SK286409B6 - Použitie činidla blokujúceho lymfotoxín-beta receptor (LT-beta -R) na prípravu farmaceutickej kompozície na liečenie imunologických chorôb - Google Patents

Abstract

Je opísané použitie činidla blokujúceho lymfotoxín-beta receptor (LT-beta-R) na prípravu farmaceutickej kompozície na liečenie imunologických chorôb vybraných zo skupiny sklerózy multiplex, sympatickej oftalmie, uveitídy, psoriázy, zápalového ochorenia čriev, reumatoidnej artritídy, odmietnutia tkaniva a odmietnutia orgánu u živočícha.

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka prípravkov obsahujúcich „agens blokujúci receptor lymfotoxínu-β“, ktorý blokuje signálnu dráhu lymfotoxínu-β. Agens blokujúci receptor lymfotoxínu-β je užitočný na liečenie imunologických ochorení sprostredkovaných lymfocytmi, hlavne na potlačenie imunitnej odpovede sprostredkovanej Thl bunkami. Vynález sa týka rozpustných foriem extracelulámych domén receptora lymfotoxínu-β, ktoré pôsobia ako agens blokujúci receptory lymfotoxínu-β. Vynález sa ďalej týka použitia protilátok namierených proti receptorom lymfotoxínu-β alebo ich ligandom, povrchovým lymfotoxínom, ktoré pôsobia ako agens blokujúci receptory lymfotoxínu-β (LT-β). Vynález poskytuje nový spôsob na vyhľadávanie rozpustných receptorov, protilátok a ďalších činidiel, ktorc blokujú LT-β receptorovú signálnu dráhu.

Doterajší stav techniky

Spektrum cytokínov, ktoré sa začnú uvoľňovať po spustení imunitnej odpovede, ovplyvní výber imunologických efektorových dráh, ktoré budú aktivované. Výber medzi imunitnými efektorovými mechanizmami je sprostredkovaný CD4-pozitívnymi pomocnými T lymfocytmi (Th bunkami). Th bunky interagujú s bunkami prezentujúcimi antigén (APC), ktoré vystavujú na svojom povrchu peptidové fragmenty alebo spracovaný cudzorodý antigén v spojení s molekulami MHC II. triedy. Bunky sú aktivované, keď rozpoznajú určité epitopy alebo cudzí antigén na vhodnom povrchu APC, pre ktorý Th bunky exprimujú špecifický receptor. Aktivované Th naopak vylučujú cytokíny (lymfokiny), ktoré aktivujú príslušný imunitný efektorový mechanizmus.

Th bunky môžu aktivovať rôzne efektorové mechanizmy, ktoré zahrnujú aktiváciu zabíjačských T buniek, vytváranie protilátok B bunkami alebo aktiváciu makrofágov. Výber efektorového mechanizmu je sprostredkovaný do veľkej miery tým, aké cytokíny sú produkované aktivovanými Th bunkami.

Bunky sa delia do troch podskupín podľa toho, aké cytokíny vylučujú (Fitch a kol., Ann. Rev. Imunol. 11: 29-48, 1983). Tieto podskupiny nazývame ThO, Thl a Th2. Napríklad pri myši nestimulované „naivné,, pomocné T bunky produkujú IL-2. Krátkodobá stimulácia vedie k premene na ThO prekurzorovú bunku, ktorá produkuje rad cytokínov vrátane IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-5 a IL-10. Trvalo stimulované ThO sa môžu diferencovať buď na Thl,alebo Th2 bunky, v závislosti od zmeny typu exprimovaných cytokínov.

Niektoré cytokíny sú uvoľňované Thl aj Th2 bunkami (napríklad IL-3, GM-CSF a TNF). Iné cytokíny sú vytvárané výlučne jednou podskupinou Th buniek. Špecializovaný vplyv pomocných T buniek bol prvýkrát rozpoznaný pri myšiach. Podobné delenie pomocných T buniek existuje aj u človeka (Romagnani a kol., Ann. Rev. Immunol. 12: 227-257, 1994).

Thl bunky produkujú LTa, IL-2 a IFN-γ. Profil sekrécie cytokínov zodpovedajúcich Thl bunkám je u človeka všeobecne spájaný s bunkovou imunitou a odolnosťou proti infekcii. Cytokíny Thl buniek prispievajú k aktivácii makrofágov a k určitému typu zápalovej reakcie, ako je napríklad precitlivelosť IV. typu, takzvaná neskorá precitlivelosť. Cytokíny typu Thl majú dôležitú úlohu v bunkovej odpovedi na tkanivový štep, a to odhojenie štepu alebo orgánového transplantátu.

Th2 bunky produkujú cytokíny IL-5, IL-5, IL-6 a IL-10. Cytokíny Th2 buniek zvyšujú produkciu eozinofilov a žírnych buniek (Howard a kol., T-cell derived cytokines and their receptors, íundamental Immunology, 3^rd ed., Raven press, New York, 1993). Cytokíny Th2 buniek zvyšujú tiež produkciu protilátok vrátane protilátok IgE, ktoré sú spojené s alergickou odpoveďou a s protilátkami proti štepu. Th2 bunky sa podieľajú na imunosupresii a tolerancii k perzistentnému antigénu.

Cytokíny spojené s Thl a Th2 bunkami zohrávajú úlohu pri určitých typoch precitlivelosti (hypersenzitivity), čo je neprimeraná imunitná odpoveď vyvolaná opakovaným kontaktom s už skôr rozpoznaným antigénom. Existujú štyri typy precitlivelosti (Roitt a kol., Immunology, ss. 19.1-22.12, Mosby-Year Book Európe Ltd., 3^ľd ed., 1993).

Precitlivelosť II. a III. typuje spôsobená protilátkami IgG a IgM namierenými proti bunkovému povrchu alebo špecifickým tkanivovým antigénom (II. typ), alebo rozpustným sérovým antigénom (III. typ). Predpokladá sa, že tieto typy precitlivelosti nezahrnujú Th bunky.

Precitlivelosť IV. typu, takzvaná „neskorá precitlivelosť“ (DTH), je sprostredkovaná Thl bunkami. Reakcia DTH sa vyvíja viac ako 12 hodín a opisuje sa ako reakcia „sprostredkovaná bunkami“, lebo môže byť medzi pokusnými myšami prenesená Thl bunkami, ale nie samotným sérom. Odpoveď IV. typu, teda DTH, sa rozdeľuje na tri podtypy: kontaktnú, tuberkulínovú a granulomatóznu precitlivelosť.

Bunkami sprostredkované reakcie spôsobujúce chorobu sú pri zdravých myšiach indukovateľné tým, že sa do nich prenesú lymfocyty z chorých myší (napr. diabetes závislý od inzulínu, experimentálna autoimunitná eneefalitída). Touto vlastnosťou sa odlišuje DTH IV. typu od precitlivelosti iných typov, ktoré predstavujú humorálnu imunitnú odpoveď sprostredkovanú primáme protilátkami, sú teda prenosné bezbunkovým sérom.

Pomocné T bunky sa tiež podieľajú na regulácii zmeny izotypov imunoglobulínov de novo. Odlišné subpopulácie Th buniek ovplyvňujú pomerné zastúpenie izotypov imunoglobulínov produkovaných ako odpoveď na imunitnú provokáciu (kontakt s antigénom). Tak napríklad cytokín IL-4 buniek Th2 môže zmeniť aktivované B bunky na izotyp IgGl a potlačiť iné izotypy. IL-4 tiež aktivuje nadprodukciu IgE pri precitlivelosti I. typu. Cytokín IL-5 buniek Th2 indukuje izotyp IgA. Vplyv tohto cytokínu na zmeny izotypov je udržovaný v rovnováhe IFN-γ, ktorý je produkovaný Thl bunkami.

Zdá sa, že rozdielne profily cytokínov secemovaných Thl a Th2 bunkami smerujú odpoveď k rôznym imunitným efektorovým mechanizmom. Citlivosť zmeny, ktorá aktivuje buď bunkové, alebo humorálne efektorové mechanizmy, je daná krížovou supresiou medzi Thl a Th2 bunkami. IFN-γ produkovaný Thl bunkami inhibuje proliferáciu Th2 buniek a IL-10 secemovaný Th2 bunkami redukuje sekréciu cytokínov Thl buniek.

Negatívne regulačné obvody Thl a Th2 buniek tak môžu znásobiť, v závislosti od relatívnej afinity cytokinov k ich cieľovým molekulám, vplyv malých rozdielov v koncentrácii cytokínov Thl a Th2 buniek. Zosilnený cytokínový signál Thl alebo Th2 buniek môže zmeniť bunkový alebo humorálny efektorový mechanizmus, čo závisí od malých zmien v relatívnych koncentráciách cytokínov Thl alebo Th2 typu. Schopnosť riadiť takúto zmenu tým, že sa modulujú koncentrácie cytokínov Thl alebo Th2 typu, je užitočná na ovplyvňovanie nerovnováhy medzi rôznymi druhmi imunitných odpovedi sprostredkovaných Thl a Th2 bunkami, ktorá je príčinou imunologických porúch a chorôb.

Patologické reakcie Thl buniek sú spojené s mnohými orgánovo špecifickými a systémovými autoimunitnými stavmi, ako sú napríklad chronické zápalové ochorenia a neskorá precitlivelosť. Reakcia typu Thl prispieva tiež k bunkovej imunite, ktorá spôsobuje odhojenie štepu alebo orgánového transplantátu.

Ošetrovanie rôznych imunologických stavov podmienených Thl bunkami je založené na požití imunomodulačných a imunosupresívnych prípravkov a mnohých ďalších látok, pri ktorých je veľmi málo známe o mechanizme účinku (napr. zlato alebo penicilamín). Tri v súčasnosti najpoužívanejšie imunosupresíva sú steroidy, cyklosporín a azatioprín.

Steroidy sú pleiotropné protizápalové látky, ktoré potlačujú aktivované makrofágy a inhibujú aktivitu buniek prezentujúcich antigén, a to takým spôsobom, že rušia či otáčajú účinok IFN-γ, cytokínu Thl buniek. Cyklosporín, účinný imunosupresívny prípravok, potláča produkciu cytokínov a znižuje expresiu receptorov pre IL-2 v lymfocytoch pri ich aktivácii. Azatioprín je prípravok s antiprolíferačným účinkom, ktorý inhibuje syntézu DNA. Tieto nešpecifické imunosupresíva sú väčšinou podávané vo veľkých dávkach, čo zvyšuje ich toxicitu (napr. nefro- a hepatotoxicitu) a spôsobuje mnohé vedľajšie účinky, preto nie sú vhodné na dlhodobé liečenie.

Aby sa odstránili problémy spôsobované liečbou bežnými nešpecifickými imunosupresívami, súčasné liečebné stratégie smerujú k potlačeniu alebo aktivácii selektívnych stránok imunitného systému. Mimoriadne príťažlivým cieľom je ovplyvniť rovnováhu medzi cytokínmi Thl a Th2 typu a tým ovplyvniť rovnováhu medzi bunkovým a humorálnym imunitným mechanizmom.

Na to, aby nastal posun medzi bunkovým a humorálnym imunitným mechanizmom, by bolo dobré mať možnosť modulovať aktivitu tých molekúl, ktoré môžu zmeniť relatívnu aktivitu jednotlivých podtried Thl a Th2 buniek. Medzi kandidátov takýchto molekúl patria cytokíny a ich receptory. Súčasné poznatky predpokladajú, že ĽT-ct, IL-2, IFN-α a IFN-γ podporujú rozvoj odpovede Thl typu, zatiaľ čo IL-1 a IL-2 vedú k odpovedi Th2 efektorového mechanizmu (Romagnani a kol., Ann. Rev. Imunol. 12: 225-257,1994).

Mnohé z cytokínov Th buniek sú pleiotropnými regulátormi imunitného systému. Zastavenie ich produkcie by preto mohlo mať škodlivý vplyv na imunitnú odpoveď, ktorá nie je bezprostredne závislá od T buniek. Požadované a účinné ciele na selektívne modulovanie výberu medzi efektorovými mechanizmami Thl alebo Th2 neboli doteraz identifikované.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález poskytuje farmaceutický prípravok a spôsob liečenia imunologických ochorení tak, že používa látku blokujúcu receptory lymfotoxínu-β (ΕΤ-β-R), a tým inhibuje signálnu dráhu receptorov lymfotoxínu-β. Prípravky a spôsoby obsahujúce látku blokujúcu ΕΤ-β-R sú zvlášť vhodné na inhibíciu imunitnej odpovede sprostredkovanej Thl bunkami, ako je napríklad zápalový črevný syndróm.

Jedno uskutočnenie vynálezu poskytuje rozpustnú formu extracelulámej domény receptora lymfotoxínu-β, ktorá pôsobí ako látka blokujúca LT-fl-R. Prípravok a spôsob podľa vynálezu výhodne obsahujú rekombinantný fuzny proteín receptora lymfotoxínu-β, ktorý má extracelulámu doménu LT-fl-R viažucu ligand fuzovanú s konštantnou doménou ťažkého reťazca imunoglobulínu. Výhodne je extraceluláma doména LT-fl-R viažuca ligand fuzovaná s Fc doménou ľudského IgG.

Iné uskutočnenie vynálezu poskytuje protilátky, ktoré pôsobia ako agens blokujúci ΕΤ-β-R. V tomto uskutočnení prostriedok a spôsob obsahujú jednu alebo viac protilátok namierených proti receptorom lymfo toxínu-β. Výhodnejšie protilátky sú monoklonálne protilátky. Ďalší výhodný prípravok a spôsob v tomto uskutočnení obsahuje jednu alebo viac protilátok namierených proti povrchovému lymfotoxínu. Výhodne je protilátka monoklonálna protilátka proti lymfotoxínu-β.

Vynález ďalej poskytuje nový spôsob testovania na výber agens blokujúcich LT-fi-R, ako sú napr. rozpustné formy LT-p-R, anti-LT protilátky a anti-LT-p-R protilátky. Tento nový spôsob testovania spočíva v uskutočnení testu cytotoxicity s nádorovými bunkami, ktorý monitoruje signálnu dráhu LT-fi-R. Test využíva zvýšenú citlivosť ľudských adenokarcinómových buniek na signály signálnej dráhy ΤΤ-β-R indukované ligandmi alebo protilátkami v prítomnosti agens aktivujúceho ΤΤ-β-R (napr. LT-αΙ/β).

Agens blokujúci ΤΤ-β-R inhibuje cytotoxický účinok heteromérnych komplexov LT-ocl/β (alebo iných látok aktivujúcich LT-P-R) v nádorových bunkách. Spôsob testovania agensu pravdepodobne inhibujúceho ΤΤ-β-Rje ukázaný na príklade anti-LT-P-R protilátok (v prítomnosti LT-α/β, agensu aktivujúceho LT-p-R) a pozostáva z nasledujúcich krokov:

(1) Nádorové bunky (napr. ľudské adenokarcinómové bunky HT29) sa kultivujú niekoľko dní v médiu, ktoré obsahuje IFN-γ a čistý komplex LT-αΙ/β a ďalej obsahuje alebo neobsahuje testovaný agens, napr. protilátku anti-LT-P-R.

(2) Bunky sa opracujú farbivom, ktoré farbí len živé bunky.

(3) Kvantifikuje sa počet zafarbených buniek, aby sa stanovila frakcia nádorových buniek odumretých v prítomnosti LT-ocl/p2, IFN-γ a testovanej protilátky v každej vzorke.

Počet prežívajúcich buniek môže byť stanovený ktorýmkoľvek z niekoľkých známych spôsobov merania životaschopnosti buniek, ako je napr. rýchlosť inkorporácie ³H-tymidínu do DNA. Protilátku anti-LT-P-R (alebo kombinácie protilátok), ktorá znižuje percento odumretých buniek v tomto teste najmenej o 20 %, je možné považovať za agens blokujúci LT-p-R v zmysle tohto vynálezu.

Tento cytolytický test sa dá vykonávať s LT-α/ρ heteromérovými komplexmi alebo inými agensmi aktivujúcimi LT-P-R a to buď samotnými, alebo kombináciami viacerých takých agensov. Test sa tiež môže upraviť podľa požiadaviek na identifikáciu nových agensov blokujúcich LT-P-R.

Aby bolo možné úplne porozumieť vynálezu, ďalej je uvedený podrobný opis vynálezu.

Termín „cytokín“ v tomto texte znamená molekulu, ktorá sprostredkúva interakciu medzi bunkami. „Lymfokín“ je cytokín uvoľňovaný lymfocytmi.

Termín „pomocná T bunka (Th bunka)“ označuje funkčnú podtriedu T buniek, ktoré pomáhajú generovať cytotoxické T bunky a ktoré spolupracujú s B bunkami a stimulujú tak tvorbu protilátok. Pomocné T bunky rozpoznávajú antigén spolu s molekulami MHCII. triedy.

Termín „Thl“ sa týka podtriedy pomocných T buniek, ktoré produkujú LT-α, interferón-γ a IL-2 (a ďalšie cytokíny) a ktoré vyvolávajú zápalovú reakciu spolu s bunkovou (t. j. bez účasti imunoglobulínov) imunitnou odpoveďou.

Termín „Th2“ označuje podtriedu pomocných T buniek, ktoré produkujú cytokíny vrátane IL-4, IL-5, IL-6 a IL-10 a ktoré sú spojené s imunoglobulínovou, t. j. humorálnou imunitnou odpoveďou.

Termín „bunková“ alebo „bunkami sprostredkovaná“ sa vzťahuje k takým imunologickým javom, kde výsledná imunitná odpoveď je výsledkom priameho vplyvu T buniek a ich produktov. Tento typ odpovede je všeobecne (ale nie výhradne) spojený s Thl podtriedou T buniek. Do tejto kategórie nepatrí vplyv pomocných T buniek na diferenciáciu a expanziu B buniek, lebo tieto aktivity sú obyčajne spájané s Th2 podtriedou T buniek.

Termín „precitlivelosť neskorého typu (delayed type hypersensitivity, DTH)“ označuje imunitnú odpoveď, ktorá je charakterizovaná pomalou odpoveďou na antigén a pri ktorej dochádza k plnému prejavu po 1 až 3 dňoch. Pomalá odpoveď kontrastuje s pomerne rýchlou odpoveďou pri humorálnej, imunoglobulínmi sprostredkovanej, alergickej reakcii. Existujú tri typy DTII: kontaktná precitlivelosť, precitlivelosť tuberkulínového typu a granulomatózna reakcia.

Termín „humorálna odpoveď“ alebo „imunoglobulínová odpoveď“ sa týka imunitnej odpovede zvieraťa na cudzorodý antigén, pri ktorej zviera produkuje protilátky namierené proti cudzorodému antigénu. Na účinnú produkciu vysokoafinitných protilátok je nevyhnutná Th2 podtrieda pomocných T buniek.

Termín „Fc doména“ protilátky označuje časť molekuly obsahujúcu ohybnú oblasť, doménu CH2 a CH3, ale neobsahuje miesto viažuce antigén. Termín sa tiež používa na označenie zodpovedajúcej oblasti IgM alebo protilátky iného izotypu.

Termín „protilátka anti-LT-fi-receptor“ opisuje akúkoľvek protilátku, ktorá sa špecificky viaže na aspoň jeden epitop na receptore LT-β.

Termín „protilátka anti-LT“ opisuje akúkoľvek protilátku, ktorá sa špecificky viaže na aspoň jeden epitop na LT-a, LT-β alebo komplexe LT-α/β.

Termín „signálna dráha ΕΤ-β-R označuje molekulárne reakcie spojené s celou metabolickou cestou LT-β-R a následné molekulárne reakcie, ktoré k nej vedú.

Termín „agens blokujúci LT-P-R“ označuje taký agens, ktorý zoslabí väzbu ligandu na LT-p-R, zhlukovanie LT-P-R na bunkovom povrchu alebo signálnu dráhu LT-P-R, alebo ktorý spôsobí zmenu v tom, ako je signál LT-P-R dráhy interpretovaný v bunke. Agens blokujúci LT-P-R, ktorý pôsobí v kroku väzby ligand-receptor, inhibuje väzbu LT ligandu na ίΤ-β-R aspoň o 20 %. Agens blokujúci LT-P-R, ktorý pôsobí až po tomto kroku, inhibuje cytotoxický účinok aktivácie LT-P-R na nádorové bunky najmenej o 20 %. Príklady agensu blokujúceho LT-P-R zahrnujú rozpustné molekuly LT-P-R-Fc a protilátky anti-LT-α, anti-LT-p, anti-LT-α/ρ a anti-LT-P-R. Výhodne protilátky nereagujú krížovo so sekrečnou formou LT-a.

Termín „biologická aktivita LT-P-R“ znamená (1) schopnosť molekuly LT-P-R alebo jej derivátov súťažiť o rozpustný alebo povrchový LT ligand viažuci sa na rozpustnú alebo povrchovú molekulu LT-P-R, alebo (2) schopnosť stimulovať regulačnú imunitnú odpoveď alebo všeobecne cytotoxickú aktivitu natívnou molekulou LT-P-R.

Termíny „heteromémy komplex LT-α/β“ a „LT heteromémy komplex“ opisujú stabilné spojenie aspoň jednej podjednotky LT-α a jednej alebo viacerých podjednotiek LT-β, vrátane rozpustných, mutovaných, zmenených a chimérických foriem jednej alebo viacerých podjednotiek. Podjednotky sa môžu spájať elektrostatickými, van der Waalsovými alebo kovalentnými interakciami. Heteromerický komplex LT-α/ρ má výhodné dve priľahlé podjednotky LT-β a chýbajú mu priľahlé podjednotky LT-α. Keď heteromémy komplex LT-a/p slúži ako aktivujúci agens LT-P-R v teste bunkového rastu, je komplex výhodne rozpustný a má stechiometriu ΤΤ-α1/β2. Rozpustné heteroméme komplexy LT-α/β nemajú transmembránovú doménu a môžu byť secemované vhodnou hostiteľskou bunkou, ktorá bola upravená metódami génového inžinierstva tak, aby exprimovala podjednotky LT-α a/alebo LT-β (Crowe a kol., J. Immunol. Methods 168: 79-89,1994).

Termín „LT ligand“ znamená LT heteromémy komplex alebo jeho derivát, ktorý sa špecificky viaže na receptor LT-β.

Termín „doména LT-p-R viažuca ligand“ opisuje časť alebo časti LT-p-R, ktoré sa zúčastňujú špecifického rozpoznania a interakcie s LT ligandom.

Termíny „povrchový LT-α/β komplex“ a „povrchový LT komplex“ označujú komplex, zložený z podjednotky LT-α a podjednotky LT-β naviazanej na membránu, vrátane mutantných, pozmenených a chimérických foriem jednej alebo viacerých podjednotiek, a ktorý je prezentovaný na povrchu bunky. „Povrchový LT ligand“ znamená povrchový LT komplex alebo jeho derivát, ktorý sa špecificky viaže na receptor LT-β.

Termín „subjekt“ tu znamená zviera alebo jednu či viac buniek pochádzajúcich zo zvieraťa. Výhodne je zviera cicavcom. Bunky sú v akejkoľvek forme, vrátane, ale nie výhradne, buniek obsiahnutých v tkanive, zhlukov buniek, imortalizovaných, transfekovaných alebo transformovaných buniek, a tiež buniek pochádzajúcich zo zvieraťa, ktoré bolo fyzikálne alebo fenotypovo zmenené.

Lymfotoxín-β: člen rodiny TNF

Cytokíny príbuzné s nádorovým nekrotíckým faktorom (tumor necrosis factor, TNF) sa objavili ako veľká rodina pleiotropných mediátorov zúčastňujúcich sa imunitnej regulácie a hostiteľskej obranyschopnosti. Členovia tejto rodiny sa vyskytujú vo forme viazanej na membránu, ktorá lokálne pôsobí prostredníctvom priameho medzibunkového kontaktu, alebo vo forme sekrečného proteínu, ktorý pôsobí na vzdialené ciele. Rodina receptorov príbuzných TNF reaguje s týmito cytokínmi a spúšťa tak rôzne metabolické dráhy vrátane bunkovej smrti, proliferácie, diferenciácie tkanív a zápalovej reakcie.

TNF, lymfotoxín-α (LT-α, zvaný tiež TNF-β) a lymfotoxín-β (LT-β) sú členmi rodiny TNF ligandov, ktorá zahrnuje tiež ligandy receptorov Fas, CD27, CD30, CD40, OX-40 a 4-1BB (Smith a kol., Celí 76: 959-962, 1994). Signálne dráhy niektorých členov TNF rodiny, vrátane TNF, LT-a, LT-β a Fas, môžu indukovať odumieranie nádorových buniek tým, že spôsobia nekrózu alebo apoptózu (programovanú bunkovú smrť). TNF a mnoho ďalších interakcií ligand-receptor rodiny TNF ovplyvňuje vývoj imunitného systému a imunitnú odpoveď na rôzne antigény v netumorogénnych bunkách.

Väčšina ligandov rodiny TNF sa nachádza v podobe viazanej na membránu buniek. TNF a LT-α existujú u človeka tak v sekrečnej, ako aj povrchovej, na membránu viazanej forme. Povrchový TNF má transmembránovú oblasť, ktorá je proteolyticky štiepená za vzniku sekrečnej formy. Naopak, LT-α transmembránový úsek vôbec nemá. Forma LT-α asociovaná s membránou je naviazaná na bunkový povrch ako heteromérový komplex s LT-β, príbuzným transmembránovým polypeptidom, a tvorí tak komplex LT-α/β.

Väčšina komplexov LT-α/β asociovaných s membránou (povrchových LT) má stechiometriu LT-ccl/p2 (Browning a kol., Celí 72: 847-856, 1992, Browning a kol., J. Immunol. 154: 33-46, 1995). Povrchové LT ligandy sa neviažu na TNF-R s vysokou aktivitou a neaktivujú signálnu dráhu TNF-R. Iný receptor príbuzný TNF, zvaný LT-β receptor (LT-P-R), viaže tieto povrchové lymfotoxínové komplexy s vysokou aktivitou (Crowe a kol., Science 264: 707-710, 1994).

Aktivácia signálnej dráhy LT-P-R, podobne ako signálnej dráhy TNF-R, má antiproliferačný účinok a môže mať cytotoxický účinok na nádorové bunky. V už podanej patentovej prihláške autorov predkladaného vynálezu (poradové číslo v USA 08/378,968) sú opísané prípravky a spôsoby na selektívnu stimuláciu LT-β-R s použitím agens aktivujúcich ΕΤ-β-R. Agens aktivujúci LT-β-Κ je užitočný na inhibíciu rastu nádorových buniek bez toho, aby súčasne spôsoboval aktiváciu zápalovej reakcie alebo imunoregulačnej dráhy indukovanej TNF-R.

TNF a cytokíny príbuzné TNF sú v nenádorových bunkách aktívne pri rôznych typoch imunitnej odpovede. Tak ligandy TNF, ako aj LT-α sa viažu na aktivovaný receptor TNF (p55 alebo p60 a p75 alebo p80, tu nazývaný TNF-R). TNF a LT-α sú produkované makrofágmi pri skorej imunitnej odpovedi alebo rýchlej imunitnej reakcii na mikrobiálnu infekciu, čo zvyšuje baktericídnu aktivitu makrofágov a neutrofilov. TNF a LT-α produkované makrofágmi alebo cytotoxickými T lymfocytmi (zabíjačskými T bunkami, CTL) sa viažu na receptory TNF na povrchu cieľových buniek a spúšťajú mechanizmus vedúci k usmrteniu citlivých buniek.

TNF a cytokíny príbuzné TNF tiež iniciujú zápalovú kaskádu ako odpoveď na stres alebo infekciu. Uvoľnenie TNF, LT-α alebo LT-γ mení adhézne vlastnosti medzi bunkami cievneho endotelu a určitými typmi lymfocytov. Zvýšená adhézia uľahčuje migráciu fagocytov a leukocytov z krvného riečiska do tkanív obklopujúcich miesto zápalu. Podobná zápalová reakcia má hlavnú úlohu v odhojovaní tkanivového štepu alebo orgánového transplantátu, a tiež v niektorých imunologických poruchách.

Komplexy povrchových lymfotoxínov (LT) boli charakterizované v hybridómových T bunkách CD4+ (11-23,D7), ktoré exprimujú vysokú hladinu LT (Browning a kol., J. Immunol. 147: 1230-1237, 1991, Androlewicz a kol., J. Biol. Chem. 267: 2542-2547, 1992). Expresia a biologická funkcia ΕΤ-β-R, podjednotiek LT a povrchových LT komplexov sú opísané v prehľade Warw, C.F.: The ligands and receptors of the lymphotoxin systém. In: Pathways for Cytolysis. Current Topics Microbiol. Immuno. Springer-Verlag, s 175-218, 1995).

Expresia LT-α je indukovaná a LT-α je primárne secemovaný aktivovanými T a B lymfocytmi a zabíjačskými (NK, „natural killer,,) bunkami. V rámci pomocných T buniek je LT-α produkovaný podskupinou Thl, ale nie podskupinou Th2. LT-α bol tiež nájdený v melanocytoch. Mikroglie a T bunky v léziách u pacientov s roztrúsenou mozgovo-miechovou sklerózou reagujú pozitívne s antisérom anti-LT-a.

Lymfotoxín-β (tiež zvaný p33) bol nájdený na povrchu T lymfocytov, línií T buniek, línií B buniek a zabíjačských buniek aktivovaných lymfokínom (LAK). LT-β je predmetom už podaných patentových prihlášok tých istých autorov ako predkladaný vynález PCT/US91/04588, publikovaný 9. januára 1992 ako dokument WO 92/00329, a PCT/US93T1669, publikovaný 23. júna 1994 ako WO 94/13808, na ktoré sa tu odvoláva.

Povrchové LT komplexy sú exprimované primáme aktivovanými T a B lymfocytmi a zabíjačskými bunkami, ako sa dá ukázať analýzou pomocou FACS alebo imunohistologickou analýzou s použitím protilátok anti-LT-α alebo rozpustných fúznych proteínov ΕΤ-β-R-Fc. Povrchové LT boli tiež nájdené na klonoch ľudských cytotoxických T lymfocytov (CTL), v aktivovaných periférnych mononukleámych lymfocytoch (PML), periférnych B lymfocytoch aktivovaných buď mitogénom z líčidla amerického (Phytolacca americana), alebo anti-CD40 (PBL), a rôznych T a B buniek pochádzajúcich z lymfoidných nádorov. Zapojenie cieľových buniek nesúcich aloantigén špecificky indukuje expresiu povrchových LT pri klonoch CD4+ a CD8+ CTL.

Receptor LT-β, člen rodiny receptorov TNF, špecificky viaže povrchové LT ligandy. υΓ-β-R viaže heteroméme LT komplexy (najmä ΕΤ-α1/β2 a LT-aŽ/βΙ), ale neviaže ani TNF, ani LT-α (Crowe a kol., Science 264: 707-710, 1994). Signálna dráha ΕΤ-β-R zohráva dôležitú úlohu vo vývoji periférnych lymfoidných orgánov a v humorálnej imunitnej odpovedi.

Výskum expresie ΕΤ-β-R je zatiaľ v počiatočnej fáze. mRNA pre ΕΤ-β-R bola nájdená v ľudskej slezine, týmuse a ďalších hlavných orgánoch. Profil expresie ΕΤ-β-R je podobný profilu p55-TNF-R, ale ΕΤ-β-R chýba na T bunkách periférnej krvi a na líniách T buniek.

Produkcia rozpustných LT komplexov

Rozpustné heteroméme komplexy LT-a/á obsahujú podjednotky LT-á, ktoré boli zmenené z pôvodných, viazaných na membránu, na rozpustné. Tieto komplexy sú podrobne opísané v už podanej medzinárodnej prihláške autorov predkladaného vynálezu (PCT/US93/11669, publikované 23. júna 1994 ako WO 94/13808). Rozpustné peptidy LT-á sú definované sekvenciou aminokyselín lymfotoxínu-á, ktorého sekvencia je štiepená kdekoľvek medzi koncom transmembránového úseku (t. j. 44. aminokyselina) a prvým úsekom homologickým s TNF (t. j. 88. aminokyselina), a kde číslovanie aminokyselín zodpovedá opisu podľa Browninga a kol. (Celí 72: 847-856, 1993).

Rozpustné polypeptidy LT-á vznikajú odštiepením N-konca z LT-á, čím sa oddelí cytoplazmový a transmembránový úsek (Crowe a kol., Science 264: 707-710, 1994). Iným spôsobom sa môže transmembránová doména inaktivovať deléciou alebo substitúciou hydrofóbnej aminokyseliny hydrofilnou. V oboch prípadoch tak vznikne v podstate hydrofilný hydropatický profil, ktorý zníži afinitu k lipidom a zlepšuje rozpustnosť vo vode. Delécia transmembránovej domény je výhodnejšia ako substitúcia, lebo sa tak zabráni vzniku nových potenciálne imunogénnych epitopov.

Deletovaná alebo inaktivovaná transmembránová doména sa môže nahradiť alebo pripojiť k vedúcej sekvencii I. typu (napr. vedúca sekvencia VCAM-1) tak, že sekvencia secemovaného proteínu začína kdekoľvek medzi aminokyselinami val40 a pro88. Rozpustné polypeptidy LT-á môžu na svojom N-konci obsahovať niekoľko z množstva známych zavádzajúcich sekvencií. Takéto sekvencie zaistia, že peptid je exprimovaný a zacielený do sekrečnej metabolickej dráhy v eukaryotickom systéme (pozri napr. Emst a kol., US patent č. 5,082,783, 1992).

Heteroméme komplexy LT-a/á môžu vznikať kotransfekciou vhodnej hostiteľskej bunky DNA, ktorá kóduje LT-α a rozpustný LT-á (Crowe a kol., J. Immunol. Methods 168: 78-89, 1994). Rozpustný LT-á, secernovaný v neprítomnosti LT-α, je vysoko oligomerizovaný. Ak je však koexprimovaný s LT-α, vytvára sa triméru podobná štruktúra s veľkosťou 70 kD, ktorá obsahuje obidva proteíny. Heteroméme komplexy LT-al/á2 môžu vznikať tak, že sa bunková línia exprimujúca len LT-α (napr. RPMI 1788) transfekuje génom kódujúcim rozpustný polypeptid LT-á.

Polypeptidy LT-α a LT-á sa môžu syntetizovať oddelene, denaturovať pomocou slabého detergentu, zmiešať a potom spoločne renaturovať odstránením detergentu, a tak vniknú heteroméme komplexy, ktoré možno ďalej separovať.

Purifikácia komplexov LT-al/á2

Rozpustné heteroméme komplexy LT-al/á2 sa chromatograficky oddelia od koexprimovaných komplexov obsahujúcich podjednotky v inej stechiometrii. Pri chromatografii sa ako afinitný purifikačný reagent použijú receptory TNF a LT-á. Receptor LT-á viaže s vysokou afinitou jedine útvary á/á, s nízkou afinitou viaže útvary α/á alebo heteroméme komplexy LT-a/á. Teda LT-cc3 a LT-a2/ál sa vyviažu na TNF-R. LT-á-R môže viazať tiež triméry LT-a2/ál (prostredníctvom α/á miesta), ale nemôže viazať LT-a3. Navyše LT-á-R (ale nie TNF-R) viaže LT-al/á2 a LT-á(n) (presné zloženie týchto preparátov nie je známe, ale vytvárajú veľké agregáty).

Receptorový afinitný reagent sa dá pripraviť buď vo forme rozpustnej extracelulámej domény (pozri napr. Loetscher a kol., J. Biol. Chem. 266: 18324-18329, 1991), alebo vo forme chimérických proteínov s Fc doménou imunoglobulínu (pozri Loetscher a kol., J. Biol. Chem. 266: 18324-18329, 1991, Crowe a kol., Science 264: 707-710, 1994). Receptory sa naviažu k afinitnej matrici chemickým zosietením použitím bežných postupov.

Existujú dve cesty, ktorými sa môžu ligandy LT-al/á2 purifikovať pomocou receptorov a imunoafmitnej chromatografie. Podľa prvého postupu sa supematant zo systému, ktorý koexprimuje tak LT-α, ako aj skrátenú LT-á formu, prečistí na kolóne s TNF-R, pričom TNF-R naviaže LT-a3 a triméry LT-a2/ál. V eluáte, ktorý vytečie z kolóny, budú obsiahnuté LT-á(n) a LT-al/á2.

Podľa druhého postupu sú všetky formy obsahujúce LT-á (t. j. LT-á(n), LT-al/á2 a LT-a2/ál) najprv naviazané a potom eluované z kolóny obsahujúcej LT-á-R klasickým spôsobom pomocou chaotropného alebo pH činidla (LT-a3 touto kolónou pretečie). Eluát sa neutralizuje alebo zbaví chaotropného činidla a potom sa purifikuje na kolóne obsahujúcej TNF-R, ktorý naviaže jedine triméry LT-a2/ál. Výsledný eluát potom obsahuje len LT-á(n) a triméry LT-al/ä2.

V oboch prípadoch môžu byť čisté triméry LT-al/á2 oddelené od LT-á následnou gélovou filtráciou a/alebo iónomeničovou chromatografiou, čo sú v danom odbore známe metódy.

Alternatívne sa môžu rôzne formy heteromémych komplexov LT-a/á separovať a čistiť radom obvyklých chromatografických postupov. Výhodné je kombinovať rad obvyklých purifikačných postupov s jedným uvedeným krokom imunoafinitného čistenia.

Testovanie (vyhľadávanie) agensu blokujúceho LT-p-R

V jednom uskutočnení predkladaného vynálezu obsahuje agens blokujúci LT-P-R protilátku namierenú proti LT-P-R, ktorá inhibuje signálnu dráhu Ι.Τ-β-R. Výhodne je protilátka anti-LT-p-R monoklonálna protilátka. Jednou z protilátok s takýmto inhibičným účinkom je monoklonálna protilátka BDA8.

Inhibičné protilátky anti-LT-P-R a iné agensy blokujúce LT-P-R možno identifikovať pomocou spôsobu testovania, ktorý zisťuje schopnosť jedného alebo viacerých agensov viazať sa na LT-P-R alebo LT ligand, alebo inhibovať vplyv signálnej dráhy LT-P-R na bunky.

Jeden spôsob testovania využíva cytotoxický účinok signálnej dráhy LT-p-R na nádorové bunky nesúce LT-P-R. Nádorové bunky sú vystavené pôsobeniu jedného alebo viacerých agensov aktivujúcich LT-p-R, aby sa indukovala signálna dráha LT-p-R. Agens aktivujúci LT-P-R zahŕňa ako heteroméme komplexy LTα/β (výhodne rozpustný komplex LT-al/p2) v prítomnosti IFN-γ alebo akúkoľvek aktivačnú protilátku antiLT-P-R (ako je tiež opísané v už podanej patentovej prihláške U.S. č. 08/378,968). Protilátky alebo iné agen sy, ktoré môžu blokovať cytotoxický účinok signálnej dráhy LT-P-R na nádorové bunky, sú vyberané na základe nasledujúceho testu.

(1) Nádorové bunky, napr. bunky HT29, sú kultivované 3 až 4 dni v súpravách jamiek na tkanivové kultúry obsahujúcich médium a aspoň jeden z agensov aktivujúcich LT-P-R, a to buď v prítomnosti alebo neprítomnosti testovaného agensu, ktorý je použitý v sériovom riedení.

(2) K nádorovým bunkám sa pridá farba vhodná na vitálne farbenie, ktorá reaguje na funkciu mitochondrií, a nechá sa reagovať niekoľko hodín.

(3) Optická hustota v každej jamke sa kvantifikuje meraním pri vlnovej dĺžke 550 nm (OD 500). Hodnota OD 500 je úmerná počtu nádorových buniek, ktoré pretrvávajú v prítomnosti agensu aktivujúceho LT-P-R a testovaného agensu blokujúceho LT-P-R. Agens alebo kombinácia viacerých agensov, ktorý v tomto teste znižuje cytotoxicitu nádorových buniek aktivovaných LT-P-R aspoň o 20 %, sa považuje za agens blokujúci LT-P-R v zmysle predkladaného vynálezu.

V tomto teste sa na identifikáciu agensu blokujúceho LT-P-R môže použiť akýkoľvek agens alebo kombinácia viacerých agensov aktivujúcich signálnu dráhu LT-P-R. Agens aktivujúci LT-P-R, ktorý indukuje signálnu dráhu LT-P-R (ako je napr. monoklonálna protilátka anti-LT-P-R), sa vyberie na základe svojej schopnosti, či už osamote, alebo v kombinácii s inými agensmi, podporovať cytotoxicitu nádorových buniek, ktorú možno otestovať aj testom s nádorovými bunkami, ktorý je opísaný.

Inou možnosťou ako testovať agens blokujúci LT-P-R, je sledovať schopnosť domnelého agensu priamo reagovať vo väzbe LT ligand-receptor. Agens alebo kombinácia viacerých agensov, ktorý zníži väzbu ligand-receptor aspoň o 20 %, je pokladaný za agens blokujúci LT-P-R v zmysle predkladaného vynálezu.

Na komparatívny test s domnelým blokujúcim agensom sa dá použiť ktorýkoľvek z mnohých testov, ktoré merajú silu väzby ligand-receptor. Sila väzby medzi receptorom a ligandom sa potom môže stanoviť pomocou ELISA (enzyme-linked immunoadsorbtion assay) alebo rádioimunotestu (RIA). Špecifická väzba sa dá merať aj pomocou fluorescenčné značených komplexov protilátka-antigén s využitím triedenia fluorescenčné aktivovaných buniek (FACS), alebo pomocou inej imunodetekčnej metódy, čo sú techniky dobre známe v danom odbore.

Interakcia ligand-receptor sa dá merať aj prístrojom BIAcore (Pharmacia Biosensor), ktorý využíva detekciu rezonancie (Zhou a kol., Biochemistry 32: 8139-98, 1993, Faegerstram a O’Shannessy, Surface Plasmon resonance detection in affinity technologies. In: Handbook of Affmity Chromatography, s. 229-252, Marcell Dekker, Inc., New York, 1993).

Technológia využívajúca BIAcore umožňuje naviazať receptor na zlatý povrch a nechať pretekať ligand okolo. Detekcia plazmónovej rezonancie priamo kvantitatívne hodnotí množstvo naviazanej hmoty v reálnom čase. Výsledkom použitia tejto techniky sú rýchlostné konštanty pre oba smery reakcie. Tak sa môže priamo stanoviť afmitná a disociačná konštanta väzby ligand-receptor v prítomnosti a neprítomnosti predpokladaného agensu blokujúceho LT-P-R.

Ktoroukoľvek z týchto techník, alebo aj iným postupom na meranie interakcií ligand-receptor, možno hodnotiť schopnosť agensu, či už samotného, alebo v kombinácii s inými agensmi, blokovať väzbu povrchových alebo rozpustných LT ligandov na povrchové alebo rozpustné molekuly LT-P-R. Takýto test tiež možno využiť na testovanie agensov blokujúcich LT-P-R alebo ich derivátov (fúznych, chimérických, mutovaných alebo chemicky pozmenených foriem), a to buď samotných, alebo v kombinácii, aby sa optimalizovala schopnosť agensu blokovať aktiváciu LT-p-R.

Produkcia rozpustných molekúl LT-P-R

Podľa jedného uskutočnenia tohto vynálezu agens blokujúci LT-P-R obsahuje molekulu receptora LT-p. Obr. 1 ukazuje sekvenciu extracelulámeho úseku ľudského LT-P-R, ktorá kóduje doménu viažucu ligand. Na základe znalosti sekvencie (obr. 1) a s využitím postupov rekombinantných DNA, ktoré sú v odbore dobre známe, je možné klonovať funkčný fragment domény viažucej ligand do vektora a potom exprimovať vo vhodnej hostiteľskej bunke, a tak produkovať rozpustnú molekulu LT-P-R. Rozpustné molekuly LT-P-R, ktoré súťažia (kompetujú) s natívnymi receptormi LT-P o LT ligand v opísanom teste, sú vybrané ako agensy blokujúce LT-p-R.

Rozpustné receptory LT-P-R, obsahujúce sekvenciu aminokyselín vybranú zo sekvencie uvedenej na obr. 1, sa môžu pripojiť k (jednej alebo) viacerým heterológnej proteínovej doméne („fuznej doméne“), aby sa zvýšila in vivo stabilita receptorového fúzneho proteínu, alebo aby sa modulovala jeho biologická aktivita alebo lokalizácia.

Výhodné sú na vytvorenie fúznych receptorových proteínov použité stabilné plazmatické proteíny, ktoré majú polčas obehu väčší ako 20 hodín. Takéto plazmatické proteíny sú napr. (ale uvedené príklady nepredstavujú obmedzenie) imunoglobulíny, sérový albumín, lipoproteíny, apolipoproteíny a transferín. Aby sa vytvoril špecificky lokalizovaný rozpustný fúzny proteín LT-P-R, môžu sa k doméne viažucej ligand tiež pripojiť sekvencie, ktoré zacielia rozpustnú molekulu LT-P-R do určitého bunkového alebo tkanivového typu.

Buď celý ΕΤ-β-R, alebo funkčný úsek z jeho extracelulámej oblasti obsahujúci doménu viažucu ligand, sa môže íuzovať s konštantným úsekom imunoglobulínu, napr. s Fc doménou ťažkého reťazca ľudského IgGl (Browning a kol., J. Immuno. 154: 33-46,1995). Rozpustné fuzne proteíny receptor-IgG sú výhodné. Predstavujú bežný imunologický reagens a spôsoby ich prípravy sú v odbore dobre známe (pozri napr. U. S. patent č. 5,225,535, na ktorý odkazujeme).

Funkčná doména z LT-P-R viažuca ligand sa môže fúzovať s Fc doménou imunoglobulínu (Ig) odvodeného od imunoglobulínu inej triedy či podtriedy, ako je IgG. Fc domény protilátok patriacich do odlišných tried alebo podtried môžu aktivovať odlišné druhotné efektorové funkcie. K aktivácii dôjde potom, čo sa Fc doména naviaže na vhodný receptor. Druhotné efektorové funkcie zahrnujú napr. schopnosť aktivovať komplement, krížovo reagovať s placentou alebo viazať rôzne mikrobiálne proteíny. Vlastnosti rôznych tried a podtried imunoglobulinov sú opísané v Roitt a kol., Immunology, s. 4.8, Mosby-Year Book Európe Ltd., 3. vyd., 1993).

Aktivácia komplementu iniciuje kaskádu enzymatických reakcií, ktoré sprostredkúvajú zápalovú reakciu. Jednotlivé produkty komplementu majú rôzne funkcie vrátane viazania baktérií, endocytózy, fagocytózy, cytotoxicity, produkcie voľných radikálov a solubilizácie imunitných komplexov.

Enzýmová kaskáda komplementu je aktivovaná Fc doménami protilátok IgGl, IgG3 a IgM s naviazanými antigénmi. Zdá sa, že Fc doména IgG2 je v aktivácii komplementu menej účinná a domény IgG4, IgA, IgD a IgE sú úplne neúčinné. Takže sa dá vybrať vhodná Fc doména v závislosti od toho, či s ňou spojená druhotná efektorové funkcia je žiaduca pre určitú imunitnú odpoveď alebo chorobu, ktorá je liečená pomocou fuzneho proteínu LT-P-R-Fc.

Ak by bolo žiaduce poškodiť alebo usmrtiť cieľové bunky nesúce LT ligand, je možné pre fúzny receptorový proteín vybrať mimoriadne aktívnu Fc doménu (IgGl). Ak by bolo žiaduce zacieliť fúzny proteín LT-β-R-Fc na bunku bez toho, aby sa aktivoval komplement, vyberie sa neaktívna Fc doména.

Opísali sa mutácie v Fc doméne, ktoré redukujú alebo úplne eliminujú väzbu na Fc receptor a aktiváciu komplementu (Morrison, S., Annu. Rev. Immunol. 10: 239-265, 1992). Tieto mutácie, či už samotné, alebo v kombinácii, možno použiť na optimalizáciu aktivity Fc domén použitých na vytvorenie fúzneho proteínu LT-P-R-Fc.

Produkcia rozpustného ľudského fúzneho proteínu obsahujúceho sekvencie viažuce ligand fuzované s Fc doménou ľudského imunoglobulínu (hLT-P-R-Fc) je opísaná v príklade 1. Jedna línia buniek CHO vytvorená podľa príkladu 1, ktorá secemuje hLT-P-R-Fc, je nazvaná „hLT, R-hGl CHO 14“. Vzorka bola deponovaná v Američan Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) v súlade s Budapeštianskou dohodou dňa 21. júna 1995 pod prístupovým číslom CRL11965.

Produkcia rozpustného myšieho fúzneho proteínu LT-P-R (mLT-P-R-Fc) je opísaná v príklade 2. Bunková línia CHO, ktorá secemuje mLT-P-R-Fc, je nazvaná „mLT, R-hGl CHO 1.3.BB“. Vzorka tejto línie bola deponovaná v Američan Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) v súlade s Budapeštianskou dohodou dňa 21. júna 1995 pod prístupovým číslom CRL11964.

Všetky obmedzenia týkajúce sa dostupnosti týchto deponovaných vzoriek pre verejnosť budú zrušené hneď, ako budú dané záruky udelenia patentu na túto prihlášku.

Rôzne aminokyselinové zvyšky tvoriace spojovací bod vo fuznom proteíne receptor-Ig ovplyvňujú štruktúru, stabilitu a teda aj konečnú biologickú aktivitu rozpustného LT-β receptorového fuzneho proteínu. K C-koncu vybraného fragmentu LT-P-R sa môže pridať jedna alebo viac aminokyselín, čím je možné modifikovať spojovací bod vo vybranej fuznej doméne.

Taktiež N-koniec fuzneho proteínu LT-P-R sa môže pozmeniť tým, že sa mení poloha, v ktorej je vybraný fragment DNA LT-P-R štiepený na svojom 5’ konci, aby mohol byť vložený do rekombinantného expresného vektora. Stabilita a aktivita každého fuzneho proteínu LT-P-R sa testuje a optimalizuje použitím rutinných testov a tiež pomocou testu na výber agensu blokujúceho LT-P-R, ako je opísaný tu.

Na základe sekvencie domény LT-p-R viažucej ligand vnútri extracelulámej domény, ktorá je ukázaná na obr. 1, je možné vytvárať rôzne sekvenčné varianty, aby sa modifikovala afinita rozpustného receptora LT-β alebo fúzneho proteínu k LT ligandu. Rozpustné molekuly LT-P-R podľa vynálezu môžu súťažiť o naviazanie povrchového LT ligandu s endogénnymi receptormi LT-P-R na povrchu buniek. Dá sa predpokladať, že akákoľvek rozpustná molekula obsahujúca doménu LT-P-R viažucu ligand, ktorá súťaží s povrchovými bunkovými receptormi LT-p o naviazanie LT ligandov, je blokujúci agens v zmysle predkladaného vynálezu.

Rozpustné molekuly LT-P-R ako agens blokujúci LT-P-R

Rozpustný ľudský fúzny proteín obsahujúci receptor LT-β a imunoglobulín (hLT-P-R-Fc) bol vytvorený postupom opísaným v príklade 1 a bola testovaná jeho schopnosť blokovať cytotoxicitu ľudských nádorových buniek HT29 indukovanú LT-P-R. Tabuľka 1 (príklad 3) porovnáva schopnosť fúznych proteínov obsahujúcich rozpustný receptor LT-β hLT-P-R-Fc a receptor TNF p-TNF-R-Fc) blokovať inhibičný účinok rôznych TNF a rozpustných LT ligandov na rast nádorových buniek HT29. Údaje v tabuľke 1 ukazujú kon9 centrácie, pri ktorých rozpustný receptor LT-β (hLT-p-R-Fc) blokuje na 50 % odumieranie nádorových buniek spôsobené interakciou medzi ligandom Ι_Τ-α1/β2 a receptormi LT-β na bunkovom povrchu. Schopnosť blokovať rast nádorových buniek aspoň o 20 % charakterizuje receptory LT-β ako účinné agensy blokujúce ΤΤ-β-R v zmysle predkladaného vynálezu. Rozpustný fúzny proteín s TNF-R (p55-TNF-R-Fc) podľa očakávania úplne blokoval inhibíciu rastu indukovanú TNF tým, že naviazal TNF a zabránil tak jeho interakcii s povrchovým receptorom.

Rozpustný fuzny proteín TNF-R nemal žiadny účinok na antiproliferačné pôsobenie sprostredkovné LT ligandom (ΤΤ-α1/β2): Naopak, fúzny proteín ΤΤ-β-R blokoval vplyv LT ligandov, ale neovplyvnil TNF ani LT-a. Takže rozpustný ľudský fúzny proteín ΤΤ-β-R neovplyvňuje aktiváciu TNF-R ani TNF, ani LT-α ligandmi.

Podobné pokusy boli uskutočnené s myšími nádorovými bunkami, aby sa zistilo, či má signálna dráha ΤΤ-β-R cytotoxický účinok na nádorové bunky myší a či rozpustné fuzne proteíny ΤΤ-β-R blokujú cytotoxicitu indukovanú υΤ-β-R. Rozpustný myší fuzny proteín mLT-3-R-Fc (pozri príklad 2) bol testovaný, ako blokuje odumieranie myších buniek WEHI164, ošetrených LT ligandom (príklad 4).

Na obr. 2 je ukázaný vplyv rozpustného myšieho LT-3-R ímLT-p-R-Fc) na signálnu dráhu ΤΤ-β-R indukovanú LT ligandom v myších bunkách línie WEHI 164. Ako ukazuje tento test, bunky WEHI 164 odumierajú po ošetrení rozpustným ligandom υΓ-α1/β2. Pridanie mLT-3-R-Fc blokuje odumieranie buniek aktivované LT ligandom. TNF receptorový fúzny proteín (p55TNF-R-Fc), použitý ako kontrola, mal len malý vplyv na odumieranie buniek.

Údaje ukazujú, že rozpustný fuzny proteín ΤΤ-β-R účinne súťaži s povrchovými molekulami ΤΤ-β-R o naviazanie LT ligandu. Rozpustný fúzny proteín mLT^-R-Fc teda pôsobí ako agens blokujúci ΤΤ-β-R pri myšiach.

Zdroj protilátok proti ľudskému ΤΤ-β-R

V inom uskutočnení tohto vynálezu protilátky namierené proti ľudskému receptoru LT-β (protilátka anti-LT^-R‘) pôsobia ako agens blokujúci υΤ-β-R. Protilátky anti-LT^-R podľa predkladaného vynálezu sú buď polyklonálne, alebo monoklonálne protilátky a je možné ich modifikovať tak, aby sa dosiahla optimálna schopnosť blokovať signálnu dráhu ΤΤ-β-R, ich in vivo biologickú dostupnosť, stabilitu alebo iné žiaduce znaky.

Polyklonálne sérum proti ľudskému receptoru LT-β sa pripraví konvenčným spôsobom tak, že sa koze, králikovi, potkanovi, škrečkovi alebo myši subkutánne injikuje ľudský fúzny proteín LT-P-R-Fc príklad 1 v kompletnom Freundovom adjuvanse a potom nasleduje druhá (spúšťacia) intraperitoneálna alebo subkutánna injekcia s neúplným Freundovým adjuvansom. Polyklonálne sérum obsahujúce požadované protilátky sa testuje obvyklým imunochemickým spôsobom.

Myšie monoklonálne protilátky proti ľudskému fúznemu proteínu υΓ-β-R-Fc sa pripravia tak, ako je to opísané v príklade 5. Hybridómová bunková línia BD.A8.AB9 produkujúca myšiu monoklonálnu protilátku BDA8 namierenú proti ľudskému ΤΤ-β-R bola uložená v Američan Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) v súlade s Budapeštianskou dohodou dňa 12. januára 1995 pod prístupovým číslom CRL11964. Všetky obmedzenia dostupnosti takto uloženej vzorky pre verejnosť budú zrušené hneď potom, čo budú dané záruky udelenia patentu na túto prihlášku.

Rôzne formy protilátok anti-LT-3-R sa môžu tiež pripraviť štandardnými technikami rekombinantných DNA (Winter a Milstein, Náture 349: 293-299, 1991). Napríklad je možné vytvoriť chimérické protilátky, v ktorých sú domény viažuce antigén zo zvieracej protilátky spojené s ľudskou konštantnou doménou (Cabily a kol., US 4,816,567, Morrison a kol., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A 81: 6851-6855, 1984). Pri klinickom použití bolo pozorované, že chimérické protilátky redukujú imunitnú reakciu vyvolanú zvieracími protilátkami použitými u človeka.

Okrem toho je možné syntetizovať aj rekombinantné „humanizované,, protilátky rozoznávajúce Ι.Τ-β-R. Humanizované protilátky sú chimérické molekuly obsahujúce väčšinou sekvencie ľudského IgG, do ktorých boli vložené úseky zodpovedajúce za špecifickú väzbu s antigénom (napr. WO 94/04679). Zvieratá sa imunizujú požadovaným antigénom, zodpovedajúca protilátka sa potom izoluje a odstráni sa variabilný úsek zodpovedný za špecifickú väzbu s antigénom. Úsek, odvodený zo zvieracej molekuly, zodpovedný za špecifickú väzbu s antigénom, sa potom klonuje do vhodného miesta v géne ľudskej protilátky, z ktorého bola odstránená oblasť špecificky viažuca antigén. Humanizované protilátky minimalizujú použitie heterológnych (medzidruhových) sekvencií v ľudských protilátkach, a teda s omnoho menšou pravdepodobnosťou vyvolávajú nežiaducu imunitnú odpoveď ošetrovaného.

Rôzne triedy rekombinantných protilátok ΤΤ-β-R sa môžu pripraviť ako chimérické alebo humanizované protilátky obsahujúce variabilné domény ΤΤ-β-R a konštantné domény (CH1, CH2, CH3) izolované z rôznych tried imunoglobulínov. Tak napr. protilátky anti-LT-P-R-IgM so zvýšenou valenciou miest viažucich antigén je možné pripraviť metódami rekombinantných DNA tak, že sa klonuje miesto viažuce antigén do vektora, ktorý obsahuje konštantnú oblasť ľudského μ-reťazca (Arulanadam a kol., J. Exp. Med.. 177: 1439-1450, 1993, Lane a kol., Eur. J. Immuno. 22: 2573-78, 1993, Traunecker a kol., Náture 339: 68-70,1989).

Taktiež je možné použiť techniky rekombinantných DNA na to, aby sa zmenila afinita väzby rekombinantných protilátok s antigénom, a to tým, že sa zmenia aminokyseliny susediace s väzbovým miestom. Afinitu humanizovaných protilátok k antigénu je možné zvýšiť mutagenézou založenou na molekulárnom modelovaní (Queen a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 10029-10033,1989, WO 94/04679).

Je žiaduce zvýšiť alebo znížiť afinitu protilátok anti- LT-P-R k ΤΤ-β-R v závislosti od typu cieľového tkaniva alebo v závislosti od predpokladaného liečebného postupu. Tak napr. z profylaktických dôvodov je výhodné ošetrovať pacienta tak, že sa použije konštantná hladina anti-LT-P-R so zníženou schopnosťou prenášať signál v signálnej dráhe LT-P-R. Inhibičné anti-LT-p-R so zvýšenou afinitou k LT-P-R sú zase výhodné na krátkodobé ošetrovanie.

Protilátky anti-LT-fl-R ako agens blokujúci LT-P-R

Protilátky anti-LT-p-R, ktoré sú účinné ako agens blokujúci LT-P-R, sa vyberajú tak, že sa testuje ich schopnosť inhibovať cytotoxicitu indukovanú LT-P-R v nádorových bunkách (príklad 5).

Prípravky a spôsoby vo výhodnom uskutočnení tohto vynálezu obsahujú myšiu monoklonálnu protilátku BDA8 namierenú proti ľudskému LT-p-R. Obr. 3 ukazuje, že protilátka BDA8 pôsobí ako agens blokujúci LT-P-R v zmysle definovanom v tomto vynáleze. Nádorové bunky WiDr zastavujú rast v prítomnosti IFN-γ a rozpustného ligandu LT-al/p2. Kontrolná protilátka IgGl nemá na inhibíciu rastu nijaký vplyv, naproti tomu protilátka BDA8 (myšia protiľudská anti-LT-P-R) blokuje schopnosť rozpustného ligandu LT-al/p2 inhibovať rast buniek WiDr. Takže protilátky namierené proti LT-P-R sú účinné ako agens blokujúci LT-p-R v zmysle predkladaného vynálezu.

Očakáva sa, že sa u človek nájdu ďalšie protilátky anti-LT-P-R s funkciou blokujúceho agensu, pokiaľ sa budú ďalšie protilátky proti ľudskému LT-fl-R vyhľadávať a testovať rutinnými spôsobmi a spôsobom opísaným v predkladanom vynáleze.

Zdroj protilátok proti povrchovým LT ligandom

Iné výhodné uskutočnenie vynálezu zahŕňa prípravky a spôsoby, ktoré obsahujú protilátky, namierené proti LT ligandom, ktoré pôsobia ako agensy blokujúce LT-P-R. Rovnako, ako je uvedené v súvislosti s protilátkami anti-LT-P-R, protilátky proti LT ligandom účinné ako agens blokujúci LT-P-R sú polyklonálne alebo monoklonálne protilátky a môžu sa modifikovať rutinnými postupmi, aby sa modulovali ich väzobné vlastnosti a imunogenicita.

Protilátky anti-LT podľa predkladaného vynálezu môžu byť namierené individuálne proti jednej z dvoch podjednotiek LT, a to vrátane rozpustných, mutovaných, zmenených alebo chimérických foriem LT podjednotiek. Pokiaľ sa použijú podjednotky LT-α, je výhodné, keď sa výsledné protilátky anti-LT-α viažu s povrchovým LT ligandom a nereagujú krížovo so secemovaným LT-α, ani nemodulujú aktivitu TNF-R (podľa testu opísaného v príklade 3).

Protilátky, namierené proti homomémym (LT-P) alebo heteromémym (LT-α/β) komplexom, zložených z jednej alebo viacerých LT podjednotiek, sa môžu vytvoriť a testovať na aktivitu blokujúcu LT-P-R. Výhodné je použiť ako antigén LT- ccl/2). Ako už bolo spomenuté, je výhodné, keď sa výsledné protilátky antiLT-pi/a2 viažu s povrchovým LT ligandom a nereagujú krížovo so secemovaným LT-α ani nemodulujú aktivitu TNF-R.

Produkcia polyklonálnych proti-ľudských protilátok LT-α je opísaná v už podanej patentovej prihláške WO 94/13808. Taktiež boli publikované monoklonálne protilátky anti-LT-α a anti-LT-P (Browning a kol., J. Immunol. 154: 33-46,1995).

Myšie proti-ľudské monoklonálne protilátky anti-LT-p boli pripravené postupom opísaným v príklade 6. Hybridómová bunková línia B9.C9.1 produkujúca myšie proti-ľudské monoklonálne protilátky anti-LT-β B9 bola uložená v Američan Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) v súlade s Budapeštianskou dohodou dňa 21. júla 1995 pod prístupovým číslom HB11962.

Škrečie protimyšie monoklonálne protilátky anti-LT-al/p2 BB.F6 boli pripravené postupom opísaným v príklade 7. Hybridómová bunková línia BB.F6.1 produkujúca škrečie protimyšie monoklonálne protilátky anti-LT-ocl/p2 BB.F6 bola uložená v Američan Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) v súlade s Budapeštianskou dohodou dňa 21. júla 1995 pod prístupovým číslom HB11963. Všetky obmedzenia dostupnosti takto uloženej vzorky pre verejnosť budú zrušené, len čo budú vydané záruky udelenia patentu na túto prihlášku.

Protilátky anti-LT-ligand ako agens blokujúci

Test pomocou triedenia fluorescenčné aktivovaných buniek (FACS) bol vyvinutý na sledovanie a výber protilátok namierených proti LT podjednotkám a LT komplexom, ktoré môžu pôsobiť ako agens, blokujúci LT-P-R (príklady 6 a 7). V tomto teste sa pridajú rozpustné ľudské fuzne proteíny LT-P-R-Fc k bunkám 11-23, ktoré exprimujú povrchové LT komplexy (Browning a kol., J. Immunol. 154: 33-46, 1995), aktivovaným PMA, a to v prítomnosti zvyšujúceho sa množstva testovaných protilátok. Protilátka, ktorá inhibuje interakciu ligandu s receptorom LT-β aspoň o 20 %, je potom vybraná ako agens blokujúci LT-P-R.

Výsledky takéhoto testu, ktorý slúžil na overenie monoklonálnych myších proti-ľudských protilátok LT-β B9, sú ukázané na obr. 4. Ukazuje sa, že protilátka anti-LT-P-R B9 selektívne blokuje väzbu rozpustných fuznych proteínov LT-P-R a povrchových LT ligandov indukovanú na aktivovaných bunkách. Výsledky potvrdzujú, že protilátky namierené proti podjednotkám LT ligandov pôsobia ako agens blokujúci LT-P-R.

Opísaný FACS test bol tiež použitý na testovanie škrečích monoklonálnych protilátok proti rozpustným myším komplexom LT-α/β (príklad 7). Výsledok tohto testu protilátky BB.F6 (príklad 7) je ukázaný v tabuľke 2. Ukazuje sa, že monoklonálna protilátka anti-LT-α/β BBF6 účinne blokuje väzbu rozpustných fúznych proteínov LT-p-R-Fc (príklad 2) a povrchových LT ligandov exprimovaných na myších hybridómových T bunkách, a teda je agens blokujúci LT-P-R podľa predkladaného vynálezu.

Použitie komplexov LT-α/β miesto podjednotiek ako antigénu na imunizáciu povedie k účinnejšej imunizácii, alebo povedie k vzniku protilátok s vyššou afinitou k povrchovým LT ligandom. Je možné si predstaviť, že imunizácia pomocou komplexov LT-α/β povedie k izolácii protilátok, ktoré rozpoznávajú aminokyselinové rezíduá tak podjednotiek LT-α, ako i LT-β, t. j. rezíduá, ktoré tvoria štep LT-al/p2. Dá sa očakávať, že ďalšie protilátky anti-LT namierené proti ľudským homomémym komplexom LT-α/β, ktoré pôsobia ako agens blokujúci LT-P-R u človeka, sa nájdu použitím rutinných testov a testov opísaných v tomto vynáleze.

Agens blokujúci LT-p-R inhibuje kontaktnú precitlivelosť sprostredkovanú Thl bunkami pri myšiach

Agens blokujúci LT-P-R podľa predkladaného vynálezu môže inhibovať imunitnú odpoveď sprostredkovanú bunkami Thl. Jeden takýto typ predstavuje neskorú precitlivelosť DTH (Cer a Mosmann, J. Immunol. 1238: 3688-3694, 1987, Roitt a kol., Immunology, s. 22.1-22.12, Mosby-Year Book Európe LTD., 3. vydanie, 1993). DTH je vyvolaná, keď bunky Thl citlivé na antigén secemujú cytokíny potom, čo sa znovu stretli s rovnakým antigénom. Thl cytokíny priťahujú a aktivujú makrofágy, ktoré uvoľňujú ešte ďalšie efektorové molekuly, a tie spustia zápalovú odpoveď.

Imunitná odpoveď typu DTH sa rozdeľuje na tri podtypy: kontaktnú, tuberkulínovú a granulomatóznu precitlivelosť. Tieto tri typy precitlivelosti (hypersenzitívne reakcie, HS) sa odlišujú rýchlosťou a povahou odpovede na cudzorodý antigén, keď je aplikovaný priamo na kožu alebo do podkožia senzibilizovanému (stretnutím s antigénom aktivovanému) subjektu. Reakcia DTH sa dá sledovať meraním rýchlosti a miery zosilnenia kože.

HS reakcie tuberkulínového typu sú kožné reakcie, ktoré sa objavujú na koži v mieste vpichu po injekcii cudzorodého mikrobiálneho materiálu, ktorému bol už predtým subjekt vystavený (napr. Mycobacterium tuberculosis alebo M. lepraé). Táto kožná reakcia, ktorá dosahuje maximum medzi 48 a 72 hodinami, sa často používa ako diagnostický test vnímavosti k antigénu, s ktorým sa subjekt už skôr stretol (napr. tuberkulínový kožný test). Po rozvinutí lézií tuberkulínového typu môže nastať granulomatózna reakcia, pokiaľ antigén v tkanive pretrváva.

Granulomatózne reakcie sú klinicky najzávažnejšou formou DTH reakcií, lebo vedú k mnohým patologickým účinkom spojeným s chorobami sprostredkovanými bunkami Thl. Niekedy dochádza k extenzívnemu odumieraniu buniek v jadre granulómu (napr. v pľúcnom tkanive ovplyvnenom tuberkulózou). Stvrdnutie cieľového tkaniva pri granulomatóznej reakcii nastáva počas 4 týždňov. Látky ovplyvňujúce frekvenciu tvorby granulómov je možné identifikovať pomocou myší infikovaných parazitickou krvnou motolicou (Schizostoma sp.). Parazitická krvná motolica Schizostoma spôsobuje ochorenie vedúce k vzniku granulómov okolo vajíčok motolice nakladených v portálnych žilkách infikovanej pečene. Agens, inhibujúci DTH reakciu sprostredkovanú Thl bunkami, buď zmenší veľkosť granulómu, alebo zmenší frekvenciu vzniku granulómov v infikovanej myšej pečeni. Bunková reakcia na vajíčka motolice sa dá kvantifikovať sledovaním časového priebehu počtu a veľkosti granulómov vzniknutých v myšiach ošetrených predpokladaným agensom blokujúcim LT-P-R s rastúcou koncentráciou.

Kontaktná precitlivelosť (CHS) je trieda DTH, kde cieľovým orgánom je koža. Zápalová odpoveď sa pri CHS vyvolá lokálnou aplikáciou reaktívneho hapténu na kožu. Alergény všeobecne obsahujú aspoň jednu hapténovú molekulu, ktorá je príliš malá na to, aby sama bola antigénna. Haptén preniká epidermou a reaguje s normálnymi proteínmi pod kožou, kde tak vzniká nový antigénny komplex.

Opakované stretnutie citlivého subjektu s hapténom spúšťa DTH odpoveď. Konjugát tvorený hapténom a proteínovým nosičom, spolu s bunkami prezentujúcimi antigén, aktivuje efektorový mechanizmus, ktorý spúšťa uvoľnenie cytokínov vrátane IL-2, IL-3, IFN-γ a GM-CSF. Kaskáda uvoľnených cytokínov spôsobí, že T bunky CD4+ začnú proliferovať, zmení sa profil expresie rôznych povrchových adhezívnych molekúl a zmení sa tiež miera, s ako sú T bunky a makrofágy priťahované na miesto zápalu v koži. Kaskáda cytokínov a následná vazodilatácia, bunková infiltrácia a edém kože a epidermy vedú k opuchu a zápalu cieľového tkaniva, čo spôsobí merateľné zhrubnutie kože ako odpoveď na DTH reakciu.

Miera senzibilizácie jedinca určitým hapténom závisí od mnohých faktorov. Tieto faktory zahrnujú napríklad to, ako dobre preniká haptén pokožkou, a ako vytvára konjugát s hostiteľovým proteínovým nosičom. Jeden z hapténov, ktorý senzibilizuje takmer každého jedinca, je 2,4-dmitrofluórbenzén (DNFB).

Kožná reakcia na haptén DNFB je klasickým zvieracím modelom bunkovej (bunkami sprostredkovanej) imunity. Lokalizácia tejto CHS odpovede na ucho senzibilizovanej myši umožňuje ľahko, presne a reprodukovateľné kvantifikovať túto bunkovú imunitnú odpoveď in vivo meraním hrúbky ucha. Podrobnosti týkajúce sa CHS reakcií pri myšiach a histopatológie zápalovej odpovede indukovanej DFNB boli opísané (Chisholm a kol., Eur. J. Immunol. 23: 682-688,1993).

Schopnosť DNFB indukovať kontaktnú precitlivelosť u väčšiny jedincov môže byť využitá na identifikáciu látok, ktoré redukujú alebo úplne eliminujú zápalovú odpoveď spojenú s DTH reakciou, sprostredkovanou TH1 bunkami. Rozpustný myší fúzny protein LT-p-R-Fc účinne inhibuje odpoveď kontaktnej precitlivelosti indukovanú DNFB pri myši (príklad 8). Myši boli na začiatku senzibilizované aplikáciou DFNB do chodidla zadnej nohy dva dni za sebou. Päť dní potom im bola aplikovaná podprahová dávka DNFB v roztoku nosiča na povrch ľavého ucha. Samotný roztok nosiča bol ako kontrola aplikovaný na pravé ucho.

Do myší bola potom intravenózne vstrekovaná rastúca dávka agensu blokujúceho LT-P-R (príklad 2, príklad 8). Injekcia samotného pufru PBS alebo ľudského fúzneho proteínu IgG LFA3-Fc slúžili ako negatívne kontroly. Injekcia monoklonálnej protilátky PS/2 špecifickej pre anti-VLA4, ktorá inhibuje CHS, bola použitá ako pozitívna kontrola. Po 24 hodinách bola zmeraná hrúbka každého ucha. Inhibícia opuchu ucha spôsobená agensom blokujúcim LT-p-R bola posúdená porovnávaním s neošetrenou skupinou a s negatívnou kontrolou.

Obrázok 5 ukazuje, že mLT-P-R-Fc spôsobuje významné zníženie opuchu ucha ako odpoveď na aplikáciu DNFB pri myšiach v porovnaní s kontrolami (PBS a LFA3_Ac). Rozpustný LT-P-R blokuje CHS reakciu rovnako účinne ako inhibítorová monoklonálna protilátka PS/2 špecifická pre anti-VLA4, ktorá pôsobí tak, že blokuje vstup T buniek do miesta pôsobenia antigénu (Chisholm a koľ, Eur. J. Immunol. 23: 682-688, 1993).

Tieto údaje ukazujú, že rozpustný fúzny LT-P-R, ktorý pôsobí ako agens blokujúci LT-P-R in vitro, tiež účinne inhibuje imunitnú odpoveď sprostredkovanú Thl bunkami po podaní zvieraťu. Agens blokujúci LT-β-R podľa tohto vynálezu, identifikovaný testom in vitro, sa môže testovať opísaným testom sledujúcim opuch ucha a môže sa tak vybrať ďalší agens blokujúci LT-P-R, ktorý je užitočný na zmenšenie sily imunitnej odpovede spojenej s Thl bunkami in vivo.

Agens blokujúci LT-P-R neinhibuje imunitnú odpoveď sprostredkovanú Th2 bunkami (humorálnu)

Agens blokujúci LT-P-R podľa vynálezu, ako je ukázané), inhibuje efektorový mechanizmus sprostredkovaný Thl bunkami, ako je napríklad neskorá kontaktná precitlivelosť (obr. 5). Táto odpoveď sprostredkovaná Thl bunkami je inhibovaná bez vplyvu na imunitnú odpoveď závislú od Th buniek. Odlišný vplyv agens blokujúceho LT-P-R na imunitnú odpoveď závislú od Th2 buniek bol ukázaný sledovaním imunitnej odpovede závislej od Th2 buniek, ako je napríklad primárna protilátková odpoveď a zmena izotypu, v prítomnosti agens blokujúceho LT-P-R.

Počas desaťdenného obdobia bol myšiam päťkrát injikovaný buď rozpustný fúzny protein LT-P-R (mLTP-R-Fc, príklad 2), alebo kontrolný IgG fúzny protein (LFA3-Fc), alebo boli ponechané bez ošetrenia. Po druhej injekcii bolo všetkým myšiam ku koreňu chvosta injikovaných 100 μΐ kompletného Freundovho adjuvansu so 100 pl ovalbumínu. Po 11 dňoch boli metódou ELISA sledované titre primárnych sérových protilátok izotypov IgGl, IgG2 a IgM špecifických proti ovalbumínu.

Obrázok 6 ukazuje vplyv agensu blokujúceho myší LT-P-R (mLT-P-R-Fc) na produkciu protialbumínových protilátok v sére myší imunizovaných ovalbumínom (príklad 9). Podanie agensu blokujúceho LT-P-R významne neovplyvnilo titre primárnych protilátok. Na porovnanie signálna dráha receptora CD40 indukovaná ligandom CD40 úplne blokuje antigénne špecifickú odpoveď IgG pri myšiach (Renshaw a kol., L Exp. Med. 180: 1889-1900, 1994). CD40 je ďalším zo skupiny párov ligand/receptor, ktorý patri do rodiny TNF.

Celková produkcia imunoglobulínov a ich zrenie sú jasne závislé od Th2 buniek. Ale je tiež zrejmé, že Thl cytokín IFN-γ sa zúčastňuje zmeny na podtríedu imunoglobulínov IgG2a, ale pritom nie je na tento proces celkom nevyhnutný (Huang a koľ, Science 259: 1742-1745, 1993). Agens blokujúci LT-P-R (mLT-P-R-Fc) neinhibuje zmenu IgG2 a v týchto pokusoch je možné, že agens blokujúci LT-P-R podľa predkladaného vynálezu neblokuje humorálnu stránku odpovede sprostredkovanej Thl bunkami. Okrem toho, proliferačná odpoveď lymfocytov pri myšiach ošetrených mLT-P-R-Fc nebola znížená (príklad 10, obrázok 7).

Tieto pokusy ukazujú, že terapia založená na podávaní agensu blokujúceho LT-p-R podľa vynálezu nemá nepriaznivý vplyv na produkciu protilátok pri imunitnej odpovedi sprostredkovanej Th2 bunkami. Normálny profil protilátkovej odpovede, ukázaný na obrázku 6, tiež ukazuje, že intenzívne ošetrovanie myší mLT-P-R-Fc nie je pre myši toxické, a ďalej ukazuje terapeutickú užitočnosť prípravkov podľa vynálezu.

Ochorenia sprostredkované pomocnými T bunkami

Mnoho orgánovo špecifických autoimunitných stavov zahrnuje patologickú odpoveď Thl buniek. Prehľady z poslednej doby prinášajú Modlin a Nutman, Current Opinion in Immunol. 5: 511-517, 1993, Romagnani a koľ, Ann. Rev. Immunol. 12: 227-257, 1994. K orgánovo špecifickým autoimunitným stavom patrí: roztrúsená mozgovo-miechová skleróza, diabetes mellitus závislý od inzulínu, sympatická oftalmia, uveitída a lupienka.

Diabetes mellitus závislý od inzulínu je autoimunitná choroba, pri ktorej sú beta bunky pankreasu produkujúce inzulín zničené infiltráciou leukocytov do Langerhansových ostrovčekov. Diabetes môže byť ľahko indukovaný pri novonarodených „neobéznych diabetických,, (NOD) myšiach tým, že sa prenesú aktivované prediabetické splenocyty. Bunky podobné Thl a Th2 bunkám, inak geneticky veľmi podobné, boli prenesené do novonarodených NOD myší. Jedine Thl bunky rýchlo indukovali diabetes takmer pri všetkých príjemcoch (Katz a kol., Science 268: 1185-1188, 1995). To ukazuje, žc agens blokujúci LT-P-R podľa vynálezu, ktorý in vivo inhibuje vplyv imunitnej odpovede sprostredkovanej Thl bunkami, bude užitočný na liečenie alebo prevenciu diabetu závislého od inzulínu.

Niektoré systémové autoimunitné ochorenia, vrátane rôznych artritíd, sú spojené s Thl bunkami. Reumatická artróza a Sjorgenov syndróm zahrnujú aj ThO a Thl bunky. Naproti tomu systémový lupus erythematosus (SLE) je spojený s aberantnou ThO/Thl dominantnou odpoveďou.

Niektoré chronické zápalové ochorenia majú tiež aberantnú odpoveď Thl typu, vrátane zápalovej črevnej choroby, pľúcnej sarkodiózy a odhojenia aloštepu. Zápalová choroba čriev (inflammatory bowel disease, IBD) u človeka zahrnuje aspoň dve kategórie, ulcerickú kolitídu a Crohnovu chorobu. Obe choroby sú dôsledkom imunopatologickej poruchy podobnej autoimunitným poruchám. Pri myšom modeli IBD je zrejmé, že niektoré látky blokujúce Thl odpoveď môžu blokovať rozvoj alebo priebeh choroby (Powrie, F. a kol., Immunity 1: 553, 1994). Je možné, že inhibícia Thl zložky imunitnej odpovede by mohla mať prospešný vplyv tiež na ľudskú IBD. Opísané boli mnohé modely IBD a v prehľade ich uvádza Elsom, C. a kol. (Gastroenterology 109: 1344, 1995). Existujú najmenej tri skupiny modelov: modely chemicky indukované, modely indukované polymérmi alebo mikroorganizmami a modely imunologické používajúce mutované myši.

V jednom všeobecne používanom modeli, indukovanom polymérmi alebo mikroorganizmami, sa myšiam do vody na pitie pridá roztok dextánsulfátu. Po strávení je epitelová výstelka čreva podráždená, čo vedie k výraznej imunitnej odpovedi na poškodenie. Zvieratám sa vyvinie kolitída, ktorá sa manifestuje hnačkou, krvou v stolici, stratou telesnej hmotnosti a skrátením hrubého čreva v dôsledku expanzie črevnej steny. Tento model indukuje ľavostrannú kolitídu a epitelovú displáziu, ktorá môže viesť k rakovine, čo sa charakterizuje ako ulcerická kolitída.

Druhý model predstavuje transplantácia vybranej skupiny T buniek CD4 do myší SCID, t. j. myší, ktoré nemajú B a T bunky (Powrie, F. a kol., Intemational. Immunology 5: 1461-1471, 1993, Morrissey a kol., J. exp. Med. 178:273, 1993). Keď vybrané bunky, zvané CD45RB^V'^S, expandujú a rekonštituujú imunitný systém SCID myší, je normálny mechanizmus zabraňujúci vzniku autoreaktívnych buniek nefunkčný, a teda sa vyvinú autoreaktívne bunky. Pri potkanoch sa objavujú bunky reagujúce s mnohými orgánmi, zatiaľ čo pri myšiach reagujú primáme v čreve. Látky, ktoré buď zmenia spôsob expanzie a vývoja autoreaktívnych buniek, alebo ktoré môžu zablokovať schopnosť buniek napadať črevo, budú účinné v tomto modeli. Ale keďže tento model do istej miery napodobňuje patologický rozvoj autoreaktívnych buniek imunitného systému, ošetrenie, ktoré úplne blokuje tento model, bude pravdepodobne len modifikovať priebeh choroby u človeka. V modeli protilátky proti TNF blokujú chorobu (Powrie a kol. Immunity 1: 552, 1994) a tieto protilátky boli účinné pri ošetrení človeka (van Dullemen, H. M. a kol., Gastroenterology 109: 106, 1995). Tento model sa dá použiť na predpoveď a testovanie tých látok, ktoré môžu byť terapeuticky účinné v BDH. Model CD45RB je príkladom chorobného procesu sprostredkovaného Thl bunkami a skutočne pri potkanoch spôsobuje choroby mnohých orgánov. Účinnosť LT-P-R-Ig v tomto modelovom systéme ukazuje, že ίΤ-β-R-lg alebo iné prostriedky, blokujúce interakcie LT-P-R s ligandom, môžu byť prospešné v celom rade príbuzných imunologických ochorení.

Všeobecne nebol pri týchto autoimunitných ochoreniach dosiaľ presne zistený príspevok autoprotilátok v porovnaní so špecifickými T bunkami. Bunková odpoveď tvorí zrejme hlavný príspevok k patogenicite pri týchto systémových autoimunitných ochoreniach, pri ktorých sa v súčasnosti predpokladá, že sú primáme spôsobené protilátkami, napr. rôzne artritídy.

Normálna imunitná odpoveď na niektoré patogénne infekčné agensy tiež vyvoláva odpoveď Thl buniek, ktorá môže byť nadmerná a sama osebe predstavuje značný problém. Príklady granulomatóznych reakcií (trieda DTH opísaných reakcií), ktoré vedú k vážnym zdravotným problémom, zahrnujú lepru, tvorbu granu lomov v pľúcach tuberkulóznych pacientov, sarkodiózu a schizostomiázu (Roitt a kol., Immunology, s. 22.522.6, Mosby-Year Book Európe Ltd., 3. vydanie, 1993). Thl bunkami je pravdepodobne sprostredkovaná aj lupienka.

Cytotoxické T bunky, t. j. CTL (CD8 pozitívne T bunky, CD+) sa tiež delia na dve subpopulácie podobné Thl a Th2 bunkám. Je preto možné, že to, čo je známe o Th skupinách, platí aj pre bunky CD8+, ktoré sa primáme zúčastňujú antivírusovej imunitnej odpovede a odhojenia štepu.

Liečenie podávaním agensu blokujúceho LT-p-R

Prípravky podľa vynálezu sa budú podávať v účinnej dávke pri liečení určitých klinických stavov. Určenie výhodného farmaceutického prípravku, terapeuticky účinnej dávky a režimu na určité použitie je plne zvládnuteľné v rámci súčasného stavu odboru, napr. v závislosti od hmotnosti pacienta, rozsahu požadovaného liečenia, tolerancie pacienta. Dávky v hodnote 1 mg/kg rozpustného LT-P-R sú vhodným východiskovým bodom na optimalizáciu liečebných dávok.

Vhodné terapeuticky účinné dávky sa tiež môžu stanoviť uskutočnením pokusov in vitro, v ktorých sa meria koncentrácia agensu blokujúceho LT-P-R potrebná na vysýtenie povrchu cieľových buniek (v závislosti od agensu buď bunky pozitívne na LT-p-R, alebo LT ligand) počas 1 až 14 dní. Tu opísaný test založený na sledovaní väzby ligand-receptor sa môže použiť na sledovanie reakcie vysycovania povrchu buniek. Bunky pozitívne na LT-P-R alebo LT ligand sa dajú separovať od populácie aktivovaných lymfocytov pomocou FACS. Na základe výsledkov testov in vitro možno stanoviť vhodný rozsah koncentrácií agensu blokujúceho LT-P-R na ďalšie testovanie na zvieratách spôsobom opísaným vo vynáleze.

Podávanie rozpustných molekúl LT-P-R, protilátok anti-LT-ligand a anti-LT-P-R podľa vynálezu, samotných alebo kombinovaných, vrátane izolovaných a purifikovaných foriem protilátok alebo komplexov, ich solí alebo farmaceutický prijateľných derivátov, je možné vykonávať obvyklým spôsobom podávania látok s imunosupresívnou aktivitou.

Farmaceutické prípravky na túto terapiu môžu byť v rôznych formách, to znamená napr. tuhé, polotuhé alebo tekuté dávkové formy ako napr. tabletky, pilulky, prášky, roztoky alebo suspenzie, čapíky, injekčné a infúzne roztoky. Výhodná forma závisí od požadovaného spôsobu podávania a terapeutického použitia. Spôsoby podávania zahrnujú aplikačnú cestu parenterálnu, perorálnu, subkutánnu, intravenóznu, topickú a intraléznu (do poškodeného miesta).

Rozpustné molekuly LT-P-R, ligandy anti-LT a protilátky anti-LT-P-R podľa vynálezu sa môžu napr. pridať do sterilného izotonického prípravku, buď s, alebo bez kofaktorov stimulujúcich príjem alebo stabilitu. Prípravok je výhodne tekutý alebo lyofilizovaný prášok. Prípravok sa z rozpustných molekúl LT-P-R, ligandov anti-LT a protilátok anti-LT-P-R podľa vynálezu vytvorí napr. tak, že sa nariedi pufrom, ktorý obsahuje 5,0 mg/ml monohydrátu kyseliny citrónovej, 2,7 mg/ml trinátrium-citrátu, 4,1 mg/ml manitolu, 1 mg/ml glycínu a 1 mg/ml polysorbátu 20. Tento roztok sa lyofilizuje, uskladní zamrazený a rekonštituuje pred použitím sterilnou vodou na injekcie.

Prípravok tiež výhodne obsahuje obvyklé farmaceutický prijateľné nosiče, dobre známe v odbore (pozri napr. Remington Pharmaceutical Sciences, 16. vyd. 1980, Mac Publishing Company). Takéto farmaceutický prijateľné nosiče zahrnujú ďalšie medicinálne agensy, nosiče, genetické nosiče, adjuvanciá, excipienty a ďalšie, napr. ľudský sérový albumín alebo preparáty z plazmy. Prípravok je výhodne v podobe jednotkovej dávky a podáva sa jeden alebo viackrát denne.

Farmaceutický prípravok podľa vynálezu je možné podávať tiež pomocou mikrosfér, lipozómov alebo iných mikročasticových systémov alebo stálych uvoľňovacích zmesí umiestnených priamo v ovplyvňovanom orgáne, v jeho blízkosti alebo v inom spojení s ním, alebo v krvnom obehu. Vhodným príkladom takejto liekovej formy s predĺženým uvoľňovaním liečiva je semipermeabilná polyméma matrica formovaná do tvaru čapíkov alebo mikrokapsúl. Implantovateľné alebo v mikrokapsulách použiteľné matrice zahŕňajú polylaktidy (u. S. patent č. 3,773,319, EP 58,481), kopolyméry kyseliny L-glutámovej a etyl-L-glutamátu (Sidman a kol., Biopolymers 22: 547-556, 1995), poly-2-hydrosy, kopolyméry kyseliny L-glutámovej a etyl-L-glutamátu (Sidman a kol., Biopolymers 22: 547-556, 1995), poly-2-hydroxyetylmetakrylátu alebo etilvinylacetátu (Langer a kol., J. biomed. Mater. Res. 15: 167-277, 1981, Langer, Chem. Tech. 12: 98-105, 1982).

Lipozómy obsahujúce rozpustné molekuly LT-P-R, ligandy anti-LT a protilátky anti-LT-p-R podľa vynálezu, samotné alebo v kombináciách, sa pripravia dobre známym spôsobom (pozri napr. DE 3,218,121, Epstein a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 3688-3692, 1995, Hwang a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77: 4030-4034, 1980, U. S. patenty č. 4,485,045 a 4,544,545). Lipozómy sú obvykle malého (200 až 800 Angstrom) jednovrstvového typu a obsah lipidov je vyšší ako 30 % (molámych) cholesterolu. Podiel cholesterolu sa vyberie tak, že riadi optimálnu mieru uvoľňovania rozpustných molekúl LT-p-R, protilátok anti-LT-ligand a anti-LT-P-R.

Rozpustné molekuly LT-P-R, ligandy anti-LT a protilátky anti-LT-p-R podľa vynálezu sa môžu pripojiť k lipozómom obsahujúcim iné agensy blokujúce LT-p-R, imunosupresíva alebo cytokíny modulujúce aktivi tu blokujúcu LT-P-R. Naviazanie rozpustných molekúl LT-P-R, ligandov anti-LT a protilátok anti-LT-P-R sa vykoná známym zosieťovacím činidlom, ktoré sa používa na naviazanie toxínov alebo chemoterapeutických agensov na protilátky na cielené podávanie. Konjugácia s lipozómami sa dá tiež uskutočniť použitím zosieťovacieho činidla zacieleného na sacharidy 4-(4-maleimidofenyl)hydrazidu kyseliny maslovej, MPBH (Duzgunes a kol., J. Celí. Biochem. Abst. Suppl. 16E 77, 1992).

Výhody terapeutických prípravkov obsahujúcich agens blokujúci LT-P-R

Agens blokujúci LT-p-R podľa vynálezu je schopný selektívne inhibovať imunitný efektorový mechanizmus sprostredkovaný Thl bunkami, ale nie mechanizmus sprostredkovaný Th2 bunkami. Agens blokujúci LT-p-R bude užitočný na liečenie stavov, ktoré sú exacerbované aktivitami cytokínov Thl typu (napr. IL-2 a IFN-γ). Keďže Thl cytokíny inhibujú imunitnú odpoveď závislú od Th2 buniek, agens blokujúci LT-P-R tak môže nepriamo stimulovať určité odpovede závislé od Th2, ktoré sú normálne inhibované kaskádou cytokínov indukovanou Thl bunkami.

Schopnosť selektívne potláčať bunkovú odpoveď Thl (alebo nepriamo stimulovať Th2) je užitočná na liečenie abnormalít rôznych typov bunkovej imunitnej odpovede, vrátane rôznych autoimunitných a chronických zápalových stavov, tolerancie antigénu a bunkového odhojenia tkanivového štepu alebo orgánového transplantátu.

Ako už bolo spomenuté, liečenie imunologických stavov sprostredkovaných Thl bunkami využíva imunomodulačné a imunosupresívne agensy, ktoré majú pleiotoropný účinok na široké spektrum bunkových typov a imunitných odpovedí. Tieto nešpecifické imunosupresívne agensy sú spravidla vyžadované vo vysokých a často aj cytotoxických dávkach, ktoré spôsobujú rad vedľajších účinkov.

Schopnosť meniť charakter imunitnej odpovede je podporovaná nedávnym štúdiom diabetu pri myšiach (Katz a kol., Scince 268: 1185-1188,1995) a pri modeli alogénneho transplantátu (Saegh a kol., J Exp. Med. 181: 1869-1874, 1995). V štúdii Saegha (pozri skôr) je ukázané, že fúzny proteín, blokujúci kostimulačnú dráhu T buniek CD28-B7, indukuje toleranciu k štepu z ľadviny. Tolerancia korelovala so znížením Thl cytokínov a so zvýšením Th2 cytokínov in vivo. Tieto údaje ukazujú, že agens blokujúci LT-P-R podľa vynálezu bude užitočný na potlačenie odhojenia tkanivového štepu alebo orgánového transplantátu tým, že inhibuje uvoľňovanie cytokínov sprostredkované Thl bunkami.

Agens blokujúci LT-P-R v prípravku a spôsobe podľa vynálezu sa môže modifikovať, aby sa dosiahla požadovaná úroveň signálnej dráhy LT-P-R v závislosti od stavu, poruchy alebo choroby, ktorá sa lieči. Je možné predvídať, že absolútna úroveň signálnej dráhy LT-P-R môže byť jemne nastavená tým, že sa budú meniť koncentrácie a afinity (k príslušným molekulovým cieľom) činidiel blokujúcich LT-P-R.

Napríklad v jednom uskutočnení vynálezu je prípravok obsahujúci rozpustné molekuly LT-P-R podaný subjektu. Rozpustný receptor LT-P-R účinne súťaží s receptormi LT-β na povrchu buniek o naviazanie povrchových ligandov. Schopnosť kompetície s povrchovými ligandmi je závislá od relatívnych koncentrácií rozpustných LT-P-R a molekúl LT-P-R na bunkovom povrchu, a tiež od ich relatívnych afinít k ligandu.

Rozpustné molekuly nesúce mutácie, ktoré zvyšujú alebo znižujú väzbovú afinitu daného mutantného rozpustného LT-P-R k povrchovému ligandu, sa môžu vytvoriť technikami rekombinantných DNA, ktoré sú odborníkovi dobre známe. Veľký počet molekúl s cielenými alebo náhodnými mutáciami sa môže testovať na svoju schopnosť pôsobiť ako agens blokujúci LT-P-R použitím rutinných pokusov a spôsobov opísaných v predkladanom vynáleze.

Podobne v inom uskutočnení vynálezu protilátky namierené proti LT-P receptorom alebo proti jednej, alebo viacerým podjednotkám LT ligandov pôsobia ako agensy blokujúce LT-P-R. Schopnosť týchto protilátok blokovať signálnu dráhu receptora LT-β sa môže modifikovať mutáciou, chemickou modifikáciou alebo iným spôsobom, ktorý môže zmeniť účinné koncentrácie alebo aktivity protilátky podanej subjektu.

Schopnosť znížiť aktivitu signálnej dráhy ΕΤ-β-R bez toho, aby sa úplne inhibovala, môže byť dôležitá na ustanovenie alebo udržanie redukovanej hladiny signálnej dráhy ΕΤ-β-R, ktorá podporuje normálnu imunitnú funkciu, zatiaľ čo inhibuje odpovede sprostredkované Thl bunkami, ktoré prevyšujú normálnu úroveň alebo sú inak abnormálne.

Poškodenie génu LT-α myši vedie k aberantnému vývoju periférnych lymfoidných orgánov (DeTongi a kol., Science 264:703-707, 1994). Takéto myši nemajú lymfatické uzliny a v ich slezinách chýba vo folikuläch zvyčajne celkom jasná hranica medzi oblasťami bohatými na B bunky a T bunky. Veríme, že tento fenotyp je spojený so stratou signálnej dráhy LT-P-R indukovanej povrchovými LT, pretože podobné fenotypy neboli pozorované, keď sa modulovala aktivita TNF-R. Schopnosť selektívne alebo čiastočne blokovať dráhu LT-P-R môže byť užitočná na liečenie abnormálneho vývoja lymfoidných orgánov, ktorý je spôsobený chybnou alebo nadmernou expresiou v signálnej dráhe LT-P-R.

Niektoré reakcie spojené s Thl sú kritickými zložkami radu foriem imunitnej odpovede sprostredkovaných bunkami (Romagnani, S., Ann. Rev. Immuno. 12: 227-257, 1994), a preto úplná inhibícia aktivity Thl buniek môže byť za určitých okolností nežiaduca. Napr. myš je účinne odolná proti parazitámej infekcii, po16 kiaľ je aktivovaná dobrá Thl odpoveď. Infekčné agensy ako napr. Listeria a Toxoplasma vyvolávajú silnú odpoveď Thl typu. U človeka je odpoveď vyvolaná Mycobacterium tuberculosis tiež založená na Thl type. Patogenicita leishmanióz koreluje s odpoveďami podobnými Thl odpovedi pri myšiach (Reed a Scottt, Current Opinion in Immunol. 5: 524-531,1993).

Nasledujúce príklady ilustrujú rozpustné LT-β receptory, anti-LT ligandy a protilátky anti-LT-P-R podľa vynálezu a spôsoby použité a ich charakterizáciu. Tieto príklady nie sú žiadnym spôsobom obmedzujúce, ich účelom je osvetliť a ilustrovať vynález. Predkladaný vynález je obmedzený jedine uvedenými nárokmi.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1: Sekvencia extracelulámej časti ľudského receptora LT-β, ktorá kóduje doménu viažucu ligand.

Obr. 2: Rozpustný myší receptor LT-β spojený s doménou Fc ľudského IgGl (m LT-P-R-Fc) blokuje LT-β-R signálnu dráhu v myších bunkách WEHI po indukcii myším ligandom LT-α/β. Bunky WEHI 164 odumierajú v závislosti od rastúcej koncentrácie LT ligandu (mLTa/β). Rozpustný mLT-P-R-Fc v koncentrácii 10 mg/1 blokuje ligandom indukované odumieranie. Rozpustný myší TNF receptorový fúzny proteín (p55TNF-R-Fc) má len malú účinnosť v blokovaní odumierania buniek po aktivácii LT-α/β. Rast bol kvantifíkovanýpo troch dňoch meraním optickej hustoty (OD 500) po reakcii MTT, čo je úmerné počtu buniek.

Obr. 3: Monoklonálna protilátka namierená proti ľudskému LT-p-R (BDA8) blokuje interakciu medzi rozpustným LT ligandom a LT-P-R na povrchu ľudských buniek. Rast nádorových buniek je blokovaný kombináciou IFN-γ a rozpustného ligandu LT-al/p2. Protilátka BDA8 blokuje schopnosť ligandu LT-al/p2 inhibovať rast nádorových buniek WiDr. Plné symboly v grafe ukazujú rast kontrolných buniek v prítomnosti IgGl mAb (10 pg/l). Prázdne symboly ukazujú vplyv anti-LT-β-R protilátky BDA8 (10 pg/ml).

Obr. 4: Monoklonálna protilátka namierená proti ľudskému LT-β (B9) blokuje interakciu medzi povrchovým ligandom LT-α/β a rozpustným receptorom LT-β (hLT-P-R-Fc, 2 pg/ml). Povrchovo viazaný LT-P-R-Fc bol detegovaný pomocou oslej protiľudskej protilátky IgG značenej fykoeritrínom a následnou analýzou na triediči buniek (FACS). Priemerná intenzita fluorescencie výsledného vrcholu je vynesená v grafe ako číslo kanálu. Čiarkovaná čiara ukazuje priemernú intenzitu fluorescencie zodpovedajúceho množstva viazaných receptorov bez prítomnosti B9.

Obr. 5: Vplyv agensu blokujúceho LT-P-R (mLT-P-R-Fc) na opuch ucha pri myšom modeli kontaktnej neskorej precitlivelosti (DTH). Graf ukazuje zväčšenie hrúbky ucha merané 24 hodín po vnesení antigénu 0,2 % DFNB do ucha senzibilizovaných myší. Každý symbol predstavuje samostatný pokus. Vo všetkých pokusoch bolo použitých 7 až 8 myší na jedno meranie okrem tých, ktoré sú označené kosoštvorcom, v ktorých boli použité len štyri zvieratá. Ako negatívna kontrola slúžili myši ošetrené pufrom (PBS) alebo kontrolným fúznyrn proteínom IgG LFA3-Fc (20 mg/kg). Myši ošetrené monoklonálnou protilátkou anti-VLA4 (PS/2 mAb) s koncentráciou 8 mg/kg, ktorá inhibuje opuch ucha spôsobený kontaktnou DTH, slúžili ako pozitívne kontroly.

Obr. 6: Graf ukazuje zmeny hmotnosti pozorované na myšiach 14 dní po ošetrení fúznyrn proteínom mLT-P-R-lg a hLFA3-lg.

Obr. 7: Graf ukazuje dĺžku hrubého čreva pozorovanú 14 dní po ošetrení fúznyrn proteínom mLT-P-R-lg a hLFA3-lg._

Obr. 8: Časový priebeh telesnej hmotnosti myší po injekcii CD45RB^nĽky CD4 pozitívnych T buniek, CD45RB^vysoký CD4 pozitívnych T buniek, CD45RB^vysoký a inLTPR-lg, CD45RB^vysoký a hLFA3-lg.

Obr. 9: Grafická reprezentácia priemerov a smerodajných odchýlok telesnej hmotnosti pozorovanej v pokusoch zobrazených na obr. 8 až 11.

Obr. 10: Graf ukazuje zvýšenie hrúbky chodidiel zadných končatín myší po injekcii negatívnej a pozitívnej kontroly mLTpRlg.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava rozpustných ľudských LT-β receptorov v podobe fuznych proteínov s imunoglobulínovým Fc.

Sekvencia cDNA ľudského klonu izolovaná z ľudskej knižnice 12p transkribovaných sekvencií odvodená zo somatických hybridných buniek (Baens a kol., Genomics 16: 214-218, 1993) bola vložená do GeneBank a až neskôr bola identifikovaná ako sekvencia kódujúca ľudský LT-P-R. Úplná sekvencia cDNA ľudského LT-β-R je dostupná od roku 1992 v GenBank pod položkou č. L04270.

Extraceluláma doména LT-P-R až po transmembránovú oblasť (obr. 1) bola amplifikovaná metódou PCR z cDNA klonu pomocou primerov obsahujúcich miesta pre reštrikčné enzýmy Notl a Sali na svojich 5’ a

3’koncoch (Browning a kol., J. Immunol. 154: šš-46, 1995'. Amplifíkovaný produkt bol naštiepený NotI a Sali, prečistený a ligovaný (vložený) do vektora pMDR901 linearizovaného NotI, spoločne s fragmentom SaΠ-Notl kódujúcim Fc úsek ľudského IgGl. Výsledný vektor obsahoval gén dihydrofolátreduktázy a fúzneho proteínu LT-P-R-Fc, každý so zvláštnym promótorom.

Vektor bol elektroporáciou vnesený do buniek CHO dhft- a štandardným postupom boli izolované klony rezistentné k metotrexátu. LT-p-R-Fc bol secemovaný do média a na výber bunkových línií produkujúcich najvyššiu hladinu receptorového fúzneho proteínu bol použitý test ELISA. Vysokoprodukčná bunková línia bola potom kultivovaná vo veľkom a upravené médium sa zbieralo. Čistý LT-P receptorový fúzny proteín sa získal prečistením pomocou afinitnej chromatografie s proteín-A-sepharózou (Pharmacia).

Príklad 2

Príprava rozpustných myších LT-β receptorov v podobe fuznych proteínov s imunoglobulínovým Fc

Úplný cDNA kloň myšieho mLT-P-R bol pripravený ligáciou fragmentov 5’NotI/ApaLI a 3’ApaLI/NotI z dvoch čiastočných izolátov cDNA do NotI miesta vektora pCDNA3 (InVitrogen, San Diego, CA). Sekvencia tohto cDNA klonu je prístupná v GenBank ako položka č. U29173. Pri porovnaní s inou sekvenciou mLT-P-R nájdenou v GenBank pod číslom L38423 neboli nájdené žiadne rozdiely v sekvencií.

Rozpustný fúzny proteín (hlgGl) bol pripravený tak, že pomocou PCR sa amplifikoval kloň s úplnou cDNA mLT-P-R s printermi 5’AACTGCAGCAGCGGCCGCCATGCGCCTGCCC 3’ a 5’GACTTTGTCGACCATTGCTCCTGGCTCTGGGGG 3’. Amplifíkovaný produkt bol prečistený a naštiepený NotI a Sali a ligovaný spoločne so Sall/NotI fragmentom Fc ľudského IgGl do NotI linearizovaného a fosfatázou ošetreného vektora SAB132, čím vznikol vektor JLB122: NotI kazeta obsahujúca mLT-p-R-Fc bola pre stálu expresiu prenesená do NotI miesta plazmidu pMDR901, a tak vznikol vektor PSH001, ktorý bol transfekovaný do CHO buniek, ako bolo publikované (Browning a kol., J. Immunol. 154: 33-46, 1995). Bunkové klony secemujúce mLT-P-R-Fc boli identifikované testom ELISA. Čistý LT-β receptorový fúzny proteín bol získaný prečistením zo supemantantu CHO buniek pomocou afinitnej chromatografie s proteín-A-sepharózou (Pharmacia).

Príklad 3

Použitie rozpustného ľudského ΕΤ-β-R-Fc na blokovanie interakcie LT-β receptorov s ligandmi

Rozpustné ľudské hLT-P-R-Fc boli testované na schopnosť blokovať väzbu LT ligandov k LT-P receptorom v opísanom teste cytotoxicity nádorových buniek. V tomto teste sa rozpustné formy LT ligandov (hLTot 1 /p2), ktoré aktivujú signálnu dráhu LT-P-R, použijú na usmrtenie nádorových buniek. Inhibítory signálnej dráhy znižujú cytotoxicitu nádorových buniek indukovanú LT-P-R.

Rozpustné hLT-al/p2 obsahujú skrátené alebo modifikované podjednotky LT-P, ktorým chýba funkčná transmembránová doména. Rozpustné ligandy hLT-al/p2 sa viažu na LT-P-R a tým stimulujú signálnu dráhu LT-p-R rovnako ako povrchové formy LT ligandov (Browning a koľ, J. Immunol. 154: 33-46, 1995). V mikrotitračnej doštičke s 96 jamkami boli pripravené série zriedení hLT-al/p2, hTNF a hLT-α po 0,05 ml a bolo pridaných 5000 buniek HT29 (ATCC) ošetrených trypsmom v 0,05 ml média obsahujúceho 80 U/ml (antivírusových jednotiek) hu-IFN-γ. Po 4 dňoch bola meraná mitochondriálna redukcia MTT nasledujúcim spôsobom: Pridalo sa 10 pl MTT a po 3 hodinách sa redukované farbivo nariedilo 0,09 ml izopropanolu s lOmM HC1 a merala sa O. D. pri 550 nm. Rozpustné receptorové formy čistého ľudského IgG sa pridali v 10 pl pred pridaním buniek tak, aby výsledná koncentrácia bola 5 pg/ml.

Tab. 1 porovnáva schopnosť hLT-p-R-Fc a p55-TNF-R-Fc chimér (a s ľudským IgG ako kontrolou) blokovať inhibičné pôsobenie rôznych rozpustných TNF a LT ligandov na rast nádorových buniek HT29.

Tab. 1 Koncentrácia cytotoxického agensu vedúca k 50 % inhibícii rastu v prítomnosti agensu“:

cytotoxický agens	hu-IgG kontrola	p55-TNF-R-Fc	LT-P-R-Fc
TNF	0,08	>10b	0,08
LT-a	3	>1000	3
LT-al/p2	5	5	>200

^a Každý cytotoxický agens bol zmiešaný s Ig fúznym proteínom 10 minút pred pridaním k bunkám. Výsledná koncentrácia fuzneho proteínu bola 5 pg/ml.

^b Vyššie koncentrácie neboli testované.

Údaje v tab. 1 ukazujú, že rozpustný ľudský fúzny proteín hLT-P-R-Fc účinne blokuje interakciu medzi LT ligandmi (al/p2) a bunkovými povrchovými LT-P receptormi, a teda je agens blokujúci LT-P-R podľa predkladaného vynálezu.

Rozpustný fuzny proteín TNF-R (p55-TNF-R-Fc) podľa očakávania úplne blokoval TNF-indukovanú inhibíciu rastu tým, že naviazal TNF a tak zabránil jeho interakcii s povrchovými TNF receptormi. Rozpustný TNF receptor nijako neovplyvňoval antiproliferačný účinok spôsobený LT ligandom. Naopak, LT-p-R-Fc blokoval cytotoxický účinok indukovaný LT ligandom, ale neovplyvnil účinok TNF ani LT-α. Rozpustný ľudský fuzny proteín LT-^-R neinterferuje s aktiváciou TNF-R pôsobením TNF a LT-α ligandov.

Príklad 4

Použitie rozpustného myšieho ΕΤ-β-R-Fc na blokovanie interakcie myších LT-β receptorov s ligandmi

Rozpustný myší LT-β receptor spojený s ľudskou doménou IgGl (mLT-p-R-Fc, pozri príklad 2) bol testovaný na schopnosť blokovať interakciu LT ligandov a LT-β receptorov myší v teste cytotoxicity myších buniek (obr. 2). Test cytotoxicity bol uskutočnený na bunkách WEHI 164 v podstate rovnakým spôsobom, ktorý bol použitý v teste s HT29 bunkami v príklade 3 (pozri tiež Browning a Ribolini, J. Immunol. 143: 1859-1867, 1989).

Obr. 2 ukazuje vplyv mLT^-R-Fc na ligandom indukovanú signálnu dráhu v myších bunkách WEHI 164. Bunky WEHI 164 sú usmrtené po ošetrení LT-α/β ligandom s koncentráciou v rozmedzí od 1 do 100 ng/ml. Rozpustný mLT-P-R-Fc (10 μ/ml) blokuje LT ligandom aktivovanú bunkovú smrť. Pridanie rozpustného myšieho fuzneho proteínu p55-TNF-R-Fc alebo kontrolnej IgG protilátky (všetko 10 μ/ml) má malý alebo žiadny vplyv na blokovanie bunkovej smrti. Údaje ukazujú, že rozpustný fuzny proteín mLT-P-R-Fc účinne súťaží s povrchovými molekulami ΕΤ-β-R o naviazanie LT ligandu. Tieto výsledky tiež ukazujú, že cytotoxicita indukovaná LT-α/β je sprostredkovaná ΕΤ-β-R a je inhibovaná rozpustným mLT^-R-Fc, ktorý pôsobí ako agens blokujúci ίΤ-β-R podľa predkladaného vynálezu.

Príklad 5

Použitie protilátok proti ľudskému ΕΤ-β-R na blokovanie LT-β receptora s ligandom

Myšie monoklonálne protilátky namierené proti ľudským LT-β receptorom boli pripravené opakovanou intraperitoneálnou imunizáciou RBF myší fúznym proteínom získaným z CHO buniek, nachytaným na perličky proteín-A-sepharózy (Pharmacia) v neprítomnosti adjuvansu. Zvieratá boli nakoniec stimulované rozpustným hLT-P-R-Fc, tak i.p. ako aj i.v., bunky sleziny boli potom fuzované podľa klasického spôsobu. Supematanty z hybridómov boli testované použitím ELISA testu (Ling a kol., J. Interferon and Cytokine Res. 15: 53-59, 1995). Supernatanty z hybridómov boli ďalej testované na svoju schopnosť blokovať viazanie aktivovaných hybridómových buniek 11-23, ktoré exprimujú povrchový ΕΤ-α1/β2, k doštičkám povlečeným LT-p-R-Fc spôsobom „ryžovania buniek,, (celí panning assay). Čisté monoklonálne protilátky boli získané prečistením IgG zo supematantu pomocou proteín-A-sepharózy (Pharmacia).

Na stanovenie toho, či monoklonálna protilátka anti-LT-P-R môže blokovať signálnu dráhu LT-P-R iniciovanú naviazaním rozpustných LT, bol vykonaný test cytotoxicity s ľudskými karcinómovými bunkami WiDr.

V mikrotitračnej doštičke s 96 jamkami boli pripravené rady sériových riedení LT-al/p2 po 0,05 ml a bolo pridaných 10 μΐ roztoku obsahujúceho 100 pg/ml buď kontrolnej myšej protilátky IgGl, alebo myšej monoklonálnej protilátky anti-LT-P-R. Do každej jamky sa potom pridalo 5000 buniek WiDr (ATCC) ošetrených trypsínom v 0,05 ml média obsahujúceho 50 U/ml (antivírusových jednotiek) hu-IFN-γ. Po 4 dňoch bola meraná mitochondriálna redukcia MTT nasledujúcim spôsobom: Pridalo sa 10 μΐ MTT a po 3 hodinách sa redukované farbivo nariedilo 0,09 ml izopropanolu s lOmM HC1 a merala sa O.D. pri 550 nm. Množstvo červeného farbiva je úmerné miere bunkového rastu.

Obr. 3 ukazuje, že monoklonálna protilátka BDA8 anti-LT-P-R pôsobí ako agens blokujúci LT-P-R podľa vynálezu. Ľudské karcinómové bunky WiDr prestávajú rásť v prítomnosti IFN-γ a rozpustného LT-al/p2 ligandu (v rozmedzí 0,05 až 50 ng/1). Kontrolná protilátka IgGl (10 pg/ml) nemá žiadny vplyv na inhibíciu rastu. Naopak, protilátka BDA8 anti-LT-p-R (10 pg/ml) obnovuje schopnosť buniek WiDr rásť v prítomnosti rozpustného ligandu LT-al/p2.

Príklad 6

Použitie protilátok proti ľudskému LT-β na blokovanie interakcie receptora s ligandom

Monoklonálne protilátky proti ľudskému LT-β boli pripravené imunizáciou myši RBF roztokom, získaným opláchnutím perličiek proteín-A-sepharózy-9E10-rLT-P-R, ktorý obsahoval 1 až 2 pg rekombinantného ľudského LT-β v CFA, po ktorom nasledovala jednorazová stimulácia tým istým materiálom v IFA. 8 týždňov po stimulácii sa myšiam i.v. podalo 30 pg prečisteného rozpustného rLT-β (kyslý eluát zo živice 9E10) a 20 pg rovnakého materiálu o dva dni neskôr. Jeden deň po druhej i.v. stimulácii boli bunky zo sleziny fúzované klasickým spôsobom, aby vytvorili monoklonálne protilátky. Supematnaty hybridómov boli testované priamou ELISA alebo FACS farbením PMA-aktivovaných IL-23 buniek . Čisté monoklonálne protilátky boli získané prečistením IgG zo supematantu pomocou proteín-A-sepharózy (Pharmacia).

Testovanie pomocou FACS sa použilo na výber protilátok namierených proti LT-β, ktoré účinne blokujú väzbu LT-α/β ligandu k LT-β receptorom na povrchu buniek, a tým napodobujú interakciu medzi dvoma bunkami in vivo. V tomto teste sa rozpustné ľudské Ι.Τ-β-R-Fc (2 pg/ml) nechali naviazať na povrchové LT ligandy PMA-aktivovaných buniek 11-23 (Browning a kol., J. Immunol. 154: 33-46, 1995) v prítomnosti zvy5 šujúcej sa koncentrácie testovanej protilátky anti-LT-β (od 0,02 do 20 pg/ml). Bunky boli opláchnuté a naviazaný LT^-R-Fc bol detegovaný reakciou s oslím protiľudským IgG značeným fykoerytrínom. Množstvo naviazanej fluorescenčnej značky bolo stanovené pomocou FACS analýzy a priemerná intenzita fluorescencie bola vynesená do grafu.

Obr. 4 ukazuje výsledky FACS analýzy, ktorá merala schopnosť protilátok B9 anti-LT-β blokovať inter10 akciu LT-β receptora s ligandom. Pokus ukazuje, že monoklonálna protilátka B9 anti-LT-β (0,02 až 5 pg/ml) špecificky a účinne súťaží s rozpustným fuznym proteínom Ι.Τ-β-R (2 pg/ml) o naviazanie LT ligandov bunkového povrchu, a teda sa zaraďuje medzi agensy blokujúce LT-P-R podľa predkladaného vynálezu.

Príklad 7

Použitie protilátok proti myšiemu LT-α/β na blokovanie interakcie receptora s ligandom

Rozpustné myšie komplexy LT-a/á boli pripravené rovnako ako ľudské rozpustné komplexy LT-α/β, čo bolo opísané. Rozpustné myšie podjednotky LT-a/á boli pripravené na základe už skôr publikovanej sekvencie (Lawton a kol., J. Immunol. 154: 239-246, 1995). Rozpustné myšie komplexy LT-a/á boli exprimované pomocou bakulovírusu v hmyzom expresnom bunkovom systéme a komplexy LT-a/á potom boli izolované 20 afmitnou chromatografiou na kolónach s ľudským p55 TNF-R a LT-á-R v podstate rovnako, ako boli exprimované a prečistené ľudské komplexy, čo je opísané. Arménske škrečky boli imunizované prečisteným rozpustným myším komplexom LT-α/β v podstate rovnako, ako je opísané v príklade 6. Bunky sleziny škrečkov boli fuzované s myšími hybridómovými bunkami P3X podľa publikácie Sanchez-Madrid a kol. (Methods of Enzymology 121: 239-244, 1986). Hybridómy boli rozdelené do dvoch skupín, anti-mLT-á alebo anti-mLT25 a, podľa charakteristík väzby buď s komplexmi LT-a/á, alebo so samotnou LT-α. Hybridómové bunky boli namnožené a protilátky boli prečistené zo supemantantu pomocou afinitnej chromatografie s proteínom A (Pharmacia).

Po hodnotení toho, či škrečie protimyšie monoklonálne protilátky LT-α a LT-β môžu blokovať väzbu LT ligandu s mLT-á-R, boli použité bunky TIMI-4 (ATCC), myšie T bunky exprimujúce povrchový LT ligand 30 po aktivácii PMA po 7 hodinách. Škrečie monoklonálne protilátky anti-mLT-α a anti-mLT-β boli preinkubované 30 minút s bunkami pri 4 °C a potom dvakrát opláchnuté. Opláchnuté bunky boli potom inkubované s 1 pg/ml mLT-p-R-Fc pri 4 °C. Po 30 minútach bol nenaviazaný mLT^-R-Fc opláchnutý a bunky boli inkubované 30 min. s 10 pg/ml oslieho protiľudského IgG značeného fykoerytrínom, aby sa stanovil naviazaný mLT^-R-Fc. Množstvo naviazanej fluorescenčnej značky bolo stanovené pomocou FACS a bola vypočítaná 35 priemerná intenzita fluorescencie.

Analýzou sa zistilo, že škrečie monoklonálne protilátky anti-mLT-á účinne blokujú väzbu rozpustných LT-β receptorov s povrchovými LT ligandmi T buniek. Výsledky ukazuje tab. 2.

Tabuľka 2. Schopnosť protimyších monoklonálnych protilátok LT-β inhibovať väzbu mLT^-R-Fc s myšími 40 povrchovými LT ligandmi.

Koncentrácia protilátky (pg/ml)	Anti-mLT-á (BB.F6)	Anti-mLT-α (AF.B3)
	MFCIb	% inhibc	MFCIb	% inhibc
0	6	-	6	-
0	85	0	85	0
0,01	71	18	84	2
0,03	67	23	86	0
0,1	51	44	86	0
0,3	36	62	84	2
1	29	71	89	0
3	17	86	88	0
10	11	94	95	0
30	10	95	94	0
100	8	98	92	0

^a nebol pridaný nijaký receptor ^b priemerná hodnota fluorescencie v kanále ^c percento inhibície

SK 286409 Β6

Príklad 8

Agens blokujúci LT-P-R inhibuje kontaktnú precitlivelosť sprostredkovanú Thl bunkami pri myšiach

Samice Balb/c myší s hmotnosťou 20 g (Jackson Laboroatoires, Bar Harbor, ME) boli senzibilizované aplikáciou 25 μΐ 0,5 % 2,4-dinitrofluórobenzénu (DFNB) v zmesi acetónu a olivového oleja 4 : 1 (objem : objem) do chodidla zadnej nohy. Za 24 hodín po prvej senzibilizácii boli myši senzibilizované znovu 25 μΐ toho istého roztoku. Senzibilizácia bola uskutočnená bez anestézy. Piaty deň (t. j. 120 hodín po počiatočnej senzibilizácii) bola myš podrobená anestézii i.p. injekciou katemínu:xylazínu (90:10 mg/kg) a bola jej aplikovaná podprahová dávka 10 μΐ 0,2 % DNFB na dorzálny a ventrálny povrch ľavého ucha. Na pravé ucho bolo aplikované vehikulum acetón : olivový olej 4 : 1 (objem : objem). Štyri hodiny po vyprovokovaní imunitnej odpovede boli myšiam injikované i.v. dávky mLT-p-R-Fc s rastúcou koncentráciou (0,08 až 5,0 mg/kg, príklad 2) v 0,01 ml fyziologického roztoku pufrovaného fosfátom (PBS). Injekcia samotného PBS alebo 20 mg/kg ľudského fuzneho proteínu IgG (LFA3-Fc) slúžili ako negatívna kontrola (Miller a kol., J. Exp. Med. 178: 211-222, 1993). Injekcia 8 mg/kg monoklonálnej protilátky špecifickej pre anti-VLA4 (PS/2, Chisolm a kol., Eur. J. Immunol. 23: 682-688, 1993), ktorá je známa tým, že inhibuje CHS blokovaním vstupu T buniek do miesta provokácie, slúžila ako pozitívna kontrola. Na aplikáciu jednej koncentrácie protilátky bola použitá skupiny štyroch až ôsmych myší.

Dvadsaťštyri hodín po provokácii boli myši znovu podrobené anestézii zmesou ketamímxylazín a bola meraná hrúbka oboch uší technickým mikrometrom s presnosťou na 0,00254 mm (10*⁴ palca). Opuch ucha ako odpoveď pri každej myši bol stanovený ako rozdiel medzi hrúbkou kontrolného ucha a ucha provokovaného DFNB. Typické neinhibované odpovede boli v rozmedzí 3,74 až 4,33 x 10’⁴ mm (95 až 110 x 10'⁴ palca). Inhibícia opuchu ucha bola posúdená porovnaním ošetrenej skupiny s negatívnou kontrolnou skupinou. Štatistická významnosť rozdielu medzi skupinami bola hodnotená jednosmernou analýzou rozptylu, po ktorej nasledoval počítačový Turkey-Kramerov test významnosti rozdielu (JMP, SAS Inštitúte) pre p<0,05.

Obr. 5 ukazuje, že podávanie rastúcich koncentrácií mLT-P-R-Fc významne redukovalo opúchanie ucha pri myšiach ošetrených DNFB v porovnaní s neinhibovanými myšami ošetrenými DFNB (PBS a LFA3-Fc). Rozpustný ΕΤ-β-R (v rozmedzí 1 až 5 mg/kg) blokuje kontaktnú DTH reakciu rovnako účinne ako inhibujúca monoklonálna protilátka špecifická proti anti-VLA4. V časti testu nedošlo k inhibícii opuchu, čo bolo spôsobené zrejme nešpecifickou interakciou granulocytov.

Príklad 9

Model zápalovej črevnej choroby (inflammatory bowel disease, IBF) s roztokom dextránsulfátu (DSS)

Myši boli ošetrené hLFA3-Ig tak, ako je vysvetlené v opise obrázka, t. j. kontrolným Ig fuznym proteínom alebo ml.TpR-lg intraperitoneálnou injekciou. Nultého dňa bola pitná voda nahradená 5 % roztokom dextránsulfátu (DSS), ktorý bol myšiam ponechaný na pitie počas jedného týždňa. O týždeň neskôr, t. j. dva týždne od začiatku podávania DSS, boli myši usmrtené a bola zistená zmena hmotnosti a zmeraná dĺžka hrubého čreva (od konečníka po slepé črevo). Obr. 6 ukazuje zmeny hmotnosti a dĺžky čreva pri rôznych ošetreniach. Skrátená dĺžka čreva rovnako ako strata hmotnosti ukazujú na IBD. Zistilo sa, že ošetrenie mLTpR-Ig dramaticky zabránilo skráteniu hrubého čreva a strate hmotnosti, čo dokazuje účinnosť.

Obr. 6. Zmeny hmotnosti pozorované 14 dní po začiatku pridávania DSS do pitnej vody pri rôznych ošetreniach. LTBr a LFA3 znamenajú fúzne proteíny mLTpR-Ig a hLFA3-Ig, ktoré boli podané intraperitoneálnou injekciou v množstve 100 pg týždeň pred pridaním DSS, priamo v čase podania DSS a tiež 1 týždeň neskôr (t. j. š injekcie v týždni -1, 0 a 1). V skupine bolo 10 zvierat. Veh znamená vehikulum.

Obr. 7. DÍžka hrubého čreva 14 dní po začiatku pridávania DSS do pitnej vody pri rôznych ošetreniach rovnako ako na obr. 6.

Príklad 10

IBD model CD45RB^vys/scid

CD4 pozitívne T bunky boli izolované zo samíc myší C.B-17 pomocou technológie magnetických perličiek, ako už bolo opísané skôr (Powrie, F. a kol., Intemational Immunology 5: 1461-1471, 1993). CD4 bunky zbavené CD8 pozitívnych buniek, B bunky a monocyty boli rozdelené pomocou metódy triedenia fluorescenčné aktivovaných buniek (FACS) na dve populácie, CD45RB^vysoký a CD45RB”'^zky v podstate tak, ako je opísané. 5x10⁵ buniek CD45RB bolo intravenózne injikovaných do samíc scid myší C.B.-17 a potom bola sledovaná telesná hmotnosť. Je vidieť, že hmotnosť myši rekonštituovaných bunkami CD45RB^nizty pribúdala normálne. Naopak, zvieratá, ktoré dostali bunky CD45RB^vystll<l strácali časom hmotnosť a po 10 týždňoch boli blízko smrti. Keď kontrolné myši stratili približne 20 % svojej počiatočnej hmotnosti, boli usmrtené a rôzne orgány boli histologický vyšetrené. Typické choré zviera vyzeralo kachektické, malo hnačku a dramaticky zväčšené hrubé a slepé črevo. Zvieratá ošetrené hLFA3-Ig, ako je vysvetlené v opise obrázka 8, boli podobné neošetreným zvieratám, zatiaľ čo zvieratá ošetrené mLTPR-Ig nemali úbytok hmotnosti, mali normálnu veľkosť hrubého čreva a nemali masívny zápalový infiltrát typicky pozorovaný v hrubom čreve. Obr. 8 ukazuje časový priebeh hmotnostných strát pri zvieratách s injikovanými bunkami CD45RB^vysoky po rôznych ošetreniach a obr. 9 ukazuje konečnú telesnú hmotnosť 8 týždňov po injekcii. Účinok mLTfiR-Ig v dvoch veľmi odlišných modeloch IBD, t. j. modeli CD45RB a dextránsulfátovom modeli, predstavuje silný dôkaz o skutočnom účinku tohto ošetrenia na imunitný systém.

Obr. 8. Časový priebeh telesnej hmotnosti po injekcii CD4 pozitívnych T buniek CD45RB do scid myší. Každá krivka predstavuje jedno zviera a opis ukazuje, aké bunky boli injikované, t. j. CD45RR’^y5oky alebo CD45RB^nlzlcy, a povahu ošetrenia. Zvieratám bolo intraperitoneálne infikovaných 100 pg proteínu týždenne. Ošetrovanie začalo 2 týždne pred injekciou buniek a pokračovalo po celý čas pokusu.

Obr. 9. Priemer a smerodajná odchýlka telesnej hmotnosti po rôznych ošetreniach pozorovaná po 10 týždňoch po transplantácii (v jednej skupine 5 až 6 zvierat).

Príklad 11

Model precitlivelosti neskorého typu SRBC

Samice myší balb/c boli senzibilizované subkutánnou injekciou 2x10⁷ opláchnutých ovčích červených krviniek (SRBC) v PBS. Po 5 dňoch boli myši provokované injekciou lxlO⁸ SRBC v PBS do pravého chodidla (subplantárnou injekciou). V rôznych časoch po injekcii bola kaliperom meraná hrúbka chodidla. Obr. 10 ukazuje veľkosť opuchu chodidla myší ošetrovaných intraperitoneálnou injekciou mLTfiR-Ig. Ošetrenie mLTpR-Ig buď v okamihu senzibilizácie, alebo tak pri senzibilizácii, ako pri provokácii, inhibovali SRBC indukovanú DTH odpoveď.

Obr. 10. Zväčšenie hrúbky chodidla merané 18 hodín po provokačnej injekcii SRBC. Druhy ošetrenia sú: injekcia PBS ako negatívna kontrola, protilátka PS/2, ktorá blokuje VLA4 interakcie a nasmerovanie buniek, ako pozitívna kontrola a mLTfiR-Ig (100 ug v intravenóznych injekciách) podané buď bezprostredne pred senzibilizáciou subkutánnou injekciou SRBC, v okamihu provokácie, alebo v oboch týchto časoch.

Priemyselná využiteľnosť

Predkladaný vynález poskytuje farmaceutický prípravok a spôsob liečenia imunologických ochorení tak, že používa látku blokujúcu LT-fi-R, a tým inhibuje príslušnú signálnu dráhu.

Prípravok podľa vynálezu bude užitočný na liečenie alebo prevenciu diabetu závislého od inzulínu, na liečenie imunologických ochorení sprostredkovaných lymfocytmi a hlavne na potlačenie imunitnej odpovede sprostredkovanej Thl bunkami, ako je napr. zápalový črevný syndróm. Prípravky obsahujúce ΤΓ-β-R-Ig alebo iné agensy, blokujúce interakciu ΤΤ-β-R s ligandom, môžu byť užitočné v celom rade ďalších imunologických ochorení.

Zoznam sekvencií (2) INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ SEQ ID NO: 1 (i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 197 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Druh vlákna:

(D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Opis sekvencie SEQ ID NO: 1:

Ser Gin Pro Gin Ala Val Pro Pro Tyr Ala Ser Glu Asn Gin

Thr Cys

Arg Asp Gin Glu

Lys Glu Tyr Tyr Glu

Pro Gin His Arg íle

Cys Cys

Ser Arg Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Val Ser

Ala Lys Cys Ser Arg íle

Arg Asp

Thr Val Cys Ala Thr

Cys Ala Glu Asn Ser Tyr Asn Glu His

Claims (12)

1. 5 PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použitie činidla blokujúceho lymfotoxín-beta receptor (LT-P-R) na prípravu farmaceutickej kompozície na liečenie imunologických chorôb vybraných zo skupiny sklerózy multiplex, sympatickej oftalmie, uveitídy, psoriázy, zápalového ochorenia čriev, reumatoidnej artritídy, odmietnutia tkaniva a odmietnutia orgánu

   10 u živočícha.
2. 2. Použitie podľa nároku 1, kde činidlo blokujúce LT-P-R je vybrané zo skupiny pozostávajúcej z: (a) z rozpustného receptora lymfotoxínu-P, výhodne obsahujúceho funkčnú sekvenciu aminokyselín vybraných z aminokyselín sekvencie SEQ ID NO: 1; (b) protilátky namierenej proti receptoru LT-P; a (c) protilátky namierenej proti povrchovému LT ligandu.

   15
3. 3. Použitie podľa nároku 1 alebo 2, kde činidlo blokujúce LT-P-R zahrnuje monoklonálnu protilátku namierenú proti LT-p-receptoru.
4. 4. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, kde činidlo blokujúce LT-P-R zahrnuje proti-ľudskú LT-P-R mAb BDA8.

   SK 286409 Β6
5. 5. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, kde činidlo blokujúce LT-P-R zahrnuje monoklonálnu protilátku namierenú proti povrchovému LT ligandu.
6. 6. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, kde činidlo blokujúce LT-p-R zahrnuje proti-ľudskú LT-β mAb B9.
7. 7. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, kde činidlom blokujúcim LT-P-R je fuzny proteín LT-P-R.
8. 8. Použitie podľa nároku 7, kde fuzny proteín LT-P-R ďalej obsahuje funkčnú sekvenciu aminokyselín vybraných z aminokyselín SEQ ID No: 1 a farmaceutický prijateľný nosič.
9. 9. Použitie podľa nároku 7, kde fuzny proteín LT-P-R zahrnuje doménu viažucu ligand LT-p-R, ktorá sa môže selektívne viazať na povrchový LT ligand.
10. 10. Použitie podľa nároku 7, kde fuzny proteín LT-P-R ďalej zahrnuje jednu alebo viac heterológnych proteínových domén.
11. 11. Použitie podľa nároku 10, kde uvedená heterológna proteínová doména zahrnuje doménu Fc ľudského imunoglobulínu.
12. 12. Použitie podľa nároku 11, kde uvedená heterológna proteínová doména je vybraná zo skupiny zo sérového albumínu, lipoproteínov, apolipoproteínov a transferinu.