JPH10509876A

JPH10509876A - Ｃｄ３８に対する擬人化抗体

Info

Publication number: JPH10509876A
Application number: JP8518423A
Authority: JP
Inventors: エリス、ジョナサン・ヘンリー; ルイス、アラン・ピーター
Original assignee: ザ・ウエルカム・ファウンデーション・リミテッド
Priority date: 1994-12-02
Filing date: 1995-11-28
Publication date: 1998-09-29
Also published as: GB9424449D0; EP0794966B1; US20050158305A1; ATE222928T1; DE69527975D1; WO1996016990A1; ES2181795T3; EP0794966A1; AU3933695A; DE69527975T2

Abstract

(57)【要約】本発明は、異種起源のドナーＣＤＲｓと、ヒトまたは霊長類起源の配列を有する受容側フレームワーク領域領域とを有するモノクローナル抗体、好ましくはＣＤ３８に対する特異性を有するモノクローナル抗体であって、重鎖の前記受容側フレームワーク領域の配列の位置２９および／または７８における元のアミノ酸残基が、前記ＣＤＲｓの誘導源である抗体の重鎖の対応するフレームワークの配列の対応する位置におけるそれと同一もしくは類似の置換アミノ酸残基で置き換えられているモノクローナル抗体に関する。該モノクローナル抗体の製造方法、前記抗体を含有する薬学的組成物。癌および自己免疫疾患の治療のための前記抗体の使用。

Description

【発明の詳細な説明】ＣＤ３８に対する擬人化抗体本発明は抗体に関し、特に、擬人化抗体およびその製造に関する。抗体は、典型的にはジスルフィド結合によって相互に連結された二つの重鎖と、軽鎖とを具備している。各軽鎖は、ジスルフィド結合によって夫々の重鎖に結合されている。各重鎖はその一端に可変ドメインを有し、これに続く多くの定常ドメインを有している。各軽鎖は、その一端に可変ドメインを有し、他端に定常ドメインを有している。軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインに対して整列している。軽鎖定常ドメインは、重鎖の第一定常ドメインに対して整列している。軽鎖および重鎖の定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合には直接関与していない。軽鎖および重鎖の夫々の対は、抗原結合部位を形成している。軽鎖および重鎖の可変ドメインは同じ一般的構造を有しており、夫々のドメインは、三つの相補性決定領域（ＣＤＲｓ：ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３）によって結合された四つのフレームワーク領域を具備しており、これらフレームワーク領域の配列は比較的保存されている。四つのフレームワーク領域は大概ベータシート型コンホメーションをとっており、ＣＤＲ領域はこのベータシート構造を連結する（ある場合にはその一部を形成する）ループを形成している。これらＣＤＲ領域はフレームワーク領域によって相互に近接して保持されており、他のドメインからのＣＤＲと共に、抗原結合部位の形成に寄与している。従って、四つのフレームワーク領域はＣＤＲを互いに正しく位置決めするために極めて重要であり、従って抗体結合において極めて重要である。多くの非ヒト抗体が、例えばヒト・フレームワーク内に非ヒトＣＤＲを具備した擬人化抗体のように擬人化されるに伴って、ＣＤＲ領域とフレームワーク領域との間の相互作用の重要性がますます明らかになってきている。擬人化抗体は、マウス抗体またはラット抗体のような非ヒト抗体とは対照的に、ヒトに投与されたときに無視し得る程度の免疫反応しか誘発しない。従来技術は、このような擬人化抗体を製造するための幾つかの方法を開示している、即ち、ＥＰ-Ａ-0239400号は、ヒト・フレームワーク中にＣＤＲをスプライシングすることを記載している。簡単に言えば、ラットまたはマスのような非ヒト種からＣＤＲを誘導する一方、可変ドメインのフレームワーク領域および定常領域はヒト抗体から誘導する。特に、擬人化された抗ＣＤ５２抗体がＥＰ-Ａ- 0328404号に開示されている。ＥＰ-Ａ-054951号には、非ヒト抗体を、ヒト抗体に近似するように造り直すことによって擬人化する方法が記載されている。この方法は基本的に、マウスまたはラットの可変ドメインのような非ヒト可変ドメインを取り出し、フレームワーク領域内の残基をヒト・フレームワークの残基に対応するように変えることを具備している。ＥＰ-Ａ-0239400号およびＥＰ-Ａ-054951号の両者においては、抗体の可変ドメインのＣＤＲが第一の非ヒト種から誘導され、またフレームワーク領域および（もし存在するならば）抗体の定常ドメインはヒトから誘導された、改変された抗体が製造される。このような擬人化抗体において、ヒト・フレームワーク領域の多くの残基は、抗原結合の親和性に対して重要な影響を及ぼすように見える（例えば、Ｋettleb orough et al.,1991,Ｐrot.Ｅng.4:773）。重鎖フレームワーク領域における一定の位置が、種々の改変抗体における抗原結合活性の保持には特に重要であるように思える。多くの研究者は、重鎖フレーム領域内の位置６７，６９および７１における残基の重要性を報告している。これらの残基は、ＣＤＲＨ２ループの内部アスペクトに接触したベータシートを形成しており、おそらく、これらの位置におけるミスマッチはＣＤＲ形状を歪めるであろう。また、位置９１および９４の残査は、多くの重鎖における正しいＣＤＲＨ３コンホメーションのために重要であるように見える（例えば、Ｔempest et al.,Ｂio/Ｔechnology 9:266）。抗原結合に影響しそうな他の位置は、重鎖の残基２７，３０および９４と、軽鎖における残基４９および７１である(番号付けはカバット(Ｋabat)システムによる) 。更に、文献では、重鎖における領域６６〜７３および領域２７〜３０が重要であり、残基６６〜７３はＣＤＲＨ２と密着して存在することが認識されている。今や、フレームワーク領域の残基２９および７８は、ＣＤＲＨ１に近接した抗原結合性に影響するポケットを占めていることが知られていり、また、この望ましくない効果は、ＣＤＲｓの誘導源である抗体のフレームワークの対応位置の残基に対応した残基を用いることによって回避できることが知られている。従って、本発明は、異種起源のドナーＣＤＲｓと、ヒトまたは霊長類起源の配列を有する受容側フレームワーク領域領域とを有するモノクローナル抗体であって、重鎖の前記受容側フレームワーク領域の配列の位置２９および／または７８における元のアミノ酸残基が、前記ＣＤＲｓの誘導源である抗体の重鎖の対応するフレームワークの配列の対応する位置におけるそれと同一もしくは類似の置換アミノ酸残基で置き換えられているモノクローナル抗体に向けられている。「類似の」とは、大きさが等しいアミノ酸、好ましくは大きさ、疎水性および電荷が等しいアミノ酸を意味する。典型的には、受容側フレームワーク領域の位置２９および／または７８における元のアミノ酸残基は、ＣＤＲｓの誘導源である抗体のフレームワーク領域におけるその対応する残基よりも大きい。これら大きな残基の例には、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンおよび２−フェニルアラニンが含まれる。ＣＤＲｓを付与する抗体のフレームワーク領域における対応の小さい残基の例には、グリシン、アラニン、バリン、セリンおよびロイシンが含まれる。本発明によれば、受容側フレームワークの位置２９および／または７８における元の大きな残基が、ＣＤＲｓを与える抗体の対応する小さな残基と同一もしくは類似の置換アミノ酸残基で置き換えられる。置換アミノ酸残基は、ＣＤＲｓを与える抗体の対応する残基と同じであるのが望ましいが、大きさ、および好ましくは疎水性および電荷に関しする特性が実質的に同一、即ち保存されれば、類似したアミノ酸残基にすることもできる。例えば、もし、ＣＤＲｓを与える抗体の残基が２９および／または７８の位置にバリンを有していれば、受容側フレームワークに同じくバリンである置換アミノ酸残基を有する代わりに、例えばアラニンを用いてもよい。何故なら、アラニンはバリンに等しい電荷、大きさおよび疎水性を有しており、従って類似しているからである。正確に同じアミノ酸の代わりに類似したアミノ酸を使用することは、当該技術において十分確率されたプラクティスであり、保存性置換として知られている。一例を挙げるならば、マウス重鎖フレームワークにおいて、Ｌｅｕ−２９およびＶａｌ−７８の側鎖はＣＤＲＨ１に近接した小さなポケットに一緒にパックされるのに対して、例えばＮＥＷのように、その他の点ではマウスフレームワークに対する密接な相同性を有している対応のヒト重鎖フレームワークでは、類似の位置は二つのＰｈｅ残基によって占められている。この大きな芳香族側鎖は、マウス抗体におけると同じ用にしてパックされるには嵩張り過ぎるようであり、そのために隣接する表面残基の配置を変更させて、擬人化抗体におけるＣＤＲＨ１の異なったコンホメーションをもたらす。何れかのＰｈｅ残基をもっと小さいネズミの残基で置換すると、この効果は部分的に解除され、抗原結合性が許容される。一般に、両方の残基を置き換えることによって、完全な親和性が修復される。従って、位置２９および７８の両方において、アミノ酸を置き換えることが好ましい。本発明によれば、置換アミノ酸残基は、例えばＣＤＲＨ１コンホメーションの歪みを生じることなく、当該ポケットの中に嵌め込まれる。好ましくは、抗体重鎖のフレームワークはヒト抗体ＮＥＷの対応するフレームワークに対して相同性である（Ｓaul et al,J.Ｂiol.Ｃhem.253:585-597,1978）。この場合、フレームワーク１の最終残基は、適切にはＳｅｒまたはＴｈｒ、好ましくはＳｅｒである。この残基は３０位にある（Ｋabat et al,1987）。好ましくは、抗体軽鎖のフレームワークはタンパクＲＥＩの可変ドメインフレームワークに対して相同性である（Ｅpp et al,Ｅur.Ｊ.Ｂiochem.,45:513-524,1974）。残基２９および７８がＣＤＲＨ１に近接した小さなポケットの中に一緒にパックされたネズミ重鎖の特定の例は、コバット群ＩＢおよびＩＩＣにおけるものである。これとは対照的に、フレームワーク領域における２９および７８の位置に嵩張った残基を有するヒト重鎖の例は、コバットに列記されたＬＥＳ−Ｃ、Ｔ５２、Ａｂ４４、ＨＩｇＩおよびＮＥＷである。位置２９および７８にサイズの小さい残基を有し得るマウス以外の種は、例えばラット、ウサギおよびハムスターである。この明細書に記載する全てのアミノ酸残基位置は、コバットの番号付けシステムを用いている。本発明に従う抗体は、（ｉ）ドナー重鎖の配列を得る工程と、（ｉｉ）ベストフィット相同性法(best-fit homology method)によって、受容側のヒトまたは霊長類フレームワークを選択する工程と、（ｉｉｉ）前記重鎖の受容側フレームワーク領域の配列の位置２９または７８におけるアミノ酸を、ＣＤＲｓの誘導源である抗体の対応するフレームワーク領域の配列の対応位置におけるアミノ酸と同一もしくは類似のアミノ酸によって置き換える工程とを含む方法によって製造され得る。抗体重鎖は、相補的な抗体軽鎖と共に同時発現され得る。少なくとも可変ドメインのフレームワーク領域および／または相補鎖の各定常ドメインは、一般に霊長類またはヒト受容者から誘導される。好ましくは、両方の鎖のＣＤＲｓは、同一の選択された抗体から誘導される。抗体は、好ましくは天然の抗体またはそのフラグメントの構造を有する。従って、抗体の用語には、完全な抗体、（Ｆａｂ′）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆｄフラグメント、ＳＦｖフラグメント、軽鎖二量体または重鎖、およびそれらの誘導体が含まれる。抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のようなＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＤであり得る。更に、抗体は全ての種類の修飾、即ち、ＩｇＧ二量体、Ｆｃ受容体に結合せず又はＣ１ｑ結合を媒介するＦｃ変異体（阻止抗体）も含まれ得る。抗体はまた、ＷＯ86/01533に記載されているタイプのキメラ抗体であってもよく、これは抗原結合性領域および非免疫グロブリン領域を具備している。抗原結合性領域は、抗体の軽鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメインである。典型的には、抗原結合性領域は軽鎖可変ドメインおよび重鎖の可変ドメインの両者を含んでいる。非免疫グロブリン領域は、そのＣ末端で抗原結合性領域に融合している。非免疫グロブリン領域は、典型的には非免疫グロブリンタンパクであり、酵素、トキシンまたは公知の結合特異性をもったタンパクであり得る。キメラ抗体の二つの領域は、開裂可能なリンカー配列によって連結されてもよい。好ましくは、本発明は抗体、例えばラット、ウサギ、ハムスターまたはマウス起源の抗体を擬人化するために用いられる。従って、擬人化された抗体の軽鎖および／または重鎖のＣＤＲｓはラットまたはマウスのＣＤＲｓであるのに対して、該抗体のフレームワーク領域および定常ドメインはヒトまたは霊長類起源である。この抗体は、ＣＤＲｓがラットまたはマウス起源であるような、ヒトまたは霊長類のＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）；ＩｇＭ；ＩｇＡ；ＩｇＥまたはＩｇＤであり得る。ＣＤＲｓの誘導源である抗体は、典型的には選択された特異性をもった抗体である。この特異性を確実に保持するために、該抗体の可変ドメインフレームワーク領域がヒトまたは霊長類抗体の可変ドメインフレームワーク領域に対応するように再構成されるか、或いは、ＣＤＲｓが最も近いヒトまたは霊長類フレームワーク領域に移植される。何れにしても、得られた抗体は、好ましくは非ヒトＣＤＲｓと、該ＣＤＲｓの誘導源である抗体の対応するフレームワーク領域に対して相同性のヒトもしくは霊長類フレームワーク領域とを具備している。好ましくは、二つの可変ドメインの間には少なくとも５０％の相同性が存在する。擬人化抗体を製造するには、一般的に次の四つの工程がある。（１）ＣＤＲｓの誘導源である抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列を決定する工程。（２）ヒトまたは霊長類の抗体のフレームワーク領域の何れを用いるかを決定する工程。（３）実際に移植または再構成を行う方法論／技術（４）移植または再構成された抗体の形質導入および発現。これらの４工程を以下に説明する。〈工程１〉：ＣＤＲｓの誘導源である抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列の決定抗体を擬人化するために、非ヒト抗体（ドナー抗体）の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を知る必要がある。定常ドメインの配列は無関係である。抗体の可変ドメインのアミノ酸配列を決定するための最も単純な方法は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインをコードするクローン化されたｃＤＮＡから得るものである。与えられた抗体の重鎖可変メインおよび軽鎖可変メインのｃＤＮＡをクローニングするための二つの一般的な方法は、（１）従来のｃＤＮＡライプラリーから得る方法と、（２）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による方法である。これらの方法は両方とも広く知られている。ｃＤＮＡ類のヌクレオチド配列が与えられれば、この情報を抗体可変ドメインの予想アミノ酸配列に翻訳するのは簡単なことである。〈工程２〉：擬人化抗体の設計何れのヒト抗体（受容側抗体）配列を使用するかを決定する際に、幾つかの考慮すべき因子が或る。軽鎖および重鎖の擬人化は相互に独立に考慮されるが、その理論は基本的には同じである。この選択プロセスは、下記の理論に基づいている。与えられた抗体の抗原特異性および親和性は、主には可変領域ＣＤＲｓのアミノ酸配列によって決定される。可変ドメインフレームワーク残基は直接的には少ししか寄与せず、またはその直接的な寄与はない。可変ドメインフレームワーク領域の機能は、ＣＤＲｓを、抗原を認識する適切な空間的配置に保持することである。従って、ヒト可変ドメインがＣＤＲ誘導源である齧歯類の可変ドメイン（類）に対して高度に相同性であるならば、齧歯類ＣＤＲｓをヒト可変ドメインフレームワークに置換することによって、正しい空間的配置は最も良く維持され易いように思える。適切なヒト抗体可変ドメインの配列は、次のようにして選択される。（ｉ）コンピュータプログラムを用いて、例えば齧歯類抗体の可変ドメインに対して最も相同性の高いヒト抗体可変ドメイン配列について、入手可能なタンパク（およびＤＮＡ）データベースをサーチする。これは、ＦＡＳＴＡと称するプログラムを用いて容易に達成できるが、他の適切なプログラムも入手可能である。該プログラムの出力は、齧歯類抗体に対して最も相同性の高い配列、各配列に対する相同性パーセント、および齧歯類配列に対する各配列のアラインメントのリストである。これは、重鎖および軽鎖の可変ドメイン配列の両者について独立に行われる。ヒト免疫グロブリン配列のみを含むカスタマイズされた副データベースを最初に作成すれば、上記の分析は最も容易に達成される。第一に、分析はデータベースの善配列ではなく、問題の配列のみに限定されるから、実際のコンピュータ処理時間は大幅に減少する。第二の利点は、分析をヒト免疫グロブリン配列に限定することによって、その出力は齧歯類免疫グロブリン配列の存在によって混乱されないことである。データベースの中には、ヒトよりも遙かに多くの齧歯類免疫グロブリン配列が存在する。（ｉｉ）上記のものから、齧歯類抗体可変ドメインに対して最も広い相同性を有するヒト抗体可変ドメイン配列を列記する。フレームワーク領域内の相同性およびＣＤＲｓ内の相同性は区別しない。全体の相同性を考慮する。（ｉｉｉ）齧歯類ＣＤＲｓとは長さの異なるＣＤＲｓを有する有するようなヒト配列は、考慮から除外する。このルールはＣＤＲ３には適用しないが、その理由は、このＣＤＲの長さが普通は非常に変化するからである。また、ときには齧歯類抗体と同じ長さのＣＤＲが非常に少ないか、或いは全く存在しないことがある。そのような場合には、このルールを緩和して、ＣＤＲ長さにおける１以上の相違をもったヒト配列を許容することができる。（ｉｖ）残りのヒト可変ドメインから、齧歯類に対して最も相同性の高い物を選択する。（ｖ）実際の擬人化抗体（最終結果）は、齧歯類抗体由来のＣＤＲｓと、上記で選択されたヒト抗体由来の可変ドメインフレームワークとを含んでいなければならない。（ｖｉ）非ヒト可変ドメインのアミノ酸が決定され、最も相同性の高いヒト可変ドメインが同定されたなら、再構成または移植によって擬人化抗体を製造する代わりに、最初から全体の可変ドメインを合成することも可能である。（ｖｉｉ）ドナー重鎖が位置２９および７８に二つの小さい残基を有しており、また受容側の鎖がこれら位置の一方または両方に大きい残基（典型的には芳香族残基）を有していれば、更なる分析が必要とされる。（ｖｉｉ）この分析は、ドナー鎖のＣＤＲＨ１と他の抗体のＣＤＲＨ１との間の配列比較の形をとり得る。例えば、ＳＹＧＶＨのＣＤＲＨ１は、完全な活性のために位置２９および７８に小さな残基を必要とすることが示されており、同一もしくは類似のＣＤＲＨ１配列をもった他の抗体もまた、これらの位置に同様の残基を必要とすると思われる。或いは、この分析は、提案された擬人化抗体ＣＤＲＨ１の、標準的技術（例えば、オックスフォード分子社から入手可能なＡｂＭパッケージ）を用いた詳細なコンピュータによるモデリングの形をとり得る。もし、この分析によって、例えば、ＣＤＲＨ１が残基２９および７８のパックされた側鎖に非常に近接して存在し、これらの残基をヒトからもっと小さな残基へ変更するとＣＤＲＨ１の配置または位置が変化することが明らかになれば、ヒトの残基はこのような小さな残基で置き換えられるべきである。このようなＣＤＲＨ１のパーターベーションの一例は、図５および図６に示されている。〈工程３〉：移植および再構成詳細については、ＥＰ-Ａ-0239400およびＥＰ-Ａ-054951を参照されたい。〈工程４〉：改変抗体のトランスフェクションおよび発現抗体が擬人化され、且つ残基２９および／７８が置換されたら、このｃＤＮＡを、軽鎖定常領域または重鎖定常領域をコードする適切なＤＮＡに連結し、発現ベクター中にクローニングし、哺乳類細胞中にトランスフェクトする。これらの工程はルーチンの方法で行うことができる。従って、擬人化抗体は下記の工程を含むプロセスによって製造され得る。（ａ）Ｉｇ重鎖またはＩｇ軽鎖の少なくとも可変ドメインをコードするＤＮＡ配列に対して機能的にリンクされた適切なプロモータを含む、第一の複製可能な発現ベクターを調製する。ここで、該可変ドメインは、ヒトまたは霊長類抗体由来のフレームワーク領域と、異なる起源の第二の抗体に由来するＣＤＲｓの少なくとも一部とを具備している。（ｂ）もし必要ならば、相補的なＩｇ軽鎖またはＩｇ重鎖の夫々少なくとも可変ドメインをコードするＤＮＡ配列に機能的にリンクした適切なプロモータを含む、第二の複製可能な発現ベクターを調製する。（ｃ）細胞系を、第一のまたは両方のベクターで形質転換する。（ｄ）前記形質転換された細胞系を培養して、前記改変抗体を製造する。好ましくは、工程（ａ）のＤＮＡ配列は、抗体鎖の両方の可変ドメインと、該または各定常ドメインの両方をコードし、該または各定常ドメインはヒトまたは霊長類抗体に由来するものである。抗体を回収し、精製する。改変抗体を製造するように形質転換された細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系または不死化された哺乳類細胞系であればよいが、ミエローマ、ハイブリドーマ、トリオーマ、またはクワドローマ細胞系のようなリンパ系起源であるのが有利である。この細胞系はまた、エプスタインバーウイルスのようなウイルスでの形質転換により不死化されたＢ細胞のような、正常なリンパ細胞をも包含し得る。最も好ましくは、この不死化細胞系はミエローマ細胞系またはその誘導体である。改変抗体の製造に用いる細胞系は、好ましくは哺乳類細胞系であるが、その代わりにバクテリア細胞系または酵母細胞系のような何れかの他の適切な細胞系を用いてもよい。特に、大腸菌（Ｅ.coli）から誘導されたバクテリア株を使用することもできるであろう。ミエローマ細胞系のような幾つかの不死化されたリンパ系細胞は、その正常な状態で、Ｉｇの軽鎖または重鎖を分泌する。このような細胞系が工程（ａ）で調製されたベクターで形質転換されるときは、この正常に分泌された鎖が工程（ａ）で調製されたベクターによってコードされるＩｇ鎖の可変ドメインに対して相補的であるならば、当該プロセスの工程（ｂ）を行う必要はないであろう。しかしながら、不死化された細胞系がそう補佐を分泌しない場合は、工程（ｂ）を行う必要があるであろう。この工程は、工程（ａ）で調製されたベクターを、該ベクターが改変抗体の軽鎖または重鎖だけでなく、相補的な可変ドメインをもコードするように更に加工することによって行ってもよい。或いは、工程（ｂ）は、不死化細胞系を形質転換するために使用する第二のベクターを調製することによって行われる。この別法は、構築物の調製をより容易にするが、抗体の効率的な製造を導く可能性がない点で、第一の方法ほどに好ましくない。不死化された細胞系が相補的な軽鎖または重鎖を分泌しない場合には、当該形質転換細胞系は、例えば、適切なバクテリア細胞をベクターで形質転換し、次いで、該バクテリア細胞をスフェロプラスト融合によって不死化細胞系と融合させることにより製造すればよい。或いは、電気穿孔法または他の適切な方法によって、該ＤＮＡを不死化細胞系に直接導入してもよい。本発明のプロセスは、ＣＤ３８表面抗原に対する抗体を得るために適用された。簡単に言えば、擬人化された抗ＣＤ３８モノクローナル抗体（ｈ３Ｓ称する）が、次のようにして製造された。ｃＤＮＡを、ネズミ・モノクローナル抗（ヒトＣＤ３８）ＡＴ１３／５を分泌するハイブリドーマ細胞から得らた。マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡクローンを同定し、配列決定を行った（図１および図２に添付した配列１および２）。次いで、この情報を用いて、ベストフィット相同性法により、ＣＤＲ移植を受け入れる適切なヒトフレームワークを選択した。この方法によって、最適な選択として、ＲＥＩ軽鎖およびＮＥＷ重鎖が決定された。ＣＤＲｓがヒトフレームワークに移植された。加えて、発表された研究（Ｒie chman et al.，1988，Ｎature 332: 323：and Ｔempest et al.，1991，Ｂio/Ｔ echnology 9:266）にガイドされて、この段階で、抗原結合性に影響し易いと思われる位置、即ち、重鎖の残基２７，３０および９４並びに軽鎖の残基４９（番号付けはコバットのシステムに従った）で、四つのフレームワーク変化を施した。得られた擬人化抗体をＣＤ３８結合性について試験し、陰性の結果を得た。キメラ重鎖（ネズミＶＨ、ヒトＣＨ）と一緒に擬人化された軽鎖を発現させることにより機能的な抗体が生成し、軽鎖の擬人化が十分であることが示された。更に、一連の重鎖フレームワークの変化を試験した。特に、この分析によって、ＣＤＲＨ２および残基２９および７８によって形成されるポケット（ＣＤＲＨ１に近接して存在する）に密着して存在する残基６６〜７３の伸びた配列が、高原結合性影響するものとして同定された。先に述べたように、領域６６〜７３および２７〜３０の重要性については文献においても認識されているが、残基２９および７８の役割および残基２９および７８の側鎖の間の相互作用は認識されていない。本発明は抗ＣＤ３８抗体に関連して説明されているが、本発明はどのような抗体に結合する如何なる抗体についても適用可能である。特に、文献(Ｊ.Ｃell.Ｂ iol.,125（2）437-446,Ａpril 1994 and Proc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.87,3542-3546, Ｍay 1990）に開示されているような４０ｋＤ抗原、癌抗原、および自己免疫疾患に関与する抗原に結合する何れかの抗体が挙げられる。抗４０ｋＤ抗体の特殊な例は、３２３／Ａ３である。抗体の他の例は、文献（Ａ.Ｔomasetti et al,Ｆederation of Ｅuropean Ｂi ochemical Ｓocieties Ｖol.317,143-146,Ｆeb.1993）に開示されている抗葉酸受容体抗体である。抗葉酸抗体の特定の例は、ＭＯＶ１８である。抗体の更なる例には、抗ＣＥＡ抗体、抗ムチン抗体、抗２０／２００ｋＤ抗体、抗ガングリオシド抗体、抗ジゴキシン公知亜、抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ２３抗体が含まれる。特に、抗ＣＤ３８抗体は、図３、図３ａおよび図４に示した重鎖可変領域および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列を有している。本発明のもう一つの側面に従えば、治療における、本発明による抗体の使用が提供される。特に、癌およびその関連した転移の治療、自己免疫疾患の治療、特に多発性骨髄腫、リンパ種およびリューマチ性関節炎の治療のための、本発明による抗体の使用が提供される。本発明の抗ＣＤ３８抗体は、多発性骨髄腫の治療に使用することができる。ＣＤ３８は、未成熟Ｂリンパ球、活性化されたＴリンパ球およびＢリンパ球、および形質細胞によって発現される膜貫通糖タンパクである。細胞溶解を生じさせることができるＣＤ３８に対する抗体は、この抗原をもった腫瘍、主に多発性骨髄腫および非ホジキン氏リンパ種の５０％の免疫療法において有用であり得る。加えて、抗ＣＤ３８抗体は、免疫系の液性エフェクターおよび細胞性エフェクターの両者を抑制する能力を有しているので、リウマチ性関節炎および筋無力症のような自己免疫疾患の治療において有用であり得る。本発明によるＣＤ３８抗体は、その表面にＣＤ３８を発現している細胞について溶解性であることが示されている。この擬人化抗体はＣＤ３８に結合して、ＣＤ３８結合において本来の抗体と拮抗することが示されている。多発性骨髄腫は、形質細胞のクローンの蓄積を特徴とする新生物であり、免疫グロブリン鎖の分泌を伴うことが多い。腫瘍による骨髄浸潤には貧血、低グロブリン血症およびバクテリア感染を併発した顆粒球減少症が伴われる。主にＩＬ６レベルが増大した異常なサイトカイン環境は、骨の痛み、骨折および低カルシウム血症を導く破骨細胞の増大をもたらす。高濃度の骨髄腫免疫グロブリンおよび高カルシウム血症に関して、腎不全は希なものではない。近年に亘って種々の治療プロトコールが試みられてきたが、骨髄腫患者の全体の予後に対する影響は少ししなかった。３０年前のメルファランおよびプレドニゾロンを用いた治療（Ｂergsagel,1989）は、今でも標準的な治療である。化学療法に対する反応には、約２年の中間的な持続と共に緩解の導入が伴うが、全ての症例において、その後に突然再発して死亡する（Ａlexanian and Ｄimopoulos ,1994 Ｎew Ｅngland Ｊ.of Ｍedicine Ｖol.330:484）。高ドーズ療法(high-do setherapy)に続く自己骨髄移植は未だ活発な開発分野であるが、多くの細胞毒製剤を利用した更に攻撃的な化学療法は、生存または緩解の継続の点で少ししか追加の利点を与えていない。何人かの研究者によって、骨髄腫と闘うための免疫療法的戦略が提案されている。インターロイキン６は骨髄腫細胞の主要な増殖因子であり、自己分泌または傍分泌の何れかで機能し得ることが示唆されている。このような結果に基づけば、ＩＬ６信号伝達系を崩壊させることを目的とした介入が計画されてきた。ＩＬ６を中和する二つのモノクローナル抗体は、疾患の白血病変異を伴う患者において骨髄腫細胞の増殖を抑制したが、６０日後には腫瘍が再発した。抗ＩＬ６受容体モノクローナル抗体を、ヒト骨髄腫細胞系を移植されたＳＣＩＤマウスに対して投与すると、骨髄腫細胞の注入の１日後に抗体を投与したときだけではあるが、腫瘍増殖は抑制された。増殖の５日後に抗体を投与しても、有意な効果はなかった。また、この抗体のＣＤＲ移植形は可能なヒト治療の用途のために製造されている。同様にして、高レベルのＩＬ６受容体を有する骨髄細胞もまた、修飾された形のシュードモナスエキソトキシンに結合されたＩＬ６変種からなるキメラ細胞トキシンによってターゲッティングされた。臨床におけるこの技術の適用可能性は残っているように思えるが、イン・ビトロにおいて細胞の死滅が観察される。より生理学的なアプローチのための我々の選択は、ホスト免疫系による殺滅のために、骨髄腫細胞をターゲッティングすることである。表面抗原ＣＤ３８は、９０％を越える多発性骨髄腫細胞によって強く発現され、その溶解性免疫療法の標的としての安定性が議論されてきた（Ｓteenson et al,1991 Ｂlood,Ｖol.77, 5:1071-1079）。また、この同じ報告は、骨髄腫患者から得たエフェクター細胞がキメラ抗ＣＤ３８でコートされた標的細胞を溶解する能力を有することを証明した。このような抗体の投与量は、治療すべき症状および治療を受ける患者によって変化するが、成人患者１人当たり１〜約100ｍg、好ましくは１〜約10ｍgであり、通常は１日〜30日の期間の間毎日投与される。１〜５ｍgを５〜10日間投与し、続いて６〜15ｍgを更に５〜10日間投与する、２パート投与レジメが好ましいかもしれない。また、項ＣＤ３８抗体の精製された製剤を含有する製剤もまた本発明の範囲内に含まれる。このような製剤は、好ましくは、抗体に加えて、生理学的に許容され得る希釈剤またはキャリアを含んでおり、他の抗体または抗生物質のような他の薬剤との混合物であってもよい。適切なキャリアには、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、および緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。或いは、抗体は凍結乾燥（フリーズドライ）し、必要とされるときに上記のような緩衝水溶液を添加することに理再構成して使用してもよい。投与経路は、経口ルート、並びに静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内の注射または配薬を含む非経腸的ルートである。以下の実施例は本発明を例示するものである。添付の図面において：図１は、マウス抗ＣＤ３８抗体重鎖可変領域のヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列を示している。各行における最初および最後のアミノ酸またはヌクレオチドの番号は、それぞれ左マージンおよび右マージンに示されている。ＣＤＲｓには下線が付されている。図２は、マウス抗ＣＤ３８抗体軽鎖可変領域のヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列を示している。各行における最初および最後のアミノ酸またはヌクレオチドの番号は、それぞれ左マージンおよび右マージンに示されている。ＣＤＲｓ（下線を付した部分）は、公知の免疫学的配列との比較によって同定されたものである（Ｋabat et al，「免疫学的興味のあるタンパクの配列」、米国厚生省、米国政府印刷局、1987）。図３および図３ａは一緒になって、擬人化された抗ＣＤ３８抗体軽鎖ｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。各行における最初および最後のアミノ酸またはヌクレオチドの番号は、それぞれ左マージンおよび右マージンに示されている。ＣＤＲｓには下線が賦されている。図４は、擬人化された抗ＣＤ３８抗体重鎖ｃＤＮＡのヌクレオチドおよび予想アミノ酸配列を示している。各行における最初および最後のアミノ酸またはヌクレオチドの番号は、それぞれ左マージンおよび右マージンに示されている。ＣＤＲｓには下線が付されている。図５は、ネズミ抗ＣＤ３８（位置２９および７８におけるネズミ残基）におけるＣＤＲＨ１（暗管）のコンフィギュレーションを示している。図６は、図５と同じ領域におけるものではあるが、位置２９および７８にヒト残基を有する擬人化構築物におけるＣＤＲＨ１（暗管）のコンフィギュレーションを示している。図７は、抗ＣＤ３８抗体の相対的結合親和性に対する、種々の重鎖フレームワーク置換の効果を示している。図８は、ＣＤ３８抗体に媒介された抗体依存性細胞毒性に対する、種々の重鎖フレームワーク置換の効果を示している。実施例実施例１マウス抗体に基づく抗ＣＤ３８のヒト化（ＡＴ１３／５：ＩｇＧＬＫ）（ａ）方法に関する一般的説明他に特に明記しない場合は、以下の方法において、以下の標準的方法と条件を使用した。該当する場合は製造業者の勧める方法を使用した。ＰＣＲ実験（Ｓaikiら、Ｓcience 239:487-491,1988）は、プログラム可能なサーマルサイクラー（トリオバイオメトラ(Ｔrio Ｂiometra)）を用いて行なった。典型的な１００μｌの反応ミックスは、製造業者の提供する緩衝液中に２．５単位のＡmpliＴaqポリメラーゼ（パーキン・エルマー・シータス（Ｐerkin-Ｅ lmer Ｃetus）、ビーコンスフィールド（Ｂeaconsfield）、英国）を含有した；ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを各２５０μＭ、１μＭの増幅プライマー、および鋳型ＤＮＡ。他に特に明記しない場合は、以下のサイクル条件を使用した：工程０：９４℃で９０秒工程１：９４℃で６０秒工程２：５０℃で６０秒、０．１５℃／秒の速度で工程３まで変化する工程３：７２℃で６０秒、工程１に行く、このループを２５回繰り返す工程４：７２℃で１０分。ＤＮＡ配列決定は、製造業者の説明書に従って、シーケナーゼＶ２（Ｓequena sev2 ）系（ＵＳＢ、ケンブリッジ、英国）を用いて、ジデオキシ法により行なった。反応産物は、８％アクリルアミド配列決定ゲルで分離した（ゲルミックス８（Ｇel-Ｍix8）、ＢＲＬ、パイスリー（Ｐaisley）、スコットランド、英国）。ＤＮＡをゲル精製するために、２つの方法のうち１つを使用した。１７５塩基対より小さな断片のために、ＤＮＡを通常の高融点アガロースゲルで分離し、プレパジーン（Ｐrep-a-Ｇene)系（バイオラッドラボラトリーズ（Ｂio-Ｒad Ｌab oratories）、ヘメルヘンブステッド（Ｈemel Ｈempstead）、英国）を用いて、ＤＮＡを回収した。大きな断片は、低融点アガロースゲル（ヌシーブＧＴＧ（Ｎ uＳieve ＧＴＧ）、ＲＭＣ、ロックランド、メイン州）で分離し、マジックＰＣＲプレップ（Ｍagic ＰＣＲＰreps）（プロメガ（Ｐromega）、サザンプトン、英国）を用いてＤＮＡを回収した。抗体鎖のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋabatらの方法（「免疫学的興味のあるタンバク質の配列」("Ｓequences of proteins of immunological interest")、米国保健社会福祉省（ＵＳＤept of Ｈealth and Ｈuman Ｓervices）、米国政府印刷局、１９９１）に従った。（ｂ）ＡＴ１３／５抗体−重鎖のクローニングと配列決定マイクロファーストトラクト（Ｍicro Ｆast Ｔract)キット（ブリティッシュバイオテクノロジー(Ｂritish Ｂiotechnology）、オックスフォード、英国）４用いて、５×１０⁶のＡＴ１３／５マウスハイブリドーマ株を含有する培養物から、ポリアデニル化ＲＮＡを抽出した。これを、スーバースクリプト・プレアンプリフィケーション（ＳuperＳcript Ｐreamplification）システム（ＢＲＬ、パイスリー（Ｐaisley）、スコットランド、英国）を用いて、オリゴ−ｄＴプライムした１本鎖ｃＤＮＡに変換した。マウス免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域を別々に増幅するために設計したＰＣＲで、得られたｃＤＮＡの一定分割量を使用した。シグナルペブチド領域（ＭＨＶ１−１２）に特異的なプライマー、およびマウス_γ１定常領域に特異的なプライマー（マウスＩｇＧ１重鎖逆プライマー）のカクテルを用いて、Ｊones＆Ｂendig（Ｂio/Ｔechnology 9:88-89）の方法に従って、重鎖の可変領域を増幅した。得られたＰＣR断片を、ＸｍａＩとＳａｌＩで消化し、ｐＵＣ１８にクローン化した。２つの独立したＰＣＲ反応から得られたクローンを、両方の鎖で配列決定し、同一であることが確認し、配列は、ＰＣＲ方法により導入されるエラーを含まないことが示唆された。可変領域の完全な配列を、図１に示す。（ｃ）ＡＴ１３／５抗体−軽鎖のクローニングおよび配列決定軽鎖の可変領域の配列もまた、ＰＣＲベースのクローニング戦略により、重鎖と同じ１本鎖ｃＤＮＡ調製を用いて得た。しかし、Ｊone ＆Ｂendig（前述）の記載したプライマーは、非生産的に再配列したカッパ軽鎖をＡＴ１３／５ｃＤＮＡから優先的に増幅するため、より複雑なクローニングおよび配列決定プロココールが必要であった。この鎖は、ＡＴ１３／５ハイブリドーマを作成するために使用される融合パートナー（ここでは、ＭＯＰＣ−２１関連Ｖ_Kと呼ぶ）に由来し、公知の配列である（Ｃarroll,ＷＬら、Ｍolecular Ｉmmunology 25:99l-995 :1988）。抗ＣＤ３８軽鎖をコードするｃＤＮＡを増幅するために、Ｊones＆Ｂendig（前述）の記載したマウスカッパ軽鎖逆プライマーおよびほとんどのマウスカッパ鎖のフレームワーク１領域（配列：５’ＧＡＣＡＴＴＣＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡ３’）にハイブリダイズするプライマーＶＫ１−ＢＡＣＫを用いて、ＰＣＲを行った。条件は、３５サイクル行なった以外は、重鎖増幅について記載したものと同じであった。これらのプライマーは、これらの条件下ではＭＯＰＣ−２１関連ＶＫをコードするｃＤＮＡを増幅しない。適当なサイズの増幅断片を精製し、軽鎖逆プライマーとＨｉｎｄIII部位を含有するＶＫ１−ＢＡＣＫの変種（配列：５’ＧＡＴＣＡＡＧＣＴＴＧＡＣＡＴＴＣＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡ３’）を用いて、第２の増幅（条件は前記と同じ、３０サイクル）の鋳型としてこのＤＮＡの一部を使用した。得られた断片を、ＨｉｎｄIIIとＸｍａＩで消化し、ｐＵＣ１８にクローン化した。通常のジデオキシ法により、クローンを両方の鎖の上で配列決定した。さらに、ＰＣＲ産物の一部を、サーマルサイクリング戦略（ｆｍｏｌシステム、プロメガ（Ｐ romega）、サザンプトン、英国）を用いて、³²Ｐで末端を標識したプライマー（軽鎖逆プライマー、前述）で、直接配列決定をした。サイクル配列決定実験から得られた配列は、常法により得られた配列と完全に一致した。この配列は、２回の増幅の産物から得られたため、その正確性についてさらなる確認が必要であった。フレームワーク１領域にハイブリダイズするプライマーを設計するのに既存の軽鎖配列を使用した（配列：５’ＡＣＴＡＧＴＣＧＡＣＣＡＴＣＣＴＣＣＴＴＴＴＣＴＧＴＴＴＣＴＣＴＡＧＧＡＧ３’）。これは、以下のサイクルとともにＰＣＲで、軽鎖逆プライマーとともに使用した：工程０：９５℃で１２０秒工程１：９５℃で６０秒工程２：５０℃で６０秒工程３：７２℃で６０秒、工程１に行く、このループを３０回繰り返す工程４：７２℃で１０分。３つの独立の反応を行い、精製後、生成物をＸｍａＩとＳａｌＩで消化し、ｐＵＣ１８にクローン化した。いくつかのクローンを、ジデオキシ法で配列決定した。こうして得られたすべての配列は、すでに得られたものと同一であり、提唱された軽鎖配列は、確かにＰＣＲエラーがないことが確認された。軽鎖の可変領域の完全な配列を、図２に記載する。（ｄ）ヒト化抗体のバージョン１の設計と作製ヒト可変ドメインフレームワークを、ベストフィット相同性方法（best-fit h omology method）により選択した（Ｌewis,ＡＰ＆Ｃrowe,ＪＳ「細胞による抗体の作成と遺伝子不死化」（"Ｇeneration of Ａntibodies by Ｃell and Ｇene Immortalisation"）、Ｔerhosrt,Ｃ,Ｍalavasi,Ｆ,Ａlbertini,Ａ（編）Ｋarger :Ｂasel、１９９３）。ヒト化法のために選択したフレームワークは、Ｃampath １Ｈ(ＥＰ−Ａ−０３２８４０４に開示されている)の軽鎖と重鎖可変ドメインであった。次に、組換えＰＣＲ法により、ヒト化重鎖と軽鎖を作成した（Ｌewis＆Ｃrowe,Ｇene 101:297-302,1991）。ｉ）軽鎖ヒト化法において使用したプライマーは、以下のものである：プライマーＡ_LとＨ_Lは、最終増幅産物のクローニングを可能にするＨｉｎｄII I部位を含有する。以下のサイクル条件でＰＣＲを行なった：工程０：９５℃で１２０秒工程１：９５℃で６０秒工程２：４５℃で６０秒工程３：７２℃で６０秒、工程１に行く、このループを２５回繰り返す工程４：７２℃で１０分。この反応に使用した鋳型は、フレームワーク残基をＲＥＩから取り、ＣＤＲをラット抗ヒトＣＤｗ５２抗体から取った作製体であるＣampath１Ｈ軽鎖をコードするＤＮＡである（Ｒeichmann,Ｌ．ら、Ｎature332:323-337,1988）。上記プライマーは、Ｃampath１Ｈ配列を置換して、ＡＴ１３／５ＣＤＲをＲＥＩフレームワーク上に移植させて残すように、設計される。最初の４回のＰＣＲは、プライマー対（Ａ_LとＢ_L、Ｃ_LとＤ_L、Ｅ_LとＦ_L、およびＧ_LとＨ_L）とともに１０ngの鋳型を用いて行なった。これらの反応の生成物（ＡＢ_L、ＣＤ_L、ＥＦ_L、およびＧＨ_L）をそれぞれゲル濾過して、回収した量の半分を２回目のＰＣＲに使用した。断片ＡＢ_LとＣＤ_Lは、１つの反応でプライマーＡ_LとＤ_Lとともに鋳型として使用し、断片ＥＦ_LとＧＨ_Lは、プライマーＥ_LとＨ_L とともに鋳型として使用した。反応条件は以下の通りである：工程０：９５℃で１２０秒工程１：９５℃で６０秒工程２：４５℃で６０秒工程３：７２℃で９０秒、工程１に行く、このループを２０回繰り返すこれらの反応の生成物（ＡＤ_LとＥＨ_L）をゲル濾過し、各ＤＮＡの半分を最後の反応で、前述の２回目のＰＣＲと同じ反応条件でプライマーＡ_LとＨ_Lとともに鋳型として使用した。得られた生成物をＨｉｎｄIIIで消化し、ｐＵＣ１８にクローン化した。両方の鎖の上の挿入体の完全な配列により決定した予測された構造を有するクローンを、選択してさらに操作した。この作製体の可変領域の配列を、図３と３ａに示す。ii ）重鎖ヒト化工程で使用したフライマーは以下のものである：以下のサイクル条件に従ってＰＣＲを行なった：工程０：９５℃で１２０秒工程１：９５℃で６０秒工程２：４５℃で６０秒工程３：７２℃で６０秒、工程１に行く、このループを２５回繰り返す工程４：７２℃で１０分。この反応に使用した鋳型は、ＣＤＲとフレームワーク残基２７と３０をラット抗ヒトＣＤｗ５２抗体から取った作製体であるＣampath１Ｈ重鎖をコードするＤＮＡであり（Ｒeichmann,Ｌ.ら、前述）、フレームワーク残基の残りはＮＥＷから取った。上記プライマーは、Ｃampath１ＨＣＤＲ配列を置換して、ＡＴ１３／５ＣＤＲをＣampath１Ｈフレームワーク上に移植させて残すように、設計される。また、重鎖残基９４は、抗原結合に重要であることが知られており（Ｔempest ,ＰＲら、Ｂio/Ｔechnology,9:260-271,1991）、従ってＡＴ１３／５配列をこの位置に採用した。残基２７と３０のラットの配列は、非修飾ＮＥＷ配列より相同性が高い。プライマーＡ_HとＨ_Hは、それぞれＨｉｎｄIIIとＥｃｏＲＩ部位を含有する。さらに、プライマーＧ_Hは、Ｓｐｅ１部位をＧ_Hに作成し、あらかじめ調製したヒトＣ_H配列に結合することを可能にする。最初の４回のＰＣＲは、プライマー対（Ａ_HとＢ_H、Ｃ_HとＤ_H、Ｅ_HとＦ_H、およびＧ_HとＨ_H）とともに１０ngの鋳型を用いて行なった。これらの反応の生成物ＡＢ_HとＣＤ_Hは、１つの反応でプライマーＡ_HとＤ_Hとともに鋳型として使用し、断片ＥＦ_HとＧＨ_Hは、プライマーＥ_HとＨ_Hとともに鋳型として使用した。反応条件は以下の通りである：工程０：９５℃で１２０秒工程１：９５℃で６０秒工程２：４５℃で６０秒工程３：７２℃で９０秒、工程１に行く、このループを２０回繰り返すこれらの反応の生成物（ＡＤ_HとＥＨ_H）をゲル濾過し、各ＤＮＡの半分を最後の反応で、前述の２回目のＰＣＲと同じ反応条件でプライマーＡ_HとＨ_Hとともに鋳型として使用した。得られた生成物をＨｉｎｄIIIとＳｐｅＩで消化し、可変領域を含有する断片を、ヒトＣ_H配列を含有するｐＵＣ１８にクローン化した。両方の鎖の上の挿入体の完全な配列により決定した予測された構造を有するクローンを、選択してさらに操作した。（ｅ）ヒト化抗体のバージョン１の真核生物発現ヒト化ＡＴ１３／５重鎖と軽鎖を、ヒトβアクチンプロモーター下で真核生物発現ベクターにクローン化した。トランスフェクタム（Ｔransfectam）（プロメガ（Ｐromega）、サザンプトン、英国）を用いて、２つのプラスミドを同時トランスフェクションすることにより、Ｂ１１ＣＨＯ細胞中で、重鎖と軽鎖プラスミドが一過性に発現された。培養物上清を、ＥＬＩＳＡでヒトＩｇＧについて測定し、ＣＤ３８−陽性Ｂ細胞株Ｗｉｅｎ１３３を用いてＦＡＣＳ解析によりＣＤ３８結合能について試験した。培養物上清は多量のヒトＩｇＧを含有したが、上清を１０倍濃縮してもＦＡＣＳで抗ＣＤ３８活性は検出されなかった。この結果は、ＡＴ１３／５からＣampa th１ＨおよびＲＥＩヒトフレームワークへのＣＤＲの単純な移植では、抗体特異性を移すには不充分であることを示唆する。従って、ＣＤ３８結合活性を回復するために、一連のフレームワーク変化を試みた。（ｆ）フレームワーク変化抗原結合性を回復するのに重要であることがすでにわかっているほとんどのフレームワーク残基は重鎖可変領域中にあるため、抗体のこの部分に焦点を当てることにした。ヒト化軽鎖をキメラ重鎖作製体（マウス重鎖可変領域をヒトＣ_Hに融合させた）とさらに同時トランスフェクションすると、元々のマウス抗体に匹敵する親和性でＣＤ３８に結合する活性な抗体(以後、ハイブリッド抗体と呼ぶ) が得られた。使用したヒトフレームワークと元々のマウス配列の間の相同性が最も低い領域もまた、重要性が既知のいくつかの残基に近い。ＣＤＲ３配列のすぐ下流にあるこの領域を、突然変異のために選択した。重鎖残基６７〜７１および７３を、組換えＰＣＲを用いて、マウス抗体からヒト化重鎖に移植した。使用したプライマーは以下の通りである：Ａ_H：前述Ｈ_H ：前述。最初のＰＣＲは、プライマー対（Ａ_HとＩ_H、およびＪ_HとＨ_H）とともに１０ng のバージョン１ヒト化重鎖鋳型を用いて行なった。これらの反応の生成物ＡＩ_H とＪＨ_Hを、ゲル濾過し、回収したＤＮＡの半分を、Ａ_HとＨ_Hを用いて２回目のＰＣＲに使用して、ヒト化重鎖可変領域のバージョン２を作成した。これをクローン化し、配列決定し、発現系に移し、次に前述のヒト化軽鎖作製体とともに一過性に同時発現した。トランスフェクションしたＣＨＯ細胞からの培養物上清を、再度ＥＬＩＳＡでヒトＩｇＧについて測定するとヒトＩｇＧが産生されたが、ＦＡＣＳ解析によりＣＤ３８結合能は検出されなかった。さらに、ヒト化重鎖のバージョン１と２の両方に基づく突然変異を、前述の方法と同じ方法により行なった。全部で６つのバージョン３重鎖が産生された（ここで、以下の重鎖フレームワーク残基が、マウス配列からいずれかのヒト化配列に移植されている）：さらに、すべての作製でプライマーＡ_HとＨ_Hを使用した。使用したプライマー配列は以下の通りである：Ａ_H ：前述の配列Ｈ_H ：前述の配列予測される配列を含有する重鎖作製体を、哺乳動物発現ベクターに移し、前述のようにＣＨＯ細胞中でヒト化軽鎖作製体とともに同時トランスフェクションした。ＥＬＩＳＡによる測定によりヒトＩｇＧを含有する組織培養上清を、ＦＡＣＳによりＣＤ３８結合能について測定した。作製体ｈ３Ｋとｈ３Ｏは、ハイブリッド抗体よりは活性が低いが、この測定法で抗原結合性を示した（図７を参照）。（ｇ）２９位と７８位のフレームワーク残基を変化させる方法ｈ３Ｏがハイブリッド抗体より活性が弱い理由を見つけるために、さらに解析すると、重鎖中の２９位と７８位に問題があることが示唆された。重鎖フレームワーク領域中で作成できる突然変異が同定されれば、これらは、種々の標準的方法で産生できる（例えば、部位特異的突然変異誘発、組換えＰＣＲ、およびオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子合成）。抗ＣＤ３８重鎖ＶＨの場合は、組換えＰＣＲを用いて、２８〜２９位および７８位に順番にマウスの残基を導入した。２７、３０、６７、６８、６９、７０、７１、７３および９４位にマウス残基をすでに取り込んでいるヒト抗ＣＤ３８重鎖ＶＨ（前述の（ｆ）で記載のバージョン２）を、最初の突然変異誘発の鋳型として使用した。これを、以下のＰＣＲプライマーを用いて２つの別々の反応で増幅した：プライマーＢとＣにおいて、２８位と２９位のマウス残基をコードするトリプレットに下線を引いた。最初の反応で、鋳型をプライマーＡとＢで増幅した。第２の反応で、鋳型をプライマーＣとＤで増幅した。２つの反応の生成物を精製し、混合し、プライマーＡとＤで増幅した。反応生成物を精製し、ＨｉｎｄIIIとＳｐｅＩで切断し、ＶＨをコードする４５０塩基対の断片を、ヒトγ１ｃＤＮＡカセットを含有するｐＵＣ１８の変種にクローン化した（Ｓimeら、1993；Ｊ. Ｉmmunol,151:2296）。クローンの配列を決定し、２８位と２９位にマウス残基が正しく導入されていることを確認した。次にこれらの変化を取り込んでいるクローンを、２回目の組換えＰＣＲ突然変異誘発の鋳型として用いて、７８位にマウス残基を導入した。前記の方法と同じ方法を用いたが、プライマーＢとＣの代わりにそれぞれプライマーＥとＦ（７８位にマウス残基を取り込んでいるトリプレット（下線）を含有する）を使用した。得られた重鎖（図４を参照）は、ヒト化軽鎖（図３を参照）とともに同時発現すると、重鎖抗ＣＤ３８，ｈｓＳを産生する。（ｈ）機能性ヒト化抗体の真核生物発現さらなる性状解析のための細胞株を作成するために、ヒト化ｈ３Ｓ重鎖とキメラ重鎖をコードするプラスミドを、Ｂ１１ＣＨＯ細胞中にヒト化軽鎖とともに、別々に同時トランスフェクションした。実施例２生物活性（ａ）ＣＤ３８結合試験（ｉ）抗ＣＤ３８抗体の相対的結合親和性に及ぼす種々の重鎖フレームワーク置換の影響結合は、ＣＤ３８陽性細胞のＦＡＣＳ染色により評価した。１つまたはそれ以上のマウスフレームワーク残基を取り込んでいる重鎖を前述のように作成し、ヒト化軽鎖と一緒にして抗体を作成し、これをＣＤ３８への結合について測定して以下の結果を得た。この表で、＋は、記載した位置でヒト化抗体中にマウスフレームワーク残基が取り込まれていることを示し、−は、ヒト残基が残っていることを示す。考察コンピューターモデル実験では、６６〜７３領域がマウスフレームワークに戻る変化は、ヒト化ＣＤＲＨ２がマウス抗体と同様のコンフォメーションを取るようにさせる。しかし、作製体ｈ２が示すように、これは結合には不充分である。モデルはまた、マウス抗ＣＤ３８抗体では、２９位と７８位は小さい残基に占められており、その側鎖は一緒にきちんと詰め込まれ、ＣＤＲＨ１が抗原結合のための正しい配向を取ることを可能にする。ヒト化作製体ｈ１とｈ２では、側鎖はもっと大きいためこのように一緒に詰め込まれることはできず、ＣＤＲＨ１を変形させ、抗原結合を妨害している。モデルのこの面を、図５と６に示す（添付）。図５は、マウス抗ＣＤ３８におけるＣＤＲＨ１（黒い管）の配向を示す。２９位と７８位にヒト残基を有するヒト化作製体中に同じ領域を示す図６では、これらの側鎖の余分な大きさのために、ＣＤＲＨ１コンフォメーションが明らかに変形している。２９位にマウス残基を使用し７８位にヒト残基を使用することによりこの影響が部分的に緩和されるが、得られる抗体の機能は著しく低下している。２９位と７８位の両方でマウス残基を使用すると、ｈ３Ｓ作製体のデータで示されるように活性が回復する。（ii）抗ＣＤ３８重鎖可変領域を、ヒトγ１定常領域に融合させ、ＣＨＯ細胞中でヒト化抗ＣＤ３８軽鎖とともに同時発現させた。同じ実験中で飽和用量のハイブリッド抗体（マウスＶＨ）を用いて得られたシグナルに対して標準化して、ＣＤ３８結合活性を表す。結果を図７に示す。図中、 ◆ ２８、２９、および７８位にマウス残基を有するヒト化抗体 ▲ ２８、２９、および７６位にマウス残基を有するヒト化抗体 ● ２８、２９にマウス残基を有するヒト化抗体 ■ ハイブリッド抗体。上記置換以外に、すべてのヒト化重鎖は、２７、３０、６７、６８、６９、７０、７１、７３、および９４位でマウスフレームワーク残基を含有した。これらだけでは、ＦＡＣＳにより検出可能な結合を得るには不充分である。これらの結果は、完全なヒト化重鎖活性を得るのに２９位および／または７８位の小さい残基が決定的に重要であることを示す。これらはまた、７８位に近い７６位のマウス残基は、活性を回復するのは不可能であるという点で、相互作用の特異性を示す。（ｂ）ＣＤ３８抗体に仲介される抗体依存性細胞障害に及ぼす種々の重鎖フレームワーク置換の影響抗体依存性細胞障害は通常、文献で公知のいくつかの標識放出法の１つにより評価されろ。そのような方法の１つでは、１０⁴個の標的細胞（Ｗｉｅｎ１３３）をユーロピウムで標識し、抗体の存在下でエフェクター:標的比が５０：１で、新たに調製したヒト末梢血に接触させる。４時間後ユーロピウムの放出を検出し、抗体または末梢血リンパ球のない対照反応またはトリトンＸ−１００のような界面活性剤と比較して定量して、溶解を推定する。ヒト化抗ＣＤ３８モノクローナル抗体の溶解能に及ぼすフレームワーク置換の影響を、標識放出測定法で評価した。１３３標的細胞に標識物（５１ＣｒまたはＥｕ）を加え、次に種々の濃度の抗ＣＤ３８抗体の存在下で、新たに調製したヒト末梢血単核細胞に接触させる。細胞毒性は、放出可能な全標識物に対する、抗体処理により放出された比率として表す。結果を図１０に示す。図中： ◆ ２８、２９、および７８位にマウス残基を有するヒト化抗体 ■ ２８、２９、および７６位にマウス残基を有するヒト化抗体 ● ハイブリッド抗体。これらの結果は、２９位と７８位のフレームワーク変化の組合せが、ヒト化重鎖に細胞毒性機能の完全な活性を与えることを示す。２９位での小さなマウス残基の取り込みは、ある程度の結合活性を与える（図７）が、これは完全なエフェクター機能を達成するには不充分である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 16/46 Ｃ０７Ｋ 16/46 // Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ルイス、アラン・ピーターイギリス国、ハートフォードシャーエスジー１・２エヌワイ、スティーブンエイジ、ガナルス・ウッド・ロード、グラクソ・ウエルカム・ピーエルシー内

Claims

【特許請求の範囲】１．異種起源のドナーＣＤＲｓと、ヒトまたは霊長類起源の配列を有する受容側フレームワーク領域領域とを有するモノクローナル抗体であって、重鎖の前記受容側フレームワーク領域の配列の位置２９および／または７８における元のアミノ酸残基が、前記ＣＤＲｓの誘導源である抗体の重鎖の対応するフレームワークの配列の対応する位置におけるそれと同一もしくは類似の置換アミノ酸残基で置き換えられているモノクローナル抗体。２．請求項１に記載のモノクローナル抗体であって、重鎖の受容側フレームワーク領域の配列の位置２９および７８の両者における元のアミノ酸残基が、前記ＣＤＲｓの誘導源である抗体の対応するフレームワークの対応する位置におけるアミノ酸と同一もしくは類似のアミノ酸置換によって置き換えられているモノクローナル抗体。３．請求項１または２に記載のモノクローナル抗体であって、受容側フレームワークの前記元のアミノ酸残基の一方もしくは両方が、前記ＣＤＲｓの誘導源である抗体の対応するフレームワークの対応する位置におけるアミノ酸と同様の大きさ、疎水性および電荷の置換アミノ酸残基によって置き換えられているモノクローナル抗体。４．請求項１〜３の何れか１項に記載のモノクローナル抗体であって、受容側フレームワーク領域の前記元の二つのアミノ酸残基は同一もしくは異なり、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンまたは２−フェニルアラニンであるモノクローナル抗体。５．請求項４に記載のモノクローナル抗体であって、前記置換アミノ酸残基は同一もしくは異なり、グリシン、アラニン、バリン、セリンまたはロイシンから選択されるモノクローナル抗体。６．請求項１〜５の何れか１項に記載のモノクローナル抗体であって、前記受容側フレームワーク領域が、ＬＥＳ−Ｃ、Ｔ５２、Ａｂ４４、ＨＩＧＩおよびＮＥＷから選択される重鎖に由来するモノクローナル抗体。７．請求項１〜６に記載のモノクローナル抗体であって、前記ＣＤＲｓの起源ははラット、マウス、ウサギまたはハムスターであるモノクローナル抗体。８．請求項１〜７の何れか１項に記載のモノクローナル抗体であって、前記ＣＤＲｓの誘導源である抗体の重鎖は、コバット群(Ｋobat groups)ＩＢおよびII Ｃにおけるネズミ重鎖であるモノクローナル抗体。９．請求項１〜８の何れか１項に記載のモノクローナル抗体であって、該抗体はＣＤ３８に結合するモノクローナル抗体。１０．請求項９に記載のモノクローナル抗体であって、図３，３ａおよび４に示したヌクレオチド配列を有するモノクローナル抗体。１１．請求項１〜１０の何れか１項に記載のモノクローナル抗体であって、前記ドナーＣＤＲがＣＤＲＨ１であるモノクローナル抗体。１２．請求項１１に記載のモノクローナル抗体であって、ＣＤＲＨ１が、ＳＹＧＶＨの配列を有するモノクローナル抗体。１３．請求項１〜１２の何れか１項に記載のモノクローナル抗体を製造する方法であって、（ｉ）ドナー重鎖の配列を得る工程と、（ｉｉ）ベストフィット相同性法(best-fit homology method)によって、受容側のヒトまたは霊長類フレームワークを選択する工程と、（ｉｉｉ）前記重鎖の受容側フレームワーク領域の配列の位置２９または７８におけるアミノ酸を、ＣＤＲｓの誘導源である抗体の対応するフレームワーク領域の配列の対応位置におけるアミノ酸と同一もしくは類似のアミノ酸によって置き換える工程と、（ｉｖ）ドナーＣＤＲｓを、受容側ヒトフレームワークの中に移植する工程とを具備した方法。１４．癌および自己免疫疾患の治療のための、請求項１〜１２の何れか１項に記載の抗体の使用。１５．多発性骨髄腫、リンパ種およびリウマチ性関節炎のような自己免疫疾患の治療のための、請求項９または１０に記載の抗体の使用。１６．癌または自己免疫疾患の治療用医薬を製造するための、請求項１〜１２の何れが１項に記載の抗体の使用。１７．多発性骨髄腫、リンパ種またはリウマチ性関節炎の治療用医薬を製造するための、請求項１〜１２の何れか１項に記載の抗体の使用。１８．請求項１〜１２の何れが１項に記載の抗体と、生理学的に許容され得る希釈剤またはキャリアとを含有する薬学的組成物。