JPH04197196A - ヒトｉｌ―２レセプタ―重鎖に結合する新規モノクロ―ナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 ヒトＩ　Ｌ−２レセプター重鎖に結合し、ヒトＩＬ−２
のヒトＩＬ−２レセプター重鎖への結合、及びヒ）ＩＬ
−２の生理活性をともに阻害する活性を有するモノクロ
ーナル抗体に関する０本発明のモノクローナル抗体は、
単独あるいはヒトＩＬ−２レセプター軽鎖に結合する抗
体と併用することにより、臓器移植時の拒絶反応の予防
や自己免疫疾患の治療に適応できる免疫抑制剤として有
用な物質である。尚、本発明においてはインターロイキ
ン２をＩＬ−２とインターロイキン２受容体をＩＬ−２
レセプターと略することになる。

〔従来の技術〕

臓器移植の外科的技術が著しく向上した現在、臓器移植
手術の成否は術後の移植片拒絶反応をいかにして抑制で
きるかに換言されてきている。拒絶反応は、生体が移植
片を異物として認識し、それを排除するために一連の免
疫反応が惹、起されることにより生じる。そこで、従来
より拒絶防止薬として、ステロイド剤、アザチオプリン
、メトトレキセード、６−メルカプトプリンなどのいわ
ゆる免疫抑制剤と呼ばれている薬剤の投与が行われてき
た。しかし、安全域が狭いこと、あるいは効果が弱いこ
となどの理由で生着率の著しい向上はみられなかった。

ところが、近年開発されたサイクロスポリンＡの登場に
より、生着率は格段の向上をみるようになった。しかし
ながら、サイクロスポリンＡには重篤な腎毒性があるこ
とが明らかとなり、その使用の制限を与儀なくされてき
ている。したがって、より安全で、かつ効果的な免疫抑
制剤の開発が望まれてきている。

ところで、ＩＬ−２は、ヘルパーＴ細胞から産出される
タンパク質であり、生体内においてキラーＴ細胞の増殖
や分化誘導、Ｂ細胞の分化誘導など、広汎な働きを有し
ている生体防御上非常に重要な因子である。Ｎ器移植や
骨髄移植においては、移植片の生着の鍵を握ると考えら
れている宿主対移植片反応（ＨＶＧ反応）、あるいは移
植片対宿主反応　（ＧＶＨ反応）に、ＩＬ−２などによ
り活性化されたキラーＴ細胞が深く関与していることが
示されている。他方、自己免疫疾患は生体内での免疫系
のバランスがくずれ、生体自身を攻撃することにより発
症すると考えられており、その中でも特にＩ　Ｌ−２を
はじめとする免疫系に関与する因子の過剰産生、あるい
はそれに対する過剰反応などがその大きな一因となって
いる可能性が高い。

これらのことから、ＩＬ−２の関与する生体応答を選択
的かつ効果的に抑制することができれば、臓器移植時の
拒絶反応の予防や、自己免疫疾患の治療が可能となるも
のと考えられるようになった。

事実、Ｉ　Ｌ−２レセプターを有しているＩＬ−２応答
細胞を選択的に傷害する細胞毒を結合させたＩ　Ｌ−２
を、自己免疫疾患の動物モデルの一つであるアジュバン
ト関節炎ラットに投与すると、関節炎の発症が遅れ症状
も軽くなり（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ　ｔｈｅ　Ｎ
ａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃ
ｅ　ｏｆ　Ｕ、Ｓ、Ａ、。

８６巻、２８７頁、１９８９年）、またマウス同種心臓
移植時に投与すると移植心臓の拒絶が抑制される（Ｐｒ
ｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ
　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｕ、Ｓ
、Ａ、＋８６巻、１００８頁、１９８９年）、シかし、
細胞毒を結合させたＩＬ−２はその血中半減期が短く、
効果をあげるためには大量に投与する必要があり、それ
に伴う副作用が懸念される。

そこで、より安全でかつ有効なＩＬ−２応答を制御でき
る薬剤の開発が望まれている。

ところで、ヒトＩ　Ｌ−２応答細胞上のヒトＩＬ−２レ
セプターは、ともにヒトＩ　Ｌ−２との結合能を有する
分子量が約７５．０００の重鎮と約５５．０００の軽鎖
の２つの糖タンパク質分子からなることが知られている
（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ　ｏｆ
υ、Ｓ、Ａ、、８４巻、２００２頁、１９８７年）。

それぞれの分子とヒトＩＬ−２との結合の解離定数は、
軽鎖の場合１０−”Ｍ、重鎮の場合１０−’Ｍであるが
、軽鎖と重鎮の両方の分子が接してＩＬ−２との三者の
会合体が形成された場合には、解離定数が１０−”　Ｍ
という高親和性の結合となることが明らかになっている
。また、軽鎖のみを発現している細胞では、ヒトＩ　Ｌ
−２が結合してもなんら応答反応が生じないが、重鎖、
又は重鎮と軽鎖の重鎖を発現している細胞では、ヒトＩ
Ｌ−２の結合により様々な生理活性が惹起されることか
ら、ヒ）ＩＬ−２の生理的機能が発現されるためにはヒ
トＩ　Ｌ−２レセプターの重鎮の存在が必須であると考
えられるようになったきた（実験医学、６巻、６０６頁
、１９８８年）、すなわち、ヒト■Ｌ−２と重鎮の結合
を阻害できれば、ヒトＩＬ−２に対する応答が生じなく
なるものと推定される。

ヒトＩ　Ｌ−２とヒトＩ　Ｌ−２レセプターの重鎮の結
合を阻害するものとして、ヒトＩＬ−２レセプターの重
鎮に結合活性を有する抗体が考えられる。

実際、ヒトＩＬ−２レセプターの重鎮に結合してヒトＩ
Ｌ−２レセプターの重鎮とヒトＩ　Ｌ−２との結合を阻
害する活性を有する抗体は既にいくつか報告されている
（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏ
ｎａｌＡｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ　ｏｆ　
Ｕ、Ｓ、Ａ、＋８６巻、１９８２頁、１９８９年、Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄ
ｉｃｉｎｅ。

１６９巻、１３２３頁、１９８９年）。

また本発明者等も以前にヒトＩＬ−２レセプターの重鎮
とヒ）ＩＬ−２の結合を阻害する活性を有する抗体（モ
ノクローナル抗体ＴＵ２７（ハイブリドーマＦＥＲＭ　
　ＢＰ−２５１０が産出するモノクローナル抗体））を
報告している（特開平２−２００１９８参照）。しかし
、それらの抗体を通常の濃度で加えると、ヒトＩ　Ｌ−
２とヒトＩＬ−２レセプター重鎖との結合は阻害される
にもかかわらず、ヒ）ＩＬ−２による生理活性は阻害さ
れないことが明らかとなった。この理由として、それら
の抗体の重鎮分子への結合親和性が低く、生理的条件下
で培養中に次々と細胞表面上に新生されてくる重鎮分子
と、軽鎖分子との会合による高親和性のレセプターの形
成を阻害することができないためと考えられる。したが
って、これらの抗体を患者に投与しようとすると、血中
濃度を著しく高濃度に保つ必要があり、副作用が懸念さ
れ、実際には臨床応用は不可能である。この問題点を解
決するためには、非常に高親和性をもって、ヒトＩＬ−
２レセプターの重鎮分子に結合する抗体を用いるか、更
に望ましくは、そのような抗体とヒトＩＬ−２レセプタ
ーの軽鎖に結合する抗体を併用することにより、ヒトＩ
Ｌ−２の高親和性の結合を阻害する必要がある。しかし
、ヒトＩ　Ｌ−２レセプター重鎖に高親和性をもって結
合し、単独でヒトＩＬ−２の生理活性を阻害する活性を
有する抗体については現在まで知られておらず、まして
やそのような抗体とヒトＩＬ−２レセプター軽鎖に結合
する抗体を併用する治療薬については、全く知られてい
ない。

ｃ本発明が解決しようとする課題〕 したがって本発明の目的は、高親和性をもってヒトＩ　
Ｌ−２レセプターに結合し、ヒトＩ　Ｌ−２とヒトＩ　
Ｌ−２レセプター重鎮との結合のみならず、ヒ）　Ｉ　
Ｌ−２の生理活性をも阻害する活性を有するモノクロー
ナル抗体を提供することである。

本発明のモノクローナル抗体は、単独又はヒトＩＬ−２
レセプター軽鎖に結合する抗体と併用することにより、
臓器移植時の拒絶反応の予防や自己免疫疾患の治療に有
用な免疫抑制剤として期待できる。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、上記課題を解決するために、ヒ）　Ｉ　
Ｌ−２レセプターの重鎮に結合するモノクローナル抗体
を多数作成し、更にその中から高親和性をもってヒトＩ
　Ｌ−２レセプターの重鎮分子に結合し、ヒトＩＬ−２
の生理活性を阻害できる抗体を選択することにより本発
明を完成するに至った。すなわち本発明に従えば、高親
和性をもってヒトＩ　Ｌ−２レセプター〇重鎖分子に結
合し、ヒ）ＩＬ−２の生理活性を阻害できるモノクロー
ナル抗体を産出するハイブリドーマ、及び該ハイブリド
ーマが産出する性状の均一なモノクローナル抗体が提供
される。

本発明のハイブリドーマは、骨髄腫細胞と、ヒ）　Ｉ　
Ｌ−２レセプターの重鎮を高発現しているヒト細胞で免
疫された動物の肺臓、またはリンパ節の細胞中に存在す
る抗体産生細胞とのハイブリドーマを作成し、このハイ
ブリドーマを培養及びクローン化して、ヒトＩ　Ｌ−２
レセプターの重鎮分子に結合し、ヒ）ＩＬ−２の生理活
性を阻害できるモノクローナル抗体を産生ずるクローン
とじて選択されるものである。

目的とするモノクローナル抗体は、このようなりローン
を培養した上清から、塩析、イオン交換クロマトグラフ
ィーなどの精製操作により回収できる。また、大量に取
得する場合には、得られたハイブリドーマを、組織適合
性動物、あるいは胸腺欠損ヌードマウスなどの腹腔内に
接種して増殖させ、該動物の腹水中に産生されたモノク
ローナル抗体を回収して、同様の操作にて精製すればよ
い。

以下にこのヒトＩ　Ｌ−２レセプターの重鎮分子に結合
し、ヒトＩＬ−２の生理活性を阻害できるモノクローナ
ル抗体の調製法を記す。

ハイブリドーマは骨髄腫細胞と抗体産生細胞を融合する
ことにより製造される。抗体産生細胞としては、ヒトＩ
　Ｌ−２レセプターの重鎮分子を高発現しているヒト成
人Ｔ細胞白血病つィルス感染Ｔ細胞株であるＴＬ−Ｍａ
ｒ細胞で免疫されたマウスやラットなどの動物からの肺
臓またはリンパ節細胞を用いればよい。なお、免疫する
細胞としては、ヒ）ＩＬ−２レセプターの重鎮分子を発
現しているヒト細胞である限り、いかなる細胞を用いて
もかまわない。また、それらの細胞より精製した重鎮分
子そのものを免疫原として用いてもさしつかえない。

抗体産生細胞と骨髄腫細胞の由来する動物の種は、両細
胞が融合可能な限り異なってもよいが、通常同一種の細
胞を用いた方が良い結果が得られる。本発明実施のため
の一つの好ましいノ＼イブリドーマは、ヒト成人Ｔ細胞
白血病つィルス感染Ｔ細胞株であるＴＬ−Ｍａｒ細胞で
免疫したマウスの肺臓細胞またはリンパ節細胞と、マウ
ス骨髄腫細胞との間のハイブリドーマである。例えば、
生理食塩水に懸濁したＴＬ−Ｍａｒ細胞で免疫したＢａ
１ｂ／ｃマウスの肺臓細胞とＢａ１ｂ／ｃマウスの骨髄
腫細胞ＳＰ２１０−Ａｇ１４の間のハイブリドーマで後
記の実施例でも示す様に優れた結果が得られた。骨髄腫
細胞としては、ＳＰ２１０−Ａｇ１４（７）ほかに、Ｘ
６３−Ａｇ８−６．５．３．　Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−
Ｕｌ、　Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．　Ｐ３−ＮＳＩ／１−
Ａｇ４−１．　ＭＰＣＩＩ−４，５，６゜ＴＧ、１．７
．　（以上マウス細胞）　、２１０．ＲＣＹ、Ａｇ１．
２．３゜（ラット細胞）　、５ＫＯ−００７，ＧＨ１５
００６ＴＧ−Ａ１２　（以上ヒト細胞）等の８アザグア
ニン耐性の細胞株を用いてもよい。ハイブリドーマの作
成と、更にその中からヒトＩＬ−２レセプターの重鎮分
子に結合し、ヒトＩ　Ｌ−２の生理活性を阻害できるモ
ノクローナル抗体を産生しているクローンの選択は、例
えば次の様にして行える。ポリエチレングリコール、あ
るいはセンダイウィルスなどを用いて抗体産生細胞と骨
髄腫細胞とを融合させる。融合したハイブリドーマのみ
が、ヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリンを含む
培地（ＨＡＴ培地）中で生育することができる゛。得ら
れたハイブリドーマがすべて抗体を産生じているわけで
はないし、抗体を産生じているハイブリドーマがすべて
目的とする抗体を産生しているわけではないので、それ
らのハイブリドーマクローンの中からヒトＩ　Ｌ−２レ
セプターの重鎮分子に結合し、ヒト’ＩＬ−２の生理活
性を阻害できるモノクローナル抗体を産生じているハイ
ブリドーマクローンを選択しなければならない。

その選択は例えば以下の様な方法を用いて行うことがで
きる。すなわち、−次スクリーニングとして１２５７標
識ヒトＩＬ−２を作成し、ハイブリドーマ培養上清によ
る１２Ｓｉ標識ヒトＩＬ−２と！：：）ＩＬ−２レセプ
ターの重鎮分子、及び軽鎖分子をともに発現しているＴ
Ｌ−Ｍａｒ細胞との結合阻害を測定する。二次スクリー
ニングとして、ハイブリドーマ培養上清によるＩｔｓ（
標識ヒトＩ　Ｌ−２と、ヒトＩ　Ｌ−２レセプターの軽
鎖のみを発現しているヒト成人Ｔ細胞白血病つィルス感
染Ｔ細胞株であるＭＴ−１細胞との結合阻害活性を測定
する。

ＴＬ−Ｍｏｒ細胞とヒ）　Ｉ　Ｌ−２との結合阻害活性
を有し、ＭＴ−１細胞とヒ）ＩＬ−２との結合阻害活性
を有していなければ、そのハイブリドーマがＩＬ−２レ
セプターの重鎮分子に対する抗体を産生じているハイブ
リドーマとなる。　ＩｚＳＩ標識ヒトＩＬ−２の作成法
としては、ヒトＩＬ−２が生理活性を有している限り、
ポルトン・ハンター法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｊｏ
ｕｒｎａｌ、１３３巻、５２９頁、１９７３年）、ラク
トパーオキシダーゼ法（Ｎａｔｕｒｅ、２６９巻、３０
９頁、１９７７年）、クロラミン−Ｔ法（Ｎａｔｕｒｅ
、　１９４巻、４９５頁、１９６２年）などいかなる方
法を用いてもかまわない。また、−次スクリーニングに
用いる細胞は、重鎖、及び軽鎖をともに発現しているヒ
ト細胞である限り、いかなる細胞を用いてもがまわない
。また、二次スクリーニングに用いる細胞も、重鎮、あ
るいは軽鎖のいづれか一方を発現しているヒト細胞であ
る限り、いかなる細胞を用いてもかまわない。こうして
得られたヒトＩ　Ｌ−２レセプターの重鎮に対するモノ
クローナル抗体を産生じている゛ハイブリドーマクロー
ンの培養上清を、更にヒトＩＬ−２とともにヒトＩＬ−
２に依存的に増殖するヒト成人Ｔ細胞白血病つィルス感
染Ｔ細胞株ＩＬＴ−Ｍａｔ細胞に加え、ＩＬＴ−Ｍａｔ
細胞の増殖阻害活性を測定する。増殖阻害活性を有して
いれば、そのハイブリドーマクローンが目的とするモノ
クローナル抗体を産生じているハイブリドーマクローン
ということになる。こうして得られたハイブリドーマと
して、例えばハイブリドーマＴＵ２５　（ＦＥＲＭ　Ｐ
−１１８５８）と呼ばれる細胞がある。

次に、モノクローナル抗体の大量調製法であるが、Ｔ　
Ｕ　２５　（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１８５８）細胞を、組織
適合性動物、あるいは胸腺欠損ヌードマウスなどの腹腔
内に接種して増殖させ、該動物の腹水中に産生された抗
体を回収して、塩析、イオン交換クロマトグラフィーな
どの操作により精製すればよい。

さて、こうして得られたモノクローナル抗体は、次のよ
うな性質を有するものである。

Ｔ　Ｕ　２５　（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１８５８）細胞が産
生ずる抗ヒ）　Ｉ　Ｌ−２レセプター重鎖モノクローナ
ル抗体（以後、モノクローナル抗体ＴＵ２５とする）（
ａ）　　免疫グロブリンの種類：ＩｇＧ２ｂ）分子量：
　１５０，０００ダルトン（ｃ）　　分子吸光係数：Ｅ
ｔｍ。、、　＝１４．０（ｄ）　　ヒトＩ　Ｌ−２レセ
プター重鎖に特異的に結合する。

（ｅ）　　ヒトＩＬ−２とヒトＩＬ−２レセプター重鎮
との結合を阻害する。

げ）　ヒ）ＩＬ−２の生理活性を阻害する。

このようにして製造したモノクローナル抗体ＴＵ２５は
、単独でヒ）ＩＬ−２の生理活性を阻害できることから
、単剤で、あるいは更にヒトＩＬ−２レセプターの軽鎖
に結合活性を有する抗体、例えば市販のモノクローナル
抗体２Ｒ１２（Ｔセルサンエンス社製）を併存させても
よい、更に他のサイクロポリンＡ他の免疫抑制剤や各種
安定化剤、各種賦型剤を本発明の免疫抑制剤に含有させ
ても良い。

これらの薬剤は臓器移植時の拒絶反応の予防、あるいは
自己免疫疾患の治療のための免疫抑制剤として使用でき
る。

本発明のヒトＩＬ−２レセプター重鎖モノクローナル抗
体と免疫抑制剤中通常０．１〜１００重量％、好ましく
は０．５〜７０重置％含有させれば良い。もちろん、上
記値に限定されるものではない。

また、上記免疫抑制剤の投与方法は経口、皮下注射、静
脈注射、及び静脈への点滴等のいずれの方法を用いて投
与しても良いが、好ましくは静脈注射、静脈への点滴に
より、投与するのが好ましい。

注射剤又は点滴剤として用いる場合には、例えば、細菌
やパイロジエンを含有せず、凍結乾燥状態にある本発明
に係る抗体を、用時日本薬局方注射用蒸留水に溶解する
。完全に溶解したことを確認し、自己免疫疾患に罹患し
た患者、あるいは臓器移植、骨髄移植手術を実施する予
定または手術完了、の患者に投与する− 投与経路は前述したように静脈内注射又は点滴が望まし
く、濃度や投与量は、患者毎あるいは患者の状況により
異なるが、ヒトＩ　Ｌ−２レセプターめ重鎮に結合する
抗体を単剤で用いる場合には、５〜２５０　ｍｇ／威の
濃度の抗体を１〜５０ｍｇ／　ｋｇ／日程度投与し、ヒ
トＩＬ−２レセプターの軽鎖に結合する抗体と併剤とす
る場合には、それぞれ５〜２５０　ｍｇ／ａｄ！の濃度
の抗体をそれぞれ１〜５０＋＋＋ｇ／ｋｇ／日程度とな
るように合剤として投与するのが適当である。くり返し
述べるが、上記投与量は一応の基準であって、それぞれ
の患者の状態に応じて適宜選択すれば良い。

本発明の免疫抑制剤の製剤化は、タンパク賞製剤におい
て、一般に行われている方法にしたがって行う。すなわ
ち、製剤分野において常用され、かつ本発明の免疫抑制
剤と反応しない物質であるゼラチン、ヒト血清アルブミ
ンなどの賦形剤として、グルタチオン、各種アミノ酸類
などを安定化剤として、更に必要に応じて緩衝側、保存
剤などを含有させてもよい。

本発明で使用する抗体は、抗体そのものでもよいが、抗
原との結合活性がある限り、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（
ａｂ）’ｚフラグメント、■領域のみのフラグメントな
どを使用してもさしつかえないし、Ｃ３ＪＩ域を他の種
のものに置き換えたキメラ抗体、抗体に他のポリペプチ
ドや細胞傷害性薬剤、金属結合体などを結合させたもの
でもかまわない。

以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。

（実施例１、ハイプリドーマ及びモノクローナル抗体の
調製） ６〜８週令の雌のＢａ１ｂ／ｃマウスに、生理食塩水に
懸濁したＴＬ−Ｍａｒ細胞を１匹あたりｌＸｌ０’個腹
腔的投与することにより免疫した。その１０日後、同様
の操作により追加免疫し、更にその５日後、マウスの眼
窩静脈より採血して、下記の方法に従って、′ｚ５１標
識ヒトＩ　Ｌ−２のＴＬ−Ｍａｒ細胞に対する結合阻害
活性を調べることにより抗体価を測定した。抗体価の高
かったマウスを更に同様の操作にて最終免疫し、その３
日後、肺臓を摘出して肺臓細胞とマウス骨髄種細胞（Ｓ
Ｐ２１０−Ａｇ１４）とを、５０％ポリエチレングリコ
ール＃　４０００　（牛丼化学社製）存在下にて細胞数
で１０：１の割合で混合し、細胞融合させた。融合細胞
を、１０％牛脂児血清（Ｇｉｂｃｏ社製）を含むＲＰＭ
１１６４０培地（Ｇ　ｉ　ｂｃｏ社製）にて５Ｘ１０ｈ
個／Ｉｄとなるように懸濁し、１穴あたり５Ｘ１０’個
のマウス胸腺細胞を含有する９６穴平底プレート（ｃｏ
ｒｎｉｎｇ社製）に１００ｐｆｆｉずつ分注した。１日
、２日、３日、６日後に培地の半量をヒボキサンチン、
アミノプテリン、チミジンを含む培地（ＨＡＴ培地）と
交換し、以後３日ごとに同様の操作を繰り返した。融合
より約２週間後、融合した細胞（ハイブリドーマ）の増
殖してきた各人の培養上清について、後述の参考例に示
す方法にて　皿２５Ｉ標識ヒトＩＬ−２のＴＬ−Ｍａｒ
細胞に対する結合阻害活性、及びＭＴ−１細胞に対する
結合阻害活性を測定し、ＴＬ−Ｍａｒ細胞に対する結合
阻害活性を有しており、ＭＴ−１細胞に対する結合阻害
活性を有していない穴に含まれるハイブリドーマを、限
界希釈法にてクローン化した。更にそれぞれのハイプリ
ドーマクローンの培養上滑中の阻害活性を測定して、抗
ヒトＩ　Ｌ−２レセプター重鎖抗体産生バイプリドーマ
を得た。更に、得られた抗と）　Ｉ　Ｌ−２レセプター
重鎖抗体産生ハイブリドーマの培養上清について、以下
の方法にてヒトＩ　Ｌ−２の生理活性の抑制能を調べた
。１０％牛脂児血清（Ｇｉｂｃｏ社製）を含むＲＰＭ１
１６４０培地（Ｇｉ−ｂｃｏ社製）にて２Ｘ１０’個／
ＩＩｌの濃度となるように懸濁したＩＬＴ−Ｍａｔ細胞
液を一穴あたり１００μｌずつ９６穴平底マイクロプレ
ート（コーニング社製）に分注して、サンプルの培養上
清を５０μｌ加え、３７℃、３０分間、インキュベート
した。

尚、ＩＬＴ−Ｍａｔ細胞はヒトＩＬ−２に依存的に増殖
するヒト細胞株である。更に、１０％牛脂児血清を含む
ＰＲＭｒ１６４０培地にて２００ｕｎ　ｉ　ｔｓ　／　
ａｌｌに調製したヒトリコンビナントＩＬ−２溶液を５
０ｕ　ｌずつ加えて、５％ＣＯ；存在下３７℃にて４８
時間培養した。

最後の４時間は１μＣｉの３Ｈ−チミジン（デュポン社
製）を加えて培養し、細胞内に取り込まれた放射活性量
をシンチレーションカウンター（パフカード社製）にて
測定することにより、培養上清ニヨるヒ）　Ｉ　Ｌ−２
の生理活性の阻害能を調べた。

このような方法にて選択されたハイブリドーマクローン
として、Ｔ　Ｕ　２５　（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１８５８）
がある。

ハイブリドーマＴ　Ｕ　２５　（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１８
５８）が産生ずるモノクローナル抗体ＴＵ２５の調製は
以下のようにして行った。あらかじめ１週間前に１匹あ
たり０．５ｍのプリスタン（和光純薬社製）を腹腔内注
射しておいた８週令の雌Ｂａ１ｂ／ｃマウスに、１匹あ
たりｌＸｌ０’個のハイブリドーマＴＵ２５（ＦＥＲＭ
　ｐ−ｘ１８５８）ラミ腔内注射シタ。おヨ＋１０日後
、マウス　腹腔内より腹水を採取し、遠心操作にて細胞
を取り除いた。０．４飽和硫安にて塩析を行い、０．１
５Ｍ　ＮａＣ１を含む１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７
，５）に対して透析した。あらかじめ０．１５ＭＮａＣ
１を含む１０１ｗＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）にて
平衡化しておいたプロティンＡセファロース（ファルマ
シア社製）に添加し、素通り画分を得た後、０．５　Ｍ
酢酸を用いて溶出した。溶出画分をただちに０．１５Ｍ
ＮａＣ１を含む１０ｎ＋Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，５
）に対して透析してモノクローナル抗体ＴＵ２５を得た
。

（実施例２、モノクローナル抗体ＴＵ２５単独、あるい
は抗ＩＬ−２レセプター軽鎖抗体共存下におけるＩＬ−
２依存性細胞株ｒＬＴ−Ｍａｔ細胞の増殖抑制効果） １０％牛脂児血清（Ｇｉｂｃｏ社製）を含むＰＲＭ１１
６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社製）にて２Ｘ１０’個／Ｉ１
１の濃度となるように懸濁したＩＬＴ−Ｍａｔ細胞液を
一穴あたり　１００ｕｌずっ９６穴平低マイクロプレー
ト（コーニング社製）に分注した。モノクローナル抗体
Ｔυ２５、マウスモノクローナル抗ヒトＩＬ−２レセプ
ター軽鎖抗体、公知のマウスモノクローナル抗ヒ）ＩＬ
−２レセプター重鎖抗体、及びコントロールのマウスモ
ノクローナル抗体を１０％牛脂児血清を含むＲＰＭ１１
６４０培地にて５０μｇ／ｄに調製し、モノクローナル
抗体ＴＵ２５、及びコントロールのマウスモノクローナ
ル抗体をそれぞれ単独、あるいはモノクローナル抗体Ｔ
Ｕ２５とマウスモノクローナル抗ヒトＩ　Ｌ−２レセプ
ター軽鎖抗体を混合した溶液を５０μｌ添加し、３７°
Ｃ１３０分間インキュベートした。更に、１０％牛脂児
血清を含むＰＲＭ１１６４０培地にて種々の濃度に調製
したヒトリコンビナントＩ　Ｌ−２溶液を５０μＩずつ
加えて、５％ＣＯ２存在下３７℃にて４８時間培養した
。最後の４時間は１ｕｃｉの３Ｈ−チミジン（デュポン
社製）を加えて培養し、細胞内に取り込まれた放射活性
量をシンチレーションカウンター（パラカード社製）に
て測定し、抗体によるヒトＩ　Ｌ−２の生理活性の阻害
能を調べた。その結果、図１に示すようにモノクローナ
ル抗体ＴＵ２５単独添加により、ヒトＩ　Ｌ−２の生理
活性が公知のマウスモノクローナル抗ヒトＩＬ−２レセ
プター重鎖抗体Ｔ　Ｕ　２７　（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２５
１０が産生ずるモノクローナル抗体）に比べて顕著に阻
害された。またモノクローナル抗体ＴＵ２５、及びマウ
スモノクローナル抗ヒトＩＬ−２レセプター軽鎖抗体を
ともに添加することにより、Ｉ　Ｌ二２の生理活性は高
濃度においても完全に阻害されることが判明した。

（発明の効果） 本発明はモノクローナル抗体を単独で、あるいはヒトＩ
　Ｌ−２レセプター軽鎖に結合する抗体と併用で用いる
ことにより、臓器移植時の拒絶反応の予防や自己免疫疾
患の治療に有用な免疫抑制剤として利用できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、モノクローナル抗体ＴＵ２５が、単独である
いはマウスモノクローナル抗ＩＬ−２レセプター軽鎖抗
体と共存下でＩＬ−２の生理活性を阻害する活性を有す
ることを示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の性質を有するヒトＩＬ−２レセプター重鎖
   に結合するモノクローナル抗体。 （ａ）ヒトＩＬ−２レセプター重鎖に結合する（ｂ）ヒ
   トＩＬ−２のヒトＩＬ−２レセプター重鎖への結合を阻
   害する （ｃ）ヒトＩＬ−２の生理活性を阻害する
2. （２）モノクローナル抗体がモノクローナル抗体ＴＵ２
   ５である請求項（１）記載のモノクローナル抗体。
3. （３）請求項（１）又は（２）記載のモノクローナル抗
   体を含有してなる免疫抑制剤。
4. （４）ヒトＩＬ−２レセプター軽鎖に結合する抗体を更
   に含んでなる請求項（３）記載の免疫抑制剤。