WO1997019111A2 - Anticuerpos monoclonales anti-cd6 y sus utilizaciones - Google Patents

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Rolando Perez Rodriguez
Patricia Sierra Blazquez
Blanca Rosa Tormo Bravo
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Definitions

  • the present invention relates to the branch of immunology and in particular to obtaining pharmaceutical compositions containing a monoclonal antibody that recognizes the CD6 leukocyte differentiation antigen.
  • the murine mAbs directed against molecules expressed in the cell membrane of human T lymphocytes have contributed to improve the diagnosis of clinical entities where the functional defect lies in these cells, they have also been used to explore new therapeutic approaches, with the interest of modulating their activity functional as it is in Transplant Rejection, Graft versus Host Disease (GvHD) and Autoimmune Diseases (Waldmann, TA (1991) Science 252: 1657; Waldmann, TA (1992) Annu. Rev. Immunol. 10: 675).
  • CD6 is a poorly characterized molecule. It is known to be a glycoproin that exists in two molecular forms that remain in dynamic equilibrium and differ only in the degree of phosphorylation. In resting T lymphocytes it is a 105 kDa phosphorylated molecule and in activated cells a hyperphosphorylated 130 kDa form (Cárdenas, L. et al. (1990) J. Immunol. 145: 1450; Swack, JA et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 7137), member of a family of membrane receptors and secretory proteins with characteristic structure (Kodama, T. et al. (1990) Nature 343: 531; Aruffo, A.
  • CD6 The role of CD6 in the ontogeny of T cells is unknown, as well as its possible role in the pathophysiology of diseases of different etiologies.
  • ALCAM Activated Leukocyte-Cell Molecule Adhesion
  • the Murino ior ti Monoclonal Antibody of the IgG2a isotype classified as anti-CD6 in the IV International Workshop of Leukocyte Differentiation Antigens in Vienna (1989), defines an epitope different from those recognized by other anti-CD6 mAbs that is stable and insensitive to reducing agents, possibly located in the primary structure of the CD6 molecule (Osorio, LM et al. (1994) Cell. Immunol. 154: 123).
  • This Monoclonal Antibody has a lower recognition than other anti CD3 in peripheral mononuclear cells of healthy individuals;
  • the recognition of ior ti in human cell lines in culture of T origin is in Jurkat 47%, Molt-4 (23%), CCRF-CEM (does not recognize it); of origin B in Raji (9%), erythroblastoid origin K-562 (12%) and myelomonocytic U-937 (9%), as well as recognizes cells:: peripheral cnuclear of patients with Chronic Lymphocytic Leukemia B (89 + 4 %) (Garc ⁇ a, CA et al. (1992) Applied Biotec. 9 (1): 70) and lymphocytes from skin lesions of patients with Cutaneous T-cell Lymphomas (Rodr ⁇ guez, T. et al. (1985) Interferón and Biotec. 2 (1): 41).
  • Pso r iasis is a disease whose pathophysiology is undefined (Hunziker, T. et al. (1993) Ther. Umsch. 50 (2): 110; Eider, JT et al. (1994) J. In ⁇ est. Dermatol. 102 (6): 24S); It is characterized by presenting an inflammatory infiltrate in the target organ with a predominance of activated T lymphocytes with CD4 + and CD8 + phenotype (Chang, JCC et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci.
  • Spontaneous remission of Psoriasis can be predicted if the number of T cells in the skin decreases, so it is suggested that they play an important role in perpetuating the disease by releasing soluble immune response mediators capable of inducing keratinocyte proliferation, responsible for the clinical manifestations of the disease.
  • the novelty of the present invention consists in providing topical and systemic pharmaceutical compositions containing an anti-CD6 monoclonal antibody, obtaining a humanized anti-CD6 monoclonal antibody and the therapeutic application of the pharmaceutical compositions in patients with Vulgar Psoriasis, using different routes of administration. and in different clinical forms of the disease.
  • the anti-CD6 Monoclonal Antibody can be purified from ascites liquid by Protein A Sepharose, diluted with equal volume of 1.5M Glycine Buffer, 3M NaCl pH 8.9; balancing the matrix with that same buffer and applying the same volume of ascites as a buffer should be eluted at a flow rate of 50 mL / h.
  • the column is washed overnight to zero baseline, with the same application buffer.
  • the column is subsequently washed with 0.1 M Citric Acid Buffer pH 6 to remove the IgGl, until the baseline reaches zero, at a flow rate of 50 mL / h (between 2-5 column volumes, approximately 2 hours) .
  • iot tlA a subclone called iot tlA which recognizes the same epitope in the CD6 molecule.
  • the ior tlA was modified to obtain a less immunogenic monoclonal antibody, by the method described in European patent application No. 0699755, whereby the immunogenicity of the original murine antibody is simultaneously reduced and at the same time preserves its ligand binding properties.
  • the immunogenicity of an xenogeneic or allogeneic antibody could be reduced by replacing the residues included in its T antigenic sequences with the same found in other species, in this case in Human immunoglobulins
  • the substitution of said residues does not include amino acids from the so-called "Vernier" zone or those included in the canonical structures, these substitutions cannot affect the structural determinants or contact areas between the FRs and the CDRs in such a way that affinity in antigen binding is guaranteed. - Homology analysis of the variable regions.
  • variable domains of human antibody variable domains compiled by Kabat et al., "Sequences of proteins of Immunological Interest” Fifth edition, Bethesda, Maryland, National lnst. of Health, 1994.
  • variable domain of the light and heavy chains of the murine ior tlA are compared with the corresponding variable domains of the human sequences.
  • the amino acid sequences of the variable domains of murine immunoglobulins are compared with the sequences of variable regions of human immunoglobulins reported, to identify the human immunoglobulin that has the highest homology value with the murine molecule under analysis.
  • T epitopes In the second stage, the two sequences of homologous variable regions (mouse and human) are analyzed to predict T antigen sequences.
  • variable domains of murine immunoglobulins are analyzed with the AMPHI Program (Berzofsky et al (1987) J. Immunol 138: 2213), which allows prediction of an unfriendly helix, to which T immunogenicity has been related.
  • the substitutions of the residues involved in the canonical structures or in the so-called "Vernier" zone are not included as they can affect the three-dimensional structure of the antibody and may therefore affect its binding to the antigen. Additional information on the influence of the substitutions that are made on the tertiary structure, can be obtained by molecular modeling of the variable regions.
  • Method to construct and express the modified antibody The following procedures are used to prepare recombinant DNA sequences, where amino acids of one species are substituted by amino acids of other species, these modifications are made in both chains of the variable region of a mouse immunoglobulin. Once the mutations have been made, they are combined with a constant region of a human immunoglobulin and introduced into an appropriate vector to express this less immunogenic antibody in higher cells.
  • the anti-CD6 mAbs can be used for diagnostic purposes in vitro and in vivo in the different clinical forms of Psoriasis, for the evolutionary follow-up of patients after applying local or systemic therapeutic procedures, as well as relapse prediction.
  • Anti-CD6 mAbs can be conjugated directly with fluorescent substances by different methods (Coligan, JE et al. (Ed.) Current Protocols in Immunology, National Institutes of Health. Vol. I: 5.3.2. Wiley Interscience) and used with similar purposes as described, at concentrations between 5 to 30mg / mL.
  • tissue cryosections eg skin
  • Sodium Azide 0.05 - 0.2%)
  • Albumin 0.05 - 0.2%)
  • Biotinylated murine anti-immunoglobulin conjugate and Biotin-Avidin-Peroxidase Complex eg, from ram [Dako]
  • Biotin-Avidin-Peroxidase Complex eg, from ram [Dako]
  • Biotin-Avidin-Peroxidase Complex eg, from ram [Dako]
  • Biotin-Avidin-Peroxidase Complex eg, from ram [Dako]
  • anti CD3 anti CD3
  • anti CD4 anti CD4
  • anti CD8 anti CD45
  • an anti CD45 ior L3
  • an AcM anti Growth Factor Receptor Epidermal ior egf / r3
  • keratinocyte activation marker Mozzanica, N. et al. (1994) Acta Derm. Venereol. Suppl. Stockh. 186: 171
  • Patients treated with anti-CD6 Monoclonal Antibodies may have a biopsy of the lesions prior to the start of the treatment, after the course of the treatment and after it is finished, in an area adjacent to the initial biopsy to evaluate the therapeutic effectiveness of the topical compositions. or systemic
  • the scale of classification of the response to treatment can be qualitative in percentages and is established by the index of CD6 + cell mating over the total of CD45 + cells, evaluated in each biopsy.
  • CD6 + cell index Number of CD6 + cells 100
  • CD45 + cells Number of CD45 + cells
  • CD4 + and CD8 + cells can be established on the total of CD45 + cells and the index of CD4 + and CD8 + cells on the total of CD6 + cells.
  • CD3 + cell index Number of CD3 + cells x 100
  • CD45 cells + CD8 + cell index Number of CD8 + x 100 cells
  • CD6 cells + CD8 + cell index Number of CD8 + cells x 100 Number of CD6 cells - * -
  • Another way to evaluate the therapeutic effect with the anti-CD6 AcM can be the immunogammographic study in the patient of the expression and distribution of the CD6 + cells during the treatment, using between 1 and 5mg of the same AcM conjugated with radioactive isotopes such as Technetium 99, using conjugation method as described by Mather, SJ et al. (1990) J. Nuc ⁇ . Med. 31 (5): 692.
  • the anti-CD6 mAbs can be used in the different clinical forms of Psoriasis, both with formulations for topical and systemic use, in single or multiple doses, with one or several treatment cycles according to the clinical form and severity of the illness.
  • Therapeutic formulations for topical use with AcM anti CD6 can be composed of semi-solid systems in one or two phases, mainly with hydrophilic formulations that allow the incorporation of dissolved AcM in sterile buffer solution (pH 7.0 +/- 0.5) in doses between 0.1 mg at 5mg per gram of product.
  • Gels, jellies, ointments, lotions or creams can be formulated with liquid matrix (eg, water) formulated with gelatin, carboxymethyl cellulose or similar substances and bases containing glycerin, calcium gluconate;
  • the compositions may include preservatives (ex: methyl p-hydroxybenzoate) to avoid contamination, the pH must be physiological so that it does not affect the characteristics of the AcM.
  • These therapeutic compositions should allow the release and penetrability of the AcM into the skin.
  • Topical treatment should be applied between one and three times a day, on the covered or not covered lesions and can be combined with the systemic use (mainly endovenous) of the same AcM with doses between 0.1 to lmg / kg of the patient's weight, it should be Dilute in Physiological Solution for intravenous use and administer slowly.
  • the intravenous treatment can be applied independently to the topical route of administration. Clinical follow-up of treated patients.
  • the clinical evolution of the lesions can be used as the main criterion for the evaluation of therapeutic efficacy.
  • the main response variables used to measure the effects of treatment may be the improvement of the clinical characteristics of the lesions (infiltration, scales, erythema) and the reduction of the area of the lesions.
  • the degree of severity of the signs of the disease can be established between the values 0 - 1 - 2
  • the extension of the treated plates should also be considered by measuring 2 of their diameters and the area of the lesion is calculated with the radius product
  • the size of the plate at time 0 represents 100% and in the times of successive evaluations the percentage of the plate size is established by rule of 3.
  • TITLE OF SEVERITY OF PSORIASIS similar to PASI (psoriasis area and severity index) (Fredriksson, T. et al. (1978) Dermatological 157: 238) is obtained, with the formula: infiltration (0-2) + scales (0-2) + erythema (0-2) x% of affected area
  • MONOCLONAL MURINO ior tlA MONOCLONAL MURINO ior tlA.
  • RNA was extracted from 10 6 cells of the ior ti A. hybridoma. It was prepared as described by Faloro et al. (Faloro, et al. (1989) Method in Enzimology 65: 718). -The cDNA synthesis reaction consists of adding 5 ⁇ g of RNA,
  • RNAse inhibitor 250 ⁇ M of each dNTP, 50mM Tris-Hcl, Ph7.5, 75 mM KC1, lMm DTT, 3 mM MgC12, 25 pmoles of the oligo CG2A FOR (5'GGAAGCTTAGACCGATGGGGCTGTTGTTTTG 3 ') for the heavy chain variable region or 25 pmoles of CK FOR (5'GGAAGCTTGAAGATGGATACAGTTGGTGCAGC 3 ') and 15 units of RNAse inhibitor for a total volume of 15 ⁇ l, heated at 70 ° C for 10 minutes and slowly cooling to 37 ° C. Then 100 reverse transcriptase units (BRL) are added and incubated at 37 ° C for 1 hour.
  • BTL reverse transcriptase units
  • VH and VK cDNAs were then amplified by PCR, as described by Orlandi et al. (Orlandi, et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 3833).
  • a reaction mixture is made to which 25 pmoles of oligo CG2A FOR and 25 pmoles of oligo VH 1BACK are added to 5 ⁇ l of cDNA.
  • the reaction mixture consists of 5 ⁇ l of cDNA, 25 pmoles of CK2 FOR and VK lOBACk
  • variable region of the heavy chain of the monoclonal antibody ior ti A was analyzed with the AMPHI program, which determined the regions of 1 1 amino acids with an amphipathic helix structure and therefore the regions Candidates to join the MHC II molecules.
  • AMPHI program the AMPHI program
  • FIGURES 1 and 2 represent the possible T epitopes.
  • FIGURE 1 shows the sequences corresponding to the heavy chain. Is the murine sequence compared to the human protein sequences reported in the GenBank and EMBL bases, from where was it extracted ? the sequence of the variable region of a human immunoglobulin that has greater homology, belonging to subgroup III of Kabat. Subsequently, the murine immunoglobulin amino acids that differ from those found in the same position in the human sequence are determined.
  • FIGURE 2 shows the previous analysis applied to the ior ti A light chain, resulting in a group of overlapping segments, which predict an antigenic zone from amino acid 2 to 69. After the analysis, 7 replacements are proposed in the Frs 1 and
  • the reaction mixture was: 0.5 ⁇ l of single chain VH supernatant cloned in M 13, 25 pmoles of mutagenic oligos 1 or 2, 25 pmoles of mutagenic oligo 3 or 4 (see below the sequences of the oligos)
  • To these mixtures were added 2.5 mM of cda dATP, dTTP, dCTP, dGTP, 5 ⁇ l of the 10X buffer of the Vent DNA polymerase (NEB) and a Vent DNA polymerase (NEB) unit in a final volume of 50 ⁇ l.
  • Oligo 4 5'AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 3 '.
  • Oligo 3 5 'GTAAAACGACGGCCAGT 3'.
  • Oligo 1 For the light chain the changes in FR 1 in residues 3, 1 1, 12, 15 and 17 the designed oligos were the following: Oligo 1:
  • Oligo 3 5'GTAAAACGACGGCCAGT3 '. These oligos are combined in a single PCR. Oligo 2:
  • Oligo 4 5 ⁇ CTGGCCGTCGTTTTAC3 '. These oligos are combined in a single PCR. The product of both PCRs are combined in a PCR using oligos 3 and 4.
  • Oligo 1 5 'CAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGACCCTG 3'
  • Oligo 3 5 'GTAAAACGACGGCCAT3'
  • oligos are combined in a single PCR.
  • Oligo 2 5 'CAGGGTCTTAGGAGCTTTCCCTGGTTTCTG 3' Oligo 4: 5 ⁇ CTGGCCGTCGTTTTAC3 " .
  • the murine AcM ior ti was purified and obtained dissolved in sterile buffer solution (pH 7.0 +/- 0.5).
  • the therapeutic jelly was made with buffer solution with similar composition to that described for the AcM (pH 7.0 +/- 0.5).
  • Vulgar expression exists between 60-90% of cells with CD6 + T lymphoid phenotype.
  • a Clinical Trial was performed in patients with Vulgar Psoriasis diagnosed, in relapse, with lesions characteristic of this disease.
  • the study was structured in two groups of jelly-defined patients who receive as a topical treatment (AcM ior ti or vehicle) and 14 patients per group were included.
  • a topical therapeutic formulation consisting of a base jelly or vehicle (A / V sodium carboxymethylcellulose, Propylene Glycol, Methylparaben, Propylparaben, Triethanolamine) was used on which the AcM was incorporated. The treatment was applied twice a day without occlusion of the treated lesions, for 21 days.
  • a Clinical Trial was performed in 19 patients with Vulgar Psoriasis diagnosed in relapse, with lesions characteristic of this disease.
  • the study was structured in three groups of patients defined by the concentration of ior ti Monoclonal Antibody contained in the therapeutic formulation they received as a topical treatment (0.3mg, lmg or 3mg of AcM ior ti) and 6, 7 and 6 patients were included respectively per group.
  • a topical therapeutic formulation consisting of a base jelly or vehicle (A / V sodium carboxymethylcellulose, Propylene Glycol, Methylparaben, Propylparaben, Triethanolamine) was used on which the AcM was incorporated. The treatment was applied twice a day without occlusion of the treated lesions, for 21 days.
  • the clinical evolution of the patients was evaluated using the PASI (Psoriatic Area and Severity Index) and simultaneously the appearance of the human antibody response against murine immunoglobulins (HAMA) was analyzed in the serum of these patients.
  • PASI Psoriatic Area and Severity Index
  • HAMA human antibody response against murine immunoglobulins
  • the best clinical response was observed in the group of patients treated with the lower dose of AcM ior ti (0.3mg), which corresponded to the group with the highest frequency of occurrence and the highest titers of HAMA response.
  • anti-idiotypic antibodies anti-AcM ior ti
  • ELISA method Enzyme Linked Immunosorbent Assay
  • FACS Fluorescent Activating Cell Sorter
  • the patient From day 6 of the treatment, the patient begins to improve her general condition and dermatological condition. It was evaluated at 21 days of the treatment and presented approximately 60% of the body surface without injuries and the rest of the skin with improvement of the clinical signs of the disease, the patient reported improvement of joint symptoms; It presents good general condition, normal vital signs and routine clinical laboratory tests without alterations.
  • FIGURES 1 and 2 are identical to FIGURES 1 and 2
  • Figure 1 Sequence of the variable region of the murine AcM heavy chain ior tlA
  • Figure 2 Sequence of the variable region of the murine AcM ior tlA light chain
  • CDRs Complementary Determinant Regions
  • FIGURE 4 The evaluation of the therapeutic efficacy of the ACM anti CD6 used in the treatment of Psoriasis was carried out taking into account the variables infiltration, scales, erythema and size of the area of the lesions, degree of severity was established between the values 0 - 1 - two; The extension of the treated plates was also considered by measuring 2 of their diameters.
  • a PSORIASIS SEVERITY TITLE (TSP) similar to PASI (psoriasis area and severity index) was obtained and the response to treatment is stratified according to the changes in the TSP by completing the designated evaluation times, establishing the following categories: Whitening, Responding, Non-responding and Worsening.
  • Treatment with the intravenous Monoclonal Antibody was applied intravenously to a 56-year-old patient with a history of presenting
  • a single dose treatment of AcM ior ti was applied at 0.6 mg / kg of weight by slow intravenous route, diluted in 200mL of 0.9% Saline, simultaneously administered for 2 days, in all lesions, twice a day, Therapeutic jelly containing the AcM ior ti at the concentration of 3mg of AcM / g of Jelly, for a total of 224g of therapeutic Jelly.
  • the clinical, immunohistochemical and clinical laboratory response was evaluated weekly, evolutionary photographs of the skin lesions are shown (day before treatment and at 21 days).

Abstract

Anticuerpos monoclonales que reconocen el antígeno CD6, composiciones farmacéuticas que contienen estos anticuerpos y que son capaces de conseguir una efectividad clínica e histológica en pacientes que sufren de diferentes tipos clínicos de Psoriasis.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-CD6 Y SUS USOS. Sector Técnico
La presente invención se relaciona con la rama de la inmunología y en particular con la obtención de composiciones farmacéuticas que contienen un anticuerpo monoclonal que reconoce el antígeno de diferenciación leucocitario CD6. Técnica Anterior
Los Anticuerpos Monoclonales (AcM) han permitido la caracterización de moléculas de importancia fisiológica expresadas en las membranas celulares, definiendo en las células del sistema inmune los antígenos o "Cluster de Diferenciación Leucocitarios" (CD), (Schlossman, S.F. et al. (1994) Immunol. Today 15(3):98). La definición del papel de los CD en la diferenciación y maduración de las células linfoides durante su desarrollo ontogenético, los mecanismos de reconocimiento y adhesión celular, los mecanismos de activación y proliferación durante la respuesta inmunitaria han conducido al empleo de sus respectivos AcM en el diagnóstico y la inmunoterapia, con resultados alentadores (Dantal, J. et al. (1991) Curr. Opin. Immunol.3:740).
Los AcM murinos dirigidos contra moléculas expresadas en la membrana celular de linfocitos T humanos han contribuido a mejorar el diagnóstico de entidades clínicas donde el defecto funcional radica en estas células, además han sido utilizados para explorar nuevos enfoques terapéuticos, con el interés de modular su actividad funcional como es en el Rechazo de Trasplantes, la Enfermedad Injerto contra Huésped (GvHD) y las Enfermedades Autoinmunes (Waldmann, T.A. (1991) Science 252: 1657; Waldmann, T.A. (1992) Annu. Rev. Immunol. 10:675).
El CD6 es una molécula poco caracterizada. Se conoce que es una glicopro teína que existe en dos formas moleculares que se mantienen en equilibrio dinámico y difieren solamente en el grado de fosforilación. En linfocitos T en reposo es una molécula fosforilada de 105 kDa y en células activadas una forma hiperfosforilada de 130 kDa (Cárdenas, L. et al. (1990) J. Immunol. 145: 1450; Swack, J.A. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:7137), miembro de una familia de receptores de membrana y proteínas de secreción con estructura característica (Kodama, T. et al. (1990) Nature 343:531 ; Aruffo, A. et al. (1991) J. Exp. Med. 174:949); se expresa en la superficie de timocitos humanos maduros, en linfocitos T de sangre periférica, donde constituye la mayor parte de la población de células CD3+, en un subtipo de linfocitos B y en las neuronas de la corteza cerebral, en los linfocitos T de sangre periférica participa en los mecanismos de activación celular (Reinherz, E.L. et al. (1982) Cell 30:735; Kamoun, M. et al. (1981) J. Immunoi. 127:987; Mayer, B. et ai. ( 1990) J. Neuroimmunol. 29: 193; Rasmussen, R.A. et al. (1994) J. Immunol. 152:527).
Se desconoce el papel del CD6 en la ontogenia de las células T, así como su posible rol en la fisiopatología de enfermedades de diferentes etiologías.
Recientemente se identificó y caracterizó un ligando del CD6 con amplia distribución celular en tejidos normales como timo, bazo, ganglios linfáticos y piel (Dhavalkumar, D.P. et al. (1995) J. Exp. Med. 181 : 1563). Esta molécula denominada ALCAM (Activated Leukocyte-Cell Adhesión Molecule) por su expresicn en linfocitos T y B activados así como en monocitos, es una glicoproteína de membrana tipo I de lOOkDa de Peso Moleculai , con 5 dominios extracelulares similares a los de las Inmunoglobulinas, puede presentar diferentes grados de activación dependiendo de cationes divalentes y puede mediar interacciones hυmofílicas y heterofílicas (Boweπ, M.A. et al. (1995) J. Exp. Med. 181 :2213).
En la clínica, diferentes AcM anti CD6 han sido utilizados, en la prevención del rechazo agudo de trasplante de órganos (Kirkman, R.L. et al. (1983) Transplan tation 36:620) y para depletar de linfocitos T los trasplantes de médulas óseas para prevenir la Enfermedad Injerto contra Huésped (GvHD) (Soiffer, R.J. et al. (1992) J. Clin. Oncol. 10: 1 191). El AcM ior ti se encuentra en Ensayo Clínico Fase II en el trata.íiiento de los Linfornas de Células T Cutáneos (García, C.A. et al. (1990) Biotec. Aplicada 7(2): 176; Faxas, M.E. et al. (1993) Biotec. Aplicada 10(1):20). El Anticuerpo Monoclonal Murino ior ti de isotipo IgG2a, clasificado como anti CD6 en el IV Taller Internacional de Antígenos de Diferenciación Leucocitario de Viena (1989), define un epitopo diferente a los reconocidos por otros AcM anti CD6 que es de conformación estable e insensible a agentes reductores, posiblemente localizado en la estructura primaria de la molécula CD6 (Osorio, L.M. et al. (1994) Cell. Immunol. 154: 123).
Este Anticuerpo Monoclonal tiene un reconocimiento inferior al de otros anti CD3 en células mononucleares periféricas de individuos sanos; ei reconocimiento del ior ti en líneas celulares humanas en cultivo de origen T es en Jurkat 47%, Molt-4 (23%), CCRF-CEM (no la reconoce); de origen B en Raji (9%), origen eritroblastoide K-562 ( 12%) y mielomonocítica U-937 (9%), así como también reconoce células : :¡cnonucleares periféricas de pacientes con Leucemia Linfocítica Crónica B (89+4%) (García, C. A. et al. (1992) Biotec. Aplicada 9( 1):70) y linfocitos de lesiones cutáneas de pacientes con Linfomas Cutáneos de Células T (Rodríguez, T. et al. (1985) Interferón y Biotec. 2(1):41).
El AcM ior ti no inhibe "in υitro" la cito toxicidad celular antígeno específica
(Faxas, M.E. et al. (1993) Biotec. Aplicada 10( 1):47) y es capaz de activar uir. vitro" linfocitos T de sangre periférica de individuos sanos, a concentraciones subóptimas de OKT3 (anti CD3) el cross-linking con el ior ti induce respuestas superiores que las logradas con otros AcM anti CD6 (Osorio, L.M. et al. (1994) Cell. Immunol. 154 123).
La Psoriasis es una enfermedad cuya fisiopatología no está definida (Hunziker, T. et al. (1993) Ther. Umsch. 50(2): 110; Eider, J.T. et al. (1994) J. Inυest. Dermatol. 102(6):24S); se caracteriza por presentar un infiltrado inflamatorio en el órgano diana con predominio de linfocitos T activados con fenotipo CD4+ y CD8+ (Chang, J.C.C. et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:9282), así como marcada oligoclonalidad de los Receptores de Células T estas células al parecer presentan tendencia acentuada a migrar a la piel (homing)(Barker, J.N.W.N. et al. ( 1992) Br. J. Dermatol. 127:205; Menssen, A. et al. (1995) J. Immunol. 155:4078; Valdimarsson, H. et al. (1995) Immunol. Today 16(3): 145).
La remisión espontánea de la Psoriasis puede predecirse si disminuye el número de células T en la piel, por lo que se sugiere que juegan un importante papel en la perpetuación de la enfermedad al liberar mediadores solubles de respuesta inmune capaces de inducir la proliferación de queratinocitos, responsables de las manifestaciones clínicas de la enfermedad.
Estas consideraciones están apoyadas por nechos como la cura de ia enfermedad post trasplante de médula ósea alogénico, la probable asociación HLA, la mejoría con esteroides y sobre todo con inmunomoduladores como la Ciclosporina y la mejoría clínica con Anticuerpos Monoclonales (AcM) terapéuticos anti células T, aunque de forma reversible (Griffiths, C.E.M. et al. (1992) Springer Semin Immunopathol 13:441 ; Nanney, L.B. et al. (1986) J Invest Dermatol 86(3):260; Picassia, D.D. et al. (1987) J Am Acad Dermatol 17(3):408; Schopf, R.E. et al. (1986) Arch Dermatol Res 279(2):89; van de Kerkhof, P.C. et al. (1987) Dermatológica 174(5):224).
El éxito de la inmunoterapia con anticuerpos monoclonales depende de la selección de la molécula diana, la que debe intervenir en funciones celulares importantes o de la selección del AcM (Dantal, J. et al. ( 1991) Curr. Opin. Immunol. 3:740) . Los AcM evaluados en la Psoriasis dirigidos contra el CD3 (Weinshenker, B.G. et al. (1989) J. Am Acad. Dermatol. 20: 1 132) y entra el CD4 (Poizot-Martin, I. et al. (1991) Lancet 337: 1477; Prinz, J. et al. (1991) Lancet 338:320; Nicolás, J.F. et al. (1991) Lancet 338:321) han conducido a mejoría clínica en los pacientes luego de múltiples aplicaciones endovenosas a dosis elevadas, con remisiones de corta duración y recaída precoz de los síntomas y signos de la enfermedad en todos los casos.
La aplicación terapéutica de Anticuerpos Monoclonales murinos a múltiples dosis se asocia con la aparición de efectos indeseables en el paciente debido a la xenogenicidad de las proteínas murinas lo que conlleva la aparición de la respuesta de anticuerpos humanos contra las inmunoglobulinas murinas (Human Anti-Mouse Antibodies - HAMA); por lo que la humanización de los AcM utilizando la ingeniería de proteínas garantizan la reducción de su inmunogenicidad, mejoría en su farmacocinética y de la efectividad clínica (Winter, G. et al. ( 1993) Trends-Pharmacol-Sci. 14(5): 139) Hasta el momento actual no se ha reportado ningún estudio en que se describa la expresión de la molécula CD6 en los linfocitos T del infiltrado inflamatorio de la piel en la Psoriasis, ni la posible asociación de esta molécula con el desarrollo de la enlermedad, además no se ha evaluado el usυ terapéutico de un AcM anti CD6 en esta enfermedad. Divulgación de Invención
La novedad de la presente invención consiste en proporcionar composiciones farmacéuticas tópicas y sistémicas que contienen un anticuerpo monoclonal anti CD6, la obtención de un anticuerpo monoclonal humanizado anti CD6 y la aplicación terapéutica de las composiciones farmacéuticas en pacientes con Psoriasis Vulgar, utilizando diferentes vías de administración y en diferentes formas clínicas de la enfermedad. Descripción detallada de la Invención
Purificación del Anticuerpo Monoclonal Murino.
El Anticuerpo Monoclonal (AcM) anti CD6 se puede purificar a partir de liquido ascítico por Proteina A Sepharosa, diluido con igual volumen de Buffer Glicina 1.5 M, NaCl 3M pH 8.9; equilibrando la matriz con ese mismo buffer y aplicando igual volumen de ascitis que de buffer se debe eluir a velocidad de flujo de 50 mL/h. Se lava overnight la columna hasta línea base cero, con el mismo buffer de aplicación. Posteriormente se lava la columna con Buffer Acido Cítrico 0.1 M pH 6 para eliminar las IgGl , hasta que la línea base alcance el cero, a una velocidad de flujo de 50 mL/h (entre 2-5 volúmenes de columna, 2 horas aproximadamente). Se aplica Buffer Acido Cítrico 0.1 M, pH 5, para eluir las IgG2a (ior ti). Humanización del Anticuerpo Monoclonal Murino A partir de los AcM anti CD6 pueden construirse por métodos de ingeniería genética variantes como anticuerpos quiméricos y humanizados a partir de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo murino (Takashi, N. et al. ( 1982) Cell 29:718; Hieter, P.A. et al. ( 1980) Cell 29:718) Descripción del método de humanización del Anticuerpo Monoclonal murino ior 11.
A partir del hibridoma parental murino secretor del Anticuerpo Monoclonal ior ti se obtuvo un subclon denominado iot tlA el cual reconoce el mismo epitopo en la molécula CD6. El ior tlA fue modificado para obtener un anticuerpo monoclonal menos inmunogénico, por el método descrito en la solicitud de patente europea No. 0699755, mediante el cual simultáneamente se reduce la inmunogenicidad del anticuerpo murino original y a la vez preserva sus propiedades de unión al ligando. Como la antigenicidad de una proteína es dependiente de la presencia de epitopos T en los mismos, la inmunogenicidad de un anticuerpo xenogénico o alogénico pudiera ser reducida sustituyendo los residuos incluidos en sus secuencias antigénicas T por los mismos encontrados en otras especies, en este caso en inmunoglobulinas humannas. Por supuesto, la sustitución de dichos residuos no incluye aminoácidos de la llamada zona de "Vernier" ni los incluidos en las estructuras canónicas, estas sustituciones no pueden afectar los determinantes estructurales o las zonas de contacto entre los FRs y los CDRs de manera tal que se garantize la afinidad en la unión al antígeno. -Análisis de homología de las regiones variables.
En este procedimiento se hace uso de las secuencias disponibles de dominios variables de anticuerpos humanos recopilados por Kabat y colaboradores, "Sequences of proteins of Immunological Interest" Fifth edition , Bethesda, Maryland, National lnst. of Health, 1994. En la primera etapa el dominio variable de las cadenas ligeras y pesadas del ior tlA murino son comparados con los dominios variables correspondientes de las secuencias humanas. Las secuencias de aminoácidos de los dominios variables de las inmunoglobulinas murinas son comparadas con las secuencias de regiones variables de inmunoglobulinas humanas reportadas, para identificar la inmunoglobulina humana que posea mayor valor de homología con la molécula murina sometida a análisis.
Las bases de secuencias humanas utilizadas fueron las reportadas en GeneBank (Nov 1990) y EMBL (Nov 1990). El programa que se utiliza para determinar la homología entre secuencias es el PC-DOS HIBIO PROSIS 06-00, Hitachi.
Mediante este programa las secuencias se comparan y se identifican los residuos que difieren en cada una de las posiciones dentro de los frameworks (Kabat, E. (1991) Sequences of proteins of inmunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health), entre las secuencia humana de mayor homología y la secuencia murina sometida a análisis.
- Predicción de epitopos T. En la segunda etapa, las dos secuencias de regiones variables homologas (ratón y humana) son analizadas para predecir las secuencias antigénicas T.
Las secuencias de los dominios variables de las inmunoglobulinas murinas son analizadas con el Programa AMPHI (Berzofsky et al (1987) J. Immunol 138: 2213), el cual permite la predicción de hélice antipática, a la cual se ha relacionado la inmunogenicidad T.
- Análisis para la reducción de inmunogenicidad.
Después de identificar sobre la secuencia murina los posibles epitopos T y de identificar los residuos responsables de las estructuras canónicas, se sustituyen en la molécula murina los residuos que son diferentes entre ambas especies por los que se encuentran en la misma posición en la inmunoglobulina humana de mayor homología estas sustituciones se realizan solamente en aquellos segmentos que los algoritmos predicen que podría ser un epitopo T y sólo en la región de los Frs.
Finalmente, las sustituciones de los residuos involucrados en las estructuras canónicas o en la llamada zona "Vernier" no son incluidas pues pueden afectar la estructura tridimensional del anticuerpo y pυi tanto afectar su unión al antígeno. Información adicional sobre la influencia de las sustituciones que se hacen en la estructura terciaria, pueden ser obtenidas por modelaje molecular de las regiones variables. - Método para construir y expresar el anticuerpo modificado. Los siguientes procedimientos son usados para preparar secuencias ADN recombinantes, donde son sustituidos aminoácidos de una especie por aminoácidos de otras especies, estas modificaciones son realizadas en ambas cadenas de la región variable de una inmunoglobulina de ratón. Una vez realizadas las mutaciones, estas se combinan con una región constante de una inmunoglobulina humana y son introducidas en un vector apropiado para expresar este anticuerpo menos inmunogénico en células superiores. a) Mutagénesis en la región variable de ambas cadenas de un anticuerpo. Para ello se introcen los cambios necesarios a través del método de mutagénesis por sobrelapamientos de PCR. (Kamman, M. et al., (1989) Nucleid Acids Res. 17: 5404). b) Preparación de un vector de expresión que contenga una región constante humana y una región variable murina, que una vez transfectado las células resultantes secreten la inmunoglobulina modificada con la afinidad y especifidad deseada. c) Co-transfección de cadenas ligeras y pesadas en vectores de expresión apropiados en diferentes líneas de células. Después de dos semanas, los sobrenadantes resultantes de la transfección en placas de 96 pozos son analizados por ELISA de detección de inmunoglobulinas humanas. Las muestras que produzcan inmunoglobulinas humanas serán testadas en un método capaz de detectar unión de este anticuerpo a su antígeno.
Formulaciones para realizar estudios con fines diagnósticos "in vitro" e "in vivo" .
Los AcM anti CD6 se pueden utilizar con fines diagnósticos in vitrυ e in vivu en las diferentes formas clínicas de la Psoriasis, para el seguimiento evolutivo de los pacientes luego de aplicar procederes terapéuticos locales o sistémicos, así como la predicción de recaídas.
Estos AcM purificados y disueltos en solución tampón (pH 7.0 +/- 0.5) que contenga Azida Sódica (0.01 - 0.2%) y Albúmina (0.05 - 0.2%) se pueden utilizar para cuantificar los linfocitos T CD6+ y/o la expresión de esta molécula en la superficie de las células linfoides en fluidos biológicos (ej: sangre, líquido cefaloraquídeo, líquido sinovia!) incubando entre 50 y 200 mL de la muestra con cantidades entre 10 y 30 mL de AcM a concentraciones entre 0. 1 - 3mg/mL, entre 20 y 30 min a 4°C.
Posteriormente, se debe lavar con solución tampón e incubar con inmunoglobulinas de otra especie animal conjugado con sustancias fluorescentes (Ej: Fluoresceína, Ficoeritrina) . Los AcM anti CD6 se pueden conjugar directamente con sustancias fluorescentes por diferentes métodos (Coligan, J.E. et al. (Ed.) Current Protocols in Immunology, National Institutes of Health. Vol.I:5.3.2. Wiley Interscience) y utilizarse con similares fines a los descritos, a concentraciones entre 5 a 30mg/mL.
Evaluación inmunohistoquímica de lesiones de pacientes con Psoriasis.
El estudio inrnunohistoquirnico de lesiones cutáneas o de otros tejidos afectos (ej: articulaciones) de pacientes con Psoriasis Vulgar se puede realizar sobre criosecciones de tejido (ej: piel) fijadas o no en acetona fría, incubando el AcM anti CD6 disuelto entre 3 a lOmg/mL de solución tampón (pH 7.0 +/- 0.5) que contenga Azida Sódica (0.05 - 0.2%) y Albúmina (0.05 - 0.2%) durante 30min. A continuación se incuban las muestras con conjugado anti inmunoglobulinas murinas Biotinilado y Complejo Biotina-Avidina-Peroxidasa (ej: de carnero [Dako]) durante 30min a temperatura ambiente; finalmente se revela con el sustrato 3-amino-9-etil-carbazol [Sigma] (Hsu, S.M. et al. (1981) J. Histochem. Cytochem. 29:577). Las biopsias deben ser analizadas por 2 especialistas y se ajusta la evaluación del CD6 a una escala de puntos < 10% (±), 10-25% (+), 25-50% (++), 50-90% (+++), 9υ- iÜ0% (++++).
Se pueden utilizar diferentes AcM dirigidos contra CD de linfocitos T, anti CD3 (ior t3), anti CD4 (ior t4), anti CD8 (ior t8) y un anti CD45 (ior L3), además un AcM anti Receptor del Factor de Creciminto Epidérmico (ior egf/r3) como marcador de activación de keratinocitos (Mozzanica, N. et al. ( 1994) Acta Derm. Venereol. Suppl. Stockh. 186: 171), que permita evaluar en detalles las características del infiltrado inflamatorio de las lesiones en el curso del tratamiento de la enfermedad.
Seguimiento inmunohistoquímico de lesiones de pacientes tratados. Pacientes tratados con Anticuerpos Monoclonales anti CD6 se les puede realizar biopsia de las lesiones previo al inicio del tratamiento, durante el curso del tratamiento y luego de concluido éste, en área aledaña a la biopsia inicial para evaluar la efectividad terapéutica de las composiciones de uso tópico o sistémico. La escala de clasificación de la respuesta al tratamiento puede ser cualitativa en porcientos y se establece mediante el índice de mareaje de células CD6+ sobre el total de células CD45+, evaluado en cada biopsia. índice de células CD6+ = Número de células CD6+ x 100
Número de células CD45+ Se pueden establecer, además, los índices de mareaje de células CD3+, CD4+ y CD8+ sobre el total de células CD45+ y el índice de mareaje de células CD4+ y CD8+ sobre el total de células CD6+. índice de células CD3+ = Número de células CD3+ x 100
Número de células CD45+ Indice de células CD4+ = Número de células CD4+ x 100
Número de células CD45+ índice de células CD8+ = Número de células CD8+ x 100
Número de células CD45+ índice de células CD4+ = Número de células CD4+ x 100
Número de células CD6+ índice de células CD8+ = Número de células CD8+ x 100 Número de células CD6-*-
Seguimiento inmunogammagráfico de pacientes tratados. Otra forma para evaluar el efecto de la terapéutica con el AcM anti CD6 puede ser el estudio inmunogammagráfico en el paciente de la expresión y distribución de las células CD6+ durante el tratamiento, utilizando entre 1 y 5mg del mismo AcM conjugado con isótopos radiactivos como el Tecnecio 99, utilizando método de conjugación como el que describe Mather, S.J. et al. (1990) J. Nucí. Med. 31(5):692.
Obtención de formulaciones terapéuticas para uso tópico y sistémico. Con fines terapéuticos los AcM anti CD6 se pueden utilizar en las diferentes formas clínicas de la Psoriasis, tanto con formulaciones para uso tópico como sistémico, en dosis única o múltiples, con uno o varios ciclos de tratamiento de acuerdo a la forma clínica y a la severidad de la enfermedad.
Las formulaciones terapéuticas de uso tópico con AcM anti CD6 pueden estar compuestas por sistemas semisólidos en una o dos fases, principalmente con formulaciones hidrofílicas que permitan la incorporación del AcM disuelto en solución tampón estéril (pH 7.0 +/- 0.5) en dosis entre 0.1 mg a 5mg por cada gramo de producto. Pueden formularse geles, jaleas, ungüentos, lociones o cremas con matriz líquida (ej:agua) formulada con gelatina, carboximetilcelulosa o sustancias similares y bases que contengan glicerina, gluconato de calcio; además las composiciones pueden incluir preservativos (ej: metil p-hidroxibenzoato) para evitar la contaminación, el pH debe ser fisiológico para que no afecte las características del AcM. Estas composiciones terapéuticas deben permitir la liberación y penetrabilidad del AcM en la piel.
El tratamiento tópico se debe aplicar entre una y tres veces al día, sobre las lesiones cubiertas o no y se puede combinar con el uso sistémico (principalmente endovenoso) del mismo AcM con dosis entre 0.1 a lmg/kg de peso del paciente, se debe diluir en Solución Fisiológica para uso endovenoso y administrar lentamente. El tratamiento endovenoso puede aplicarse independiente a la vía tópica de administración. Seguimiento clínico de los pacientes tratados.
Como criterio principal de evaluación de la eficacia terapéutica puede utilizarse la evolución clínica de las lesiones.
Las variables principales de respuesta utilizadas para medir los efectos del tratamiento pueden ser la mejoría de las características clínicas de las lesiones (infiltración, escamas, eritema) y la reducción del área de las lesiones.
Se puede establecer el grado de severidad de los signos de la enfermedad (Infiltración, Escamas y Eritema) entre los valores 0 - 1 - 2
0- sin el signo 1- presencia escasa
2- presencia intensa
Se debe considerar además la extensión de las placas tratadas midiendo 2 de sus diámetros y se calcula el área de la lesión con el producto de los radios
(en cm) por p (3.14), el tamaño de la placa en el tiempo 0 representa el 100% y en los tiempos de evaluaciones sucesivas se establece el porciento del tamaño de la placa por regla de 3.
Se obtiene un TITULO DE SEVERIDAD DE LA PSORIASIS (TSP) similar al PASI (psoriasis área and severity índex) (Fredriksson, T. et al. ( 1978) Dermatológica 157:238), con la fórmula: infiltración (0-2) + escamas (0-2) + eritema (0-2) x % de área afectada
6 La respuesta al tratamiento se estratifica de acuerdo a los cambios en el TSP al completar los tiempos de evaluación designados, estableciéndose las siguientes categorías (Perkins, W. et al. (1993) Br. J. Dermatol 129:584): -Blanqueamiento (> 90% de mejoría en el TSP) -Respondedor (> 50% de mejoría en el TSP)
-No respondedor (< 50% de mejoría en ei TSP o empeoramiento del TSP) -Empeoramiento (> 50% de aumento en el TSP) Se pueden asumir los tiempos de evaluación de la respuesta hasta las 12 semanas a partir del inicio de la aplicación del tratamiento (pre tratamiento, semanas 1 , 2, 3, 4, 6, 8, 12) EJEMPLOS DE REALIZACIÓN: EJEMPLO 1 SECUENCIACIÓN DE LA REGIÓN VARIABLE DEL ANTICUERPO
MONOCLONAL MURINO ior tlA.
El RNA fue extraído a partir de 106 células del hibridoma ior ti A. El mismo fue preparado como describe Faloro y colaboradores (Faloro, et al. (1989) Method in Enzimology 65: 718). -La reacción de síntesis de cADN consiste en añadir 5μg de RNA,
250μM de cada dNTP, 50mM Tris-Hcl, Ph7.5, 75 mM KC1, lOmM DTT, 3 mM MgC12, 25 pmoles del oligo CG2A FOR (5'GGAAGCTTAGACCGATGGGGCTGTTGTTTTG 3') para la región variable de cadena pesada o 25 pmoles de CK2 FOR (5'GGAAGCTTGAAGATGGATACAGTTGGTGCAGC 3') y 15 unidades de inhibidor de RNAsa para un volumen total de 15 μl, calentados a 70°C por 10 minutos y enfriándose lentamente hasta 37°C . Entonces se le añade 100 unidades de reverso transcriptasa (BRL) y se incuba a 37°C durante 1 hora. -Los cADNs de VH y VK fueron entoces amplificados por PCR, como describe Orlandi y colaboradores (Orlandi, et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 3833). Para la amplificación de VH,se hace una mezcla de reacción a la que a 5 μl de cADN se le añade 25 pmoles del oligo CG2A FOR y 25 pmoles del oligo VH 1BACK
(5'AGGT(G/C)(A/C)A(A/G)CTGCAG(G/C)AGTC(A/T)GG 3').
Para la amplificación de VK, la mezcla de reacción consiste en 5 μl de cADN, 25 pmoles de CK2 FOR y VK lOBACk
(5'TTGAATTCCAGTGATGTTTTGATGACCCA 3'). A estas mezclas se les añadió 2.5 mM de cada dNTP, 5 μl de tampón 10X de la enzima Thermolasa y una unidad de esta enzima, en un volumen final de 50 μl. La mezcla de reacción fue sometida a 25 ciclos de desnaturalización, hibridización y extensión a 94 C, 55 C, y 72 C, respectivamente, con una incubación final de 5 min a 72υC. Geles al 2 % de agarosa, teñidos con bromuro de etidium fueron usados para visualizar los fragmentos producidos por PCR. Dichos fragmentos fueron purificados con Prep A gene (Kit de la Bio Rad) y clonados en
M13. Los clones fueron secuenciados usando el método de los dideoxinucleótidos con enzima T7 ADN polimerasa de Pharmacia (ver FIGURAS 1 y 2).
EJEMPLO 2
MODIFICACIÓN DE LA SECUENCIA DE LAS REGIONES VARIABLES DEL ANTICUERPO MONOCLONAL MURINO ior tlA PARA OBTENER UNA INMUNOGLOBULINA MENOS INMUNOGÉNICA POR HUMANIZACIÓN DE LOS EPITOPOS T POTENCIALES.
Se parte del conocimiento de la secuencia de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal ior ti A. Esta secuencia se analizó con el programa AMPHI, el cual determinó las regiones de 1 1 aminoácidos con estructura de hélice anfipática y por tanto las regiones candidatas a unirse a las moléculas del MHC II. En la región variable de la cadena pesada del anticuerpo ior ti A, aparecieron 3 bloques fundamentales.
- FR 1 entre los aminoácidos 2 - 21.
- CDR1 y FR2 entre los aminoácidos 29 - 43. - CDR 3 y FR4 entre los aminoácidos 95 - 1 1 1.
La numeración de los aminoácidos se corresponde con la propuesta por Kabat en base a los aminoácidos invariantes. En las FIGURAS 1 y 2 se representan los posibles epitopos T. La FIGURA 1 muestra las secuencias correspondientes a la cadena pesada . La secuencia murina, es comparada con las secuencias de proteínas humanas reportadas en las bases GenBank y EMBL, de donde se extι-a? la secuencia de la región variable de una inmunoglobulina humana que presenta mayor homología, perteneciente al subgrupo III de Kabat. Posteriormente se procede a determinar aquellos aminoácidos de la inmunoglobulina murina que difieren de los que se encuentran en la misma posición en la secuencia humana . Ambas regiones variables de cadena pesada, la humana y la murina son comparadas, y se escoben los aminoácidos en los Frs que no están involucrados en la zona de "Vernier" o en las estructuras canónicas y que podrán ser sustituidos. Las posiciones 13 y 19 no se modifican porque el aminoácido Lys se encuentra en esas posiciones en otr?s inmunoglobulinas humar* pertenecientes al mismo subgrupo.
Para la cadena pesada se propusieron 4 cambios: THR de la posición 40 por ALA. GLU de la posición 42 por GLY.
THR de la posición 108 porLEU. LEU de la posición 109 porVAL.
HOJA DE SüSπTUClON (REGLA 2βl En la FIGURA 2 se muestra el análisis anterior aplicado a la cadena ligera del ior ti A, dando como resultado un grupo de segmentos superpuestos, que predicen una zona antigénica desde el aminoácido 2 hasta el 69. Después del análisis se proponen 7 reemplazamientos en los Frs 1 y
2.
-LYS en posición 3 por GLN.
-MET en posición 1 1 por LEU.
-TYR en posición 12 por SER. -LEU en posición 15 por VAL.
-GLU en posición 17 por ASP.
-TRP en posición 41 por GLY.
-SER en posición 43 por ALA
EJEMPLO 3
CONSTRUCCIÓN DE LA MUTANTE POR HUMANIZACIÓN DE EPITOPOS T EN LA REGIÓN VARIABLE DE CADENA PESADA DEL ANTICUERPO MONOCLONAL ior ti A.
Los cambios en los aminoácidos de la región variable de cadena pesada para construir la mutante por humanización de epitopos T fueron construido por muatgénesis solapando PCRs (Kamman, M. et al, ( 1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86, 4220).
Brevemente, dos amplificaciones por PCR: La mezcla de reacción fue: 0.5 μl de sobrenadante de VH de simplecadena clonado en M 13, 25 pmoles de oligos mutagénicos 1 ó 2, 25 pmoles de oligo mutagénico 3 ó 4 (ver debajo las secuencias de los oligos). A estas mezclas se les añadió 2.5 mM de cda dATP, dTTP, dCTP, dGTP, 5 μl del buffer 10X de la Vent ADN polymerasa (NEB) y una unidad de Vent ADN polimerasa (NEB) en un volumen final de 50 μl. Las muestras fueron sometidas entre 12- 15 ciclos de PCR (94°C, 30 seg; 50°C, 30 seg y 75°C, 1 min), con una incubación final de 75°C durante 5 min. Los productos de ambos PCRs están unidos en un segundo PCR usando solamente los oligos de afuera (3 y 4). La VH mutante amplificada fue purificada por Prep.A gene purification kit (Bio Rad) . Para los cambios de las posiciones 40 y 42, los oligos usados fueron los siguientes:
Oligo 1 :
5'TGGGTTCGCCAGGCTCCGGGGAAGAGGCTGGAG3'
Oligo 3 5'GTAAAACGACGGCCAGT 3'.
Estos oligos fueron combinados en un solo PCR.
Oligo 2:
5'CTCCAGCCTCTTCCCCGGAGCCTGGCGAACCCA 3'
Oligo 4: 5'AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 3'.
Estos oligos fueron combinados en un solo PCR.
Los productos de ambos PCRs son utilizados en un solo PCR usando los oligos 3 y 4.
Para los cambios en las posiciones 108 y 109 los oligos diseñados fueron:
Oligo 1 :
5' GGC CAÁ GGC ACC CTT GTC ACC GTC TCC 3'.
Oligo 3: 5' GTAAAACGACGGCCAGT 3'.
Estos oligos fueron combinados en un solo PCR.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Oligo 2:
5' GGA GAC GGT GAC AAG GGT GCC TTG GCC 3'. Oligo 4:
5' AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 3'. Estos oligos fueron combinados en un solo PCR.
Los productos de ambos PCRs son utilizados en un solo PCR usando los oligos 3 y 4.
Para la cadena ligera los cambios en el FR 1 en los residuos 3, 1 1 , 12, 15 Y 17 los oligos diseñados fueron los siguientes: Oligo 1 :
5TGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCGGTGGG AGACAGAGTCACC 3'
Oligo 3: 5'GTAAAACGACGGCCAGT3'. Estos oligos son combinados en un solo PCR. Oligo 2:
5'GGTGACTCTGTCTCCCACCGATGCAGACAGGGAGGATGGAGACTGGGTC ATCTGGATGTCACA 3'
Oligo 4: 5ΑCTGGCCGTCGTTTTAC3'. Estos oligos son combinados en un solo PCR. El producto de ambos PCRs son combinados en un PCR usando los oligos 3 y 4.
Para los cambios propuestos en los residuos 41 y 43 del FR2, los oligos fueron :
Oligo 1 : 5' CAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGACCCTG 3' Oligo 3: 5' GTAAAACGACGGCCAT3'
Estos oligos son combinados en un solo PCR.
Oligo 2: 5' CAGGGTCTTAGGAGCTTTCCCTGGTTTCTG 3' Oligo 4: 5ΑCTGGCCGTCGTTTTAC3".
HOJA DE SUSTΓΠJC'OV (REGLA 26) Estos oligos son combinados en un solo PCR.
El producto de ambos PCRs son combinados en un PCR usando los oligos 3 y 4.
EJEMPLO 4
OBTENCIÓN DE UNA FORMULACIÓN FARMACÉUTICA PARA USO TÓPICO EN LESIONES CUTÁNEAS DE PACIENTES CON PSORIASIS VULGAR. Se purificó el AcM murino ior ti y se obtuvo disuelto en solución tampón estéril (pH 7.0 +/- 0.5).
Ingredientes Cantidad Calidad
AcM ior ti 50 mg *
Fosfato de sodio monobásico 4.50 mg reactivo USPXXII
Fosfato de sodio dibásico 18 mg reactivo USPXXII
Cloruro de sodio 86 mg reactivo USPXXII
Polisorbato 80 1.852 μl USPXXII
Agua para inyección csp 10 mi USPXXI1
*según especificaciones de calidad del fabricante
Se incorporó la solución que contiene el AcM a una Jalea Base con la composición:
-Carboximetilcelulosa sódica (alta viscosidad) A/V 3.00 g -Propilenglicol 10.00 g
-Metilparabeno 0.180 g
-Propilparabeno 0.020 g
-Trietanolamina 0.045 g
-Agua Destilada c.s.p. completar 100.00 g
La jalea terapéutica se elaboró con solución tampón con similar composición a la descrita para el AcM (pH 7.0 +/- 0.5). EJEMPLO 5
ESTUDIO HISTOLÓGICO DE LESIONES CUTÁNEAS DE PACIENTES CON PSORIASIS VULGAR
El estudio inrnunohistoquíπiico de lesiones cutáneas de pacientes con Psoriasis Vulgar se realizó sobre criosecciones de piel, se utilizó el AcM ior ti en paralelo con diferentes AcM dirigidos contra CD de linfocitos T ior t3 (anti CD3), ior t4 (anti CD4), ior t8 (anti CD8), ior L3 (anti CD45) y Dako CD6 (anti CD6) como control, además el ior egf/r3 (anti receptor del Factor de Creciminto Epidérmico). A continuación se incubaron las muestras con Conjugado de Carnero anti Inmunoglobulinas Murinas Biotinilado y Complejo Biotina-Avidina-Peroxidasa [Dako], finalmente se reveló con 3-amino-9-etil- carbazol [Sigma]. Las biopsias fueron analizadas por 2 especialistas y se ajustó la evaluación del CD6 a una escala de puntos:
< 10% (±), 10-25% (+), 25-50% (++), 50-90% (+++), 90- 100% (++++) . En los pacientes tratados se les tomó biopsia de las lesiones previo al inicio del tratamiento y al finalizar la tercera semana de tratamiento, en área aledaña a la biopsia inicial. La escala de clasificación de la respuesta al tratamiento fue cualitativa en porcientos y se estableció mediante el índice de mareaje de células CD6+ sobre el total de células CD45+, evaluado en cada biopsia. Se determinó además el porciento de expresión del receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico en las diferentes capas de la piel, así como las modificaciones de las características histológicas típicas de la enfermedad.
-Los linfocitos CD3+ representan aproximadamente el 100% de las células CD45+. -Se encontró que en el infiltrado inflamatorio característico de la Psoriasis
Vulgar existe expresión entre 60 - 90 % de células con fenotipo linfoide T CD6+.
-De las células marcadas con el Anticuerpo Monoclonal Dako CD6 sólo entre el 30 - 50% fueron marcadas con el Anticuerpo Monolonal ior ti . -La expresión en queratinocitos del Receptor del FCE fue elevada con patrón reticulado.
Resulta significativo el predominio de expresión de la molécula CD6+ en los linfocitos T del infiltrado inflamatorio de la Psoriasis Vulgar, por ser una molécula característica de linfocitos T activados, ésto nos induce a pensar que ésta puede constituir una molécula de adhesión leucocitaria en los linfocitos T inicialmente activados en piel por la penetración de antígenos exógenos o propios modificados, necesaria para la interacción con determinantes celulares específicos de la piel activada durante la respuesta a dichos antígenos. La diferencia de reconocimiento observada entre los Anticuerpos Monoclonales anti CD6 evaluados, apoya el planteamiento de la diferencia de epitopo reconocido por el ior ti .
EJEMPLO 6 RESPUESTA CLÍNICA DE PACIENTES CON PSORIASIS VULGAR A LA
TERAPÉUTICA TÓPICA CON EL AcM ior ti
Se realizó Ensayo Clínico en pacientes con Psoriasis Vulgar diagnosticada, en recidiva, con lesiones características de esta enfermedad. Se estructuró el estudio en dos grupos de pacientes definidos por la jalea que reciben como tratamiento tópico (AcM ior ti o vehículo) y se incluyeron 14 pacientes por grupo. Se utilizó una formulación terapéutica tópica formada por una jalea base o vehículo (CarboximetiTcelulosa sódica A/V, Propilenglicol, Metilparabeno, Propilparabeno, Trietanolamina) sobre la que se incorporó el AcM. El tratamiento se aplicó 2 veces al día sin oclusión de las lesiones tratadas, durante 21 días.
Todos los pacientes blanquearon las lesiones psoriásicas en placas tratados con el AcM ior ti (FIGURA 4). Este resultado corresponde con lo observado en la biopsia post- tratamiento realizada sólo 21 días después de iniciada la aplicación del AcM, donde se encontró disminución del infiltrado linfocitario T, disminución de la expresión del Receptor del EGF en queratinocitos y regresión de los signos histológicos característicos de la enfermedad. EJEMPLO 7
RELACIÓN DE LA RESPUESTA CLÍNICA CON LA DOSIS DE ANTICUERPO MONOCLONAL MURINO ior ti APLICADO TÓPICAMENTE EN LOS
PACIENTES CON PSORIASIS VULGAR.
Se realizó Ensayo Clínico en 19 pacientes con Psoriasis Vulgar diagnosticada en recidiva, con lesiones características de esta enfermedad. Se estructuró el estudio en tres grupos de pacientes definidos por la concentración de Anticuerpo Monoclonal ior ti contenida en la formulación terapéutica que recibieron como tratamiento tópico (0.3mg, lmg o 3mg de AcM ior ti) y se incluyeron 6, 7 y 6 pacientes respectivamente por grupo. Se utilizó una formulación terapéutica tópica formada por una jalea base o vehículo (Carboximetilcelulosa sódica A/V, Propilenglicol, Metilparabeno, Propilparabeno, Trietanolamina) sobre la que se incorporó el AcM. El tratamiento se aplicó 2 veces al día sin oclusión de las lesiones tratadas, durante 21 días.
La evolución clínica de los pacientes fue evaluada utilizando el PASI (Psoriatic Área and Severity Index) y simultáneamente se analizó en el suero de estos pacientes la aparición de la respuesta de anticuerpos humanos contra la inmunoglobulinas murinas (human anti mouse antibody - HAMA). Se observó la mejor respuesta clínica en el grupo de pacientes tratados con la dosis inferior del AcM ior ti (0.3mg) lo que se correspondió con el grupo de mayor frecuencia de aparición y los mayores títulos de respuesta HAMA. Se evaluó además la presencia de anticuerpos anti-idiotípicos (anti- AcM ior ti) por el método de ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) y por FACS (Fluorescent Activating Cell Sorter) y se observó mayor frecuencia de aparición y mayor título de respuesta de anticuerpos anti-idiotípos contra el ior ti en el mismo grupo de pacientes. EJEMPLO 8
RESPUESTA CLÍNICA DE UN PACIENTE CON FORMA SEVERA DE
PSORIASIS GENERALIZADA A LA TERAPÉUTICA ENDOVENOSA CON EL
AcM ior ti. Paciente femenina de 56 años de edad con antecedentes de presentar
Psoriasis con artropatía psoriásica diagnosticada hace aproximadamente 17 años, en los últimos 5 años con crisis frecuentes e intensas por lo que ha recibido varios ingresos. Comienza con brote de la enfermedad, con lesiones eritemato-escamosas generalizadas, dolores óseos y musculares, toma del estado general, febrícula y edemas generalizados, este cuadro se mantiene y
21 días más tarde aparece en pliegues submamarios, axilares y en el cuello lesiones fisuradas con exulceraciones con secresión serosa y fétida, acompañado de fiebre. Por la evolución tórpida de la enfermedad, la no tolerancia a ningún tratamiento tópico incluyendo cremas esteroideas se decide administrar tratamiento con Metotrexate (dosis total 15mg) 3 ciclos, sin aparecer respuesta clínica.
-Dosis única de AcM ior ti a 0.6 mg/kg de peso por vía endovenosa lenta, diluido en 200 mL de Solución Salina al 0.9%.
-Simultáneamente se administró durante 2 días, en todas las lesiones, dos veces al día, Jalea terapéutica que contiene el AcM ior ti a la concentración de 3mg de AcM / g de Jalea.
A partir del día 6 de realizarse el tratamiento la paciente comienza a mejorar su estado general y cuadro dermatológico. Se evaluó a los 21 días del tratamiento y presentaba aproximadamente el 60% de la superficie corporal sin lesiones y el resto de la piel con mejoría de los signos clínicos de la enfermedad, la paciente refiere mejoría de la sintomatología articular; presenta buen estado general, signos vitales normales y pruebas de rutina del laboratorio clínico sin alteraciones.
Treinta días después la paciente se mantiene con regresión completa de la síntomatología de la enfermedad. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS.
FIGURAS 1 y 2
Análisis para la modificación por humanización de epitopos T de las regiones variables de cadena pesada y ligera del Anticuerpo Monoclonal murino ior ti A.
Figura 1 : Secuencia de la región variable de la cadena pesada del AcM murino ior tlA
Figura 2: Secuencia de la región variable de la cadena ligera del AcM murino ior tlA
A: Secuencia de la región variable de la cadena pesada o ligera del Acm murino ior tlA
B: Secuencia de la región variable de la Ig humana que más se le parece al ior tlA C: Secuencia modificada de la región variable del ior ti A, por humanización de epitopos T.
Residuos de aminoácidos subrayados: aminoácidos involucrados en la estructura terciaria.
Letras en negrita: Regiones Determinantes de complementariedad (CDRs).
Residuos de aminoácidos enmarcados en un cuadro: cambios propuestos.
La descripción es similar para cadenas pesadas y ligeras.
FIGURA 3
Se presenta el resultado de la expresión del antígeno CD6 en linfocitos del infiltrado inflamatorio característicos de las lesiones cutáneas de pacientes con Psoriasis Vulgar. Esta evaluación se realizó en biopsias por congelación de piel afecta con lesiones localizadas en miembros superiores y/o inferiores y/ o tórax-abdomen en forma de placas. La evaluación histológica se realizó previo al tratamiento por técnicas de inmunohistoquímica.
FIGURA 4 La evaluación de la eficacia terapéutica del AcM anti CD6 utilizada en el tratamiento de la Psoriasis se realizó teniendo en cuenta las variables infiltración, escamas, eritema y tamaño del área de las lesiones, se estableció grado de severidad entre ios valores 0 - 1 - 2; se consideró además ia extensión de las placas tratadas midiendo 2 de sus diámetros. Se obtuvo un TITULO DE SEVERIDAD DE LA PSORIASIS (TSP) similar al PASI (psoriasis área and severity index) y la respuesta al tratamiento se estratifica de acuerdo a los cambios en el TSP al completar los tiempos de evaluación designados, estableciéndose las siguientes categorías: Blanqueamiento, Respondedor, No respondedor y Empeoramiento.
FIGURA 5
La respuesta clínica de los pacientes tratados tópicamente con el Anticuerpo Monoclonal ior ti contenido en la formulación terapéutica a diferentes dosis (0.3mg, lmg o 3mg de AcM ior ti) evaluada por PASI, se relacionó con la aparición de la respuesta de anticuerpos humanos contra la inmunoglobulinas murinas (human anti mouse antibody - HAMA) . Se observó la mejor respuesta clínica en el grupo de pacientes tratados con la dosis inferior del AcM ior ti (0.3mg) lo que se correspondió con el grupo de mayor frecuencia de aparición y los mayores títulos de respuesta HAMA.
FIGURA 6
Se le aplicó tratamiento con el Anticuerpo Monoclonal ior ti por vía endovenosa a una paciente de 56 años de edad con antecedentes de presentar
Psoriasis con artropatía psoriásica diagnosticada hace aproximadamente 17 años, ahora con Forma Severa de Psoriasis Generalizada caracterizada por lesiones eritemato-escamosas generalizadas, dolores óseos y musculares, toma del estado general, febrícula y edemas generalizados. Cuadro que no mejora con tratamiento médico, incluyendo Metotrexate. Se le aplicó tratamiento en dosis única de AcM ior ti a 0.6 mg/kg de peso por vía endovenosa lenta, diluido en 200mL de Solución Salina al 0.9%, simultáneamente se administró durante 2 días, en todas las lesiones, dos veces al día, Jalea terapéutica que contiene el AcM ior ti a la concentración de 3mg de AcM / g de Jalea, para un total de 224g de Jalea terapéutica. Se evaluó la respuesta clínica, inmunohistoquímica y de laboratorio clínico semanalmente, se muestran fotografías evolutivas de las lesiones cutáneas (día anterior al tratamiento y a los 21 días).

Claims

REIVIND ICACIONES
1. Anticuerpos monoclonales que reconocen el CD6 humano caracterizados porque son útiles para el diagnóstico y tratamiento de la Psoriasis.
2. Anticuerpos monoclonales que reconocen el CD6 humano según la reivindicación 1 caracterizados porque son subclones de anticuerpos monoclnnales murinos denominados ior ti, iυr LIA, así como cualquier variante humanizada obtenida a partir de ellos.
3. Anticuerpos monoclonales según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizados porque el subclon ior ti A obtenido a partir del hibridoma de igual nombre (Número de Depósito pendiente) presenta una región variable de su cadena pesada cuya secuencia es:
GLU VAL GLN LEU VAL GLU SER GLY GLY GLY LEU VAL
LYS PRO GLY GLY SER LEU LYS LEU SER CYS ALA ALA
SER GLY PHE LYS PHE SER ARG TYR ALA MLT SER TRP
VAL ARG GLN THR PRO GLU LYS ARG LEU GL' ! TRP VAL
ALA THR ILE SER SER GLY GLY SER TYR ILE TYR TYR
PRO ASP SER VAL LYS GLY ARG PHE THR ILE SER ARG
ASP AS1M VAL LYS ASN THR LEU TYR LEU GLN MET SER
SER LEU ARG SER GLU ASP THR ALA MET TYR TYR CYS
ALA ARG ARG ASP TYR ASP LEU ASP TYR PHE ASP SER
TRP GLY GLN GLY THR THR LEU THR VAL SER SER
y la región variable de su cadena ligera tiene una secuencia que corresponde con:
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) ASP ILE LYS MET THR GLN SER PRO SER SER MET TYR
ALA SER LEU GLY GLU ARG VAL THR ILE THR CYS LYS
ALA SER ARG ASP ILE ARG SER TYR LEU THR TRP TYR
GLN GLN LYS PRO TRP LYS SER PRO LYS THR LEU ILE TYR TYR ALA THR SER LEU ALA ASP GLY VAL PRO SER
ARG PHE SER GLY SER GLY SER GLY GLN ASP TYR SER
LEU THR ILE SER SER LEU GLU SER ASP ASP THR ALA
THR TYR TYR CYS LEU GLN HIS GLY GLU SER PRO PHE
THR PHE GLY SER GLY THR LYS LEU GLU ILE LYS ARG ALA
4. Anticuerpos monoclonales según las reivindicaciones de la 1 a la 3 caracterizados por ser una variante humanizada del subclon ior tlA cuya región variable de su cadena pesada tiene la secuencia:
GLU VAL GLN LEU VAL GLU SER GLY GLY GLY LEU VAL
LYS PRO GLY GLY SER LEU LYS LEU SER CYS ALA ALA
SER GLY PHE LYS PHE SER ARG TYR ALA MFT SER TRP
VAL ARG GLN ALA PRO GLY LYS ARG LEU GLU TRP VAL
ALA THR ILE SER SER GLY GLY SER TYR ILE TYR TYR
PRO ASP SER VAL LYS GLY ARG PHE THR ILF SER ARG
ASP ASN VAL LYS ASN THR LEU TYR LEU GLN MET SER
SER LEU ARG SER GLU ASP THR ALA MET TYR TYR CYS
ALA ARG ARG ASP TYR ASP LEU ASP TYR PHE ASP SER
TRP GLY GLN GLY THR LEU VAL THR VAL SER SER
y la secuencia de la región variable de su cadena ligera se corresponde con:
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) ASP ELE GLN MET THR GLN SER PRO SER SER LEU SER
ALA SER VAL GLY ASP ARG VAL THR ELE THR CYS LYS
ALA SER ARG ASP ELE ARG SER TYR LEU THR TRP TYR
GLN GLN LYS PRO GLY LYS ALA PRO LYS THR LEU ELE
TYR TYR ALA THR SER LEU ALA ASP GLY VAL PRO SER
ARG PHE SER GLY SER GLY SER GLY GLN ASP TYR SER
LEU THR ELE SER SER LEU GLU SER ASP ASP THR ALA
THR TYR TYR CYS LEU GLN HIS GLY GLU SER PRO PHE
TTHHRR PPHHEE GGLLYY SSEERR GGLLYY THR LYS LEU GLU ELE LYS ARG
5. Anticuerpos monoclonales según las reivindicaciones de la 1 a la 4 caracterizado porque dichos anticuerpos monoclonales reconoce en la molécula CD6 humana un epitopo de conformación estable e insensible a agentes reductores.
6. Anticuerpos monoclonales según las reivindicaciones de la 1 a la 3 caracterizados porque son isotipo IgG2a.
7. Anticuerpos monoclonales humanizados según la reivindicación 5 caracterizados porque son isotipo IgGl .
8. Uso de los anticuerpos de las reivindicaciones de la 1 a la 4 para la fabricación de un medicamento útil en el tratamiento de la Psoriasis.
9. Uso de los anticuerpos de las reivindicaciones de la 1 a la 4 para la fabricación de un reactivo útil en el diagnóstico "in vitro" e "in vivo" de la Psoriasis.
10. Composición farmacéutica para el tratamiento de la Psoriasis caracterizada porque contiene uno de los anticuerpos monoclonales de las reivindicaciones de la 1 a la 4.
11. Reactivo para el diagnóstico de la Psoriasis caracterizado porque contiene uno de los anticuerpos monoclonales de las reivindicaciones de la 1 a la 4.
PCT/CU1996/000004 1995-11-17 1996-11-18 Anticuerpos monoclonales anti-cd6 y sus utilizaciones WO1997019111A2 (es)

Priority Applications (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/875,674 US6572857B1 (en) 1995-11-17 1996-11-18 Anti-CD6 monoclonal antibodies and their uses
AT96939805T ATE280783T1 (de) 1995-11-17 1996-11-18 Monoklonale anti-cd6 antikörper zur behandlung und diagnose von psoriasis
CA002210751A CA2210751C (en) 1995-11-17 1996-11-18 Anti-cd6 monoclonal antibodies and their uses
DK96939805T DK0807125T3 (da) 1995-11-17 1996-11-18 Monoklonale antistoffer mod CD6 til behandling og diagnosticering af psoriasis
AU76905/96A AU722882B2 (en) 1995-11-17 1996-11-18 Anti-CD6 monoclonal antibodies and their uses
DE69633717T DE69633717T2 (de) 1995-11-17 1996-11-18 Monoklonale anti-cd6 antikörper zur behandlung und diagnose von psoriasis
KR1019970704893A KR100533854B1 (ko) 1995-11-17 1996-11-18 항-cd6 단일클론항체 및 이를 포함하는 건선치료용 약제조성물
EP96939805A EP0807125B1 (en) 1995-11-17 1996-11-18 Monoclonal antibodies anti-cd6 for the treatment and diagnosis of psoriasis
BRPI9607171A BRPI9607171B1 (pt) 1995-11-17 1996-11-18 anticorpo monoclonal anti-cd6 humano, usos dos mesmos para o diagnóstico in vitro de psoríase, composição farmacêutica e reagente contendo o dito anticorpo
JP51926797A JP4113929B2 (ja) 1995-11-17 1996-11-18 アンチｃｄ６モノクロナール抗体とその利用

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CU1995120A CU22584A1 (es) 1995-11-17 1995-11-17 Composiciones farmacéuticas que contienen un anticuerpo monoclonal que reconoce el antígeno de diferenciación leucocitario humano cd6 y sus usos para el diagnóstico y tratamiento de la psoriasis

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ES (1) ES2231826T3 (es)
PT (1) PT807125E (es)
WO (1) WO1997019111A2 (es)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
LT5354B (lt) 2002-10-23 2006-07-25 Centro De Immunologia Molecular Ląstelių linijų išskyrimo baltymų neturinčioje terpėje būdas ir šiuo būdu išskirtos ląstelių linijos
WO2008077355A1 (es) * 2006-12-26 2008-07-03 Centro De Inmunolgía Molecular Composición farmaceutica que comprende un anticuerpo monoclonal anti-cd6 utilizado en el diagnóstico y tratamiento de la artritis reumatoide
WO2008077356A1 (es) * 2006-12-26 2008-07-03 Centro De Inmunolgía Molecular Composiciones farmacéuticas con capacidad de inducción de apoptosis en células tumorales, útiles para el diagnóstico y tratamiento de la leucemia linfocítica crónica b.
US10000573B2 (en) 2008-03-14 2018-06-19 Centro De Immunologia Molecular Monoclonal antibody and a method thereof
US10189899B2 (en) 2013-07-23 2019-01-29 Biocon Limited Use of a CD6 binding partner and method based thereon
US11242401B2 (en) 2016-10-21 2022-02-08 Biocon Limited Monoclonal antibody and a method of use for the treatment of lupus
US11981743B2 (en) 2008-03-14 2024-05-14 Biocon Limited Monoclonal antibody and a method thereof

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001091793A1 (en) * 2000-05-26 2001-12-06 Smithkline Beecham Corporation Anti-rank ligand monoclonal antibodies useful in treatment of rank ligand mediated disorders
WO2004074318A2 (en) 2003-02-24 2004-09-02 Institut Pasteur Secreted chlamydia polypeptides, polynucleotides coding therefor, therapeutic and diagnostic uses thereof.
HUE031207T2 (hu) 2008-01-11 2017-07-28 Adheron Therapeutics Inc Cadherin-11 EC1 domén elleni antitestek gyulladásos ízületi rendellenességek kezeléséhez
CN107090039A (zh) * 2010-07-15 2017-08-25 亚德赫伦医疗公司 靶向于钙粘着蛋白‑11的ec1结构域的人源化抗体及相关组合物和方法
EP3578205A1 (en) 2010-08-06 2019-12-11 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
NZ608972A (en) 2010-10-01 2015-09-25 Moderna Therapeutics Inc Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US8710200B2 (en) 2011-03-31 2014-04-29 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids encoding a modified erythropoietin and their expression
US9910039B2 (en) 2011-07-01 2018-03-06 Beckman Coulter, Inc. Regulatory T cells and methods of identifying, obtaining and using to treat immuno-based disorders
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
CA2850624A1 (en) 2011-10-03 2013-04-11 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
CN110201187A (zh) 2011-12-16 2019-09-06 现代泰克斯公司 经修饰的核苷、核苷酸和核酸组合物
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
AU2013243952A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US10501512B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides
PT2922554T (pt) 2012-11-26 2022-06-28 Modernatx Inc Arn modificado nas porções terminais
FR3000216B1 (fr) * 2012-12-21 2015-02-06 Galderma Res & Dev Utilisation de proteases particulieres pour la detection de trichophytons et de pathologies associees
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
US10323076B2 (en) 2013-10-03 2019-06-18 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
CN105504062B (zh) * 2015-12-25 2019-06-04 百泰生物药业有限公司 一种抗CD6单抗T1h的检测性抗体及应用
WO2019169015A1 (en) * 2018-02-27 2019-09-06 Equillium, Inc. Anti cd6 antibodies for treating severe asthma
EP3813951A1 (en) 2018-06-29 2021-05-05 City of Hope Cd6 targeted chimeric antigen receptors for treatent of certain autoimmune disorders
AU2020229830A1 (en) 2019-02-26 2021-09-16 Equillium, Inc. Anti-CD6 antibody compositions and methods for treating lupus
EP4084808A1 (en) 2019-12-30 2022-11-09 City of Hope Methods of making and using regulatory t cells and effector t cells having chimeric antigen receptors targeted to cd6, cd19, and/or an il-13r for treatment of autoimmune disorders and cancers
CA3231281A1 (en) 2021-09-08 2023-03-16 Yanelda De Los Angeles Garcia Vega Use of anti-cd6 monoclonal antibodies in the prevention of cellular and organ damage resulting from hyper-inflammatory response

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995012614A1 (en) * 1993-11-02 1995-05-11 Duke University Cd6 ligand
EP0699755A2 (en) * 1994-06-30 1996-03-06 Centro de Inmunologia Molecular Method for obtaining modified immunoglobulins with reduced immunogenicity of murine antibody variable domains, compositions containing them

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995012614A1 (en) * 1993-11-02 1995-05-11 Duke University Cd6 ligand
EP0699755A2 (en) * 1994-06-30 1996-03-06 Centro de Inmunologia Molecular Method for obtaining modified immunoglobulins with reduced immunogenicity of murine antibody variable domains, compositions containing them

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C. GARCIA ET AL.: "Therapeutic effects of IOR-T1 (anti-CD6) murine monoclonal antibody in patients with T-cell lymphomas." JOURNAL OF CELLULAR BIOCHEMISTRY, SUPPLEMENT, vol. 0, no. 18 part D, 1994, page 106 XP000646495 USA *
J. LIMONTA ET AL.: "Production of active anti-CD6 mouse/human chimeric antibodies in the milk of transgenic mice." IMMUNOTECHNOLOGY, vol. 1, no. 2, August 1995 (1995-08), pages 107-113, XP000647504 *
L. OSORIO ET AL.: "The anti-CD6 mAb, IOR-T1, defined a new epitope on the human CD6 molecule that induces greater responsiveness in T cell receptor/CD3-mediated T cell proliferation." CELLULAR IMMUNOLOGY, vol. 154, no. 1, March 1994 (1994-03), pages 123-133, XP000647384 NEW YORK, NY, USA *
M. COLOMA ET AL.: "Primer design for the cloning of immunoglobulin heavy-chain leader-variable regions from mouse hybridoma cells using the PCR." BIOTECHNIQUES, vol. 11, no. 2, August 1991 (1991-08), pages 152-156, XP000647450 NATICK, MA, USA *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
LT5354B (lt) 2002-10-23 2006-07-25 Centro De Immunologia Molecular Ląstelių linijų išskyrimo baltymų neturinčioje terpėje būdas ir šiuo būdu išskirtos ląstelių linijos
EP2363418A2 (en) 2002-10-23 2011-09-07 Centro de Inmunologia Molecular Method of obtaining recombinant mammalian myeloma cell lines adapted to growth in serum- and protein-free media
WO2008077355A1 (es) * 2006-12-26 2008-07-03 Centro De Inmunolgía Molecular Composición farmaceutica que comprende un anticuerpo monoclonal anti-cd6 utilizado en el diagnóstico y tratamiento de la artritis reumatoide
WO2008077356A1 (es) * 2006-12-26 2008-07-03 Centro De Inmunolgía Molecular Composiciones farmacéuticas con capacidad de inducción de apoptosis en células tumorales, útiles para el diagnóstico y tratamiento de la leucemia linfocítica crónica b.
AU2007336563B2 (en) * 2006-12-26 2012-11-01 Centro De Inmunologia Molecular Pharmaceutical composition, comprising an anti-CD6 monoclonal antibody used in the diagnosis and treatment of rheumatoid arthritis
AU2007336564B2 (en) * 2006-12-26 2012-11-01 Centro De Inmunologia Molecular Pharmaceutical compositions capable of inducing apoptosis in tumour cells, useful for diagnosis and treatment of B-Chronic Lymphocytic Leukaemia
US10000573B2 (en) 2008-03-14 2018-06-19 Centro De Immunologia Molecular Monoclonal antibody and a method thereof
US10669346B2 (en) 2008-03-14 2020-06-02 Biocon Limited Monoclonal antibody and a method thereof
US11981743B2 (en) 2008-03-14 2024-05-14 Biocon Limited Monoclonal antibody and a method thereof
US10189899B2 (en) 2013-07-23 2019-01-29 Biocon Limited Use of a CD6 binding partner and method based thereon
US11028168B2 (en) 2013-07-23 2021-06-08 Biocon Limited Use of a CD6 binding partner and method based thereon
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