CN112074292A - 治疗性抗sPLA2-GIB抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合PLA2‑GIB的人或人源化抗体、它们的产生及其用途。这些抗体表现出有利的特征，特别是用于治疗和诊断目的。

Description

治疗性抗sPLA2-GIB抗体及其用途
本发明涉及结合PLA2-GIB的抗体、它们的产生及其用途。这些抗体表现出有利的特性，特别是用于治疗和诊断目的。
发明背景
IB组胰分泌性磷脂酶A2(PLA2-GIB)为一种低分子量(14kD)、高度稳定(7个二硫键)的分泌蛋白，其催化磷脂的sn-2脂肪酰基键的水解以释放游离脂肪酸及溶血磷脂质(Lambeau及Gelb 2008)。在人类中，PLA2-GIB基因主要表达于胰腺中，在十二指肠、空肠及胃中具有较弱表达水平(Eskola等人1983a)(Nevalainen及Haapanen 1993)。已在诸如肺、眼(Kolko等人2007)及睾丸的其他组织中描述边缘表达。在人类胰腺中，PLA2-GIB主要合成于胰腺腺泡细胞的顶端酶原颗粒部分中(Eskola等人1983a)。亦已在胰岛β细胞的胰岛素分泌颗粒中检测到sPLA2-GIB且其与来自葡萄糖刺激的胰岛的胰岛素共分泌(Ramanadham等人1998)。酶以非活性前形式释放于胰液中且通过前肽的蛋白水解切割活化以产生成熟分泌形式(sPLA2-GIB)。体外实验表明胰蛋白酶及纤溶酶能够以良好效力活化前-sPLA2-GIB(Nakano等人1994)。
除了在胃肠道中的作用以外，PLA2-GIB亦在人类血浆中循环((Nishijima等人1983)(Eskola等人1983b)(Sternby 1984)(Nevalainen等人1985)(Kitagawa等人1991))。近期，PLA2-GIB被鉴定为在作为病毒血症HIV感染患者中的CD4T淋巴细胞的无应答性的基础的机制中起到关键作用。具体地，证明了sPLA2-IB为造成CD4 T淋巴细胞的长期不活化的蛋白质，其迫使CD4 T淋巴细胞进入异常活化分化状态，使得CD4 T淋巴细胞对某些生理学信号(诸如通过介白素-7传送的信号)不起反应(THEZE Jacques等人2015)。
因此需要允许抑制PLA2-GIB的酶促活性的针对PLA2-GIB的抗体。
发明概述
本发明提供了抗PLA2-GIB抗体及其使用方法。更具体地，本发明提供了针对人sPLA2-GIB的治疗性抗体，其可以中和sPLA2-GIB的酶促活性。
更具体地，本发明的目的涉及结合人sPLA2-GIB的人或人源化抗体或其衍生物。
本发明的优选的人或人源化抗体结合包含至少一个选自人sPLA2-GIB的W3、R6、K7、K10、C77、Y75、G79和S80的氨基酸残基的表位。本发明的进一步优选的抗体是中和抗体。此类抗体的具体例子是抗体#2B，#2B1和#2B2。
本发明的另一个目的涉及编码如上定义的抗体或衍生物或其轻链或重链或其可变域的核酸分子。
本发明还涉及包含如上定义的核酸的载体，以及包含此类载体或核酸分子的重组宿主细胞。
本发明的另一个目的是药物组合物，其包含(i)如上文定义的抗体或衍生物、核酸、载体或重组宿主细胞，和(ii)药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明还涉及如上定义的抗体或衍生物、核酸、载体、重组宿主细胞或组合物，其用作药物，特别是用于用于在有此需要的受试者中治疗免疫病症。
本发明还涉及用于治疗有此需要的受试者，特别是患有免疫病症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用如上文定义的抗体或衍生物、核酸、载体、重组宿主细胞或组合物。
本发明的另一个目的涉及产生如上文定义的抗体的方法，包括在适合于抗体表达的条件下培养如上文定义的细胞，和任选地回收所述抗体。
本发明的治疗性抗体可以用于任何哺乳动物，特别是有此需要的任何人类受试者。它们适合于抑制PLA2-GIB并校正与所述蛋白质的不期望的活性有关的任何疾病。
附图简述
图1：单克隆抗体14G9的特性。A：对sPLA2-GIB酶促活性的抑制。B：间接ELISA中的稀释曲线。C：竞争性ELISA中的稀释曲线。
图2：单克隆抗体14G9对于自HIV-1感染患者分离的血浆对来自一个健康供体的CD4 T细胞中磷酸STAT5(phosphoSTAT5)的核移位(nuclear translocation)的抑制作用的抑制。使用同种型对照单抗未观察到作用。
图3：10μg单克隆抗体14G9对于自HIV-1感染患者分离的血浆对来自5个不同健康供体的CD4 T细胞中的磷酸STAT5的核移位的抑制作用的抑制。使用10μg同种型对照单抗或非抑制性#6F7单抗未观察到作用。
图4：1mg单克隆抗体14G9对于100μg sPLA2-GIB对自小鼠脾细胞分离的CD4 T细胞中磷酸STAT5的核移位的抑制作用的体内抑制。在注射900μg同种型对照单抗时未观察到显著作用。
图5：通过竞争性ELISA对14G9人源化变体的亲和力的估计。
图6：人源化抗体#1A、#1B、#2A及#2B的标准化热变性。
图7：#2B的SEC分析。上部图，#2B的SEC层析图。中间图，经缩放基线。下部图，具有峰值指派的经缩放基线。
图8：人源化抗体#2B1及#2B2的标准化热变性。
图9：人源化抗体#2B、#2B1及#2B2对人类FcγR的单体IgG结合的流式细胞术分析。
图10：#2B对人类FcγR的免疫复合体结合的流式细胞术分析。
图11：人源化抗体#2B、#2B1及#2B2的抗体致敏细胞上的抗原与人类FcγR的残留结合的流式细胞术分析。
图12：Fab#2B2/sPLA2-IB复合体的晶体结构。sPLA2-GIB主链以灰色及紫色描绘，#2B2 Fab轻链呈浅蓝色及粉色，且#2B2 Fab重链呈绿色及黄色(A)。Fab#2B2/sPLA2-GIB复合体中的非共价键，sPLA2-GIB主链呈黄色，#2B2 Fab轻链呈浅蓝色，且#2B2 Fab重链呈绿色(B)。
图13：通过14G9或#2B抑制sPLA2-GIB(A)或自HIV-1感染患者分离的血浆(B)对来自一个健康供体的CD4 T细胞中的磷酸STAT5的核移位的抑制作用。
图14：通过1或2mg#2B2体内抑制100μg sPLA2-GIB对自小鼠脾细胞分离的CD4 T细胞中的磷酸STAT5的核移位的抑制作用。在注射1mgμg同种型对照单抗时未观察到显著作用。
表1：小鼠V基因或其人源化形式与用作受体序列的可变人类种系之间的一致性百分比。
表2：人源化形式与其对应人类种系之间的跨V基因的序列差异的细节。
表3：通过人源化抗体抑制sPLA2-GIB酶促活性。结果表述为对照％。
表4：通过竞争性ELISA所获得的不同人源化抗体针对重组人类sPLA2-GIB及重组人类前-sPLA2-GIB的估计IC50。
表5：人源化抗体的差示扫描量热法。Tm为变性/熔解温度。Tonset为解折叠转变开始的温度。T1/2为在波峰的半高处的转变的宽度。ΔH为量热解折叠焓且反映蛋白质的分子内相互作用的破坏。总面积为整体解折叠焓(热分析图下的总面积)且反映热力学稳定性。
表6：#1A、#1B、#2A及#2B人源化抗体的SEC-HPLC分析。
表7：通过#2B、#2B1及#2B2人源化抗体的表面等离子体共振针对重组人类sPLA2-GIB及重组人类前-sPLA2-GIB测定Kd。
表8：#2B1及#2B2人源化抗体的差示扫描量热法。Tm为变性/熔解温度。Tonset为解折叠转变开始的温度。T1/2为在波峰的半高处的转变的宽度。ΔH为量热解折叠焓且反映蛋白质的分子内相互作用的破坏。总面积为整体解折叠焓(热分析图下的总面积)且反映热力学稳定性。
表9：#2B1及#2B2人源化抗体的SEC-HPLC分析。
表10：#2B、#2B1及#2B2人源化抗体的成像毛细管等电聚焦(icIEF)分析。样品中存在的不同电荷变体的平均表观pI。
发明详述
抗体
本发明基于新型人抗体和人源化抗体的产生，所述新型人抗体和人源化抗体在治疗上可用于有效和选择性地调节人受试者中PLA2-GIB的活性。
如本文所用，术语“PLA2-GIB”表示IB组胰腺磷脂酶A2。PLA2-GIB已自各种哺乳动物物种中鉴定出并克隆。人类PLA2-GIB蛋白公开于例如Lambeau及Gelb(2008)中。序列可以以Genbank编号NP_000919获得。
示例性的人PLA2-GIB的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO:1)。
Figure BDA0002662449460000041
SEQ ID NO:1的氨基酸1至15(加下划线)为信号序列，且SEQ ID NO:1的氨基酸16至22(加粗)为前肽序列。
在本发明的上下文内，术语“PLA2-GIB”优选表示人类PLA2-GIB。
人类PLA2-GIB蛋白可以两个不同形式存在：非活性前形式(前-sPLA2-GIB)，其通过前肽的蛋白水解切割活化，从而产生成熟分泌形式(sPLA2-GIB)。术语PLA2-GIB包括任何形式的蛋白质，诸如前形式和/或成熟形式。通常，成熟分泌形式包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基23-148的序列(SEQ ID NO:14)或其任何天然变体，诸如由多态性或剪接产生的变体。
SEQ ID NO: 14：
Figure BDA0002662449460000051
术语“前-sPLA2-GIB”或“前PLA2-GIB”优选表示包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基16-148的序列或其任何天然变体(诸如由多态性或剪接产生的变体)的蛋白质。
申请人已产生若干针对sPLA2-GIB的单克隆抗体。他们已发现它们之一抗体#14G9展现显著中和活性且对sPLA2-GIB具选择性。申请人进一步表征此单克隆抗体、其可变区以及其表位。具体地，如实验部分中所示，抗体14G9结合参考SEQ ID NO:14包含人类sPLA2-GIB的氨基酸残基W3、R6、K7、K10、C77、Y75、G79及S80的表位。申请人亦能够基于14G9产生人源化抗体且证明其显著体外及体内活性。
因此，本发明涉及针对PLA2-GIB的分离的人类或人源化抗体。
更具体地，本发明提供了选择性结合人类PLA2-GIB且中和人类PLA2-GIB的人类或人源化抗体。
非人类(例如，鼠)抗体的“人源化”形式为嵌合抗体，其含有来源于植入人类支架(例如，人类抗体链恒定域)中的非人类免疫球蛋白的最小序列。在极大程度上，人源化抗体为人类免疫球蛋白(接受者抗体)，其中接受者的高变区残基经来自诸如具有所需特异性、亲和力及能力的小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物的非人类物种(供体抗体)的高变区残基置换。此外，人源化抗体可包含在接受者抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体效能。一般而言，人源化抗体包含至少一个及通常两个可变域中的基本上全部可变域，其中全部或基本上全部高变区对应于非人类免疫球蛋白的高变区，且全部或基本上全部FR为人类免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选地亦包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常为人类免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分(Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Reichmann等人,Nature 332:323.329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992))。
“人类抗体”为具有对应于人类产生抗体的氨基酸序列的氨基酸序列和/或使用用于制备如本文所公开的人类抗体的技术中之任一者产生的抗体。人类抗体可使用本领域本身已知的各种技术产生，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581(1991))。Cole等人,Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy,AlanR.Liss,第77页(1985)；Boerner等人,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)中描述的方法亦可用于制备人类单克隆抗体。亦参见van Dijk及van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。人类抗体可通过将抗原施用至转基因动物来制备，该转基因动物已经修饰以响应抗原攻击而产生此类抗体，但其内源基因座已失能(例如经免疫的Xenomice)(参见例如关于XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181及6,150,584)且经人类基因座置换。关于经由人类B细胞杂交瘤技术产生的人类抗体，亦参见例如Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。
本发明抗体可为多克隆抗体、单克隆抗体或其衍生物，其保持相同抗原特异性，诸如人源化纳米抗体或scFv。本发明抗体优选为单克隆抗体，亦即，各自针对单一抗原位点的抗体。本发明的单克隆抗体可通过本领域本身已知的方法制备，诸如通过首先由Kohler等人,Nature 256:495(1975)描述的杂交瘤方法或通过重组DNA方法制备。其亦可使用描述于例如Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)及Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中的技术自噬菌体抗体文库分离。
特别地，本发明提供了选择性结合人类PLA2-GIB且中和人类PLA2-GIB的人类或人源化单克隆抗体。
在优选实施方案中，本发明抗体为人源化单克隆抗体。
在一个更优选的实施方案中，本发明涉及结合人类sPLA2-GIB，优选地结合包含至少一个选自人类sPLA2-GIB的W3、R6、K7、K10、C77、Y75、G79及S80的氨基酸残基(参考SEQ IDNO:14)的表位，更优选地结合包含至少2个或至少3个选自人类sPLA2-GIB的W3、R6、K7、K10、C77、Y75、G79及S80的氨基酸残基的表位，进一步更优选地结合包含至少4个、至少5个、至少6个或至少7个选自人类sPLA2-GIB的W3、R6、K7、K10、C77、Y75、G79及S80的氨基酸残基的表位的人类或人源化单克隆抗体。本发明显示结合此类残基的抗体展现有力的中和活性且代表用于体内抑制人类PLA2-GIB的有价值的治疗剂。
在一个具体的实施方案中，本发明抗体或衍生物竞争性抑制单克隆抗体14G9对人类sPLA2-GIB的结合，该单克隆抗体14G9包含：包含SEQ ID NO:2的轻链可变区和包含SEQID NO:3的重链可变区。
在另一个具体的实施方案中，本发明抗体或衍生物竞争性抑制单克隆抗体#2B对人类sPLA2-GIB的结合，该单克隆抗体#2B包含：包含SEQ ID NO:4或由SEQ ID NO:4组成的轻链和包含SEQ ID NO:5或由SEQ ID NO:5组成的重链。
在另一个具体的实施方案中，本发明抗体或衍生物竞争性抑制单克隆抗体#2B1对人类sPLA2-GIB的结合，该单克隆抗体#2B1包含：包含SEQ ID NO:4或由SEQ ID NO:4组成的轻链和包含SEQ ID NO:6或由SEQ ID NO:6组成的重链。
在另一个具体的实施方案中，本发明抗体或衍生物竞争性抑制单克隆抗体#2B2对人类sPLA2-GIB的结合，该单克隆抗体#2B2包含：包含SEQ ID NO:4或由SEQ ID NO:4组成的轻链和包含SEQ ID NO:7或由SEQ ID NO:7组成的重链。
术语“竞争性抑制”指示抗体可减少或抑制或置换参考抗体对sPLA2-GIB的结合。可使用诸如例如竞争性ELISA或其他结合测定法的标准技术进行竞争测定法。典型地，竞争性结合测定法涉及通常结合至固体基底或细胞的纯化的标靶抗原、未标记的测试抗体及经标记的参考抗体。竞争性抑制是通过测定在测试抗体存在的情况下所结合的经标记的抗体的量来测量的。通常，测试抗体过量存在，诸如为参考抗体的量的约5至500倍。典型地，对于ELISA，测试抗体为100倍过量，且对于酶促法，测试抗体为10倍过量。当过量存在的测试抗体抑制或置换参考抗体对抗原的结合的至少70％时，其被视为竞争性抑制所述参考抗体。在一个具体的实施方案中，当100倍过量存在的测试抗体在ELISA中抑制或置换参考抗体对抗原的结合的至少70％，更优选地至少80％时，其被视为竞争性抑制所述参考抗体。优选竞争抗体结合共享共同氨基酸残基的表位。
在一个具体的实施方案中，本发明涉及一种单克隆抗体，其包含：
(i)包含CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3及FR-L的轻链可变区，其中CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3分别由SEQ ID NO:2的轻链可变区的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3组成或基本上由以上者组成，且其中FR-L是人类免疫球蛋白序列；及
(ii)包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3及FR-H的重链可变区，其中CDR-H1、CDR-H2和/或CDR-H3分别由SEQ ID NO:3的重链可变区的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3组成或基本上由以上者组成，且其中FR-H是人类免疫球蛋白序列。
抗体的“可变区”指含有抗原结合位点的重链或轻链的氨基端域(“VH”或“VL”)。轻链或重链可变区(VL或VH)一般由以三个高变区中断的框架区(“FR”)组成，所述高变区被称作“互补决定区”或“CDR”。框架区及CDR的范围已由例如Kabat(参见“Sequences ofProteins of Immunological Interest”，E.Kabat等人,U.S.Department of Health andHuman Services,(1983))及Chothia精确限定。
参考SEQ ID NO:2，三个CDR区对应于以下氨基酸残基：
.CDR-L1：氨基酸残基QDVSTA，
.CDR-L2：氨基酸残基WAS，
.CDR-L3：氨基酸残基QQDYSTPPT。
参考SEQ ID NO:3，三个CDR区对应于以下氨基酸残基：
.CDR-H1：氨基酸残基GYTFTNYW，
.CDR-H2：氨基酸残基IDPSDTRT，
.CDR-H3：氨基酸残基ARQTLYYEALDY。
在一个具体的实施方案中，本发明涉及一种单克隆抗体，其选自：
.包含含有SEQ ID NO:4、基本上由SEQ ID NO:4组成或由SEQ ID NO:4组成的轻链及含有SEQ ID NO:5、基本上由SEQ ID NO:5组成或由SEQ ID NO:5组成的重链的单克隆抗体(克隆#2B)；
.包含含有SEQ ID NO:4、基本上由SEQ ID NO:4组成或由SEQ ID NO:4组成的轻链及含有SEQ ID NO:6、基本上由SEQ ID NO:6组成或由SEQ ID NO:6组成的重链的单克隆抗体(克隆#2B1)；
.包含含有SEQ ID NO:4、基本上由SEQ ID NO:4组成或由SEQ ID NO:4组成的轻链及含有SEQ ID NO:7、基本上由SEQ ID NO:7组成或由SEQ ID NO:7组成的重链的单克隆抗体(克隆#2B2)；及
.其衍生物。
如本文所用，术语“抗体衍生物”指保持参考抗体的抗原特异性但其中一或多个氨基酸残基(以化学方式或在生物学上)经修饰以改良其特性的抗体。
此类化学修饰的实例包括例如烷基化、聚乙二醇化、酰化、酯或酰胺形成等。具体地，衍生物为经修饰以含有诸如水溶性聚合物的一或多个其他非蛋白质部分的如本文所公开的抗体。水溶性聚合物的实例包括(但不限于)PEG、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖及聚乙烯醇。
亦可产生衍生物以增加或减少抗体糖基化的程度。向抗体中添加糖基化位点或使抗体缺失糖基化位点可通过改变氨基酸序列以便产生或移除一或多个糖基化位点来便利地实现。在抗体包含Fc区的情况下，可改变连接于其上的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含一般通过N键连接至Fc区的CH2域的Asn297的分支、双触角寡糖(参见例如Wright等人,TIBTECH,1997,15:26-32)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及连接至双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可对本发明抗体中的寡糖进行修饰以便产生具有某些改良特性的抗体变体。
在一个实施方案中，衍生物具有经修饰的Fc区以便改变ADCC(经由调节FcgammaRIII结合)。
在一个实施方案中，提供具有缺乏连接(直接或间接)至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的抗体变体。例如，此类抗体中的岩藻糖的量可为1％至80％、1％至65％、5％至65％，或20％至40％。岩藻糖的量是通过相对于如通过MALDI-TOF质谱法所测量的连接至Asn 297的所有糖结构(例如，复杂、杂合及高甘露糖结构)的总和计算Asn297处的糖链内的岩藻糖的平均量来测定的。Asn297指位于Fc区中约位置297(Fc区残基的Eu编号)处的天冬酰胺残基；然而，由于抗体的轻微序列变化，Asn297亦可位于位置297上游或下游约±3个氨基酸处，亦即位置294与300之间。与“去岩藻糖基化(defucosylated)”或“岩藻糖缺乏”抗体变体相关的出版物的实例包括(但不限于)Okazaki等人J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)及Yamane-Ohnuki N,Satoh M.mAbs.2009；1:230-236。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括蛋白岩藻糖基化中缺乏的Led 3CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986))及基因敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8基因敲除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006))。
在某些实施方案中，可能需要产生经半胱氨酸工程化改造的抗体，例如“thioMAb”，其中抗体之一或多个残基经半胱氨酸残基取代。在具体实施方案中，经取代的残基存在于抗体的可接近位点处。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基藉此定位于抗体的可接近位点处且可用于使抗体与其他部分(诸如药物部分或接头-药物部分)缀合以产生如本文中进一步描述的免疫缀合物。在某些实施方案中，以下残基中的任一者或多者可经半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；及重链Fc区的S400(EU编号)。可如例如美国专利号7,521,541中所描述产生经半胱氨酸工程化改造的抗体。
术语衍生物亦包括包含与一或多个异源分子(包括但不限于细胞毒剂、诸如荧光部分的可检测部分、诊断性放射性同位素或显影剂)缀合或与固体支持物(诸如琼脂糖珠粒等)缀合的如上文所定义的抗sPLA2-GIB抗体的免疫缀合物。细胞毒剂的实例包括但不限于化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段)或放射性同位素。可使用熟练技术人员熟知的多种双官能蛋白偶联剂制备抗体与细胞毒剂的缀合物。接头可为促进细胞毒性药物在细胞中释放的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含有二硫化物的接头(Chari等人,Cancer Res.52:127-131(1992))。衍生物亦可为双特异性抗体。
典型地，本发明抗体是“分离的”，例如已自其天然环境的至少一种组分分离。具体地，抗体可经纯化至更大纯度，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或逆相HPLC)技术所测定。对用于评估抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman等人,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
如上文所论述，本发明抗体实质上为中和抗体，亦即，其能够至少部分抑制PLA2-GIB的活性。
sPLA2-GIB催化磷脂质的sn-2脂肪酰基键的水解以释放游离脂肪酸及溶血磷脂。本发明的特定抗体抑制sPLA2-GIB的酶促活性，诸如磷脂质的sn-2脂肪酰基键的水解。用于测试此特性的方法详细公开于实验部分中。
本发明的其他特定抗体抑制sPLA2-GIB与其底物的结合。
本发明的其他特定抗体抑制sPLA2-GIB介导的对CD4 T细胞中IL-7诱导的磷酸STAT5核移位的抑制。用于测试此特性的方法详细公开于实验部分中。
抗体或衍生物的中和活性可使用例如结合或生物分析(诸如如实验部分中所描述的测试)体外或体内测定。抑制/中和可为完全或部分的。具体地，抗体可抑制10％或更高的所测试活性，优选地20％或更高、30％或更高、40％或更高、50％或更高。
在优选实施方案中，抗体为IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
优选抗体选择性结合sPLA2-GIB，亦即相较于其他分子展现与sPLA2-GIB的优选结合。选择性可通过竞争性ELISA或Biacore测定法测定。标志着选择性的亲和力/亲合力的差异可为任何可检测的偏爱，诸如大于1:1.1或大于约1:5、1:10、1:100、1:1000或更大的比率。
本发明抗体或衍生物可使用常规方法及培养基分离及保存。它们可经冻干。它们亦可经冷冻。
核酸、载体、宿主细胞及重组产物
在另一方面，本发明涉及编码本发明的抗体、或其轻链或重链、或其可变域的核酸分子，或与所述编码序列互补的核酸。优选地，核酸为分离或纯化的核酸。
核酸可为DNA(cDNA或gDNA)、RNA或其混合物。其可呈单链形式或呈双链体形式或两者的混合。它可包含经修饰的核苷酸，包含例如经修饰的键、经修饰的嘌呤或嘧啶碱基或经修饰的糖。其可通过本领域技术人员已知的任何方法制备，包括化学合成、重组及诱变。根据本发明的核酸可自根据本发明的抗体的序列推论，且密码子选择可根据应转录核酸的宿主细胞来调适。这些步骤可根据本领域技术人员公知的方法进行且其中一些描述于参考手册Sambrook等人(Sambrook J,Russell D(2001)Molecular cloning:a laboratorymanual,Third Edition Cold Spring Harbor)中。
本发明的核酸可编码包含抗体的轻链的氨基酸序列和/或包含抗体的重链的氨基酸序列，或可与此类编码序列互补。
此类核酸序列的具体实例包括以SEQ ID NO:10-13提供的序列。
本发明进一步提供包含本发明的核酸的载体。任选地，载体可包含若干本发明的核酸。具体地，载体可包含与调节区(亦即包含一或多个控制序列的区域)可操作地连接的本发明核酸。任选地，载体可包含与若干调节区可操作地连接的若干本发明核酸。
术语“控制序列”指表达编码区所需的核酸序列。控制序列可为内源性或异源性的。本领域技术人员熟知且当前所使用的控制序列将为优选的。此类控制序列包括但不限于启动子、信号肽序列及转录终止子。
术语“可操作地连接”指将控制序列相对于编码序列置放于适当位置处，以此方式使得控制序列引导编码区的表达的结构。
本发明进一步涉及根据本发明的核酸或载体用以转化、转染或转导宿主细胞的用途。
本发明亦提供一种宿主细胞，其包含一种或若干种本发明的核酸和/或一种或若干种本发明的载体。
术语“宿主细胞”亦涵盖亲本宿主细胞的因复制期间发生的突变而与亲本宿主细胞不一致的任何后代。
适于克隆或表达抗体编码载体的宿主细胞包括本文所描述的原核或真核细胞。
例如，抗体可于细菌中产生，在不需要糖基化及Fc效应功能时尤其如此。对于细菌中抗体片段及多肽的表达，参见例如美国专利号5,648,237、5,789,199及5,840,523(亦参见Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ,2003),第245-254页，其描述大肠杆菌中抗体片段的表达)。抗体在表达后可自可溶性级份中的细菌裂解物分离且可进一步经纯化。
除原核生物以外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物为适用于抗体编码载体的克隆或表达宿主，包括糖基化路径已经“人源化”，从而使得所产生的抗体具有部分或完全人类糖基化模式的真菌及酵母菌株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)及Li等人,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
适用于表达糖基化抗体的宿主细胞亦来源于多细胞生物体(无脊椎动物及脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物及昆虫细胞。已鉴定出众多可与昆虫细胞联合使用，尤其用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的杆状病毒株。植物细胞培养物亦可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978及6,417,429。
脊椎动物细胞亦可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可为适用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例为经SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系；人类胚肾细胞系(如例如在Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977)中所描述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞特利细胞(mouse Sertoli cell)(如例如在Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人类宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；水牛鼠肝细胞(buffalo rat livercell)(BRL 3A)；人类肺细胞(W138)；人类肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；如例如在Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所描述的TRI细胞；MRC 5细胞；及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；及骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0及Sp2/0。关于适合于产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ),第255-268页(2003)。
本发明亦涉及一种用于产生本发明的抗体的方法，包含在适合于表达抗体的条件下培养包含如上文所提供的本发明核酸或本发明载体的宿主细胞，及任选地自宿主细胞或自宿主细胞培养基回收抗体。任选地，所回收抗体可进一步经纯化或分离。合适的培养基、培养条件及产生方法为技术人员所公知且可易于根据宿主细胞及待产生的抗体进行选择。
药物组合物
本发明进一步涉及药物组合物，其包含本发明的抗体、核酸、载体或宿主细胞。该组合物可包含一种或若干种本发明抗体、一种或若干种本发明核酸和/或一种或若干种本发明载体和/或一种或若干种本发明宿主细胞。优选地，该药物组合物包含一种或若干种本发明抗体。
包含本发明抗体的药物组合物可根据已知方法配制，以制备药学上有用的组合物，其中将具有所需纯度的抗体与任选的生理学上可接受载剂、赋形剂或稳定剂以水溶液、冻干的配制剂或其他方式干燥的配制剂的形式混合(Remington:The Science andPractice of Pharmacy第20版(2000))。
如本文所用，术语“药物配制剂”或“药物组合物”指一种制剂，其呈诸如允许活性成分的生物活性有效的形式，且其不含对将接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的其他组分。优选地，此类配制剂为无菌的，亦即无菌或不含任何活微生物及其孢子。
可接受载剂、赋形剂或稳定剂在所采用剂量及浓度下对接受者无毒性，且包括但不限于缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等张剂、非离子去污剂、抗氧化剂及其他各种添加剂。
缓冲剂有助于将pH维持在接近生理条件的范围内。它们优选地以在约1mM至约50mM范围内的浓度存在。适用于本发明的缓冲剂包括但不限于有机酸及无机酸两者以及其盐，诸如柠檬酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、延胡索酸盐、葡糖酸盐、草酸盐、乳酸盐及乙酸盐缓冲剂，以及磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂及三甲胺盐，诸如Tris。
可以添加防腐剂以延缓微生物生长，并且添加量可在0.2％至1％(w/v)范围内。适用于本发明的防腐剂包括但不限于酚类；丁醇或苯甲醇；间甲苯酚；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；氯化十八烷基二甲基苯甲铵(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride)，苯扎卤铵(benzalkonium halides)(例如，苯扎氯铵、苯扎溴铵、苯扎碘铵)；氯己双铵或苄索氯铵；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；及3-戊醇。
可添加等张剂来确保本发明的液体组合物的等张性且等张剂包括多羟基糖醇(polhydric sugar alcohol)，优选三羟基以上糖醇，诸如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇及甘露糖醇。
稳定剂指广泛类别的赋形剂，其功能范围可自填充剂至使治疗剂溶解或有助于防止变性或粘附于容器壁上的添加剂。典型的稳定剂可以是多羟基糖醇(以上所列举)；氨基酸，诸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，诸如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌肉肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括环醇，诸如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，诸如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油及硫代硫酸钠；低分子量多肽(亦即，＜10个残基)；蛋白质，诸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮单糖，诸如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，诸如乳糖、麦芽糖、蔗糖；及三糖，诸如棉子糖；以及多糖，诸如葡聚糖。每重量份治疗剂可存在0.1至10,000重量范围内的稳定剂。
可添加非离子表面活性剂或洗涤剂(亦称为“湿润剂”)以帮助溶解治疗剂以及保护治疗性蛋白质以免搅拌诱导的聚集。合适的非离子表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯(20、80等)、泊洛沙姆(polyoxamer)(184、188等)、PLURONICSTM、多元醇、聚氧乙烯山梨聚糖单醚(polyoxyethylene sorbitan monoether)(TWEENTM-20、TWEENTM-80等)。非离子表面活性剂可按约0.05mg/ml至约1.0mg/ml，优选约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。
其他各种赋形剂包括但不限于填充剂(例如，淀粉)、螯合剂(例如，EDTA)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)及共溶剂。
亦可将活性成分截留于例如通过凝聚技术或通过表面聚合所制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊))中、截留于胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子及纳米胶囊)中或截留于粗乳液中。此类技术公开于Remington:The Science and Practice of Pharmacy第20版(2000)中。
药物组合物的形成、施用途径、剂量及方案视待治疗的病状、疾病的严重度、患者的年龄、重量及性别等而定。
用于施用的剂量可随各种参数而调适，且具体地随所用施用模式、相关病理学或者所需治疗持续时间而调适。
本发明的药物组合物可经配制用于局部、经口、胃肠外、鼻内、静脉内、肌肉内、皮下或眼内施用等。
优选地，药物配制剂为能够注射的配制剂。这些尤其可为等张的无菌盐水溶液(磷酸单钠或二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或此类盐的混合物)，或干燥、尤其冷冻干燥的组合物，其根据情况添加例如灭菌水或生理盐水时，允许构成可注射溶液。
无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物视需要与上文列举的各种其他成分一起并入适当溶剂中，随后过滤灭菌来制备。在无菌粉末用于制备无菌可注射溶液的情况下，优选制备方法为真空干燥及冷冻干燥技术，其从先前无菌过滤溶液产生活性成分加任何其他所需成分的粉末。
除经配制用于胃肠外施用(诸如静脉内或肌肉内注射)的组合物以外，其他药学上可接受的形式包括例如片剂或用于经口施用的其他固体；延时释放胶囊；及目前使用的任何其他形式。
本发明的药物组合物可包含一种或若干种本发明抗体。
药物组合物可进一步包含一种或若干种其他活性化合物。其他活性化合物的实例包括但不限于化学治疗药物、抗生素、抗寄生物剂、抗真菌剂或抗病毒剂。
将有效治疗特定病症或病状的本发明抗体的量将取决于该病症或病状的性质且可通过标准临床技术测定。
在一个优选实施方案中，每剂量的范围可为每千克体重约0.1mg至约25mg抗体或更优选为每千克体重约1mg至约10mg。
用于施用的给药时程可视多种临床因素(包括疾病的类型、疾病的严重度及受试者对治疗剂的敏感性)而定在每月一次至每天一次之间变化。
治疗性应用
本发明进一步涉及本发明的抗体、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物，其用作尤其预防或治疗与sPLA2-GIB相关的疾病的药物。
本发明亦涉及本发明的抗体、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物作为用于治疗疾病的药物的用途。本发明亦涉及本发明的抗体、核酸、载体、宿主细胞或药物组合物用于制造或制备治疗受试者的疾病的药物的用途。
具体地，本发明涉及一种治疗受试者中的疾病的方法，其包含向有此需要的受试者施用有效量的本发明的抗体、核酸、载体、宿主细胞或组合物。
如本文所用，术语“受试者”或“患者”指任何哺乳动物，优选地人类。
有效量可为治疗或预防有效量。“治疗有效量”指必需剂量下及在必需时间段内有效达成所需治疗或预防结果的量。本发明的抗体或组合物的治疗有效量可根据以下因素变化，诸如疾病状态、受试者的年龄、性别及体重，以及抗体或组合物在受试者中诱导所需反应的能力。治疗有效量涵盖抗体或组合物的治疗有利作用超过任何毒性或有害作用的量。“预防有效量”指在必需剂量下及在必需时间段内有效达成所需预防结果的量。通常但并非必需，因为在疾病之前或在疾病早期在受试者中使用预防剂量，所以预防有效量将低于治疗有效量。
本发明可用于预防或治疗与某一程度的不期望的PLA2-GIB活性相关的任何疾病或病症。
在一个具体的实施方案中，本发明可用于预防或治疗与不适当(例如，缺陷性或不当)免疫反应(具体地与不适当CD4 T细胞活性)相关的任何疾病以及增加免疫性可改善受试者病状的任何疾病。这些疾病在本申请中有时被称作“免疫病症”或“免疫缺陷”。这包括尤其由病毒感染或病原性感染或癌症引起的免疫缺陷情形。
如本文所用，术语“治疗”指例如尝试改变待治疗的个体的自然过程的任何临床干预，且可针对预防或治愈目的而进行。所需治疗作用包括但不限于预防疾病发生或复发、缓解症状、减轻疾病的任何直接或间接病理性结果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或缓和疾病病况及缓解或改良预后。在一些实施方案中，本发明的组合物及方法用以延缓疾病或病症的形成或减慢疾病或病症的进展。
可得益于此类治疗的疾病的实例为关于免疫缺陷(诸如HIV介导的免疫缺陷)的所有疾病。就此而言，在一个具体的实施方案中，本发明涉及用于治疗有此需要的受试者中的免疫缺陷或相关病症的方法，其包含向所述受试者施用如上文所定义的抗体、核酸、载体、宿主细胞或组合物。
在另一个具体的实施方案中，本发明涉及一种用于治疗有此需要的受试者中的免疫缺陷或相关病症的如上文所定义的抗体、核酸、载体、宿主细胞或组合物。
免疫缺陷及相关病症表示特征为受试者中的免疫功能或反应降低和/或由免疫功能或反应降低所致的任何病状或病理学。免疫缺陷可由例如病毒感染(例如HIV、乙肝等)、细菌感染、癌症或其他病理性病状所致。因此，术语“免疫缺陷相关病症”表示由免疫缺陷所致或与免疫缺陷有关的任何疾病。本发明尤其适用于治疗与CD4-T细胞相关的免疫缺陷症，及相关疾病。
在一个具体的实施方案中，本发明涉及通过向受试者施用如上文所定义的抗体、核酸、载体、宿主细胞或组合物治疗该受试者的HIV感染的方法。在一些实施方案中，受试者为早期HIV患者且方法使患者成为HIV控制者的概率增加。在一些实施方案中，受试者为在抗逆转录病毒治疗之后具有低免疫重建和/或具有重度特发性CD4 T淋巴细胞减少症(ICL)的患者。本发明亦涉及一种通过向经HIV感染的受试者施用式A化合物来增加该受试者中CD4-T细胞活性的方法。
本发明可用于治疗感染初期的受试者以预防或减少免疫缺陷的发生、程度或持续时间。通常，他们可在检测到传染病后立即及显现临床症状之前进行施用。在HIV感染期间的极早期，本发明可引导患者朝向HIV控制者状态发展。本发明亦可在之后单独地或与抗病毒剂组合用于被感染受试者。在此方案中，本发明可加速CD4 T淋巴细胞的恢复及其功能的恢复。因此，在一个具体的实施方案中，本发明包含同时、分开或依序向具有病毒感染的受试者施用(i)抗病毒剂及(ii)如上文所定义的抗体、核酸、载体、宿主细胞或组合物。此方案尤其适合于治疗经HIV感染的受试者，其中本发明抗体与抗逆转录病毒疗法(例如，HAART)组合使用，从而允许减少严重有害作用已知的HAART治疗或甚至至少暂时中断HAART治疗。
本发明亦提供通过增加受试者的免疫反应来治疗癌症的方法，其包含向该受试者施用如上文所定义的抗体、核酸、载体、宿主细胞或组合物。本发明亦提供通过向受试者施用如上文所定义的抗体、核酸、载体、宿主细胞或组合物来治疗该受试者的与癌症相关的CD4 T细胞相关免疫缺陷的方法。
本发明抗体(及任何其他治疗剂)可通过任何合适手段施用，包括胃肠外、肺内及鼻内施用，且视需要针对局部治疗，包括病灶内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。部分视施用的短期或长期性而定，可通过任何合适途径(例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射)给药。本文中涵盖各种给药时程，包括(但不限于)单次施用或经各个时间点多次施用、推注施用及脉冲式输注。
以下实例出于说明的目的给出而非作为限制。
实施例
1-抗sPLA2-GIB抗体14G9的产生及表征
1.1-#14G9单抗的产生
简言之，用重组人类sPLA2-GIB使小鼠免疫，且针对其抑制能力及分别对sPLA2-GIB与前-sPLA2-IB的亲和力筛选所产生单抗。
1.2-#14G9单抗的表征
1.2.1-通过竞争性ELISA得到的亲和力
通过基于板的竞争免疫测定法测量抗体与前-sPLA2-IB及sPLA2-IB的结合亲和力。对于竞争ELISA，简言之，将不同水平下的恒定量的抗体与在0至10μg/ml范围内的抗原蛋白，人类sPLA2-IB或前-sPLA2-IB的连续稀释液预混合，且在室温下温育两小时以在抗体与抗原之间达成伪结合平衡。随后将这些溶液转移至96孔sPLA2-IB或前-sPLA2-IB预包被板以允许混合物中的游离抗体与板所包被的sPLA2-IB或前-sPLA2-IB结合。通常将板在4℃下用30至100ng人类sPLA2-IB或前-sPLA2-IB蛋白的PBS溶液包被过夜，随后进行BSA非特异性封闭。在溶液中洗除过量抗体后，用HRP缀合的山羊抗小鼠IgG或IgA多克隆抗体试剂检测板结合抗体且使用比色底物显影。使用PrismTM软件(Graph Pad)利用4-参数拟合分析来分析信号对溶液中抗原的浓度的依赖性且报告为IC50。
1.2.2-通过SPR进行亲和力测定
通过基于实时生物感测器表面等离子体共振测定法(BIAcoreTM)的表面动力学测定前-sPLA2-IB及sPLA2-IB与#14G9抗体结合的亲和力常数(KD)。更具体地，使用
Figure BDA0002662449460000191
2000来测量抗体对人类前-sPLA2-IB及sPLA2-IB的亲和力。在抗小鼠IgG表面上捕捉抗体且将其暴露于各种浓度的重组前-sPLA2-IB及sPLA2-IB蛋白。使用BIAevaluationTM软件进行动力学分析以获得缔合及解离速率常数。
1.2.3-通过间接ELISA进行特异性测定
通常在4℃下用含100ng重组人类sPLA2-X、sPLA2-IBGIB或前-sPLA2-IB的PBS pH7.5包被微板孔过夜。用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤样品孔三次。在最终洗涤之后，在室温下用含有含1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液的封闭溶液处理样品孔60min。用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤后，将增加量(10ng/mL直至3μg/mL)的#14G9单抗添加至经抗原包被的孔且在室温下温育细胞120min。在用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤之后，用HRP缀合的山羊抗小鼠IgG或IgA多克隆抗体试剂检测#14G9单抗的结合且使用比色底物显影。使用PrismTM软件(Graph Pad)利用4-参数拟合分析来分析信号对溶液中抗原的浓度的依赖性且报告为EC50。
1.2.4-sPLA2-IB酶促活性的抑制
根据公开规程(Rouault等人2007)测试#14G9单抗对sPLA2-IB酶促活性的抑制。简言之，将重组人类sPLA2-IB(0.1nM)与增加量(0.1、0.3、1及3μg)的靶向人类sPLA2-IB的纯化的家兔多克隆免疫血清或纯化的#14G9抗体一起在37℃下温育30min。随后使用[3H]-油酸酯-放射性标记的经高压处理的大肠杆菌膜作为sPLA2活性缓冲液中的磷脂底物来测量sPLA2酶促活性。通过添加300μL停止缓冲液来停止反应，随后以10000g离心混合物5min，且对含有释放的[3H]-油酸酯的上清液进行计数。
使用市售荧光测定酶促活性测定法确认结果。将重组人类sPLA2-IB(3nM)与增加量的纯化的#14G9单抗一起在室温下温育120min，随后使用选择性荧光测定法(
Figure BDA0002662449460000201
sPLA2 Activity，Aterovax Paris，France)来测量sPLA2酶促活性。结果以单位每mL样品(U/mL)表述，其中一个单位定义为在一分钟内催化1nmol产物的释放的sPLA2酶的量。测定法的检测极限为17U/mL，其中上限线性分析范围为232U/mL，且功能灵敏度(20％)为21U/mL。平均运行内变化率及平均测定法内变化率分别为5.9％及8.9％。两种方法的结果使用PrismTM软件(Graph Pad)利用4-参数拟合分析来分析且报告为IC50。
1.3-#14G9单抗对CD4 T细胞中IL-7诱导的磷酸STAT5的核移位的体外作用
1.3.1 -IL-7诱导的磷酸STAT5的核移位
使用RosetteSep分离试剂盒(Stemcell Technologies，#15062)纯化人类CD4。将CD4 T细胞以106个细胞/ml重悬于补充有5％胎牛血清(FBS)、50mm HEPES pH 7.4、谷氨酰胺、青霉素、链霉素及fungizone的RPMI 1640培养基(Lonza,Verviers,Belgium)(完全培养基)中并在37℃下于5％CO2湿润环境中平衡至少2h。
使用共焦显微术追踪pSTAT5核移位。平衡之后，将固定化细胞涂铺于经聚赖氨酸包被的玻璃载片上，之后用2nM IL-7活化15min。在37℃下将细胞固定于4％PFA中15min，随后在RT下固定15min，且在-20℃下渗透于90％甲醇/水溶液中。随后通过用经驴抗家兔AlexaFluor 555(Life Technologies，#A31572)标记的家兔抗pSTAT5(CST，#9359)染色来显露pSTAT5。对于人类CD4 T淋巴细胞，用经山羊抗小鼠AlexaFluor 488(LifeTechnologies，#A11029)标记的小鼠抗人类CD4(eBioscience，#14-0042-82)来染色细胞。对于小鼠CD4T淋巴细胞，用经鸡抗大鼠AlexaFluor 488(Life Technologies，#A21470)标记的大鼠抗小鼠CD4(eBioscience，#14-0042-85)来染色细胞。使用水浸没式复消色差40×/1.2NA物镜(Zeiss)或油浸没式平场复消色差63x/1.4NA物镜(Zeiss)于倒置激光扫描共焦显微镜(LSM700，Zeiss)上捕捉超出衍射限制的图像。捕捉图像且用ZEN软件(Zeiss)分析。
1.3.2-#14G9单抗对于HIV-1阳性血浆对人类CD4 T细胞中IL-7诱导的磷酸STAT5 核移位的抑制的体外作用
对于剂量-反应实验，首先将增加量的#14G9单抗或同种型单抗与重组sPLA2-IB或来自一个HIV-1阳性患者的人类血浆(于PBS中的3％稀释液v/v)一起在室温下温育25min，之后在37℃下温育5min。随后将经平衡混合物添加至自一个健康供体分离的CD4 T细胞，且通过如上文所描述的共焦显微术分析磷酸STAT5的核移位。对于单一剂量实验，首先将10μg(最终浓度)的#14G9单抗、非抑制#6F7单抗或同种型对照单抗与来自五个不同HIV-1阳性患者的人类血浆(于PBS中的3％稀释液v/v)一起在室温下温育25min，之后在37℃下温育5min。随后将经平衡混合物添加至自一个健康供体分离的CD4 T细胞，且通过如上文所描述的共焦显微术分析磷酸STAT5的核移位。
1.4-#14G9单抗对于sPLA2-GIB对CD4 T细胞中IL-7诱导的磷酸STAT5核移位的抑制的体内中和作用
将30个C57BL/6J SOPF雌性小鼠(Charles River Laboratories)保持于具有任意提供的无菌食物及水的SOPF条件下且在12小时的昼/夜循环下的单独换气笼中，且使其在新环境中稳定5天，之后开始实验。所有实验性规程已受到当地动物道德委员会(AnimalEthical Committee；CETEA89，Institut Pasteur de Paris)批准。将30个动物划分成6个实验组(每组1个笼子)，通过腹膜内注射接受测试产品的不同组合。第1组在T0接受1mg(300μL)的同种型对照单抗，随后在T+2h接受100μg(100μL)的sPLA2-IB；第2组在T0接受1mg(300μL)的#14G9单抗，随后在T+2h接受100μg(100μL)的sPLA2-IB；第3组在T+2h接受100μg(100μL)的sPLA2-GIB；第4组在T+2h接受PBS注射(100μL)；第5组在T0接受PBS注射(100μL)；且第6组在T0接受100μg(100μL)的sPLA2-GIB。在研究开始之后的不同时间点通过颈椎脱位术使小鼠安乐死。第1至4组在T+5h安乐死，且第5及6组在T+48h安乐死。紧接在安乐死之后，自动物收集脾脏且在室温下保持于含有5mL RPMI 5％的15mL试管中直至进一步处理为止。用gentleMACS解离器(程序m_spleen_01)制备小鼠脾细胞，随后使用EasySep分离试剂盒(Stemcell Technologies，#19851)通过负向选择分离小鼠CD4。通过如上文所描述的共焦显微术分析磷酸STAT5的核移位。使用曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)比较各组的中值。
1.5-#14G9单抗的序列
#14G9单抗的可变区根据经典规程测序。简言之，自杂交瘤细胞提取高纯度RNA且使用高保真度逆转录酶合成互补DNA链。使用高保真度PCR产生的PCR产物及特异性靶向编码抗体重链及轻链的cDNA的简并引物经直接测序(双链测序)。分析且组装cDNA序列。根据抗体结构来翻译及验证肽序列。
2-#14G9抗体的人源化
2.1-#14G9人源化变体的人源化策略及产生
通过将如通过Kabat命名法所定义的三个CDR自轻链可变区(VL)植入至尽可能与小鼠抗体VL同源的人类种系VL中来人源化#14G9小鼠抗体。类似地，将来自重链可变区(VH)的三个CDR植入至尽可能小鼠抗体VH同源的人类种系VH中。另外，所选人类种系可变区的框架区中的一些氨基酸残基变成小鼠可变区中存在的氨基酸残基(所谓的回复突变)。
2.2-通过人源化抗体抑制sPLA2-GIB酶促活性
根据公开规程(Rouault等人2007)测试人源化抗体#1A、#1B、#2A及#2B对sPLA2-GIB酶促活性的抑制。简言之，重组人类sPLA2-GIB(0.05nM)与增加量(0.1、0.3、1及3μg)的纯化的抗体一起在37℃下温育30min。随后使用[3H]-油酸酯-放射性标记的经高压处理的大肠杆菌膜作为sPLA2活性缓冲液中的磷脂底物来测量sPLA2酶促活性。通过添加300μL停止缓冲液来停止反应，随后以10000g离心混合物5min，且对含有释放的[3H]-油酸酯的上清液进行计数。
2.3-通过竞争性ELISA进行人源化抗体的亲和力测定
通过基于板的竞争免疫测定法测量人源化抗体与前-sPLA2-GIB及sPLA2-GIB的结合亲和力。对于竞争ELISA，简言之，将不同水平下的恒定量的抗体与在0至10μg/ml范围内的抗原蛋白、人类sPLA2-GIB或前-sPLA2-GIB的连续稀释液预混合，且在室温下温育两小时以在抗体与抗原之间达成伪结合平衡。随后将这些溶液转移至96孔sPLA2-GIB或前-sPLA2-GIB预包被板以允许混合物中的游离抗体与板所包被的sPLA2-GIB或前-sPLA2-GIB结合。通常将板在4℃下用30至100ng人类sPLA2-GIB或前-sPLA2-GIB蛋白的PBS溶液包被过夜，随后进行BSA非特异性封闭。在溶液中洗除过量抗体后，用HRP缀合的山羊抗小鼠IgG或IgA多克隆抗体试剂检测板结合抗体且使用比色底物显影。使用PrismTM软件(Graph Pad)利用4-参数拟合分析来分析信号对溶液中抗原的浓度的依赖性且报告为IC50。
2.4-人源化抗体的差示扫描量热法
于Microcal VP-Capillary DSC系统上通过差示扫描量热法(DSC)比较抗体#1A、#1B、#2A及#2B的PBS缓冲液的热稳定性。将所有样品装运于干冰中，且通过在-20℃下过夜温育、之后冰温育2小时来解冻。样品解冻后，将所有样品离心(20.000×g，5min，4℃)，且在DSC分析之前，在Nanodrop ND-1000分光光度计上利用IgG分析程序将其蛋白质含量定量。预平衡时间为3min，且用60℃/小时的扫描比率、25秒的滤波时段及中等反馈在20与110℃之间捕捉所追踪热分析图。在样品分析之前，测量5次缓冲液/缓冲液扫描以稳定仪器，且在每一蛋白质/缓冲液扫描之间进行一次缓冲液/缓冲液扫描。
2.5-人源化抗体的分析性尺寸排阻层析(SEC-HPLC)
在Shimadzu Prominence HPLC上于Superdex 200increase 5/150GL柱(GEHealthcare)上进行分析性尺寸排阻层析(SEC-HPLC)。事先将柱以0.25mL/min于PBS中平衡，柱烘箱设定成30℃。将所有样品离心(20000g，5min，4℃)，且在SEC分析之前在NanodropND-1000分光光度计上利用IgG分析程序将其蛋白质含量定量。等度程序经设定成在18min期间以0.25mL/min喷射每一样品约15μg。SEC分析之后，自原始数据提取280nm层析图且通过波峰积分来进行分析。来自GE Lifesciences分子量SEC校准试剂盒之一系列蛋白质用以在样品分析期间所使用的相同条件及缓冲液下校准柱。所用蛋白质为：抑肽酶(6.500Da)、核糖核酸酶A(13.700Da)、碳酸酐酶(29.000Da)、卵白蛋白(44.000Da)、伴白蛋白(75.000Da)及醛缩酶(158.000)。蓝色葡聚糖用以判定柱的空隙体积。根据Gel Filtration校准试剂盒说明书(GE Lifesciences)完成柱校准。
3-#2B1及#2B2的表征
3.1-#2B、#2B1及#2B2抗体的SPR亲和力测定
通过基于实时生物感测器表面等离子体共振测定法(BIAcoreTM)的表面动力学测定前-sPLA2-GIB及sPLA2-GIB与#2B、#2B1及#2B2抗体结合的亲和力常数(KD)。更具体地，使用
Figure BDA0002662449460000231
2000来测量抗体对人类前-sPLA2-IB及sPLA2-IB的亲和力。在抗小鼠IgG表面上捕捉抗体且将其暴露于各种浓度的重组前-sPLA2-IB及sPLA2-IB蛋白。使用BIAevaluationTM软件进行动力学分析以获得缔合及解离速率常数。
3.2-#2B1及#2B2人源化抗体的差示扫描量热法
通过如上文所描述的差示扫描量热法(DSC)比较#2B1及#2B2抗体于PBS缓冲液中的热稳定性。
3.3-#2B1及#2B2人源化抗体的分析性尺寸排阻层析(SEC-HPLC)
如上文所描述进行#2B1及#2B2的分析性尺寸排阻层析(SEC-HPLC)分析。
3.4-#2B1及#2B2人源化抗体的毛细管等电聚焦分析
以最终蛋白质浓度0.2mg/mL在尿素存在下使用Pharmalyte pH3-10(适用于大部分单抗的宽范围)通过成像毛细管等电聚焦(icIEF)分析测定#2B、#2B1及#2B2的电荷变体的等电点及相对分布。将括入样品的预期pI的两个pI标记用于校准。读出的数据以吸收度(280nm下)测量且以电泳图表述。使用Compass及Empower 3软件计算pI值，且在Empower 3中进行波峰积分。
3.5-#2B、#2B1及#2B2人源化抗体与人类FcγR的结合
通过将#2B、#2B1及#2B2抗体(100ng/mL)与稳定表达人类FcγR的1×105个CHO细胞一起在冰上温育30min来测试单体IgG结合。随后洗涤细胞、剥离、固定且通过流式细胞术分析(FACSCalibur；BD Biosciences)。使用0.5mg/mL的PE缀合山羊抗人类IgG F(ab’)2片段(Jackson Laboratories；Cat#109-096-006)检测结合的单抗。
通过在37℃下将10μg/ml人源化抗体与5μg/ml sPLA2-GIB共温育30min来产生抗体-抗原免疫复合体。随后将免疫复合体与稳定表达人类FcγR的1×105个CHO细胞在冰上一起温育30min。随后洗涤细胞、剥离、固定且通过流式细胞术分析(FACSCalibur；BDBiosciences)。使用0.5mg/mL的PE缀合山羊抗人类IgG F(ab’)2片段(JacksonLaboratories；Cat#109-096-006)检测结合的单抗。
通过首先将#2B、#2B1及#2B2抗体(10μg/mL)与稳定表达人类FcγR的1×105个CHO细胞在冰上一期温育30min来测试抗原于抗体致敏细胞上的剩余结合。洗涤后，在冰经30min添加sPLA2-IB生物素标记的抗原(5μg/mL)。随后洗涤细胞、剥离、固定且通过流式细胞术分析。使用抗生物素蛋白-FITC缀合物检测结合的生物素化的抗原。使用流式细胞术分析软件(FlowJo)分析所有数据。
4-#2B2人源化抗体的生物特性
4.1-#2B单抗对CD4 T细胞中IL-7诱导的磷酸STAT5的核移位的体外作用
首先将增加量的#14G9或#2B抗体在室温下温育25min，之后在37℃下与75nM重组sPLA2-GIB或来自一个HIV-1阳性患者的人类血浆(于PBS中的3％稀释液v/v)一起温育5min。随后将经平衡混合物添加至自一个健康供体分离的CD4 T细胞，且通过如上文所描述的共焦显微术分析磷酸STAT5的核移位。使用PrismTM软件(Graph Pad)利用4-参数拟合分析来分析剂量依赖性曲线且报告为EC50。
1.4-#2B2对于sPLA2-IB对CD4 T细胞上IL-7诱导的磷酸STAT5核移位的抑制的体内中和作用
将18个7周龄的C57BL/6J SOPF雄性小鼠(Charles River Laboratories)保持于具有任意提供的无菌食物及水的SOPF条件下且在12小时的昼/夜循环下的单独换气笼中，且使其在新环境中稳定5天，之后开始实验。所有实验性规程已受到当地动物道德委员会(CETEA 89，Institut Pasteur de Paris)批准。将18个动物划分为5个实验组(每组1个笼子)，通过腹膜注射接受测试产品的不同组合。第1组在T0接受PBS注射(350μL)，随后在T+2h接受PBS注射(100μL)；第2组在T0接受PBS注射(350μL)，随后在T+2h接受100μg(100μL)的sPLA2-GIB；第3组在T0接受2mg(350μL)的同种型对照单抗，随后在T+2h接受100μg(100μL)的sPLA2-GIB；第4组在T0接受1mg(350μL)的#2B2人源化单抗，随后在T+2h接受100μg(100μL)的sPLA2-IB；第5组在T0接受2mg(350μL)的#2B2人源化单抗，随后在T+2h接受100μg(100μL)的sPLA2-IB。在研究开始之后的T+5h通过颈椎脱位术使小鼠安乐死。紧接在安乐死之后，自动物收集脾脏并立即进行处理。用gentleMACS解离器制备小鼠脾细胞，随后使用EasySep分离试剂盒(Stemcell Technologies，#19851)通过负向选择分离小鼠CD4。通过如上文所描述的共焦显微术分析磷酸STAT5的核移位。使用曼-惠特尼检验比较各组的中值。
结果
5-抗sPLA2-IB 14G9抗体的产生及表征
5.1-#14G9单抗的产生及表征
简言之，用重组人类sPLA2-IB使小鼠免疫，且针对其抑制能力及分别对sPLA2-IB与前-sPLA2-IB的亲和力筛选所产生单抗。显示#14G9单抗以2.3nM的估计EC50抑制sPLA2-IB酶促活性(图1A)，对于sPLA2-GIB与前-sPLA2-GIB(图1B及图1C)具有高度特异性。在竞争ELISA中，前-sPLA2-GIB及sPLA2-GIB的IC50分别经估计为108.6nM及1.0nM。前-sPLA2-GIB及sPLA2-GIB与#14G9结合的亲和力常数(KD)通过基于实时生物感测器表面等离子体共振测定法(BIAcoreTM)的表面动力学测定。在这些实验中，对于前-sPLA2-IB及sPLA2-IB的Kd分别估算为174nM及0.34nM。
5.2-#14G9单抗对于来自HIV-1感染患者的血浆对CD4 T细胞中IL-7诱导的磷酸STAT5核移位的抑制的体外作用
近期，sPLA2-IB酶经鉴定在病毒血症HIV感染患者中的CD4 T淋巴细胞的无应答性背后的机制中起到关键作用。具体地，经证实，sPLA2-IB为造成CD4 T淋巴细胞的慢性活化的蛋白质，其驱使CD4 T淋巴细胞进入异常活化分化状态，使得CD4 T淋巴细胞对某些生理学信号(诸如通过介白素-7传送的信号)不起反应(THEZE Jacques等人2015)。
通过将自HIV-1病毒血症患者分离的血浆与#14G9单抗一起温育来测试#14G9单抗抗衡自HIV-1感染患者分离的血浆对CD4 T细胞中IL-7诱导的磷酸STAT5核移位的抑制作用的能力。
如图2中所描绘，增加量的#14G9单抗引起来自病毒血症患者的血浆抑制自一个健康供体分离的人类CD4 T细胞中由IL-7诱导的磷酸STAT5的核移位的能力的剂量依赖性恢复。对于同种型对照单抗，未观察到此剂量-反应恢复作用。这些结果在使用单次剂量(10μg)的#14G9单抗或10μg的非抑制性#6F7单抗或同种型对照单抗对自5个不同健康供体分离的CD4 T细胞进行的5个相继实验中再现(图3)。
5.3-#14G9单抗对于sPLA2-IB对磷酸STAT5核移位的抑制的体内作用
通过首先在小鼠中注射1mg的#14G9单抗，之后注射100μg的sPLA2-IB来测试#14G9单抗体内抗衡注射sPLA2-IB对CD4 T细胞中IL-7诱导的磷酸STAT5核移位的抑制作用的能力。随后通过共焦显微术分析自经处理小鼠的脾细胞分离的CD4 T细胞中的磷酸STAT5的核移位。
如图4中所描绘，在小鼠中注射1mg的sPLA2-IB引起对自脾细胞分离的CD4 T细胞中磷酸STAT5的核移位的60％抑制。此作用通过事先注射1mg的#14G9单抗而完全消除，其中在对照注射中未观察到显著作用。
5.4-#14G9单抗可变区的序列
#14G9单抗的轻链及重链的可变区经测序且如下经呈现。
>14G9-VL(SEQ ID NO:8)
Figure BDA0002662449460000271
>14G9-VL(SEQ ID NO:2)
Figure BDA0002662449460000272
>14G9-VH(SEQ ID NO:9)
Figure BDA0002662449460000273
>14G9-VH(SEQ ID NO:3)
Figure BDA0002662449460000274
在大部分抗体中，保守性VH/VL界面主要由重链框架残基中Kabat位置H37、H45、H47、H89、H91、H100B及H103与轻链框架残基中Kabat位置L36、L44、L46、L87、L96及L98之间的疏水相互作用以及H39与L38之间的氢键键合构成。
#14G9单克隆抗体的突出且特有的特征为Arg在Kabat位置H39处及Glu在Kabat位置L38处的不同寻常的存在，而非普通及高度保守性的Gln存在于该两个位置。在14G9中，Gln H39与Gln L38之间的氢键键合相互作用经Arg H39与Glu L38之间的静电引力置换。
6-#14G9小鼠单克隆抗体的人源化
6.1-人源化抗体的人源化策略及产生
通过将如通过Kabat命名法所定义的三个CDR自轻链可变区(VL)植入至尽可能与小鼠抗体VL同源的人类种系VL中来人源化#14G9小鼠抗体。类似地，将来自重链可变区(VH)的三个CDR植入至尽可能与小鼠抗体VH同源的人类种系VH中。另外，所选人类种系可变区的框架区中的一些氨基酸残基变成小鼠可变区中存在的氨基酸残基(所谓的回复突变)。基于关于免疫球蛋白可变区的结构的信息，框架区中的这些少数残基经鉴定在将CDR维持于正确构象或VH/VL组装中并因此保留于人源化形式A及B中起到关键作用。针对#14G9 VH的CDR植入形式的设计，选择两个人类种系IGHV1-46*01及IGHV5-10-1*01。选择人类种系IGHV1-46*01，是因为其展现跨整个V基因与小鼠14G9 VH之间的最佳总体一致性66.3％。选择人类种系IGHV5-10-1*01，是因为尽管其与14G9 VH具有较低总体一致性(58.2％)，但其具有不同于IGHV1-46*01的跨整个14G9 VH的同源性模式。针对14G9 VL的CDR植入形式的设计，选择两个不同人类κ种系IGKV1-39*01及IGKV3-15*01。选择IGKV1-39*01，是因为其具有跨整体V基因与小鼠14G9 VL的最高同源性，一致性为67.4％。尽管一致性百分比较低(62.1％)，但选择IGKV3-15*01，是因为其具有不同于IGKV1-39*01的与#14G9 VL在CDR内的一致性模式。
人源化形式的设计考虑到Arg H39及Glu L38在VH/VL界面处的不寻常的存在。在CDR植入VH及VL序列的形式A中，在H39(Arg)及L38(Glu)处的亲本小鼠残基分别为保守性的。在形式B中，Kabat位置H39及L38处的亲本残基经Gln(人类种系对应残基)取代以便重新产生高度保守的氢键键合相互作用。因此，针对用于CDR植入#14G9的设计的每一人类种系(2个用于VH且2个用于VL)，构建2个形式(A及B)。形式A具有Arg H39(VH)或Glu L38(VL)，而形式B在两个位置处具有Gln。VH的人源化形式A仅与VL的人源化形式A配对，且对于人源化形式B，原理相同。表1中呈现小鼠#14G9杂交瘤与CDR植入形式之间的跨整体V基因的序列一致性百分比(亦即，人源化百分比)的增加。表2呈现人源化形式与对应免疫球蛋白可变人类种系之间的跨V基因的序列差异的细节。
6.2-通过人源化抗体抑制sPLA2-IB酶促活性
通过在存在增加量的纯化的单克隆抗体的情况下将经放射性标记膜与重组人类sPLA2-IB一起温育来测试不同人源化抗体抑制sPLA2-IB酶促活性的能力。结果表述为在所测试单抗的最高浓度下观察到的酶促活性抑制百分比且呈现于表3中。如所呈现，#2B为具有抑制sPLA2-GIB的最高效力的单抗。
6.3-通过竞争性ELISA进行人源化抗体的亲和力测定
通过基于板的竞争免疫测定法测量人源化抗体分别与人类前-sPLA2-GIB及人类sPLA2-GIB的结合亲和力。简言之，将不同水平下的恒定量的抗体与抗原蛋白的连续稀释液预混合以在抗体与抗原之间达成伪结合平衡。随后将这些溶液转移至抗原预包被板以允许混合物中的游离抗体与板所包被的sPLA2-GIB或前-sPLA2-GIB结合。用HRP缀合的多克隆抗体检测板结合抗体。图5中呈现不同变体所获得的滴定曲线的实例。数据与4PL逻辑斯蒂非线性回归模型拟合，且相对IC50值根据该模型估计(表4)。
6.4-人源化抗体的差示扫描量热法
图6中呈现不同所测试抗体的标准化热变性，且表5中呈现DSC参数。Tm为变性/熔解温度。Tonset为解折叠转变开始的温度。T1/2为在波峰的半高处的转变的宽度。ΔH为量热解折叠焓且反映蛋白质的分子内相互作用的破坏。总面积为整体解折叠焓(热分析图下的总面积)且反映热力学稳定性。通过DSC，根据所有热分析图的叠加(图6)，#1B为具有较佳特性之一者。第一转变(约70至72℃)应对应于CH2域。最后转变(约82至83℃)应对应于CH3，且最高波峰对应于Fab转变。在#2A中，Fab转变在CH2顶部，所有其他变体在CH3转变的顶部上具有Fab转变，且至少在#2B上，Fab转变的右端上的肩峰应对应于CH3转变。
6.5-人源化抗体的分析性尺寸排阻层析(SEC-HPLC)
在PBS缓冲液中通过SEC-HPLC分析人源化#1A、#1B、#2A及#2B抗体。图7中呈现#2B的代表性层析图，且结果汇总于表6中。如所呈现，所有变体显示接近160kDa的表观分子量，指示单体构象且在所测试条件下不存在聚集。
6.6-#2B序列
基于上文所描述的抑制性、结合及生理特性，选择#2B抗体以供进一步优化。变体#2B的重链显示与IGHV1-46*01人类种系的81.60％一致性(80/98)。#2B的轻链显示与IGKV3-15*01种系的86.3％一致性(82/95)。#2B的总体一致性％为与参考人类种系83.94％一致。
#2B的重链及轻链的序列呈现如下：
重链
>3352.VH 2B(SEQ ID NO:11)
Figure BDA0002662449460000301
轻链
>3352.VL2.B(SEQ ID NO:10)
Figure BDA0002662449460000302
＞重链(SEQ ID NO:5)
Figure BDA0002662449460000311
＞轻链(SEQ ID NO:4)
Figure BDA0002662449460000312
7-#2B1及#2B2人源化变体的表征
7.1-消除CDC及ADCC的点突变的策略
通过引入已知消除单抗的重链恒定区中的ADCC及CDC功能两者的特异性点突变来进一步优化人源化#2B抗体。
所得抗体#2B1(双重突变L234A及L235E)及#2B2(三重突变L234A、L235E及P331S)的序列呈现如下：
2B1(突变L234A及L235E)
重链
SEQ ID NO:12
Figure BDA0002662449460000321
轻链
与2B相同(参见SEQ ID NO:10)
＞重链(SEQ ID NO:6)
Figure BDA0002662449460000322
＞轻链
与2B相同(参见SEQ ID NO:4)
2B2(突变L234A、L235E及P331S)
重链
SEQ ID NO:13
Figure BDA0002662449460000331
轻链
与2B相同(参见SEQ ID NO:10)
＞重链(SEQ ID NO:7)
Figure BDA0002662449460000341
＞轻链
与2B相同(参见SEQ ID NO:4)
7.2-#2B1及#2B2人源化抗体的SPR亲和力测定
通过基于实时生物感测器表面等离子体共振测定法(BIAcoreTM)的表面动力学测定前-sPLA2-GIB及sPLA2-GIB与#2B1及#2B2结合的亲和力常数(KD)。在抗小鼠IgG表面上捕捉抗体且将其暴露于各种浓度的重组前-sPLA2-IB及sPLA2-IB蛋白。使用BIAevaluationTM软件进行动力学分析以获得缔合及解离速率常数(表7)。如表7中所呈现，在#2B1或#2B2中引入双重或三重突变并不显著影响变体对sPLA2-IB目标的亲和力。
7.3-#2B1及#2B2人源化抗体的差示扫描量热法
图8中呈现#2B1及#2B2的标准化热变性，且表8中呈现DSC参数。#2B1在这些实验中显示较佳概况，因为Tonset及Tm1(对应于CH2)较高。
7.4-#2B1及#2B2人源化抗体的分析性尺寸排阻层析(SEC-HPLC)
在PBS缓冲液中通过SEC-HPLC分析#2B1及#2B2。结果汇总于表9中。如所呈现，小于5％的单抗以高分子量聚集物存在，指示单体构象且在所测试条件下不存在聚集。
7.5-#2B1及#2B2人源化抗体的毛细管等电聚焦分析
通过成像毛细管等电聚焦(icIEF)分析测定#2B、#2B1及#2B2的电荷变体的等电点及相对分布。结果汇总于表10中。对于所有抗体，以低RSD值％获得重复结果。对于#2B，主峰的pI为8.96，对于#2B1为8.76，且对于#2B2为8.75。除主峰的pI略微不同以外，#2B亦显示与其他两个样品相反的略微不同的电荷变体概况。虽然#2B1及#2B2与酸性电荷相比更具碱性，但#2B相反(表10)。#2B中的主峰包含所有波峰的64％，而在#2B1及#2B2中，主峰仅包含57％。在所有所测试样品中，未检测到前酸性波峰及后碱性波峰。
7.6-#2B、#2B1及#2B2与人类FcγR的结合
通过将单抗与稳定表达人类FcγRI、FcγRIIA(H131)、FcγRIIA(R131)、FcγRIIB、FcγRIIIA(F176)、FcγRIIIA(V176)、FcγRIIIB(NA1)、FcγRIIIB(NA2)及FcγRIIIB(SH)的CHO细胞一起温育来通过流式细胞术测试单体#2B、#2B1及#2B2与人类FcγR的结合(REF P.Bruhns)。如图9中所呈现，#2B仅与hFcγRI及hFcγRIIIA(V176)结合，而未观察到#2B1及#2B2与所有所测试hFcγR的单体结合。通过首先将单抗与抗原一起温育，且随后将形成的免疫复合体与稳定表达人类FcγR的CHO细胞一起温育来测试抗体-抗原免疫复合体。#2B的免疫复合体与除hFcγRIIB外的所有所测试hFcγR结合(图10)。观察到#2B1的免疫复合体与hFcγRIIIA(V176)的较弱结合(数据未展示)，而未观察到#2B2与任何所测试hFcγR的免疫复合体结合(数据未展示)。通过首先将#2B、#2B1及#2B2与稳定表达人类FcγR的CHO细胞一起温育来测试抗原在抗体致敏细胞上的剩余结合。洗涤后，添加sPLA2-GIB生物素标记抗原且使用抗生物素蛋白-FITC缀合物通过流式细胞术进行检测。如图11中所描绘，当与hFcγRI及hFcγRIIIA(V176)结合时观察到sPLA2-GIB抗原与单抗#2B的剩余结合。相反，未观察到sPLA2-GIB抗原与单抗#2B1及#2B2的剩余结合。
7.7-#2B2 Fab与sPLA2-GIB的共结晶及表位的定义
使#2B2的Fab片段与其抗原sPLA2-GIB共结晶，并且在Soleil同步加速器上的PROXIMA-1射束线收集共晶体的X射线衍射数据(St.Aubin，France)。晶体属于每不对称单元具有两个sPLA2-GIB/Fab复合体的P21空间群(
Figure BDA0002662449460000351
Figure BDA0002662449460000352
α＝β＝99.58°)(图12A)。sPLA2-GIB/Fab复合体的结构的解析实现与参与复合体中的非共价相互作用的关键残基的鉴定及#2B2表位的定义。如图12B中所呈现，sPLA2-IB中的W3、R6及K7参与与Fab轻链的相互作用，且sPLA2-GIB中的K10、C77、Y75、G79及S80参与与Fab重链的相互作用。
8-#2B2人源化抗体的生物特性
8.1-#2B人源化抗体对于sPLA2-GIB或来自HIV感染患者的血浆对磷酸STAT5核移位的抑制的体外作用。
通过将自HIV-1感染患者分离的血浆与#14G9或#2B单抗一起温育来测试#14G9或#2B抗衡75nM sPLA2-GIB或自HIV-1感染患者分离的血浆对CD4T细胞中IL-7诱导的磷酸STAT5核移位的抑制作用的能力。
如图13中所描绘，增加量的#14G9或#2B单抗引起sPLA2-IB(图13A)或来自病毒血症患者的血浆(图13B)抑制自一个健康供体分离的人类CD4 T细胞中由IL-7诱导的磷酸STAT5的核移位的能力的剂量依赖性恢复。sPLA2-IB作用的恢复的EC50针对#2B及#14G9单抗分别为3.7ng/mL及2.2ng/mL。HIV感染血浆作用的恢复的EC50针对#2B及#14G9单抗分别为3.3ng/mL及2.7ng/mL。
8.2-#2B2对于sPLA2-GIB对磷酸STAT5核移位的抑制的体内作用
通过首先在小鼠中注射1或2mg的#2B2单抗，之后注射100μg的sPLA2-IB来测试#2B2单抗体内抗衡注射sPLA2-IB对CD4 T细胞中IL-7诱导的磷酸STAT5核移位的抑制作用的能力。随后通过共焦显微术分析自经处理小鼠的脾细胞分离的CD4 T细胞中的磷酸STAT5的核移位。
如图14中所描绘，在小鼠中注射100μg的sPLA2-IB引起对自脾细胞分离的CD4 T细胞中磷酸STAT5的核移位的50％抑制。此作用通过事先注射1或2mg的#2B2单抗而完全消除，其中在对照注射中未观察到显著作用。
表1
Figure BDA0002662449460000371
表2
Figure BDA0002662449460000372
表3
Figure BDA0002662449460000381
表4
Figure BDA0002662449460000382
表5
Figure BDA0002662449460000383
表6
Figure BDA0002662449460000384
表7
Figure BDA0002662449460000391
表8
Figure BDA0002662449460000392
表9
Figure BDA0002662449460000393
表10
Figure BDA0002662449460000394
参考文献
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<210> 1
<211> 148
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Lys Leu Leu Val Leu Ala Val Leu Leu Thr Val Ala Ala Ala Asp
1 5 10 15
Ser Gly Ile Ser Pro Arg Ala Val Trp Gln Phe Arg Lys Met Ile Lys
20 25 30
Cys Val Ile Pro Gly Ser Asp Pro Phe Leu Glu Tyr Asn Asn Tyr Gly
35 40 45
Cys Tyr Cys Gly Leu Gly Gly Ser Gly Thr Pro Val Asp Glu Leu Asp
50 55 60
Lys Cys Cys Gln Thr His Asp Asn Cys Tyr Asp Gln Ala Lys Lys Leu
65 70 75 80
Asp Ser Cys Lys Phe Leu Leu Asp Asn Pro Tyr Thr His Thr Tyr Ser
85 90 95
Tyr Ser Cys Ser Gly Ser Ala Ile Thr Cys Ser Ser Lys Asn Lys Glu
100 105 110
Cys Glu Ala Phe Ile Cys Asn Cys Asp Arg Asn Ala Ala Ile Cys Phe
115 120 125
Ser Lys Ala Pro Tyr Asn Lys Ala His Lys Asn Leu Asp Thr Lys Lys
130 135 140
Tyr Cys Gln Ser
145
<210> 2
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 14G9 VL
<400> 2
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Leu Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asn Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile
115
<210> 3
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 14G9 VH
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Lys Arg Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Thr Arg Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Ala Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Phe Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Thr Leu Tyr Tyr Glu Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr
115 120 125
Pro Leu
130
<210> 4
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2B L
<400> 4
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 5
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2B H
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Thr Arg Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Thr Leu Tyr Tyr Glu Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 6
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2B1 H
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Thr Arg Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Thr Leu Tyr Tyr Glu Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 7
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2B2 H
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Thr Arg Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Thr Leu Tyr Tyr Glu Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 8
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 14G9 VL
<400> 8
gacattgtga tgacccagtc tcacaaactc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtag cctggtatca agaaaaacca 120
ggtcaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctaat 180
cgcttcacag gcagtagatc tgggacagat tatactctca ccatcagcag tgtgcaggct 240
gaagacctgg cactttatta ctgtcagcaa gattatagca ctcctcctac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat c 351
<210> 9
<211> 392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 14G9 VH
<400> 9
caggtccaac tgcaacagcc tggggctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc aactactgga tacactgggt gaagcggagg 120
cctggacaag gccttgaatg gattggtaat attgaccctt ctgatactag aactcactac 180
aatcaaaagt tcaaggacaa ggccacattg gctgtagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct tttactgtgc aagacagacc 300
ctctactatg aggccttgga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagcc 360
aaaacgacac ccccatctgt ctatccactg gg 392
<210> 10
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2B L
<400> 10
gcggccgcca tgaattttgg actgaggctg attttcctgg tgctgaccct gaaaggcgtc 60
cagtgtgaga tcgtgatgac gcagtcgccg gcgacgctga gcgtgagtcc gggggagcgg 120
gcgacgctga gctgcaaggc gtcgcaggac gtgagcacgg ccgtcgcgtg gtatcaacag 180
aagccggggc aagcgccgcg gctgctgatc tactgggcga gcacgcggca cacgggcatc 240
ccggcgcgat tctcggggag ccggagcggg acggagtaca cgctgacgat ctcgtcgctg 300
caaagcgagg acttcgccgt ctactactgc cagcaggact actcgacgcc gccgacgttc 360
ggggggggta ccaaggtcga gatcaaacgt acggtcgcgg cgccttctgt gttcattttc 420
cccccatctg atgaacagct gaaatctggc actgcttctg tggtctgtct gctgaacaac 480
ttctacccta gagaggccaa agtccagtgg aaagtggaca atgctctgca gagtgggaat 540
tcccaggaat ctgtcactga gcaggactct aaggatagca catactccct gtcctctact 600
ctgacactga gcaaggctga ttacgagaaa cacaaagtgt acgcctgtga agtcacacat 660
caggggctgt ctagtcctgt gaccaaatcc ttcaataggg gagagtgctg atagtaaaag 720
ctttga 726
<210> 11
<211> 1431
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2B H
<400> 11
gcggccgcca tgaattttgg actgaggctg attttcctgg tgctgaccct gaaaggcgtc 60
cagtgtcaag tccagctcgt ccagagcggg gcggaagtca agaagccggg ggcgagcgtg 120
aaagtctcgt gcaaggcgag cggatatacg ttcacgaact actggattca ctgggtccgg 180
caagcgccgg ggcaggggct ggagtggatc gggaacatcg acccgtcgga cacgcggacg 240
cactacaacc agaagttcaa ggaccgggcg acgctgaccg tcgacaagag cacgagcacg 300
gcgtacatgg agctgtcgag cctgcggagc gaggacacgg ccgtctacta ctgcgcgcgg 360
cagacgctgt actacgaggc gctggactac tgggggcagg ggacgctcgt cacggtctcg 420
agcgctagca caaagggccc tagtgtgttt cctctggctc cctcttccaa atccacttct 480
ggtggcactg ctgctctggg atgcctggtg aaggattact ttcctgaacc tgtgactgtc 540
tcatggaact ctggtgctct gacttctggt gtccacactt tccctgctgt gctgcagtct 600
agtggactgt actctctgtc atctgtggtc actgtgccct cttcatctct gggaacccag 660
acctacattt gtaatgtgaa ccacaaacca tccaacacta aagtggacaa aagagtggaa 720
cccaaatcct gtgacaaaac ccacacctgc ccaccttgtc ctgcccctga actgctggga 780
ggaccttctg tgtttctgtt cccccccaaa ccaaaggata ccctgatgat ctctagaacc 840
cctgaggtga catgtgtggt ggtggatgtg tctcatgagg accctgaggt caaattcaac 900
tggtacgtgg atggagtgga agtccacaat gccaaaacca agcctagaga ggaacagtac 960
aattcaacct acagagtggt cagtgtgctg actgtgctgc atcaggattg gctgaatggc 1020
aaggaataca agtgtaaagt ctcaaacaag gccctgcctg ctccaattga gaaaacaatc 1080
tcaaaggcca agggacagcc tagggaaccc caggtctaca ccctgccacc ttcaagagag 1140
gaaatgacca aaaaccaggt gtccctgaca tgcctggtca aaggcttcta cccttctgac 1200
attgctgtgg agtgggagtc aaatggacag cctgagaaca actacaaaac aaccccccct 1260
gtgctggatt ctgatggctc tttctttctg tactccaaac tgactgtgga caagtctaga 1320
tggcagcagg ggaatgtctt ttcttgctct gtcatgcatg aggctctgca taaccactac 1380
actcagaaat ccctgtctct gtctcccggg aaatgatagt aaaagctttg a 1431
<210> 12
<211> 1426
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2B1 H
<400> 12
gcggccgcca tgaattttgg actgaggctg attttcctgg tgctgaccct gaaaggcgtc 60
cagtgtcaag tccagctcgt ccagagcggg gcggaagtca agaagccggg ggcgagcgtg 120
aaagtctcgt gcaaggcgag cggatatacg ttcacgaact actggattca ctgggtccgg 180
caagcgccgg ggcaggggct ggagtggatc gggaacatcg acccgtcgga cacgcggacg 240
cactacaacc agaagttcaa ggaccgggcg acgctgaccg tcgacaagag cacgagcacg 300
gcgtacatgg agctgtcgag cctgcggagc gaggacacgg ccgtctacta ctgcgcgcgg 360
cagacgctgt actacgaggc gctggactac tgggggcagg ggacgctcgt cacggtctcg 420
agcgctagca caaagggccc tagtgtgttt cctctggctc cctcttccaa atccacttct 480
ggtggcactg ctgctctggg atgcctggtg aaggattact ttcctgaacc tgtgactgtc 540
tcatggaact ctggtgctct gacttctggt gtccacactt tccctgctgt gctgcagtct 600
agtggactgt actctctgtc atctgtggtc actgtgccct cttcatctct gggaacccag 660
acctacattt gtaatgtgaa ccacaaacca tccaacacta aagtggacaa aagagtggaa 720
cccaaatcct gtgacaaaac ccacacctgc ccaccttgtc cggcgcctga agcggaagga 780
ggaccttctg tgtttctgtt cccccccaaa ccaaaggata ccctgatgat ctcgcgaacc 840
cctgaggtga catgtgtggt ggtggatgtg tctcatgagg accccgaagt caaatttaat 900
tggtatgtcg acggcgtcga ggtgcataat gccaaaacca agcctagaga ggaacagtac 960
aattcaacct acagagtcgt cagtgtgctg actgtgctgc atcaggattg gctgaatggc 1020
aaggaataca agtgtaaagt ctcaaacaag gccctgcctg ctccaattga gaaaacaatc 1080
tcaaaggcca agggacagcc tagggaaccc caggtctaca ccctgccacc ttcaagagag 1140
gaaatgacca aaaaccaggt gtccctgaca tgcctggtca aaggcttcta cccttctgac 1200
attgctgtgg agtgggagtc aaatggacag cctgagaaca actacaaaac aaccccccct 1260
gtgctggatt ctgatggctc tttctttctg tactccaaac tgactgtgga caagtctaga 1320
tggcagcagg ggaatgtctt ttcttgctct gtcatgcatg aggctctgca taaccactac 1380
actcagaaat ccctgtctct gtctcccggg aaatgataag ctttga 1426
<210> 13
<211> 1503
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2B2 H
<400> 13
gcggccgcca tgaattttgg actgaggctg attttcctgg tgctgaccct gaaaggcgtc 60
cagtgtcaag tccagctcgt ccagagcggg gcggaagtca agaagccggg ggcgagcgtg 120
aaagtctcgt gcaaggcgag cggatatacg ttcacgaact actggattca ctgggtccgg 180
caagcgccgg ggcaggggct ggagtggatc gggaacatcg acccgtcgga cacgcggacg 240
cactacaacc agaagttcaa ggaccgggcg acgctgaccg tcgacaagag cacgagcacg 300
gcgtacatgg agctgtcgag cctgcggagc gaggacacgg ccgtctacta ctgcgcgcgg 360
cagacgctgt actacgaggc gctggactac tgggggcagg ggacgctcgt cacggtctcg 420
agcgctagca caaagggccc tagtgtgttt cctctggctc cctcttccaa atccacttct 480
ggtggcactg ctgctctggg atgcctggtg aaggattact ttcctgaacc tgtgactgtc 540
tcatggaact ctggtgctct gacttctggt gtccacactt tccctgctgt gctgcagtct 600
agtggactgt actctctgtc atctgtggtc actgtgccct cttcatctct gggaacccag 660
acctacattt gtaatgtgaa ccacaaacca tccaacacta aagtggacaa aagagtggaa 720
cccaaatcct gtgacaaaac ccacacctgc ccaccttgtc cggcgcctga agcggaagga 780
ggaccttctg tgtttctgtt cccccccaaa ccaaaggata ccctgatgat ctcgcgaacc 840
cctgaggtga catgtgtggt ggtggatgtg tctcatgagg accccgaagt caaatttaat 900
tggtatgtcg acggcgtcga ggtgcataat gccaaaacca agcctagaga ggaacagtac 960
aattcaacct acagagtcgt cagtgtgctg actgtgctgc atcaggattg gctgaatggc 1020
aaggaataca agtgtaaagt ctcaaacaag gccctgcctg cttcaattga gaaaacaatc 1080
tcaaaggcca agggacagcc tagggaaccc caggtctaca ccctgccacc ttcaagagag 1140
gaaatgacca aaaaccaggt gtccctgaca tgcctggtca aaggcttcta cccttctgac 1200
attgctgtgg agtgggagtc aaatggacag cctgagaaca actacaaaac aaccccccct 1260
gtgctggatt ctgatggctc tttctttctg tactccaaac tgactgtgga caagtctaga 1320
tggcagcagg ggaatgtctt ttcttgctct gtcatgcatg aggctctgca taaccactac 1380
actcagaaat ccctgtctct gtctcccggg aaatgataag ctttgatgtc atgcatgagg 1440
ctctgcataa ccactacact cagaaatccc tgtctctgtc tcccgggaaa tgataagctt 1500
tga 1503
<210> 14
<211> 126
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
Ala Val Trp Gln Phe Arg Lys Met Ile Lys Cys Val Ile Pro Gly Ser
1 5 10 15
Asp Pro Phe Leu Glu Tyr Asn Asn Tyr Gly Cys Tyr Cys Gly Leu Gly
20 25 30
Gly Ser Gly Thr Pro Val Asp Glu Leu Asp Lys Cys Cys Gln Thr His
35 40 45
Asp Asn Cys Tyr Asp Gln Ala Lys Lys Leu Asp Ser Cys Lys Phe Leu
50 55 60
Leu Asp Asn Pro Tyr Thr His Thr Tyr Ser Tyr Ser Cys Ser Gly Ser
65 70 75 80
Ala Ile Thr Cys Ser Ser Lys Asn Lys Glu Cys Glu Ala Phe Ile Cys
85 90 95
Asn Cys Asp Arg Asn Ala Ala Ile Cys Phe Ser Lys Ala Pro Tyr Asn
100 105 110
Lys Ala His Lys Asn Leu Asp Thr Lys Lys Tyr Cys Gln Ser
115 120 125

Claims (19)

1.结合人sPLA2-GIB的分离的人或人源化抗体，或其衍生物。
2.权利要求1的抗体或其衍生物，其是单克隆的。
3.权利要求1或2的抗体或衍生物，其结合表位，所述表位参考SEQ ID NO:14包含至少一个选自人sPLA2-GIB的W3、R6、K7、K10、C77、Y75、G79和S80的氨基酸残基。
4.权利要求1或2的抗体或衍生物，其竞争性抑制单克隆抗体14G9对人sPLA2-GIB的结合，所述单克隆抗体14G9含有包含SEQ ID NO:2的轻链可变区和包含SEQ ID NO:3的重链可变区。
5.权利要求1或2的抗体或衍生物，其竞争性抑制单克隆抗体#2B对人sPLA2-GIB的结合，所述单克隆抗体#2B含有包含SEQ ID NO:4或由SEQ ID NO:4组成的轻链和包含SEQ IDNO:5或由SEQ ID NO:5组成的重链。
6.权利要求1的抗体或衍生物，其竞争性抑制单克隆抗体#2B1对人sPLA2-GIB的结合，所述单克隆抗体#2B1含有包含SEQ ID NO:4或由SEQ ID NO:4组成的轻链和包含SEQ IDNO:6或由SEQ ID NO:6组成的重链。
7.权利要求1的抗体或衍生物，其竞争性抑制单克隆抗体#2B2对人sPLA2-GIB的结合，所述单克隆抗体#2B2含有包含SEQ ID NO:4或由SEQ ID NO:4组成的轻链和包含SEQ IDNO:7或由SEQ ID NO:7组成的重链。
8.前述权利要求中任一项的抗体或衍生物，其中和sPLA2-GIB。
9.权利要求1的分离的抗体，其含有包含SEQ ID NO:4或由SEQ ID NO:4组成的轻链和包含SEQ ID NO:5或由SEQ ID NO:5组成的重链。
10.权利要求1的分离的抗体，其含有包含SEQ ID NO:4或由SEQ ID NO:4组成的轻链和包含SEQ ID NO:6或由SEQ ID NO:6组成的重链。
11.权利要求1的分离的抗体，其含有包含SEQ ID NO:4或由SEQ ID NO:4组成的轻链和包含SEQ ID NO:7或由SEQ ID NO:7组成的重链。
12.权利要求1的分离的抗体，其包含以下CDR区：
.CDR-L1：氨基酸残基QDVSTA，
.CDR-L2：氨基酸残基WAS，
.CDR-L3：氨基酸残基QQDYSTPPT，
.CDR-H1：氨基酸残基GYTFTNYW，
.CDR-H2：氨基酸残基IDPSDTRT，和
.CDR-H3：氨基酸残基ARQTLYYEALDY。
13.核酸，其编码前述权利要求中任一项的抗体或衍生物，或此类抗体的轻链或重链，或其可变域。
14.权利要求13的核酸，其包含选自SEQ ID NO:10-13中任一项的核苷酸序列或其互补序列。
15.载体，其包含权利要求13或14的核酸。
16.重组宿主细胞，其包含权利要求15的载体或权利要求13的核酸。
17.药物组合物，其包含(i)权利要求1至12中任一项的抗体或衍生物，或权利要求15的载体或权利要求13的核酸或权利要求16的重组宿主细胞，以及(ii)药学上可接受的载体或赋形剂。
18.权利要求1至12中任一项的抗体或衍生物，用于治疗有此需要的受试者中的疾病。
19.用于产生权利要求1至12中任一项的抗体的方法，其包括在适合于所述抗体表达的条件下培养权利要求16的细胞，和任选地回收所述抗体。
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