BR112020017956A2 - Anticorpos anti-spla2-gib terapêuticos e os usos dos mesmos - Google Patents
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Abstract
a presente invenção se refere a anticorpos humanos ou humanizados que se ligam a pla2-gib, sua produção e os usos dos mesmos. esses anticorpos exibem características vantajosas, em particular, para propósitos terapêuticos e diagnósticos.
Description
“ANTICORPOS ANTI-SPLA2-GIB TERAPÊUTICOS E OS USOS DOS MESMOS”
[0001] A presente invenção se refere a anticorpos que se ligam a PLA2-GIB, sua produção e os usos dos mesmos. Esses anticorpos exibem características vantajosas, em particular, para propósitos terapêuticos e diagnósticos.
[0002] A fosfolipase A2 secretada pancreática de grupo IB (PLA2-GIB) é uma proteína secretada de baixo peso molecular (14 kD), altamente estável (7 ligações de dissulfeto), que catalisa a hidrólise da ligação de acila graxa sn-2 de fosfolipídeos para liberar ácidos graxos livres e lisofosfolipídeos (Lambeau & Gelb 2008). Em humanos, o gene PLA2-G1B é principalmente expresso no pâncreas, com níveis de expressão mais fracos no duodeno, jejuno e estômago (Eskola et al. 1983a) (Nevalainen & Haapanen 1993). A expressão marginal foi descrita em outros tecidos, como o pulmão, olhos (Kolko et al. 2007) e testículos. No pâncreas humano, PLA2-GIB é principalmente sintetizada em porção apical de grânulo de zimogênio de células acinares pancreáticas (Eskola et al. 1983a). sPLA2- GIB também foi detectada em grânulos secretores de insulina de células β de ilhota pancreática e deve ser cossecretada com insulina das ilhotas estimuladas por glicose (Ramanadham et al. 1998). A enzima é liberada no suco pancreático como uma pró-forma inativa e é ativada por clivagem proteolítica de um pró-peptídeo para gerar a forma secretada madura (sPLA2-GIB). Os experimentos in vitro sugerem que a tripsina e plasmina são capazes de ativar pró-sPLA2-GIB com potência satisfatória (Nakano et al. 1994).
[0003] Além de uma função no trato gastrointestinal, PLA2-GIB também circula no plasma humano ((Nishijima et al. 1983) (Eskola et al. 1983b) (Sternby 1984) (Nevalainen et al. 1985) (Kitagawa et al. 1991)). Recentemente, PLA2-GIB foi identificada como desempenhando uma função crucial no mecanismo subjacente à falta de resposta dos linfócitos T CD4 em pacientes virêmicos infectados pelo HIV. Em particular, demonstrou-se que sPLA2-IB é a proteína responsável pela inativação crônica de linfócitos T CD4, que conduzem a mesma para um estado anormal de diferenciação de ativação que torna a mesma refratária a certos sinais fisiológicos como aqueles entregues por interleucina-7 (THEZE Jacques et al. 2015).
[0004] Portanto, há uma necessidade de anticorpos contra PLA2-GIB que permite uma inibição da atividade enzimática de PLA2-GIB.
[0005] A presente invenção fornece anticorpos anti-PLA2- GIB e métodos de uso dos mesmos. Mais particularmente, a invenção fornece anticorpos terapêuticos contra sPLA2-GIB humana que pode neutralizar uma atividade enzimática de sPLA2-GIB.
[0006] Um objetivo da invenção se refere, mais particularmente, a anticorpos humanos ou humanizados, ou derivados dos mesmos, que se ligam à sPLA2-GIB humana.
[0007] Os anticorpos humanos ou humanizados preferenciais da invenção se ligam a um epítopo que compreende pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado a partir de W3, R6, K7, K10, C77, Y75, G79 e S80 de sPLA2- GIB humana. Os anticorpos adicionalmente preferenciais da invenção são anticorpos de neutralização. Os exemplos específicos de tais anticorpos são anticorpos nº 2B, nº 2B1 e nº 2B2.
[0008] Um outro objetivo da invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo ou derivado como definido acima, ou uma cadeia leve ou pesada do mesmo ou um domínio variável do mesmo.
[0009] A invenção também se refere a um vetor que compreende um ácido nucleico como definido acima, bem como a uma célula hospedeira recombinante que contém tal vetor ou molécula de ácido nucleico.
[0010] Um objetivo adicional da invenção consiste em uma composição farmacêutica que compreende (i) um anticorpo ou derivado, um ácido nucleico, um vetor ou uma célula hospedeira recombinante, como definido acima, e (ii) um excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável.
[0011] A invenção também se refere a um anticorpo ou derivado, um ácido nucleico, um vetor, uma célula hospedeira recombinante ou uma composição, como definido acima, para uso como um medicamento, particularmente, no tratamento de um transtorno imunológico, em um indivíduo em necessidade do mesmo.
[0012] A invenção também se refere a um método para tratar um indivíduo em necessidade do mesmo, particularmente, um indivíduo que tem um transtorno imunológico, que compreende administrar ao indivíduo um anticorpo ou derivado, um ácido nucleico, um vetor, uma célula hospedeira recombinante ou uma composição, como definido acima.
[0013] Um objetivo adicional da invenção se refere a um método para produzir um anticorpo como definido acima, que compreende cultivar uma célula como definido acima sob condições adequadas para expressão do anticorpo e, opcionalmente, recuperar o dito anticorpo.
[0014] Os anticorpos terapêuticos da invenção podem ser usados em qualquer mamífero, particularmente, qualquer indivíduo humano em necessidade dos mesmos. Os mesmos são adequados para inibir PLA2-GIB e corrigir qualquer doença associada à atividade indesejada da dita proteína.
[0015] Figura 1: Propriedades de anticorpo monoclonal 14G9. A: inibição de atividade enzimática de sPLA2-GIB. B: curvas de diluição em ELISA indireto. C: curvas de diluição em ELISA comparativo.
[0016] Figura 2: Inibição de anticorpo monoclonal 14G9 do efeito inibitório de plasma isolado de pacientes infectados por HIV-1 na translocação nuclear de fosfoSTAT5 em células T CD4 de um doador saudável. Nenhum efeito foi observado usando um mAb de controle de isotipo.
[0017] Figura 3: Inibição por 10 µg de anticorpo monoclonal 14G9 do efeito inibitório de plasma isolado de pacientes infectados por HIV-1 na translocação nuclear de fosfoSTAT5 em células T CD4 de 5 doadores saudáveis diferentes. Nenhum efeito foi observado usando 10 µg de um mAb de controle de isotipo ou o mAb nº 6F7 não inibitório.
[0018] Figura 4: Inibição in vivo por 1 mg de anticorpo monoclonal 14G9 do efeito inibitório de 100 µg de sPLA2-GIB na translocação nuclear de fosfoSTAT5 em células T CD4 isoladas de esplenócitos de camundongos. Nenhum efeito significativo foi observado ao injetar 900 µg de um mAb de controle de isotipo.
[0019] Figura 5: Estimativa de afinidade de variantes humanizadas por 14G9 por ELISA comparativo
[0020] Figura 6: Desnaturação térmica normalizada de anticorpos humanizados nº 1A, nº 1B, nº 2A e nº 2B.
[0021] Figura 7: Análise de SEC de nº 2B. Painel superior, cromatograma de SEC de nº 2B. Painel médio, linha de base ampliada. Painel inferior, linha de base ampliada com atribuição de pico.
[0022] Figura 8: Desnaturação térmica normalizada de anticorpos humanizados nº 2B1 e nº 2B2.
[0023] Figura 9: Análise de citometria de fluxo da ligação de IgG monomérica de anticorpos humanizados nº 2B, nº 2B1 e nº 2B2 a FcγRs humanos.
[0024] Figura 10: Análise de citometria de fluxo dos complexos imunológicos ligação de nº 2B a FcγRs humanos.
[0025] Figura 11: Análise de citometria de fluxo de ligação residual de antígeno em células sensibilizadas por anticorpo de anticorpos humanizados nº 2B, nº 2B1 e nº 2B2 a FcγRs humanos.
[0026] Figura 12: Estrutura de cristal do complexo de Fab nº 2B2/sPLA2-IB. As estruturas principais de sPLA2-GIB são descritas em cinza e roxo, a cadeia leve de Fab nº 2B2 está na cor azul claro e rosa e a cadeia pesada de Fab nº 2B2 está na cor verde e amarelo (A). Ligações não covalentes no complexo de Fab nº 2B2/sPLA2-GIB, a estrutura principal de sPLA2-GIB está na cor amarela, a cadeia leve de Fab nº 2B2 está na cor azul claro e a cadeia pesada de
Fab nº 2B2 está na cor verde (B).
[0027] Figura 13: Inibição por 14G9 ou nº 2B do efeito inibitório de sPLA2-GIB (A) ou de plasma isolado de pacientes infectados por HIV-1 (B) na translocação nuclear de fosfoSTAT5 em células T CD4 a partir de um doador saudável.
[0028] Figura 14: Inibição In vivo por 1 ou 2 mg de nº 2B2 do efeito inibitório de 100 µg de sPLA2-GIB na translocação nuclear de fosfoSTAT5 em células T CD4 isoladas de esplenócitos de camundongos. Nenhum efeito significativo foi observado ao injetar 1 mg µg de um mAb de controle de isotipo.
[0029] Tabela 1: Identidade em porcentagem entre genes V de camundongo ou suas versões humanizadas com linhagem germinativa humana variável usada como sequências aceitadoras.
[0030] Tabela 2: Detalhes das diferenças em sequência através dos genes V entre as versões humanizadas e suas linhagens germinativas humanas correspondentes.
[0031] Tabela 3: Inibição de atividade enzimática de sPLA2-GIB por anticorpos humanizados. Os resultados são expressos como % de controle.
[0032] Tabela 4: IC50 estimada dos diferentes anticorpos humanizados obtidos por ELISA comparativo para sPLA2-GIB humana recombinante e pró-sPLA2-GIB humana recombinante.
[0033] Tabela 5: Calorimetria de Varredura Diferencial de anticorpos humanizados. Tm são temperaturas de desnaturação/fusão. Início de T são temperaturas em que a transição de desdobramento começa. T1/2 é a largura da transição na metade da altura do pico. ΔH é a entalpia calorimétrica de desdobramento e reflete a interrupção das interações intramoleculares da proteína. Área Total é a entalpia completa de desdobramento (área total sob o termograma) e reflete a estabilidade termodinâmica.
[0034] Tabela 6: Análise de SEC-HPLC de anticorpos humanizados nº 1A, nº 1B, nº 2A e nº 2B.
[0035] Tabela 7: Determinação de Kd para sPLA2-GIB humana recombinante e pró-sPLA2-GIB humana recombinante por Ressonância de Plasmon de Superfície dos anticorpos humanizados nº 2B, nº 2B1 e nº 2B2.
[0036] Tabela 8: Calorimetria de Varredura Diferencial de anticorpos humanizados nº 2B1 e nº 2B2. Tm são temperaturas de desnaturação/fusão. Início de T são temperaturas em que a transição de desdobramento começa. T1/2 é a largura da transição na metade da altura do pico. ΔH é a entalpia calorimétrica de desdobramento e reflete a interrupção das interações intramoleculares da proteína. Área Total é a entalpia completa de desdobramento (área total sob o termograma) e reflete a estabilidade termodinâmica.
[0037] Tabela 9: Análise de SEC-HPLC dos anticorpos humanizados nº 2B1 e nº 2B2.
[0038] Tabela 10: Análise de focalização isoelétrica capilar imageada (icIEF) dos anticorpos humanizados nº 2B, nº 2B1 e nº 2B2. pI aparente médio das diferentes variantes de carga presentes nas amostras.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Anticorpos
[0039] A presente invenção tem como base a geração de anticorpos humanizados e humanos inovadores que são terapeuticamente úteis para modular de modo eficaz e seletivo a atividade de PLA2-GIB em um indivíduo humano.
[0040] Como usado no presente documento, o termo “PLA2- GIB” designa a fosfolipase A2 pancreática do grupo IB. PLA2-GIB foi identificada e clonada a partir de várias espécies de mamíferos. A proteína PLA2-GIB humana é revelada, por exemplo, em Lambeau e Gelb (2008). A sequência é disponível em Genbank nº NP_000919.
[0041] A sequência de aminoácidos de uma PLA2-GIB humana exemplificativa é mostrada abaixo (SEQ ID NO: 1).
[0042] Os aminoácidos 1 a 15 de SEQ ID NO: 1 (sublinhado) são uma sequência de sinal, e os aminoácidos 16 a 22 de SEQ ID NO: 1 (em negrito) são uma sequência de pró-peptídeos.
[0043] Dentro do contexto da invenção, o termo “PLA2- GIB” designa, de preferência, PLA2-GIB humana.
[0044] A proteína de PLA2-GIB humana pode estar presente em duas formas distintas: uma pró-forma inativa (pró-sPLA2- GIB), que é ativada por clivagem proteolítica de um pró- peptídeo, levando à forma secretada madura (sPLA2-GIB). O termo PLA2-GIB inclui qualquer forma da proteína, como a pró-forma e/ou a forma madura. Tipicamente, a forma secretada madura compreende a sequência de resíduos de aminoácido 23-148 de SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 14) ou quaisquer variantes naturais da mesma, como variantes Resultantes de polimorfismo ou splicing.
[0045] SEQ ID NO: 14:
[0046] O termo “pró-sPLA2-GIB” ou “proPLA2-GIB” designa, de preferência, uma proteína que compreende a sequência de resíduos de aminoácido 16-148 de SEQ ID NO: 1 ou quaisquer variantes naturais da mesma, como variantes resultantes de polimorfismo ou splicing.
[0047] O requerente gerou vários anticorpos monoclonais contra sPLA2-GIB. Foi constatado que um dos mesmos, anticorpo nº 14G9, exibe atividade de neutralização notável e é seletivo para sPLA2-GIB. O requerente caracterizou adicionalmente esse anticorpo monoclonal, suas regiões variáveis, bem como o epítopo do mesmo. Em particular, como mostrado na seção experimental, o anticorpo 14G9 se liga a um epítopo que compreende resíduos de aminoácido W3, R6, K7, K10, C77, Y75, G79 e S80 de sPLA2-GIB humana, por referência a SEQ ID NO: 14. O requerente também foi capaz de produzir anticorpos humanizados com base em 14G9 e de demonstrar sua atividade notável in vitro e in vivo.
[0048] A invenção se refere, desse modo, a anticorpos humanos ou humanizados isolados contra PLA2-GIB.
[0049] A invenção fornece mais especificamente anticorpos humanos ou humanizados que se ligam seletivamente à PLA2-GIB humana e neutralizam a mesma.
[0050] As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são anticorpos quiméricos que contêm sequências mínimas derivadas de imunoglobulina não humana enxertada em um arcabouço humano (por exemplo, domínio constante humano de cadeias de anticorpo). Para a maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) nas quais os resíduos de região hipervariável do recipiente são substituídos por resíduos de região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) como camundongo, rato, coelho ou primata não humano que tem a especificidade, a afinidade e a capacidade desejadas. Adicionalmente, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recipiente ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar adicionalmente o desempenho de anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreende substancialmente todos dentre pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreende opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323.329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)).
[0051] Um "anticorpo humano" é um anticorpo que tem uma sequência de aminoácidos que corresponde à de um anticorpo produzido por um humano e/ou que foi feito com o uso de qualquer uma das técnicas para produzir anticorpos humanos como revelado no presente documento. Os anticorpos humanos podem ser produzidos com o uso de várias técnicas conhecidas per se na técnica, incluindo bibliotecas de exibição de fago (Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Também disponíveis para a preparação de anticorpos humanos monoclonais estão os métodos descritos em Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(l):86- 95 (1991). Consulte também van Dijk e van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Os anticorpos humanos podem ser preparados pela administração do antígeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir tais anticorpos em resposta a estímulo antigênico, mas cujos loci endógenos foram desabilitados, por exemplo, xenocamundongo imunizado (consulte, por exemplo, as Patentes US 6.075.181 e US 6.150.584 a respeito da tecnologia XENOMOUSE™) e substituídos por loci humanos. Consulte, também, por exemplo, Li et ah, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) referente aos anticorpos humanos gerados através de uma tecnologia de hibridoma de célula B humana.
[0052] Os anticorpos da invenção podem ser policlonais, monoclonais ou derivados dos mesmos que retêm a mesma especificidade antigênica, como, por exemplo, nanocorpos humanizados ou ScFv, por exemplo. Os anticorpos da invenção são, de preferência, anticorpos monoclonais, isto é, anticorpos que são, cada um, direcionados contra um sítio antigênico único. Os anticorpos da presente invenção podem ser preparados pelos métodos conhecidos per se na técnica, como pelo método de hibridoma primeiramente descrito por Kohler et ah, Nature 256:495 (1975), ou pelos métodos de
DNA recombinante. Os mesmos também podem ser isolados das bibliotecas de anticorpo de fago usando as técnicas descritas em Clackson et ah, Nature 352:624-628 (1991) e Marks et ah, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por exemplo.
[0053] A invenção fornece particularmente anticorpos monoclonais humanos ou humanizados que se ligam seletivamente à PLA2-GIB humana e neutralizam a mesma.
[0054] Em modalidades preferenciais, os anticorpos da invenção são anticorpos humanizados monoclonais.
[0055] Em uma modalidade mais preferencial, a invenção se refere a anticorpos humanizados monoclonais ou humanos que se ligam à sPLA2-GIB humana, de preferência, um epítopo que compreende pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado a partir de W3, R6, K7, K10, C77, Y75, G79 e S80 de sPLA2-GIB humana (por referência a SEQ ID NO: 14), com mais preferência, um epítopo que compreende pelo menos 2 ou pelo menos 3 resíduos de aminoácido selecionados a partir de W3, R6, K7, K10, C77, Y75, G79 e S80 de sPLA2-GIB humana, ainda com mais preferência, um epítopo que compreende pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6 ou pelo menos 7 resíduos de aminoácido selecionados a partir de W3, R6, K7, K10, C77, Y75, G79 e S80 de sPLA2-GIB humana. A invenção mostra que os anticorpos que se ligam a tais resíduos exibem atividade de neutralização potente e representam agentes terapêuticos valiosos para inibição in vivo de PLA2-GIB humana.
[0056] Em uma modalidade particular, os anticorpos ou derivados da invenção inibem competitivamente a ligação de anticorpo monoclonal 14G9 à sPLA2-GIB humana, em que o dito anticorpo monoclonal 14G9 compreende uma região variável de cadeia leve que compreende SEQ ID NO: 2 e uma região variável de cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 3.
[0057] Em uma outra modalidade particular, os anticorpos ou derivados da invenção inibem competitivamente a ligação de anticorpo monoclonal nº 2B, à sPLA2-GIB humana, em que o dito anticorpo monoclonal nº 2B compreende uma cadeia leve que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 4 e uma cadeia pesada que compreende ou que consiste em SEQ ID NO: 5.
[0058] Em uma modalidade particular, os anticorpos ou derivados da invenção inibem competitivamente a ligação de anticorpo monoclonal nº 2B1, à sPLA2-GIB humana, em que o dito anticorpo monoclonal nº 2B1 compreende uma cadeia leve que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 4 e uma cadeia pesada que compreende ou que consiste em SEQ ID NO: 6.
[0059] Em uma outra modalidade particular, os anticorpos ou derivados da invenção inibem competitivamente a ligação de anticorpo monoclonal nº 2B2, à sPLA2-GIB humana, e que o dito anticorpo monoclonal nº 2B2 compreende uma cadeia leve que compreende ou consiste em SEQ ID NO: 4 e uma cadeia pesada que compreende ou que consiste em SEQ ID NO: 7.
[0060] O termo “inibe competitivamente” indica que o anticorpo pode reduzir ou inibir ou deslocar a ligação de um anticorpo de referência à sPLA2-GIB. Os ensaios de competição podem ser realizados com o uso de técnicas padrão, como, por exemplo, ensaios de ELISA competitivos ou outros ensaios de ligação. Tipicamente, um ensaio de ligação competitiva envolve um antígeno-alvo purificado, em geral, ligado a um substrato sólido ou células, um anticorpo de teste não identificado e um anticorpo de referência identificada. A inibição competitiva é medida pela determinação da quantidade de anticorpo identificado ligado na presença do anticorpo de teste. Usualmente, o anticorpo de teste está presente em excesso, como cerca de 5 a 500 vezes a quantidade de anticorpo de referência. Tipicamente, para ELISA, o anticorpo de teste está 100X em excesso e, para métodos enzimáticos, o anticorpo de teste está em 10X em excesso. Quando um anticorpo de teste presente em excesso inibe ou desloca pelo menos 70 % da ligação do anticorpo de referência ao antígeno, o mesmo é considerado como inibidor de modo competitivo do dito anticorpo de referência. Em uma modalidade específica, quando um anticorpo de teste presente com excesso de 100X inibe ou desloca pelo menos 70 %, com mais preferência, pelo menos 80 % da ligação do anticorpo de referência ao antígeno em ELISA, o mesmo é considerado como inibidor de modo competitivo ao dito anticorpo de referência. a. Os anticorpos competidores preferenciais se ligam aos epítopos que compartilham resíduos de aminoácidos comuns.
[0061] Em uma modalidade particular, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal que compreende: (i) uma região variável de cadeia leve que compreende uma CDR-L1, uma CDR-L2, uma CDR-L3 e uma FR-L, em que a CDR-L1, CDR-L2 e/ou CDR-L3 consistem ou consistem essencialmente em CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, respectivamente, da região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 2, e em que uma FR-L é de uma sequência de imunoglobulinas humanas; e (ii) uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR-H1, uma CDR-H2, uma CDR-H3 e uma FR-H, em que a CDR-H1, CDR-H2 e/ou CDR-H3 consistem ou consistem essencialmente em CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, respectivamente,
da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 3, e em que uma FR-H é de uma sequência de imunoglobulinas humanas.
[0062] A “região variável” de um anticorpo se refere aos domínios de terminal amino da cadeia leve ou pesada (“VH” ou “VL”), que contém os sítios de ligação de antígeno. Uma cadeia leve ou pesada região variável (VL ou VH) consiste geralmente em uma região de arcabouço (“FR”) interrompida por três regiões hipervariáveis chamadas de "regiões de determinação de complementaridade" ou "CDRs". A extensão da região de arcabouço e das CDRs foi precisamente definida, por exemplo, como em Rabat (consulte "Sequences of Proteins of Immunological Interest," E. Rabat et ah, EUA Department of Health and Human Services, (1983)), e como em Chothia.
[0063] Com referência a SEQ ID NO: 2, as três regiões de CDR correspondem aos seguintes resíduos de aminoácido: . CDR-L1: resíduos de aminoácido QDVSTA, . CDR-L2: resíduos de aminoácido WAS, . CDR-L3: resíduos de aminoácido QQDYSTPPT.
[0064] Com referência a SEQ ID NO: 3, as três regiões de CDR correspondem aos seguintes resíduos de aminoácido: . CDR-H1: resíduos de aminoácido GYTFTNYW, . CDR-H2: resíduos de aminoácido IDPSDTRT, . CDR-H3: resíduos de aminoácido ARQTLYYEALDY.
[0065] Em uma modalidade particular, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal selecionado a partir de: . um anticorpo monoclonal que compreende uma cadeia leve que compreende, que consiste essencialmente em ou que consiste em SEQ ID NO: 4 e uma cadeia pesada que compreende, que consiste essencialmente em ou que consiste em SEQ ID NO: 5 (clone nº 2B);
. um anticorpo monoclonal que compreende uma cadeia leve que compreende, que consiste essencialmente em ou que consiste em SEQ ID NO: 4 e uma cadeia pesada que compreende, que consiste essencialmente em ou que consiste em SEQ ID NO: 6 (clone nº 2B1); . um anticorpo monoclonal que compreende uma cadeia leve que compreende, que consiste essencialmente em ou que consiste em SEQ ID NO: 4 e uma cadeia pesada que compreende, que consiste essencialmente em ou que consiste em SEQ ID NO: 7 (clone nº 2B2); e . derivados dos mesmos.
[0066] O termo “anticorpo derivado”, como usado no presente documento, se refere a um anticorpo que retém a especificidade antigênica de um anticorpo de referência, mas em que um ou mais resíduos de aminoácido são (química ou biologicamente) modificados para aprimorar suas propriedades.
[0067] Os exemplos de tais modificações químicas incluem, por exemplo, alquilação, PEGuilação, acilação, formação de éster ou amida e similares. Em particular, um derivado é um anticorpo como revelado no presente documento que é modificado para conter uma ou mais frações não proteináceas adicionais, como polímeros solúveis em água. Os exemplos de polímeros solúveis em água incluem, mas não são limitados a, PEG, copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carboximetilcelulose, dextrano e álcool polivinílico.
[0068] Os derivados também podem ser gerados para aumentar ou diminuir a extensão em que o anticorpo é glicosilado. A adição ou deleção de sítios de glicosilação a um anticorpo pode ser convenientemente realizada pela alteração da sequência de aminoácidos de modo que um ou mais sítios de glicosilação sejam criados ou removidos. Onde o anticorpo compreender uma região de Fc, o carboidrato fixado a isso pode ser alterado. Os anticorpos nativos produzidos por células de mamífero compreendem tipicamente um oligossacarídeo biantenário ramificado que é, em geral, fixado por uma ligação N a Asn297 do domínio de CH2 da região de Fc (consulte, por exemplo, Wright et al. TIBTECH, 1997, 15:26-32). O oligossacarídeo pode incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, N-acetil glicosamina (GlcNAc), galactose, e ácido siálico, bem como uma fucose fixada a um GlcNAc no "tronco" da estrutura de oligossacarídeo biantenário. Em algumas modalidades, as modificações do oligossacarídeo em um anticorpo da invenção podem ser feitas a fim de criar variantes de anticorpo com certas propriedades aprimoradas.
[0069] Em uma modalidade, o derivado tem uma região de Fc modificada a fim de alterar ADCC (através de uma modulação de ligação de FcgamaRIII).
[0070] Em uma modalidade, as variantes de anticorpo são fornecidas tendo uma estrutura de carboidrato que carece de fucose fixada (direta ou indiretamente) a uma região de Fc. Por exemplo, a quantidade de fucose em tal anticorpo pode ser de 1 % a 80 %, de 1 % a 65 %, de 5 % a 65 % ou de 20 % a 40 %). A quantidade de fucose é determinada pelo cálculo da quantidade média de fucose dentro da cadeia de açúcar em Asn297, em relação à soma de todas as glicoestruturas fixadas a Asn 297 (por exemplo, estruturas complexas, híbridas e com alto teor de manose) como medido por espectrometria de massa MALDI-TOF. Asn297 se refere ao resíduo de asparagina localizado em torno da posição 297 na região de Fc (numeração de Eu de resíduos de região de Fc); no entanto, Asn297 também pode estar localizado a cerca de ± 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, isto é, entre as posições 294 e 300, devido às variações de sequência menores nos anticorpos. Os exemplos de publicações relacionadas às variantes de anticorpo "defucosilado" ou "deficiente em fucose" incluem, porém sem limitação, Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336: 1239-1249 (2004) e Yamane-Ohnuki N, Satoh M. mAbs. 2009;1:230-236. Os exemplos de linhagens celulares capazes de produzir anticorpos defucosilados incluem células Led 3 de CHO deficientes em fucosilação de proteína (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)) e linhagens celulares modificadas, como gene alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células CHO modificadas (consulte, por exemplo, Yamane- Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)).
[0071] Em certas modalidades, pode ser desejável criar anticorpos manipulados com cisteína, por exemplo, "thioMAbs", nos quais um ou mais resíduos de um anticorpo são substituídos por resíduos de cisteína. Em modalidades particulares, os resíduos substituídos ocorrem em sítios acessíveis do anticorpo. Ao substituir esses resíduos por cisteína, os grupos tiol reativos são, por meio disso, posicionados em sítios acessíveis do anticorpo e podem ser usados para conjugar o anticorpo para outras porções químicas, como porções químicas de fármaco ou porções químicas de ligante-fármaco, para criar um imunoconjugado,
como descrito adicionalmente no presente documento. Em certas modalidades, qualquer um ou mais dos seguintes resíduos pode ser substituído por cisteína: V205 (numeração de Kabat) da cadeia leve; Al 18 (numeração de EU) da cadeia pesada; e S400 (numeração de EU) da região de Fc de cadeia pesada. Os anticorpos manipulados por cisteína podem ser gerados como descrito, por exemplo, na Patente nº US
7.521.541.
[0072] O termo derivado também inclui imunoconjugados que compreendem um anticorpo anti-sPLA2-GIB como definido acima conjugado para uma ou mais moléculas heteróloga, incluindo, porém sem limitação, um agente citotóxico, um fração detectável, como uma fração fluorescente, um radioisótopo de diagnóstico ou um agente de imageamento; ou para um suporte sólido, como microesferas de agarose ou similares. Os exemplos de agentes citotóxicos incluem, mas não são limitados a agentes ou fármacos quimioterápicos, agentes inibitórios do crescimento, toxinas (por exemplo, toxinas de proteína, toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos das mesmas), ou isótopos radioativos. Os conjugados de um anticorpo e agente citotóxico podem ser feitos com o uso de uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncionais bem conhecidos pelos elementos versados na técnica. O ligante pode ser um "ligante clivável" que facilita a liberação de um fármaco citotóxico na célula. Por exemplo, um ligante lábil em ácido, ligante sensível à peptidase, ligante fotolábil, ligante de dimetila ou ligante que contém dissulfeto (Chari et al., Cancer Res. 52: 127-131 (1992)) pode ser usado. Os derivados também podem ser anticorpos biespecíficos.
[0073] Os anticorpos da invenção são tipicamente “isolados”, por exemplo, foram separados de pelo menos um componente de seu ambiente natural. Em particular, os anticorpos podem ser purificados para mais que, por exemplo, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %; pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de pureza como determinado, por exemplo, por técnicas eletroforéticas (por exemplo, SDS-PAGE, focalização isoelétrica (IEF), eletroforese capilar) ou cromatográficas (por exemplo, troca de íon ou HPLC de fase reversa). Para revisão de métodos para avaliação de pureza de anticorpo, consulte, por exemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
[0074] Como discutido acima, os anticorpos da invenção são essencialmente anticorpos de neutralização, isto é, são capazes de inibir pelo menos parcialmente uma atividade de PLA2-GIB.
[0075] sPLA2-GIB catalisa a hidrólise da ligação de acila graxa sn-2 de fosfolipídeos para liberar ácidos graxos livres e lisofosfolipídeos. Os anticorpos particulares da invenção inibem uma atividade enzimática de sPLA2-GIB, como a hidrólise da ligação de acila graxa sn-2 de fosfolipídeos. Os métodos para testar tal propriedade são revelados em detalhes na seção experimental.
[0076] Os anticorpos particulares adicionais da invenção inibem a ligação de sPLA2-GIB a um substrato dos mesmos.
[0077] Os anticorpos particulares adicionais da invenção inibem inibição mediada por sPLA2-GIB de translocação nuclear de fosfo-STAT5 induzida por IL-7 em células T CD4.
Os métodos para testar tal propriedade são revelados em detalhes na seção experimental.
[0078] A atividade de neutralização do anticorpo ou derivado pode ser determinada in vitro ou in vivo com uso, por exemplo, de ensaios de ligação ou biológicos, como testes como descrito na seção experimental. Inibição/neutralização pode ser completa ou parcial. Em particular, os anticorpos podem inibir 10 % ou mais da atividade testada, de preferência, 20 % ou mais, 30 % ou mais, 40 % ou mais, 50 % ou mais.
[0079] Em modalidades preferenciais, os anticorpos são IgG, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.
[0080] Os anticorpos preferenciais se ligam seletivamente à sPLA2-GIB, isto é, exibem ligação preferencial à sPLA2-GIB como comparado a outras moléculas. A seletividade pode ser determinada por ensaios de ELISA comparativo ou Biacore. A diferença em afinidade/avidez que marca a seletividade pode ser qualquer preferência detectável, como, por exemplo, uma razão de mais de 1:1,1 ou mais de cerca de 1:5, 1:10, 1:100, 1:1000 ou mais.
[0081] Os anticorpos ou derivados da invenção podem ser isolados e preservados com uso de métodos e meios convencionais. Os mesmos podem ser liofilizados. Os mesmos também podem ser congelados. Ácidos nucleicos, vetores, células hospedeiras e produção recombinante
[0082] Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a moléculas de ácido nucleico que codificam um anticorpo da invenção, ou uma cadeia leve ou pesada do mesmo, ou um domínio variável do mesmo, ou um ácido nucleico complementar à dita sequência de codificação. De preferência, o ácido nucleico é um ácido nucleico isolado ou purificado.
[0083] O ácido nucleico pode ser DNA (cDNA ou gDNA), RNA ou uma mistura dos mesmos. O mesmo pode ser em forma de cadeia simples ou em forma duplex ou uma mistura das duas. Isso pode compreender nucleotídeos modificados, que compreendem, por exemplo, uma ligação modificada, uma purina modificada ou base de pirimidina, ou um açúcar modificado. O mesmo pode ser preparado por qualquer método conhecido por um elemento versado na técnica, incluindo síntese química, recombinação e mutagênese. O ácido nucleico de acordo com a invenção pode ser deduzido da sequência do anticorpo de acordo com a invenção e o uso de códon pode ser adaptado de acordo com a célula hospedeira na qual o ácido nucleico deve ser transcrito. Essas etapas podem ser executadas de acordo com os métodos bem conhecidos por um elemento versado na técnica e alguns dos quais são descritos no manual de referência Sambrook et al. (Sambrook J, Russell D (2001) Molecular cloning: a laboratory manual, Terceira Edição Cold Spring Harbor).
[0084] O ácido nucleico da invenção pode codificar uma sequência de aminoácidos que compreende a cadeia leve e/ou uma sequência de aminoácidos que compreende a cadeia pesada do anticorpo, ou pode ser complementar a tal sequência codificante.
[0085] Exemplos específicos de tais sequências de ácidos nucleicos incluem as sequências fornecidas como SEQ ID NOs: 10-13.
[0086] A presente invenção fornece adicionalmente um vetor que compreende um ácido nucleico da invenção. Opcionalmente, o vetor pode compreender vários ácidos nucleicos da invenção. Em particular, o vetor pode compreender um ácido nucleico da invenção ligado de modo funcional a uma região regulatória, isto é, uma região que compreende uma ou mais sequências de controle. Opcionalmente, o vetor pode compreender vários ácidos nucleicos da invenção ligados de modo funcional a várias regiões regulatórias.
[0087] O termo "sequências de controle" significa sequências de ácidos nucleicos necessárias para expressão de uma região de codificação. As sequências de controle podem ser endógenas ou heterólogas. As sequências de controle bem conhecidas e atualmente usadas pelo elemento versado na técnica serão preferenciais. Tais sequências de controle incluem, mas não são limitados a, promotor, sequência de peptídeo de sinal e terminador de transcrição.
[0088] O termo "ligado de modo funcional" significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação a uma sequência de codificação, de modo que a sequência de controle direcione a expressão da região de codificação.
[0089] A presente invenção se refere adicionalmente ao uso de um ácido nucleico ou vetor de acordo com a invenção para transformar, transfectar ou submeter à transdução uma célula hospedeira.
[0090] A presente invenção também fornece uma célula hospedeira que compreende um ou vários ácidos nucleicos da invenção e/ou um ou vários vetores da invenção.
[0091] O termo "célula hospedeira" também abrange qualquer progênie de uma célula hospedeira parental que não é idêntica à célula hospedeira parental devido a mutações que ocorrem durante a replicação.
[0092] As células hospedeiras adequadas para clonar ou expressar vetores que codificam anticorpo incluem células eucariotas ou procariotas descritas no presente documento.
[0093] Por exemplo, os anticorpos podem ser produzidos em bactéria, em particular, quando a glicosilação e a função efetora de Fc não são necessárias. Para expressão de fragmentos de anticorpo e polipeptídeos em bactérias, consulte, por exemplo, Patentes sob os números US
5.648.237, US 5.789.199 e US 5.840.523. (Consulte também Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, EUA, 2003), páginas 245- 254, que descreve a expressão de fragmentos de anticorpo em E. coli.) Após a expressão, o anticorpo pode ser isolado do lisato celular bacteriano em uma fração solúvel e pode ser adicionalmente purificado.
[0094] Além dos procariotas, os micróbios eucariotas como fungos filamentosos ou levedura são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores que codificam anticorpo, incluindo cepas de fungos e levedura cujas vias de glicosilação foram "humanizadas", resultando na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação parcial ou completamente humano. Consulte Gerngross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004), e Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).
[0095] As células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpo glicosilado são também derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Os exemplos de células invertebradas incluem células vegetais e de inseto. Várias cepas baculovirais foram identificadas, as quais podem ser usadas em conjunto com células de inseto, particularmente, para transfecção de células de Spodoptera frugiperda. As culturas de célula vegetal também podem ser utilizadas como hospedeiros. Consulte, por exemplo, as Patentes de números US 5.959.177, US 6.040.498, US
6.420.548, US 7.125.978 e US 6.417.429.
[0096] Células vertebradas também podem ser usadas como hospedeiros. Por exemplo, as linhagens celulares de mamífero que são adaptadas para crescer em suspensão podem ser úteis. Outros exemplos de linhagens celulares hospedeiras de mamífero úteis são a linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7); linhagem de rim embrionário humano (293 ou células 293 como descrito, por exemplo, em Graham et ah, J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células renais de hamster bebê (BHK); células de Sertoli de camundongo (células TM4 como descrito, por exemplo, em Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1); células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical humano (HELA); células de rim canino (MDCK; células do fígado de rato búfalo (BRL 3A); células de pulmão humano (W138); células de fígado humano (Hep G2); tumor mamário de camundongo (MMT 060562); células TRI, como descrito, por exemplo, em Mather et ah, Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); células MRC 5; e células FS4. Outras linhagens celulares hospedeiras de mamíferos úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células CHO de DHFR (Urlaub et ah, Proc. Nath Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); e linhagens celulares de mieloma, como Y0, NSO e Sp2/0. Para uma análise de certas linhagens celulares hospedeiras de mamífero adequadas para produção de anticorpo, consulte, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, EUA), pp. 255-268 (2003).
[0097] A presente invenção também se refere a um método para produzir um anticorpo da invenção, que compreende cultivar uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico da invenção ou um vetor da invenção, como fornecido acima, sob condições adequadas para expressão do anticorpo, e recuperar opcionalmente o anticorpo da célula hospedeira ou do meio de cultura de célula hospedeira. Opcionalmente, o anticorpo recuperado pode ser adicionalmente purificado ou isolado. Os meios, condições de cultura e método de produção adequados são bem conhecidos pelo elemento versado na técnica e podem ser facilmente escolhidos de acordo com a célula hospedeira e o anticorpo a ser produzido. Composições farmacêuticas
[0098] A presente invenção se refere adicionalmente às composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo, um ácido nucleico, um vetor ou uma célula hospedeira da invenção. A composição pode compreender um ou vários anticorpos da invenção, um ou vários ácidos nucleicos da invenção e/ou um ou vários vetores da invenção e/ou um ou várias células hospedeiras da invenção. De preferência, a composição farmacêutica compreende uma ou vários anticorpos da invenção.
[0099] As composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo da invenção podem ser formuladas de acordo com métodos conhecidos para preparar composições farmaceuticamente úteis, através do que o anticorpo que tem o grau desejado de pureza é misturado com carreadores, excipientes ou estabilizantes fisiologicamente aceitáveis opcionais, (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20ª edição (2000)), na forma de soluções aquosas, liofilizadas ou outras formulações secas.
[0100] Como usado no presente documento, o termo “formulação farmacêutica” ou “composição farmacêutica” se refere a uma preparação que está em tal forma com a finalidade de permitir que a atividade biológica do ingrediente ativo seja eficaz, e que não contém componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um indivíduo ao qual a formulação seria administrada. De preferência, tais formulações são estéreis, isto é, assépticas ou de forma livre de todos os microrganismos vivos e seus esporos.
[0101] Os carreadores, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos para os recipientes nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem, mas não são limitados a, agentes de tamponamento, agentes estabilizantes, conservantes, isotonificantes, detergentes não iônicos, antioxidantes e outros aditivos variados.
[0102] Os agentes de tamponamento ajudam a manter o pH na faixa que se aproxima das condições fisiológicas. Os mesmos estão, de preferência, presentes em concentração na faixa de cerca de 1 mM a cerca de 50 mM. Os agentes de tamponamento adequados para uso com a presente invenção incluem, mas não são limitados a, tanto ácidos orgânicos quanto inorgânicos e sais dos mesmos como tampões de citrato, succinato, tartrato, fumarato, gliconato, oxalato, lactato e acetato, bem como tampões de fosfato, tampões de histidina e sais de trimetilamina como Tris.
[0103] Os conservantes podem ser adicionados para retardar crescimento microbiano, e podem ser adicionados em quantidades na faixa de 0,2 %-1 % (p/v). Os conservantes adequados para uso com a presente invenção incluem, porém sem limitação, fenol, álcool butílico ou benzílico; meta- cresol; alquil parabenos, como metil ou propil parabeno; cloreto de octadecildimetilbenzil amônio, haleto de benzalcônio (por exemplo, cloreto, brometo, iodeto); cloreto de hexametônio ou benzetônio; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; e 3-pentanol.
[0104] Os isotonificantes podem ser adicionados para assegurar isotonicidade de composições líquidas da presente invenção e incluem álcoois de açúcar poli-hídrico, de preferência, álcoois de açúcar tri-hídricos ou superiores, como glicerina, ertritol, arabitol, xilitol, sorbitol e manitol.
[0105] Os agentes estabilizantes se referem a uma categoria ampla de excipientes que podem estar na faixa de função de um agente avolumador a um aditivo que solubiliza o agente terapêutico ou ajuda a impedir a desnaturação ou a aderência à parede do recipiente. Os estabilizadores típicos podem ser álcoois de açúcar poli-hídricos (enumerados acima); aminoácidos, como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutâmico, treonina, etc., açúcares orgânicos ou álcoois de açúcar,
como lactose, trealose, estaquiose, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinositol, galactitol, glicerol e similares, incluindo ciclitóis, como inositol; polietileno glicol; polímeros de aminoácido; enxofre que contém agentes de redução, como ureia, glutationa, Ácido Tióctico, tioglicolato de sódio, tioglicerol, alfa-monotioglicerol e tiossulfato de sódio; polipeptídeos de baixo peso molecular (isto é, <10 resíduos); proteínas, como albumina sérica humana, albumina séria bovina, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, como monossacarídeos de polivinilpirrolidona, como xilose, manose, frutose, glicose; dissacarídeos, como lactose, maltose, sacarose e trissacarídeos, como rafinose; polissacarídeos, como dextrano. Os estabilizantes podem estar presentes na faixa de 0,1 a 10.000 peso por parte de agente terapêutico em peso.
[0106] Os tensoativos ou detergentes não iônicos (também conhecidos como "agentes de molhagem") podem ser adicionados para ajudar a solubilizar o agente terapêutico bem como proteger a proteína terapêutica contra agregação mediada por agitação. Os tensoativos não iônicos adequados incluem, mas não são limitados a, polissorbatos (20, 80, etc.), polioxâmeros (184, 188 etc.), PLURONICS™, polióis, monoéteres de polioxietileno sorbitano (TWEEN™-20, TWEEN™- 80, etc.). Os tensoativos não iônicos podem estar presentes em uma faixa of cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 1,0 mg/ml, de preferência, cerca de 0,07 mg/ml a cerca de 0,2 mg/ml.
[0107] Os excipientes variados adicionais incluem, mas não são limitados a, agentes avolumadores, (por exemplo, amido), agentes de quelação (por exemplo, EDTA),
antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico, metionina, vitamina E) e cossolventes.
[0108] Os ingredientes ativos também podem ser aprisionados em microcápsula preparada, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsula de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsula de poli(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de entrega de fármaco coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são reveladas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20ª edição (2000).
[0109] A forma das composições farmacêuticas, a via de administração, a dosagem e o regime dependem da condição a ser tratada, da gravidade da enfermidade, da idade, do peso e do sexo do paciente, etc.
[0110] As doses usadas para a administração podem ser adaptadas como uma função de vários parâmetros e, em particular, como uma função do modo de administração usado, da patologia relevante, ou alternativamente da duração desejada de tratamento.
[0111] As composições farmacêuticas da invenção podem ser formuladas para uma administração tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutânea ou intraocular e similares.
[0112] De preferência, a formulação farmacêutica é uma formulação capaz de ser injetada. Essas podem ser, em particular, soluções isotônicas, estéreis, salinas (fosfato monossódico ou dissódico, cloreto de sódio, potássio, cálcio ou magnésio e similares ou misturas de tais sais),
ou composições secas, especialmente secas por congelamento, que, mediante a adição, dependendo do caso, de água esterilizada ou solução salina fisiológica, permitem a constituição de soluções injetáveis.
[0113] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas pela incorporação dos compostos ativos na quantidade exigida no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados acima, como exigido, seguido por esterilização filtrada. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferenciais de preparação são técnicas de secagem a vácuo e secagem por congelamento que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução anteriormente filtrada e estéril do mesmo.
[0114] Além das composições formuladas para administração parenteral, como injeção intravenosa ou intramuscular, outras formas farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, tabletes ou outros sólidos para administração; cápsulas de liberação de tempo; e qualquer outra forma atualmente usada.
[0115] A composição farmacêutica da invenção pode compreender um ou vários anticorpos da invenção.
[0116] A composição farmacêutica pode compreender adicionalmente um ou vários compostos ativos adicionais. Os exemplos de compostos ativos adicionais incluem, mas não são limitados a, fármaco quimioterápico, antibióticos, agentes antiparasíticos, agentes antifúngicos ou agentes antivirais.
[0117] A quantidade de anticorpo da invenção que será eficaz no tratamento de um transtorno ou condição particular dependerá da natureza do transtorno ou condição, e pode ser determinada por técnicas clínicas padrão.
[0118] Em uma modalidade preferencial, cada dose pode se situar na faixa de cerca de 0,1 mg a cerca de 25 mg por quilograma de peso corporal de anticorpo, ou com mais preferência, de cerca de 1 mg a cerca de 10 mg por quilograma de peso corporal.
[0119] O cronograma de dosagem para administração pode variar de uma vez por mês a diariamente dependendo de inúmeros fatores clínicos, incluindo o tipo de doença, gravidade de doença e a sensibilidade do indivíduo ao agente terapêutico. Aplicações Terapêuticas
[0120] A presente invenção se refere adicionalmente a um anticorpo, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira ou composição farmacêutica da invenção para uso como um medicamento, particularmente, na prevenção ou tratamento de uma doença associada à sPLA2-GIB.
[0121] A presente invenção também se refere ao uso de um anticorpo, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira ou composição farmacêutica da invenção como um medicamento, para o tratamento de uma doença. A invenção também se refere ao uso de um anticorpo, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira ou composição farmacêutica da invenção para a fabricação ou preparação de um medicamento para tratar uma doença em um indivíduo.
[0122] Em particular, a presente invenção se refere a um método para tratar uma doença em um indivíduo, que compreende administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um anticorpo, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira ou composição da invenção.
[0123] Como usado no presente documento, o termo “indivíduo” ou “paciente” se refere a qualquer mamífero, de preferência, um ser humano.
[0124] A quantidade eficaz pode ser uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz. Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado terapêutico ou profilático desejado. A quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou composição da invenção pode variar de acordo com fatores como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo ou composição em provocar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz abrange uma quantidade na qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo ou composição são compensados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma “quantidade profilaticamente eficaz” se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profilático desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, uma vez que uma dose profilática é usada em indivíduos antes de ou em um estágio anterior da doença, a quantidade profilaticamente eficaz seria menor que a quantidade terapeuticamente eficaz.
[0125] A invenção pode ser usada para prevenir ou tratar qualquer doença ou transtorno associado a algum grau de atividade de PLA2-GIB indesejada.
[0126] Em uma modalidade particular, a invenção pode ser usada para prevenir ou tratar qualquer doença relacionada a uma resposta imunológica inapropriada (por exemplo, defeituosa ou inadequada), particularmente, a uma atividade de célula T CD4 inapropriada, bem como qualquer doença em que uma imunidade aumentada pode melhorar a condição do indivíduo. Essas doenças são algumas vezes chamadas de “transtornos imunológicos” ou “imunodeficiências” no presente pedido. Isso inclui particularmente casos de imunodeficiência causados por infecção viral ou infecção patogênica ou cânceres.
[0127] Como usado no presente documento, o termo "tratamento" ou “tratar” se refere, por exemplo, a qualquer intervenção clínica em uma tentativa de alterar o curso natural do indivíduo que é tratado e pode ser realizado para propósito preventivo ou curativo. Os efeitos desejáveis de tratamento incluem, porém sem limitação, prevenção da ocorrência ou recorrência de doenças, alívio de sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas indiretas ou diretas da doença, prevenção da metástase, diminuição da taxa de progressão da doença, melhora ou paliação do estado da doença, e remissão ou prognóstico aprimorado. Em algumas modalidades, as composições e métodos da invenção são usados para atrasar o desenvolvimento de uma doença ou transtorno ou para retardar a progressão de uma doença ou transtorno.
[0128] Os exemplos de doenças que podem se beneficiar de tal tratamento consistem em todas as doenças com uma imunodeficiência, como imunodeficiência mediada por HIV. Nesse sentido, em uma modalidade particular, a invenção é direcionada aos métodos para tratar uma imunodeficiência ou um transtorno associado em um indivíduo em necessidade do mesmo, que compreende administrar um anticorpo, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira ou composição como definido acima ao dito indivíduo.
[0129] Em uma outra modalidade particular, a invenção é direcionada a um anticorpo, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira ou composição como definido acima para uso para tratar uma imunodeficiência ou um transtorno associado em um indivíduo em necessidade do mesmo.
[0130] As imunodeficiências e transtornos associados designam qualquer condição ou patologia caracterizada por e/ou causada por uma resposta ou função imunológica reduzida em um indivíduo. As imunodeficiências podem ser causadas, por exemplo, por infecção viral (por exemplo, HIV, hepatite B, etc.), infecção bacteriana, câncer ou outras condições patológicas. O termo “transtorno associado à imunodeficiência” designa, portanto, qualquer doença causada por ou associada a uma imunodeficiência. A invenção é, particularmente, adequada para tratar imunodeficiências relacionadas às células T CD4 e doenças associadas.
[0131] Em uma modalidade particular, a invenção se refere a métodos para tratar infecção de HIV em um indivíduo administrando-se um anticorpo, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira ou composição como definido acima ao dito indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo é um paciente com HIV em estágio inicial e os métodos resultam no aumento da probabilidade de o paciente ser um controlador de HIV. Em algumas modalidades, o indivíduo é um paciente com baixa imunorreconstituição após o tratamento antirretroviral e/ou com linfopenia de T CD4 idiopática grave (ICL). A invenção também se refere a um método para aumentar a atividade de célula T CD4 em um indivíduo infectado por HIV administrando-se um composto de fórmula A ao dito indivíduo.
[0132] A invenção pode ser usada para tratar indivíduos em um estágio mais inicial da infecção, para prevenir ou reduzir a ocorrência, extensão ou duração de uma imunodeficiência. Tipicamente, os mesmos podem ser administrados imediatamente mediante a detecção de uma doença infecciosa e antes do aparecimento de sinais clínicos. Muito cedo, durante a infecção pelo HIV, a invenção pode levar os pacientes a um nível de controlador de HIV. A invenção também pode ser usada posteriormente em indivíduos infectados, sozinha ou em combinação com agente (ou agentes) antiviral. Em tal regime, a invenção pode acelerar a recuperação de linfócitos T CD4 e a restauração de suas funções. Consequentemente, em uma modalidade particular, a invenção compreende administrar simultânea, separada ou sequencialmente ao indivíduo que tem uma infecção viral (i) um agente antiviral e (ii) um anticorpo, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira ou composição como definido acima. Tal protocolo é particularmente adequado para tratar indivíduos infectados com HIV, em que um anticorpo da invenção é usado em combinação com terapia antirretroviral (por exemplo, HAART), permitindo reduzir HAART ou até mesmo interromper pelo menos temporariamente o tratamento de HAART que é conhecido para seus efeitos prejudiciais graves.
[0133] A invenção também fornece métodos para tratar câncer aumentando-se uma resposta imunológica no indivíduo, que compreende administrar um anticorpo, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira ou composição como definido acima ao dito indivíduo. A invenção também fornece métodos para tratar a imunodeficiência ligada à célula T CD4 associada ao câncer em um indivíduo administrando-se um anticorpo, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira ou composição como definido acima ao dito indivíduo.
[0134] Um anticorpo da invenção (e qualquer agente terapêutico adicional) pode ser administrado por qualquer meio adequado, incluindo administração parenteral, intrapulmonar e intranasal, e, se desejado para tratamento local, intralesional. As infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A dosagem pode ser por qualquer via adequada, por exemplo, por injeções, como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração é breve ou crônica. Vários cronogramas de dosagem incluindo, mas não se limitando a, administrações únicas ou múltiplas por vários pontos de tempo, administração de bolo e infusão de pulso são contemplados no presente documento.
[0135] Os seguintes exemplos são dados para propósitos de ilustração e não por meio de limitação.
[0136] 1- Geração e caracterização do anticorpo 14G9 anti-sPLA2-
1.1 - Geração do mAb nº 14G9
[0137] Brevemente, os camundongos foram imunizados com sPLA2-GIB humana recombinante e mAbs gerados foram selecionados quando à capacidade inibitória e respectiva afinidade para sPLA2-GIB versus pró-sPLA2-IB.
1.2 - Caracterização de mAb nº 14G9
1.2.1 - Afinidade por ELISA comparativo
[0138] As afinidades de ligação dos anticorpos em relação à pró-sPLA2-IB e à sPLA2-IB foram medidas por imunoensaio de competição à base de placa. Para ELISA de competição, brevemente, quantidades constantes de anticorpo em diferentes níveis foram pré-misturadas com diluições em série de proteína de antígeno, sPLA2-IB ou pró-sPLA2-IB humana, variando de 0 a 10 µg/ml, e incubadas por duas horas à temperatura ambiente para alcançar equilíbrio de pseudo-ligação entre o anticorpo e o antígeno. Essas soluções foram, então, transferidas para placas pré- revestidas com sPLA2-IB ou pró-sPLA2-IB de 96 poços para permitir que o anticorpo livre nas misturas se ligue à sPLA2-IB ou pró-sPLA2-IB revestida com placa. As placas foram tipicamente revestidas com 30 a 100 ng de proteína de sPLA2-IB ou pró-sPLA2-IB humana em solução de PBS durante a noite a 4 °C Seguido de bloqueio não específico de BSA. Após a lavagem de anticorpo em excesso na solução, os anticorpos ligados à placa foram detectados com um reagente de anticorpo policlonal de IgG ou IgA anticamundongo de cabra conjugado em HRP e desenvolvido usando substrato calorimétrico. A dependência dos sinais nas concentrações de antígeno em solução foi analisada com uma análise de ajuste de 4 parâmetros usando software Prism™ (Graph Pad) e relatada como IC50.
1.2.2 - Determinação por Afinidade por SPR
[0139] As constantes de afinidade (KD) da ligação de pró-sPLA2-IB e sPLA2-IB ao anticorpo nº 14G9 foram determinadas por cinéticas de superfície em um ensaio de ressonância de plasmon de superfície de biossensor em tempo real (BIAcore™). Mais especificamente, a afinidade dos anticorpos para pró-sPLA2-IB e sPLA2-IB humana foi medida usando um BIAcore® 2000. O anticorpo foi capturado em uma superfície de IgG anticamundongo e exposto a várias concentrações de proteína de pró-sPLA2-IB e sPLA2-IB recombinante. A análise cinética usando software BIAevaluation™ foi realizada para obter as constantes de taxa de associação e dissociação.
1.2.3 - Determinação de especificidade por ELISA indireto
[0140] Os poços de microplaca foram tipicamente revestidos com 100 ng de sPLA2-X, sPLA2-IB ou pró-sPLA2-IB humana recombinante em PBS pH 7,5, durante a noite a 4 °C. Os poços de amostra foram lavados três vezes com PBS contendo 0,05 % de Tween 20. Após a lavagem final, os poços de amostra foram tratados com solução de bloqueio contendo 1 % de albumina sérica bovina (BSA) em tampão de PBS por 60 min à temperatura ambiente. Após a lavagem com PBS contendo 0,05 % de Tween 20, quantidades crescentes (10 ng/ml até 3 µg/ml) de mAb nº 14G9 foram adicionadas aos poços revestidos com antígeno e incubadas por 120 min à temperatura ambiente. Após a lavagem com PBS contendo 0,05 % de Tween 20, a ligação de mAb nº 14G9 foi detectada com um reagente de anticorpo policlonal de IgG ou IgA anticamundongo de cabra conjugado em HRP e desenvolvida usando o substrato calorimétrico. A dependência dos sinais nas concentrações de antígeno em solução foi analisada com uma análise de ajuste de 4 parâmetros usando software Prism™ (Graph Pad) e relatada como EC50.
1.2.4 - Inibição de atividade enzimática de sPLA2-IB
[0141] Inibição de atividade enzimática de sPLA2-IB pelo mAb nº 14G9 foi testada de acordo com os procedimentos publicados (Rouault et al. 2007). Brevemente, sPLA2-IB humana recombinante (0,1 nM) foi incubada com quantidade crescente (0,1, 0,3, 1 e 3 µg) de um soro imune policlonal de coelho purificado direcionado para sPLA2-IB humana ou de anticorpo nº 14G9 purificado por 30 min a 37 °C. A atividade enzimática de sPLA2 foi, então, medida com uso de membranas de E. coli autoclivadas radioidentificadas com [3H]-oleato como substrato de fosfolipídeo em tampão de atividade de sPLA2. As reações foram interrompidas pela adição de 300 µl de tampão de parada, as misturas foram, então, centrifugadas a 10000 g por 5 min, e os tensoativos que contêm [3H]-oleato liberado foram contados.
[0142] Os resultados foram confirmados usando um ensaio de atividade enzimática fluorimétrico convencional. sPLA2- IB humana recombinante (3 nM) foi incubada com quantidade crescente de mAb nº 14G9 purificado por 120 min à temperatura ambiente, atividade enzimática de sPLA2 foi, então, medida usando um método fluorimétrico seletivo (atividade de sPLA2 de AteroDX®, Aterovax Paris, França). Os resultados são expressos em Unidade por ml de amostra (U/ml), com uma unidade definida como a quantidade de enzima de sPLA2 que catalisa a liberação de um nmol de produto em um min. Limite de detecção do ensaio é 17 U/ml com faixa analítica linear superior de 232 U/ml e sensibilidade funcional (20 %) é 21 U/ml. A variabilidade média dentro da execução e a variabilidade média intra- ensaio são 5,9% e 8,9%. respectivamente. Os resultados de ambos os métodos foram analisados com uma análise de ajuste de 4 parâmetros co uso de software Prism™ (Graph Pad) e registrados como IC50.
1.3 - Efeito in vitro do mAb nº 14G9 na translocação nuclear induzida por IL-7 de fosfo-STATS em células T CD4
1.3.1 - Translocação nuclear induzida por IL-7 de fosfo- STAT5
[0143] CD4s humanos foram purificados usando o kit de isolamento de RosetteSep (Stemcell Technologies, nº 15062). As células T CD4 foram ressuspensas em 106 células/ml em meio de RPMI 1640 (Lonza, Venders, Bélgica) suplementado com 5 % de soro bovino fetal (FBS), 50 mM de HEPES pH 7,4, glutamina, penicilina, estreptomicina e fungizona (meio completo) e equilibradas por pelo menos 2 h a 37 °C em uma atmosfera humidificada de CO2 a 5 %.
[0144] A translocação nuclear de pSTAT5 foi seguida usando microscopia confocal. Após o equilíbrio, as células imobilizadas foram laminadas em lâminas de vidro revestidas com polilisina antes da ativação por 15 min com 2 nM de IL-
7. As células foram fixadas em 4 % de PFA por 15 min a 37 °C, então, 15 min à TA e permeabilizadas em solução de metanol/água a 90 % a -20 °C. pSTAT5 foi, então, revelado através da coloração com anti-pSTAT5 de coelho (CST, nº 9359) identificado com anti-coelho-AlexaFluor 555 de asno (Life Technologies, nº A31572). Para linfócitos T CD4 humanos, as células foram submetidas à coloração com CD4 anti-humano de camundongo (eBioscience, nº 14-0042-82) identificado com anti-camundongo-AlexaFluor 488 de cabra
(Life Technologies, nº A11029). Para linfócitos T CD4 de camundongos, as células foram submetidas à coloração com CD4 anti-camundongo de rato (eBioscience, nº 14-0042-85) identificado com anti-rato-AlexaFluor 488 de frango (Life Technologies, nº A21470). As imagens foram adquiridas acima do limite de difração em um microscópio confocal de varredura a laser invertido (LSM700, Zeiss) com uma lente objetiva apocromática 40x/1.2 NA de imersão em água (Zeiss) ou uma lente objetiva apocromática 63x/1.4 NA de plano de imersão em óleo (Zeiss). As imagens foram adquiridas e analisadas com o software ZEN (Zeiss).
1.3.2 - Efeito in vitro de mAb nº 14G9 na inibição por plasma positivo para HIV-1 de translocação nuclear de fosfo-STAT5 induzida por IL-7 em células T CD4 humanas
[0145] Para o experimento de resposta de dose, quantidades crescentes do mAb nº 14G9 ou mAb de isotipo isotópico, foram primeiramente incubadas por 25 min à temperatura ambiente, seguido de 5 min a 37 °C, juntamente com plasma humano ou sPLA2-IB recombinante de um paciente positivo para HIV-1 (3 % de diluição v/v em PBS). A mistura equilibrada foi, então, adicionada às células T CD4 isoladas de um doador saudável e a translocação nuclear de fosfo-STAT5 foi analisada por microscopia confocal como descrito acima. Para o experimento de dose única, 10 µg (concentração final) de mAb nº 14G9, o mAb nº 6F7 não inibitório ou mAb de controle de isotipo foi primeiramente incubado por 25 min à temperatura ambiente, seguido de 5 min a 37 °C, juntamente com plasma humano a partir de cinco pacientes positivos para HIV-1 diferentes (3 % de diluição v/v em PBS). A mistura equilibrada foi, então,
adicionada às células T CD4 isoladas de um doador saudável e a translocação nuclear de fosfo-STAT5 foi analisada por microscopia confocal como descrito acima.
1.4 - Efeito de neutralização in vivo do mAb nº 14G9 na inibição por sPLA2-GIB de translocação nuclear de fosfo- STAT5 induzida por IL-7 em células T CD4
[0146] 30 camundongos do sexo feminino C57BL/6J SOPF (Charles River Laboratories) foram mantidos em gaiolas individualmente ventiladas em condições SOPF com ração estéril e água fornecida ad libitum e em ciclos de dia/noite de 12 horas, e permitiu-se o estabelecimento em seu novo ambiente por 5 dias antes do começo dos experimentos. Todos os procedimentos experimentais receberam uma aprovação da Comissão de Ética no uso de Animais local (CETEA 89, Institut Pasteur de Paris). Os 30 animais foram divididos em 6 grupos experimentais (1 gaiola por grupo), que receberam diferentes combinações dos produtos de teste por injeção intraperitoneal. O grupo 1 recebeu 1 mg (300 µl) de mAb de controle de isotipo à TO, então, 100 µg (100 µl) de sPLA2-IB a T+2 h, o grupo 2 recebeu 1 mg (300 µl) de mAb nº 14G9 à TO, então, 100 µg (100 µl) de sPLA2-IB a T+2 h, o grupo 3 recebeu 100 µg (100 µl) de sPLA2-GIB a T+2 h, o grupo 4 recebeu injeção de PBS (100 µl) a T+2 h, o grupo 5 recebeu injeção de PBS (100 µl) à TO e o grupo 6 recebeu 100 µg (100 µl) de sPLA2- GIB à TO. Os camundongos foram submetidos à eutanásia por deslocamento cervical em diferentes intervalos de tempo após o início do estudo. Os grupos 1 a 4 foram submetidos à eutanásia a T + 5 h e os grupos 5 e 6 a T+ 48 h. Imediatamente após a eutanásia, os baços foram colhidos dos animais e mantidos à temperatura ambiente em tubos de 15 ml contendo 5 ml de RPMI a 5 % até o processamento adicional. Os esplenócitos de camundongo foram preparados com o dissociador gentleMACS (programa mspleenOl), em seguida, CD4 de camundongo foi isolado por seleção negativa usando o kit de isolamento EasySep (Stemcell Technologies, nº 19851). A translocação nuclear de fosfo-STAT5 foi analisada por microscopia confocal como descrito acima. O teste de Mann-Whitney foi usado para comparar medianas dos grupos.
1.5 - Sequências do mAb nº 14G9
[0147] As regiões variáveis do mAb nº 14G9 foram sequenciadas de acordo com os procedimentos clássicos. Brevemente, RNA altamente puro foi extraído das células de hibridoma e o filamento de DNA complementar foi sintetizado usando transcriptase reversa de alta fidelidade. Os produtos de PCR gerados usando PCR de alta fidelidade e iniciadores degradados que alvejam de modo específico a codificação de cDNA para a cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo foram diretamente sequenciados (sequenciamento de fita dupla). As sequências de cDNA foram analisadas e montadas. As sequências petídicas foram traduzidas e validadas de acordo com a estrutura de anticorpo. 2- Humanização de anticorpo nº 14G9
2.1 - Estratégia de humanização e geração de variantes humanizadas nº 14G9
[0148] O anticorpo de camundongo nº 14G9 foi humanizado pelo enxerto das três CDRs, como definido pela nomenclatura de Rabat, da região variável de cadeia leve (VL) em uma VL de linhagem germinativa humana que era tão homóloga quanto possível para a VL de anticorpo de camundongo. De modo similar, as três CDRs da região variável de cadeia pesada (VH) foram enxertadas em uma VH de linhagem germinativa humana que era tão homóloga quanto possível para a VH de anticorpo de camundongo. Além disso, alguns resíduos de aminoácido nas regiões de arcabouço das regiões variáveis de linhagem germinativa humana selecionadas foram alterados para os resíduos de aminoácido que estavam presentes nas regiões variáveis de camundongo (assim denominadas mutações reversas).
2.2 - Inibição de atividade enzimática de sPLA2-GIB por anticorpos humanizados
[0149] Inibição de atividade enzimática de sPLA2-GIB pelos anticorpos humanizados nº 1A, nº 1B, nº 2A e nº 2B foi testada de acordo com os procedimentos publicados (Rouault et al. 2007). Brevemente, sPLA2-GIB humana recombinante (0,05 nM) foi incubada com quantidade crescente (0,1, 0,3, 1 e 3 µg) de anticorpos purificados por 30 min a 37 °C. A atividade enzimática de sPLA2 foi, então, medida usando membranas de E. coli autoclivadas radioidentificadas com [3H]-oleato como substrato de fosfolipídeo em tampão de atividade de sPLA2. As reações foram interrompidas pela adição de 300 µl de tampão de parada, as misturas foram, então, centrifugadas a 10000 g por 5 min, e os tensoativos que contêm [3H]-oleato liberado foram contados.
2.3 - Determinação de afinidade de anticorpos humanizados por ELISA comparativo
[0150] As afinidades de ligação dos anticorpos humanizados em relação à pró-sPLA2-GIB e à sPLA2-GIB foram medidas por imunoensaio de competição à base de placa. Para
ELISA de competição, brevemente, quantidades constantes de anticorpo em diferentes níveis foram pré-misturadas com diluições em série de proteína de antígeno, sPLA2-GIB ou pró-sPLA2-GIB humana, variando de 0 a 10 µg/ml, e incubadas por duas horas à temperatura ambiente para alcançar equilíbrio de pseudo-ligação entre o anticorpo e o antígeno. Essas soluções foram, então, transferidas para placas pré-revestidas com sPLA2-GIB ou pró-sPLA2-GIB de 96 poços para permitir que o anticorpo livre nas misturas se ligue à sPLA2-GIB ou pró-sPLA2-GIB revestida com placa. As placas foram tipicamente revestidas com 30 a 100 ng de proteína de sPLA2-GIB ou pró-sPLA2-GIB humana em solução de PBS durante a noite a 4 °C Seguido de bloqueio não específico de BSA. Após a lavagem de anticorpo em excesso na solução, os anticorpos ligados à placa foram detectados com um reagente de anticorpo policlonal de IgG ou IgA anticamundongo de cabra conjugado em HRP e desenvolvido usando substrato calorimétrico. A dependência dos sinais nas concentrações de antígeno em solução foi analisada com uma análise de ajuste de 4 parâmetros usando software Prism™ (Graph Pad) e relatada como IC50.
2.4 - Calorimetria de Varredura Diferencial de anticorpos humanizados
[0151] A estabilidade térmica em tampão de PBS de anticorpos nº 1A, nº 1B, nº 2A e nº 2B foi comparada por Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) em um sistema de MicroCal VP-DSC Capilar. Todas as amostras foram transportadas em gelo seco e descongeladas por incubação durante a noite a -20 °C, seguido de incubação em gelo por 2 horas. Após o descongelamento de amostra, todas as amostras foram centrifugadas (20.000 xg, 5 min, 4 °C) e tiveram seu teor de proteína quantificado em um espectrofotômetro Nanodrop ND-1000 com programa de análise de IgG, antes da análise de DSC. O tempo de tempo de pré- equilíbrio foi 3 min e os termogramas que seguiram foram adquiridos entre 20 e 110 °C com uma taxa de varredura de 60 °C/hora, um período de filtragem de 25 segundos e retorno médio. Antes da análise de amostra, 5 varreduras de tampão/tampão foram medidas para estabilizar o instrumento e uma varredura de tampão/tampão foi realizada entre cada varredura de proteína/tampão.
2.5 - Cromatografia por Exclusão de Tamanho Analítica (SEC- HPLC) de anticorpos humanizados
[0152] Cromatografia por Exclusão de Tamanho Analítica (SEC-HPLC) foi realizada em uma HPLC de Shimadzu Prominence em uma coluna Gl 5/150 GL de Superdex 200 de aumento (GE Healthcare). A coluna foi, anteriormente, equilibrada em PBS, a 0,25 ml/min, com o forno de coluna ajustado para 30 °C. Todas as amostras foram centrifugadas (20000 g, 5 min, 4 °C), e teve seu teor de proteína quantificado em um espectrofotômetro Nanodrop ND-1000 com programa de análise de IgG, antes da análise de SEC. O programa isocrático foi definido para injetar cerca de 15 µg de cada amostra, em 0,25 ml/min por 18 min. Após a análise de SEC, cromatograma de 280 nm foi extraído dos dados brutos e analisado por integração de pico. Uma série de proteínas dos kits de Calibração de SEC de peso molecular de GE Lifesciences foi usada para calibrar a coluna nas mesmas condições e o tampão usado durante a análise de amostra. As proteínas usadas foram: Aprotinina (6,500 Da), Ribonuclease
A (13,700 Da), Anidrase Carbônica (29,000 Da), Ovalbumina (44,000 Da), Conalbumina (75,000 Da) e Aldolase (158,000). Dextrano Azul foi usado para determinar o Volume Vazio da coluna. A calibração de coluna foi feita de acordo com as instruções dos Kits de Calibração por Filtração em Gel (GE Lifesciences). 3- Caracterização de nº 2B1 e nº 2B2
3.1- Determinação por afinidade de SPR de anticorpos nº 2B, nº 2B1 e nº 2B2
[0153] As constantes de afinidade (KD) da ligação de pró-sPLA2-GIB e sPLA2-GIB aos anticorpos nº 2B, nº 2B1 e nº 2B2 foram determinadas por cinéticas de superfície em um ensaio de ressonância de plasmon de superfície de biossensor em tempo real (BIAcore™). Mais especificamente, a afinidade dos anticorpos para pró-sPLA2-IB e sPLA2-IB humana foi medida usando um BIAcore® 2000. O anticorpo foi capturado em uma superfície de IgG anticamundongo e exposto a várias concentrações de proteína de pró-sPLA2-IB e sPLA2- IB recombinante. A análise cinética usando software BIAevaluation™ foi realizada para obter as constantes de taxa de associação e dissociação.
3.2 - Calorimetria de Varredura Diferencial de anticorpos humanizados nº 2B1 e nº 2B2
[0154] A estabilidade térmica em tampão de PBS dos anticorpos nº 2B1 e nº 2B2 foi comparada por Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) como descrito acima.
3.3- Cromatografia Analítica de Exclusão por Tamanho (SEC- HPLC) de anticorpos humanizados nº 2B1 e nº 2B2
[0155] A análise de Cromatografia Analítica de Exclusão por Tamanho (SEC-HPLC) dos nº 2B1 e nº 2B2 foi realizada como descrito acima.
3.4 - Análise de Focalização Isoelétrica Capilar de anticorpos humanizados nº 2B1 e nº 2B2
[0156] O ponto isoelétrico e a distribuição relativa de variantes de carga dos nº 2B, nº 2B1 e nº 2B2 foram determinados por análise de focalização isoelétrica capilar imageada (icIEF) usando Pharmalyte pH3-10 (faixa ampla adequada para a maioria dos mAbs) na presença de ureia em uma concentração de proteína final de 0,2 mg/ml. Os dois marcadores de pI que agrupam o pI esperado da amostra foram usados para calibração. A leitura de dados foi medida como absorbância (em 280 nm) e expressa em um eletroferograma. Os valores de pI foram calculados usando o software Compass e Empower 3 e a integração de pico foi realizada em Empower
3.
3.5 -Ligação de anticorpos humanizados nº 2B, nº 2B1 e nº 2B2 aos FcγRs humanos
[0157] A ligação de IgG monomérica foi testada incubando-se os anticorpos nº 2B, nº 2B1 e nº 2B2 (100 ng/ml) com 1 x 105 células de CHO que expressam estavelmente FcγRs humanos por 30 min em gelo. As células foram, então, lavadas, destacadas, fixadas e analisadas por citometria de fluxo (FACSCalibur; BD Biosciences). mAbs ligados foram detectados usando um fragmento IgG F(ab')2 de IgG anti-humano de cabra conjugado em PE em 0,5 mg/ml (Jackson Laboratories; nº de cat 109-096-006).
[0158] O complexo imunológico de anticorpo-antígeno foi gerado por coincubação de 10 µg/ml de anticorpos humanizados e 5 µg/ml de sPLA2-GIB por 30 min a 37 °C. Os complexos imunológicos foram, então, incubados com 1 x 105 células de CHO que expressam estavelmente FcγRs humanos por 30 min em gelo. As células foram, então, lavadas, destacadas, fixadas e analisadas por citometria de fluxo (FACSCalibur; BD Biosciences). mAbs ligados foram detectados usando um fragmento IgG F(ab')2 de IgG anti- humano de cabra conjugado em PE em 0,5 mg/ml (Jackson Laboratories; nº de cat 109-096-006).
[0159] A ligação residual de antígeno em células sensibilizadas por anticorpo foi testada incubando-se primeiramente os anticorpos nº 2B, nº 2B1 e nº 2B2 (10 µg/ml) com 1 x 105 células de CHO que expressam estavelmente FcγRs humanos por 30 min em gelo. Após a lavagem, o antígeno biotinilado com sPLA2-IB (5 µg/ml) foi adicionado por 30 min em gelo. As células foram, então, lavadas, destacadas, fixadas e analisadas por citometria de fluxo. O antígeno biotinilado ligado foi detectado usando um conjugado de FITC de avidina. Todos os dados foram analisados com Software de Análise de Citometria de Fluxo (FlowJo). 4-Propriedades biológicas de anticorpo humanizado nº 2B2
4.1 - Efeito in vitro do mAb nº 2B na translocação nuclear induzida por IL-7 de fosfo-STAT5 em células T CD4
[0160] As quantidades crescentes dos anticorpos nº 14G9 ou nº 2B foram primeiramente incubadas por 25 min à temperatura ambiente, seguido de 5 min a 37 °C, juntamente com 75 nM de sPLA2-GIB recombinante ou plasma humano de um paciente positivo para HIV-1 (3 % de diluição v/v em PBS). A mistura equilibrada foi, então, adicionada às células T CD4 isoladas de um doador saudável e a translocação nuclear de fosfo-STAT5 foi analisada por microscopia confocal como descrito acima. As curvas dependentes de dose foram analisadas com uma análise de ajuste de 4 parâmetros usando software Prism™ (Graph Pad) e relatadas como EC50.
1.4 - Efeito de neutralização in vivo de nº 2B2 na inibição por sPLA2-IB de translocação nuclear de fosfo-STAT5 induzida por IL-7 em células T CD4
[0161] Dezoito camundongos do sexo masculino C57BL/6J SOPF de sete semanas de idade (Charles River Laboratories) foram mantidos em gaiolas individualmente ventiladas em condições SOPF com ração estéril e água fornecida ad libitum e em ciclos de dia/noite de 12 horas, e permitiu-se o estabelecimento em seu novo ambiente por 5 dias antes do começo dos experimentos. Todos os procedimentos experimentais receberam uma aprovação da Comissão de Ética no uso de Animais local (CETEA 89, Institut Pasteur de Paris). Os 18 animais foram divididos em 5 grupos experimentais (1 gaiola por grupo), que receberam diferentes combinações dos produtos de teste por injeção peritoneal. O grupo 1 recebeu injeção de PBS (350 µl) à TO, então, injeção de PBS (100 µl) a T+2 h, o grupo 2 recebeu injeção de PBS (350 µl) à TO, então, 100 µg (100 µl) de sPLA2-GIB a T+2 h, o grupo 3 recebeu 2 mg (350 µl) de mAb de controle isotópico à TO, então, 100 µg (100 µl) de sPLA2-GIB a T+2 h, o grupo 4 recebeu 1 mg (350 µl) de mAb humanizado nº 2B2 à TO, então, 100 µg (100 µl) de sPLA2-IB a T+2 h, o grupo 5 recebeu 2 mg (350 µl) de nº mAb humanizado 2B2 a T0, então, 100 µg (100 µl) de sPLA2-IB a T+2 h. Os camundongos foram submetidos à eutanásia por deslocamento cervical a T + 5h após o início do estudo. Imediatamente após a eutanásia, os baços foram coletados dos animais e imediatamente processados. Os esplenócitos de camundongo foram preparados com o dissociador gentleMACS, em seguida, CD4 de camundongo foi isolado por seleção negativa usando o kit de isolamento EasySep (Stemcell Technologies, nº 19851). A translocação nuclear de fosfo- STAT5 foi analisada por microscopia confocal como descrito acima. O teste de Mann-Whitney foi usado para comparar medianas dos grupos.
RESULTADOS 5- Geração e caracterização do anticorpo anti-sPLA2-IB 14G9
5.1 - Geração e caracterização do mAb nº 14G9
[0162] Brevemente, os camundongos foram imunizados com sPLA2-IB humana recombinante, e mAbs gerados foram selecionados quanto à sua capacidade inibitória e respectiva afinidade para sPLA2-IB versus pró-sPLA2-IB. mAb nº 14G9 foi mostrado para inibir a atividade enzimática de sPLA2-IB com um EC50 estimado de 2,3 nM (Figura 1A), para ser altamente específico para sPLA2-GIB vs pró-sPLA2-GIB (Figura 1B e 1C). Em ELISA competidor, IC50 foram estimados para serem 108,6 nM e 1,0 nM para pró-sPLA2-GIB e sPLA2- GIB, respectivamente. A constante de afinidade (KD) da ligação de pró-sPLA2-GIB e sPLA2-GIB ao nº 14G9 foi determinada por cinéticas de superfície em um ensaio de ressonância de plasmon de superfície de biossensor em tempo real (BIAcore™). Nesses experimentos, Kd foi estimado para ser 174 nM e 0,34 nM para pró-sPLA2-IB e sPLA2-IB, respectivamente.
5.2 - Efeito in vitro de mAb nº 14G9 na inibição por plasma de pacientes infectados por HIV-1 de translocação nuclear de fosfo-STAT5 induzida por IL-7 em células T CD4
[0163] Recentemente, a enzima de sPLA2-IB foi identificada como desempenhando uma função crucial no mecanismo subjacente à falta de resposta dos linfócitos T CD4 em pacientes virêmicos infectados pelo HIV. Em particular, demonstrou-se que sPLA2-IB é a proteína responsável pela ativação crônica de linfócitos T CD4, que conduzem a mesma para um estado anormal de diferenciação de ativação que torna a mesma refratária a certos sinais fisiológicos como aqueles entregues por interleucina-7 (THEZE Jacques et al. 2015).
[0164] A capacidade de o mAb nº 14G9 to contrabalancear o efeito inibitório de plasma isolado de pacientes infectados por HIV-1 na translocação nuclear de fosfo-STAT5 induzida por IL-7 em células T CD4 foi testada incubando-se plasmas isolados de pacientes virêmicos infectados pelo HIV-1 com o mAb nº 14G9.
[0165] Como descrito na Figura 2, as quantidades crescentes do mAb nº 14G9 levaram a uma restauração dependente de dose da capacidade de plasmas de pacientes virêmicos para inibir a translocação nuclear de fosfoSTAT5 induzida por IL-7 em células T CD4 humanas isoladas de um doador saudável. Esse efeito de restauração de resposta de dose não foi observado com um mAb de controle de isotipo. Esses resultados foram reproduzidos em 5 experimentos sucessivos, em células T CD4 isoladas de 5 diferentes doadores saudáveis usando uma única dose (10 µg) do mAb nº 14G9, ou 10 µg do mAb nº 6F7 não inibitório ou mAb de controle de isotipo (Figura 3).
5.3 - Efeito in vivo de mAb nº 14G9 na inibição de translocação nuclear de fosfo-STAT5 por sPLA2-IB
[0166] A capacidade de o mAb nº 14G9 contrabalancear in vivo o efeito inibitório da injeção de sPLA2-IB na translocação nuclear de fosfo-STAT5 induzida por IL-7 em células T CD4 foi testada injetando-se primeiramente 1 mg do mAb nº 14G9 em camundongos, seguido da injeção de 100 µg de sPLA2-IB. A translocação nuclear de fosfo-STAT5 em células T CD4 isoladas de esplenócitos dos camundongos tratados foi, então, analisada por microscopia confocal.
[0167] Como descrito na Figura 4, a injeção de 1 mg de sPLA2-IB em camundongos levou a uma inibição de 60 % da translocação nuclear de fosfoSTAT5 em células T CD4 isoladas de esplenócitos. Esse efeito foi completamente eliminado pela injeção anterior de 1 mg do mAb nº 14G9, com nenhum efeito significativo observado nas injeções de controle.
5.4 - Sequências de regiões variáveis de mAb nº 14G9
[0168] As regiões variáveis de cadeias leves e pesadas do mAb nº 14G9 foram sequenciadas e são apresentadas abaixo. >14G9-VL (SEQ ID NO: 8) >14G9-VL (SEQ ID NO: 2) >14G9-VH (SEQ ID NO: 9)
>14G9-VH (SEQ ID NO: 3)
[0169] Na grande maioria dos anticorpos, a interface de VH/VL conservada é principalmente composta de interações hidrofóbicas entre posições de Kabat H37, H45, H47, H89, H91, H100B e H103 em resíduos de arcabouço de cadeia pesada e L36, L44, L46, L87, L96 e L98 em resíduos de arcabouço de cadeia leve e de ligação de hidrogênio entre H39 e L38.
[0170] Um recurso único e surpreendente de anticorpo monoclonal nº 14G9 consiste na presença muito incomum de um Arg na posição de Kabat H39 e um Glu na posição de Kabat L38 em vez do Gln usual e altamente conservado em ambas as posições. Em 14G9, a interação de ligação de hidrogênio entre Gln H39 e Gln L38 é substituída por uma atração eletrostática entre Arg H39 e Glu L38. 6- Humanização do anticorpo monoclonal de camundongo nº 14G9
6.1 - Estratégia de humanização e geração de anticorpos humanizados
[0171] O anticorpo de camundongo nº 14G9 foi humanizado pelo enxerto das três CDRs, como definido pela nomenclatura de Kabat, da região variável de cadeia leve (VL) em uma VL de linhagem germinativa humana que era tão homóloga quanto possível para a VL de anticorpo de camundongo.
De modo similar, as três CDRs da região variável de cadeia pesada (VH) foram enxertadas em uma VH de linhagem germinativa humana que era tão homóloga quanto possível para a VH de anticorpo de camundongo.
Além disso, alguns resíduos de aminoácido nas regiões de arcabouço das regiões variáveis de linhagem germinativa humana selecionadas foram alterados para os resíduos de aminoácido que estavam presentes nas regiões variáveis de camundongo (assim denominadas mutações reversas). Com base nas informações da estrutura de regiões variáveis de imunoglobulina, esses alguns resíduos nas regiões de arcabouço foram identificados como tendo funções-chave na manutenção das CDRs na coformação direta ou em embalagem de VH/VL e, desse modo, retidos na versão humanizada A e B.
Para o projeto de versões enxertadas de CDR de VH nº 14G9, duas linhagens germinativas humanas, IGHV1-46*01 e IGHV5-10-1*01 foram selecionadas.
A linhagem germinativa humana IGHV1-46*01 foi selecionada devido ao fato de que exibiu a melhor identidade geral através de todo o gene V com VH de camundongo 14G9 com 66,3 %. A linhagem germinativa humana IGHV5-10-1*01 foi selecionada devido ao fato de que, embora tenha menos identidade geral com VH 14G9 (58,2 %), tinha um padrão de homologia diferente através de toda a VH 14G9 de IGHV1-46*01. Para o projeto de versões enxertadas com CDR de VL 14G9, duas linhagens germinativas Kappa humanas diferentes, IGKV1- 39*01 e IGKV3-15*01, foram selecionadas.
IGKV1-39*01 foi selecionada devido ao fato de que tinha a homologia mais alta através de todo o gene V com VL de camundongo 14G9 com
67,4 % de identidade. IGKV3-15*01, apesar de uma identidade de porcentagem inferior (62,1 %), foi selecionado devido ao fato de que tinha padrão de identidade diferente dentro das CDRs com VL nº 14G9 de IGKV1-39*01.
[0172] O projeto das versões humanizadas leva em consideração a presença incomum de Arg H39 e Glu L38 na interface de VH/VL. Na versão A de sequências de VH e VL enxertadas em CDR, os resíduos de camundongo parental em H39 (Arg) e L38 (Glu) foram conservados, respectivamente. Na versão B, os resíduos parentais nas posições Kabat H39 e L38 foram substituídos com Gln (o resíduo de contraparte de linhagem germinativa humana) a fim de recriar a interação de ligação de hidrogênio altamente conservada. Consequentemente, para cada linhagem germinativa humana (2 para a VH e 2 para a VL) usada para o projeto de nº 14G9 enxertado em CDR, 2 versões (A e B) foram construídas. A versão A tinha Arg H39 (VH) ou Glu L38 (VL) enquanto a versão B tinha Gln em ambas as posições. A versão humanizada A de VH foi apenas pareada com a versão humanizada A de VL e o mesmo princípio serve para a versão humanizada B. O aumento na porcentagem de identidade de sequência (isto é, porcentagem de seres humanos) através de todos os genes V entre a hibridoma de camundongo nº 14G9 e as versões enxertadas em CDR é apresentado na tabela 1. Os detalhes das diferenças em sequências através do gene V entre as versões humanizadas e as linhagens germinativas humanas variáveis de imunoglobulina correspondentes são apresentadas na tabela 2.
6.2 - Inibição de atividade enzimática de sPLA2-IB por anticorpos humanizados
[0173] A capacidade dos diferentes anticorpos humanizados inibirem a atividade enzimática de sPLA2-IB foi testada incubando-se as membranas radioidentificadas com sPLA2-IB humana recombinante na presença de quantidades crescentes de anticorpos purificados monoclonais. Os resultados são expressos como porcentagem de inibição de atividade enzimática observada com a concentração mais alta de mAb testado e são apresentados na Tabela 3. Como apresentado, o nº 2B é o mAb com a potência mais alta de inibição de sPLA2-GIB.
6.3 - Determinação de afinidade de anticorpos humanizados por ELISA comparativo
[0174] As respectivas afinidades de ligação dos anticorpos humanizados à pró-sPLA2-GIB humana e sPLA2-GIB humana foram medidas pelo imunoensaio de competição à base de placa. Brevemente, as quantidades constantes de anticorpo em diferentes níveis foram pré-misturadas com diluições em série de antígeno proteínas para alcançar o equilíbrio de pseudo-ligação entre o anticorpo e o antígeno. Essas soluções foram, então, transferidas para as placas pré-revestidas com antígeno para permitir que o anticorpo livre nas misturas se ligue à sPLA2-GIB ou pró- sPLA2-GIB revestida com placa. Os anticorpos ligados à placa foram detectados com um anticorpo policlonal conjugado em HRP. Os exemplos das curvas de titulação obtidas para as diferentes variantes são apresentados na Figura 5. Os dados foram ajustados com um modelo de regressão não linear logístico de 4PL e os valores de IC50 relativos foram estimados a partir do modelo (Tabela 4).
6.4 - Calorimetria de Varredura Diferencial de anticorpos humanizados
[0175] A desnaturação térmica normalizada dos diferentes anticorpos testados é apresentada na Figura 6 e os parâmetros de DSC na Tabela 5. Tm são temperaturas de desnaturação/fusão. Início de T são temperaturas em que a transição de desdobramento começa. T1/2 é a largura da transição na metade da altura do pico. ΔH é a entalpia calorimétrica de desdobramento e reflete a interrupção das interações intramoleculares da proteína. Área Total é a entalpia completa de desdobramento (área total sob o termograma) e reflete a estabilidade termodinâmica. De acordo com a superposição de todos os termogramas (Figura 6), nº 1B é o único com melhor comportamento por DSC. A primeira transição, cerca de 70-72 °C, deve corresponder ao domínio de CH2. A última transição, cerca de 82-83 °C, deve corresponder a CH3, e o pico mais alto corresponde à transição de Fab. Em nº 2A, a transição de Fab está no topo do CH2, todas as outras variantes têm a transição de Fab no topo da transição de CH3 e pelo menos em nº 2B, o ombro na extremidade direita da transição de Fab deve corresponder à transição de CH3.
6.5 - Cromatografia por Exclusão de Tamanho Analítica (SEC- HPLC) de anticorpos humanizados
[0176] Os anticorpos nº 1A, nº 1B, nº 2A e nº 2B humanizados foram analisados por SEC-HPLC em tampão de PBS. Um cromatograma representativo para nº 2B é apresentado na figura 7 e os resultados são resumidos na Tabela 6. Como apresentado, todas as variantes exibem um peso molecular aparente próximo de 160 kDa, indicando conformação monomérica e ausência de agregação nas condições testadas.
6.6 - Sequências nº 2B
[0177] Com base nas propriedades inibitórias, de ligação e biofísicas descritas acima, o anticorpo nº 2B foi selecionado para otimização adicional. A cadeia pesada de nº 2B de variante exibe 81,60 % de identidade (80/98) com a linhagem germinativa humana de IGHV1-46*01. A cadeia leve de nº 2B exibe 86,3 % de identidade (82/95) com a linhagem germinativa de IGKV3-15*01. Toda a % de identidade de nº 2B é 83,94 % com as linhagens germinativas humanas de referência.
[0178] As sequências das cadeias pesadas e leves de nº 2B são apresentadas abaixo: Cadeia pesada > 3352.VH 2B (SEQ ID NO: 11) Cadeia leve
> 3352.VL2.B (SEQ ID NO: 10) > Cadeia pesada (SEQ ID NO: 5) > Cadeia leve (SEQ ID NO: 4) 7- Caracterização de variantes humanizadas nº 2B1 e nº 2B2
7.1 - Estratégia para mutações de ponto que eliminam CDC e
[0179] O anticorpo nº 2B humanizado foi adicionalmente otimizado introduzindo-se mutações de ponto específico conhecidas para eliminar as funções tanto de ADCC quanto de CDC na região de constante de cadeia do mAb.
[0180] As sequências dos anticorpos nº 2B1 (mutações duplas L234A & L235E) e nº 2B2 resultantes (mutação tripla L234A, L235E e P331S) são apresentadas abaixo:
2B1 (mutações L234A & L235E) Cadeia pesada SEQ ID NO: 12
Cadeia leve mesma que 2B (consulte SEQ ID NO: 10) > Cadeia pesada (SEQ ID NO: 6)
> Cadeia leve mesma que 2B (consulte SEQ ID NO: 4) 2B2 (mutações L234A, L235E e P331S) Cadeia pesada SEQ ID NO: 13
Cadeia leve mesma que 2B (consulte SEQ ID NO: 10) > Cadeia pesada (SEQ ID NO: 7)
> Cadeia leve mesma que 2B (consulte SEQ ID NO: 4)
7.2- Determinação por afinidade de SPR de anticorpos humanizados nº 2B1 e nº 2B2
[0181] As constantes de afinidade (KD) da ligação pró- sPLA2-GIB e sPLA2-GIB a nº 2B1 e nº 2B2 foram determinadas por cinéticas de superfície em um ensaio de ressonância de plasmon de superfície de biossensor em tempo real (BIAcore™). O anticorpo foi capturado em uma superfície de IgG anticamundongo e exposto a várias concentrações de proteína de pró-sPLA2-IB e sPLA2-IB recombinante. A análise cinética usando software BIAevaluation™ foi realizada para obter as constantes de taxa de associação e dissociação (Tabela 7). Como apresentado na Tabela 7, a introdução das mutações duplas ou triplas em nº 2B1 ou nº 2B2 não impactou de modo significativo a afinidade das variantes para o alvo de sPLA2-IB.
7.3 - Calorimetria de Varredura Diferencial de anticorpos humanizados nº 2B1 e nº 2B2
[0182] A desnaturação térmica normalizada de nº 2B1 e nº 2B2 é apresentada na Figura 8 e os parâmetros de DSC na Tabela 8. nº 2B1 mostra um perfil melhor nesses experimentos visto que o início de Tm e a Tm1 (que corresponde a CH2) foram maiores.
7.4- Cromatografia Analítica de Exclusão por Tamanho (SEC- HPLC) de anticorpos humanizados nº 2B1 e nº 2B2
[0183] Os nº 2B1 e nº 2B2 foram analisados por SEC-HPLC em tampão de PBS. Os resultados são resumidos na Tabela 9. Como apresentado, menos que 5 % do mAb estão presentes nos agregados de alto peso molecular, indicando conformação monomérica e ausência de agregação nas condições testadas.
7.5 - Análise de focalização isoelétrica capilar de anticorpos humanizados nº 2B1 e nº 2B2
[0184] O ponto isoelétrico e a distribuição relativa de variantes de carga dos nº 2B, nº 2B1 e nº 2B2 foram determinados por análise de focalização isoelétrica capilar imageada (icIEF). Os resultados são resumidos na Tabela 10. Para todos os anticorpos, os resultados repetíveis foram obtidos com valores de RSD de baixa %. O pI do pico principal foi 8,96 para nº 2B, 8,76 para nº 2B1 e 8,75 para nº 2B2. Além de um pI ligeiramente diferente do pico principal, nº 2B também mostra um perfil de variante de carga ligeiramente diferente como oposto às outras duas amostras. Enquanto nº 2B1 e nº 2B2 têm carga mais básica que ácida, o oposto é verdadeiro para nº 2B (Tabela 10). O pico principal em nº 2B compreendeu 64 % de todos os picos enquanto em nº 2B1 e nº 2B2, o pico principal apenas compreendeu 57 %. Nenhum pico pré-ácido e pós-básico foram detectados em todas as amostras testadas.
7.6 - Ligação de nº 2B, nº 2B1 e nº 2B2 aos FcγRs humanos
[0185] A ligação de nº 2B, nº 2B1 e nº 2B2 monoméricos aos FcγRs humanos foi testada por citometria de fluxo incubando-se os mAbs com células de CHO que expressam estavelmente FcγRI humano, FcγRIIA (H131), FcγRIIA(R131), FcγRIIB, FcγRIIIA(F176), FcγRIIIA(V176), FcγRIIIB(NAl), FcγRIIIB(NA2) e FcγRIIIB(SH), (REF P. Bruhns). Como apresentado na Figura 9, nº 2B é ligação apenas a hFcγRI e hFcγRIIIA(V176), enquanto nenhuma ligação monomérica de nº 2B1 e nº 2B2 a todos os hFcγRs testados foi observado. Complexo imunológico de anticorpo-antígeno foi testado incubando-se primeiramente o mAb com o antígeno e, então, incubando-se os complexos imunológicos formados com células de CHO que expressam estavelmente FcγRs humanos. O complexo imunológico de nº 2B é ligado a todos os hFcγRs testados, exceto hFcγRIIB (Figura 10). A ligação fraca é observada para complexo imunológico de nº 2B1 ao hFcγRIIIA(V176) (dados não mostrados), enquanto nenhuma ligação de complexo imunológico de nº 2B2 a quaisquer hFcγRs testados (dados não mostrados). A ligação residual de antígeno em células sensibilizadas por anticorpo foi testada incubando-se primeiramente nº 2B, nº 2B1 e nº 2B2 com células de CHO que expressam estavelmente FcγRs humanos. Após a lavagem, o antígeno biotinilado de sPFA2-GIB foi adicionado e detectado por citometria de fluxo usando um conjugado de FITC de avidina. Como descrito na Figura 11, a ligação residual do antígeno de sPFA2-GIB em mAb nº 2B foi observada quando ligada ao hFcγRI e ao hFcγRIIIA(V176). Ao contrário, nenhuma ligação residual do antígeno sPFA2-GIB em mAb nº 2B1 e nº 2B2 foi observada.
7.7 - Cocristalização de Fab nº 2B2 com sPLA2-GIB e definição do epítopo
[0186] O fragmento Fab de nº 2B2 foi cocristalizado com seu antígeno, os dados de difração de raios X e sPFA2-GIB do cocristal foram coletados na linha PROXIMA-1 em Soleil Synchrotron (St. Aubin, França). Os cristais pertencem ao grupo de espaço P21 (A=71,9Å, b=83,8Å, c=103,9Å; α=β=99,58°) com dois complexos de sPFA2-GIB/Fab por unidade assimétrica (Figura l2A). A resolução da estrutura do complexo de sPFA2-GIB/Fab possibilitou a identificação dos resíduos críticos envolvidos nas interações não covalentes no complexo e definido no epítopo nº 2B2. Como apresentado na Figura 12B, W3, R6 e K7 em sPFA2-IB estão envolvidos na interação com a cadeia leve de Fab e K10, C77, Y75, G79 e S80 em sPFA2-GIB estão envolvidos na interação com a cadeia pesada de Fab. 8- Propriedades biológicas de anticorpo humanizado nº 2B2
8.1- Efeito in vitro de anticorpo humanizado nº 2B na inibição de translocação nuclear de fosfoSTAT5 por sPLA2- GIB ou plasma de paciente infectado por HIV.
[0187] A capacidade de nº 14G9 ou nº 2B contrabalancear o efeito inibitório de 75 nM de sPLA2-GIB ou plasma isolado de pacientes infectados por HIV-1 na translocação nuclear de fosfo-STAT5 induzida por IL-7 em células T CD4 foi testada incubando-se os plasmas isolados de pacientes infectados por HIV-1 com os mAbs nº 14G9 ou nº 2B.
[0188] Como descrito na Figura 13, as quantidades crescentes dos mAbs nº 14G9 ou nº 2B levam a uma restauração dependente de dose da capacidade de sPLA2-IB (Figura 13A) ou plasmas de pacientes virêmicos (Figura 13B) para inibir a translocação nuclear de fosfoSTAT5 induzida por IL-7 em células T CD4 humanas isoladas de um doador saudável. EC50 para a restauração do efeito de sPLA2-IB consistiu em 3,7 ng/ml e 2,2 ng/ml para mAb nº 2B e mAb nº
14G9, respectivamente. EC50 para a restauração do efeito de plasma infectado por HIV consistiu em 3,3 ng/ml e 2,7 ng/ml para mAb nº 2B e mAb nº 14G9, respectivamente.
8.2- Efeito in vivo de nº 2B2 na inibição de translocação nuclear de fosfoSTAT5 por sPLA2-GIB
[0189] A capacidade de o mAb nº 2B2 contrabalancear in vivo o efeito inibitório da injeção de sPLA2-IB na translocação nuclear de fosfo-STAT5 induzida por IL-7 em células T CD4 foi testada injetando-se primeiramente 1 ou 2 mg do mAb nº 2B2 em camundongos, seguido da injeção de 100 µg de sPLA2-IB. A translocação nuclear de fosfo-STAT5 em células T CD4 isoladas de esplenócitos dos camundongos tratados foi, então, analisada por microscopia confocal.
[0190] Como descrito na Figura 14, a injeção de 100 µg de sPLA2-IB em camundongos levou a uma inibição de 50 % da translocação nuclear de fosfoSTAT5 em células T CD4 isoladas de esplenócitos. Esse efeito foi completamente eliminado pela injeção anterior de 1 ou 2 mg do mAb nº 2B2, com nenhum efeito significativo observado em injeções de controle. Tabela 1 Regiões variáveis Humanizadas Número de
IMGT Hibridoma versão versão resíduos Linhagem idênticos germinativa humana A B % de identidade geral 46*01 IGHV1- 66,3 80,6 81,6 65 - 79-80 / 98 10-1*04 IGHV5- 58,2 80,6 81,6 57 - 79-80 / 98
Regiões variáveis Humanizadas Número de
IMGT Hibridoma versão versão resíduos Linhagem idênticos germinativa humana A B % de identidade geral 39*01 IGKV1- 67,4 83,2 84,2 64 - 79-80 / 95 15*01 IGKV3- 62,1 85,3 86,3 59-81-82/95 Tabela 2 Nomenclatura C F C F C de Kabat WR1 DR1 WR2 DR2 WR3 DR3 Versões Não correspondência com Total humanizadas linhagem germinativa humana 1 1 3 Número de VH 0 5 4 7 2 98 identidade de resíduos 8 IGHV1 -46*01 3 2 9 5 R N 9 0,6 % versão A (79//98) 8 IGHV1 -46*01 3 1 9 5 R N 8 1,6 % versão B (80//98) IGHV5 -10- 8 1*04 versão 2 2 9 4 R N 9 0,6 % A (79//98) IGHV5 -10- 8 1*04 versão 2 1 9 4 R N 8 1,6 % B (80//98) 1 1 7 3 Número de VL 3 6 5 2 100 identidade de resíduos 8 IGKV1 -39*01 7 1 5 2 1 6 3,2 % versão A (79/95) IGKV1 -39*01 7 0 5 2 1 5 8
Nomenclatura C F C F C de Kabat WR1 DR1 WR2 DR2 WR3 DR3 Versões Não correspondência com Total humanizadas linhagem germinativa humana versão B 4,2 % (80/95) 8 IGKV3 -15*01 5 1 2 2 4 4 5,3 % versão A (81/95) 8 IGKV3 -15*01 5 0 2 2 4 3 6,3 % versão B (82/95) Tabela 3 Inibição de Atividade Enzimática (% de Controle) mAb (ug) Ab nº 1A Ab nº 1B Ab nº 2A Ab nº 2B 0,1 64 % 60 % 55 % 42 % 0,3 41 % 42 % 33 % 24 % 1 19 % 22 % 20 % 13 % 3 14 % 12 % 12 % 10 % Tabela 4 IC50 de IC50 de Ab pró-sPLA2- sPLA2-GIB humanizado GIB (nM) (nM) nº 1A 1053 1,9 nº 1B 263 3,3 nº 2A 216 1,9 nº 2B 341 2,3 Tabela 5
T Nome de Conc ΔH Tinício Tm1 Tm2 Tm3 1/2 amostra (mM) (cal/M) (°C) (°C) (°C) (°C) (°C) Ab nº 0,0034 5,01 1.04E6 65,26 70,65 78,84 - 1A
T Nome de Conc ΔH Tinício Tm1 Tm2 Tm3 1/2 amostra (mM) (cal/M) (°C) (°C) (°C) (°C) (°C) Ab nº 0,0137 5,01 1.09E6 64,28 71,19 81,94 - 1B Ab nº 0,0078 5,00 1.06E6 64,76 74,15 - 82,70 2A Ab nº 0,0074 5,02 1.03E6 64,68 70,59 77,81 83,85 2B
Tabela 6 Tempo de Retenção % de Área MW Calculado (kDa) nº 1A Ab 6,186 97,55 158 nº 1B Ab 6,193 97,19 157 nº 2A Ab 6,181 93,96 159 nº 2B Ab 6,183 97,52 159
Tabela 7 kon (104 koff t1/2 mAb Antígeno Kd (pM) M-1.s-1) (10-4s-1) (min)
22,5 ± 5,1 ± nº 2B sPLA2-IB 289 ± 12 786 ± 63 2,0 0,4
20,3 ± 5,7 ± nº 2B1 sPLA2-IB 278 ± 1 729±9 0,4 0,1
24,7 ± 4,7 ± nº 2B2 sPLA2-IB 302 + 2 796 + 8 1,3 0,2
0,080 pró- 17,6 ± 1417 ± 784900 ± nº 2B ± sPLA2-IB 0,4 25 31600 0,002 0,074 pró- 18,1 ± 1551 ± nº 2B1 ± 853400±12400 sPLA2-IB 0,4 51 0,003 kon (104 koff t1/2 mAb Antígeno Kd (pM) M-1.s-1) (10-4s-1) (min) 0,079 pró- 16,4 ± 1462 ± 879500 ± nº 2B2 ± sPLA2-IB 1,2 129 28300 0,007 Tabela 8 Nome de Conc T1/2 ΔH Tinício Tm1 Tm2 Tm3 amostra (mM) (°C) (cal/M) (°C) (°C) (°C) (°C) Ab nº 0,0060 5,02 0.591E6 64,16 68,66 77,60 83,38 2B1 Ab nº 0,0074 5,01 0.785E6 56,97 64,53 78,00 84,10 2B2 Tabela 9 Tempo de MW Calculado % de Área Retenção (kDa) Ab nº 2B1 6,128 96,30 170,53 Ab nº 2B2 6,159 97,18 166,12 Tabela 10 Nome de Ácido Ácid Ácido 1 Pico Bási Básic Básic amostra 3 o 2 Princip co 1 o 2 o 3 al Ab nº 2B 8,76 8,84 8,89 8,96 9,06 9,13 NA Ab nº 8,36 8,50 8,64 8,76 8,88 8,99 9,05 2B1 Ab nº 8,35 8,49 8,63 8,75 8,87 8,98 9,04 2B2
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Claims (19)
1. Anticorpo humanizado ou humano isolado ou um derivado do mesmo caracterizado por se ligar a sPLA2-GIB humano.
2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, ou o derivado do mesmo, caracterizado por ser monoclonal.
3. Anticorpo ou derivado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por se ligar a um epítopo que compreende pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado a partir de W3, R6, K7, K10, C77, Y75, G79 e S80 de sPLA2-GIB humano, por referência a SEQ ID NO: 14.
4. Anticorpo ou derivado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por inibir competitivamente a ligação de anticorpo monoclonal 14G9 ao sPLA2-GIB humano, em que o dito anticorpo monoclonal 14G9 compreende uma região variável de cadeia leve que compreende SED ID NO: 2 e uma região variável de cadeia pesada que compreende SEQ ID NO: 3.
5. Anticorpo ou derivado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por inibir competitivamente a ligação de anticorpo monoclonal nº 2B ao sPLA2-GIB humano, em que o dito anticorpo monoclonal nº 2B compreende uma cadeia leve que compreende ou que consiste em SEQ ID NO: 4 e uma cadeia pesada que compreende ou que consiste em SEQ ID NO: 5.
6. Anticorpo ou derivado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por inibir competitivamente a ligação de anticorpo monoclonal nº 2B1 ao sPLA2-GIB humano, em que o dito anticorpo monoclonal nº 2B1 compreende uma cadeia leve que compreende ou que consiste em SEQ ID NO: 4 e uma cadeia pesada que compreende ou que consiste em SEQ ID NO: 6.
7. Anticorpo ou derivado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por inibir competitivamente a ligação de anticorpo monoclonal nº 2B2 ao sPLA2-GIB humano, em que o dito anticorpo monoclonal nº 2B2 compreende uma cadeia leve que compreende ou que consiste em SEQ ID NO: 4 e uma cadeia pesada que compreende ou que consiste em SEQ ID NO: 7.
8. Anticorpo ou derivado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por neutralizar sPLA2-GIB.
9. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma cadeia leve que compreende ou que consiste em SEQ ID NO: 4 e uma cadeia pesada que compreende ou que consiste em SEQ ID NO: 5.
10. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma cadeia leve que compreende ou que consiste em SEQ ID NO: 4 e uma cadeia pesada que compreende ou que consiste em SEQ ID NO: 6.
11. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma cadeia leve que compreende ou que consiste em SEQ ID NO: 4 e uma cadeia pesada que compreende ou que consiste em SEQ ID NO: 7.
12. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender as seguintes regiões CDR: . CDR-L1: resíduos de aminoácido QDVSTA, . CDR-L2: resíduos de aminoácido WAS, . CDR-L3: resíduos de aminoácido QQDYSTPPT,
. CDR-H1: resíduos de aminoácido GYTFTNYW, . CDR-H2: resíduos de aminoácido IDPSDTRT e . CDR-H3: resíduos de aminoácido ARQTLYYEALDY.
13. Ácido nucleico caracterizado por codificar um anticorpo ou derivado conforme definido em qualquer uma das reivindicações anteriores ou uma cadeia leve ou pesada de tal anticorpo, ou um domínio variável do mesmo.
14. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por compreender uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs: 10-13 ou o complemento da mesma.
15. Vetor caracterizado por compreender um ácido nucleico conforme definido na reivindicação 13 ou 14.
16. Célula hospedeira recombinante caracterizada por conter um vetor conforme definido na reivindicação 15 ou um ácido nucleico conforme definido na reivindicação 13.
17. Composição farmacêutica caracterizada por compreender (i) um anticorpo ou derivado conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou um vetor conforme definido na reivindicação 15 ou um ácido nucleico conforme definido na reivindicação 13 ou uma célula hospedeira recombinante conforme definida na reivindicação 16, e (ii) um excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável.
18. Anticorpo ou derivado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por ser para uso no tratamento de uma doença em um indivíduo em necessidade do mesmo.
19. Método para produzir um anticorpo conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 12 caracterizado por compreender cultivar a célula conforme definida na reivindicação 16 sob condições adequadas para expressão do anticorpo, e recuperar opcionalmente o dito anticorpo.
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