JP4113929B2 - アンチｃｄ６モノクロナール抗体とその利用 - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、免疫の分野に関し、特にCD6白血球分化抗原を認識するモノクロナール抗体を含む薬剤成分の獲得に関する。
先行技術の説明
モノクロナール抗体(mAbs)は、細胞表面に発現された生理学的重要なある分子の特徴付けを可能にしてきた。免疫システムの細胞の中で「白血球分化群」又は抗原(CD)を定義している(Scholosman, S. F. et al. (1994) Immunol. Today 15(3):98)。細胞認識、吸着のメカニズムにおいて、さらに免疫反応での活性化、増殖のメカニズムにおいて、個体発生の際のリンパ球分化や成熟において、CDの役割は、診断や免疫療法でそれぞれのmAbsを使用するために定義され、有望な結果をもたらしてきた(Dan tal, J et al.(1991) Curr. Opin. Immunol. 3:740)。
ヒトTリンパ球の細胞膜で発現される分子の逆方向に向くマウスmAbsは、これらの細胞の機能不全が存在する臨床実体の診断を改善するために寄与してきた。さらに、移植拒絶、移植片対宿主疾患(GvHD)、自己免疫疾患の場合に、機能的活性を調製する目的で、新しい治療法を開拓するために使われてきた（Waldman, T. A.(1991) Sience2 52:1657;Waldman, T,A.(1992) Annu. Rev. Immunol.10:675）。CD6は、明確に特徴付けされていない分子である。これが動態的平衡において維持され、リン酸化のグレードにおいてのみ異なる２つの分子形に存在するグリコプロテインであることが知られている。活性化されたTリンパにおいては、過剰リン酸化された130kDaの分子で(C Eldenas, L. et al. (1990) J. Immunol. 145:1450;Swack, J. A. et al.(1991) J. Boil. Chem. 266: 7137)、特徴のある構造で一団の膜受容体や分泌蛋白質の一員であるが(Kodam a, T. et al.(1990) Nature 343: 531; Aruffo, A. et al.(1991 J. Exp. Med. 174:949)、残りのTリンパにおいては、リン酸化された105kDaの分子である。末梢血のTリンパ球においては、ヒトの成熟した胸腺細胞表面で発現され、Bリンパ球のサブタイプや大脳皮質の神経においては、CD3+細胞の大部分を構成する。末梢血のTリンパ球にお皮質の神経においては、CD3+細胞の大部分を構成する。末梢血のTリンパ球においては、細胞の活性化メカニズムに関与する(Reinhertz E. L. et al. (1982) Cell 30: 735; Kamoun, M. et al(1981)J.Immunol. 127:987; Mayer, B et al.(1990) J. Neuroimmunol. 29: 193; Rasmussen, R. A.et al.(1994)J. Immunol. 152: 527)。病因の異なる疾患での生理病理学上の役割だけでなく、T細胞個体発生におけるCD6の役割も知られていない。
近年になってCD6リガンドが同定され、胸腺、脾臓、リンパ節、皮膚など正常な組織に広範囲にわたる細胞分布を持つという特徴も分かってきた(Dhavalkumar, D. P. et al. (1995) J. Exp. Med. 181: 1563)。この分子は、単球だけでなく活性化したT、Bリンパ球で発現されるためにALCAM(活性化白血球細胞吸着分子)と称され、イムノグロブリンと同様に細胞外ドメインを5個持つ分子量100kDaのタイプI膜グリコプロテインである。二価の陽イオンにより異なる活性化レベルが存在でき、異種親和的及び、同種親和的相互作用が介在できる(Bowen, M. A. et al.(1995)J. Exp Med. 181:2213)。
異なる抗CD6mAbsが、臓器移植での拒絶反応を防ぐための臨床試験で使用され(Kirkman, R. L. et al. (1983) Transplantation 36: 620)、又、移植片対宿主疾患(GvHD)を防ぐために単球からの骨髄移植を減少させるためにも使われている(Soiffer, R.J. et al.(1992) J. Clin. Oncol. 10: 1191)。ior t1 mAbは、皮膚T細胞リンパ腫の治療のために、二相の臨床試験におかれている。(Garc EDa, C. A. et al.(1990) Bi otecnolog EDa Aplicada 7(2): 176; Faxas, M.E. et al(1993)BiotecnologEDa Apli cada 10(1): 20)。
IgG2aイソタイプのior t1モノクロナール抗体は、白血球分化の国際ワークショップIVにおいてCD6として分類された(Antigans, Virnna(1989))。このmAbは、別の抗CD6mAbsに認識されるものとは異なるエピトープを定義する。このエピトープは、CD6分子の一次構造に位置する可能性があり、安定なコンホメーションで、還元剤に感受性がない(Osori, L. M. et al.(1994)Cell Immnol. 154: 123)。このモノクロナール抗体では、健康なドナーの末梢血の単核細胞では、他のCD6mAbsよりも認識が低い。Tリンパ球起源のヒト細胞培養系におけるior t1 mAbの認識パターンは、Jurkat細胞の47％、Molt-4細胞の23％であり、CCRF-CEM細胞は認識されない。Bリンパ球起源ではRajiの9％が、赤芽球起源ではK-562の12％、骨髄単球起源では、U-937の9％が認識されている。さらに、慢性Bリンパ球白血病(89+/- 4％)の末梢血単核細胞(Garc EDa C.A et al. (1992) Biotecnolog Eda Aplicasa 90(1): 70)や、皮膚T細胞白血病患者の皮膚病変のリンパ球(Rodr EDguez, T. et al.(1985)Interfer F3n y Biotec. 2(1):41)も認識している。
ior t1 mAbは、in vitroにおいて抗原特異的細胞の細胞毒性を阻害しない(Fax as M.E. et al.(1993) Biotecnolog EDa Aplicada 10(1): 47)。これはin vitroにおいて健康なドナーの末梢血T細胞を活性化することができる。OKT3(抗CD3)の最適下限濃度においては、ior t1との架橋は、他の抗CD6mAbsとの架橋で得られるものよりも反応性が高い(Osorio, L. M. et al/(1994) Cell Immunol. 154: 123)。乾せんは、生理病理学的には定義されていない疾患である(Hunziker, T. et al.(1993) Ther, Umsch. 50(2):110; Elder, J. T et al(1994) J. Invest. Dermatol. 102(6):24S)。T細胞受容体の強度の少クロン性だけでなくCD4+やCD8+フェノタイプの活性化Tリンパが優勢で(Chang, J. C. C. et al.(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9282)、標的臓器に炎症性浸潤が存在するという特徴があり、この細胞は皮膚に遊走する傾向が強いようである(ホーミング)(Baker, J. N. W. N. ert al(1992)Br. J. Derma tol. 127: 205; Messen, A. et al.(1995) J. Immunol. 155: 4078; Valdimarsson, H.et al.(1995) Imunol. Today 16(3): 145)。
皮膚のT細胞が減少していれば、乾せんの自発的軽減が予測される。つまり、それがケラチノサイトの増殖を誘発する、臨床兆候の原因となる免疫反応の溶解性仲介物質を放出することにより、疾患を永続させる重要な役割を持つことを示唆している。これらの判断は、同種間骨髄移植後の疾患治癒、HLA結合の可能性、ステロイド特にサイクロスポリンによる改善、不可逆的ではあるが、抗T細胞治療モノクロナール抗体による改善などの事実により支持される(Griffitha, C.E.M.et al.(1992) Springer Sem in Immunopathol. 13: 441; Nanney, L. B. et al.(1986)J.Invest.Dermayol/86(3) : 260; Piccasia, D. D. et al.(1978)I. Am. Acad. Dermatol17)3: 408; Schopf, R. F. et al. (1986) Arch. Dermatol. Res. 279(2): 89; vande Kerkhof, P. C. et al,(1987) Dermatologica 174(5):224)。
モノクロナール抗体免疫療法の成功は、標的分子の選択にかかっている。この標的分子は重要な細胞機能に、又はmAbの選択に関与しているはずである(Dantal, J. et al.(1991)urr. Opin. Immunol. 3: 740)。CD3(Weinshenker, B. G. et al.(1989) JAm. Acad. Dermatol. 20: 1132)やCD4(poizot-Martin, I. et al.(1991) Lancet 337: 1477; Prinz J. et al. (1991) Lancet 338: 320; Nicolas, J. F. etal.(1991) Lancet 338; 321)と逆向きの乾せんに評価されるmAbsは、複合的で高用量の静脈内投与後の患者において、短い持続時間で部分的に軽減したり、あらゆる症例の疾患症状や兆候を早期に再発させながら、臨床的改善をもたらす。
複合的用量でのマウスmAbsの治療適用は、幾つかの二次的効果につながり、患者における臨床利用は限られる。これらは、ヒト抗マウス抗体反応(HAMA)を誘導するマウス蛋白質の異種性に関係する。蛋白質設計で生じる人間化抗体は、遺伝子原性、薬理学的動態の改善、臨床的利益を減少させる(Winter, G. et al.(1993) Trends-Pharmacol-Sci, 14(5); 139)。
これまでに、乾せんの皮膚の炎症性浸潤にあるTリンパ球で、CD6分子の発現を説明する試験や、この分子と疾患生成との可能な関わりを説明した試験は報告されていない。又、この疾患での抗CD6mAbsの治療適用についてもこれまでに評価されていない。
本発明の新案は、異なる投与経路や異なる臨床形式を使って、CD6モノクロナール抗体など、局所的及び全身的な薬剤構成を提供することや、尋常性乾せん患者へ適用するための人間化モノクロナール抗体抗CD6を獲得することからなる。
発明の詳細な記述
モノクロナール抗体の取得
ネズミモノクロナール抗体の精製
抗CD6モノクロナール抗体（mAb）をProtein A Sephroseにより腹水から精製し、同体積のグリシン緩衝液1.5M、NaCl 3M、pH8.9で希釈し、同じ緩衝液のマトリックスと平衡にする。同体積の腹水及び緩衝溶出液を適用して50ml/hの流速で行なうべきである。ベースラインがゼロになるまでカラムを同じ適用緩衝液で一夜洗浄せよ。
その後、べースラインがゼロになるまで、50ml/hの流速（カラム体積の2〜5倍、約2時間）で、IgG1免疫グロプリンを除くためにクエン酸緩衝液0.1M、pH6でカラムを洗浄する。クエン酸緩衝液0.1M、pH5をIgG2a免疫グロプリン（ior t1）を溶出するために適用する。
ネズミモノクロナール抗体の人間化
遺伝子工学法を用いて、抗CD6ネズミmAbの変種を、ネズミ抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域から、キメラ及び人間化抗体のように構成する（Takashi, N. et al. (1982)Cell29;718;Hieter, P. A. et al.(1980)Cel129 ; 718）。
ネズミモノクロナール航体ior t1の人間化の方法の記述。
サブクローンior t1Aを、CD6分子上に同じエビトープを認識する母体ネズミior t1分泌ハイブリドーマ細胞から得た。そのリガンド結合特性を全体として保ちながら、侵食性モノクロナール抗体の免疫原性を同時に減少する方法で、その免疫原性を減少するためにior t1Aを変更した（特許＃0699755E. P. Bul.）。免疫グロプリンの抗原性はT細胞抗原ペプチドの存在のその配列に依存するので、異種間又は同種間抗体の免疫原性が、通常他の哺乳類抗体で見いだされるものと異なるT細胞抗原配列上に含まれる残基を代えることにより減少できた。もちろん、残基の置換は極限構造又はVernier帯に含まれるものを含まない。この残基の賢明な置換は構造決定因子又は領域間接触に影響せず、リガンド結合特性は可変領域骨格残基に限られる変化の結果として変えるべきでない。
可変領域の相同性の分析：
本方法はKabat et al.,”Sequences of proteins of Immunological Interest”5版、Bethesda, Maryland; National Inst. of Health, 1994により収集されたヒト抗体可変領域の入手可能な配列データを使用する。
第一段階で、ネズミior t1重鎖又は軽鎖の可変領域をヒト配列の可変領域の対応するものと比較する。
比較を自動化コンピュータ法（PC−DOS HIBIO PROSIS 06-00, Hitachi）で行なう。最も一致するヒト可変領域の残基を対応するネズミ領域の残基と比較する。これは各マウス配列が最も似ているヒトサブグループに限定されるだろう。
Tエピトープの予測
第二段階として、マウスとヒトの二つの最も一致する可変領域配列をT抗原配列の予測のために分析する。
アルゴリズムAMPHI（Bersofsky et al., (1987) J. Immunol 138;2213）はヘリックス配列を予測する。アルゴリズムSOHHAはヘリツクス疎水性のストリップ（Elliot et al., (1987) J.Immunol., 138;2949）を予測する。これらのアルゴリズムは抗原蛋白質の断片汁を示したT細胞を予測する。
免疫原性減少のための分析
そのヒトの対応部と異なるマウス骨格の残基をヒトの対応部に存在する残基で置き換える。この切替えはT抗原配列にある、それらの残基でのみ生じる。
最後に、極限構造に対応するそれらの残基又はVernier帯に含まれるそれらの残基は三次構造に有意な影響を有することができる。三次構造又は結合位置への提案された置換の影響に関する追加の情報は可変領域の分子模型から得ることができた。
変化した抗体を構成し発現するための方法
次の方法は、免疫原性が少なく、動物モノクロナール抗体の抗原特異性を有する組替え抗体の発現のための哺乳類細胞を移入するために使用できるヒト骨格へのネズミCDRsの軽鎖及び重鎖の両方を組み入れる組替えDNA配列を用意するために用いる。
a）CDRs及びFRs領域に含まれる可変領域の変異誘発及び構築。PCR変異誘発法（Kamman et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17;5404）は異なる位置に変化を導入するのに好ましい。
b）細胞への移入で一個の可変領域及び親和性及び特異性決定のために十分な蛋白質の分泌を生じる対応するヒト不変領域を含む発現ベクトルの用意。
c）適当な細胞線への重鎖及び軽鎖の共移入。約2週間後に、細胞上澄みをヒトIgG生産に対するELISAにより分析する。試料を特異抗原への結合可能なヒトIgGのための方法で分析する。
in vitrol及びin vivo診断研究で行なうための調合
抗CD6mAbは局所的又は全身的処置の後の患者監視にのために、再発予測と同様に、乾せんの異なる臨床形にin vitro及びin vivo診断目的で使用できる。精製し、アジ化ナトリウム（0.01〜0.2％）及びウシ血清アルプミンを含む緩衡液（pH7.0±0.5）に溶解したmAbは、試料の50〜200mと0.1〜3mg/mlの濃度でmAbの10〜30mlを、40℃で20〜30分培養する、生物学的液体（すなわち、血液、セファロラキジウム液、滑液）中でリンパ球細胞の表面のCD6＋Tリンパ球及び／又はこの分子の発現を定量するために使用できる。緩衝液による洗浄及び蛍光物質（すなわちフルオレセイン、フィコエリスリン）と結合した他の動物種の免疫グロコブリンとの培養が続く。抗CD6mAbは異なる方法で（Coligan, J. E. et al. (Ed.) Current Protocols in Immunology, National Institute of Health, Vol:5, 3, 2, Wiley Intersciencec）蛍光物質と結合され、5〜30mg/mlの濃度で、すでに述べた同様な方法で使用される。
乾せんの患者の障害の免疫化学的評価
感染の患者の皮膚障害又は他の影響した組織（すなわち、関節）の免疫組職化学研究が、アジ化ナトリウム（0.05〜0.2％）及びウシ血清アルブミン（0.05〜0.2％）を含む緩衝液（pII7.0±0.5）中に3〜10mg/mlで溶解した抗CD6mAbを30分間培養して、固定した又は冷たいアセトン中でなく組織凍結断面（すなわち、皮膚）で行なうことができる。ヒツジからのピオチニル化したマウス免疫グロブリン及びアヴィジンビオチンペルオキシダーゼ複合体（すなわちDAKO）と室温で30分間の組織断面の培養が続く。最後に、反応は色原体（Sigma）（）として3-アミノ-9-エチルカルバゾールを用いて展開する。乾せんは二人の専門家こよって試験されねばならず、CD6の評価は点のスケール＜10％（±）、10〜25％（＋）、25〜50％（＋＋）、50〜90％（＋＋＋）、90〜100％（＋＋＋＋）で調整される。
Tリンパ球CDに対する異なる抗体を使用でき、抗CD3（iort3）、抗CD4（iort4）、抗CD8（iort8）、汲び抗CD45（iorL3）、病気の処置の経過中の障害の炎症浸潤の特性の詳細の評価を可能にするケラチン細胞の活性化のマーカー（）として抗皮膚成長因子受容体（ioregf/r3）もまた使用できる。
治療を施した患者の病巣の免疫組織学による検討
抗免疫性のCD6単一クローン免疫グロブリンを投与して治療した患者は、局部又は全身の使用による組織に関する治療の有効性を評価するために、治療開始前、治療中及び治療後に採取した生検と最初に採取した生検を常に隣に並べて、比較されることができる。
治療による反応の程度は質的にパーセンテージで分類することができ、CD6+細胞をCD45+細胞のトータルで割ったインデックスで確定され、生検ごとに評価が可能である。
CD6+細胞のインデックス=CD6+細胞の数X100
CD45+細胞の数
CD3+細胞のインデックス、CD4+細胞のインデックス及びCD8+細胞のインデックスは、CD45+細胞のトータルで割ることによって確定し、CD+4細胞とCD8+細胞のインデックスもCD6+細胞のトータルで割ることによって確定される。
CD3+細胞のインデックス=CD3+細胞の数X100
CD45+細胞の数
CD4+細胞のインデックス=CD4+細胞の数X100
CD45+細胞の数
CD8+細胞のインデックス=CD8+細胞の数X100
CD45+細胞の数
CD4+細胞のインデックス=CD4+細胞の数X100
CD6+細胞の数
CD8+細胞の指数=CD8+細胞の数X100
CD6+細胞の数
治療した患者の免疫シンチグラフィーによる検討
抗免疫性のCD6mAbの投与による治療効果を評価するもう1つの方法は、99m Technetiumのような放射性同位元素と結合した類似のmAbを1ないし5mg投与し、すなわち、Mathers,S.J. et al. (1990) J. NUCL.MED.31(5):692に記載されているような接合法を使って、治療中にCD6+細胞が発現し分布をした患者を免疫シンチグラフィーによって検討することが可能である。
局部及び全身の使用のための治療法の確立
抗免疫性のCD6mAbsは、治療の目的により、様々な乾癬の臨床形態に、局部及び全身の処方として、単一あるいは複合の処方により、疾患の度合いに応じて単独で又は治療の一環として使用することができる。
CD6による局所的治療処方は、mAbを製品1グラム当たり0.1mgから5mgの間の投与量で無菌緩衝溶液（pH7.0+/-0.5）中に溶解できるような一相また二相の半個体組織から構成できる。処方はゼラチン、カルボキシメチルセルローズまたは類似の物質とグリセリン、カルシウムを含む塩基で処理した液体基質（つまり水）を有するゲル、ゼリー、軟膏、ローション剤およびクリームとして形を整えられる。組成物にはさらに汚染を避けるため防腐剤（つまりp-ヒドロキシベンゾナイト）を加えてもよい。mAbの特性に影響をあたえないようpHは生理学的でなければならない。これらの治療用組成物はmAbの皮膚への接触と浸透を助けなければならない。
局所治療剤は1日当たり1回から3回患部全体に塗布するか、そうでなければ同一mAbの患者体重1kg当たり0.1から1mgの全身的用法（主として点滴）と結合して使える。点滴用には生理的食塩水で希釈し徐々におこなう。点滴治療は局所管理とは独立して実施する。
治験患者の臨床的追跡
患部の臨床的測定を治療効果評定の主判断基準として用いてよい。
治療効果評定に用いる反応の主変数は患部の臨床的特性（浸潤、鱗屑、紅斑）の改善と病変部の縮小である。
疾患徴候の厳しさの程度（浸潤、鱗屑、紅斑）は値0-1-2の間で確定できる。
0−徴候なし
1−少し認められる
2−強く認められる
治療した鱗屑の広がりもまた考慮しなければならない。その直径を二つ測り、半径（センチメートル）の積に(3.14)を掛けて患部の面積を計算する。時刻0における鱗屑の大きさを100％としその後の測定においては鱗屑の寸法の百分率を比例的に定める。
PASI（乾蘚面積および強度インデクス）（T.Fredriksson他、(1978)Dermatologica 157:238)類似の乾蘚強度得点を次式により計算する：
浸潤(0-2)＋乾蘚(0-2)＋紅斑(0-2)×疾患部分の面積の％
６
治療への反応は評価時期を終える際のPSSの変化に応じて層化し、下記の範疇を確定する（W.Perkins他、(1993)、Br.J.Dermatol.129:584）
−治癒（PSSの90％以上の改善）
−有効（PSSの50％以上の改善）
−無効（PSSの50％以下の改善または悪化）
−悪化（PSSの50％以上の増加）
反応の評価時期は治療開始の日から12週までと推定する（前治療、週1、2、3、4、6、8、12）
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実施例1：ior t1Aモノクローナル抗体DNA配列決定のネズミの可変領域
細胞質のRNAはFaloro et al （Faloro,J. et al.（1989）Methods in Enzimology 65:718）に記載のごとくおよそ106T1ハイブリドーマ細胞から抽出した。
・cDNA合成反応は5ug RNA, 50mM Tris-HCl, pH7.5, 75mM KCl, 10mM DTT, 3mM MgCl2，重い鎖の可変領域についての25pmol CG2AFORプライマー（5｀GGAAGCTTAGACCGATGGGGCCTGTTGTTTTG3｀）または軽い鎖の可変領域についてのCK2FOR(5｀GGAAGCTTGAAGATGGATACAGTTGGTGCAGC3｀）、それぞれ250uMのdATP, dTTP, dCTP, dGTP,15uのリボヌクレアーゼ阻害剤（RNA guard, Pharmacia）合計体積50ulで構成された。
サンプルは700℃で10分間加熱し、30分にわたって370℃まで徐冷した。つぎに、100単位のMMLV逆転写酵素（BRL）を添加し、1時間にわたって370℃に連続して保温した。
VHとcDNAsはOrlandi et al (Orlandi, R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837, (1989))に記載のごとくPCRを用いて増幅した。VHのPCR増幅について、DNA/プライマー混合物は5ulのcDNA, 25pmolesのCG2AFOR(5｀GGAAGCTTAGACCGATGGGGCCTGTTGTTTTG3｀)とVH1BACKプライマー(5｀AGGT(G/C)(A/C)A(A/G)CTGCAG(G/C)AGTC(A/T)GG3｀)を含んでいた。
VKのPCR増幅についてDNA/プライマー混合物は5ulのcDNA, 25pmolesのCK2 FOR(5｀GGAAGCTTGAAGATGGATACAGTTGGTGCAGC3｀)およびVK10BACK(5｀TTGAATTCCAGTGATGTTTTGATGACCCA3)｀プライマーで構成されていた。
これらの混合物にそれぞれ2.5mMのdATP,dCTP,dTTP,and dGTP,5ulの10X緩衝熱分解酵素と1単位の熱分解酵素(IBI)を添加して最終的体積を50ulとした。サンプルは940℃、30秒；500℃、30秒、720℃、1分間で25回の熱サイクルにかけ、最後に720℃で5分間保温した。増幅したVHおよびVK DNAはPrep.A遺伝子精製キット(BioRad)で精製した。
精製したVHおよびVK DNAはM13ベクター内でクローニングした。クローンはT7 DNA Pol (Pharmacia)を用いてジデオキシ法で配列を決定した。図1と図2参照。
実施例2：予測T細胞抗原配列をヒト化するためのior t1Aネズミのモノクローナル抗体の可変領域配列の修飾
ior t1Aの重い、および軽い鎖の可変領域配列をT細胞抗原配列について分析した。分析に使用した電算機アルゴリズムAMPHIは、両極性の螺旋構造を有する長さがアミノ酸11個の配列、すなわち疎水性の片側とMHC II分子に結合する親水性の片側を有する配列の断片を予測するものである。
重い鎖の可変領域については以下の3つの断片が予測された：（番号付けはKabat法による。）。
1.FR1はアミノ酸2-21の間
2.CDR1とFR2は29-43の間
3.CDR3とFR4はアミノ酸95-lllの間
図1は重い鎖に対応する配列を示している。
このネズミの配列をGeneBankおよびEMBLデータバンクに含まれる免疫グロブリンの配列と比較した。もっとも相同のヒトの可変領域配列を求め、ネズミの配列がもっとも近似しているヒトの亜群を決定した。この場合、発見されたヒトの配列はKabatの亜群IIIに属するIgMであった。
つぎに、ヒトとネズミの、両方の可変領域配列を残基について比較し、Vernier区域または規範的構造に関与しないFR領域の残基を選択した。したがって、これらは同じ位置にあるそれらの残基によってヒトの配列に変換することができる。位置13と19は同じ亜群に属する他のヒト免疫グロブリン内の同じ位置にアミノ酸Lysが存在するので修飾されなかった。
ネズミior t1Aの重い鎖については4つの置換が提案された：
1．ALAによる位置40のTHR
2．GLYによる位置42のGLU
3．LEUによる位置108のTHR
4．VANによる位置109のLEU
同じ手順は、アミノ酸2からアミノ酸69の重なった断片の組にされた軽い鎖（図２）にも提供された。
分析の後、3，11，12，15，17，41および43位置のFRs 1と2について7つの置換を提案した：
1.GLNによる位置3のLYS
2.LEUによる位置11のMET
3.SERによる位置12のTYR
4.VALによる位置15のLEU
5.ASPによる位置17のGLU
6.GLYによる位置41のTRP
7.ALAによる位置43のSER
実施例3：PCR突然変異誘発によるior t1Aの突然変異の重いおよび軽い鎖の可変領域の構成
突然変異の重いおよび軽い鎖の可変領域のアミノ酸の変化はPCR突然変異誘発（Kammann, M. et al. (1989) Proc.Natl.Aced.Sci. USA, 86: 4220）を用いて構成した。
要するに：PCRによる2つの修飾：0.5ulの反応混合物はM13でクローニングした一本鎖DNAのVH上澄み、25pmolesの突然変異オリゴ1または2，25pmolesの突然変異オリゴ3または4プライマー（プライマー配列については下記参照）。これらの混合物にそれぞれ2.5mMのdATP，Dttp，dCTPおよびdGTP，5mlの10X Ventポリメラーゼ緩衝液（NEB）の成分、1単位のVent DNAポリメラーゼ（NEB）を添加して、最終体積を50ulとした。サンプルは940℃で30秒；500℃で30秒；750℃で1分間の12〜15回の熱サイクルにかけ、最後に5分間750℃で保温した。両方のPCRsの生成物を外部のプライマーだけ（3と4）を使用して第二のPCR内で一緒にした。増幅したVH DNAはPrep.A遺伝子精製キット（BioRad）で精製した。
重い鎖内の変化、位置5，7，11，12と13のFR1に使用したプライマーは次の通りである：
これらのプライマーは一つのPCR内に配合された。
これらのプライマーは一つのPCR内に配合された。ついで、PCRsの生成物は3と4のプライマーを用いて一つのPCR内に配合された。
位置108と109の変化について、設計されたプライマーは以下の通りである：
これらのプライマーは一つのPCR内に配合された。
これらのプライマーは一つのPCR内に配合された。ついで、両方のPCRsの生成物は3および4プライマーを用いて一つのPCR内に配合された。
軽い鎖内の、残基3，11，12，15および17のFR1の変化のためにプライマーは以下のように設計された：
これらのプライマーは一つのPCR内に配合された。
これらのプライマーは一つのPCR内に配合された。
両方のPCRsの生成物は3と4プライマーを用いて一つのPCR内に配合された。
FR2内の残基41と43内の変化についてのプライマーは以下の通りであった：
これらのプライマーは一つのPCR内に配合された。
これらのプライマーは一つのPCR内に配合された。
両方のPCRsの生成物は3と4プライマーを用いて一つのPCR内に配合された。
実施例4：尋常性乾癬患者の皮膚創傷に局所的に使用するための医薬品の調剤
ior t1 mAbを精製し、一塩基燐酸ナトリウム4.50mg，二塩基燐酸ナトリウム18.00mg，塩化ナトリウム86.00mg，ポリソルベート80 1.852オL{ママ}、注入のための水を含む無菌緩衝溶液（10mL pH7.0+/-0.5）内に溶解した（50.00mg）。mAbを含む溶液をゼリーの基材に添加した。
治療用のゼリーはmAb（pH7.0+/-0.5）について記載したものに類似の組成を有する緩衝溶液で調製した。
実施例5：尋常性乾癬患者の皮膚の創傷の組織学研究
尋常性乾癬患者の皮膚の創傷の免疫組織学研究はTリンパ細胞のCDに対して向けられた各種のmAbsと平行してmAb ior t1を用いて、皮膚組織のクリオスタット区分について実施した。対照として、mAbs ior t3（抗CD3），ior t4（抗CD4），ior t8（抗CD8），ior L3（抗CD45）およびDAKO CD6（抗CD6），ならびにior egf/r3（抗表皮成長因子受容体）を使用した。ついで、ビオチニル化抗マウス免疫グロブリン（すなわち、ヒツジから，DAKO）とアビジン・ビオチン・ペロシキダーゼ錯体（すなわち、DAKO）で組織の断片を保温した。最後に、色素形成源として3-アミノ-9-エチル-カルバゾル（Sigma）を用いて反応を起こした。二人の専門家によって生検を検査し、CD6の評価を点数の尺度に調整した：＜10％（+/-），10-25％（+），25-50％（++），50-90％（+++），90-100％（++++）。
抗CD6モノクローナル抗体で治療した患者は治療開始の前と、最初の生検に隣接する区域内で治療の三週目の終わりに、創傷部の生検を受けていた。治療応答を分類する尺度は百分率で表した定性的尺度で、それぞれの生検について評価した。異なる皮膚層の中の抗表皮成長因子受容体（EGF-R）の発現率は、この疾病に固有の組織学的特徴の変化と合わせて決定した。
*尋常性乾癬に特徴的な炎症性浸出液内にCD6＋Tリンパ性表現型の高い発現（＋＋＋）が認められた。
*CD3+リンパ細胞はCD45+細胞のほぼ100％に当たる。
*CD6+細胞はCD3＋細胞のほぼ60％と90％超の間である。
*CD6+細胞（ior t1）はCD6+細胞（DAKO CD6）のほぼ30％と50％の間である。
*ケラチン細胞内のEGF-Rの発現が上昇して、架橋パターンを示した。
炎症浸出液のTリンパ細胞内のCD6分子の発現の優勢は大きなものになったが、それはそれが活性化したTリンパ細胞の分子特性だからである。このことから、これが外因性抗原または修飾された自己抗原の侵入によって皮膚内で当初活性化されたTリンパ細胞の白血球付着分子に当たるものと思われる。前記抗原に応答している間に活性化された皮膚の特定の細胞決定子との相互作用にこれが必要である。
実施例6：ior t1 mAbによる局所治療に対する尋常性乾癬患者の臨床的応答
尋常性乾癬に特徴的な創傷の再発のある尋常性乾癬患者の臨床試験を実施した。局所的治療のために受領したゼリー（ior t1 mAbまたは賦形剤）によって決められた群当たり14人の患者を含む二群について研究を計画した。局所的治療の処方はゼリーベースまたは賦形剤（カルボキシメチルセルローズナトリウムv/v，プロピレングリコール、メチルパラベノ、トリエタノールアミン）に従い、その中にmAbを入れた。治療は手当する創傷を隠蔽せずに21日にわたって一日2回塗布した。
ior t1 mAbで治療した全ての患者は乾癬斑創傷が白化した（図4）。この結果はmAbの塗布開始から21日後に実施した治療後生検とも符合する。Tリンパ細胞浸出液とケラチン細胞内のEDF-Rの発現の減少、ならびにこの疾患に特徴的な組織学的兆候の後退が認められた。
実施例7：ior t1モノクローナル抗体による逓減的局所治療後の尋常性乾癬患者の臨床的応答
皮膚の10％を越えて、25％未満が観戦している19人の確認された長期的尋常性乾癬患者に対してパイロット臨床試験を実施した。患者数が6、7および6人の三群がカルボキシメチルセルローズナトリウムA/V，プロピレングリコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、トリエタノールアミンからなる賦形剤のゼリー中に、それぞれ0.3，1および3mgのior t1A mAb/gramのゼリーを含有する治療用の局所的処方を受けた。患者は21日間にわたって一日2回局所的治療を受けた。
PASI（乾癬面積および重度指数）を評価、分析し、患者の血清内のヒト抗マウス抗体（HAMA）反応も研究した。臨床的応答（PASI）に関する最前の結果と疾患のない期間は少量のior t1 mAb（0.3mg）で治療した群で得られた、またHAMA（ヒト抗マウス抗体）力価とそれを発生している群当たりの患者数はやはりその群で高かった。さらに阻害ELISA（酵素連結免疫吸収剤検定）およびFACS（蛍光発生活性化細胞ソーター）によって研究した患者の血清内の抗ヨード型抗体の存在はゼリー1グラム当たり0.3mgの少量で治療した患者の方が頻繁で、はるかに高かった。
実施例8：ior t1 mAbによる静脈内治療に対する前進化した乾癬の重篤な形態の患者の臨床的応答
およそ17年前に乾癬性関節症を診断された乾癬の履歴のある56歳の女性の患者。過去5年間に患者は頻繁に、強い発症を起こして、頻繁に入院していた。発症は｛erithematosquamous？紅斑性｝全身性創傷、関節と筋肉の疼痛、発熱、浮腫と悪寒で始まった。この前進的状態は長引き、21日後に新しい創傷が脇、首、乳房の周囲に発現し、膿と感染した漿膜が分泌されると共に熱を持った。疾患の緩慢な進行と、ステロイド軟膏を含む以前の全ての治療に対する不耐性の故に、合計服用量が15mgになる3サイクルを投与するメトトレキセートによる治療が処方された。臨床的応答は認められなかった。
1回の静脈内投与量が体重1kgあたり0.6mgのior t1 mAbを0.9％生理食塩水200mL内に希釈して、徐々に投与した。
同時に、ゼリー1g当たりmAbが3mgの濃度でior t1 mAbを含む治療用のゼリーを二日間にわたって全ての創傷に一日2回塗布した。
治療6日目当たりから患者は前進的状態および皮膚科所見が改善された。21日目に評価したところ、体表面積の60％に創傷が無く、皮膚の残りの部分のこの疾患の臨床的兆候が改善を示した。患者は関節の症候が改善したと報告し、全身状態が良好で、正常な生命兆候を示し、通常の検査結果も正常であった。
30日後、患者のこの疾病の兆候は完全に後退したままであった。
【図面の簡単な説明】
図1と2
モノクローナル抗体ior t1Aの重い、および軽い鎖の可変領域のヒト化による修飾の分析
図1：ネズミのior t1Aモノクローナル抗体の重い鎖の可変領域の配列
図2：ネズミのior t1Aモノクローナル抗体の軽い鎖の可変領域の配列
A：ior t1AネズミmAbの重い鎖または軽い鎖の可変領域の配列
B：もっとも相同のヒト免疫グロブリンの可変領域の配列
C：ior t1Aの修飾した可変領域の配列
陰は予測T細胞抗原配列。
下線を引いたアミノ酸残基：第三位の構造に関与するアミノ酸。
太字は相補性決定領域。
箱の中のアミノ酸残基：提案された置換。
記載は重い鎖と軽い鎖の両方で同一。
図3
尋常性乾癬患者の皮膚の創傷に特徴的な炎症性浸出液のリンパ細胞内のCD6抗原の発現結果が示されている。上肢および／または下肢および／または胸郭・腹部に限定されたプラーク創傷に冒された皮膚のクリオスタット区分で評価を実施した。免疫組織化学研究を実施する前に組織学的評価を実施した。
図4
滲出、剥落、紅斑および創傷面積の大きさなどのパラメータを考慮して乾癬治療に使用した抗CD6 mAbsの治療効果を評価した。重篤度は0-1-2の値で設定した。治療したプラークの面積はその半径で測定した。PASI（乾癬面積および重度指数）と同様な乾癬重篤点数（PSS）が得られ、治療への応答は指定された評価時間の終わりのPSSの変化で階層化した。次の区分に分けた：明らか、応答あり、応答なし、悪化。
図5
ゼリー中に、それぞれ0.3，1および3mgのior t1A mAb/gramの局所的調剤で治療した患者の臨床的応答とコレラの患者の血清内のヒト抗マウス抗体（HAMA）反応も研究した。臨床的応答（PASI）に関する最前の結果と疾患のない期間は少量のior t1 mAb（0.3mg）で治療した群で得られた、またHAMA力価とそれを発生している群当たりの患者数はやはりその群で高かった。さらに患者の血清内の抗ヨード型抗体の存在はゼリー1グラム当たり0.3mgの少量で治療した患
図６
およそ１７年前に乾癬性関節症を診断された乾癬の履歴のある５６歳の女性の患者にｉｏｒ ｔｌ ｍＡｂによる静脈内治療を施した。現在の症例は、全身化した乾癬の重篤な形態であり、「ｅｒｉｔｈｅｍａｔｏｓｑｕａｍｏｕｓ」紅斑性全身性創傷、関節と筋肉の疼痛、発熱、浮腫と悪寒が特徴である。この全身化症例はメトトレキセートによる治療室では臨床的応答は認められなかった。１回の静脈内投与量が体重１ｋｇあたり０．６ｍｇのｉｏｒ ｔｌ ｍＡｂを０．９％生理食塩水２００ｍＬ内に希釈して、徐々に投与した。同時に、ゼリー１ｇ当たりｍＡｂが３ｍｇの濃度でｉｏｒ ｔｌ ｍＡｂを含む治療用のゼリー（合計で２２４ｇのゼリー）を二日間にわたって全ての創傷に一日２回塗布した。患者の全身的状態および皮膚科所見を週で評価した。写真は皮膚損傷の治療度合いを示す（治療前と治療後２１日経過後）。
本発明は、免疫の分野に関し、特にCD6白血球分化抗原を認識するモノクロナール抗体を含む薬剤成分の獲得に関する。
先行技術の説明
モノクロナール抗体(mAbs)は、細胞表面に発現された生理学的重要なある分子の特徴付けを可能にしてきた。免疫システムの細胞の中で「白血球分化群」又は抗原(CD)を定義している(Scholosman, S. F. et al. (1994) Immunol. Today 15(3):98)。細胞認識、吸着のメカニズムにおいて、さらに免疫反応での活性化、増殖のメカニズムにおいて、個体発生の際のリンパ球分化や成熟において、CDの役割は、診断や免疫療法でそれぞれのmAbsを使用するために定義され、有望な結果をもたらしてきた(Dan tal, J et al.(1991) Curr. Opin. Immunol. 3:740)。
ヒトTリンパ球の細胞膜で発現される分子の逆方向に向くマウスmAbsは、これらの細胞の機能不全が存在する臨床実体の診断を改善するために寄与してきた。さらに、移植拒絶、移植片対宿主疾患(GvHD)、自己免疫疾患の場合に、機能的活性を調製する目的で、新しい治療法を開拓するために使われてきた（Waldman, T. A.(1991) Sience2 52:1657;Waldman, T,A.(1992) Annu. Rev. Immunol.10:675）。CD6は、明確に特徴付けされていない分子である。これが動態的平衡において維持され、リン酸化のグレードにおいてのみ異なる２つの分子形に存在するグリコプロテインであることが知られている。活性化されたTリンパにおいては、過剰リン酸化された130kDaの分子で(C Eldenas, L. et al. (1990) J. Immunol. 145:1450;Swack, J. A. et al.(1991) J. Boil. Chem. 266: 7137)、特徴のある構造で一団の膜受容体や分泌蛋白質の一員であるが(Kodam a, T. et al.(1990) Nature 343: 531; Aruffo, A. et al.(1991 J. Exp. Med. 174:949)、残りのTリンパにおいては、リン酸化された105kDaの分子である。末梢血のTリンパ球においては、ヒトの成熟した胸腺細胞表面で発現され、Bリンパ球のサブタイプや大脳皮質の神経においては、CD3+細胞の大部分を構成する。末梢血のTリンパ球にお皮質の神経においては、CD3+細胞の大部分を構成する。末梢血のTリンパ球においては、細胞の活性化メカニズムに関与する(Reinhertz E. L. et al. (1982) Cell 30: 735; Kamoun, M. et al(1981)J.Immunol. 127:987; Mayer, B et al.(1990) J. Neuroimmunol. 29: 193; Rasmussen, R. A.et al.(1994)J. Immunol. 152: 527)。病因の異なる疾患での生理病理学上の役割だけでなく、T細胞個体発生におけるCD6の役割も知られていない。
近年になってCD6リガンドが同定され、胸腺、脾臓、リンパ節、皮膚など正常な組織に広範囲にわたる細胞分布を持つという特徴も分かってきた(Dhavalkumar, D. P. et al. (1995) J. Exp. Med. 181: 1563)。この分子は、単球だけでなく活性化したT、Bリンパ球で発現されるためにALCAM(活性化白血球細胞吸着分子)と称され、イムノグロブリンと同様に細胞外ドメインを5個持つ分子量100kDaのタイプI膜グリコプロテインである。二価の陽イオンにより異なる活性化レベルが存在でき、異種親和的及び、同種親和的相互作用が介在できる(Bowen, M. A. et al.(1995)J. Exp Med. 181:2213)。
異なる抗CD6mAbsが、臓器移植での拒絶反応を防ぐための臨床試験で使用され(Kirkman, R. L. et al. (1983) Transplantation 36: 620)、又、移植片対宿主疾患(GvHD)を防ぐために単球からの骨髄移植を減少させるためにも使われている(Soiffer, R.J. et al.(1992) J. Clin. Oncol. 10: 1191)。ior t1 mAbは、皮膚T細胞リンパ腫の治療のために、二相の臨床試験におかれている。(Garc EDa, C. A. et al.(1990) Bi otecnolog EDa Aplicada 7(2): 176; Faxas, M.E. et al(1993)BiotecnologEDa Apli cada 10(1): 20)。
IgG2aイソタイプのior t1モノクロナール抗体は、白血球分化の国際ワークショップIVにおいてCD6として分類された(Antigans, Virnna(1989))。このmAbは、別の抗CD6mAbsに認識されるものとは異なるエピトープを定義する。このエピトープは、CD6分子の一次構造に位置する可能性があり、安定なコンホメーションで、還元剤に感受性がない(Osori, L. M. et al.(1994)Cell Immnol. 154: 123)。このモノクロナール抗体では、健康なドナーの末梢血の単核細胞では、他のCD6mAbsよりも認識が低い。Tリンパ球起源のヒト細胞培養系におけるior t1 mAbの認識パターンは、Jurkat細胞の47％、Molt-4細胞の23％であり、CCRF-CEM細胞は認識されない。Bリンパ球起源ではRajiの9％が、赤芽球起源ではK-562の12％、骨髄単球起源では、U-937の9％が認識されている。さらに、慢性Bリンパ球白血病(89+/- 4％)の末梢血単核細胞(Garc EDa C.A et al. (1992) Biotecnolog Eda Aplicasa 90(1): 70)や、皮膚T細胞白血病患者の皮膚病変のリンパ球(Rodr EDguez, T. et al.(1985)Interfer F3n y Biotec. 2(1):41)も認識している。
ior t1 mAbは、in vitroにおいて抗原特異的細胞の細胞毒性を阻害しない(Fax as M.E. et al.(1993) Biotecnolog EDa Aplicada 10(1): 47)。これはin vitroにおいて健康なドナーの末梢血T細胞を活性化することができる。OKT3(抗CD3)の最適下限濃度においては、ior t1との架橋は、他の抗CD6mAbsとの架橋で得られるものよりも反応性が高い(Osorio, L. M. et al/(1994) Cell Immunol. 154: 123)。乾せんは、生理病理学的には定義されていない疾患である(Hunziker, T. et al.(1993) Ther, Umsch. 50(2):110; Elder, J. T et al(1994) J. Invest. Dermatol. 102(6):24S)。T細胞受容体の強度の少クロン性だけでなくCD4+やCD8+フェノタイプの活性化Tリンパが優勢で(Chang, J. C. C. et al.(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9282)、標的臓器に炎症性浸潤が存在するという特徴があり、この細胞は皮膚に遊走する傾向が強いようである(ホーミング)(Baker, J. N. W. N. ert al(1992)Br. J. Derma tol. 127: 205; Messen, A. et al.(1995) J. Immunol. 155: 4078; Valdimarsson, H.et al.(1995) Imunol. Today 16(3): 145)。
皮膚のT細胞が減少していれば、乾せんの自発的軽減が予測される。つまり、それがケラチノサイトの増殖を誘発する、臨床兆候の原因となる免疫反応の溶解性仲介物質を放出することにより、疾患を永続させる重要な役割を持つことを示唆している。これらの判断は、同種間骨髄移植後の疾患治癒、HLA結合の可能性、ステロイド特にサイクロスポリンによる改善、不可逆的ではあるが、抗T細胞治療モノクロナール抗体による改善などの事実により支持される(Griffitha, C.E.M.et al.(1992) Springer Sem in Immunopathol. 13: 441; Nanney, L. B. et al.(1986)J.Invest.Dermayol/86(3) : 260; Piccasia, D. D. et al.(1978)I. Am. Acad. Dermatol17)3: 408; Schopf, R. F. et al. (1986) Arch. Dermatol. Res. 279(2): 89; vande Kerkhof, P. C. et al,(1987) Dermatologica 174(5):224)。
モノクロナール抗体免疫療法の成功は、標的分子の選択にかかっている。この標的分子は重要な細胞機能に、又はmAbの選択に関与しているはずである(Dantal, J. et al.(1991)urr. Opin. Immunol. 3: 740)。CD3(Weinshenker, B. G. et al.(1989) JAm. Acad. Dermatol. 20: 1132)やCD4(poizot-Martin, I. et al.(1991) Lancet 337: 1477; Prinz J. et al. (1991) Lancet 338: 320; Nicolas, J. F. etal.(1991) Lancet 338; 321)と逆向きの乾せんに評価されるmAbsは、複合的で高用量の静脈内投与後の患者において、短い持続時間で部分的に軽減したり、あらゆる症例の疾患症状や兆候を早期に再発させながら、臨床的改善をもたらす。
複合的用量でのマウスmAbsの治療適用は、幾つかの二次的効果につながり、患者における臨床利用は限られる。これらは、ヒト抗マウス抗体反応(HAMA)を誘導するマウス蛋白質の異種性に関係する。蛋白質設計で生じる人間化抗体は、遺伝子原性、薬理学的動態の改善、臨床的利益を減少させる(Winter, G. et al.(1993) Trends-Pharmacol-Sci, 14(5); 139)。
これまでに、乾せんの皮膚の炎症性浸潤にあるTリンパ球で、CD6分子の発現を説明する試験や、この分子と疾患生成との可能な関わりを説明した試験は報告されていない。又、この疾患での抗CD6mAbsの治療適用についてもこれまでに評価されていない。
本発明の新案は、異なる投与経路や異なる臨床形式を使って、CD6モノクロナール抗体など、局所的及び全身的な薬剤構成を提供することや、尋常性乾せん患者へ適用するための人間化モノクロナール抗体抗CD6を獲得することからなる。
発明の詳細な記述
モノクロナール抗体の取得
ネズミモノクロナール抗体の精製
抗CD6モノクロナール抗体（mAb）をProtein A Sephroseにより腹水から精製し、同体積のグリシン緩衝液1.5M、NaCl 3M、pH8.9で希釈し、同じ緩衝液のマトリックスと平衡にする。同体積の腹水及び緩衝溶出液を適用して50ml/hの流速で行なうべきである。ベースラインがゼロになるまでカラムを同じ適用緩衝液で一夜洗浄せよ。
その後、べースラインがゼロになるまで、50ml/hの流速（カラム体積の2〜5倍、約2時間）で、IgG1免疫グロプリンを除くためにクエン酸緩衝液0.1M、pH6でカラムを洗浄する。クエン酸緩衝液0.1M、pH5をIgG2a免疫グロプリン（ior t1）を溶出するために適用する。
ネズミモノクロナール抗体の人間化
遺伝子工学法を用いて、抗CD6ネズミmAbの変種を、ネズミ抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域から、キメラ及び人間化抗体のように構成する（Takashi, N. et al. (1982)Cell29;718;Hieter, P. A. et al.(1980)Cel129 ; 718）。
ネズミモノクロナール航体ior t1の人間化の方法の記述。
サブクローンior t1Aを、CD6分子上に同じエビトープを認識する母体ネズミior t1分泌ハイブリドーマ細胞から得た。そのリガンド結合特性を全体として保ちながら、侵食性モノクロナール抗体の免疫原性を同時に減少する方法で、その免疫原性を減少するためにior t1Aを変更した（特許＃0699755E. P. Bul.）。免疫グロプリンの抗原性はT細胞抗原ペプチドの存在のその配列に依存するので、異種間又は同種間抗体の免疫原性が、通常他の哺乳類抗体で見いだされるものと異なるT細胞抗原配列上に含まれる残基を代えることにより減少できた。もちろん、残基の置換は極限構造又はVernier帯に含まれるものを含まない。この残基の賢明な置換は構造決定因子又は領域間接触に影響せず、リガンド結合特性は可変領域骨格残基に限られる変化の結果として変えるべきでない。
可変領域の相同性の分析：
本方法はKabat et al.,”Sequences of proteins of Immunological Interest”5版、Bethesda, Maryland; National Inst. of Health, 1994により収集されたヒト抗体可変領域の入手可能な配列データを使用する。
第一段階で、ネズミior t1重鎖又は軽鎖の可変領域をヒト配列の可変領域の対応するものと比較する。
比較を自動化コンピュータ法（PC−DOS HIBIO PROSIS 06-00, Hitachi）で行なう。最も一致するヒト可変領域の残基を対応するネズミ領域の残基と比較する。これは各マウス配列が最も似ているヒトサブグループに限定されるだろう。
Tエピトープの予測
第二段階として、マウスとヒトの二つの最も一致する可変領域配列をT抗原配列の予測のために分析する。
アルゴリズムAMPHI（Bersofsky et al., (1987) J. Immunol 138;2213）はヘリックス配列を予測する。アルゴリズムSOHHAはヘリツクス疎水性のストリップ（Elliot et al., (1987) J.Immunol., 138;2949）を予測する。これらのアルゴリズムは抗原蛋白質の断片汁を示したT細胞を予測する。
免疫原性減少のための分析
そのヒトの対応部と異なるマウス骨格の残基をヒトの対応部に存在する残基で置き換える。この切替えはT抗原配列にある、それらの残基でのみ生じる。
最後に、極限構造に対応するそれらの残基又はVernier帯に含まれるそれらの残基は三次構造に有意な影響を有することができる。三次構造又は結合位置への提案された置換の影響に関する追加の情報は可変領域の分子模型から得ることができた。
変化した抗体を構成し発現するための方法
次の方法は、免疫原性が少なく、動物モノクロナール抗体の抗原特異性を有する組替え抗体の発現のための哺乳類細胞を移入するために使用できるヒト骨格へのネズミCDRsの軽鎖及び重鎖の両方を組み入れる組替えDNA配列を用意するために用いる。
a）CDRs及びFRs領域に含まれる可変領域の変異誘発及び構築。PCR変異誘発法（Kamman et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17;5404）は異なる位置に変化を導入するのに好ましい。
b）細胞への移入で一個の可変領域及び親和性及び特異性決定のために十分な蛋白質の分泌を生じる対応するヒト不変領域を含む発現ベクトルの用意。
c）適当な細胞線への重鎖及び軽鎖の共移入。約2週間後に、細胞上澄みをヒトIgG生産に対するELISAにより分析する。試料を特異抗原への結合可能なヒトIgGのための方法で分析する。
in vitrol及びin vivo診断研究で行なうための調合
抗CD6mAbは局所的又は全身的処置の後の患者監視にのために、再発予測と同様に、乾せんの異なる臨床形にin vitro及びin vivo診断目的で使用できる。精製し、アジ化ナトリウム（0.01〜0.2％）及びウシ血清アルプミンを含む緩衡液（pH7.0±0.5）に溶解したmAbは、試料の50〜200mと0.1〜3mg/mlの濃度でmAbの10〜30mlを、40℃で20〜30分培養する、生物学的液体（すなわち、血液、セファロラキジウム液、滑液）中でリンパ球細胞の表面のCD6＋Tリンパ球及び／又はこの分子の発現を定量するために使用できる。緩衝液による洗浄及び蛍光物質（すなわちフルオレセイン、フィコエリスリン）と結合した他の動物種の免疫グロコブリンとの培養が続く。抗CD6mAbは異なる方法で（Coligan, J. E. et al. (Ed.) Current Protocols in Immunology, National Institute of Health, Vol:5, 3, 2, Wiley Intersciencec）蛍光物質と結合され、5〜30mg/mlの濃度で、すでに述べた同様な方法で使用される。
乾せんの患者の障害の免疫化学的評価
感染の患者の皮膚障害又は他の影響した組織（すなわち、関節）の免疫組職化学研究が、アジ化ナトリウム（0.05〜0.2％）及びウシ血清アルブミン（0.05〜0.2％）を含む緩衝液（pII7.0±0.5）中に3〜10mg/mlで溶解した抗CD6mAbを30分間培養して、固定した又は冷たいアセトン中でなく組織凍結断面（すなわち、皮膚）で行なうことができる。ヒツジからのピオチニル化したマウス免疫グロブリン及びアヴィジンビオチンペルオキシダーゼ複合体（すなわちDAKO）と室温で30分間の組織断面の培養が続く。最後に、反応は色原体（Sigma）（）として3-アミノ-9-エチルカルバゾールを用いて展開する。乾せんは二人の専門家こよって試験されねばならず、CD6の評価は点のスケール＜10％（±）、10〜25％（＋）、25〜50％（＋＋）、50〜90％（＋＋＋）、90〜100％（＋＋＋＋）で調整される。
Tリンパ球CDに対する異なる抗体を使用でき、抗CD3（iort3）、抗CD4（iort4）、抗CD8（iort8）、汲び抗CD45（iorL3）、病気の処置の経過中の障害の炎症浸潤の特性の詳細の評価を可能にするケラチン細胞の活性化のマーカー（）として抗皮膚成長因子受容体（ioregf/r3）もまた使用できる。
治療を施した患者の病巣の免疫組織学による検討
抗免疫性のCD6単一クローン免疫グロブリンを投与して治療した患者は、局部又は全身の使用による組織に関する治療の有効性を評価するために、治療開始前、治療中及び治療後に採取した生検と最初に採取した生検を常に隣に並べて、比較されることができる。
治療による反応の程度は質的にパーセンテージで分類することができ、CD6+細胞をCD45+細胞のトータルで割ったインデックスで確定され、生検ごとに評価が可能である。
CD6+細胞のインデックス=CD6+細胞の数X100
CD45+細胞の数
CD3+細胞のインデックス、CD4+細胞のインデックス及びCD8+細胞のインデックスは、CD45+細胞のトータルで割ることによって確定し、CD+4細胞とCD8+細胞のインデックスもCD6+細胞のトータルで割ることによって確定される。
CD3+細胞のインデックス=CD3+細胞の数X100
CD45+細胞の数
CD4+細胞のインデックス=CD4+細胞の数X100
CD45+細胞の数
CD8+細胞のインデックス=CD8+細胞の数X100
CD45+細胞の数
CD4+細胞のインデックス=CD4+細胞の数X100
CD6+細胞の数
CD8+細胞の指数=CD8+細胞の数X100
CD6+細胞の数
治療した患者の免疫シンチグラフィーによる検討
抗免疫性のCD6mAbの投与による治療効果を評価するもう1つの方法は、99m Technetiumのような放射性同位元素と結合した類似のmAbを1ないし5mg投与し、すなわち、Mathers,S.J. et al. (1990) J. NUCL.MED.31(5):692に記載されているような接合法を使って、治療中にCD6+細胞が発現し分布をした患者を免疫シンチグラフィーによって検討することが可能である。
局部及び全身の使用のための治療法の確立
抗免疫性のCD6mAbsは、治療の目的により、様々な乾癬の臨床形態に、局部及び全身の処方として、単一あるいは複合の処方により、疾患の度合いに応じて単独で又は治療の一環として使用することができる。
CD6による局所的治療処方は、mAbを製品1グラム当たり0.1mgから5mgの間の投与量で無菌緩衝溶液（pH7.0+/-0.5）中に溶解できるような一相また二相の半個体組織から構成できる。処方はゼラチン、カルボキシメチルセルローズまたは類似の物質とグリセリン、カルシウムを含む塩基で処理した液体基質（つまり水）を有するゲル、ゼリー、軟膏、ローション剤およびクリームとして形を整えられる。組成物にはさらに汚染を避けるため防腐剤（つまりp-ヒドロキシベンゾナイト）を加えてもよい。mAbの特性に影響をあたえないようpHは生理学的でなければならない。これらの治療用組成物はmAbの皮膚への接触と浸透を助けなければならない。
局所治療剤は1日当たり1回から3回患部全体に塗布するか、そうでなければ同一mAbの患者体重1kg当たり0.1から1mgの全身的用法（主として点滴）と結合して使える。点滴用には生理的食塩水で希釈し徐々におこなう。点滴治療は局所管理とは独立して実施する。
治験患者の臨床的追跡
患部の臨床的測定を治療効果評定の主判断基準として用いてよい。
治療効果評定に用いる反応の主変数は患部の臨床的特性（浸潤、鱗屑、紅斑）の改善と病変部の縮小である。
疾患徴候の厳しさの程度（浸潤、鱗屑、紅斑）は値0-1-2の間で確定できる。
0−徴候なし
1−少し認められる
2−強く認められる
治療した鱗屑の広がりもまた考慮しなければならない。その直径を二つ測り、半径（センチメートル）の積に(3.14)を掛けて患部の面積を計算する。時刻0における鱗屑の大きさを100％としその後の測定においては鱗屑の寸法の百分率を比例的に定める。
PASI（乾蘚面積および強度インデクス）（T.Fredriksson他、(1978)Dermatologica 157:238)類似の乾蘚強度得点を次式により計算する：
浸潤(0-2)＋乾蘚(0-2)＋紅斑(0-2)×疾患部分の面積の％
６
治療への反応は評価時期を終える際のPSSの変化に応じて層化し、下記の範疇を確定する（W.Perkins他、(1993)、Br.J.Dermatol.129:584）
−治癒（PSSの90％以上の改善）
−有効（PSSの50％以上の改善）
−無効（PSSの50％以下の改善または悪化）
−悪化（PSSの50％以上の増加）
反応の評価時期は治療開始の日から12週までと推定する（前治療、週1、2、3、4、6、8、12）
/E
実施例1：ior t1Aモノクローナル抗体DNA配列決定のネズミの可変領域
細胞質のRNAはFaloro et al （Faloro,J. et al.（1989）Methods in Enzimology 65:718）に記載のごとくおよそ106T1ハイブリドーマ細胞から抽出した。
・cDNA合成反応は5ug RNA, 50mM Tris-HCl, pH7.5, 75mM KCl, 10mM DTT, 3mM MgCl2，重い鎖の可変領域についての25pmol CG2AFORプライマー（5｀GGAAGCTTAGACCGATGGGGCCTGTTGTTTTG3｀）または軽い鎖の可変領域についてのCK2FOR(5｀GGAAGCTTGAAGATGGATACAGTTGGTGCAGC3｀）、それぞれ250uMのdATP, dTTP, dCTP, dGTP,15uのリボヌクレアーゼ阻害剤（RNA guard, Pharmacia）合計体積50ulで構成された。
サンプルは700℃で10分間加熱し、30分にわたって370℃まで徐冷した。つぎに、100単位のMMLV逆転写酵素（BRL）を添加し、1時間にわたって370℃に連続して保温した。
VHとcDNAsはOrlandi et al (Orlandi, R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837, (1989))に記載のごとくPCRを用いて増幅した。VHのPCR増幅について、DNA/プライマー混合物は5ulのcDNA, 25pmolesのCG2AFOR(5｀GGAAGCTTAGACCGATGGGGCCTGTTGTTTTG3｀)とVH1BACKプライマー(5｀AGGT(G/C)(A/C)A(A/G)CTGCAG(G/C)AGTC(A/T)GG3｀)を含んでいた。
VKのPCR増幅についてDNA/プライマー混合物は5ulのcDNA, 25pmolesのCK2 FOR(5｀GGAAGCTTGAAGATGGATACAGTTGGTGCAGC3｀)およびVK10BACK(5｀TTGAATTCCAGTGATGTTTTGATGACCCA3)｀プライマーで構成されていた。
これらの混合物にそれぞれ2.5mMのdATP,dCTP,dTTP,and dGTP,5ulの10X緩衝熱分解酵素と1単位の熱分解酵素(IBI)を添加して最終的体積を50ulとした。サンプルは940℃、30秒；500℃、30秒、720℃、1分間で25回の熱サイクルにかけ、最後に720℃で5分間保温した。増幅したVHおよびVK DNAはPrep.A遺伝子精製キット(BioRad)で精製した。
精製したVHおよびVK DNAはM13ベクター内でクローニングした。クローンはT7 DNA Pol (Pharmacia)を用いてジデオキシ法で配列を決定した。図1と図2参照。
実施例2：予測T細胞抗原配列をヒト化するためのior t1Aネズミのモノクローナル抗体の可変領域配列の修飾
ior t1Aの重い、および軽い鎖の可変領域配列をT細胞抗原配列について分析した。分析に使用した電算機アルゴリズムAMPHIは、両極性の螺旋構造を有する長さがアミノ酸11個の配列、すなわち疎水性の片側とMHC II分子に結合する親水性の片側を有する配列の断片を予測するものである。
重い鎖の可変領域については以下の3つの断片が予測された：（番号付けはKabat法による。）。
1.FR1はアミノ酸2-21の間
2.CDR1とFR2は29-43の間
3.CDR3とFR4はアミノ酸95-lllの間
図1は重い鎖に対応する配列を示している。
このネズミの配列をGeneBankおよびEMBLデータバンクに含まれる免疫グロブリンの配列と比較した。もっとも相同のヒトの可変領域配列を求め、ネズミの配列がもっとも近似しているヒトの亜群を決定した。この場合、発見されたヒトの配列はKabatの亜群IIIに属するIgMであった。
つぎに、ヒトとネズミの、両方の可変領域配列を残基について比較し、Vernier区域または規範的構造に関与しないFR領域の残基を選択した。したがって、これらは同じ位置にあるそれらの残基によってヒトの配列に変換することができる。位置13と19は同じ亜群に属する他のヒト免疫グロブリン内の同じ位置にアミノ酸Lysが存在するので修飾されなかった。
ネズミior t1Aの重い鎖については4つの置換が提案された：
1．ALAによる位置40のTHR
2．GLYによる位置42のGLU
3．LEUによる位置108のTHR
4．VANによる位置109のLEU
同じ手順は、アミノ酸2からアミノ酸69の重なった断片の組にされた軽い鎖（図２）にも提供された。
分析の後、3，11，12，15，17，41および43位置のFRs 1と2について7つの置換を提案した：
1.GLNによる位置3のLYS
2.LEUによる位置11のMET
3.SERによる位置12のTYR
4.VALによる位置15のLEU
5.ASPによる位置17のGLU
6.GLYによる位置41のTRP
7.ALAによる位置43のSER
実施例3：PCR突然変異誘発によるior t1Aの突然変異の重いおよび軽い鎖の可変領域の構成
突然変異の重いおよび軽い鎖の可変領域のアミノ酸の変化はPCR突然変異誘発（Kammann, M. et al. (1989) Proc.Natl.Aced.Sci. USA, 86: 4220）を用いて構成した。
要するに：PCRによる2つの修飾：0.5ulの反応混合物はM13でクローニングした一本鎖DNAのVH上澄み、25pmolesの突然変異オリゴ1または2，25pmolesの突然変異オリゴ3または4プライマー（プライマー配列については下記参照）。これらの混合物にそれぞれ2.5mMのdATP，Dttp，dCTPおよびdGTP，5mlの10X Ventポリメラーゼ緩衝液（NEB）の成分、1単位のVent DNAポリメラーゼ（NEB）を添加して、最終体積を50ulとした。サンプルは940℃で30秒；500℃で30秒；750℃で1分間の12〜15回の熱サイクルにかけ、最後に5分間750℃で保温した。両方のPCRsの生成物を外部のプライマーだけ（3と4）を使用して第二のPCR内で一緒にした。増幅したVH DNAはPrep.A遺伝子精製キット（BioRad）で精製した。
重い鎖内の変化、位置5，7，11，12と13のFR1に使用したプライマーは次の通りである：
位置108と109の変化について、設計されたプライマーは以下の通りである：
軽い鎖内の、残基3，11，12，15および17のFR1の変化のためにプライマーは以下のように設計された：
両方のPCRsの生成物は3と4プライマーを用いて一つのPCR内に配合された。
FR2内の残基41と43内の変化についてのプライマーは以下の通りであった：
両方のPCRsの生成物は3と4プライマーを用いて一つのPCR内に配合された。
実施例4：尋常性乾癬患者の皮膚創傷に局所的に使用するための医薬品の調剤
ior t1 mAbを精製し、一塩基燐酸ナトリウム4.50mg，二塩基燐酸ナトリウム18.00mg，塩化ナトリウム86.00mg，ポリソルベート80 1.852オL{ママ}、注入のための水を含む無菌緩衝溶液（10mL pH7.0+/-0.5）内に溶解した（50.00mg）。mAbを含む溶液をゼリーの基材に添加した。
治療用のゼリーはmAb（pH7.0+/-0.5）について記載したものに類似の組成を有する緩衝溶液で調製した。
実施例5：尋常性乾癬患者の皮膚の創傷の組織学研究
尋常性乾癬患者の皮膚の創傷の免疫組織学研究はTリンパ細胞のCDに対して向けられた各種のmAbsと平行してmAb ior t1を用いて、皮膚組織のクリオスタット区分について実施した。対照として、mAbs ior t3（抗CD3），ior t4（抗CD4），ior t8（抗CD8），ior L3（抗CD45）およびDAKO CD6（抗CD6），ならびにior egf/r3（抗表皮成長因子受容体）を使用した。ついで、ビオチニル化抗マウス免疫グロブリン（すなわち、ヒツジから，DAKO）とアビジン・ビオチン・ペロシキダーゼ錯体（すなわち、DAKO）で組織の断片を保温した。最後に、色素形成源として3-アミノ-9-エチル-カルバゾル（Sigma）を用いて反応を起こした。二人の専門家によって生検を検査し、CD6の評価を点数の尺度に調整した：＜10％（+/-），10-25％（+），25-50％（++），50-90％（+++），90-100％（++++）。
抗CD6モノクローナル抗体で治療した患者は治療開始の前と、最初の生検に隣接する区域内で治療の三週目の終わりに、創傷部の生検を受けていた。治療応答を分類する尺度は百分率で表した定性的尺度で、それぞれの生検について評価した。異なる皮膚層の中の抗表皮成長因子受容体（EGF-R）の発現率は、この疾病に固有の組織学的特徴の変化と合わせて決定した。
*尋常性乾癬に特徴的な炎症性浸出液内にCD6＋Tリンパ性表現型の高い発現（＋＋＋）が認められた。
*CD3+リンパ細胞はCD45+細胞のほぼ100％に当たる。
*CD6+細胞はCD3＋細胞のほぼ60％と90％超の間である。
*CD6+細胞（ior t1）はCD6+細胞（DAKO CD6）のほぼ30％と50％の間である。
*ケラチン細胞内のEGF-Rの発現が上昇して、架橋パターンを示した。
炎症浸出液のTリンパ細胞内のCD6分子の発現の優勢は大きなものになったが、それはそれが活性化したTリンパ細胞の分子特性だからである。このことから、これが外因性抗原または修飾された自己抗原の侵入によって皮膚内で当初活性化されたTリンパ細胞の白血球付着分子に当たるものと思われる。前記抗原に応答している間に活性化された皮膚の特定の細胞決定子との相互作用にこれが必要である。
実施例6：ior t1 mAbによる局所治療に対する尋常性乾癬患者の臨床的応答
尋常性乾癬に特徴的な創傷の再発のある尋常性乾癬患者の臨床試験を実施した。局所的治療のために受領したゼリー（ior t1 mAbまたは賦形剤）によって決められた群当たり14人の患者を含む二群について研究を計画した。局所的治療の処方はゼリーベースまたは賦形剤（カルボキシメチルセルローズナトリウムv/v，プロピレングリコール、メチルパラベノ、トリエタノールアミン）に従い、その中にmAbを入れた。治療は手当する創傷を隠蔽せずに21日にわたって一日2回塗布した。
ior t1 mAbで治療した全ての患者は乾癬斑創傷が白化した（図4）。この結果はmAbの塗布開始から21日後に実施した治療後生検とも符合する。Tリンパ細胞浸出液とケラチン細胞内のEDF-Rの発現の減少、ならびにこの疾患に特徴的な組織学的兆候の後退が認められた。
実施例7：ior t1モノクローナル抗体による逓減的局所治療後の尋常性乾癬患者の臨床的応答
皮膚の10％を越えて、25％未満が観戦している19人の確認された長期的尋常性乾癬患者に対してパイロット臨床試験を実施した。患者数が6、7および6人の三群がカルボキシメチルセルローズナトリウムA/V，プロピレングリコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、トリエタノールアミンからなる賦形剤のゼリー中に、それぞれ0.3，1および3mgのior t1A mAb/gramのゼリーを含有する治療用の局所的処方を受けた。患者は21日間にわたって一日2回局所的治療を受けた。
PASI（乾癬面積および重度指数）を評価、分析し、患者の血清内のヒト抗マウス抗体（HAMA）反応も研究した。臨床的応答（PASI）に関する最前の結果と疾患のない期間は少量のior t1 mAb（0.3mg）で治療した群で得られた、またHAMA（ヒト抗マウス抗体）力価とそれを発生している群当たりの患者数はやはりその群で高かった。さらに阻害ELISA（酵素連結免疫吸収剤検定）およびFACS（蛍光発生活性化細胞ソーター）によって研究した患者の血清内の抗ヨード型抗体の存在はゼリー1グラム当たり0.3mgの少量で治療した患者の方が頻繁で、はるかに高かった。
実施例8：ior t1 mAbによる静脈内治療に対する前進化した乾癬の重篤な形態の患者の臨床的応答
およそ17年前に乾癬性関節症を診断された乾癬の履歴のある56歳の女性の患者。過去5年間に患者は頻繁に、強い発症を起こして、頻繁に入院していた。発症は｛erithematosquamous？紅斑性｝全身性創傷、関節と筋肉の疼痛、発熱、浮腫と悪寒で始まった。この前進的状態は長引き、21日後に新しい創傷が脇、首、乳房の周囲に発現し、膿と感染した漿膜が分泌されると共に熱を持った。疾患の緩慢な進行と、ステロイド軟膏を含む以前の全ての治療に対する不耐性の故に、合計服用量が15mgになる3サイクルを投与するメトトレキセートによる治療が処方された。臨床的応答は認められなかった。
1回の静脈内投与量が体重1kgあたり0.6mgのior t1 mAbを0.9％生理食塩水200mL内に希釈して、徐々に投与した。
同時に、ゼリー1g当たりmAbが3mgの濃度でior t1 mAbを含む治療用のゼリーを二日間にわたって全ての創傷に一日2回塗布した。
治療6日目当たりから患者は前進的状態および皮膚科所見が改善された。21日目に評価したところ、体表面積の60％に創傷が無く、皮膚の残りの部分のこの疾患の臨床的兆候が改善を示した。患者は関節の症候が改善したと報告し、全身状態が良好で、正常な生命兆候を示し、通常の検査結果も正常であった。
30日後、患者のこの疾病の兆候は完全に後退したままであった。
【図面の簡単な説明】
図1と2
モノクローナル抗体ior t1Aの重い、および軽い鎖の可変領域のヒト化による修飾の分析
図1：ネズミのior t1Aモノクローナル抗体の重い鎖の可変領域の配列
図2：ネズミのior t1Aモノクローナル抗体の軽い鎖の可変領域の配列
A：ior t1AネズミmAbの重い鎖または軽い鎖の可変領域の配列
B：もっとも相同のヒト免疫グロブリンの可変領域の配列
C：ior t1Aの修飾した可変領域の配列
陰は予測T細胞抗原配列。
下線を引いたアミノ酸残基：第三位の構造に関与するアミノ酸。
太字は相補性決定領域。
箱の中のアミノ酸残基：提案された置換。
記載は重い鎖と軽い鎖の両方で同一。
図3
尋常性乾癬患者の皮膚の創傷に特徴的な炎症性浸出液のリンパ細胞内のCD6抗原の発現結果が示されている。上肢および／または下肢および／または胸郭・腹部に限定されたプラーク創傷に冒された皮膚のクリオスタット区分で評価を実施した。免疫組織化学研究を実施する前に組織学的評価を実施した。
図4
滲出、剥落、紅斑および創傷面積の大きさなどのパラメータを考慮して乾癬治療に使用した抗CD6 mAbsの治療効果を評価した。重篤度は0-1-2の値で設定した。治療したプラークの面積はその半径で測定した。PASI（乾癬面積および重度指数）と同様な乾癬重篤点数（PSS）が得られ、治療への応答は指定された評価時間の終わりのPSSの変化で階層化した。次の区分に分けた：明らか、応答あり、応答なし、悪化。
図5
ゼリー中に、それぞれ0.3，1および3mgのior t1A mAb/gramの局所的調剤で治療した患者の臨床的応答とコレラの患者の血清内のヒト抗マウス抗体（HAMA）反応も研究した。臨床的応答（PASI）に関する最前の結果と疾患のない期間は少量のior t1 mAb（0.3mg）で治療した群で得られた、またHAMA力価とそれを発生している群当たりの患者数はやはりその群で高かった。さらに患者の血清内の抗ヨード型抗体の存在はゼリー1グラム当たり0.3mgの少量で治療した患
図６
およそ１７年前に乾癬性関節症を診断された乾癬の履歴のある５６歳の女性の患者にｉｏｒ ｔｌ ｍＡｂによる静脈内治療を施した。現在の症例は、全身化した乾癬の重篤な形態であり、「ｅｒｉｔｈｅｍａｔｏｓｑｕａｍｏｕｓ」紅斑性全身性創傷、関節と筋肉の疼痛、発熱、浮腫と悪寒が特徴である。この全身化症例はメトトレキセートによる治療室では臨床的応答は認められなかった。１回の静脈内投与量が体重１ｋｇあたり０．６ｍｇのｉｏｒ ｔｌ ｍＡｂを０．９％生理食塩水２００ｍＬ内に希釈して、徐々に投与した。同時に、ゼリー１ｇ当たりｍＡｂが３ｍｇの濃度でｉｏｒ ｔｌ ｍＡｂを含む治療用のゼリー（合計で２２４ｇのゼリー）を二日間にわたって全ての創傷に一日２回塗布した。患者の全身的状態および皮膚科所見を週で評価した。写真は皮膚損傷の治療度合いを示す（治療前と治療後２１日経過後）。
Claims (8)
- 乾癬の治療薬の製造のための抗ＣＤ６モノクロナール抗体の使用。
- 前記抗ＣＤ６モノクロナール抗体が、マウス・モノクロナール抗体またはそれのヒト化変型である請求項１の使用。
- 前記抗ＣＤ６モノクロナール抗体が、以下にそれぞれ示される重鎖と軽鎖可変領域を有するサブクラスＩｇＧ２ａのマウス・モノクロナール抗体である請求項２の使用；
重鎖可変領域；
GLU VAL GLN LEU VAL GLU SER GLY GLY GLY LEU VAL
LYS PRO GLY GLY SER LEU LYS LEU SER CYS ALA ALA
SER GLY PHE LYS PHE SER ARG TYR ALA MET SER TRP
VAL ARG GLN THR PRO GLU LYS ARG LEU GLU TRP VAL
ALA THR ILE SER SER GLY GLY SER TYR ILE TYR TYR
PRO ASP SER VAL LYS GLY ARG PHE THR ILE SER ARG
ASP ASN VAL LYS ASN THR LEU TYR LEU GLN MET SER
SER LEU ARG SER GLU ASP THR ALA MET TYR TYR CYS
ALA ARG ARG ASP TYR ASP LEU ASP TYR PHE ASP SER
TRP GLY GLN GLY THR THR LEU THR VAL SER SER
軽鎖可変領域；
ASP ILE LYS MET THR GLN SER PRO SER SER MET TYR
ALA SER LEU GLY GLU ARG VAL THR ILE THR CYS LYS
ALA SER ARG ASP ILE ARG SER TYR LEU THR TRP TYR
GLN GLN LYS PRO TRP LYS SER PRO LYS THR LEU ILE
TYR TYR ALA THR SER LEU ALA ASP GLY VAL PRO SER
ARG PHE SER GLY SER GLY SER GLY GLN ASP TYR SER
LEU THR ILE SER SER LEU GLU SER ASP ASP THR ALA
THR TYR TYR CYS LEU GLN HIS GLY GLU SER PRO PHE
THR PHE GLY SER GLY THR LYS LEU GLU ILE LYS ARG
ALA。 - 前記抗ＣＤ６モノクロナール抗体が、以下にそれぞれ示される重鎖と軽鎖可変領域を有するサブクラスＩｇＧ１のヒト化モノクロナール抗体である請求項２の使用；
重鎖可変領域；
GLU VAL GLN LEU VAL GLU SER GLY GLY GLY LEU VAL
LYS PRO GLY GLY SER LEU LYS LEU SER CYS ALA ALA
SER GLY PHE LYS PHE SER ARG TYR ALA MET SER TRP
VAL ARG GLN ALA PRO GLY LYS ARG LEU GLU TRP VAL
ALA THR ILE SER SER GLY GLY SER TYR ILE TYR TYR
PRO ASP SER VAL LYS GLY ARG PHE THR ILE SER ARG
ASP ASN VAL LYS ASN THR LEU TYR LEU GLN MET SER
SER LEU ARG SER GLU ASP THR ALA MET TYR TYR CYS
ALA ARG ARG ASP TYR ASP LEU ASP TYR PHE ASP SER
TRP GLY GLN GLY THR LEU VAL THR VAL SER SER
軽鎖可変領域；
ASP ILE GLN MET THR GLN SER PRO SER SER LEU SER
ALA SER VAL GLY ASP ARG VAL THR ILE THR CYS LYS
ALA SER ARG ASP ILE ARG SER TYR LEU THR TRP TYR
GLN GLN LYS PRO GLY LYS ALA PRO LYS THR LEU ILE
TYR TYR ALA THR SER LEU ALA ASP GLY VAL PRO SER
ARG PHE SER GLY SER GLY SER GLY GLN ASP TYR SER
LEU THR ILE SER SER LEU GLU SER ASP ASP THR ALA
THR TYR TYR CYS LEU GLN HIS GLY GLU SER PRO PHE
THR PHE GLY SER GLY THR LYS LEU GLU ILE LYS ARG
ALA。 - 乾癬の診断に有用な試薬製造のための抗ＣＤ６モノクロナール抗体の使用。
- 前記抗ＣＤ６モノクロナール抗体が、マウス・モノクロナール抗体またはそれのヒト化変型である請求項５の使用。
- 前記抗ＣＤ６モノクロナール抗体が、以下にそれぞれ示される重鎖と軽鎖可変領域を有するサブクラスＩｇＧ２ａのマウス・モノクロナール抗体である請求項６の使用；
重鎖可変領域；
GLU VAL GLN LEU VAL GLU SER GLY GLY GLY LEU VAL
LYS PRO GLY GLY SER LEU LYS LEU SER CYS ALA ALA
SER GLY PHE LYS PHE SER ARG TYR ALA MET SER TRP
VAL ARG GLN THR PRO GLU LYS ARG LEU GLU TRP VAL
ALA THR ILE SER SER GLY GLY SER TYR ILE TYR TYR
PRO ASP SER VAL LYS GLY ARG PHE THR ILE SER ARG
ASP ASN VAL LYS ASN THR LEU TYR LEU GLN MET SER
SER LEU ARG SER GLU ASP THR ALA MET TYR TYR CYS
ALA ARG ARG ASP TYR ASP LEU ASP TYR PHE ASP SER
TRP GLY GLN GLY THR THR LEU THR VAL SER SER
軽鎖可変領域；
ASP ILE LYS MET THR GLN SER PRO SER SER MET TYR
ALA SER LEU GLY GLU ARG VAL THR ILE THR CYS LYS
ALA SER ARG ASP ILE ARG SER TYR LEU THR TRP TYR
GLN GLN LYS PRO TRP LYS SER PRO LYS THR LEU ILE
TYR TYR ALA THR SER LEU ALA ASP GLY VAL PRO SER
ARG PHE SER GLY SER GLY SER GLY GLN ASP TYR SER
LEU THR ILE SER SER LEU GLU SER ASP ASP THR ALA
THR TYR TYR CYS LEU GLN HIS GLY GLU SER PRO PHE
THR PHE GLY SER GLY THR LYS LEU GLU ILE LYS ARG
ALA。 - 前記抗ＣＤ６モノクロナール抗体が、以下にそれぞれ示される重鎖と軽鎖可変領域を有するサブクラスＩｇＧ１のヒト化モノクロナール抗体である請求項６の使用；
重鎖可変領域；
GLU VAL GLN LEU VAL GLU SER GLY GLY GLY LEU VAL
LYS PRO GLY GLY SER LEU LYS LEU SER CYS ALA ALA
SER GLY PHE LYS PHE SER ARG TYR ALA MET SER TRP
VAL ARG GLN ALA PRO GLY LYS ARG LEU GLU TRP VAL
ALA THR ILE SER SER GLY GLY SER TYR ILE TYR TYR
PRO ASP SER VAL LYS GLY ARG PHE THR ILE SER ARG
ASP ASN VAL LYS ASN THR LEU TYR LEU GLN MET SER
SER LEU ARG SER GLU ASP THR ALA MET TYR TYR CYS
ALA ARG ARG ASP TYR ASP LEU ASP TYR PHE ASP SER
TRP GLY GLN GLY THR LEU VAL THR VAL SER SER
軽鎖可変領域；
ASP ILE GLN MET THR GLN SER PRO SER SER LEU SER
ALA SER VAL GLY ASP ARG VAL THR ILE THR CYS LYS
ALA SER ARG ASP ILE ARG SER TYR LEU THR TRP TYR
GLN GLN LYS PRO GLY LYS ALA PRO LYS THR LEU ILE
TYR TYR ALA THR SER LEU ALA ASP GLY VAL PRO SER
ARG PHE SER GLY SER GLY SER GLY GLN ASP TYR SER
LEU THR ILE SER SER LEU GLU SER ASP ASP THR ALA
THR TYR TYR CYS LEU GLN HIS GLY GLU SER PRO PHE
THR PHE GLY SER GLY THR LYS LEU GLU ILE LYS ARG
ALA。
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