BRPI9607171B1 - anticorpo monoclonal anti-cd6 humano, usos dos mesmos para o diagnóstico in vitro de psoríase, composição farmacêutica e reagente contendo o dito anticorpo - Google Patents
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Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CD6 HUMANO, USOS DOS MESMOS PARA O DIAGNÓSTICO IN VITRO DE PSORÍASE, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E REAGENTE CONTENDO O DITO ANTICORPO".
Campo Técnico A presente invenção refere-se ao ramo da imunologia e em particular à obtenção de composições farmacêuticas que contêm um anticorpo monoclonal que reconhece o antígeno de diferenciação leucocitático CD6. Técnica Anterior Os Anticorpos Monoclonais (AcM) permitiram a caracterização de moléculas de importância fisiológica expressas nas membranas celulares, definindo nas células do sistema imunológico os antigenos ou "Cluster de Diferenciação Leucocitáticos" (CD), (Schlossman, S. F. et al. (1994) Immunol. Today 15(3): 98). A definição do papel dos CD na diferenciação e maturação das células linfóides durante seu desenvolvimento ontogenético, os mecanismos de reconhecimento e adesão celular, os mecanismos de ativação e proliferação durante a resposta imunológica levaram ao emprego de seus respectivos AcMs no diagnóstico e imunoterapia, com resultados animadores (Dantal, J. et al. (1991) Curr. Opin. Immunol. 3: 740).
Os AcMs murinos direcionados contra moléculas expressas na membrana celular de linfócitos T humanos contribuiram para melhorar o diagnóstico de entidades clínicas onde o defeito funcional se localiza nestas células, além disso foram utilizados para explorar novos enfoques terapêuticos com a finalidade de modular sua a-tividade funcional como na Rejeição de Transplantes, na Doença do Enxerto versus Hospedeiro (GvHD) e nas Doenças Auto-imunes (Waldmann, T. A. (1991) Science 252: 1657 ; Waldmann, T. A. (1992) Annu. Rev. Immunol. 10: 675) . O CD6 é uma molécula pouco caracterizada. Sabe-se que é uma glicoproteina que existe em duas formas moleculares que se mantêm em equilíbrio dinâmico e diferem apenas no grau de fosforilação. Em linfócitos T em repouso ele é uma molécula fosforilada de 105 kDa e em células ativadas, uma forma hiperfosforilada de 130 kDa (Cárdenas, L. et al. (1990) J. Immunol. 145: 1450; Swack, J. A. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 7137), membro de uma família de receptores de membrana e proteínas de secreção com estrutura característica (Kodama, T. et al. (1990) Nature 343: 531; Aruffo, A. et al. (1991) J. Exp. Med. 174: 949); é expresso na superfície de timócitos humanos maduros, em linfócitos T do sangue periférico, onde constitui a maior parte da população de células CD3+, em um subtipo de linfócitos B e nos neurônios do córtex cerebral, nos linfócitos T do sangue periférico, participa dos mecanismos de ativação celular (Reinherz, E. L. et al. (19 82) Cell 30: 73 5 ; Kamoun, M. et al. (1981) J. Im-munol. 127: 987; Mayer, B. et al. (1990) J. Neuroimmunol. 29 : 193; Rasmussen, R. A. et al. (1994) J. Immunol. 152: 527) . Não se conhece o papel do CD6 na ontogenia das células T, assim como sua possível função na fisiopatolo-gla de doenças de diferentes etiologias.
Foi recentemente identificado e caracterizado um ligador do CD6 com ampla distribuição celular em tecidos normais como timo, baço, gânglios linfáticos e pele (Dhavalkumar, D, P. et ai. (199 5) Jt Exp. Med.. 181: 1563). Esta molécula, denominada ALÇAM Molécula de Adesão de Célula de Leucócito Ativado (Activated Leukocyte-Cell Adhesion Molecule)) por sua expressão em línfócitos T e B ativados assim como em monócitos, é uma glicoproteina de membrana tipo I de 100 IcDa de peso molecular, com 5 domínios extracelulares similares aos das imunoglobulinas, pode apresentar diferentes graus de ativação dependendo de cátions divalentes e pode mediar interações homofilí-cas e heterof ilícas (Bowen, Μ. A, et al. {1995) j, Exp, Med. 181: 2213), Em clinica foram utilizados diferentes AcMs an-ti-CD6 na prevenção de rejeição aguda de transplante de órgãos (Kirkman, R. L. et al. {1983} Transplantarion. 36: 620} e para remover línfócitos T dos transplantes de medulas ósseas para prevenir contra a Doença do Enxerto versus Hospedeiro {GvHD) (Soiffer, R, J. et a.l. {1992} J. Clin. Oncol . 10:1191). O AcM ior tl é encontrado em Ensaio Clinico Fase II no tratamento dos linfomas de células T cutâneos (Garcia, C. A. et al. {1990} Biotec. Aplicada 7 {2) : 176; Faxas, Μ. Ξ, et a.l. (1993) Biotec, Aplicada 10(1): 20}. O anticorpo monoclonal murino ior tl de isótipo I.gG2a, classificado como anti -CD6 no IV Seminário Internacional de Antígenos de Diferenciação Leucocitático de Viena (19 89) , define um epítopo diferente daqueles reco- ^necxdot. por outros âcm anti-cDS que tem configuração estável e insensível a agentes redatores, possivelmente localizado na estrutura primária da molécula CD6 (Osorio, L. M, et al . {1994) Cell. Iminurjol. 154: 12.3} , Este anticorpo monoclonal tem um. reconhecimento inferior ao de outros anti CD3 em células mononucleares periféricas de indivíduos sadios; o reconhecimento do io.r tl em linhagens celulares humanas em cultura de origem T é em Ju.rk.at 47%, Molt-4 (23%) , CCRF-CEM ínão a reconhece); de origem B em Ra j i (9%) , origem eri troblastóide K-5 62 (12%) e in.ielomonoc.itíca U-937 (9%) , assim como também reconhece células mononucleares periféricas de pacientes com leucemia linfocí. tica crônica B (89 ± -4%) (Garcia, C. A. et al. (.1992) Siotoc. Aplicada 9(1) : 70) e linfócitos de lesões cutâneas de pacientes com línfornas cutâneos de células T (Rodríguez, T. et al. Ç1985) Interíerón y Bío-tec. 2(1): 41). 0 AcM ior tl não inibe !'in vitro" a citotoxídez celular antígeno especifica (Faxas, Μ. E. et al. (199 3) Siotec„ Aplicada 10(1); 47) e é capaz de ativar hin vi -tiro" linfócitos T do sangue periférico de indivíduos sadios, a concentrações subótimas de OKT3 (anti CD3) â re-ticulaçâo tom o ior tl induz respostas superiores que as obtidas com outros AcM anti-CD 6 (Osorio, L. M. et al . (1994) Cell. Immunol. 154; 123). A psoriase ê uma doença cuja patologia ainda não está definida (Hunziker, T- et al. (199 3} I.l.ier. Umsch. 50(2); 110; Elder, J. T. et al. (1594) tol^. 102(ο): 243); caracteriza-se por apresentar um in-~ filtrado ínfrainatório no órgão alvo com predomínio de linfóeitos T ativados com fenótipo CD4 + e CD8+ (Chang, j. C. C. et al. (1994} Proc. NatI. Acad. Sei USA 91; 9282), bem como acentuada oligoclon.aI.ida.de dos receptores de células T. Estas células ao que parece apresentam tendência acentuada para migrar para a pele (homing) [Bariter, J. Mi Ví, m. et ai. (1992} Br. j. Dermatol, 127: 205; Henssen, A. et. al. ( 19953 J- I urutu no 1. 155; 4078; Valdi rraarsson, Bi et al. (1995) Immunol. Today 16(3): 145). A remissão espontânea da psoríase pode ser prevista se o número de células T na pele estiver reduzido, o que sugere que desempenham um. papel importante na perpetuação da doença ao liberar mediadores solúveis de resposta imunoiógica capazes de induzir a proliferação de queratinócitos r responsáveis pelas manifestações clínicas da doença.
Estas considerações encontram apoio em fatos como a cura da doença pós-transplante de medula óssea alogênico, a provável associação HLA, a melhora com este-rõid.es e sobretudo com imunomoduIadores como a ciclospo-rins e a melhora clínica com anticorpos monoclonais (AcM) terapêuticos anti-células T, ainda que de forma reversível (Gri f f íthE, c. E. M. et al. (19923 Sprirxger Semin Im- munopathol 13: 441; Nanney, L. B. et al. (19 86) J. In vest, Dermatol. 86(3): 260; Pícassia. D. D. et al. (1987) J. Am. Acad. Dermatol. 17 (3): 408; Schopf, R. B. et al -(1986) Arch. Dermatol. Res. 279(23: 89; van de Kerkhofú c. et al. (1987) Dermatológica 174 (55 : 224). O sucesso cia ii.un oter a.p i a com ant.ícurpo» mono cionais depende da seleção da molécula alvo, que deve interferir nas funções celulares importantes ou da seleção do AcM (Dental, -Ji et al. (1991) Curr, Opin. Iramunol, 3: 740). Os AcMs avaliados na psoríase direcionados contra o CD3 (Weins.henk.er, B. G. et al. (1989) J. Am. Acad. Derma-tol. 20: 1132) e contra o CD4 íPoizot-Martin, I. et. al, (1.99 3.) Lancet 3 37: .14 77; Prinz, J. et al. (1991) Lancet 3 38: 320; Nicolas, J. F. et ai, (1991) Lance t 338; 321) levaram a uma melhora clinica nos pacientes depois de múltiplas aplicações endovenosas em doses elevadas, com. remissões de curta duração e recaída precoce dos sintomas e sinais da doença em todos os casos.
A aplicação terapêutica de anticorpos monoclo-nais murinos em múltiplas doses associa-se ao aparecimento de efeitos indesejáveis no paciente devido à xenogení-cidade das proteínas murinas que implica no aparecimento da resposta de anticorpos humanos contra as iitmnoglobulí -nas murinas (Anticorpos anti-rato humano (Human An ti -Mouse Antihodi.es) - H.AMA) ; pelo que a humanicação dos AcM utilizando a engenharia de proteínas garante a redução de sua imunogenicidade, melhora em sua £armacocinética. e da eficácia clinica {Winter, G. et al. (1993) Trenós-Pharraacol- Sei . 14(5) : 139} , Até o presente ainda não foi apresentado nenhum estudo no qual esteja descrita a expressão da molécula CD6 nos linfócitos do infiltrado inf1ama tório da pele na psoríase, nem a possível associação desta molécula com o desenvolvimento da doença, e além disso ainda não foi avaliado o uso terapêutico de um AcM anti-CD6 nesta doença.
Divulgação da Invenção A novidade da presente invenção consiste em fornecer composições farmacêuticas tópicas e sistêmicas que contêm um anticorpo monoclonal anti-CD6, a obtenção de um anticorpo monoclonal humanizado anti-CD6 e a aplicação terapêutica das composições farmacêuticas em pacientes com psoríase vulgar, utilizando diferentes vias de administração e em diferentes formas clínicas da doença. Descrição Detalhada da Invenção Purificação do anticorpo monoclonal murino O anticorpo monoclonal (AcM) anti-CD6 pode ser purificado a partir de líquido ascítico por Proteína A Sepharose, diluído com igual volume de tampão glicina 1,5 M, NaCl 3M pH 8,9; equilibrando-se a matriz com esse mesmo tampão e aplicando-se um volume de ascite igual ao de tampão deve-se eluir a velocidade de fluxo de 50 ml/h. A coluna é lavada por uma noite até a linha base zero, com o mesmo tampão de aplicação.
Em seguida a coluna é lavada com tampão ácido citrico 0, 1M pH 6 para eliminar as IgGl, até que a linha base atinja zero, a uma velocidade de fluxo de 50 ml/h (entre 2-5 volumes de coluna, 2 horas aproximadamente). O tampão ácido cítrico 0,1 M, pH 5, é aplicado para eluir as IgG2a (ior tl).
Humanizacão do anticorpo monoclonal murino A partir dos AcMs anti-CD6 podem ser construídas, por métodos de engenharia genética, variantes como anticorpos quiméricos e humanizados a partir das regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo murino (Takashi, N. et al. (1982) Cell 29: 718; Hieter, P. A. et al. (1980) Cell 29: 718) Descricão do método de humanizacão do anticorpo monoclo-nal murino ior tl A partir do hibridoma parental murino secretor do anticorpo monoclonal ior tl foi obtido um subclone denominado iot tlA que reconhece o mesmo epitopo na molécula CD6. O ior tlA foi modificado para obter um anticorpo monoclonal menos imunogênico pelo método descrito no pedido de patente européia Ns 0699755, segundo o qual se reduz simultaneamente a imunogenicidade do anticorpo murino original e ao mesmo tempo se preserva suas propriedades de união ao ligador. Como a antigenicidade de uma proteina depende da presença de epitopos T nos mesmos, a imunogenicidade de um anticorpo xenogênico ou alogênico poderia ser reduzida substituindo-se os resíduos incluídos em suas sequências antigênicas T pelos mesmos encontrados em outras espécies, neste caso em imunoglobulinas humanas. Certamente, a substituição dos referidos resíduos não inclui aminoácidos da chamada zona de "Vernier" nem aqueles incluídos nas estruturas canônicas. Estas substituições não podem afetar os determinantes estrutu- rais ou as zonas de contato entre os FRs e os CDRs, de tal modo que fica garantida a afinidade na união ao antí-geno.
Análise de homolocria das regiões variáveis Neste procedimento faz-se uso das seqüências disponíveis de domínios variáveis de anticorpos humanos compilados por Kabat et al. , "Sequences of Proteins of Immunological Interest", quinta edição, Bethesda, Ma-ryland, National Inst. of Health, 1994.
Na primeira etapa o domínio variável das cadeias leves e pesadas do ior tlA murino é comparado com os domínios variáveis correspondentes das seqüências humanas. As seqüências de aminoácidos dos domínios variáveis das imunoglobulinas murinas são comparadas com as seqüências de regiões variáveis de imunoglobulinas humanas relatadas, para identificar a imunoglobulina humana que possui maior homologia com a molécula murina submetida à análise .
As bases de seqüências humanas utilizadas foram as relatadas em GeneBank (nov. 1990) e EMBL (nov. 1990) . O programa usado para determinar a homologia entre seqüências é o PC-DOS HIBIO PROSIS 06-00, Hitachi.
De acordo com este programa as seqüências são comparadas e identificados os resíduos que são diferentes em cada uma das posições dentro das estruturas ("frameworks") (Kabat E. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, quinta edição, National Institute of Health), entre a seqüência humana de maior homologia e a seqüência murina submetida à análise.
Previsão de epítopos T
Na segunda etapa, as duas seqüências de regiões variáveis homólogas (de rato e humana) são analisadas para prever as seqüências antigênicas T.
As seqüências dos domínios variáveis das imuno-globulinas murinas são analisadas com o programa AMPHI (Berzofsky et al. (1987) The Journal of Immunology 138: 2213), o qual permite a previsão de hélice anfipática, à qual foi relacionada a imunogenicidade T.
Análise para redução de imunogenicidade Depois de identificar na seqüência murina os possíveis epítopos T e identificar os resíduos responsáveis pelas estruturas canônicas, na molécula murina os resíduos que são diferentes entre as duas espécies são substituídos pelos que se encontram na mesma posição na imunoglobulina humana de maior homologia, e estas substituições são realizadas somente naqueles segmentos que os algoritmos prevêem que poderíam ser um epítopo T e somente na região dos Frs.
Finalmente, as substituições dos resíduos intercalados nas estruturas canônicas ou na chamada zona "Vernier" não são incluídas pois podem afetar a estrutura tridimensional do anticorpo e portanto afetar sua união ao antígeno. Informações adicionais sobre a influência das substituições que são feitas na estrutura terciária podem ser obtidas por modelagem molecular das regiões variáveis . Método para construir e expressar o anticorpo modificado Os procedimentos a seguir são usados para preparar seqüências de ADN recombinantes, onde os aminoácidos de uma espécie são substituídos por aminoácidos de outras espécies, estas modificações são realizadas nas duas cadeias da região variável de uma imunoglobulina de rato. Uma vez realizadas as mutações, estas são combinadas com uma região constante de uma imunoglobulina humana e são introduzidas em um vetor apropriado para expressar este anticorpo menos imunogênico em células superiores. a) Mutagênese na região variável das duas cadeias de um anticorpo. Assim as alterações necessárias são introduzidas pelo método de mutagênese por sobreposições de PCR. (Kamman et al., Nucleic Acids Res. 17:5404 (1989) . b) Preparação de um vetor de expressão que contenha uma região constante humana e uma região variável murina que, uma vez transfectado, as células resultantes secretam a imunoglobulina modificada com a afinidade e especificidade desejadas, c) Co-transfecção de cadeias leves e pesadas em vetores de expressão apropriados em diferentes linhagens de células.
Depois de duas semanas, os sobrenadantes resultantes da transfecção em placas de 96 compartimentos são analisados por ELISA de detecção de imunoglobulinas humanas. As amostras que produzirem imunoglobulinas humanas serão testadas por um método capaz de detectar a união deste anticorpo a seu antigeno.
Formulações para realizar estudos com fins de diagnósticos "in vitro" e "in vivo" Os AcM anti-CD6 podem ser utilizados com fins de diagnósticos "in vitro" e "in vivo" nas diferentes formas clinicas da psoriase, para o acompanhamento evolutivo dos pacientes depois de se aplicar procedimentos terapêuticos locais ou sistêmicos, assim como a previsão de recaídas.
Estes AcM purificados e dissolvidos em solução tampão (pH 7,0 + /- 0,5) que contenha azida sódica (0,01 -0,2%) e albumina (0,05 - 0,2%) podem ser utilizados para quantificar os linfócitos T CD6+ e/ou a expressão desta molécula na superfície das células linfóides em fluidos biológicos (por exemplo sangue, líquido cefalorraquidia-no, líquido sinovial) incubando entre 50 e 200 ml da amostra com quantidades entre 10 e 30 ml de AcM a concentrações entre 0,1-3 mg/ml, entre 20 e 30 min a 4°C.
Em seguida, deve-se lavar com solução tampão e incubar com imunoglobulinas de outra espécie animal conjugada com substâncias fluorescentes (por exemplo fluo-resceína, ficoeritrina). Os AcM anti-CD6 podem ser conjugados diretamente com substâncias fluorescentes por diferentes métodos (Coligan, J, E. et al. (ed.) Current Pro- tocols in Immunology, National Institutes of Health. Vol. 1:5.3.2. Wiley Interscience) e ser utilizados com finalidades similares às descritas, a concentrações entre 5 e 30 mg/ml.
Avaliação imunohistoauíiaica de lesões de pacientes com psoríase O estudo imunohistoquímico de lesões cutâneas ou de outros tecidos afetados (por exemplo articulações) de pacientes com psoriase vulgar pode ser realizado sobre criosseções de tecido (por exemplo pele) fixadas ou não em acetona fria, incubando o AcM anti-CD6 dissolvido entre 3 e 10 mg/ml de solução tampão (pH 7,0 +/- 0,5) que contenha azida sódica (0,05 - 0,2%) e albumina (0,05 -0,2%) durante 30 min. Em seguida as amostras são incubadas com conjugado antiimunoglobulinas murinas Biotilinado e Complexo Biotina-Avidina-Peroxidase (por exemplo de carneiro [Dako]) durante 30 min à temperatura ambiente; finalmente revela-se com o substrato 3-amino-9-etil-carbazol [Sigma] (Hsu, S. M. et al. (1981) J. Histochem. Cytochem. 29: 577). As biópsias devem ser analisadas por 2 especialistas e a avaliação do CD6 é ajustada a uma escala de pontos < 10% (±), 10 - 25% (+), 25 - 50% (++), 50 - 90% (+ + + ), 90 - 100% (++++).
Podem ser utilizados diferentes AcM dirigidos contra CD de linfócitos T, anti CD3 (ior t3) , anti CD4 (ior t4), anti CD8 (ior t8) e um anti CD45 (ior L3), além de um AcM anti-Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico (ior egf/r3) como marcador de ativação de ceratinóci-tos (Mozzanica, N. et al. (1994) Acta Derm. Venereol. Suppl. Stockh. 186: 171), que permita avaliar detalhadamente as características do infiltrado inflamatório das lesões durante o tratamento da doença.
Acompanhamento imunohistoquímico de lesões de pacientes tratados Em pacientes tratados com anticorpos monoclonais anti-CD6 pode ser realizada biópsia das lesões antes do inicio do tratamento, durante o tratamento e depois de concluído o mesmo, em área limitada à biópsia inicial para avaliar a eficácia terapêutica das composições de uso tópico ou sistêmico. A escala de classificação da resposta ao tratamento pode ser qualitativa em por cento e é estabelecida segundo o índice de marcação de células CD6+ sobre o total de células CD45+, avaliado em cada biópsia. índice de células CD6+ = número de células CD6+ x 100 número de células CD45+ Pode-se estabelecer, além disso, os índices de marcação de células CD3+, CD4+ e CD8 + sobre o total de células CD45+ e o índice de marcação de células CD4+ e CD8+ sobre o total de células CD6+. índice de células CD3+ = número de células CD3+ x 100 número de células CD45+ índice de células CD4 + = número de células CD4+ x 100 número de células CD45+ índice de células CD8+ = número de células CD8+ x 100 número de células CD45+ índice de células CD4+ = número de células CD4+ x 100 número de células CD6+ índice de células CD8+ = número de células CD8+ x 100 número de células CD6+ Acompanhamento imunogamagráfico de pacientes tratados Outra forma para avaliar o efeito da terapêutica com o AcM anti-CD6 pode ser o estudo imunogamagráfico no paciente da expressão e distribuição das células CD6+ durante o tratamento, utilizando entre 1 e 5 mg do mesmo AcM conjugado com isótopos radioativos como o tecnécio 99, utilizando o método de conjugação como o descrito por Mather, S. J. et al. (1990) J. Nucl. Med. 31(5): 692.
Obtenção de formulações terapêuticas para uso tópico e sistêmico Com fins terapêuticos os AcM anti-CD6 podem ser utilizados nas diferentes formas clínicas da psoríase, com formulações tanto para uso tópico como sistêmico, em dose única ou doses múltiplas, com um ou vários ciclos de tratamento de acordo com a forma clínica e a gravidade da doença.
As formulações terapêuticas de uso tópico com AcM anti-CD6 podem ser compostas por sistemas semi-sólidos em uma ou duas fases, principalmente com formulações hidrófilas que permitam a incorporação do AcM dissolvido em solução tampão estéril (pH 7,0 + /- 0,5) em uma dose entre 0,1 mg e 5 mg por cada grama de produto. Podem ser formulados géis, geléias, ungüentos, loções ou cremes com matriz líquida (por exemplo água) formulada com gelatina, carboximetil celulose ou substâncias similares e bases que contenham glicerina, gluconato de cálcio; além disso as composições podem incluir preservativos (por exemplo p-hidroxibenzoato metílico) para evitar contami- nação, o pH deve ser fisiológico para não afetar as características do AcM. Estas composições terapêuticas devem permitir a liberação e penetrabilidade do AcM na pele. O tratamento típico deve ser aplicado entre uma e três vezes ao dia, sobre as lesões cobertas ou não e pode ser combinado com o uso sistêmico (principalmente endovenoso) do mesmo AcM com doses entre 0,1 e 1 mg/kg de peso do paciente, e deve ser diluído em solução fisiológica para uso endovenoso e administrado lentamente. O tratamento endovenoso pode ser aplicado independentemente da via tópica de administração.
Acompanhamento clínico dos pacientes tratados Como critério principal de avaliação da eficácia terapêutica pode-se utilizar a evolução clínica das lesões .
As variáveis principais de resposta utilizadas para medir os efeitos do tratamento podem ser a melhora das características clínicas das lesões (infiltração, escamas, eritema) e a redução da área das lesões.
Pode-se estabelecer o grau de severidade dos indícios da doença (infiltração, escamas, eritema) entre os valores 0-1-2 0 - sem indício 1 - presença escassa 2 - presença intensa Deve-se considerar ainda a extensão das placas tratadas medindo-se 2 de seus diâmetros e calcular a área da lesão com o produto dos raios (em cm) por p (3,14), o tamanho da placa no tempo 0 representa 100% e nos tempos de avaliações sucessivas se estabelece o percentual do tamanho da placa pela regra de 3. É obtido um TÍTULO DE SEVERIDADE DA PSORÍASE (TSP) similar ao PASI (área psoriática e índice de severidade (psoriasis area and severity index)) (Fredriksson, T. et al. (1978) Dermatológica 157: 238), com a fórmula: (infiltração (0-2) + escamas (0-2) + eritema (0-2)/6) x % de área afetada A resposta ao tratamento é descrita de acordo com as alterações no TSP ao completar os tempos de avaliação designados, sendo estabelecidas as seguintes categorias (Perkins, W. et al. (1993) Br. J. Dermatol. 129: 584) : clareamento (> 90% de melhora no TSP) respondente (> 50% de melhora no TSP) não-respondente (< 50% de melhora no TSP ou piora do TSP) piora (> 50% de aumento no TSP) Pode-se considerar os tempos de avaliação da resposta até as 12 semanas a contar do inicio da aplicação do tratamento (pré-tratamento, semanas 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12) .
Exemplos de realização Exemplo 1. SEQÜENCIAMENTO DA REGIÃO VARIÁVEL DO ANTICORPO MONOCLONAL MURINO ior tlA O RNA foi extraído a partir de 106 células do hibridoma ior tlA. 0 mesmo foi preparado como descrito por Faloro e colaboradores (Faloro, et al. (1989) Method in Enzimology 65: 718). A reação de síntese de cADN consiste em adicionar 5 μρ de RNA, 250 μΜ de cada um de dNTP, 5 0 mM Tris- HCl, pH 7,5, 7 5 mM KCl, 10 mM DDT, 3 mM MgCl2, 2 5 pmoles do oligo CG2A FOR (5'GGAAGCTTAGACCGATGGGGCTGTTGTTTTG 3') para a região variável de cadeia pesada ou 25 pmoles de CK2 FOR (5'GGAAGCTTGAAGATGGATACAGTTGGTGCAGC 3') e 15 unidades de inibidor de RNAsa para um volume total de 15 μΐ, aquecidos a 70°C por 10 minutos e lentamente resfriados até 37°C. Adiciona-se então ao mesmo 100 unidades de transcriptase invertida (BRL) e incuba-se a 37°C por 1 hora.
Os cADNs de VH e VK foram então ampliados por PCR, como descrito por Orlandi e colaboradores (Orlandi et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. 86: 3833). Para a ampliação de VH, faz-se uma mistura reacional à qual são adicionados a 5 μΐ de cADN: 25 pmoles do oligo CG2A FOR e 25 pmoles do oligo VH1BACK (5'AGGT(G/C)(A/C)A(A/G)CTGCAG(G/C)AGTC(A/T)GG3').
Para a ampliação de VK, a mistura reacional consiste de 5 μΐ de cADN, 25 pmoles de CK2 FOR e VK10BACK (5'TTGAATTCCAGTGATGTTTTGATGACCCA3'). A estas misturas são adicionados 2,5 mM de cada um de dNTP, 5 μΐ de tampão 10X da enzima Thermolase e uma unidade desta enzima, em um volume final de 5 0 μΐ. A mistura reacional foi submetida a 25 ciclos de desnaturali- zação, hibridização e extensão a 94°C, 55°C e 72°C, res- pectivamente, com uma incubação final de 5 min a 7 2°C. Géis a 2% de agarose, tingidos com brometo de etídio, foram usados para visualizar os fragmentos produzidos por PCR. Os referidos fragmentos foram purificados com Prep A gene (kit da Bio Rad) e clonados em M13. Os clones foram sequenciados usando-se o método dos dideóxinucleotideos com enzima T7 ADN polimerase de Pharmacia (ver figuras 1 e 2) .
Exemplo 2. MODIFICAÇÃO DA SEQÜÊNCIA DAS REGIÕES VARIÁVEIS DO ANTICORPO MONOCLONAL MURINO ior tlA PARA OBTER UMA IMUNOGLOBULINA MENOS IMUNOGÊNICA POR HUMANIZAÇÃO DOS EPÍ-TOPOS T POTENCIAIS
Parte-se do conhecimento da seqüência da região variável da cadeia pesada do anticorpo monoclonal ior tlA. Esta seqüência foi analisada com o programa AMPHI, o qual determinou as regiões de 11 aminoácidos com estrutura de hélice anfipática e portanto as regiões candidatas a se unirem às moléculas do MHC II.
Na região variável da cadeia pesada do anticorpo ior tlA aparecerão 3 blocos fundamentais: 1. FR 1 entre os aminoácidos 2-21. 2. CDR1 e FR2 entre os aminoácidos 29-43. 3. CDR3 e FR4 entre os aminoácidos 95-111. A numeração dos aminoácidos corresponde àquela proposta por Kabat com base nos aminoácidos não-variantes. Nas figuras 1 e 2 estão representados os epí-topos T possíveis. A figura 1 mostra as seqüências cor- respondentes à cadeia pesada. A seqüência murina é comparada com as seqüências de proteínas humanas apresentadas nos bancos de dados GenBank e EMBL, de onde é extraída a seqüência da região variável de uma imunoglobulina humana que apresenta maior homologia, pertencente ao subgrupo III de Kabat. Em seguida procede-se à determinação daqueles aminoácidos da imunoglobulina murina que diferem daqueles que se encontram na mesma posição na seqüência humana. As duas regiões variáveis de cadeia pesada, a humana e a murina, são comparadas e são escolhidos os aminoácidos nos Frs que não estão intercalados na zona de "Vernier" ou nas estruturas canônicas e que poderão ser substituídos. As posições 13 e 19 não se modificam porque o aminoácido Lys se encontra nestas posições em outras imunoglobulinas humanas pertencentes ao mesmo subgrupo.
Para a cadeia pesada foram propostas 4 alterações : THR da posição 40 por ALA. GLU da posição 42 por GLY. THR da posição 108 por LEU. LEU da posição 109 por VAL.
Na figura 2 está mostrada a análise anterior aplicada à cadeia leve do ior tlA, dando como resultado um grupo de segmentos superpostos que prevêem uma zona antigênica do aminoácido 2 ao 69.
Depois da análise são propostas 7 substituições nos Frs 1 e 2. - LYS na posição 3 por GLN. - MET na posição 11 por LEU. - TYR na posição 12 por SER. - LEU na posição 15 por VAL. - GLU na posição 17 por ASP. - TRP na posição 41 por GLY. - SER na posição 43 por ALA.
Exemplo 3. CONSTRUÇÃO DO MUTANTE POR HUMANIZAÇÃO DE EPÍ~ TOPOS T NA REGIÃO VARIÁVEL DE CADEIA PESADA DO ANTICORPO MONOCLONAL ior tlA
As alterações nos aminoácidos da região variável de cadeia pesada para construir o mutante por humanização de epitopos T foram construídas por mutagênese sobrepondo PCRs (Kamman, M. et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86, 4220).
Em resumo, duas ampliações por PCR: A mistura reacional foi: 0,5 μΐ de sobrenadante de VH de cadeia simples clonado em M13, 25 pmoles de oligos mutagênicos 1 ou 2, 25 pmoles de oligo mutagênico 3 ou 4 (ver abaixo as seqüências dos oligos). A estas misturas foram adicionados 2,5 mM de cada um de dATP, dTTP, dCTP, dGTP, 5 μΐ do tampão 10X da Vent ADN polimerase (NEB) e uma unidade da Vent ADN polimerase (NEB) em um volume final de 50 μΐ. As amostras foram submetidas a 12 - 15 ciclos de PCR (94°C, 30 seg; 50°C, 30 seg e 7 5°C, 1 min) com uma incubação final de 75°C, 5 min. Os produtos de ambas as PCRs estão unidos em uma segunda PCR usando somente os oligos de fora (3 e 4) . O VH mutante ampliado foi purificado pelo kit de purificação Prep.A gene (Bio Rad).
Para as alterações nas posições 40 e 42 os oli-gos usados foram os seguintes: Oligo 1: 5'TGGGTTCGCCAGGCTCCGGGGAAGAGGCTGGAG3' Oligo 3: 5'GTAAAACGACGGCCAGT 3' Estes oligos foram combinados em uma única PCR. Oligo 2: 5' CTCCAGCCTCTTCCCCGGAGCCTGGCGAACCCA3' Oligo 4: 5' AGCGGATAACAATTTCACACAGGA3'.
Estes oligos foram combinados em uma única PCR. Os produtos das duas PCRs são utilizados em uma única PCR usando os oligos 3 e 4.
Para as alterações nas posições 108 e 109, os oligos construídos foram: Oligo 1: 5'GGCCAAGGCACCCTTGTCACCGTCTCC3'.
Oligo 3: 5'GTAAAACGACGGCCAGT3'.
Estes oligos foram combinados em uma única PCR. Oligo 2: 5'GGTGACTCTGTCTCCCACCGATGCAGACAGGGAGGATGGAGACTGGGTCATCTGG ATGTCACA 3' Oligo 4: 5'ACTGGCCGTCGTTTTAC 3' Estes oligos foram combinados em uma única PCR.
Os produtos das duas PCRs são utilizados em uma única PCR usando os oligos 3 e 4.
Para a cadeia leve, as alterações no FR1 nos resíduos 3, 11, 12, 15 e 17, os oligos construídos foram os seguintes: Oligo 1: 5'CAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGACCCTG 3' Oligo 3: 5'GTAAAACGACGGCCAT3' Estes oligos são combinados em uma única PCR.
Oligo 2: 5'CAGGGTCTTAGGAGCTTTCCCTGGTTTCTG 3' Oligo 4: 5'ACTGGCCGTCGTTTTAC3'.
Estes oligos são combinados em uma única PCR.
Os produtos das duas PCRs são combinados em uma única PCR usando os oligos 3 e 4.
Para as alterações propostas nos resíduos 41 e 43 do FR2, os oligos foram: Oligo 1: 5'CAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGACCCTG3' Oligo 3: 5'GTAAAACGACGGCCAT3'.
Estes oligos são combinados em uma única PCR.
Oligo 2: 5'CAGGGTCTTAGGAGCTTTCCCTGGTTTCTG 3' Oligo 4: 5' ACTGGCCGTCGTTTAC3' Estes oligos são combinados em uma única PCR.
Os produtos das duas PCRs são combinados em uma única PCR usando os oligos 3 e 4.
Exemplo 4 Obtenção de uma formulação farmacêutica para uso tópico em lesões cutâneas de pacientes com psoríase vulgar 0 AcM murino ior tl foi purificado e dissolvido em solução tampão estéril (pH 7,0 +/- 0,5).
Ingredientes Quantidade Qualidade AcM ior tl 50 mg * fosfato de sódio 4,50 mg reativo USPXXII monobásico fosfato de sódio 18 mg reativo USPXXII dibásico cloreto de sódio 85 mg reativo USPXXII
Polisorbato 80 1,852 μΐ USPXXII
água para injeção 10 ml USPXXII qsp * conforme especificações de qualidade do fabricante. A solução que contém o AcM foi incorporada a uma geléia base com a composição: Carboximetil celulose sódica (alta viscosidade) A/V 3,00 g propileno glicol 10,00 g metilparabeno 0,180 g propilparabeno 0,020 g trietanolamina 0,045 g água destilada qsp completar. 100,00 g A geléia terapêutica foi elaborada com solução tampão com composição similar à descrita para o AcM (pH 7,0 +/- 0,5).
Exemplo 5 Estudo histológico de lesões cutâneas de pacientes com psoriase vulgar 0 estudo imunohistoquímico de lesões cutâneas de pacientes com psoriase vulgar foi realizado em criosse- ções de pele, o AcM ior tl foi utilizado paralelamente com diferentes AcM dirigidos contra CD de linfócitos T ior t3 (anti CD3) , ior t4 (anti CD4) , ior t8 (anti CD8) , ior L3 (anti CD45) e Dako CD6 (anti-CD6) como controle, e ainda o ior egf/r3 (anti-receptor do fator de crescimento epidérmico). Em seguida as amostras foram incubadas com conjugado de carneiro anti imunoglobulinas murinas bioti-nilado e complexo biotina-avidina-peroxidade [Dako], e finalmente foram reveladas com 3-amino-9-etilcarbazol [Sigma]. As biópsias foram analisadas por 2 especialistas e a avaliação do CD6 foi associada a uma escala de pontos : <10% (±) , 10 - 25% ( + ) , 25 - 50% (++) , 50 - 90% (+++), 90 - 100% (++++).
Nos pacientes tratados a biópsia das lesões foi feita antes do inicio do tratamento e ao terminar a terceira semana de tratamento, na área confinada à biópsia inicial. A escala de classificação da resposta ao tratamento foi qualitativa em percentagem e foi estabelecida de acordo com o índice de marcação de células CD6+ sobre o total de células CD45+, avaliado em cada biópsia. Foi ainda determinada a percentagem de expressão do receptor do fator de crescimento epidérmico nas diferentes camadas da pele, bem como as modificações das características histológicas típicas da doença. - Os linfócitos CD3+ representam aproximadamente 100% das células CD45+. - Foi verificado que no infiltrado inflamatório característico da psoríase vulgar existe expressão entre 60 - 90% de células com fenótipo linfóide T CD6+. - Das células marcadas com anticorpo monoclonal Dako CD6 apenas entre 30 - 50% foram marcadas com o anticorpo monoclonal ior tl. - A expressão em ceratinócitos do receptor de FCE foi elevada com padrão reticulado.
Resulta significativo o predomínio de expressão da molécula CD6+ nos linfócitos T do infiltrado inflama-tório da psoríase vulgar, por ser uma molécula característica de linfócitos T ativados, isto nos leva a pensar que esta pode constituir uma molécula de adesão leucoci-tária nos linfócitos T inicialmente ativados na pele pela penetração de antigenos exógenos ou próprios modificados, necessária para a interação com determinantes celulares específicos da pele ativada durante a resposta aos referidos antigenos. A diferença de reconhecimento observada entre os anticorpos monoclonais anti-CD6 avaliados sustenta a hipótese da diferença de epitopo reconhecido pelo ior tl.
Exemplo 6 Resposta clínica de pacientes com psoríase vulgar à terapêutica tópica com AcM ior tl Foi realizado um ensaio clínico em pacientes com psoríase vulgar diagnosticada, em recidiva, com lesões características desta doença. O estudo foi estruturado em dois grupos de pacientes definidos pela geléia que rece- bem como tratamento tópico (AcM ior tl ou veículo) e foram incluídos 14 pacientes por grupo. Foi utilizada uma formulação terapêutica tópica formada por uma geléia base ou veículo (carbóximetil celulose sódica A/V, propileno glicol, metilparabeno, propilparabeno, trietanolamina) sobre a qual foi incorporado o AcM. O tratamento foi a-plicado 2 vezes ao dia sem oclusão das lesões tratadas, durante 21 dias.
Todos os pacientes tratados com o AcM ior tl tiveram as lesões psoriáticas clareadas em placas (figura 4). Este resultado corresponde ao observado na biópsia pós-tratamento apenas 21 dias depois de iniciada a aplicação do AcM, onde foi verificada diminuição do infiltrado linfocitário T, diminuição da expressão do receptor do EGF em ceratinócitos e regressão dos indícios histológi-cos característicos da doença.
Exemplo 7 Relação da resposta clínica com a dose de anticorpo mono-clonal murino ior tl aplicado topicamente nos pacientes com psoríase vulgar Foi realizado um ensaio clínico em 19 pacientes com psoríase vulgar diagnosticada em recidi-va, com lesões características desta doença. O estudo foi estruturado em três grupos de pacientes definidos pela concentração de anticorpo monoclonal ior tlA contida na formulação terapêutica que receberam como tratamento tópico (0,3 mg, 1 mg ou 3 mg de AcM ior tlA) e foram incluídos 6, 7 e 6 pacientes respectivamente por grupo. Foi utilizada uma for- mulação terapêutica tópica formada por uma geléia base ou veiculo (carbóximetil celulose sódica A/V, propileno gli-col, metilparabeno, propilparabeno, trietanolamina) sobre a qual foi incorporado o AcM. O tratamento foi aplicado 2 vezes ao dia sem oclusão das lesões tratadas, durante 21 dias . A evolução clinica dos pacientes foi avaliada utilizando o PASI (Área Psoriática e índice de Severidade (Psoriatic Area and Severity Index)) e simultaneamente o soro destes pacientes foi analisado quanto ao aparecimento da resposta de anticorpos humanos contra as imunoglo-bulinas humanas (anticorpo anticamundongo humano - HAMA). A melhor resposta clinica foi observada no grupo de pacientes tratados com a dose mais baixa de AcM ior tl (0,3 mg) que correspondeu ao grupo de maior freqüência de aparecimento e os maiores títulos de resposta HAMA. Foi ainda avaliada a presença de anticorpos antiidiotípicos (anti-AcM ior tl) pelo método ELISA (Teste Imunossovente de enzima ligada (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)) e por FACS (classificador de célula ativadora de fluorescência (Fluorescent Activating Cell Sorter)) e foi observada maior freqüência de aparecimento e maior título de resposta de anticorpos antiidiotípicos contra o ior tl no mesmo grupo de pacientes.
Exemplo 8 Resposta clínica de um paciente com forma severa de pso-ríase generalizada à terapêutica endovenosa com o AcM ior tl Uma paciente do sexo feminino de 56 anos de idade com antecedentes de apresentar psoriase com artropatia psoriática diagnosticada há aproximadamente 17 anos, nos últimos 5 anos com crises frequentes e intensas por causa das quais foi internada várias vezes. Começa com gomos da doença, com lesões eritemato-escamosas generalizadas, dores ósseas e musculares, debilitação ("toma") do estado geral, febricula e edemas generalizados, este quadro se mantém e 21 dias depois aparecem nas dobras submamárias, axilares e no colo lesões fissuradas com ulcerações com secreção serosa e malcheirosa, acompanhado de febre. Pela evolução tórpida da doença, a não tolerância a nenhum tratamento tópico incluindo cremes esteroidais, decide-se administrar tratamento com metotrexate (dose total 15 mg) 3 ciclos, sem aparecer resposta clinica. - Dose única de AcM ior tl a 0,6 mg/kg de peso por via endovenosa lenta, diluído em 200 ml de solução salina a 0,9%. - Simultaneamente foi administrada, durante 2 dias, em todas as lesões, duas vezes ao dia, geléia terapêutica que contém o AcM ior tl à concentração de 3 mg de AcM / g de geléia. A partir do dia 6 de realização do tratamento a paciente começa a melhorar seu estado geral e quadro dermatológico. Ela foi avaliada aos 21 dias de tratamento e apresentava aproximadamente 60% da superfície corporal sem lesões e o resto da pele com melhora dos indícios clínicos da doença; a paciente menciona melhora da sinto- matologia articular; apresenta bom estado geral, sinais vitais normais e exames de rotina de laboratório clinico sem alterações.
Trinta dias depois a paciente continua com regressão completa da sintomatologia da doença.
Breve Descrição dos Desenhos Figuras 1 e 2 - Análise para a modificação por humanização de epitopos T das regiões variáveis de cadeia pesada e leve do anticorpo monoclonal murino ior tlA.
Figura 1: Seqüência da região variável da cadeia pesada do AcM murino ior tlA.
Figura 2: Seqüência da região variável da cadeia leve do AcM murino ior tlA. A: Seqüência da região variável da cadeia pesada ou leve do AcM murino ior tlA. B: Seqüência da região variável da Ig humana que mais se parece com o ior tlA. C: Seqüência modificada do ior tlA, por humanização de epitopos T.
Resíduos de aminoácidos sublinhados: aminoácidos intercalados na estrutura terciária.
Letras em negrito: regiões determinantes de com- plementariedade (CDRs).
Resíduos de aminoácidos envolvidos em um quadro: alterações propostas. A descrição é similar para cadeias pesadas e leves .
Figura 3 - Apresenta o resultado da expressão do antígeno CD6 em linfócitos do infiltrado inflamatório característicos das lesões cutâneas de pacientes com psorí-ase vulgar. Esta avaliação foi realizada em biópsias por congelamento de pele afetada com lesões localizadas em membros superiores e/ou inferiores e/ou tórax-abdômen em forma de placas. A avaliação histológica foi realizada antes do tratamento por técnicas de imunohistoquímica.
Figura 4 - A avaliação da eficácia terapêutica do AcM anti CD6 utilizada no tratamento da psoríase foi realizada levando-se em conta as variáveis infiltração, escamas, eritema e tamanho da área das lesões; foi estabelecido um grau de severidade entre os valores 0 - 1 -2; foi ainda considerada a extensão das placas tratadas medindo-se 2 de seus diâmetros. Foi obtido um TÍTULO DE SEVERIDADE DA PSORÍASE (TSP) similar ao PASI ("psoriasis area and severity index") e a resposta ao tratamento é classificada de acordo com as alterações no TSP ao terminar os tempos de avaliação designados, estabelecendo-se as seguintes categorias: clareamento, respondente, não respondente e piora.
Figura 5 - A resposta clínica dos pacientes tratados topicamente com o anticorpo mono-clonal ior tlA contido na formulação terapêutica a diferentes doses (0,3 mg, 1 mg ou 3 mg de AcM ior tlA) avaliada por PASI foi relacionada com o aparecimento da resposta de anticorpos humanos contra as imunoglobulinas murinas (anticorpo an- ticamundongo humano - HAMA). A melhor resposta clinica foi observada no grupo de pacientes tratados com a dose mais baixa do AcM ior tl (0,3 mg) , o que correspondeu ao grupo de maior freqüência de aparecimento e os maiores títulos de resposta HAMA.
Figura 6 - Um tratamento com o anticorpo mono-clonal ior tl por via endovenosa foi aplicado a uma paciente de 5 6 anos de idade com antecedentes de apresentar psoríase com artropatia psoriática diagnosticada há aproximadamente 17 anos, agora na forma severa de psoríase generalizada caracterizada por lesões eritemato-escamosas generalizadas, dores ósseas e musculares, debilitação ("toma") do estado geral, febrícula e edemas generalizados. Quadro que não melhora com tratamento médico, inclusive metotrexate. Foi aplicado à paciente um tratamento em dose única de AcM ior tl a 0,6 mg/kg de peso por via endovenosa lenta, diluído em 200 ml de solução salina a 0,9%, simultaneamente foi administrada, durante 2 dias, em todas as lesões, duas vezes ao dia, geléia terapêutica que contém o AcM ior tl à concentração de 3 mg de AcM / g de geléia, para um total de 224 g de geléia terapêutica. As respostas clínica, imunohistoquímica e de laboratório clínica foram avaliadas semanalmente, e estão mostradas fotografias evolutivas das lesões cutâneas (dia anterior ao tratamento e aos 21 dias).
REIVINDICAÇÕES
Claims (4)
1. Anticorpo monoclonal que reconhece o CD6 humano e útil no diagnóstico e tratamento da psoríase, caracterizado por ser um anticorpo monoclonal humanizado tendo a região variável de sua cadeia pesada com a seguinte seqüência: GLU VAL GLN LEU VAL GLU SER GLY GLY GLY LEU VAL LYS PRO GLY GLY SER LEU LYS LEU SER CYS ALA ALA SER GLY PHE LYS PHE SER ARG TYR ALA MET SER TRP VAL ARG GLN ALA PRO GLY LYS ARG LEU GLU TRP VAL ALA THR ILE SER SER GLY GLY SER TYR ILE TYR TYR PRO ASP SER VAL LYS GLY ARG PHE THR ILE SER ARG ASP ASN VAL LYS ASN THR LEU TYR LEU GLN MET SER SER LEU ARG SER GLU ASP THR ALA MET TYR TYR CYS ALA ARG ARG ASP TYR ASP LEU ASP TYR PHE ASP SER TRP GLY GLN GLY THR LEU VAL THR VAL SER SER e a região variável de sua cadeia leve com a seguinte seqüência : ASP ILE GLN MET THR GLN SER PRO SER SER LEU SER ALA SER VAL GLY ASP ARG VAL THR ILE THR CYS LYS ALA SER ARG ASP ILE ARG SER TYR LEU THR TRP TYR GLN GLN LYS PRO GLY LYS ALA PRO LYS THR LEU ILE TYR TYR ALA THR SER LEU ALA ASP GLY VAL PRO SER ARG PHE SER GLY SER GLY SER GLY GLN ASP TYR SER LEU THR ILE SER SER LEU GLU SER ASP ASP THR ALA THR TYR TYR CYS LEU GLN HIS GLY GLU SER PRO PHE THR PHE GLY SER GLY THR LYS LEU GLU ILE LYS ARG ALA.
2. Uso de um anticorpo monoclonal humanizado, como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para o diagnóstico in vitro de psoríase.
3. Composição farmacêutica para o tratamento da psoríase, caracterizada por conter um anticorpo monoclo- nal, como definido na reivindicação 1, e um veiculo far-maceuticamente aceitável.
4. Reagente útil para o diagnóstico da psoriase, caracterizado por conter um anticorpo monoclonal, como definido na reivindicação 1, e um veiculo.
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