BR122012004341A2

BR122012004341A2 - Anticorpos monoclonais contra proteína rgm a e usos destes

Info

Publication number: BR122012004341A2
Application number: BRBR122012004341-9A
Authority: BR
Inventors: Bernhard K Müller; Martin Schmidt; Eve H Barlow; Mary R Leddy; Chungming Hsieh; Phillip D Bardwell
Original assignee: Abbott Gmbh & Co Kg; Abbvie Inc
Priority date: 2008-02-29
Filing date: 2009-02-27
Publication date: 2015-07-14
Also published as: PE20091474A1; CR20170015A; JP5986123B2; JP5661474B2; EP3309173A1; RU2010139886A; JP2014138599A; TWI508741B; CA2715456C; PL2260055T3; TW201545760A; EP2260055B1; US8962803B2; UY31677A1; EP2260055A1; MY159596A; CA3090849A1; RU2524136C2; PH12013502068A1; DOP2010000258A

Abstract

Anticorpos monoclonais contra proteina rgm a e usos destes. A presente invenção refere-se a proteínas isoladas, particularmente anticorpos monocionais, que ligam e neutralizam a proteína rgm a. De modo específico, esses anticorpos têm a capacidade de inibirem a ligação de rgm a a seu receptor e/ou co-receptores. Esses anticorpos ou porções destes da invenção são úteis para determinar rgm a e inibir a atividade de rgm a, por exemplo, em um individuo que sofre de um distúrbio que inclui, mas não se limita a, esclerose múltipla, trauma cerebral de mamíferos, lesão da medula espinhal, derrame, doenças neurodegenerativas e esquizofrenia.

Description

“ANTICORPOS MONOCLONAIS CONTRA PROTEÍNA RGM A E USOS DESTES” Este pedido é dividido do PI 0908012-0 de 24/08/2010.

CAMPO DA TÉCNICA O presente pedido descreve proteínas de ligação à RGM A, particularmente anticorpos monoclonais, e, em particular, versões humanizadas enxertadas com GDR destes, que tenham a capacidade de se ligarem a RGM A e evitar a ligação de proteínas RGM a receptores RGM A e a outras proteínas de ligação à RGM A, e, portanto, neutralizarem a função de RGM A. Esses anticorpos podem ter utilidade no tratamento de vários estados que incluem, mas não se limitam a, esclerose múltipla, trauma cerebral em mamíferos, lesão da medula espinhal, derrames, doenças neurodegenerativas, e esquizofrenia.

FUNDAMENTOS A regeneração axonal após lesões, ataques inflamatórios ou doenças neurodegenerativas no sistema nervoso central (CNS) de mamíferos é quase sempre impossível; o resultado depende do equilíbrio entre a capacidade intrínseca das fibras nervosas no CNS em se regenerar, e os fatores inibitórios no CNS, localizados no microambiente da lesão ou no sítio danificado, que evitam ativamente a regeneração, e, portanto, a regeneração dos tratos fibrosos lesionados.

Estabeleceu-se que a mielina CNS, gerada por oligodendrócitos, e a cicatriz lesio-nal são as estruturas não-permissivas mais relevantes para o crescimento axonal na fase preliminar de uma lesão, induzindo-se um colapso do cone de crescimento e a inibição do crescimento de neurite in vitro, bem como in vivo, resultando, assim, em uma inibição direta de regeneração axonal. Identificaram-se os fatores inibitórios principais das proteínas RGM na mielina e no tecido de cicatrização (Monnier et al.,Nature 419: 392 - 395, 2002; Schwab et al„ Arch. Neurol.62: 1561-8, 2005a; Schwab et al. Eur. J. Neurosci. 21:1569-76, 2005 b; Hata et al. J. Cell Biol. 173:47-58, 2006; para revisões consulte: Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sei. 361: 1513-29, 2006; Yamashita et al. Curr. Opin. Neurobiol. 17: 29-34, 2007). As proteínas RGM são reguladas ascendentemente nos sítios danificados ou lesionados em humanos morrendo de trauma cerebral ou insulto isquêmico, (Schwab et al., Arch. Neurol. 62: 1561-8, 2005a) e são regulados ascendentemente nos sítios lesionados em ratos com lesão da medula espinhal (Schwab et al. Eur. J. Neurosci. 21:1569-76, 2005 b; Hata et al. J. Cell Biol.173:47-58, 2006 para revisão consulte: Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sei. 361: 1513-29, 2006; Yamashita et al. Curr. Opin. Neurobiol. 17: 29-34, 2007). Além disso, os primeiros dados que utilizam amostras clínicas de pacientes com esclerose múltipla e pessoas saudáveis sugerem que a RGM A humana seja regulada ascendentemente no fluido cerebrospinal de pacientes que sofrem de MS (dados não mostrados).

Com a finalidade de avaliar o potencial promotor de regeneração de um anticorpo policlonal RGM A específico, os anticorpos foram administrados em um modelo moderado para grave de lesão da medula espinhal, onde aproximadamente 60% da medula espinhal no nível toráxico 9/10 foram transectados. O exame histológico revelou que tal lesão danificou todas as fibras dorsais e laterais do trato corticoespinhal. O anticorpo policlonal RGM A específico administrado localmente através de uma bomba durante duas semanas induzir uma regeneração à longa distância de fibras nervosas lesionadas (Hata et ai., J. Cell Biol. 173:47-58, 2006).

Centenas de fibras nervosas se estenderam além do sítio de lesão e as fibras mais longas se regeneraram por mais de 10 mm além da lesão, apesar de que nenhuma fibra de regeneração foi encontrada distai à lesão em animais tratados com o anticorpo de controle. A recuperação funcional dos ratos tratados com anti-RGM A foi significativamente aperfeiçoada em comparação com os ratos com lesão na medula espinhal tratados com o anticorpo de controle, provando, assim, que o RGM A consiste em um potente inibidor de neuro regeneração e um alvo valioso em indicações caracterizadas por danos axonais ou lesão das fibras nervosas (Hata et al., J. Cell Biol. 173:47-58, 2006; Kyoto et al. Brain Res. 1186: 74-86, 2007). Além disso, a neutralização da proteína RGM A com um anticorpo policlonal de bloqueio funcional estimulou não apenas a regeneração das fibras nervosas lesionadas em ratos com lesão na medula espinhal, mas aperfeiçoou sua formação de sinapse, permitindo, assim, a reformação ou restauração dos circuitos neuronais danificados (Kyoto et al. Brain Res. 1186: 74-86,.2007). A família do gene rgm abrange três genes diferentes, sendo que dois deles, rgm a e b, são expressos na CNS de mamíferos que origina as proteínas RGM A e RGM B, enquanto que o terceiro membro, rgm c, é expresso na periferia (Muelier et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sei. 361: 1513-29, 2006), onde a RGM C representa um papel importante no metabolismo do ferro. In vitro, a RGM A inibe o crescimento de neurite ligando-se à Neo-genina, que foi identificada como um receptor RGM (Rajagopalan et al. Nat Cell Biol.: 6(8), 756-62, 2004). A neogenina foi primeiramente descrita como uma proteína de ligação de netrina (Keino-Masu et al. Cell, 87(2):175-85, 1996). Esta é uma importante descoberta porque a ligação de Netrina-1 à Neogenina ou à seu receptor DCC intimamente relacionado (deletado no câncer colorretal) foi reportada para estimular ao invés de inibir o crescimento de neurite (Braisted et al. J. Neurosci. 20: 5792-801, 2000). Portanto, a RGM A de bloqueio libera a inibição de crescimento mediada por RGM permitindo-se que a Neogenina se ligue a sua Netrina ligante de estímulo de crescimento de neurite. Com base nas observações, pode-se assumir que a neutralização de RGM A seja superior à neutralização de to neogenina nos modelos de lesão da medula espinhal em humanos. Além de ligar a RGM A à Neogenina e induzir a inibição de crescimento de neurite, a ligação de RGM A ou B às proteínas morfogenéticas ósseas BMP-2 e BMP-4 poderia representar outro obstáculo para uma neu- ro regeneração bem sucedida e recuperação funcional (Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sei. 361: 1513-29, 2006).

Existe uma necessidade na técnica por anticorpos aperfeiçoados capazes de ligar RGM A, de preferência, um anticorpo monoclonal que bloqueie a RGM A e evite a interação entre a RGM A e seu receptor e/ou proteínas de ligação, ou seja, Neogenina e BMP-2, BMP-4. O presente pedido proporciona (a) a geração de um anticorpo monoclonal neutrali-zante contra RGM A, que inibe, de modo seletivo, a ligação de RGM A à seu receptor de Neogenina e às proteínas morfogenéticas ósseas 2 e 4 (BMP-2, BMP-4), e (b) a geração de um anticorpo monoclonal neutralizante contra RGM A, que inibe, de modo seletivo, a ligação de RGM A às proteínas morfogenéticas ósseas 2 e 4 (BMP-2, BMP-4). Espera-se que os anticorpos monoclonais neutralizantes da presente invenção estimulem a regeneração de fibras nervosas lesionadas ou danificadas e a formação de sinapses funcionais de fibras nervosas de regeneração visto que um dos anticorpos monoclonais neutralizantes da presente invenção aparenta transformar a natureza inibitória de RGM A em uma condição na qual as células neuronais preferem migrar e crescer em um substrato RGM A, e não em um substrato permissivo tipo o Colágeno I. Além disso, este anticorpo é capaz de induzir uma regeneração à longa distância em um modelo de rato in vivo com lesão do nervo óptico e aumenta, também, a re mielinização de fibras nervosas lesionadas e regenerativas.

Consequentemente, espera-se que os anticorpos monoclonais neutralizantes da presente invenção promovam uma regeneração neuronal e o recrescimento de conexões neuronais danificadas ou rompidas na CNS humana lesionada e inflamada , por exemplo, em esclerose múltipla, após uma lesão aguda da medula espinhal, trauma cerebral, ou em doenças neurodegenerativas, tais como, por exemplo, coréia de Huntington, doença de Par-kinson, doença de Alzheimer.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com um aspecto, a presente invenção proporciona uma proteína de ligação que se dissocia da RGM A humana (hRGM A) com um Kq igual a 1 x 10"^ M ou menor e uma constante de taxa kQff igual a 1 x 10"2 s-1 ou menor, ambos determinados por ressonância plasmônica superficial.

De acordo com outro aspecto, a invenção se refere a uma proteína de ligação, como, por exemplo, uma proteína de ligação que mostra os recursos cinéticos anteriores, que se ligam à RGM A humana e neutralizam a atividade inibitória de crescimento de neurite de RGM A humana, conforme determinado em um ensaio padrão in vitro, como, por exemplo, o ensaio de crescimento neuronal Ntera conforme exemplificado no Exemplo 3, abaixo. A invenção se refere, também, à proteína de ligação, conforme definido anteriormente, tendo ao menos uma das características funcionais adicionais a seguir: ligação a RGM A de ratos, ligação a RGM C humana, e ligação a RGM C de ratos.

Em particular, a proteína de ligação, conforme descrito no presente documento, modula a capacidade da RGM se ligar a pelo menos um de seus receptores.

Em particular, essa proteína de ligação se liga a um domínio de ligação ao receptor de RGM A humana. Para RGM A, identificaram-se domínios de ligação ao receptor N- e C-terminal. As modalidades particulares das proteínas de ligação da invenção se ligam ao domínio de ligação ao receptor N-termina! de RGM A, conforme ilustrado pela inibição entre um fragmento de hRGM A N-terminal, como, por exemplo, 47-168 e moléculas receptoras, como Neogenina e BMP-4. O dito fragmento de hRGM N-terminal pode ter um comprimento total de cerca de 30 a cerca de 150 ou cerca de 30 a cerca de 122 resíduos de aminoácidos. Como um exemplo não-limitativo, o Fragmento 0 (correspondente aos resíduos N-terminais 47-168) de hRGM A, conforme descrito no presente documento, ou qualquer fragmento de ligação ao receptor mais curto podem ser mencionados.

Em particular, a dita proteína de ligação modula, de preferência, inibe, pelo menos uma das interações a seguir: Ligação de RGM A humana à BMP-4 humana.

Ligação de hRGM A à Neogenina humana, Ligação de hRGM C à Neogenina humana, Ligação de RGM A humana à BMP-2 humana.

De acordo com uma modalidade particular, a proteína de ligação, conforme definido no presente documento, consiste em um anticorpo humanizado. A proteína de ligação, conforme descrito anteriormente, pode ter um domínio de ligação ao antígeno, sendo que a dita proteína de ligação é capaz de ligar um epítopo de uma molécula RGM, sendo que o dito domínio de ligação ao antígeno compreende ao menos uma CDR que compreende uma sequência aminoacídica selecionada a partir do grupo que consiste em GTTPDY(SEQ ID NO: 59), FQATHDPLT(SEQ ID NO: 62), ARRNEYYGSSFFDY(SEQ ID NO: 65), LQGYIPPRT(SEQ ID NO: 68), e sequências aminoacídicas com CDR modificada tendo uma identidade de sequência de ao menos 50% em relação a uma das ditas sequências. Em outra modalidade, a presente invenção se refere a uma proteína de ligação, que compreende um domínio de ligação ao antígeno, sendo que a dita proteína de ligação é capaz de ligar um epítopo de uma molécula RGM, sendo que o dito domínio de ligação ao antígeno compreende ao menos uma CDR que compreende uma sequência aminoacídica selecionada a partir do grupo que consiste em: GTTPDY(SEQ ID NO: 59), FQATHDPLT(SEQ ID NO: 62), ARRNEYYGSSFFDY(SEQ ID NO: 65), LQGYIPPRT(SEQ ID NO: 68), e sequências aminoacídicas com CDR modificada tendo uma identidade de sequência de ao menos 50%, como, por exemplo, ao menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 % de identidade a uma das ditas sequências.

Por exemplo, a dita proteína de ligação pode compreender duas ou mais CDRs, como, por exemplo, SEQ ID NO: 59 e 62; ou SEQ ID NO: 65 e 68; sendo que pelo menos uma das ditas CDRs pode ser identificada, tendo uma identidade de sequência de ao menos 50%, como, por exemplo, ao menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 % de identidade a uma das ditas sequências. A dita proteína de ligação pode compreender, ainda, ao menos uma CDR que compreende uma sequência aminoacídica selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 57, 58, 60, 61, 63, 64, 66, 67 e sequências aminoacídicas com CDR modificada tendo uma identidade de sequência de ao menos 50%, como, por exemplo, ao menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 % de identidade a uma das ditas sequências.

Em outra modalidade, proporciona-se uma proteína de ligação, sendo que o dito pelo menos uma CDR compreende uma sequência aminoacídica selecionada a partir do grupo que consiste em: Em uma modalidade particular, a dita proteína de ligação compreende ao menos 3 CDRs que são selecionadas a partir de um conjunto de CDR de domínio variável que consiste em: ou um conjunto de domínio variável onde ao menos uma das ditas 3 CDRs consiste em uma sequência aminoacídica com CDR modificada tendo uma identidade de sequência de ao menos 50%, como, por exemplo, ao menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 % de identidade à sequência parente.

Em particular, cada uma das ditas modificações supramencionadas pode ser gerada através da adição, deleção, ou, em particular, substituição de um único ou de múltiplos aminoácidos, ou combinações dos mesmos.

Em outra modalidade, a proteína de ligação compreende ao menos dois conjuntos de CDR de domínio variável.

Em particular, os ditos ao menos dois conjuntos de CDR de domínio variável são selecionados a partir de um grupo que consiste em: Conjunto de VH 5F9 & conjunto de VL 5F9; e Conjunto de VH 8D1 & conjunto de VL 8D1 A proteína de ligação de acordo com a invenção compreende, ainda, uma estrutura aceptora humana. A dita estrutura aceptora humana pode compreender ao menos uma sequência a-minoacídica selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32 e 33. A proteína de ligação da invenção pode, em particular, compreender ao menos um conjunto das sequências de estrutura selecionado a partir do grupo que consiste nos conjuntos: (1) conjunto de VH3-48 (Seq ID NO: 15, 16 e 17) Conjunto de VH3-33 (SEQ ID NO: 21,22 e 23) Conjunto de VH3-23 (SEQ ID NO: 24, 25 e 26) sendo que cada um desses conjuntos é combinado com uma sequência de estrutura adicional, selecionada a partir de JH3 (SEQ ID NO:18), JH4 (SEQ ID NO:19), JH6 (SEQ ID NO:20); ou (2) selecionada a partir do grupo que consiste nos conjuntos Conjunto de A18: (SEQ ID NO: 27, 28 e 29) Conjunto de A17: (SEQ ID NO: 31,32 e 33) Sendo que cada um desses conjuntos é combinado com uma sequência de estrutura adicional, selecionada a partir de JK2 (SEQ ID NO:2) De acordo com as modalidades particulares, a proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreende ao menos um domínio variável de cadeia pesada enxertado com CDR selecionado a partir de SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, e 43; e/ou ao menos um domínio variável de cadeia leve enxertado com CDR selecionado a partir de SEQ ID NO: 44, 45, e 46.

Mais particularmente, a proteína de ligação da invenção compreende uma combinação de dois domínios variáveis, sendo que os ditos dois domínios variáveis têm sequências aminoacídicas selecionadas a partir de: SEQ ID NOs: 35 & 44; 36 & 44; 37 & 44; 38 & 44; 39 & 44; 40 & 44; 41 & 44; 42 & 44; 43 & 44; SEQ ID NOs: 35 & 45; 36 & 45; 37 & 45; 38 & 45; 39 & 45; 40 & 45; 41 & 45; 42 & 45; 43 & 45; SEQ ID MOs: 35 & 46; 36 & 46; 37 & 46; 38 & 46; 39 & 46; 40 & 46; 41 & 46; 42 & 46; 43 & 46;

Em outra modalidade da invenção, a dita estrutura aceptora humana da proteína de ligação compreende ao menos uma substituição de aminoácido na região de estrutura em um resíduo chave, sendo que o dito resíduo chave é selecionado a partir do grupo que consiste em: um resíduo adjacente a uma CDR; um resíduo de sítio de glicosilação; um resíduo raro; um resíduo capaz de interagir com um epítopo RGM; um resíduo capaz de interagir com uma CDR; um resíduo canônico; um resíduo de contato entre a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve; um resíduo em uma zona Vernier; um resíduo N-terminal capaz de formação de paraglutamato e um resíduo em uma região que se sobrepõe entre uma CDR1 de cadeia pesada variável definido por Chothia e uma estrutura de cadeia pesada primeiramente definida por Kabat.

Em particular, os ditos resíduos chave são selecionados a partir do grupo que consiste em (posição de sequência de cadeia pesada): 1, 5, 37, 48, 49, 88, 98 (posição de sequência de cadeia leve): 2, 4, 41, 51 Em uma particular modalidade, a proteína de ligação da invenção é composta por um domínio variável humano consensual.

De acordo com outra modalidade da proteína de ligação da invenção, a dita estrutura aceptora humana compreende ao menos uma substituição aminoacídica na região de estrutura, sendo que a sequência aminoacídica da estrutura é ao menos 65%, como, por exemplo, ao menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou 99 %, idêntica à sequência da dita estrutura aceptora humana e compreende ao menos 70 resíduos aminoacídicos, como, por exemplo, ao menos 75, 80, ou 85 resíduos, idênticos à dita estrutura aceptora humana.

De acordo com uma particular modalidade, a proteína de ligação da invenção compreende ao menos um domínio variável com estrutura mutada tendo uma sequência amino- acídica selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ 1D NO: 47, 48, 49, 50; (domínio VH), e/ou selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 51, 52, 53, e 54 (domínio VL) Em particular, a dita proteína de ligação compreende dois domínios variáveis com estrutura opcionalmente mutada, sendo que os ditos dois domínios variáveis têm sequências aminoacídicas selecionada a partir dos grupos que consistem em: SEQ ID NOs: 47 & 44; 47 & 45; 47 & 46; 47 & 51; 47 & 52; 47 & 53; 47 & 54; SEQ ID NOs: 48 & 44; 48 & 45; 48 & 46; 48 & 51; 48 & 52; 48 & 53; 48 & 54; SEQ ID NOs: 49 & 44; 49 & 45; 49 & 46; 49 & 51; 49 & 52; 49 & 53; 49 & 54; SEQ ID NOs: 50 & 44; 50 & 45; 50 & 46; 50 & 51; 50 & 52; 50 & 53; 50 & 54;

As proteínas de ligação da invenção, conforme descrito no presente documento, são capazes de ligar ao menos um alvo selecionado a partir das moléculas RGM.

Em particular, elas são capazes de se ligar a RGM A humana, e, opcionalmente, ao menos uma molécula RGM adicional de origem humana ou originada a partir de macacos cinomolgos, ratos, galinhas, sapos, e peixes.

Por exemplo, elas podem se ligar adicionalmente a RGM A de ratos, RGM C humana, e/ou RGM C de ratos.

Em particular, a proteína de ligação da invenção é capaz de modular, em particular, capaz de neutralizar ou inibir uma função biológica de um alvo, selecionado a partir das moléculas RGM, conforme definido anteriormente.

Em particular, a proteína de ligação da invenção modula, em particular, inibe, a capacidade da RGM em se ligar a pelo menos um de seus receptores, como, por exemplo, Neogenina, e BMP, como BMP-2 e BMP-4.

Por exemplo, a dita proteína de ligação modula, em particular, reduz e, de preferência, inibe pelo menos das interações a seguir: ligação de RGM A humana à BMP-4 humana, ligação de hRGM A à Neogenina humana, ligação de hRGM C à Neogenina humana, ligação de RGM A humana à BMP-2 humana.

As proteínas de ligação com diferentes combinações de recursos funcionais, e, consequentemente, que mostram diferentes perfis funcionais, conforme descrito no presente documento, encontram-se no escopo da invenção. Exemplos não limitativos desses perfis são listados abaixo: Por exemplo, o perfil 1 é satisfeito pelo anticorpo 5F9, conforme fornecido pela presente invenção e seus derivados aqui descritos.

Por exemplo, o perfil 2 é satisfeito pelo anticorpo 8D1, conforme fornecido pela presente invenção e seus derivados aqui descritos.

Em particular, uma proteína de ligação da invenção é capaz de inibir ao menos uma atividade biológica de RGM, em particular, RGM A, sendo que a dita RGM A é selecionada a partir de humanos, macacos cinomolgos, ratos, galinhas, sapos, e peixes.

De acordo com outra modalidade, a proteína de ligação da invenção apresenta um ou mais dos recursos cinéticos a seguir: (a) uma constante da taxa para associação (kon) ao dito alvo selecionado a partir do grupo que consiste em: ao menos cerca de 102M"V1; ao menos cerca de 103M'V1; ao menos cerca de 104M'1s'1; ao menos cerca de 105M~1s"1; ao menos cerca de 106M'V\ e ao menos cerca de 107M‘V1, conforme medido pela ressonância plasmônica superficial; (b) uma constante da taxa para dissociação (koff) ao dito alvo selecionado a partir do grupo que consiste em: no máximo, cerca de 10'2s'\ no máximo, cerca de 1CrV1; no máximo, cerca de 10'4s*1; no máximo, cerca de 10'V1; e, no máximo, cerca de 10'6s~1, conforme medido pela ressonância plasmônica superficial; ou (c) uma constante de dissociação (KD) ao dito alvo selecionado a partir do grupo que consiste em: no máximo, cerca de 10'7 M; no máximo, cerca de 1CT8 M; no máximo, cerca de 10~9 M; no máximo, cerca de 10~1° M; no máximo, cerca de 10'11 M; no máximo, cerca de 10' 12 M; e, no máximo, 10'13M.

De acordo com um aspecto adicional, a presente invenção proporciona uma construção de anticorpos que compreende uma proteína de ligação descrita anteriormente, sendo que a dita construção de anticorpos compreende, ainda, um polipeptídeo de ligação ou um domínio constante de imunoglobulina. A dita construção de anticorpos ou a proteína de ligação da invenção podem ser selecionadas a partir do grupo que consiste em: uma molécula de imunoglobulina, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo enxertado com CDR, um anticorpo humanizado, um Fab, um Fab’, um F(ab’)2, um Fv, um Fv ligado a dissulfeto, um scFv, um anticorpo de domínio único, um diacorpo, um anticorpo multi específico, um anticorpo específico duplo, uma imunoglobulina de domínio variável duplo, e um anticorpo bi-específico.

Em uma construção de anticorpos de acordo com a invenção, a dita proteína de ligação compreende um domínio constante de imunoglobulina de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste em; um domínio constante de IgM humana, um domínio constante de lgG1 humana, um domínio constante de lgG2 humana, um domínio constante de lgG3 humana, um domínio constante de lgG4 humana, um domínio constante de IgE humana, um domínio constante de IgD humana, um domínio constante de lgA1 humana um domínio constante de lgA2 humana um domínio constante de IgY humana, domínios constantes mutados correspondentes Em particular, uma construção de anticorpos de acordo com a invenção compreende um domínio constante de imunoglobulina tendo uma sequência aminoacídica selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 11, 12, 13e 14 De acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona um conjugado de anticorpos que compreende uma construção de anticorpos descrita no presente documento, sendo que o dito conjugado de anticorpos compreende, ainda, um agente selecionado a partir do grupo que consiste em; uma molécula de imunoadesão, um agente de formação de imagem, um agente terapêutico, e um agente citotóxico, sendo que cada um desses agentes é conjugado, de um exemplo covalentemente ligado à dita proteína de ligação.

Por exemplo, o dito agente consiste em um agente de formação de imagem selecionado a partir do grupo que consiste em um rádio marcador, uma enzima, um marcador fluorescente, um marcador luminescente, um marcador bioluminescente, um marcador magnético, e biotina. Em particular, o dito agente de formação de imagem é um rádio marcador selecionado a partir do grupo que consiste em: 3H, 14C 35S, 90Y, "Tc, 111ln, 125l, 131l, 177Lu, 166Ho, e 153Sm.

Por exemplo, o dito agente consiste em um agente terapêutico ou citotóxico selecionado a partir do grupo que consiste em; um anti-metabólito, um agente de alquilação, um antibiótico, um fator de crescimento, uma citocina, um agente anti-angiogênico, um agente anti-mitótico, uma antraciclina, uma toxina, e um agente apoptótico.

De acordo com outra modalidade, a dita proteína de ligação da invenção, conforme descrito no presente documento possui um padrão de glicosilação humana.

Além disso, as proteínas de ligação, as construções de anticorpos e o conjugado de anticorpos de acordo com a invenção podem estar presentes em um cristal (sob a forma cristalina), de preferência, retendo a atividade biológica.

Em particular, o dito cristal consiste em um cristal farmacêutico de liberação controlada isento de veículos. Devido à dita forma cristalina, a proteína de ligação, a construção de anticorpos ou o conjugado de anticorpos podem ter uma meia-vida in vivo maior do que a contraparte solúvel correspondente.

Outro aspecto da presente invenção proporciona um ácido nucléico isolado que codifica uma sequência aminoacídica de proteína de ligação, uma sequência aminoacídica de construção de anticorpos, e uma sequência aminoacídica de conjugado de anticorpos, conforme descrito no presente documento. A invenção se refere, também, a um vetor que compreende um ácido nucléico isolado, conforme descrito no presente documento. Em particular, o vetor é selecionado a partir do grupo que consiste em pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV, e pBJ. A invenção se refere, também, a uma célula hospedeira que compreende tal vetor. Em particular, a dita célula hospedeira é uma célula procariótica, como, por exemplo, E.coli; ou uma célula eucariótica, e pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula protista, célula animal, célula vegetal e célula fúngica. Em particular, a dita célula eucariótica consiste em uma célula animal selecionada a partir do grupo que consiste em; uma célula de mamíferos, uma célula de aves, e uma célula de insetos. De preferência, a dita célula hospedeira é selecionada a partir de células HEK, células CHO, células COS e células de levedura. A célula de levedura pode ser Saccharomyces cerevisiae e a dita célula de insetos pode ser uma célula Sf9. A invenção proporciona, também, um método de produção de uma proteína capaz de aglutinar RGM, que compreende submeter uma célula hospedeira à cultura, conforme definido no presente documento, em um meio de cultura sob condições suficientes para produzir uma proteína de ligação capaz de aglutinar RGM. A invenção se refere, também, a uma proteína produzida de acordo com o dito método. A invenção proporciona, também, uma composição para liberação de uma proteína de ligação, sendo que a dita composição compreende (a) uma formulação, sendo que a dita formulação compreende uma proteína de produto cristalizado, conforme definido no presente documento, e um ingrediente; e (b) ao menos um carreador polimérico. O dito carreador polimérico pode ser um polímero selecionado a partir de um ou mais do grupo que consiste em: ácido poli (acrílico), poli (cianoacrilatos), poli (aminoácidos), poli (anidridos), poli (depsipeptídeo), poli (ésteres), ácido poli (lático), ácido poli (lático-coglicólico) ou PLGA, poli (b-hidróxi butirato), poli (caprolactona), poli (dioxanona); poli (eti-leno glicol), poli ((hidróxi propila) metacrilamida, poli [(organo) fosfazeno], poli (orto ésteres), álcool poli (vinílico), poli (vinil pirrolidona), copolímeros de anidrido maléico e aquil vinil éter, polióis plurônicos, albumina, alginato, celulose e derivados de celulose, colágeno, fibrina, gelatina, ácido hialurônico, oligossacarídeos, glicaminoglicanos, polissacarídeos sulfatados, blendas e copolímeros destes. O dito ingrediente pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em albumi- na, sacarose, trealose, lactitol, gelatina, hidróxi ρΓορΝ-β-ciclodextrina, metóxi polietileno glicol e polietileno glicol.

De acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona um método destinado ao tratamento de um mamífero que compreende a etapa de administrar ao mamífero uma quantidade eficaz da composição, conforme definido no presente documento.

De acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica que compreende o produto (em particular, uma proteína de ligação, construção ou conjugado, conforme descrito anteriormente no presente documento), e um veículo far-maceuticamente aceitável. O dito veículo farmaceuticamente aceitável pode funcionar como um adjuvante útil para aumentara absorção, ou dispersão da dita proteína de ligação.

Por exemplo, o dito adjuvante é hialuronidase.

De acordo com outra modalidade, o dito produto farmacêutico compreende, ainda, ao menos um agente terapêutico adicional que sirva para tratar um distúrbio no qual a atividade RGM seja maligna. Por exemplo, o dito agente é selecionado a partir do grupo que consiste em: agentes terapêuticos, agentes de formação de imagem, agentes citotóxicos, inibidores de angiogênese; inibidores de quinase; bloqueadores de moléculas coestimulató-rias; bloqueadores de molécula de adesão; anticorpos anti-citocina ou fragmentos funcionais destes ou; metotrexatos; ciclosporinas; rapamicinas; FK506; marcadores ou repórteres de-tectáveis; um antagonista TNF; um agente antirreumático; um relaxante muscular, um narcótico, um fármaco antiinflamatório não-esteróide (NSAID), um analgésico, um anestésico, um sedativo, um anestésico local, um bloqueador neuromuscular, um agente antimicrobiano, um agente antipsoriático, um corticosteróide, um esteróide anabólico, uma eritropoietina, uma imunização, uma imunoglobulina, um imunossupressor, um hormônio de crescimento, um fármaco de substituição hormonal, um agente radiofarmacêutico, um antidepressivo, um antipsicótico, um estimulante, uma medicação contra asma, um beta-agonista, um esteróide inalável, uma epinefrina ou análogo, uma citocina, e um antagonista de citocina. A presente invenção se refere, também, a um método destinado à redução da atividade de RGM A humana que compreende colocar uma RGM A humana em contato com ao menos um produto (em particular, uma proteína de ligação, construção ou conjugado, conforme descrito anteriormente no presente documento), de tal modo que ao menos uma atividade de RGM A humana seja reduzida. A presente invenção se refere, também, a um método destinado à redução da ligação de hRGM A ao receptor Neogenina em um indivíduo em necessidade, que compreende a etapa de administrar ao indivíduo um produto da invenção (em particular, uma proteína de ligação, construção ou conjugado, conforme descrito anteriormente no presente documento). A presente invenção se refere, também, a um método destinado à redução da ligação de hRGM A à proteína morfogenética óssea -2 e/ou à proteína morfogenética óssea -4 (BMP-2 e BMP-4) em um indivíduo em necessidade, que compreende a etapa de administrar ao indivíduo um produto da invenção (em particular, uma proteína de ligação, construção ou conjugado, conforme descrito anteriormente no presente documento), A presente invenção se refere, também, a um método destinado ao tratamento de um indivíduo com um distúrbio associado à atividade de RGM A que compreende a etapa de administrar sozinho ou em combinação com outros agentes terapêuticos um produto da invenção (em particular, uma proteína de ligação, construção ou conjugado, conforme descrito anteriormente no presente documento). A presente invenção se refere, também, a um método destinado à redução da atividade de RGM A em um indivíduo que sofra de um distúrbio no qual a atividade de RGM A seja maligna, que compreende administrar ao indivíduo um produto da invenção (em particular, uma proteína de ligação, construção ou conjugado, conforme descrito anteriormente no presente documento), sozinho ou em combinação com outros agentes terapêuticos.

De preferência, o dito distúrbio compreende doenças neurológicas selecionadas a partir do grupo que compreende Esclerose Lateral Amiotrófica, Lesão do Plexo Braquial, Lesão Cerebral, que inclui lesão cerebral traumática, Paralisia Cerebral, Síndrome de Guilla-in Barre, Leucodistrofias, Esclerose Múltipla, Pós-Pólio, Espinha Bífida, Lesão da Medula Espinhal, Atrofia Muscular Espinhal, Tumores Espinhais, Derrame, Mietile Transversa; demência, demência senil, deficiência cognitiva leve, demência relacionada a Alzheimer, Coréia de Huntington, discinesia tardia, hipercinesias, manias, Morbus Parkinson, síndrome de steel-Richard, síndrome de Down, miastenia grave, trauma nervoso, amiloidose vascular, hemorragia cerebral I com amiloidose, inflamação cerebral, distúrbio de confusão mental aguda, esclerose lateral amiotrófica, glaucoma e doença de Alzheimer.

Descrevem-se aspectos particulares adicionais da invenção abaixo: Uma proteína de ligação isolada que interage especificamente com ao menos um epítopo de uma proteína hRGM A; sendo que a dita proteína isolada é um anticorpo monoclonal neutralizante ou fragmento de ligação ao antígeno deste; sendo que o dito fragmento de ligação ao antígeno compreende um domínio VH e um domínio VL; sendo que o dito anticorpo neutralizante diminui a capacidade de a hRGM A se ligar a seu receptor; sendo que o dito anticorpo neutralizante é capaz de inibir a atividade biológica de o hRGM A; sendo que o dito anticorpo reconhece um receptor RGM A selecionado a partir de humanos, macacos cinomólogos, ratos, galinhas, sapos, e peixes; sendo que o dito anticorpo reconhece uma proteína RGM A que compartilha 90% de homologia com a sequência aminoacídica SEQ ID NO:2; sendo que o dito anticorpo onde a proteína RGM A é codificada por um ácido nu-cléico compartilha 90% de homologia com a sequência de ácido nucléico SEQ ID NO: 1; sendo que o dito anticorpo tem ao menos 90% da identidade da sequência aminoacídica com uma sequência que compreende uma região variável de cadeia pesada (região VH) que compreende a sequência de SEQ ID NO:9 ou 34 ou uma versão mutada adicional opcionalmente humanizada da dita região VH; sendo que o dito anticorpo tem ao menos 90% da identidade da sequência aminoacídica com uma sequência que compreende uma região variável de cadeia leve (região VL) que compreende a sequência de SEQ ID NO:10 ou uma versão mutada adicional opcionai-mente humanizada da dita região VL, sendo que o dito anticorpo que se liga a hRGM A é glicosilado; o dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, sendo que o dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno consiste em um anticorpo de camundongos, um anticorpo humanizado, um anticorpo completamente humano, um anticorpo quimérico, um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo humanizado, ou um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo quimérico; o dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, sendo que o dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno consiste em um fragmento de ligação ao antígeno selecionado a partir do grupo que consiste de um fragmento Fab, um fragmento Fab’, um fragmento F(ab’)2 e um fragmento Fv; o dito anticorpo monoclonal que se liga especificamente a pelo menos um epítopo de hRGM A, sendo que o dito anticorpo monoclonal é o anticorpo monoclonal secretado pela linhagem celular de hibridoma, conforme descrito no presente documento; o dito anticorpo monoclonal, sendo que a ligação resulta na inativação da interação de hRGM A com seu receptor; a dita linhagem celular de hibridoma que produz um anticorpo monoclonal, que se liga especificamente a pelo menos um epítopo de hRGM A; a dita linhagem celular de hibridoma, sendo que o hibridoma é selecionado a partir do grupo que consiste em hibridoma de humanos, camundongos, ratos, ovelhas, porcos, gado, cabras, e cavalos; o dito anticorpo monoclonal, sendo que a ligação resulta na inativação de hRGM A; a dita linhagem celular de hibridoma que produz um anticorpo monoclonal, que se liga especificamente a pelo menos um epítopo de hRGM A; a dita linhagem celular de hibridoma, sendo que o hibridoma é selecionado a partir do grupo que consiste em hibridoma de humanos, camundongos, ratos, ovelhas, porcos, gado, cabras, e cavalos; o dito anticorpo neutralizante monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno deste, tendo ao menos uma característica selecionada a partir do grupo que consiste em: a) ligar ao RGM A de mamíferos com afinidade na faixa de nM ou inferior; b) antagonizar funcionalmente in vitro a atividade de RGM A em um ensaio de crescimento de neurite com eficácia de μΜ, nM ou inferior; c) induzir in vivo a germinação no modelo de esmagamento do nervo óptico; d) induzir in vivo a germinação em um modelo de lesão da medula espinhal; e) aliviar in vivo a lesão da medula espinhal experimental aumentando-se o crescimento regenerativo das fibras nervosas lesionadas; ou f) aliviar in vivo a lesão da medula espinhal promovendo-se a formação de sinapse; um ácido nucléico isolado que codifica o dito anticorpo neutralizante monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno; um vetor que compreende o dito ácido nucléico isolado; sendo que o dito vetor é selecionado a partir do grupo que consiste em pcDNA; pTT; pTT3; pEFBOS; pBV; pJV; pHybE e pBJ; uma célula hospedeira transformada de acordo com o dito vetor, sendo que a célula hospedeira é selecionado a partir do grupo que consiste em célula protista, célula animal, célula vegetal e célula fungica; a dita célula hospedeira, sendo que a célula animal é uma célula de mamífero selecionada a partir do grupo que compreende HEK293, CHO e COS; Célula hospedeira transformada com o vetor, de acordo com a reivindicação 24, sendo que a célula hospedeira é uma célula eucariótica; método de produção da proteína de ligação que liga a hRGM A, que compreende submeter uma célula hospedeira á cultura em um meio de cultura sob condições suficientes para produzir uma proteína de ligação que liga a hRGM A; composição farmacêutica que compreende o dito anticorpo monoclonal ou porção de ligação ao antígeno e um veículo farmaceuticamente aceitável; método destinado à redução da ligação de hRGM A ao receptor Neogenina em um indivíduo em necessidade, que compreende a etapa de administrar o dito anticorpo ao indivíduo; método destinado à redução da ligação de hRGM A à proteína morfogenética ós-sea-2 e à proteína morfogenética óssea-4 (BMP-2 e BMP-4) em um indivíduo em necessidade, que compreende a etapa de administrar o dito anticorpo ao indivíduo; método destinado ao tratamento de um indivíduo com distúrbio associado à atividade de RGM A que compreende a etapa de administrar o dito anticorpo sozinho ou em com- binação com outros agentes terapêuticos; método destinado à redução da atividade de RGM A em um indivíduo que sofre de um distúrbio no qual a atividade de RGM A seja maligna, que compreende administrar ao indivíduo o dito anticorpo sozinho ou em combinação com outros agentes terapêuticos; o dito anticorpo, que compreende ao menos uma região VH que compreende uma sequência aminoacídica selecionada a partir de SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42 e 43; o dito anticorpo, que compreende ao menos uma região VL que compreende uma sequência aminoacídica selecionada a partir de SEQ ID NO: 44, 45 e 46; o dito anticorpo, adicionalmente modificado por 1 a 5 mutações em uma sequência VH ou VL; o dito anticorpo, sendo que as mutações são selecionadas a partir de retromuta-ções e mutações de estrutura de resíduos de interface de Vernier e VH/VL;

Qualquer ensinamento ou referência à SEQ ID NO: 34, conforme descrito no presente documento, em analogia se aplica à SEQ ID NO:9.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A FIGURA 1A mostra a ligação de anticorpos monoclonais à hRGM A no ensaio ELISA. A FIGURA 1B descreve a ligação de anticorpos monoclonais à hRGM A expressada em células HEK 293. A FIGURA 1C descreve a ligação de anticorpos monoclonais à RGM A de ratos expressada em células HEK 293. A FIGURA 2 mostra a ligação de RGM A de comprimento inteiro à Neogenina. O MAB 5F9 inibe a ligação de hRGM A acoplada a fc de comprimento inteiro à Neogenina. A FIGURA 3 descreve a ligação de RGM A de comprimento inteiro à BMP-4. O MAB 5F9 inibe a ligação do fragmento de hRGM A acoplada a fc de comprimento inteiro (47- 422) à BMP-4. A FIGURA 4 descreve a ligação de fragmento 0 de RGM A à BMP-4. O MAB 5F9 i-nibe a ligação do fragmento 0 de hRGM acoplada a fc (47-168) à BMP-4. A FIGURA 5 mostra a ligação de RGM A de comprimento inteiro à BMP-2. O MAB 5F9 inibe a ligação do fragmento de hRGM A acoplada a fc de comprimento inteiro (47- 422) à BMP-2. A FIGURA 6 é uma combinação de microfotografias que mostram a neutralização mAb5F9 do fragmento de RGM A no ensaio de crescimento de neurite com células NTera. O MAB 5F9 neutraliza a atividade inibitória de crescimento de um fragmento inibidor de hRGM A potente conjugado a fc em ensaios de crescimento de neurite com agregados de Ntera humanos. A. Cultura de controle, crescimento de neurônios Ntera em íaminina, B. em um substrato de fragmento de hRGM A de laminina (47 - 168), C. - E. em um substrato de fragmento de hRGM A de laminina (47 - 168) na presença de 0,1 pg/ml MAB 5F9 (C.), 1 pg/ml MAB 5F9 (D.), 10 pg/ml MAB 5F9 (E.)· A FIGURA 7 mostra a análise quantitativa dos resultados do ensaio NTera 2. O MAB 5F9 neutraliza, de modo dependente de dosagem, a atividade inibitória de crescimento de um fragmento inibidor de hRGM A potente conjugado a fc (fragmento 0, 47 - 168) em ensaios de crescimento de neurite com agregados de Ntera humanos. A FIGURA 8 mostra a análise quantitativa do ensaio de fixa SH-SY5Y. O MAB 5F9 neutraliza a repulsão, induzida por faixas que consistem em RGM A humana de comprimento inteiro de células neuronais SH-SY5Y em carpetes de membrana em faixas. Na ausência de MAB 5F9 (A) ou na presença de neurônios SH-SY5Y com baixas concentrações de MAB, prefere-se evitar as faixas de RGM A. Este comportamento é revertido aumentando-se as concentrações do MAB 5F9. (B a D). Na maior concentração de MAB (10 pg/ml) (E), os neurônios SH-SY5Y mostram uma forte preferência pelas faixas de RGM A em comparação às faixas de Colágeno I. A FIGURA 9 resume a análise quantitativa das características de ligação de mABs 5F9 e 8D1. Os MABs 5F9 e 8D1 são avaliados em ensaios de ligação de hRGM A - neoge-nina, hRGM A - BMP-2 e hRGM A - BMP-4 em diferentes concentrações. A FIGURA 10 mostra a atividade neutralizante para atividade quimio-repulsiva de anticorpos quimio-repulsiva da hRGM A de anticorpos 5F9 humanizados (h5F9.21, h5F9.23, h5F9.25) em um ensaio de quimiotaxia de SH-SY5Y. A FIGURA 11 mostra a atividade neuro-regenerativa in vivo da aplicação local de 5F9 em um modelo animal com lesão do nervo óptico. A aplicação local de MAB 5F9 neutraliza a RGM A e estimula o crescimento regenerativo de axônios nervosos ópticos lesionados em um modelo animal de rato com esmagamento do nervo óptico. Nos animais tratados com 5F9 (A), muitas fibras GAP-43 positivas se estendem além do sítio de esmagamento em contraste ao MAB 8D1 (B) de controle, que não se liga à RGM A de rato.

As FIGURAS 12 A e 12 B mostram a análise quantitativa da aplicação local de local 5F9 em um modelo animal com lesão do nervo óptico. (A) O 5F9, porém, não o MAB 8D1 de controle aumentou o número de fibras positivas GAP-43 de regeneração. Observaram-se significativamente mais fibras (p < 0.05) nos animais tratados com 5F9 em distâncias de 200 pm, 400 pm e 600 pm, e em 1200 pm, as fibras são somente encontradas em animais tratados com 5F9 mas não nos animais de controle (B) O 5F9 aumentou significativamente a área positiva GAP-43 no sítio de lesão do nervo óptico em comparação ao anticorpo de controle 8D1 e ao PBS de controle de veículo. A área do crescimento regenerativo (área positiva GAP-43) foi medida utilizando-se o software Axiovision (Zeiss). A FIGURA 13 mostra a atividade neuro-regenerativa in vivo da aplicação sistêmica de 5F9 em um modelo animal com lesão do nervo óptico. Os animais foram tratados com 5F9 no dia 0 e no dia 21 com 2 mg/kg e 10 mg/kg, respectivamente. O anticorpo ou veículo foi administrado de modo intraperitoneal ou intravenoso. Imagens compósitas dos nervos ópticos de ratos. Nos animais tratados com 5F9 (A), muitas fibras positivas GAP-43 se estendem além do sítio de esmagamento em contraste aos animais de controle tratados com PBS (Bj. O sítio de esmagamento está localizado na margem esquerda e as fibras de regeneração estão coloridas com um anticorpo to GAP-43. Observam-se muitas fibras nas margens superior e inferior do nervo óptico em animais tratados com 5F9, mas não em animais PBS.

As FIGURAS 14 A e 14 B mostram a análise quantitativa da aplicação sistêmica de 5F9 em um modelo animal com lesão do nervo óptico. A FIGURA 15 mostra a atividade de remielinização in vivo da aplicação sistêmica de 5F9 em um modelo animal com lesão do nervo óptico. Os animais foram tratados com 5F9 no dia 0 e no dia d21 com 2 mg/kg e 10 mg/kg, respectivamente. O anticorpo ou veículo foi administrado de modo intraperitoneal ou intravenoso. Imagens compósitas dos nervos ópticos de ratos. A mielinização é visualizada utilizando-se um anticorpo voltado contra a proteína básica de mielina MBP marcadora de mielina. Os sítios de esmagamento estão localizados na parte intermediária dos nervos compósitos e a área está livre em animais de controle tratados com veículo (A e B). Nos animais tratados com 5F9 (C e D), observam-se muitas estruturas MBP positivas na área intermediária (centro de esmagamento) dos nervos ópticos. A FIGURA 16 mostra o efeito quantitativo sobre a remielinização da aplicação sistêmica de 5F9 em um modelo animal com lesão do nervo óptico.

DESCRIÇÃO DETALHADA A presente invenção descreve proteínas de ligação RGM A, de modo mais específico, anticorpos monoclonais RGM A, anticorpos monoclonais RGM A especialmente humanizados, ou porções de ligação ao antígeno dos mesmos, que se ligam à RGM A. Vários aspectos deste pedido se referem a anticorpos e fragmentos de anticorpos, e composições farmacêuticas dos mesmos, assim como ácidos nucléicos, vetores de expressão recombi-nante e células hospedeiras que servem para constituir tais anticorpos e fragmentos. Os métodos de utilização dos anticorpos deste pedido que servem para detectar RGM A humana; neutralizar a atividade de RGM humana e/ou RGM A humana, seja in vivo ou in vitro, e regular a expressão genética, também são abrangidos pela invenção. 1. Definições Gerais Exceto onde definido em contrário no presente documento, os termos científicos e técnicos usados de acordo com a presente invenção deverão ter significados que sejam comumente compreendidos pelos indivíduos versados na técnica. O significado e o escopo dos termos devem ser claros, entretanto, no caso de qualquer ambiguidade latente, as definições proporcionadas no presente documento adotam precedentes em qualquer dicionário ou definição extrínseca. Além disso, exceto onde requerido em contrário pelo contexto, os termos no singular deverão incluir pluralidades e os termos no plural deverão incluir singularidades. Neste pedido, o uso de “ou” significa “e/ou” exceto onde indicado em contrário. A-lém disso, o uso do termo “incluindo”, assim como outras formas, tais como “inclui” e “incluído”, não é limitativo. Da mesma forma, termos como “elemento” ou “componente” abrangem tanto elementos como componentes que compreendem uma unidade e elementos e componentes que compreendem mais de uma subunidade, exceto onde especificamente indicado em contrário.

Em geral, as nomenclaturas usadas em conjunto com, e técnicas de, cultura celular e tecidual, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética, química e hibridização de proteínas e ácidos nucléicos descritas no presente documento são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. Os métodos e técnicas da presente invenção são genericamente realizados de acordo com os métodos convencionais conhecidos na técnica e, conforme descrito, em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo do presente relatório descritivo exceto onde indicado em contrário. As reações en-zimáticas e as técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, conforme comumente realizado na técnica ou conforme descrito no presente documento. As nomenclaturas usadas em conjunto com, e os procedimentos e técnicas laboratoriais de química analítica, química orgânica sintética, e química medicinal e farmacêutica descritas no presente documento são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. As técnicas padrão são usadas para síntese química, análise química, preparação farmacêutica, formulação, e administração, e tratamento de pacientes. A presente invenção pode ser mais prontamente compreendida a partir dos termos selecionados descritos abaixo.

Conforme o uso em questão, o termo “polipeptídeo” se refere a qualquer cadeia po-limérica de aminoácidos. Os termos “peptídeo” e “proteína” são usados de modo intercambi-ável com o termo “polipeptídeo” e se refere, também, a uma cadeia polimérica de aminoácidos. O termo “polipeptídeo” abrange proteínas nativas ou artificiais, fragmentos de proteína e análogos de polipeptídeo de uma sequência protéica. Um polipeptídeo pode ser monomé-rico ou polimérico. O termo “proteína isolada” ou “polipeptídeo isolado” consiste em uma proteína ou polipeptídeo que, por virtude de sua origem ou fonte de derivação, não seja associado a componentes naturalmente associados que o acompanham em seu estado nativo; seja substancialmente isento de outras proteínas da mesma espécie; seja expresso por uma célula de uma espécie diferente; ou não ocorra na natureza. Portanto, um polipeptídeo quimi- camente sintetizado ou sintetizado em um sistema celular diferente da célula a partir da qual se origina naturalmente será “isolado” de seus componentes naturalmente associados. Uma proteína também pode ser proporcionada substancialmente isenta de componentes naturalmente associados por isolamento, utilizando-se técnicas de purificação de proteínas bem conhecidas na técnica.

Conforme o uso em questão, o termo “recuperar” se refere a um processo de proporcionar uma espécie química, tal como um polipeptídeo substancialmente isento de componentes naturalmente associados por isolamento, por exemplo, técnicas de purificação de proteínas bem conhecidas na técnica.

Conforme o uso em questão, o termo “RGM A humana” (abreviado no presente documento como hRGM A) se refere a uma glicoproteína ancorada com glicosil fosfatidilinosi-tol (gpi) com 450 aminoácidos, foi primeiramente descrito como um repelente de crescimento de neurite ou inibidor de crescimento de neurite durante o desenvolvimento de projeções topográficas (Stahl et al. Neuron 5: 735-43, 1990; Mueller, in Molecular Basis of Axon Growth and Nerve Pattern Formation, Edited by H. Fujisawa, Japan Scientific Societies Press, 215 - 229, 1997). A família do gene rgm abrange três genes diferentes, sendo que dois deles, rgm a e b, são expressos na CNS de mamíferos, enquanto que o terceiro membro, rgm c, é expresso na periferia (Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sei. 361: 1513-29, 2006), onde representa um papel importante no metabolismo do ferro. As proteínas RGM humanas têm uma identidade de sequência de 43% - 50%; a homologia de aminoácido de RGM A humana e de ratos é igual a 89%. As proteínas RGM humanas não compartilham uma homologia de sequência significativa com qualquer outra proteína conhecida. Elas são proteínas ricas em prolina contendo uma região RGD e têm uma homologia estrutural ao domínio de fato de Von-Willebrand e são clivadas no aminoácido N-terminal 168 através de uma protease desconhecida de modo a produzir uma proteína funcionalmente ativa (Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sei. 361: 1513-29, 2006).

In vitro, a RGM A inibe o crescimento de neurite em concentrações picomolares ligando-se à Neogenina, que foi identificada como um receptor RGM (Rajagopalan et al. Nat Cell Biol.: 6(8),756-62,2004). A neogenina foi primeiramente descrita como uma proteína de ligação á netrina (Keino-Masu et al. Cell, 87(2):175-85, 1996), porém, sua afinidade por Ne-trina (Kd 2nM) é uma ordem de magnitude inferior àquela por RGM (Kd 0,2nM) (Rajagopalan et al. Nat Cell Biol.: 6(8),756-62,2004). Isto é uma descoberta importante porque a ligação de Netrina-1 à Neogenina, ou à seu receptor DCC intimamente relacionado (deletado em câncer colorretal) foi reportada para estimular ao invés de inibir o crescimento de neurite (Braisted etal. J. Neurosci. 20: 5792-801,2000).

Além da ligação de RGM A à Neogenina e da indução da inibição de crescimento de neurite, a ligação de RGM A ou B às proteínas morfogenéticas ósseas BMP-2 e BMP-4 pode representar outro obstáculo à neuro regeneração bem sucedida e à recuperação funcional (Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sei. 361: 1513-29, 2006). Ambas as classes de proteínas (Neogenin and the BMPs) foram reportadas por transduzir o sinal inibitório de crescimento de neurite de RGM A através de dois caminhos de transdução de sinal independentes e completamente diferentes. Geralmente, a expressão dessas proteínas BMP é relativamente baixa na maioria das regiões do CNS adulto, porém, rápidos aumentos na expressão e no acúmulo de algumas BMPs (por exemplo, BMP-2, BMP-6, BMP-7) foram reportados em resposta a lesões e insultos (Lai et al., Neuroreport 8: 2691 - 94, 1997; Mar-tinez et al. Brain Res. 894: 1 - 11, 2001; Hall and Miller, J. Neurosci. Res. 76: 1-8, 2004; Setoguchi et al., Exp. Neurol. 189: 33-44, 2004). Além disso, em um modelo de esclerose múltipla, o modelo de encefalomielite autoimune experimental (EAE), a BMP-4, BMP-6 e BMP-7 foram reguladas ascendentemente na medula espinhal do camundongo (Ara et al., J. Neurosci.Res. 86: 125-35, 2008). A BMP-2 foi reportada por inibir o crescimento de neurite ligando-se à superfície celular RGM A, receptores BMP I e II e ativando-se diretamente a LIM-quinase (Matsuura et al. Bichem Biophys Res Commun., 360: 868-73, 2007) e, portanto, espera-se que o bloqueio da interação RGM A-BMP-2 aumente ainda mais a recuperação funcional após a lesão CNS.

Conforme mencionado anteriormente, os ratos com lesão na medula espinhal e os humanos com lesão cerebral apresentam acúmulos massivos de RGM celular no sítio da lesão e o padrão de coloração de RGM A em ratos no sítio da lesão espinhal é bastante semelhante à coloração de anticorpo RGM pan em humanos, sugerindo que a maior parte da coloração RGM pan em humanos seja relacionada à localização de RGM A, mas não à localização de RGM B (Schwab et al., Arch. Neurol.62: 1561-8, 2005a; Schwab et al. Eur. J. Neurosci. 21:1569-76, 2005 b; Hata et al. J. Cell Biol. 173:47-58, 2006). No cérebro humano saudável, coloração pan RGM (imunorreatividade RGM A & B) foi detectada nas fibras de massa branca, oligodendrócitos, pericária de alguns neurônios, algumas células musculares lisas vasculares e algumas células endoteliais. Não se observou nenhuma coloração de as-trócitos. O padrão de coloração de RGM no cérebro humano saudável adulto é bastante similar ao padrão de coloração observado em lesões de medula espinhal de ratos adultos (Schwab et al. Eur. J. Neurosci. 21:1569-76, 2005 b; Hata et al. J. Cell Biol. 173:47-58, 2006).

Com base no acúmulo de RGM A em sítios de lesão no cérebro e lesão da medula espinhal e devido a sua atividade inibitória de crescimento de neurite celular, espera-se que a proteína exerça uma atividade de inibitória de crescimento de neurite e sua neutralização por anticorpos, ou que fragmento de ligação ao antígeno destes que se liga a pelo menos um epítopo da RGM A humana possa resultar em uma regeneração aperfeiçoada das fibras nervosas lesionadas e em um aprimoramento da recuperação funcional em indicações Ca- racterizadas por lesão de fibras nervosas e acúmulo de RGM.

Exceto onde indicado em contrário, o termo “RGM A” também abrange moléculas de RGM A isoladas ou obtidas a partir de outras espécies, como, por exemplo, roedores, como camundongos ou ratos; especificamente, a molécula derivada de ratos é designada no presente documento como “RGM A de ratos”.

TABELA 1: LISTA DAS SEQUÊNCIAS DE MOLÉCULAS RELACIONADAS A RGM A

Conforme o uso em questão, o termo “atividade biológica” se refere a todas as propriedades biológicas de RGM A, conforme definido no presente documento.

Conforme o uso em questão, os termos “ligação específica” ou “ligação de modo específico”, em referência à interação de um anticorpo, uma proteína, ou um peptídeo com uma segunda espécie química, significam que a interação é dependente mediante a presença de uma estrutura particular (por exemplo, um “determinante antigênico” ou “epítopo” conforme definido mais adiante) na espécie química; por exemplo, um anticorpo reconhece e se liga a uma estrutura protéica específica ao invés de se ligar a proteínas em geral. Se um anticorpo for específico para epítopo “A”, a presença de uma molécula contendo epítopo A (ou livre, não rotulado A), em uma reação contendo “A” rotulado e o anticorpo, reduzirá a quantidade de “A” rotulado ligado ao anticorpo.

Conforme o uso em questão, o termo “anticorpo” se refere amplamente a qualquer molécula de imunoglobulina (Ig) composta por quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias (H) pesadas e duas cadeias (L) leves, ou qualquer fragmento funcional, mutante, variante, ou derivação destas, que retêm os recursos de ligação de epítopo essenciais de uma molécula Ig. Esses formatos de anticorpo mutante, variante, ou derivado são conhecidos na téc- nica. As modalidades não limitativas destes são discutidas mais adiante. Diz-se que um anticorpo é “capaz de se ligar” a uma molécula se o mesmo for capaz de reagir especificamente com a molécula para, desse modo, ligar a molécula ao anticorpo.

Conforme o uso em questão pretende-se que o termo “anticorpo monoclonal” se refira a uma preparação de moléculas de anticorpo, que compartilhe uma sequência aminoa-cídica dé cadeia pesada e cadeia leve em comum, ao contrário das preparações de anticorpos “policlonais” que contêm uma mistura de diferentes anticorpos. Os anticorpos monoclo-nais podem ser gerados através de várias tecnologias inusitadas como exibição de fago, bactéria, levedura ou ribossomo, assim como métodos clássicos exemplificados por anticorpos derivados de hibridoma (por exemplo, um anticorpo secretado por um hibridoma preparado através da tecnologia de hibridoma, tal como a metodologia de hibridoma padrão de Kohler and Milstein ((1975) Nature 256:495-497).

Em um anticorpo de comprimento inteiro, cada cadeia pesada é composta por uma região variável de cadeia pesada (abreviada no presente documento como HCVR ou VH) e por uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é composta por três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é composta por uma região variável de cadeia leve (abreviada no presente documento como LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é composta por um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabi-lidade, denominada como regiões de determinação de complementaridade (CDR), inters-persas com regiões que sejam mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir da terminação amino até a terminação carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As moléculas de imunoglobulina podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2) ou subclas-se. O termo “porção de ligação ao antígeno” ou “fragmento de ligação ao antígeno” de um anticorpo (ou simplesmente “porção de anticorpo” ou “fragmento de anticorpo”), conforme o uso em questão, se refere a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno (por exemplo, hRGM A). Mostrou-se que a função de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento inteiro. Essas modalidades de anticorpo também podem ser de formatos biespecíficos, específicos duplos, ou multi específicos; ligando-se especificamente a dois ou mais antígenos diferentes. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos pelo termo “porção de ligação ao antígeno” de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste em domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por um ponto de dissulfeto na região de articulação; (iii) um fragmento Fd que consiste em domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv que consiste em domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546. Winter et al., publicação PCT WO 90/05144 A1 aqui incorporada a título de referência), que compreende um único domínio variável; e (vi) uma região de determinação de complementaridade isolada (COR). Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, utilizando-se métodos recombinantes, através de um ligante sintético que permite que estes sejam constituídos como uma única cadeia protéica na qual as regiões VL e VH se juntam de modo a formarem moléculas monovalen-tes (conhecidas como cadeia única Fv (scFv); consulte, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883). Pretende-se que esses anticorpos de cadeia única também sejam abrangidos no termo “porção de ligação ao antígeno” de um anticorpo. Outras formas de anticorpos de cadeia única, tais como diacorpos, também são abrangidas. Os diacorpos são anticorpos bivalentes e bí-específicos nos quais os domínios VH e VL são expressos em uma única cadeia de polipep-tídeo, porém utilizam um ligante que seja pequeno o suficiente para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, forçando, assim, os domínios a se unirem com os domínios complementares de outra cadeia e criando dois sítios de ligação ao antígeno (consulte, por exemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448; Pol-jak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123). Essas porções de ligação ao anticorpo são conhecidas na técnica (Kontermann and Dubel eds., Antibodv Enaineerinq (2001) Springer-Verlag. Nova York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5).

Conforme o uso em questão, o termo “construção de anticorpos” se refere a um po-lipeptídeo que compreende uma ou mais porções de ligação ao antígeno da invenção ligadas a um polipeptídeo de ligação ou a um domínio constante de imunoglobulina. Os polipep-tídeos de ligação compreendem dois ou mais resíduos de aminoácidos unidos por ligações peptídicas e são usados para ligar uma ou mais porções de ligação ao antígeno. Esses poli-peptídeos de ligação são bem conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123). Um domínio constante de imunoglobulina se refere a um domínio constante de cadeia pesada ou leve. As sequências aminoacídicas constantes de cadeia pesada e leve de IgG humana são conhecidas na técnica e representadas na tabela 2.

TABELA 2: SEQUÊNCIA DE DOMÍNIO CONSTANTE DE CADEIA PESADA E DOMÍNIO CONSTANTE DE CADEIA LEVE DE laG HUMANA

Além disso, um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno deste pode ser parte de moléculas de imunoadesão maiores, formadas por associação covalente ou não-covalente do anticorpo ou porção de anticorpo com uma ou mais proteínas ou peptídeos. Exemplos dessas moléculas de imunoadesão incluem o uso da região de núcleo de estreptavidina de modo a constituir uma molécula scFv tetramérica (Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) e o uso de uma resíduo de cisteína, um peptídeo marcador e um marcador de poli-histidina C-terminal de modo a constituir moléculas scFv bivalentes e biotiniladas (Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). As porções de anticorpo, tais como fragmentos Fab e F(ab')2, podem ser preparadas a partir de anticorpos completos utilizando-se técnicas convencionais, tal como digestão de papaína ou pepsina, respectivamente, de anticorpos completos. Além disso, os anticorpos, as porções de anticorpo e as moléculas de imunoadesão podem ser obtidas utilizando-se técnicas de DNA de recombinante padrão, conforme descrito no presente documento.

Conforme o uso em questão, pretende-se que um “anticorpo isolado” se refira a um anticorpo que seja substancialmente isento de outros anticorpos tendo diferentes especifici-dades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente a hRGM A é substancialmente isento de anticorpos que se ligam especificamente a antígenos diferentes de hRGM A). Um anticorpo isolado que se liga especificamente a hRGM A pode, no entanto, ter uma reatividade cruzada a outros antígenos, tais como moléculas de RGM A provenientes de outras espécies. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente isento de outros materiais celulares e/ou elementos químicos.

Conforme o uso em questão pretende-se que o termo “anticorpo humano” inclua anticorpos tendo regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados pelas sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana (por exemplo, mutações induzidas por mutagênese aleatória ou sítio-específica in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo, nas CDRs e, em particular, CDR3. No entanto, conforme o uso em questão não pretende-se que o termo “anticorpo humano” inclua anticorpos nos quais as sequências de CDR derivadas a partir da linha germinativa de outra espécie de mamífero, tal como um camundongo, foram enxertadas em sequências de estruturas humanas.

Conforme o uso em questão pretende-se que o termo “anticorpo humano recombinante” inclua todos os anticorpos humanos que sejam preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como os anticorpos expressos utilizando-se um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira (descrita adicionalmente mais adiante), anticorpos isolados a partir de uma biblioteca de anticorpos humanos com-binatórios recombinantes (Hoogenboom H.R., (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., and Highsmith W.E., (2002) Clin. Bichem. 35:425-445; Gavilondo J.V., e Larrick J.W. (2002) Bio-Techniques 29:128-145; Hoogenboom H., and Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378 ), anticorpos isolados a partir de um animal (por exemplo, um camundongo) que seja transgênico para genes de imunoglobulina humana (consulte, por exemplo, Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A., e Green L.L. (2002) Cur-rent Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. et al (2000) Immunology Today 21:364-370) ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvam o processamento (splicing) de sequências genéticas de imunoglobulina humana a outras sequências de DNA. Esses anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis e constantes derivadas a partir de sequências de imunoglobulina de linha germina-tiva humana. Em determinadas modalidades, no entanto, esses anticorpos humanos recombinantes são submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para sequências Ig humana for usado, mutagênese somática in vivo) e, portanto, as sequências aminoacídicas das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas e relacionadas às sequências VH e VL de linha germinativa humana, podem não existir naturalmente no repertório da linha germinativa de anticorpos humanos in vivo. O termo “anticorpo quimérico” se refere a anticorpos que compreendem sequências de região variável de cadeia pesada e leve provenientes de uma espécie e sequências de região constante provenientes de outra espécie, tais como anticorpos tendo regiões variáveis de cadeia pesada e leve murinos ligadas a regiões constantes de humanos. O anticorpo quimérico pode ser produzido através de técnicas biológicas moleculares recombinantes, ou podem ser fisicamente conjugados entre si. O termo “anticorpo enxertado com CDR” se refere a anticorpos que compreendem sequências de região variável de cadeia pesada e leve provenientes de uma espécie, porém, nas quais as sequências de uma ou mais regiões CDR de VH e/ou VL são substituídas por sequências CDR de outra espécie, tais como anticorpos tendo regiões variáveis de cadeia pesada e leve murinos nas quais uma ou mais CDRs murinos (por exemplo, CDR3) foram substituídas por sequências CDR de humanos.

Os termos “numeração de Kabat”, “definições de Kabat” e “rotulação de Kabat” são usados de modo intercambiável no presente documento. Esses termos, que são reconhecidos na técnica, se referem a um sistema de numeração de resíduos de aminoácidos que sejam mais variáveis (ou seja, hiper-variáveis) do que outros resíduos de aminoácidos nas regiões variáveis de cadeia pesada e leve de um anticorpo, ou uma porção de ligação ao antígeno destes (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sei. 190:382-391 e, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, publicação NIH No. 91-3242). Para a região variável de cadeia pesada, a região hiper-variável varia a partir das posições de aminoácidos 31 a 35 para CDR1, posições de aminoácidos 50 a 65 para CDR2, e posições de aminoácidos 95 a 102 para CDR3. Para a região variável de cadeia leve, a região hiper-variável varia a partir das posições de aminoácidos 24 a 34 para CDR1, posições de aminoácidos 50 a 56 para CDR2, e posições de aminoácidos 89 a 97 para CDR3.

Conforme o uso em questão, os termos “aceptor” e “anticorpo aceptor” se referem ao anticorpo ou à sequência de ácido nucléico que proporcionam ou codificam pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou 100% da sequência aminoacídicas de uma ou mais regiões de estrutura. Em algumas modalidades, o termo “aceptor” se refere a uma sequência de aminoácido ou ácido nucléico de anticorpo que proporciona ou codifica a(s) região(ões) constante(s). Ainda em outra modalidade, o termo “aceptor” se refere a uma sequência de aminoácido ou ácido nucléico de anticorpo que proporciona ou codifica uma ou mais regiões de estrutura e a(s) região(ões) constan-te(s). Em uma modalidade específica, o termo “aceptor” se refere a uma sequência de aminoácido ou ácido nucléico de anticorpo humano que proporciona ou codifica pelo menos 80%, de preferência, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou 100% das sequências aminoacídicas de uma ou mais regiões de estrutura. De a-cordo com esta modalidade, um aceptor pode conter pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, ou pelo menos 10 resíduos de aminoácidos que não ocorram em uma ou mais posições específicas de um anticorpo humano. Uma região de estrutura aceptora e/ou região(ões) constante(s) aceptora(s) podem, por exemplo, ser derivadas ou obtidas a partir de um gene de anticorpo de linha germinativa, um gene de anticorpo maduro, um anticorpo funcional (por exemplo, anticorpos bem conhecidos na técnica, anticorpos em desenvolvimento, ou anticorpos comercialmente disponíveis).

Conforme o uso em questão, o termo “CDR” se refere à região de determinação de complementaridade nas sequências variáveis de anticorpo. Existem três CDRs em cada uma das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve, que são designadas como CDR1, CDR2 e CDR3, para cada uma das regiões variáveis. Conforme o uso em questão, o termo “conjunto de CDR” se refere a um grupo de três CDRs que ocorrem em uma única região variável capaz de se ligar ao antígeno. Os limites exatos dessas CDRs foram definidos diferentemente de acordo com os diferentes sistemas. O sistema descrito por Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) e (1991)) não apenas proporciona um sistema de numeração não-ambíguo aplicável a qualquer região variável de um anticorpo, mas, proporciona, também, limites precisos de resíduos que definem as três CDRs. Essas CDRs podem ser denominadas como CDRs de Kabat. Chothia e os colaboradores (Chothia &Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) e Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989)) descobriram que determinadas subporções em CDRs de Kabat adotam conformações de cadeia principal quase i-dênticas, apesar de terem uma grande diversidade no nível de sequência aminoacídica. Essas subporções foram designadas como L1, L2 e L3 ou H1, H2 e H3 onde “L” e “H” designam as regiões de cadeia leve e regiões de cadeias pesadas, respectivamente. Essas regiões podem ser denominadas como CDRs de Chothia, que têm limites que se sobrepõem às CDRs de Kabat. Outros limites que definem as CDRs que se sobrepõem às CDRs de Kabat foram descritos por Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995)) e MacCailum (J Mol Biol 262(5):732-45 (1996)). Ainda outras definições de limite de CDR podem não seguir estritamente um dos sistemas anteriores, porém, irão se sobrepor às CDRs de Kabat, embora possam ser encurtados ou alongados devido à predição ou às descobertas experimentais que os resíduos ou grupos particulares de resíduos ou até mesmo CDRs inteiras não influenciam significativamente a ligação ao antígeno. Os métodos usados no presente documento podem utilizar CDRs definidas de acordo com qualquer um desses sistemas, embora as modalidades preferenciais utilizam as CDRs definidas por Kabat ou Chothia.

Conforme o uso em questão, o termo resíduo “canônico” se refere a um resíduo em uma CDR ou estrutura que define uma estrutura de CDR canônica particular, conforme definido por Chothia et al. (J. Mol. Biol. 196:901-907 (1987); Chothia et al., J. Mol. Biol. 227:799 (1992), estando ambos aqui incorporados a título de referência). De acordo com o Chothia et al., as porções críticas das CDRs de muitos anticorpos têm conformações de cadeia principal de peptídeos quase idênticas apesar de uma grande diversidade no nível de sequência aminoacídica. Cada estrutura canônica especifica primeiramente um conjunto de ângulos de torção de cadeia principal de peptídeos para um segmento contíguo de resíduos de aminoá-cidos que formam um laço.

Conforme o uso em questão, os termos “doador” e “anticorpo doador” se referem a um anticorpo que proporciona uma ou mais CDRs. Em uma modalidade preferencial, o anticorpo doador é um anticorpo proveniente de uma espécie diferente do anticorpo a partir do qual as regiões de estrutura são obtidas ou derivadas. No contexto de um anticorpo humanizado, o termo “anticorpo doador” se refere a um anticorpo não-humano que proporciona uma ou mais CDRs.

Conforme o uso em questão, o termo “estrutura” ou “sequência de estrutura” se refere às sequências restantes de uma região variável menos as CDRs. Devido ao fato de a definição exata de uma sequência de CDR poder ser determinada por diferentes sistemas, o significado de uma sequência de estrutura é submetido a implementações correspondentemente diferentes. As seis CDRs (CDR-L1, -L2, e -L3 de cadeia leve e o CDR-H1, -H2, e -H3 de cadeia pesada) também dividem as regiões de estrutura na cadeia leve e na cadeia pesada em quatro sub-regiões (FR1, FR2, FR3 e FR4) em cada cadeia, onde CDR1 é posicionada entre FR1 e FR2, CDR2 entre FR2 e FR3, e CDR3 entre FR3 e FR4. Sem especificar as sub-regiões particulares como FR1, FR2, FR3 ou FR4, uma região de estrutura, conforme denominada por outros, representa os FR's combinados na região variável de uma única cadeia de imunoglobulina de ocorrência natural. Conforme o uso em questão, um FR representa uma das quatro sub-regiões, e FRs representam duas ou mais das quatro sub-regiões que constituem uma região de estrutura.

As sequências aceptoras de cadeia pesada e cadeia leve humanas são conhecidas na técnica. Em uma modalidade da invenção, as sequências aceptoras de cadeia pesada e cadeia leve humanas são selecionadas a partir das sequências descritas nas Tabelas 3 e 4. As diferentes combinações para sequências de estruturas humanas FR1 a FR4 são declaradas nas ditas tabelas.

TABELA 3: SEQUÊNCIAS ACEPTORAS DE CADEIA PESADA HUMANA

TABELA 4: SEQUÊNCIAS ACEPTORAS DE CADEIA LEVE HUMANA

Conforme o uso em questão, o termo “gene dè anticorpo de linha germinativa” ou “fragmento de gene” se refere a uma sequência de imunoglobulina codificada por células não-linfóides que não foram submetidas ao processo de maturação que leva à redisposição genética e mutação para expressão de uma imunoglobulina particular, (consulte, por exemplo, Shapiro et al., Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002); Marchalonis et ai., Adv Exp Med Biol. 484:13-30 (2001)). Uma das vantagens proporcionadas peias várias modalidades da presente invenção se origina a partir do reconhecimento que os genes de anticorpo de linha germinativa são mais prováveis do que os genes de anticorpo maduro genes em conservar a característica de estruturas de sequência aminoacídica essenciais de indivíduos na espécie, portanto, menos prováveis que sejam reconhecidos como a partir de uma fonte estranha quando usados de modo terapêutico nesta espécie.

Conforme o uso em questão, o termo resíduos “chave” se refere a determinados resíduos dentro da região variável que apresentam mais impacto sobre a especificidade de ligação e/ou afinidade de um anticorpo, em particular, um anticorpo humanizado. Um resíduo chave inclui, mas não se limita a, um ou mais entre os seguintes: um resíduo que seja adjacente a uma CDR, um sítio de glicosilação potencial (pode ser um sítio de glicosilação N- ou O-), um resíduo raro, um resíduo capaz de interagir com o antígeno, um resíduo capaz de interagir com uma CDR, um resíduo canônico, um resíduo de contato entre a região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, um resíduo dentro da zona de Vernier, e um resíduo na região que se sobrepõe entre a definição de Chothia de uma CDR1 de cadeia pesada variável e a definição de Kabat da primeira estrutura de cadeia pesada. O termo “anticorpo humanizado” se refere, em geral, a anticorpos que compreendem sequências de região variável de cadeia pesada e leve proveniente de uma espécie não-humana (por exemplo, um camundongo), porém, na qual pelo menos uma porção da sequência VH e/ou VL tenha sido alterada de modo que se tornasse mais “semelhante a humano”, ou seja, mais semelhante às sequências variáveis de linha germinativa humana. Um tipo de anticorpo humanizado consiste em um anticorpo enxertado com CDR, no qual as sequências de CDR humana são introduzidas em sequências VH e VL não-humanas de modo a substituir as sequências de CDR não-humana correspondentes.

Conforme o uso em questão, em particular, o termo “anticorpo humanizado” consiste em um anticorpo ou uma variante, derivado, análogo ou fragmento que se ligue de modo imunoespecífico a um antígeno de interesse e que compreenda uma região de estrutura (FR) tendo substancialmente a sequência aminoacídica de um anticorpo humano e uma região de determinação complementar (CDR) tendo substancialmente a sequência aminoacídica de um anticorpo não-humano. Conforme o uso em questão, o termo “substancialmente” no contexto de uma CDR se refere a uma CDR tendo uma sequência aminoacídica pelo menos 50, 55, 60, 65, 70, 75 ou 80%, de preferência, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência aminoacídica de um anticorpo CDR não-humano. Um anticorpo humanizado compreende substancialmente todos ou pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis (Fab, Fab', F(ab') 2, FabC, Fv) nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquela de uma imunoglobulina não-humana (ou seja, anticorpo doador) e todas ou substancialmente todas as regiões de estrutura são aquelas de uma sequência consenso de imunoglobulina humana. De preferência, um anticorpo humanizado compreende, também, pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém tanto um domínio variável de cadeia leve como pelo menos um domínio variável de cadeia pesada. O anticorpo pode incluir, também, as regiões CH1, articulação, CH2, CH3, e CH4 da cadeia pesada. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém apenas uma cadeia leve humanizada. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado contém apenas uma cadeia pesada humanizada. Em modalidades específicas, um anticorpo humanizado contém apenas um domínio variável humanizado de uma cadeia leve e/ou cadeia pesada humanizada. O anticorpo humanizado pode ser selecionado a partir de qualquer classe de imu-noglobulinas, incluindo IgY, IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, e qualquer isotipo, que inclui, mas não se limita a, lgA1, lgA2, lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4. O anticorpo humanizado pode compreender sequências provenientes de mais de uma classe ou isotipo, e domínios constantes particulares podem ser selecionados para otimizar as funções efetoras desejadas utilizando-se técnicas bem conhecidas na técnica. A estrutura e as regiões CDR de um anticorpo humanizado não precisam corresponder precisamente às sequências parentais, por exemplo, a CDR de anticorpo doador ou a estrutura consenso podem ser mutagenizadas por substituição, inserção e/ou deleção de ao menos um resíduo de aminoácido, de tal modo que a CDR ou resíduo de estrutura neste sítio não corresponda ao anticorpo doador ou à estrutura consenso. Em uma modalidade preferencial, essas mutações, no entanto, não serão extensivas. Geralmente, pelo menos 50, 55, 60, 65, 70, 75 ou 80%, de preferência, pelo menos 85%, com mais preferência, pelo menos 90%, e, com a máxima preferência, pelo menos 95% dos resíduos de anticorpo humanizado corresponderão àqueles das sequências parentais FR e CDR. Conforme o uso em questão, o termo “estrutura consenso” se refere à região de estrutura na sequência consenso de imunoglobulina. Conforme o uso em questão, o termo “sequência consenso de imunoglobulina” se refere à sequência formada a partir dos aminoácidos de ocorrência mais frequente (ou nucleotídeos) em uma família de sequências de imunoglobulina relacionadas (consulte, por exemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987). Em uma família de imunoglobülihãs, cada posição na sequência consenso é ocupada pelo aminoácido de ocorrência mais frequente naquela posição na família. Se dois aminoácidos correrem de modo frequentemente igual, ambos podem ser incluídos na sequência consenso.

Conforme o uso em questão, a zona de “Vernier” se refere a um subconjunto de resíduos de estrutura que pode ajustar a estrutura de CDR e ajustar finamente o encaixe ao antígeno, conforme descrito por Foote and Winter (1992, J. Mol. Biol. 224:487-499, estando aqui incorporado a título de referência). Os resíduos da zona de Vernier formam uma camada subjacente às CDRs e podem influenciar na estrutura de CDRs e na afinidade do anticorpo. O termo “inibição de ligação” de RGM a um de seus receptores, conforme o uso em questão, abrange uma redução parcial (como, por exemplo, em cerca de 20%, 40%, 60%, 80%, 85%, 90%, 95% ou maior) ou completa da dita atividade de ligação do receptor. A dita “inibição de ligação” pode ser determinada através de qualquer método disponível na técnica, de preferência, através de qualquer método conforme exemplificado no presente documento, como, por exemplo, ensaios de ligação com base em ELISA.

Conforme o uso em questão, o termo “neutralizar” se refere à neutralização da atividade biológica de uma proteína alvo quando uma proteína de ligação ligar especificamente a proteína alvo. A neutralização pode ser o resultado de diferentes formas de ligação da dita proteína de ligação ao alvo. Por exemplo, a neutralização pode ser causada através da ligação da proteína de ligação em uma região do alvo que não afete a ligação do receptor à molécula alvo. Alternativamente, a ligação de uma proteína de ligação pode resultar em um bloqueio da ligação do receptor ao alvo, sendo que tal bloqueio neutraliza finalmente a atividade da proteína alvo. Cada um dos ditos mecanismos diferentes pode ocorrer de acordo com a invenção. De preferência, uma proteína de ligação neutralizante consiste em um anticorpo neutralizante cuja ligação a hRGM A resulta na neutralização de uma atividade biológica de hRGM A. De preferência, a proteína de ligação neutralizante se liga a hRGM A e reduz uma atividade biológica de hRGM A em ao menos cerca de 20%, 40%, 60%, 80%, 85% ou maior. A neutralização de uma atividade biológica de hRGM A através de uma proteína de ligação neutralizante pode ser avaliada medindo-se um ou mais indicadores da atividade biológica de hRGM A bem conhecida na técnica. Por exemplo, a neutralização de hRGM A reverte a inibição em um ensaio de crescimento neuronal Ntera (consulte o Exem- pio 3, abaixo). O ensaio de crescimento de neurite Ntera atribui a inibição do crescimento de neurite. Na ausência de uma proteína RGM A inibitória ou fragmento na presença de substrato laminina de estímulo ao crescimento, os agregados NTera neuronais mostram uma rede extensiva e densa de neurites de crescimento. Os fragmentos RGM A ou RGM A inibem o crescimento de neurite, resultando em um comprimento e números de neurites reduzidos. Os antagonistas RGM A de bloqueio funcional ou MABs tipo mAb 5F9 neutralizaram a atividade inibitória de crescimento do fragmento de cadeia leve de hRGM A potente conjugado porfc (aminoácidos 47 - 168) da proteína RGM A humana nos ensaios de crescimento de neurite com agregados de diferentes neurônios NTera humanos diferenciados, resultando em um forte aumento no comprimento e números de neurite.

Conforme o uso em questão pretende-se que um “anticorpo monoclonal neutrali-zante” se refira a uma preparação de moléculas de anticorpo, que mediante a ligação ao antígeno específico são capazes de competir e inibir a ligação do ligante natural para o dito antígeno. Em uma modalidade particular do presente pedido, os anticorpos neutralizantes da presente invenção são capazes de competir com RGM A para ligação à Neogenina e/ou à BMP-2 e/ou BMP-4, e evitar a atividade biológica ou função de RGM A. Em particular, os anticorpos neutralizantes da presente invenção são capazes de se ligarem à RGM A e evitarem a ligação à Neogenina e/ou à BMP-2 e/ou BMP-4, e evitarem a atividade biológica ou função de RGM A.O termo “atividade” inclui atividades, tais como a especificidade/afinidade de ligação de um anticorpo por um antígeno, por exemplo, um anticorpo anti-hRGM A que se liga a um antígeno RGM A e/ou a potência de neutralização de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo anti-hRGM A cuja ligação à hRGM A inibe a atividade biológica de hRGM A, por exemplo, conforme determinado em um ensaio de ligação de hRGM A-Neogenina, ensaio de ligação de hRGM A - BMP-2 ou ensaio de ligação de hRGM A - BMP-4, conforme descrito mais adiante da seção experimental. A atividade biológica de RGM A pode ser descrita como a migração celular reguladora. Um exemplo especial de migração celular é o crescimento de neurite, que é impedido ou inibido pelas proteínas RGM A. Além disso, as proteínas RGM mostraram modular a atividade de proteínas BMP. No presente documento, os exemplos publicados descrevem uma atividade de potencialização de sinergia das proteínas RGM no caminho BMP em um lado e uma atividade inibitória de proteínas RGM no caminho BMP, que é importante para regulação do metabolismo de ferro, regeneração óssea e cartilaginosa e na CNS para remieliniza-ção e regeneração. O termo “epítopo” ou “determinante antigênico” inclui qualquer determinante de po-lipeptídeo capaz de se ligar especificamente a uma imunoglobulina ou receptor de célula T. Em determinadas modalidades, os determinantes de epítopo incluem agrupamentos superficiais quimicamente ativos de moléculas, como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, fos- forila, ou sulfonila, e, em determinadas modalidades, podem ter características estruturais tridimensionais específicas, e/ou características de carga específicas. Um epítopo consiste em uma região de um antígeno que é ligada por um anticorpo. Em determinadas modalidades, diz-se que um anticorpo se liga especificamente a um antígeno quando, de preferência, este reconhecer seu antígeno alvo em uma mistura complexa de proteínas e/ou macromolé-culas. O termo “ressonância plasmônica superficial”, conforme o uso em questão, refere-se a um fenômeno óptico que permite a análise de interações bioespecíficas em tempo real através da detecção de alterações nas concentrações protéicas em uma matriz biossensori-al, por exemplo, utilizando-se o sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Swe-den and Piscataway, NJ, EUA). Para descrições adicionais, consulte Jônsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jõnsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; and Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Bichem. 198:268-277.

Conforme o uso em questão pretende-se que o termo “kon” se refira à constante da taxa para associação de um anticorpo ao antígeno para formar o complexo anticor-po/antígeno, conforme conhecido na técnica.

Conforme o uso em questão pretende-se que o termo “k0ff” se refira à constante da taxa para dissociação de um anticorpo a partir do complexo anticorpo/antígeno, conforme conhecido na técnica.

Conforme o uso em questão pretende-se que o termo “Κς|” se refira à constante de dissociação de uma interação particular anticorpo-antígeno, conforme conhecido na técnica.

Conforme o uso em questão, o termo “proteína de ligação rotulada” se refere a uma proteína com um marcador incorporado que proporciona uma identificação da proteína de ligação. De preferência, o marcador é um marcador detectável, por exemplo, a incorporação de um aminoácido radio-rotulado ou fixação de porções de biotinila que possam ser detectadas por avidina marcada (por exemplo, estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou atividade enzimática que possa ser detectada por métodos ópticos ou colorimétricos). Exemplos de marcadores para polipeptídeos incluem, mas não se limitam a: radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, 3H, 14C, 35S, 90Y, "Tc, 111ln, 125l, 131l, 177Lu, 166Ho, ou 153Sm); marcadores fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, lantanídeo fosforoso), marcadores enzimáticos (por exemplo, peroxidase de raiz-forte, luciferase, fosfatase alcalina); marcadores quimioluminescentes; grupos de biotinila; epítopos polipeptídicos predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências com par de zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação metálica, marcadores de epítopo); e agentes magnéticos, tais como quelatos de gadolínio. O termo “conjugado de anticorpos” se refere a uma proteína de ligação, tal como um anticorpo, quimicamente ligada a uma segunda porção química, tal como um agente terapêutico ou citotóxico. O termo “agente” é usado no presente documento para denotar um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica, ou um extrato constituído a partir de materiais biológicos. De preferência, os agentes terapêuticos ou citotóxicos incluem, mas não se limitam a, toxina pertussis, taxol, citochalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeõ, tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidróxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromicina e análogos ou homólogos dos mesmos.

Conforme o uso em questão, os termos “cristal”, e “cristalizado” se referem a um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, presente sob a forma de um cristal. Os cristais são uma forma do estado sólido da matéria, distinta de outras formas, tal como o estado sólido amorfo ou o estado cristalino líquido. Os cristais são compostos por arranjos tridimensionais de repetição regular de átomos, íons, moléculas (por exemplo, proteínas como anticorpos), ou montagens moleculares (por exemplo, complexos antígeno/anticorpo). Esses arranjos tridimensionais são dispostos de acordo com relações matemáticas específicas que são bem compreendidas no campo. A unidade fundamental, ou bloco de construção, que se repete em um cristal é denominada como a unidade assimétrica. A repetição da unidade assimétrica em uma disposição que se adéqua a uma determinada simetria crista-lográfica bem definida proporciona a “célula unitária” do cristal. A repetição da célula unitária por translações regulares em todas as dimensões proporciona o cristal. Consulte Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20 1-16, Oxford University Press, Nova York, Nova York, EUA (1999).” O termo "polinucleotídeo” conforme denominado no presente documento se refere a uma forma polimérica de dois ou mais nucleotídeos, sejam ribonucleotídeos ou desoxinucle-otídeos ou uma forma modificada de ambos os tipos de nucleotídeo. O termo inclui formas de fitas únicas ou duplas de DNA, porém, de preferência, é DNA de fita dupla.

Conforme o uso em questão, o termo “polinucleotídeo isolado” deve significar um polinucleotídeo (por exemplo, de origem genômica, cDNA, ou origem sintética, ou alguma combinação destas) que, em virtude de sua origem, o “polinucleotídeo isolado”: não é associado a todo ou a uma porção de um polinucleotídeo com o qual o “polinucleotídeo isolado” é encontrado na natureza; é operacionalmente ligado a um polinucleotídeo que não seja ligado na natureza; ou não ocorra na natureza como parte de uma sequência maior.

Conforme o uso em questão pretende-se que o termo “vetor” se refira a uma molécula de ácido nucléico capaz de transportar outro ácido nucléico ao qual o mesmo foi ligado. Um tipo de vetor é um plasmídeo”, que se refere a um laço de DNA de fita dupla circular no qual segmentos adicionais de DNA podem ser ligados. Outro tipo de vetor consiste em um vetor viral, sendo que os segmentos adicionais de DNA podem ser ligados ao genoma vira-le. Determinados vetores são capazes de realizar replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual se introduzem (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteri-ana de replicação e vetores de mamíferos episomais). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não-episomais) podem ser integrados ao genoma de uma célula hospedeira mediante a introdução na célula hospedeira, e, desse modo são replicados junto ao genoma hospedeiro. Além disso, determinados vetores são capazes de direcionar a expressão de genes à qual os mesmos são operativamente ligados. Esses vetores são denominados no presente documento como “vetores de expressão recombinante” (ou simplesmente, “vetores de expressão”). Em geral, os vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante encontram-se geralmente sob a forma de plasmídeos. No presente relatório descritivo, o “plasmídeo” e o “vetor” podem ser usados de modo intercambiável já que o plasmídeo é a forma mais comumente usada de vetor. No entanto, pretende-se que a invenção inclua outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, retrovírus defectivos em replicação, adenovírus e vírus adeno-associados), que servem funções equivalentes. O termo “operacionalmente ligado” se refere a uma justaposição onde os compostos descritos encontram-se em uma relação que os permite funcionar em sua maneira pretendida. Uma sequência de controle “operacionalmente ligada” a uma sequência de codificação é ligada de tal modo que a expressão da sequência de codificação seja obtida sob condições compatíveis com as sequências de controle. As sequências “operacionalmente ligadas” incluem tanto as sequências de controle de expressão que são contíguas com o gene de interesse como as sequências de controle de expressão que agem in trans ou a uma distância para controlar o gene de interesse. Conforme o uso em questão, o termo “sequência de controle de expressão” se refere a sequências polinucleotídicas, que são necessárias para realizar a expressão e o processamento de sequências de codificação às quais estas são ligadas. As sequências de controle de expressão incluem sequências apropriadas de iniciação, terminação, promotoras e acentuadoras de transcrição; sinais de processamento de RNA eficiente, tais c Orno sinais de divisão e poliadenilação; sequências que estabilizam o mRNA citoplásmico; sequências que aumentam a eficiência de translação (ou seja, sequência consenso de Kozak); sequências que aumentam a estabilidade protéica; e quando desejado, sequências que aumentam a secreção protéica. A natureza dessas sequências de controle difere dependendo do organismo hospedeiro; em procariotas, tais sequências de controle incluem, em geral, sequências promotoras, sítio de ligação ribossômi-ca, e terminação de transcrição; em eucariotas, em geral, tais sequências de controle incluem promotores e sequência de terminação de transcrição. Pretende-se que o termo “sequências de controle” inclua componentes cuja presença seja essencial para expressão e processamento, e também possa incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, sequências líder e sequências de parceiros de fusão.

Conforme definido no presente documento, o termo “transformação” se refere a qualquer processo através do qual o DNA exógeno entra em uma célula hospedeira. A transformação pode ocorrer sob condições naturais ou artificiais utilizando-se vários métodos bem conhecidos na técnica. A transformação pode depender de qualquer método conhecido para a inserção de sequências de ácido nucléicos estranhas em uma célula hospedeira procariótica e eucariótica. O método é selecionado com base na célula hospedeira sendo transformada e pode incluir, mas não se limita a, infecção viral, eletroporação, lipo-fecção, e bombardeio de partículas. Essas células “transformadas” incluem células estavei-mente transformadas nas quais o DNA inserido é capaz de replicação como um plasmídeo de replicação autônoma ou como parte do cromossomo hospedeiro. Estas também incluem células que expressam de modo transiente o DNA ou RNA inseridos durante períodos limitados de tempo.

Conforme o uso em questão pretende-se que o termo “célula hospedeira recombi-nante” (ou simplesmente “célula hospedeira”) se refira a uma célula na qual o DNA exógeno foi introduzido. Deve-se compreender que tais termos pretendem se referir não apenas à célula particular em questão, porém, à progênie de tal célula. Pelo fato de determinadas modificações poderem ocorrer nas gerações sucessoras devido às influencias mutacionais e ambientais, tal progênia não pode, de fato, ser idêntica à célula principal, porém, ainda estão incluídas no âmbito do termo “célula hospedeira”, conforme o uso em questão. De preferência, as células hospedeiras incluem células procarióticas e eucarióticas selecionadas a partir de qualquer um dos Reinos de lida. As células eucarióticas preferenciais incluem células protistas, fúngicas, vegetais e animais. Com mais preferência, as células hospedeiras incluem, mas não se limitam a, E. coli com linhagem celular procariótica; CHO com linhagens celulares de mamíferos, HEK 293 e COS; o Sf9 com linhagem celular de insetos; e Saccha-romyces cerevisiae com linhagem celular fúngica.

Podem-se utilizar técnicas padrão para síntese de oligonucleotídeo de RNA recom-binante, e cultura e transformação tecidual (por exemplo, eletroporação, lipofecção). As reações enzimáticas e técnicas de purificação podem ser realizadas de acordo com as especificações do fabricante ou conforme comumente realizado na técnica, ou conforme descrito no presente documento. As técnicas e procedimentos anteriores podem ser genericamente realizados de acordo com os métodos convencionais bem conhecidos na técnica e, conforme descrito em várias referencias gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo do presente relatório descritivo. Consulte, por exemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), que se encontra aqui incorporado para qualquer propósito a título de referência.

Conforme o uso em questão, e conforme conhecido na técnica, o termo “organismo transgênico” se refere a um organismo tendo células que contêm um transgene, sendo que o transgene induzido no organismo (ou um ancestral do organismo) expressa um polipeptí-deo não naturalmente expresso no organismo. Um “transgene” consiste em uma construção de DNA, que é estável e operacionalmente integrada ao genoma de uma célula a partir da qual um organismo transgênico se desenvolve, direcionando a expressão de um produto de gene codificado em um ou mais tipos de células ou tecidos do organismo transgênico.

Os termos “regular” e “modular” são usados de modo intercambiável, e, conforme o uso em questão, se referem a uma mudança ou alteração na atividade de uma molécula de interesse (por exemplo, a atividade biológica de hRGM A). A modulação pode ser um aumento ou uma redução na magnitude de uma determinada atividade ou função da molécula de interesse. As atividades e funções exemplificadoras de uma molécula incluem, mas não se limitam a, características de ligação, atividade enzimática, ativação de receptor celular, e transdução de sinal.

De modo correspondente, o termo “modulador,” conforme o uso em questão, consiste em um composto capaz de mudar ou alterar uma atividade ou função de uma molécula de interesse (por exemplo, a atividade biológica de hRGM A). Por exemplo, um modulador pode causar um aumento ou uma redução na magnitude de uma determinada atividade ou função de uma molécula comparada à magnitude da atividade ou função observadas na ausência do modulador. Conforme o uso em questão, o termo “agonista” se refere a um modulador que, quando colocado em contato com uma molécula de interesse, causa um aumento na magnitude de uma determinada atividade ou função da molécula comparada à magnitude da atividade ou função observadas na ausência do agonista. Os agonistas particulares de interesse podem incluir, mas não se limitam a, polipeptídeos hRGM A ou polipep-tídeos, ácidos nucléicos, carboidratos, ou quaisquer outras moléculas que se liguem a hRGM A. Conforme o uso em questão, o termo “antagonista” se refere a um modulador que, quando colocado em contato com uma molécula de interesse causa uma redução na magnitude de uma determinada atividade ou função da molécula comparada à magnitude da atividade ou função observadas na ausência do antagonista. Os antagonistas exemplificadores incluem, mas não se limitam a, proteínas, peptídeos, anticorpos, pepticorpos, carboidratos ou pequenas moléculas orgânicas. Os pepticorpos são descritos, por exemplo, em WO01/83525.

Os antagonistas particulares de interesse incluem aqueles que bloqueiam ou modulam a atividade biológica ou imunológica de hRGM A. Os antagonistas de hRGM A pode incluir, mas não se limitam a, proteínas, ácidos nucléicos, carboidratos, ou quaisquer outras moléculas, que se liguem a hRGM A, como anticorpos monoclonais que interagem com a molécula RGM A. Deve-se notar que a interação com RGM A pode resultar na ligação e neutralização de outros ligantes/componentes de membrana celular, e podem ser úteis para o funcionamento aditivo ou sinergístico contra várias doenças.

Conforme o uso em questão, o termo “quantidade eficaz” se refere à quantidade de um agente terapêutico que seja suficiente para reduzir ou atenuar a gravidade e/ou a duração de um distúrbio ou um ou mais sintomas deste, evitar o progresso de um distúrbio, causar regressão de um distúrbio, evitar a reincidência, desenvolvimento, princípio ou progressão de um ou mais sintomas associados a um distúrbio, ou aumentar ou aperfeiçoar o(s) efeito(s) profilático(s) ou terapêutico(s) de outra terapia (por exemplo, agente profilático ou agente terapêutico).

Conforme o uso em questão, o termo “amostra” é usado em seu sentido mais a-brangente. Conforme o uso em questão, uma “amostra biológica” inclui, mas não se limita a, qualquer quantidade de uma substancia proveniente de um ser vivo ou de um ser previamente vivo. Esses seres vivos incluem, mas não se limitam a, seres humanos, camundon-gos, ratos, macacos, cachorros, coelhos e outros animais. Essas substâncias incluem, mas não se limitam a, sangue, soro, urina, fluido sinovial, células, órgãos, tecidos, medula óssea, linfonodos e baço.

2. Polipeptfdeos que se liaam a hRGM A A modalidade principal do presente pedido compreende proteínas isoladas ou poli-peptídeos que se ligam especificamente a pelo menos um epítopo de uma proteína RGM A. As proteínas isoladas ou polipeptfdeos que se ligam especificamente a pelo menos um epítopo de uma proteína RGM A são capazes de inibir a ligação de RGM A à sua Neogenina receptora e/ou às proteínas morfogenéticas ósseas 2 e 4 (BMP-2, BMP-4). A modalidade mais preferencial do presente pedido compreende anticorpos que se ligam à RGM A ou porções de ligação ao antígeno ou fragmentos destes.

De preferência, os anticorpos anti-RGM A da presente invenção exibem uma alta capacidade de reduzir ou neutralizar a atividade de RGM A, por exemplo, conforme avaliado por um dos vários ensaios in vitro e in vivo conhecidos na técnica ou descritos mais adiante.

Com a máxima preferência, o presente pedido compreende neutralizar os anticorpos monoclonais contra RGM A, que evitam seletivamente a ligação de RGM A à sua Neogenina receptora ou às proteínas morfogenéticas ósseas 2 e 4 (BMP-2, BMP-4), e a geração de um anticorpo neutralizante monoclonal contra RGM A, que evita seletivamente a ligação de RGM A à suas proteínas morfogenéticas ósseas co-receptoras 2 e 4 (BMP-2, BMP-4).

De preferência, o anticorpo neutralizante monoclonal do presente pedido consiste em um anticorpo humano ou anticorpo humanizado. O termo “anticorpo humano” se refere a anticorpos tendo regiões variáveis e constantes correspondentes a, ou derivadas a partir de, sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana (por exemplo, consulte Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH No. 91-3242, 1991). Os anticorpos humanos do presente pedido, no entanto, podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados pelas sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sítio-específica in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo, nas CDRs e, em particular, CDR3.

Em várias modalidades, o anticorpo consiste em um anticorpo recombinante ou em um anticorpo monoclonal. Os anticorpos neutralizantes mais preferenciais do presente pedido são denominados no presente documento como mAb5F9 e mAb8D1 e fragmentos de anticorpo funcional destes, e outros anticorpos e fragmentos de anticorpo funcionais com propriedades equivalentes a mAb5F9 e mAb8D1, tal como uma ligação de alta afinidade à RGM A com baixa cinética de dissociação e alta capacidade de neutralização, são pretendidos como parte da presente invenção. A afinidade de ligação e a taxa de dissociação de um anticorpo anti-RGM A do presente pedido a um polipeptídeo RGM A imunogênico ou fragmento deste, podem ser determinadas através de qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, a afinidade de ligação pode ser medida por tecnologias ELISAs competitivas, c RIAs, BIAcore ou KinExA. A taxa de dissociação também pode ser medida pela tecnologia BIAcore ou KinExA. A afinidade de ligação e a taxa de dissociação são medidas por ressonância plasmônica superficial utilizando-se, por exemplo, um BIAcore.

Um dos anticorpos monoclonais preferenciais do presente pedido, o anticorpo mAb5F9, tem pelo menos 90% da identidade de sequência aminoacídica com uma sequência que compreende uma região variável de cadeia pesada (região VH) que compreende a sequência de SEQ ID NO: 9 ou 34 e uma região variável de cadeia leve (região VL) que compreende a sequência de SEQ ID NO: 10.

Pretende-se, também, que os anticorpos monoclonais isolados que interagem com a RGM A do presente pedido podem ser uma proteína de ligação glicosilada onde o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno deste compreende um ou mais resíduos de carboidra-to. A produção de proteína in vivo nascente pode ser submetida a um processamento adicional, conhecida como modificação pós-translacional. Em particular, podem-se adicionar, de modo enzimático, resíduos de açúcar (glicosil), um processo conhecido como glicosila-ção. As proteínas resultantes que transportam cadeias laterais de oligossacarídeos covalen-temente ligadas são conhecidas como proteínas glicosiladas ou glicoproteínas. A glicosila-ção de proteína depende da sequência aminoacídica da proteína de interesse, assim como da célula hospedeira na qual a proteína é expressa. Os diferentes organismos podem produzir diferentes enzimas de glicosilação (por exemplo, glicosil transferases e glicosidases), e têm diferentes substratos (açúcares de nucleotídeo) disponíveis. Devido a esses fatores, o padrão de glicosilação de proteína, e a composição de resíduos de glicosil, podem ser dife- rentes dependendo do sistema hospedeiro no qual a proteína particular é expressa. Os resíduos de glicosil úteis na invenção podem incluir, mas não se limitam a, glicose, galactose, manose, fucose, n-acetil glucosamina e ácido siálico. De preferência, a proteína de ligação glicosilada compreende resíduos de glicosil de modo que o padrão de glicosilação seja humano.

Os anticorpos do presente pedido compreendem uma região constante de cadeia pesada, tal como uma região constante lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM, IgY ou IgD. Além disso, o anticorpo pode compreender uma região constante de cadeia leve, uma região constante de cadeia leve kappa ou uma região constante de cadeia leve lambda. De preferência, o anticorpo compreende uma região constante de cadeia leve kappa. Alternativamente, a porção de anticorpo pode ser, por exemplo, um fragmento Fab ou um fragmento Fv de cadeia simples. As substituições de resíduos de aminoácidos na porção Fc para alterar a função efetuadora do anticorpo são conhecidas na técnica (Winter, et al. Patentes U.S. Nos. 5.648.260; 5.624.821). A porção Fc de um anticorpo media várias importantes funções efe-tuadoras, por exemplo, indução de citocina, ADCC, fagocitose, citotoxicidade dependente complementar (CDC) e a taxa de meia-vida/afastamento de complexos de antígeno-anticorpo. Em alguns casos, essas funções efetuadoras são desejáveis para anticorpos terapêuticos, porém, em outros casos, podem ser desnecessárias ou até mesmo prejudiciais, dependendo dos objetivos terapêuticos. Determinados isotipos IgG humanos, particularmente lgG1 e lgG3, mediam ADCC e CDC através da ligação a Fcy Rs e C1q complementar, respectivamente. Os receptores Fc neonatais (FcRn) são os componentes críticos que determinam a meia-vida de circulação dos anticorpos. Ainda em outra modalidade, pelo menos um resíduo de aminoácido é substituído na região constante do anticorpo, por exemplo, a região Fc do anticorpo, de tal modo que as funções efetuadoras do anticorpo sejam alteradas.

3. Geração de anticorpos anti-hRGM A 3.1. Geral Os anticorpos do presente pedido podem ser gerados por imunização de um hospedeiro adequado (por exemplo, vertebrados, incluindo seres humanos, camundongos, ratos, ovelhas, bodes, porcos, gado, cavalos, répteis, peixes, anfíbios, e nos ovos de pássaros, répteis e peixes). Com a finalidade de gerar os anticorpos do presente pedido, o hospedeiro é imunizado com um polipeptídeo de RGM A imunogênico ou fragmento deste da invenção. O termo “imunização” se refere, no presente documento, ao processo de apresentar um antígeno a um repertório imune se este repertório estiver presente em um organismo natural geneticamente inalterado, ou em um organismo transgênico, incluindo aqueles modificados para exibir um repertório imune humano artificial. De modo semelhante, uma “preparação imunogênica” consiste em uma formulação de antígeno que contém adjuvantes ou outros aditivos que aumentariam a imunogenicidade do antígeno. A imunização de animais pode ser realizada através de qualquer método conhecido na técnica. Consulte, por exemplo, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Nova York, EUA: Cold Spring Harbor Press, 1990. Os métodos para imunização de animais não-humanos, tais como camundongos, ratos, ovelhas, bodes, porcos, gado cavalos são bem conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Harlow and Lane e a Patente U.S. No. 5.994.619. Em uma modalidade preferencial, o antígeno RGM A é administrado com um adjuvante para estimular a resposta imune. Esses adjuvantes incluem adjuvantes de Freund completos ou incompletos, RIBI (muramil dipeptídeos) ou ISCOM (complexos imuno estimulantes). Esses adjuvantes podem proteger o polipeptídeo contra uma rápida dispersão sequestrando-o em um depósito local, ou eles podem conter substâncias que estimulam o hospedeiro a secretar fatores que sejam quimiotáticos para macrófagos e outros componentes do sistema imune. De preferência, se um polipeptídeo estiver sendo administrado, o esquema de imunização envolverá duas ou mais administrações do polipeptídeo, propagadas durante várias semanas.

Contempla-se que o animal hospedeiro é imunizado com o antígeno associado à membrana celular de uma célula intacta ou rompida e os anticorpos do presente pedido são identificados através da ligação a um polipeptídeo imunogênico da invenção. Após a imunização do animal hospedeiro com o antígeno, os anticorpos podem ser obtidos a partir do animal. O soro contendo anticorpo é obtido a partir do animal escoando-se o sangue ou sacrificando-se o animal. O soro pode ser usado assim como é obtido a partir do animal, pode-se obter uma fração de imunoglobulina a partir do soro, ou os anticorpos podem ser purificados a partir do soro. O soro ou imunoglobulinas obtidos desta maneira são policlonais, tendo, portanto, uma matriz heterogênea de propriedades. 3.2. Anticorpos Monoclonais Anti-RGM A que utilizam a tecnologia de Hibridomas Os anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando-se uma ampla variedade de técnicas conhecidas na técnica que incluem o uso de tecnologias de exibição de hibridomas, recombinantes e fago, ou uma combinação destas. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos utilizando-se técnicas de hibridomas que incluem estas conhecidas na técnica e ensinadas, por exemplo, em Harlow et al. , Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al., em: Mo-noclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) (sendo que as ditas referências encontram-se aqui incorporadas em suas totalidades a título de referência). O termo “anticorpo monoclonal” Conforme o uso em questão, os anticorpos não se limitam a anticorpos produzidos através da tecnologia de hibridomas. O termo “anticorpo monoclonal” se refere a um anticorpo derivado a partir de um único clone, que inclui qualquer clone euca-riótico, procariótico, ou fágico, e não através do método pelo qual este é produzido.

Os métodos para produção e triagem de anticorpos específicos utilizando-se a tecnologia de hibridomas são rotineiros e bem conhecidos na técnica. Em uma modalidade, a presente invenção proporciona métodos de gerar anticorpos monoclonais assim como anticorpos produzidos pelo método que compreende submeter à cultura uma célula de hibrido-ma secretando-se um anticorpo da invenção, sendo que, de preferência, o hibridoma é gerado fundindo-se os esplenócitos isolados a partir de um camundongo imunizado com um antígeno da invenção com células de mieloma em então, submetendo-se os hibridomas à triagem resultando a partir da fusão para clones de hibridomas que secretam um anticorpo capaz de aglutinar um polipeptídeo da invenção. Resumidamente, os camundongos podem ser imunizados com um antígeno RGM A. Em uma modalidade preferencial, o antígeno RGM A é administrado com um adjuvante de modo a estimular a resposta imune. Esses adjuvantes incluem adjuvantes de Freund completos ou incompletos, RIBI (muramil dipeptí-deos) ou ISCOM (complexos imuno estimulantes). Esses adjuvantes podem proteger o polipeptídeo contra uma rápida dispersão sequestrando-o em um depósito local, ou eles podem conter substâncias que estimulam o hospedeiro a secretar fatores que sejam quimiotáticos para macrófagos e outros componentes do sistema imune. De preferência, se um polipeptídeo estiver sendo administrado, o esquema de imunização envolverá duas ou mais administrações do polipeptídeo, propagadas durante várias semanas.

Uma vez que a resposta imune for detectada, por exemplo, anticorpos específicos para o antígeno RGM A forem detectados no soro do camundongo, o baço do camundongo é coletado e os esplenócitos isolados. Os esplenócitos são, então, fundidos através de técnicas bem conhecidas em quaisquer células de mieloma adequadas, por exemplo, células provenientes da linhagem celular SP20 disponíveis a partir de ATCC. Os hibridomas são selecionados e clonados através de diluição limitada. Os clones de hibridomassão, então, analisados através de vários métodos conhecidos na técnica para células que secretam anticorpos capazes de aglutinar RGM A. Os fluidos de ascite, que contém genericamente altos níveis de anticorpos, podem ser gerados imunizando-se o camundongo com clones de hibridomas positivos.

Em outra modalidade, os hibridomas imortalizados de produção de anticorpos podem ser preparados a partir de um animal imunizado. Após a imunização, o animal é sacrificado e as células B esplênicas são fundidas às células de mielona imortalizadas, conforme bem conhecido na técnica. Consulte, por exemplo, Harlow and Lane, supra. Em uma modalidade preferencial, as células de mieloma não secretam polipeptídeos de imunoglobulina (uma linhagem celular não-secretória). Após a fusão e a seleção antibiótica, os hibridomas são submetidos à triagem utilizando-se RGM A, ou uma porção desta, ou uma RGM A de expressão celular. Em uma modalidade preferencial, a triagem inicial é realizada utilizando-se um imunoensaio enzimático (ELISA) ou um radio imunoensaio (RIA), de preferência, um ELISA. Um exemplo de triagem ELISA é proporcionado no documento WO 00/37504, aqui incorporado a título de referência.

Os hibridomas de produção de anticorpos Anti-RGM A são selecionados, clonados e, adicionalmente, submetidos à triagem para determinação das características desejadas, que incluem o crescimento robusto de hibridomas, alta produção de anticorpo e características desejadas de anticorpos, conforme discutido mais adiante. Os hibridomas podem ser submetidos à cultura e expandidos in vivo em animais singênicos, em animais desprovidos de um sistema imune, por exemplo, camundongos glabros, ou em cultura celular in vitro. Os métodos de seleção, clonagem e expansão de hibridomas são bem conhecidos pelos indivíduos versados na técnica.

Em uma modalidade preferencial, os hibridomas são hibridomas de camundongos, conforme descrito anteriormente. Em outra modalidade preferencial, os hibridomas são produzidos em uma espécie que não seja humana nem seja um camundongo, tais como ratos, ovelhas, porcos, bodes, gado ou cavalos. Em outra modalidade, os hibridomas são hibridomas humanos, no qual um mieloma não-secretório humano é fundido a uma célula humana que expressa um anticorpo anti-RGM A.

Os fragmentos de anticorpos que reconhecem os epítopos específicos podem ser gerados por técnicas conhecidas. Por exemplo, os fragmentos Fab e F(ab')2 da invenção podem ser produzidos por divagem proteolítica de moléculas de imunoglobulina, utilizando-se enzimas, tais como papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos F(ab')2). Os fragmentos F(ab')2 contêm a região variável, a região constante de cadeia leve e o domínio CHI da cadeia pesada.

3.3. Anticorpos Monoclonais Anti-RGM A aue utilizam SLAM

Em outro aspecto da invenção, os anticorpos recombinantes são gerados a partir de linfócitos isolados simples utilizando-se um procedimento denominado na técnica como o método de produção de anticorpos por linfócitos selecionados (SLAM), conforme descrito na Patente U.S. No. 5.627.052, na Publicação PCT WO 92/02551 e Babcock, J.S. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:7843-7848. Neste método, as células simples que secretam anticorpos de interesse, por exemplo, linfócitos derivados a partir de quaisquer animais imunizados descritos anteriormente, são submetidas à triagem utilizando-se um ensaio em placa hemolítica antígeno-específico, sendo que a RGM A antígeno, uma subunidade de RGM A, ou um fragmento deste, é acoplada às células sanguíneas vermelhas de ovelhas através do uso de um ligante, tal como biotina, e usada para identificar celular simples que secretam anticorpos com especificidade para RGM A. Após a identificação das células secretoras de anticorpos de interesse, os cDNAs de região variável de cadeia leve são resgatadas a partir das células através de transcriptase-PCR reversa e essas regiões variáveis podem, então, ser expressas, no contexto das regiões constantes apropriadas de imunoglobulinas (por e- xemplo, regiões constantes humanas), em células hospedeiras de mamíferos, tais como as células COS ou CHO. As células hospedeiras transfectadas com as sequências de imuno-globulinas amplificadas, derivadas de linfócitos selecionados in vivo, podem, então, ser submetidas a uma análise e seleção adicional in vitro, por exemplo, posicionando-se as células transfectadas de modo a isolar as células que expressam anticorpos à RGM A. As sequências de imunoglobulinas amplificadas podem, ainda, ser manipuladas in vitro, tal como através de métodos de maturação por afinidade in vitro, tais como aqueles descritos na Publicação PCT WO 97/29131 e na Publicação PCT WO 00/56772. 3.4. Anticorpos Monoclonais Anti-RGM A aue utilizam animais transaênicos Em outra modalidade da invenção instantânea, os anticorpos são produzidos imunizando-se um animai não-humano que compreende alguns, ou todos, os locais de imunoglo-bulina humana com um antígeno RGM A. Em uma modalidade preferencial, o animal não-humano é um camundongo transgênico XENOMOUSE, uma cepa de camundongo geneticamente modificada que compreende grandes fragmentos dos locais de imunoglobulina humana e seja deficiente na produção de anticorpo de camundongos. Consulte, por exemplo, Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994) e as Patentes Norte-Americanas 5.916.771, 5.939.598, 5.985.615, 5.998.209, 6.075.181, 6.091.001, 6.114.598 e 6,130,364. Consulte, também, WO 91/10741, publicado em 25 de julho de 1991, WO 94/02602, publicado em 3 de fevereiro de 1994, WO 96/34096 e WO 96/33735, ambos publicados em 31 de outubro de 1996, WO 98/16654, publicado em 23 de abril de 1998, WO 98/24893, publicado em 11 de junho de 1998, WO 98/50433, publicado em 12 de novembro de 1998, WO 99/45031, publicado em 10 de setembro de 1999, WO 99/53049, publicado em 21 de outubro de 1999, WO 00 09560, publicado em 24 de fevereiro de 2000 e WO 00/037504, publicado em 29 de junho de 2000. O camundongo transgênico XENOMOUSE produz um repertório humano tipo adulto de anticorpos totalmente humanos, e gera Mabs humanos antígeno-específico. O camundongo transgênico XENOMOUSE contém aproximadamente 80% do repertório de anticorpos humanos através da introdução de fragmentos YAC com configuração de linha germinativa em dimensões de megabase dos locais de cadeia pesada humana e x locais de cadeia leve. Consulte Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green and Jako-bovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), estando as descritos destes aqui incorporadas a título de referência. 3.5. Anticorpos Monoclonais Anti-RGM A que utilizam bibliotecas de anticorpos re-combinantes Os métodos In vitro também podem ser usados para produzir os anticorpos da invenção, sendo que uma biblioteca de anticorpos é submetida à triagem com a finalidade de identificar um anticorpo tendo a especificidade de ligação desejada. Os métodos para tal triagem de bibliotecas de anticorpos recombinantes são bem conhecidos na técnica e inclu- em os métodos descritos, por exemplo, em Ladner et al. Patente U.S. No. 5.223.409; Kang et al. Publicação PCT No. WO 92/18619; Dower et al. Publicação PCT No. WO 91/17271; Winter et al. Publicação PCT No. WO 92/20791; Markland et al. Publicação PCT No. WO 92/15679; Breitling et al. Publicação PCT No. WO 93/01288; McCafferty et al. Publicação PCT No. WO 92/01047; Garrard et al. Publicação PCT No. WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896: Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad etal. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) NucAcid Res 19:4133-4137; e Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982, Publicação de Pedido de Patente U.S 20030186374, e Publicação PCT No. WO 97/29131, estando os conteúdos destes aqui incorporadas a título de referência. A biblioteca de anticorpos recombinantes pode ser proveniente de um indivíduo i-munizado com RGM A, ou uma porção de RGM A. Alternativamente, a biblioteca de anticorpos recombinantes pode ser proveniente de um indivíduo nativo, ou seja, aquele que não foi imunizado com RGM A, tal como uma biblioteca de anticorpos humanos provenientes de um indivíduo humano que não foi imunizado com a RGM A humana. Os anticorpos da invenção são selecionados submetendo-se a biblioteca de anticorpos recombinantes à triagem com o peptídeo que compreende RGM A humana para, desse modo, selecionar esses anticorpos que reconhecem a RGM A. Os métodos para conduzir tal triagem e seleção são bem conhecidos na técnica, tal como descrito nas referências no parágrafo anterior. Com a finalidade de selecionar os anticorpos da invenção tendo afinidades de ligação particulares por hRGM A, tais como aqueles que se dissociam a partir da RGM A humana com uma constante de taxa koff particular, o método conhecido na técnica de ressonância plasmônica superficial pode ser usado para selecionar anticorpos tendo a constante de taxa k0tf desejada. Com a finalidade e selecionar os anticorpos da invenção tendo uma atividade neutralizante particular para hRGM A, tais como aqueles com um IC50 particular, podem-se utilizar os métodos padrão conhecidos na técnica para avaliar a inibição da atividade de hRGM A.

Em um aspecto, a invenção pertence a um anticorpo isolado, ou a uma porção de ligação ao antígeno deste, que se liga à RGM A humana. De preferência, o anticorpo é um anticorpo neutralizante. Em várias modalidades, o anticorpo é um anticorpo recombinante ou um anticorpo monoclonal.

Por exemplo, os anticorpos da presente invenção também podem ser gerados utilizando-se vários métodos de exibição de fago conhecidos na técnica. Nos métodos de exibição de fagos, os domínios de anticorpo funcional são exibidos na superfície das partículas de fago que transportam as sequências de polinucleotídeo que as codificam. Em particular, tal fago pode ser utilizado para exibir domínios de ligação ao antígeno expressos a partir de um repertório ou de uma biblioteca de anticorpo combinatórios (por exemplo, humanos ou murinos). O fago que expressa um domínio de ligação ao antígeno que se liga ao antígeno de interesse pode ser selecionado ou identificado com o antígeno, por exemplo, utilizando-se um antígeno rotulado ou um antígeno ligado ou capturado a uma superfície sólida ou mi- croesfera. O fago usado nesses métodos são fagos tipicamente filamentosqs que incluemjd _ e domínios de ligação M13 expressos a partir de fagos com domínios de anticorpo Fab, Fv ou Fv estabilizado com dissulfeto recombinantemente fundidos ao gene do fago III ou à proteína do fago VIII. Exemplos de métodos de exibição de fagos que podem ser usados para constituir os anticorpos da presente invenção incluem aqueles descritos em Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); Pedido PCT No. PCT7GB91/01134; Publicações PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; e Patentes U.S. Nos. 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780. 225; 5.658.727; 5.733.743 e 5.969.108; estando cada um desses aqui incorporados em sua totalidade a título de referência.

Conforme descrito nas referências anteriores, após a seleção de fago, as regiões de codificação de anticorpos provenientes do fago podem ser isoladas e usadas para gerar anticorpos completos, incluindo anticorpos humanos ou qualquer outro fragmento de ligação ao antígeno desejado, e expressas em qualquer hospedeiro desejado, incluindo células de mamíferos, células de insetos, células vegetais, levedura, e bactérias, por exemplo, conforme descrito em maiores detalhes mais adiante. Por exemplo, as técnicas para produzir recombinantemente os fragmentos Fab, Fab' e F(ab')2 também podem ser empregadas utili-zando-se os métodos conhecidos na técnica,tais como aqueles descritos na Publicação PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); e Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); e Better et al., Science 240:1041-1043 (1988) (estando as ditas referências aqui incorporadas em sua totalidade a título de referência). Exemplos de técnicas, que podem ser usadas para produzir Fvs de cadeia simples e anticorpos incluem aquelas descrias nas Patentes U.S. 4.946.778 e 5.258.498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); e Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988).

As metodologias alternativas à triagem de bibliotecas de anticorpos recombinantes por exibição de fago, outras metodologias conhecidas na técnica para triagem de grandes bibliotecas combinatórias podem ser aplicadas à identificação de anticorpos com especificidade dupla da invenção. Um tipo de sistema de expressão alternativo é um no qual a biblio- teca de anticorpos recombinantes é expressa como fusões de proteínas de RNA, conforme descrito na Publicação PCT No. WO 98/31700 por Szostak and Roberts, e em Roberts, R.W. and Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:12297-12302. Neste sistema, cria-se um fusão covalente entre um mRNA e o peptídeo ou proteína que esta codifica através de translação in vitro de mRNAs sintéticos que transportam puromicina, um antibiótico aceptor de peptidil, em sua terceira terminação. Portanto, um mRNA específico pode ser enriquecido a partir de uma mistura complexa de mRNAs (por exemplo, uma biblioteca combinatória) com base nas propriedades do peptídeo ou proteína codificada, por exemplo, anticorpo, ou porção do mesmo, tal como a ligação do anticorpo, ou porção dos mesmo, ao antígeno com especificidade dupla. As sequências de ácido nucléico que codificam anticorpos, ou porções dos mesmos, recuperados a partir da triagem dessas bibliotecas podem ser expressas por meios recombinantes, conforme descrito anteriormente (por exemplo, em células hospedeiras de mamíferos) e, além disso, podem ser submetidas a uma maturação por afinidade adicional através de rodadas adicionais de triagem de fusões de peptídeo mRNA onde as mutações foram introduzidas na(s) sequência(s) origínalmente seleciona-da(s), ou através de outros métodos para maturação por afinidade in vitro de anticorpos recombinantes, conforme descrito anteriormente.

Em outra abordagem, os anticorpos da presente invenção também podem ser gerados utilizando-se métodos de exibição de levedura conhecidos na técnica. Nos métodos de exibição de levedura, utilizam-se métodos genéticos para fixar os domínios de anticorpo à parede celular da levedura e os exibir na superfície da levedura. Em particular, tal levedura pode ser utilizada para exibir domínios de ligação ao antígeno expressos a partir de um repertório ou biblioteca de anticorpos combinatórios (por exemplo, humanos ou murinos) E-xemplos de métodos de exibição de levedura que podem ser usados para produzir os anticorpos da presente invenção incluem aqueles descritos em Wittrup, et al. Patente U.S No. 6.699.658 aqui incorporada a título de referência. 4. Produção de anticorpos RGM A recombinantes particulares da invenção Os anticorpos da presente invenção podem ser produzidos através de qualquer entre uma série de técnicas conhecidas. Por exemplo, a expressa de células hospedeiras, sendo que o(s) vetor(es) de expressão que codifica(m) as cadeias pesadas e leves é (são) transfectado(s) em uma célula hospedeira através de técnicas padrão. Pretende-se que as várias formas do termo “transfecção” abranjam uma ampla variedade de técnicas comumen-te usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção com DEAE-dextrano, e similares. Muito embora seja possível expressar os anticorpos da invenção em células hospedeiras eucarióticas ou procarióticas, a expressão de anticorpos em células eucarióticas é preferível, e, com preferência, em células hospedeiras de mamíferos, porque tais células eucarióticas (e, em particular, células de mamíferos) são mais prováveis do que as células procarióticas em montar e secretar um anticorpo apropriadamente dobrado e imunologicamente ativo.

As células hospedeiras de mamíferos preferenciais para expressar os anticorpos recombinantes da invenção incluem células do Ovário de Hamster Chinês (células CHO) incluindo células dhfr-CHO, descritas em Urlaub and Chasin, (1980) Proc. NatL Acad. Sei. USA 77:4216-4220, usadas com um marcador selecionável DHFR, por exemplo, conforme descrito em R.J. Kaufman and P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621). células de mielo-ma NSO, células COS e células SP2. Quando os vetores de expressão recombinante que codificam os genes de anticorpo forem introduzidos em células hospedeiras de mamíferos, os anticorpos são produzidos submetendo-se as células hospedeiras à cultura durante um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, com mais preferência, a secreção do anticorpo no meio de cultura onde as células hospedeiras estão se desenvolvendo. Os anticorpos podem ser recuperados a partir do meio de cultura utilizando-se métodos de purificação de proteínas padrão.

As células hospedeiras também podem ser usadas para produzir os fragmentos funcionais de anticorpos, tais como os fragmentos Fab ou as moléculas scFv. Compreender-se-á que as variações sobre o procedimento anterior encontram-se no escopo da presente invenção. Por exemplo, pode ser desejável transfectar uma célula hospedeira com DNA que codifica os fragmentos funcionais de cadeia leve e/ou cadeia pesada de um anticorpo da presente invenção. A tecnologia de DNA recombinante também pode ser usada para remover parte, ou todo o DNA que codifica uma ou ambas as cadeias leves e pesadas que não sejam necessárias para ligação aos antígenos de interesse. As moléculas expressas a partir de tais moléculas de DNA truncadas também são abrangidas pelos anticorpos da invenção. Além disso, podem-se produzir anticorpos bifuncionais onde uma cadeia pesada e uma cadeia leve encontram-se em um anticorpo da invenção e a outra cadeia pesada e a outra cadeia leve são específicas para um antígeno diferente dos antígenos de interesse reticulan-do-se um anticorpo da invenção a um segundo anticorpo através de métodos de reticulação química padrão.

Em um sistema preferencial para expressão recombinante de um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, da invenção, um vetor de expressão recombinante que codifica tanto a cadeia pesada do anticorpo como a cadeia leve do anticorpo é introduzido nas células dhfr-CHO através de transfecção mediada por fosfato de cálcio. No vetor de expressão recombinante, os genes de cadeia pesada e leve do anticorpo são operacionalmente ligados aos elementos regulatórios acentuadores de CMV/promotores de AdMLP com a finalidade de acionar altos níveis de transcrição dos genes. O vetor de expressão recombinante também transporta um gene DHFR, que permite a seleção de células CHO que foram transfectadas com o vetor utiiizando-se seleção/amplificação de metotrexato. As células hospedeiras transformantes selecionadas são submetidas à cultura de modo a permitir a expressão das cadeias pesadas e leves do anticorpo e o anticorpo intacto é recuperado a partir do meio de cultura. Utilizam-se técnicas de biologia molecular padrão para preparar o vetor de expressão recombinante, transfectar as células hospedeiras, selecionar os trans-formantes, submeter à cultura as células hospedeiras e recuperar o anticorpo a partii^ do meio de cultura. Além disso, a invenção proporciona um método de sintetizar um anticorpo recombinante da invenção submetendo-se à cultura uma célula hospedeira da invenção em um meio de cultura adequado até que um anticorpo recombinante da invenção seja sintetizado. O método pode compreender, ainda, isolar o anticorpo recombinante do meio de cultura.

4.1. Anticorpos Anti RGM A A Tabela 5 é uma lista de sequências aminoacídicas das regiões VH e VL dos anticorpos anti-hRGM A preferenciais da invenção. TABELA 5: LISTA DE SEQUÊNCIAS AMINOACÍDICAS DAS REGIÕES VH E VL DE ANTICORPOS ΑΝΤΙ hRGM A 5F9 E 8D1 As sequências CDR de anticorpo anti-RGM A isoladas anteriormente estabelecem uma nova família de proteínas de ligação RGM A, isoladas de acordo com a presente invenção. Com a finalidade de gerar e seleciona os CDR’s da invenção tendo atividades preferenciais de ligação e/ou neutralizantes de RGM A em relação a hRGM A, podem-se utilizar os métodos padrão conhecidos na técnica destinados à geração de proteínas de ligação da presente invenção e avaliar as características de ligação e/ou neutralizantes de RGM A dessa proteína de ligação, que incluem, mas não se limitam àqueles descritos de modo específico no presente documento.

4.2. Anticorpos Quiméricos Anti RGM A

Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual diferentes porções do anticorpo são derivadas a partir de diferentes espécies animais, tais como os anticorpos tendo uma região variável derivada a partir de um anticorpo monoclonal murino e uma região constante de imunoglobulina humana. Os métodos para produção de anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; Patentes U.S. Nos. 5.807.715; 4.816.567; e 4.816.397, estando aqui incorporadas em suas totali- dades a título de referência. Além disso, podem-se utilizar as técnicas desenvolvidas para a produção de “anticorpos quiméricos” (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454, estando aqui incorporadas em suas totalidades a título de referência) através de splicing genético proveniente de uma molécula de anticorpo de camundongo de especificidade de antígeno apropriada junto a genes provenientes de uma molécula de anticorpo humano de atividade biológica apropriada.

Em uma modalidade, os anticorpos quiméricos da invenção são produzidos substi-tuindo-se a região constante de cadeia pesada dos anticorpos anti-RGM A humana mono-clonal murino descritos no presente documento por uma região constante lgG1 humana.

4.3. Anticorpos Anti RGM A enxertados com CDR

Os anticorpos enxertados com CDR da invenção compreendem sequências de região variável de cadeia pesada e leve provenientes de um anticorpo humano, sendo que uma ou mais regiões CDR de VH e/ou VL são substituídas por sequências CDR de anticorpos não-humanos, como, por exemplo, anticorpos murinos da invenção. Uma sequência de estrutura proveniente de qualquer anticorpo humano pode servir como o modelo para o enxerto com CDR. No entanto, a substituição de cadeira linear em tal estrutura geralmente leva a alguma perda de afinidade de ligação ao antígeno. Quanto mais homólogo um anticorpo humano for em relação ao anticorpo murino original, menor será a possibilidade de que a combinação dos CDRs murinos com a estrutura humana introduza distorções nas CDRs que poderíam reduzir a afinidade. Portanto, é preferível que a estrutura variável humana que é escolhida para substituir a estrutura variável murina sem considerar as CDRs tenha pelo menos uma identidade de sequência de 65% com a estrutura de região variável de anticorpo murino. É mais preferível que as regiões variáveis humanas e murinas sem considerar as CDRs tenha pelo menos uma identidade de sequência de 70%. É mais preferível ainda que as regiões variáveis humanas e murinas sem considerar as CDRs tenham pelo menos uma identidade de sequência de 75%. É mais preferível ainda que as regiões variáveis humanas e murinas sem considerar as CDRs tenham pelo menos uma identidade de sequência de 80%. Os métodos para produção de anticorpos enxertados com CDR são conhecidos na técnica (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Patente U.S. Nos. 5.225.539). Em uma modalidade específica, a invenção proporciona anticorpos enxertados com CDR com cadeias VH e/ou VL conforme descrito na Tabela 6.

TABELA 6: ANTICORPOS ENXERTADOS COM CDR

As sequências CDR derivadas a partir de mAb 5F9 são citadas em negrito. Também se faz referência às sequências de estruturas específicas (FR1 a FR4) citando-se os SEQ ID Nos correspondentes (consulte, também, as Tabelas 3 e 4) 4.4. Anticorpos humanizados Anti RGM A

Os anticorpos humanizados são moléculas de anticorpos provenientes de anticorpos de espécie não-humana que se liga ao antígeno desejado tendo uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) provenientes de uma espécie não-humana e regiões de estrutura provenientes de uma molécula de imunoglobulina humana. As sequências Ig humanas conhecidas são descritas, por exemplo, em www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez- /query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html;www.sciquest.com/; www.abcam.com/;www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html;www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH- 05/ku by05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/lmmune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m- ikeima-ges.html; www.antibodyresource.com/;mcb.harvard.edu/BioLinks/lmmuno- logy.html.www.immunologyiink.com/; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.- html; www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/;www.pebio.com/pa/340913/340913.html-; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito- /Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp;www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin- ks.html; www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html; www.isac-net.org/sites_geo.html; axim- tl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP-Start.html; baserv.uci.kun.nl/.aboutjraats/linksl.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/;www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu-blic/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; anticorpo.bath.ac.uk/; ab- gen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/.about.honegger/AHOsem- i-nar/Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.Uk/.about.ubcg07s/;www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ cca-ewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h- umanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html;www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.abo- ut.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/fr roducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat et ai., Sequences of Proteins of Immuno-logical Interest, Departamento de Saúde Norte-Americano (1983), estando cada um desses aqui incorporados a título de referência. Essas sequências importadas podem ser usadas para reduzir a imunogenicidade ou reduzir, aperfeiçoar ou modificar a ligação, afinidade, constante de taxa para associação, constante de taxa para dissociação, avidez, especificidade, meia-vida, ou qualquer outra característica adequada, conforme conhecido na técnica.

Os resíduos de estrutura nas regiões de estrutura humana podem ser substituídos pelos resíduos correspondentes provenientes do anticorpo doador CDR para alterar, de preferência, aperfeiçoar, a ligação ao antígeno. Essas substituições de estrutura são identificadas por métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, através da modelagem das interações dos resíduos de CDR e estrutura que serve para identificar os resíduos de estrutura importantes para ligação ao antígeno e pela comparação de sequências que serve para i-dentificar resíduos de estrutura incomuns em posições particulares. (Consulte, por exemplo, Queen etal., Patente U.S. No. 5.585.089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), estando aqui incorporadas em suas totalidades a título de referência.) Os modelos de imunoglobulina tridimensionais são comumente disponíveis e são familiares aos indivíduos versados na técnica. Encontram-se disponíveis programas computacionais que ilustram e exibem prováveis estruturas conformacionais tridimensionais de sequências de imunoglobulinas candidatas selecionadas. A inspeção dessas exibições permite a análise do provável papel dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, ou seja, a análise de resíduos que influencia na capacidade da imunoglobulina candidata em se ligar a seu antí-geno. Desta forma, os resíduos FR podem ser selecionados e combinados a partir se sequências consenso e importadas de tal modo que a característica de anticorpo desejada, tal como uma afinidade maior ao(s) antígeno(s) alvo(s), seja obtida. Em geral, os resíduos de CDR são diretamente e mais substancialmente envolvidos em influenciar a ligação ao antí-geno. Os anticorpos podem ser humanizados utilizando-se uma variedade de técnicas conhecidas na técnica, que incluem, mas não se limitam a, aquelas descritas em Jones et al., Nature 321:522 (1986); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta etal., J. Immunol. 151:2623 (1993), Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al. , PNAS 91:969-973 (1994); Publicação PCT WO 91/09967, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, W090/14430, EP 229246, EP 592,106; EP 519,596, EP 239,400, Patentes U.S. Nos. 5.565.332, 5.723.323, 5.976.862, 5.824.514, 5.817.483, 5.814.476, 5.763.192, 5.723.323, 5.766.886, 5.714.352, 6.204.023, 6.180.370, 5.693.762, 5.530.101, 5.585.089, 5.225.539; 4.816.567, estando cada uma dessas aqui incorporadas e incluídas em suas totalidades a título de referência. 5. Modalidades Adicionais de Anticorpos da Invenção 5.1. Anticorpos de Fusão e Imunoadesinas O presente pedido também descreve um anticorpo de fusão ou imunoadesina que pode ser constituída que compreende todo ou uma porção de um anticorpo RGM A do presente pedido ligado a outro polipeptídeo. Em algumas modalidades, apenas a região variável do anticorpo RGM A é ligada ao polipeptídeo. Em outras modalidades, o domínio VH de um anticorpo RGM A deste pedido é ligado a um primeiro polipeptídeo, enquanto o domínio VL do anticorpo é ligado a um segundo polipeptídeo que se associada ao primeiro polipeptídeo de modo que permita que os domínios VH e VL interajam entre si com a finalidade de formar um sítio de ligação de anticorpos. Em outras modalidades, o domínio VH é separado do domínio VL por um ligante que permite que os domínios VH e VL interajam entre si (consulte abaixo, Single Chain Antibodies). O anticorpo VH-ligante-VL é, então, ligado a um polipeptídeo de interesse. O anticorpo de fusão é útil para direcionar um polipeptídeo a uma célula ou tecido que expresse uma RGM A. O polipeptídeo de interesse pode ser um agente terapêutico, tal como uma toxina, ou pode ser um agente de diagnóstico, tal como uma enzima; que possa ser facilmente visualizada, tal como peroxidade de raiz-forte. Além disso, os anticorpos de fusão podem ser criados onde dois (ou mais) anticorpos de cadeia simples são ligados entre si. Isto é útil se alguém desejar criar um anticorpo divalente ou polivalente em uma cadeia simples de polipeptídeo, ou se alguém desejar criar um anticorpo biespecífico.

Uma modalidade proporciona uma proteína de ligação rotulada onde um anticorpo ou porção de anticorpo do presente pedido é derivatizado ou ligado a outra molécula funcional (por exemplo, outro peptídeo ou proteína). Por exemplo, uma proteína de ligação rotulada do presente pedido pode ser derivada ligando-se funcionalmente um anticorpo ou porção de anticorpo do presente pedido (por ligação química, fusão genética, associação não-covalente ou similares) a uma ou mais entidades moleculares, tal como ácido nucléico, outro anticorpo (por exemplo, um anticorpo biespecífico, ou um diacorpo), um agente detectável, um agente citotóxico, um agente farmacêutico, e/ou uma proteína ou peptídeo que podem mediar a associação do anticorpo ou porção de anticorpo com outra molécula (tal como uma região de núcleo de estreptavidina ou um marcador de poliistidina).

Os agentes detectáveis úteis com os quais um anticorpo ou porção de anticorpo do presente pedido podem ser derivatizados incluem compostos fluorescentes. Os agentes detectáveis fluorescentes exemplificadores incluem fluoresceína, isotiocianato de fluoresceí-na, rodamina, cloreto de 5-dimetilamina-1-naftaleno sulfonil, ficoeritrina e similares. Um anticorpo também pode ser derivatizado com enzimas detectáveis, tal como fosfatase alcalina, peroxidase de raiz-forte, glucose oxidase e similares. Quando um anticorpo for derivatizado com uma enzima detectável, este é detectado adicionando-se reagentes adicionais que a enzima usa para produzir um produto de reação detectável. Por exemplo, quando o agente detectável peroxidase de raiz-forte estiver presente, a adição de peróxído de hidrogênio e diaminobenzidina levam a um produto de reação colorido, que é detectável. Um anticorpo também pode ser derivatizado com um ácido nucléico, biotina, detectado através da medição indireta de ligação de avidina ou estreptavidina. 5.2. Anticorpos de Cadeia Simples O presente pedido inclui um anticorpo de cadeia simples (scFv) que se liga a uma RGM A imunogênica da invenção. Com a finalidade de produzir o scFv, o DNA codificador de VH e V é operativamente ligado ao DNA que codifica um ligante flexível, por exemplo, codifica a sequência aminoacídica (Gly4-Ser), de tal modo que as sequências VH e VL possam ser expressas como uma proteína de cadeia simples contígua, com as regiões VL e VH unidas pelo ligante flexível (consulte, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-42 6; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al., 30 Nature (1990) 34 8: 552- 554). O anticorpo de cadeia simples pode ser monovalente, se apenas uma única região VH e VL for usada, bivalente, se duas regiões VH e VL forem usadas, ou polivalente, se mais de duas regiões VH e VL forem usadas. Dois entre os ditos fragmentos scFvs acoplados através do ligante são denominados como “diacorpo” cuja forma também é abrangida pela invenção. 5.3. Anticorpos Biespecíficos O presente pedido inclui, ainda, um anticorpo biespecífico ou fragmento de ligação ao antígeno deste no qual uma especificidade serve para um polipeptídeo RGM A imunogê-nico do presente pedido. Por exemplo, pode-se gerar um anticorpo biespecífico que se liga especificamente a um polipeptídeo RGM A imunogênico da invenção através de um domínio de ligação e a uma segunda molécula através de um segundo domínio. Além disso, pode-se gerar um anticorpo de cadeia simples contendo mais de uma região VH e VL que se ligue especificamente a um polipeptídeo imunogênico da invenção e a outra molécula que seja associada à atenuação do colapso do cone de crescimento mediado por mielina e à inibição do crescimento e desenvolvimento de neurite. Esses anticorpos biespecíficos podem ser gerados utilizando-se técnicas que sejam bem conhecidas, por exemplo, Fanger et al. Im-munol Methods 4: 72-81 (1994) e Wright and Harris, 20 (supra).

Em algumas modalidades, os anticorpos biespecíficos são preparados utilizando-se uma ou mais regiões variáveis provenientes de um anticorpo da invenção. Em outra modalidade, o anticorpo biespecífico é preparado utilizando-se uma ou mais regiões CDR provenientes do dito anticorpo. 5.4. Anticorpos Derivatizados e Rotulados Um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do presente pedido podem ser derivatizados ou ligados a outra molécula (por exemplo, outro peptídeo ou proteína). Em geral, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é derivatizado de tal modo que a ligação a um polipeptídeo imunogênico da invenção não seja afetada adversamente pela derivatização ou rotulagem.

Por exemplo, um anticorpo ou porção de anticorpo do presente pedido podem ser funcionalmente ligados (por acoplamento químico, fusão genética, associação não-covalente ou similares) a uma ou mais outras entidades moleculares, tal como outro anticorpo (por exemplo, um anticorpo biespecífico ou um diacorpo), um reagente de detecção, um agente citotóxico, um agente farmacêutico, e/ou uma proteína ou peptídeo que possa mediar a associação do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno à outra molécula (tal como uma região de núcleo de estreptavidina ou um marcador de poliistidina). Além disso, um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno deste podem ser parte de uma molécula de i-munoadesão maior, formada por associação covalente ou não-covalente do anticorpo ou porção de anticorpo a uma ou mais proteínas ou peptídeos diferentes. Exemplos dessas moléculas de imunoadesão incluem o uso da região de núcleo de estreptavidina para constituir uma molécula scFv tetramérica (Kipriyanov et al. (1995) Human Antibodies and Hybri-domas 6:93-101) e o uso de um resíduo de cisteína, u peptídeo marcador e um marcador de poliistidina C-terminal para constituir moléculas scFv bivalentes e biotiniladas (Kipriyanov et al. (1994) Molecular Immunology 31:1047-1058). As porções de anticorpo, tais como frag- mentos Fab e F(ab’)2 podem ser preparadas a partir de anticorpos inteiros utilizando-se técnicas convencionais, tal como digestão de papaína ou pepsina, respectivamente, de anticorpos inteiros. Além disso, os anticorpos, a porção de anticorpos e as moléculas de imunoa-desão podem ser obtidos utilizando-se técnicas de DNA recombinante padrão.

Um anticorpo derivatizado pode ser produzido reticulando-se dois óu mais anticorpos (do mesmo tipo ou de tipos diferentes, por exemplo, para criar anticorpos biespecíficos). Os reticuladores adequados incluem aqueles que são heterobifuncionais, tendo dois grupos distintamente reativos separados por um espaçador apropriado (por exemplo, m-maleimidobenzoil-N-hidróxi succinimida éster) ou homobifuncionais (por exemplo, suberato de disuccinimidil). Esses ligadores encontram-se disponíveis junto a Pierce Chemical Com-pany, Rockford, III.

Um anticorpo derivatizado também pode ser um anticorpo rotulado. Por exemplo, os agentes de detecção com os quais um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção pode ser derivatizado são compostos fluorescentes, que incluem fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloreto de 5-dimetilamina-1-naftaleno sulfonil, ficoeritrina, lantanídeo fosforoso e similares. Um anticorpo também pode ser rotulado com enzimas que sejam úteis para detecção, tal como peroxidase de raiz-forte, galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina, glucoseoxidase e similares. Nas modalidades que são rotuladas com uma enzima detec-tável, o anticorpo é detectado adicionando-se reagentes adicionais que a enzima usa para produzir um produto de reação detectável. Por exemplo, a peroxidase de raiz-forte com pe-róxido de hidrogênio e diaminobenzidina. Um anticorpo também pode ser rotulado com bio-tina, e detectado através de medição indireta de ligação de avidina ou estreptavidina. Um anticorpo também pode ser rotulado com um epítopo de polipeptídeo predeterminado reconhecido por um repórter secundário (por exemplo, sequências par de zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação metálica, epítopo: marcadores). Um anticorpo RGM A ou um fragmento de antígeno deste também podem ser rotulados com um aminoácido rádio-rotulado. O rádio-marcador pode ser usado tanto para propósitos de diagnóstico como para propósitos terapêuticos. O anticorpo RGM A rádio-rotulado pode ser usado de modo diagnóstico, por exemplo, para determinar os níveis de receptor RGM A em um indivíduo. Além disso, o anticorpo RGM A rádio-rotulado pode ser terapeuticamente u-sado para o tratamento de lesão da medula espinhal.

Exemplos de marcadores para polipeptídeos incluem, mas não se limitam a, radioi-sótopos ou radionucleotídeos 15N, 35S, 90Y, "Tc, '"ln, 125l, 131l, 177Lu, 166Ho, 153Sm. Um anticorpo RGM A ou um fragmento de antígeno deste também pode ser derivatizado com um grupo químico, como polietileno glicol (PEG), um grupo metil ou etil, ou um grupo carboidra-to. Esses grupos podem ser úteis para aperfeiçoar as características biológicas do anticorpo, por exemplo, para aumentar a meia-vida do soro ou aumentar a ligação tecidual. Da mesma forma, um marcador para polipeptídeos pode incluir um ácido nucléico, por exemplo, DNA para detecção por PCR, ou aprimoramento da expressão genética, ou siRNA para suprimir a expressão genética em células ou tecidos contendo RGM A. A classe e subclasse de anticorpo RGM As podem ser determinadas através de qualquer método conhecido na técnica. Em geral, a classe e subclasse de um anticorpo podem ser determinadas utilizando-se anticorpos que sejam específicos para uma classe e subclasse particulares de anticorpo. Esses anticorpos encontram-se comercialmente disponíveis. A classe e subclasse podem ser determinadas por ELISA, Western Blot assim como por outras técnicas. Alternativamente, a classe e subclasse podem ser determinadas se-qüenciando-se todos ou uma porção dos domínios constantes das cadeias pesadas e/ou leves dos anticorpos, comparando-se suas sequências aminoacídicas a sequências amino-acídicas conhecidas de várias classes e subclasses de imunoglobulinas, e determinando-se a classe e subclasse dos anticorpos. 5.5. Imunoglobulinas com Domínio Variável Duplo Conforme o uso em questão, as proteínas de ligação ou imunoglobulinas com domínio variável duplo (DVD) são proteínas de ligação que compreendem dois ou mais sítios de ligação ao antígeno e são proteínas de ligação multivalentes, como, por exemplo, diva-lentes e tetravalentes. O termo “proteína de ligação multivalente” é usado neste relatório descritivo para denotar uma proteína de ligação que compreende dois ou mais sítios de ligação ao antígeno. A proteína de ligação multivalente é, de preferência, geneticamente modificada de modo que tenha dois ou mais sítios de ligação ao antígeno, e, genericamente, não consiste em um anticorpo de ocorrência natural. O termo “proteína de ligação multiespecífi-co” se refere a uma proteína de ligação capaz de ligar dois ou mais alvos não-relacionados. Esses DVDs podem ser monoespecíficos, ou seja, capazes de ligar um antígeno ou podem ser multiespecíficos, ou seja, capazes de ligar dois ou mais antígenos. As proteínas de ligação DVD que compreendem dois polipeptídeos DVD de cadeia pesada e dois polipeptídeos DVD de cadeia leve são denominadas a uma Ig DVD. Cada metade de uma Ig DVD compreende um polipeptídeo DVD de cadeia pesada, e um polipeptídeo DVD de cadeia leve, e dois sítios de ligação ao antígeno. Cada sítio de ligação compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve com um total de 6 CDRs envolvidas na ligação ao antígeno por sítio de ligação ao antígeno. As proteínas de ligação DVD e os métodos de constituir proteínas de ligação DVD são descritos no Pedido de Patente US. No. 11/507.050, aqui incorporado a título de referência. Pretende-se que a presente invenção compreenda uma proteína de ligação DVD que compreende proteínas de ligação capazes de se ligarem à RGM A. De preferência, a proteína de ligação DVD é capaz de se ligar à RGM A e um segundo alvo. O segundo alvo é selecionado a partir do grupo que consiste em atividades MAB antiinflamatórias (IL-1, IL-6, IL-8, IL-11, IL-12.IL-17, IL-18, IL-23.TNF al- fa/beta, IFN-beta, gama, LIF, OSM, CNTF, PF-4, proteína básica de pfaquetas (PBP), NAP-2, beta-TG, MIP-1, MCP2/3, RANTES, linfotactina), de proteínas mediadoras de transporte (receptor de insulina, receptor de transferrina, receptor de trombina, receptor de leptina, receptor de LDL), de outros MABs neuro regenerativos (NgR, Lingo, p75, CSPG (por exemplo NG-2, neurocano, brevicano, versicano, agrecano), ácido hialurônico, mAG, tenascina, NI-35, NI-250, IMP, perlecano, neurocano, fosfacano, nogo-A, OMGP, Sema4D, Sema 3A, efri-na B3, efrina A2, efrina A5, MAG, EphA4, plexina B1, TROY, wnts, ryk rec., BMP-2, BMP-4, BMP-7), de atividades MAB neuroprotetoras (EGF, EGFR, Sema 3), de MABs anti-beta ami-lóide (por exemplo, m266, 3D6 (bapineuzumab), MABs anti-globulômeros 7C6), de receptores e transportadores localizados em CNS (receptores de serotonina, receptores de dopa-mina, DAT, Asc-1, GlyT 1). 5.6. Anticorpos Específicos Duplos O presente pedido também descreve uma tecnologia de “anticorpo específico duplo”. Os anticorpos específicos duplos servem como agonistas, antagonistas, ou ambos em diferentes combinações. Os anticorpos específicos duplos são anticorpos onde a cadeia VH se liga a um primeiro antígeno e a cadeia VL se liga a outro antígeno conforme exemplificado em W02008082651. 5.7. Anticorpos Cristalizados Outra modalidade do presente pedido proporciona uma proteína de ligação cristalizada. Conforme o uso em questão, o termo “cristalizado” se refere a um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno deste, presente sob a forma de um cristal. Os cristais consistem em uma forma do estado sólido da matéria, distinta de outras formas, tal como o estado sólido amorfo ou o estado cristalino líquido. Os cristais são compostos por arranjos tridimensionais regulares e repetidos de átomos, íons, moléculas (por exemplo, proteínas, como anticorpos), ou montagens moleculares (por exemplo, complexos antígeno/anticorpo). Esses arranjos tridimensionais são dispostos de acordo com relações matemáticas específicas que são bem compreendidas no campo. A unidade fundamental, ou bloco de construção, que se repete em um cristal é denominada como unidade assimétrica. A repetição da unidade assimétrica em uma disposição que se adéqua a uma determinada simetria cristalográfica bem definida proporciona a “célula unitária” do cristal. A repetição da célula unitária por transla-ções regulares em todas as três dimensões proporciona o cristal. Consulte, Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic acids and Proteins, a Practical Approach, 2a ed., pp. 20 1-16, Oxford University Press, Nova York, Nova York, EUA (1999).

De preferência, o presente pedido descreve cristais de anticorpos RGM A completos e fragmentos destes, conforme descrito no presente documento, e formulações e composições que compreendem tais cristais. Em uma modalidade, a proteína de ligação cristalizada tem uma meia-vida maior in vivo do que a contraparte solúvel da proteína de ligação.

Em outra modalidade, a proteína de ligação retém uma atividade biológica após a cristalização. A proteína de ligação cristalizada da invenção pode ser produzida de acordo com métodos conhecidos na técnica e conforme descrito no documento WO 02072636, aqui incorporado a título d& referência. 5.8. Anticorpos Glicosilados Outra modalidade da invenção proporciona uma proteína de ligação glicosiiada onde o anticorpo ou a porção de ligação ao antígeno deste compreendem um ou mais resíduos de carboidrato. A produção de proteína nascente in vivo pode ser submetida a um processamento adicional, conhecido como modificação pós-translacional. Em particular, os resíduos de açúcar (glicosil) podem ser enzimaticamente adicionais, um processo conhecido como glicosilação. As proteínas resultantes contendo cadeias laterais de oligossacarídeos covalentemente ligados são conhecidas como proteínas glicosiladas ou glicoproteínas. Os anticorpos são glicoproteínas com um ou mais resíduos de carboidrato no domínio Fc, assim como no domínio variável. Os resíduos de carboidrato no domínio Fc têm um efeito importante sobre a função efetuadora do domínio Fc, com efeito mínimo sobre a ligação ao antígeno ou sobre a meia-vida do anticorpo (R. Jefferis, Biotechnol. Prog. 21 (2005), pp. 11-16). Por outro lado, a glicosilação do domínio variável pode ter um efeito sobre a atividade de ligação ao antígeno do anticorpo. A glicosilação no domínio variável pode ter um efeito negativo sobre a afinidade de ligação ao anticorpo, provavelmente devido ao estereoimpedi-mento (Co, M.S., et al., Mol. Immunol. (1993) 30:1361- 1367), ou resultado na afinidade maior para o antígeno (Wallick, S.C., et al., Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright, A., et, al., EMBO J. (1991) 10:2717 2723).

Um aspecto da presente invenção se refere à geração de mutantes de sítio de glicosilação nos quais se mutacionou o sítio de glicosilação ligado a O ou N da proteína de ligação. Um indivíduo versado na técnica pode gerar tais mutantes utilizando-se tecnologias bem conhecidas padrão. Os mutantes de sítio de glicosilação que retêm a atividade biológica, porém, tem uma atividade de ligação aumentada ou reduzida consistem em outro objetivo da presente invenção.

Ainda em outra modalidade, modifica-se a glicosilação do anticorpo ou porção de ligação ao antígeno da invenção. Por exemplo, pode-se constituir um anticorpo aglicosilado (ou seja, um anticorpo desprovido de glicosilação). A glicosilação pode ser alterada, por e-xemplo, com a finalidade de aumentar a afinidade do anticorpo por antígeno. Essas modificações de carboidrato podem ser realizadas, por exemplo, alterando-se um ou mais sítios de glicosilação na sequência de anticorpo. Por exemplo, pode-se realizar uma ou mais substituições de aminoácidos que resultam na eliminação de um ou mais sítios de glicosilação de região variável para, desse modo, eliminar a glicosilação neste sítio. Essa aglicosilação po- de aumentar a afinidade do anticorpo por antígeno. Essa abordagem é descrita em maiores detalhes na Publicação PCT W02003016466A2, e nas Patentes U.S. Nos. 5.714.350 e 6.350.861, estando cada uma dessas aqui incorporadas em suas totalidades a título de referência. --------Adicional ou alternativamente, pode-se constituir um anticorpo modificado da invenção que tenha um tipo alterado de glicosilação, tal como um anticorpo hipofucosilado tendo quantidades reduzidas de resíduos de fucosil ou um anticorpo tendo estruturas GlcNAc bis-setoras maiores. Esses padrões alterados de glicosilação demonstraram um aumento na capacidade de ADCC dos anticorpos. Essas modificações de carboidrato podem ser realizadas, por exemplo, expressando-se o anticorpo em uma célula hospedeira com um maqui-nário de glicosilação alterada. As células com maquinário de glicosilação alterada foram descritas na técnica e podem ser usadas como células hospedeiras nas quais se expressam os anticorpos recombinantes da invenção para, desse modo, produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Consulte, por exemplo, Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, assim como, Patente Européia No: EP 1.176.195; Publicações PCT WO 03/035835; WO 99/54342 80, estando cada uma dessas aqui incorporadas em suas totalidades a título de referência. A glicosilação de proteína depende da sequência aminoacídica da proteína de interesse, assim como da célula hospedeira na qual a proteína é expressa. Diferentes organismos podem produzir enzimas de glicosilação diferentes (por exemplo, glicosil transferases e glicosidases), e têm substratos diferentes (açúcares nucleotídicos) disponíveis. Devido a esses fatores, o padrão de glicosilação da proteína, e a composição dos resíduos de glicosil, podem ser diferentes dependendo do sistema hospedeiro no qual a proteína particular é expressa. Os resíduos de glicosil usados na invenção podem incluir, mas não se limitam a, glicose, galactose, manose, fucose, n-acetil glucosamina e ácido siálico. De preferência, a proteína de ligação glicosilada compreende resíduos de glicosil de tal modo que o padrão de glicosilação seja humano.

Os indivíduos versados na técnica sabem que uma glicosilação de proteína diferente pode resultar nas características de proteína diferentes. Por exemplo, a eficácia de uma proteína terapêutica produzida em um hospedeiro de microorganismo, tal como levedura, e glicosilada utilizando-se o caminho endógeno de levedura pode ser reduzida comparada à mesma proteína expressa em uma célula de mamíferos, tal como uma linhagem celular CHO. Essas glicoproteínas também podem ser imunogênicas em humanos e amostram meia-vida reduzida in vivo após a administração. Os receptores específicos em humanos e em outros animais podem reconhecer resíduos de glicosil específicos e promover um afastamento rápido da proteína a partir da corrente sanguínea. Outros efeitos adversos podem incluir alterações no dobramento de proteínas, solubilidade, suscetibilidade a proteases, tráfego, transporte, compartimentalização, secreção, reconhecimento por outras proteínas ou fatores, antigenicidade, ou alergenicidade. Consequentemente, um profissional da área médica pode preferir uma proteína terapêutica com uma composição específica e padrão de glicosilação, por exemplo, composição de glicosilação e padrão idêntico, ou pelo menos similar, àqueles produzidos em células humanas ou em células de espécies específicas do animal em questão. A expressão de proteínas glicosiladas diferente da expressão de uma célula hospedeira pode ser obtida modificando-se geneticamente a célula hospedeira de modo a expressar enzimas de glicosilação heteróloga. Utilizando-se técnicas conhecidas na técnica, um profissional da área médica pode gerar anticorpos ou porções de ligação ao antígeno destes que exibem glicosilação de proteína humana. Por exemplo, as cepas de levedura foram geneticamente modificadas para expressar enzimas de glicosilação de ocorrência não-natural de tal modo que as proteínas glicosiladas (glicoproteínas) produzidas nessas cepas de levedura exibam glicosilação de proteína idêntica àquela de células animais, células especialmente humanas (Pedidos de Patente U.S 20040018590 e 20020137134 e Publicação PCT W02005100584 A2).

Além disso, avaliar-se-á pelos indivíduos versados na técnica que uma proteína de interesse pode ser expressa utilizando-se uma biblioteca de células hospedeiras geneticamente modificadas de modo a expressar várias enzimas de glicosilação, de tal modo que as células hospedeiras da biblioteca produzam a proteína de interesse com padrões de glicosilação variantes. Um profissional da área médica pode, então, selecionar e isolar a proteína de interesse com padrões de glicosilação inusitados particulares. De preferência, a proteína tendo um padrão de glicosilação inusitado particularmente selecionado exibe propriedades biológicas aperfeiçoadas ou alteradas. 5.9. Anticorpos Anti-idiotíoicos Além das proteínas de ligação, a presente invenção também se refere a um anticorpo anti-idiotípico (anti-ld) específico para tais proteínas de ligação da invenção. Um anticorpo anti-ld consiste em um anticorpo, que reconhece determinantes exclusivos genericamente associados à região de ligação ao antígeno de outro anticorpo. O anti-ld pode ser preparado imunizando-se um animal com a proteína de ligação ou uma CDR contendo uma região da mesma. O animal imunizado reconhecerá, e responderá aos determinantes idiotí-picos do anticorpo imunizante e produzirá um anticorpo anti-ld. O anticorpo anti-ld também pode ser usado como um “imunógeno” para induzir uma resposta imune ainda em outro a-nimal, produzindo um suposto anticorpo anti-anti-ld. 6. Usos dos Anticorpos Determinada sua capacidade em se ligar à RGM A humana, os anticorpos neutrali-zantes do presente pedido, ou porções destes, podem ser usados para detectar a RGM A humana (por exemplo, em uma amostra biológica, tal como soro ou plasma), utilizando-se um imunoensaio convencional, tal como um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), um radioimunoensaio (RIA) ou imuno histoquímica tecidual. O presente pedido proporciona um método para detecção de RGM A humana em uma amostra biológica que compreende colocar uma amostra biológica em contato com um anticorpo; ou porção de anticorpo, da invenção e detectar o anticorpo (ou porção de anticorpo) ligado à RGM A humana ou anticorpo não-ligado (ou porção de anticorpo), para, desse modo, detectar a RGM A humana na amostra biológica. O anticorpo é direta ou indiretamente rotulado com uma substância detectável de modo a facilitar a detecção do anticorpo ligado ou não-ligado. As substâncias detectáveis adequadas incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes e materiais radioativos. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de raiz-forte, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, ou acetilco-linesterase; exemplos de complexos de grupo prostéticos adequados incluem estreptavidi-na/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeli-ferona, fluoresceína, isotiocinato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceí-na, cloreto de dansil ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; e exemplos de material radioativo adequado incluem 3H, 14C, 35S, 90Y, "Tc, 111ln, 125l, 1311, 177Lu, 166Ho, 153Sm.

Os anticorpos e as porções de anticorpos do presente pedido são, de preferência, capazes de neutralizar a atividade de RGM A humana tanto in vitro como in vivo. Consequentemente, tais anticorpos e porções de anticorpos da invenção podem ser usados para inibir a ligação de RGM A à sua Neogenina receptora, à BMP-2, ou à BM-4, e, portanto, inibe a atividade resultante.

Em outra modalidade, o presente pedido proporciona um método para reduzir a atividade de RMG A em um indivíduo, vantajosamente a partir de um indivíduo que sofre de uma doença ou distúrbio no qual a atividade resultante de RGM A é prejudicial. O presente pedido proporciona métodos para reduzir a atividade de RGM A em um indivíduo que sofre de tal doença ou distúrbio, evitando-se a ligação de RGM A à Neogenina, e/ou BMP-2, e/ou BMP-4, através do uso dos anticorpos monoclonais do presente pedido. Os anticorpos do presente pedido, em particular, os anticorpos humanizados aqui descritos, podem ser administrados em um ser humano para propósitos terapêuticos. Além disso, os anticorpos do presente pedido podem ser administrados em um mamífero não-humano que expressa uma RGM A com a qual o anticorpo é capaz de se ligar para propósitos veterinários ou como um modelo animal de doença humana. Independentemente dos últimos, tais modelos animais podem ser úteis para avaliar a eficácia terapêutica de anticorpos da invenção (por exemplo, teste de dosagens e cursos de tempo de administração).

Conforme o uso em questão, pretende-se que o termo “um distúrbio no qual a ativi- dade de RGM A é prejudicial” inclua doenças e outros distúrbios nos quais a presença de RGM A ou sua atividade resultante em um indivíduo que sofre de distúrbio tenha sido mostrada, ou seja suspeita, como sendo a responsável pela patofisiologia do distúrbio ou um fator que contribui para uma piora do distúrbio. Consequentemente, um distúrbio no qual a atividade de RGM A é prejudicial consiste em um distúrbio no qual se espera que a redução da atividade de RGM A alivie os sintomas e/ou a progressão do distúrbio. Exemplos não-limitativos de distúrbios que podem ser tratados com os anticorpos da invenção incluem a-queles distúrbios discutidos na seção abaixo pertencente às composições farmacêuticas dos anticorpos da invenção.

Reconhece-se que a RGM A representa um papel importante na patologia associada a uma variedade de doenças que envolvem doenças neurológicas associadas à neuro degeneração ou inibição de processos neuro regenerativos, resultando em paralisia. Estas incluem demência, demência senil, deficiência cognitiva leve, demência relacionada a Al-zheimer, Coréia de Huntington, discinesia tardia, hipercinesias, manias, Morbus Parkinson, síndrome de steel-Richard, síndrome de Down, miastenia grave, trauma nervoso, amiloidose vascular, hemorragia cerebral I com amiloidose, inflamação cerebral, ataxia de Friedrich, distúrbio de confusão metal aguda, glaucoma, doença de Alzheimer, esclerose lateral amio-trófica, lesão do plexo braquial, lesão cerebral, que inclui lesão cerebral traumática, paralisia cerebral, síndrome de Guillain Barre, leucodistrofias, esclerose múltipla, pós-pólio, espinha bífida, lesão da medula espinhal, atrofia muscular espinhal, tumores espinhais, derrame, e mielite transversa.

Da mesma forma, conforme discutido anteriormente, as imunoglobulinas DVD, ou anticorpos específicos duplos entre um dos padrões descritos acima podem ser úteis. Essas preparações de anticorpo, conforme descrito anteriormente, podem ser úteis para o tratamento de doença de Alzheimer, doença de Parkinson, lesão da medula espinhal, lesão cerebral traumática, esclerose múltipla, lesão nervosa periférica, esquizofrenia, depressão, ansiedade, assim como qualquer doença relacionada à flexibilidade, crescimento de neurite e neurotoxicidade citada anteriormente.

Os anticorpos do presente pedido também podem ser combinados com peptídeos que permitem que a transferência trans membranar inclua aimejar as proteínas alvo intracelular. Essas sequências peptídicas podem incluir, mas não se limitam a, peptídeos tat, ante-napedia, poli-argininas, alguns peptídeos antimicrobianos. Esses peptídeos podem permitir uma transferência através das membranas, que incluem membranas de plasma celular, mas, também, membranas epiteliais e endoteliais, que incluem a barreira hematoencefálica, mucosa intestinal, meninges, e outros.

Um anticorpo, ou porção de anticorpo, do presente pedido também pode ser administrado com um ou mais agentes terapêuticos moleculares pequenos adicionados úteis no tratamento de distúrbios nos quais a atividade de RGM A está envolvida, conforme discutido nos parágrafos anteriores. Deve-se compreender que os anticorpos do presente pedido ou porções de ligação ao antígeno destes podem ser usados sozinhos ou em combinação com um agente adicional, por exemplo, um agente terapêutico, sendo que o dito agente adicional é selecionado pélõ indivíduo versado na técnica por seu propósito pretendido. Por exemplo, o agente adicional pode ser agente terapêutico reconhecido na técnica como sendo útil para tratar a doença ou condição sendo tratada pelo anticorpo da presente invenção. O agente adicional também pode ser um agente que confira um atributo benéfico à composição terapêutica, por exemplo, um agente que afete a viscosidade da composição. 7. Composições Farmacêuticas A invenção proporciona, também, composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, da invenção e um veículo far-maceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas que compreendem anticorpos da invenção servem para uso em, mas não se limitam a, diagnosticar, detectar, ou monitorar um distúrbio, em prevenir, tratar, gerenciar, ou atenuar um distúrbio ou um ou mais sintomas deste, e/ou em pesquisa. Em uma modalidade específica, uma composição compreende um ou mais anticorpos da invenção. Em outra modalidade, a composição farmacêutica compreende um ou mais anticorpos da invenção e um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos diferentes dos anticorpos da invenção que servem para tratar um distúrbio no qual a atividade de RGM A seja prejudicial. De preferência, os agentes profiláticos ou terapêuticos são conhecidos por serem úteis ou por terem sido ou estiverem atualmente sendo usados na prevenção, tratamento, gerenciamento ou atenuação de um distúrbio ou um ou mais sintomas deste. De acordo com essas modalidades, a composição pode compreender, ainda, um veículo, diluente ou excipiente.

Os anticorpos e porções de anticorpos da invenção podem ser incorporados em composições farmacêuticas adequadas para administração em um indivíduo. Tipicamente, a composição farmacêutica compreende um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Conforme o uso em questão, o “veículo farmaceu-ticamente aceitável” inclui quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e agentes de retardo de absorção, e similares que sejam fisiologicamente compatíveis. Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem um ou mais entre: água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e similares, assim como combinações destes. Em muitos casos, é preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliál-coois, como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis podem compreender, ainda, quantidades mínimas de substâncias auxiliares, tais como agentes de molhagem ou agentes emulsificantes, preservativos ou tampões, que aumentam a vida útil ou a efetividade do anticorpo ou da porção de anticorpo. Vários sistemas de distribuição são conhecidos e podem ser usados para administrar um ou mais more anticorpos da invenção ou uma combinação de um ou mais anticorpos da invenção e um agente profilático ou agente terapêutico úteis para prevenir, gerenciar, tratar ou atenuar um distúrbio ou um ou mais sintomas deste, por exemplo, encapsulação em lipossomos, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar o anticorpo ou fragmento de anticorpo, endocitose mediada por receptor (consulte, por exemplo, Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), construção de um ácido nu-cléico como parte de um retrovírus ou outro vetor, etc. Os métodos de administrar um agente profilático ou terapêutico da invenção incluem, mas não se limitam a, administração pa-renteral (por exemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa e subcutâ-nea), administração epidural, administração intratumoral, e administração mucosal (por e-xemplo, intranasal e vias orais). Além disso, pode-se empregar a administração pulmonar, por exemplo, através do uso de um inalador ou nebulizador, e formulação com um agente aerossol. Consulte, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 6.019.968, 5.985.320, 5.985.309, 5.934.272, 5.874.064, 5.855.913, 5.290.540, e 4.880.078; e as Publicações PCT Nos. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, e WO 99/66903, estando cada uma dessas aqui incorporadas em sua totalidade a título de referência. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção, terapia de combinação, ou uma composição da invenção é administrada utilizando-se a tecnologia de administração de fármacos pulmonar Alkermes AIR® (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass., EUA). Em uma modalidade específica, os agentes profi-láticos ou terapêuticos da invenção são administrados de modo intramuscular, intravenoso, intratumoral, oral, intranasal, pulmonar, ou subcutâneo. Os agentes profiláticos ou terapêuticos podem ser administrados através de qualquer via conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção em bolus, absorção através de revestimentos epiteliais ou muco-cutâneos (por exemplo, mucosa oral, retal e intestinal, etc.) e pode ser administrado junto a outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser sistêmica ou local.

Em uma modalidade específica, pode ser desejável administrar os agentes profiláticos ou terapêuticos da invenção localmente à área em necessidade de tratamento; isto pode ser obtido, por exemplo, e sem caráter limitativo, através de infusão local, injeção, ou por meio de um implante, sendo que o dito implante é constituído por um material poroso ou não-poroso, que inclui membranas e matrizes, tais como membranas de sialástico, polímeros, matrizes fibrosas (por exemplo, Tisseel®), ou matrizes de colágeno. Em uma modalidade, uma quantidade eficaz de um ou mais anticorpos dos antagonistas da invenção é administrada localmente à área afetada em um indivíduo de modo a prevenir, tratar, gerenciar, e/ou atenuar um distúrbio ou um sintoma do mesmo. Em outra modalidade, uma quantidade eficaz de um ou mais anticorpos da invenção é administrada localmente à área afetada em combinação com uma quantidade eficaz de uma ou mais terapias (por exemplo, um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos) diferentes de um anticorpo da invenção em um indivíduo com a finalidade e prevenir, tratar, gerenciar, e/ou atenuar um distúrbio ou um ou mais sintomas deste.

Em outra modalidade, o agente profilático ou terapêutico pode ser administrado em um sistema de liberação controlada ou sustentada. Em uma modalidade, pode-se utilizar uma bomba para obter esta liberação controlada ou sustentada (consulte Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). Em outra modalidade, podem-se utilizar materiais poliméricos para se obter a liberação controlada ou sustentada das terapias da invenção (consulte, por exemplo, Medicai Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fia., EUA (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Pro-duct Design and Performance, Smolen and Bali (eds.), Wiley, Nova York, EUA (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sei. Rev. Macromol. Chem. 23:61; consulte, também, Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); Patente U.S. No. 5.679.377; Patente U.S. No. 5.916.597; Patente U.S. No. 5.912.015; Patente U.S. No. 5.989.463; Patente U.S. No. 5.128.326; Publicação PCT No. WO 99/15154; e Publicação PCT No. WO 99/20253. Exemplos dos polímeros usados nas formulações de liberação sustentada incluem, mas não se limitam a, poli(2-hidróxi etil metacrilato), poli(metil metacrilato), ácido poli(acrílico), poli(etileno-co-vinil acetato), ácido poli(metacrílico), poliglicolídeos (PLG), polianidridos, poli(N-vinil pirrolidona), álcool poli(vinílico), poliacrilamida, poli(etileno glicol), polilactídeos (PLA), poli(lactido-co-glicolídeos) (PLGA), e poliortoésteres. Em uma modalidade preferencial, o polímero usado em uma formulação de liberação sustentada é inerte, isento de impurezas lixiviáveis, estável em armazenamento, estéril, e biodegradável. Ainda em outra modalidade, um sistema de liberação controlada ou sustentada pode ser substituído nas proximidades do alvo profilático ou terapêutico, exigindo, assim, apenas uma fração da dose sistêmica (consulte, por exemplo, Goodson, em Medicai Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).

Os sistemas de liberação controlada são discutidos na revisão por Langer (1990, Science 249:1527-1533). Pode-se utilizar qualquer técnica conhecida pelos indivíduos versados na técnica para produzir formulações de liberação sustentada que compreendem um ou mais agentes terapêuticos da invenção. Consulte, por exemplo, a Patente U. S. No. 4.526.938, Publicação PCT WO 91/05548, Publicação PCT WO 96/20698, Ning et al. , 1996, “Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Câncer Xenograft Using a Sustained-Release Gel,” Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al., 1995, “Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science &

Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, “Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application,” Pro. Int'l. Symp. Control. Rei. Bioact. Mater. 24:853-854, and Lam et al., 1997, “Microencapsulation of Recombinant Humanized Mono-clonal Antibody for Local Delivery,” Proc. Int'l. Symp. Control Rei. Bioact. Mater. 24:759- 760, estando cada uma dessas aqui incorporadas em suas tõtalidades a título de referência.

Em uma modalidade específica, onde a composição da invenção consiste em um ácido nucléico que codifica um agente profilático ou terapêutico, o ácido nucléico pode ser administrado in vivo de modo a promover a expressão de seu agente profilático ou terapêutico codificado, construindo-o como parte de um vetor de expressão de acido nucléico apropriado e o administrando de modo que se torne intracelular, por exemplo, através do uso de um vetor retroviral (consulte, a Patente U. S. No. 4.980.286), ou através de injeção direta, ou através do uso de bombardeio de micropartículas (por exemplo, uma pistola de genes; Bio-listic, Dupont), ou revestimento com lipídeos ou receptores de superfície celular ou agentes de transfecção, ou administrando-o em ligação com um peptídeo tipo homeobox conhecido por entrar no núcleo (consulte, por exemplo, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:1864-1868). Alternativamente, um ácido nucléico pode ser introduzido intracelularmente e incorporado na célula hospedeira DNA para expressão por recombinação homologa.

Uma composição farmacêutica da invenção é formulada de modo que seja compatível a sua via pretendida de administração. Exemplos de vias de administração incluem, mas não se limitam a, administração parenteral, por exemplo, intravenosa, intradérmica, subeutânea, oral, intranasal (por exemplo, inalação), transdérmica (por exemplo, tópica), transmucosal, e retal. Em uma modalidade específica, a composição é formulada de acordo com os procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa, subeutânea, intramuscular, oral, intranasal, ou tópica a seres humanos. Tipicamente, as composições para administração intravenosa são soluções em tampão aquoso isotônico estéril. Quando necessário, a composição também pode incluir um agente solubilizante e um anestésico local, tal como lignocaína para aliviar a dor no sítio da injeção.

Se as composições da invenção precisarem ser administradas topicamente, as composições podem ser formuladas sob a forma de uma pomada, creme, aplique transdér-mico, loção, gel, xampu, spray, aerossol, solução, emulsão, ou outra forma bem conhecida pelos indivíduos versados na técnica. Consulte, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19a ed., Mack Pub. Co., Eas-ton, Pa. (1995). Para formas de dosagem tópicas não-aspergíveis, aplicam-se, tipicamente, formas viscosas a semi-sólidas ou sólidas que compreendem um veículo ou um ou mais excipientes compatíveis à aplicação tópica e tendo uma viscosidade dinâmica, de preferência, maior que à viscosidade dinâmica da água. As formulações adequadas incluem, sem caráter limitativo, soluções, suspensões, emulsões, cremes, pomadas, pós, unguentos, bál- samos, e similares, que são, se desejado, esterilizadas ou misturadas com agentes auxiliares (por exemplo, preservativos, estabilizadores, agentes umectantes, tampões, ou sais) para influenciar várias propriedades, tal como, por exemplo, pressão osmótica. Outras formas de dosagem adequadas incluem preparações de aerossol aspergíveis onde o ingrediente ativo, de preferência, em combinação com um veículo inerte sólido ou líquido, é encap-sulado em uma mistura com um volátil pressurizado (por exemplo, um propelente gasoso, tal como freon) ou em uma garrafa de aperto. Podem-se adicionar, também, hidratantes ou umectantes às composições farmacêuticas e formas de dosagem, se desejado. Exemplos desses ingredientes ativos são bem conhecidos na técnica.

Se o método da invenção compreender uma administração intranasal de uma composição, a composição pode ser formulada sob a forma de aerossol, spray, névoa ou sob a forma de gotas. Em particular, os agentes profiláticos ou terapêuticos para uso de acordo com a presente invenção podem ser convenientemente distribuídos sob a forma de uma apresentação de spray aerossol a partir de pacotes pressurizados ou um nebulizador, através do uso de um propelente adequado (por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluoro-metano, dicloro-tetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outros gases adequados). No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada proporcionando-se uma válvula para distribuir uma quantidade medida. As cápsulas ou cartuchos (compostos, por exemplo, por gelatina) para uso em um inalador ou insuflador podem ser formulados contendo uma mistura de pó do composto e uma base de pó adequada, tal como lactose ou amido.

Se o método da invenção compreender uma administração oral, as composições podem ser formuladas oralmente sob a forma de tabletes, cápsulas, comprimidos, cápsulas de gel, soluções, suspensões, e similares. Os tabletes ou cápsulas podem ser preparados através de meios convencionais com excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tal como agentes de ligação (por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado, polivinil pirrolidona, ou hidróxi propil metilceluiose); cargas (por exemplo, lactose, celulose microcristalina, ou fosfato hidrogênio de cálcio); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco, ou sílica); d es integrantes (por exemplo, amido de batata ou glicolato de amido de sódio); ou agentes umectantes (por exemplo, sódio lauril sulfato). Os tabletes podem ser revestidos por métodos bem conhecidos na técnica. As preparações líquidas para administração oral podem assumir a forma, sem caráter limitativo, de soluções, xaropes ou suspensões, ou podem ser apresentados como um produto seco para constituição com água ou outro veículo adequado antes do uso. Essas preparações líquidas podem ser preparadas através de meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes de suspensão (por exemplo, xarope de sorbitol, derivados de celulose, ou gorduras hidrogenadas comestíveis); agentes emulsificantes (por exemplo, lecitina ou acácia); veículos não-aquosos (por exem- pio, óleo de amêndoa, ésteres oleosos, álcool etílico, ou óleos vegetais fracionados); e preservativos (por exemplo, metil ou propil-p-hidróxi benzoatos ou ácido sórbico). As preparações também podem conter sais de tampão, agentes flavorizantes, colorantes, e adoçantes, conforme apropriado. As preparações para administração oral podem ser adequadamente formuladas para liberação lenta, liberação controlada, óü liberação sustentadá dê um agente profilático ou terapêutico. O método da invenção pode compreender uma administração pulmonar, por exemplo, através do uso de um inalador ou nebulizador, de uma composição formulada com um agente aerossol. Consulte, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 6.019.968, 5.985.320, 5.985.309, 5.934.272, 5.874.064, 5.855.913, 5.290.540, e 4.880.078; e as Publicações PCT Nos. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, e WO 99/66903, estando cada uma dessas aqui incorporadas em suas totalidades a título de referência. Em uma modalidade específica, um anticorpo da invenção, terapia de combinação, e/ou composição da invenção é administrado utilizando-se a tecnologia de administração de fármacos pulmonar Alkermes AIR® (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass., EUA). O método da invenção pode compreender uma administração de uma composição formulada para administração parenteral através de injeção (por exemplo, injeção em bolus ou infusão contínua). As formulações para injeção podem ser apresentadas sob a forma de dosagem unitária (por exemplo, em ampolas ou em recipientes de múltiplas dosagens) com um preservativo adicionado. As composições podem assumir formas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes formulató-rios, como agentes de suspensão, estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente, o ingrediente ativo pode estar sob a forma de um pó para constituição com um veículo adequado (por exemplo, água isenta de pirogênio estéril) antes do uso. Os métodos da invenção podem compreender, adicionalmente, a administração de composições formuladas como preparações de depósito. Essas formulações de longa ação podem ser administradas por implante (por exemplo, subcutâneo ou intramuscular) ou por injeção intramuscular. Portanto, por exemplo, as composições podem ser formuladas com materiais poliméricos ou hidrofó-bicos adequados (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca iônica, ou como derivados moderadamente solúveis (por exemplo, como um sal moderadamente solúvel).

Os métodos da invenção abrangem a administração de composições formuladas sob formas neutras ou salinas. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles formados por ânions, tais como aqueles derivados a partir dos ácidos hidroclorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., e aqueles formados com cátions, tais como aqueles derivados a partir de hidróxidos de sódio, potássio, amônia, cálcio, férrico, isopropilamina, trietila-mina, 2- etilamino etanol, histidina, procaína, etc.

Em geral, os ingredientes das composições são fornecidos separadamente ou misturados em uma forma de dosagem única, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado isento de água em um recipiente hermeticamente vedado, tal como uma ampola ou sache que indica a quantidade de agente ativo. Quando o modo de administração for infusão, a composição pode ser dispensada com uma garrafa de infusão contendo água ou solução salina de grau farmaceuticamente estéril. Quando o modo de administração for por injeção, uma ampola de água esterilizada para injeção pode ser proporcionada de modo que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

Em particular, a invenção também determina que um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos, ou composições farmacêuticas da invenção sejam embalados em um recipiente hermeticamente vedado, tal como uma ampola ou sache que indicam a quantidade do agente. Em uma modalidade, um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos, ou composições farmacêuticas da invenção são fornecidos como um pó liofilizado esterilizado seco ou concentrado desprovido de água em um recipiente hermeticamente vedado e podem ser reconstituídos (por exemplo, com água ou solução salina) à concentração apropriada para administração em um indivíduo. De preferência, um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos ou composições farmacêuticas da invenção são fornecidos como um pó liofilizado esterilizado seco em um recipiente hermeticamente vedado em uma dosagem única de peto menos 5 mg, com mais preferência, pelo menos 10 mg, pelo menos 15 mg, pelo menos 25 mg, pelo menos 35 mg, pelo menos 45 mg, pelo menos 50 mg, pelo menos 75 mg, ou pelo menos 100 mg. Os agentes profiláticos ou terapêuticos liofilizados ou composições farmacêuticas da invenção devem ser armazenados entre 2o C e 8o C. em seu recipiente original e os agentes profiláticos ou terapêuticos, ou composições farmacêuticas da invenção devem ser administrados dentro em 1 semana, de preferência, em 5 dias, em 72 horas, em 48 horas, em 24 horas, em 12 horas, em 6 horas, em 5 horas, em 3 horas, ou em 1 hora após ser reconstituído. Em uma modalidade alternativa, um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos ou composições farmacêuticas da invenção são fornecidos sob forma líquida em um recipiente hermeticamente vedado que indica a quantidade e concentração do agente. De preferência, a forma líquida da composição administrada é fornecida em um recipiente hermeticamente vedado pelo menos 0,25 mg/ml, com mais preferência, pelo menos 0,5 mg/ml, pelo menos 1 mg/ml, pelo menos 2,5 mg/ml, pelo menos 5 mg/ml, pelo menos 8 mg/ml, pelo menos 10 mg/ml, pelo menos 15 mg/kg, pelo menos 25 mg/ml, pelo menos 50 mg/ml, pelo menos 75 mg/ml ou pelo menos 100 mg/ml. A forma líquida deve ser armazenada entre 2° C e 8o C em seu recipiente original.

Os anticorpos e as porções de anticorpos da invenção podem ser incorporados em uma composição farmacêutica adequada para administração parenteral. De preferência, o anticorpo ou porções de anticorpos serão preparados como uma solução injetável contendo 0,1 a 250 mg/ml de anticorpo. A solução injetável pode ser composta por uma forma de dosagem líquida ou liofilizada em um frasco, ampola ou seringa pré-carregada de sílex ou âmbar. O tampão pode ser L-histidina (1-50 mM), otimamente 5-1 OmM, em pH 5,0 a 7,0 (otimamente pH 6,0). Outros tampões adequados incluem, mas não se limitam a, succinato de sódio, citrato de sódio, fosfato de sódio ou fosfato de potássio. Pode-se utilizar cloreto de sódio para modificar a toxicidade da solução em uma concentração de 0-300 mM (otimamente 150 mM para uma forma de dosagem líquida). Podem-se incluir agentes crioproteto-res para uma forma de dosagem liofilizada, principalmente 0-10% de sacarose (otimamente 0,5-1,0%). Outros agentes crioprotetores adequados incluem trealose e lactose. Podem-se incluir agentes avolumadores para uma forma de dosagem liofilizada, principalmente 1-10% de manitol (otimamente 2-4%). Podem-se utilizar estabilizantes tanto na forma de dosagem líquida como na forma de dosagem liofilizada, principalmente 1-50 mM de L-Metionina (otimamente 5-10 mM). Outros agentes avolumadores adequados incluem glicina, arginina, podem ser incluídos como 0-0,05% de polisorbato-80 (otimamente 0,005-0,01%). Os ten-soativos adicionais incluem, mas não se limitam a, polisorbato 20 e tensoativos BRIJ. A composição farmacêutica que compreende os anticorpos e as porções de anticorpos da invenção preparada como uma solução injetável para administração parenteral pode compreender, ainda, um agente útil como um adjuvante, tais como aqueles usados para aumentar a absorção, ou dispersão de uma proteína terapêutica (por exemplo, anticorpo). Um adjuvante particularmente útil é a hialuronidase, tal como Hylenex® (hialuronidase recombinante humana). A adição de hialuronidase na solução injetável aperfeiçoa a biodisponibilidade humana após a administração parenteral, administração particularmente subcutânea. Isto também permite maiores volumes no sítio de injeção (ou seja, maiores que 1 ml) com menos dor e desconforto, e incidência mínima de rações no sítio da injeção, (consulte W02004078140, US2006104968 aqui incorporados a título de referência).

As composições da presente invenção podem se encontrar sob várias formas. Estas incluem, por exemplo, formas de dosagem líquida, semi-sólida e solida, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis), dispersões ou suspensões, tabletes, pílulas, pós, lipossomos e supositórios. A forma preferencial depende do modo pretendido de administração e aplicação terapêutica. As composições tipicamente preferenciais encontram-se sob a forma de soluções injetáveis ou infusíveis, tais como as composições semelhantes àquelas usadas para imunização passiva de humanos com outros anticorpos. O modo preferencial de administração é parenteral (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular). Em uma modalidade preferencial, o anticorpo é administrado por infusão ou injeção intravenosa. Em outra modalidade preferencial, o anticorpo é administrado por injeção intramuscular ou subcutânea.

Tipicamente, as composições terapêuticas devem ser estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossomo, ou outra estrutura adequada para altas concentrações de fármacos. As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando-se o composto ativo (ou seja, anticorpo ou porção de anticorpo) na quantidade necessária em um solvente apropriada com um ingrediente ou cõm uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme a necessidade, seguidas por esterilização filtrada. Em geral, as dispersões são preparadas incorporando-se o composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e outros ingredientes necessários a partir daqueles enumerados acima. No caso de pós liofilizados estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferenciais de preparação são secagem a vácuo e secagem por aspersão que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional a partir de uma solução filtrada previamente estéril do mesmo. A fluidez apropriada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, através do uso de um revestimento, tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e através do uso de tensoativos. A absorção prolongada de composições injetáveis pode ser produzida incluindo-se, na composição, um agente que retarde a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

Os anticorpos e as porções de anticorpos da presente invenção podem ser administrados através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica, embora para muitas aplicações terapêuticas, a via/modo de administração preferencial seja injeção subcutânea, injeção ou infusão intravenosa. Conforme será avaliado pelos artesãos versados na técnica, a via e/ou modo de administração irá variar dependendo dos resultados desejados. Em determinadas modalidades, o composto ativo pode ser preparado com um veículo que protegerá o composto contra uma liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, que inclui implantes, apliques transdérmicos, e sistemas de distribuição microencapsu-lados. Podem-se utilizar polímeros biodegradáveis e biocompatíveis, tal como acetato de vinil etileno, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, e ácido polilático. Muitos métodos para a preparação dessas formulações são patenteados ou genericamente conhecidos pelos indivíduos versados na técnica. Consulte, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcei Dekker, Inc., Nova York, EUA, 1978.

Em determinadas modalidades, um anticorpo ou uma porção de anticorpo da invenção podem ser oralmente administrados, por exemplo, com um diluente inerte ou um veículo comestível assimilável. O composto (e outros ingredientes, se desejado) também pode ser confinado em uma cápsula gelatinosa com invólucro duro ou macio, compactado em tabletes, ou diretamente incorporado na dieta do indivíduo. Para uma administração terapêutica oral, os compostos podem ser incorporados com excipientes e usados sob a forma de tabletes ingeríveis, tabletes bucais, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, pílulas, e similares. Com a finalidade de administra um composto da invenção diferentemente de uma administração parenteral, pode ser necessário revestir o composto com, ou co-administrar o composto com, um material para evitar sua inativação.

Os compostos suplementarmente ativos também podem ser incorporados às composições. Em determinadas modalidades, um anticorpo ou uma porção de anticorpo da invenção é co-formulado com e/ou co-administrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais que sejam úteis para o tratamento de distúrbios onde a atividade de RGM A é prejudicial. Por exemplo, um anticorpo anti-RGM A ou porção de anticorpo da invenção pode ser co-formulado e/ou co-administrado com um ou mais anticorpos adicionais que se ligam a outros alvos (por exemplo, anticorpos que se ligam a citocinas ou que se ligam a moléculas de superfície celular). Além disso, um ou mais anticorpos da invenção podem ser usados em combinação com dois ou mais agentes terapêuticos anteriores. Essas terapias de combinação podem utilizar, de modo vantajoso, dosagens menores dos agentes terapêuticos administrados, evitando, assim, possíveis toxicidades oi complicações associadas a várias mono-terapias.

Em determinadas modalidades, um anticorpo RGM A ou fragmento deste é ligado a um veículo de extensão de meia-vida conhecido na técnica. Esses veículos incluem, mas não se limitam a, domínio Fc, polietileno glicol, e dextrano. Esses veículos são descritos, por exemplo, no Pedido U.S. com Número de Série 09/428.082 e no Pedido PCT Publicado No. WO 99/25044, estando aqui incorporados a título de referência para qualquer propósito.

Em uma modalidade específica, as sequências de ácido nucléico que compreendem sequências de nucleotídeo que codificam um anticorpo da invenção ou outro agente profilático ou terapêutico da invenção são administrados para tratar, prevenir, gerenciar, ou atenuar um distúrbio ou um ou mais sintomas do mesmo através de terapia genética. A terapia genética se refere a uma terapia realizada pela administração a um indivíduo de um ácido nucléico expresso ou exprimível. Nesta modalidade da invenção, os ácidos nucléicos produzem seu anticorpo codificado ou agente profilático ou terapêutico da invenção que mediam um efeito profilático ou terapêutico.

Pode-se utilizar qualquer um dos métodos para terapia genética disponíveis na técnica de acordo com a presente invenção. Parta revisões gerais dos métodos de terapia genética, consulte Goldspiel et al., 1993, Clinicai Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, Science 260:926- 932 (1993); e Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; Maio de 1993, TIBTECH 11(5):155-215. Os métodos comumente conhecidos na técnica da tecnologia de DNA recombinante que pode ser usada são descritos em Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993); and Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990). A descrição detalhada de vários métodos de terapia genética está descrita no documento US20050042664 A1, que se encontra aqui incorporado a título de referência. A RGM A representa um papel crítico na patologia associada a uma variedade de doenças, conforme definido no presente documento anterior. As proteínas RGM A e RGM foram descritas como sendo reguladas ascendentemente em sítios de lesão em seres humanos que sofrem de lesão cerebral traumática (Schwab et al., Arch. Neurol. 62: 1561-8, 2005a) em penumbra infartada e áreas de núcleo do cérebro humano lesionado por derrame (Schwab et al., Arch. Neurol. 62: 1561-8, 2005a), na substância negra de pacientes que sofrem de doença de Parkinson (Bossers et al. Brain Pathology vol. 19 : 91-107, 2008). Portanto, os anticorpos RGM A são adequados para terapia combinatória de derrame cerebral, lesão cerebral traumática, doença de Parkinson, doença de Alzheimer e outros distúrbios neurodegeneratívos do sistema nervoso humano. Em pacientes com derrame, o tratamento atual nas primeiras três horas consiste em administrar um ativador plasminogênico tecidual para lise de coágulos sanguíneos (Liang et al. Arch. Neurol . 65: 1429 - 33, 2008) e tal tratamento pode, no princípio, ser combinado com uma administração de anticorpo RGM A que oferece uma abordagem de tratamento diferente e uma janela terapêutica bem mais extensa. Na doença de Alzheimer, uma combinação de fármacos com anticorpos RGMA é possível com os acentuadores de cognição aprovados, Donepezil, Memantina e tal abordagem pode reduzir significativamente a neuropatologia progressiva. A administração intranasal de insulina tem efeitos positivos na atenção e na memória (Hanson and Frey, BMC Neurosci. 9: S5, 2008) e consiste em uma via de administração possível para terapia de anticorpos RGM A contornando-se a barreira hematoencefálica. Em pacientes com doença de Parkinson (PD), o tratamento atual se baseia principalmente em agentes dopaminérgicos como levo-dopa, um pró-fármaco de dopamina (Khor and Hsu, Curr. Clin. Pharmacol. 2: 234 - 43, 2007), ropinirola, um agonista de dopamina não ergolínico (Jost et al. J. Neurol. 255 Suppl. 5: 60 -63, 2008), os inibidores de oxidase B monoamina Rasagiline and Selegiline (Elmer and Bertoni, Expert Opin. Pharmacother. 9: 2759 - 72, 2008). Apesar de os efeitos benéficos em PD precoce ou moderada, nenhum desses fármacos é capaz de evitar a degenera-ção progressiva da substância negra e das áreas cerebrais subcorticais e corticais associadas, e uma terapia de combinação com anticorpos RGM A estimulantes de regeneração pode, portanto, reduzir o processo da doença.

Qualquer agente neuroprotetor sendo este um antioxidante, um agente sequestran-te de radical, um fármaco anti convulsivo como Fenitoína ou o fármaco para anemia Eritro-poetina é adequado para uma terapia combinatória com anticorpos RGM A pró-regenerativos, estendendo, assim, a janela de tratamento terapêutico geralmente bastante curta dos neuroprotetores.

Os anticorpos, e a porção de anticorpos da invenção podem ser usados para tratar seres humanos que sofrem de tais doenças.

Deve-se compreender que os anticorpos da invenção ou porção de ligação ao antí-geno destes podem ser usados sozinhos ou em combinação com um agente adicional, por exemplo, um agente terapêutico, sendo que o dito agente adicional é selecionado pelos in-divíduos versados na técnica para seu propósito pretendido. Por exemplo, o agente adicional pode ser um agente terapêutico reconhecido na técnica como sendo útil no tratamento da doença ou condição sendo tratadas pelo anticorpo da presente invenção. O agente adicional também pode ser agente que confere um atributo benéfico à composição terapêutica, por exemplo, um agente, que afeta a viscosidade da composição.

Deve-se compreender, ainda, que as combinações que devem ser incluídas nesta invenção são aquelas combinações úteis para seu propósito pretendido. Os agentes apresentados abaixo são ilustrativos para propósitos e não pretende-se que sejam limitados. As combinações, que fazem parte desta invenção, podem ser os anticorpos da presente invenção e pelo menos um agente adicional selecionado a partir das listas abaixo. A combinação também pode incluir mais de um agente adicional, por exemplo, dois ou três agentes se a combinação for de modo que a composição formada possa realizar sua função pretendida.

Exemplos não-limitativos de agentes terapêuticos para esclerose múltipla com os quais um anticorpo, ou porção de anticorpo, da invenção podem ser combinados incluem os seguintes: corticosteróides; prednisolona; metilprednisolona: azatioprina; ciclofosfamida; ciclosporina; metotrexato; 4-aminopiridina; tizanidína; interferon-31a (AVONEX; Biogen); interferon-p1b (BETASERON; Chiron/Berlex); interferon a-n3) (Interferon Scien-ces/Fujimoto), interferon-α (Alfa Wassermann/J&J), interferon βΙΑ-IF (Serono/lnhale Thera-peutics), Peginterferon α 2b (Enzon/Schering-Plough), Copolímero 1 (Cop-1; COPAXONE; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.); oxigênio hiperbárico; imunoglobulina intravenosa; cla-dribina; anticorpos ou antagonistas de outras citocínas humanas ou fatores de crescimento e seus receptores, por exemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-23, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, e PDGF. Os anticorpos da invenção, ou porções de ligação ao antígeno destes, podem ser combinados com anticorpos ligados à moléculas de superfície celular, como CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90 ou seus ligantes. Os anticorpos da invenção, ou porções de ligação ao antígeno destes, também podem ser combinados aos agentes, tais como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato mofetil, leflunomida, NSAIDs, por exemplo, ibuprofeno, corticosteróides, como prednisolona, inibidores de fosfodiesterase, agonistas de adensosina, agentes antitrombóticos, inibidores complementares, agentes adrenérgicos, agentes que interferem com a sinalização por citocinas pró-inflamatórias, como TNFa ou IL-1 (por exemplo, inibidores de quinase IRAK, NIK, IKK, p38 ou MAP), inibidores de enzima de conversão IL-Ιβ, inibidores TACE, inibidores de sinalização de células T, como inibidores de quinase, inibidores de metaloproteinase, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inibidores de enzimas de conversão de angiotensina, receptores de citocina solúveis e derivados destes (por exemplo, receptores TNF p55 ou p75 solúveis, slL-1RI, slL-1 Rll, SIL-6R) e citocinãs antiinflanrTàtórias (por exemplo IL-4, IL-10, IL-13 e TGFp).

Os exemplos preferenciais de agentes terapêuticos para esclerose múltipla nos quais o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno deste podem ser combinados incluem interferon-β, por exemplo, IFN β1θ e IFN β1ό; copaxona, corticosteróides, inibidores de cas-pase, por exemplo, inibidores de caspase-1, inibidores de IL-1, inibidores de TNF, e anticorpos ao ligante CD40 e CD80.

Os anticorpos da invenção, ou porções de ligação ao antígeno destes também podem ser combinados com agentes, tais como alemtuzumab, dronabinol, Unimed, daclizu-mab, mitoxantrona, cloridrato de xaliprodeno, fampridina, acetato de glatirâmero, natalizu-mab, sinnabidol, a-imunocina NNS03, ABR-215062, AnergiX.MS, antagonistas de receptor de quimiocina, BBR-2778, calagualina, CPI-1189, LEM (mitoxantrona encapsulado com li-possomo), THC.CBD (agonista canabinóide) MBP-8298, mesopramo (inibidor PDE4), MNA-715, anticorpo receptor anti-lL-6, neurovax, pirfenidone allotrap 1258 (RDP-1258), sTNF-R1, talampanel, teriflunomida,TGF-beta2, tiplimotida, antagonistas VLA-4 (por exemplo, TR-14035, VLA4 Ultrahaler, Antegran-ELAN/Biogen), antagonistas interferon gama, agonistas IL-4.

As composições farmacêuticas da invenção podem incluir uma “quantidade tera-peuticamente eficaz” ou uma “quantidade profilaticamente eficaz” de um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção. Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e durante períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou porção de anticorpo pode ser determinada por um indivíduo versado na técnica e pode variar de acordo com fatores como o estado da doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo ou porção de anticorpo em produzir uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz também é aquela onde quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo, ou porção de anticorpo, são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma “quantidade profilaticamente eficaz” se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e durante períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profilático desejado. Tipicamente, visto que uma dose profilática é usada em indivíduos antes ou em um estágio precoce da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será menor que a quantidade terapeuticamente eficaz.

Os regimes de dosagem podem ser ajustados de modo a proporcionar a resposta desejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica ou profilática). Por exemplo, pode- se administrar um único bolus, podem-se administrar várias doses divididas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. Particularmente, é vantajoso formular composições parentais na forma unitária de dosagem de modo a facilitar a administração e uniformidade da dosagem. Conforme o uso em questão, a forma unitária de dosagem se refere a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos mamíferos a serem tratados; sendo que cada unidade contém uma quantidade pré determinada de composto ativo calculada de modo a produzir o efeito terapêutico desejado em associação ao veículo farmacêutico necessário. A especificação para formas unitárias de dosagem da invenção são ditadas por, e dependem diretamente de, (a) características exclusivas do composto ativo e do efeito terapêutico ou profilático particular a ser obtido, e (b) limitações inerentes na técnica de compor tal composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.

Uma faixa não limitativa exemplificadora para uma quantidade terapêutica ou profi-laticamente eficaz de um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção é igual a 0,1-20 mg/kg, com mais preferência, 1-10 mg/kg. Deve-se notar que os valores de dosagem podem variar em relação ao tipo e à gravidade da condição a ser atenuada. Deve-se compreender, ainda, que para qualquer indivíduo particular, os regimes específicos de dosagem devem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e com o julgamento profissional da pessoa que estiver administrando ou supervisionando a administração das composições, e as faixas de dosagem aqui apresentadas são apenas exemplificadoras e não se destinam a limitar o escopo nem a prática da composição reivindicada.

Tornar-se-á prontamente aparente aos indivíduos versados na técnica que outras modificações e adaptações adequadas dos métodos da invenção aqui descritos são obvias e podem ser realizadas utilizando-se equivalentes adequados sem que se divirja do escopo da invenção ou das modalidades descritas no presente documento. Uma vez descrita a presente invenção em detalhes, a mesma serão mais claramente compreendida com referência aos exemplos a seguir, que estão incluídos apenas por propósitos de ilustração e não pretendem limitar a invenção. EXEMPLOS: Métodos Os métodos a seguir descrevem em detalhes os procedimentos experimentais usados na seção dos Exemplos. (i) As placas de ELISA de ligação direta foram revestidas com hRGM A (R&D) em uma concentração de 2pg/mL em tampão de carbonato. Os poços foram, então, bloqueados com 2% de solução de bloqueio (Bio-Rad) durante 1 hora em temperatura ambiente. Os anticorpos biotinilados foram serialmente diluídos com um fator de diluição 1:5 em 0,1% de BSA/PBS ao longo da placa e incubados durante 1 hora em temperatura ambiente. O rea-gente de detecção era uma diluição 1:10.000 de estreptavidina-HRP em 0,1% de BSA/PBS. A detecção foi realizada com um reagente TMB, que foi interrompido com 2N de H2S04 e a OD foi lida em 450nM. (ii) Análise FACS. Os transfectantes estáveis de células HEK293 que sobre-expressam hRGM A ou células BAF3 que sobre-expressam ratRGM A foram submetidos à coloração com MABs 5F9 ou 8D1 não rotulados durante mais de 15 minutos a 4o em 0m1% de tampão BSA/PBS. A detecção foi realizada com um anticorpo anti-rat IgG PE de camun-dongos. (iii) Ensaios ELISA de fase sólida para avaliação de MAB 5F9 em ensaios de ligação de hRGM A à neogenina.

As placas de ELISA (Immuno Plate Cert. Maxi Sorb. F96 NUNC, 439454) foram revestidas durante 1 hora a 37°C com uma concentração de 2,5 pg/ml do domínio extracelular da proteína de Neogenin humana marcada com His (concentração de solução de estoque: 30 pg/ml). Após a incubação, a Neogenina não-ligada foi removida em 3 etapas de lavagem separadas com PBS contendo 0,02% de Tween 20. O bloqueio das placas revestidas com Neogenina foi realizado adicionando-se 200 pl por poço de uma albumina sérica bovina a 3% (BSA), PBS, solução de bloqueio Tween 20 (0,02%). Após a incubação durante 1 hora a 37°C, a solução de bloqueio foi removida e os fragmentos de RGM A ou uma proteína de comprimento inteiro, conjugada com um marcador fc humano, com ou sem um anticorpo, foram adicionados. Em alguns experimentos, os anticorpos foram pré-incubados com as proteínas hRGM A conjugadas com fc durante 1 hora em temperatura ambiente. As placas revestidas com Neogenina foram incubadas com hRGM A com ou sem anticorpos durante 1 hora a 37°C. Após 3 etapas de lavagem com PBS-Tween 20 (0,02%), as placas foram incubadas com um anticorpo fc anti-humano rotulado com Biotina (1mg/ml, diluído 1:200 em PBS contendo 0,6% de BSA, 0,02% de Tween 20), Jackson ImmunoResearch catálogo no: 709-065-149, durante 1 hora a 37°C. O anticorpo não-ligado foi removido através de 3 etapas de lavagem com PBS-Tween 20 (0,02%). Com a finalidade de visualizar a ligação no anticorpo anti-fc rotulado com Biotina, um complexo que consiste em Estreptavidina-Peroxidase (Roche, cat.# 11089153001), diluído 1:5000 com PBS contendo 0,6% de BSA, 0,02% de Tween 20 foi adicionado, seguido pela incubação a 37°C durante 1 hora. O complexo de Peroxidase não ligado foi removido em 3 etapas de lavagem subsequentes (PBS-Tween 20 (0,02%) antes de adicionar o substrato de Peroxidase (Immuno Pure TMB, Pierce # 34021). A reação de substrato foi interrompida 1 a 30 minutos após sua adição aos poços por 2,5 M de H2S04. As placas foram analisadas (determinação OD) em um comprimento de onda de 450 nm utilizando-se um fotômetro Anthos. (iv) Ensaios ELISA de fase sólida para avaliação de MAB 5F9 em ensaios de liga- ção hRGM A — BMP-4.

As placas de ELISA (Immuno Plate Cert. Maxi Sorb. F96 NUNC, 439454) foram revestidas durante 1 hora a 37°C com uma solução contendo uma concentração de 2,5 pg/ml de proteína BMP-4 humana recombinante (R&D Systems, # 314-BP, Lot # BEM316061). Após a incubação, a BMP-4 não-ligada foi removida em 3 etapas de lavagem separadas com PBS contendo 0,02% de Tween 20. O bloqueio das placas revestidas com BMP-4 foi realizado adicionando-se 200 pl por poço de uma albumina sérica bovina a 3% (BSA), PBS, solução de bloqueio Tween 20 (0,02%). Após a incubação durante 1 hora a 37°C, a solução de bloqueio foi removida e os fragmentos RGM A ou a proteína de comprimento inteiro, conjugados com um marcador fc humano, com ou sem anticorpo, foram adicionados. Em alguns experimentos, os anticorpos foram pré-incubados com as proteínas hRGM A conjugadas com fc durante 1 hora em temperatura ambiente. As placas revestidas com BMP-4 foram incubadas com hRGM A com ou sem anticorpos durante 1 hora a 37°C. Após 3 etapas de lavagem com PBS-Tween 20 (0,02%), as placas foram incubadas com um anticorpo fc anti-humano rotulado com Biotina (1mg/ml, diluído 1:200 em PBS contendo 0,6% de BSA, 0,02% de Tween 20), Jackson ImmunoResearch catálogo no: 709-065-149, durante 1 hora a 37°C. O anticorpo não-ligado foi removido através de 3 etapas de lavagem com PBS-Tween 20 (0,02%). Com a finalidade de visualizar a ligação do anticorpo anti-fc rotulado com Biotina, um complexo que consiste em Estreptavidina-Peroxidase (Roche, cat.# 11089153001), diluído 1:5000 com PBS contendo 0,6% de BSA, 0,02% de Tween 20 foi adicionado, seguido pela incubação a 37°C durante 1 hora. O complexo de Peroxidase não ligado foi removido em 3 etapas de lavagem subsequentes (PBS-Tween 20 (0,02%) antes de adicionar o substrato de Peroxidase (Immuno Pure TMB, Pierce # 34021). A reação de substrato foi interrompida 1 a 30 minutos após sua adição aos poços por 2,5 M de H2S04. As placas foram analisadas (determinação OD) em um comprimento de onda de 450 nm utilizando-se um fotômetro Anthos. (v) Ensaios ELISA de fase sólida para avaliação de MAB 5F9 em ensaios de ligação hRGM A - BMP-2.

As placas de ELISA (Immuno Plate Cert. Maxi Sorb. F96 NUNC, 439454) foram revestidas durante 1 hora a 37°C com uma solução contendo uma concentração de 2,5 pg/ml de proteína BMP-2 humana recombinante (R&D Systems, # 355-BM, Lot # MSA04). Após a incubação, a BMP-2 não-ligada foi removida em 3 etapas de lavagem separadas com PBS contendo 0,02% de Tween 20. O bloqueio das placas revestidas com BMP-2 foi realizado adicionando-se 200 μΙ por poço de uma albumina sérica bovina a 3% (BSA), PBS, solução de bloqueio Tween 20 (0,02%). Após a incubação durante 1 hora a 37°C, a solução de bloqueio foi removida e os fragmentos RGM A ou a proteína de comprimento inteiro, conjugados com um marcador fc humano, com ou sem anticorpo, foram adicionados. Em alguns experimentos, os anticorpos foram pré-incubados com as proteínas hRGM A conjugadas com fc durante 1 hora em temperatura ambiente. As placas revestidas com BMP-2 foram incubadas com hRGM A com ou sem anticorpos durante 1 hora a 37°C. Após 3 etapas de lavagem com PBS-Tween 20 (0,02%), as placas foram incubadas com um anticorpo fc anti-humano rotulado com Biotina (1mg/ml, diluído 1:200 em PBS contendo 0,6% de BSA, 0,02% de Tween 20), Jackson ImmunoResearch catálogo no: 709-065-149, durante 1 hora a 37°C. O anticorpo não-ligado foi removido através de 3 etapas de lavagem com PBS-Tween 20 (0,02%). Com a finalidade de visualizar a ligação no anticorpo anti-fc rotulado com Biotina, um complexo que consiste em Estreptavidina-Peroxidase (Roche, cat.# 11089153001), diluído 1:5000 com PBS contendo 0,6% de BSA, 0,02% de Tween 20 foi adicionado, seguido pela incubação a 37°C durante 1 hora. O complexo de Peroxidase não ligado foi removido em 3 etapas de lavagem subsequentes (PBS-Tween 20 (0,02%) antes de adicionar o substrato de Peroxidase (Immuno Pure TMB, Pierce # 34021). A reação de substrato foi interrompida 1 a 30 minutos após sua adição aos poços por 2,5 M de H2S04. As placas foram analisadas (determinação OD) em um comprimento de onda de 450 nm utilizando-se um fotômetro Anthos. (vi) Cultura celular Ntera-2 As células Ntera-2 humanas foram obtidas a partir de German Collection of Micro-organisms and Cell Cultures (DMSZ, Braunschweig). Os estoques congelados de células Ntera-2 não-diferenciadas foram derretidos em um meio DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (FBS; JRH Bioscience, Kansas, EUA) e 5% de soro equino (HS; Sigma, Alemanha). As células foram desenvolvidas em frascos de cultura (Greiner, Alemanha) até que alcançassem uma confluência de 80%.

Para diferenciação neuronal, as células Ntera-2 foram semeadas em uma densidade de 2,5 x 106 células/175 cm2 em um meio de diferenciação (meio DMEM contendo 10% de FBS, 5% de HS, 1% de penicillina-estreptomicina, ácido retinóico 10μΜ). As células foram diferenciadas durante 3 semanas e o meio foi trocado duas vezes por semana.

Após a diferenciação, as células foram separadas com tripsina-EDTA e divididas em uma razão de 1:6. 48h após as células neuronais terem sido separadas derivando-se a partir de células subjacentes. As células desalojadas foram transferidas por agregação em um meio novo em novos frascos de cultura de agitação (Corning, EUA). Permitiu-se que as células Ntera-2 diferenciadas se agregassem sob condições de agitação horizontal suave a 37°C, durante 24 horas em um meio Neurobasal (Gibco) suplementado com B27 (Gibco), glutamina (Gibco) e penicillina-estreptomicina. Os agregados Ntera-2 foram semeados em uma densidade de aproximadamente 20 - 30 agregados por lamínulas em placas com 24 poços. As lamínulas pré-revestidas com poli-lisina foram revestidas com laminina (20pg/ml, Sigma) e com o fragmento de RGM A humana acoplado com fc recombinante #786 (amino- ácidos 47 - 168) em uma concentração de 10 pg/ml. Após a semeação, as culturas foram tratadas com 5F9 MAB, adicionadas em três concentrações diferentes (0,1 pg/ml; 1 pg/ml; 10 pg/ml) ao meio de cultura e foram adicionalmente incubadas durante 24 horas a 37°C em um meio Neurobasal. Os agregados foram, então, fixados em 4% de paraformaldeído (2 horasy temperatura ambiente) e permeabilizados através dã adição de 0,1% Triton X-100 em PBS (20 minutos, temperatura ambiente). Para coloração fluorescente, as culturas foram bloqueadas com PBS contendo 1 % de BSA durante 1 hora em temperatura ambiente. Após o bloqueio, as células Ntera foram incubadas com um anticorpo monoclonal de camundongo contra o isotipo 3 de β-tubulina (clone SDL3D10, Sigma # T8660) durante 2 horas em temperatura ambiente. O anticorpo não-ligado foi removido através de 3 etapas de lavagem diferentes (5-15 minutos cada) e as células Ntera foram incubadas com um anticorpo anti-camundongo de asnos conjugados com Cy-3 (Jackson ImmunoResearch Lot 62597), diluído 1:350 vezes em PBS/0,5% BSA e 0,5 pg/ml de bisbenzimida. Após 1 hora de incubação, as culturas foram lavadas 3 vezes de modo a remover o anticorpo secundário não-ligado. Para microscopia de fluorescência, as lamínulas foram incrustadas em Fluoromount G (Southern Biotech, Eching, Alemanha).

As imagens de agregados Ntera-2 foram adquiridas utilizando-se um microscópio de fluorescência Zeiss Axiovert 200 e o crescimento das culturas foi automaticamente analisado utilizando-se um sistema interno de aquisição e análise de imagem. A análise automática de crescimento foi realizada por Image Pro Plus 4.5 e a análise estatística dos dados foi realizada por Graph Pad Prism 4. O crescimento foi normalizado de modo a controlar o desenvolvimento das culturas na ausência do fragmento RGM A humana #786. (vii) Cultura SH-SY5Y.

As células SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) são células de neuroblastoma humana derivadas a partir de tumor cerebral metastático. As células foram desenvolvidas em um meio que consiste em 50% de Solução Salina Balanceada de Earle (Invitrogen Life Technologies, Cat. # 24010-043) e 50% de Mistura de Nutrientes F12 (Ham) + GlutaMAX-1 (Invitrogen Life Technologies, Cat. # 31765-027). Este meio é adicionalmente suplementado com 10% de soro fetal de bezerros inativado por calor (FCS, JRH Biosciences, Kansas, EUA Cat. # 12107-10O0M), 1% de NEAA (solução de aminoácidos não-essenciais MEM (Sigma-Aldrich Cat.# M1745), e 1% de Penicillina (10.000 U/ml)/Estreptomicina (10.000 pg/ml) (Invitrogen Life Technologies, Cat. # 15140-122). Com a finalidade de estimular uma diferenciação neu-ronal e um crescimento de processos neuronais, as células SH-SY5Y foram submetidas à cultura em um meio suplementado com 10 pM de ácido retinóico (RA, Sigma-Aldrich Cat. # R2625-050MG)) durante vários dias. As células SH-SY5Y diferenciadas foram desenvolvidas em frascos de cultura tecidual e removidas por tripsinação cuidadosa e colocadas em lamínulas de vidro revestidas com um padrão em faixas de proteína RGM A ou fragmento desta e Colágeno I. (viii) Preparação de lamínulas de vidro em faixas A versão modificada do ensaio de faixa em lamínulas de vidro foi realizada de maneira ligeiramente diferente daquela descrita anteriormente (Knoell et ai. Nature Protocols 2: 1216 -1224, 2007) e resumida abaixo.

As matrizes de silício estéreis para produção de faixas que consistem em proteínas purificadas foram pressionadas sobre a superfície de uma placa de petri com a face áspera da matriz voltada para cima. As lamínulas limpas lavadas com etanol foram colocadas sobre a matriz e os cantos da matriz são marcados com uma caneta de ponta esférica na parte posterior das lamínulas. A matriz que transporta a lamínula foi cuidadosamente virada de cabeça para baixo com a lamínula voltada para parte inferior da placa de petri. A RGM A inibitória de comprimento inteiro conjugado com Fc ou fragmento fc ou RGM A humana re-combinante (R&D Systems Cat. # 2459 RM) ou foram misturados com 10 pl de um anticorpo anti-camundongo rotulado com FITC (IgG anti-camundongo de cabra Fab-específico, Sig-ma-Aldrich Cat. # F-4018) com a finalidade de visualizar as faixas de RGM A. Utilizando-se uma seringa Hamilton, 50 pl da solução de anticorpo RGM A - FITC foram cuidadosamente injetados através do canal de entrada. O fluido em excesso deixou a matriz através do canal de saída e foi removido com um tecido Kleenex. Após a incubação da lamínula de matriz a 37°C durante 2 horas, a primeira solução de revestimento (contendo RGM A) foi lavada com 100 pl de PBS. Na próxima etapa, a lamínula com as faixas de RGM A foi transferida a uma placa com 24 poços, revestida com 500 μΙ de Colágeno I (Colágeno I da cauda de rato, Bec-ton Dickinson Biosciences Cat. # 354236) de modo a preencher os espaços vazios entre as faixas de RGM A e foi incubada a 37°C durante 2 horas. No fim, produziu-se um padrão de faixas alternadas de RGM A e Colágeno I na lamínula. Após a incubação, o Colágeno I não-ligado foi lavado através de três etapas de lavagem separadas com PBS e as células SH-SY5Y diferenciadas foram colocadas sobre as lamínulas. A incubação das células SH-SY5Y no substrato padronizado foi continuada a 37°C durante 20 a 24 horas na presença ou ausência de anticorpos monoclonais direcionados contra RGM A humana.

As células de análise de imunofluorescência foram fixadas em 4% de paraformalde-ído durante 2horas em temperatura ambiente ou de um dia para o outro em 4°C e permeabi-lizadas por incubação com PBS contendo 0,1% de Triton X-100 durante 10 a 20 minutos em temperatura ambiente. Após o bloqueio com 3% de BSA durante 60 minutos, as células foram incubadas com o anticorpo primário (clone de isotipo 3 anti—β-tubulina monoclonal SDL 3D10, Sigma-Aldrich Cat. # T8660) durante 2 horas em temperatura ambiente e após várias etapas de lavagem com o anticorpo secundário (anti-camundongo de asno Cy-3 Jackso-nlmmuno Research Lot:62597), diluído em PBS com 0,1% de BSA durante 1 hora. Os núcleos foram contra-coloridos utilizando-se bisbenzimida H33258 (Riedel-De-Haen, Cat. # A- 0207). As células foram finalmente incrustadas em Fluoromount G (Southern Biotechnology Associates Inc.: Cat. # 010001). As células foram analisadas utilizando-se um microscópio de fluorescência Axioplan2 (Zeiss). (ix) Construção e expressão de anticorpos anti RGMA recombinantes O DNA que codifica õs fragmentos cDNA da região variável de cadeia pesada de anticorpos monoclonais RGMA anti-humano de ratos 5F9 e 8D1 foi clonado em um vetor de expressão pHybE contendo a região constante lgG1 humana, que contém 2 mutações de aminoácido de região articulada, através de recombinação homóloga em bactérias. Essas mutações consistem em uma alteração de leucina para alanina nas posições 234 e 235 (EU numbering, Lund et al., 1991, J. Immunol., 147:2657). A região variável de cadeia leve dos anticorpos monoclonais 5F9 e 8D1 foi clonada em vetor pHybE contendo uma região constante kappa humana. Os vetores pHyb-E exemplificadores incluem pHybE-hCk, e pHybE-hCg1,z,non-a (consulte o Pedido de Patente US com Número de Série 61/021,282). Os anticorpos de comprimento inteiro foram expressos, de modo transiente, em células 293E através de co-transfecção de cDNAs quiméricos de cadeia pesada e leve no plasmídeo de expressão pHybE. Os sobrenadantes celulares contendo o anticorpo recombinante foram purificados por cromatografia em Proteína A Sefarose e o anticorpo ligado foi eluído pela adição de um tampão ácido. Os anticorpos foram neutralizados e dialisados em PBS. Os anticorpos monoclonais RGMA anti-humanos purificados foram, então, testados para determinação de sua capacidade em se ligar a RGMA por ELISA, conforme descrito no Exemplo 1 e ELISA de competição, conforme descrito no Exemplo 7.

Exemplo 1: Geração de anticorpos monoclonais RGMA anti-humanos Os anticorpos monoclonais de ratos RGMA anti-humanos foram obtidas a seguinte forma: Exemplo 1A: Imunização de ratos com antíaeno RGMA humano Injetaram-se, subcutaneamente, vinte e cinco microgramas de RGMA humana purificada recombinante (R&D Systems Cat#2459-RM lote MRH02511A) misturados com adju-vante de Freund completo (Sigma) em ratos Harlan Sprague Dawley com de 6 a 8 semanas de idade no dia 1. Nos dias 21, 42, e 63, injetaram-se, subcutaneamente, vinte e cinco microgramas de RGMA humana purificada recombinante misturados com adjuvante de Freund incompleto (Sigma) nos mesmos 4 ratos Harlan Sprague Dawley. No dia 144, ou no dia 165, injetaram-se, subcutaneamente, 10 pg de RGMA humana purificada recombinante nos ratos.

Exemplo 1B: Geração de Hibridoma Os esplenócitos obtidos a partir dos ratos imunizados no Exemplo 1.2.A foram fundidos com células SP2/0 em uma razão de 2:de acordo com o método estabelecido descrito em Kohler, G. and Milstein 1975, Nature, 256:495 com a finalidade de gerar hibridomas. Os produtos de fusão foram colocados em um meio de seleção contendo azaserina e hipoxanti-na em placas com 96 poços em uma densidade de 1.5x105 células do baço por poço. De sete a dez dias após a fusão, observaram-se colônias de hibridoma macroscópico. O sobre-nadante proveniente de cada poço contendo colônias de hibridoma foi testado por ELISA direto (consulte Exemplo 2) para a determinação da presença de anticorpo RGMA humano. As linhagens celulares positivas ELISA foram testadas em FACS contra as células HEK293 transfectadas estáveis que expressam o RGMA de humanos e/ou ratos. Essas linhagens celulares de hibridomas de ratos foram subsequentemente testadas em ELISA Direto para determinação da reatividade cruzada com RGMA de ratos, e ligação de ELISA à proteína de fusão HuRGMA 47-168. TABELA 7: LIGAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS DE RATOS ΑΝΤΙ RGMA Nome ELISA Direta FACS ELISA Direta ELISA Direta rHuRGMA HEK293-rhRGMA rRatRGMA hRGMA 47-168/HulgGFc ML68-8D1 Sim Sim Não Sim ML69-5F9 Sim Sim Sim Sim Exemplo 2. Liaacão de ELISA Direta de mABs 5F9 e 8D1 Conforme mostrado na FIGURA 1A, os MABs 5F9 e 8D1 se ligam à hRGM A com títulos semelhantes, conforme descrito na seção anterior (i). O MAB 5F9 também mostrou uma ligação à ratRGM A em ELISA, embora 8D1 não seja capaz de se ligar à ratRGM A (dados não mostrados). A FIGURA 1B mostra que os MABs 5F9 e 8D1 se ligam às células HEK293 que sobre-expressam a hRGM A em FACS. A FIGURA 1C mostra que 5F9, mas não o 8D1 é capaz de se ligar às células BAF3 que sobre-expressam ratRGM A em FACS. O FACS foi realizada conforme descrito na seção (ii).

Utilizaram-se ensaios ELISA de fase sólida para avaliar a ligação de MAB 5F9 em ensaios de ligação de neogenina hRGM A competitiva. As placas de ELISA foram preparadas e usadas conforme descrito na seção (iii) do presente pedido. A hRGM A foi adicionada em uma concentração de 0,5 pg/ml com anticorpos 5F9 durante 1 hora a 37°C. A MAB 5F9 foi usada nas seguintes concentrações: 1,25 pg/ml; 0,63 pg/ml; 0,32 pg/ml; 0,16 pg/ml; 0,08 pg/ml; 0,04 pg/ml; 0,02 pg/ml; 0,01 pg/ml. A ligação de hRGM A foi visualizada utilizando-se um anticorpo anti-fc rotulado com Biotina e um complexo de Estreptavidina-Peroxidase. As placas foram analisadas (determinação OD) em um comprimento de onda de 450 nm com o uso de um fotômetro Anthos. Conforme mostrado na FIGURA 2, as três maiores concentrações de anticorpo inibiram, dependendo da dose, a ligação de RGM A humana de comprimento inteiro à Neogenina.

Os ensaios ELISA de fase sólida também foram usados para avaliar MAB 5F9 em ensaios de ligação competitivos hRGM A a BMP-4. As placas de ELISA foram preparadas e usadas conforme descrito na seção (iv) do presente pedido. Adicionou-se hRGM A em uma concentração de 0,5 pg/ml com anticorpos 5F9 durante 1 hora em 37°C. A MAB 5F9 foi usada nas seguintes concentrações: 1,25 pg/ml; 0,63 pg/ml; 0,32 pg/ml; 0,16 pg/ml; 0,08 pg/mi; 0,04 pg/ml; 0,02 pg/ml; 0,01 pg/ml.. A ligação de hRGM A foi visualizada utilizando-se um anticorpo anti-fc rotulado com Biotina e um complexo de Estreptavidina-Peroxidase. As placas foram analisadas (determinação OD) em um comprimento de onda de 450 nm com o uso de um fotômetro Anthos. Conforme mostrado na FIGURA 3, as quatro maiores concentrações de anticorpo inibiram, dependendo da dose, a ligação de RGM A humana de comprimento inteiro à BMP-4.

Os ensaios ELISA de fase sólida também foram usados para avaliar a inibição da ligação de MAB 5F9 de fragmento 0 (47 — 168) hRGM A a BMP-4. As placas de ELISA foram revestidas durante 1 hora a 37°C com uma concentração de 2,5 pg/ml da proteína BMP-4 recombinante humana. Adicionou-se a hRGM A de cadeia leve (fragmento 0, 47-168) em uma concentração de 0,5 pg/ml com anticorpos 5F9 durante 1 hora a 37°C. A MAB 5F9 foi usada nas seguintes concentrações: 1,25 pg/ml; 0,63 pg/ml; 0,32 pg/ml; 0,16 pg/ml; 0,08 pg/ml; 0,04 pg/ml; 0,02 pg/ml; 0,01 pg/ml.. A ligação de hRGM A foi visualizada utili-zando-se um anticorpo anti-fc rotulado com Biotina e um complexo de Estreptavidina-Peroxidase. As placas foram analisadas (determinação OD) em um comprimento de onda de 450 nm com o uso de um fotômetro Anthos. A FIGURA 4 descreve as concentrações de anticorpo de 1,25 pg/ml, 0,63 pg/ml e 0,32 pg/ml que inibem, dependendo da dose, a ligação da RGM A humana de cadeia leve à BMP-4.

Os ensaios ELISA de fase sólida também foram usados para avaliar a ligação de MAB 5F9 em ensaios de ligação competitivos hRGM A a BMP-2. As placas de ELISA foram preparadas e usadas conforme descrito na seção (v) do presente pedido. Adicionou-se hRGM A de comprimento inteiro em uma concentração de 0,5 pg/ml com anticorpos 5F9 durante 1 hora a 37°C. A MAB 5F9 foi usada nas seguintes concentrações: 5 pg/ml; 2,5 pg/ml; 1,25 pg/ml; 0,63 pg/ml; 0,32 pg/ml; 0,16 pg/ml. A ligação de hRGM A foi visualizada utilizando-se um anticorpo anti-fc rotulado com Biotina e um complexo de Estreptavidina-Peroxidase. As placas foram analisadas (determinação OD) em um comprimento de onda de 450 nm com o uso de um fotômetro Anthos. A FIGURA 5 descreve as concentrações de anticorpo de 5 pg/ml, 2,5 pg/ml, 1,25 pg/ml, 0,63 pg/ml que inibem, dependendo da dose, a ligação da RGM A humana de comprimento inteiro à BMP-2.

Os ensaios ELISA de fase sólida também foram usados para avaliar os ensaios de ligação MABs 5F9 e 8D1 em hRGM A - neogenina, hRGM A - BMP-2 e hRGM A - BMP-4. (FIGURA 9) Conforme descrito, as placas ELISA foram revestidas durante 1 hora a 37°C com uma concentração de 2,5 pg/ml do domínio extracelular da proteína de Neogenina hu- mana marcada por His ou com 2,5 pg/ml de Bmp-2 ou BMP-4. Adicionou-se hRGM A conjugado a fc de comprimento inteiro em uma concentração de 0,5 pg/ml com anticorpos durante 1 hora a 37°C. As MABs 5F9 e 8D1 foram usadas nas seguintes concentrações: 5 pg/ml; 2,5 pg/ml; 1,25 pg/ml; 0,63 pg/ml; 0,32 pg/ml; 0,16 pg/ml; 0,08 pg/ml. A ligação de hRGM A foi visualizada ütilizãhdo-se um anticorpo anti-fc rotulado com Biotina e um compíexo de Estreptavidina-Peroxidase. As placas foram analisadas (determinação OD) em um comprimento de onda de 450 nm com o uso de um fotômetro Anthos. Conforme mostrado na FIGURA 9, o anticorpo monoclonal 8D1 de ratos inibe ou reduz a ligação de RGM A humana a BMP-2 e a BMP-4, porém, não é capaz de inibir sua ligação à Neogenina.

Exemplo 3. Atividade de mAb 5F9 em ensaios de crescimento de neurite com agregados de neurônios NTera humanos diferenciados As células Ntera foram obtidas e submetidas à cultura conforme descrito na seção de Método (vi) do presente pedido. A mAb 5F9 neutralizou a atividade inibitória de crescimento de neurite da cadeia leve conjugada com fc potente aminoácidos 47 - 168) da proteína RGM A humana nos ensaios de crescimento de neurite com agregados de neurônios NTera humanos diferenciados. Conforme mostrado na FIGURA 6, na ausência de uma proteína RGM A inibitória ou fragmento e na presença da laminina de substrato de estímulo de crescimento, os agregados NTera neuronais mostram uma rede extensiva e densa de neuri-tes de crescimento (A). Conforme mostrado na FIGURA 6, a presença da cadeia leve de hRGM A reduz, dramaticamente, o número, a densidade e o comprimento de neurites NTe-ra, provando a atividade inibitória potente do fragmento hRGM A. As poucas neurites que deixam o agregado são curtas e intimamente entrelaçadas (B). As partes C-E da FIGURA 6 mostram concentrações crescentes da MAB 5F9, que adicionadas às culturas neutralizaram e depressaram, dependendo da dose, a atividade inibitória de crescimento de neurite do fragmento de cadeia leve hRGM A. Com maiores concentrações de MAB, o crescimento de agregados neuronais NTera é completamente restabelecido, apesar da presença do inibidor RGM A (C: 0,1 pg/ml MAB 5F9; D: 1 pg/ml MAB 5F9; E: 10 pg/ml MAB 5F9).

Realizou-se uma análise quantitativa da atividade neutralizante de MAB 5F9 em ensaios de crescimento de neurite com agregados NTera humanos com a finalidade de testar o fragmento inibitório de cadeia leve conjugado a fc potente (aminoácidos 47 - 168) da proteína RGM A humana. O crescimento das culturas foi automaticamente analisado tendo agregados coloridos com bisbenzimida e, subsequentemente, fotografados. A coloração apenas marcou o agregado e não as neurites em crescimento. No entanto, estas foram coloridas com um anticorpo a β3-ίυ6υΐίη3 e um anticorpo secundário rotulado com fluoroforo. O crescimento de neurite foi automaticamente determinado calculando-se o índice de crescimento de neurite, um índice determinado subtraindo-se a área dos corpos celulares da área colorida com β3-^υΝη8 do agregado e seus processos. Este fator foi, então, dividido pela área dos corpos celulares conforme descrito em Lingor et al. J. Neurochem. 103: 181 — 189, 2007. A FIGURA 7 mostra que a MAB 5F9 neutralizou, dependendo da dose (0,1-10,0 pg), a atividade inibitória de crescimento de um fragmento inibidor hRGM A conjugado com fc potente (fragmento 0, 47- 168; 10 pg) em ensaios de crescimento de neurite com agregados Ntera humanos.

Exemplo 4. Atividade de mAb 5F9 em faixas de hRGM A/ Coláqeno I.

As células SH-SY5Y foram submetidas á cultura e usadas conforme descrito na seção (vii) do presente pedido. As lamínulas de vidro em faixas com RGM A e colágeno I foram preparadas conforme descrito na seção (viii) do presente pedido. Um carpete com faixas alternadas de hRGM A/Colágeno I e Colágeno I foi produzido para os experimentos de acordo com um protocolo descrito na literatura (Knoell et al. Nature Protocols 2: 1216 -1224, 2007). Na ausência de 5F9 MAB (A), as células SH-SY5Y neuronais mostram uma preferência clara pela faixa de Colágeno I com mais de 90% das células preferindo as faixas de Colágeno I em relação às faixas de hRGM A. Com concentrações aumentadas de MAB 5F9, as células SH-SY5Y neuronais preferem as faixas de hRGM A em relação às faixas de Colágeno I (B-E). Na maior concentração de MAB usada (E), os neurônios SH-SY5Y mostram uma forte preferência pelas faixas de hRGM A em comparação âs faixas de Colágeno I (consulte a FIGURA 8). Isto pode ser interpretado como uma característica exclusiva da 5F9 MAB visto que transformou a natureza inibitória de RGM A em uma atividade atrativa. Na presença de concentrações crescentes de 5F9, as células neuronais preferem migrar e se desenvolver em um substrato RGM A, e não em um substrato permissivo como o Colágeno I. Esse recurso exclusivo nunca tinha sido descrito antes para um anticorpo monoclonal.

Exemplo 5: Construção de anticorpos enxertados com CDR

Aplicando-se métodos padrão bem conhecidos na técnica, as sequências CDR de cadeias VH e VL de anticorpo monoclonal 5F9 (consulte a Tabela 5 acima) são enxertadas em sequências aceptoras de cadeia pesada e leve humanas diferentes. Com base nos alinhamentos de sequência VH e VL com as sequências VH e VL de anticorpo monoclonal 5F9 da presente invenção, selecionam-se as seguintes sequências humanas conhecidas: a) VH3-48, VH3-33 e VH3-23 assim como as sequências de união hJH3, hJH4 e hJH6 para construir sequências aceptoras de cadeia pesada (de acordo com a tabela 3 acima); b) A17 e A18 assim como hJK2 para construir sequências aceptoras de cadeia leve (de acordo com a Tabela 4 acima).

Enxertando-se os CDRs VH e VL correspondentes de 5F9 nas ditas sequências aceptoras, prepararam-se as seguintes sequências VH e VL modificadas, humanizadas e enxertadas com CDR (consulte, também, a Tabela 6, acima): VH 5F9.1-GL, VH 5F9.2-GL, VH 5F9.3-GL, VH 5F9.4-GL, VH 5F9.5-GL, VH 5F9.6-GL, VH 5F9.7-GL, and VH 5F9.8-GL; VL 5F9.1-GL, VL 5F9.2-GL, e VL 5F9.3-GL.

Exemplo 6: Construção de retromutacões de estrutura em anticorpos enxertados com CDR

Com a finalidade de gerar retromutações de estrutura em anticorpos humanizados, as mutações são introduzidas nas sequências de anticorpo enxertado com CDR conforme preparado de acordo com o Exemplo 5, através de síntese de novo do domínio variável e/ou utilizando-se prímeres mutagênicos e PCR, e métodos bem conhecidos na técnica. As diferentes combinações de retromutações e outras mutações são construídas para cada um dos enxertos de CDR da seguinte forma.

Para cadeias pesadas VH 5F9.1-GL, VH 5F9.2-GL, e VH 5F9.3-GL, um ou mais dos seguintes resíduos de interface de Vernier e VH/VL são retromutados da seguinte forma: V37->l, V48->l, S49->G, e/ou R98-»K

Para cadeias pesadas VH 5F9.4-GL, VH 5F9.5-GL, e VH 5F9.6-GL, um ou mais dos seguintes resíduos de interface de Vernier e VH/VL são retromutados da seguinte forma: V37->l, V48->l, A49->G, R98-»K.

Para cadeias pesadas VH 5F9.7-GL, VH 5F9.8-GL, e VH 5F9.9-GL, um ou mais dos seguintes resíduos de interface de Vernier e VH/VL são retromutados da seguinte forma: V37->l, V48->l, S49->G.

As mutações adicionais incluem: para cadeias pesadas VH 5F9.1-GL, VH 5F9.2-GL, e VH 5F9.3-GL: D88-»A, para cadeias pesadas VH 5F9.4-GL, VH 5F9.5-GL, e and VH 5F9.6-GL: Q1-*E e para cadeias pesadas VH 5F9.7-GL, VH 5F9.8-GL, e VH 5F9.9-GL: L5-»V. para cadeias leves VL 5F9.1-GL, um ou mais dos seguintes resíduos de interface de Vernier e VH/VL são retromutados da seguinte forma: I2-^V, M4->L, Y41 ->F.

Para cadeia leve VL 5F9.2-GL, um ou mais dos seguintes resíduos de interface de Vernier e VH/VL são retromutados da seguinte forma: M4->L, R51~>L.

Para cadeia leve VL 5F9.3-GL, um ou mais dos seguintes resíduos de interface de Vernier e VH/VL são retromutados da seguinte forma: M4->L, Y41 ->F.

Exemplo 7: Construção e Expressão de Anticorpos anti RGMA Humanizados Re-combinantes Os vetores de expressão pHybE que hospedam cadeias pesadas e leves contendo retromutações de estrutura foram co-transfectados em células 293-6E com a finalidade de produzir, de modo transiente, anticorpos humanizados de comprimento inteiro, conforme descrito na seção ix anterior. As mutações foram introduzidas nas sequências de anticorpo enxertado com CDR conforme preparado de acordo com o Exemplo 5, através de síntese de novo do domínio variável e/ou utilizando-se prímeres mutagênicos e PCR, e métodos bem conhecidos na técnica. As sequências aminoacídicas das regiões VH e VL dos anticorpos humanizados são descritas na Tabela 8.

De modo específico, para as cadeias pesadas: VH 5F9.1, VH 5F9.5, e VH 5F9.9 contêm VH 5F9.4-GL com uma mutação Q1->E. VH 5F9.2, VH 5F9.6, VH 5F9.10, VH 5F9.19, VH 5F9.20, VH 5F9.21, e VH 5F9.22 contêm VH 5F9.4-GL com uma mutação Q1->E ê ãs seguintes retromutações de resíduo de interface de Vernier e VH/VL: V37^l, V48^l, A49^-G, R98-»K. VH 5F9.3, VH 5F9.7, e VH 5F9.11 contêm VH 5F9.7-GL com uma mutação L5->V. VH 5F9.4, VH 5F9.8, VH-5F9.12, VH 5F9.23, VH 5F9.24, VH 5F9.25, e VH 5F9.26 contêm VH 5F9.7-GL com uma mutação L5->V e as seguintes retromutações de resíduo de interface de Vernier e VH/VL: V37^l, V48-»l, S49^G.

Para as cadeias leves: VL 5F9.1, VL 5F9.2, VL 5F9.3, e VL 5F9.4 são idênticos a VL 5F9.1-GL. VL 5F9.5, VL 5F9.6, VL 5F9.7, e VL 5F9.8 são idênticos a VL 5F9.2-GL. VL 5F9.9, VL 5F9.10, VL 5F9.11, e VL 5F9.12 são idênticos a VL 5F9.3-GL. VL 5F9.19 e VL 5F9.23 contêm VL 5F9.2-GL com as seguintes retromutações de resíduo de interface de Vernier e VH/VL: M4-»L, R51-»L. VL 5F9.20 e VL 5F9.24 contêm VL 5F9.2-GL com a seguinte retromutação de resíduo de interface de Vernier e VH/VL: M4->L. VL 5F9.21 e VL 5F9.25 contêm VL 5F9.3-GL com as seguintes retromutações de resíduo de interface de Vernier e VH/VL: M4-*L, Y41 -»F. VL 5F9.22 e VL 5F9.26 contêm VL 5F9.3-GL com a seguinte retromutação de resíduo de interface de Vernier e VH/VL: M4-»L.

TABELA 8: EXPRESSÃO DE ANTICORPOS HUMANIZADOS

Exemplo 8: Caracterização de anticorpos 5F9 humanizados utilizando-se utilizam ELISA de competição As placas de ELISA (Costar 3369) foram revestidas de um dia para o outro a 4°C com 50 μΙ/poço de 0,25pg/ml hRGMA em 0,2 M de tampão de carbonato-bicarbonato de sódio, pH 9,4, lavadas com Tampão de Lavagem (PBS contendo 0,1% de Tween 20), e bloqueadas durante 1 hora em temperatura ambiente com 200 μΙ/poço de 2% de leite em pó desnatado em PBS. Após a lavagem com o Tampão de Lavagem, adicionou-se, em duplicata, uma mistura de um 5F9 quimérico biotinilado (0,1 pg/ml de final concentração) e um anticorpo de teste competidor não-rotulado iniciando em 50 pg/ml de final concentração e serialmente diluído 5 vezes em 50 pl/poço de tampão de ELISA. Após a incubação das placas durante 1 hora em temperatura ambiente, e a lavagem com Tampão de Lavagem, os anticorpos ligados foram detectados utilizando-se 100 μΙ/poço de 1:10.000 de diluição de estrep-tavidina conjugada com HRP (Fitzgerald) em tampão de ELISA. Após a incubação durante 1 hora em temperatura ambiente, e a lavagem com Tampão de Lavagem, realizou-se um desenvolvimento de cor mediante a adição de 100 μΙ/poço de Tampão TMB (Zymed). Após a incubação durante 15 minutos em temperatura ambiente, interrompeu-se o desenvolvimento de cor mediante a adição de 50 μΙ/poço de 1N de ácido hidroclórico. A absorbância foi lida em 490 nm. A tabela 9 mostra os valores IC50 de anticorpos 5F9 humanizados obtidos utilizando-se o software computacional GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA).

TABELA 9: VALORES IC50 PE ANTICORPOS 5F9 HUMANIZADOS EM ELISA COMPETITIVA

Exemplo 9: Determinações de afinidade de anticorpos quiméricos e humanizados utilizando-se tecnologia BIACORE O ensaio BIACORE (Biacore, Inc, Piscataway, NJ, EUA) determina a afinidade de anticorpos com medições cinéticas de constantes de taxa para associação e constantes de taxa para dissociação. A ligação de anticorpos à RGMA humana purificada recombinante foi determinada por medições baseadas em ressonância plasmônica superficial com um instrumento Biacore® 3000 (Biacore® AB, Uppsala, Suécia) utilizando-se HBS-EP (10 mM HEPES [pH 7,4], Ύ50 mM de NaCI, 3 mM de EDTA, e 0,005% de tensoativo Ρ20) a 25°C. Todos os elementos químicos foram obtidos junto a Biacore® AB (Uppsala, Suécia). Aproximadamente 5000 RU de IgG anti-humano de cabra, (Fcy), anticorpo policlonal de fragmento específico (Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL, EUA) diluídos em 10 mM de acetato de sódio (pH 4,5) foram diretamente imobilizados através de um chip biossensorial de grau de pesquisa CM5 que utiliza um kit de acoplamento de amina padrão de acordo com as instruções e procedimentos do fabricante em 25 pg/ml. As porções não-reagidas na superfície do biossensor foram bloqueadas com etanolamina. A superfície de dextrano carboximetil modificado em fluxo celular 2 e 4 foi usada como uma superfície de reação. O dextrano carboximetil não-modificado sem IgG anti-humano de cabra em fluxo celular 1 e 3 foi usado como a superfície de referência. Os anticorpos purificados foram diluídos em uma solução salina tamponada HEPES para captura através das superfícies de reação específicas IgG anti-humano de cabra. Os anticorpos humanos a serem capturados como um ligante (25 pg/ml) foram injetados pelas matrizes de reação em uma taxa de vazão de 5 μΙ/min. As constantes da taxa para associação e dissociação, k0„ (unidade M~1s~1) e koff (unidade s'1) foram determinada sob uma taxa de vazão contínua de 25 μΙ/min. As constantes de taxa foram derivadas realizando-se medições de ligação cinética em dez concentrações de antígeno diferentes que variam de 0,39 a - 50 nM. Para análise cinética, as equações de taxa derivadas do modelo de ligação Langmuir 1:1 foram simultaneamente ajustadas às fases de associação e dissociação de todas as oito injeções (utilizando-se análise de ajuste global) com o uso do software Biaevaluation 4.0.1. A constante de dissociação de equilíbrio (unidade M) da reação entre os anticorpos humanizados e a RGMA humana purificada recombinante foi, então, calculada a partir das constantes de taxa cinética pela seguinte fórmula: KD = k0ff/k0l1.

TABELA 9: AFINIDADE DE ANTICORPOS MONOCLONAIS QUIMÉRICOS E ANTI-RGMA HUMANIZADOS

Exemplo 10: os anticorpos 5F9 humanizados neutralizam a atividade quimio- repulsiva de RGM A humana em um ensaio de quimiotaxia SH-SY5Y neuronal. O ensaio de quimiotaxia mede o comportamento quimiotático de células em resposta a fatores difusíveis que podem exercer atividades quimio-atrativas e quimio-repulsivas. A RGM A foi descrita como uma proteína que age tanto na ligação de membrana (repulsão dependente de contato) e em forma difusível solúvel (quimio-repulsiva) e, portanto, foi avaliada em um ensaio de quimiotaxia hRGM A. Nesse sentido, as células SH-SY5Y de neuro-blastoma humano sensível à RGM A, que transportam a Neogenina receptora RGM foram usadas (Schaffar et al. J. Neurochemistry: 107:_418 - 431, 2008). As células SH-SY5Y foram desenvolvidas em um meio de Solução Salina Balanceada de Earle/F12 (EBSS/F12) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de aminoácidos não-essenciais (MEM-NEAA). Para indução de crescimento de neurite, as células foram submetidas à cultura no meio suplementado com 10 μΜ de ácido retinóico (RA). De 5 a 6 horas depois, as células foram tripsinizadas e contadas para colocação em Boyden Chambers com 24 poços (BD Falcon 351185, HTS Multiwell System). Adicionaram-se 500 pl da suspensão celular (correspondente a 1x105 células) ao círculo interno de cada poço. Este círculo interno é separado do círculo externo maior de cada poço por uma membrana PET com diâmetro de poro de 8 pm. Pipetaram-se 600 μΙ de meio +/- RGM A +/- anticorpos no círculo externo e as células foram cultivadas no Multiwell Boyden Chambers de um dia para o outro a 37°C. Após a incubação, o meio foi aspirado e substituído pelo íixativo (2% de paraformaídeído. Deu-se continuidade à fixação durante 2 horas em temperatura ambiente e após várias etapas de lavagem com PBS, realizou-se permeabilização utilizando-se PBS contendo 0,1% de Triton-X-100 (15 minutos, temperatura ambiente). A colocação das células foi realizada incubando-as durante 1 hora no escuro em uma solução de Alexa Fluor 488 Phalloidin 1:100 (Invitrogen A12379) e Bisbenzimida (H332456) 1: 100. Após 2 etapas de lavagem com PBS, as culturas foram carregadas por PBS, vedadas por parafilme e armazenadas no escuro para a análise com um microscópio de fluorescência (Zeiss Axiovert).

Na ausência de hRGM A, as células migram através dos poros de membrana e podem ser contadas após a fixação e a coloração. Apenas essas células contadas são fixadas à parte inferior da membrana, porque essas células migraram através da membrana PET. As células na parte superior da membrana foram cuidadosamente removidas antes do procedimento de fixação. Este ensaio de quimiotaxia provou que a presença de hRGM A reduziu significativamente o número de células SH-SY5Y que migram através da membrana por mais de 80%. O 5F9 monoclonal de ratos, o 5F9 de ratos quimérico humano e o 5F9 humanizado, mas não um anticorpo monoclonal de ratos de controle de isotipo (p21) neutralizaram parcial ou completamente a atividade quimio-repulsiva de hRGM A em 10 pg/ml, foram manifestados como grandes números de células encontradas na parte inferior da membrana (FIGURA 10).

Exemplo 11: 5F9 inclui regeneração de axônios ópticos esmagados e danificados em um modelo de ratos de lesão do nervo óptico O modelo de Esmagamento Nervoso Óptico (ou Lesão do Nervo Óptico) proporciona um modelo animai para testar várias substâncias que estimulam a regeneração das fibras de nervo óptico e reduz a morte em massa de células de células de gânglio retinal.

Os experimentos foram realizados em ratos Sprague Dawley machos adultos e ratos Wistar machos obtidos a partir de Charles River (D) Laboratories (Alemanha). Os animais são mantidos em gaiolas únicas em um círculo de luz/escuro 12:12 h com alimento e água ad libitum. O esmagamento de nervo óptico é realizado sempre apenas no olho esquerdo através de cirurgia anterior mínima. Este é um método minimamente invasivo de lesão do nervo óptico e foi desenvolvido, de acordo com métodos cirúrgicos visuais anteriores humanos. Antes e durante o procedimento operacional, os animais foram anestesiados por anestesia de inalação utilizando-se Sevoflurano (Abbott GmbH Co. & KG, Delkenheim, Alemanha) e são fixados na mesa de operação utilizando-se grampos e fita adesiva para os membros. Evita-se uma queda na temperatura corpórea posicionando-se os animais em uma almofada de aquecimento. Para cirurgia de esmagamento anterior do nervo óptico do rato, removem-se cuidadosamente os ligamentos e o tecido conjuntivo do olho esquerdo. Como uma primeira etapa, realiza-se um corte micro-cirúrgico (2-3 mm) do tecido adjacente no canto externo do olho. Então, o nervo óptico é exposto utilizando-se um par de fórceps para mover lateralmente os músculos do olho e a glândula lacrimal, reservando-o. Na próxima etapa, as meninges foram longitudinalmente abertas utilizando-se microtesouras para expor o nervo óptico.

Isto resulta em uma maior mobilidade do olho e permite uma rotação lateral do olho e acessar seu nervo óptico esquerdo. O nervo óptico é lesionado aproximadamente 1-3 mm atrás do olho, utilizando-se um par de fórceps ajustado para proporcionar uma pressão máxima fixa durante 20-30 segundos. Toma-se um cuidado especial para não danificar o suprimento vascular do olho.

Administração local de anticorpos e solução tampão.

Após a lesão por esmagamento do nervo óptico, os ratos Sprague Dawley machos foram localmente tratados com anticorpo 5F9 (n = 10 animais), com o anticorpo de controle 8D1 (n = 10 animais) ou com um controle de veículo PBS (n = 10 animais). As pessoas que conduziram o teste desconheciam os diferentes grupos de tratamento. Para uma aplicação de anticorpo local, pequenos pedaços de espuma de gel (comprimento: 2,5 mm, largura: 2,5 mm, altura: 2,5 mm) foram embebidos com 20 pl de uma solução de anticorpo de 10 mg/ml ou com 20 pl de PBS e foram diretamente colocados adjacentes ao sítio da lesão do nervo óptico. Após a cirurgia invasiva mínima e a aplicação de anticorpos, os animais foram colocados em toalhas de papel na gaiola limpa ajustada em uma temperatura mais quente de modo a controlar a temperatura corporal até que os animais voltassem a se movimentar. Uma pomada que contém antibiótico (Gentamytrex, Dr. Mann Pharma) foi aplicada no olho de modo a evitar infecção bacteriana e secar totalmente a esclera. Aplicou-se carprofen (Rimadyl, 5 mg/kg, Pfizer GmbH, Karlsruhe, Alemanha) intraperitonealmente para terapia de dor pós-operatória diretamente após a cirurgia e, então, duas vezes ao dia durante um período de 3 dias. Os animais foram observados e controlados regularmente durante várias horas diretamente após a cirurgia e nos próximos dias de modo a garantir que todos os animais sobreviveram e se recuperaram da anestesia e da cirurgia. Cinco semanas após a cirurgia e a aplicação de anticorpo/veículo, os animais foram anestesiados com uma overdose de Narcoren (40 - 60 mg/kg) e injetou-se uma solução de 4% de paraformaldeído no coração. Os nervos foram isolados e transferidos em uma solução de 4% de paraformaldeído durante 1 hora em temperatura ambiente de modo a garantir uma fixação apropriada do tecido. Após a pós-fixação, os nervos ópticos do rato foram armazenados de um dia para o outro em uma solução de 30% de sacarose (4°C). No dia seguinte, os nervos ópticos foram incrustados em Tissue Tek, congelados e realizaram-se seções longitudinais com uma espessura de 16 pm com o uso de um criostato.

Para imunocolocações, as seções de nervo óptico foram fixadas com acetona gelada (-20°C) (10 minutos), lavadas 3x (5 minutos) com uma solução salina Tris tamponada (TBS, Fluka 93312) e bloqueadas e permeabilizadas com TBS, contendo 5% de albumina sérica bovina e 1% de Triton-X-100 (30 minutos), em temperatura ambiente). Removeram-se o BSA residual e o detergente através de 2 etapas de lavagem separadas (5 minutos cada) com TBS. As seções foram incubadas durante 1 hora em temperatura ambiente com um anticorpo anti-GAP-43 policlonal de coelhos (Abcam, ab 7562) diluído 1:100 em 5% de solução BSA/TBS. Após 3 etapas de lavagem com TBS, 0,1% Tween, as seções foram incubadas durante 1 hora em temperatura ambiente com um anticorpo secundário de cabra anti-coelho cabra conjugado com Alexa Fluor 488 (Molecular Probes A11034), diluído 1:1000 em 5% de BSA/TBS, contendo uma diluição 1:100 de Bisbenzimid (H33258, 50 pg/ml) para visualizar os núcleos celulares. Antes da incrustação, as seções coloridas foram lavadas 3 vezes com TBS 0,1% Tween (5 minutos cada etapa) e com água destilada. As seções foram incrustadas em Fluoromount G, revestidas por uma lamínula e armazenadas no escuro para documentação microscópica.

Utilizando-se um microscópio de fluorescência Zeiss, as imagens (FIGURA 11) de seções longitudinais coloridas foram armazenadas com o uso de um software Zeiss Axiovi-son. Montaram-se imagens únicas de cada nervo para análise utilizando-se o software Photoshop Image Analysis (Adobe). Realizou-se uma análise quantitativa de duas formas diferentes utilizando-se as imagens compósitas dos nervos ópticos. A área positiva GAP-43 no sítio de lesão foi medida utilizando-se o software Axiovision (FIGURA 12B). Independente- mente da primeira análise quantitativa, as fibra únicas de regeneração (GAP-43 positiva) foram contadas em 4 áreas diferentes: 0 - 200 pm, 200 - 400 pm, 400 - 600 pm e 600 - 1200 pm além do sítio de esmagamento. A análise de dados e a avaliação estatística dos dados foram realizadas com o auxílio do software Graphpad Prism. (FIGURA 12A) Administração sistêmica de anticorpos e solução tampão Para uma distribuição sistêmica de anticorpos, os ratos Wistar machos foram sis-temicamente tratados (intraperitonealmente, ip ou intravenosamente, iv) com anticorpos 5F9 (n = 10 animais) ou com um controle de veículo PBS (n = 10 animais). Os animais foram injetados duas vezes e as injeções foram realizadas no dia 0 pouco após a indução do esmagamento do nervo e no dia 21 após o esmagamento. As doses de anticorpos administradas foram 2 mg/kg no dia 0 e 10 mg/kg no dia 21. Os animais foram mortos cinco semanas após a lesão por esmagamento e isolamento tecidual, as preparação de seções, colorações e análise quantitativa foram realizados conforme descrito anteriormente. Como anteriormente, as pessoas que conduziram o teste desconheciam os dois grupos diferentes de tratamento. As imagens compósitas dos nervos ópticos dos ratos são mostradas na FIGURA 13. Nos animais tratados com 5F9 (A), muitas fibras positivas GAP-43 se estendem além do sítio de esmagamento em contraste aos animais de controle tratados com PBS (B). O sítio de esmagamento está localizado na margem esquerda e as fibras de regeneração são coloridas com um anticorpo para GAP-43. Observam-se muitas fibras na borda superior e inferior do nervo óptico em animais tratados com 5F9, mas não em animais PBS. O anticorpo 5F9, mas não o controle de veículo PBS aumentou significativamente o número de regenerações das fibras positivas GAP-43. Encontraram-se significativamente mais fibras (p < 0,001) em animais tratados com 5F9 em distâncias de 300 pm a 1800 pm, em relação aos animais tratados com veículo. Os animais foram tratados com 5F9 no dia 0 e d21 com 2 mg/kg e 10 mg/kg, respectivamente. O anticorpo ou o veículo foram administrados intraperitoneal ou intravenosamente. Os dados foram provenientes da análise de 9 animais por grupo. Analisaram-se 3 séries de seções de criostato por animal. (FIGURA 14A) Em um segundo experimento, os ratos Wistar machos foram tratados pós a lesão do nervo óptico sistemicamente (iv) com anticorpo 5F9 (n = 10 animais), com o anticorpo de controle 8D1 (n = 10 animais) ou com o controle de veículo PBS (n = 10 animais). Os ratos foram injetados uma vez por semana com 2 mg/kg de anticorpo dado em iv e as injeções foram iniciadas imediatamente após o esmagamento do nervo óptico. Todos os ratos receberam 4 injeções e os animais foram eutanasiados 5 semanas após a lesão por esmagamento. As pessoas que conduziram o teste desconheciam o processamento tecidual e a análise quantitativa foi realizada conforme descrito anteriormente. O anticorpo 5F9, mas não o controle de veículo PBS aumentou significativamente o número de regenerações das fibras positivas GAP-43. Encontraram-se significativamente mais fibras (p < 0,001) e, animais tratados com 5F9 em distâncias de 200 μηη a 1400 μηι, em relação aos animais tratados com veículo ou anticorpo de controle. Os animais foram tratados iv uma vez por semana durante 4 semanas iniciando no dia 0 com 5F9 (2 mg/kg por dose), com o anticorpo de controle 8D1 (2 mg/kg por dose) ou com PBS. (FIGURA 14B).

Exemplo 11: 5F9 induz a remielinizacão de axônios de nervo óptico esmagados e danificados em um modelo de ratos de lesão do nervo óptico Um marcador para oligodentrócitos e mielina consiste em uma proteína básica de mielina (MBP). Um anticorpo voltado contra a MBP foi usado para responder a questão se ocorreram diferenças na remielinização nos diferentes grupos de tratamento. Com a finalidade de visualizar o processo de remielinização, as seções de nervo óptico de animais sis-temicamente tratados foram fixadas com acetona gelada (-20°) (10 minutos), lavadas 3x (5 minutos) com solução salina Tris tamponada (TBS, Fluka 93312) e bloqueadas e permeabi-lizadas com TBS, contendo 5% de albumina sériva bovina e 1% de Triton-X-100 (30 minutos), em temperatura ambiente). Removeram-se o BSA residual e o detergente através de 2 etapas de lavagem separadas (5 minutos cada) com TBS. As seções foram incubadas durante 3 horas de um dia para o outro a 4°C com um anticorpo anti-MBP policlonal de coelhos (Abcam, ab 2404) diluído 1:50 em 5% de solução BSA/TBS. Após 3 etapas de lavagem com TBS, 0,1% Tween, as seções foram incubadas durante 1 hora em temperatura ambiente com um anticorpo secundário de cabra anti-coelho cabra conjugado com Alexa Fluor 488 (Molecular Probes A11034), diluído 1:1000 em 5% de BSA/TBS, contendo uma diluição 1:100 de Bisbenzimid (H33258, 50 pg/ml) para visualizar os núcleos celulares. Antes da in-crustação, as seções coloridas foram lavadas 3 vezes com TBS 0,1% Tween (5 minutos cada etapa) e com água destilada. As seções foram incrustadas em Fluoromount G, revestidas por uma lamínula e armazenadas no escuro para documentação microscópica.

Utilizando-se um microscópio de fluorescência Zeiss, as imagens de seções longitudinais coloridas foram armazenadas com o uso de um software Zeiss Axiovison. Montaram-se imagens únicas de cada nervo para análise utilizando-se o software Photoshop Ima-ge Analysis (Adobe). Realizou-se uma análise quantitativa de duas formas diferentes utili-zando-se as imagens compósitas dos nervos ópticos. A área positiva MBP no sítio de lesão foi medida utilizando-se o software Axiovision. A análise de dados e a avaliação estatística dos dados foram realizadas com o auxílio do software Graphpad Prism.

Os animais foram tratados com 5F9 no dia 0 e d21 com 2 mg/kg e 10 mg/kg, respectivamente. O anticorpo ou veículo foram administrados intraperitoneal ou intravenosa-mente. Imagens compósitas dos nervos ópticos de ratos. A mielinização é visualizada utilizando-se um anticorpo voltado contra o marcador de mielina de proteína básica de mielina MBP. Os sítios de esmagamento estão localizados na parte intermediária dos nervos compósitos e a área está livre em animais de controle tratados com veículo (A e B). Nos animais tratados com 5F9 (C e D), muitas estruturas MBP positivas são observadas na área intermediária (centro de esmagamento) dos nervos ópticos. (FIGURA 15) A mielinização é visualizada utilizando-se um anticorpo voltado contra o marcador de mielina de proteína básica de mielina MBP. A área MBP foi medida utilizando-se o Software Zeiss Axiovison. O M1 e M2 são duas medições independentes e M é a média medida da área MPB positiva. O anticorpo 5F9 aumenta significativamente (p < 0.001 versus o controle de veículo) a área MBP do sítio de esmagamento do nervo óptico por um fator de 3,5. (FIGURA 16).

Claims

1. Proteína de ligação que se dissocia da RGM A humana com um KD de 1 x 10'7 M ou inferior e uma taxa k0ffde 1 x 10'2 s"1 ou inferior, CARACTERIZADA pelo fato de serem ambas determinadas por ressonância plasmônica superficial, em que a proteína de ligação é selecionada a partir de um: Anticorpo monoclonal; Anticorpo quimérico; Anticorpo CDR-enxertado; Anticorpo humanizado; Fab; Fab’; F(ab’)2; Fv; Fv dissulfeto ligado; scFv; Anticorpo de domínio simples; Diacorpo; Anticorpo multiespecífico; Anticorpo específico duplo; Imunoglobulina de domínio variável duplo; e Anticorpo biespecífico.

2. Proteína de ligação que se liga à RGM A humana e neutraliza a atividade inibitó-ria de crescimento de neurite de RGM A humana, CARACTERIZADA pelo fato de ser conforme determinado em um ensaio in vitro padrão.

3. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADA pelo fato de ter pelo menos uma das seguintes características funcionais adicionais: ligação à RGM A de ratos, ligação à RGM C humana, e ligação à RGM C de ratos.

4. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, sendo que a dita proteína de ligação modula a capacidade de a RGM se ligar à pelo menos um de seus receptores.

5. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita proteína de ligação interage com um domínio de ligação do receptor de RGM A humana.

6. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita proteína de ligação modula pelo menos uma das seguintes interações: ligação de RGM A humana à BMP-4 humana, ligação de hRGM A à Neogenina humana, ligação de hRGM C à Neogenin humana, ligação de RGM A humana à BMP-2 humana.

7. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADA pelo fato de que consiste em um anticorpo humanizado.

8. Proteína de ligação, de acordo com uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um domínio de ligação ao antígeno, sendo que a dita proteína de ligação é capaz de se ligar a um epítopo de uma molécula RGM, semdo que o dito domínio de ligação ao antígeno compreende pelo menos uma CDR que compreende uma sequência aminoacídica selecionada a partir do grupo que consiste em GTTPDY(SEQ ID NO: 59), FQATHDPLT(SEQ ID NO: 62), ARRNEYYGSSFFDY(SEQ ID NO: 65), LQGYIPPRT(SEQ ID NO: 68), e sequências aminoacídicas CDR modificadas tendo uma identidade de sequência de pelo menos 50% a uma das ditas sequências.

9. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende, ainda, pelo menos uma CDR que compreende uma sequência aminoacídica selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 57, 58, 60, 61, 63, 64, 66, 67 e sequências aminoacídicas CDR modificadas tendo uma identidade de sequência de pelo menos 50% a uma das ditas sequências.

10. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita pelo menos uma CDR compreende uma sequência aminoacídica selecionada a partir do grupo que consiste em:

11. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende pelo menos 3 CDRs que são selecionadas a partir de um conjunto CDR de domínio variável que consiste em: ou um conjunto de domínio variável onde pelo menos uma das ditas 3 CDRs consiste em uma sequência aminoacídica CDR modificada tendo uma identidade de sequência de pelo menos 50% à sequência principal.

12. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende pelo menos dois conjuntos de CDR de domínio variável, em que os ditos pelo menos dois conjuntos de CDR de domínio variável são selecionados a partir de um grupo que consiste em: Conjunto VH 5F9 e conjunto VL 5F9; e Conjunto VH 8D1 e conjunto VL 8D1.

13. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda uma estrutura aceptora humana e em que a dita estrutura aceptora humana compreende pelo menos uma sequência aminoa-cídica selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 e 33.

14. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um conjunto de sequência de estruturas selecionado a partir do grupo que consiste nos conjuntos: Conjunto VH3-48 (SEQ ID NO: 15, 16 e 17) Conjunto VH3-33 (SEQ ID NO: 21, 22 e 23) Conjunto VH3-23 (SEQ ID NO: 24, 25 e 26) sendo cada um desses conjuntos combinados com uma sequência de estrutura a-dicional, selecionada a partir de JH3 (SEQ ID NO:18), JH4 (SEQ IDNO-.19), JH6 (SEQ ID NO:20); ou selecionadas a partir do grupo que consiste nos conjuntos Conjunto A18: (SEQ ID NO: 27, 28 e 29) Conjunto A17: (SEQ ID NO: 31, 32 e 33) sendo cada um desses conjuntos combinados com uma sequência de estrutura a-dicional, selecionada a partir de JK2 (SEQ ID NO:2).

15. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende pelo menos um domínio variável de cadeia pesada selecionado a partir de SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, e 43; e/ou pelo menos um domínio variável de cadeia leve selecionado a partir de SEQ ID NO: 44, 45, e 46.

16. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita proteína de ligação compreende dois domínios variáveis, sendo que os ditos dois domínios variáveis têm sequências aminoacídicas selecionadas a partir de: SEQ ID NOs: 35 e 44; 36 e 44; 37 e 44; 38 e 44; 39 e 44; 40 e 44; 41 e 44; 42 e 44; 43 e 44; SEQ ID NOs: 35 e 45; 36 e 45; 37 e 45; 38 e 45; 39 e 45; 40 e 45; 41 e 45; 42 e 45; 43 e 45; SEQ ID NOs: 35 e 46; 36 e 46; 37 e 46; 38 e 46; 39 e 46; 40 e 46; 41 e 46; 42 e 46; 43 e 46;

17. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita estrutura aceptora humana compreende pelo menos uma substituição aminoacídica de região de estrutura em um resíduo principal, sendo que o dito resíduo principal é selecionado a partir do grupo que consiste em: um resíduo adjacente a uma CDR; um resíduo de sítio de glicosilação; um resíduo raro; um resíduo capaz de interagir com um epítopo RGM; um resíduo capaz de interagir com uma CDR; um resíduo canônico; um resíduo de contato entre a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve; um resíduo em uma zona de Vernier; um resíduo N-terminal capaz de formação de paraglutamato; e um resíduo em uma região que se sobrepõe entre uma CDR1 de cadeia pesada variável definida por Chotia e uma primeira estrutura de cadeia pesada definida por Kabat.

18. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito resíduo principal é selecionado a partir do grupo que consiste em (posição de sequência de cadeia pesada): 1, 5, 37, 48, 49, 88, 98 (posição de sequência de cadeia leve): 2, 4, 41, 51.

19. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita proteína de ligação compreende pelo menos um domínio variável (estrutura mutada) tendo uma sequência aminoacídica selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50; SEQ ID NO: 51, 52, 53, e 54.

20. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita proteína de ligação compreende dois domínios variáveis, sendo que os ditos dois domínios variáveis têm sequências aminoacídicas selecionadas a partir dos grupos que consistem em: SEQ ID NOs: 47 e 44; 47 e 45; 47 e 46; 47 e 51; 47 e 52; 47 e 53; 47 e 54; SEQ ID NOs: 48 e 44; 48 e 45; 48 e 46; 48 e 51; 48 e 52; 48 e 53; 48 e 54; SEQ ID NOs: 49 e 44; 49 e 45; 49 e 46; 49 e 51; 49 e 52; 49 e 53; 49 e 54; SEQ ID NOs: 50 e 44; 50 e 45; 50 e 46; 50 e 51; 50 e 52; 50 e 53; 50 e 54.

21. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADA pelo fato de ser capaz de se ligar à RGM A humana.

22. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADA pelo fato de ter pelo menos uma das seguintes características funcionais adicionais: ligação à RGM A de ratos, ligação à RGM C humana, ligação à RGM C de ratos.

23. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de ligação é capaz de modular uma função biológica das moléculas RGM por ligação à pelo menos um de seus receptores.

24. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita proteína de ligação modula pelo menos uma das seguintes interações: ligação de RGM A humana à BMP-4 humana, ligação de hRGM A à Neogenina humana, ligação de hRGM C à Neogenin humana, ligação de RGM A humana à BMP-2 humana.

25. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita proteína de ligação é capaz de inibir uma atividade biológica RGM A.

26. Construção de anticorpos que compreende uma proteína de ligação como definida em qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita construção de anticorpos compreende, ainda, um polipeptídeo de ligação ou um domínio constante de imunoglobulina e em que a dita proteína de ligação é selecionada a partir do grupo que consiste em: uma molécula de imunoglobulina, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo enxertado com CDR, um anticorpo humanizado, um Fab, um Fab’, um F(ab’)2, um Fv, um Fv ligado à bissulfeto, um scFv, um anticorpo de domínio único, um diacorpo, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo específico duplo, uma imunoglobulina de domínio variável duplo, e um anticorpo biespecífico.

27. Construção de anticorpos, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita proteína de ligação compreende um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina selecionado a partir do grupo que consiste em; um domínio constante de IgM humana, um domínio constante de lgG1 humana, um domínio constante de lgG2 humana, um domínio constante de lgG3 humana, um domínio constante de lgG4 humana, um domínio constante de IgE humana, um domínio constante de IgD humana, um domínio constante de lgA1 humana, um domínio constante de lgA2 humana, um domínio constante de IgY humana, e domínios mutados correspondentes.

28. Construção de anticorpos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 27, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um domínio constante de imunoglobulina tendo uma sequência aminoacídica selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 11, 12, 13 e 14.

29. Conjugado de anticorpos que compreende uma construção de anticorpos, como definido em qualquer uma das reivindicações 26 a 27, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito conjugado de anticorpos compreende, ainda, um agente selecionado a partir do grupo que consiste em; uma molécula de imunoadesão, um agente de formação de imagem, um agente terapêutico, e um agente citotóxico.

30. Conjugado de anticorpos, de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito agente consiste em um agente de formação de imagem selecionado a partir do grupo que consiste em um radio-marcador, uma enzima, um marcador fluorescente, um marcador luminescente, um marcador bioluminescente, um marcador magnético, e biotina.

31. Conjugado de anticorpos, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito agente consiste em um agente terapêutico ou citotóxico selecionado a partir do grupo que consiste em; um antimetabólito, um agente de alquilação, um antibiótico, um fator de crescimento, uma citocina, um agente anti-angiogênico, um agente antimitótico, uma antraciclina, uma toxina, e um agente apoptótico.

32. Ácido nucléico isolado CARACTERIZADO pelo fato de que codifica (i) uma sequência de aminoácidos de proteína de ligação como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 25; (ii) uma sequência de aminoácidos de construção de anticorpos como definida em qualquer uma das reivindicações 26 a 28; ou uma sequência de aminoácidos de conjugado de anticorpos como definida em qualquer uma das reivindicações 29 a 31.

33. Vetor, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um ácido nucléico isolado como definido na reivindicação 32.

34. Vetor, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito vetor é selecionado a partir do grupo que consiste em pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV, pHybE, e pBJ.

35. Célula hospedeira que compreende um vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 33 e 34, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita célula hospedeira é uma célula procariótica ou a dita célula hospedeira é uma célula eucariótica geneticamente modificada.

36. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita célula hospedeira é E.coli.

37. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita célula hospedeira geneticamente modificada é selecionada a partir de células HEK, células CHO, células COS e células de levedura geneticamente modificadas.

38. Método de produção de uma proteína capaz de se ligar à RGM, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende submeter uma célula hospedeira como definida em qualquer uma das reivindicações 35 a 37 à cultura, em um meio de cultura sob condições suficientes para produzir uma proteína de ligação capaz de se ligar à RGM.

39. Proteína, CARACTERIZADA pelo fato de ser produzida conforme o método definido na reivindicação 38.

40. Composição farmacêututica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o produto definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31 e um veículo farmaceutica-mente aceitável.

41. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADA pelo fato de o dito veículo farmaceuticamente aceitável funciona como um adjuvante útil para aumentar a absorção, ou dispersão da dita proteína de ligação.

42. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 41, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende pelo menos um agente terapêutico adicio- nal destinado ao tratamento de um distúrbio no qual a atividade RGM é prejudicial.

43. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 42, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito agente adicional é selecionado a partir do grupo que consiste em: agentes terapêuticos, agentes de formação de imagem, agentes citotóxi-cos, inibidores de angiogênese; inibidores de quinase; bloqueadores de moléculas coestimu-latórias; bloqueadores de molécula de adesão; anticorpos anti-citocina ou fragmentos funcionais destes ou; metotrexatos; ciclosporinas; rapamicinas; FK506; marcadores ou repórteres detectáveis; um antagonista TNF; um agente antirreumático; um relaxante muscular, um narcótico, um fármaco antiinflamatório não-esteróide (NSAID), um analgésico, um anestésico, um sedativo, um anestésico local, um bloqueador neuromuscular, um agente antimicro-biano, um agente antipsoriático, um corticosteróide, um esteróide anabólico, uma eritropoie-tina, uma imunização, uma imunoglobulina, um imunossupressor, um hormônio de crescimento, um fármaco de substituição hormonal, um agente radiofarmacêutico, um antidepres-sivo, um antipsicótico, um estimulante, uma medicação contra asma, um beta-agonista, um esteróide inalável, uma epinefrina ou análogo, uma citocina, e um antagonista de citocina.

44. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o produto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31 para uso (i) na redução da atividade de RGM A humana; (ii) redução da ligação de hRGM A ao receptor de Neoge-nina em um indivíduo em necessidade; ou (iii) redução da ligação de hRGM A à proteína morfogenética óssea-2 e à proteína morfogenética óssea-4 (BMP-2 e BMP-4) em um indivíduo em necessidade.

45. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o produto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 31 sozinho ou compreendendo ainda outros agentes terapêuticos para uso (i) no tratamento de um distúrbio associado à atividade de RGM A; ou (ii) na redução da atividade de RGM A em um indivíduo que sofra de um distúrbio no qual a atividade de RGM A é prejudicial.

46. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 45, CARACTERIZADA pelo fato de que o distúrbio compreende doenças neurológicas selecionadas a partir do grupo que compreende Esclerose Lateral Amiotrófica, Lesão do Plexo Braquial, Lesão Cerebral, que inclui lesão cerebral traumática, Paralisia Cerebral, Síndrome de Guillain Barre, Leucodistrofias, Esclerose Múltipla, Pós-Pólio, Espinha Bífida, Lesão da Medula Espinhal, Atrofia Muscular Espinhal, Tumores Espinhais, Derrame, Mietile Transversa; demência, demência senil, deficiência cognitiva leve, demência relacionada a Alzheimer, Coréia de Huntington, discinesia tardia, hipercinesias, manias, Morbus Parkinson, síndrome de steel-Richard, síndrome de Down, miastenia grave, trauma nervoso, amiloidose vascular, hemorragia cerebral I com amiloidose, inflamação cerebral, distúrbio de confusão mental aguda, esclerose lateral amiotrófica, glaucoma e doença de Alzheimer.