až 50 ng/1). Kontrolní protilátka IgGl (10 pg/ml) nemá žádný vliv na inhibici růstu. Naopak protilátka BDA8 anti-1.Τ-β-R (10 pg/ml) obsahuje 15 schopnost buněk WiDr růst v přítomnosti rozpustného ligandu LT—cx 1 /β2.

Příklad 6

Použití protilátek proti lidskému LT—β pro blokování interakce receptorů s ligandem

Monoklonální protilátky proti lidskému LT-β byly připraveny imunizací myší RBF roztokem, získaným opláchnutím perliček protein A-saferóza-9E 1O-rLT-β, který obsahoval I až 2 pg rekombinantního lidského LT-β v CFA, po kterém následovalo jednorázová stimulace týmž 25 materiálem v IFA. 8 týdnů po stimulaci se myším i.v. podalo 30 pg přečištěného rozpustného rLT β (kyselý eluát z pryskyřice 9E10) a 20 pg stejného materiálu o 2 dny později. Jeden den po druhé i.v. stimulaci byly buňky ze sleziny fúzovány klasickým způsobem, aby vytvořily monoklonální protilátky. Supernatanty hybridomů byly testovány přímou ELIS A nebo FACS barvením ΡΜΛ- aktivovaných 11-23 buněk. Čisté monoklonální protilátky byly získány přečištěním IgG ze sc supernatantu pomocí protein-A-sefarózy (Pharmacia).

Testování pomocí FACS se užilo pro výběr protilátek namířených proti LT-β, které účinně blokují vazbu LT-α/β ligandu v LT-β receptorům na povrchu buněk, a tím napodobují interakci mezi dvěma buňkami in vivo. V tomto testu rozpustné lidské LT-fi-R-Fc (2 pg/ml) se nechaly 35 navázat na povrchové LT ligandy PMA-aktivovaných buněk 11-23 (Browning a kol,,

J. Immunol. 154: 33 -46. 1995) v přítomnosti zvyšující se koncentrace testované protilátky antiLT-β (od 0.02 do 20 pg/ml). Buňky byly opláchnuty a navázány ΕΤ-β-R-Fc byl detekován reakci s oslím protilidským IgG značením fykoerytrincm. Množství navázané fluorescenční značky bylo stanoveno pomocí FACS analýzy a průměrná intenzita fluorescence byla vynesena 40 do grafu.

Obr. 4 ukazuje výsledky FACS analýzy, která měřila schopnost protilátek B9 anti-LT-β blokovat interakci LT-β receptorů s ligandem. Pokus ukazuje, že monoklonální protilátka B9 anti LTβ (0,02 až 5 pg/ml) specificky a účinně soutěží s rozpustným fúzníni proteinem ΤΤ-β-R (2 pg/ml) o navázání LT ligandu buněčného povrchu, a tudíž se radí mezi agans blokující LT β R podle předkládaného vynálezu.

Příklad 7

Použití protilátek proti myšímu LT-α/β pro blokování interakce receptorů s ligandem

-26 CZ 298277 B6

Rozpustné myší komplexy LT aa byly připraveny stejně jako lidské rozpustné komplexy

LT-α/β, což bylo popsáno výše. Rozpustné myší podjednotky L i -á byly připraveny na základě sekvence již dříve publikované (Lawton a kol., J. Immunol. 154: 239-246. 1995). Rozpustné myší komplexy LT-a/á byly exprimovány pomocí bakuloviru v hmyzím expresním buněčném s systému a komplexy LT-a/á pak byly izolovány afínitní chromatografií na kolonách s lidským p55 TNF-5 a LT á-R v podstatě shodné s tím. jak byly exprimovány a přečištěny lidské komplexy, popsaném výše. Arménští křečkové byli imunizováni přečištěným rozpustným myším komplexem LT-α/β v podstatě stejně jak je popsáno v příkladu 6. Buňky ze sleziny křečků byly fúzovány s myšími hybridomovými buňkami P3X podle publikace Sanchcz-Madrid a kol. io (Mcthods of Enzymology 121: 239244. 1986) Hybridomy byly rozděleny do dvou skupin, antimLT-á nebo anti-mLT-α, podle charakteristik vazby bud s komplexy LT-a/á, nebo se samotnou LT-α. Hybridomové buňky byly pomnoženy a protilátky byly přečištěny ze supematantu pomocí afínitní chromagrafie s proteinem A (Pharmacia).

i? Pro hodnocení toho, zda křečci proti myší monoklonální protilátky LT-α a LT-β mohou blokovat vazbu LT ligandu s mLT-á-R. byly použity buňky TIMM (ATCC), myší T buňky exprimující povrchový LT ligand po aktivaci PMA po 7 hodin. Křcččí monoklonální protilátky anti-mLT-a a anti-mLT-β byly preinkubovány 30 minut sbuňkami ve 4 °C a potom dvakrát opláchnuty. Opláchnuté buňky pak byly inkubovány s 1 pg/ml mLT-p-R-Fc při 4 °C. Po 30 minutách byl opláchnut nenavázaný ηιΤΤ-β-R-Fc a buňky byly inkubovány po 30 minut s 10 pg/ml oslího proti lidského IgG značeného fykoerytrincm. aby se stanovil navázaný ιηΤΤ-β-R-Fc. Množství navázané fluorescenční značky bylo stanoveno pomocí FACS a byla vypočtena průměrná intenzita fluorescence.

Analýzou se zjistilo, žc křcččí monoklonální protilátky anti-mLT-á účinně blokují vazbu rozpustných LT-β receptorů s povrchovými LT ligandy T buněk. Výsledky ukazují tab. 2.

Tabulka 2 Schopnost protimyších monoklonálních protilátek LT β inhibovat vazbu rnLT-β30 R-Fc s myšími povrchovými LT ligandy.

Koncentrace protilátky (pg/ml)	Ant-mLT-á (BB.F6)	Anti-mLT-a (AF.B3)
MFCI*	% inhib”	MFCI*	% inhíb“
0	6	-	6	-
0	85	0	85	0
0,01	71	18	84	2
0,03	67	23	86	0
ca	51	44	86	0
0/3	36	62	84	2
1	29	71	89	0
3	17	86	88	0
10	11	94	95	0
30	10	95	94	0
100	8	98	92	0

nebyl přidán žádný receptor průměrná hodnota fluorescence v kanálu procenta inhibice

-27CZ 29X277 B6

Příklad 8

Agens blokují LT-p-R inhibuje kontaktní přecitlivělost zprostředkovanou Tlil buňkami u myší.

Samice Balb/c myší o hmotnosti 20g (Jackson Laborabories. Bar Harbor, ME) byly senzibilizovány aplikací 25 μΙ 0.5% 2,4-dinitrofluorobenzenu (DFNB) ve směsi acetonu a olivového oleje 4:1 (objem:objem) do chodidly zadní nohy. Za 24 hodin po první senzibilizaci byly myši senzibilizovány opět 25 μΙ téhož roztoku. Senzibil iziace byla provedena bez anestézie. 5. den (tj. io 120 hodin po počáteční senzibilizaci) byla myš podrobena anesterzii i.p. injekcí ketaminu: xylazinu (90:10 mg/kg) a byla jí aplikována podprahová dávka 10 μΙ 0,2% DNFB na dorzální a ventrální povrch levého ucha. Na pravé ucho bylo aplikováno vehikuluni aceton:olivovy olej 4:1 (objem:objem.). Čtyři hodiny po vyprovokování imunitní odpovědi byly myším injektovány i.v. dávky mLT-p-R-Fc v rostoucí koncentraci (0,08 až 5.0 mg/kg, příklad 2) v 0.1 ml fyziologičtí kého roztoku pufrovaného fosfátem (PBS). Injekce samotného PBS nebo 20 mg/kg lidského íúzního proteinu IgCi (LFA3-Fc) sloužily jako negativní kontrola (Miller a kol. J. Exp. Med. 178: 21-222, 1993). Injekce 8 mg/kg monoklonální protilátky specifické pro anti-VLA4 (PS/2, Chisolm a kol.. Eur. J. Intmunl. 23: 682-688, 1993), která je známa tím. že inhibuje CHS blokováním vstupu T buněk do místa provokace, sloužila jako pozitivní kontrola. Pro aplikaci jedné 2o koncentrace protilátky byla použita skupina čtyř až osmi myší.

Dvacet čtyři hodin po provokaci byly myši opět podrobeny anestézii směsí ketamimxylazin a byla měřena tloušťka obou uší technickým mikrometrem s přesností na 0,00254 mm (10⁴ palce). Otok ucha jako odpověď u každé myši byl stanoven jako rozdíl mezi tloušťkou kontes rolního ucha a ucha provokovaného DFNB. Typické ncinhibované odpovědi byly v rozmezí

3,74 až 4,33 x I0’⁴ mm (95 až 100 x 10⁴ palce). Inhibice otoku ucha byla posuzována srovnáním ošetřené skupiny s negativní kontrolní skupinou. Statistická významnost rozdílu mezi skupinami byla hodnocena jednosměrnou analýzou rozptylu, po které následoval počítačový Tukcy-Kramerův test významnosti rozdílu (JMP, SAS institute) pro p<0,05.

Obr. 5 ukazuje, žc podávání rostoucích koncentrací ιηΕΤ-β-R Fc významně redukovalo otékání ucha u myší ošetřených DNFB ve srovnání s neinhibovanými myšmi ošetřenými DNFB (PBS a LFA3-Fc). Rozpustný ΕΤ-β-R (v rozmezí 1 až 5 mg/kg) blokuje kontrolní D111 reakci stejně účinně jako inhibující monoklonální protilátka specifická pro anti-VLAL V části testu nedošlo 35 k inhibici otoku, což bylo způsobeno zřejmé nespecifickou infiltrací granulocytú.

Příklad 9

Model zánětlivé střevní choroby (inflammatorv bowel diseasc, IBD) s roztokem dextransulfátu (DSS)

Myši byly ošetřeny hLFA3-Ig. tak jak je vysvětleno v popisu obrázku, tj. kontrolní Ig fúzních proteinem nebo mLTpR-lg intraperitoneální injekcí. Dne 0 byla pitná voda nahrazena 5% rozto45 kem dextransulfátu (DSS), který byl myším ponechán k pití po dobu jednoho týdne. O týden později tj. dva týdny od počátku podávání DSS, byly myši usmrceny a byla zjištěna změna hmotnosti a změřena délka tlustého střeva (od konečníku po slepé střevo). Obr. 6 ukazuj změny hmotnosti a délky střeva při různých ošetřeních. Ztrácená délka střeva stejně tak jako ztráta hmotnosti ukazují na IBD. Bylo vidět, žc ošetření mLTpR-lg dramaticky zabránilo zkrácení tlustého střeva 50 a ztrátě hmotnosti, což prokazuje účinnost.

Obr. 6 Změny hmotnosti pozorované 14 dní po začátku přidávání DSS do pitné vody při různých ošetřeních. LTBr a LFA3 znamenají fúzní protein mLTpR-lg a I1LFA3 Ig. které byly podány intraperitoneální injekcí v množství 100 ug týden před přidáním DSS, přímo v čase podání DSS

-28CZ 298277 B6 a také o 1 týden později (tj. 3 injekce v týdnu -1,0 a 1). Ve skupině bylo 10 zvířat. Velí znamená vehikulum.

Obr. 7. Délka tlustého střeva 14 dní po začátku přidávání DSS do pitné vody při různých ošetře5 nich stejně jako v obr. 6.

Příklad 10 io 1BD model CD45RB^v>7scid

CD4 pozitivní T buňky byly izolovány ze samic myší C. B-17 pomocí technologie magnetických perliček, jak bylo již popsáno dříve (Powrie. F. a kol., International lmmunology 5: 1461 1471. 1993). CD4 buňky zbavené CD8 pozitivních buněk. B buňky a monocyty byly rozděleny pomocí 15 metody třídění fluorescenčně aktivovaných buněk (FACS) na dvě populace, CD45RB^M,k> a CD45RB^mzk> v podstatě tak. jak jc popsáno výše. 5x10' buněk CD45RB bylo intravenózně injikováno do samic acid myší C.B.-17, a pak byla sledována tělesná hmotnost. Je vidět, žc hmotnost myší rekonstituovaných buněk CD45RB'^ll,k-' přibývala normálně. Naproti tomu zvířata, která obdržela buňky CD45RB^v>Mlky, ztrácela časem hmotnost a po 10 týdnech byla blízká smrti. Když 20 kontrolní myši ztratily přibližně 20 % své počáteční hmotnosti, byly usmrceny a různé orgány byly histologicky vyšetřeny. Typické nemocné zvíře vypadalo kachcktickc, mělo průjem a dramaticky zvětšené tlusté a slepé střevo. Zvířata ošetřená hLFA3-Ig. jak je vysvětleno v popisu obrázku 8, byla podobná neosetreným zvířatům, zatímco zvířata ošetřená mLTpR-lg neměla úbytek hmotnosti, měla normální velikost tlustého střeva a neměla masivní zánět li vý i n filtrát 25 typicky pozorovaný v tlustém střevu. Obr. 8 ukazuje časový průběh hmotnostních ztrát u zvířat s injikovanými buňkami CD45RB'^>sllk> po různých ošetřeních a obr. 9 ukazuje konečnou tělesnou hmotnost 8 týdnů po injekci. Účinek mLTpR-lg ve dvou velmi odlišných modelech 1BD. tj. modelu CD45RB a dextransulfátovém modelu, představuje silný důkaz o opravdovém účinku tohoto ošetření na imunitní systém.

Obr. 8. Časový průběh tělesné hmotnosti po injekci CD4 pozitivních T buněk CD45RB do acid myší. Každá křivka představuje jedno zvíře a popisek ukazuje, jaké buňky byly i nj i kovány, tj. CD45RB'^,>st)kv nebo CD45RB^lll,k\ a povahu ošetření. Zvířatům bylo intraperitoneálně i nj i kováno 100pg proteinu týdně. Ošetřování začalo 2 týdny před injekcí buněk a pokračovalo po 35 celou dobu pokusu.

Obr. 9. Průběh a směrodatná odchylka tělesné hmotností po různých ošetřeních pozorovaná po 10 týdnech po transplantaci (v jedné skupině 5 až 6 zvířat).

Příklad 11

Model přecitlivělosti pozdního typu SRBC

Samice myší balb/c byly senzibilizovány subkutánní injekcí 2x10' opláchnutých ovčích červených krvinek (SRBC) v PBS. Po 5 dnech byly myši provokovány injekcí 1x10° SRBSC v PBS do pravého chodidla (subplantární injekcí). V různých časech po injekci byla kalí perem měřena tloušťka chodidla. Obr. 10 ukazuje velikost otoku chodidla u myší ošetřovaných intrapcritoncální injekcí mLTpR-lg. Ošetření mLTpR-lg buď v okamžiku scnzibilizace. nebo jak při senzibili50 zaci, tak i provokaci, inhibovaly SRBC indukovanou DTH odpověd'.

Obr. 10. Zvětšení tloušťky chodidla měřené 18 hodin po provokační injekci SRBC. Druhy ošetřeni jsou : injekce PBS jako negativní kontrola, protilátka PS/2, která blokuje VLA4 interakce a nasměrování buněk jako pozitivní kontrola, a mLTpR-lg (100 pg v intravenózních injekcích)

-29 ( / 298277 B6 podané buď bezprostředně před senzibilizací subkutánní injekcí SRBO, v okamžiku provokace, anebo v obou těchto časech.

Průmyslová využitelnost

Předkládaný vynález poskytuje farmaceutický přípravek a způsob léčení imunologických onemocnění tak. že užívá látku blokující LT-p-R, a tím inhibujc příslušnou signální dráhu.

Přípravek podle vynálezu bude užitečný pro léčení nebo prevenci diabetů závislého na inzulínu, pro léčení imunologických onemocnění zprostředkovaných lynifocyty, a zejména pro potlačení imunitní odpovědi zprostředkované Th t buňkami, jako je např. zánětlivý střevní syndrom. Přípravky obsahují LT-p-R-Ig nebo jiná agens. blokující interakce LT-p-R $ ligandem. mohou být prospěšné v celé radě dalších imunologických onemocnění.

Claims (32)

1. Použití agens blokujícího LT β-R pro výrobu léčiva pro léčení imunologických onemocni není vybraných ze skupiny sestávající z následujících nemocí: roztroušená skleróza mozkomíšní, sympatická oftalmie, diabetes závislý na inzulínu, uveitída, lupenka, zánčtlivé onemocnění střev, revmatoidní artritida, odvržení tkáně a odvržení orgánu.

2. Použití podle nároku 1, kdy agens blokující ΕΤ-β-R je vybráno ze skupiny sestávající 15 z následujících:

(a) rozpustný receptor lymfotoxinu-β, obsahující funkční sekvenci aminokyselin obsahující sekvenci identifikačního čísla 1, (b) rozpustný ΕΤ-β-R fúzovaný s jednou nebo více heterologními proteinovými doménami, (c) protilátka namířená proti ΕΤ-β reccptoru, a

20 (d) protilátka namířená proti povrchovému LT ligandu.

3. Použití podle nároku 1. kdy agens blokující LT-β-Κ obsahuje rozpustný receptor lymfotoxinu-β, který' obsahuje doménu vázající ligand, která se může selektivně vázat s povrchovým LT ligandem.

4. Použití podle nároku 3. kdy rozpustný receptor lymfotoxinu-β dále obsahuje Fc doménu lidského imunoglobulinu.

5. Použití podle nároku 3. kdy rozpustný ΕΤ-β-R obsahuje extracelulární doménu L Γ-β-R.

6. Použití podle nároku 3. kdy rozpustný L Γ-β-R jc lidský LT β-R.

7. Použití podle nároku 2. kdy heterologní proteinová doména obsahuje Fc doménu lidského imunoglobulinu.

8. Použití podle nároku 2, kdy heterologní proteinová doména je vy brána ze skupiny sestávající ze sérového albuminu, lipoproteinú. apolipoproteinů a transfcrrinu.

9. Použití podle nároku 2, kdy rozpustný receptor lymfotoxinu-β obsahuje doménu vázající ligand, která se může selektivně vázat s povrchovým LT ligandem.

10. Použití podle nároku 2, kdy rozpustný receptor lymfotoxinu-β obsahuje Fc doménu lidského imunoglobulinu.

11. Použití podle nároku 2. kdy rozpustný ΕΤ-β-R obsahuje extracelulární doménu ΕΤ-β-R.

12. Použití podle nároku 2, kdy rozpustný LT-β-Κ je lidský ΕΤ-β-R.

13. Použití podle nároku 1. kdy zánětlivé onemocnění střev je Crohnova nemoc nebo ulcerující kolitida.

14. Použití podle nároku I. kdy agens blokující LT β R obsahuje monoklonální protilátku namířenou proti receptoru ΕΤ-β.

15. Použití podle nároku 14, kdy agens blokující LT β-R obsahuje monoklonální protilátku DBA8 proti lidskému receptoru ΕΤ-β.

16. Použití podle nároku I, kdy agens blokující LT-β R obsahuje monoklonální protilátku namířenou proti povrchovému LT ligandu.

17. Použití podle nároku 16, kdy agens blokující LT-β R obsahuje monoklonální protilátku B9 proti lidskému LT -β.

18. Farmaceutický přípravek pro léčeni imunologických onemocnění vybraných ze skupiny sestávající z následujících nemocí: roztroušená skleróza mozkomíšní. sympatická oftalmie. uveitida. lupenka, zánětlivé onemocnění střev, diabetes závislý na inzulínu, revmatoidní artritida, odvržení tkáně a odvržení orgánu, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství rozpustného LT-β R fúzovaného sjednou nebo více heterologními proteinovými doménami a farmaceuticky přijatelný nosič.

19. Farmaceutický přípravek podle nároku 18. vyznačující se tím. že rozpustný receptor lymfotoxinu-β obsahuje doménu vázající ligand ΕΓ-β-R, která se může selektivně vázat s povrchovým LT ligandem.

20. Farmaceuticky přípravek podle nároku 19, vyznačující sc tím, že rozpustný receptor lymfotoxinu-β dále obsahuje doménu Fc lidského imunoglobulinu.

21. Farmaceutický přípravek podle nároků 18 až 20, v y z π a č u j í c í se tím. že rozpust-

5 ná LΊ-β-Κ obsahuje funkční sekvenci aminokyselin obsahující sekvenci identifikačního čísla 1.

22. Farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 18 až 21. vyznačující se tím, žc hctcrologní proteinová doména je vybrána ze skupiny sestávající ze sérového albuminu. lipoproteinů, apolipoproteinů a transferrinu.

23. Farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 18 až 21, vyznačující se tím, že rozpustný ΕΤ-β-R obsahuje extracelulární doménu LT-β· R.

24. Farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv z nároku 18 až 21, vyznačující se 15 tím, že rozpustný LΤ-β-R jc lidský ΕΤ-β-R.

25. Použití účinného množství rozpustného LT-β R a farmaceuticky účinného nosiče pro výrobu léčiva k léčení revniatoidní artritidy.

20

26. Použití podle nároku 25, kde rozpustný ΕΤ-β-R je fúzován sjednou nebo více heterologními proteinovými doménami.

27. Použití podle nároku 26, kde hcterologní proteinová doména je vybrána ze skupiny sestávající ze sérového albuminu, lipoproteinů, apolipoproteinů a transferrinu.

28. Použití podle nároku 26, kde hctcrologní proteinová doména obsahuje doménu Fc lidského imunoglobulinu.

29. Použití podle nároku 25. kde rozpustný LΤ-β-R obsahuje funkční sekvenci aminokyselin ,w obsahující sekvenci identifikačního čísla I.

30. Použití podle kteréhokoliv z nároků 25 až 29, kdy rozpustný ΕΤ-β-R obsahuje doménu vázající ligand, která se může selektivně vázat s povrchovým LT ligandem obsahujícím alespoň jednu podjednotku 1 T-β.

31. Použití podle kteréhokoliv z nároků 25 až 29, kdy rozpustný ΕΤ-β-R obsahuje extracelulární doménu ΕΤ-β-R.

32. Použití podle kteréhokoliv z nároků 25 až 29. kdy rozpustný ΕΤ-β-R je lidský LT β-R.