KR20120098783A - 인간 ｉｌ-２２ｒａ에 대한 인간화된 항체 - Google Patents

인간 ｉｌ-２２ｒａ에 대한 인간화된 항체 Download PDF

Info

Publication number
KR20120098783A
KR20120098783A KR1020127015390A KR20127015390A KR20120098783A KR 20120098783 A KR20120098783 A KR 20120098783A KR 1020127015390 A KR1020127015390 A KR 1020127015390A KR 20127015390 A KR20127015390 A KR 20127015390A KR 20120098783 A KR20120098783 A KR 20120098783A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
human
seq
humanized
amino acid
humanized antibody
Prior art date
Application number
KR1020127015390A
Other languages
English (en)
Inventor
롤란트 베크만
캐롤라인 존슨-레저
Original Assignee
메르크 세로노 에스. 에이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=41565648&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20120098783(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 메르크 세로노 에스. 에이. filed Critical 메르크 세로노 에스. 에이.
Publication of KR20120098783A publication Critical patent/KR20120098783A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

본 발명은 인간 IL-22RA에 대한 인간화된 항체 및 건선 및 다른 면역-매개 질환, 예를 들면 건선 관절염 및 아토피성 피부염의 치료에서의 그들의 용도에 관한 것이다.

Description

인간 ＩＬ-２２ＲＡ에 대한 인간화된 항체{HUMANIZED ANTIBODIES AGAINST HUMAN IL-22RA}
본 발명은 인간 IL-22RA에 대한 인간화된 항체 및 건선 및 건선 관절염 및 아토피성 피부염과 같은 건선-매개 질환의 치료에서의 그들의 용도에 관한 것이다.
IL-22RA (IL22R, IL22R1, IL22RA1, CRF2-9 및 Zcytorl1로도 알려짐)는 타입 II 사이토카인 수용체 패밀리에 속하는 것으로 IL-20, IL-22 및 IL-24 수용체의 구성성분이다. 그들의 구조적 유사성으로 인해, IL-19 및 IL-26와 함께, IL-20, IL-22 및 IL-24는 소위 "IL-10 패밀리" 내의 IL-10와 조합된다 (Kunz S et al. 2006). IL-10는 대식세포, T 세포, 및 기타 면역 시스템 세포 내의 전-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 발현의 하향 조절을 매개하는 면역 반응의 주요 조절인자이다 (Moore KW et al. 2001).
생체 밖에서 (in vitro), IL-20 및 IL-24는 활성화된 면역 세포 뿐만 아니라, 케라틴생성세포에 의해서도 비슷한 정도로 생성된다. 생체 내에서 (in vivo), 이러한 사이토카인은 염증 조직에서 우세하게 발현된다. IL-20 및 IL-24는 2개의 수용체 복합체, IL-20RA/IL-20RB 및 IL-22RA/IL-20RB를 통해 신호를 보낼 수 있다 (Langer JA et al. 2004). 각각의 조직, 특히 피부, 생식계 및 호흡기계로부터의 조직, 및 다양한 선(gland)은 이러한 매개인자의 주요 표적으로 존재하는 것으로 보인다 (Kunz S et al. 2006). IL-22는 활성시 CD4+ T 세포에 의해 상향-조절되는 유전자로서 발견되었고, 그것은 IL-10와 22%의 아미노산 염기서열 동일성을 공유한다; 즉, 따라서 원래 IL-10-관련 T 세포-유도된 유도성 인자 (IL-TIF)로 명명되었다 (Dumoutier L et al. 2000). 면역 세포 기능을 조절하는, IL-10와 달리, IL-22는 면역 시스템에 대한 조직 반응을 조절한다. IL-22는 다양한 조직 내에서 높이 발현되는 IL-22RA 및 IL-10RB에 의해 형성된 이종이합체 수용체를 통해 신호를 내보내지만, 면역 세포에서 검출가능하지 않다. 초기에, IL-22는 그것의 IL-22RA 결합 부위를 통해 IL-22RA의 세포외 도메인에 결합하고, 그 다음 IL-10RB는 IL-22와 IL-22RA의 상호작용에 의해 생성된 영역에 결합함으로써, IL-22에서 더 높은 친화도를 갖는 사이토카인 수용체 복합체를 형성한다 (Li J et al. 2004). IL-10RB가 매우 다양한 세포종에서 광범위하게 발현되므로, IL-22RA 발현은 세포의 L-22 반응성을 측정하는 제한 성분이다. IL-22RA는 간에서 뿐만 아니라 피부, 허파, 취장 및 다른 말초 조직에서 강하게 발현된다 (Wolk K et al. 2004; Aggarwal S et al. 2001). 다른 세포주의 광범위한 스크리닝에 의해 IL-22RA를 발현하는 세포 만이 IL-22에 반응한다는 것이 밝혀졌는바, 이는 IL-22 신호전달을 매개할 수 있는 대체적인 수용체가 존재하지 않음을 나타낸다.
IL-22 결합 단백질 (IL-22BP; 또한 IL22BP, IL22RA2, IL-22R-알파2, CRF2X, CRF2-S1 및 CRF2-10로도 명명됨)로 불리는 수용성 수용체는 또한 천연 단백질 길항제로서 IL-22에 결합할 수 있고 IL-22 활성의 체계적 조절을 제공할 것이다 (Kotenko SV et al. 2003). IL-22는 활성화된 T 세포의 공격과 관련된 다양한 만성 염증성 질환, 예를 들면 건선, 건선 관절염 및 아토피성 피부염을 갖는 환자로부터의 질병 조직에서 발견되었다. IL-22는 만성 염증성 질병을 갖는 환자의 병변에서의 발현 및 IL-6, IL-8 및 TNF-a와 같은 전-염증성 사이토카인의 유도로 인해, 전-염증성 사이토카인에서 대부분 기술되어 있다 (Wolk K et al. 2004; Andoh A et al. 2005; Ikeuchi H et al. 2005; Nograles KE et al. 2009a.; Nograles KE et al. 2009b). 최근 문헌 [Zheng et al.]에는 IL-22가 건선을 갖는 마우스 모델 내의 IL-23-유도 피부 염증을 매개하는데 중요한, 전-염증성 역할을 나타내는 것으로 보고되어 있다 (Zheng Y et al. 2007). 케라틴생성세포, 과다형성증, 특성 세포에서 사이토카인의 유도 및 전-염증성 사이토카인의 생성, IL-22의 활성을 예를 들면, 수용체 결합을 방해함으로써 차단하거나, 억제하거나, 감소시키거나 또는 중성화시키는 길항체의 용도를 포함하는, IL-22의 생물학적 효과의 제공은 염증 부위에 있는 병원성 세포의 침입을 막을 수도 있다. 마우스 항-인간 IL-22RA 모노클로날 항체는 2005년 10월 21일자 출원된 PCT 특허 출원 WO 2006/047249에 이미 기술되어 있다. 그러나, 마우스 항체는 면역원성을 야기할 수도 있으므로, 인간화된 항-인간 IL-22RA 항체가 바람직하다. 인간화된 항체는 일반적으로 인간 치료에서 사용하기에 마우스 항체 보다 최소한 3개의 잠재적 이점을 가진다: (1) 작용인자 부위가 인간이기 때문에, 그것은 인간 면역 시스템의 다른 부분과 더욱 작용할 수도 있다 (예를 들면, 보체-의존성 세포독성 (CDC) 또는 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)에 의해 더 유효하게 표적 세포를 파괴할 수도 있다); (2) 인간 면역 시스템은 외래물질로서 인간화된 항체의 프레임워크 또는 불변 영역을 인식할 수 없으므로, 그러한 주입된 항체에 대한 항체 반응이 최종 외래의 마우스 항체에 비해 낮을 것이다; 및 (3) 주입된 마우스 항체는 인간 항체의 반감기 보다 인간 순환에서 매우 짧은 반감기를 가지는 것으로 보고되어 있다. 주입된 인간화된 항체는 아마도 천연적으로 발생하는 인간 항체와 더 비슷한 반감기를 가질 것이므로, 유사하거나 더 적은 투여 빈도의 제공을 가능하게 한다. 따라서, 상기의 견지에서, 건선, 건선 관절염 및 아토피성 피부염과 같은 IL-22 매개 염증을 치료하기 위한 인간화된 항-인간 IL-22RA 항체의 요구가 존재한다.
일 측면에서, 본 발명은 인간 IL-22RA에 결합하는 인간화 항체를 제공한다. 상기 본 발명의 인간화 항체는 a) 각각 SEQ ID NO: 1, 2 및 3의 아미노산 염기서열로 이루어지는 H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 b) 각각 SEQ ID NO: 4, 5 및 6의 아미노산 염기서열로 이루어지거나 각각 SEQ ID NO: 4, 5 및 7의 아미노산 염기서열로 각각 이루어지는 L-CDR1, L-CDR2, 및 L-CDR3를 포함하는 경쇄 가변 도메인를 포함한다. 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 항체를 제공하는 것으로, 여기서 a) 상기 중쇄 가변 도메인은 각각 SEQ ID NO: 8, 9, 10 및 11의 아미노산 염기서열로 이루어지는 프레임워크 영역 H-FR1, H-FR2, H-FR3 및 H-FR4을 포함하고, 그리고 b) 상기 경쇄 가변 도메인 각각 SEQ ID NO: 12, 13, 14 및 15의 아미노산으로 각각 이루어지는 프레임워크 영역 L-FR1, L-FR2, L-FR3 및 L-FR4을 포함한다. 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 항체를 제공하는 것으로, 여기서 a) 상기 중쇄 가변 도메인은 SEQ ID NO: 16의 아미노산 염기서열로 이루어지고, 그리고 b) 상기 경쇄 가변 도메인은 SEQ ID NO: 17의 아미노산 염기서열로 이루어진다. 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 항체를 제공하는 것으로, 여기서 상기 항체는 a) SEQ ID NO: 18의 아미노산 염기서열로 이루어지는 중쇄 불면 영역 및 및 b) SEQ ID NO: 19의 아미노산 염기서열로 이루어지는 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 20의 아미노산 염기서열을 포함하거나 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 21의 아미노산 염기서열을 포함하거나 이루어지는 경쇄를 포함하는 인간 IL-22RA에 결합하는 인간화된 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 인간화된 항체의 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들면 DNA를 제공한다. 바람직하기는, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 23을 포함하거나 이루어진다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 인간화된 항체의 중쇄 뿐만 아니라 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들면 DNA를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 a) 본 발명에 따른 인간화된 항체의 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 b) 본 발명에 따른 인간화된 항체의 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 보다 구체적으로 발현 벡터를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 인간화된 항체의 중쇄 뿐만 아니라 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 보다 구체적으로 발현 벡터를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 예를 들면, 형질감염의 결과로서, 본 발명에 따른 벡터, 보다 구체적으로 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포, 바람직하기는 CHO 세포를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 인간화된 항체의 생산 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 본 발명에 따른 숙주 세포, 바람직하기는 CHO 세포를 배양하는 단계, 본 발명에 따른 인간화된 항체를 단리하는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 약물로서 사용하기 위한, 특히 건선, 건선 관절염 또는 아토피성 피부염의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 인간화 항체를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 인간화된 항체를 포함하는 약제학적 조성물 및 약물로서의 용도, 특히 건선, 건선 관절염 또는 아토피성 피부염에 사용하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 인간화된 항체의 사용을 위한 또는 건선, 건선 관절염 또는 아토피성 피부염의 치료를 위한 약물의 제조시 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
도 1은 인간 면역글로불린 생식세포 가파 가변 유전자 4-1 (IGKV4-1) 및 마우스 280.46.3.4 VL (280.46.3.4) 사이의 배열을 나타낸다.
도 2는 인간 면역글로불린 생식세포 중쇄 가변 유전자 3-66 (IGHV3-66) 및 마우스 280.46.3.4 VH (280.46.3.4) 사이의 배열을 나타낸다.
도 3은 인간 면역글로불린 생식세포 카파 가변 유전자 4-1 (IGKV4-1) 및 인간화된 280.46.3.4 VL의 제1버전 (280.VK4-1-C) 사이의 배열을 나타낸다. .
도 4는 인간화된 280.46.3.4 VH의 제1버전 (280.VH3-66.1) 및 인간 면역글로불린 생식세포 중쇄 가변 유전자 3-66 (IGHV3-66) 사이의 배열을 나타낸다.
도 5는 비-변성 조건 하에 SDS 젤 상에서 수행된 단백질 A-정제된 인간화된 280.46.3.4 항체의 Coomassie 블루 염색 결과를 나타낸다. 상업적으로 이용가능한 항-TNFa 모노클로날 항체, "후미라(Humira)" (Adalimumab)가 본 명세서에서 표준 참조로서 사용된다. "마커(Marker)"는 도면의 왼쪽 측면에 나타낸 kD를 갖는 표준 단백질 분자량 (MW) 마커를 나타낸다. "이전(Before)"은 280.VK4-1-C와 결합된 280.VH3-66-1를 포함하는 단백질 A-정제된 인간화된 280.46.3.4 항체를 나타내는 것으로, 경쇄 내에 비결합 시스테인을 함유한다. "이후(After)"는 280.VK4-1-S와 결합된 280.VH3-66-1를 포함하는 단백질 A-정제된 인간화된 280.46.3.4 항체를 나타낸다.
도 6은 280.VK4-1-S (■ 280.VH3-66-1/VK4-1-S)와 결합된 280.VH3-66-1를 포함하는, 인간 lgG1/카파로 발현되는 인간화된 항체와 마우스 부모 항체 280.46.3.4 (● 280.46.3.4)의 효능을 비교하기 위하여, 인간 HepG2 간암 세포 내에서 수행된 STAT3 인산화 검정법의 결과를 나타내는 것이다. 상기 결과는 각각 257.5 pM 및 370.5 pM의 IC50 수치로서, 인간화된 항체가 유리 시스테인을 함유하는, 마우스 부모 항체 보다 1.4배 이상의 효능을 가지는 것으로 관찰되었다.
도 7은 280.VK4-1-S (■ 280.VH3-66-1/VK4-1-S)와 결합된 280.VH3-66-1를 포함하는, 인간 lgG1/카파로 발현되는 인간화된 항체와 마우스 부모 항체 280.46.3.4 (● 280.46.3.4)의 효능을 비교하기 위하여 인간 IL-22 수용체 형질감염된-BaF3 안정한 세포내에서 수행된 증식 검정법의 결과를 나타낸다. 상기 결과는 각각 340 pM 및 587 pM의 IC50 수치로서, 인간화된 항체가 유리 시스테인을 함유하는, 마우스 부모 항체 보다 1.7배 이상의 효능을 가지는 것으로 관찰되었다.
도 8은 280.VK4-1-S (■ 280.VH3-66-1/VK4-1-S)와 결합된 280.VH3-66-1를 포함하는, 인간 lgG1/카파로 발현되는 인간화된 항체와 마우스 부모 항체 280.46.3.4 (● 280.46.3.4)의 효능을 비교하기 위하여 뮤린 IL-22 수용체 형질감염된-BaF3 안정한 세포내에서 수행된 증식 검정법의 결과를 나타낸다. 상기 결과는 각각 693 pM 및 1473 pM의 IC50 수치로서, 인간화된 항체가 유리 시스테인을 함유하는, 마우스 부모 항체 보다 2.1배 이상의 효능을 가지는 것으로 관찰되었다.
도 9는 인간 면역글로불린 생식세포 중쇄 가변 유전자 3-66 (IGHV3-66) 및 인간화된 280.46.3.4 VH의 제4버전 (280.VH3-66-4) 사이의 배열을 나타낸다.
도 10은 280.VK4-1-T (◆ 280.VH3-66-4/VK4-1-T)와 결합된 280.VH3-66-4를 포함하는, 인간 lgG1/카파로 발현되는 인간화된 항체와 마우스 부모 항체 280.46.3.4 (● 280.46.3.4)의 효능을 비교하기 위하여 인간 HepG2 간암 세포 내에서 수행된 STAT3 인산화의 결과를 나타낸다. 상기 결과는 각각 183.2 pM 및 333.0 pM의 IC50 수치로서, 인간화된 항체가 마우스 부모 항체 보다 1.8배 이상의 효능을 가지는 것으로 관찰되었다.
도 11은 280.VK4-1-T(◆ 280.VH3-66-4/VK4-1-T)와 결합된 280.VH3-66-4를 포함하는, 인간 lgG1/카파로 발현되는 인간화된 항체와 마우스 부모 항체 280.46.3.4 (● 280.46.3.4)의 효능을 비교하기 위하여 인간 IL-22 수용체 형질감염된-BaF3 안정한 세포내에서 수행된 증식 검정법의 결과를 나타낸다. 상기 결과는 각각 334 pM 및 587 pM의 IC50 수치로서, 인간화된 항체가 마우스 부모 항체 보다 1.75배 이상의 효능을 가짐을 나타낸다.
도 12는 280.VK4-1-T(◆ 280.VH3-66-4/VK4-1-T)와 결합된 280.VH3-66-4를 포함하는, 인간 lgG1/카파로 발현되는 인간화된 항체와 마우스 부모 항체 280.46.3.4 (● 280.46.3.4)의 효능을 비교하기 위하여 뮤린 IL-22 수용체 형질감염된-BaF3 안정한 세포내에서 수행된 증식 검정법의 결과를 나타낸다. 상기 결과는 각각 687 pM 및 1473의 IC50 수치로서, 인간화된 항체가 마우스 부모 항체 보다 2.1배 이상의 효능을 가짐을 나타낸다.
도 13은 돌연변이체 세트를 갖는 인간 IL-22RA에 대한 결합 친화도를 측정하는 것을 목표로 하는 Biacore 분석의 결과를 나타내는 것으로, 여기서 H-CDR1 내의 Asp 32 및 H-CDR3 내의 Asp 96는 개별적으로 280.VH3-66-4에서 돌연변이화되었다. 이러한 단일 돌연변이체를 인간화된 경쇄 가변 도메인 280.VK4-1-T와 결합시킨 후 친화도 측정을 실험하였다. D32E: 버전 280.VH3-66-18를 생성하기 위하여 280.VH3-66-4 내의 32위치에서의 Asp의 Glu로의 돌연변이; D32N: 280.VH3-66-4 내의 위치 32에서 Asp의 Asn로의 돌연변이; D96E: 280.VH3-66-4 내에서 위치 96에서 Asp의 Glu로의 돌연변이; D96N: 280.VH3-66-4 내의 위치 96에서 Asp의 Asn로의 돌연변이.
본 도면에 제시된 결과는 D32E 돌연변이가 부모 비돌연변이 D32 (280.VH3-66-4)에 비해, 약 2배까지 온 레이트를 증가시키고 약 5배까지 오프 레이트를 감소시킴을 나타낸다. 한편, D96E 돌연변이는 부정적인 영향을 미쳤는바, 약 500배 까지 친화도를 경감시켰다.
도 14는 D32E 돌연변이 및 부모 비돌연변이 D32E에 대해 그들의 열적 안정성을 평가하기 위해 수행된 시차 주사 열량계 (DSC)의 결과를 제시한다. D32E 돌연변이체 (밝은 그레이 선)은 부모 D32E (어두운 그레이 선) 보다 1도까지 더 안정하였다.
도 15는 280.VK4-1-T (◆ 280.VH3-66-18/VK4-1-T)와 결합된 280.VH3-66-18를 포함하는, 인간 lgG1/카파로서 발현되는 인간화된 항체와 마우스 부모 항체 280.46.3.4 (● 280.46.3.4)의 효능을 비교하기 위하여 인간 HepG2 간암 세포 내에서 수행된 STAT3 인산화 검정법의 결과를 제시한다. 상기 결과는 각각 132.5 pM 및 370.5 pM의 IC50 수치로, 인간화된 항체가 마우스 부모 항체에 비해 거의 3배 이상의 효능을 가지는 것으로 관찰되었다.
도 16은 최종 인간화된 VH 버전, 280.VH3-66-46, 및 인간 면역글로불린 생식세포 중쇄 가변 유전자 3-66 (IGHV3-66) 사이의 배열을 나타낸다.
도 17은 인간 면역글로불린 생식세포 카파 가변 유전자 4-1 (IGKV4-1 ) 및 최종 인간화된 VL 버전, 280.VK4-1-TSY 사이의 배열을 나타낸다.
도 18은 280.VK4-1-TSY (◆ 280.VH3-66-46/VK4-1-TSY)와 결합된 280.VH3-66-46를 포함하는, 인간 lgG1/카파로 발현되는 인간화된 항체와 마우스 부모 항체 280.46.3.4 (● 280.46.3.4)의 효능을 비교하기 위하여 보통의 인간 케라틴생성세포 내에서 수행된 STAT3 인산화 검정법의 결과를 나타낸다. 상기 결과는 각각 60.95 pM 및 541.9 pM의 IC50 수치로서, 인간화된 항체 (280.346.TSY, 실시예 7 참고)가 마우스 부모 항체에 비해 거의 9배 이상의 효능을 가지는 것으로 관찰되었다.
도 19는 280.VK4-1-TSY (◆ 280.VH3-66-46/VK4-1-TSY)와 결합된 280.VH3-66-46를 포함하는, 인간 lgG1/카파로 발현되는 인간화된 항체와 마우스 부모 항체 280.46.3.4 (● 280.46.3.4)의 효능을 비교하기 위하여 인간 HepG2 간암 세포 내에서 수행된 STAT3 인산화 검정법의 결과를 나타낸다. 상기 결과는 각각 55.16 pM 및 266.3 pM의 IC50 수치로서, 인간화된 항체 (280.346.TSY, 실시예 7 참고)가 마우스 부모 항체 보다 거의 5배 이상의 효능을 가짐을 나타낸다.
도 20은 280.VK4-1-TSY (◆ 280.VH3-66-46/VK4-1-TSY)와 결합된 280.VH3-66-46를 포함하는, 인간 lgG1/카파로 발현되는 인간화된 항체와 마우스 부모 항체 280.46.3.4 (● 280.46.3.4)의 효능을 비교하기 위하여 인간 IL-22 수용체 형질감염된-BaF3 안정한 세포 내에서 수행된 증식 검정법의 결과를 나타낸다. 상기 결과는 각각 317 pM 및 545 pM의 IC50 수치로, 인간화된 항체 (280.346.TSY, 실시예 7 참고) 가 마우스 부모 항체 보다 1.7배 이상의 효능을 가짐을 나타낸다.
도 21은 280.VK4-1-TSY (● 280.VH3-66-46/VK4-1-TSY)와 결합된 280.VH3-66-46를 포함하는, 인간 lgG1/카파로 발현되는 인간화된 항체의 효능을 계산하기 위하여 뮤린 HEPA1-6 간암 세포 내에서 수행된 STAT3 인산화 검정법의 결과를 나타낸다. 인간 lgG1가 음성 대조군으로 사용되었다 (■ 대조군 hlgG1 ). 상기 결과는 인간화된 항체 (280.346.TSY, 실시예 7 참고)가 나노몰 범위 (2,1 nM)의 IC50로 뮤린 IL-22의 안정성을 억제할 수 있음을 나타낸다.
도 22는 280.VK4-1-TSY (◆ 280.VH3-66-46/VK4-1-TSY)와 결합된 280.VH3-66-46를 포함하는, 인간 lgG1/카파로 발현되는 인간화된 항체와 마우스 부모 항체 280.46.3.4 (● 280.46.3.4)의 효능을 비교하기 위하여 뮤린 IL-22 수용체 형질감염된-BaF3 안정한 세포 내에서 수행된 증식 검정법의 결과를 나타낸다. 상기 결과는 각각 137 pM 및 849 pM의 IC50 수치로서, 인간화된 항체 (280.346.TSY, 실시예 7 참고)가 마우스 부모 항체 보다 6.2배 이상의 효능을 가짐을 나타낸다.
도 23은 인간 IL-22RA에 대한 280.346.TSY의 친화도를 측정하기 위해 수행된 경쟁적 ELISA의 결과를 나타낸다. 미세역가 플레이트를 인간 IL-22RA-ECD (즉, IL-22RA-세포외 도메인)로 코팅하였다. 비오틴화된 280-346-TSY 항체를 경쟁자: 인간 인터루킨 22 수용체 알파 (hlL-22RA), 인간 IL-22 결합 단백질 (hlL-22 BP), 뮤린 IL-22 수용체 알파 (mlL-22RA), 인간 IL-10 수용체 알파 (hlL-10R) 및 인간 IL-20 수용체 알파 (hlL-20R)의 존재 하에 상기 플레이트에 첨가하였다. 플레이트 상에 코팅된 hlL-22RA의 결합은 퍼옥시다제-컨쥬게이트된 스트렙타비딘의 첨가함으로써 보였다. 인간 (● ML-22RA) 및 뮤린 (◆ mlL-22RA) IL-22RA에서 측정된 IC50 수치는 각각 18.25 pM 및 149.3 pM이었다. 280.346.TSY는 인간 IL-22BP (■ ML-22BP), IL-10R 알파 (Δ hlL-10R) 및 IL-20R 알파 (V hlL-20R)와의 상호-반응성을 나타내지 않았다.
도 24는 마우스 내의 IL-22-유도된 혈청 아밀로이드 A 상의 280-346-TSY의 약력학적 활성의 결과를 나타낸다. 280.346.TSY의 용량을 달리함으로써, 재조합 뮤린 IL-22 정맥 주입 전에 22시간 피하 투여하였다. 운반체 대조군에는 PBS를 피하 투여하였다. 혈액을 IL-22 투여 이후에 6시간 동안 샘플링하였다. 인간 lgG1를 음성 대조군으로 (동종형 대조군) 사용하였다. 혈청 아밀로이드 A를 ELISA에 의해 측정하였다. 280-346-TSY가 상기 모델에서 효능을 보였으며, 0.5 mg/kg의 ED50 수치를 나타내었다. Mann Whitney 실험을 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다: * p< 0.05 vs. 동종형 대조군; *** p< 0.001 vs. 동종형 대조군.
도 25는 건선을 갖는 마우스 모델 내의 280-346-TSY의 약력학적 활성의 결과를 나타낸다. 두꺼워지는 IL-23-유도 귀에서 280-346-TSY의 효능을 측정하였다. 마우스를 14일 동안 2틀에 한번씩 재조합 IL-23 또는 PBS를 500 ng 주입하였다. 전체 치료학적 범위를 280.346.TSY의 용량을 달리하여 피하 투여함으로써 수행하였다. 운반체 대조군에는 PBS를 피하로 투여하였다. 덱사메타손(Dexa)을 양성 대조군으로 사용하였다. 백분율 억제를 귀가 부풀어오른 피크에 해당하는 9일째에 계산하였다. 280-346-TSY가 본 모델에서 효능을 보였으며, 1.8 mg/kg의 ED50 수치를 나타내었다.
발명의 상세한 설명
본 발명을 상세히 설명하기 전에, 하기의 용어들을 정의하는 것이 본 발명의 이해를 도울 수도 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "항체(antibody)", 및 그것의 복수 형태 "항체들(antibodies)"는 특히 폴리클로날 항체, 친화성-정제된 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 나노항체 및 항원-결합 단편, 예를 들면 F(ab')2, Fab 단백질 가수분해성 단편, 및 단쇄 가변 영역 단편 (scFv)을 포함한다. 또한, 키메라 항체, Fv 단편, 단쇄 항체 등과 같은 유전적으로 가공된 무손상 항체 또는 단편 뿐만 아니라 합성 항원-결합 펩티드 및 폴리펩티드가 포함된다. 비-인간 항체는 비-인간 CDR를 인간 프레임워크 및 불변 영역 상에 그래프트하거나, 전체 비-인간 가변 도메인을 통합시키는 것에 의해 인간화될 수도 있다. 몇몇 예에서, 인간화된 항체는 적당한 결합 특성을 증진시키기 위하여 인간 프레임워크 영역 내부에 비-인간 잔기를 보유할 수도 있다. 항체를 인간화시킴으로써, 생물학적 반감기가 증진될 수도 있고,그리고 인간에 투여시 해로운 면역 반응의 가능성이 감소된다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "면역글로불린(immunoglobulin)" (Ig)는 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 암호화되는 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드로 이루어지는 단백질을 의미한다. 면역글로불린의 일 형태가 항체의 기본적인 구조 단위를 구성한다. 이 형태는 사량체이며, 2개의 동일한 쌍의 면역글로불린 사슬로 이루어지는 것으로, 각각의 쌍은 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄를 갖는다. 경쇄는 2개의 부분: 가변 도메인 (VL) 및 불변 도메인 (CL)을 가지는 것으로, 상기 경쇄의 맥락에서, 불변 영역으로도 언급될 수 있다. 중쇄도 2개의 부분: 가변 도메인 (VH) 및 불변 영역 (CH)을 가진다. 각각의 쌍에서, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 모두 항원 결합 기능을 가지며, 그리고 불변 영역은 항체 작용인자 기능(effector function)을 가진다.
전장 면역글로불린 "경쇄(light chain)" (약 25 Kd)는 N-말단에 있는 가변 도메인 유전자 (약 110개 아미노산) 및 C-말단에 있는 카파 (카파) 또는 람다 (lambda) 불변 도메인 (각각, Cκ 및 Cλ) 유전자에 의해 암호화된다. 전장 면역글로불린 "중쇄(heavy chain)" (약 50 Kd)도 마찬가지로 가변 도메인 유전자 (약 116개 아미노산) 및 이하에서 언급되는 다른 불변 영역 유전자 (약 330개 아미노산)에 의해 암호화된다. 포유동물 중쇄는 그리스 문자: α, δ, ε, γ, 및 μ로 표시되는 5개의 종류가 존재한다. 상기 중쇄의 종류들은 각각 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM와 같은 항체의 동종형으로 정의된다. 불변 영역은 동일한 동종형을 갖는 모든 항체 내에서 동일하지만, 다른 동종형을 갖는 항체에서는 상이하다. 중쇄 γ, α 및 δ는 3개의 Ig 불변 도메인 (CH1 , CH2, 및 CH3)으로 구성되는 불변 영역, 및 가요성 증가를 위한 힌지 영역을 가지며; 중쇄 μ 및 ε는 4개의 Ig 불변 도메인 (CH1 , CH2, CH3, 및 CH4)으로 구성된는 불변 영역 및 힌지 영역을 가진다.
면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인은 3개의 초가변 영역에 의해 차단되는 "프레임워크(framework)" 영역으로 이루어진다. 따라서, 상기 용어 "초가변 영역(hypervariable region)"은 항원 결합 기능을 하는 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역(Complementarity Determining Region)" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기, 즉 경쇄 가변 도메인 내의 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3와 중쇄 가변 도메인 내의 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3 (Kabat et al. 1991) 및/또는 "초가변 루프(hypervariable loop)"로부터의 아미노산 잔기들 (Chothia and Lesk, 1987)을 포함한다. "프레임워크 영역(Framework Region)" 또는 "FR" 잔기들은 본 명세서에 정의된 초가변 영역 잔기들 이외의 가변 도메인 잔기들이다. 다른 경쇄 (예를 들면, L-FR1, L-FR2, L-FR3 및 L-FR4) 또는 중쇄 (예를 들면, H-FR1 , H-FR2, H-FR3 및 H-FR4)의 프레임워크 영역의 염기서열은 종 내부에서 상대적으로 보존된다. 따라서, "인간 프레임워크 영역"은 천연적으로 발생하는 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역과 실직적으로 동일한 (약 85% 또는 그 이상, 일반적으로 90-95% 또는 그 이상) 프레임워크 영역이다. 구성성분 경쇄 및 중쇄의 조합된 프레임워크 영역인, 항체의 프레임워크 영역은 CDR의 위치 및 배열에 기여한다. CDR은 기본적으로 항원의 에피토프 결합 기능을 가진다.
따라서, 용어 "인간화된(humanized)" 면역글로불린은 인간 프레임워크 영역 및 비-인간 (일반적으로 마우스 또는 래트) 면역글로불린으로부터 일 또는 그 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린을 의미한다. CDR을 제공하는 비-인간 면역글로불린은 "공여체(donor)"라 하고, 프레임워크를 제공하는 인간 면역글로불린은 "수용체(acceptor)"라 한다. 불변 영역은 존재할 필요가 없지만, 존재하는 경우, 그들은 인간 면역글로불린 불변 영역과 실질적으로 동일, 예를 들면, 적어도 약 85-90%, 바람직하게는 약 95% 또는 그 이상 동일해야 한다. 그러므로, 작용인자 기능의 조절이 필요한 경우, 아마도 CDR 및 중쇄 불변 영역 내의 소수의 잔기들을 제외한, 인간화 면역글로불린의 모든 부분이 천연 인간 면역글로불린 염기서열에 대응하는 부분과 실질적으로 동일하다. "인간화된 항체(humanized antibody)"는 인간화된 경쇄 가변 도메인 및 인간화된 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체이다. 몇몇 예에서, 인간화된 항체는 적당한 결합 특성을 증진시키기 위하여 인간 프레임워크 영역 내부에 비-인간 잔기를 보유할 수도 있고 및/또는 일부 아미노산 돌연변이가 결합 친화도를 향상시키거나 및/또는 면역원성을 감소시키거나 및/또는 인간화(humanness)도를 증가시키기 위하여 CDR 내부에 도입될 수도 있다.
용어 "재조합 항체(recombinant antibody)"는 아미노산 염기서열이 천연 항체의 것과는 다른 항체를 의미한다. 항체의 발생시 재조합 DNA 기술의 관련성으로 인해, 천연 항체에서 발견되는 아미노산의 염기서열을 규정할 필요는 없으며; 항체는 원하는 특성을 얻기 위하여 재설계될 수 있다. 가능한 변화는 단지 하나 또는 소수의 아미노산 변화로부터 전체 재설계, 예를 들면 가변 도메인 또는 불변 영역의 변화에 이르기까지 다양하다. 불면 영역에서의 변화는 일반적으로 보체 고정 (예를 들면, 보체 의존성 세포독성 (complement dependent cytotoxicity, CDC)), 막과의 상호작용 및 다른 작용인자 기능 (예를 들면, 항체 의존성 세포 독성 (antibody dependent cellular cytotoxicity, CDC))과 같은 특성들을 개선시키거나, 감소시키거나 또는 변경시키기 위하여 수행될 것이다. 가변 도메인에서의 변화는 항체 결합 특성을 개선하기 위하여 수행될 것이다.
항체 이외에, 면역글로불린은 다양한 다른 형태, 예를 들면, 단일-사슬 또는 Fv, Fab, 및 (Fab')2 뿐만 아니라 항체절편(diabody), 선형 항체, 다가 또는 다중특이적 혼성화 항체를 포함하는 형태로 존재할 수도 있다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "단일-사슬 Fv", "단일-사슬 항체", "Fv" 또는 "scFv"는 종쇄 및 경쇄로부터의 가변 도메인을 포함하는 항체 단편을 의미하는 것이나, 불편 영역이 결핍되어 있는 것으로, 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다. 일반적으로, 단일-사슬 항체는 항원 결합을 허용하는 원하는 구조의 형성을 가능하게 하는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 단일-사슬 항체는 이중-특이적이고 및/또는 인간화될 수 있다. "Fab 단편"은 하나의 경쇄와 하나의 중쇄의 가변 및 CH1 도메인으로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 이황화 결합을 형성할 수 없다. "Fab' 단편"은 하나의 경쇄와, 사슬내 이황화 결합이 두 중쇄 사이에서 형성됨으로써 F(ab')2 분자가 형성될 수 있도록, CH1 및 CH2 도메인 사이에 많은 불변 영역을 함유하는 하나의 중쇄를 함유한다. "F(ab')2"는 2개의 경쇄와, 사슬내 이황화 결합이 두개의 중쇄 사이에서 형성될 수 있도록, CH1와 CH2 도메인 사이에 불변 영역 부분을 함유하는 2개의 중쇄를 함유한다. 몇몇 중요한 용어들을 정의함으로써, 이제 본 발명의 특정 구현예에 집중하는 것이 가능하다.
본 발명은 인간화된 항-인간 IL-22RA 항체의 발견을 바탕으로 한다. 상기 항체의 IL-22RA 길항체로서의 사용은 염증을 억제할 수 있으므로, 건선, 건선 관절염 및 아토피성 피부염과 같은, 활성화된 T 세포에 침입하는 것과 관련된 만성 염증성 질병의 치료에 유용할 수 있다. 본 발명은 IL-22RA을 인식하고, 상기에 결합하고, 상기를 조절하고 및/또는 상기를 중성화하는 인간화된 항체의 용도를 제공한다. 특히, 본 발명은 IL-22RA를 인식하고, 상기에 결합하고, 상기를 조절하고 및/또는 상기를 중성화하는 인간화된 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 용도를 제공한다. 그러한 인간화된 경쇄 및 또는 중쇄 가변 도메인은 각각 카파 또는 람다 불변 도메인 및 임의의 동종형에서 선택되는 중쇄의 불변 영역 (IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM)에 융합될 수 있고, 다양한 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 바람직하게는, 상기 불변 영역은 IgG의 불변영역으로부터, 더 바람직하게는 lgG1의 것으로부터 선택될 수 있다. 본 명세서에 기술된 상기 인간화된 항-IL-22RA 항체는 인간화 공정의 출발점으로서, 2005년 10월 21일자 출원된 PCT 특허 출원 WO 2006/047249에 이미 기술된 마우스 항-인간 IL-22RA 모노클로날 항체의 아미노산 염기서열을 사용하여 생성된다.
IL-22RA는 1998년 7월 30일자 출원된 PCT 특허 출원 WO 99/07848에서, Zcytor11로서 처음 기술된, 타입 II 사이토카인 수용체이다. 인간 IL-22RA의 아미노산 염기서열을 SEQ ID NO: 24에 나타내었다.
본 발명은 또한 IL-22RA 폴리펩티드의 에피토프-내포 부분 또는 면역원성 에피토프 또는 항원성 에피토프를 포함하는 폴리펩티드 단편 또는 펩티드에 결합하는 인간화된 IL-22RA 항체를 제공한다. 항체가 상기 에피토프에 결합하는 것에 의해, IL-22RA의 신호 변환이 억제, 차단, 중화, 및/또는 감소된다.
본 명세서에 기술된 항체의 활성은 IL-22RA 수용체를 발현하는 세포의 증식 및/또는 상기 세포에 대한 결합을 측정하는 다양한 분석법을 사용하여, 증식을 억제하거나, 또는 감소시키는 그들의 활성에 의해 측정될 수 있다. 특히, 관심의 대상은 IL-22-의존성 세포에서의 변화이다. IL-22-의존성인 것으로 가공되기에 적합한 세포주는 BaF3 세포주를 포함한다. 인간화된 항-IL-22RA 항체의 활성은 또한 하기에 기술된 인간 HepG2 간암(hepatoma) 세포에서 또는 마우스 HEPA1-6 간암 세포에서 BaF3 증식 검정법, STAT3 인산화 검정법, Biacor 검정법, 또는 보통의 인간 케라틴생성세포(keratinocyte) 검정법으로 측정될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 인간화 항체는 a) 각각 SEQ ID NO: 1, 2 및 3의 아미노산 염기서열로 이루어지는 H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 b) 각각 SEQ ID NO: 4, 5 및 6의 아미노산 염기서열로 이루어지거나 각각 SEQ ID NO: 4, 5 및 7의 아미노산 염기서열로 이루어지는 L-CDR1, L-CDR2, 및 L-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 본 명세서이 기술된 항체를 제공하는 것으로, 여기서 a) 상기 중쇄 가변 도메인은 각각 SEQ ID NO: 8, 9, 10 및 11의 아미노산 염기서열로 이루어지는 프레임워크 영역 H-FR1, H-FR2, H-FR3 및 H-FR4을 포함하고, 그리고 b) 상기 경쇄 가변 도메인은 각각 SEQ ID NO: 12, 13, 14 및 15의 아미노산 염기서열로 이루어지는 프레임워크 영역 L-FR1, L-FR2, L-FR3 및 L-FR4을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 항체를 제공하는 것으로, 여기서 a) 상기 중쇄 가변 도메인은 SEQ ID NO: 16의 아미노산 염기서열로 이루어지고, 그리고 b) 상기 경쇄 가변 도메인은 SEQ ID NO: 17의 아미노산 염기서열로 이루어진다.
다른 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 항체를 제공하는 것으로, 여기서 a) 상기 중쇄 가변 도메인은 인간 IgA, IgG, IgM, IgD, IgE 또는 임의의 소그룹, 바람직하기는 lgG1의 불변 영역으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중쇄 불변 영역에 융합되고, 그리고 b) 상기 경쇄 가변 도메인은 κ 또는 λ 인간 면역글로불린 경쇄, 바람직하기는 κ의 불변 도메인에 융합된다.
다른 구현예에서, 상기 중쇄 불변 영역은 항체 작용인자 기능 (예를 들면, 항체 의존성 세포 독성 (ADCC) 및 보체 의존성 세포독성 (CDC))을 조절하거나, 감소시키거나 또는 억제하는 일부 아미노산 돌연변이를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 항체를 제공하는 것으로, 여기서 상기 항체는 a) SEQ ID NO: 18의 아미노산 염기서열로 이루어지는 중쇄 불변 영역 및 b) SEQ ID NO: 19의 아미노산 염기서열로 이루어지는 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 20의 아미노산 염기서열을 포함하거나 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 21의 아미노산 염기서열을 포함하거나 또는 이루어지는 경쇄를 포함하는 인간 IL-22RA에 결합하는 인간화된 항체를 제공한다.
본 명세서에 기술된 항체를 암호화하는 폴리뉴크레오티드를 제조하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 전체 RNA는 구아니디움 이소티오시아네이트 추출법과, 그 다음 CsCl 그라디언트에서의 원심분리에 의한 단리를 사용하여 제조될 수 있다 (Chirgwin JM et al. 1979). 폴리(A)+ RNA는 Aviv 및 Leder의 방법을 사용하여 전체 RNA로부터 제조된다 (Aviv H et al. 1972). 상보성 DNA (cDNA)는 공지된 방법을 사용하여 폴리(A)+ RNA로부터 제조된다. 선택적으로, 게놈 DNA가 단리될 수 있다. 그 다음, IL-22RA 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 동정되고 예를 들면, 혼성화 또는 PCR에 의해 단리된다.
본 명세서에 개시된 항체는 당해 기술분야에 공지된 임의의 기술에 의해, 예를 들면 재조합 기술, 화학적 합성, 클로닝, 리게이션, 또는 그들의 조합에 의해 생산될 수도 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 재조합 기술, 예를 들면 적합한 숙주 세포 내에서 대응하는 핵산의 발현에 의해 생산된다. 상기 생산된 폴리펩티드는 글리코실화되거나 되지않을 수도 있으며, 또는 사용된 숙주 세포의 종류에 따라 다른 번역-후 변형을 함유할 수도 있다. 많은 서적 및 참고문헌은 벡터 및 진핵 또는 원핵 숙주 세포를 사용하여 재조합 단백질을 클로닝하고 생산하는 방법을 개시한다.
따라서, 본 발명의 추가 구현예는 상기 또는 하기에 기술된 임의의 항체 또는 그것의 부분을 암호화하는 단리된 핵산 분자, 또는 그것의 상보적 가닥 또는 그것의 축퇴성 염기서열이다. 이와 관련하여, 용어 "핵산 분자"는 모든 상이한 유형의 핵산을 포함하는 것으로, 예를 들면 데옥시리보핵산 (예를 들면, DNA, cDNA, gDNA, 합성 DNA, 등), 리보핵산 (예를 들면, RNA) 및 펩티드 핵산 (PNA)를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직한 구현예에서, 상기 핵산 분자는 이중-가닥 DNA 분자 또는 cDNA 분자와 같은 DNA 분자이다. 상기 용어 "단리된(isolated)"은 보통 천연 공급원과 관련된 최소한 하나의 오염 핵산 분자로부터 동정되고 분리된된 핵산 분자를 의미한다. 단리된 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 설정과는 다르다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 그것이 천연 세포에 존재하는 한, 특이적 핵산 분자와는 구별된다. 축퇴성 염기서열은 참조 뉴클레오티드 염기서열과 같은 아미노산 염기서열을 암호화하지만, 유전자 코드 축퇴성의 결과와 다른 뉴클레오티드 염기서열을 포함하는 임의의 뉴클레오티드 염기서열을 나타낸다.
다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드로도 불리는, 핵산 분자는 본 발명의 인간화된 항체의 중쇄를 암호화하고, 다른 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 인간화된 항체의 경쇄를 암호화한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 인간화된 항체의 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 22를 포함하거나, 이루어진다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 인간화된 항체의 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 23를 포함하거나, 이루어진다.
바람직한 구현예에서, 유일한 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 인간화된 항체의 중쇄 뿐만 아니라 경쇄를 암호화한다.
본 발명의 추가 구현예는 상기 또는 하기에 기술된 임의의 항체 또는 그것의 일부를 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터이다. 상기 벡터는 임의의 원핵 또는 진핵 세포에서 기능을 할 수 있는, 통합적이거나 자동복제가능한, 임의의 클로닝 또는 발현 벡터일 수도 있다. 특히, 상기 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 파지, 에피솜, 인공 염색체 등일 수도 있다. 상기 벡터는 중쇄 및 경쇄 모두에 대한 코딩 염기서열, 또는 경쇄나 중쇄 중 어느 하나에 대한 코딩 염기서열 포함할 수도 있다. 상기 벡터가 중쇄 및 경쇄 모두에 대한 코딩 염기서열을 포함해야 한다면, 상기 중쇄 및 경쇄는 각각 프로모터에 작용 가능하게 연결될 수도 있다. 상기 프로모터는 중쇄 및 경쇄와 동일하거나 다를 수도 있다. 상기 중쇄 및 경쇄는 또한 하나의 단일의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수도 있는 것으로, 이 경우 상기 중쇄 및 경쇄에 대한 코딩 염기서열은 바람직하게는 내부 리보솜 유입 부위 (internal ribosomal entry site, IRES)에 의해 분리될 수도 있다. 진핵 유전자 발현에 적합한 프로모터로는 예를 들면, 뮤린 또는 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV)와 같은 바이러스 유전자로부터 유래된 프로모터, 마우스 양-방향 CMV 프로모터 또는 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터가 있고, 상기는 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. 상기 벡터는 조절 요소, 예를 들면 프로모터, 터미네이터, 인핸서, 선택 마커, 복제 기원, 인슐레이터 등을 포함할 수도 있다. 적당한 핵산 염기서이은 다양한 공정에 의해 벡터 내로 삽입될 수도 있다. 일반적으로, DNA는 당해 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 적당한 제한효소 부위(들) 내로 삽입된다. 일 또는 그 이상의 상기 구성요소들을 함유하는 적합한 벡터의 구축은 당업자들에게 공지된 표준 리게이션 기술을 사용한다.
본 발명의 추가 구현예는 재조합 숙주 세포로서, 여기서 상기 세포는 핵산 분자/폴리뉴클레오티드 또는 상기 정의된 벡터를 포함한다. 상기 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수도 있다. 원핵 세포의 예로는 E.coli와 같은 박테리아를 포함한다. 진핵 세포의 예는 효모 세포, 식물 세포, 포유류 세포 및 곤충 세포가 있고, 임의의 일차 세포 배양물 또는 확립된 세포주 (예를 들면, 3T3, Vera, HEK293, TN5, 등)를 포함한다. 글리코실화된 단백질의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유도된다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예로는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 및 COS 세포가 있다. 본 발명의 특히 바람직한 포유동물 세포는 CHO 세포이다.
상기 개시된 바와 같이, 본 발명의 항체는 당해 기술분야에 공지된 임의의 기술, 예를 들면 재조합 기술, 화학적 합성, 클로닝, 리게이션, 또는 그것의 조합에 의해 생산될 수도 있다.
따라서, 본 발명의 다른 구현예는 본 발명의 항체의 생산 방법으로, 상기 방법은 핵산 분자의 발현을 가능하게 하는 조건 하에 본 발명의 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 생성된 폴리펩티드를 회수하는 단계/단리하는 단계를 포함한다. 생성된 폴리펩티드는 글리코실화되거나 되지않을 수도 있고, 또는 사용된 숙주 세포 유형에 따라서는 다른 번역-후 변형을 함유할 수도 있다. 본 발명의 항체의 생산 방법은 상기 항체를 약제학적 조성물로 제형화하는 단계를 추가로 포함할 수도 있다.
따라서, 본 발명의 추가적 구현예는 본 발명에 따른 인간화된 항체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 바람직하게는, 상기 약제학적 조성물은 부가적인 부형제, 예를 들면 완충제, 안정화제, 계면활성제 등을 추가로 포함할 수도 있다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 건선 및 건선 관절염 및 아토피성 피부염과 같은 다른 면역-매개 질환의 진단, 예방 및/또는 치료 (국소 또는 전신)에 유용하다.
본 발명의 맥락에서 용어 "치료(treatment)"는 질병의 개시 이후에 병리학적 진행의 감쇠, 경감, 감소 또는 소멸을 포함하는, 질병의 진행에 영향을 미치는 임의의 유리한 효과를 나타낸다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 투여될 수도 있다.
상기 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 활성 성분의 생물학적 활성 효과를 방해하지 않고, 숙주에 투여시 독성이 없는, 임의의 담체를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들면, 비경구 투여의 경우, 활성 단백질(들)은 살린, 덱스트로스 용액, 혈청 알부민 및 링거 용액과 같은 운반체 내에서 주입되기 위한 단위 투여량 형태로 제형화될 수도 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 약물로 사용하게 위한 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 환자의 질병을 치료하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 환자에 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 상기 질병은 건선, 건선 관절염 및 아토피성 피부염으로부터 선택된다.
다른 측면에서, 본 발명은 약물로 사용하게 위한 본 발명에 따른 인간화된 항체를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 환자의 질병을 치료하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 본 발명에 따른 인간화된 항체를 환자에 투여하는 것을 포함한다. 바람직하기는, 상기 질병은 건선, 건선 관절염 및 아토피성 피부염으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 건선, 건선 관절염 또는 아토피성 피부염의 치료를 위한 약물의 제조에서 본 발명에 따른 인간화된 항체의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 제1용도에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 폐에 투여된다.
본 발명에 따른 제2용도에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 비강 내로 투여된다.
본 발명에 따른 제3용도에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 흡입에 의해 투여된다.
본 발명에 따른 제4용도에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 구강으로 투여된다.
본 발명에 따른 제5용도에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 정맥 내 또는 근육 내로 투여된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 용도에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 피하로 투여된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 매일 또는 2일에 한번, 상기 기술된 임의의 방법에 따라 투여된다.
비경구 (예를 들면, 정맥, 피하, 근육) 투여의 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 비경구 운반체 (예를 들면, 물, 살린, 덱스트로스 용액) 및 등장성을 유지시키는 첨가제 (예를 들면, 만니톨) 또는 화학적 안정성 (예를 들면, 보존제 및 완충제)와 함께, 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 동결건조된 분말로 제형화될 수 있다. 상기 제제는 통상적으로 사용되는 기술에 의해 멸균된다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물의 활성 성분들은 다양한 방법으로 개체에 투여될 수 있다. 투여 경로는 피내, 경피 (예를 들면, 느린 방출 제제), 근육, 복막, 정맥, 피하, 경막외, 국소, 구강 경로 및 에어로졸 투여, 비강 경로 또는 흡입을 포함할 수도 있다. 임의의 다른 치료학적으로 유효한 투여 경로로는 상피 또는 내피 조직을 통한 흡수 또는 활성 작용제를 암호화하는 DNA 분자가 환자에게 (예를 들면, 벡터를 통해) 투여됨으로써, 상기 활성 작용제가 생체 내에서(in vivo) 발현되거나 분비되는 유전자 치료에 의한 흡수가 사용될 수 있다. 게다가, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 계면활성제, 부형제, 담체, 희석제 및 운반체와 같은 생물학적 활성 작용제의 다른 구성성분들과 함께 투여될 수 있다.
개체에 투여되는 투여량은 다양한 인자, 예를 들면 약물동역학적 특성, 투여 경로, 환자의 상태 및 특성 (성별, 연령, 체중, 건강상태, 크기), 증상의 정도, 공동 치료, 치료의 횟수 및 원하는 효과에 따라 다양할 것이다.
본 발명의 항체는 원하는 사용 방법 및/또는 생산 방법에 따라 적합한 대체적인 형태로 생산되거나, 제형화되거나, 투여되거나 또는 사용될 수 있다. 유용한 컨쥬게이트 또는 복합체가 또한 약물 전달 효능의 관점에서 작용제를 향상시키기 위하여 형성될 수 있다. 본 목적을 위하여, 본 명세서에 기술된 항체는 활성 컨쥬게이트 또는 폴리에틸렌 글리콜 및 다른 천연 또는 합성 폴리머와 같은 분자와의 복합체 형태로 존재할 수 있다 (Harris JM et al. 2003). 이와 관련하여, 본 발명은 항체가 폴리머와 링크된, 화학적으로 변형된 항체를 의도한다. 전형적으로, 상기 폴리머는 수용성으로서, 컨쥬게이트는 생리학적 환경과 같은 수계 환경에서 침전하지 않는다. 더욱이, 폴리머의 혼합물이 컨쥬게이트를 생산하기 위하여 사용될 수 있다. 치료를 위해 사용되는 컨쥬게이트는 약물동역학적으로 허용가능한 수-용성 폴리머 모이어티를 포함할 수 있다. 적합한 수-용성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 모노메톡시-PEG, 아릴옥시-PEG, 비스-숙시니미딜 카보네이트 PEG, 프로필렌 글리콜 호모폴리머, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 코-폴리머, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (예를 들면, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 덱스트란, 셀룰로오스, 또는 다른 카보하이드레이트-기재 폴리머를 포함한다. 적합한 PEG는 약 600 내지 약 60,000의 분자량을 가질 수도 있는 것으로, 예를 들면 5,000, 12,000, 20,000 및 25,000를 포함한다. 컨쥬게이트는 또한 상기 수-용성 폴리머의 혼합물을 포함할 수 있다. 컨쥬게이트의 예는 임의의 상기에 개시된 임의의 항체 및 N-말단에 부착된 폴리아크릴 옥사이드 모이어티를 포함한다. PEG는 적합한 폴리아크릴 옥사이드이다. 예시된 바와 같이, 본 명세서에 개시된 임의의 항체는 PEG로서, "PEG화(PEGylation)"로 알려진 공정을 통해 변형될 수 있다. PEG화는 본 기술분야에 알려진 임의의 PEG화 반응에 의해 수행될 수 있다 (Francis GE et al. 1998). 예를 들면, PEG화는 아크릴화 반응에 의해 또는 반응성 폴리에틸렌 글리콜 분자와의 아크릴화 반응에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 모든 변형은 인간 IL-22RA에 결합하는 항체의 결합력에 유의적으로 영향을 미치지 않는다.
본 발명은 또한 상기 기술된 것들과 기능적으로 동등한(equivalent) 재조합 인간 IL-22RA에 대한 인간화된 항체를 포함한다. 개선된 안정성 및/또는 치료학적 유용성을 제공하는 변형된 인간화된 항체가 또한 포함된다. 변형된 항체의 예로는 항원 유용성을 유의적으로 해롭게 바꾸지 않는, 아미노산 잔기의 보존적 치환, 및 아미노산의 일 또는 그 이상의 결실 또는 첨가를 포함한다. 치환은 일 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 바꾸거나 변경하는 것으로부터 치료적 유용성이 유지되는 한, 영역을 완전히 재설계하기에 이르기까지 다양할 수 있다. 본 발명의 인간화된 항체는 번역-후 변형될 수 있거나 (예를 들면, 아세틸화, 및 인산화), 합성적으로 변형될 수 있다 (예를 들면, 표지화 기의 부착). 본 발명의 방법에 의해 설계된 인간화된 항체는 항원 결합 또는 다른 면역글로불린 기능에 유의적으로 영향을 미치지 않는 추가의 보존적 아미노산 치환을 가질 수도 있는 것으로 이해된다.
본 발명의 인간화된 항체는 또한 변형된 유도체를 포함할 수 있는 것으로, 예를 들면 상기 유도체는 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질 가수분해성 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에 대한 결합에 의해 변형된, 인간화된 항체를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 부가적으로, 상기 유도체는 일 또는 그 이상의 비-분류 및/또는 비-천연 아미노산을 함유할 수도 있다. 생체내에서 본 발명에 따른 인간화 항체의 반감기는 Fc 영역과 FcRn 수용체 사이의 상호작용에 관여하는 것으로 동정된 아미노산 잔기를 변형 (예를 들면, 치환, 결실 또는 첨가)하는 것에 의해 증가될 수 있다.
본 명세서에서 인용되어 있는 모든 참고문헌, 예를 들면 간행물 기사 또는 발췌문, 공개 또는 비공개 U.S. 또는 해외 특허 출원, 발행 U.S 또는 해외 특허 또는 임의의 다른 참고문헌들은 상기 인용된 참고문헌 내에 존재하는 모든 데이타, 표, 도면 및 본문을 포함하는 그 전체내용이 본 명세서에서 참조로 통합된다. 부가적으로, 본 명세서 내에 인용된 참고문헌 내에 인용되어 있는 참고문헌의 모든 내용은 그 전체내용이 참조로 통합된다.
특정 구현예의 상기 상세한 설명은 또한 본 발명의 일반적 성질을 충분히 나타내기 위한 것이며, 본 기술분야 (본 명세서에서 인용된 참고문헌의 본문을 포함)에서 통상의 기술을 가진 자들의 지식을 적용함으로써, 과도한 실험 없이, 본 발명의 일반적 개념을 벗어남이 없이, 다른 것들이 상기 특정 구현예와 같은 다양한 적용을 위해 용이하게 변경되거나 및/또는 선택될 수 있다. 따라서, 그러한 선택 및 변경은 본 명세서에 존재하는 개시내용 및 안내를 바탕으로, 개시된 구현예에 대한 등가물의 범위를 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서에 기술된 어법 또는 용어는 설명의 목적을 위한 것으로 제한하려는 목적이 아님이 이해될 것이다.
실시예
실시예 1: 인간화 공정을 위한 출발 항체의 선별
2005년 10월 21일자 출원된 PCT 특허 출원 WO 2006/047249의 실시예 18에 기술된 5개의 하이브리도마에 의해 발현된 마우스 항-인간 IL-22RA 모노클로날 항체를 비교함으로써, 인간화 공정의 출발점으로 사용할 것을 선별하였다. 상기 선별에서 가장 중요한 기준은 다음과 같다: 인간 IL-22RA에 대한 높은 친화도, 뮤린 IL-22RA와의 상호-반응성, IL-22BP와의 비 상호-반응성 및 인간 IL-22RA에 대한 비 길항적 활성. 오직 하나의 항체, 예를 들면, 마우스 lgG1/카파 항체인, 280.46.3.4 (ATCC Patent Deposit Designation PTA-6284)로 불리는 하이브리도마에 의해 발현된 항체만이 상기 모든 기준을 만족하였다 (데이타는 나타내지 않음).
상기 마우스 항-인간 IL-22RA 모노클로날 항체 (이하 "마우스 280.46.3.4"라 함)의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인의 특정 아미노산 염기서열을 각각 SEQ ID NO: 25 및 26에 나타내었다.
실시예 2: 재형성 인간화된 280.46.3.4 가변 도메인의 설계
A. 프레임워크 염기서열을 위한 상동 인간 생식세포의 선별
전체 염기서열 (프레임워크 및 CDR)이 마우스 280.46.3.4 VL의 것과 높은 비율로 동일성을 나타내는, 인간 생식세포 카파 경쇄 가변 도메인을 IMGT-GENE 데이타베이스 (Giudicelli V. et al. 2005)를 사용하여, 아미노산 염기서열을 비교함으로써 동정하였다. 마우스 280.46.3.4 VL는 인간 면역글로불린 생식세포 카파 가변 유전자 4-1 (IGKV4-1)와 가장 동종인 것으로, 82.2 % (101개 중에서 83개의 아미노산 잔기; 도 1)의 동일성을 나타내었다. SEQ ID NO: 27에 나열된, IGKV4-1를 CDR-그레프트를 위한 인간 프레임워크 수용체 염기서열로 선택하였다. 마우스 280.46.3.4 VH의 경우, 인간 생식세포와 높은 비율의 동일성이 없는 것을 IMGT-GENE 데이타베이스를 사용하여 동정하였다. 인간 면역글로불린 생식세포 중쇄 가변 유전자 1-46 (IGHV1-46) 인간 생식세포를 60.2% 동일성 (98개 중에서 59개의 아미노산 잔기)으로 높은 유사도를 갖도록 동정하였다. 그러나, SEQ ID NO: 28에 나열된, IGHV3-66가 그것의 염기서열이 가변의 중요한 프레임워크 위치 내의 마우스 280.46.3.4 VH의 것과 가까워서 우수한 안정성을 제공하기 때문에, 그것의 낮은 유사도 (50.0% 동일성, 98개의 아미노산 중 49개의 아미노산 잔기; 도 2)에도 불구하고 인간 프레임워크 수용체로서 유효하게 선별되었다.
B. 프레임워크 영역 내에서의 아미노산 치환
B.1 경쇄
인간화된 280.46.3.4 VL를 위한 설계의 다음 단계는 마우스 280.46.3.4 VL로부터의 CDR을 인간 생식세포 IGKV4-1로부터 프레임워크 영역 (FR)에 연결하는 것이다. 면역글로불린 카파 연결 1 인간 생식세포 유전자 (IGKJ1)를 마우스 J 유전자 대신에 사용하였다. SEQ ID NO: 29에 나열된, 재형성 인간화된 280.46.3.4 VL의 제1버전 (280.VK4-1-C)에서, 어떠한 변화도 인간 FR에서 나타나지 않았는바, 즉 FR 내의 어떠한 마우스 잔기도 구조적으로 중요할 것으로 여겨지지 않는다. IGKV4-1와 인간화된 280.46.3.4 VL의 제1버전 (280.VK4-1-C) 사이의 배열을 도 3에 나타내었다.
B.2 중쇄
인간화된 280.46.3.4 VH를 위한 설계 공정에서의 다음 단계는 마우스 280.46.3.4 VH로부터의 CDR을 인간 생식세포 IGHV3-66로부터의 FR에 연결하는 것이다. SEQ ID NO: 30에 나열된, 재형성 인간화된 280.46.3.4 VH의 제1버전 (280.VH3-66.1)에서, 12개의 변화가 인간 프레임워크 영역에서 형성되었다 (도 4). 인간 FR에서의 12개의 변화는 위치 27, 28, 29, 30, 48, 49, 67, 69, 70, 71 , 73 및 78 (표 1의 번호 참고)에 있었다.
표 1. 인간화된 280.46.3.4 VH의 설계를 야기하는 아미노산 염기서열의 배열.
제1컬럼 (Kabat 번호)은 Kabat에 따른 잔기의 번호를 제공한다 (Kabat et al. 1991). FR 및 CDR는 4개의 FR을 분리하는 3개의 CDR로, 중쇄 가변 도메인의 프레임워크 영역 (H-FR1, H-FR2, H-FR3, 및 H-FR4) 및 보체-확인 영역 (H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3)을 동정한다. 제2컬럼 (Chothia 번호)은 Chothia의 CDR 정의에 따른 잔기의 번호를 제공한다 (Al-Lazikani et al. 1997). 제3컬럼 (마우스 280.46.3.4 VH)은 마우스 280.46.3.4의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 염기서열을 제공한다. 제4컬럼 (IGHV3-66)은 CDR-그래프트를 위한 인간 수용체 프레임워크로 사용된 인간 면역글로불린 생식세포 중쇄 가변 유전자 3-66 (accession number IMGT X92218)의 아미노산 염기서열을 제공한다. 제5컬럼 (인간화된 280.VH3-66-46)은 마우스 280.46.3.4 VH의 최종 인간화된 버전의 아미노산 염기서열을 제공하는 것으로; 밑줄친 잔기들은 인간 생식세포 IGHV3-66와 다른 아미노산을 나타낸다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
H-FR 내의 위치 27, 28, 29 및 30에서, 인간 생식세포 IGHV3-66 내에 존재하는 아미노산이 마우스 280.46.3.4 VH 내의 상기 위치에서 발견되는 아미노산으로 바뀌었다. 상기 위치들은 H-FR1 (Kabat 번호; 표 1) 내에 있는 것으로 지정되어 있지만, 위치 26 내지 30은 VH의 H-CDR1 루프를 형성하는 구조적 루프의 일부이다. 따라서, 상기 위치에 있는 아미노산은 형원과의 결합에 직접적인 관련성이 있을 것이다. 사실, 위치 27 내지 30은 Chothia에 의해 정의된 (표 1) H-CDR1의 정규 구조의 일부이다.
H-FR2 내의 위치 48 및 49에서, 인간 생식세포 IGHV3-66 내에 존재하는 아미노산 (각각, 발린 및 세린)이 마우스 280.46.3.4 VH 내의 상기 위치에서 발견되는 아미노산 (각각, 이소루신 및 글리신; 표 1)으로 바뀌었다. 이러한 두개의 잔기는 H-CDR2에 매우 가까운 것으로 CDR 루프의 정밀한 구조에 영향을 미친다.
H-FR3 내의 위치 67, 69, 70, 73 및 78에서, 인간 생식세포 IGHV3.66 내에 존재하는 아미노산 (각각, 페닐알라닌, 이소루신, 세린, 아스파라진 및 루신)이 마우스 280.46.3.4 VH 내의 상기 위치에서 발견되는 아미노산 (각각, 알라닌, 루신, 트레오닌, 글루타민 및 알라닌; 표 1)으로 바뀌었다. 이러한 5개의 잔기들은 VL 및 VH 도메인의 패킹에 중요한 것으로 항체의 전체 안정성에 매우 영향을 미친다.
H-FR3 내의 위치 71에서, 인간 생식세포 IGHV3-66 내에 존재하는 아르기닌이 마우스 280.46.3.4 VH 내의 상기 위치에서 발견되는 발린으로 바뀌었다. 위치 71은 Chothia에 의해 정의된 H-CDR2의 정규 구조의 일부이다 (표 1). 상기 위치에서 아르기닌의 발린으로의 치환은 H-CDR2 루프의 위치화를 매우 방해한다.
실시예 3: 경쇄의 CDR1 내에서의 유리 시스테인의 제거
280.VK4-1-C와 결합하는 280.VH3-66-1를 포함하는 인간화된 280.46.3.4 항체의 발현 및 정제 동안 높은 수준의 공유 응집체 형성과 관련되는 Kabat 위치 32 (표 2의 번호 참고)에 경쇄의 CDR1 (L-CDR1) 기에 배결합 시스테인이 존재한다 (데이타로 나타내지 않음).
표 2. 인간화된 280.46.3.4 VL의 설계를 야기하는 아미노산 염기서열의 배열.
제1컬럼 (Kabat & Chothia 번호)은 Kabat (Kabat et al. 1991) 및 Chothia (Al-Lazikani et al. 1997)에 따른 잔기의 번호를 제공한다. FR 및 CDR는 4개의 FR을 분리하는 3개의 CDR으로, 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 영역 (L-FR1, L-FR2, L-FR3, 및 L-FR4) 및 보체-확인 영역 (L-CDR1, L-CDR2, 및 L-CDR3)을 동정한다. 제2컬럼 (마우스 280.46.3.4 VL)은 마우스 280.46.3.4의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 염기서열을 제공한다. 제3컬럼 (IGKV4-1)은 CDR-그래프트를 위한 인간 수용체 프레임워크로 사용된 인간 면역글로불린 생식세포 카파 가변 유전자 4-1 (accession number IMGT Z00023)의 아미노산 염기서열을 제공한다. 제4컬럼 (인간화된 280.VK4-1-TSY)은 마우스 280.46.3.4 VL의 최종적으로 최적화된 인간화된 버전의 아미노산 염기서열을 제공하는 것으로; 상기 밑줄친 잔기들은 인간 생식세포 IGKV4-1와 다른 아미노산을 나타낸다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
유리 시스테인을 제거하기 위하여, 시스테인이 크기 및 친수성이 거의 보존적으로 변화 가능한 세린으로 돌연변이화된, SEQ ID NO: 31에 나열된, 인간화된 경쇄의 제2버전, 280.VK4-1-S을 설계하여 제조하였다. 단백질 A 정제 이후에, SDS 겔 상에서, 시스테인 비함유 항체 (예를 들면, 280.VK4-1-S와 결합된 280.VH3-66-1를 포함하는 인간화된 280.46.3.4 항체)의 프로파일이 시스테인 함유 항체 (예를 들면, 280.VK4-1-C와 결합된 280.VH3-66-1를 포함하는 인간화된 280.46.3.4 항체) 보다 잘 보인다 (도 5). 더 나은 프로파인이란, 유리 시스테인을 함유하는 항체 (80.VK4-1-C; 도 5 내의 "이전")와 비교해 볼 때, 비결합 시스테인이 없는 항체 (280.VK4-1-S; 도 5 내의 "이후")에서 부산물에 비해 중쇄 및 경쇄가 더 정확히 관여함을 의미한다.
280.VK4-1-S와 결합된 280.VH3-66-1을 포함하는, 인간 lgG1/카파로 발현되는 인간화 항체의 효능을 3개의 별개의 세포 분석법으로 평가하였다:
1 ) 인간 HepG2 간암 세포에서 STAT3 인산화 검정법. HepG2 인간 간암 세포주를 ATCC (American Type Culture Collection)로부터 수득하고, 24-웰 플레이트 내에서 재조합 인간 IL-22로 자극하였다. 중성화 항체의 연속 희석물을 EC80에서 IL-22와 혼합하고, 20분 동안 세포에 첨가하였다. HepG2 용해물을 Cell Signaling으로부터의 PathScan Phospho-STAT3 Sandwich ELISA 키드로 검사하고, 검사된 항체의 IC50 수치를 측정하였다. 상기 HepG2 검정법에서, 각각 257.5 pM 및 370.5 pM의 IC50 수치로서, 인간화된 항체는 280.46.3.4 히브리도마 (ATCC Patent Deposit Designation PTA-6284)로부터 정제된, 유리 시스테인을 함유하는, 마우스 부모 항체 보다 1.4배 이상의 효능을 갖는 것으로 관찰되었다 (도 6).
2) BaF3 세포에서 증식 검정법. BaF3 세포주를 인간 IL-22 수용체 사슬 (IL-22RA 및 IL-10RB)로 형질감염시키고 96-웰 플레이트 내에서 재조합 인간 IL-22와 배양하였다. 중성화 항체의 연속 희석물을 상기 세포에 첨가하고, BaF3 증식에 미치는 영향을 트리티에이티드 티미딘 통합 측정법에 의해 측정하였다. 상기 인간 IL-22 수용체 형질감연된-BaF3 안정한 세포주 검정법에서, 각각 340 및 587 pM의 IC50 수치로서, 상기 인간화된 항체는 280.46.3.4 히브리도마 (ATCC Patent Deposit Designation PTA-6284)로부터 정제된, 유리 시스테인을 함유하는, 마우스 부모 항체 보다 1.7 배 이상의 효능을 가지는 것으로 관찰되었다 (도 7).
3) BaF3 세포 내에서 증식 검정법. BaF3 세포주를 뮤린 IL22 수용체 사슬 (IL-22RA 및 IL-10RB)로 형질감염시키고 96-웰 플레이트 내에서 재조합 뮤린 IL-22와 배양하였다. 중성화 항체의 연속 희석물을 상기 세포에 첨가하고, BaF3 증식에 미치는 영향을 트리티에이티드 티미딘 통합 측정법에 의해 측정하였다. 상기 뮤린 IL-22 수용체 형질감연된-BaF3 안정한 세포주 검정법에서, 각각 693 및 1473 pM의 IC50 수치로서, 상기 인간화된 항체는 280.46.3.4 히브리도마 (ATCC Patent Deposit Designation PTA-6284)로부터 정제된, 유리 시스테인을 함유하는, 마우스 부모 항체에 보다 2.1 배 이상의 효능을 가지는 것으로 관찰되었다 (도 8).
결론적으로, L-CDR1 내의 유리 시스테인의 돌연변이는 원래의 마우스 280.46.3.4 항체와 비교해 볼 때, 생물리학적 특성 뿐만 아니라 인간 및 마우스 IL-22RA 상의 280.VK4-1-S와 결합된 280.VH3-66.1를 포함하는 인간화된 280.46.3.4 항체의 효능을 급진적으로 향상시킨다.
실시예 4: L- CDR1 내의 디아미드화 모티프의 제거 및 인간화된 280.46.3.4 VH 내의 인간화도의 증가
항체는 다양한 화학적 변형 및/또는 분해 반응, 예를 들면 디아미드화, 이성체화, 가수분해, 디설피드 스크램블링, 베타-제거화, 산화 및 부가 형성의 대상이될 수 있다. 분해의 주요 가수분해 기전은 특히 글라이신 또는 세린 이후의 아스파라진의 디이미드화를 포함할 수 있다. L-CDR1에서 세린에 의한 시스테인의 치환은 잠재적 디이미드화 부위를 구성하는 NS 모티프를 생성하므로 제거되어야만 한다. 상기 NS 모티프를 제거하기 위한 시도로서, 연속적인 돌연변이체를 구성하였다 (데이타는 나타내지 않음). 가장 전체적인 돌연변이는 세린으로부터 트레오닌까지의 변화였다. SEQ ID NO: 32에 나열된, 돌연변이화된 경쇄 가변 도메인 (280.VK4-1-T)은 인간화된 280.46.3.4 VH의 제4버전 (280.VH3-66-4; 하기 참고)과 결합하는 것으로, 세포 기반 검정법으로 억제 효능을 평가하였다.
인간화된 280.46.3.4 VH의 제4버전 (280.VH3-66-4)에서, 잔기 70 (표 1)은 상기 위치에서 발견되는 인간 생식세포 잔기로 돌연변이화, 즉 트레오닌에서 세린으로 돌연변이 되었다. 또한, H-CDR2의 마지막 2개의 잔기, 위치 64 및 65에 있는 글루탐산 및 알라닌 (표 1)은 상기 위치에서 발견되는 인간 생식세포 잔기들로; 각각 리신 및 글라이신으로 돌연변이 되었다. 전체적으로, SEQ ID NO: 33에 나열된, 인간화된 280.46.3.4 VH의 제4버전 (280.VH3-66-4)은 H-CDR2내에 위치하는 상기 잔기들 중 2개를 갖는 (도 9와 도 4의 비교), 제1버전 (280.VH3-66-1)과 비교해볼 때, 3개의 더 많은 인간 생식세포 잔기들을 가진다.
280.VK4-1-T와 결합하는 280.VH3-66-4를 포함하는, 인간 lgG1/카파로서 발현되는 인간화된 항체의 효능을 각각 상기 실시예 3에서 기술한 3개의 세포 검정법으로 평가하였다.
1) HepG2 검정법에서, 각각 183.2 및 333.0 pM의 IC50 수치로서, 상기 인간화된 항체는 280.46.3.4 히브리도마 (ATCC Patent Deposit Designation PTA-6284)로부터 정제된 마우스 부모 항체 보다 1.8배 이상의 효능을 갖는 것으로 관찰되었다 (도 10).
2) 인간 IL-22 수용체 형질감염된-BaF3 안정한 세포주 검정법에서, 각각 334 및 587 pM의 IC50 수치로서, 상기 인간화된 항체는 280.46.3.4 히브리도마 (ATCC Patent Deposit Designation PTA-6284)로부터 정제된 마우스 부모 항체 보다 1.75배 이상의 효능을 갖는 것으로 관찰되었다 (도 11).
3) 뮤린 IL-22 수용체 형질감염 BaF3 안정한 세포주 검정법에서, 각각 687 및 1473 pM의 IC50 수치로서, 상기 인간화된 항체는 280.46.3.4 히브리도마 (ATCC Patent Deposit Designation PTA-6284)로부터 정제된 마우스 부모 항체 보다 2.1 배 이상의 효능을 갖는 것으로 관찰되었다 (도 12).
실시예 5: 인간화된 280.46.3.4 VH 의 CDR1 에서 Asp 내지 Glu 의 Kabat 잔기 32의 돌연변이는 친화도를 증가시키고 안정성을 향상시킨다.
항체는 다양한 화학적 변형 및/또는 분해 반응, 예를 들면 디아미드화, 이성체화, 가수분해, 디설피드 스크램블링, 베타-제거화, 산화 및 부가 형성의 대상이될 수 있다. 분해의 주요 가수분해 기전은 아스팔트산 (Asp)의 이성체화를 포함할 수 있다. 상기를 예방하기 위하여, H-CDR1 내의 Asp 32 및 H-CDR3 내의 Asp 96이 각각 280.VH3-66-4에서 돌여변이된, 돌연변이체 세트가 만들어진다. 이러한 단일 돌여변이체는 그 다음 상기 기술된, 인간화된 경쇄 가변 도메인 280.VK4-1-T와 결합하고, 생성된 NiNTA-정제된 Fab 항체 단편을 Biacore에 의해 친화도 측정 시험하였다. H-CDR1 내의 위치 332에서 Asp의 Glu로의 돌연변이를 함유하는 VH를 제18버전 또는 280.VH3-66-18으로 하였고, SEQ ID NO: 34에 나열하였다. 도 13에 존재하는 인간 IL-22RA에 대한 결합 측정하는 Biacore 분석 결과는 D32E 돌연변이가 상기의 부모 돌연변이화된 D32 (280.VH3-66-4)에 비해, 온 레이트 (on rate)를 약 2배까지 증가시키고 오프 레이트 (off rate)를 약 5배까지 감소시킴을 나타낸다. 반면, D96E 돌연변이는 부정적인 영향을 미쳤는바, 약 500배까지 친화도를 감소시켰다. 시차 주사 열량계 (differential scanning calorimetry, DSC)로 분석한 경우, 돌연변이 D32E는 그것의 부모 D32 항체보다 1도 더 안정한 것으로 나타냈다 (도 14). 전체적으로, D32E 돌연변이는 최신의 중쇄 인간화 제18버전 (280.VH3-66-18)의 특성을 크게 향상시킨다는 결론을 내릴 수 있다.
280.IGKV4-1-T와 결합하는 280.VH3-66.18를 포함하는, 인간 lgG1/카파로서 발현되는 인간화된 항체를 HepG2 세포 검정법으로 평가하였다. 도 15에 존재하는 결과는 각각 132.5 및 370.5 pM의 IC50 수치로서, 인간화된 항체 (280.VH3-66.18/VK4-1-T)는 280.46.3.4 히브리도마 (ATCC Patent Deposit Designation PTA-6284)로부터 정제된 마우스 부모 항체 보다 거의 3배 이상의 효능을 가짐을 나타낸다.
실시예 6: 인간화도의 증가
A. 중쇄
부모 마우스 280.46.3.4에 비해, 인간화된 280.46.3.4의 증가된 친화도, 효능 및 안정성을 갖도록, 최종 인간화된 버전의 인간화도를 증가시키기 위한 시도로서 연속 돌연변이체를 설계하였다. 본 목표는 많은 프레임워크 잔기들이 마우스의 부모 오리진이 대응하는 인간 생식세포 IGHV3-66 잔기로 되돌아갈 수 있도록 돌연변이화 하는 것이다. 이 공정 동안, 본 발명자들은 성공적으로 잔기 Ala 67 및 Leu 69를 각각 잔기 Phe 및 lie로 다시 돌연변이시킬 수 있었다 (표 1). 또한, 인간 생식세포 IGHV3-66 내에 존재하는 발린 대신, 위치 29에 이소루신을 도입하는 경우 열적 안정성에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 발견하였다 (데이타는 나타내지 않음). lie 29가 인간 생식세포 IGHV3-66 (val 29) 내의 상기 위치에서 발견되는 보통의 잔기가 아님에도 불구하고, 활성의 손실 없이 안정성에 긍정적인 영향을 미치기 때문에, 그것을 SEQ ID NO. 16에 나열된, 최종 인간화된 VH 제46버전 (280.VH3-66-46)에 통합할 것을 결심하였다. 인간 생식세포 IGHV3-66를 갖는, 최종 인간화된 VH 제46버전 (280.VH3-66-46)의 염기서열 배열은 9개의 마우스 프레임워크 잔기가 보존되어 있음을 나타낸다 (도 16 및 표 1).
B. 경쇄
인간화된 경쇄, 인간으로부터의 모든 프레임워크 잔기들에서, CDR 잔기들의 생식세포 가능성을 조사하였다. 마우스 CDR 잔기들 내의 일련의 돌연변이를 각각의 CDR 잔기의 동일한 위치에서 발견되는 인간 생식세포 IGKV4-1 잔기로 돌연변이화하는 것에 의해 건설하였다. 돌연변이체를 시차 주사 열량계 및 Biacore로 스크리닝하여 각각 열적 안정성 및 친화도를 관찰하였다. L-CDR3 내의 위치 92에 있는 Phe가 열적 안정성에서 섭씨 1도를 얻고 친화도의 손실 없이 인간 생식세포 IGKV4-1 내의 상기 위치에 존재하는 Tyr 잔기로 치환될 수 있음을 발견하였다. 상기 최적의 인간화 VL 염기서열을 280.VK4-1-TSY로 명명하고, SEQ ID NO. 17에 나열하였다. 도 17에 나타낸, 인간 생식세포 IGKV4-1를 갖는 그것의 배열은 280.VK4-1-TSY가 염기서열이 5 위치에서만 다르기 때문에, 프레임워크 및 CDR 잔기들을 포함하는, 그것의 생식세포 IGKV4-1 염기서열과 매우 동일함을 나타낸다 (도 17 및 표 2).
상기 언급된 모든 인간화된 항체를 특정 중쇄 가변 도메인을 SEQ ID NO: 18에 나열된 불변 영역에, 그리고 특정 경쇄 가변 도메인을 SEQ ID NO: 19에 나열된 불변 도메인에 연결하는 것에 의해 생산하였다. 이러한 불변 영역은 일 예로서 사용될 수 있으며 결합 친화도 및 항체 특이성이 가변 도메인 내에 존재하므로 다른 것에 의해 용이하게 치환될 수 있음을 주목해야 한다. 상기-언급된 Fab과 관련하여, 그들은 SEQ ID NO: 18에 나열된 염기서열의 제1중쇄 불변 도메인 (CH1) 및 SEQ ID NO: 19에 나열된 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
상기 실시예에 언급된 다른 인간화된 항체 및 Fab를 2개의 다른 프로모터의 조절 하에 중쇄 및 경쇄를 위한 cDNA 코딩을 포함하는, 단일 발현 벡터를 사용하여 CH0 세포에서 생산하였다.
실시예 7: 인간 IL -22 RA 발현-세포 검정법에서 280. VK4 -1- TSY VL 와 결합된 인간화된 280. VH3 -66-46 VH 의 효능
280.IGKV4-1-TSY와 결합된 280.VH3-66.46을 포함하는, 인간 lgG1/카파로 발현되는 인간화된 항체의 효능을 3개의 별개 세포 검정법으로 평가하였다. 이하, 상기 용어 "280.346.TSY"는 중쇄 및 경쇄 불변 영역과 상관없이, 280.IGKV4-1-TSY와 결합된 280.VH3-66.46를 포함하는 항-인간 IL-22RA 인간화 항체를 나타내는 것으로 사용된다.
1) 보통의 인간 케라틴생성세포에서 STAT3 인산화 검정법. 보통의 인간 케라틴생성세포를 Biopredic International로부터 수득하고 96-웰 플레이트에서 재조합 인간 IL-22로 자극하였다. 중성화 항체의 일련의 희석물을 EC80에서 IL-22와 혼합하고 20분 동안 세포에 첨가하였다. 케라틴생성세포 용해물을 Cell Signaling로부터의 PathScan Phospho-STAT3 Sandwich ELISA 키트로 검사하고 검사된 항체의 IC50 수치를 측정하였다. 상기 보통의 인간 케라틴생성세포 검정법에서, 각각 60.95 및 541.9 pM의 IC50 수치로서, 280.346.TSY가 280.46.3.4 히브리도마 (ATCC Patent Deposit Designation PTA-6284)로부터 정제된 마우스 부모 항체 보다 거의 9배 이상의 효능을 가지는 것으로 관찰되었다.
2) HepG2 세포에서 STAT3 인간화 검정법. HepG2 인간 간암 세포주를 ATCC (American Type Culture Collection)로부터 수득하고 24-웰 플레이트에서 재조합 인간 IL-22로 자극하였다. 중성화 항체의 연속 희석물을 EC80에서 IL-22로 혼합하고 20분 동안 세포에 첨가하였다. HepG2 용해물을 Cell Signaling로부터의 PathScan Phospho-STAT3 Sandwich ELISA 키트로 검사하고, 검사된 항체의 IC50 수치를 측정하였다. 상기 HepG2 검정법에서, 각각 55.16 및 266.3 pM의 IC50 수치로서, 280.346.TSY가 280.46.3.4 히브리도마 (ATCC Patent Deposit Designation PTA-6284)로부터 정제된 마우스 부모 항체 보다 거의 5배 이상의 효능을 가지는 것으로 관찰되었다 (도 19) .
3) BaF3 세포에서 증식 검정법. BaF3 세포주를 인간 IL-22 수용체 사슬 (IL-22RA 및 IL-10RB)로 형질감염한 후 96-웰 플레이트에서 재조합 인간 IL-22와 배양하였다. 중성화 항체의 연속 희석물을 세포에 첨가하고, BaF3 증식에 미치는 효과를 트리티에이티드 티미딘 통합 측정법에 의해 측정하였다. 상기 인간 IL-22 수용체 형질감염된-BaF3 안정한 세포주 검정법에서, 각각 317 및 545 pM의 IC50 수치로서, 280.346.TSY는 280.46.3.4 히브리도마 (ATCC Patent Deposit Designation PTA-6284)로부터 정제된, 마우스 부모 항체에 보다 1.7 배 이상의 효능을 가지는 것으로 관찰되었다 (도 10).
특정 280.346.TSY의 중쇄 및 경쇄 불변 영역의 아미노산 염기서열을 각각 SEQ ID NO: 18 및 19에 나열하고, 상기 특정 280.346.TSY의 전체 중쇄 및 경쇄 아미노산 염기서열을 각각 SEQ ID NO: 20 및 21에 나열하였다.
실시예 8: 마우스 IL -22 RA 발현-세포 검정법에서 인간화된 280.346. TSY 의 효능
80.346.TSY의 효능을 2개의 다른 세포 검정법으로 평가하였다:
1) HEPA1-6 세포에서 인산 검정법. HEPA1-6 뮤린 간암 세포주를 DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)로부터 수득하고 96-웰 플레이트에서 재조합 뮤린 IL-22로 자극하였다. 중성화 항체의 연속 희석물을 EC80에서 IL-22와 혼합하고 20분 동안 세포에 첨가하였다. 인간 lgG1를 대조군으로 사용하였다. HEPA1-6 용해물을 Cell Signaling로부터의 PathScan Phospho-STAT3 Sandwich ELISA 키트로 검사하고, 검사된 항체의 IC50 수치를 측정하였다. 상기 HEPA1-6 검정법에서, 280.346.TSY는 IC50을 사용한 뮤린 IL-22의 활성이 나노몰 범위 (2,1 nM; 도 21)에로 억제된다는 것이 관찰되었다.
2) BaF3에서 증식 검정법. BaF3 세포주를 뮤린 IL-22 수용체 사슬 (IL-22RA 및 IL-10RB)로 형질감염한 후 96-웰 플레이트에서 재조합 뮤린 IL-22와 배양하였다. 중성화 항체의 연속 희석물을 세포에 첨가하고, BaF3 증식에 미치는 영향을 트리티에이티드 티미딘 통합 측정법에 의해 측정하였다. 상기 마우스 IL-22 수용체 형질감염된-BaF3 안정한 세포주 검정법에서, 각각 137 및 849 pM의 IC50 수치로서, 280.346.TSY는 280.46.3.4 히브리도마 (ATCC Patent Deposit Designation PTA-6284)로부터 정제된, 마우스 부모 항체에 보다 6.2 배 이상의 효능을 가지는 것으로 관찰되었다 (도 22).
실시예 9: 경쟁적 ELISA 에 의한 IL -22 RA 관련 단백질 상의 280.346. TSY 의 결합 특이도
280.346.TSY의 특이도 및 결합 친화도를 경쟁적 ELISA를 사용하여 측정하였다. 미세역가 플레이트를 인간 IL-22RA-ECD (즉. IL-22RA-세포외 도메인)로 코팅하였다. 비오틴화 280-346-TSY 항체를 경쟁자: 간 인터루킨 22 수용체 알파 (hlL-22RA), 인간 IL-22 결합 단백질 (hlL-22BP), 마우스 IL-22 수용체 알파 (mlL-22RA), 인간 IL-10 수용체 알파 (hlL-10R) 및 인간 IL-20 수용체 알파 (hlL-20R)의 존재 하에 플레이트에 첨가하였다. 플레이트 상에 코팅된 hlL-22RA의 결합은 퍼옥사이드 컨쥬게이트된 스트렙타비딘를 첨가함으로써 보인다. 재조합 인간 및 뮤린 IL-22RA의 측정된 IC50 수치는 각각 18.25 pM 및 149.3 pM이었다 (도 23). 모노클로날 항체는 재조합 인간 IL-22BP, IL-10R, 및 IL-20R와 상호-반응성을 나타내지 않았다.
실시예 10: KinExA 및 Biacore 의 Kd 측정에 의해 평가된 IL -22 RA 오르토로그에 대한 280-346- TSY 상호 반응성
280-346-TSY의 Kd를 Biacore 및 KinExA 기구를 사용하여 평가하였다. 인간 및 다른 종 (래트, 마우스, 개, 레서스 원숭이, 사이노몰구스 원숭이 및 마모셋 원숭이)에서 발견되는 동종의 유전자 염기서열의 IL-22RA 세포외 도메인 (ECD)을 HEK-293 세포에서 생산하고, NiNTA-를 6 His 태그를 사용하여 정제하였다. 280-346-TSY 항체는 검사된 IL-22RA의 인간 및 모든 3개의 원숭이 종에 대해 부나노몰 (subnanomolar) 친화도를 가진다. 그것은 인간에 비해 약 100 배 낮은 친화도로서, 마우스에 대한 나노몰 친화도 및 래트 IL-22RA에 대한 마이크로몰 친화도를 가진다 (표 3).
표 3. 인간 IL-22RA-ECD 및 그것의 오르토로그 상의 280-346-TSY 모노클로날 항체의 Kd 친화도 측정
Figure pct00009
실시예 11: 마우스 내의 IL -22-유도 혈청 아밀로이드 A에 미치는 280-346-TSY의 효능
280-346-TSY의 약력학적 활성을 숫컷 Balb/c 마우스 내의 IL-22-유도 혈청 아밀로이드 A상에서 측정하였다. 280.346.TSY의 투여량을 달리함으로써, 재조합 뮤린 IL-22 정맥 주입 전에 22시간 피하 투여하였다. 운반체 대조군은 10 ml/kg으로 PBS를 피하로 투여하였다.
마우스에 이소플루란 마취제 하에 안와정맥총으로 IL-22를 100 μg/kg 제공하였다. IL-22 주입 이후에, 혈액을 이소플루란 마취제 하에 심장 천자에 의해 6시간 동안 샘플링하였다. IL-22를 음성 대조군 (동종형 대조군)으로 사용하였다. 혈청 아밀로이드 A를 ELISA (Biosource)에 의해 측정하였다. 280-346-TSY는 0.5 mg/kg의 ED50 수치를 나타내었다. Mann Whitney 테스트를 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다: * p< 0.05 vs. 동종형 대조군; *** p< 0.001 vs. 동종형 대조군 (도 24).
실시예 12: 마우스 내의 IL -23-유도된 귀 염증에 미치는 280-346- TSY 의 효능
280-346-TSY의 약력학적 활성을 건선을 갖는 마우스 모델에서 측정하였다. 암컷 C57BL/6 마우스에서 두꺼워진 IL-23-유도 귀에 미치는 280-346-TSY의 효능을 검사하였다. 마우스에 Zheng Y et al. (Nature 2007)에 의해 기술된 바와 같이 14일 동안 2틀에 한번씩 재조합 인간 IL-23 500 ng 또는 총 부피 20μl의 PBS를 주입하였다. 280.346.TSY의 투여량을 달리함으로써 재조합 IL-23에 의한 제1투여 이전에 제공된 제1용량으로 2틀에 한번씩 피하로 투여하였다. 운반체 대조군에는 10 ml/kg으로 PBS를 피하 투여하였다. 엑사메타손(Dexa)을 양성 대조군으로 사용하였다. 백분율 억제를 귀가 부풀어오른 피크에 해당하는 9일째에 계산하였다. 280-346-TSY는 1.8 mg/kg의 ED50를 나타내었다.
Figure pct00011
참고문헌 리스트
Figure pct00012
Figure pct00013

Claims (19)

  1. 인간 IL-22RA에 결합하는 인간화 항체로,
    a) 각각 SEQ ID NO: 1, 2 및 3의 아미노산 염기서열로 이루어지는 H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3를 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및
    b) 각각 SEQ ID NO: 4, 5 및 6의 아미노산 염기서열로 이루어지거나 각각 SEQ ID NO: 4, 5 및 7의 아미노산 염기서열로 이루어지는 L-CDR1, L-CDR2, 및 L-CDR3를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 인간화 항체.
  2. 제1항에 있어서, 여기서,
    a) 상기 중쇄 가변 도메인은 각각 SEQ ID NO: 8, 9, 10 및 11의 아미노산 염기서열로 이루어지는 프레임워크(framework) 영역 H-FR1, H-FR2, H-FR3 및 H-FR4를 포함하고, 그리고
    b) 상기 경쇄 가변 도메인은 각각 SEQ ID NO: 12, 13, 14, 및 15의 아미노산 염기서열로 이루어지는 프레임워크 영역 L-FR1, L-FR2, L- FR3 및 L-FR4를 포함하는 인간화 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 여기서,
    a) 상기 중쇄 가변 도메인은 SEQ ID NO: 16의 아미노산 염기서열로 이루어지고, 그리고
    b) 상기 경쇄 가변 도메인은 SEQ ID NO: 17의 아미노산 염기서열로 이루어진 인간화 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 항체는:
    a) SEQ ID NO: 18의 아미노산 염기서열로 이루어지는 중쇄 불변 영역, 및
    b) SEQ ID NO: 19의 아미노산 염기서열로 이루어지는 경쇄 불변 도메인을 포함하는 인간화 항체.
  5. SEQ ID NO: 20의 아미노산 염기서열을 포함하거나 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 21의 아미노산 염기서열을 포함하거나 이루어지는 경쇄를 포함하는 인간 IL-22RA에 결합하는 인간화 항체.
  6. 제5항에 따른 인간화 항체의 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  7. 제6항에 있어서, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 22를 포함하거나 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
  8. 제5항에 따른 인간화 항체의 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  9. 제8항에 있어서, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 23을 포함하거나 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
  10. 제5항에 따른 인간화 항체의 중쇄 및 경쇄 모두를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  11. a) 제6항 또는 제7항에 따른 폴리뉴클레오티드 및 b) 제8항 또는 제9항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  12. 제10항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  13. 제11항 또는 제12항에 따른 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  14. 제13항에 있어서, 상기 세포는 CHO 세포인 숙주 세포.
  15. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 인간화 항체를 제조하는 방법으로, 여기서 상기 방법은 제13항 또는 제14항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 항체를 단리하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 인간화 항체 및 제15항의 방법에 따라 제조된 인간화된 항체를 포함하는 약제학적 조성물.
  17. 약제로 사용하기 위한 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따르거나 제15항의 방법에 따라 제조된 인간화된 항체.
  18. 건선, 건선 관절염 또는 아토피성 피부염의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따르거나 제15항의 방법에 따라 제조된 인간화된 항체.
  19. 건선, 건선 관절염 또는 아토피성 피부염의 치료용 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따르거나 제15항의 방법에 따라 제조된 인간화된 항체의 용도.



KR1020127015390A 2009-11-19 2010-11-12 인간 ｉｌ-２２ｒａ에 대한 인간화된 항체 KR20120098783A (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09176525 2009-11-19
EP09176525.5 2009-11-19
US26299809P 2009-11-20 2009-11-20
US61/262,998 2009-11-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20120098783A true KR20120098783A (ko) 2012-09-05

Family

ID=41565648

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020127015390A KR20120098783A (ko) 2009-11-19 2010-11-12 인간 ｉｌ-２２ｒａ에 대한 인간화된 항체

Country Status (19)

Country Link
US (1) US8545844B2 (ko)
EP (1) EP2512511B1 (ko)
JP (1) JP5818804B2 (ko)
KR (1) KR20120098783A (ko)
CN (1) CN102665759B (ko)
AU (1) AU2010321047B2 (ko)
BR (1) BR112012012003A2 (ko)
CA (1) CA2778864C (ko)
EA (1) EA021356B1 (ko)
EC (1) ECSP12011980A (ko)
ES (1) ES2531996T3 (ko)
IL (1) IL219740A0 (ko)
IN (1) IN2012DN03362A (ko)
MX (1) MX2012005791A (ko)
NZ (1) NZ599438A (ko)
PE (1) PE20121560A1 (ko)
UA (1) UA105405C2 (ko)
WO (1) WO2011061119A1 (ko)
ZA (1) ZA201202793B (ko)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1812476E (pt) * 2004-10-22 2010-11-08 Zymogenetics Inc Anticorpos anti-il-22ra e parceiros de ligação e métodos de utilização no tratamento de inflamações
PL2686347T3 (pl) 2011-03-16 2018-10-31 Argenx Bvba Przeciwciała przeciwko CD70
KR20180021234A (ko) 2013-08-12 2018-02-28 제넨테크, 인크. 보체-연관 상태의 치료를 위한 조성물 및 방법
WO2015168468A1 (en) * 2014-05-01 2015-11-05 Genentech, Inc. Anti-factor d antibody variants and uses thereof
US10391168B1 (en) 2014-08-22 2019-08-27 University Of Bern Anti-CD70 combination therapy
EP3368090A1 (en) 2015-10-30 2018-09-05 H. Hoffnabb-La Roche Ag Anti-factor d antibody variant conjugates and uses thereof
JP2018534930A (ja) 2015-10-30 2018-11-29 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｄ因子抗体及びコンジュゲート
ES2966133T3 (es) * 2016-03-18 2024-04-18 Staidson Beijing Biopharmaceuticals Co Ltd Proteína de fusión que comprende el factor de crecimiento nervioso y método de preparación y uso de la misma
GB201612337D0 (en) 2016-07-15 2016-08-31 Argen-X N V Ant-il-22r antibodies
CA3064443A1 (en) * 2017-05-24 2018-11-29 Development Center For Biotechnology Humanized antibodies against globo h and uses thereof in cancer treatments
AU2018292438A1 (en) 2017-06-30 2019-12-12 Zymeworks Bc Inc. Stabilized chimeric fabs
GB201800649D0 (en) 2018-01-16 2018-02-28 Argenx Bvba CD70 Combination Therapy
WO2023232789A1 (en) * 2022-06-03 2023-12-07 Leo Pharma A/S Liquid formulation of il-22r antibody

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5965704A (en) 1997-08-05 1999-10-12 Zymogenetics, Inc. Class two cytokine receptor-11
PT1812476E (pt) * 2004-10-22 2010-11-08 Zymogenetics Inc Anticorpos anti-il-22ra e parceiros de ligação e métodos de utilização no tratamento de inflamações
RU2007139283A (ru) * 2005-03-25 2009-04-27 Гликарт Биотехнологи Аг (Ch) АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ МОЛЕКУЛЫ, НАПРАВЛЕННЫЕ К MCSP И ОБЛАДАЮЩИЕ ПОВЫШЕННОЙ АФФИННОСТЬЮ СВЯЗЫВАНИЯ Fc-РЕЦЕПТОРА И ЭФФЕКТОРНОЙ ФУНКЦИЕЙ
AU2006342792A1 (en) * 2005-12-02 2007-11-08 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of diseases and disorders associated with cytokine signaling involving antibodies that bind to IL-22 and IL-22R

Also Published As

Publication number Publication date
JP5818804B2 (ja) 2015-11-18
EA021356B1 (ru) 2015-05-29
CN102665759A (zh) 2012-09-12
NZ599438A (en) 2013-12-20
BR112012012003A2 (pt) 2016-11-29
ES2531996T3 (es) 2015-03-23
PE20121560A1 (es) 2012-12-05
UA105405C2 (ru) 2014-05-12
EP2512511A1 (en) 2012-10-24
CA2778864A1 (en) 2011-05-26
ECSP12011980A (es) 2012-07-31
CA2778864C (en) 2017-06-27
IN2012DN03362A (ko) 2015-10-23
JP2013511267A (ja) 2013-04-04
IL219740A0 (en) 2012-07-31
US20120230990A1 (en) 2012-09-13
US8545844B2 (en) 2013-10-01
WO2011061119A1 (en) 2011-05-26
AU2010321047A1 (en) 2012-05-24
EP2512511B1 (en) 2015-01-07
EA201290360A1 (ru) 2012-11-30
AU2010321047B2 (en) 2016-06-09
CN102665759B (zh) 2015-09-30
ZA201202793B (en) 2013-06-26
MX2012005791A (es) 2012-07-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5818804B2 (ja) ヒトｉｌ−２２ｒａに対するヒト化抗体
JP6526089B2 (ja) 抗神経成長因子抗体ならびにそれを調製および使用する方法
CN108699136B (zh) 结合cd3和psma的异二聚抗体
JP2022180448A (ja) イヌ化抗体
CN103732621B (zh) 抗神经生长因子抗体及其制备和使用方法
ES2704036T3 (es) Anticuerpos anti-factor de crecimiento nervioso y procedimientos de preparación y uso de los mismos
AU2016365191B2 (en) Human endothelin receptor binding antibody and use thereof
JP7469292B2 (ja) 抗ｂｔｌａ抗体
KR20120075457A (ko) 톨-유사 수용체 2에 대한 인간화 항체 및 이의 용도
KR20230009441A (ko) 항-tigit 항체, 이의 제조 방법 및 용도
KR20220156526A (ko) 조작된 항-her2 이중특이성 단백질
IL262244B2 (en) Antibodies against beta interferon and their use
AU2021311701A1 (en) Anti-CTLA-4 antibody and use thereof
US20140294815A1 (en) Caninised tumour necrosis factor antibodies and methods of using the same
ES2903412T3 (es) Anticuerpos anti-IL-22R
KR20210121102A (ko) 항-cd79b 항체, 이의 항원-결합 단편, 및 이의 약학적 용도
WO2023061005A1 (zh) 新型抗体-细胞因子融合蛋白及其制备方法和用途
WO2024088342A1 (en) Antibodies against cd24 and uses thereof
WO2017076805A1 (en) Use of an inhibitor of il18 for treatment of acute kidney injury
JP2024521967A (ja) 抗ｉｌ－３６ｒ抗体及びその使用
NZ621619B2 (en) Caninised tumour necrosis factor antibodies and methods of using the same

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid