FR2669936A1 - Anticorps monoclonal capable de se fixer a la chaine lourde des recepteurs a l'il-2 humaine. - Google Patents

Abstract

Anticorps monoclonal se fixant à la chaîne lourde du récepteur à l'IL-2 humaine et possédant les propriétés de fixation à la chaîne lourde du récepteur à l'IL-2 humaine, d'inhibition de la fixation de l'IL-2 humaine à la chaîne lourde du récepteur à l'IL-2 humaine et d'inhibition des propriétés physiologiques de l'IL-2 humaine. Cette substance est utile comme immunosuppresseur dans la prévention du rejet des greffes d'organes ou le traitement des maladies auto-immunes.

Description

La présente invention concerne un anticorps monoclonal capable de se fixer à La chaine lourde des récepteurs à L'IL-2 humaine, possédant les activités d'inhibition à la fois de La fixation de l'IL-2 humaine à la chaine Lourde des récepteurs a l'IL-2 humaine et L'activité physiologique de l'IL-2 humaine.

L'anticorps monoclonal selon la présente invention, seul ou associé à L'anticorps monoclonal dirigé contre la chaine Légère des récepteurs à l'IL-2, est une substance utile comme immunosuppresseur utilisable dans la prévention du rejet dans la transplantation d'organes ou Le traitement des maladies auto-immunes. Dans la présente invention, l'interleukine 2 et le récepteur à l'interLeukine 2 sont abrégés en IL-2 et récepteur à L'IL-2, respectivement.

A L'heure actuelle ou les techniques chirurgicales de transplantation d'organes se sont notablement améliorées, le succès ou L'échec des interventions pour transplantation d'organes peut dépendre de la façon dont est prévenu le rejet postopératoire du greffon transplante. Le rejet est provoqué par l'induction d'une série de réactions immunitaires, car L'organisme vivant reconnaît
Le greffon transplanté comme un corps étranger et tente de l'expul- ser. Par conséquent, les médicaments appelés immunosuppresseurs tels que les agents stéroidiens, l'azathiopurine, le méthothrexate,
La 6-mercaptopurine, etc. sont administrés en vue de la prévention du rejet. Mais aucune améLioration notable n'a été observée en raison de leur marge d'innocuité réduite ou de leur effet insuffisant. La ciclosporine mise au point au cours des dernières années a contribué à une amélioration importante.

Mais on constate cependant que la ciclosporine implique une toxicité rénale grave, de sorte que son administr tion doit être limitée. La mise au point d'immunosuppresseurs plus efficaces, ayant une securité d'emploi supérieure, est donc désirée.

IL-2 est une protéine produite par Le lymphocyte T auxi Liaire et un facteur tres important de ta protection virale, qui joue des rôles variés, tels que l'induction de la prolifération ou de La différenciation de ceLLuLes tueuses T ou l'induction de [a différenciation de Lymphocytes B in vivo, dans de Larges domaines.

Dans la transplantation d'organes ou la transplantation de moelle osseuse, on suppose que les ceLLuLes tueuses T activées par l'IL-2, etc. participent activement à La réaction de L'hôte contre le greffon (réaction HVG) ou à la réaction du greffon contre L'hôte
(réaction GVH) qui est considérée comme une clé du rejet de la greffe. D'autre part, on considère que les maladies auto-immunes sont provoquées par un déséquilibre du système immunitaire dans
l'organisme vivant et, par conséquent, par une attaque dirigée contre L'organisme vivant meme. Il est fort probable qu'en particulier la production excessive des facteurs impliqués dans le système immunitaire, incluant l'IL-2, ou des réactions excessives qui leur sont associées sont fortement à l'origine de La maladie immune.

Partant de ces aspects, on considère à présent que, si la réaction vitale incluant l'IL-2 pouvait être inhibée sélectivement et efficacement, il serait possible de prévenir Le rejet au cours de la greffe d'organes ou de traiter les maladies auto-immunes. De fait, lorsque de L'IL-2 à laquelle avait été liée une cytotoxine
Lésant sélectivement les cellules réagissant à l'IL-2 et portant le récepteur IL-2 est administrée à un rat souffrant d'arthrite par adjuvant, Le début de l'arthrite est retardé et son état amélioré (Proceedings of the National Academy of Science of U.S.A., 86, 287, 1989); lorsque de l'IL-2 est administrée à la souris lors d'une homogreffe cardiaque, Le rejet du coeur greffé est inhibé (Proceedings of the NationaL Academy of Science of U.S.A., 86, 1008, 1989). Mais L'IL-2 à laquelle est fixée une cytotoxine a une demivie brève, de sorte qu'il est nécessaire de l'administrer en une dose importante, ce qui pose la question des effets secondaires. On désire, par conséquent, que soit mis au point un médicament présentant une sécurité d'emploi supérieure et qui puisse contrôler la réaction effective à l'IL-2.

On sait que le récepteur à l'IL-2 humaine sur les cel Lules réagissant à L'IL-2 humaine est constitué par deux molécules de glycoprotéine de poids moléculaires égaux à environ 75 000 et environ 55 000, toutes deux capables de se fixer à L'IL-2 humaine (Proceedings of the National Academy of Science of U.S.A., 84, 2002, 1987). On a constaté que la constante d'association de La fixation entre chaque molécule et l'IL-2 humaine est de 10 8 M dans
-9 le cas de la chaine Légère et de 10 M dans Le cas de la chaîne lourde, mais, lorsque les deux molécules de La chaîne Légère et de la chaine lourde sont en contact L'une avec L'autre pour former le produit de L'association de trois molécules comprenant l'IL-2, la fixation possède une affinité élevée, se traduisant par une constante d'association élevée de 10-12 M. En outre, dans la cellule ou la chaine légère seule est exprimée, il ne se produit aucune réaction de réponse, bien que l'IL-2 humaine soit liée; mais, dans la cellule où (1) la chaine Lourde ou (2) la chaine lourde et la chaine Légère sont exprimées, diverses activités physiologiques sont induites par la fixation de l'IL-2 humaine. IL a donc été considéré que la présence de la chaine Lourde est nécessaire pour que s'exerce la fonction physiologique de L'IL-2 humaine (Jikken
Igaku CExperimental Medicine], 6, 606, 1988). Ce qui signifie qu'on assume que, si la fixation entre L'tL-2 humaine et La chaîne lourde est inhibée, la réaction à l'IL-2 humaine sera supprimée. Pour inhiber La fixation entre l'IL-2 humaine et la chaîne lourde du récepteur à l'IL-2 humaine, un anticorps possédant une activité de fixation à La chaîne lourde du récepteur à L'tL-2 humaine entre en ligne de compte. De fait, certains anticorps capables de se fixer à la chaine lourde du récepteur à l'IL-2 humaine pour faire preuve d'une activité d'inhibition de la Liaison entre la chaîne lourde du récepteur à l'IL-2 humaine et l'IL-2 humaine ont déjà été rapportés (Proceedings of the National Academy of Science of U.S.A., 86, 1982, 1989; Journal of Experimental Medicine, 169, 1323, 1989).

Les présents inventeurs ont rapporté antérieurement un anticorps Anticorps monoclonal TU27 (anticorps monoclonal produit par l'hybridome FERM BP-2510) (FERM = Fermentation Research Institute, Japon)] (cf. demande de brevet japonais mise à la
o disposition du public n 2-200198). Mais on a constaté que, lorsque ces anticorps sont appliqués en une concentration conventionnelle, la fixation entre l'IL-2 humaine et la chaine lourde du récepteur à l'IL-2 humaine est inhibée, alors que L'activité physiologique de l'IL-2 humaine n'est pas inhibée. On considère que
La raison en est La mauvaise affinité de ces anticorps pour la molécule de la chaîne Lourde et, par conséquent, ('impossibilité à inhiber la formation du récepteur présentant une affinité élevée par association des molécules de La chaîne lourde néoformées successivement à la surface cellulaire durant l'incubation dans des conditions physiologiques avec la chaîne Légère. Par conséquent, lorsque ces anticorps sont administrés au maLade, Leur concentration sanguine doit être maintenue à un niveau notablement élevé, ce qui donne lieu à des effets secondaires potentiels et rend l'usage clinique réel impossible. Pour résoudre ce problème, il est nécessaire d'utiliser un anticorps capable de se fixer à la molécule de la chaîne lourde du récepteur à l'IL-2 humaine avec une affinité très éLevée ou, de préférence, d'utiliser un tel anticorps et un anticorps capable de se fixer à la chaîne Légère du récepteur à
L'IL-2 humaine, en association, pour inhiber la fixation de l'IL-2 humaine possédant une affinité aussi élevée. Mais on ne con nait pas à L'heure actuelle d'anticorps capable de se fixer à la chaîne lourde du récepteur à l'IL-2 humaine avec une affinité très élevée pour inhiber ainsi par lui-meme L'activité physiologique de l'IL-2 humaine. On ne connaît pas non plus d'agent thérapeutique comprenant un tel anticorps et un anticorps capable de se fixer à
La chaîne Légère du récepteur à l'IL-2 humaine, en association.

Un objet de La présente invention est par conséquent de fournir un anticorps monoclonal capable de se fixer au récepteur à L'tL-2 humaine avec une affinité très élevée et présentant une activité d'inhibition non seuLement de La fixation entre L'IL-2 humaine et la chaine Lourde du récepteur à L'tL-2 humaine, mais également de L'activité physiologique de L'IL-2 humaine.

L'anticorps monoclonal selon la présente invention est destiné à être utiLisé comme immunosuppresseur utile dans la prévention du rejet provoqué lors de la greffe d'organes et dans le traitement des maLadies auto-immunes.

Pour résoudre les problèmes susmentionnés, les présents inventeurs ont préparé un certain nombre d'anticorps monoclonaux capables de se fixer à la chaine lourde du récepteur à L'IL-2 humaine et sélectionné un anticorps capable de se fixer à la chaine Lourde du récepteur à l'IL-2 humaine avec une affinité très élevée et capable d'inhiber L'activité physiologique de l'IL-2 humaine, et sont ainsi parvenus à la réalisation de la présente invention. C'est-à-dire qu'il est fourni selon la présente invention un hybridome qui peut produire un anticorps monoclonal capable de se fixer à la chaine lourde du récepteur à L'IL-2 humaine et capable d'inhiber l'activité physiologique de l'IL-2 humaine, de meme qu'un anticorps monoclonal présentant une propriété uniforme, produit par L'hybridome.

L'hybridome selon la présente invention est sélectionné en tant que clone capable de produire un anticorps monoclonal qui peut se fixer à la molécule de la chaîne lourde du récepteur à l'IL-2 humaine et inhiber L'activité physiologique de l'IL-2 humaine, par production d'un hybridome entre une cellule de myélome et une cellule produisant des anticorps présente dans la rate ou les ganglions lymphatiques de L'animal immunisé par la cellule humaine qui exprime la chaine Lourde du récepteur à l'IL-2 humaine à un taux élevé, culture et clonage de l'hybridome.

On peut récupérer L'anticorps monoclonal désiré dans le surnageant de culture d'un tel clone, par des opérations de purification, par exemple relargage, chromatographie d'échange d'ions, etc. Pour récolter l'anticorps monoclonal en grandes quantités, on inocule l'hybridome obtenu par voie intrapritonéale à des souris nude athymiques, etc. pour cultiver l'hybridome et on récupère l'anticorps monoclonal produit dans L'ascite de L'animal et on le purifie par le procédé tel que décrit ci-dessus.

IL est décrit à présent dans la suite un procédé de préparation de l'anticorps monoclonal capable de se fixer à la chaine lourde du récepteur à L'IL-2 humaine et capable d'inhiber l'acti- vité physiologique de l'IL-2 humaine.

L'hybridome est préparé par fusion d'une cellule de myélome avec une cellule produisant des anticorps. On peut utiliser comme cellule produisant des anticorps une cellule de rate ou de ganglion lymphatique d'un animal tel qu'une souris ou un rat, immunisé par une cellule TL-Mor qui est une Lignée de lymphocytes T infectée par le virus du syndrome immunodéficitaire acquis de l'adulte, qui exprime la chaîne lourde du récepteur à l'IL-2 humaine à un taux élevé. On peut utiliser n'importe quelle cellule comme cellule à immuniser, pour autant qu'il s'agisse d'une cellule humaine exprimant la chaîne Lourde du récepteur à l'L-2 humaine.

On peut également utiliser comme immunogène La molécule de la chaine lourde en soi, purifiée à partir de ces cellules.

Les espèces animales sur lesquelles sont prélevées La cellule produisant les anticorps et la cellule de myélome peuvent être différentes, pour autant que les deux cellules puissent fusionner l'une avec L'autre, mais on obtient généralement de bons résultats lorsqu'on utilise des cellules d'une même espèce. Un hybridome préférable pour la mise en oeuvre de la présente invention est celui réalisé entre une cellule de rate ou une cellule de ganglion lymphatique d'une souris immunisée par une cellule TL-Mor qui est une Lignée de lymphocytes T infectée par le virus du syndrome immunodéficitaire acquis de l'adulte et une cellule de myélome de la souris. Par exempLe, l'hybridome réalisé entre la cellule de rate d'une souris Balb/c immunisée par une suspension de cellules TL-Mor dans une solution salée et une cellule de myélome SP2/O-Ag14 de souris Balb/c a donné d'excellents résultats, comme montré par l'exemple qui sera présenté ultérieurement. On peut utiliser comme cellule de myélome, en plus des cellules SP2/0-Ag14, des lignées cellulaires résistantes à la 8-azaguanine telles que
X63-Ag8-6.5.3, P3-X63-Ag8-U1, P3-X63-Ag8, P3-NS 1/1 -Ag4-1, MCP11-4.5.6TG1.7 (qui sont toutes des cellules de souris), 210.RCY.Ag1.2.3 (cellule de rat), SKL-007 et GH15006TG-A12 (qui sont des cellules humaines). La préparation des hybridomes et la élection parmi les hybridomes du clone qui produit l'anticorps monoclonal capable de se fixer à la chaîne lourde du récepteur à l'IL-2 humaine et capable d'inhiber l'activité physiologique de l'IL-2 humaine peuvent s'effectuer par exemple comme suit. On fait fusionner la cellule produisant des anticorps avec une cellule de myélome en utilisant le polyéthyléneglycol ou le virus Sendai. Seul
L'hybridome fusionné peut être cultivé dans un milieu contenant de l'hypoxanthine, de la thymidine et de l'aminopurine (milieu HAT).

Tous les hybridomes obtenus ne produisent pas d'anticorps et tous les hybridomes produisant un anticorps ne produisent pas l'anticorps désiré. Par conséquent, il faut sélectionner parmi ces clones d'hybridome le clone d'hybridome qui produit l'anticorps monoclonal capable de se fixer à la chaine Lourde du récepteur à l'IL-2 humaine et capable d'inhiber L'activité physiologique de l'IL-2 humaine.

On peut procéder à cette sélection en utilisant, par exemple, le procédé suivant. On prépare pour criblage primaire de l'IL-2 humaine marquée au 125I et on détermine L'inhibition de la
125 fixation de l'IL-2 humaine marquée au 1 à La cellule TL-Mor qui exprime à la fois la molécule de la chaîne lourde et la chaîne Légère du récepteur à l'IL-2 humaine, par le surnageant de culture de l'hybridome. On détermine comme criblage secondaire l'activité
125 d'inhibition de la fixation de l'IL-2 humaine marquee au 25I à la cellule MT-1 qui est une lignée de lymphocytes T infectée par le virus du syndrome immunodéficitaire acquis de l'adulte, qui n'exprime que la chaine Légère du récepteur à l'IL-2 humaine.

L'hybridome qui possède L'activité d'inhibition de la fixation de la celluLe TL-Mor à l'lL-2 humaine mais ne possède pas d'activité d'inhibition de la fixation de la cellule MT-1 à l'lL-2 humaine est
L'hybridome qui produit l'anticorPs dirigé contre la chaine lourde du récepteur à l'IL-2. Pour préparer l'IL-2 humaine marquée au 1251, on peut employer un procédé quelconque parmi le procédé de
Bolton-Hunter (Biochemical Journal, 133, 529, 1973), le procédé à la lactoperoxydase (Nature, 269, 309, 1977), le procédé à la chloramine-T (Nature, 194, 495, 1962), etc., pour autant que l'IL-2 humaine possède l'activité physiologique. On peut employer ntim- porte quelle cellule comme cellule utilisée pour le criblage primaire, pour autant qu'il s'agisse d'une cellule humaine qui exprime à la fois la chaine lourde et la chaine légère. On peut utiliser n'importe quelle cellule pour le criblage secondaire, pour autant qu'il s'agisse d'une cellule humaine qui exprime soit la chaine lourde, soit la chaine légère. Le surnageant de culture du clone d'hybridome qui produit L'anticorps monoclonal dirigé contre la chaine lourde du récepteur à l'IL-2 humaine est ajouté à la cellule
ILT-Mat qui est une lignée de lymphocytes T infectée par le virus du syndrome immunodéficitaire acquis de l'adulte et dont la croissance est dépendante de l'IL-2 humaine et on détermine L'activité d'inhibition de La croissance de la cellule ILT-Mat. Le clone d'hybridome qui présente l'activité d'inhibition de la croissance est le clone d'hybridome qui produit l'anticorps monoclonal désiré.

Un exemple de L'hybridome ainsi obtenu est une cellule appelée hybridome TU25 (FERM BP-3529).

En ce qui concerne à présent un procédé de préparation de l'anticorps monoclonal en grandes quantités, on inocule la cellule
TU25 (FERM BP-3529) dans la cavité abdominale d'un animal histocompatible ou d'une souris nude athymique en vue de sa culture.

On récupère l'anticorps produit dans l'ascite de l'animal et on le purifie par des opérations telles que relargage, chromatographie d'échange d'ions, etc.

L'anticorps monoclonal ainsi obtenu possède à présent les propriétés suivantes.

Anticorps monoclonal anti-chaine lourde de récepteur à l'IL-2 humaine, produit par TU25 (FERM eP-3529) (appelé ci-apres anticorps monoclonal TU25)
(a) Type d'immunoglobuline : IgG1.

(b) Poids moléculaire : 150 000 daltons.

(c) Coefficient d'extinction moléculaire : E280nm = 14,0.

(d) Il se fixe spécifiquement à la chaine lourde du ré
cepteur à l'IL-2 humaine.

(e) IL inhibe la fixation de l'tL-2 humaine à la chaîne
lourde des récepteurs à L'IL-2 humaine.

(f) IL inhibe l'activité physiologique de L'IL-2 humaine.

L'anticorps monoclonal TU25 ainsi préparé peut inhiber par lui-meme L'activité physiologique de l'IL-2 humaine. Par conséquent, L'anticorps monoclonal TU25 peut être utilisé seul ou en association à un anticorps capable de se fixer à la chaîne
Légère du récepteur à l'IL-2 humaine, par exemple l'anticorps monoclonal 2R12 disponible dans le commerce (fabriqué par T Cell
Science Co.). La composition immunosuppressive selon la présente invention peut contenir en outre d'autres immunosuppresseurs tels que la ciclosporine, etc., divers stabilisants et divers excipients.

La figure unique présente l'activité d'inhibition de l'activité physiologique de L11L-2 humaine par emploi de L'anticorps monoclonal TU25 seul ou associé à L'anticorps monoclonal dirigé contre la chaine légère du récepteur à l'IL-2.

On peut utiliser ces agents comme immunosuppresseurs pour la prévention du rejet dans la greffe d'organes ou pour le traitement des maladies auto-immunes.

L'anticorps monoclonal anti-chaine lourde de récepteur à l'IL-2 humaine selon la prévente invention peut être incorporé dans l'immunosuppresseur généralement en une quantité de 0,1 à 100% en poids, de préférence de 0,5 à 70% en poids. Il va de soi que la quantité n'est pas limitée à la plage susmentionnée.

On peut administrer l'immunosuppresseur par voie orale, sous-cutanée ou intraveineuse ou par goutte-å-goutte dans la veine, etc., de préférence par voie intraveineuse ou goutte-å-goutte dans la veine.

Lorsque L'anticorps monoclonal selon la prévente invention est utilisé sous la forme d'une injection ou d'un goutte-àgoutte, on dissout l'anticorps monoclonal Lyophilisé, au moment de l'emploi, dans de L'eau distillée stérile pour injection, exempte de bactéries ou de pyrogénes, définie dans la Pharmacopée Japonaise. Après confirmation de la dissolution complète de l'anticorps, on administre l'injection au patient souffrant de maladie auto-immune ou au patient pour lequel est prévue une intervention pour greffe d'organes ou pour greffe de moelle osseuse ou en postopératoire.

La voie d'administration est de préférence l'injection intraveineuse ou Le goutte-å-goutte, comme indiqué plus haut. On peut varier la concentration ou La posologie en fonction du malade ou de L'état du malade, mais, lorsque L'anticorps capable de se fixer à la chaîne Lourde du récepteur à L'IL-2 humaine est utilisé seul, L'anticorps ayant une concentration de 5 à 250 mg/ml est administré en une dose d'environ 1 à environ 50 mg/kg/j; lorsque
L'anticorps monoclonal selon la prévente invention est utilisé en association avec l'anticorps capable de se fixer à la chaîne légère du récepteur à L'IL-2 humaine, les anticorps ayant chacun une concentration de 5 à 250 mg/ml sont administrés chacun en une dose d'environ 1 à environ 50 mg/kg/j. De nouveau, la posologie indiquée ici ne L'est qu'à titre d'exemple et peut être choisie de façon appropriée en fonction de l'état de chaque malade.

La préparation immunosuppressive selon la présente invention est préparée selon le procédé conventionnellement utilisé pour préparer des préparations de protéines. C'est-à-dire que la préparation immunosuppressive peut contenir de la gélatine, de La sérumalbumine humaine, etc. comme excipients inertes vis-å-vis de l'immunosuppresseur selon la prévente invention; divers acides aminés comme stabilisants; et, si nécessaire, des solutions tampons, des agents de conservation, etc.

L'anticorps utilisé dans la présente invention peut être
L'anticorps en soi, mais on peut également utiliser un fragment
Fab, un fragment F(ab)'2, un fragment ou une région V uniquement, pour autant que le fragment possède la capacité de se fixer à l'antigéne. On peut également utiliser en outre un anticorps chimère dans lequel la région C est remplacée par un autre type, l'anticorps auquel sont fixés d'autres polypeptides ou un agent cytotoxique, un complexe métallique, etc.

La présente invention va être décrite de façon détaillée dans la suite, par référence aux exemples.

(Exemple 1. Préparation d'hybridome et d'anticorps monoclonal)
On a administré par voie intrapéritonéale une suspension de cellules TL-Mor dans une solution salée à des souris femelles
Balb/c de 6 à 8 semaines, en une dose de 1 x 107 par souris. Dix jours après l'administration, on a réitéré la même opération en vue d'une administration de rappel. Cinq jours plus tard, on a prélevé du sang par la veine orbitaire des souris. On a déterminé le titre d'anticorps par détermination de l'activité d'inhibition de la fixation de l'IL-2 humaine marquée au 1251 à la cellule
TL-Mor selon le procédé décit ci-dessous. La souris présentant un titre d'anticorps élevé a été soumise à une administration de rappel finale par la même opération. Trois jours plus tard, on a prélevé la rate. On a mélangé les cellules de rate et Les cellules de myélome de souris (SP2/0-Ag14) dans un rapport de numération cellulaire de 10 : 1, en présence de polyéthyléneglycol nO 4000 à 50% (fabriqué par Nakarai Chemical Co.) pour provoquer la fusion cellulaire. Les cellules résultant de la fusion ont été mises en suspension dans du milieu RPMI 1640 (fabriqué par Gibco Co.) contenant 10% de sérum de veau foetal (fabriqué par Gibco Co.) à raison
6 de 5 x 106 cellules/ml. La suspension a été introduite séparément par fractions de 100 pl sur une plaque à fond plat de 96 puits
(fabriquée par Corning Co.), chaque puits contenant 5 x 105 cellu
les de thymus de souris. 1, 2, 3 et 6 jours plus tard, on a remplacé la moitié du milieu par un milieu contenant de l'hypcxan- thine, de l'aminopurine et de la thymidine (milieu HAT), puis on a répété cette opération tous les 3 jours. Deux semaines environ après la fusion, on a déterminé L'activité d'inhibition de la fixation de l'IL-2 humaine marquée au 1251 à la cellule TL-Mor et l'activité d'inhibition de la fixation de la cellule MT-1 dans le surnageant de culture de chaque puits dans lequel était cultivée la cellule fusionnée (hybridome), selon le procédé indiqué dans l'exemple de référence décrit ultérieurement. On a cloné par dilution Limitante l'hybridome contenu dans le puits présentant l'acti- vité d'inhibition de la fixation à la cellule TL-Mor mais ne présentant pas d'activité d'inhibition de la fixation à la cellule
MT-1. On a en outre déterminé L'activité d'inhibition dans le surnageant de culture de chaque clone d'hybridome pour obtenir un hybridome produisant un anticorps anti-chaine lourde de récepteur à L'IL-2 humaine. En outre, on a examiné la capacité du surnageant de culture de L'hybridome producteur d'anticorps anti-chaine lourde de récepteur à l'IL-2 humaine obtenu à supprimer L'activité physiologique de l'IL-2 humaine, par le procédé suivant. On a mis en suspension des cellules ILT-Mat dans un milieu RPMI 1640 (fabriqué par Gibco Co.) contenant 10% de sérum de veau foetal (fabriqué par Gibco Co.) en une concentration de 2 x 5 cellules/ml. La suspension a été introduite séparément par frac tions de 100 pI sur une plaque à fond plat de 96 puits (fabriquée par Corning Co.) et on a ajouté 50 yl du surnageant de culture de l'échantillon, puis on a incubé à 370C pendant 30 min.

La cellule ILT-Mat est une lignée cellulaire humaine dont la croissance est dépendante de l'IL-2 humaine. En outre, on a ajouté 50 pl de solution d'IL-2 recombinée humaine, préparée à raison de 200 unitésjml avec du milieu RPMI 1640 contenant 10% de
o veau foetal, au système, puis on incubé à 37 C pendant 48 h en
3 présence de 5% de C02. On a ajouté 1 pCi de thymidine-3H (fabriquée par Du Pont) au système pendant les 4 dernières heures et on a poursuivi L'incubation. On a mesuré la radioactivité absorbée dans la cellule à l'aide d'un compteur à scintillation (fabriqué par Packard), ce qui a permis de déterminer la capacité d'inhibition de l'activité physiologique de l'IL-2 humaine par le surnageant de culture. Il existe comme clone d'hybridome sélectionné comme décrit ci-dessus, le TU25 (FERM 8P-3529).

L'anticorps monoclonal TU25 produit par l'hybridome TU25 (FERM BP-3529) a été préparé comme suit. On a injecté par voie intrapéritonéale l'hybridome TU25 (FERM BP-3529) à raison de 1 x 107 cellules/souris à des souris femelles Balb/c de 8 semaines auxquelles on avait administré préalablement par voie intrapérito néale du Pristane (fabriqué par Wabo Pure Chemical Inc.) en une dose de 0,5 ml/souris une semaine auparavant. Dix jours plus tard, on a recueilli L'ascite de la cavité abdominale des souris et on a séparé les cellules par centrifugation. Après relargage avec du sulfate d'ammonium saturé à 40%, on a procédé à une dialyse contre un tampon phosphate 10 mM (pH 7,5) contenant du NaCl 0,15 M. On a ajo

(Exemple 2. Effet d'inhibition de la croissance de la cellule
ILT-Mat d'une lignée cellulaire dépendante de L'IL-2 en présence de
l'anticorps monoclonal TU25 seul ou associé à l'anticorps antichaine Légère de récepteur à l'IL-2).

On a préparé une suspension de cellules ILT-Mat dans du milieu RPMI 1640 (produit par Gibco Co.) contenant 10% de sérum de veau foetal (fabriqué par Gibco Co.) à raison de 2 x cellules/ml. On a introduit la suspension par fractions de 100 PI sur une plaque à fond plat de 96 puits (fabriquée par Corning Co.).

On a préparé L'anticorps monoclonal TU25, L'anticorps monoclonal de souris anti-chaîne Légère de récepteur à 1'IL-2 humaine, l'anticorps monoclonal connu de souris anti-chaine Lourde de récepteur à L'IL-2 humaine et, en guide de témoin, l'anticorps monoclonal de souris, dans 50 pg/ml avec du milieu RPMI 1640 contenant 10% de sérum de veau foetal et on a ajouté 50 pl (1) de l'anticorps monoclonal TU25 seul, (2) de l'anticorps monoclonal de souris témoin seul ou (3) d'un mélange en solution de l'anticorps monoclonal TU25 et de l'anticorps monoclonal de souris anti-chaîne Légère de récep
O teur à L'IL-2 humaine, puis on a incubé à 37 C pendant 30 min. On a ajouté au système 50 pl supplémentaires de solution d'IL-2 recombinée humaine préparée en diverses concentrations avec du milieu RPMI 1640 contenant 10% de sérum de veau foetal et on a
O incubé à 37 C pendant 48 h en présence de 5% de C02. On a ajouté au
3 système 1 pCi de thynidine- H (fabriquée par Du Pont) pendant les quatre dernières heures et on a poursuivi l'incubation. On a mesuré la radioactivité absorbée par la cellule à l'aide d'un compteur à scintilLation (fabriqué par Packard), ce qui a permis de déterminer la capacité d'inhibition de l'activité physiologique de L'IL-2 humaine par L'anticorps. L'activité physiologique de l'IL-2 humaine était notablement inhibée par l'addition de l'anticorps monoclonal
TU25 seul, par comparaison à celle provoquée par L'anticorps monoclonal TU27 connu de souris anti-chaine Lourde de récepteur à l'IL-2 humaine (anticorps monoclonal produit par FERM 8P-2510).

L'addition en association avec l'anticorps monoclonal TU 25 antichanne Légère et l'anticorps monclonal de souris anti-récepteur à l'IL-2 humaine en association révèle que l'activité physiologique de l'lL-2 est totalement inhibée, même à une concentration élevée.

Employant l'anticorps monoclonal seul ou associé à l'anticorps capable de se fixer à la chaine Légère du récepteur à l'IL-2 humaine, la présente invention est utilisable comme immunosuppresseur utile pour prévenir le rejet dans la greffe d'organes ou pour traiter les maladies auto-immunes.

Claims (4)

REVENDICATIONS

1. Anticorps monoclonal se fixant à la chaine lourde du récepteur à l'IL-2 humaine, caractérisé en ce qu'il posséde les propriétés suivantes

(a) il se fixe à la chaine lourde du récepteur à l'IL-2

humaine,

(b) il inhibe la fixation de l'IL-2 humaine à la chaîne

lourde du récepteur à l'IL-2 humaine, et

(c) il inhibe les propriétés physiologiques de L'tL-2

humaine.

2. Anticorps monoclonal selon la revendication 1, caracte- rise en ce que ledit anticorps monoclonal est L'anticorps monoclonal TU25 (FERM BP-3529).

3. Immunosuppresseur, caractérisé en ce qu'il comorend un anticorps monoclonal selon la revendication 1 cu 2.

4. Immunosuppresseur selon La revendication 3, caracterise en outre en ce qu'il comprend un anticorps anti-chaine légère de récepteur à l'IL-2 humaine.