KR100533854B1 - 항-cd6 단일클론항체 및 이를 포함하는 건선치료용 약제조성물 - Google Patents

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Abstract

CD6 항체를 인식하는 단일클론항체에서 약제 제조법은 건선과 같은 형태의 병을 갖고 있는 환자들에게 효과적으로 임상적인 조직학적으로 치료할 수 있다.

Description

항-CD6 단일클론 항체 및 이를 포함하는 건선치료용 약제 조성물{MONOCLONAL ANTIBODIES ANTI-CD6 AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF PSORIASIS WHICH CONTAINS THE MONOCLONAL ANTIBODIES}
본 발명은 면역학에 관한 것으로서 특히 CD6 백혈구 분화 항원(CD6 leukocyte differentiation antigen)을 인식하는 단일클론 항체를 포함하는 제약 화합물을 얻는 것에 관한 것이다.
단일클론항체(mAbs)는 세포면에 나타나는 생리적 중요성을 갖는 분자들의 특성 기술을 가능하게 했다.
면역체계의 세포들에 한정된 "백혈구 분화군 또한 항원(CD)(Scholossman, S.F.등 1994 면역학 Today 15(3);98). 개체발생중 임파세포의 분화 및 성숙에 있어서 CD들의 역할에 대한 정의는 면역반응동안 세포적 인식 및 착생의 메카니즘에서 그리고 활성화와 증식의 메카니즘에서 유망한 결과와 함께 진단 및 면역제 치료법 분야에서 개개의 mabs를 사용하여 시행되어 왔다(Dental, J , 등(1991) Curr. Opin. Immunol. 3;740).
인간의 T임파구의 세포막에 나타난 분자들에 대항하는 뮤린 mAbs는 이러한 세포들의 기능장애가 존재하는 임상 실체의 진단을 향상시키는데 기여해 왔다. 더욱이 이식거부반응, 이식편대숙주병(GVHD), 자가면역병의 경우에서와 같이 그들의 기능적 활동을 조정하기 위한 목적으로 새로운 치료적 접근을 개척해 왔다(Waldman, T.A(1991) Science 252; 1657; Waldman, T.A(1992) Auun. Rev. Immunol. 10;672).
CD6는 충분히 특성화된 분자가 아니다. CD6는 동적 평형에서 유지되는 두개의 분자형태로 존재하며 인산화 반응의 등급에서만 차별되는 당단백질로 알려져 있다. 휴지하는 T임파구에 있어서 CD6은 105kDa의 인산화된 분자이며, 반면 활동중인 세포에 있어서 CD6는 130kDa의 하이퍼포스포릴레이티드(Cardenas, L. et al. (1990) J . Immunol. 145:1450; Swack J .A. et al.(1991) J. Biol. Chem. 266: 7137)이다. 독특한 구조를 가진 막 수융체군 및 분비단백질의 멤버(Kodama, T. et al. (1990) Nature 343: 531; Aruffo, A. et al. (1991) J. Exp. Med 174: 949). 말초혈액의 T임파구, B임파구의 아형 및 뇌피질의 뉴런에 있어서, CD6는 CD3+ 세포 개체군의 대다수를 구성하는 성숙된 인간 흉선세포의 표면에 나타난다. 말초혈액의 T임파구에서 CD6은 세포 활성화 메카니즘에 참여한다(Reinhertz, E.L. et al. (1982) Cell 30: 735 ; Kamoun, M. et al(1981) J. Immunol. 127: 987; Mayer, B. et al. (1990) J. Neuroimmuno 1.29:193;Rasmussen, R. A. et al. (1994) J. Immunol. 152:527).
상이한 병인학 외관 병리학에 있어서의 가능한 역할 및 T세포 개체발생에 있어서의 CD6분자의 역할은 미지이다.
최근에 CD6 리간드는 흉성, 비장, 림포절 및 피부와 같은 정상 조직에서 광범위한 세포분표를 갖는 것으로 식별되고, 특성화되었다(Dhavalkumar, D.P. et al.(1995) J. Exp. Med. 181:1563).
단핵백혈구 뿐만 아니라 활성화된 T 및 B 임파구에 CD6의 발현때문에 ALCAM(활성 백혈구-세포 착생분자)로 명명된 이 분자는 그들의 면역 글로블린과 유사한 다섯개의 세포의 도메인을 갖는 100kDa 분자량 형태의 1막 당단백질이다. 그것은 2가의 양이온에 따라 서로 다른 활성 수준을 나타내며 헤테로필릭 및 호포필릭 상호작용을 조정할 수 있다(Bowen, M.A. et al.(1995)J.Exp. med, 181:2213).
상이한 항 CD6 mAbs는 기관이식에 있어서의 거부반응의 위기를 방지하기위한 임상연구에 사용되어 왔으며(Kirkman, R.L.et al.(1983) Transplantation 36:620), 그리고 이식편대숙주병(GVHD)을 방지하기 위해 임파구로부터의 골수이식을 감소시키기 위해서 시용되어 왔다(Soiffer R.J. et al.(1992) J. Clin. Oncol. 10:1191). ior t1 mAbs는 피부의 T세포 림포종의 치료를 위한 Pahse Ⅱ 임상노력중에 있다(Garcia, C.A.et al.(1990) Biotenologia Apicada 7(2):176;Faxas,M.E. et al (1993) Biotecnologia Aplicada 10(1):20).
IgG2a 이소타입(isotype)의 ior t1 단일클론항체는 제4차 국제 백혈구 분화항원 워크샵에서 항 CD6로 분류되어 있다(1989). 이 mAbs는 다른 항 CD6 mAbs에 의해 인식되는 것들과는 다른 항원결정부를 정의한다. 그 항원결정부는 안정적 형태를 가지고 있으며, CD6 분자의 주구조에 위치하는 감소 작용인자에 무감각하다(Osorio, L.M. et al. (1994) Cell Immunol. 154:123).
이 단일클론 항체는 건강한 기증자의 말초 단핵세포에서 다른 CD6 mAbs보다 더 낮은 인식도를 갖고 있다. T임파구 기시의 인체 세포배양 라인에서 ior t1 mAbs의 인식패턴은 쥬캇 세포에서 47%이고, 몰트-4 세포에서 23%이며, CCRF-CEM 세포에서 인식이 없다. B임파구 기시의 경우 라지에서 9%이며 적아세포 기시의 경우 K-562에서 12%이며 U-937에서 미엘로모노사이틱 기시의 경우 9%이다. 또는 만성의 B임파구 백혈병의 말초 단핵 세포를 인식하고(89+/-4%)(Garia C.A 등 1992, biotecnologia Aplica 9(1);70) 그리고 피부 T 림포종을 갖는 환자에게 피부손상의 임파구를 인식한다(Rodriguez, T. 등 1985 Interfeforn y Biotec. 2(1);41).
ior t1 mAbs는 생체의 항원 특정세포 세포독성을 억제하지 않는다(Faxas, M.E 등 1993, Biotecnologia Aplicade 10(1);47). 그것은 건강한 기증자의 생체외 말초 혈랙 T임파구를 활성화시킬 수 있다. OKT3(항 CD3)의 부분 최적집중에서 ior t1과의 교차결합은 다른 항 CD6 mAbs에 대해 얻어지는 것보다 더 높은 반응을 유도한다(Osorior, L.M. 등(1994) CELL Immunol. 154:123).
건선은 외관병리학으로 정의되지 않는 병이다(Hunziker, T 등(1993) Ther.Umsch. 50(2):110; Elder, J.T. et al (1994) J. Invest . Permatol 102(6):245). 그것은 CD4+ 및 CD8+ 표현형의 활성화 T 임파구의 우세를 가지며 표적기관에서 염증성 침윤물을 제공함으로써 특성화되고(Chang, J.C.C. 등(1994) Proc.Nat l. Acad. Sci USA 91:9282), T-세포 수증자의 강한 올리고 클로낼러티 뿐만 아니라 세포들은 피부쪽으로 이주되는 현저한 경향을 나타내는 것이 보인다(Baker J.N.W.N. 등(1992) Br. J. Dermatol. 127: 205, Merssen, A. 등(1995) J . Immunol. 155: 4078; Valdimarsson, H. 등(1995) Immunol. Today 16(3): 145).
건선의 동시적 소강은 피부에서 수많은 T세포의 수가 감소한다면 예견될 수 있다. 따라서 병의 임상증상발현에 책임이 있는 케라티노 사이트의 증식을 감소시킬 수 있는 면역반응의 해결중개자를 해제함으로써 병의 영속화에 중요한 역할을 하는 것으로 암시된다.
이러한 고려는 동종 골수이식술에 따르는 병의 치료와 같은 사실에 의해 지지되며 또한 HLA와 스테로이드와의 결합, 시클로포린과 체방향상과의 결합 그리고 항 T세포 처방적 단일클론 항체들과의 결합에 의해 지지된다(Griffiths, C.E.M.et al. (1992) Springer Semin Immunopathol. 13:441; Nanney, L.B. et al (1986) J. Invest. Dermatol 86(3); 260;Picassia, D.D. et al.(1987) Dermatologica 174(5);224).
단일클론 항체들에 대한 면역요법의 성공은 타겟분자의 선택에 달려 있는데, 타겟분자는 중요한 세포기능에 참여하거나 mAbs의 선택에 참여한다(Dental, J e, d(1991) urr, Opin. Immunol. 3: 740). CD3에 대항하는 건선에서 평가된 mAbs(Weinshenker, B.G. 등(1989) J.am. Acad. Dermatol. 20:1132) 및 CD4에 대항하는 건선에서 평가된 mAbs(Poizot-Martin I. 등(1991) Lancet 337:1477; Prinz J . 등 (1991) Lancet 338; 320 ; Nicolas, J.F등(1991) Lancet 338:321)는 모든 경우에 짧은 기간의 부분적 완화 및 증세의 초기 재발과 병의 징후와 함께 다발성 대량투여 엔도비스를 적용한 후에 환자에게 임상적 향상이 발생되었다.
다발성 투여에서 뮤린 mAbs의 처방적 응용은 환자에게서 몇가지 이차적 효과와 제한적인 임상용도와 연결되며, 이러한 것은 인체 항-마우스 항체반응(HAMA)을 유도하는 뮤린 단백질의 제노제니시티와 관련된다. 프로테인 엔지니어링에 의해 발생된 인체적용 항체는 면역원성을 감소시키고, 약물동태학과 임상효과를 향상시켰다(Winter, G. et al.(1993) Trans-Pharmacol-Sci.14(5):139).
지금까지 건선에서 피부의 염증성 침윤병소의 T임파구에서 CD6분자의 발현뿐만 아니라 이 분자를 병의 발전과 결합시키는 가능성에 대해 기술하고 있는 연구논문은 엇다. 더욱이 이 병에서 항 CD6 mAbs의 처방적 사용은 이전에는 평가된 적이 없다.
본 발명의 신규성은 상이한 관리 경로를 사용하면서 그리고 병의 상이한 임상적 상태에서 심상성건선을 가진 환자에 적용하기 위해 인체화 단일클론항체 항CD6의 항CD6단일클론 항체를 포함하는 조직적 약학 성분들로 구성된다.
도 1 및 2
단일 세포 항체 ior t1A의 H 및 L 사슬에서 변수 영역을 인체에 적용시킴으로서 변형된 분석.
도1: 쥐 ior t1A 단일세포 항체의 L 사슬에서 변수 영역의 배열순.
도2: 쥐 ior t1A 단일세포 항체의 H 사슬에서 변수 영역의 배열순.
A: ior t1A 쥐 mAb의 H 사슬 또는 L 사슬에서 변수 영역의 배열순.
B: 대부분 이체동형인 인간 면역글로블린에서 변수 영역의 배열순.
C: ior t1A에서 변수 영역의 배열순.
명암을 준 부분: 예정된 T-세포 항체 배열순.
밑줄친 아미노산 잔류물: 제안된 대체물
서술된 것은 H 및 L 사슬을 위한 IDEM이다.
도3
건선 별거를 보인 피부를 해치는 장애의 특성을 갖는 병소가 침투한 임파구내의 CD6항체를 표현한 결과, 이러한 평가는 상위 및/또는 하수 수족 및/또는 흉부-복부에 위치한 플라크 병소에 의해 영향받은 피부의 저온 유지 부분의 생체검사를 수행함으로써 이루어진다. 조직학적 평가는 이전의 면역조직화학 연구에서 수행된다.
도4
건선의 치료에 사용되는 항 CD6 mAbd의 치료 효능 평가는 다음의 변수를 고려하여 수행된다: 침투,스케일,홍반 및 장애 부분의 크기. 가장 큰 괴로움은 값 0-1-2 사이에서 이루어진다. 취급된 플러그의 확장은 플러그의 직경을 측정함으로써 이루어진다. PASI(Psoriasis Area Stratifited Index)와 유사한 건선에 의한 괴로움의 스코어(PSS)는 얻어지고, 치료의 응답은 계획된 측정시간의 마지막에서 PSS내의 변화와 일치하여 충화추출된다. 다음의 카테고라들이 얻어진다: 소거, 적응,비-적응,악화.
도5
각각의 젤리 ior t1A mAb/g의 0.3, 1, 또는 3mg으로 구성된 구구소 공식으로 치료된 환자의 임상 반응은 PASI(Psoriasis Area Stratifited Index)에 의해 평가되고, 인간 항 쥐 항체(HAMA)는 이러한 환자의 형청에 일치 하도록 연구되어진다.
임상 반응(PASI)과 관련되고 질병의 자유로운 간격과 관련된 최고의 결과는 ior t1A mAb(0.3mg)의 최저 양으로 치료한 그룹 뿐만 아니라 환자 그룹에 HAMA 적정제의 양을 더욱 많이 투여한 그룹에서도 얻어졌다. 나아가 환자의 혈청 내에 있는 항-유전자형 혈청의 존재는 젤리 그람 당 0.3mg을 최저 약량으로 치료한 환자들보다 훨씬 더 자주 그리고 훨씬 더 높게 나타난다.
도6
엔도베노스(endovenous) 치료는 약 17세부터 건선 관절증으로 진단받은 56세의 환자에게 ior t1 mAb를 투여하여 이루어졌다. 현재 환자는 에리세마토스퀘아모스(erithematosquamous)로 일반적인 병소에 의해 일반화된 건선의 질병 특성으로 지금 고통받고 있으며, 관절과 근육통의 고통, 열병, 일반화된 부종 및 말라리아로 고통받아왔다. 이러한 환자의 일반적인 상태는 메토트렉사트를 포함한 치료에 반응하지 않았다. 치료는 신체 무게에서 kg 당 0.6mg/kg으로 ior t1 mAb의 단일 엔도베네우 tm(endovenous) 분량을 염류성의 용해제 0.9%인 200mL에 희석하여 서서히 투약하였다. 동시에 치료제로 사용되는 젤리의 mAb/g의 3mg으로 농축한 ior t1 mAb를 포함한 젤리는 이틀 동안 모든 장애 부위에 하루에 두 번 투약하여 치료젤리 전체양 224g을 투약하였다. 임상 반응 및 면역조직화 연구의 결과는 주마다 평가되었다.
피부의 병소의 전개 사진이 도시되었다.(치료전과 치료한지 21일 이후의 모습).
단일클론 항체의 획득
단일클론 항체 뮤린의 정제
항원 배열속에 T세포 항체(mAbs)는 단백질 A 세파로오스의 복수로부터 정제되고, 같은 완충제로 기질에 평행하는 글리신 완중제 1.5몰농도와 염화나트륨 3몰 농도 pH8.9의 동량으로 희석한다. 동량의 복수와 완충제 용출을 적용하면서 50mL/h의 유속에서 실행된다. 같이 적용된 완충제를 가지고 영점 기준선까지 밤새도록 컬롬을 세척한다.
그후 컬럼은 기준선이 영점에 도달하고, 50mL/h의 유속이 될때까지 IgG1면역 글로블린을 제거하기 위해 pH6의 구연산 완충제로 세척한다(컬럼 양 2내지 5, 대략 2 시간). pH5의 완충제 구연산 0.1 몰농도는 IgG2a 면역글로블린(ior t1)을 용출하기 위해 적용된다.
단일클론항체 뮤린의 교화
항 CD6 뮤린 mAbs의 유전공학 방식 변이형을 사용하는 것은 가공 그리고 인체화된 항체와 같은 뮤린 항체의 다양한 범위의 가볍거나 무거운 사슬로부터 구성된다(Takashi N.et al.(1982) Cell 29:718; HieterP.A. et al.(1980) Cell 29:718).
단일클론항체 ior t1의 인체화의 방법설명
보조클론 ior t1A는 CD6 분자에서 같은 항원 결정부를 인식하는 혼성세포를 분비하는 부모 뮤린 ior t1으로부터 얻어진다.
ior t1A는 그들의 전체에서 그것의 리간드 결합 특성을 보전하는 반면에 서류 단일클론항체의 면역원성을 자발적으로 감소시키는 과정과 함께 그것의 면역원성을 감소하기 위해 수정된다. 면역글로블린의 항원성은 그들의 배열순에서 T-세포 항원성 단백질의 존재에 의존하기 때문에 이종 또는 동종 항체의 면역원성은 다른 포유류 항체에서 일반적으로 발견되는 것들과 다른 T-세포 항원성 배열순에서 포함되는 잔기들로 대체함으로써 감소된다. 물론 잉여 대체물은 표준구조나 또는 버니어존에서 포함된 이들을 포함하지 않는다. 잔여물의 바람직한 대체물은 구조적인 유전자나 인터 도메인 접촉자에서는 효과가 없다. 따라서 특성을 묶는 리간드는 여러 부위의 뼈대의 잉여물이 제한되는 교체 결과에 영향을 받지 아니한다.
가변부의 유사성의 분석
본 절차는 1994년 베쓰다 마리랜드 의학잡지 5판 "인체의 면역기구의 단백질 배열" 캐벳에 의해 만들어진 다양한 부분의 인간항체 변수영역을 위한 배열 데이터를 사용할 수 있다.
첫번째 단계에서 뮤린 ior t1 H 또는 L사슬의 변수영역은 이들의 인간배열의 변수영역과 비교된다.
상기 비교는 장동계산 방법에 의해 수행된다(POSDOS HIBIO PROSIS 06-00, 히타치). 가장 유사한 인간 변수영역은 뮤린영역에 일치하는 잔여물과 비교된다. 이것은 각각의 쥐의 배열인 인간의 서브그룹에 한정된다.
-T-에피트프 예상
두번째 단계에서, 두가지 유사한 변수영역 배열순, 쥐와 인간은 T항원의 배열순의 예상으로 분석된다.
알로리즘 AMPHI(Bersofsky et al.,(1987)J.Immunol 138:2213)는 α나선배열이 예상된다. 알고리즘 SOHHA는 나선 소수성의 스트립이 예상된다(Elliott et al.,(1987) J. Immunol.138:2949). T세포에서 예상되는 이러한 알고리즘은 항원 단백질의 조각을 제공한다.
-면역원성 환원에 대한 분석
인간의 상응물과 다른 쥐의 구조에 있어서 잔여물은 인간의 상응물에 의해 대처된다. 이러한 전환은 T항원 배열인 잔여물을 생성한다.
마지막으로, 포준구조 또는 버니어 존에 포함되어 반응하는 잔여물의 대처는 제3의 구조에서 효과가 있다. 또한 그들은 대처물을 포함할 수 없다. 제3의 구조에서 제안되는 대처물의 영향에 또는 결합 사이트에 대한 추가정보는 가변부의 분자로 델부터 얻을 수 있다.
-개조항체를 구성하고 표현하기 위한 방법
다음의 절차는 유전자 재조합형 DNA 배열을 대비하여 사용된다. 상기 DNA는 가볍고 무거운 사슬 두가지 모두 쥐의 mAbs CDR을 포함한다.
a)돌연변이유발과 가변부의 조직은 CDR과 FR의 영역을 포함하는 영역이다. PCR-돌연변이 유발 방법(Kamman et al., (1989) Nucleic Res. 17:5404)은 다른 위치에서 변화를 개재하여 사용된다.
b)가변부를 포함하는 표현 백터의 준비와 인간에 대응하는 세포에서 트랜스펙션 위의 불변부는 친화력과 특이성 결정을 위한 충부한 단백질 분비의 결과이다.
c)H 및 L사슬의 발현의 복제는 세포라인을 충단한다.
2주후에 세포 상청액은 인간의 IgG생성물에 대한 ELISA에 의해 분석된다. 그 샘플은 다음에 뚜렷한 항원으로 결속이 가능한 인간 IgG에 의해 다른 방법으로 분석된다.
생체외와 생체내의 특징적인 연구를 실행하기 위한 공식화
항 CD6 mAbs는 예견된 재발에서 뿐만 아니라 경피 후의 모니터링 환자 또는 계통적 처지를 위해, 건선의 다른 임상적 형태에서 생체외와 생체내 특징적인 목적으로 사용된다.
이러한 mAbs는 소디움 아지드(0.01-0.2%)를 포함하는 완충제(ph 7.0+/-0.5)에서 정제되고 용해되며, 소혈청 알부민(0.05-0.2%)은 CD6+T 임파구와 또한 4℃에서 20 내지 30분 동안 0.1과 3mg/mL 사이의 농도에서 mAb의 10에서 30ml를 가지고 샘플의 50에서 200ml을 담은 생물학적 유체(예를 들어 혈액, 세팔로아퀴디움 액체, 윤활액)에서 임파구 세포의 표면상에 이 분자의 양을 정하여 사용한다. 이후 완충용액에서 세척을 하고 침해물질로 변화되는 다른 동물계의 면역글로브린으로 부화한다. 이 항 CD6 mAbs는 다른 방법에 의해 침해물질로 직접 변화시킬 수 있고 5 내지 30mg/ml 사이에서 농도로 유사하게 사용된다.
건선을 가진 환자의 병소의 면역조직화학적 평가
건선 벌가로 이루어진 환자의 조직에 다른 영향을 받거나 또는 피부를 해치는 손상에 대한 이 면역조직화학적 연구는 차가운 아세톤에서 할 수 없고 고정된 저온유지 분위기에서 형성된다.
항 CD6 mAbs는 소지움 아지드(0.05-0.2%)를 포함하는 완충용액(pH 7.0+/-0.5)에서 2-10 mg/ml 사이에서 용해된다. 그리고 30분 동안 소혈청알부민(0.05-0.2%)을 용해한다. 이후 아비딘 바이오틴 퍼톡사이스는 룸 온도에서 30분 동안 혼합한다. 마지막으로 반응물은 색원체(시그마)(Hsu,S.M. et al.(1981) J. Histochem. cytochem. 29:577)같은 3-아미노-9-에틸-카바졸로 사용이 제한된다. 생체검사법은 두 전문가들에 의해 실험되어졌고, CD6의 평가는 10%(+/-)이하, 10-25%(+/-), 20-25%(++), 50-90%(+++), 90-100%(++++)점의 범위에서 조정되었다.
T임파구 CD에서 다른 항체는 항 CD3(ior t3), 항 CD4(ior t4), 항 CD8(ior t8), 항 CD45(ior t3)사용되며, 또한 케라티노사이트 활성의 표지로서 표피 성장 인자 수용자 mAbs(ior egf/r3)로 사용된다(Mozzanica. N.et al(1994) Acta Derm.Venereol SuppI. Stockh. 186:171). 이들은 질병의 치료제 과정중 손상에 스며드는 염증의 특정의 상세한 값을 허용한다.
치료된 환자의 병소의 면역조직화학적 모니터링
항 CD6 단일클론항체로 처방되는 환자는 조직으로 사용하거나 또는 국소 조직의 효능값으로 초기 생체검사 다음에 항상 치료초기, 치료중, 치료가 끝난 후에 이전에 형성된 손상을 생체검사할 수 있다.
손상 응답 등급에 대한 범위는 퍼센트로 구분되고 각 생체검사에서 결정된 전체 CD45+ 세포에서 CD6+ 세포의 색인으로 확정된다.
CD6+ 세포 인덱스=CD6+ 세포들의 수 × 100/CD45+ 세포의 수
CD3+ 세포, CD4+세포와 CD8+세포의 인덱스는 항상 CD45+ 세포전체와 CD4+의 인덱스와 CD6+ 세포의 전체비율로 계산할 수 있다.
CD3+ 세포 인덱스=CD3+ 세포들의 수 × 100/CD45+ 세포의 수
CD4+ 세포 인덱스=CD4+ 세포들의 수 × 100/CD45+ 세포의 수
CD8+ 세포 인덱스=CD8+ 세포들의 수 × 100/CD45+ 세포의 수
CD4+ 세포 인덱스=CD4+ 세포들의 수 × 100/CD6+ 세포의 수
CD8+ 세포 인덱스=CD8+ 세포들의 수 × 100/CD6+ 세포의 수
처치된 환자들의 면역신티그래프 모니터링
항 CD mAbs와 함께 처치한 효과의 평가의 다른 형태는 Mathers,S.J.등(19910)J.Nucl. Med. 31(5):692에 의해 설명된 것과 같이 결합하는 방법을 사용하면서, 99m 테크네튬과 같은 방사선 동위원소와 함께 결합된 같은 mAb의 1 내지 5mg을 사용하는 처치동안에 CD6+ 세포들의 표현과 분포의 환자에서 면역신티그래프의 연구를 할 수 있다.
국소와 전신의 사용을 위한 치료의 제제화의 획득
항 CD6 mAbs는 병의 고통이 따르는 하나 또는 다양한 처치 사이클을 가진 한번 또는 여러번의 약에서, 국소와 전신의 제제화, 건선의 다른 임상적 형태에서 치료를 목적으로 사용된다.
항 CD6 mAbs와 함께 국소 치료의 제제화는 생산품의 각 g당 0.1 내지 5mg의 약에서 멸균 완충제(pH 7.0 +/-0.5)에 용해된 mAbs의 주입을 인정하는 친수성 제제화와 함께 하나 또는 두개의 상태에서 반고체 조직에 의해 형성된다. 제제화는 젤라틴, 카르복시메틸셀루로오스 또는 유사한 물질 그리고 글리세린과 칼슘을 포함한 염기로 형성된 액체기질(예를 들어 물), 겔, 젤리, 연고, 로션, 크림과 같이 상세하게 설명한다; 부가적으로 그 조성물은 오염을 피하기 위해 방부제(예를 들어, p-하이드록시베조에이트)를 함유한다. pH는 mAbs의 특성에 영향을 주지 않는 생리학적인 것임에 틀림없다. 이들 치료의 조성물은 피부에서 mAbs의 방출과 관통성이 허용된다.
치료된 환자의 임상적 접촉
병소의 임상적 발전은 치료능력의 평가의 주요 기준으로서 사용된다.
치료의 영향을 측정하기위해 사용되는 주요 다양한 반응은 병소(침윤물, 스케일, 홍반)의 임상적 특징의 향상과 병소의 영역의 감소이다.
병의 신호의 고통의 정도는 0, 1, 2 사이에서 입증된다.
0 - 신호없슴
1 - 드문 출현
2 - 격렬한 출현
치료된 스케일의 확정은 p(3.14)의 라이오스의 생성물의 증식에 의해 병소의 영역을 계산하고 그리고 그것의 직경을 측정하는 것이 고려된다.
PASI(freddiksson, T. et al.(1978 Dermatologica 157:238)와 유사한 PSORIASIS SEVERITY SCORE(PSS)는 다음의 식에 의해 만들어진다.
치료에 대한 반응은 평가시간이 완전해질 때 PSS내의 변화와 일치하여 추출되고, 다음의 카테고리에 따라 평가할 수 있다(Perkins W. et al (1993) Br. J. dermatol. 129:584).
- 소거 (PSS내에서 90% 이상의 향상)
- 적응 (PSS내에서 50% 이상의 향상)
- 비-적응(PSS내에서 50% 이하의 향상 또는 악화)
- 악화(PSS내에서 50% 이상 증진)
응답을 위한 평가시간은 치료약을 처음 투약한 날부터 12주로 설정할 수 있다(사전 처리는 1, 2, 3, 5, 6, 8, 12주).
실시예1 :ior t1A 단일클론항체 DNA 배열순의 쥐 변수 영역
세포질 RNA는 Faloro et al(Faloro, J. et al. (1989) Enzimology)의 방법(65:718) 에서 상술된 바와 같이 106TI의 혼성세포로부터 추출된다.
cDNA 합성반응은 50㎕의 전체 양중에서 H사슬 변수영역을 위한 5㎍의 RNA, 50mM의 Tris-HCI, pH 7.5, 75mM의 KCI, 10mM의 DTT, 3mM의 MgCl2, 25pmol의 CG2AFOR 프리머(5' GGAAGCTTAGACCGATGGGGCCTGTTGTTTTG 3') 또는 L사슬 변수 영역을 위한 CK2FOR (5'GGAAGCTTGAAGATGGATACAGTTGGTGCAGC 3'), 각각 250uM 씩의 dATP, dTTp, dCTP, dGTP, 15u의 리보핵산 가수분해효소 억제물(RNA가드, 제약자)로 구성된다.
샘플은 70℃에서 10분동안 가열되고, 30분 동안 서서히 37℃로 떨어지게 한다. 그러면 100유니트의 MMLV의 역전사효소(BRL)는 37℃에서 1시간 동안 연속적으로 추가되고 인큐베이션된다.
VH 및 VK cDNAs는 Orlandi 등(Orlandi, R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837), (1989))에서 상술된 바와 같이 PCR을 사용함으로써 증폭된다. VH의 PCR 증폭을 위해서, DNA/프라이머 혼합물은 5㎕dml cDNA, 25pmoles CG2A FOR(5' GGAAGCTTAGACCGATGGGGCCTGTTGTTTTG 3') 및 VHl BACK 프라이머 (5'AGGT(G/C)(A/C)A(A/G)CTGCAG(G/C)AGTC(A/T)GG 3')로 구성된다. VK의 PCR 증폭을 위해서, DNA/프라이머 혼합물은 5㎕dml cDNA, 25pmoles CK2 FOR(5' GGAAGCTTGAAGATGGATACAGTTGGTGCAGC 3') 및 VK10 BACK (5'TTGAATTCCAGTGATGTTTTGATGACCCA 3') 프라이머로 구성된다.
이러한 혼합물은 50㎕의 최종량에서 각각 2.5mM의 dATP, dCTP, dTTP 및 dGTP와 5㎕의 10X 완충 서모라제 및 1 유니트의 서모라제(IBI)가 추가된다. 샘플은 94℃에서 30초 동안 25번의 열사이클을 수행하고; 50℃에서 30초 동안 수행하며; 72℃에서 1분 동안 수행하고, 그리고 72℃에서 5분 동안 마지막 인큐베이션을 수행한다. 증폭된 VH 및 파 움는 Prep 상에서 정제된다. 유전자 정제기구(BioRad).
정제된 VH 및 VH DNA는 M13 벡터로 복제된다. 복제물은 T7 DNA Pol(제약자)를 사용한 디디옥시 방법에 의해 연속적으로 복제된다. 도 1 및 도 2를 보라.
실시예2: 예견된 T-세포 항체 배열순을 사람에게 적용하기 위한 ior t1A 쥐 세포 항체의 변수 영역 배열순의 변경.
ior t1A의 H 및 L 사슬의 변수 영역 배열순은 T-세포 항체 배열순을 위해 분석된다. 이는 AMPHI 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 만들어지고, 이 컴퓨터 알고리즘은 길이의 형태가 양극성 나선형 구조인 배열순 11 아미노산의 세크먼트를 예견할 수 있으며, 이는 MHC I1 분자와 결합된 한측은 소수성이고, 한측은 친수성을 갖는다.
H 사슬의 변수 영역 시퀸스는 다음과 같은 3 세그먼트를 예상할 수 있다. 이는 Kabat's 넘버링을 사용한 것이다.
1. 아미노산 2-21 간의 FR1
2. 아미노산 29-43 간의 CDR1 및 FR2
3. 아미노산 95-111 간의 CDR3 및 FR4
도1은 H 사슬과 일치하는 배열순을 도시한 것이다.
이러한 쥐 배열순은 유전자 은행 및 EMBL 데이터베이스 내에 포함된 면역글로블린과 비교된다. 대부분의 이체동형의 인간 변수 영역 배열순은 결정되고, 또한 쥐의 배열순과 아주 닮은 인간의 서브그룹도 정의된다. 이러한 경우에 발견된 인간 배열순은 Kabat의 서브그룹 III에 속하는 IgM이다.
양쪽의 변수 영역 배열순에서, 인간의 쥐는 잔류물을 위해 잔류물을 비교하게 되고, Vernier 영역에 포함되지 않거나 또는 표준구조를 갖지 않는 FR 영역에서 이러한 잔류물을 선택하게 된다. 그러므로 양쪽의 변수 영역 배열순 인간의 배열순상에 동일하게 위치한 이러한 잔류물에 의해 변화될 수 있다. 위치 13 및 19는 아미노산 Lys가 동일한 서브그룹에 속한 다른 인간의 면역글로블린의 동일 위치에 존재하기 때문에 변경되지 않는다.
쥐 iro t1A의 H 사슬을 위해 네가지의 대체물을 제안한다:
1. ALA에 의해 위치 40을 THR로 대체.
2. GLY에 의해 위치 42를 GLU로 대체.
3. LEU에 의해 위치 108을 THR로 대체.
4. VAL에 의해 위치 109를 LEU로 대체.
동일 처리과정은 L 사슬(도2)에 적용되고, 아미노산 2에서부터 아미노산 69까지의 세그먼트를 중첩하여 셋팅하게 된다. 이러한 분석을 실행한 이후에, 위치에서 FRs 1 및 2를 7가지의 대체물을 제안한다: 3,11,12,15,17,41, 및 43.
1. GLN에 의해 위치 3을 LYS로 대체.
2. LEU에 의해 위치 11을 MET로 대체.
3. SER에 의해 위치 12를 TYR로 대체.
4. VAL에 의해 위치 15를 LEU로 대체.
5. ASP에 의해 위치 17을 GLU로 대체.
6. GLY에 의해 위치 41을 TRP로 대체.
7. ALA에 의해 위치 43을 SER로 대체.
실시예3: PCR 변이유전자에 의해 ior t1A의 돌연변이 H 및 L 사슬 변수 영역의 구축
돌연변이 H 및 L 사슬 변수 영역의 아미노산의 변호는 PCR 변이 유전자를 사용함으로써 구축되어진다(Kammann.M.et al.(1989) Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 86;4220)
요약: PCR에 의한 두개의 증폭: 반응작용 혼합물은 M13에 복제된 단일 성분 DNA인 0.5㎕의 VH 상청액, 25pmoles의 돌연변이 유전자 결핍 1 또는 2,25 poles의 돌연변이 유전자 결핍 3 또는 4 프라이머(다음에 설명한 프라이머 배열순을 참조하라)로 이루어진다. 이러한 혼합물은 50㎕의 전체량 중에서 각각 2.5mM의 dATP, Dttp, dCTP 및 dGTP와 5㎕의 10X 벤트 폴리메라아제 버퍼(NEB) 및 1유니트의 벤트 DNA 폴리메라아제로 이루어진다. 샘플은 94℃에서 30초 동안 12-15의 열 사이클을 수행하고; 50℃에서 30초 동안 수행하며; 75℃에서 1분 동안 수행하고, 75℃에서 5분동안 마지막 인큐베이션을 수행한다. 양쪽의 PCRs를 생성한 것은 단지 (3 및 40 바깥 프로이머를 사용함으로써 제2 PCR 내에 결합되어진다. 증폭된 VH DNA는 prep상에서 정제된다.
유전자 정제기구.
H 사슬에서의 변화를 위해서, 위치 5,7,11,12 및 13 프라이머 내의 FR1을 사용한다:
프라이머 1:
Figure pct00002
프라이머 3:
Figure pct00003
이러한 프라이머들은 하나의 PCR에 결합된다.
프라이머 2:
Figure pct00004
프라이머 4:
Figure pct00005
이러한 프라이머들은 PCR 상에서 결합된다. 이때 양쪽 PCRs의 생성물은 3 및 3 프라이머를 사용한 하나의 PCR 내에 결합된다.
위치 108 및 109 내의 변화를 위하여, 프라이머는 다음과 같이 디자인된다:
프라이머 1:
Figure pct00006
프라이머 3:
Figure pct00007
이러한 프라이머들은 하나의 PCR 내에 결합된다.
프라이머 2:
Figure pct00008
프라이머 4:
Figure pct00009
이러한 프라임들은 하나의 PCR내에 결합된다. 이때 양쪽 PCRs의 생성물은 3 및 4 프라이머를 사용한 하나의 PCR내에 결합된다.
L 사슬에서 잔류물 3,11,12,15 및 17의 FR1이 변화되도록 하기 위해서는 프라이머를 다음과 같이 디자인한다:
프라이머 1:
Figure pct00010
프라이머 3: 5' GTA AAA CGA CGG CCA GT 3'
이러한 프라이머들은 하나의 PCR 내에 결합된다.
프라이머 2:
Figure pct00011
프라이머 4: 5' ACT GGC CGT CGT TTT TAC 3'
이러한 프라이머들은 하나의 PCR 내에 결합된다.
양쪽 PCRs의 생성물은 프라이머 3 및 4를 사용한 하나의 PCR 내에 결합된다.
FR2 내의 잔류물 41 및 43을 변화시키기 위해서 프라이머는 다음과 같이 디자인된다.
프라이머 1: 5 ' CAG AAA CCA GGG AAA GCT CCT AAG ACC CGT 3'
프라이머 3: 5 ' GTA AAA CGA CGG CCA T 3'
이러한 프라이머 들은 하나의 PCR 내에 결합한다.
프라이머 2: 5 ' CAG GGT CTT AGG AGC TTT CCC TGG TTT CTG 3'
프라이머 4: 5 ' ACT GGC CGT CGT TTT TAC 3'
이러한 프라이머들은 하나의 PCR 내에 결합된다
양쪽 PCRs의 생성은 프라이머 3 및 4를 사용한 하나의 PCR 내에 결합된다.
실시예 4: 건선 벌거로 피부장애를 갖는 환자에게 사용하기 위한 제약공식
ior t1 mAb는 정제되고, 4.50mg의 염기성 인산나트륨, 10.88mg의 2염기성 인산나트륨, 86.00mg의 염화나트륨, 80 1.852㎕의 폴리소르베이트, 주입을 위한 물로 이루어진 불임 버퍼 용해제 (10ml pH 7.0 +/- 0.5) 내에 용해된다(50.00mg). mAb를 포함한 용해제는 젤리 주약에 추가된다.
치료제로 쓰이는 젤리는 mAb(pH 7.0 +/- 0.5)을 유사하게 사용할 수 있도록 하는 구성을 갖는 완충제로 동화된다.
실시예 5: 건선 별거로 피부장애를 갖는 환자에 대한 조직학적 연구
건선 별거로 피부장애를 갖는 환자의 면역조직화학적 연구는 피부 조직의 저온 형성 장치 부분에서 이루어지고, T 림프세포의 CD에 직접 대항한 다른 mAbs와 유사하게 있는 mAbs ior t1을 사용함으로써 이루어진다. mAbs ior t3 (항 CD3), ior t4 (항 CD4), ior t8 (항 CD8), ior L3 (항 CD45) 및 DAKO CD6 (항 CD6)은 ior egf/r3 (항상피 성장 요소 감각기관)에서와 같이 제어되고 사용된다. 그리고 비오틴화된 항 쥐 면역글로블린(즉, sheep, DAKO로부터)과 아비딘 비오틴 산화제 복합물(즉,DAKO)를 사용한 조직 부분의 인큐베이션에 의해 수행된다. 최종적인 반응은 색원체(시그마)로써 3-아미노-9-에틸-카본졸레(carbazole)를 사용함으로써 이루어진다. 생체검사법은 두 전문가에 의해 실험되었고, CD6의 평가는 10 % (+/-)이하, 10-25 % (+), 20-50 %(++), 50-90 % (+++), 90-100 % (++++) 포인트의 크기에 적합하도록 조정된다.
환자는 초기 치료시 이전에 형성된 장애를 생체검사한 항 CD6 단일클론항체로 치료되고, 초기 생체검사를 수행한 다음 3주의 끝까지 치료를 계속 수행한다. 분류된 치료응답의 크기는 퍼센트로 질을 나타내고, 전체 CD45+ 세포 상에서 CD6세포의 인덱스에 의해 수행되며, 각각의 생체검사에 의해 평가된다. 피부의 다른 층내에 있는 항 상피 성장요소 감각기관을 표현하는 퍼센트율은 질병의 조직 특성 형태의 변형에 따라 결정 되어진다.
* 건선 별거의 연소 침투 특성은 CD6+ T 임파성의 표현형을 갖는 중요한 표현(+++)이 존재하는 지를 찾게된다.
* CD3+ 임파구는 CD45+ 세포의 약 100%를 나타낸다.
* CD6+ 세포는 CD3+ 세포의 약 60% 내지 90%를 나타낸다.
* CD6+ 세포(ior t1)는 CD6+ 세포(DAKO CD6)의 약 30% 내지 50%를 나타낸다.
* 각질 내의 EGF-R이 나타내는 것은 그물 형태이다.
활성화된 T 임파구가 자체의 분자 특성을 계속 유지하는 동안 염증을 일으키도록 스며든 T 임파구의 CD6 분자가 표현하는 탁월함은 의미 심장한 결과를 갖는다. 이는 T 임파구의 백혈구 부착 분자를 구성한다고 믿어지고 있으며, T 임파구는 외인성 항원 또는 변형된 자체 항원의 침투에 의해 피부에서 처음으로 활성된다. 피부의 특정 세포 결정 요소간의 상호작용을 위해 필요한 것은 항기 항원에 반응하는 동안 T-임파구가 활성화 되도록 하는 것이다.
실시예 6: 건선 벌거를 갖는 환자에게 ior t1 mAb로 국소 치료를 하는 임상 반응
이러한 질병의 장애 특성이 도지는 건선 벌거를 진단할 수 있도록 환자에 대한 임상 실험이 수행되었다. 이 연구는 국소치료(ior t1 mAb 또는 부형약)를 위해 사용된 젤리와 일치 하도록 한정된 두 개의 그룹을 구성하고 그룹 당 40명의 환자들을 포함시켜 임상 실험이 계획되었다. 국소 치료 공식은 mAb가 결합된 젤리 주약 또는 부형약(나트륨카르복시메틸셀롤로오스 V/V, 프로필렌클리콜, 메틸파라베노, 삼중 에탄올아민)에 의해 수행되었다. 치료는 장애 치료를 중단하지 않고 21 동안 하루에 두 번씩 실행하였다.
건선 플라그 장애는 ior t1 mAb(도4)로 치료한 모든 환자들을 희게 만들었다. 이러한 결과는 mAb를 처음에 적용한 이후 21일째에 수행된 생체 검사법에 의한 결과와 일치한다. 질병의 조직 부호 특성의 복귀와 마찬가지로 각질의 T 임파구 침투의 감소와 EGF-R 표현의 감소는 획득 되어졌다.
실시예 7: ior t1 단일클론항체로 스케일링-다운 국부 치료를 수행한 이후에 환자의 건선 벌거의 임상반응
10% 내지 25%의 만성 건선 벌거를 갖는 환자에게 19번 실행하여 확인된 안내적인 임상 실험은 환자의 피부에 대해 수행되었다. 세 개의 다른 그룹 6,7및 6 환자들은 각각이 젤리 형태인 0.3, 1 및 3mg의 ior t1A mAb/g을 함유한 국부 치료 방식과 나트륨카프복시메틸셀롤로오스 A/V, 프로필렌글리콜, 메틸파라베네, 프로필파라베네 및 트리에탄올아민을 함유한 부형약으로 치료를 받았다.
PASI(Psoriatic Aera and Severity Index ; 건선 부분 및 시버러티 인덱스)는 기록 되어지고 분석되어졌으며, 또한 환자들의 질병 혈청과 일치하는 인간 항 쥐항체(HAMA; human anti mouse antibody)는 연구 되어졌다. 임상 반응(PASI) 및 질병의 자유로운 간격과 관련된 최고의 결과는 ior t1 mAb (0.3mg)의 최저량을 사용하여 처방한 그룹 뿐만 아니라 환자 그룹에 HAMA(Human Anti-Mouse Antibody) 적정제의 양을 투여한 그룹에서도 얻어졌다. 더욱이 블로킹 ELISA (Enzyme Linked Immunsorbent Assay) 및 FACS(Fluorescent Activating Cell Sorter)를 사용하여 연구된 환자들의 혈청에서 항-유전자형 항체의 존재는 젤리 그람 당 0.3mg을 최저약량으로 치료한 환자들 보다 훨씬 더 자주 그리고 훨씬 더 높게 나타났다.
실시예 8: 일반적인 건선에 의해 심한 형태를 갖는 한 명의 환자를 ior t1 mAb로 치료한 임상 반응
여성 환자는 약 17세부터 건선 관절증으로 진단되어 지금까지 건선을 앓고 있는 56세의 사람이다. 최근 5년간 이 환자는 자주 그리고 심한 위험으로 고통받아왔으며, 자주 입원치료를 받아야 했다. 이러한 위험을 에리세마토스퀘아모스(erithematosquamous)로 일반적인 병소를 갖고서 시작되고, 관절과 근육의 고통, 열병, 일반화된 부종 및 말라리아로 고통 받아왔다.
이러한 환자의 일반적인 상태는 지속되었고, 21일 이후에는 목과 가슴주변, 궤양과 열병에 의해 감염된 세로세(serose) 분비와 같은 새로운 병소가 나타났다.
질병의 무감각한 전개와 스테로이드 크림을 포함한 이전의 모든 치료를 더 이상 참을 수 없는 것 때문에, 메토트렉사트에 의한 치료는 15mg의 전체 분량으로 세번의 사이클 동안 투여하도록 지시하였다. 어떠한 임상 반응도 관찰되지 않았다.
신체 무게에서 kg 당 0.6mg/kg으로 ior t1 mAb의 단일 엔도베네우스(endovenous) 분량을 염류성의 용해제 0.9% 인 200mL에 희석하여 서서히 투약하였다.
동시에 치료제로 사용되는 젤리의 mAb/g의 3mg으로 농축한 ior mAb를 포함한 젤리는 이틀 동안 모든 병소 부위에 하루에 두 번 투약하였다.
환자는 그녀의 일반적인 상태를 향상시키기 시작했고, 치료한지 6일 정도 되면서 피부의 모습이 향상되기 시작했다. 치료한 지 21일째 되는 날 평가한 것은 질병의 임상적 표시가 개선 되었음을 부여주는 피부의 잔여부분과 신체 피부에서 60%의 병소 부위가 없는 결과가 나왔다. 환자는 관절이 양호한 상태를 갖게 되어 관절의 증상도 개선 되었고, 정상적인 생동적인 모습과 정기적인 실험 테스트를 받았다.
30일 후에 환자는 질병의 증상으로부터 완전히 벗어나 정상상태를 유지하였다.

Claims (5)

  1. 아래와 같은 서열(서열번호 1)로 이루어지는 H사슬 가변부와 아래와 같은 서열(서열번호 2)로 이루어지는 L사슬 가변부를 포함하는 것을 특징으로 하는 항CD-6 단일클론 항체.
    H사슬의 가변부 서열(서열번호 1);
    Figure pct00012
    L사슬의 가변부 서열(서열번호 2);
    Figure pct00013
    Figure pct00014
  2. 아래와 같은 서열(서열번호 3)로 이루어지는 H사슬 가변부와 아래와 같은 서열(서열번호 4)로 이루어지는 L사슬 가변부를 포함하는 것을 특징으로 하는 항CD-6단일클론 항체의 IgG1 이소타입(isotype)을 갖는 인간화된 변종.
    H사슬의 가변부 서열(서열번호 3);
    Figure pct00015
    Figure pct00016
    L사슬의 가변부 서열(서열번호 4);
    Figure pct00017
  3. 제1항에 있어서, IgG2a 이소타입인 것을 특징으로 하는 항CD-6 단일클론 항체.
  4. 제1항에 있어서, IgC1 이소타입인 것을 특징으로 하는 인간화된 항CD-6 단일클론 항체.
  5. 제1항 또는 제2항에 따른 단일클론 항체를 포함하는 건선치료용 약제 조성물.
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