BR112021001530A2 - anticorpo anti-btla - Google Patents

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BR112021001530A2
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Jian Yao
Sheng Yao
Hui Feng
Jing Zhang
Yuehua ZHOU
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Shanghai Junshi Biosciences Co., Ltd.
Suzhou Junmeng Biosciences Co., Ltd.
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Abstract

A presente invenção refere-se a um anticorpo anti-BTLA ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, o anticorpo anti-BTLA ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende pelo menos um domínio de estrutura da CDR de cadeia leve selecionado dentre as SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 22, 23, 24, 31, 32 e 33, e/ou pelo menos um domínio de estrutura da CDR de cadeia pesada selecionado dentre as SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 13, 14, 15, 19, 20, 21, 25, 26, 27, 28, 29 e 30. A presente invenção também se refere às moléculas de ácido nucleico que codificam o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um vetor de expressão correspondente e uma célula hospedeira, assim como o uso terapêutico do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno, moléculas de ácido nucleico, um vetor de expressão e uma célula hospedeira da mesma.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTI- CORPO ANTI-BTLA".
CAMPO TÉCNICO
[0001] A presente invenção refere-se ao campo da biotecnologia e se refere especificamente a um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA e ao seu uso. Mais espe- cificamente, a presente invenção refere-se a um anticorpo ativo que reconhece o BTLA humano e pode ser utilizado para o tratamento ou prevenção de tumores, doenças infecciosas, doenças inflamatórias, doenças autoimunes, e similares.
ANTECEDENTES
[0002] Sinais coestimuladores positivos e negativos desempe- nham um papel crucial na regulação da atividade de células B e célu- las T, e as moléculas que atuam como mediador desses sinais têm se mostrado alvos eficazes para moduladores imunológicos. Além do en- volvimento do receptor de células T (TCR), a coestimulação positiva é necessária para a ativação ideal de células T virgens, enquanto a co- estimulação negativa é considerada necessária para a aquisição de tolerância autoimune e a terminação da função das células T efetoras. Após interagir com B7.1 ou B7.2 na superfície das células apresenta- doras de antígeno (APCs), o protótipo da molécula coestimuladora de células T CD28 sinaliza a promoção da proliferação e diferenciação de células T em resposta ao envolvimento do TCR, enquanto que o antí- geno 4 de linfócito T citotóxico homólogo CD28 (CTLA-4) atua como mediador da inibição da proliferação de células T e função efetora (Chambers et al., Ann. Rev. Immunol., 19: 565-594, 2001; Egen et al., Nature Immunol., 3: 611-618, 2002). Várias novas moléculas homólo- gas à família B7 foram encontradas (Abbas et al., Nat.Med., 5: 1345-6, 1999; Coyle et al., Nat. Immunol., 2: 203-9, 2001; Carreno et al., Annu. Rev. Immunol., 20: 29-53, 2002; Liang et al., Curr. Opin. Immunol., 14:
384-90, 2002) e a elucidação para seus papéis na ativação de células T apenas começa.
[0003] O atenuador de linfócitos B e T (BTLA) é um membro da família CD28, que também inclui CD28, ICOS, CTLA-4 e PD-1. Com base no efeito funcional de aumentar a proliferação de células T pela adição de mAb, os primeiros membros desta família, CD28 e ICOS, mostraram ter um efeito de ativação imune (Hutloff et al., 1999). E BTLA, CTLA-4, PD-1 e similares são descritos como proteínas regula- doras negativas. Vários estudos in vivo demonstraram o efeito inibidor do BTLA nas respostas dos linfócitos. Camundongos deficientes em BTLA adquiridos por Murphy e seus colegas (Washington University St. Louis) mostraram um aumento de 3 vezes na produção de IgG em resposta aos antígenos T-dependentes. Além disso, as células T e as células B isoladas de camundongos com BTLA apresentaram respos- tas proliferativas mais fortes à estimulação do receptor de antígeno com CD3- e anti-IgM, respectivamente (Watanabe, 2003). Em um es- tudo de superexpressão, descobriu-se que o BTLA se associa com os complexos de receptores de células B e também com os receptores de células T. De acordo com os resultados deste estudo, em linfócitos com deficiência de BTLA, a estimulação independente do receptor de antígeno utilizando ConA (células T) ou LPS (células B) não foi afetada e não pode ser regulada mesmo com o uso de um anticorpo anti- BTLA. Foi demonstrado que camundongos neutralizados com BTLA desenvolvem doenças autoimunes espontâneas ao longo do tempo e possuem uma vida útil mais curta (Oya, 2008). A gravidade da doença aumentou para camundongos neutralizados com BTLA com encefa- lomielite autoimune experimental (EAE) e modelos de inflamação alér- gica das vias aéreas, ambos baseados na atividade das células T (Wa- tanabe, 2005; Deppong, 2006).
[0004] O mediador de entrada de herpesvírus (HVEM) demonstrou ser um ligante de BTLA (Scully et al, 2005). O HVEM é uma glicoprote- ína da transmembrana do tipo I com 4 domínios extracelulares ricos em cisteína (CDRs) contendo 6 cisteínas pseudocompetitivas e é um membro da superfamília de receptores de TNF. BTLA e HVEM regu- lam a função das células T e APC principalmente por meio da expres- são dinâmica na superfície celular. A ligação de BTLA ao ligante não apenas inibe a proliferação de células T e desregula o marcador de ativação de células T CD25, mas também inibe a produção de IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-10 e similares, mas não induz apoptose celular. A ligação de HVEM ao BTLA resulta na infrarregulação da ativação e prolifera- ção de células T (Sedy, 2005). Estas descobertas indicam que a ex- pressão de BTLA ou ligação de BTLA-HVEM está fortemente correla- cionada com a ativação e proliferação de células T.
[0005] Um anticorpo pode ser utilizado como um agente terapêuti- co. Alguns anticorpos podem provocar imunogenicidade indesejada do anticorpo quando utilizados como agentes terapêuticos in vivo. O uso repetido de um anticorpo monoclonal em seres humanos resulta em uma resposta imune contra o anticorpo terapêutico (por exemplo, anti- corpo humano anticamundongo ou HAMA), devido à origem da maioria dos anticorpos monoclonais em roedores. Essas respostas imunes re- sultam em pelo menos uma perda de eficácia terapêutica e, no máxi- mo, uma reação alérgica potencialmente letal. Um método para reduzir a imunogenicidade de anticorpos de roedores inclui a produção de an- ticorpos quiméricos, nos quais a região variável de camundongo (Fv) é fundida à região constante humana (Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-43). No entanto, os camundongos injetados com um híbrido da região variável humana e da região constante do ca- mundongo desenvolvem uma forte resposta de anticorpos contra a re- gião variável humana, sugerindo que a retenção da região Fv de roe- dor intacta em tais anticorpos quiméricos ainda pode provocar imuno-
genicidade deletéria em pacientes.
[0006] Além disso, o enxerto das alças calibradas da região de- terminante de complementaridade (CDR) do domínio variável de roe- dor na estrutura humana (isto é, humanização) foi utilizado para mini- mizar ainda mais as sequências de roedores. Jones et al. (1986) Natu- re 321: 522; Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534. No entanto, a troca da alça calibrada da CDR ainda não consegue produzir unifor- memente um anticorpo com as mesmas propriedades de ligação que o anticorpo inicial. Em anticorpos humanizados, as alterações nos resí- duos de estrutura (FRs) (resíduos envolvidos no suporte da alça cali- brada da CDR) são frequentemente necessárias para manter a afini- dade de ligação ao antígeno. Kabat et al. (1991) J. Immunol. 147:
1709. Embora o uso de enxerto de CDR e retenção de resíduo de es- trutura em muitos construtos de anticorpos humanizados tenha sido relatado, é difícil prever se uma sequência particular irá produzir um anticorpo com as propriedades de ligação desejadas e, ocasionalmen- te, propriedades biológicas. Ver, por exemplo, Queen et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029; Gorman et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4181; and Hodgson, (1991) Biotechnology (NY), 9: 421-5. Além disso, na maioria dos estudos existentes, diferentes se- quências humanas são adotadas para as sequências variáveis de ca- deia leve e pesada de animais, o que torna a previsibilidade de tais estudos questionável. As sequências de anticorpos conhecidas, ou de uma forma mais geral anticorpos tendo uma estrutura de cristal de rai- os-X conhecida, tal como os anticorpos NEW e KOL, foram utilizadas. Ver, por exemplo, Jones et al., supra; Verhoeyen et al., supra; and Gorman et al., supra. A informação exata da sequência foi relatada para alguns construtos humanizados.
[0007] Existe uma necessidade de anticorpos anti-BTLA, particu- larmente anticorpos monoclonais anti-BTLA, para uso no tratamento de distúrbios humanos (por exemplo, distúrbios inflamatórios, distúr- bios autoimunes e distúrbios proliferativos). Esses anticorpos podem ter, de preferência, baixa imunogenicidade em seres humanos, permi- tindo a administração repetida sem respostas imunes adversas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0008] A presente invenção refere-se a um ou mais anticorpos an- ti-BTLA humano ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, e ao uso dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos no tratamento de doenças.
[0009] Em uma ou mais modalidades, a presente invenção se refe- re a um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao BTLA humano (atenuador de linfócitos B e T), compreendendo uma ou mais propriedades selecio- nadas do que se segue: A) bloqueio da ligação de BTLA a HVEM (mediador de entrada de her- pesvírus); B) reação cruzada com o BTLA de macaco cinomolgo; C) ligação ao BTLA humano com uma KD ≤ 0,28 nM; e D) não tendo nenhuma capacidade de mediar o efeito ADCC.
[0010] Em uma ou mais modalidades, a presente invenção refere- se a um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano compreendendo pelo menos um domínio da CDR de cadeia leve selecionado das SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 22, 23, 24, 31, 32 e 33, e pelo menos um domí- nio da CDR de cadeia pesada selecionado das SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 13, 14, 15, 19, 20, 21, 25, 26, 27, 28, 29 e 30.
[0011] Em uma ou mais modalidades, a presente invenção refere- se a um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano, em que as sequências de ami- noácido das CDR1, CDR2 e CDR3 do CDR da cadeia leve são seleci-
onadas a partir de qualquer um dos seguintes grupos de A a E: Grupo LCDR1 LCDR2 LCDR3 A SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 B SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 C SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18 D SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 24 E SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33 e/ou as sequências de aminoácido das CDR1, CDR2 e CDR3 da CDR de cadeia pesada são selecionadas de qualquer um dos seguintes grupos de F a K: Grupo HCDR1 HCDR2 HCDR3 F SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 G SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 H SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15 I SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21 G SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 27 K SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 30
[0012] Em uma ou mais modalidades, a presente invenção refere- se a um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano, em que as sequências de ami- noácido das CDR1, CDR2 e CDR3 da CDR de cadeia pesada e as se- quências de aminoácido das CDR1, CDR2 e CDR3 da CDR de cadeia leve são selecionadas de qualquer um dos seguintes grupos de I a IX: Grupo LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3 I SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 II SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 III SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15
IV SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21 V SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 27 VI SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 30 VII SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 VIII SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 IX SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15
[0013] Em uma ou mais modalidades, a presente invenção refere- se a um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano compreendendo uma região va- riável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, em que a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve é seleci- onada das SEQ ID NOs: 36, 37, 39, 41, 44, 46, 47 e 48, e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada é selecionada das SEQ ID NOs: 34, 35, 38, 40, 42, 43 e 45.
[0014] Em uma ou mais modalidades, a presente invenção refere- se a um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano, em que a sequência de aminoá- cido da região variável de cadeia leve é apresentada na SEQ ID NO: 36, e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada é apresentada na SEQ ID NO: 34.
[0015] Em uma ou mais modalidades, a presente invenção refere- se a um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano, em que a sequência de aminoá- cido da região variável de cadeia leve é apresentada na SEQ ID NO: 36, e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada é apresentada na SEQ ID NO: 35.
[0016] Em uma ou mais modalidades, a presente invenção refere- se a um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano, em que a sequência de aminoá- cido da região variável de cadeia leve é apresentada na SEQ ID NO: 37; e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada é apresentada na SEQ ID NO: 34.
[0017] Em uma ou mais modalidades, a presente invenção refere- se a um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano, em que a sequência de aminoá- cido da região variável de cadeia leve é apresentada na SEQ ID NO: 37, e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada é apresentada na SEQ ID NO: 35.
[0018] Em uma ou mais modalidades, a presente invenção refere- se a um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano, em que a sequência de aminoá- cido da região variável de cadeia leve é apresentada na SEQ ID NO: 39, e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada é apresentada na SEQ ID NO: 38.
[0019] Em uma ou mais modalidades, a presente invenção refere- se a um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano, em que a sequência de aminoá- cido da região variável de cadeia leve é apresentada na SEQ ID NO: 41, e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada é apresentada na SEQ ID NO: 40.
[0020] Em uma ou mais modalidades, a presente invenção refere- se a um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano, em que a sequência de aminoá- cido da região variável de cadeia leve é apresentada na SEQ ID NO: 41, e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada é apresentada na SEQ ID NO: 42.
[0021] Em uma ou mais modalidades, a presente invenção refere- se a um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano, em que a sequência de aminoá- cido da região variável de cadeia leve é apresentada na SEQ ID NO: 44, e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada é apresentada na SEQ ID NO: 43.
[0022] Em uma ou mais modalidades, a presente invenção refere- se a um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano, em que a sequência de aminoá- cido da região variável de cadeia leve é apresentada na SEQ ID NO: 46, e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada é apresentada na SEQ ID NO: 45.
[0023] Em uma ou mais modalidades, a presente invenção refere- se a um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano, em que a sequência de aminoá- cido da região variável de cadeia leve é apresentada na SEQ ID NO: 47, e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada é apresentada na SEQ ID NO: 45.
[0024] Em uma ou mais modalidades, a presente invenção refere- se a um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano, em que a sequência de aminoá- cido da região variável de cadeia leve é apresentada na SEQ ID NO: 48, e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada é apresentada na SEQ ID NO: 45.
[0025] Em uma ou mais modalidades, o anticorpo isolado ou o fra- gmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui divulgado que se liga ao BTLA humano é um tipo de IgG, mais preferencialmente um subtipo de IgG4.
[0026] Em uma ou mais modalidades, o anticorpo isolado ou o fra- gmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui divulgado que se liga ao BTLA humano é um anticorpo Fv de cadeia única; em algumas mo- dalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo Fab; em algumas modalidades, o anticorpo ou o frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo Fab'; e em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antíge-
no do mesmo é um anticorpo (Fab')2.
[0027] Em outras modalidades, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo isolado compreendendo o domínio VL ou o domínio VH de qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antí- geno dos mesmos aqui descritos.
[0028] Em outras modalidades, a presente invenção refere-se a um ácido nucleico isolado que codifica o domínio VL ou o domínio VH de qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui descritos.
[0029] Em outras modalidades, a presente invenção refere-se a uma composição que compreende um ou mais dos anticorpos ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui descritos e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
[0030] Em outras modalidades, a presente invenção refere-se a um método para prevenir ou tratar doenças através da eliminação, ini- bição ou redução da atividade de BTLA utilizando um ou mais dos an- ticorpos ou dos fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui descritos, compreendendo a administração a um indivíduo com sua necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, do ácido nucleico, do vetor de expressão, da célula hospedeira, do imunoconjugado ou da composição farmacêutica aqui divulgada. De preferência, a preven- ção ou o tratamento das doenças ou distúrbios é beneficiado pela eli- minação, inibição ou redução da atividade de BTLA; de preferência, as doenças ou distúrbios são selecionados de câncer, doenças infeccio- sas e doenças inflamatórias.
[0031] Em outras modalidades, a presente invenção também refe- re-se ao uso do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno, do ácido nucleico, do vetor de expressão, da célula hospedeira, do imu- noconjugado ou da composição farmacêutica para a preparação de um medicamento para tratar ou prevenir doenças ou distúrbios, prefe- rivelmente doenças mediadas por BTLA, que podem ser selecionadas de câncer, doenças infecciosas ou doenças inflamatórias.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0032] A FIG. 1 mostra o eletroferograma SDS-PAGE da proteína de domínio extracelular de BTLA humana.
[0033] A FIG. 2 mostra a capacidade de ligação de BTLA ao HVEM testada por um citômetro de fluxo.
[0034] A FIG. 3 mostra um ensaio ELISA na ligação de anticorpos quiméricos ao BTLA humano.
[0035] A FIG. 4 mostra a capacidade dos anticorpos quiméricos de bloquear a ligação BTLA-HVEM.
[0036] A FIG. 5 mostra um ensaio sobre o efeito de anticorpos quiméricos na atividade de células T.
[0037] A FIG. 6 mostra um ensaio sobre a ligação específica de anticorpos humanizados ao BTLA.
[0038] A FIG. 7 mostra um ensaio sobre a ligação de anticorpos humanizados ao hBTLA em células 293F.
[0039] A FIG. 8 mostra um ensaio sobre o bloqueio de anticorpos humanizados da ligação de BTLA ao HVEM na superfície celular.
[0040] A FIG. 9 mostra um ensaio sobre a promoção de anticorpos humanizados na ativação de células T.
[0041] A FIG. 10 mostra uma experiência comparativa na ligação do anticorpo humanizado 17 aos BTLAs de diferentes espécies.
[0042] A FIG. 11 mostra o efeito de hu18 no volume do tumor de camundongos B-hBTLA transplantados com células MC38-hHVEM.
[0043] A FIG. 12 mostra o efeito de amostras no peso corporal de camundongos B-hBTLA transplantados com células MC38-hHVEM.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0044] O sistema imunológico de mamíferos desenvolveu várias vias que controlam a atividade potencialmente deletéria dos linfócitos T e B, incluindo várias vias de receptor de citocina e vias coestimula- doras envolvendo receptores (tais como CD28, CTLA-4, PD-1 e BTLA). A interação CD28-B7 é um exemplo de uma via coestimulado- ra positiva (isto é, o CD28 desencadeia um aumento na resposta das células T aos acionadores específicos do antígeno), enquanto que os outros 3 receptores são vias coestimuladoras inibidoras. CTLA-4, PD-1 e BTLA mostram perfis de expressão sobrepostos, mas únicos, e limi- tam a atividade de linfócitos T e B e outras células imunes (ver Dep- pong et al., J. Immunol 2006; Tao et al., J. Immunol 2005). Embora o CTLA-4 concorra com o CD28 pela ligação a B7.1 e B7.2 (CD80 e CD86) e defina um limite inicial para a ativação de células T virgens em nódulos linfáticos e baço, PD-1 e BTLA cada um possui seus pró- prios ligantes exclusivos (PD-L1/-L2 e HVEM, respectivamente) e pa- recem controlar a homeostase e reativação das células T periféricas (ver Krieg et al., Nat. Immunol 2007).
[0045] O BTLA infrarregula a ativação de células B e células T. Como o próprio nome sugere, o atenuador de linfócitos B e T (BTLA) é expresso nos linfócitos B e T tanto em repouso quanto ativados. O BTLA é uma glicoproteína da transmembrana do tipo I com uma cauda citoplasmática contendo vários motivos inibidores da tirosina (Watana- be, 2003). O BTLA compartilha uma certa semelhança estrutural com os membros da família CD28/CTLA-4, mas possui propriedades úni- cas. O BTLA está associado a uma variedade de doenças imunológi- cas, inflamatórias e proliferativas. Portanto, o desenvolvimento de anti- corpos monoclonais capazes de bloquear a ligação BTLA-HVEM hu- mana é uma necessidade contínua para o tratamento da doença.
DEFINIÇÕES
[0046] Para que a presente invenção possa ser mais facilmente compreendida, alguns termos técnicos e científicos são especificamen-
te definidos como se segue. A menos que definido de outra forma nes- ta invenção, todos os outros termos técnicos e científicos aqui utiliza- dos possuem o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa de habilidade prática na técnica à qual a presente inven- ção pertence.
[0047] Aqui, a menos que de outra forma ou especificamente es- pecificado no contexto, "ativação", "estimulação" e "tratamento" para uma célula ou um receptor podem ter o mesmo significado. Por exem- plo, a célula ou o receptor é ativado, estimulado ou tratado com um ligante. "Ligantes" incluem ligantes naturais e sintéticos, tais como ci- tocinas, variantes de citocinas, análogos, proteínas mutantes e com- postos de ligação derivados de anticorpos. "Ligantes" também incluem moléculas pequenas, tais como peptidomiméticos de citocinas e pepti- domiméticos de anticorpos. "Ativação" pode se referir à ativação de uma célula regulada por mecanismos internos, assim como por fatores externos ou ambientais. "Resposta/reação", por exemplo, uma respos- ta de uma célula, um tecido, um órgão ou um organismo, inclui mu- danças nos comportamentos bioquímicos ou fisiológicos (por exemplo, concentração, densidade, aderência ou migração, taxa de expressão gênica ou estado de diferenciação dentro um compartimento biológi- co), onde as alterações estão associadas a uma ativação, estimulação ou tratamento, ou estão associadas a um mecanismo interno, tal como a programação genética.
[0048] "Atividade" de uma molécula pode descrever ou referir-se à ligação da molécula a um ligante ou a um receptor; a atividade catalíti- ca; a capacidade de estimular a expressão gênica ou sinalização, dife- renciação ou maturação celular; a atividade antigênica; a regulação da atividade de outras moléculas, etc. "Atividade" de uma molécula tam- bém pode se referir à atividade na regulação ou manutenção da inte- ração célula-célula (por exemplo, aderência), ou na manutenção da estrutura celular (por exemplo, membrana celular ou cadeia principal celular). "Atividade" também pode se referir à atividade específica, tal como [atividade catalítica] / [mg de proteína], [atividade imunológica] / [mg de proteína], ou concentração em um compartimento biológico, etc. "Atividade" pode se referir à regulação de um componente do sis- tema imunológico inato ou do sistema imunológico adaptativo. "Ativi- dade proliferativa" inclui atividades que promovem, são necessárias ou estão especificamente associadas com os aspectos tais como a divi- são celular normal, assim como cânceres, tumores, displasia, trans- formação celular, metástase e angiogênese.
[0049] "Administração" e "tratamento" aplicado a um animal, ser humano, indivíduo, célula, tecido, órgão ou fluido biológico significa o contato de um fármaco exógeno, agente terapêutico, agente de diag- nóstico ou composição com o animal, ser humano, indivíduo, célula, tecido, órgão ou fluido biológico. "Administração" e "tratamento" podem referir-se a, por exemplo, métodos terapêuticos, farmacocinéticos, di- agnósticos, de pesquisa e experimentais. O tratamento de células in- clui o contato de um agente com as células e o contato do agente com um fluido que faz contato com as células. "Administração" e "tratamen- to" também significam tratamentos in vitro e ex vivo, por exemplo, tra- tamentos in vitro e ex vivo de uma célula com um agente, um diagnós- tico, um composto de ligação ou outra célula. "Tratamento" também inclui a administração de um agente terapêutico, por exemplo, uma composição compreendendo qualquer um dos anticorpos ou seus fra- gmentos de ligação ao antígeno aqui divulgados, interna ou externa- mente a um paciente com necessidade. Em geral, os anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno ou composições farmacêuti- cas correspondentes aqui descritas são administrados em uma quanti- dade eficaz para aliviar um ou mais sintomas da doença no paciente ou na população a ser tratada, seja por indução de regressão ou inibi-
ção da progressão destes sintomas em qualquer grau clinicamente mensurável. Uma quantidade de agente terapêutico eficaz para aliviar qualquer sintoma de doença particular (também referido como uma "quantidade terapeuticamente eficaz") pode variar dependendo de fa- tores tais como o estado da doença, idade e peso de um paciente e a capacidade do agente em provocar uma reação desejada no paciente. O fato de um sintoma de uma doença ser atenuado pode ser avaliado por quaisquer medições clínicas comumente executadas por médicos ou outros profissionais de saúde para avaliar a gravidade ou progres- são de um sintoma.
[0050] O termo "indivíduo" ou "paciente" inclui qualquer organis- mo, de preferência um animal, mais preferivelmente um mamífero (tal como rato, camundongo, cão, gato, coelho), e o mais preferível um ser humano.
[0051] Aqui, "administração" ou "tratamento" pode ser executado por uma via invasiva, por exemplo, através de uma administração por injeção de qualquer um dos anticorpos anti-BTLA ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, ou composições farmacêuticas corresponden- tes aqui descritas. A administração por vias não invasivas (por exem- plo, administração oral; por exemplo, administração oral em pílulas, cápsulas ou comprimidos) também está dentro do escopo da presente invenção. Em uma modalidade da presente invenção, o anticorpo anti- BTLA ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou uma com- posição farmacêutica do mesmo é administrado por via intravenosa, subcutânea, intramuscular, intra-arterial, intra-articular (por exemplo, em articulações artríticas), através de inalação, mediante a liberação por aerossol ou por via intratumoral.
[0052] Qualquer um dos anticorpos anti-BTLA ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, ou composições correspondentes dos mesmos aqui descritos, podem ser administrados utilizando dispo-
sitivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, a composição farmacêutica aqui divulgada pode ser administrada por injeção utili- zando uma agulha hipodérmica; ou a composição farmacêutica aqui divulgada pode ser administrada por injeção utilizando uma agulha in- travenosa.
[0053] Em algumas modalidades, qualquer um dos anticorpos anti- BTLA ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, ou suas composições farmacêuticas correspondentes descritas nesta inven- ção, podem ser utilizados isoladamente ou em combinação para tratar ou prevenir qualquer doença ou condição em um indivíduo com ne- cessidade de tal tratamento ou prevenção.
[0054] Aqui, os termos "atenuador de linfócitos B e T" e ge- ne/proteína de "BTLA" podem ser utilizados de modo trocável e inclu- em variantes, isótipos, homólogos, ortólogos e parálogos. Por exem- plo, em algumas modalidades, um anticorpo específico de BTLA hu- mano pode apresentar reação cruzada com BTLA de uma espécie não humana. Em outras modalidades, um anticorpo específico de BTLA humano pode ser totalmente específico para BTLA humano e não ter reatividade cruzada de espécies ou outros tipos de reatividade cruza- da. A não ser que de outra maneira mencionada, o termo "BTLA hu- mano" ou "hBTLA" refere-se à sequência de BTLA humano. Salvo in- dicação em contrário, a sequência de BTLA humana inclui todos os isótipos humanos e variantes de BTLA, por exemplo, a sequência de aminoácido completa de BTLA humano com o número de acesso do Genbank AAP44003. Existem também pelo menos duas variantes de transcritos de BTLA humano, a variante de transcrito 1 e a variante de transcrito 2. A primeira codifica uma proteína que possui 289 aminoá- cidos de comprimento (No. de acesso do GenBank NP_861445) e possui quase 98% de identidade com a sequência de BTLA com um No. de acesso AAP44003, e o último codifica uma proteína que possui
241 aminoácidos de comprimento (No. de acesso do GenBank NP_001078826).
[0055] O BTLA é um regulador negativo da resposta imune com um motivo inibidor C-terminal envolvido na inibição da produção de IL- 2 e expansão de células T (Watanabe et al., Nat.Immunol., 4, 670-679, 2003; Chemnitz et al, J. Immunol., 176, 6603-6614, 2006). Além disso, o BTLA humano pode ser um epítopo no domínio extracelular do BTLA que se liga especificamente ao anticorpo aqui divulgado.
[0056] A sequência de nucleotídeo extracelular de uma sequência específica de BTLA pode geralmente ter pelo menos 90% de identida- de com o domínio extracelular de BTLA humano apresentado na SEQ ID NO: 49 ou a sequência de nucleotídeo de outros isótipos e conter resíduos de aminoácido identificados como a sequência de aminoáci- do de seres humanos quando comparados com as sequências de aminoácido de BTLA de outras espécies (por exemplo, murino). Em alguns casos, o domínio extracelular de BTLA humano pode ter pelo menos 95%, ou mesmo pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% de iden- tidade com o domínio extracelular de BTLA humano apresentado na SEQ ID NO: 49, ou outros isótipos ou variantes.
[0057] O termo "resposta imune" refere-se à ação, tais como linfó- citos, de células apresentadoras de antígeno, fagócitos, granulócitos e macromoléculas solúveis produzidas pelas células acima ou fígado (incluindo anticorpos, citocinas e complemento), que resulta no dano, destruição ou eliminação de células ou tecidos invadidos ou infectados por patógenos, células cancerosas ou células ou tecidos humanos normais no caso de autoimunidade ou inflamação patológica do corpo.
[0058] Como aqui utilizado, o termo "anticorpo" refere-se a qual- quer forma de anticorpos tendo uma bioatividade desejada. Assim, é utilizado no sentido mais amplo e inclui especificamente, mas não está limitado a anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento total), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecífi- cos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), anticorpos humanizados, anticorpos totalmente humanos, anticorpos quiméricos e anticorpos de domínio único camelizados. Como aqui utilizado, o termo "anticorpo anti-BTLA" ou "fragmento de ligação ao antígeno" do anticorpo refere- se a um anticorpo que se liga ao BTLA e bloqueia a ligação de BTLA a HVEM, incluindo fragmentos ou derivados do anticorpo, tipicamente incluindo em pelo menos um fragmento de uma região de ligação ao antígeno ou uma região variável (por exemplo, uma ou mais CDRs) do anticorpo, que retém pelo menos algumas especificidades de ligação do anticorpo. Exemplos de fragmentos de ligação ao anticorpo inclu- em, mas não são limitados a estes, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia úni- ca, tais como sc-Fv; nanocorpos e anticorpos multiespecíficos forma- dos a partir de fragmentos de anticorpos. Um fragmento de ligação ou um derivado tipicamente retém pelo menos 10% de sua atividade de ligação ao BTLA quando a atividade de ligação ao BTLA é expressa em uma base de concentração molar. De preferência, um fragmento de ligação ou um derivado retém pelo menos 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% ou mais da afinidade de ligação ao BTLA do anti- corpo. É também contemplado que os fragmentos de ligação ao antí- geno anti-BTLA podem incluir substituições conservativas ou não con- servativas de aminoácidos (referidas como "variantes conservativas" ou "variantes conservativas de função" de anticorpos) que não alteram significativamente sua atividade biológica.
[0059] O termo "anticorpo isolado" refere-se ao estado purificado de um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e, neste caso, significa que a molécula está substancialmente livre de outras biomoléculas, tais como ácidos nucleicos, proteínas, lipídios, açúcares ou outras substâncias tais como resíduos celulares e meios de crescimento. O termo "isolado" não significa a ausência completa de tais substâncias ou a ausência de água, tampões ou sais, a menos que estejam presentes em uma quantidade que interfira significativa- mente com o uso experimental ou terapêutico dos anticorpos ou dos fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui descritos.
[0060] Como aqui utilizado, o termo "fragmento funcional" ou "fra- gmento de ligação ao antígeno" refere-se em particular a um fragmen- to de anticorpo tal como um fragmento Fv, um scFv, um Fab, um F(ab')2, um Fab', um scFv-Fc ou um diacorpo, ou qualquer fragmento capaz de aumentar a meia-vida através da modificação química, por exemplo, adição de poli(alquileno)glicol, tal como polietileno glicol ("PEGuilação") (fragmentos PEGuilados conhecidos como Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG ou Fab'-PEG) ("PEG "sendo polieti- leno glicol), ou através da incorporação em lipossomas, e o fragmento possui atividade de ligação a EGFR. De preferência, o fragmento fun- cional consiste em ou compreende uma parte da sequência da cadeia variável pesada ou leve do anticorpo a partir do qual é derivado, que é suficiente para reter a mesma especificidade de ligação e afinidade suficiente que o anticorpo do qual é derivado, que, para o BTLA, é pre- ferivelmente pelo menos 1/100, e mais preferivelmente pelo menos 1/10 da afinidade do anticorpo do qual é derivado. Esses fragmentos funcionais compreenderão pelo menos 5 aminoácidos, de preferência 10, 15, 25, 50 e 100 aminoácidos contíguos da sequência de anticorpo da qual são derivados.
[0061] Um "fragmento Fab" consiste em uma cadeia leve, um CH1 e uma região variável de uma cadeia pesada. A cadeia pesada de uma molécula Fab não pode formar uma ligação de dissulfeto com outra molécula de cadeia pesada.
[0062] Uma região "Fc" contém 2 fragmentos de cadeia pesada compreendendo os domínios CH1 e CH2 de um anticorpo. Os 2 frag-
mentos da cadeia pesada são mantidos juntos por duas ou mais liga- ções de dissulfeto e pela interação hidrofóbica dos domínios CH3.
[0063] Um "fragmento Fab'" contém uma cadeia leve e uma parte de cadeia pesada ou fragmento compreendendo o domínio VH, o do- mínio CH1 e a região entre os domínios CH1 e CH2, de tal modo que as ligações de dissulfeto intercadeias possam ser formadas entre 2 cadeias pesadas de 2 fragmentos Fab' para formar uma molécula F(ab')2.
[0064] Um "fragmento F(ab')2" contém 2 cadeias leves e 2 cadeias pesadas contendo uma parte da região constante entre os domínios CH1 e CH2, de tal modo que ligações de dissulfeto intercadeias sejam formadas entre as 2 cadeias pesadas. Assim, um fragmento F(ab’)2 consiste em 2 fragmentos Fab' mantidos juntos através de ligações de dissulfeto entre 2 cadeias pesadas.
[0065] Uma "região Fv" compreende regiões variáveis derivadas de cadeias tanto pesadas quanto leves, mas carece de regiões cons- tantes.
[0066] O termo anticorpo "Fv de cadeia única" ou "scFv" refere-se a um fragmento de anticorpo compreendendo os domínios VH e VL do anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma única ca- deia de polipeptídeo. Um polipeptídeo scFv também compreende tipi- camente um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL que per- mite que o scFv forme a estrutura desejada para ligação ao antígeno.
[0067] Um "anticorpo de domínio" é um fragmento de imunoglobu- lina imunofuncional que contém apenas a região variável de cadeia pesada ou da cadeia leve. Em alguns casos, duas ou mais regiões VH são covalentemente ligadas a um ligante peptídico para formar um an- ticorpo de domínio bivalente. As 2 regiões VH do anticorpo de domínio bivalente podem ter como alvo os mesmos antígenos ou antígenos diferentes.
[0068] Um "anticorpo bivalente" compreende 2 sítios de ligação ao antígeno. Em alguns casos, os 2 sítios de ligação possuem a mesma especificidade de antígeno. No entanto, um anticorpo bivalente pode ser biespecífico.
[0069] Como aqui utilizado, o termo "anticorpo anti-BTLA" refere- se a um anticorpo levantado contra o BTLA humano ou sua variante, ou qualquer fragmento de antígeno deste, salvo indicação em contrá- rio.
[0070] Como aqui utilizado, o termo "anticorpo monoclonal" refere- se a um anticorpo obtido de uma população substancialmente homo- gênea de anticorpos, isto é, os anticorpos que compõem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em pequenas quantidades. Um anticorpo monoclonal é altamente específico e tem como alvo um único epítopo de antígeno. Em contraste, as preparações de anticorpos convencio- nais (policlonais) tipicamente incluem um grande número de anticorpos que direcionam (ou específicos para) diferentes epítopos. O modifica- dor "monoclonal" indica o caráter de um anticorpo obtido de uma popu- lação substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser in- terpretado como produtor do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais aqui utilizados podem ser preparados pelo método do hibridoma ou método do DNA recombinan- te. "Anticorpos monoclonais" também podem ser isolados utilizando uma biblioteca de anticorpos de fago.
[0071] Em algumas modalidades, os anticorpos monoclonais in- cluem anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) em que uma parte da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências cor- respondentes de anticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpo específica, en- quanto que o restante da cadeia é idêntico ou homólogo às sequên-
cias correspondentes de anticorpos derivados de outra espécie ou per- tencentes à outra classe ou subclasse de anticorpos, assim como fra- gmentos de tais anticorpos, contanto que possuam a bioatividade de- sejada.
[0072] Como aqui utilizado, um "anticorpo quimérico" é um anti- corpo tendo os domínios variáveis de um primeiro anticorpo e os do- mínios constantes de um segundo anticorpo, em que o primeiro e o segundo anticorpos são de espécies diferentes. Tipicamente, o domí- nio variável é obtido a partir de um anticorpo de um animal experimen- tal tal como um roedor ("anticorpo precursor"), e a sequência de domí- nio constante é obtida a partir de um anticorpo humano, de tal modo que o anticorpo quimérico resultante é menos provável de induzir uma resposta imune adversa em um ser humano em comparação com o anticorpo de roedor precursor.
[0073] Em algumas modalidades, os anticorpos monoclonais nes- sa invenção incluem ainda anticorpos camelizados de domínio único. Ver, por exemplo, Muyldermans et al. (2001) Trends Biochem. Sci. 26: 230; Reichmann et al. (1999) J. Immunol. Methods 231: 25.
[0074] Como aqui utilizado, o termo "diacorpo" refere-se a um pe- queno fragmento de anticorpo tendo dois sítios de ligação ao antígeno, que compreende um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) em uma cadeia polipeptídica (VH-VL ou VL-VH). Ao utilizar um ligante que é muito curto para empa- relhar entre dois domínios em uma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares da outra cadeia para formar dois sítios de ligação ao antígeno.
[0075] Como utilizado nessa invenção, o termo "anticorpo humani- zado" refere-se a uma forma de anticorpo contendo sequências de an- ticorpos humanos e não humanos (tais como camundongo e rato). Em geral, um anticorpo humanizado compreende substancialmente todos de pelo menos um, e geralmente dois, domínios variáveis, em que to- das ou substancialmente todas as regiões hipervariáveis correspon- dem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substan- cialmente todas as regiões estruturais (FRs) são aquelas de uma se- quência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado pode compreender opcionalmente pelo menos uma parte de uma região constante de imunoglobulina humana (Fc).
[0076] No geral, a unidade estrutural básica do anticorpo é conhe- cida por compreender um tetrâmero. Cada tetrâmero compreende dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia "leve" (ao redor de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" (ao redor de 50 a 70 kDa). A parte amino-terminal ou fragmento de cada cadeia pode compreender uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais ami- noácidos principalmente responsáveis pelo reconhecimento do antíge- no. A parte carbóxi-terminal ou fragmento de cada cadeia pode definir uma região constante principalmente responsável pela função efetora. As cadeias leves humanas são geralmente classificadas como cadeias leves κ e λ. Além disso, as cadeias pesadas humanas são geralmente classificadas como μ, δ, γ, α ou ε, e os isótipos de anticorpos são defi- nidos como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro das ca- deias leve e pesada, as regiões variáveis e constantes são conectadas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, e a cadeia pesada também compreende uma região "D" de cerca de mais 10 aminoácidos. Ver de uma forma geral, Fundamental Immunology, Chap. 7 (Paul, W. ed., 2nd edition. Raven Press, N.Y. (1989)).
[0077] As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada são emparelhadas para formar um sítio de ligação do anticorpo. Assim, um anticorpo IgG completo tipicamente possui 2 sítios de ligação. Os 2 sítios de ligação são geralmente idênticos, exceto para aqueles de an- ticorpos bifuncionais ou biespecíficos.
[0078] Tipicamente, cada cadeia possui a mesma estrutura geral de regiões estruturais relativamente conservadas (FRs) conectadas por 3 regiões hipervariáveis (também conhecidas como regiões deter- minantes de complementaridade ou CDRs). As CDRs de 2 cadeias de cada par são tipicamente alinhadas pelas regiões estruturais para permitir a ligação a um epítopo particular. No geral, as cadeias tanto leves quanto pesadas compreendem os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4 do N-terminal ao C-terminal. Os aminoáci- dos de cada domínio são geralmente especificados de acordo com as definições nas seguintes literaturas: Sequences of Proteins of Immuno- logical Interest, Kabat et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md.; version 5; NIH publication No. 91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32: 1-75; Kabat et al. (1977) J. Biol. Chem. 252: 6609- 6616; Chothia et al. (1987) J Mol.Biol. 196: 901-917; ou Chothia et al. (1989) Nature 342: 878-883.
[0079] Conforme utilizado nessa invenção, o termo "região hiper- variável" refere-se a resíduos de aminoácido de um anticorpo respon- sável pela ligação ao antígeno. A região hipervariável compreende re- síduos de aminoácido de uma "região determinante de complementa- ridade" ou "CDR". Tal como aqui utilizado, o termo resíduo "estrutural" ou "FR" refere-se aos resíduos do domínio variável diferentes dos re- síduos da região hipervariável que são aqui definidos como resíduos CDR.
[0080] Uma "quantidade eficaz" inclui uma quantidade suficiente para melhorar ou prevenir um sintoma ou sinal de uma condição médi- ca. Uma quantidade eficaz também significa uma quantidade suficiente para permitir ou facilitar o diagnóstico. A quantidade eficaz para um paciente particular ou objeto veterinário pode variar dependendo de fatores como a condição a ser tratada, a saúde geral do paciente, a via e a dose de administração e a gravidade dos efeitos colaterais. Uma quantidade eficaz pode ser a dose máxima ou regime de administra- ção que evita efeitos colaterais significativos ou efeitos tóxicos. Os re- sultados podem resultar em uma melhoria na medição ou parâmetro de diagnóstico de pelo menos 5%, tipicamente pelo menos 10%, mais tipicamente pelo menos 20%, o mais típico pelo menos 30%, de prefe- rência pelo menos 40%, mais preferivelmente pelo menos 50%, o mais preferível pelo menos 60%, de forma ideal pelo menos 70%, de forma mais ideal pelo menos 80% e o mais ideal pelo menos 90%, em que 100% é definido como o parâmetro de diagnóstico apresentado por um indivíduo normal (ver, por exemplo, Maynard et al. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FL; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch publica- tion, London, UK).
[0081] "Homologia" refere-se à semelhança de sequência entre duas sequências de polinucleotídeo ou entre duas sequências de poli- peptídeo. Quando uma posição em duas sequências comparadas é ocupada pela mesma base ou subunidade de monômero de aminoáci- do, por exemplo, se uma posição em cada uma das duas moléculas de DNA é ocupada por adenina, as moléculas são homólogas nessa po- sição. A porcentagem de homologia entre duas sequências é uma fun- ção do número de posições emparelhadas ou homólogas partilhadas pelas duas sequências / o número de posições comparadas × 100%. Por exemplo, duas sequências são 60% homólogas se 6 das 10 posi- ções das duas forem correspondidas ou homólogas quando estiverem alinhadas de maneira ideal. As comparações são tipicamente efetua- das ao alinhar duas sequências para adquirir a porcentagem máxima de homologia.
[0082] Aqui, "distúrbio imunológico" inclui, tal como, inflamação patológica, distúrbios inflamatórios e distúrbios ou doenças autoimu- nes. "Doença imunológica" também refere-se às infecções, infecções persistentes e condições proliferativas tais como câncer, tumor e an- giogênese, incluindo infecções, tumores e cânceres que resistem à erradicação do sistema imunológico. "Condição cancerosa" inclui, tais como, cânceres, células cancerígenas, tumores, angiogênese e condi- ções pré-cancerosas tais como displasia. A "lesão imune" e a "condi- ção cancerosa" aqui descritas são de preferência ambas mediadas por BTLA.
[0083] "Distúrbio inflamatório" refere-se a um distúrbio ou condição patológica em que toda ou parte da patologia é provocada, por exem- plo, através de alterações no número, taxa de migração ou ativação de células do sistema imunológico. As células do sistema imunológico in- cluem, tais como, células T, células B, monócitos ou macrófagos, célu- las apresentadoras de antígeno (APCs), células dendríticas, microglia, células NK, células NKT, neutrófilos, eosinófilos, mastócitos ou qual- quer outra célula de particular relevância em imunologia, tais como cé- lulas endoteliais ou epiteliais produtoras de citocinas. O "distúrbio in- flamatório" aqui descrito é de preferência mediado por BTLA.
[0084] Uma "molécula de ácido nucleico isolada" refere-se a DNA ou RNA de origem genômica, mRNA, cDNA ou sintética, ou algumas combinações dos mesmos, que não está associada com a totalidade ou parte de um polinucleotídeo em que o polinucleotídeo isolado é de ocorrência natural, ou está ligado a um polinucleotídeo ao qual não está naturalmente ligado. Para os propósitos da presente invenção, deve ficar entendido que uma "molécula de ácido nucleico" "compre- endendo" uma sequência de nucleotídeo particular não inclui um cro- mossomo intacto. Além das sequências especificadas, uma molécula de ácido nucleico isolada "compreendendo" uma sequência de ácido nucleico especificada também pode incluir uma sequência de codifica- ção para até 10 ou mesmo até 20 ou mais de outras proteínas ou par- tes ou fragmentos das mesmas, ou pode também incluir uma sequên-
cia reguladora efetivamente ligada que controla a expressão das regi- ões de codificação das sequências de ácido nucleico citadas e/ou também pode incluir uma sequência de vetor.
[0085] Como aqui utilizadas, as expressões "célula", "linhagem celular" e "cultura celular" podem ser utilizadas de modo trocável e to- das essas designações incluem as suas progênies. Assim, os termos "transformante" e "célula transformada" incluem a célula primária do indivíduo e culturas derivadas dela independentemente do número de transferências. Também deve ficar entendido que o teor de DNA de todas as progênies pode não ser idêntico devido à mutação deliberada ou inadvertida. A progênie mutante selecionada para a mesma função ou bioatividade na célula originalmente transformada está incluída. Embora diferentes designações sejam especificadas, isso ficará claro no contexto.
[0086] A célula hospedeira aqui descrita pode ser uma célula hos- pedeira procariótica, uma célula hospedeira eucariótica ou um bacte- riófago. A célula hospedeira procariótica pode ser Escherichia coli, Ba- cillus subtilis, Streptomyces ou Proteus mirabilis, etc. A célula hospe- deira eucariótica pode ser fungos tais como Pichia pastoris, Saccha- romyces cerevisiae, Schizosaccharomyces e Trichoderma, células de insetos tais como Spodoptera frugiperda, células vegetais tais como tabaco e células de mamífero tais como células BHK, células CHO, células COS e células de mieloma. Em algumas modalidades, a célula hospedeira aqui descrita é de preferência uma célula de mamífero, mais preferivelmente uma célula BHK, uma célula CHO, uma célula NSO ou uma célula COS.
[0087] Como aqui utilizado, "reação em cadeia da polimerase" ou "PCR" geralmente requer que a informação da sequência no final ou além da região alvo deve estar disponível para que os iniciadores de oligonucleotídeo possam ser projetados; estes iniciadores podem ser idênticos ou similares na sequência aos filamentos opostos do modelo a ser amplificado. O nucleotídeo do terminal 5' dos 2 iniciadores pode coincidir com o final do material de amplificação. A PCR pode ser utili- zada para amplificar sequências de RNA específicas, sequências de DNA específicas de DNA genômico completo, cDNA transcrito de RNA celular total, sequências de fago ou plasmídeo, e similares. Ver de uma forma geral, Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263; Erlich ed. (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y). Como aqui utilizado, a PCR é considerada ser um exemplo (mas não o único) de um método de reação da polimerase de ácido nucleico para amplificar uma amostra de ácido nucleico e, no método, um ácido nucleico e uma polimerase de ácido nucleico conhecidas como inicia- dores são utilizados para amplificar ou gerar um fragmento de ácido nucleico específico. Anticorpo Específico de BTLA humano
[0088] Em geral, a presente invenção refere-se a anticorpos isola- dos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam ao BTLA e ao uso de tais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antí- geno dos mesmos. Mais especificamente, a presente invenção fornece anticorpos anti-BTLA isolados ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos e uso desses anticorpos ou fragmentos de ligação ao an- tígeno dos mesmos no tratamento e prevenção de doenças. Exemplos de anticorpos anti-BTLA incluem, mas não são limitados a estes, ch7, ch12, ch17, ch22, ch27, hu17, hu18 e hu19 aqui descritos.
[0089] A presente invenção fornece um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA hu- mano (atenuador de linfócitos B e T), compreendendo uma ou mais das seguintes propriedades: A) bloqueio da ligação de BTLA a HVEM (mediador de entrada de herpesvírus); B) reação cruzada com BTLA de macaco cinomolgo; e C) ligação ao BTLA humano com uma KD ≤
0,28 nM.
[0090] Em uma ou mais modalidades, o anticorpo isolado ou o fra- gmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA huma- no aqui fornecido compreende pelo menos uma CDR de cadeia leve selecionada das SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 22, 23, 24, 31, 32 e 33. Por exemplo, em algumas modalidades, a CDR de cadeia leve do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo que se liga ao BTLA humano aqui fornecido compre- ende uma LCDR1 que pode ser selecionada de qualquer uma das se- quências de CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 7, 10, 16, 22 e 31; em algumas modalidades, a CDR de cadeia leve do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui fornecido que se liga ao BTLA humano compreende uma LCDR2 que pode ser sele- cionada de qualquer uma das sequências de CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 8, 11, 17, 23 e 32; e a CDR de cadeia leve do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui forne- cido que se liga ao BTLA humano compreende uma LCDR3 que pode ser selecionada de qualquer uma das sequências de CDR apresenta- das nas SEQ ID NOs: 9, 12, 18, 24 e 33.
[0091] Em algumas modalidades, na CDR de cadeia leve do anti- corpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano aqui fornecido, a LCDR1 é selecionada de qualquer uma das sequências de CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 7, 10, 16, 22 e 31, a LCDR2 é selecionada de qualquer uma das sequências de CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 8, 11, 17, 23 e 32, e a LCDR3 é selecionada de qualquer uma das sequências de CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 9, 12, 18, 24 e 33.
[0092] Em algumas modalidades, no anticorpo isolado ou no frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano aqui fornecido, as sequências de aminoácido das LCDR1, LCDR2 e
LCDR3 da CDR da cadeia leve são selecionadas de qualquer um dos seguintes grupos de A a E: Grupo LCDR1 LCDR2 LCDR3 A SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 B SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 C SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18 D SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 24 E SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33
[0093] Em uma ou mais modalidades, o anticorpo isolado ou o fra- gmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA huma- no aqui fornecido compreende pelo menos uma CDR de cadeia pesa- da selecionada das SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 13, 14, 15, 19, 20, 21, 25, 26, 27, 28, 29 e 30. Por exemplo, em algumas modalidades, a CDR de cadeia pesada do anticorpo isolado ou do fragmento de liga- ção ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano fornecido nessa invenção compreende uma HCDR1 que pode ser selecionada a partir de qualquer uma das sequências de CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 4, 13, 19, 25 e 28; em algumas modalidades, a CDR de cadeia pesada do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano aqui fornecido com- preende uma HCDR2 que pode ser selecionada de qualquer uma das sequências de CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 2, 5, 14, 20, 26 e 29; e em algumas modalidades, a CDR de cadeia pesada do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui forne- cido que se liga ao BTLA humano compreende uma LCDR3 que pode ser selecionada de qualquer uma das sequências de CDR apresenta- das nas SEQ ID NOs: 3, 6, 15, 21, 27 e 30.
[0094] Em algumas modalidades, na CDR da cadeia pesada do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano aqui fornecido, a HCDR1 é selecionada de qualquer uma das sequências de CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 4, 13, 19, 25 e 28; a HCDR2 é selecionada de qualquer uma das sequências de CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 2, 5, 14, 20, 26 e 29; e a LCDR3 é selecionada de qualquer uma das sequências de CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 3, 6, 15, 21, 27 e 30.
[0095] Em uma ou mais modalidades, no anticorpo isolado ou no fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA hu- mano aqui fornecido, as sequências de aminoácido das HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da CDR de cadeia pesada são selecionadas a partir de qualquer um dos seguintes grupos de F a K: Grupo HCDR1 HCDR2 HCDR3 F SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 G SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 H SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15 I SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21 G SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 27 K SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 30
[0096] Em uma ou mais modalidades, na CDR de cadeia leve do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano aqui fornecido, a LCDR1 é selecionada de qualquer uma das sequências de CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 7, 10, 16, 22 e 31, a LCDR2 é selecionada de qualquer uma das sequências de CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 8, 11, 17, 23 e 32, e a LCDR3 é selecionada de qualquer uma das sequências de CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 9, 12, 18, 24 e 33; e na cadeia pesada do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano aqui fornecido, a HCDR1 é selecionada de qualquer uma das sequências de CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 4, 13, 19, 25 e 28, a HCDR2 é selecionada de qualquer uma das sequências de CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 2, 5, 14, 20, 26 e 29, e a HCDR3 é selecionada de qualquer uma das sequências de CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 3, 6, 15, 21, 27 e 30.
[0097] Em uma ou mais modalidades, no anticorpo isolado ou no fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA hu- mano aqui fornecido, as sequências de aminoácido das LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da CDR da cadeia leve são selecionadas a partir de qualquer um dos seguintes grupos de A a E: Grupo LCDR1 LCDR2 LCDR3 A SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 B SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 C SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18 D SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 24 E SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33 e/ou as sequências de aminoácido das HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da CDR de cadeia pesada são selecionadas de qualquer um dos seguin- tes grupos de F a K: Grupo HCDR1 HCDR2 HCDR3 F SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 G SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 H SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15 I SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21 G SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 27
K SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 30
[0098] Deve ficar entendido que cada sequência de CDR da ca- deia leve, em particular cada sequência de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 divulgada nesta invenção pode ser combinada arbitrariamente com cada sequência CDR da cadeia pesada, em particular cada sequência de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 divulgada nesta invenção. Por exemplo, qualquer uma das sequências aqui definidas como LCDR1 pode ser combinada com qualquer uma das sequências aqui definidas como LCDR2, qualquer uma das sequências aqui definidas como LCDR3, qualquer uma das sequências aqui definidas como HCDR1, qualquer uma das sequências aqui definidas como HCDR2 e qualquer uma das sequências aqui definidas como HCDR3 para formar os 6 domínios de CDR inteiros compreendidos pelo anticorpo isolado ou pelo fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano aqui descrito.
[0099] Assim, por exemplo, em uma ou mais modalidades, no an- ticorpo isolado ou no fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano aqui fornecido, as sequências de aminoácido das HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da CDR de cadeia pesada e as se- quências de aminoácido das LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da CDR de ca- deia leve são selecionadas de qualquer um dos seguintes grupos de I a IX: Grupo LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3 I SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 II SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 III SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15 IV SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21 V SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 27 VI SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 30 VII SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 VIII SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 IX SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15
[00100] Em uma ou mais modalidades, o anticorpo isolado ou o fra- gmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA huma- no aqui fornecido compreende uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, em que a sequência de amino- ácido da região variável de cadeia leve é selecionada das SEQ ID NOs: 36, 37, 39, 41, 44, 46, 47 e 48; e/ou a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada é selecionada das SEQ ID NOs: 34, 35, 38, 40, 42, 43 e 45.
[00101] Em uma ou mais modalidades, o anticorpo isolado aqui di- vulgado compreende uma região constante de cadeia pesada, de pre- ferência uma região constante humana, por exemplo, uma região constante de cadeia pesada humana γ1, γ2, γ3 ou γ4 ou uma variante da mesma. Em outra modalidade, o anticorpo isolado aqui divulgado compreende uma região constante da cadeia leve, de preferência uma região constante da cadeia leve humana, por exemplo, uma região de cadeia leve humana λ ou κ ou uma variante da mesma. A título de exemplo e não de limitação, a região constante da cadeia pesada hu- mana pode ser γ4 e a região constante da cadeia leve humana pode ser κ. Em uma modalidade, a região Fc do anticorpo pode ser γ4 com modificações conservativas ou substituições conservativas ou muta- ções conservativas.
[00102] Aqui, o termo "variante conservativamente modificada " ou "substituição conservativa" ou "mutação conservadora" refere-se à substituição de um aminoácido em uma proteína por outro aminoácido com propriedades similares (por exemplo, carga, tamanho da cadeia lateral, capacidade hidrofóbica / capacidade hidrófila, conformação e rigidez da estrutura principal), de tal modo que as alterações possam ser feitas com frequência, sem alterar a bioatividade da proteína. Aqueles versados na técnica reconhecem que a substituição de um único aminoácido na região não essencial de um polipeptídeo geral- mente não alterará significativamente a bioatividade (ver, por exemplo, Watson et al., (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benja- min/Cummings Pub.Co., page 224 (4th edition)). Além disso, as substi-
tuições de aminoácidos estrutural ou funcionalmente similares não são susceptíveis de destruir a bioatividade. Os anticorpos ou os seus fra- gmentos de ligação ao antígeno de várias modalidades da presente invenção compreendem cadeias polipeptídicas com as sequências que, quando comparadas com uma sequência de aminoácido particu- lar divulgada nesta invenção (por exemplo, SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 e 48), compreendem até 0 (sem alteração), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20 ou mais substituições conservadoras de aminoá- cidos; por exemplo, de 0 a 20 substituições de aminoácido, ou de 1 a 15, 1 a 10, 1 a 8 ou 1 a 5 substituições de aminoácido, ou substitui- ções totalizando um número em uma faixa que consiste em qualquer um de dois dos valores acima.
[00103] Assim, a presente invenção também fornece variantes con- servativas da função do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antí- geno aqui divulgado, isto é, variantes nas quais um ou mais resíduos de aminoácido no anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui divulgado são alterados sem alterar a conformação geral e a função do anticorpo, incluindo, mas não limitado à substituição de um aminoácido por um aminoácido com propriedades similares. Em geral, o número de substituições pode estar nas faixas descritas aci- ma, tais como de 0 a 20 substituições conservativas de aminoácido.
[00104] Em uma ou mais modalidades, o anticorpo isolado ou o fra- gmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA huma- no aqui divulgado é um anticorpo Fv de cadeia única; em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo Fab; em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo Fab'; e em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao an-
tígeno do mesmo é um anticorpo (Fab')2.
[00105] Em uma ou mais modalidades, a região variável de cadeia leve do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano aqui divulgado compreende uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 36, e a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 34 ou 35.
[00106] Em uma ou mais modalidades, a região variável de cadeia leve do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano aqui divulgado compreende uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 37, e a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 34 ou 35.
[00107] Em uma ou mais modalidades, a região variável de cadeia leve do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano aqui divulgado compreende uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 39, e a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 38.
[00108] Em uma ou mais modalidades, a região variável de cadeia leve do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano aqui divulgado compreende uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 41, e a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 40 ou 42.
[00109] Em uma ou mais modalidades, a região variável de cadeia leve do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano aqui divulgado compreende uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 44, e a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 43.
[00110] Em uma ou mais modalidades, a região variável de cadeia leve do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao BTLA humano aqui divulgado compreende uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 46. 47 ou 48, e a região variável da cadeia compreende um aminoácido apresentado na SEQ ID NO: 45.
[00111] A presente invenção também fornece um ácido nucleico isolado, por exemplo, DNA, que codifica um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui divulgado. Em al- gumas modalidades, o ácido nucleico isolado aqui divulgado codifica um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo pelo menos um domínio variável de cadeia leve (VL) de anticorpo maduro e pelo menos um domínio variável de cadeia pe- sada (VH) de anticorpo maduro, em que o domínio VL compreende pelo menos 3 CDRs tendo sequências selecionadas das SEQ ID NOs: 7 a 8, 10 a 12, 16 a 18, 22 a 24 e 31 a 33, e o domínio VH compreen- de pelo menos 3 CDRs tendo sequências selecionadas das SEQ ID NOs: 1 a 3, 4 a 6, 13 a 15, 19 a 21, 25 a 27 e 28 a 30. Em uma moda- lidade, o ácido nucleico isolado codifica sequências da região variável de cadeia leve e pesada maduras apresentadas na SEQ ID NO: 36 e na SEQ ID NO: 34, respectivamente. Em uma modalidade, o ácido nu- cleico isolado codifica sequências da região variável de cadeia leve e pesada maduras apresentadas na SEQ ID NO: 36 e na SEQ ID NO: 35, respectivamente. Em uma modalidade, o ácido nucleico isolado codifica sequências da região variável de cadeia leve e pesada madu- ras apresentadas na SEQ ID NO: 37 e na SEQ ID NO: 34, respectiva- mente. Em uma modalidade, o ácido nucleico isolado codifica sequên- cias da região variável de cadeia leve e pesada maduras apresentadas na SEQ ID NO: 37 e na SEQ ID NO: 35, respectivamente. Em uma modalidade, o ácido nucleico isolado codifica sequências da região variável de cadeia leve e pesada maduras apresentadas na SEQ ID NO: 39 e na SEQ ID NO: 38, respectivamente. Em uma modalidade, o ácido nucleico isolado codifica sequências da região variável de cadeia leve e pesada maduras apresentadas na SEQ ID NO: 41 e na SEQ ID NO: 40, respectivamente. Em uma modalidade, o ácido nucleico isola- do codifica sequências da região variável de cadeia leve e pesada maduras apresentadas na SEQ ID NO: 41 e na SEQ ID NO: 42, res- pectivamente. Em uma modalidade, o ácido nucleico isolado codifica sequências da região variável de cadeia leve e pesada maduras apre- sentadas na SEQ ID NO: 44 e na SEQ ID NO: 43, respectivamente. Em uma modalidade, o ácido nucleico isolado codifica sequências da região variável de cadeia leve e pesada maduras apresentadas na SEQ ID NO: 46 e na SEQ ID NO: 45, respectivamente. Em uma moda- lidade, o ácido nucleico isolado codifica sequências da região variável de cadeia leve e pesada maduras apresentadas na SEQ ID NO: 47 e na SEQ ID NO: 45, respectivamente. Em uma modalidade, o ácido nu- cleico isolado codifica sequências da região variável de cadeia leve e pesada maduras apresentadas na SEQ ID NO: 48 e na SEQ ID NO: 45, respectivamente. Em uma ou mais modalidades, o ácido nucleico isolado codifica tanto uma cadeia leve quanto uma cadeia pesada em uma única molécula de ácido nucleico, enquanto que em outras moda- lidades, o ácido nucleico isolado codifica uma cadeia leve e uma ca- deia pesada em duas ou mais moléculas de ácido nucleico indepen- dentes.
[00112] A presente invenção também fornece um vetor de expres- são que compreende o ácido nucleico isolado aqui divulgado. A pre- sente invenção também fornece uma célula hospedeira compreenden- do o vetor de expressão aqui divulgado. A presente invenção também refere-se a um método para produzir o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno aqui divulgado.
[00113] A presente invenção também se refere a um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao mesmo epítopo no BTLA humano como anticorpos ch7, ch12, ch17, ch22, ch27, hu17, hu18 e hu19 aqui descritos, por exemplo, um anticorpo que é capaz de bloqueio cruzado da ligação de qualquer um dos anti- corpos aqui divulgados. Doença e Tratamento ou Sua Prevenção
[00114] A presente invenção também fornece um método para tra- tar ou prevenir um indivíduo (incluindo um ser humano) com necessi- dade do tratamento com um anticorpo isolado ou um fragmento de li- gação ao antígeno do mesmo utilizando um anticorpo ou um fragmen- to de ligação ao antígeno do mesmo (de preferência um anticorpo hu- manizado) divulgado nessa invenção. O método de uma forma geral compreende a administração a um indivíduo com necessidade de uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalida- des da presente invenção. As vias de administração adequadas po- dem ser selecionadas conforme apropriado, incluindo, mas não limita- da a administração oral, intravenosa, subcutânea, intramuscular, intra- arterial, intra-articular (por exemplo, em articulações artríticas), por ina- lação, liberação de aerossol, intratumoral, e similares.
[00115] O indivíduo tipicamente sofre de doenças mediadas por BTLA, isto é, doenças que se beneficiam da eliminação, inibição ou redução da atividade de BTLA. Geralmente, as doenças mediadas por BTLA são todas as doenças associadas à imunossupressão, incluindo doenças autoimunes, rejeição de transplantes, tumores, e similares. Os tumores incluem melanoma, câncer de mama, câncer renal, câncer de próstata, câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer de pâncreas, câncer ósseo, câncer de pele, câncer de cabeça ou pescoço, câncer uterino, câncer de ovário, câncer retal, câncer anal, câncer de estôma- go, câncer testicular, câncer de esôfago, câncer de intestino delgado, câncer cervical, câncer vaginal, doença de Hodgkin, linfoma não Hod- gkin, câncer de esôfago, câncer do sistema endócrino, câncer de tire- oide, carcinoma da glândula adrenal, câncer de tecidos moles, câncer uretral, leucemia crônica ou aguda, leucemia mieloide crônica, leuce- mia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, tumor sólido infan- til, linfoma linfocítico, câncer de bexiga, câncer renal ou ureteral, cân- cer de pelve renal, neoplasias do sistema nervoso central, linfoma do sistema nervoso central primário, angiogênese tumoral, tumor do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, adenoma pituitário, sarcoma de Kaposi, carcinoma epidermoide, carcinoma de células escamosas, lin- foma de células T, cânceres induzidos pelo ambiente incluindo aqueles induzidos por amianto e combinações dos cânceres. As doenças au- toimunes incluem doenças autoimunes específicas de órgãos e doen- ças autoimunes sistêmicas; as doenças autoimunes específicas do órgão incluem tireoidite linfocítica crônica, hipertireoidismo, diabete melito insulino-dependente, miastenia gravis, colite ulcerativa, anemia perniciosa com gastrite atrófica crônica, síndrome de goodpasture, pênfigo vulgar, penfigoide, cirrose biliar primária, esclerose múltipla, polineurite idiopática aguda, e similares; e as doenças autoimunes sis- têmicas incluem lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, vas- culite sistêmica, esclerodermia, pênfigo, dermatomiosite, doença mista do tecido conjuntivo, anemia hemolítica autoimune, colite ulcerativa, e similares.
[00116] Esses tratamentos também podem incluir a administração de um ou mais outros agentes terapêuticos, tais como vacinas de tu- mor, agentes terapêuticos de quimioterapia de tumor padrão e outros indutores imunológicos. Kit
[00117] A presente invenção também fornece um kit que compre- ende componentes de uma combinação de fármacos aqui divulgada. O kit aqui divulgado compreende um ou mais componentes, incluindo, mas não limitado a um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao BTLA aqui descrito (por exemplo, anti- corpos ch7, ch12, ch17, ch22, ch27, hu17, hu18 e hu19, mas não limi- tado àqueles descritos acima) e um ou mais de outros componentes, incluindo, mas não limitado a um veículo farmaceuticamente aceitável e/ou um agente quimioterápico aqui descrito. Os anticorpos ou frag- mentos de ligação ao antígeno e/ou agentes quimioterápicos podem ser formulados em composições puras ou combinados com um veículo farmaceuticamente aceitável em composições farmacêuticas.
[00118] Em uma modalidade, um kit compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo divulgado nesta in- venção (por exemplo, anticorpos ch7, ch12, ch17, ch22, ch27, hu17, hu18 e hu19, mas não limitado àqueles descritos acima) ou uma com- posição farmacêutica do mesmo incluída em um recipiente (por exem- plo, um frasco de vidro ou plástico estéril) um recipiente (por exemplo, um frasco de vidro ou plástico estéril) e um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou uma composição farmacêutica do mesmo divulgada nesta invenção, e/ou um fármaco quimioterápico incluído em outro recipiente (por exemplo, um frasco de vidro ou plás- tico esterilizado).
[00119] Em outra modalidade da presente invenção, um kit com- preende uma combinação de fármacos aqui divulgada, compreenden- do um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno (por exem- plo, anticorpos ch7, ch12, ch17, ch22, ch27, hu17, hu18 e hu19, mas não limitado àqueles descritos acima) em um único recipiente comum,
juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável, opcional- mente em combinação com um ou mais componentes de um agente quimioterápico formulado em conjunto, opcionalmente em uma com- posição farmacêutica.
[00120] Um kit pode compreender uma bula que fornece informa- ções sobre a composição farmacêutica e a forma de dosagem no kit. Essas informações geralmente ajudam os pacientes e médicos a utili- zar a composição farmacêutica anexada e a forma de dosagem de maneira eficaz e segura. Por exemplo, as seguintes informações po- dem ser fornecidas na bula em relação ao fármaco de combinação aqui divulgado: farmacocinética, farmacodinâmica, estudos clínicos, parâmetros de eficácia, indicações e uso, contraindicações, avisos, precauções, reações adversas, uso excessivo, dosagem e administra- ção adequadas, especificações de fornecimento, condições de arma- zenamento adequadas, referências, informações do fabrican- te/atacadista e informações de patentes. Composição Farmacêutica e Administração
[00121] A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica compreendendo qualquer um dos anticorpos anti-BTLA humano ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui descritos. Como aqui utilizado, o termo "composição farmacêutica" re- fere-se a uma combinação de pelo menos um fármaco e, opcional- mente, um veículo farmaceuticamente aceitável ou um excipiente combinado entre si para atingir um determinado objetivo. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica inclui combinações separa- das temporal e/ou espacialmente, contanto que possam atuar em con- junto para atingir o objetivo da presente invenção. Por exemplo, os componentes compreendidos na composição farmacêutica (por exem- plo, o anticorpo, a molécula de ácido nucleico, a combinação de molé- culas de ácido nucleico e/ou o conjugado de acordo com a presente invenção) podem ser administrados a um indivíduo como um todo ou separadamente. Quando administrados a um indivíduo separadamen- te, os componentes compreendidos na composição farmacêutica po- dem ser administrados ao indivíduo simultânea ou sequencialmente. De preferência, o veículo farmaceuticamente aceitável é água, solu- ções tampão aquosas, soluções de sal isotônico tais como PBS (solu- ção salina de tampão de fosfato), glicose, manitol, dextrose, lactose, amido, estearato de magnésio, celulose, carbonato de magnésio, gli- cerol 0,3%, ácido hialurônico, etanol ou polialquileno glicóis tais como polipropileno glicol, triglicerídeos, e similares. O tipo do veículo farma- ceuticamente aceitável utilizado depende particularmente se a compo- sição de acordo com a presente invenção é formulada para adminis- tração oral nasal, intradérmica, subcutânea, intramuscular ou intrave- nosa. A composição de acordo com a presente invenção pode com- preender agentes umectantes, agentes emulsificantes ou substâncias tampão como aditivos. O imunoconjugado divulgado nesta invenção pode compreender um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades aqui conjugada com um agente terapêutico, de preferência uma imunotoxi- na, um radioisótopo, um medicamento ou um agente citotóxico conhe- cido na técnica e comumente utilizado na preparação de imunoconju- gados.
[00122] Para preparar uma composição farmacêutica ou estéril do anticorpo anti-BTLA humano ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui divulgado, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo pode ser misturado com um veículo farmaceuticamen- te aceitável ou um excipiente. Ver, por exemplo, Remington's Pharma- ceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984).
[00123] A composição farmacêutica aqui divulgada pode ser prepa-
rada em uma variedade de formas de dosagem adequadas conheci- das na técnica, incluindo, mas não limitado a pó liofilizado, pomada, solução aquosa ou suspensão, e similares. As formas de dosagem tais como pó liofilizado, pomada, solução aquosa ou suspensão do agente terapêutico e agente de diagnóstico podem ser preparadas através da mistura com um veículo, um excipiente ou um estabilizante aceitável (ver, por exemplo, Hardman et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY).
[00124] O regime de dosagem depende de vários fatores, incluindo a taxa de renovação do soro ou do tecido do anticorpo terapêutico, o nível de sintomas, a imunogenicidade do anticorpo terapêutico e a acessibilidade das células alvo na matriz biológica. De preferência, o regime de dosagem fornece anticorpos terapêuticos suficientes para atingir uma melhora no estado doentio alvo, minimizando os efeitos colaterais adversos. Assim, a quantidade de produtos biológicos admi- nistrados depende em parte do anticorpo terapêutico particular e da gravidade da condição a ser tratada. A orientação na seleção de doses apropriadas de anticorpo terapêutico está disponível (ver, por exemplo, Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Ox- fordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Mono- clonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Mar-
cel Dekker, New York, NY; Baert et al. (2003) New Engl. J. Med. 348: 601-608; Milgrom et al. (1999) New Engl. J. Med. 341: 1966-1973; Slamon et al. (2001) New Engl. J. Med. 344: 783-792; Beniaminovitz et al. (2000) New Engl. J. Med. 342: 613-619; Ghosh et al. (2003) New Engl. J. Med. 348: 24-32; Lipsky et al. (2000) New Engl. J. Med. 343: 1594-1602). Uso
[00125] A presente invenção fornece o uso do anticorpo anti-BTLA e do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades nessa invenção no tratamento, pre- venção e diagnóstico de doenças mediadas por BTLA. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece o anticorpo anti-BTLA e o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das modalidades nessa invenção para uso no tratamento, pre- venção e diagnóstico de doenças mediadas por BTLA.
EXEMPLOS
[00126] Os seguintes exemplos são fornecidos para demonstrar e ilustrar ainda mais algumas modalidades e aspectos preferidos da pre- sente invenção e não devem ser interpretados como limitativos do es- copo da presente invenção. Exemplo 1. Clonagem de Domínio Extracelular de BTLA Humano em Plasmídeo de Expressão Eucariótica
[00127] O plasmídeo HG11895-G-N contendo sequências de cDNA do gene BTLA humano foi adquirido da Sino Biological, e o fragmento extracelular de BTLA humano (sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 49) foi amplificado por PCR utilizando um iniciador di- reto 5'-gtacGCTCTTCATGTaaagaatcatgtgatgtacagcttta-3' (SEQ ID NO: 50) e um iniciador reverso 5'- gatcGCTCTTCTAGCatacaggagccagggtctgcttgcca-3' (SEQ ID NO: 51). Depois de digeridos por BSPQI, os fragmentos amplificados foram in-
seridos em um sistema de plasmídeo de expressão eucariótica auto- construído (HX1-FC) para gerar um plasmídeo de expressão da prote- ína de domínio extracelular de BTLA humano (hBTLA-ECD-FC). As células 293E foram transfectadas com este plasmídeo por PEI e, após 6 dias, o sobrenadante da cultura foi coletado e a proteína recombi- nante do domínio extracelular de BTLA humano (hBTLA-ECD-FC) foi purificada por cromatografia de afinidade.
[00128] A FIG. 1 mostra o eletroferograma SDS-PAGE da proteína de domínio extracelular de BTLA humano. Exemplo 2. Ensaio da Ligação de Proteína Recombinante hBTLA- ECD-FC a HVEM humano nas Células por FACS
[00129] Uma linhagem celular 293F estável (hHVEM-293F) expres- sando HVEM humano (Gene Bank: NP_003811.2) foi construída. A suspensão de células hHVEM-293F foi misturada com hBTLA marca- da com biotina (300 ng/ml) e incubada na temperatura ambiente du- rante 30 minutos. Após lavagem das células 3 vezes com um tampão FACS, 5 μg/ml de NA-PE foram adicionados e a mistura foi incubada durante 30 minutos. Após lavagem das células 3 vezes com um tam- pão FACS, a ligação da proteína BTLA recombinante a HVEM na su- perfície das células 293F foi testada e verificada por um citômetro de fluxo. Os resultados são mostrados na Fig. 2. Exemplo 3. Preparação de Anticorpo de Murino Anti-BTLA
3.1. Imunização de animais
[00130] A proteína recombinante hBTLA-ECD-FC obtida no Exem- plo 1 foi utilizada como um antígeno e misturada com uma quantidade igual de imunoadjuvante (adjuvante de Freund), e 5 camundongos Balb/c fêmeas com 6 semanas de idade foram submetidos à imuniza- ção subcutânea. A imunização de reforço foi executada a cada duas semanas após a imunização primária, totalizando 6 vezes de imuniza- ção.
3.2. Fusão celular
[00131] Após a injeção de reforço final, os gânglios linfáticos ingui- nais dos camundongos foram retirados e triturados em solução salina normal, e a suspensão rica em linfócitos foi retirada e fundida com cé- lulas SP2/0 de acordo com um método de eletroporação convencional (ver o manual do instrumento de eletroporação BTX). As células fundi- das foram cultivadas em meio DMEM completo (Corning) contendo HAT em CO2 8%, 37oC. Exemplo 4. Experimentos de Varredura nas Células de Hibridoma
[00132] Em 11.500 diferentes linhagens celulares de células de hi- bridoma policlonal, 560 clones que secretam anticorpos que se ligam à proteína de BTLA humano foram selecionados por ensaio imunossor- vente ligado a enzima (ELISA). Dos 560 clones, 33 clones foram capa- zes de se ligar ao BTLA expresso em células 293F; e destes 33 clo- nes, 16 clones tinham a capacidade de inibir a ligação de BTLA huma- no marcado com biotina ao HVEM em 293F. Os primeiros 4 destes 16 clones (2D12, 3B3, 3E3 e 6A7) estiveram principalmente envolvidos em experiências subsequentes e as experiências de varredura foram como se segue.
4.1. Ensaio sobre a ligação de anticorpos de hibridoma ao hBTLA por
ELISA
[00133] As linhagens celulares de hibridoma que secretam anticor- pos que se ligam ao hBTLA foram rastreadas por ELISA. Uma micro- placa de 384 cavidades foi revestida com 1 μg/ml de hBTLA e incuba- da durante a noite a 4°C. A solução nas cavidades foi então descarta- da e as cavidades foram lavadas 3 vezes com tampão de lavagem e bloqueadas durante 60 minutos com PBS contendo BSA 1%. Após se- rem lavadas 3 vezes com tampão de lavagem, as cavidades foram complementadas com o sobrenadante da cultura de hibridoma, incu- badas na temperatura ambiente durante 60 minutos e lavadas 3 vezes com o tampão de lavagem. Em seguida, o anticorpo secundário de IgG de anti-camundongo de cabra marcado com HRP diluído em 1:5000 foi adicionado e a mistura foi incubada na temperatura ambiente durante 30 minutos. Depois de lavar as cavidades três vezes com tampão de lavagem, 30 μl de solução de substrato TMB foram adicionados para desenvolvimento de cor na temperatura ambiente durante 10 minutos, e então a reação foi interrompida com 30 μl de solução de ácido clorí- drico (2M) e a absorbância foi lida em 450 nm.
4.2. Ensaio sobre a especificidade de espécie da ligação de anticorpos de hibridoma ao hBTLA por ELISA
[00134] As linhagens celulares de hibridoma que secretam anticor- pos que se ligam ao BTLA de macaco cinomolgo foram classificadas por ELISA. Uma microplaca de 96 cavidades foi revestida com 1 μg/ml de BTLA de cinomolgo e incubada na temperatura ambiente durante 60 minutos. A solução nas cavidades foi então descartada e as cavi- dades foram lavadas 3 vezes com tampão de lavagem e bloqueadas durante 60 minutos com PBS contendo BSA 1%. Após serem lavadas 3 vezes com tampão de lavagem, as cavidades foram adicionadas com o sobrenadante da cultura de hibridoma, incubadas na temperatu- ra ambiente durante 60 minutos e lavadas 3 vezes com o tampão de lavagem. Em seguida, anticorpo secundário de IgG anti-camundongo de cabra marcado com HRP diluído em 1:5000 foi adicionado e a mis- tura foi incubada na temperatura ambiente durante 30 minutos. Após lavagem das cavidades três vezes com tampão de lavagem, 100 μl de solução de substrato TMB foram adicionados para o desenvolvimento de cor na temperatura ambiente durante 10 minutos e depois a reação foi interrompida com 100 μl de solução de ácido clorídrico (2M) e a ab- sorbância foi lida em 450 nm.
4.3. Ensaio sobre o bloqueio de anticorpos de hibridoma da ligação de BTLA ao HVEM por FACS
[00135] O sobrenadante de cultura dos 33 anticorpos foi misturado com BTLA humano marcado com biotina (300 ng/ml) e incubado na temperatura ambiente durante 30 minutos. A mistura foi então incuba- da com uma suspensão da linhagem celular estável hHVEM-293F du- rante 30 minutos na temperatura ambiente. Após lavagem das células 3 vezes com um tampão FACS, 5 μg/ml de NA-PE foram adicionados e a mistura foi incubada durante 30 minutos. Após lavagem das célu- las 3 vezes com um tampão FACS, o bloqueio da ligação de BTLA humano a HVEM na superfície das células 293F por anticorpos secre- tados pelas células de hibridoma foi testado e verificado por um citô- metro de fluxo. Exemplo 5. Aquisição de Sequências da Região Variável de Anticor- pos Candidatos (Representado por Kabat ou IMGT)
[00136] As sequências de DNA das regiões variáveis dos anticor- pos de camundongo expressas pelos hibridomas candidatos foram de- terminadas utilizando um método de PCR baseado no iniciador dege- nerado. Resumidamente, as linhagens celulares de hibridoma foram expandidas separadamente, as células foram colhidas por centrifuga- ção em 1000 rpm e o RNA total foi extraído com Trizol. Após o primei- ro cDNA de fita ter sido sintetizado utilizando o RNA total como um modelo, a sequência de DNA de uma região variável correspondente foi amplificada por PCR utilizando o primeiro cDNA de fita como um modelo subseqüente, e os iniciadores de PCR utilizados são baseados em um grupo de iniciador de Ig. Após isolamento e purificação dos produtos de PCR e sequenciamento dos produtos amplificados, as se- quências da região variável de cadeia pesada e da região variável de cadeia leve do hibridoma candidato foram obtidas.
[00137] O NCBI Ig-Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/igblast/) foi utilizado para pesqui- sar sequências de consenso na linha germinativa e bancos de dados de sequência da região variável de Ig reorganizados. As regiões de- terminantes de complementaridade (CDRs) foram identificadas através da anotação de sequência e da análise de sequência baseada na In- ternet (http://www. Imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/index.html e http://www.ncbi.nlm.nih. gov/igblast/) baseado em Kabat (Wu, T.T and Kabat, E.A. 1970 J. Exp. Med., 132: 211-250) e IMGT system (Lefranc M.-P. et al., 1999 Nucleic Acids Research, 27, 209-212).
[00138] As sequências de aminoácido das regiões variáveis de ca- deia leve e pesada e CDRs codificadas nas células de hibridoma são mostradas abaixo (onde as CDRs expressas em negrito e sublinhadas são demarcadas com base no sistema de Kabat, e as CDRs expres- sas em itálico e negrito são demarcadas com base no sistema IMGT): 2D12 HC1 EVQLQQSGAELVKPGASVNLSCTASGFAIRDTYLHWVKQRPE- QVLEWTGRIDPANGNTKYDPRFQGKATLTADTSSNTAYLHLSS- LTSEDTAVYYCVADYYGSSLFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 34, sequências de 3 HCDRs correspondem às SEQ ID NOs: 1 a 3, respec- tivamente) 2D12 HC2 EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTVSGFNIKDSYIHWVKQRPE- QGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFRGKATITADASSNTAALQVSS- LTSEDTAVYFCVGDHYGSSLFDYWGHGTTLTVSS (SEQ ID NO: 35, sequências de 3 HCDRs correspondem às SEQ ID NOs: 4 a 6, respec- tivamente) 2D12 LC1 DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSD- GKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYVLSKLESGVPDRFTGVGSG- TDFTLKISRVEAVDLGVYYCWQGTHFPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 36, sequências de 3 LCDRs correspondem às SEQ ID NOs: 7 a 9, respectivamente)
2D12 LC2 EVVMTQTPLTLSVTIGQSASISCKSSQSLLDSD- GKTYLNWFLQRPGQSPKRLMHLVSKLDSGVPDRFTGSGSG- TDFTLKISGVEAEDLGVYYCWQGTYFPYTFGGGTKLETK (SEQ ID NO: 37, sequências de 3 LCDRs correspondem às SEQ ID NOs: 10 a 12, respectivamente) 3B3 HC EVQLQQSGADLVKPGASVKLSCTASGFNFKHTYAHWVKQRPE- QGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATMTADTASNAAFLQLSS- LTSEDTAVYYCVADHYGSSLLDYWGQGTSLTVSS (SEQ ID NO: 38, sequências de 3 HCDRs correspondem às SEQ ID NOs: 13 a 15, res- pectivamente) 3B3 LC DIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDINKYIAWYQHKPGKGPR- LLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGSDYSLTISSLESE- DSANYYCLQYATYAPPAVSIFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 39, se- quências de 3 LCDRs correspondem às SEQ ID NOs: 16 a 18, respec- tivamente) 3E3 HC1 EVQLQQSGADLVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYVHWVKQRPE- QGLEWIGRIDPANGHTKFDPKFQGKATITADTSSNTANLQISSLTSE- DTAVYYCVSDYYGSSLLDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 40, se- quências de 3 HCDRs correspondem às SEQ ID NOs: 19 a 21, res- pectivamente) 3E3 LC DPDSTHFVDYHWTTCLHLLQVQSEPPSEDGKTYLSWIFQM- FHLSPKRLIYVVSKLNSGVPVRLSANHSRTDFTLKISRVEAEDL- GVYYCWQGTHFPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 41, sequências de 3 LCDRs correspondem às SEQ ID NOs: 22 a 24, respectivamente) 3E3 HC2
EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTVSGFNIKDTYVHWVKQRPE- QGLEWIGRIDPANGHTKYDPKLQGTATITADTSSNTAYLQLSSLTSE- DTAVYYCATDYYGSSLLDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 42, se- quências de 3 HCDRs correspondem às SEQ ID NOs: 25 a 27, res- pectivamente) 6A7 HC EVHLQQSGTELMKPGASVKLSCTASGLNIRDTYMHWVKQRPE- QGLEWIGRIDPANGNTKFDPKFQGKATLTSDTSSNTAYLHFSS- LTSEDAAVYYCVSDHYGSSLLDYWGQGTSLTVSS (SEQ ID NO: 43, sequências de 3 HCDRs correspondem às SEQ ID NOs: 28 a 30, res- pectivamente) 6A7 LC DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDIKSYLSWYQQKPW- KSPKTLIYYATSLADGVPSRFSGSGSGQDYSLTITSLESDDTA- TYYCLQHGADAAPTVSIFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 44, sequências de 3 LCDRs correspondem às SEQ ID NOs: 31 a 33, respectivamente) Exemplo 6. Construção de Vetores de Expressão de Anticorpo Quimé- rico
[00139] Os genes da região variável de cadeia pesada e da região variável de cadeia leve do anticorpo de murino candidato foram fundi- dos ao N-terminal das regiões constantes da cadeia FC e κ de IgG4 humana, respectivamente, através de técnicas de PCR padrão, e inse- ridos em vetores pcDNA3.1 para construir plasmídeos de expressão de cadeias pesadas ou leves quiméricas. As células de expressão fo- ram transfectadas através da combinação de pares dos plasmídeos do vetor de expressão acima da cadeia pesada e da cadeia leve, seguido pela purificação e extração para adquirir os anticorpos quiméricos ch7, ch12, ch17, ch22 e ch27. As sequências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia leve e pesada e CDRs codificadas nas células de hibridoma são mostradas abaixo.
Anticorpo quimérico No. Cadeia/CDR Sequência No.
Cadeia pesada HCDR1 SEQ ID NO: 4 HCDR2 SEQ ID NO: 5 HCDR3 SEQ ID NO: 6 ch7 Cadeia leve LCDR1 SEQ ID NO: 10 LCDR2 SEQ ID NO: 11 LCDR3 SEQ ID NO: 12 Cadeia pesada HCDR1 SEQ ID NO: 13 HCDR2 SEQ ID NO: 14 HCDR3 SEQ ID NO: 15 ch12 Cadeia leve LCDR1 SEQ ID NO: 10 LCDR2 SEQ ID NO: 11 LCDR3 SEQ ID NO: 12 Cadeia pesada HCDR1 SEQ ID NO: 19 HCDR2 SEQ ID NO: 20 ch17 HCDR3 SEQ ID NO: 21 Cadeia leve LCDR1 SEQ ID NO: 10
Anticorpo quimérico No. Cadeia/CDR Sequência No.
LCDR2 SEQ ID NO: 11 LCDR3 SEQ ID NO: 12 Cadeia pesada HCDR1 SEQ ID NO: 25 HCDR2 SEQ ID NO: 26 HCDR3 SEQ ID NO: 27 ch22 Cadeia leve LCDR1 SEQ ID NO: 10 LCDR2 SEQ ID NO: 11 LCDR3 SEQ ID NO: 12 Cadeia pesada HCDR1 SEQ ID NO: 28 HCDR2 SEQ ID NO: 29 HCDR3 SEQ ID NO: 30 ch27 Cadeia leve LCDR1 SEQ ID NO: 10 LCDR2 SEQ ID NO: 11 LCDR3 SEQ ID NO: 12 Exemplo 7. Ensaio sobre a Ligação de Anticorpos Quiméricos ao hBTLA por ELISA
[00140] A capacidade de ligação dos anticorpos quiméricos ao hBTLA foi avaliada por ELISA. Uma microplaca de 96 cavidades foi revestida com 0,5 μg/ml de hBTLA e incubada a 37 °C durante 60 mi- nutos. A solução nas cavidades foi então descartada e as cavidades foram lavadas 3 vezes com tampão de lavagem e bloqueadas durante 60 minutos com PBS contendo BSA 2%. Depois de serem lavadas 3 vezes com tampão de lavagem, as cavidades foram complementadas com anticorpos gradativamente diluídos, incubadas a 37 °C durante 60 minutos e lavadas 3 vezes com tampão de lavagem antes de adicionar um anticorpo secundário de IgG4 anti-humano de camundongo mar- cado com HRP diluído em 1:10000. A mistura foi incubada a 37 °C du- rante 1 hora, lavada três vezes com tampão de lavagem e adicionada com 100 μl de solução de substrato TMB para desenvolvimento de cor na temperatura ambiente durante 30 minutos, depois a reação foi inter- rompida com 100 μl de solução de ácido clorídrico 2M e a absorbância foi lida em 450 nm.
[00141] Os resultados são mostrados na FIG. 3. Os anticorpos qui- méricos ch7, ch12, ch17, ch22 e ch27 podem se ligar especificamente ao hBTLA. Os valores de EC50 são mostrados na Tabela 1 abaixo. Tabela 1. Dados sobre a ligação específica de anticorpos quiméricos ao BTLA humana Anticorpo quimérico ch7 ch12 ch17 ch22 ch27 EC50 (ng/ml) 0,066 0,094 0,298 0,373 0,052 Exemplo 8. Ensaio sobre o Bloqueio de Anticorpos Quiméricos da Li- gação de BTLA a HVEM por FACS
[00142] A capacidade dos anticorpos quiméricos em bloquear a li- gação de hBTLA a hHVEM expresso nas células 293F foi testada por FACS. As células estáveis hHVEM-293F foram centrifugadas e colo- cadas novamente em suspensão em um tampão FACS após a diges- tão e, em seguida, adicionadas a uma placa de fundo redondo de 96 cavidades em uma densidade de 2,5 × 104 células/50 μl. Depois, as células foram misturadas com a proteína de hBTLA (1 μg/ml) anterior- mente marcada com biotina, incubadas a 4 °C durante 15 minutos, se- guido pela mistura com 50 μl de diluente de anticorpo quimérico (con-
centração inicial: 5 μg/ml, titulação 3 vezes) em diferentes concentra- ções e incubação na temperatura ambiente durante 30 minutos. De- pois de serem lavadas com um tampão FACS duas vezes, as células foram adicionadas com 100 μl de anticorpo anti-humano de cabra IgG- PE, incubadas durante 30 minutos longe da luz e testadas por FACS após duas lavagens com um tampão FACS. As células lavadas foram colocadas novamente em suspensão em tampão a 4 °C contendo io- deto de propídio (PI) e azida de sódio 0,02% que evita a internalização do receptor e analisadas por citometria de fluxo. As células viáveis fo- ram bloqueadas com base nas células PI positivas sendo excluídas do canal FSC/SSC e sua intensidade de fluorescência média geométrica (MFI) foi medida. Os dados foram analisados utilizando um modelo de dose-resposta sigmoide dentro do software Prism™.
[00143] Os resultados são mostrados na FIG. 4 e Tabela 2 abaixo. Os anticorpos quiméricos ch12, ch17, ch22 e ch27 podem bloquear efetivamente a ligação de BTLA humano a HVEM na superfície celular. Tabela 2 Anticorpo quimérico ch12 ch17 ch22 ch27 FACS, IC50 (ng/ml) 77,17 76,07 75,67 69,54 Exemplo 9. Ensaio sobre o Efeito de Anticorpos Quiméricos na Ativi- dade de células T pelo Gene Repórter de Luciferase
[00144] A ativação de células T foi alcançada através do estímulo dos receptores de células T (TCRs) que reconhecem peptídeos espe- cíficos apresentados pelasr proteínas de classe I ou classe II do com- plexo principal de histocompatibilidade nas células apresentadoras de antígenos (APCs). Em seguida, os TCRs ativados iniciaram uma cas- cata de eventos de sinalização que podem ser monitorados por genes repórter impulsionados por fatores de transcrição (tais como proteína ativadora-1 (AP-l), fator nuclear de células T ativadas (NFAT) ou inten- sificador da cadeia leve κ do fator nuclear de células B ativadas
(NFκb)). As respostas das células T foram reguladas pela composição ou indução do empenho de correceptores expressos nas células T. A proteína de morte celular programada (PD1) e BTLA são reguladores negativos da atividade das células T. PD-1 e BTLA interagem com seus ligantes (PD-L1) e HVEM, respectivamente, expressos em célu- las alvo incluindo APC ou células cancerosas, o que resulta na libera- ção de um sinal inibidor através do recrutamento de fosfatase para o sinalossomo de TCR, produzindo assim a inibição da sinalização posi- tiva. A sinalização de células T induzida pela interação entre APC e células T foi medida pela construção de duas linhagens celulares está- veis planejadas, células Jurkat (Jurkat/NFAT-Luc/hPD-1-hBTLA) e cé- lulas CHO (CHO/hPD-L1-hHVEM).
[00145] As células CHO expressando de forma estável hPD- L1/hHVEM foram espalhadas em uma placa de 96 cavidades em 5 × 104 células/cavidade e incubadas durante a noite a 37 °C, CO2 7%. Após remoção do sobrenadante celular, cada cavidade foi complemen- tada com 40 μl de diluente de anticorpo anti-BTLA quimérico (concen- tração inicial: 60 μg/ml, titulação 3 vezes) e 40 μl de células repórteres Jurkat capazes de expressar continuamente hPD-1/hBTLA/NFAT- luciferase, com o número total de células sendo 1 × 105 células. A mis- tura foi incubada durante 6 horas a 37 °C, CO2 7% e adicionada com o reagente de luciferase. Os valores de luminescência foram detectados por uma leitora de microplacas.
[00146] Os resultados são mostrados na FIG. 5 e Tabela 3 abaixo. Os anticorpos quiméricos ch12, ch17, ch22 e ch27 podem inibir significati- vamente a inibição da atividade das células T mediada por BTLA e PD-1. Tabela 3. Promoção eficaz da atividade de células T por anticorpos quiméricos Anticorpo quimérico ch12 ch17 ch22 ch27 Luciferase, EC50 (ng/ml) 300,6 370,6 912,4 278,6 Exemplo 10. Humanização de Anticorpos
[00147] A humanização foi realizada com base nas sequências da região variável dos anticorpos secretados pelas células de hibridoma obtidas acima.
Resumidamente, a humanização compreendeu as se- guintes etapas: A. comparação da sequência do gene do anticorpo se- cretado por cada célula de hibridoma com a sequência do gene do an- ticorpo embrionário humano para descobrir uma sequência com alta homologia; B. análise e inspeção da afinidade de HLA-DR e seleção de uma sequência estrutural embrionária humana com baixa afinidade; e C. análise das sequências de aminoácido estruturais das regiões va- riáveis e sua periferia utilizando uma tecnologia de simulação de com- putador e aplicação de ancoragem molecular para investigar seus mo- dos de combinação espaciaus e estéreos.
Os indivíduos de aminoáci- do essenciais que podem interagir com hBTLA e manter a estrutura espacial na sequência genética do anticorpo secretado por cada célula de hibridoma foram analisados pelo cálculo da força eletrostática, força de Van der Waals, hidrofilicidade e hidrofobicidade e valores de entro- pia, e enxertados de volta para dentro da estrutura genética embrioná- ria humana selecionada.
Em seguida, os sítios de aminoácido da regi- ão de estrutura que devem ser preservados foram mapeados e os an- ticorpos humanizados foram sintetizados (Pini, A. et al., (1998) design and use of a phage display library: human antibodies with 10 subna- nomolar affinity against a marker of angiogenesis eluted from a two- dimensional gel., Journal of Biological Chemistry, 273(34): 21769- 21776). Com base nisso, os seguintes anticorpos humanizados foram obtidos: clones hu17, hu18 e hu19. hu 17: Sequência de aminoácido de cadeia pesada SEQ ID NO: 45; Sequência de aminoácido de cadeia leve SEQ ID NO: 46; hu18: Sequência de aminoácido de cadeia pesada SEQ ID NO: 45;
Sequência de aminoácido de cadeia leve SEQ ID NO: 47; hu19: Sequência de aminoácido de cadeia pesada SEQ ID NO: 45; Sequência de aminoácido de cadeia leve SEQ ID NO: 48. Exemplo 11. Ensaio sobre a ligação de Anticorpos Humanizados ao hBTLA por ELISA
[00148] A especificidade de ligação dos anticorpos humanizados ao hBTLA foi determinada pelo método convencional de ELISA. Uma mi- croplaca de 96 cavidades foi revestida com 0,5 μg/ml de hBTLA e in- cubada a 37 °C durante 60 minutos. A solução nas cavidades foi então descartada e as cavidades foram lavadas 3 vezes com tampão de la- vagem e bloqueadas durante 60 minutos com PBS contendo BSA 2%. Depois de serem lavadas 3 vezes com tampão de lavagem, as cavida- des foram adicionadas com anticorpos gradativamente diluídos, incu- badas a 37°C durante 60 minutos e lavadas 3 vezes com tampão de lavagem antes de adicionar um anticorpo secundário de IgG4 anti- humano de camundongo marcado com HRP diluído em 1:10000. A mistura foi incubada a 37°C durante 1 hora, lavada três vezes com tampão de lavagem e adicionada com 100 μl de solução de substrato TMB para desenvolvimento de cor na temperatura ambiente durante 30 minutos, depois a reação foi interrompida com 100 μl de solução de ácido clorídrico 2M e a absorbância foi lida em 450 nm.
[00149] Os resultados são mostrados na FIG. 6. Os anticorpos hu- manizados hu17, hu18 e hu19 podem se ligar especificamente ao hBTLA. Os valores de EC50 são mostrados na Tabela 4 abaixo. Tabela 4. Dados sobre a ligação específica dos anticorpos humaniza- dos hu17, hu18 e hu19 ao hBTLA Anticorpo humanizado hu17 hu18 hu19 EC50 (ng/ml) 6,3 5,4 6,6 Exemplo 12. Ensaio sobre a Ligação de Anticorpos Humanizados ao hBTLA nas Células 293F por FACS
[00150] Os anticorpos anti-BTLA humanizados foram determinados quanto à sua capacidade de ligação ao hBTLA expresso nas células utilizando citometria de fluxo baseada em células (FACS). As células 293F que expressam hBTLA foram centrifugadas e colocadas nova- mente em suspensão em um tampão de FACS após a digestão e, em seguida, adicionadas a uma placa de fundo redondo de 96 cavidades em uma densidade de 2,5 × 104/50 μl. Depois as células foram mistu- radas com 50 μl de diluente de anticorpo em diferentes concentrações (concentração inicial: 10 μg/ml, titulação 3 vezes) e incubadas na tem- peratura ambiente durante 30 minutos. Depois de serem lavadas com um tampão de FACS duas vezes, as células foram adicionadas com 100 μl de anticorpo anti-humano de cabra IgG-PE, incubadas durante 30 minutos longe da luz e testadas por FACS após duas lavagens com um tampão de FACS. As células lavadas foram colocadas novamente em suspensão em tampão a 4 °C contendo iodeto de propídio (PI) e azida de sódio 0,02% que evita a internalização do receptor e analisa- das por citometria de fluxo. As células viáveis foram bloqueadas com base nas células PI positivas sendo excluídas do canal FSC/SSC e sua intensidade de fluorescência média geométrica foi medida. Os da- dos foram analisados utilizando um modelo de dose-resposta sigmoide dentro do software Prism™.
[00151] Os resultados são mostrados na figura. 7. Os anticorpos humanizados hu17, hu18 e hu19 podem se ligar efetivamente ao hBTLA nas células 293. Os valores de EC50 para cada anticorpo são mostrados na Tabela 5 abaixo. Tabela 5 hu17 hu18 hu19 ch12 EC50 (ng/ml) 96,74 89,34 95,06 88,12
Exemplo 13. Ensaio sobre o Bloqueio de Anticorpos Humanizados da Ligação de BTLA ao HVEM por FACS
[00152] Os anticorpos humanizados foram determinados quanto à sua capacidade de bloquear a ligação de hBTLA ao hHVEM expresso em células 293F utilizando ensaio de citometria de fluxo baseado na célula (FACS). As células estáveis hHVEM-293F foram centrifugadas e colocadas novamente em suspensão em um tampão de FACS após a digestão e, em seguida, adicionadas a uma placa de fundo redondo de 96 cavidades em uma densidade de 2,5 × 104 células/50 μl. Depois as células foram misturadas com proteína de hBTLA (1 μg/ml) anterior- mente marcada com biotina, incubadas a 4 °C durante 15 minutos, se- guido de mistura com 50 μl de diluente de anticorpo humanizado (con- centração inicial: 5 μg/ml, titulação 3 vezes) em diferentes concentra- ções, e incubação na temperatura ambiente durante 30 minutos. De- pois de serem lavadas com um tampão de FACS duas vezes, as célu- las foram adicionadas com 100 μl de anticorpo anti-humano de cabra IgG-PE, incubadas durante 30 minutos longe da luz e testadas por FACS após duas lavagens com um tampão de FACS. As células lava- das foram colocadas novamente em suspensão em tampão a 4 °C contendo iodeto de propídio (PI) e azida de sódio 0,02% que evita a internalização do receptor e analisadas por citometria de fluxo. As cé- lulas viáveis foram bloqueadas com base nas células PI positivas sen- do excluídas do canal FSC/SSC e sua intensidade de fluorescência média geométrica foi medida. Os dados foram analisados utilizando um modelo de dose-resposta sigmoide dentro do software Prism™.
[00153] Os resultados são mostrados na FIG. 8. Os anticorpos qui- méricos hu17, hu18 e hu19 podem bloquear efetivamente a ligação do BTLA humano ao HVEM na superfície celular. Os valores de IC50 para cada anticorpo são mostrados na Tabela 6 abaixo. Tabela 6 hu17 hu18 hu19 ch12 IC50 (ng/ml) 142,7 172,2 161,5 156,9 Exemplo 14. Promoção da Ativação de Células T por Anticorpos Anti- BTLA Humanizados
[00154] As células CHO expressando de forma estável hPD- L1/hHVEM foram dispersas em uma placa de 96 cavidades a 5 × 104 células/cavidade e incubadas durante a noite a 37 °C, CO2 7%. Após a remoção do sobrenadante celular, cada cavidade foi complementada com 40 μl de diluente de anticorpo anti-BTLA humanizado (concentra- ção inicial: 60 μg/ml, diluição gradiente de 3 vezes) e 40 μl de células repórteres Jurkat capazes de expressar continuamente hPD- 1/hBTLA/NFAT-luciferase, com o número total de células sendo 1 × 105 células. A mistura foi incubada durante 6 horas a 37 °C, CO 2 7% e adicionada com o reagente de luciferase. Os valores de luminescência foram detectados por uma leitora de microplacas.
[00155] Os resultados são mostrados na FIG. 9. Os anticorpos anti- BTLA humanizados hu17 e hu18 podem efetivamente promover a ati- vação de células T. Os valores de EC50 para cada anticorpo são mos- trados na Tabela 7 abaixo. Tabela 7 hu17 hu18 hu19 ch12 EC50 (ng/ml) 256,7 277,3 290,4 138,7 Exemplo 15. A Afinidade de Anticorpos Anti-BTLA Humanizados para hBTLA
[00156] O ensaio foi realizado utilizando um instrumento Biacore T200 (GE Healthcare). O chip Série S CM5 foi carregado no instru- mento e o tampão do sistema utilizado foi HBS-EP+ (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensoativo P20 0,05%). Os antí- genos BTLA-Fc foram acoplados em um canal de detecção do chip: injetar uma solução mista de EDC 400 mM e NHS 100 mM em 10 μl/min durante 420 s para ativar a superfície do chip, diluir os antíge- nos BTLA-Fc em um tampão de acetato de sódio/ácido acético 10 mM (pH 5,5) para uma concentração final de 20 µg/ml e injeção de 10 μl/min para acoplamento, e injetar uma solução de etanolamina-ácido clorídrico 1M (pH 8,5) em 10 μl/min durante 420 s para bloqueio.
[00157] Os anticorpos foram diluídos em um gradiente de 2 vezes com tampão do sistema Biacore para um total de 6 pontos de concen- tração. Os gradientes de concentração foram 24 nM, 12 nM, 6 nM, 3 nM, 1,5 nM e 0,75 nM, com 24 nM sendo uma réplica. Os dados foram analisados utilizando o Biacore T200 Evaluation Software (versão no.
3.0, GE Healthcare). Os dados foram ajustados utilizando um modelo de ligação 1:1. As constantes cinéticas da ligação dos anticorpos aos antígenos, isto é, a constante do índice de associação ka (1/Ms), cons- tante do índice de dissociação kd (1/s) e a constante de afinidade kd (M), foram obtidas por ajuste, e os resultados são mostrados na Tabe- la 8. Tabela 8. Dados de afinidade para anticorpos humanizados KA (1/Ms) KD (1/s) KD (M) hu17 6,24E+05 1,16E-04 1,86E-10 hu18 6,39E+05 8,67E-05 1,36E-10 Exemplo 16. Caracterização da Cinética de Ligação de Anticorpos Humanizados a BTLAs de Espécies Diferentes
[00158] Para detectar a reatividade cruzada entre anticorpos quimé- ricos e BTLAs de cinomolgo e murino, o ensaio Fortebio foi utilizado. Resumidamente, BTLA humano, BTLA de cinomolgo ou BTLA de mu- rino foi acoplado a um chip biossensor CM5 ativado para atingir apro- ximadamente 100 a 200 unidades de resposta (RUs) e, em seguida, os grupos não reagidos foram bloqueados com etanolamina IM. Amos- tras de anticorpos humanizados em concentrações crescentes de 0,12 nM a 90 nM em 30 vezes foram injetadas por minuto no tampão de operação de SPR e as respostas de ligação em BTLAs de diferentes espécies foram calculadas subtraindo a RU da célula de fluxo em branco.
[00159] Os resultados são mostrados na figura. 10. Resultados comparativos da ligação de hu17 a BTLAs de diferentes espécies mos- tram que: hu17 não só possui alta afinidade com relação ao BTLA hu- mano, mas também tem afinidade semelhante com relação ao BTLA de macaco cinomolgo, e mal se liga ao BTLA de murino. Exemplo 17. Inibição do Crescimento de Tumor em Camundongos através de Anticorpos Humanizados
[00160] O banco de células MC38-hHVME foi criado em células MC38 (ATCC) através da eletroporação de plasmídeos Hxp-hHVEM, as células foram subclonadas pelo método de diluição limitativa e os monoclones foram classificados por citometria de fluxo para adquirir células MC38-HVEM. As células MC38-HVEM foram inoculadas no tecido subcutâneo direito dos camundongos B-HBTLA fêmeas huma- nizados em 1 × 106 células/0,1 ml, e quando os tumores cresceram para aproximadamente 118 mm3, os camundongos foram agrupados aleatoriamente, por volume de tumor, em 5 grupos (8 camundongos por grupo), a saber, grupo de controle de solvente de injeção de clore- to de sódio a 0,9% G1, grupo de controle negativo G2 KLH (10 mg/kg) G2, grupo de hu18 (1 mg/kg) G3, grupo de hu18 (3 mg/kg) G4 e grupo de hu18 (10 mg/kg) G5. Todos os grupos foram submetidos à adminis- tração por injeção intraperitoneal duas vezes por semana durante 7 vezes consecutivas, e o experimento terminou 4 dias após a última administração. O volume do tumor e o peso corporal dos camundon- gos foram medidos e registrados duas vezes por semana. No final do experimento, os animais foram sacrificados, os tumores foram retira- dos, pesados e fotografados, e a inibição relativa do tumor (TGITW%) foi calculada.
[00161] O efeito de cada amostra sobre o volume do tumor de ca- mundongos B-hBTLA transplantados com células MC38-hHVEM é mostrado na Tabela 9 e FIG. 11. 21 dias após a primeira administra- ção, o grupo de controle negativo KLH (10 mg/kg) teve um volume tu- moral médio de 1560 ± 256 mm3, e os outros grupos de dosagem tive- ram volumes tumorais médios de 1073 ± 224 mm3, 747 ± 268 mm3 e 868 ± 211 mm3, respectivamente. Em comparação com o grupo de controle negativo KLH, os outros grupos de dosagem tiveram o TGITV% de 33,7%, 56,4% e 48,0%, respectivamente, e valores P de 0,175, 0,046 e 0,056, respectivamente, indicando que o fármaco de teste hu18 possui um certo efeito inibidor sobre o crescimento do tu- mor em um nível de dose de 3 mg/kg. Tabela 9. Efeito de hu18 sobre o volume tumoral de camundongos B- hBTLA transplantados com células MC38-hHVEM Fármaco de teste Volume do tumor (mm3)a Pb Grupo Antes da administra- 21 dias após a primeira adminis- TGI ção tração (%) Injeção de cloreto de G1 118 ± 2 1029 ± 155 - - sódio 0,9% G2 KLH (10 mg/kg) 118 ± 2 1560 ± 256 - - G3 hu18 (1 mg/kg) 118 ± 3 1073 ± 224 33,7 0,175 G4 JS004 (3 mg/kg) 118 ± 2 747 ± 268 56,4 0,046 G5 JS004 (10 mg/kg) 118 ± 3 868 ± 211 48,0 0,056 Nota: a: média ± erro padrão; b: volumes de tumor dos grupos de do- sagem comparados estatisticamente com aqueles do grupo de contro- le negativo KLH 21 dias após a administração, teste t.
[00162] Os resultados do efeito de cada amostra no peso corporal de camundongos B-hBTLA transplantados com células MC38-hHVEM são mostrados na Tabela 10 e FIG. 12. Todos os animais experimen- tais estavam bem ativos e alimentados durante a administração, e o peso corporal dos animais em cada grupo de dosagem aumentou até certo ponto. Nenhuma mortalidade dos animais experimentais ocorreu durante o experimento. Em comparação com o peso corporal dos ca- mundongos no grupo de controle negativo KLH, o peso corporal dos camundongos em cada grupo de dosagem não teve alteração signifi- cativa (P ＞ 0,05) 21 dias após a administração, indicando que os ani- mais experimentais possuem boa tolerância às amostras. Tabela 10. Efeito das amostras no peso corporal de camundongos B- hBTLA transplantados com células MC38-hHVEM Alteração do peso corporal (g) 21 dias Peso corporal (g)a após a administração Grupo Fármaco de teste Antes da adminis- 21 dias após a primeira Pb tração administração Injeção de cloreto de G1 18,4 ± 0,4 20,7 ± 0,4 - +2,3 sódio 0,9% G2 KLH (10 mg/kg) 18,3 ± 0,5 20,8 ± 0,6 - +2,5 G3 hu18 (1 mg/kg) 18,5 ± 0,4 20,8 ± 0,4 0,943 +2,3 G4 hu18 (3 mg/kg) 18,5 ± 0,4 20,0 ± 0,6 0,341 +1,5 G5 hu184 (10 mg/kg) 18,6 ± 0,3 20,5 ± 0,2 0,623 +1,9 Nota: a: média ± erro padrão; b: pesos corporais dos grupos de dosa- gem comparados estatisticamente com aqueles do grupo de controle negativo KLH 21 dias após a administração, teste t. Exemplo 18. Anticorpo Humanizado hu18 sem Função Efetora de
ADCC
[00163] A ADCC é iniciada quando um anticorpo se liga a uma pro- teína alvo da superfície celular e, em seguida, se liga a um receptor Fc γ (FcγR) expresso nas células efetoras. Está claramente documentado que a IgG1 humana possui afinidade de ligação significativamente maior para FcγR do que a IgG4, particularmente com relação a FcγR-I e FcγR-IIIA, que se correlaciona com a força de IgG1 para ativar a ADCC. Em conjunto com a ADCC, a CDC é ativada quando os anti- corpos reticulam o alvo da superfície celular e a proteína C1q, seguido por uma reação em cascata de formação do complexo do complemen- to e lise da célula alvo. Como um substituto para ADCC e CDC, a de- tecção da ligação do anticorpo a FcγR e C1q pode servir como indica-
dores básicos de ADCC e CDC. Assim, na presente invenção, a afini- dade de ligação cinética de mAbs com relação aos principais FcγRs foi avaliada utilizando biacore T200 (GE).
[00164] O anticorpo anti-His (GE) foi imobilizado na lâmina do sen- sor. Vários receptores Fc, incluindo FcγRIIIA humano recombinante (CD16a) V176, FcγRIIA humano recombinante (CD32a) R167, FcγRI humano recombinante (CD64) e FcRn humano recombinante, foram capturados, depois uma série de anticorpos anti-BTLA humanos re- combinantes diluídos (ou seja, hu18) foram injetados, e as proprieda- des de ligação das interações foram examinadas e analisadas. hu18 é um subtipo de IgG4 e hu18-IgG1 é um subtipo de IgG1 que comparti- lha o mesmo Fab como o hu18 e serve como um controle positivo.
[00165] Conforme mostrado na Tabela 11, a ligação do anticorpo anti-BTLA humano recombinante do subtipo IgG4 aos receptores Fc foi relativamente fraca em comparação com aquela do anticorpo con- trole do subtipo de IgG1, e a interação do anticorpo hu18 com FcγRIIIA (CD16a) V176 foi 400 vezes mais fraca em comparação com aquela do anticorpo de controle do subtipo de IgG1. Isso sugere que o hu18 possui fraco ou nenhum efeito de ADCC. Como mostrado na Tabela 12, o anticorpo hu18 não se ligou a C1q, enquanto que o anticorpo hu18-IgG1 foi capaz de se ligar a C1q. Tabela 11. A afinidade de ligação da interação entre anticorpos anti- BTLA e receptores Fc Receptor Fc Anticorpo Ka (1/Ms) Kd (1/s) KD (M) FcγRIIIA (CD16a)V176 hu18-IgG1 6,15E+04 8,85E-03 1,44E-07 hu18 N/A N/A 6,02E-05 FcγRIIA (CD32a)R167 hu18-IgG1 N/A N/A 5,90E-06 hu18 N/A N/A 4,06E-05 FcγRI (CD64) hu18-IgG1 2,99E+05 1,20E-03 4,00E-09 hu18 2,10E+05 3,87E-03 1,84E-08 FcRn hu18-IgG1 1,69E+06 3,88E-02 2,29E-08 hu18 5,12E+05 7,08E-02 1,38E-07
Tabela 12. A afinidade de ligação da interação entre anticorpos anti- BTLA e C1q humano Proteína Anticorpo Conclusão hu18-IgG1 Ligação específica C1q hu18 Ligação não específica

Claims (13)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antíge- no do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: pelo me- nos um domínio da CDR de cadeia leve selecionado das SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 22, 23, 24, 31, 32 e 33, e/ou pelo menos um domínio da CDR de cadeia pesada selecionado das SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 13, 14, 15, 19, 20, 21, 25, 26, 27, 28, 29 e 30.
2. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a CDR de cadeia leve do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma LCDR1 selecionada de qualquer uma das sequências de CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 7, 10, 16, 22 e 31, uma LCDR2 selecionada de qualquer uma das sequências de CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 8, 11, 17, 23 e 32, e/ou uma LCDR3 selecionada de qualquer uma das sequências de CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 9, 12, 18, 24 e 33; e/ou a CDR de cadeia pesada do anticorpo isolado ou do fragmento de li- gação ao antígeno do mesmo compreende uma HCDR1 selecionada de qualquer uma das sequências de CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 4, 13, 19, 25 e 28, uma HCDR2 selecionada de qualquer uma das sequências de CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 2, 5, 14, 20, 26 e 29, e/ou uma HCDR3 selecionada de qualquer uma das sequên- cias de CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 3, 6, 15, 21, 27 e 30.
3. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que, na CDR de cadeia leve do anticorpo isolado ou do fragmento de liga- ção ao antígeno do mesmo, a LCDR1 é selecionada de qualquer uma das sequências de CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 7, 10, 16, 22 e 31, a LCDR2 é selecionada de qualquer uma das sequências de
CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 8, 11, 17, 23 e 32, e a LCDR3 é selecionada de qualquer uma das sequências de CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 9, 12, 18, 24 e 33; e/ou na CDR de cadeia pesada do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, a HCDR1 é selecionada qualquer uma das sequências de CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 4, 13, 19, 25 e 28, a HCDR2 é selecionada de qualquer uma das sequências de CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 2, 5, 14, 20, 26 e 29, e a HCDR3 é selecionada de qualquer uma das sequências de CDR apresentadas nas SEQ ID NOs: 3, 6, 15, 21, 27 e 30.
4. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que, as sequências de aminoácido das LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da CDR de cadeia leve do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao an- tígeno do mesmo são selecionadas de qualquer um dos seguintes grupos A a E: Grupo LCDR1 LCDR2 LCDR3 A SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 B SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 C SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18 D SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 24 E SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33 e/ou as sequências de aminoácido das HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da CDR de cadeia pesada do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo são selecionadas de qualquer um dos seguintes grupos F a K:
Grupo HCDR1 HCDR2 HCDR3 F SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 G SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 H SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15 I SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21 G SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 27 K SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 30
5. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as sequências de aminoácido das LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da CDR de cadeia leve e as sequências de aminoácido das HCDR1, HCDR2 e HCDR3 da CDR de cadeia pesada do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo são selecionadas de qualquer um dos seguintes grupos I a IX: Grupo LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3 I SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 II SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 III SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15 IV SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21 V SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 27 VI SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 30 VII SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 VIII SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 IX SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15
6. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoáci- do selecionada de qualquer uma das sequências de aminoácido apre- sentadas nas SEQ ID NOs: 36, 37, 39, 41, 44, 46, 47 e 48; e/ou uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de ami-
noácido selecionada de qualquer uma das sequências de aminoácido apresentadas nas SEQ ID NOs: 34, 35, 38, 40, 42, 43 e 45.
7. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que, a região variável de cadeia leve do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 36, e a região variável de ca- deia pesada compreende uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 34 ou 35; a região variável de cadeia leve do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 37, e a região variável de ca- deia pesada compreende uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 34 ou 35; a região variável de cadeia leve do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 39, e a região variável de ca- deia pesada compreende uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 38; a região variável de cadeia leve do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 41, e a região variável de ca- deia pesada compreende uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 40 ou 42; a região variável de cadeia leve do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 44, e a região variável de ca- deia pesada compreende uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 43; ou a região variável de cadeia leve do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 46, 47 ou 48, e a região vari- ável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 45.
8. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ca- racterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo totalmente humano.
9. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que é selecionado de: (1) uma sequência de polinucleotídeo que codifica o anticorpo isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7; e (2) uma sequência complementar da sequência de polinucleotídeo de (1).
10. Vetor de expressão ou célula hospedeira compreen- dendo o vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que o vetor de expressão compreende o ácido nucleico isolado como definido na rei- vindicação 9.
11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo isolado ou o fragmento de ligação ao an- tígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, o ácido nucleico como definido na reivindicação 9, o vetor de expressão ou célula hospedeira como definidos na reivindicação 10, ou qualquer combinação dos mesmos.
12. Uso do anticorpo isolado ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 7, ácido nucleico como definido na reivindicação 9, ou vetor de expressão ou célula hospedeira como definidos na reivindicação
10, caracterizado pelo fato de que o uso é na preparação de um medi- camento para o tratamento ou prevenção de doenças mediadas por BTLA.
13. Imunoconjugado, caracterizado pelo fato de que com- preende o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 conjugado com um agente terapêutico, de preferência o agente terapêutico sendo uma toxina, um radioisótopo, um medicamento ou um agente citotóxi- co.
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