CN102665759A - 人源化抗il-22ra抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗人IL-22RA的人源化抗体及它们在治疗银屑病和其他免疫-介导疾病如银屑病关节炎和特发性皮炎中的应用。

Description

人源化抗IL-22RA抗体
发明领域
本发明涉及人源化抗IL-22RA抗体及其在治疗银屑病和其他免疫-介导疾病如银屑病关节炎和特发性皮炎中的应用。
发明背景
IL-22RA(也称为IL22R、IL22R1、IL22RA1、CRF2-9和Zcytor11)属于II型细胞因子受体家族，是IL-20、IL-22和IL-24受体的一种组分。由于它们的结构相似，IL-20、IL-22和IL-24与IL-19和IL-26一起加上IL-10都属于所谓的“IL-10家族”(Kunz S等.2006)。IL-10是免疫应答反应的主要调节剂，可介导巨噬细胞、T细胞和免疫系统其他细胞促炎症细胞因子表达下调(Moore KW等.2001)。
在体外，不仅活化的免疫细胞而且角质形成细胞均能程度相似地产生IL-20和IL-24。在体内，发炎组织优先表达这些细胞因子。IL-20和IL-24可通过二种受体复合体IL-20RA/IL-20RB和IL-22RA/IL-20RB传递信号(Langer JA等.2004)。几种组织，特别是皮肤、生殖和呼吸系统组织及各种腺体，看来是这些介导因子的主要靶标(Kunz S等，2006)。
发现CD4+T细胞在激活时上调IL-22基因的表达，它与IL-10的氨基酸序列有22％相同，因此，它最初的名字称为IL-10相关的T细胞产生的可诱导因子(IL-TIF)(Dumoutier L等.2000)。不象IL-10能调节免疫细胞的功能，IL-22可调控组织对免疫系统的应答反应。IL-22通过在各种组织中高表达但在免疫细胞中不可检测的IL-22RA和IL-10RB所形成的异质二聚体受体来传递信号。最初认为，IL-22系通过其IL-22RA结合位点结合于IL-22RA的胞外结构域，后来发现，IL-10RB结合于IL-22与IL-22RA相互反应所产生的区域，形成对IL-22有高亲和力的细胞因子受体复合体(Li J等.2004)。由于许多不同类型的细胞能广泛表达IL-10RB，而IL-22RA表达是决定细胞IL-22应答反应的限制性组分。IL-22RA在肝脏以及皮肤、肺、胰腺和其他外周组织中强表达(Wolk K等.2004；Aggarwal S等.2001)。
不同细胞系的广泛筛选揭示了只有表达IL-22RA的细胞才对IL-22应答，提示没有能介导IL-22信号传递的可替代受体。
称为IL-22结合蛋白的可溶性受体(IL-22BP；也称为IL22BP、IL22RA2、IL-22R-α2、CRF2X、CRF2-S1和CRF2-10)也能结合IL-22，作为天然的蛋白拮抗剂从而提供IL-22活性的全面调节(Kotenko SV等.2003)。在包含浸润性活化T细胞的各种慢性炎症疾病(例如银屑病、银屑病关节炎和特发性皮炎)病人的患病组织中发现了IL-22。最常将IL-22描述为促-炎症细胞因子，因为它在慢性炎症疾病病人的病灶中表达，诱生了促炎细胞因子，如IL-6、IL-8和TNF-α(Wolk K等.2004；Andoh A等.2005；Ikeuchi H等.2005；Nograles KE等.2009a.；Nograles KE等.2009b)。最近Zheng等人证明，在银屑病小鼠模型中IL-22对介导IL-23-诱导的皮炎至关重要，表明其有促炎症作用(Zheng Y等.2007)。鉴于IL-22的生物学作用包括诱导角质形成细胞增生，诱导某些组织产生趋化因子和促炎细胞因子，可采用能阻断、抑制、降低或中和IL-22活性的拮抗剂，例如通过干扰其与受体的结合，而防止病原性细胞渗入炎症部位。在2005年10月21日提交的PCT专利申请WO 2006/047249中已描述了小鼠抗人IL-22RA单克降抗体。然而，小鼠抗体可有免疫原性，故需要人源化的抗人IL-22RA抗体。用于人类治疗时人源化抗体通常至少有三个潜在的优点优于小鼠抗体：(1)由于需要其发挥效应的是人，故人源化抗人IL-22RA抗体能与人免疫系统的其他部分更好地相互作用(例如，通过补体依赖的细胞毒(CDC)或抗体依赖的细胞毒(ADCC))更有效地摧毁靶细胞；(2)人免疫系统应不会识别人源化抗体的框架区或恒定区为异物，因此对注入抗体的抗体应答反应应低于对完全异源的小鼠抗体的抗体应答反应；和(3)已报导注入的小鼠抗体在人体循环中的半衰期比人抗体的半衰期短得多。推测注入的人源化抗体半衰期与天然的人抗体更相似，故可给予较少剂量和较少次数。因此，鉴于以上所述，治疗IL-22介导的炎症，如银屑病、银屑病关节炎和特发性皮炎，需要人源化的抗人IL-22RA抗体。
发明概述
第一方面，本发明提供结合人IL-22RA的人源化抗体。本发明的人源化抗体包含a)含有分别由氨基酸序列SEQ ID NO：1、2和3组成的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的重链可变区，和b)含有分别由氨基酸序列SEQ IDNO：4、5和6或分别由氨基酸序列SEQ I D NO：4、5和7组成的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的轻链可变区。另一方面，本发明提供本说明书所述的抗体，此抗体中a)所述重链可变区包含分别由氨基酸序列SEQ ID NO：8、9、10和11组成的框架区H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4；和b)所述轻链可变区包含分别由氨基酸序列SEQ ID NO：12、13、14和15组成的框架区L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4。在另一方面，本发明提供本说明书所述的抗体，此抗体中a)所述重链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO：16组成；b)所述轻链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO：17组成。在另一方面，本发明提供本说明书所述的抗体，此抗体包含a)由氨基酸序列SEQ ID NO：18组成的重链恒定区；和b)由氨基酸序列SEQ ID NO：19组成的轻链恒定区。
另一方面，本发明提供结合人IL-22RA的人源化抗体，其包含由氨基酸序列SEQ ID NO：20组成的重链和氨基酸序列SEQ ID NO：21组成的轻链。
另一方面，本发明提供一种多聚核苷酸，如DNA，其编码本发明人源化抗体的重链。优选所述多聚核苷酸包含或由序列SEQ ID NO：22组成。
另一方面，本发明提供一种多聚核苷酸，如DNA，其编码本发明人源化抗体的轻链。优选所述多聚核苷酸包含或由序列SEQ ID NO：23组成。
另一方面，本发明提供一种多聚核苷酸，如DNA，其编码本发明人源化抗体的重链和轻链。
另一方面，本发明提供一种载体，更具体地说，一种表达载体，其包含a)编码本发明人源化抗体重链的多聚核苷酸，和b)编码本发明人源化抗体轻链的多聚核苷酸。
另一方面，本发明提供一种载体，更具体地说，一种表达载体，其包含编码本发明人源化抗体重链和轻链的多聚核苷酸。
另一方面，本发明提供宿主细胞，优选CHO细胞，其包含转染的本发明载体，具体说，本发明的表达载体。
另一方面，本发明提供制备本发明人源化抗体的方法，该方法包括培养本发明的宿主细胞，优选CHO细胞，和分离本发明的人源化抗体。
另一方面，本发明提供本发明的人源化抗体作为药物的应用，具体用于治疗银屑病、银屑病关节炎或特发性皮炎。
另一方面，本发明提供一种包含本发明的人源化抗体的药物组合物及其作为药物的应用，具体用于治疗银屑病、银屑病关节炎或特发性皮炎。
另一方面，本发明提供本发明的人源化抗体或含有所述抗体的药物组合物在制备治疗银屑病、银屑病关节炎或特发性皮炎药物中的应用。
附图说明
图1报告了人免疫球蛋白κ轻链可变区基因4-1(IGKV4-1)与小鼠280.46.3.4VL(280.46.3.4)之间的排列对比。
图2报告了人免疫球蛋白重链可变区基因3-66(IGHV3-66)与小鼠280.46.3.4VH(280.46.3.4)之间的排列对比。
图3报告了人免疫球蛋白κ轻链可变区基因4-1(IGKV4-1)与第1版人源化280.46.3.4VL(280.VK4-1-C)之间的排列对比。
图4报告了第一版人源化280.46.3.4VH(280.VH3-66.1)与人免疫球蛋白重链可变区基因3-66(IGHV3-66)之间的排列对比。
图5报告了用蛋白A-纯化的人源化280.46.3.4抗体在非变性条件下SDS凝胶电泳的考马斯兰染色结果。“Humira”(阿达木单抗)，一种商品化抗-TNFα单克隆抗体，此处用作标准参比品。图左侧“Marker”是标准蛋白质分子量(MW)标志。“Before”(前)指A蛋白纯化的人源化280.46.3.4抗体，其包含与280.VK4-1-C配对的280.VH3-66-1，因此其轻链含有未配对的半胱氨酸。“After”(后)指A蛋白纯化的人源化280.46.3.4抗体，其包含与280.VK4-1-S配对的280.VH3-66-1。
图6报告了人HepG2肝细胞瘤细胞STAT3磷酸化试验结果，比较了表达为人IgG1/κ链(包含与280.VK4-1-S配对的280.VH3-66-1，■280.VH3-66-1/VK4-1-S)的人源化抗体与亲代小鼠抗体280.46.3.4(●280.46.3.4)的效价。结果显示该人源化抗体的效价比含有游离半胱氨酸的亲代小鼠抗体高1.4倍，IC50值分别为257.5pM和370.5pM。
图7报告了人IL-22受体转染的BaF3稳定细胞增殖试验结果，比较了表达为人IgG1/κ链(包含与280.VK4-1-S配对的280.VH3-66-1，■280.VH3-66-1/VK4-1-S)的人源化抗体与亲代小鼠抗体280.46.3.4(●280.46.3.4)的效价。结果显示该人源化抗体的效价比含有游离半胱氨酸的亲代小鼠抗体高1.7倍，IC50值分别为340pM和587pM。
图8报告了小鼠IL-22受体转染的BaF3稳定细胞增殖试验结果，比较了表达为人IgG1/κ链(包含与280.VK4-1-S配对的280.VH3-66-1，■280.VH3-66-1/VK4-1-S)的人源化抗体与亲代小鼠抗体280.46.3.4(●280.46.3.4)的效价。结果显示该人源化抗体的效价比含有游离半胱氨酸的亲代小鼠抗体高2.1倍，IC50值分别为693pM和1473pM。
图9报告了人免疫球蛋白重链可变区基因3-66(IGHV3-66)与第四版人源化280.46.3.4VH(280.VH3-66-4)之间的排列对比。
图10报告了人HepG2肝细胞瘤细胞STAT3磷酸化试验结果，比较了表达为人IgG1/κ链(包含与280.VK4-1-T配对的280.VH3-66-4，◆280.VH3-66-4/VK4-1-T)的人源化抗体与亲代小鼠抗体280.46.3.4(●280.46.3.4)的效价。结果显示该人源化抗体的效价比亲代小鼠抗体高1.8倍，IC50值分别为183.2pM和333.0pM。
图11报告了人IL-22受体转染的BaF3稳定细胞增殖试验结果，比较了表达为人IgG1/κ链(包含与280.VK4-1-T配对的280.VH3-66-4，◆280.VH3-66-4/VK4-1-T)的人源化抗体与亲代小鼠抗体280.46.3.4(●280.46.3.4)的效价。结果显示该人源化抗体的效价比亲代小鼠抗体高1.75倍，IC50值分别为334pM和587pM。
图12报告了小鼠IL-22受体转染的BaF3稳定细胞增殖试验结果报告，比较了表达为人IgG1/κ链(包含与280.VK4-1-T配对的280.VH3-66-4，◆280.VH3-66-4/VK4-1-T)的人源化抗体与亲代小鼠抗体280.46.3.4(●280.46.3.4)的效价。结果显示该人源化抗体的效价比亲代小鼠抗体高2.1倍，IC50值分别为687pM和1473pM。
图13报告了目的在于测定对人IL-22RA一组突变体的结合亲和力的Biacore分析：280.VH3-66-4中单个地产生H-CDR1区Asp 32突变和H-CDR3区Asp 96突变。将这些单一突变体与人源化轻链可变区280.VK4-1-T配对，然后检测亲和力。D32E：280.VH3-66-4的32位Asp突变为Glu，产生版本280.VH3-66-18；D32：亲代版本280-VH3-66-4；D32N：280.VH3-66-4的32位Asp突变为Asn；D96E：280.VH3-66-4的96位Asp突变为Glu；D96N：280.VH3-66-4的96位Asp突变为Asn。
此图报告的结果表明，与亲代未突变的D32(280.VH3-66-4)相比，D32E突变提高了结合率约2倍，降低了解离率约5倍。另一方面，D96E突变有负面影响，降低了亲和力约500倍。
图14报告了用示差扫描量热法(DSC)检测D32E突变体与亲代未突变D32的热稳定性结果。D32E突变体(淡灰色线)比亲代D32(深灰色线)稳定，相差1度。
图15报告了人HepG2肝细胞瘤细胞STAT3磷酸化试验结果，比较了表达为人IgG1/κ链(包含与280.VK4-1-T配对的280.VH3-66-18，◆280.VH3-66-18/VK4-1-T)的人源化抗体与亲代小鼠抗体280.46.3.4(●280.46.3.4)的效价。结果显示该人源化抗体的效价比亲代小鼠抗体几乎高3倍，IC50值分别为32.5pM和370.5pM。
图16报告了最终的人源化VH版本280.VH3-66-46与人免疫球蛋白重链可变区基因3-66(IGHV3-66)之间的排列对比。
图17报告了人免疫球蛋白κ轻链可变区基因4-1(IGKV4-1)与最终的人源化VL版本280.VK4-1-TSY之间的排列对比。
图18报告了正常人角质形成细胞STAT3磷酸化试验结果，比较了表达为人IgG1/κ链(包含与280.VK4-1-TSY配对的280.VH3-66-46，◆280.VH3-66-46/VK4-1-TSY)的人源化抗体与亲代小鼠抗体280.46.3.4(●280.46.3.4)的效价。结果显示该人源化抗体(280.346.TSY，参见实施例7)的效价比亲代小鼠抗体几乎高9倍，IC50值分别为60.95pM和541.9pM。
图19报告了人HepG2肝细胞瘤细胞STAT3磷酸化试验结果，比较了表达为人IgG1/κ链(包含与280.VK4-1-TSY配对的280.VH3-66-46，◆280.VH3-66-46/VK4-1-TSY)的人源化抗体与亲代小鼠抗体280.46.3.4(●280.46.3.4)的效价。结果显示该人源化抗体(280.346.TSY，见实施例7)的效价比亲代小鼠抗体几乎高5倍，IC50值分别为55.16pM和266.3pM。
图20报告了人IL-22受体转染的BaF3稳定细胞增殖试验结果，比较了表达为人IgG1/κ链(包含与280.VK4-1-TSY配对的280.VH3-66-46，◆280.VH3-66-46/VK4-1-TSY)的人源化抗体与亲代小鼠抗体280.46.3.4(●280.46.3.4)的效价。结果显示该人源化抗体(280.346.TSY，参见实施例7)的效价比亲代小鼠抗体高1.7倍，IC50值分别为317pM和545pM。
图21报告了小鼠HEPA1-6肝细胞瘤细胞STAT3磷酸化试验结果，计算出表达为人IgG1/κ链(包含与280.VK4-1-TSY配对的280.VH3-66-46，●280.VH3-66-46/VK4-1-TSY)的人源化抗体的效价，用人IgG1作为阴性对照(■对照hIgG1)。结果显示该人源化抗体能抑制小鼠IL-22的活性，其IC50在纳摩尔范围(2.1nM)。
图22报告了小鼠IL-22受体转染的BaF3稳定细胞增殖试验结果，比较了表达为人IgG1/κ链(包含与280.VK4-1-TSY配对的280.VH3-66-46，◆280.VH3-66-46/VK4-1-TSY)的人源化抗体与亲代小鼠抗体280.46.3.4(●280.46.3.4)的效价。结果显示该人源化抗体(280.346.TSY，参见实施例7)的效价比亲代小鼠抗体高6.2倍，IC50值分别为137pM和849pM。
图23报告了为测定280.346.TSY对人IL-22RA的特异性所作的竞争性ELISA的结果。用人IL-22RA-ECD(即IL-22RA-胞外区)包被微孔板。在竞争剂人白介素22受体α(hIL-22RA)、人IL-22结合蛋白(hIL-22BP)、小鼠IL-22受体α(mIL-22RA)、人IL-10受体α(hIL-10R)和人IL-20受体α(hIL-20R)存在下，在微孔板中加入生物素化280-346-TSY抗体。加入过氧化物酶偶联的链霉亲和素，显示与板上包被的hIL-22RA的结合。测得的人(●hIL-22RA)和小鼠(◆mIL-22RA)IL-22RA的IC50值分别为18.25pM和149.3pM。280.346.TSY未显示与人IL-22BP(■hIL-22BP)、IL-10Rα(ΔhIL-10R)和IL-20Rα(VhIL-20R)的交叉反应。
图24报告了280-346-TSY对IL-22-诱导小鼠血清淀粉样蛋白A的药效学活性结果。皮下给予不同剂量的280.346.TSY，22小时后静脉注射重组小鼠IL-22。运载体对照为皮下给予PBS。给予IL-22后6小时采集血样品。用人IgG作为阴性对照(同种型对照)。用ELISA测定血清淀粉样蛋白A。在此模型中280-346-TSY显示有效，其ED50值为0.5mg/kg。用Mann Whitney检验作统计学分析：*p＜0.05，与同种型对照组相比；***p＜0.001，与同种型对照组相比。
图25报告了小鼠银屑病模型中280-346-TSY的药效学活性结果。检测了280-346-TSY对IL-23-诱导的耳朵增厚的治疗效应。隔天一次给小鼠注射500ng重组人IL-23或PBS共14天。皮下给予不同剂量280.346.TSY进行全治疗覆盖。运载体对照为皮下给予PBS。采用地塞米松为阳性对照。计算出第9天(对应于耳朵肿胀峰)的百分抑制率。在此模型中280-346-TSY显示有效，其ED50值为1.8mg/kg。
发明详述
在开始详述本发明之前，定义以下术语可能有助于理解本发明。
本说明书所用的术语“抗体”及其复数形式，除了别的以外，包括多克隆抗体、亲和纯化的多克隆抗体、单克隆抗体、纳米体(nanobodies)和抗原结合片段，如F(ab′)2、Fab蛋白水解片段和单链可变区片段(scFvs)。还包括遗传工程改造的完整抗体或片段，如嵌合抗体、Fv片段、单链抗体等，以及合成的抗原结合肽或多肽。可通过在人框架区和恒定区中植入非人抗体的CDR，或掺入非人抗体的整个可变区而使非人抗体人源化。在某些情况下，人源化抗体的人框架区可包含非人残基以提高其本身的结合特性。抗体人源化后可延长其生物学半衰期和给予人体后降低其引起不良免疫反应的可能性。
本说明书所用术语“免疫球蛋白”(Ig)指基本上由免疫球蛋白基因编码的一条或多条多肽组成的蛋白质。一种类型的免疫球蛋白构成了一类抗体的基础结构单元。其型状是一种四聚体，由二对相同的免疫球蛋白链组成，每对有一条轻链和一条重链。轻链有两部分：可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)，后者也可称为恒定区。重链也有两部分：可变结构域(VH)和恒定区(CH)。在每对中，轻链和重链的可变区共同负责结合抗原，恒定区负责抗体的效应器功能。
免疫球蛋白的全长“轻链”(约25Kd)由N-末端的可变区(约110个氨基酸)基因和C-末端的κ或λ恒定区(分别为Cκ和Cλ)基因编码产生。类似地，如下文所述，免疫球蛋白的全长“重链”(约50Kd)由可变区(约116个氨基酸)基因和其他恒定区(约330个氨基酸)基因之一编码产生。哺乳动物的重链分为五类，用希腊字母α、δ、ε、γ和μ表示。重链的类型确定了抗体的同种型，分别为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。同种型相同的所有抗体其恒定区相同，而同种型不同的抗体恒定区不相同。重链γ、α和δ的恒定区有三个Ig恒定结构域(CH1、CH2和CH3)和一个增加可屈曲性的绞链区；重链μ和ε的恒定区有4个Ig恒定结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)和一个绞链区。
免疫球蛋白轻链或重链可变结构域由间插3个超变区的“框架”区组成。因此，术语“超变区”指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。超变区包含“互补决定区”或“CDR”即轻链可变结构域中的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3和重链可变结构域中的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的氨基酸残基(Kabat等.1991)和/或“超变环”的残基(Chothia和Lesk，1987)。“框架区”或“FR”残基如本说明书定义，是除了超变区残基之外的可变区残基。一种种族内不同轻链的框架区(即L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4)或重链的框架区(即H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4)的序列相对保守。因此，“人框架区”是与天然的人免疫球蛋白框架区基本上(约85％或更高，通常90-95％或更高)相同的框架区。抗体的框架区，即由结构性轻链和重链联合组成的框架区，其功能是定位和对齐CDR。CDR主要负责结合抗原的表位。
因此，术语“人源化的”免疫球蛋白指含有人框架区和非人(常为小鼠或大鼠)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白称为“供者”，而提供框架的人免疫球蛋白称为“受者”。不需要存在恒定区，但如果存在，它们必须与人免疫球蛋白的恒定区基本上相同，即至少约85-90％，优选约95％或更高相同。因此，人源化免疫球蛋白的所有部分，除了CDR和重链恒定区的少许残基外(如果需要修饰其效应器功能)，与天然人免疫球蛋白序列相对应的各部分基本上相同。“人源化抗体”是包含人源化轻链可变结构域和人源化重链可变结构域的抗体。在某些情况下，人源化抗体的人框架区中可保留非人残基以提高其本身的结合特性，和/或在CDR中可引入某些氨基酸突变以改善其结合亲和力和/或降低其免疫原性，和/或提高其人性度。
术语“重组抗体”指其氨基酸序列与天然抗体有所不同的抗体。由于产生这种抗体时采用了重组DNA相关技术，不必局限于天然抗体的氨基酸序列；可重新设计抗体以获得所需特性。有许多可能的变化，其范围从例如只改变可变区或恒定区的一个或几个氨基酸到完全重新设计。通常恒定区中的改变可促进、降低或改变其特性，如固定补体(如补体依赖的细胞毒性CDC)、与膜相互作用和其他效应器功能(如抗体依赖的细胞毒性ADCC)。可变区中的改变可以改善抗原的结合特性。
除抗体外，免疫球蛋白还有多种其他形态，包括例如单链或Fv、Fab和(Fab’)2以及双抗体、线性抗体、多价或多特异性杂交抗体。本说明书所用的术语“单链Fv”，“单链抗体”，“Fv”或“scFv”指在一条多肽链中含有重链和轻链可变结构域但缺乏恒定区的抗体片段。通常单链抗体还包含VH与VL结构域之间的多肽接头，使其能形成所需构型与抗原结合。在特定实施方式中，单链抗体也可以是双特异性抗体和/或人源化抗体。“Fab片段”由一条轻链与一条重链的可变区和CH1区组成。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。“Fab′片段”包含一条轻链和一条含恒定区CH1与CH2结构域的重链，其二条重链之间可形成链间二硫键从而形成F(ab′)2分子。“F(ab′)2”含有二条轻链和二条含恒定区CH1与CH2结构域的重链，因此其二条重链之间可形成链间二硫键。前面已定义了某些重要的术语，现在可将叙述的重点放在本发明的具体实施方式上。
本发明基于人源化抗人IL-22RA抗体的发现。利用这些抗体作为IL-22RA的拮抗剂可抑制炎症，因而可用于治疗涉及浸润性活化T细胞的慢性炎症疾病，如银屑病、银屑病关节炎和特发性皮炎。本发明提供利用人源化抗体来识别、结合、调节和/或中和IL-22RA。特别是，本发明提供利用人源化的轻链和重链可变区来识别、结合、调节和/或中和IL-22RA。这种人源化轻链和重链的可变区可分别与κ或λ的恒定区，和选自任一同种型(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)重链的恒定区融合，并在多种宿主细胞中表达。所选的恒定区较佳为IgG的恒定区，更佳为IgG1的恒定区。制备本说明书所述的人源化抗-IL-22RA抗体所用的人源化加工的起始点，为2005年10月21日提交的PCT专利申请WO 2006/047249中描述的小鼠抗人IL-22RA单克隆抗体的氨基酸序列。
IL-22RA是1998年7月30日提交的PCT专利申请WO 99/07848中第一次描述的II型细胞因子受体Zcytor11。人IL-22RA的氨基酸序列见SEQID NO：24。
本发明也提供能结合含IL-22RA多肽的表位携带部分、或免疫原性表位、或抗原表位的多肽片段或肽的人源化IL-22RA抗体。抗体与这些表位的结合可导致抑制、阻断、中和和/或降低IL-22RA的信号转导。
如本说明书所述，检测抗体的活性可采用检测表达IL-22RA受体的细胞的增殖和/或结合的各种试验，检测它们抑制或降低增殖的能力。特别感兴趣的是IL-22依赖细胞中的变化。可对其进行工程改造的合适细胞系包括BaF3细胞系。也可采用BaF3增殖试验、人HepG2肝细胞瘤细胞或小鼠HEPA1-6肝细胞瘤细胞的STAT3磷酸化试验、Biacore试验或下文所述的正常人角质形成细胞试验来检测人源化抗-IL-22RA抗体的活性。
在一实施方式中，本发明的人源化抗体包括a)含有分别由氨基酸序列SEQ ID NO：1、2和3组成的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的重链可变区，和b)含有分别由氨基酸序列SEQ ID NO：4、5和6组成的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的轻链可变区。
在另一实施方式中，本发明提供此处所述的抗体，其中a)所述重链可变区包含分别由氨基酸序列SEQ ID NO：8、9、10和11所组成的框架区H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，和b)所述轻链可变区包含分别由氨基酸序列SEQ ID NO：12、13、14和15组成的框架区L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4。
在另一实施方式中，本发明提供此处所述的抗体，其中a)所述重链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO：16，和b)所述轻链可变区包含氨基酸序列SEQ ID NO：17。
在另一实施方式中，本发明提供此处所述的抗体，其中a)所述重链可变区与选自人IgA、IgG、IgM、IgD、IgE或任何亚类(优选IgG1亚类)恒定区的重链恒定区相融合，和b)所述轻链可变区与人免疫球蛋白κ或λ轻链(优选κ轻链)的恒定区相融合。
在另一实施方式中，所述重链恒定区包含能调节、降低或抑制该抗体效应器功能(如抗体依赖的细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC))的氨基酸突变。
在另一实施方式中，本发明提供此处所述的抗体，其中所述抗体包含a)由氨基酸序列SEQ ID NO：18组成的重链恒定区和b)由氨基酸序列SEQID NO：19组成的轻链恒定区。
在另一实施方式中，本发明提供能结合人IL-22RA的人源化抗体，其包含由氨基酸序列SEQ ID NO：20组成的重链和由氨基酸序列SEQ ID NO：21组成的轻链。
本领域熟知制备编码本说明书所述抗体的多聚核苷酸(包括DNA和RNA)的方法。可用异硫氰酸胍提取然后用氯化铯梯度离心分离来制备总RNA(Chirgwin JM等.1979)。可采用Aviv和Leder的方法从总RNA制备Poly(A)+RNA(Aviv H等.1972)。用已知方法从poly(A)+RNA制备互补的DNA(cDNA)。或者，可分离得到基因组DNA。然后鉴定编码IL-22RA抗体的多聚核苷酸，并通过例如杂交或PCR进行分离。
可采用本领域已知的任何技术，如重组技术、化学合成、克隆、连接或它们的组合，来制备本说明书所述的抗体。在一实施方式中，用重组技术制备本发明的抗体，例如通过在合适的宿主细胞中表达相应的核酸。根据所用的宿主细胞类型，产生的多肽可被糖基化，或不含或可含某些其他翻译后修饰。许多书藉和综述对如何利用载体和原核或真核宿主细胞克隆和制备重组蛋白提供了说明。
因此本发明另一种实施方式是编码上述或下面所述任何抗体或其一部分的分离的核酸分子，或其互补链或其简并序列。在这方面，术语“核酸分子”包括所有不同类型的核酸，包括但不限于：脱氧核糖核酸(如DNA、cDNA、gDNA、合成的DNA等)、核糖核酸(如RNA)和肽核酸(PNA)。在一个优选实施方式中，核酸分子是DNA分子，如双链DNA分子或cDNA分子。术语“分离的”指经过鉴定与通常天然来源中相关的至少一种污染性核酸分子已分开的核酸分子。分离的核酸分子是自然界中所见形式以外的核酸分子。因此分离的核酸分子与天然细胞中存在的特定核酸分子有所区别。简并序列指编码同一氨基酸序列的任何核苷酸序列，可作为参比核苷酸序列，但因遗传密码子的简并性而可能包括不同的核苷酸序列。
在另一实施方式中，一种核酸分子(也称为多聚核苷酸)编码本发明人源化抗体的重链；另一种多聚核苷酸编码本发明人源化抗体的轻链。
在一优选实施方式中，编码本发明人源化抗体重链的多聚核苷酸的序列包括或由SEQ ID NO：22组成。
在一优选实施方式中，编码本发明人源化抗体轻链的多聚核苷酸的序列包括或由SEQ ID NO：23组成。
在一优选实施方式中，编码本发明人源化抗体重链和轻链的是唯一的多聚核苷酸。
本发明的另一实施方式是包含编码上述或下文所述抗体或其一部分的DNA的载体。该载体可以是在任何原核或真核细胞中的整合或自主复制和功能化的任何克隆载体或表达载体。具体说，该载体可以是质粒、粘粒、病毒、噬菌体、游离体、人造染色体等等。该载体可包含重链和轻链二者的编码序列，或重链和轻链之一的编码序列。如果该载体包含重链和轻链二者的编码序列，重链和轻链二者各自可操作地连接于启动子。重链和轻链的启动子可以相同或不同。重链和轻链也可操作性地连接于一个启动子，此时重链和轻链的编码序列可优选地用一个内部核糖体进入位点(IRES)分开。真核基因表达的合适启动子为例如本领域技术人员熟知的衍生于病毒的启动子，如小鼠或人巨细胞病毒(CMV)启动子、小鼠双向CMV启动子或罗斯肉瘤病毒(RSV)启动子。该载体可包含调控元件，如启动子、终止子、增强子、选择标记、复制起点、绝缘子(insulator)等。可用各种方法将合适的核酸序列插入到该载体中。一般来说，用本领域已知技术将DNA插入到合适的限制性内切核酸酶位点中。可采用本领域技术人员已知的标准连接技术构建包含一种或多种这些组分的合适载体。
本发明的另一个实施方式是重组宿主细胞，所述细胞包含上述核酸分子/多聚核苷酸或载体。宿主细胞可以是原核或真核细胞。原核细胞的例子包括细菌，如大肠杆菌。真核细胞的例子有酵母菌细胞、植物细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞，包括任何原代细胞培养物或已建立的细胞系(如3T3、Vera、HEK293、TN5细胞系等)。合适的可表达糖基化蛋白的宿主细胞来自多细胞生物体。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和COS细胞。本发明特别优选的哺乳动物细胞是CHO细胞。
如上所述，可用本领域已知的任何技术，如重组技术、化学合成、克隆、连接或它们的组合来产生本发明的抗体。
本发明的另一个实施方式是制备本发明抗体的方法，该方法包括在可表达所述核酸分子的条件下培养本发明的重组宿主细胞，和回收/分离产生的多肽。产生的多肽可以是糖基化或非糖基化多肽，或可含有其他翻译后修饰，这取决于所用宿主细胞的类型。制备本发明抗体的方法可进一步包括将该抗体配制成药物组合物的步骤。
本发明另一实施方式是包含本发明人源化抗体的药物组合物。较佳为，所述药物组合物还包含添加的赋形剂，如缓冲剂、稳定剂、表面活性剂等。
本发明的药物组合物可用于诊断、预防和/或治疗(局部或全身性)银屑病和其他免疫介导疾病，如银屑病关节炎和特发性皮炎。
本发明上下文中的术语“治疗”指对疾病进程的任何有益作用，包括减弱、减轻、减少或缩减疾病发作后的病理发展。
可利用药学上可接受的运载体给予本发明的药物组合物。
术语“药学上可接受的”意指包括不会干扰活性成分的生物学活性效应而且对给予的宿主无毒性的任何运载体。例如，对于胃肠道外给药，可将活性蛋白质用运载体(如盐水、葡萄糖溶液、血清白蛋白和林格液)配制成注射用的单位剂量形式。
另一方面，本发明提供用作药剂的本发明的药物组合物。另一方面，本发明提供治疗病人的方法，包括给予病人本发明的药物组合物。较佳为所述疾病选自银屑病、银屑病关节炎和特发性皮炎。
在另一方面，本发明提供本发明的人源化抗体在制备治疗银屑病、银屑病关节炎和特发性皮炎药剂上的应用。
本发明的第一种用法是肺内给予本发明的药物组合物。
本发明的第二种用法是鼻内给予本发明的药物组合物。
本发明的第三种用法是吸入给予本发明的药物组合物。
本发明的第四种用法是口服给予本发明的药物组合物。
本发明的第五种用法是静脉内或肌肉内给予本发明的药物组合物。
在本发明用法的一个优选实施方式中，本发明的药物组合物是皮下给予的。
每天或每隔一天通过上述途径之一给予本发明的药物组合物。
对于胃肠道外(如静脉内、皮下、肌肉内)给药，可联用药学上可接受的胃肠道外运载体(如水、盐水、葡萄糖液)和维持等渗的添加剂(如甘露醇)或化学稳定剂(如防腐剂和缓冲剂)，将本发明的药物组合物配制成溶液、悬浮液、乳液或冻干粉末。可用普遍采用的技术将这种制剂灭菌。
本发明药物组合物中的活性成分可以各种方式给予个体。给药途径可包括：皮内、透皮(如用缓释剂)、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、硬膜外、局部、口服途径和气溶胶给药、鼻内途径或吸入。可采用其他任何治疗有效的给药途径，如通过上皮或内皮组织吸收，或通过基因治疗将编码活性剂的DNA分子给予病人(如通过载体)使该活性剂在体内表达和分泌。此外，可将本发明的药物组合物与生物学活性剂的其他组分如药学上可接受的表面活性剂、赋形剂、运载体、稀释剂等一起给予。
给予个体的剂量视各种因素而不同，这些因素包括药代动力学性质、给药途径、病人的状况和特征(性别、年龄、体重、健康状况、块头大小)、症状的程度、同时进行的治疗、治疗频率和所需效果。
可根据所需的使用和/或制备方法优选的其他替代形式制备、配制、给予或使用本发明的抗体。也可将其制备成有用的偶联物或复合物以改善药物的递送效率。为此目的，可用例如聚乙二醇和其他天然或合成的聚合物分子将本说明书所述的抗体配制成活性偶联物或复合物形式(Harris JM等.2003)。在这方面，本发明考虑了化学修饰的抗体，使该抗体与聚合物相连。这种聚合物通常是水溶性聚合物，因此在水环境如生理环境中该偶联物不会沉淀。而且可采用混合的聚合物来制备偶联物。用于治疗的偶联物可包含药物上可接受的水溶性聚合物。合适的水溶性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、单甲氧基-PEG、芳氧基-PEG、碳酸双琥珀酰亚胺PEG、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(如甘油)、聚乙烯醇、葡聚糖、纤维素或其他碳水化合物基聚合物。合适的PEG分子量为约600至约60,000，例如包括5,000、12,000、20,000和25,000。偶联物还可包含水溶性聚合物的混合物。偶联物的例子包括上述任何抗体与附着在其N-末端的氧化聚烷基部分。PEG是一种合适的多烷氧化物。如图解说明，本说明书所述的任何抗体均可用PEG修饰，此过程称为“PEG化”。可用本领域已知的任何PEG化反应进行PEG化(Francis GE等.1998)。例如，利用反应活性的聚乙二醇分子通过酰化反应或烷化反应进行PEG化。较佳为，所有这些修饰不显著影响抗体结合人IL-22RA的能力。
本发明还包括功能上与上述抗体等价的重组人源化抗人IL-22RA抗体。还包括提供改善的稳定性和/或治疗效果的经修饰的人源化抗体。经修饰的抗体的例子包括不会显著有害地改变抗原结合用途的含有保守性氨基酸残基置换和一个或多个氨基酸缺失或添加的抗体。置换的范围从一个或多个氨基酸残基的改变或修饰到完全重新设计一个区域，只要能维持其治疗用途。本发明的人源化抗体可在翻译后修饰(如乙酰化和磷酸化)或可合成修饰(如附着标记基团)。应明白，本方法设计的人源化抗体可含有不会实质性影响其抗原结合或其他免疫球蛋白功能的额外保守性氨基酸置换。
本发明的人源化抗体可包括经修饰的衍生物，例如但不限于经糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、用已知的保护/封闭基团、蛋白水解切割、连接于细胞配体或其他蛋白等衍生化修饰的人源化抗体的衍生物。此外，这种衍生物可包含一个或多个非经典和/或非天然的氨基酸。可通过修饰(如置换、删除或添加)经鉴定参与Fc区与FcRn受体之间相互作用的氨基酸残基来延长本发明人源化抗体的体内半衰期。
本说明书引用的所有参考文献，包括杂志的文章或摘要、公布或未公布的美国或外国专利申请、审定的美国或外国专利或任何其他参考文献均整体引用纳入本说明书，包括引用参考文献的所有数据、表格、附图和正文。此外，所引参考文献中引用文献的全部内容也纳入本说明书作为参考。
以上所述的具体实施方式将非常全面地揭示本发明的总体实质，本领域技术人员可运用本领域的知识(包括本说明书所引参考文献的内容)，无需过多实验，即可容易地修改和/或改编具体实施方式用于各种用途而不背离本发明的总概念。因此，基于本说明书的教导和指引，这样的改编和修改意味着仍在与本说明书公开的实施方式等同的含义和范围内。应理解，本说明书的用语或术语目的在于说明而非限制本发明。
实施例
实施例1：选择作人源化加工的起始抗体
比较了在2005年10月21日提交的PCT专利申请WO 2006/047249实施例18中描述的5个杂交瘤所表达的小鼠抗-人IL-22RA单克隆抗体，以选出一个用作人源化加工的起始点。最重要的选择标准是：对人IL-22RA亲和力高，与小鼠IL-22RA有交叉反应，与IL-22BP无交叉反应和对人IL-22RA无激动活性。只有一种抗体符合上述所有标准(资料未显示)，即称为280.46.3.4(ATCC专利保藏登录号PTA-6284)的杂交瘤所表达的抗体，它是小鼠IgG1/κ抗体。
SEQ ID NO：25和26分别为此小鼠抗-人IL-22RA单克隆抗体(下文称为“小鼠280.46.3.4”)的重链和轻链(分别称为VH和VL)可变区的特定氨基酸序列。
实施例2：重新整形的人源化280.46.3.4可变区的设计
A.同源人框架序列的选择
利用IMGT-GENE数据库(Giudicelli V.等.2005)，通过比较氨基酸序列鉴定人种系系κ轻链可变区，其整个序列(框架和CDR)显示与小鼠280.46.3.4VL序列具有高百分比的相同。小鼠280.46.3.4VL与人免疫球蛋白κ轻链可变区基因4-1(IGKV4-1)最同源，显示相同性为82.2％(101个氨基酸残基有83个相同；图1)。因此选择IGKV4-1(其序列为SEQ ID NO：27)作为CDR-移植用的受者人框架序列。对于小鼠280.46.3.4VH，利用IMGT-GENE数据库未鉴定到与人种系系有高百分比相同。人种系系免疫球蛋白的重链可变区基因1-46(IGHV1-46)经鉴定有最高的同源性，60.2％相同(98个氨基酸残基有59个相同)。然而，有效选出IGHV3-66(其序列为SEQ ID NO：28)作为受者人框架序列，尽管其同源性最低(50.0％相同，98个氨基酸残基有49个相同；图2)，因为在许多重要的框架位置它的序列接近小鼠280.46.3.4VH的序列，从而可能提供良好的稳定性。
B.框架区的氨基酸置换
B.1轻链
人源化280.46.3.4VL抗体设计的下一步是将小鼠280.46.3.4VL的CDR连入人种系IGKV4-1的框架区(FR)内。用连接免疫球蛋白κ链1的人种系基因(IGKJ1)代替小鼠J基因。在第一版改形的人源化280.46.3.4VL(280.VK4-1-C，其序列为SEQ ID NO：29)中，人的FR中没有改变，即该FR中没有小鼠的残基被认为对于结构至关重要。IGKV4-1与第一版人源化280.46.3.4VL(280.VK4-1-C)之间的序列排列对比见图3。
B.2重链
人源化280.46.3.4VH设计加工的下一步是将小鼠280.46.3.4VH中的CDR连入人种系IGHV3-66的FR中。在第一版改形的人源化280.46.3.4VH(280.VH3-66.1，其序列为SEQ ID NO：30)中，人框架区中有12处改变(图4)。人FR中的这12处改变是27、28、29、30、48、49、67、69、70、71、73和78位氨基酸(见表1中的编号)。
表1.导致人源化280.46.3.4VH设计的氨基酸序列对比
第一行(Kabat编号)给出了按照Kabat规定的残基号码(Kabat等.1991)。FR和CDR分别标识重链可变区的框架区(H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4)和互补决定区(H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3)，三个CDR分开4个FR。第二栏(Chothia编号)给出了按照Chothia的CDR定义的残基号码(Al-Lazikani等.1997)。第三栏(小鼠280.46.3.4VH)给出了小鼠280.46.3.4的重链可变区的氨基酸序列。第四栏(IGHV3-66)给出了人种系免疫球蛋白重链可变区基因3-66(登录号IMGT X92218)用作CDR移植的受者人框架。第五栏(人源化280.VH3-66-46)给出了小鼠280.46.3.4VH的最终人源化版本的氨基酸序列；有下划线的残基表示不同于人种系IGHV3-66的氨基酸。
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人种系IGHV3-66中H-FR1的27、28、29和30位氨基酸改变成小鼠280.46.3.4VH中这些位置的氨基酸。虽然指定的这些位置在H-FR1(Kabat编号；表1)中，但26-30位氨基酸形成了VH的H-CDR1环结构的环部分。因此，这些位置的氨基酸可能直接参与结合抗原。的确，27-30位氨基酸是Chothia确定的H-CDR1的规范结构部分(表1)。
人种系IGHV3-66中H-FR2的48和49位氨基酸(分别为缬氨酸和丝氨酸，表1)改变成小鼠280.46.3.4VH中这些位置的氨基酸(分别为异亮氨酸和甘氨酸，表1))。这二个残基非常靠近H-CDR2而能影响CDR环的精细结构。
人种系IGHV3-66中H-FR3的67、69、70、73和78位氨基酸(分别为苯丙氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、天冬酰胺和亮氨酸)改变成小鼠280.46.3.4VH中这些位置的氨基酸(分别为丙氨酸、亮氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺和丙氨酸，表1)。这5个残基在包装VL和VH结构域中至关重要，最可能影响抗体的总体稳定性。
人种系IGHV3-66中H-FR3的71位氨基酸精氨酸改变成小鼠280.46.3.4VH中该位置的缬氨酸。71位是Chothia确定的H-CDR2的规范结构部分(表1)。用精氨酸转换此位的缬氨酸很可能破坏H-CDR2环的安置。
实施例3：去除轻链CDR1中的游离半胱氨酸
轻链CDR1(L-CDR1)中Kabat 32位有一个不成对的半胱氨酸(见表2编号)，它关系到含有与280.VH3-66-1配对的280.VK4-1-C的人源化280.46.3.4抗体在表达和纯化期间是否形成高水平共价聚集体(资料未显示)。
表2.导致人源化280.46.3.4VL设计的氨基酸序列对比
第一栏(Kabat和Chothia编号)给出了按照Kabat(Kabat等.1991)和Chothia(Al-Lazikani等.1997)规定的残基号码。FR和CDR分别标识轻链可变区的框架区(L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4)和互补决定区(L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3)，三个CDR分开4个FR。第二栏(小鼠280.46.3.4VL)给出了小鼠280.46.3.4的轻链可变区氨基酸序列。第三栏(IGHV4-1)给出了用作CDR移植的受者人框架的人种系免疫球蛋白κ链可变区基因4-1(登录号IMGT Z00023)的氨基酸序列。第四栏(人源化280.VK4-1-TSY)给出了小鼠280.46.3.4VL的最终优化人源版本的氨基酸序列；有下划线的残基表示不同于人种系IGKV4-1的氨基酸。
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为了去除游离半胱氨酸，设计并构建了第2版人源化轻链280.VK4-1-S(其序列为SEQ ID NO：31)，其中将半胱氨酸突变为丝氨酸，就大小和疏水性而言，这可能是最保守的改变。用A蛋白纯化后，在SDS凝胶上不含该半胱氨酸的抗体(即含有与280.VK4-1-S配对的280.VH3-66-1的人源化280.46.3.4抗体)看起来比含该半胱氨酸的抗体(即含有与280.VK4-1-C配对的280.VH3-66-1的人源化280.46.3.4抗体)好(图5)。与含该游离半胱氨酸的抗体(280.VK4-1-C；图5中的“以前”)相比，形态更好意味着在不含不成对半胱氨酸的抗体(280.VK4-1-S；图5中的“以后”)中，重链与轻链的联合比副产物更正确。
在以下三种不同细胞试验中评估了表达为人IgG1/κ链的含有与280.VK4-1-S配对的280.VH3-66-1的人源化抗体的效价：
1)人HepG2肝细胞瘤细胞STAT3磷酸化试验
人HepG2肝细胞瘤细胞系获自ATCC(American Type CultureCollection)，在24孔板中用重组人IL-2刺激该细胞系。将中和抗体的系列稀释液与EC80的IL-22混和后加入细胞20分钟。用PathScan磷酸化-STAT3夹心ELISA试剂盒检测HepG2细胞裂解液的细胞信号传递以测定受试抗体的IC50值。在此HepG2试验中，发现该人源化抗体的效价是亲代小鼠抗体(含游离半胱氨酸，从280.46.3.4杂交瘤(ATCC专利保藏指定单位，保藏号PTA-6284)纯化得到)的1.4倍，IC50值分别为257.5pM和370.5pM(图6)。
2)BaF3细胞增殖试验
在96孔板中用人IL-22受体的二条链(IL-22RA和IL-10RB)转染BaF3细胞系细胞后与重组人IL-22一起培养。在细胞中加入中和抗体的系列稀释液，用氚化胸腺嘧啶掺入测定法测定对BaF3细胞增殖的影响。在此人IL-22受体转染的-BaF3稳定细胞系试验中，发现该人源化抗体的效价是亲代小鼠抗体(含该游离半胱氨酸，从280.46.3.4杂交瘤(ATCC专利指定保藏单位，保藏号PTA-6284)纯化得到)的1.7倍，IC50值分别为340和587pM(图7)。
3)BaF3细胞增殖试验
在96孔板中用小鼠IL-22受体的二条链(IL-22RA和IL-10RB)转染BaF3细胞系细胞后与重组小鼠IL-22一起培养。在细胞中加入中和抗体的系列稀释液，用氚化胸腺嘧啶掺入测定法测定对BaF3细胞增殖的影响。在此小鼠IL-22受体转染的-BaF3稳定细胞系试验中，发现该人源化抗体的效价是亲代小鼠抗体(含该游离半胱氨酸，从280.46.3.4杂交瘤(ATCC专利指定保藏单位，保藏号PTA-6284)纯化得到)的2.1倍，IC50值分别为693和1473pM(图8)。
结论：与原始的小鼠280.46.3.4抗体相比，L-CDR1中游离半胱氨酸的突变不仅显著改善了含有与280.VK4-1-S配对的280.VH3-66.1的人源化280.46.3.4抗体的生物物理性能，而且显著提高了该抗体对人和小鼠IL-22RA的效价。
实施例4：去除L-CDR1中的脱酰胺基序提高了人源化280.46.3.4VH的人性程度
可对抗体进行各种化学修饰和/或降解反应，例如脱酰胺、异构化、水解、二硫键乱置、β片层-删除、氧化和形成内转角。降解的主要机制是水解，包括紧靠甘氨酸或丝氨酸之后的天冬酰胺的脱酰胺。用丝氨酸置换L-CDR1中的半胱氨酸可产生NS基序而构成潜在的脱酰胺位点，从而应将其删除。为尝试破坏此NS基序构建了一系列突变(资料未显示)。发现最好的总体突变是使丝氨酸变成苏氨酸。将含此突变的轻链可变区(280.VK4-1-T，其序列为SEQID NO：32)与第四版人源化280.46.3.4VH(280.VH3-66-4，见下文)配对，在细胞试验中评估其效价。
将第四版人源化280.46.3.4VH(280.VH3-66-4)的70位残基(表1)突变成该位置所见的人种系残基，即苏氨酸突变成丝氨酸。还将H-CDR2最后64和65位谷氨酸和丙氨酸二个残基(表1)分别突变成这些位置所见的人种系残基：赖氨酸和甘氨酸。第四版人源化280.46.3.4VH(280.VH3-66-4，其序列为SEQ ID NO：33)总共有3个人种系残基，与第一版(280.VH3-66-1)相比，这些残基中的2个位于H-CDR2中(图9与图4相比)。
在以上实施例3所述的三种不同细胞试验中，评估了表达人IgG1/κ的含有与280.VK4-1-T配对的280.VH3-66-4的人源化抗体的效价：
1)在HepG2细胞试验中，发现该人源化抗体的效价是从280.46.3.4杂交瘤(ATCC专利指定保藏单位，保藏号PTA-6284)纯化的亲代小鼠抗体的1.8倍，IC50值分别为183.2和333.0pM(图10)。
2)在人IL-22受体转染的-BaF3稳定细胞系细胞试验中，发现该人源化抗体的效价比是280.46.3.4杂交瘤(ATCC专利指定保藏单位，保藏号PTA-6284)纯化的亲代小鼠抗体的1.75倍，IC50值分别为334和587pM(图11)。
3)在小鼠IL-22受体转染的-BaF3稳定细胞系细胞试验中，发现该人源化抗体的效价是从280.46.3.4杂交瘤(ATCC专利指定保藏单位，保藏号PTA-6284)纯化的亲代小鼠抗体的2.1倍，IC50值分别为687和1473pM(图12)。
实施例5：人源化280.46.3.4VH的CDR1中Kabat 32位残基Asp突变成为Glu提高了亲和力和稳定性
可对抗体进行各种化学修饰和/或降解反应，例如脱酰胺、异构化、水解、二硫键乱置、β片层-删除、氧化和形成内转角。降解的主要水解机制包括天冬氨酸(Asp)的异构化。为了预防此种事件发生，使280.VH3-66-4中H-CDR1的Asp32和AH-CDR3的Asp 96各自突变。然后将这些单一突变体与上述人源化轻链可变区280.VK4-1-T配对，经过NiNTA-纯化，用Biacore检测Fab抗体片段的亲和力。在H-CDR1的32位含Asp突变为Glu的VH称为第18版或280.VH3-66-18，其序列为SEQ ID NO：34。图13提供了用Biacore分析检测其与人IL-22RA的结合，显示与亲代未突变的D32(280.VH3-66-4)相比，D32E突变提高了结合率约2倍降低了解离率约5倍。另一方面，D96E突变有负面影响，降低了亲和力约500倍。用差示扫描量热法(DSC)分析D32E突变，显示比亲代D32抗体稳定性高1摄氏度(图14)。总之，可得出结论：D32E突变极大地改善了最后的人源化第18版重链(280.VH3-66-18)的性能。
在HepG2细胞试验中，评估了表达人IgG1/κ的含有与280.IGKV4-1-T配对的280.VH3-66.18的人源化抗体的效价。图15提供的结果表明该人源化抗体(280.VH3-66.18/VK4-1-T)的效价是从280.46.3.4杂交瘤(ATCC专利指定保藏单位，保藏号PTA-6284)纯化的亲代小鼠抗体的3倍，IC50值分别为132.5和370.5pM。
实施例6：提高人性度
A.重链
鉴于人源化280.46.3.4抗体与亲代小鼠280.46.3.4抗体相比亲和力、效价和稳定性均提高，设计了旨在提高最后人源化版本人性的一系列突变。目标是将原始的亲代小鼠框架残基尽可能多的突变回到相应的人种系IGHV3-66残基。在此过程中，发明人得以成功地将Ala 67和Leu 69残基分别突变回到Phe和Ile残基(表1)。发明人还发现在人种系IGHV3-66的29位引入异亮氨酸代替缬氨酸对其热稳定性有正面影响(资料未显示)。尽管事实上Ile 29不是人种系IGHV3-66(val 29)中此位的正常残基，因为其对稳定性有正面影响而不会损失活性，决定将其掺入到最后第46版本的人源化VH(280.VH3-66-46，其序列为SEQ ID NO：16)中。该最后版本280.VH3-66-46的人源化VH与人种系IGHV3-66的序列对比显示，保留了9个小鼠框架残基(图16和表1)。
B.轻链
研究了所有框架残基是人残基的人源化轻链中插入种系CDR残基的可能性。通过将各个CDR残基突变为人种系IGKV4相同位置所见的残基，构建了一系列在小鼠CDR残基中的突变体。用差示扫描量热法和Biacore法分别筛选这些突变体，选出热稳定性和亲和力好的突变体。发现L-CDR3的92位Phe(表2)可用人种系IGKV4该位置的Tyr残基替代，获得热稳定性高1摄氏度且亲和力不丧失的突变体，该优化的人源化VL序列命名为280.VK4-1-TSY，其序列为SEQ ID NO.17。图17显示其与人种系IGKV4的对比，表明280.VK4-1-TSY与人种系IGKV4-1的全序列高度相同，包括框架区残基和CDR残基，因为序列差异仅有5个位置不同(图17和表2)。
通过将特异性重链可变区与SEQ ID NO：18所示的恒定区相连，及特异性轻链可变区与SEQ ID NO：19所示恒定区相连，业已产生了上述所有的人源化抗体。应注意，这些恒定区用作例子，由于可变区抗体残基的结合亲和力与特异性，它们可容易地用不同的恒定区代替。就上述Fab而言，它们包含SEQ ID NO：18所示序列的重链第一恒定区(CH1)和SEQ ID NO：19所示的轻链恒定区。
已采用含有在两种不同启动子调控下编码重链和轻链的cDNA的单一表达载体，在CHO细胞中产生了实施例中提及的不同人源化抗体和Fab。
实施例7：在表达人IL-22RA的细胞试验中含与280.VK4-1-TSY VL配对的280.VH3-66-46VH人源化抗体的效价
评估了表达人IgG1/κ的含有与280.IGKV4-1-TSY配对的280.VH3-66.46的人源化抗体在三种不同细胞试验中的效价。
术语“280.346.TSY”在下文中用于表示含有与280.IGKV4-1-TSY配对的280.VH3-66.46的抗人IL-22RA的人源化抗体，不论其重链和轻链恒定区。
1)正常人角质形成细胞STAT3磷酸化试验
将获自Biopredic国际公司的正常人角质形成细胞在96孔板中用重组人IL-22刺激。将中和抗体的系列稀释液与EC80的IL-22混和并加入细胞20分钟。用PathScan磷酸化-STAT3夹心ELISA试剂盒检测角质形成细胞裂解液的细胞信号，以测定受试抗体的IC50值。在此正常人角质形成细胞试验中，发现280.346.TSY的效价是从280.46.3.4杂交瘤(ATCC专利指定保藏单位，保藏号PTA-6284)纯化的亲代小鼠抗体的几乎9倍，IC50值分别为60.95和541.9pM(图18)。
2)HepG2细胞STAT3磷酸化试验
在24孔板中用重组人IL-22刺激获自ATCC(American Type CultureCollection)的HepG2人肝细胞瘤细胞。将中和抗体的系列稀释液与EC80的IL-22混和并加入细胞20分钟。用PathScan磷酸化-STAT3夹心ELISA试剂盒检测HepG2细胞裂解液的细胞信号，测定受试抗体的IC50值。在HepG2细胞试验中发现280.346.TSY的效价是从280.46.3.4杂交瘤(ATCC专利指定保藏单位，保藏号PTA-6284)纯化的亲代小鼠抗体的几乎5倍，IC50值分别为55.16和266.3pM(图19)。
3)BaF3细胞增殖试验
在96孔板中将BaF3细胞系细胞用人IL-22受体的两条链(IL-22RA和IL-10RB)转染并与人IL-22一起培养。将中和抗体的系列稀释液加入细胞，用氚化胸腺掺入法检测其对BaF3细胞增殖的影响。在此人IL-22受体转染的-BaF3稳定细胞系试验中，发现280.346.TSY的效价是从280.46.3.4杂交瘤(ATCC专利指定保藏单位，保藏号PTA-6284)纯化的亲代小鼠抗体的1.7倍，IC50值分别为317和545pM(图20)。
特异性280.346.TSY的重链和轻链恒定区的氨基酸序列分别为SEQ IDNO：18和19，所述特异性280.346.TSY的重链和轻链的全长氨基酸序列分别为SEQ ID NO：20和21。
实施例8：在表达小鼠IL-22RA的细胞试验中人源化280.346.TSY的效价
在二种不同细胞试验中评估了280.346.TSY的效价：
1)HEPA1-6细胞磷酸化试验
在96孔板中用重组小鼠IL-22刺激获自DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心)的小鼠HEPA1-6肝细胞瘤细胞系。将中和抗体的系列稀释液与EC80的IL-22混和并加入细胞中20分钟。用人IgG1作对照。用PathScan磷酸化-STAT3夹心ELISA试剂盒检测HEPA1-6细胞裂解液中的细胞信号，测定受试抗体的IC50值。在此HEPA1-6细胞试验中，发现280.346.TSY能抑制小鼠IL-22的活性，其IC50在纳摩尔级(2.1nM，图21)。
2)BaF3细胞增殖试验
在96孔板中用小鼠IL-22受体的两条链(IL-22RA和IL-10RB)转染BaF3细胞后与重组小鼠IL-22一起培养。将中和抗体的系列稀释液加入细胞，用氚化胸腺掺入测定法检测其对BaF3细胞增殖的影响。在此小鼠IL-22受体转染的-BaF3稳定细胞系试验中，发现280.346.TSY的效价是从280.46.3.4杂交瘤(ATCC专利指定保存号PTA-6284)纯化的亲代小鼠抗体的6.2倍，IC50值分别为137和849pM(图22)。
实施例9：用竞争ELISA检测280.346.TSY结合IL-22RA相关蛋白的选择性
用竞争ELISA检测了280.346.TSY的特异性和结合亲和力。用人IL-22RA-ECD(即IL-22RA-的细胞外结构域)包被微孔板。在如下竞争剂存在下：人白介素22受体α(hIL-22RA)、人IL-22结合蛋白(hIL-22BP)、小鼠IL-22受体α(mIL-22RA)、人IL-10受体α(hIL-10R)和人IL-20受体α(hIL-20R)，将生物素酰化280-346-TSY抗体加入板中。加入过氧化物酶偶联的链霉亲和素显示与板上包被的hIL-22RA的结合。测得的重组人和小鼠IL-22RA的IC50值分别为18.25pM和149.3pM(图23)。单克隆抗体显示与重组人IL-22BP、IL-10R和IL-20R无交叉反应。
实施例10：用KinExA和Biacore测定Kd来评估280-346-TSY与同源IL-22RA的交叉反应
用Biacore和KinExA仪评估280-346-TSY的Kd。在HEK-293细胞中产生人和不同动物(大鼠、小鼠、狗、恒河猴、短尾猴和猿猴)IL-22RA同源性基因序列的胞外结构域(ECD)，利用其6His尾以NiNTA-纯化。280-346-TSY抗体对受试的人和所有三种猴子IL-22RA的亲和力为亚纳摩尔级，对小鼠为纳摩尔级，比人低约100倍，对大鼠IL-22RA为微摩尔级(表3)。
表3.280-346-TSY单克隆抗体对人IL-22RA-ECD及其同源物亲和力Kd测定
  IL-22RA-ECD   Kd KinExA   Kd Biacore
  人   ～28.5pM   ～150pM
  小鼠   ～4.85nM   ～20nM
  大鼠   ～587nM   ～1μM
  恒河猴   ～137pM   未测
  短尾猴   ～64.5pM   未测
  猿猴   ～38.5pM   400pM
  狗   未测   100nM
实施例11：280-346-TSY对IL-22-诱导小鼠产生血清淀粉样蛋白A的作用
检测了280-346-TSY对IL-22诱导雄性Balb/c小鼠产生血清淀粉样蛋白A的药效学活性。皮下给予不同剂量的280.346.TSY，22小时后静脉注射重组小鼠IL-22。运载体对照为PBS，皮下给予10ml/kg。在异氟烷麻醉下经眼眶后血管丛注射给予小鼠100μg/kg的IL-22。注射IL-22后6小时异氟烷麻醉下心脏穿刺采集血液样品。用人IgG1作为阴性对照(同种型对照)。用ELISA(Biosource公司)检测血清淀粉样蛋白A。280-346-TSY的ED50值为0.5mg/kg。用Mann Whitney检验作统计学分析：*p＜0.05，与同种型对照组相比；***p＜0.001，与同种型对照组相比(图24)。
实施例12：280-346-TSY对IL-23-诱导小鼠耳朵炎症的抑制作用
在小鼠银屑病模型中检测280-346-TSY的药效学活性。检测了280-346-TSY对IL-23-诱导的C57BL/6雌性小鼠耳朵增厚的抑制作用。按照Zheng Y等.(Nature 2007)所述，给小鼠注射500ng重组人IL-23或PBS，总体积20μl，隔天一次共14天。每隔一天皮下给予不同剂量的280.346.TSY，第一次剂量在给予第一剂重组IL-23之前给予。皮下给予10ml/kg运载体PBS作为对照。用地塞米松(Dexa)作阳性对照。计算与耳朵肿胀峰相对应的第9天的抑制百分率。280-346-TSY的ED50值为1.8mg/kg(图25)。
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参考文献目录
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Claims (19)

1.一种结合人IL-22RA的人源化抗体，包含：
a)含有分别由氨基酸序列SEQ ID NO：1、2和3组成的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的重链可变区，和
b)含有分别由氨基酸序列SEQ ID NO：4、5和6或分别由氨基酸序列SEQID NO：4、5和7组成的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的轻链可变区。
2.如权利要求1所述的人源化抗体，其中：
a)所述重链可变区包含分别由氨基酸序列SEQ ID NO：8、9、10和11组成的框架区H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4；和
b)所述轻链可变区包含分别由氨基酸序列SEQ ID NO：12、13、14和15组成的框架区L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4。
3.如权利要求1或2所述的人源化抗体，其中：
a)所述重链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO：16组成；
b)所述轻链可变区由氨基酸序列SEQ ID NO：17组成。
4.如权利要求1-3中任何一项所述的人源化抗体，其中所述抗体包含：
a)由氨基酸序列SEQ ID NO：18组成的重链恒定区；和
b)由氨基酸序列SEQ ID NO：19组成的轻链恒定区。
5.一种结合人IL-22RA的人源化抗体，其包含由氨基酸序列SEQ ID NO：20组成或包括氨基酸序列SEQ ID NO：20的重链和由氨基酸序列SEQ ID NO：21组成或包括氨基酸序列SEQ ID NO：21的轻链。
6.一种编码权利要求5所述人源化抗体的重链的多聚核苷酸。
7.如权利要求6所述的多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸的包括序列SEQID NO：22或由序列SEQ ID NO：22组成。
8.一种编码权利要求5所述人源化抗体的轻链的多聚核苷酸。
9.如权利要求8所述的多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸包括序列SEQID NO：23或由序列SEQ ID NO：23组成。
10.一种编码权利要求5所述人源化抗体的重链和轻链的多聚核苷酸。
11.一种表达载体，包含：
a)权利要求6或7所述的多聚核苷酸，和
b)权利要求8或9所述的多聚核苷酸。
12.一种包含权利要求10所述多聚核苷酸的表达载体。
13.一种用权利要求11或12所述载体转化的宿主细胞。
14.如权利要求13所述的宿主细胞，其中所述细胞是CHO细胞。
15.一种制备权利要求1-5中任何一项所述的人源化抗体的方法，其中所述方法包括培养权利要求13或14所述的宿主细胞，和分离所述抗体。
16.一种药物组合物，包含权利要求1-5任何一项所述的人源化抗体，或按权利要求15所述方法制备的人源化抗体。
17.用作药物的权利要求1-5任何一项所述的人源化抗体或按权利要求15所述方法制备的人源化抗体。
18.用于治疗银屑病、银屑病关节炎或特发性皮炎的如权利要求1-5中任何一项所述的人源化抗体或按权利要求15所述方法制备的人源化抗体。
19.权利要求1-5中任何一项所述的人源化抗体或按权利要求15所述方法制备的人源化抗体在制备治疗银屑病、银屑病关节炎或特发性皮炎的药物上的应用。
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