JP2023116744A - 抗Ｃ１ｓ抗体および使用方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】抗C1s抗体およびその使用方法を提供する。【解決手段】C1sに結合する単離された抗体であって、以下の（i）または（ii）に記載されるように、酸性pHよりも中性pHにおいて高いアフィニティでC1sに結合する、抗体：（i）中性pHおよび酸性pHの両方において高カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのC1s結合活性のKD値に対する酸性pHでのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）が2以上である、（ii）中性pHおよび酸性pHの両方において高カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのC1s結合活性のkoff値に対する酸性pHでのC1s結合活性のkoff値の比（koff(酸性pH)/koff(中性pH)）が2以上である。【選択図】なし

Description

本発明は、抗C1s抗体およびその使用方法に関する。
背景
補体系は、病原体、外来抗原および腫瘍細胞に対する宿主の防御において重要な役割を果たす約25～30種の補体タンパク質を含む。補体系はまた、身体から免疫複合体およびアポトーシス細胞を除去することによって恒常性の維持にも関与している。補体成分は、一連の酵素プロセスおよび膜結合事象のカスケードにおいて相互作用することによって、それらの機能を遂行する。これらのプロセスの最終結果は、溶解機能、免疫調節機能、およびオプソニン機能を有する産物の生成である。
補体系は、3つの異なる経路：古典経路、レチシン経路、および副経路に分類できることが広く知られている。各経路の開始は異なるが、3つの経路はすべて収束し、最終的に標的細胞の破壊に関与する同じ終末補体成分（C5～C9）を共有している。
C1複合体は、古典経路カスケードの主要な開始因子として機能する大型のタンパク質複合体である。C1複合体は、モル比がそれぞれ1：2：2のC1q、C1r、およびC1sの3つの成分から構成される（非特許文献1）。古典経路は、抗体と結合した標的にC1複合体が結合すると開始される。6つの球状頭部を有するC1qは、Fc領域とのアビディティ型相互作用によってC1複合体が抗体に結合するのを媒介する。標的に緊密に結合すると、C1複合体内のC1rは自己活性化し、酵素的に活性となる。活性化したC1rはその後、C1複合体内のプロ酵素C1sを切断して活性化させる（非特許文献2）。その後、活性化したC1sは、その基質である補体成分C2およびC4を切断し、それぞれC2a/C2bおよびC4a/C4bフラグメントにする。これにより、C3コンバターゼであるC4b2aの集合体が標的の表面上にあらわれ、C3を切断してC3bを形成させる。C3bはその後、C5を切断して、C5b、C6、C7、C8、およびC9の終末膜攻撃複合体の形成を開始させ、これが孔形成を通じて標的を溶解させる。
C1sは、カルシウム依存的にホモ二量体を形成する（非特許文献3）。1 mMのカルシウムイオン濃度ではC1sのほとんどが二量体状態にあり、1 nMのカルシウム濃度下ではそれは主として単量体状態にあることが報告されている（非特許文献4）。血中では、C1sおよびC1rは、大部分がカルシウム依存的C1r2s2ヘテロ四量体としてひとつに結合しており、これがC1qと1：1比で可逆的に結合してC1複合体を形成する。カルシウムが存在しないかまたは低濃度の場合、C1r2s2四量体は、1つのC1r二量体および2つのC1s単量体へと解離する（非特許文献5）。C1sは79 kDaの糖タンパク質であり、その質量の5～6％がグリコシル化に起因する（非特許文献6）。血清中のC1sの濃度は、およそ55μg/mL（0.7μM）であると報告されている（非特許文献7）。
適切に機能する補体系は宿主を病原体から防御するが、古典経路の異常調節または不適切な活性化は、様々な補体介在性の障害、例えば、非限定的に、自己免疫性溶血性貧血（AIHA）、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡（BP）、免疫性血小板減少性紫斑病（ITP）等を引き起こす。したがって、古典経路の過剰なまたは制御されない活性化の阻害は、そのような障害を有する患者に臨床的利益を提供し得る。
抗体は、血漿中で安定性があり、それらの標的に対して高度に特異的であり、一般に良い薬物動態プロファイルを示すことから、非常に魅力的な医薬品である。しかし、それらの大きな分子サイズのために、治療用抗体の用量は通常、高い。標的が多量に存在する場合は、必要とされる抗体の治療用量はさらに高くなる。その結果、抗体の薬物動態、薬力学、および抗原結合特性を改善する方法は、治療用抗体に伴う用量および高い製造費を減少させる魅力的な方法である。
いくつかの先行する報告が、抗C1s抗体を記載している。例えば、Matsumotoら（1986）（非特許文献8）は、C1s上の異なるエピトープに結合する3つの抗体を記載している。1つのクローンは活性型のC1sに優先的に結合し、他の2つはプロ酵素および活性型の両方のC1sに結合した。これらの2つのクローンのうち1つのみが、C1sによるC2およびC4の切断を阻害することができた。特許文献1は、C1sを通じたC4の切断を阻害するがC2の切断は阻害しない抗体を記載している。加えて、特許文献2は、プロ酵素型と比較して活性型のC1sに選択的なC1s上の立体構造エピトープに結合するいくつかの抗体を記載している。特許文献3は、C4の切断を阻止することができる2クローンの抗C1s抗体を記載している。
その抗原に対する抗体のアフィニティは、その抗体がどのくらい効果的にその標的を中和することができるかを決定する。治療効果に必要な用量を減少させるように抗体のアフィニティを高めるために、様々なアフィニティ成熟方法（非特許文献9）が使用されている。しかし、1つの抗体分子は、典型的に2つの結合部位を有し、したがって投与後に2つの標的（結合部位1つにつき抗原1つ）を中和することができるのみであるという制約がある。抗体が共有結合相互作用により無限大のアフィニティで標的に結合できる場合でさえも、その抗体によって中和される標的の最大数は、依然として2つが上限となる。
pH依存的に抗原に結合する抗体（以降、本明細書で「pH依存的抗体」または「pH依存的結合抗体」とも称される）は、単一の抗体分子による複数の抗原分子の中和を可能にすることが報告されている（非特許文献10、特許文献4）。pH依存的抗体は、血漿中の中性pH条件下でその抗原に強く結合するが、細胞のエンドソーム内の酸性pH条件下で抗原から解離する。抗原から解離すると、抗体はFcRn受容体により血漿中にリサイクルされ、解離した抗原は、細胞のリソソーム内で分解される。リサイクルされた抗体はその後、再び自由に抗原分子に結合してそれを中和し、このプロセスは抗体が血中にとどまる限り繰り返される。
WO2014/071206 WO2014/066744 WO2014/186599 WO2009/125825
Wang et. al. Mol Cell. 2016 Jul 7;63(1):135-45 Mortensen et. al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Jan 31;114(5):986-991 Arlaud et. al. Biochim Biophys Acta. 1980 Nov 6;616(1):105-15 Rivas et. al. Biochemistry. 1992 Dec 1;31(47):11707-12 Rossi et.al. Methods Mol Biol. 2014;1100:43-60 Petillot et. al. FEBS Lett. 1995 Jan 30;358(3):323-8 Shi et. al. Blood. 2014 Jun 26;123(26):4015-22 Matsumoto et. al. J Immunol. 1986 Nov 1;137(9):2907-12 Kim et. al. Methods Mol Biol. 2014;1131:407-20 Igawa et. al. Nat Biotechnol. 2010 Nov;28(11):1203-7
本発明は、抗C1s抗体およびそれを使用する方法を提供する。
pH依存的な様式でのC1sへの結合に加えて、C1sに対するpH依存的抗体のアフィニティに対するカルシウムの影響が、別の重要な特性であり得る。C1sは、高カルシウム濃度下で二量体を形成するが、低カルシウム濃度下では単量体へと解離する。C1sが二量体状態にあるとき、二価抗体は、複数のC1s分子を架橋することによって免疫複合体を形成することができる。これにより、抗体は、アフィニティ型およびアビディティ型の両方の相互作用によって複合体内のC1s分子に結合することができ、それによってその抗体の見かけのアフィニティが増加する。これに対して、C1sが単量体状態にあるとき、抗体はアフィニティ型相互作用によってのみC1sに結合する。これは、pH依存的C1s抗体は血漿中の二量体C1sと免疫複合体を形成することができるが、酸性のエンドソーム内に入るとC1sは単量体へと解離することを意味する。これにより、免疫複合体が解体され、それが抗原からの抗体のpH依存的解離を増強する。
いくつかの態様において、本発明の単離された抗C1s抗体は、イオン濃度に依存して変化するC1s結合活性を有する抗体である。いくつかの態様において、単離された抗C1s抗体は、酸性pHよりも中性pHにおいて高いアフィニティでC1sに結合する。いくつかの態様において、抗C1s抗体は、低カルシウム濃度条件下よりも高カルシウム濃度条件下において高いアフィニティでC1sに結合する。いくつかの態様において、単離された抗C1s抗体は、酸性pHかつ低カルシウム濃度下よりも、中性pHかつ高カルシウム濃度条件下において、高いアフィニティでC1sに結合する。
いくつかの態様において、本発明の単離された抗C1s抗体について、中性pHおよび酸性pHの両方において高カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのそのC1s結合活性のKD値に対する酸性pHでのそのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）は2以上である。いくつかの態様において、本発明の単離された抗C1s抗体について、中性pHおよび酸性pHの両方において低カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのそのC1s結合活性のKD値に対する酸性pHでのそのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）は2以上であり、ここで該抗C1s抗体は二量体状態のC1sに結合する。いくつかの態様において、本発明の単離された抗C1s抗体について、中性pHおよび酸性pHの両方において高カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのそのC1s結合活性のkoff値に対する酸性pHでのそのC1s結合活性のkoff値の比（koff(酸性pH)/koff(中性pH)）は2以上である。いくつかの態様において、本発明の単離された抗C1s抗体について、中性pHおよび酸性pHの両方において低カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのそのC1s結合活性のkoff値に対する酸性pHでのそのC1s結合活性のkoff値の比（koff(酸性pH)/koff(中性pH)）は2以上であり、ここで該抗C1s抗体は二量体状態のC1sに結合する。いくつかの態様において、本発明の単離された抗C1s抗体について、中性pHにおける高カルシウム濃度下および酸性pHにおける低カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのそのC1s結合活性のKD値に対する酸性pHでのそのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）は5以上である。
いくつかの態様において、本発明の単離された抗C1s抗体は、以下のKabatナンバリングシステムでの位置：
重鎖：H26、H27、H28、H29、H30、H31、H32、H33、H34、H35、H50、H51、H52、H52a、H53、H54、H55、H57、H58、H59、H60、H61、H62、H63、H64、H65、H93、H94、H95、H96、H97、H98、H99、H100、H100a、H101、およびH102；ならびに
軽鎖：L24、L25、L26、L27、L27a、L28、L29、L30、L31、L32、L33、L50、L51、L52、L53、L54、L55、L56、L91、L92、L93、L94、L95、L95a、L96、およびL97
のうちの1つまたは複数にヒスチジン残基を含む。
いくつかの態様において、本発明の単離された抗C1s抗体は、以下のKabatナンバリングシステムでの位置：
重鎖：H51、H65、およびH99；ならびに
軽鎖：L92、L94、L95、およびL96
のうちの1つまたは複数にヒスチジン残基を含む。
いくつかの態様において、本発明の単離された抗C1s抗体は、以下のKabatナンバリングシステムでの位置：
重鎖：H51、H65、およびH99；ならびに
軽鎖：L92、L94、L95、およびL96
のうちの1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのヒスチジンを含む。
いくつかの態様において、本発明の単離された抗C1s抗体は、Kabatナンバリングシステムによる、以下の位置：
重鎖：H51、H65、およびH99；ならびに
軽鎖：L92、L94、L95、およびL96
のうちの1つまたは複数、および1つもしくは複数のCDRのアミノ酸位置または1つもしくは複数のFRのアミノ酸位置に、ヒスチジン残基を含む。
いくつかの態様において、本発明の単離された抗C1s抗体は、Kabatナンバリングシステムによる以下の位置：
1）L92およびL94
2）L92およびL95
3）L94およびL95
4）L92、L94、およびL95
5）H65およびL92
6）H65およびL94
7）H65およびL95
8）H65、L92、およびL94
9）H65、L92、およびL95
10）H65、L94、およびL95
11）H65、L92、L94、およびL95
12）H99およびL92
13）H99およびL94
14）H99およびL95
15）H99、L92、およびL94
16）H99、L92、およびL95
17）H99、L94、およびL95
18）H99、L92、L94、およびL95
19）H65およびH99
20）H65、H99、およびL92
21）H65、H99、およびL94
22）H65、H99、およびL95
23）H65、H99、L92、およびL94
24）H65、H99、L92、およびL95
25）H65、H99、L94、およびL95
26）H65、H99、L92、L94、およびL95、または
27）H27、H99、およびL95
にヒスチジン残基を含む。
いくつかの態様において、本発明の抗C1s抗体は、以下のKabatナンバリングシステムでの位置：
重鎖：H26、H27、H28、H29、H30、H31、H32、H33、H34、H35、H50、H51、H52、H52a、H53、H54、H55、H57、H58、H59、H60、H61、H62、H63、H64、H65、H93、H94、H95、H96、H97、H98、H99、H100、H100a、H101、およびH102；ならびに
軽鎖：L24、L25、L26、L27、L27a、L28、L29、L30、L31、L32、L33、L50、L51、L52、L53、L54、L55、L56、L91、L92、L93、L94、L95、L95a、L96、およびL97
のうちの1つまたは複数において置換された少なくとも1つのヒスチジンを含む。
いくつかの態様において、本発明の抗C1s抗体は、以下のKabatナンバリングシステムでの位置：
重鎖：H51、H65、およびH99；ならびに
軽鎖：L92、L94、L95、およびL96
のうちの1つまたは複数において置換された少なくとも1つのヒスチジンを含む。
いくつかの態様において、本発明の単離された抗C1s抗体は、以下のKabatナンバリングシステムでの位置：
重鎖：H51、H65、およびH99；ならびに
軽鎖：L92、L94、L95、およびL96
の置換された1つ、2つ、3つ、4つ、または5つのヒスチジンを含む。
いくつかの態様において、本発明の単離された抗C1s抗体は、Kabatナンバリングシステムによる、以下の位置：
重鎖：H51、H65、およびH99；ならびに
軽鎖：L92、L94、L95、およびL96
のうちの1つまたは複数、および1つもしくは複数のCDRのアミノ酸位置または1つもしくは複数のFRのアミノ酸位置に、置換された残基である少なくとも1つのヒスチジン残基を含む。
いくつかの態様において、本発明の単離された抗C1s抗体は、Kabatナンバリングシステムによる以下の位置：
1）L92およびL94
2）L92およびL95
3）L94およびL95
4）L92、L94、およびL95
5）H65およびL92
6）H65およびL94
7）H65およびL95
8）H65、L92、およびL94
9）H65、L92、およびL95
10）H65、L94、およびL95
11）H65、L92、L94、およびL95
12）H99およびL92
13）H99およびL94
14）H99およびL95
15）H99、L92、およびL94
16）H99、L92、およびL95
17）H99、L94、およびL95
18）H99、L92、L94、およびL95
19）H65およびH99
20）H65、H99、およびL92
21）H65、H99、およびL94
22）H65、H99、およびL95
23）H65、H99、L92、およびL94
24）H65、H99、L92、およびL95
25）H65、H99、L94、およびL95
26）H65、H99、L92、L94、およびL95、または
27）H27、H99、およびL95
に、置換された残基である少なくとも1つのヒスチジンを含む。
いくつかの態様において、本発明の単離された抗C1s抗体は、中性pH条件において、C1sへの結合に関して、
（a）SEQ ID NO:23のHVR-H1配列、SEQ ID NO:24のHVR-H2配列、SEQ ID NO:25のHVR-H3配列、SEQ ID NO:26のHVR-L1配列、SEQ ID NO:27のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:28のHVR-L3配列を含む抗体、
（b）SEQ ID NO:29のHVR-H1配列、SEQ ID NO:30のHVR-H2配列、SEQ ID NO:31のHVR-H3配列、SEQ ID NO:32のHVR-L1配列、SEQ ID NO:33のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:34のHVR-L3配列を含む抗体、
（c）ヒトモノクローナル抗C1s抗体M241またはヒトモノクローナル抗C1s抗体M81、
（d）SEQ ID NO:56のHVR-H1配列、SEQ ID NO:57のHVR-H2配列、SEQ ID NO:58のHVR-H3配列、SEQ ID NO:71のHVR-L1配列、SEQ ID NO:72のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:73のHVR-L3配列を含む抗体、
（e）SEQ ID NO:59のHVR-H1配列、SEQ ID NO:60のHVR-H2配列、SEQ ID NO:61のHVR-H3配列、SEQ ID NO:74のHVR-L1配列、SEQ ID NO:75のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:76のHVR-L3配列を含む抗体、
（f）SEQ ID NO:62のHVR-H1配列、SEQ ID NO:63のHVR-H2配列、SEQ ID NO:64のHVR-H3配列、SEQ ID NO:77のHVR-L1配列、SEQ ID NO:78のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:79のHVR-L3配列を含む抗体、
（g）SEQ ID NO:65のHVR-H1配列、SEQ ID NO:66のHVR-H2配列、SEQ ID NO:67のHVR-H3配列、SEQ ID NO:80のHVR-L1配列、SEQ ID NO:81のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:82のHVR-L3配列を含む抗体、ならびに
（h）SEQ ID NO:68のHVR-H1配列、SEQ ID NO:69のHVR-H2配列、SEQ ID NO:70のHVR-H3配列、SEQ ID NO:83のHVR-L1配列、SEQ ID NO:84のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:85のHVR-L3配列を含む抗体
からなる群より選択される抗体と競合し、該抗体は、以下の（i）または（ii）に記載されるように、酸性pHよりも中性pHにおいて高いアフィニティでC1sに結合する：
（i）中性pHおよび酸性pHの両方において高カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのC1s結合活性のKD値に対する酸性pHでのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）が、2以上である、
（ii）中性pHおよび酸性pHの両方において高カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのC1s結合活性のkoff値に対する酸性pHでのC1s結合活性のkoff値の比（koff(酸性pH)/koff(中性pH)）が、2以上である。
いくつかの態様において、本発明の単離された抗C1s抗体は、C1sへの結合に関して、
（a）SEQ ID NO:56のHVR-H1配列、SEQ ID NO:57のHVR-H2配列、SEQ ID NO:58のHVR-H3配列、SEQ ID NO:71のHVR-L1配列、SEQ ID NO:72のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:73のHVR-L3配列を含む抗体、
（b）SEQ ID NO:59のHVR-H1配列、SEQ ID NO:60のHVR-H2配列、SEQ ID NO:61のHVR-H3配列、SEQ ID NO:74のHVR-L1配列、SEQ ID NO:75のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:76のHVR-L3配列を含む抗体、
（c）SEQ ID NO:62のHVR-H1配列、SEQ ID NO:63のHVR-H2配列、SEQ ID NO:64のHVR-H3配列、SEQ ID NO:77のHVR-L1配列、SEQ ID NO:78のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:79のHVR-L3配列を含む抗体、
（d）SEQ ID NO:65のHVR-H1配列、SEQ ID NO:66のHVR-H2配列、SEQ ID NO:67のHVR-H3配列、SEQ ID NO:80のHVR-L1配列、SEQ ID NO:81のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:82のHVR-L3配列を含む抗体、ならびに
（e）SEQ ID NO:68のHVR-H1配列、SEQ ID NO:69のHVR-H2配列、SEQ ID NO:70のHVR-H3配列、SEQ ID NO:83のHVR-L1配列、SEQ ID NO:84のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:85のHVR-L3配列を含む抗体、
からなる群より選択される抗体と競合する。
いくつかの態様において、本開示は、補体成分Is（C1s）のドメインIVおよびVを含む領域内のエピトープに特異的に結合する単離された抗C1s抗体を提供する。いくつかの例において、当該抗体は、C1sが補体成分4（C4）に結合するのを阻害する。いくつかの例において、本開示の単離された抗C1s抗体によって結合されるエピトープは、立体構造エピトープである。いくつかの態様において、C1sの上記エピトープは、ヒトC1sのエピトープである。
いくつかの態様において、本発明の抗C1s抗体は、以下のKabatナンバリングシステムでの位置：
重鎖：H51、H65、およびH99；ならびに
軽鎖：L92、L94、L95、およびL96
のうちの1つまたは複数における少なくとも1つのアミノ酸がヒスチジンで置換されている、SEQ ID NO:35もしくは36のVH配列および/またはSEQ ID NO:37もしくは38のVL配列を含む。
いくつかの態様において、本発明の抗C1s抗体は、酸性pHでの該抗体の非特異的結合活性が低下するように、可変領域の少なくとも1つのアミノ酸がD、E、K、RおよびQからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている。
いくつかの態様において、本発明の抗C1s抗体は、中性pHでのC1s結合活性に対する酸性pHでのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）が大きくなるように、可変領域の少なくとも1つのアミノ酸がD、E、K、RおよびQからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている。
いくつかの態様において、本発明の単離された抗C1s抗体は、（a）SEQ ID NO:39のアミノ酸配列を含むHVR-H1、（b）SEQ ID NO:40のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および（c）SEQ ID NO:41のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み、ヒト由来または霊長類由来のフレームワーク領域を含む。いくつかの態様において、本発明の単離された抗C1s抗体は、（a）SEQ ID NO:42または45のアミノ酸配列を含むHVR-L1、（b）SEQ ID NO:43のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および（c）SEQ ID NO:44のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含み、ヒト由来または霊長類由来のフレームワーク領域を含む。
いくつかの態様において、本発明の抗C1s抗体は、（a）SEQ ID NO:19、17もしくは22のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列；（b）SEQ ID NO:20、18もしくは21のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列；または（c）（a）のVH配列および（b）のVL配列を含む。いくつかの態様において、本発明の抗C1s抗体は、SEQ ID NO:19、17または22のVH配列を含む。いくつかの態様において、本発明の抗C1s抗体は、SEQ ID NO:20、18または21のVL配列を含む。さらなる態様において、本発明の抗C1s抗体は、SEQ ID NO:19、17または22のVH配列およびSEQ ID NO:20、18または21のVL配列を含む。さらなる態様において、本発明の抗C1s抗体は、SEQ ID NO:19のVH配列およびSEQ ID NO:20のVL配列を含む。さらなる態様において、本発明の抗C1s抗体は、SEQ ID NO:19のVH配列およびSEQ ID NO:21のVL配列を含む。さらなる態様において、本発明の抗C1s抗体は、SEQ ID NO:22のVH配列およびSEQ ID NO:21のVL配列を含む。
いくつかの態様において、本発明の単離された抗C1s抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの態様において、本発明の単離された抗C1s抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。さらなる態様において、本発明の単離された抗C1s抗体は、全長IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4抗体である。さらなる態様において、本発明の単離された抗C1s抗体は、C1sに結合する抗体断片である。いくつかの特定の態様において、本発明の単離された抗C1s抗体は、ヒトIgG1またはヒト化IgG1である。
本発明はまた、本発明の抗C1s抗体をコードする単離された核酸を提供する。本発明はまた、本発明の核酸を含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、抗体を製造する方法であって、抗体が産生されるように本発明の宿主細胞を培養する工程を含む方法を提供する。
本発明はまた、本発明の抗体および薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤を提供する。
本発明の抗C1s抗体は、医薬品として使用するためのものであり得る。本発明の抗C1s抗体は、補体介在性の疾患または障害の治療に使用するためのものであり得る。本発明の抗C1s抗体は、血漿からのC1sのクリアランス（または除去）の増強に使用するためのものであり得る。本発明の抗C1s抗体は、血漿からのC1q、C1rおよびC1sの複合体のクリアランス（または除去）の増強に使用するためのものであり得る。いくつかの態様において、本発明の抗C1s抗体は、補体成分C4の切断の阻害に使用するためのものであり得、ここで該抗体は補体成分C2の切断を阻害しない。いくつかの例において、該抗体は古典的補体経路の成分を阻害し、いくつかの例において、古典的補体経路の成分はC1sである。
本発明の抗C1s抗体は、医薬品の製造において使用され得る。いくつかの態様において、医薬品は、補体介在性の疾患または障害を治療するためのものである。いくつかの態様において、医薬品は、血漿からのC1sのクリアランス（または除去）を増強するためのものである。いくつかの態様において、医薬品は、血漿からのC1q、C1rおよびC1sの複合体のクリアランス（または除去）を増強するためのものである。医薬品は、補体成分C4の切断を阻害するためのものであり、ここで抗体は補体成分C2の切断を阻害しない。いくつかの例において、医薬品は古典的補体経路の成分を阻害し、いくつかの例において、古典的補体経路の成分はC1sである。
本発明はまた、補体介在性の疾患または障害を有する個体を治療する方法を提供する。いくつかの態様において、この方法は、有効量の本発明の抗C1s抗体を個体に投与する工程を含む。本発明はまた、個体における血漿からのC1sのクリアランス（または除去）を増強する方法を提供する。いくつかの態様において、この方法は、血漿からのC1sのクリアランス（または除去）を増強するのに有効な量の本発明の抗C1s抗体を個体に投与する工程を含む。本発明はまた、個体における血漿からのC1q、C1rおよびC1sの複合体のクリアランス（または除去）を増強する方法を提供する。いくつかの態様において、この方法は、血漿からのC1q、C1rおよびC1sの複合体のクリアランス（または除去）を増強するのに有効な量の本発明の抗C1s抗体を個体に投与する工程を含む。本発明はまた、補体成分C4の切断を阻害する方法であって、抗体が補体成分C2の切断を阻害しない、方法を提供する。いくつかの例において、該抗体は古典的補体経路の成分を阻害し、いくつかの例において、古典的補体経路の成分はC1sである。
より具体的には、本発明は以下を提供する：
［1］C1sに結合する単離された抗体であって、以下の（i）または（ii）に記載されるように、酸性pHよりも中性pHにおいて高いアフィニティでC1sに結合する、抗体：
（i）中性pHおよび酸性pHの両方において高カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのC1s結合活性のKD値に対する酸性pHでのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）が2以上である、
（ii）中性pHおよび酸性pHの両方において高カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのC1s結合活性のkoff値に対する酸性pHでのC1s結合活性のkoff値の比（koff(酸性pH)/koff(中性pH)）が2以上である。
［2］以下のKabatナンバリングシステムでの位置：
重鎖：H51、H65、およびH99；ならびに
軽鎖：L92、L94、L95、およびL96
のうちの1つまたは複数にヒスチジン残基を含む、［1］の抗体。
［3］以下のKabatナンバリングシステムでの位置：
重鎖：H51、H65、およびH99；ならびに
軽鎖：L92、L94、L95、およびL96
のうちの1つまたは複数において、少なくとも1つのアミノ酸がヒスチジンで置換されている、［1］または［2］の抗体。
［4］中性pH条件下で、C1sへの結合に関して、
（a）SEQ ID NO:23のHVR-H1配列、SEQ ID NO:24のHVR-H2配列、SEQ ID NO:25のHVR-H3配列、SEQ ID NO:26のHVR-L1配列、SEQ ID NO:27のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:28のHVR-L3配列を含む抗体、
（b）SEQ ID NO:29のHVR-H1配列、SEQ ID NO:30のHVR-H2配列、SEQ ID NO:31のHVR-H3配列、SEQ ID NO:32のHVR-L1配列、SEQ ID NO:33のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:34のHVR-L3配列を含む抗体、
（c）ヒトモノクローナル抗C1s抗体M241、
（d）SEQ ID NO:56のHVR-H1配列、SEQ ID NO:57のHVR-H2配列、SEQ ID NO:58のHVR-H3配列、SEQ ID NO:71のHVR-L1配列、SEQ ID NO:72のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:73のHVR-L3配列を含む抗体、
（e）SEQ ID NO:59のHVR-H1配列、SEQ ID NO:60のHVR-H2配列、SEQ ID NO:61のHVR-H3配列、SEQ ID NO:74のHVR-L1配列、SEQ ID NO:75のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:76のHVR-L3配列を含む抗体、
（f）SEQ ID NO:62のHVR-H1配列、SEQ ID NO:63のHVR-H2配列、SEQ ID NO:64のHVR-H3配列、SEQ ID NO:77のHVR-L1配列、SEQ ID NO:78のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:79のHVR-L3配列を含む抗体、
（g）SEQ ID NO:65のHVR-H1配列、SEQ ID NO:66のHVR-H2配列、SEQ ID NO:67のHVR-H3配列、SEQ ID NO:80のHVR-L1配列、SEQ ID NO:81のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:82のHVR-L3配列を含む抗体、ならびに
（h）SEQ ID NO:68のHVR-H1配列、SEQ ID NO:69のHVR-H2配列、SEQ ID NO:70のHVR-H3配列、SEQ ID NO:83のHVR-L1配列、SEQ ID NO:84のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:85のHVR-L3配列を含む抗体
からなる群より選択される抗体と競合する、［1］～［3］のいずれかの抗体。
［5］可変領域の少なくとも1つのアミノ酸が、以下のKabatナンバリングシステムでの位置：
重鎖：H51、H65、およびH99；ならびに
軽鎖：L92、L94、L95、およびL96
のうちの1つまたは複数においてヒスチジンで置換されている、SEQ ID NO:35もしくは36のVH配列および/またはSEQ ID NO:37もしくは38のVL配列を含む、［1］～［4］のいずれかの抗体。
［6］さらに、可変領域の少なくとも1つのアミノ酸が、
1）前記抗体の酸性pHでの非特異的結合活性が低下するように、または
2）中性pHでのC1s結合活性のKD値に対する酸性pHでのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）が大きくなるように
D、E、K、RおよびQからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている、［1］～［5］のいずれかの抗体。
［7］C1sに結合する単離された抗体であって、（a）SEQ ID NO:39のアミノ酸配列を含むHVR-H1、（b）SEQ ID NO:40のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および（c）SEQ ID NO:41のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み、ヒト由来または霊長類由来のフレームワーク領域を含む、抗体。
［8］C1sに結合する単離された抗体であって、（a）SEQ ID NO:42のアミノ酸配列を含むHVR-L1、（b）SEQ ID NO:43のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および（c）SEQ ID NO:44のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含み、ヒト由来または霊長類由来のフレームワーク領域を含む、抗体。
［9］（a）SEQ ID NO:19、17もしくは22のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列；（b）SEQ ID NO:20、18もしくは21のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列；または（c）（a）のVH配列および（b）のVL配列を含む、［1］～［8］のいずれかの抗体。
［10］SEQ ID NO:19、17または22のVH配列を含む、［9］の抗体。
［11］SEQ ID NO:20、18または21のVL配列を含む、［9］の抗体。
［12］SEQ ID NO:19のVH配列およびSEQ ID NO:20のVL配列を含む、抗体。
［13］［1］～［12］のいずれかの抗体および薬学的に許容される担体を含む、薬学的製剤。
［14］補体介在性の疾患または障害を有する個体を治療する方法であって、［1］～［12］のいずれかの抗体を個体に有効量投与する工程を含む、方法。
さらに、本発明は、以下を提供する：
［15］血漿からC1sを除去する方法であって、
（a）その血漿からC1sを除去する必要のある個体を特定する工程；
（b）抗体を提供する工程であって、該抗体が、該抗体のC1s結合ドメインを通じてC1sに結合し、かつ2～10,000であるKD(pH 5.8)/KD(pH7.4)値を有し、ここでKD(pH 5.8)/KD(pH7.4)は、KDが表面プラズモン共鳴技術を用いて決定された場合のpH 5.8におけるC1sに対するKDとpH7.4におけるC1sに対するKDの比として定義され、該抗体が、生体内の血漿中のC1sに結合し、かつ、生体内のエンドソーム内に存在する条件下では、結合したC1sから解離し、該抗体が、ヒトIgGまたはヒト化IgGである、工程；ならびに
（c）該個体に該抗体を投与する工程
を含む、方法。
［16］対象において血漿からC1sを除去する方法であって、
（a）第1の抗体を同定する工程であって、第1の抗体が第1の抗体のC1s結合ドメインを通じてC1sに結合する、工程；
（b）第2の抗体を同定する工程であって、第2の抗体が、
（1）第2の抗体のC1s結合ドメインを通じてC1sに結合し、
（2）第1の抗体の可変領域の少なくとも1つのアミノ酸がヒスチジンで置換されていること、および/または第1の抗体の可変領域に少なくとも1つのヒスチジンが挿入されていることを除いて、第1の抗体とアミノ酸配列が同じであり、
（3）第1の抗体のKD(pH 5.8)/KD(pH7.4)値よりも高くかつ2～10,000であるKD(pH 5.8)/KD(pH7.4)値を有し、ここでKD(pH 5.8)/KD(pH7.4)は、KDが表面プラズモン共鳴技術を用いて決定された場合のpH 5.8におけるC1sに対するKDとpH7.4におけるC1sに対するKDの比として定義され、
（4）生体内の血漿中のC1sに結合し、
（5）生体内のエンドソーム内に存在する条件下では、結合したC1sから解離し、かつ
（6）ヒトIgGまたはヒト化IgGである、
工程；
（c）血漿中C1sレベルを減少させる必要のある対象を特定する工程；ならびに
（d）対象の血漿中C1sレベルが減少するように、対象に第2の抗体を投与する工程
を含む、方法。
［17］対象において血漿からC1sを除去する方法であって、
（a）第1の抗体を同定する工程であって、第1の抗体が、
（1）第1の抗体のC1s結合ドメインを通じてC1sに結合し、
（2）第1の抗体の少なくとも1つの可変領域が、第2の抗体の対応する可変領域が有するよりも少なくとも1つ多いヒスチジン残基を有することを除いて、第2の抗体の抗原結合ドメインを通じてC1sに結合する第2の抗体とアミノ酸配列が同じであり、
（3）第2の抗体のKD(pH 5.8)/KD(pH7.4)値よりも高くかつ2～10,000であるKD(pH 5.8)/KD(pH7.4)値を有し、ここでKD(pH 5.8)/KD(pH7.4)は、KDが表面プラズモン共鳴技術を用いて決定された場合のpH 5.8におけるC1sに対するKDとpH7.4におけるC1sに対するKDの比として定義され、
（4）生体内の血漿中のC1sに結合し、
（5）生体内のエンドソーム内に存在する条件下では、結合したC1sから解離し、かつ
（6）ヒトIgGまたはヒト化IgGである、
工程；
（b）血漿中C1sレベルを減少させる必要のある対象を特定する工程；ならびに
（c）対象の血漿中C1sレベルが減少するように、対象に第1の抗体を少なくとも1回投与する工程
を含む、方法。
［18］抗体を固定化し、抗原をアナライトとし、以下の条件：摂氏37度（℃）で10 mM MES緩衝液、0.05％モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタンおよび150 mM NaCl
を使用する表面プラズモン共鳴技術を用いてKDが決定される、［15］～［17］のいずれか1つの方法。
［19］C1q、C1rおよびC1sからなるC1複合体に結合する単離された抗体であって、以下の（i）または（ii）に記載されるように、酸性pHよりも中性pHにおいて高いアフィニティでC1複合体と結合する、抗体：
（i）中性pHおよび酸性pHの両方において高カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのC1複合体結合活性のKD値に対する酸性pHでのC1複合体結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）が、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000、またはそれ以上である、
（ii）中性pHにおける高カルシウム濃度下および酸性pHにおける低カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのC1複合体結合活性のKD値に対する酸性pHでのC1複合体結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）が、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000、またはそれ以上である。
［20］C1sに結合する単離された抗体であって、酸性pHよりも中性pHにおいて高いアフィニティでC1sに結合し、中性pHおよび酸性pHの両方において低カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのC1s結合活性のKD値に対する酸性pHでのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）が、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000、またはそれ以上であり、該抗C1s抗体が二量体状態のC1sに結合する、抗体。
図1は、抗体IPN92H0286/IPN93L0205-SG136を除く表10に列挙されているすべての抗体についてのスイーピング指数の改善とKD(5.8+)/KD(7.4+)比の間の相関関係を示している。 図2は、抗体IPN92H0286/IPN93L0205-SG136を除く表10に列挙されているすべての抗体についてのスイーピング指数の改善とkoff (5.8+ of 775+)/koff(7.4+)比の間の相関関係を示している。
本明細書に記載または引用される手法および手順は、概して充分に理解されており、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003))；the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987))；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)；Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)；Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)；およびCancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)に記載された広範に利用されている技法などの従来の技法を用いて、当業者により一般的に使用される。
Ｉ．定義
別途定義しない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994)、およびMarch, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)は、本出願において使用される用語の多くに対する一般的指針を当業者に提供する。特許出願および刊行物を含む、本明細書に引用される全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書を解釈する目的のために、以下の定義が適用され、該当する場合はいつでも、単数形で使用された用語は複数形をも含み、その逆もまた同様である。本明細書で使用される用語は、特定の態様を説明することのみを目的としており、限定を意図したものではないことが、理解されるべきである。下記の定義のいずれかが、参照により本明細書に組み入れられた任意の文書と矛盾する場合には、下記の定義が優先するものとする。
本明細書の趣旨での「アクセプターヒトフレームワーク」は、下で定義するヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン (VL) フレームワークまたは重鎖可変ドメイン (VH) フレームワークのアミノ酸配列を含む、フレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、それらの同じアミノ酸配列を含んでもよいし、またはアミノ酸配列の変更を含んでいてもよい。いくつかの態様において、アミノ酸の変更の数は、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、または2以下である。いくつかの態様において、VLアクセプターヒトフレームワークは、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と、配列が同一である。
「アフィニティ」は、分子（例えば、抗体）の結合部位1個と、分子の結合パートナー（例えば、抗原）との間の、非共有結合的な相互作用の合計の強度のことをいう。別段示さない限り、本明細書で用いられる「結合アフィニティ」は、ある結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）の間の１：１相互作用を反映する、固有の結合アフィニティのことをいう。分子XのそのパートナーYに対するアフィニティは、一般的に、解離定数 (KdまたはKD) により表すことができる。アフィニティは、本明細書に記載のものを含む、当該技術分野において知られた通常の方法によって測定され得る。結合アフィニティを測定するための個々の具体的な実例となるおよび例示的な態様については、下で述べる。用語「結合活性」は、ある分子（例えば、抗体）の単一または複数の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の、非共有結合的な相互作用の合計の強度のことをいう。本明細書において、結合活性は、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）間の1：1の相互作用を反映する活性に厳密に限定されるものではない。結合対のメンバーが一価結合および多価結合の両方の様式で相互に結合し得る場合、結合活性は、これらの結合の合計の強度である。そのパートナーYに対する分子Xの結合活性は、通常、解離定数（KD）により表され得る。あるいは、結合速度および解離速度（KonおよびKoff）が、結合の評価に使用され得る。結合活性は、本明細書に記載されるものを含む、当技術分野で公知の一般的方法によって測定され得る。結合アフィニティを測定するための具体的な実例となるおよび例示的な態様については、下で述べる。
「アフィニティ成熟」抗体は、改変を備えていない親抗体と比較して、1つまたは複数の超可変領域 (hypervariable region: HVR) 中に抗体の抗原に対するアフィニティの改善をもたらす1つまたは複数の改変を伴う、抗体のことをいう。
用語「抗C1S抗体」または「C1Sに結合する抗体」は、充分なアフィニティでC1Sと結合することのできる抗体であって、その結果その抗体がC1Sを標的化したときに診断剤および/または治療剤として有用であるような、抗体のことをいう。一態様において、無関係な非C1Sタンパク質への抗C1S抗体の結合の程度は、例えば、放射免疫測定法 (radioimmunoassay: RIA) により測定したとき、抗体のC1Sへの結合の約10％未満である。特定の態様において、C1Sに結合する抗体は、1μM以下、100nM以下、10nM以下、1nM以下、0.1nM以下、0.01nM以下、または0.001nM以下（例えば、10-8M以下、例えば10-8M～10-13M、例えば、10-9M～10-13M）の解離定数 (Kd) を有する。特定の態様において、抗C1S抗体は、異なる種からのC1S間で保存されているC1Sのエピトープに結合する。
本明細書で用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限りは、これらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を含む、種々の抗体構造を包含する。
「抗体断片」は、完全抗体が結合する抗原に結合する当該完全抗体の一部分を含む、当該完全抗体以外の分子のことをいう。抗体断片の例は、これらに限定されるものではないが、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、scFv）；および、抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいてその参照抗体が自身の抗原への結合を50％以上、阻止する抗体のことをいい、かつ逆にいえば、参照抗体は、競合アッセイにおいて前述の抗体が自身の抗原への結合を50％以上、阻止する。例示的な競合アッセイが、本明細書で提供される。
用語「キメラ」抗体は、重鎖および/または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖および/または軽鎖の残りの部分が異なった供給源または種に由来する抗体のことをいう。
抗体の「クラス」は、抗体の重鎖に備わる定常ドメインまたは定常領域のタイプのことをいう。抗体には5つの主要なクラスがある：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMである。そして、このうちいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）に分けられてもよい。例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2である。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインを、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ぶ。
本明細書でいう用語「細胞傷害剤」は、細胞の機能を阻害するまたは妨げる、および/または細胞の死または破壊の原因となる物質のことをいう。細胞傷害剤は、これらに限定されるものではないが、放射性同位体（例えば、211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212Pb、およびLuの放射性同位体）；化学療法剤または化学療法薬（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド類（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他のインターカレート剤）；増殖阻害剤；核酸分解酵素などの酵素およびその断片；抗生物質；例えば、低分子毒素または細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素（その断片および/または変異体を含む）などの、毒素；および、以下に開示される、種々の抗腫瘍剤または抗がん剤を含む。
「エフェクター機能」は、抗体のFc領域に起因する、抗体のアイソタイプによって異なる生物活性のことをいう。抗体のエフェクター機能の例には次のものが含まれる：C1q結合および補体依存性細胞傷害（complement dependent cytotoxicity:CDC）；Fc受容体結合；抗体依存性細胞介在性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC）；貪食作用；細胞表面受容体（例えば、B細胞受容体）の下方制御；および、B細胞活性化。
ある剤（例えば、薬学的製剤）の「有効量」は、所望の治療的または予防的結果を達成するために有効である、必要な用量におけるおよび必要な期間にわたっての、量のことをいう。
用語「エピトープ」は、抗体によって結合され得る任意の決定基を含む。エピトープは、抗原を標的とする抗体によって結合される該抗原の領域であり、抗体に直接接触する特定のアミノ酸を含む。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基またはスルホニル基などの化学的に活性な表面分子群を含むことができ、かつ特異的な三次元構造特性および/または特定の電荷特性を備えることができる。一般的に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質および/または巨大分子の複雑な混合物中でその標的抗原上のエピトープを優先的に認識する。
本明細書で用語「Fc領域」は、少なくとも定常領域の一部分を含む免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然型配列Fc領域および変異体Fc領域を含む。一態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域はCys226から、またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端まで延びる。ただし、Fc領域のC末端のリジン(Lys447)またはグリシン-リジン（残基446-447）は、存在していてもしていなくてもよい。本明細書では別段特定しない限り、Fc領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991 に記載の、EUナンバリングシステム（EUインデックスとも呼ばれる）にしたがう。
「フレームワーク」または「FR」は、超可変領域 (HVR) 残基以外の、可変ドメイン残基のことをいう。可変ドメインのFRは、通常4つのFRドメイン：FR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。それに応じて、HVRおよびFRの配列は、通常次の順序でVH（またはVL）に現れる：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
用語「全長抗体」、「完全抗体」、および「全部抗体」は、本明細書では相互に交換可能に用いられ、天然型抗体構造に実質的に類似した構造を有する、または本明細書で定義するFc領域を含む重鎖を有する抗体のことをいう。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」は、相互に交換可能に用いられ、外来核酸を導入された細胞（そのような細胞の子孫を含む）のことをいう。宿主細胞は「形質転換体」および「形質転換細胞」を含み、これには初代の形質転換細胞および継代数によらずその細胞に由来する子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸の内容において完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。オリジナルの形質転換細胞がスクリーニングされたまたは選択された際に用いられたものと同じ機能または生物活性を有する変異体子孫も、本明細書では含まれる。
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を用いる非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を備える抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒトの抗原結合残基を含むヒト化抗体を、明確に除外するものである。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンVLまたはVHフレームワーク配列の選択群において最も共通して生じるアミノ酸残基を示すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンVLまたはVH配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。通常、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3におけるサブグループである。一態様において、VLについて、サブグループは上記のKabatらによるサブグループκIである。一態様において、VHについて、サブグループは上記のKabatらによるサブグループIIIである。
「ヒト化」抗体は、非ヒトHVRからのアミノ酸残基およびヒトFRからのアミノ酸残基を含む、キメラ抗体のことをいう。ある態様では、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、当該可変領域においては、すべてのもしくは実質的にすべてのHVR（例えばCDR）は非ヒト抗体のものに対応し、かつ、すべてのもしくは実質的にすべてのFRはヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。抗体（例えば、非ヒト抗体）の「ヒト化された形態」は、ヒト化を経た抗体のことをいう。
本明細書で用いられる用語「超可変領域」または「HVR」は、配列において超可変であり（「相補性決定領域」または「CDR」(complementarity determining region)）、および/または構造的に定まったループ（「超可変ループ」）を形成し、および/または抗原接触残基（「抗原接触」）を含む、抗体の可変ドメインの各領域のことをいう。通常、抗体は6つのHVRを含む：VHに3つ（H1、H2、H3）、およびVLに3つ（L1、L2、L3）である。本明細書での例示的なHVRは、以下のものを含む：
(a) アミノ酸残基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、および96-101 (H3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987))；
(b) アミノ酸残基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、 および95-102 (H3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))；
(c) アミノ酸残基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、および93-101 (H3) のところで生じる抗原接触 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；ならびに、
(d) HVRアミノ酸残基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)、および94-102 (H3)を含む、(a)、(b)、および/または(c)の組合せ。
別段示さない限り、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基（例えば、FR残基）は、本明細書では上記のKabatらにしたがって番号付けされる。
「イムノコンジュゲート」は、1つまたは複数の異種の分子にコンジュゲートされた抗体である（異種の分子は、これに限定されるものではないが、細胞傷害剤を含む）。
「個体」または「被験体」は哺乳動物である。哺乳動物は、これらに限定されるものではないが、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびに、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）を含む。特定の態様では、個体または被験体は、ヒトである。
「単離された」抗体は、そのもともとの環境の成分から分離されたものである。いくつかの態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、SDS-PAGE、等電点分離法 (isoelectric focusing: IEF)、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフ（例えば、イオン交換または逆相HPLC）で測定して、95%または99%を超える純度まで精製される。抗体の純度の評価のための方法の総説として、例えば、Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007) を参照のこと。
「単離された」核酸は、そのもともとの環境の成分から分離された核酸分子のことをいう。単離された核酸は、その核酸分子を通常含む細胞の中に含まれた核酸分子を含むが、その核酸分子は染色体外に存在しているかまたは本来の染色体上の位置とは異なる染色体上の位置に存在している。
「抗C1S抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖および軽鎖（またはその断片）をコードする1つまたは複数の核酸分子のことをいい、1つのベクターまたは別々のベクターに乗っている核酸分子、および、宿主細胞中の1つまたは複数の位置に存在している核酸分子を含む。
本明細書でいう用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体のことをいう。すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、生じ得る変異抗体（例えば、自然に生じる変異を含む変異抗体、またはモノクローナル抗体調製物の製造中に発生する変異抗体。そのような変異体は通常若干量存在している。）を除いて、同一でありおよび/または同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られるものである、という抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の製造を求めるものと解釈されるべきではない。例えば、本発明にしたがって用いられるモノクローナル抗体は、これらに限定されるものではないが、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含んだトランスジェニック動物を利用する方法を含む、様々な手法によって作成されてよく、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
「裸抗体」は、異種の部分（例えば、細胞傷害部分）または放射性標識にコンジュゲートされていない抗体のことをいう。裸抗体は、薬学的製剤中に存在していてもよい。
「天然型抗体」は、天然に生じる様々な構造を伴う免疫グロブリン分子のことをいう。例えば、天然型IgG抗体は、ジスルフィド結合している2つの同一の軽鎖と2つの同一の重鎖から構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端に向かって、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域 (VH) を有し、それに3つの定常ドメイン（CH1、CH2、およびCH3）が続く。同様に、N末端からC末端に向かって、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域 (VL) を有し、それに定常軽鎖 (CL) ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κおよびλと呼ばれる、2つのタイプの1つに帰属させられてよい。
用語「添付文書」は、治療用品の商用パッケージに通常含まれ、そのような治療用品の使用に関する、適応症、用法、用量、投与方法、併用療法、禁忌、および/または警告についての情報を含む使用説明書のことをいうために用いられる。
参照ポリペプチド配列に対する「パーセント (％) アミノ酸配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性を得るように配列を整列させてかつ必要ならギャップを導入した後の、かつ、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとしたときの、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の、百分率比として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決める目的のアラインメントは、当該技術分野における技術の範囲内にある種々の方法、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign (DNASTAR) ソフトウェア、またはGENETYX (登録商標) (Genetyx Co., Ltd.) などの、公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントをとるための適切なパラメーターを決定することができる。
ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムは、ジェネンテック社の著作であり、そのソースコードは米国著作権庁 (U.S. Copyright Office, Wasington D.C., 20559) に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087として登録されている。ALIGN-2プログラムは、ジェネンテック社 (Genentech, Inc., South San Francisco, California) から公に入手可能であるし、ソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、Digital UNIX V4.0Dを含むUNIXオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされる。すべての配列比較パラメーターは、ALIGN-2プログラムによって設定され、変動しない。アミノ酸配列比較にALIGN-2が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Aの、所与のアミノ酸配列Bへの、またはそれとの、またはそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Bへの、またはそれとの、またはそれに対する、ある％アミノ酸配列同一性を有するまたは含む所与のアミノ酸配列A、ということもできる）は、次のように計算される：

分率X/Yの100倍

ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN-2によって、当該プログラムのAおよびBのアラインメントにおいて同一である一致としてスコアされたアミノ酸残基の数であり、YはB中のアミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、AのBへの％アミノ酸配列同一性は、BのAへの％アミノ酸配列同一性と等しくないことが、理解されるであろう。別段特に明示しない限り、本明細書で用いられるすべての％アミノ酸配列同一性値は、直前の段落で述べたとおりALIGN-2コンピュータプログラムを用いて得られるものである。
用語「薬学的製剤」は、その中に含まれた有効成分の生物活性が効果を発揮し得るような形態にある調製物であって、かつ製剤が投与される被験体に許容できない程度に毒性のある追加の要素を含んでいない、調製物のことをいう。
「薬学的に許容される担体」は、被験体に対して無毒な、薬学的製剤中の有効成分以外の成分のことをいう。薬学的に許容される担体は、これらに限定されるものではないが、緩衝液、賦形剤、安定化剤、または保存剤を含む。
本明細書でいう用語「C1S」は、別段示さない限り、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物供給源からの任意の天然型C1Sのことをいう。この用語は、「全長」のプロセシングを受けていないC1Sも、細胞中でのプロセシングの結果生じるいかなる形態のC1Sも包含する。この用語はまた、自然に生じるC1Sの変異体、例えば、スプライス変異体や対立遺伝子変異体も包含する。例示的なヒトC1Sのアミノ酸配列を、SEQ ID NO:1に示す。例示的なカニクイザルおよびラットC1Sのアミノ酸配列を、それぞれSEQ ID NO:3および2に示す。
本明細書で用いられる「治療」（および、その文法上の派生語、例えば「治療する」、「治療すること」など）は、治療される個体の自然経過を改変することを企図した臨床的介入を意味し、予防のためにも、臨床的病態の経過の間にも実施され得る。治療の望ましい効果は、これらに限定されるものではないが、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患による任意の直接的または間接的な病理的影響の減弱、転移の防止、疾患の進行速度の低減、疾患状態の回復または緩和、および寛解または改善された予後を含む。いくつかの態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅らせる、または疾患の進行を遅くするために用いられる。
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体を抗原へと結合させることに関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインのことをいう。天然型抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は、通常、各ドメインが4つの保存されたフレームワーク領域 (FR) および3つの超可変領域 (HVR) を含む、類似の構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 参照。）1つのVHまたはVLドメインで、抗原結合特異性を与えるに充分であろう。さらに、ある特定の抗原に結合する抗体は、当該抗原に結合する抗体からのVHまたはVLドメインを使ってそれぞれVLまたはVHドメインの相補的ライブラリーをスクリーニングして、単離されてもよい。例えばPortolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)； Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991) 参照。
本明細書で用いられる用語「ベクター」は、それが連結されたもう1つの核酸を増やすことができる、核酸分子のことをいう。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、および、それが導入された宿主細胞のゲノム中に組み入れられるベクターを含む。あるベクターは、自身が動作的に連結された核酸の、発現をもたらすことができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」とも称される。
ＩＩ．組成物および方法
一局面において、本発明は、抗C1S抗体およびその使用に一部基づくものである。特定の態様において、C1Sに結合する抗体が提供される。本発明の抗体は、例えば、補体介在性の疾患または障害の診断または治療のために、有用である。
A. 例示的な抗C1s抗体
一局面において、本発明は、C1sに結合する単離された抗体を提供する。一局面において、本発明は、C1sに結合する単離された抗体であって、その結合活性がイオン濃度に依存して変化する、抗体を提供する。特定の態様において、抗C1s抗体の結合活性は、pH、すなわち水素イオン（プロトン）濃度に依存して変化する。特定の態様において、抗C1s抗体の結合活性は、カルシウム濃度に依存して変化する。特定の態様において、抗C1s抗体の結合活性は、pHおよびカルシウム濃度の両方に依存して変化する。そのような抗体は、患者における用量および投与頻度を減らすことができ、結果としてその総用量を減らすことができるため、医薬品として特に優れていると予想される。
一局面において、本発明の単離された抗C1s抗体について、中性pHおよび酸性pHの両方において高カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのそのC1s結合活性のKD値に対する酸性pHでのそのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）は2以上である。一局面において、本発明の単離された抗C1s抗体について、中性pHおよび酸性pHの両方において高カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのそのC1s結合活性のkoff値に対する酸性pHでのそのC1s結合活性のkoff値の比（koff(酸性pH)/koff(中性pH)）は2以上である。一局面において、本発明の単離された抗C1s抗体について、中性pHにおける高カルシウム濃度下および酸性pHにおける低カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのそのC1s結合活性のKD値に対する酸性pHでのそのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）は5以上である。いくつかの態様において、本発明の単離された抗C1s抗体について、中性pHおよび酸性pHの両方において低カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのそのC1s結合活性のKD値に対する酸性pHでのそのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）は2以上であり、ここで該抗C1s抗体は二量体状態のC1sに結合する。いくつかの態様において、本発明の単離された抗C1s抗体について、中性pHおよび酸性pHの両方において低カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのそのC1s結合活性のkoff値に対する酸性pHでのそのC1s結合活性のkoff値の比（koff(酸性pH)/koff(中性pH)）は2以上であり、ここで該抗C1s抗体は二量体状態のC1sに結合する。
特定の理論に縛られるわけではないが、1）本発明の抗体によって結合されるC1sのエピトープ構造がカルシウムの非存在によって立体構造的に変化し得、それによって抗体のアフィニティが変わる場合、または2）本発明の抗体の相互作用（アフィニティ型もしくはアビディティ型）がC1sの状態（単量体状態もしくは二量体状態）に依存して変化し得る場合、KD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）を評価するために、特定の条件（中性pHにおける高カルシウム濃度下および酸性pHにおける低カルシウム濃度下）を使用する測定が使用され得る。
換言すると、本発明の抗体は、以下の（i）または（iii）に記載されるように酸性pHよりも中性pHにおいて高いアフィニティでC1sに結合する：
（i）中性pHおよび酸性pHの両方において高カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのC1s結合活性のKD値に対する酸性pHでのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）が2以上である、
（ii）中性pHおよび酸性pHの両方において高カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのC1s結合活性のkoff値に対する酸性pHでのC1s結合活性のkoff値の比（koff(酸性pH)/koff(中性pH)）が2以上である、
（iii）中性pHにおける高カルシウム濃度下および酸性pHにおける低カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのC1s結合活性のKD値に対する酸性pHでのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）が5以上である。
より一般的には、特定の理論に縛られるわけではないが、1）本発明の抗体によって結合される特定の抗原のエピトープ構造がカルシウムの非存在によって立体構造的に変化し得、それによって抗体のアフィニティが変わる場合、または2）本発明の抗体の相互作用（アフィニティ型もしくはアビディティ型）が抗原の状態（単量体状態もしくは二量体状態）に依存して変化し得る場合、KD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）を評価するために特定の条件（中性pHにおける高カルシウム濃度下および酸性pHにおける低カルシウム濃度下）を使用する測定が使用され得る。この比が高い場合、酸性pHにおけるアフィニティは、中性pHにおけるアフィニティよりも低い。あるいは、以下で言及されているように、KDは、koff/konの比として定義される。酸性条件と中性条件の間のkoff値の比、すなわち（koff(酸性pH)/koff(中性pH)）もまた、酸性pHにおけるアフィニティと中性pHにおけるアフィニティとの間の比較のために使用され得る。
したがって、本発明の抗体は、以下のように酸性pHよりも中性pHにおいて高いアフィニティで抗原に結合する：中性pHにおける高カルシウム濃度下および酸性pHにおける低カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHにおける抗原結合活性のKD値に対する酸性pHにおける抗原結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）が5以上である。
一局面において、本発明の単離された抗C1s抗体について、中性pHおよび酸性pHの両方において高カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのそのC1s結合活性のKD値に対する酸性pHでのそのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）が2以上であり、ここで該抗体は、CDR-H1（SEQ ID NO:23）、CDR-H2（SEQ ID NO:24）、CDR-H3（SEQ ID NO:25）、CDR-L1（SEQ ID NO:26）、CDR-L2（SEQ ID NO:27）およびCDR-L3（SEQ ID NO:28）を含まない。
一局面において、本発明の単離された抗C1s抗体について、中性pHにおける高カルシウム濃度下および酸性pHにおける低カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのそのC1s結合活性のKD値に対する酸性pHでのそのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）は5以上であり、ここで該抗体は、CDR-H1（SEQ ID NO:23）、CDR-H2（SEQ ID NO:24）、CDR-H3（SEQ ID NO:25）、CDR-L1（SEQ ID NO:26）、CDR-L2（SEQ ID NO:27）およびCDR-L3（SEQ ID NO:28）を含まない。
一局面において、本発明の単離された抗C1s抗体について、中性および酸性pHの両方において低カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのそのC1s結合活性のKD値に対する酸性pHでのそのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）は2以上であり、ここで該抗C1s抗体は二量体状態のC1sに結合し、ここで該抗体は、CDR-H1（SEQ ID NO:23）、CDR-H2（SEQ ID NO:24）、CDR-H3（SEQ ID NO:25）、CDR-L1（SEQ ID NO:26）、CDR-L2（SEQ ID NO:27）およびCDR-L3（SEQ ID NO:28）を含まない。
上記のKD比、すなわちKD(酸性pH)/KD(中性pH)は、親抗体（すなわち、本発明の改変前の元の抗体）と当該元の（親）抗体に対して1つまたは複数のアミノ酸変異（例えば、付加、挿入、欠失または置換）が導入された抗体との間で比較され得る。元の（親）抗体は、それがC1sに特異的に結合する限り、任意の公知の抗体または新たに単離された抗体であり得る。したがって、一局面において、本発明の単離された抗C1s抗体について、中性pHでのC1s結合活性のKD値に対する酸性pHでのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）は、その元の（親）抗体の中性pHでのC1s結合活性のKD値に対する酸性pHでのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）よりも少なくとも1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3倍、3.5倍、4倍、5倍、8倍、10倍高い。換言すると、本発明は、親（元の）抗体に1つまたは複数のアミノ酸変異（例えば、付加、挿入、欠失または置換）が導入され、以下の（ii）に対する（i）の比が少なくとも1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.5、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、5、8または10である、単離された抗C1s抗体を提供する：（i）単離された抗C1s抗体の中性pHでのC1s結合活性のKD値に対する酸性pHでのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）；（ii）親（元の）抗体の中性pHでのC1s結合活性のKD値に対する酸性pHでのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）。これらのKD比は、任意の（高または低）カルシウム濃度下で測定され得る、例えば、中性pHおよび酸性pHの両方において高カルシウム濃度下で測定され得る、または中性pHにおける高カルシウム濃度下および酸性pHにおける低カルシウム濃度下で測定され得る。さらなる局面において、前記のKDに代えて解離速度定数（kd）を使用してpHおよび/またはCa依存性を評価することが可能である。
一局面において、本発明の抗体は、細胞内条件と細胞外条件の間で異なる抗原結合活性を有する。細胞内条件および細胞外条件は、細胞の内部と外部の間の異なる条件のことをいう。条件のカテゴリーには、例えば、イオン濃度、より具体的には金属イオン濃度、水素イオン濃度（pH）およびカルシウムイオン濃度が含まれる。「細胞内条件」は、好ましくは、エンドソーム内の環境に特徴的な環境のことをいい、「細胞外条件」は、好ましくは、血漿中の環境に特徴的な環境のことをいう。イオン濃度に応じて変化する抗原結合活性を有するという特性を持つ抗体は、そのような特性を有するドメインについて多数の抗体をスクリーニングすることによって取得され得る。例えば、上記の特性を有する抗体は、その配列が相互に異なる多数の抗体をハイブリドーマ法または抗体ライブラリー法によって産生し、異なるイオン濃度下でそれらの抗原結合活性を測定することによって取得され得る。B細胞クローニング法は、そのような抗体をスクリーニングする方法の例の1つである。さらに、以下に記載されるように、イオン濃度に応じて変化する抗原結合活性を有するという特性を抗体に付与し得る少なくとも1つの特徴的なアミノ酸残基が特定され、当該特徴的なアミノ酸残基を共通構造として共有しつつ異なる配列を有する多数の抗体のライブラリーが調製される。そのようなライブラリーは、上記の特性を有する抗体を効果的に単離するためにスクリーニングされ得る。
一局面において、本発明は、酸性pHよりも中性pHにおいて高いアフィニティでC1sに結合する抗体を提供する。別の局面において、本発明は、C1sに対してpH依存的結合を示す抗C1s抗体を提供する。本明細書で使用される表現「pH依存的結合」は、「中性pHでの結合と比較して低下した、酸性pHでの結合」を意味し、両表現は交換可能であり得る。例えば、「pH依存的結合特性を有する」抗C1s抗体には、酸性pHよりも中性pHにおいて高いアフィニティでC1sに結合する抗体が含まれる。
特定の態様において、中性pHおよび酸性pHの両方において高カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのC1s結合活性のKD値に対する酸性pHでのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）は、2以上である。特定の態様において、本発明の抗体は、中性pHにおいて、酸性pHにおけるよりも少なくとも2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000倍、またはそれより高いアフィニティでC1sに結合する。
特定の態様において、中性pHおよび酸性pHの両方において高カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのC1s結合活性のKoff値に対する酸性pHでのC1s結合活性のKoff値の比（Koff(酸性pH)/Koff(中性pH)）は、2以上である。特定の態様において、本発明の抗体は、中性pHにおいて、酸性pHにおけるよりも少なくとも2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000倍、またはそれより高いアフィニティでC1sに結合する。
特定の態様において、中性pHにおける高カルシウム濃度下および酸性pHにおける低カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのC1s結合活性のKD値に対する酸性pHでのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）は、2以上である。特定の態様において、本発明の抗体は、中性pHにおいて、酸性pHにおけるよりも少なくとも2、3、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000倍、またはそれより高いアフィニティでC1sに結合する。
上記の例において、例えば、酸性pHは5.8であり、中性pHは7.4であり、したがってKD(酸性pH)/KD(中性pH)は、KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)である。これに関して、酸性pHおよび中性pHの例が、本明細書において詳細に後記されている。いくつかの態様において、KD(酸性pH)/KD(中性pH)、例えばKD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)は、2～10,000であり得る。上記の例において、例えば、酸性pHは5.8であり、中性pHは7.4であり、したがってkoff(酸性pH)/koff(中性pH)は、koff(pH 5.8)/koff(pH 7.4)である。これに関して、酸性pHおよび中性pHの例が、本明細書において詳細に後記されている。いくつかの態様において、koff(酸性pH)/koff(中性pH)、例えばkoff(pH 5.8)/koff(pH 7.4)は、2～10,000であり得る。
抗原が可溶性タンパク質である場合、抗体が抗原自身よりも血漿中で長い半減期を有し得かつ抗原のキャリアとして機能し得るため、抗体の抗原への結合は、抗原の血漿中半減期の延長（すなわち、血漿からの抗原のクリアランスの低減）をもたらし得る。これは、細胞内のエンドソーム経路を介したFcRnによる抗原-抗体複合体のリサイクルに起因する（Roopenian and Akilesh (2007) Nat Rev Immunol 7(9): 715-725）。しかし、中性の細胞外環境下では抗原に結合するが細胞内への侵入後は酸性のエンドソーム区画内に抗原を放出する、pH依存的結合特性を有する抗体は、pH非依存的様式で結合する対応物に比べて抗原の中和およびクリアランスの点で優れた特性を有すると予想される（Igawa et al (2010) Nature Biotechnol 28(11); 1203-1207; Devanaboyina et al (2013) mAbs 5(6): 851-859; 国際特許出願公開番号：WO 2009/125825）。
一局面において、本発明は、低カルシウム濃度条件下よりも高カルシウム濃度条件下において高いアフィニティでC1sに結合する抗体を提供する。
本発明において、好ましい金属イオンには、例えば、カルシウムイオンが含まれる。カルシウムイオンは、筋肉、例えば骨格筋、平滑筋および心筋の収縮；白血球の運動、食作用等の活性化；血小板の形状変化、分泌等の活性化；リンパ球の活性化；ヒスタミンの分泌を含むマスト細胞の活性化；カテコールアミンアルファ受容体またはアセチルコリン受容体により媒介される細胞応答；エクソサイトーシス；ニューロン末端からの伝達物質の放出；ならびにニューロンにおける軸索流を含む、多くの生物学的現象の調整に関与する。公知の細胞内カルシウムイオン受容体には、トロポニンC、カルモジュリン、パルブアルブミンおよびミオシン軽鎖が含まれ、これらは、いくつかのカルシウムイオン結合部位を有し、分子進化の点で共通起源から派生していると考えられている。また、多くのカルシウム結合モチーフが公知となっている。そのような周知のモチーフには、例えば、カドヘリンドメイン、カルモジュリンのEFハンド、プロテインキナーゼCのC2ドメイン、血液凝固タンパク質第IX因子のGlaドメイン、アシアロ糖タンパク質受容体およびマンノース結合受容体のC型レクチン、LDL受容体のAドメイン、アネキシン、トロンボスポンジン3型ドメインならびにEGF様ドメインが含まれる。
本発明においては、金属イオンがカルシウムイオンの場合には、高カルシウムイオン濃度条件下における抗原結合活性よりも低カルシウムイオン濃度条件下における抗原結合活性の方が低いことが望ましい。一方、細胞内カルシウムイオン濃度は、細胞外カルシウムイオン濃度よりも低い。逆に、細胞外カルシウムイオン濃度は、細胞内カルシウムイオン濃度よりも高い。本発明において、低カルシウムイオン濃度は、好ましくは0.1μM～30μMであり、より好ましくは0.5μM～10μMであり、特に好ましくは生体内の早期エンドソーム内のカルシウムイオン濃度に近い1μM～5μMである。一方、本発明において、高カルシウムイオン濃度は、好ましくは100μM～10μMであり、より好ましくは200μM～5 mMであり、特に好ましくは血漿中（血中）のカルシウムイオン濃度に近い0.5 mM～2.5 mMである。本発明では、低カルシウムイオン濃度がエンドソーム内のカルシウムイオン濃度であり、高カルシウムイオン濃度が血漿中のカルシウムイオン濃度であることが好ましい。抗原結合活性のレベルを低カルシウムイオン濃度下と高カルシウムイオン濃度下で比較した場合、本発明の抗体の結合は、低カルシウムイオン濃度下よりも高カルシウムイオン濃度下で強いことが好ましい。換言すると、本発明の抗体の抗原結合活性は、高カルシウムイオン濃度下よりも低カルシウムイオン濃度下で低いことが好ましい。結合活性のレベルを解離定数（KD）で表す場合、KD(低カルシウムイオン濃度)/KD(高カルシウムイオン濃度)の値は1より大きく、好ましくは2以上であり、さらにより好ましくは10以上であり、さらにより好ましくは40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000、またはそれより大きい。KD(低カルシウムイオン濃度)/KD(高カルシウムイオン濃度)の値の上限は特に限定されず、当業者の技術において作製可能な限り、100、400、1000、または10000等、いかなる値でもよい。KDの代わりに解離速度定数（kd）を用いることも可能である。KD値を計算することが困難である場合は、Biacoreにおいて同じ濃度でアナライトを流したときの結合反応性のレベルに基づいて活性を評価してもよい。本発明の抗原結合分子を固定化したチップ上に抗原を流した場合、低カルシウム濃度下での結合反応性は、高カルシウム濃度下での結合反応性の好ましくは1/2以下であり、より好ましくは1/3以下であり、さらにより好ましくは1/5以下であり、特に好ましくは1/10以下である。一般に、生体内の細胞外（例えば血漿中）のカルシウムイオン濃度は高く、細胞内（例えばエンドソーム内）のカルシウムイオン濃度は低いことが知られている。そのため本発明では、細胞外条件が高カルシウムイオン濃度であり、細胞内条件が低カルシウムイオン濃度であることが好ましい。細胞外のカルシウムイオン濃度条件下に比べて細胞内のカルシウムイオン濃度条件下では抗原結合活性が低いという特性を本発明の抗原結合分子（例えば、抗体）に付与する場合、細胞外で本発明の抗原結合分子に結合した抗原は細胞内で本発明の抗原結合分子から解離し、それによって細胞外から細胞内への抗原の取り込みが増強される。そのような抗体を生体に投与する場合、血漿中の抗原濃度を低下させ、生体における抗原の生理活性を低減させることが可能となるので、本発明の抗体は有用である。高カルシウムイオン濃度条件に比べて低カルシウムイオン濃度条件下で抗原結合活性が低い抗原結合ドメインまたは抗体をスクリーニングする方法には、例えばWO2012/073992（例えば、段落0200～0213）に記載の方法が含まれる。高カルシウムイオン濃度条件に比べて低カルシウムイオン濃度条件下で抗原に弱く結合する特性を本発明の抗原結合ドメインに付与する方法は特に限定されず、いかなる方法によって行われてもよい。具体的には、その方法は、特願2011-218006号に記載されており、例えば、抗原結合ドメインにおいて、少なくとも1つのアミノ酸残基を、金属キレート作用を有するアミノ酸残基に置換する方法、および/または金属キレート作用を有する少なくとも1つのアミノ酸残基を抗原結合ドメインに挿入する方法を含む。抗原結合ドメインの少なくとも1つのアミノ酸残基が金属キレート作用を有するアミノ酸残基に置換されている、および/または金属キレート作用を有する少なくとも1つのアミノ酸残基が抗原結合ドメインに挿入されている本発明の抗原結合分子は、本発明の抗原結合分子の好ましい態様の1つである。
金属キレート作用を有するアミノ酸残基は、好ましくは、例えば、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。また、カルシウムイオン濃度に応じて抗原結合ドメインの抗原結合活性を変化させるアミノ酸残基は、好ましくは、例えば、カルシウム結合モチーフを形成するアミノ酸残基を含む。カルシウム結合モチーフは、当業者に周知であり、詳細に報告されている（例えば、Springer et al., (Cell (2000) 102, 275-277); Kawasaki and Kretsinger (Protein Prof. (1995) 2, 305-490); Moncrief et al., (J. Mol. Evol. (1990) 30, 522-562); Chauvaux et al., (Biochem. J. (1990) 265, 261-265); Bairoch and Cox (FEBS Lett. (1990) 269, 454-456); Davis (New Biol. (1990) 2, 410-419); Schaefer et al., (Genomics (1995) 25, 638 to 643); Economou et al., (EMBO J. (1990) 9, 349- 354); Wurzburg et al., (Structure. (2006) 14, 6, 1049-1058)）。トロポニンC、カルモジュリン、パルブアルブミン、およびミオシン軽鎖のEFハンド；プロテインキナーゼCのC2ドメイン；血液凝固タンパク質第IX因子のGlaドメイン；アシアロ糖タンパク質受容体およびマンノース結合受容体、ASGPR、CD23、およびDC-SIGNのC型レクチン；LDL受容体のAドメイン；アネキシンドメイン；カドヘリンドメイン；トロンボスポンジン3型ドメイン；ならびにEGF様ドメインが、カルシウム結合モチーフとして好適に使用される。
本発明の抗原結合ドメインには、前記の金属キレート作用を有するアミノ酸残基やカルシウム結合モチーフを形成するアミノ酸残基などのカルシウムイオン濃度に応じて抗原結合活性を変化させるアミノ酸残基が含まれ得る。抗原結合ドメイン内でのそのようなアミノ酸残基の位置は特に限定されず、カルシウムイオン濃度に応じて抗原結合活性が変化する限り、どのような位置であってもよい。また、カルシウムイオン濃度に応じて抗原結合活性を変化させる限り、そのようなアミノ酸残基が単独で含まれていてもよいし、二つ以上組み合わされて含まれていてもよい。そのようなアミノ酸残基としては、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸およびグルタミン酸が好適に例示される。抗原結合ドメインが抗体の可変領域である場合、重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域にそれらのアミノ酸残基を含むことができる。好ましい態様において、それらのアミノ酸残基が重鎖可変領域のCDR3に含まれていてもよく、より好ましくは重鎖可変領域のCDR3のKabatナンバリングで表される95位、96位、100a位および/または101位に含まれていてもよい。
別の好ましい態様において、それらのアミノ酸残基が軽鎖可変領域のCDR1に含まれていてもよく、より好ましくは軽鎖可変領域のCDR1のKabatナンバリングで表される30位、31位および/または32位に含まれていてもよい。また別の好ましい態様において、それらのアミノ酸残基が軽鎖可変領域のCDR2に含まれていてもよく、より好ましくは軽鎖可変領域のCDR2のKabatナンバリングで表される50位に含まれていてもよい。また別の好ましい態様において、それらのアミノ酸残基が軽鎖可変領域のCDR3に含まれていてもよく、より好ましくは軽鎖可変領域のCDR3のKabatナンバリングで表される92位に含まれていてもよい。
また、前記の態様は組み合わせられてもよく、例えば軽鎖可変領域のCDR1、CDR2およびCDR3から選択される2つまたは3つのCDRに当該アミノ酸残基が含まれていてもよく、より好ましくは、軽鎖可変領域のKabatナンバリングで表される30位、31位、32位、50位および/または92位のいずれか1つ以上に含まれていてもよい。
前記のようなカルシウムイオン濃度に応じて抗原結合活性を変化させるアミノ酸残基を共通の構造として有しつつ互いに配列の異なる多数の抗原結合ドメインをライブラリーとして作製し、そうしたライブラリーの中からスクリーニングを行なうことによって、所望の抗原に対する結合活性を有し、なおかつカルシウムイオン濃度に応じて抗原結合活性が変化する抗原結合ドメインを効率的に取得することができる。
C1sに対する抗体の「アフィニティ」は、本開示の目的では、その抗体のKDで表される。抗体のKDは、抗体-抗原相互作用の平衡解離定数を指す。その抗原に対する抗体の結合のKD値が大きいほど、当該特定の抗原に対するその結合アフィニティは弱い。したがって、本明細書で使用される表現「酸性pHによりも中性pHにおいて高いアフィニティ」（または同等の表現「pH依存的結合」）は、酸性pHでの抗体のKDが中性pHでの抗体のKDよりも大きいことを意味する。例えば、本発明の文脈において、酸性pHでの抗体のC1sへの結合のKDが中性pHでの抗体のC1sへの結合のKDよりも少なくとも2倍大きい場合、当該抗体は、酸性pHよりも中性pHにおいて高いアフィニティでC1sに結合するとみなされる。したがって、本発明は、中性pHでの抗体のC1sへの結合のKDよりも少なくとも2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000倍、またはそれ以上大きいKDで酸性pHにおいてC1sに結合する抗体を含む。別の態様において、中性pHでの該抗体のKD値は、10-7 M、10-8 M、10-9 M、10-10 M、10-11 M、10-12 M、またはそれ未満であり得る。別の態様において、酸性pHでの該抗体のKD値は、10-9 M、10-8 M、10-7 M、10-6 M、またはそれ以上であり得る。
特定の抗原に対する結合特性はまた、抗体のkdで表され得る。抗体のkdは、特定の抗原に対する抗体の解離速度定数を指し、秒の逆数（すなわち、sec-1）の単位で表される。kd値の増加は、抗体のその抗原への結合がより弱いことを意味する。したがって、本発明は、中性pHよりも酸性pHにおいて高いkd値でC1sに結合する抗体を含む。本発明は、中性pHにおけるC1sに対する抗体の結合のkdよりも少なくとも2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000倍、またはそれ以上大きいkdで酸性pHにおいてC1sに結合する抗体を含む。別の態様において、中性pHでの抗体のkd値は、10-2 1/s、10-3 1/s、10-4 1/s、10-5 1/s、10-6 1/s、またはそれ未満であり得る。別の態様において、酸性pHでの抗体のkd値は、10-3 1/s、10-2 1/s、10-1 1/s、またはそれ以上であり得る。
特定の例において、「中性pHでの結合と比較して低下した、酸性pHでの結合」は、中性pHでの抗体のKD値に対する酸性pHでの抗体のKD値の比（またはその逆）で表される。例えば、抗体が2以上の酸性/中性KD比を示す場合、本発明の目的に関して、その抗体は「中性pHでのC1sへの結合と比較して低下した、酸性pHでのC1sへの結合」を示すとみなされ得る。特定の例示的な態様において、本発明の抗体における酸性/中性KD比は、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000倍、またはそれ以上であり得る。別の態様において、中性pHでの抗体のKD値は、10-7 M、10-8 M、10-9 M、10-10 M、10-11 M、10-12 M、またはそれ未満であり得る。別の態様において、酸性pHでの抗体のKD値は、10-9 M、10-8 M、10-7 M、10-6 M、またはそれ以上であり得る。
あるいは、「中性pHでの結合と比較して低下した、酸性pHでの結合」は、中性pHでの抗体のkoff値に対する酸性pHでの抗体のkoff値の比（またはその逆）で表される。例えば、抗体が2以上の酸性/中性koff比を示す場合、本発明の目的に関して、その抗体は「中性pHでのC1sへの結合と比較して低下した、酸性pHでのC1sへの結合」を示すとみなされ得る。特定の例示的な態様において、本発明の抗体における酸性/中性koff比は、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000倍、またはそれ以上であり得る。
特定の例において、「中性pHでの結合と比較して低下した、酸性pHでの結合」は、中性pHでの抗体のkd値に対する酸性pHでの抗体のkd値の比（またはその逆）で表される。例えば、抗体が2以上の酸性/中性kd比を示す場合、本発明の目的に関して、その抗体は「中性pHでのC1sへの結合と比較して低下した、酸性pHでのC1sへの結合」を示すとみなされ得る。特定の例示的な態様において、本発明の抗体における酸性/中性kd比は、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000倍、またはそれ以上であり得る。別の態様において、中性pHでの抗体のkd値は、10-2 1/s、10-3 1/s、10-4 1/s、10-5 1/s、10-6 1/s、またはそれ未満であり得る。別の態様において、酸性pHでの抗体のkd値は、10-3 1/s、10-2 1/s、10-1 1/s、またはそれ以上であり得る。
特定の態様において、pHおよび/またはCa依存性を有する本発明の抗C1s抗体の、中性pHでのC1s結合活性のKD値に対する酸性pHでのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）は、以下の1)～5)からなる群より選択される参照抗体のそれと同じまたはそれより大きい。
1) それぞれSEQ ID NO:19およびSEQ ID NO:20におけるVHおよびVL配列を含む抗体、
2) それぞれSEQ ID NO:17およびSEQ ID NO:18におけるVHおよびVL配列を含む抗体、
3) それぞれSEQ ID NO:22およびSEQ ID NO:20におけるVHおよびVL配列を含む抗体、
4) それぞれSEQ ID NO:19およびSEQ ID NO:21におけるVHおよびVL配列を含む抗体、ならびに
5) それぞれSEQ ID NO:22およびSEQ ID NO:21におけるVHおよびVL配列を含む抗体。
さらなる態様において、実施例4にて開示されるIPN92H0288-SG4GK/IPN93L0211-SK1、 IPN92H0288-SG4GK/IPN93L0058-SK1、およびIPN92H0307-SG4GK/IPN93L0058-SK1等の抗C1s抗体が、前記参照抗体として使用され得る。
本明細書で使用される表現「酸性pH」は、pH 4.0～6.5を意味する。表現「酸性pH」には、pH値4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、および6.5が含まれる。特定の局面において、「酸性pH」は5.8または6.0である。
本明細書で使用される表現「中性pH」は、pH 6.7～約10.0を意味する。表現「中性pH」には、pH値6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、および10.0が含まれる。特定の局面において、「中性pH」は7.0または7.4である。
本明細書で使用される表現「高カルシウム濃度条件下」または「高カルシウム濃度下」は、100μM～10 mM、より好ましくは200μM～5 mM、特に好ましくは血漿中（血中）のカルシウムイオン濃度に近い0.5 mM～2.5 mMを意味する。表現「高カルシウム濃度条件下」または「高カルシウム濃度において」は、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μM、0.5 mM、0.7 mM、0.9 mM、1 mM、1.2 mM、1.4 mM、1.6 mM、1.8 mM、2.0 mM、2.2 mM、2.4 mM、2.5 mM、3 mM、4 mM、5 mM、6 mM、7 mM、8 mM、9 mMおよび10 mM Ca2+のカルシウム濃度値を含む。特定の局面において、「高カルシウム濃度条件下」または「高カルシウム濃度下」は1.2 mM Ca2+を表す。
本明細書で使用される表現「低カルシウム濃度条件下」または「低カルシウム濃度下」は、0.1μM～30μM、より好ましくは0.5μM～10μM、特に好ましくは生体内の早期エンドソーム内のカルシウムイオン濃度に近い1μM～5μMを意味する。表現「低カルシウム濃度条件下」または「低カルシウム濃度において」は、0.1μM、0.5μM、1μM、1.5μM、2.0μM、2.5μM、2.6μM、2.7μM、2.8μM、2.9μM、3.0μM、3.1μM、3.2μM、3.3μM、3.4μM、3.5μM、4.0μM、5.0μM、6.0μM、7.0μM、8.0μM、9.0μM、10μM、15μM、20μM、25μMおよび30μM Ca2+のカルシウム濃度値を含む。特定の局面において、「低カルシウム濃度条件下」または「低カルシウム濃度下」は、3.0μM Ca2+を表す。
本明細書で表されるKD値およびkd値を、表面プラズモン共鳴に基づくバイオセンサを用いて決定して、抗体-抗原相互作用を特徴づけることができる。（例えば、本明細書の実施例2を参照されたい。）KD値およびkd値は、摂氏25度（℃）または37℃で決定され得る。この決定は、150 mM NaClの存在下で実施され得る。いくつかの態様において、この決定は、抗体を固定化し、抗原をアナライトとして用い、以下の条件を使用する表面プラズモン共鳴技術を用いて実施され得る：摂氏37度（℃）で10 mM MES緩衝液、0.05％モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタンおよび150 mM NaCl。
一局面において、本発明は、pH依存性を有する抗C1s抗体であって、可変領域に少なくとも1つのヒスチジンを含み、可変領域の少なくとも1つのアミノ酸が、
1）抗体の酸性pHおよび/もしくは中性pHにおける非特異的結合活性が低下するように、または
2）中性pHでのC1s結合活性のKD値に対する酸性pHでのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）が大きくなるように
他のアミノ酸で置換されている、抗体を提供する。
一局面において、本発明は、pH依存性を有する抗C1s抗体であって、可変領域に少なくとも1つのヒスチジンを含み、可変領域の少なくとも1つのアミノ酸が、
1）抗体の酸性pHおよび/もしくは中性pHにおける非特異的結合活性が低下するように、または
2）中性pHでのC1s結合活性のKD値に対する酸性pHでのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）が大きくなるように
D、E、K、RおよびQからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている、抗体を提供する。
特定の態様において、表現「非特異的結合活性」は、抗体の細胞外マトリクス（ECM）結合活性を意味する。特定の局面において、表現「非特異的結合活性」は、酸性pHでの抗体のECM結合活性を意味する。特定の態様において、酸性pHでのECM結合活性が低下するように、本発明の抗C1s抗体における少なくとも1つのアミノ酸が1つまたは複数のアミノ酸で置換されていてもよい。特定の態様において、中性pHでのECM結合活性が低下するように、本発明の抗C1s抗体の少なくとも1つのアミノ酸が1つまたは複数のアミノ酸で置換されていてもよい。
一局面において、本発明は、pH依存性を有する抗C1s抗体であって、該抗体のECM結合活性が低下するように、可変領域において少なくとも1つのアミノ酸が置換されている、抗体を提供する。特定の態様において、酸性pHでのECM結合活性が低下している。特定の態様において、中性pHでのECM結合活性が低下している。特定の態様において、そのような抗体は、そのような変更を有さない親抗体と比較して1つまたは複数の超可変領域（HVR）に1つまたは複数の変更を有する抗体であって、そのような変更が抗原に対する抗体のECM結合活性を改善する、すなわち、ECM結合活性を低下させる、抗体を指す。
「細胞外マトリクスとの結合」を測定する方法は特に限定されず、細胞外マトリクスを固定化したプレートにポリペプチドを添加し、そのポリペプチドに対する標識された抗体を添加することによって、ポリペプチドと細胞外マトリクスの間の結合を検出するELISAシステムを用いて、測定を実施することができる。特に、細胞外マトリクス結合能をより高感度で検出することができるという理由から、電気化学発光（ECL）法を用いる測定法が好ましい。具体的には、細胞外マトリクスを固定化したプレートにポリペプチドおよびルテニウム抗体の混合物を添加し、ルテニウムの電気化学発光を測定するECLシステムを用いて、ポリペプチドと細胞外マトリクスの間の結合を測定することができる。添加するポリペプチドの濃度は任意に設定することができるが、細胞外マトリクス結合の検出感度を増大させるためには高濃度で添加することが好ましい。本発明において使用される細胞外マトリクスは、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、エンタクチン、フィブリン、およびペルレカン等の糖タンパク質を含む限り、植物由来であっても動物由来であってもよいが、本発明においては動物由来の細胞外マトリクスが好ましく、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、およびイヌ等の動物に由来する細胞外マトリクスを使用することができる。特に、ヒトにおける薬物動態の改善をモニタリングするためには、ヒト由来の天然ヒト細胞外マトリクスが好ましい。さらに、細胞外マトリクスに対するポリペプチドの結合を評価するための条件は、pH 7.4付近の中性範囲（生理学的条件）が望ましいが、中性範囲内である必要はなく、酸性範囲（pH 6.0付近）で評価を実施してもよい。さらに、細胞外マトリクスに対するポリペプチドの結合を評価する際、細胞外マトリクスに対するポリペプチド/抗原分子複合体の結合を評価するために、ポリペプチドが結合する抗原分子が共存するようにしてもよい。
いくつかの態様において、酸性pHでの抗体の非特異的結合活性が低下するかどうかは、例えば、他段落で言及されるELISAまたはECLを用いることによって、測定することができる（例えば、実施例4を参照のこと）。さらなる態様において、本発明の単離された抗C1s抗体について、ECM結合の値は、親抗体（すなわち、D、E、K、Rおよび/またはQ置換前の元の抗体）と、元の（親）抗体に1つまたは複数のアミノ酸置換（D、E、K、Rおよび/またはQ）を導入した抗体との間で比較され得る（ただし、該抗体は可変領域に少なくとも1つのヒスチジンを含む）。元の（親）抗体は、C1sに特異的に結合する限り、任意の公知抗体であっても新たに単離された抗体であってもよい。したがって、一局面において、本発明の単離された抗C1s抗体について、置換された抗体のECM結合の値は、元の（親）抗体のECM結合の値より少なくとも1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、5倍、8倍、10倍低い。
特定の理論に縛られるわけではないが、抗体のヒスチジン残基は、その抗体のそのヒスチジン残基の周囲の様々な残基と相互作用し得る。そのような相互作用は、抗体の構造またはCDRの立体構造に影響を及ぼし得る。ヒスチジンは、酸性pHにおいてプロトン化して正に荷電する。正荷電残基（例えば、アルギニンまたはリジン）をヒスチジンの周囲の位置に導入すると、酸性pHにおいて正荷電残基とプロトン化したヒスチジンとの間に反発が引き起こされ、それによってその抗体またはCDRの構造変化または立体構造変化が誘導される。同様に、負荷電残基（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）をヒスチジンの周囲の位置に導入すると、酸性pHにおいて負荷電残基とプロトン化したヒスチジンとの間に相互作用が引き起こされ、それによってその抗体またはCDRの構造変化または立体構造変化が誘導される。酸性pHにおいて起こる抗体またはCDRのこれらの構造変化または立体構造変化は、抗体の抗原結合に影響を及ぼし、酸性pHでの抗体の抗原への結合アフィニティを低下させ得る。まとめると、抗体のヒスチジン残基の周囲の位置への荷電残基（例えば、アルギニン、リジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸）の導入は、酸性pHでの抗原に対する抗体の結合アフィニティを低下させ、それによって抗体-抗原相互作用のpH依存性を独特のメカニズムで改善し得る。
一局面において、本発明は、中性pHでの抗原結合活性のKD値に対する酸性pHでの抗体の抗原結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）を増加させる方法であって、
1）可変領域に少なくとも1つのヒスチジンを含む、pH依存性を有する抗体を提供する工程、
2）抗体の可変領域の少なくとも1つのアミノ酸を、D、E、K、R、QおよびHからなる群より選択されるアミノ酸で置換する工程、
を含む方法を提供する。
一局面において、本発明は、血漿からの抗原のクリアランス（除去）を増強する方法であって、
1）可変領域に少なくとも1つのヒスチジンを含む、pH依存性を有する抗体を提供する工程、
2）抗体の可変領域の少なくとも1つのアミノ酸を、D、E、K、R、QおよびHからなる群より選択されるアミノ酸で置換する工程、
を含む方法を提供する。
一局面において、本発明は、抗原結合分子を介した抗原の細胞内への取り込みを促進する方法であって、
1）可変領域に少なくとも1つのヒスチジンを含む、pH依存性を有する抗体を提供する工程、
2）抗体の可変領域の少なくとも1つのアミノ酸を、D、E、K、R、QおよびHからなる群より選択されるアミノ酸で置換する工程、
を含む方法を提供する。
一局面において、本発明は、1つの抗原結合分子が結合することができる抗原の数を増加させる方法であって、
1）可変領域に少なくとも1つのヒスチジンを含む、pH依存性を有する抗体を提供する工程、
2）抗体の可変領域の少なくとも1つのアミノ酸を、D、E、K、R、QおよびHからなる群より選択されるアミノ酸で置換する工程、
を含む方法を提供する。
一局面において、本発明は、血漿から抗原を除去する抗原結合分子の能力を増強する方法であって、
1）可変領域に少なくとも1つのヒスチジンを含む、pH依存性を有する抗体を提供する工程、
2）抗体の可変領域の少なくとも1つのアミノ酸を、D、E、K、R、QおよびHからなる群より選択されるアミノ酸で置換する工程、
を含む方法を提供する。
特定の態様において、本発明の上記方法において、可変領域に含まれるヒスチジン残基と置換されたアミノ酸（すなわち、D、E、K、R、QまたはH）の間の距離は、20オングストローム未満、18オングストローム未満、16オングストローム未満、14オングストローム未満、12オングストローム未満、10オングストローム未満、8オングストローム未満、6オングストローム未満、4オングストローム未満、または2オングストローム未満である。
一局面において、本発明は、個体における血漿からのC1sのクリアランスを増強する方法を提供する。いくつかの態様において、この方法は、血漿からのC1sのクリアランスを増強するのに有効な量の本発明の抗C1s抗体を個体に投与する工程を含む。本発明はまた、個体における血漿からのC1rおよびC1sの複合体のクリアランスを増強する方法を提供する。いくつかの態様において、この方法は、血漿からのC1rおよびC1sの複合体のクリアランスを増強するのに有効な量の本発明の抗C1s抗体を個体に投与する工程を含む。本発明はまた、個体における血漿からのC1q、C1rおよびC1sの複合体のクリアランスを増強する方法を提供する。いくつかの態様において、この方法は、血漿からのC1q、C1rおよびC1sの複合体のクリアランスを増強するのに有効な量の本発明の抗C1s抗体を個体に投与する工程を含む。
別の局面において、本発明は、血漿からC1sを除去する方法であって、（a）その血漿からC1sを除去する必要のある個体を同定する工程；（b）C1sに結合する抗体を提供する工程であって、該抗体が、該抗体の抗原結合（C1s結合）ドメインを通じてC1sに結合し、かつ2～10,000であるKD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)値を有し、ここでKD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)は、KDが表面プラズモン共鳴技術を用いて決定された場合のpH 5.8におけるC1sに対するKDとpH 7.4におけるC1sに対するKDとの比と定義され、該抗体が、生体内の血漿中のC1sに結合し、生体内のエンドソーム内に存在する条件下では、結合したC1sから解離し、該抗体がヒトIgGまたはヒト化IgGである、工程；および（c）該抗体を個体に投与する工程を含む方法を提供する。さらなる局面において、そのような表面プラズモン共鳴技術は、37℃および150 mM NaClで使用され得る。さらなる局面において、そのような表面プラズモン共鳴技術、抗体を固定化し、抗原をアナライトとして使用し、かつ以下の条件：37℃で10 mM MES緩衝液、0.05％モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、および150 mM NaClを用いて、使用され得る。さらなる局面において、前記のKDに代えて解離速度定数（kd）を使用することが可能である。
別の局面において、本発明は、対象において血漿からC1sを除去する方法であって、（a）第1の抗体を同定する工程であって、第1の抗体が第1の抗体の抗原結合ドメインを通じてC1sに結合する、工程；（b）第2の抗体を同定する工程であって、第2の抗体が、（1）第2の抗体の抗原結合（C1s結合）ドメインを通じてC1sに結合し、（2）第1の抗体の可変領域の少なくとも1つのアミノ酸がヒスチジンで置換されていること、および/または第1の抗体の可変領域に少なくとも1つのヒスチジンが挿入されていることを除いて、第1の抗体とアミノ酸配列が同一であり、（3）第1の抗体のKD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)値よりも高くかつ2～10,000であるKD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)値を有し、ここでKD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)は、KDが表面プラズモン共鳴技術を用いて決定された場合のpH 5.8におけるC1sに対するKDとpH 7.4におけるC1sに対するKDとの比と定義され、（4）生体内の血漿中のC1sに結合し、（5）生体内のエンドソーム内に存在する条件下では、結合したC1sから解離し、かつ（6）ヒトIgGまたはヒト化IgGである、工程；（c）血漿中C1sレベルを減少させる必要のある対象を特定する工程；ならびに（d）対象の血漿中C1sレベルが減少するように第2の抗体を対象に投与する工程を含む方法を提供する。さらなる局面において、そのような表面プラズモン共鳴技術は、37℃および150 mM NaClで使用され得る。さらなる局面において、そのような表面プラズモン共鳴技術は、37℃および150 mM NaClで使用され得る。さらなる局面において、そのような表面プラズモン共鳴技術は、抗体を固定化し、抗原をアナライトとして使用し、かつ以下の条件：37℃で10 mM MES緩衝液、0.05％モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタンおよび150 mM NaClを用いて、使用され得る。さらなる局面において、前記のKDに代えて解離速度定数（kd）を使用することが可能である。
別の局面において、本発明は、対象において血漿からC1sを除去する方法であって、（a）第1の抗体を同定する工程であって、第1の抗体が、（1）第1の抗体の抗原結合ドメインを通じてC1sに結合し、（2）第1の抗体の少なくとも1つの可変領域が、第2の抗体の対応する可変領域よりも少なくとも1つ多いヒスチジン残基を有することを除いて、第2の抗体の抗原結合（C1s結合）ドメインを通じてC1sに結合する第2の抗体とアミノ酸配列が同一であり、（3）第2の抗体のKD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)値よりも高くかつ2～10,000であるKD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)値を有し、ここでKD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)は、KDが表面プラズモン共鳴技術を用いて決定された場合のpH 5.8におけるC1sに対するKDとpH 7.4におけるC1sに対するKDとの比と定義され、（4）生体内の血漿中のC1sに結合し、（5）生体内のエンドソーム内に存在する条件下では、結合したC1sから解離し、かつ（6）ヒトIgGまたはヒト化IgGである、工程；（b）血漿中C1sレベルを減少させる必要のある対象を特定する工程；ならびに（c）対象の血漿中C1sレベルが減少するように第1の抗体を対象に少なくとも1回投与する工程を含む方法を提供する。さらなる局面において、そのような表面プラズモン共鳴技術は、37℃および150 mM NaClで使用され得る。さらなる局面において、そのような表面プラズモン共鳴技術は、37℃および150 mM NaClで使用され得る。さらなる局面において、そのような表面プラズモン共鳴技術は、抗体を固定化し、抗原をアナライトとして使用し、かつ以下の条件：37℃で10 mM MES緩衝液、0.05％モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタンおよび150 mM NaClを用いて、使用され得る。本発明はまた、補体成分C4の切断を阻害する方法であって、抗体が補体成分C2の切断を阻害しない、方法を提供する。いくつかの例において、抗体は古典的補体経路の成分を阻害し、いくつかの例において、古典的補体経路の成分はC1sである。さらなる局面において、前記のKDに代えて解離速度定数（kd）を使用することが可能である。
一局面において、本開示は、補体活性化を調整する方法を提供する。いくつかの態様において、この方法は、例えばC4b2aの産生を減少させるよう、補体活性化を阻害する。いくつかの態様において、本開示は、補体介在性の疾患または障害を有する個体において補体活性化を調整する方法であって、本開示の抗C1s抗体または本開示の薬学的組成物を個体に投与する工程を含み、ここで該薬学的組成物は本開示の抗C1s抗体を含む、方法を提供する。いくつかの態様において、そのような方法は、補体活性化を阻害する。いくつかの態様において、個体は、哺乳動物である。いくつかの態様において、個体は、ヒトである。投与は、本明細書で開示されるものを含む、当業者に公知の任意の経路によるものであり得る。いくつかの態様において、投与は静脈内投与である。いくつかの態様において、投与は髄腔内投与である。
特定の態様において、本発明の抗C1s抗体は、2つ以上の種由来のC1sに結合する。特定の態様において、抗C1s抗体は、ヒトおよび非ヒト動物由来のC1sに結合する。特定の態様において、抗C1s抗体は、ヒト、ラットおよびサル（例えば、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、チンパンジーおよびヒヒ）由来のC1sに結合する。
一局面において、本発明は、（a）SEQ ID NO:39のアミノ酸配列を含むHVR-H1；（b）SEQ ID NO:40のアミノ酸配列を含むHVR-H2；（c）SEQ ID NO:41のアミノ酸配列を含むHVR-H3；（d）SEQ ID NO:42または45のアミノ酸配列を含むHVR-L1；（e）SEQ ID NO:43のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および（f）SEQ ID NO:44のアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つのHVRを含む抗C1s抗体を提供する。
一局面において、本発明は、（a）SEQ ID NO:39のアミノ酸配列を含むHVR-H1；（b）SEQ ID NO:40のアミノ酸配列を含むHVR-H2；および（c）SEQ ID NO:41のアミノ酸配列を含むHVR-H3から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む抗体を提供する。一態様において、この抗体は、SEQ ID NO:41のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む。別の態様において、この抗体は、SEQ ID NO:41のアミノ酸配列を含むHVR-H3およびSEQ ID NO:44のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む。さらなる態様において、この抗体は、SEQ ID NO:41のアミノ酸配列を含むHVR-H3、SEQ ID NO:44のアミノ酸配列を含むHVR-L3およびSEQ ID NO:40のアミノ酸配列を含むHVR-H2を含む。さらなる態様において、この抗体は、（a）SEQ ID NO:39のアミノ酸配列を含むHVR-H1；（b）SEQ ID NO:40のアミノ酸配列を含むHVR-H2；および（c）SEQ ID NO:41のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む。
別の局面において、本発明は、（a）SEQ ID NO:42または45のアミノ酸配列を含むHVR-L1；（b）SEQ ID NO:43のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および（c）SEQ ID NO:44のアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含む抗体を提供する。一態様において、この抗体は、（a）SEQ ID NO:42または45のアミノ酸配列を含むHVR-L1；（b）SEQ ID NO:43のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および（c）SEQ ID NO:44のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む。
別の局面において、本発明の抗体は、（a）（i）SEQ ID NO:39のアミノ酸配列を含むHVR-H1；（ii）SEQ ID NO:40のアミノ酸配列を含むHVR-H2；および（iii）SEQ ID NO:41のアミノ酸配列を含むHVR-H3から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含むVHドメイン；ならびに（b）（i）SEQ ID NO:42または45のアミノ酸配列を含むHVR-L1；（ii）SEQ ID NO:43のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および（c）SEQ ID NO:44のアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVL HVR配列を含むVLドメインを含む。
別の局面において、本発明は、（a）SEQ ID NO:39のアミノ酸配列を含むHVR-H1；（b）SEQ ID NO:40のアミノ酸配列を含むHVR-H2；（c）SEQ ID NO:41のアミノ酸配列を含むHVR-H3；（d）SEQ ID NO:42または45のアミノ酸配列を含むHVR-L1；（e）SEQ ID NO:43のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および（f）SEQ ID NO:44のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む抗体を提供する。
いくつかの態様において、SEQ ID No.35または36のVH配列およびSEQ ID NO:37または38のVL配列を含む抗体にアミノ酸修飾を導入することによって調製される抗C1s抗体変異体が提供される。
いくつかの態様において、WO2014/071206に開示される抗体VH1/Vk1、VH1/Vk2、VH1/Vk3、VH2/Vk1、VH2/Vk2、VH2/Vk3、VH3/Vk1、VH3/Vk2、VH3/Vk3、VH4/Vk1、VH4/Vk2、またはVH4/Vk3にアミノ酸修飾を導入することによって調製される抗C1s抗体変異体が提供される。
いくつかの態様において、本発明の抗C1s抗体は、以下のKabatナンバリングシステムでの位置のうちの1つまたは複数にヒスチジンを含む：
重鎖：H26、H27、H28、H29、H30、H31、H32、H33、H34、H35、H50、H51、H52、H52a、H53、H54、H55、H57、H58、H59、H60、H61、H62、H63、H64、H65、H93、H94、H95、H96、H97、H98、H99、H100、H100a、H101、およびH102；ならびに
軽鎖：L24、L25、L26、L27、L27a、L28、L29、L30、L31、L32、L33、L50、L51、L52、L53、L54、L55、L56、L91、L92、L93、L94、L95、L95a、L96、およびL97。
いくつかの態様において、本発明の抗C1s抗体は、以下のKabatナンバリングシステムでの位置のうちの1つまたは複数にヒスチジンを含む：
重鎖：H26、H27、H28、H29、H30、H32、H33、H34、H50、H51、H52a、H54、H57、H58、H59、H60、H61、H65、H93、H95、H99、H100およびH100a；ならびに
軽鎖：L25、L28、L91、L92、L94、L95、L96およびL97。
いくつかの態様において、本発明の抗C1s抗体は、以下のKabatナンバリングシステムでの位置から選択される位置のうちの1つまたは複数のアミノ酸残基について置換された少なくとも1つのヒスチジンを含む：
重鎖：H26、H27、H28、H29、H30、H31、H32、H33、H34、H35、H50、H51、H52、H52a、H53、H54、H55、H57、H58、H59、H60、H61、H62、H63、H64、H65、H93、H94、H95、H96、H97、H98、H99、H100、H100a、H101、およびH102；ならびに
軽鎖：L24、L25、L26、L27、L27a、L28、L29、L30、L31、L32、L33、L50、L51、L52、L53、L54、L55、L56、L91、L92、L93、L94、L95、L95a、L96、およびL97。
いくつかの態様において、前記の抗C1s抗体のいずれか1つまたは複数のアミノ酸は、以下のKabatナンバリングシステムでの位置においてヒスチジンと置換されている：
重鎖：H51、H65、およびH99；ならびに
軽鎖：L92、L94、L95、およびL96。
いくつかの態様において、本発明の単離された抗C1s抗体は、以下のKabatナンバリングシステムでの位置のアミノ酸残基について置換された1つ、2つ、3つ、4つまたは5つのヒスチジンを含む：
重鎖：H51、H65、およびH99；ならびに
軽鎖：L92、L94、L95、およびL96。
いくつかの態様において、本発明の単離された抗C1s抗体は、Kabatナンバリングシステムによる以下の位置およびCDRまたはFRアミノ酸位置のうちの1つまたは複数において置換された残基である少なくとも1つのヒスチジンを含む：
重鎖：H51、H65、およびH99；ならびに
軽鎖：L92、L94、L95、およびL96。
いくつかの態様において、本発明の単離された抗C1s抗体は、Kabatナンバリングシステムによる以下の位置において置換された残基である少なくとも1つのヒスチジンを含む：
1）L92およびL94
2）L92およびL95
3）L94およびL95
4）L92、L94、およびL95
5）H65およびL92
6）H65およびL94
7）H65およびL95
8）H65、L92、およびL94
9）H65、L92、およびL95
10）H65、L94、およびL95
11）H65、L92、L94、およびL95
12）H99およびL92
13）H99およびL94
14）H99およびL95
15）H99、L92、およびL94
16）H99、L92、およびL95
17）H99、L94、およびL95
18）H99、L92、L94、およびL95
19）H65およびH99
20）H65、H99、およびL92
21）H65、H99、およびL94
22）H65、H99、およびL95
23）H65、H99、L92、およびL94
24）H65、H99、L92、およびL95
25）H65、H99、L94、およびL95
26）H65、H99、L92、L94、およびL95、または
27）H27、H99、およびL95。
上述の態様の任意のものにおいて、抗C1s抗体はヒト化抗体である。一態様において、抗C1s抗体は、上述の態様の任意のものにおけるHVRを含み、さらに、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークを含む。別の態様において、抗C1s抗体は、上述の態様の任意のものにおけるHVRを含み、さらに、FR配列を含むVHまたはVLを含む。さらなる態様において、本発明の抗C1s抗体は、以下の重鎖または軽鎖可変ドメインFR配列を含む：重鎖可変ドメインについては、FR1はSEQ ID NO:4または12のアミノ酸配列を含み、FR2はSEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含み、FR3はSEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含み、FR4はSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む。軽鎖可変ドメインについては、FR1はSEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含み、FR2はSEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含み、FR3はSEQ ID NO:10のアミノ酸配列を含み、FR4はSEQ ID NO:11のアミノ酸配列を含む。
別の局面において、抗C1s抗体は、SEQ ID NO:19、17または22のアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（VH）配列を含む。特定の態様において、少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％の同一性を有するVH配列は、参照配列に対する置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含むが、その配列を含む抗C1s抗体は、C1sに結合する能力を保持している。特定の態様において、合計1～10個のアミノ酸が、SEQ ID NO:19、17または22において置換、挿入および/または欠失されている。特定の態様において、置換、挿入または欠失は、HVRの外側の領域において（すなわち、FRにおいて）生じる。任意で、抗C1s抗体は、SEQ ID NO:19、17または22のVH配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。特定の態様において、当該VHは、（a）SEQ ID NO:39のアミノ酸配列を含むHVR-H1、（b）SEQ ID NO:40のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および（c）SEQ ID NO:41のアミノ酸配列を含むHVR-H3から選択される1つ、2つまたは3つのHVRを含む。翻訳後修飾は、重鎖または軽鎖のN末端のグルタミンまたはグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾を含むが、これに限定されない。
別の局面において、SEQ ID NO:20、18または21のアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（VL）を含む抗C1s抗体が提供される。特定の態様において、少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％の同一性を有するVL配列は、参照配列に対する置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含むが、その配列を含む抗C1s抗体は、C1sに結合する能力を保持している。特定の態様において、SEQ ID NO:20、18または21において合計1～10個のアミノ酸が置換、挿入および/または欠失されている。特定の態様において、置換、挿入または欠失は、HVRの外側の領域において（すなわち、FRにおいて）生じる。任意で、抗C1s抗体は、SEQ ID NO:20、18または21のVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。特定の態様において、当該VLは、（a）SEQ ID NO:42または45のアミノ酸配列を含むHVR-L1、（b）SEQ ID NO:43のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および（c）SEQ ID NO:44のアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択される1つ、2つまたは3つのHVRを含む。翻訳後修飾は、重鎖または軽鎖のN末端のグルタミンまたはグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾を含むが、これに限定されない。
別の局面において、上述の態様の任意のものにおけるVH、および上述の態様の任意のものにおけるVLを含む、C1s抗体が提供される。一態様において、当該抗体は、それぞれSEQ ID NO:19およびSEQ ID NO:20のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。翻訳後修飾は、重鎖または軽鎖のN末端のグルタミンまたはグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾を含むが、これに限定されない。一態様において、当該抗体は、それぞれSEQ ID NO:17およびSEQ ID NO:18のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。翻訳後修飾は、重鎖または軽鎖のN末端のグルタミンまたはグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾を含むが、これに限定されない。一態様において、当該抗体は、それぞれSEQ ID NO:22およびSEQ ID NO:20のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。翻訳後修飾は、重鎖または軽鎖のN末端のグルタミンまたはグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾を含むが、これに限定されない。一態様において、当該抗体は、それぞれSEQ ID NO:19およびSEQ ID NO:21のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。翻訳後修飾は、重鎖または軽鎖のN末端のグルタミンまたはグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾を含むが、これに限定されない。一態様において、当該抗体は、それぞれSEQ ID NO:22およびSEQ ID NO:21のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。翻訳後修飾は、重鎖または軽鎖のN末端のグルタミンまたはグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾を含むが、これに限定されない。
さらなる局面において、本発明は、本明細書で提供される抗C1s抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。例えば、特定の態様において、
（a）SEQ ID NO:23のHVR-H1配列、SEQ ID NO:24のHVR-H2配列、SEQ ID NO:25のHVR-H3配列、SEQ ID NO:26のHVR-L1配列、SEQ ID NO:27のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:28のHVR-L3配列を含む抗体、
（b）SEQ ID NO:29のHVR-H1配列、SEQ ID NO:30のHVR-H2配列、SEQ ID NO:31のHVR-H3配列、SEQ ID NO:32のHVR-L1配列、SEQ ID NO:33のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:34のHVR-L3配列を含む抗体、
（c）ヒトモノクローナル抗C1s抗体M241（HycultBiotech、カタログ番号HM2109）またはヒトモノクローナル抗C1s抗体M81（HycultBiotech、カタログ番号HM2108）、
（d）SEQ ID NO:56のHVR-H1配列、SEQ ID NO:57のHVR-H2配列、SEQ ID NO:58のHVR-H3配列、SEQ ID NO:71のHVR-L1配列、SEQ ID NO:72のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:73のHVR-L3配列を含む抗体、
（e）SEQ ID NO:59のHVR-H1配列、SEQ ID NO:60のHVR-H2配列、SEQ ID NO:61のHVR-H3配列、SEQ ID NO:74のHVR-L1配列、SEQ ID NO:75のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:76のHVR-L3配列を含む抗体、
（f）SEQ ID NO:62のHVR-H1配列、SEQ ID NO:63のHVR-H2配列、SEQ ID NO:64のHVR-H3配列、SEQ ID NO:77のHVR-L1配列、SEQ ID NO:78のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:79のHVR-L3配列を含む抗体、
（g）SEQ ID NO:65のHVR-H1配列、SEQ ID NO:66のHVR-H2配列、SEQ ID NO:67のHVR-H3配列、SEQ ID NO:80のHVR-L1配列、SEQ ID NO:81のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:82のHVR-L3配列を含む抗体、ならびに
（h）SEQ ID NO:68のHVR-H1配列、SEQ ID NO:69のHVR-H2配列、SEQ ID NO:70のHVR-H3配列、SEQ ID NO:83のHVR-L1配列、SEQ ID NO:84のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:85のHVR-L3配列を含む抗体、
からなる群より選択される抗体と同じエピトープに結合し、以下の（i）または（ii）に記載されるように、酸性pHよりも中性pHにおいて高いアフィニティでC1sに結合する、抗体が提供される：
（i）中性pHおよび酸性pHの両方において高カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのC1s結合活性のKD値に対する酸性pHでのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）が2以上である、
（ii）中性pHおよび酸性pHの両方において高カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのC1s結合活性のkoff値に対する酸性pHでのC1s結合活性のkoff値の比（koff(酸性pH)/koff(中性pH)）が2以上である。
いくつかの態様において、本発明の単離された抗C1s抗体は、C1sへの結合に関して、
（a）SEQ ID NO:56のHVR-H1配列、SEQ ID NO:57のHVR-H2配列、SEQ ID NO:58のHVR-H3配列、SEQ ID NO:71のHVR-L1配列、SEQ ID NO:72のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:73のHVR-L3配列を含む抗体、
（b）SEQ ID NO:59のHVR-H1配列、SEQ ID NO:60のHVR-H2配列、SEQ ID NO:61のHVR-H3配列、SEQ ID NO:74のHVR-L1配列、SEQ ID NO:75のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:76のHVR-L3配列を含む抗体、
（c）SEQ ID NO:62のHVR-H1配列、SEQ ID NO:63のHVR-H2配列、SEQ ID NO:64のHVR-H3配列、SEQ ID NO:77のHVR-L1配列、SEQ ID NO:78のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:79のHVR-L3配列を含む抗体、
（d）SEQ ID NO:65のHVR-H1配列、SEQ ID NO:66のHVR-H2配列、SEQ ID NO:67のHVR-H3配列、SEQ ID NO:80のHVR-L1配列、SEQ ID NO:81のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:82のHVR-L3配列を含む抗体、ならびに
（e）SEQ ID NO:68のHVR-H1配列、SEQ ID NO:69のHVR-H2配列、SEQ ID NO:70のHVR-H3配列、SEQ ID NO:83のHVR-L1配列、SEQ ID NO:84のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:85のHVR-L3配列を含む抗体
からなる群より選択される抗体と競合する。
さらなる局面において、本発明は、本明細書で提供される抗C1s抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。例えば、特定の態様において、本発明は、WO2014/066744に開示されているIPN-M1、IPN-M2、IPN-M3、IPN-M8、IPN-M9、IPN-M10、IPN-M11、IPN-M13、IPN-M14、IPN-M15、IPN-M18、IPN-M23、IPN-M24、IPN-M27、IPN-M28、IPN-M29、およびIPN-M33からなる群より選択される抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。
いくつかの態様において、本発明の単離された抗C1s抗体は、中性pHにおいて、C1sへの結合に関して、
（a）SEQ ID NO:23のHVR-H1配列、SEQ ID NO:24のHVR-H2配列、SEQ ID NO:25のHVR-H3配列、SEQ ID NO:26のHVR-L1配列、SEQ ID NO:27のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:28のHVR-L3配列を含む抗体、
（b）SEQ ID NO:29のHVR-H1配列、SEQ ID NO:30のHVR-H2配列、SEQ ID NO:31のHVR-H3配列、SEQ ID NO:32のHVR-L1配列、SEQ ID NO:33のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:34のHVR-L3配列を含む抗体、ならびに
（c）ヒトモノクローナル抗C1s抗体M241（HycultBiotech、カタログ番号HM2109）またはヒトモノクローナル抗C1s抗体M81（HycultBiotech、カタログ番号HM2108）、
からなる群より選択される抗体と競合する。
いくつかの態様において、本発明の単離された抗C1s抗体は、中性pHにおいて、C1sへの結合に関して、WO2014/066744に開示されているIPN-M1、IPN-M2、IPN-M3、IPN-M8、IPN-M9、IPN-M10、IPN-M11、IPN-M13、IPN-M14、IPN-M15、IPN-M18、IPN-M23、IPN-M24、IPN-M27、IPN-M28、IPN-M29、およびIPN-M33からなる群より選択される抗体と競合する。
一局面において、本開示は、補体成分Is（C1s）のドメインIVおよびVを含む領域内のエピトープに特異的に結合する、pH依存的結合特性を有する単離されたヒト化モノクローナル抗体を提供する。いくつかの例において、当該抗体は、補体成分4（C4）へのC1sの結合を阻害する。いくつかの例において、当該抗体は、C1sのプロテアーゼ活性を阻害しない。いくつかの例において、本開示の単離されたヒト化モノクローナル抗体によって結合されるエピトープは、立体構造エピトープである。
一局面において、本開示は、補体C1sタンパク質内のエピトープに特異的に結合する、pH依存的結合性を有する単離された抗体を提供する。いくつかの態様において、本開示の単離された抗C1s抗体は、活性化C1sタンパク質に結合する。いくつかの態様において、本開示の単離された抗C1s抗体は、不活性形態のC1sに結合する。他の例において、本開示の単離された抗C1s抗体は、活性化C1sタンパク質および不活性形態のC1sの両方に結合する。
一態様において、本開示は、C1sのドメインIVおよびVを含む領域内のエピトープに特異的に結合する、pH依存的結合性を有する単離されたヒト化モノクローナル抗体を提供する。例えば、本開示は、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列の272位～422位のアミノ酸内のエピトープに特異的に結合する単離されたヒト化モノクローナル抗体を提供する。いくつかの例において、当該単離されたヒト化モノクローナル抗体は、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列の272位～422位のアミノ酸内のエピトープに特異的に結合し、C1sへのC4の結合を阻害する。本開示はまた、補体介在性の疾患または障害を治療する方法であって、それを必要とする個体に、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列の272位～422位のアミノ酸内のエピトープに特異的に結合してC1sへのC4の結合を阻害する有効量の単離されたヒト化モノクローナル抗体を投与する工程を含む、方法を提供する。
一局面において、本開示は、ヒトC1s抗原の357位にアスパラギン酸を含むエピトープに特異的に結合する、pH依存的結合性を有する単離されたヒト化モノクローナル抗体を提供する。
本発明のさらなる局面において、上述の態様の任意のものによる抗C1S抗体は、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を含む、モノクローナル抗体である。一態様において、抗C1S抗体は、例えば、Fv、Fab、Fab'、scFv、ダイアボディ、またはF(ab')2断片などの、抗体断片である。別の態様において、抗体は、例えば、完全IgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4抗体、または本明細書で定義された他の抗体クラスまたはアイソタイプの、全長抗体である。
さらなる局面において、上述の態様の任意のものによる抗C1S抗体は、単独または組み合わせで、以下の項目1～7に記載の任意の特徴を取り込んでもよい。
１．抗体のアフィニティ
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、1μM以下、100nM以下、10nM以下、1nM以下、0.1nM以下、0.01nM以下、または0.001nM以下（例えば、10-8M以下、例えば10-8M～10-13M、例えば10-9M～10-13M）の解離定数 (KdまたはKD) を有する。
一態様において、Kdは、放射性標識抗原結合測定法 (radiolabeled antigen binding assay: RIA) によって測定される。一態様において、RIAは、目的の抗体のFabバージョンおよびその抗原を用いて実施される。例えば、抗原に対するFabの溶液中結合アフィニティは、非標識抗原の漸増量系列の存在下で最小濃度の (125I) 標識抗原によりFabを平衡化させ、次いで結合した抗原を抗Fab抗体でコーティングされたプレートにより捕捉することによって測定される。（例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999) を参照のこと）。測定条件を構築するために、MICROTITER（登録商標）マルチウェルプレート (Thermo Scientific) を50mM炭酸ナトリウム (pH9.6) 中5μg/mlの捕捉用抗Fab抗体 (Cappel Labs) で一晩コーティングし、続いて室温（およそ23℃）で2～5時間、PBS中2％ (w/v) ウシ血清アルブミンでブロックする。非吸着プレート (Nunc #269620) において、100 pMまたは26 pMの [125I]-抗原を、（例えば、Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997) における抗VEGF抗体、Fab-12の評価と同じように）目的のFabの段階希釈物と混合する。次いで、目的のFabを一晩インキュベートするが、このインキュベーションは、平衡が確実に達成されるよう、より長時間（例えば、約65時間）継続され得る。その後、混合物を、室温でのインキュベーション（例えば、1時間）のために捕捉プレートに移す。次いで溶液を除去し、プレートをPBS中0.1％のポリソルベート20（TWEEN-20（登録商標））で8回洗浄する。プレートが乾燥したら、150μl/ウェルのシンチラント（MICROSCINT-20（商標）、Packard）を添加し、TOPCOUNT（商標）ガンマカウンター (Packard) においてプレートを10分間カウントする。最大結合の20％以下を与える各Fabの濃度を、競合結合アッセイにおいて使用するために選択する。
別の態様によれば、Kdは、BIACORE（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定される。例えば、BIACORE（登録商標）-2000またはBIACORE（登録商標）-3000 (BIACORE（登録商標）, Inc., Piscataway, NJ) を用いる測定法が、およそ10反応単位 (response unit: RU) の抗原が固定されたCM5チップを用いて25℃で実施される。一態様において、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ (CM5、BIACORE（登録商標）, Inc.) は、供給元の指示にしたがいN-エチル-N'- (3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドヒドロクロリド (EDC) およびN-ヒドロキシスクシンイミド (NHS) を用いて活性化される。抗原は、およそ10反応単位 (RU) のタンパク質の結合を達成するよう、5μl/分の流速で注入される前に、10mM酢酸ナトリウム、pH4.8を用いて5μg/ml（およそ0.2μM）に希釈される。抗原の注入後、未反応基をブロックするために1Mエタノールアミンが注入される。キネティクスの測定のために、25℃、およそ25μl/分の流速で、0.05％ポリソルベート20（TWEEN-20（商標））界面活性剤含有PBS (PBST) 中のFabの2倍段階希釈物 (0.78nM～500nM) が注入される。結合速度 (kon) および解離速度 (koff) は、単純な1対1ラングミュア結合モデル（BIACORE（登録商標）評価ソフトウェアバージョン3.2）を用いて、結合および解離のセンサーグラムを同時にフィッティングすることによって計算される。平衡解離定数 (Kd) は、koff/kon比として計算される。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999) を参照のこと。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによってオン速度が106M-1s-1を超える場合、オン速度は、分光計（例えばストップフロー式分光光度計 (Aviv Instruments) または撹拌キュベットを用いる8000シリーズのSLM-AMINCO（商標）分光光度計 (ThermoSpectronic)）において測定される、漸増濃度の抗原の存在下でのPBS、pH7.2中20nMの抗抗原抗体（Fab形態）の25℃での蛍光発光強度（励起=295nm；発光=340nm、バンドパス16nm）の増加または減少を測定する蛍光消光技術を用いることによって決定され得る。
いくつかの態様において、pH 7.4およびpH 5.8における本発明の各ヒスチジン置換変異体の結合アフィニティは、37℃でBiacore T200機器（GE Healthcare）を用いて決定される。組み換えプロテインA/G（Pierce）が、アミンカップリングキット（GE Healthcare）を用いてCM4センサーチップのすべてのフローセル上に固定化され得る。抗体およびアナライトは、7(+)緩衝液（20 mM ACES、150 mM NaCl、1.2 mM CaCl2、0.05% Tween 20、0.005% NaN3、pH 7.4）、5(+)緩衝液（20 mM ACES、150 mM NaCl、1.2 mM CaCl2、0.05% Tween 20、0.005% NaN3、pH 5.8）または5(-)緩衝液（20 mM ACES、150 mM NaCl、3μM CaCl2、0.05% Tween 20、0.005% NaN3、pH 5.8）で調製され得る。各抗体は、プロテインA/Gによってセンサー表面上に捕捉され得る。抗体捕捉量は、200共鳴単位（RU）を目標とされる。血清由来ヒトC1s（CompTech）または調製された組み換えC1sは、例えば50または200 nMで注入し、その後に解離させることができる。センサー表面は、サイクル毎に、例えば10 mMグリシン-HCl、pH 1.5を用いて再生される。結合アフィニティは、例えば、Biacore T200 Evaluationソフトウェア、バージョン2.0（GE Healthcare）を用いてデータを処理し1：1結合モデルにフィッティングさせることによって決定され得る。
本発明のBiacoreアッセイの工程の具体例は以下のとおりである。
pH 7.4およびpH 5.8におけるヒスチジン置換変異体の結合アフィニティを、37℃でBiacore T200機器（GE Healthcare）を用いて決定する。組み換えプロテインA/G（Pierce）を、アミンカップリングキット（GE Healthcare）を用いてCM4センサーチップのすべてのフローセル上に固定化する。抗体およびアナライトを、7(+)緩衝液（20 mM ACES、150 mM NaCl、1.2 mM CaCl2、0.05% Tween 20、0.005% NaN3、pH 7.4）または5(+)緩衝液（20 mM ACES、150 mM NaCl、1.2 mM CaCl2、0.05% Tween 20、0.005% NaN3、pH 5.8）で調製する。各抗体を、プロテインA/Gによってセンサー表面上に捕捉する。抗体捕捉量は、200共鳴単位（RU）を目標にする。血清由来ヒトC1sを、pH 7.4において12.5、50 nMで、またはpH 5.8において50、200 nMで、またはpH 5.8において200および800 nMで注入し、その後に解離させる。サイクル毎に、10 mMグリシン-HCl、pH 1.5を用いてセンサー表面を再生する。Biacore T200 Evaluationソフトウェア、バージョン2.0（GE Healthcare）を用いてデータを処理し1：1結合モデルにフィッティングさせることによって、結合アフィニティを決定する。pH 7.4における解離領域の直後に、pH 5.8におけるさらなる解離領域を組み込む。5(+)緩衝液中でのこの解離速度を、Scrubber 2.0（BioLogic Software）曲線フィッティングソフトウェアを用いてデータを処理しフィッティングさせることによって決定する。
あるいは、pH 7.4およびpH 5.8におけるヒスチジン置換変異体の結合アフィニティを、37℃でBiacore T200機器（GE Healthcare）を用いて決定する。組み換えプロテインA/G（Pierce）を、アミンカップリングキット（GE Healthcare）を用いてCM4センサーチップのすべてのフローセル上に固定化する。抗体およびアナライトを、7(+)緩衝液（20 mM ACES、150 mM NaCl、1.2 mM CaCl2、0.05% Tween 20、0.005% NaN3、pH 7.4）または5(+)緩衝液（20 mM ACES、150 mM NaCl、1.2 mM CaCl2、0.05% Tween 20、0.005% NaN3、pH 5.8）で調製する。各抗体を、プロテインA/Gによってセンサー表面上に捕捉する。抗体捕捉量は、200共鳴単位（RU）を目標にする。血清由来ヒトC1sを、50 nMで注入し、その後に解離させる。サイクル毎に、10 mMグリシン-HCl、pH 1.5を用いてセンサー表面を再生する。Biacore T200 Evaluationソフトウェア、バージョン2.0（GE Healthcare）を用いてデータを処理し1：1結合モデルにフィッティングさせることによって、結合アフィニティを決定する。pH 7.4における解離領域の直後に、pH 5.8におけるさらなる解離領域を組み込む。5(+)緩衝液中でのこの解離速度を、Scrubber 2.0（BioLogic Software）曲線フィッティングソフトウェアを用いてデータを処理しフィッティングさせることによって決定する。
いくつかの態様において、必要に応じて、pH 7.4における解離領域の直後にpH 5.8におけるさらなる解離領域を組み込む。5(+)緩衝液中でのこの解離速度を、Scrubber 2.0（BioLogic Software）曲線フィッティングソフトウェアを用いてデータを処理しフィッティングさせることによって決定することができる。
２．抗体断片
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、これらに限定されるものではないが、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、および scFv断片、ならびに、後述する他の断片を含む。特定の抗体断片についての総説として、Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003) を参照のこと。scFv断片の総説として、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp.269-315 (1994)；加えて、WO93/16185；ならびに米国特許第5,571,894号および第5,587,458号を参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含みin vivoにおける半減期の長くなったFabおよびF(ab')2断片についての論説として、米国特許第5,869,046号を参照のこと。
ダイアボディは、二価または二重特異的であってよい、抗原結合部位を2つ伴う抗体断片である。例えば、EP404,097号; WO1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) 参照。トリアボディ (triabody) やテトラボディ (tetrabody) も、Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003) に記載されている。
シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分、または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分を含む、抗体断片である。特定の態様において、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第6,248,516 B1号参照）。
抗体断片は、これらに限定されるものではないが、本明細書に記載の、完全抗体のタンパク質分解的消化、組み換え宿主細胞（例えば、大腸菌 (E. coli) またはファージ）による産生を含む、種々の手法により作ることができる。
３．キメラおよびヒト化抗体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体が、例えば、米国特許第4,816,567号；および、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984) に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）およびヒト定常領域を含む。さらなる例において、キメラ抗体は、親抗体のものからクラスまたはサブクラスが変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片も含む。
特定の態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性およびアフィニティを維持したままでヒトへの免疫原性を減少させるために、ヒト化される。通常、ヒト化抗体は1つまたは複数の可変ドメインを含み、当該可変ドメイン中、HVR（例えばCDR（またはその部分））は非ヒト抗体に由来し、FR（またはその部分）はヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部分を含む。いくつかの態様において、ヒト化抗体中のいくつかのFR残基は、例えば、抗体の特異性またはアフィニティを回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、HVR残基の由来となった抗体）からの対応する残基で置換されている。
ヒト化抗体およびその作製方法は、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)において総説されており、また、例えば、Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)； Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)； 米国特許第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号、および第7,087,409号；Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)（特異性決定領域 (specificity determining region: SDR) グラフティングを記載）；Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) （リサーフェイシングを記載）； Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) （FRシャッフリングを記載）；ならびに、Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) およびKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) （FRシャッフリングのための「ガイドセレクション」アプローチを記載）において、さらに記載されている。
ヒト化に使われ得るヒトフレームワーク領域は、これらに限定されるものではないが：「ベストフィット」法（Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993) 参照）を用いて選択されたフレームワーク領域；軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992) および Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993) 参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) 参照）；および、FRライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) および Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996) 参照）を含む。
４．ヒト抗体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野において知られる種々の手法によって製造され得る。ヒト抗体は、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74 (2001) および Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008) に、概説されている。
ヒト抗体は、抗原チャレンジ（負荷）に応答して完全ヒト抗体またはヒト可変領域を伴う完全抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物へ免疫原を投与することにより、調製されてもよい。そのような動物は、典型的にはヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部もしくは一部分を含み、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部もしくは一部分は、内因性の免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、または、染色体外にもしくは当該動物の染色体内にランダムに取り込まれた状態で存在する。そのようなトランスジェニックマウスにおいて、内因性の免疫グロブリン遺伝子座は、通常不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の総説として、Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005) を参照のこと。また、例えば、XENOMOUSE（商標）技術を記載した米国特許第6,075,181号および第6,150,584号；HUMAB（登録商標）技術を記載した米国特許第5,770,429号；K-M MOUSE（登録商標）技術を記載した米国特許第7,041,870号；ならびに、VELOCIMOUSE（登録商標）技術を記載した米国特許出願公開第2007/0061900号を、併せて参照のこと。このような動物によって生成された完全抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせるなどして、さらに修飾されてもよい。
ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づいた方法でも作ることができる。ヒトモノクローナル抗体の製造のための、ヒトミエローマおよびマウス‐ヒトヘテロミエローマ細胞株は、既に記述されている。（例えば、Kozbor, J. Immunol. 133: 3001 (1984)；Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；およびBoerner et al., J. Immunol. 147: 86 (1991) 参照。）ヒトB細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体も、Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) に述べられている。追加的な方法としては、例えば、米国特許第7,189,826号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトIgM抗体の製造を記載）、および、Ni, Xiandai Mianyixue 26(4):265-268 (2006)（ヒト－ヒトハイブリドーマを記載）に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）も、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology 20(3):927-937 (2005) およびVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(3):185-91 (2005)に記載されている。
ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されたFvクローン可変ドメイン配列を単離することでも生成できる。このような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択する手法を、以下に述べる。
５．ライブラリー由来抗体
本発明の抗体は、所望の1つまたは複数の活性を伴う抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離してもよい。例えば、ファージディスプレイライブラリーの生成や、所望の結合特性を備える抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするための、様々な方法が当該技術分野において知られている。そのような方法は、Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) において総説されており、さらに例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554；Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)； Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)； Marks and Bradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)； Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)； Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004)； Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)； およびLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004) に記載されている。
特定のファージディスプレイ法において、VHおよびVL遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応 (polymerase chain reaction: PCR) により別々にクローニングされ、無作為にファージライブラリー中で再結合され、当該ファージライブラリーは、Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12: 433-455 (1994) に述べられているようにして、抗原結合ファージについてスクリーニングされ得る。ファージは、典型的には、単鎖Fv (scFv) 断片としてまたはFab断片としてのいずれかで、抗体断片を提示する。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築することを要さずに、免疫源に対する高アフィニティ抗体を提供する。あるいは、Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993) に記載されるように、ナイーブレパートリーを（例えば、ヒトから）クローニングして、免疫化することなしに、広範な非自己および自己抗原への抗体の単一の供給源を提供することもできる。最後に、ナイーブライブラリーは、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227: 381-388 (1992) に記載されるように、幹細胞から再編成前のV-遺伝子セグメントをクローニングし、超可変CDR3領域をコードしかつin vitroで再構成を達成するための無作為配列を含んだPCRプライマーを用いることにより、合成的に作ることもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載した特許文献は、例えば：米国特許第5,750,373号、ならびに、米国特許出願公開第2005/0079574号、2005/0119455号、第2005/0266000号、第2007/0117126号、第2007/0160598号、第2007/0237764号、第2007/0292936号、および第2009/0002360号を含む。
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書ではヒト抗体またはヒト抗体断片と見なす。
６．多重特異性抗体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に結合特異性を有する、モノクローナル抗体である。特定の態様において、結合特異性の1つは、C1Sに対するものであり、もう1つは他の任意の抗原へのものである。特定の態様において、二重特異性抗体は、C1Sの異なった2つのエピトープに結合してもよい。二重特異性抗体は、C1Sを発現する細胞に細胞傷害剤を局在化するために使用されてもよい。二重特異性抗体は、全長抗体としてまたは抗体断片として調製され得る。
多重特異性抗体を作製するための手法は、これらに限定されるものではないが、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖ペアの組み換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)、WO93/08829、およびTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991) 参照）、および「knob-in-hole」技術（例えば、米国特許第5,731,168号参照）を含む。多重特異性抗体は、Fcヘテロ二量体分子を作製するために静電ステアリング効果 (electrostatic steering effect) を操作すること (WO2009/089004A1)；2つ以上の抗体または断片を架橋すること（米国特許第4,676,980号およびBrennan et al., Science 229: 81 (1985)参照）；ロイシンジッパーを用いて2つの特異性を有する抗体を作成すること（Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992) 参照）；「ダイアボディ」技術を用いて二重特異性抗体断片を作製すること（Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) 参照）；および、単鎖Fv (scFv) 二量体を用いること（Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994) 参照）；および、例えばTutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991) に記載されるように三重特異性抗体を調製すること、によって作製してもよい。
「オクトパス抗体」を含む、3つ以上の機能的抗原結合部位を伴う改変抗体も、本明細書では含まれる（例えば、米国特許出願公開第2006/0025576 A1号参照）。
本明細書で抗体または断片は、C1Sと別の異なる抗原とに結合する1つの抗原結合部位を含む、「デュアルアクティングFab」または「DAF」も含む（例えば、米国特許出願公開第2008/0069820号参照）。
７．抗体変異体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体も、考慮の内である。例えば、抗体の結合アフィニティおよび/または他の生物学的特性を改善することが、望ましいこともある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入すること、または、ペプチド合成によって、調製されてもよい。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列からの欠失、および/または抗体のアミノ酸配列中への挿入、および/または抗体のアミノ酸配列中の残基の置換を含む。最終構築物が所望の特徴（例えば、抗原結合性）を備えることを前提に、欠失、挿入、および置換の任意の組合せが、最終構築物に至るために行われ得る。
ａ) 置換、挿入、および欠失変異体
特定の態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換的変異導入の目的部位は、HVRおよびFRを含む。保存的置換を、表１の「好ましい置換」の見出しの下に示す。より実質的な変更を、表１の「例示的な置換」の見出しの下に提供するとともに、アミノ酸側鎖のクラスに言及しつつ下で詳述する。アミノ酸置換は目的の抗体に導入されてもよく、産物は、例えば、保持/改善された抗原結合性、減少した免疫原性、または改善したADCCまたはCDCなどの、所望の活性についてスクリーニングされてもよい。
Figure 2023116744000001
アミノ酸は、共通の側鎖特性によって群に分けることができる：
(1) 疎水性：ノルロイシン、メチオニン (Met)、アラニン (Ala)、バリン (Val)、ロイシン (Leu)、イソロイシン (Ile)；
(2) 中性の親水性：システイン (Cys)、セリン (Ser)、トレオニン (Thr)、アスパラギン (Asn)、グルタミン (Gln)；
(3) 酸性：アスパラギン酸 (Asp)、グルタミン酸 (Glu)；
(4) 塩基性：ヒスチジン (His)、リジン (Lys)、アルギニン (Arg)；
(5) 鎖配向に影響する残基：グリシン (Gly)、プロリン (Pro)；
(6) 芳香族性：トリプトファン (Trp)、チロシン (Tyr)、フェニルアラニン (Phe)。
非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを、別のクラスのものに交換することをいう。
置換変異体の1つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の1つまたは複数の超可変領域残基の置換を含む。通常、その結果として生じ、さらなる試験のために選ばれた変異体は、親抗体と比較して特定の生物学的特性における修飾（例えば、改善）（例えば、増加したアフィニティ、減少した免疫原性）を有する、および/または親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。例示的な置換変異体は、アフィニティ成熟抗体であり、これは、例えばファージディスプレイベースのアフィニティ成熟技術（例えば本明細書に記載されるもの）を用いて適宜作製され得る。簡潔に説明すると、1つまたは複数のHVR残基を変異させ、そして変異抗体をファージ上に提示させ、特定の生物活性（例えば、結合アフィニティ）に関してスクリーニングを行う。
改変（例えば、置換）は、例えば抗体のアフィニティを改善するために、HVRにおいて行われ得る。そのような改変は、HVRの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセスの間に高頻度で変異が起こるコドンによってコードされる残基（例えば、Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008) を参照のこと）および/または抗原に接触する残基において行われ得、得られた変異VHまたはVLが結合アフィニティに関して試験され得る。二次ライブラリーからの構築および再選択によるアフィニティ成熟が、例えば、Hoogenboom et al., in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)) に記載されている。アフィニティ成熟のいくつかの態様において、多様性は、任意の様々な方法（例えば、エラープローンPCR、チェーンシャッフリングまたはオリゴヌクレオチド指向変異導入）によって成熟のために選択された可変遺伝子に導入される。次いで、二次ライブラリーが作製される。次いで、このライブラリーは、所望のアフィニティを有する任意の抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入する別の方法は、いくつかのHVR残基（例えば、一度に4～6残基）を無作為化するHVR指向アプローチを含む。抗原結合に関与するHVR残基は、例えばアラニンスキャニング変異導入またはモデリングを用いて、具体的に特定され得る。特に、CDR-H3およびCDR-L3がしばしば標的化される。
特定の態様において、置換、挿入、または欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に減少させない限り、1つまたは複数のHVR内で行われ得る。例えば、結合アフィニティを実質的に減少させない保存的改変（例えば、本明細書で提供されるような保存的置換）が、HVRにおいて行われ得る。そのような改変は、例えば、HVRの抗原接触残基の外側であり得る。上記の変異VHおよびVL配列の特定の態様において、各HVRは改変されていないか、わずか1つ、2つ、もしくは3つのアミノ酸置換を含む。
変異導入のために標的化され得る抗体の残基または領域を同定するのに有用な方法は、Cunningham and Wells (1989), Science 244:1081-1085によって記載される、「アラニンスキャニング変異導入」と呼ばれるものである。この方法において、一残基または一群の標的残基（例えば、荷電残基、例えばアルギニン、アスパラギン酸、ヒスチジン、リジン、およびグルタミン酸）が同定され、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンもしくはポリアラニン）で置き換えられ、抗体と抗原の相互作用が影響を受けるかどうかが決定される。この初期置換に対して機能的感受性を示したアミノ酸位置に、さらなる置換が導入され得る。あるいはまたは加えて、抗体と抗原の間の接触点を同定するために、抗原抗体複合体の結晶構造を解析してもよい。そのような接触残基および近隣の残基を、置換候補として標的化してもよく、または置換候補から除外してもよい。変異体は、それらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
アミノ酸配列の挿入は、配列内部への単一または複数のアミノ酸残基の挿入と同様、アミノ末端および/またはカルボキシル末端における1残基から100残基以上を含むポリペプチドの長さの範囲での融合も含む。末端の挿入の例は、N末端にメチオニル残基を伴う抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体のN-またはC-末端に、酵素（例えば、ADEPTのための）または抗体の血漿中半減期を増加させるポリペプチドを融合させたものを含む。
ｂ) グリコシル化変異体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加させるまたは減少させるように改変されている。抗体へのグリコシル化部位の追加または削除は、1つまたは複数のグリコシル化部位を作り出すまたは取り除くようにアミノ酸配列を改変することにより、簡便に達成可能である。
抗体がFc領域を含む場合、そこに付加される炭水化物が改変されてもよい。哺乳動物細胞によって産生される天然型抗体は、典型的には、枝分かれした二分岐のオリゴ糖を含み、当該オリゴ糖は通常Fc領域のCH2ドメインのAsn297にN-リンケージによって付加されている。例えば、Wright et al., TIBTECH 15:26-32 (1997) 参照。オリゴ糖は、例えば、マンノース、N‐アセチルグルコサミン (GlcNAc)、ガラクトース、およびシアル酸などの種々の炭水化物、また、二分岐のオリゴ糖構造の「幹」中のGlcNAcに付加されたフコースを含む。いくつかの態様において、本発明の抗体中のオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を伴う抗体変異体を作り出すために行われてもよい。
一態様において、Fc領域に（直接的または間接的に）付加されたフコースを欠く炭水化物構造体を有する抗体変異体が提供される。例えば、そのような抗体におけるフコースの量は、1％～80％、1％～65％、5％～65％または20％～40％であり得る。フコースの量は、例えばWO2008/077546に記載されるようにMALDI-TOF質量分析によって測定される、Asn297に付加されたすべての糖構造体（例えば、複合、ハイブリッド、および高マンノース構造体）の和に対する、Asn297における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Asn297は、Fc領域の297位のあたりに位置するアスパラギン残基を表す（Fc領域残基のEUナンバリング）。しかし、複数の抗体間のわずかな配列の多様性に起因して、Asn297は、297位の±3アミノ酸上流または下流、すなわち294位～300位の間に位置することもあり得る。そのようなフコシル化変異体は、改善されたADCC機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第2003/0157108号 (Presta, L.) ；第2004/0093621号 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) を参照のこと。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異体に関する刊行物の例は、US2003/0157108; WO2000/61739; WO2001/29246; US2003/0115614; US2002/0164328; US2004/0093621; US2004/0132140; US2004/0110704; US2004/0110282; US2004/0109865; WO2003/085119; WO2003/084570; WO2005/035586; WO2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004) を含む。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例は、タンパク質のフコシル化を欠くLec13 CHO細胞（Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；US2003/0157108 A1、Presta, L；およびWO2004/056312 A1、Adams et al.、特に実施例11）およびノックアウト細胞株、例えばアルファ-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子FUT8ノックアウトCHO細胞（例えば、Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94(4):680-688 (2006)；およびWO2003/085107を参照のこと）を含む。
例えば抗体のFc領域に付加された二分枝型オリゴ糖がGlcNAcによって二分されている、二分されたオリゴ糖を有する抗体変異体がさらに提供される。そのような抗体変異体は、減少したフコシル化および/または改善されたADCC機能を有し得る。そのような抗体変異体の例は、例えば、WO2003/011878 (Jean-Mairet et al.) ；米国特許第6,602,684号 (Umana et al.)；およびUS2005/0123546 (Umana et al.) に記載されている。Fc領域に付加されたオリゴ糖中に少なくとも1つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。そのような抗体変異体は、改善されたCDC機能を有し得る。そのような抗体変異体は、例えば、WO1997/30087 (Patel et al.)；WO1998/58964 (Raju, S.)； およびWO1999/22764 (Raju, S.) に記載されている。
ｃ) Fc領域変異体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体のFc領域に1つまたは複数のアミノ酸修飾を導入して、それによりFc領域変異体を生成してもよい。Fc領域変異体は、1つまたは複数のアミノ酸ポジションのところでアミノ酸修飾（例えば、置換）を含む、ヒトFc領域配列（例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域）を含んでもよい。
特定の態様において、すべてではないがいくつかのエフェクター機能を備える抗体変異体も、本発明の考慮の内であり、当該エフェクター機能は、抗体を、そのin vivoでの半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（補体およびADCCなど）は不要または有害である場合の適用に望ましい候補とするものである。CDCおよび/またはADCC活性の低下/欠乏を確認するために、in vitroおよび/またはin vivoの細胞傷害測定を行うことができる。例えば、Fc受容体（FcR）結合測定は、抗体がFcγR結合性を欠く（よってADCC活性を欠く蓋然性が高い）一方でFcRn結合能を維持することを確かめるために行われ得る。ADCCを媒介するプライマリ細胞であるNK細胞はFcγRIIIのみを発現するが、一方単球はFcγRI、FcγRII、FcγRIIIを発現する。造血細胞上のFcRの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991) の第464頁のTable 3にまとめられている。目的の分子のADCC活性を評価するためのin vitro測定法（アッセイ）の非限定的な例は、米国特許第5,500,362号（例えば、Hellstrom I. et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 参照）および Hellstrom I. et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；米国特許第5,821,337号（Bruggemann M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987) 参照）に記載されている。あるいは、非放射性の測定法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリー用のACT1（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；および、CytoTox 96（登録商標）non-radioactive cytotoxicity assays 法 (Promega, Madison, WI) 参照）。このような測定法に有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞 (peripheral blood mononuclear cell: PBMC) およびナチュラルキラー (natural killer: NK) 細胞を含む。あるいはまたは加えて、目的の分子のADCC活性は、例えば、Clynes et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998) に記載されるような動物モデルにおいて、in vivoで評価されてもよい。また、抗体がC1qに結合できないこと、よってCDC活性を欠くことを確認するために、C1q結合測定を行ってもよい。例えば、WO2006/029879 および WO2005/100402のC1qおよびC3c結合ELISAを参照のこと。また、補体活性化を評価するために、CDC測定を行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)；およびCragg M.S. and M.J. Glennie et al., Blood 103:2738-2743 (2004) 参照）。さらに、FcRn結合性およびin vivoでのクリアランス/半減期の決定も、当該技術分野において知られた方法を用いて行い得る（例えばPetkova S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006) 参照）。
減少したエフェクター機能を伴う抗体は、Fc領域残基238、265、269、270、297、327、および329の1つまたは複数の置換を伴うものを含む（米国特許第6,737,056号）。このようなFc変異体は、残基265および297のアラニンへの置換を伴ういわゆる「DANA」Fc変異体（米国特許第7,332,581号）を含む、アミノ酸ポジション265、269、270、297、および327の2つ以上の置換を伴うFc変異体を含む。
FcRへの向上または低下した結合性を伴う特定の抗体変異体が、記述されている。（米国特許第6,737,056号；WO2004/056312、およびShields et al., J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001) を参照のこと。）
特定の態様において、抗体変異体は、ADCCを改善する1つまたは複数のアミノ酸置換（例えば、Fc領域のポジション298、333、および/または334（EUナンバリングでの残基）のところでの置換）を伴うFc領域を含む。
いくつかの態様において、例えば米国特許第6,194,551号、WO99/51642、およびIdusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000) に記載されるように、改変された（つまり、向上したか低下したかのいずれかである）C1q結合性および/または補体依存性細胞傷害 (CDC) をもたらす改変が、Fc領域においてなされる。
増加した半減期、および新生児型Fc受容体（FcRn：母体のIgG類を胎児に移行させる役割を負う（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)））に対する向上した結合性を伴う抗体が、米国特許出願公開第2005/0014934 A1号(Hinton et al.) に記載されている。これらの抗体は、Fc領域のFcRnへの結合性を向上させる1つまたは複数の置換をその中に伴うFc領域を含む。このようなFc変異体は、Fc領域残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、または434の1つまたは複数のところでの置換（例えば、Fc領域残基434の置換（米国特許第7,371,826号））を伴うものを含む。
Fc領域変異体の他の例については、Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第5,648,260号；米国特許第5,624,821号；およびWO94/29351も参照のこと。
ｄ) システイン改変抗体変異体
特定の態様において、抗体の1つまたは複数の残基がシステイン残基で置換された、システイン改変抗体（例えば、「thioMAb」）を作り出すことが望ましいだろう。特定の態様において、置換を受ける残基は、抗体の、アクセス可能な部位に生じる。それらの残基をシステインで置換することによって、反応性のチオール基が抗体のアクセス可能な部位に配置され、当該反応性のチオール基は、当該抗体を他の部分（薬剤部分またはリンカー‐薬剤部分など）にコンジュゲートして本明細書でさらに詳述するようにイムノコンジュゲートを作り出すのに使用されてもよい。特定の態様において、以下の残基の任意の1つまたは複数が、システインに置換されてよい：軽鎖のV205（Kabatナンバリング）；重鎖のA118（EUナンバリング）；および重鎖Fc領域のS400（EUナンバリング）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第7,521,541号に記載されるようにして生成されてもよい。
ｅ) 抗体誘導体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、当該技術分野において知られておりかつ容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むように、さらに修飾されてもよい。抗体の誘導体化に好適な部分は、これに限定されるものではないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、これらに限定されるものではないが、ポリエチレングリコール (PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ１,3ジオキソラン、ポリ1,3,6,トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれでも）、および、デキストランまたはポリ（n-ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール類（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、および、これらの混合物を含む。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水に対する安定性のために、製造において有利であるだろう。ポリマーは、いかなる分子量でもよく、枝分かれしていてもしていなくてもよい。抗体に付加されるポリマーの数には幅があってよく、2つ以上のポリマーが付加されるならそれらは同じ分子であってもよいし、異なる分子であってもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数および/またはタイプは、これらに限定されるものではないが、改善されるべき抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が規定の条件下での療法に使用されるか否か、などへの考慮に基づいて、決定することができる。
別の態様において、抗体と、放射線に曝露することにより選択的に熱せられ得る非タンパク質部分との、コンジュゲートが提供される。一態様において、非タンパク質部分は、カーボンナノチューブである（Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)）。放射線はいかなる波長でもよく、またこれらに限定されるものではないが、通常の細胞には害を与えないが抗体‐非タンパク質部分に近接した細胞を死滅させる温度まで非タンパク質部分を熱するような波長を含む。
Ｂ．組み換えの方法および構成
例えば、米国特許第4,816,567号に記載されるとおり、抗体は組み換えの方法や構成を用いて製造することができる。一態様において、本明細書に記載の抗C1S抗体をコードする、単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および/またはVHを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖および/または重鎖）をコードしてもよい。さらなる態様において、このような核酸を含む1つまたは複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる態様において、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような態様の1つでは、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または、(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一のベクターと抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二のベクターを含む（例えば、形質転換されている）。一態様において、宿主細胞は、真核性である（例えば、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞）またはリンパ系の細胞（例えば、Y0、NS0、SP2/0細胞））。一態様において、抗C1S抗体の発現に好適な条件下で、上述のとおり当該抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、および任意で、当該抗体を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することを含む、抗C1S抗体を作製する方法が提供される。
抗C1S抗体の組み換え製造のために、（例えば、上述したものなどの）抗体をコードする核酸を単離し、さらなるクローニングおよび/または宿主細胞中での発現のために、1つまたは複数のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手順を用いて容易に単離および配列決定されるだろう（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることで）。
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞を含む。例えば、抗体は、特にグリコシル化およびFcエフェクター機能が必要とされない場合は、細菌で製造してもよい。細菌での抗体断片およびポリペプチドの発現に関して、例えば、米国特許第5,648,237号、第5,789,199号、および第5,840,523号を参照のこと。（加えて、大腸菌における抗体断片の発現について記載したCharlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp.245-254も参照のこと。）発現後、抗体は細菌細胞ペーストから可溶性フラクション中に単離されてもよく、またさらに精製することができる。
原核生物に加え、部分的なまたは完全なヒトのグリコシル化パターンを伴う抗体の産生をもたらす、グリコシル化経路が「ヒト化」されている菌類および酵母の株を含む、糸状菌または酵母などの真核性の微生物は、抗体コードベクターの好適なクローニングまたは発現宿主である。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)および Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) を参照のこと。
多細胞生物（無脊椎生物および脊椎生物）に由来するものもまた、グリコシル化された抗体の発現のために好適な宿主細胞である。無脊椎生物細胞の例は、植物および昆虫細胞を含む。昆虫細胞との接合、特にSpodoptera frugiperda細胞の形質転換に用いられる、数多くのバキュロウイルス株が同定されている。
植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第5,959,177号、第6,040,498号、第6,420,548号、第7,125,978号、および第6,417,429号（トランスジェニック植物で抗体を産生するための、PLANTIBODIES（商標）技術を記載）を参照のこと。
脊椎動物細胞もまた宿主として使用できる。例えば、浮遊状態で増殖するように適応された哺乳動物細胞株は、有用であろう。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40で形質転換されたサル腎CV1株 (COS-7)；ヒト胎児性腎株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977) などに記載の293または293細胞）；仔ハムスター腎細胞 (BHK)；マウスセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980) などに記載のTM4細胞）；サル腎細胞 (CV1)；アフリカミドリザル腎細胞 (VERO-76)；ヒト子宮頸部癌細胞 (HELA)；イヌ腎細胞 (MDCK)；Buffalo系ラット肝細胞 (BRL 3A)；ヒト肺細胞 (W138)；ヒト肝細胞 (Hep G2)；マウス乳癌 (MMT 060562)；TRI細胞（例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982) に記載）；MRC5細胞；および、FS4細胞などである。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、DHFR- CHO細胞 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)) を含むチャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞；およびY0、NS0、およびSp2/0などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に好適な特定の哺乳動物宿主細胞株の総説として、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003) を参照のこと。
pH依存性を有する抗体は、例えばWO 2009/125825に記載されるような、スクリーニング方法および/または変異誘発方法を用いることによって取得され得る。当該スクリーニング方法は、特定の抗原に特異的な抗体の集団内からpH依存的結合特性を有する抗体を同定する任意のプロセスを含み得る。特定の態様において、当該スクリーニング方法は、酸性pHおよび中性pHの両方において初期抗体集団内の個々の抗体の1つまたは複数の結合パラメータ（例えば、KDまたはkd）を測定することを含み得る。抗体の結合パラメータは、例えば表面プラズモン共鳴、または特定の抗原に対する抗体の結合特性の定量的もしくは定性的な評価を可能にする任意の他の分析方法を用いて測定され得る。特定の態様において、当該スクリーニング方法は、2以上の酸性KD/中性KD比で抗原に結合する抗体を同定することを含み得る。あるいは、当該スクリーニング方法は、2以上の酸性kd/中性kd比で抗原に結合する抗体を同定することを含み得る。
別の態様において、変異誘発方法は、抗原に対する抗体のpH依存的結合性を増強するために抗体の重鎖内および/または軽鎖内にアミノ酸の欠失、置換または付加を組み込むことを含み得る。特定の態様において、変異誘発は、抗体の1つまたは複数の可変ドメイン内、例えば1つまたは複数のHVR（例えば、CDR）内で行われ得る。例えば、変異誘発は、抗体の1つまたは複数のHVR（例えば、CDR）内のアミノ酸を別のアミノ酸で置換することを含み得る。特定の態様において、変異誘発は、抗体の少なくとも1つのHVR（例えば、CDR）内の1つまたは複数のアミノ酸をヒスチジンで置換することを含み得る。特定の態様において、「増強されたpH依存的結合性」は、変異型の抗体が、変異誘発前の元の「親」抗体（すなわち、pH依存性の低い抗体）よりも大きな酸性KD/中性KD比または大きな酸性kd/中性kd比を示すことを意味する。特定の態様において、変異型の抗体は、2以上の酸性KD/中性KD比を有する。あるいは、変異型の抗体は、2以上の酸性kd/中性kd比を有する。
ポリクローナル抗体は好ましくは、関連する抗原およびアジュバントの複数回の皮下(sc)または腹腔内(ip)注射により動物において産生される。関連する抗原を、免疫化される種において免疫原性であるタンパク質に、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシン阻害因子に、二官能性物質または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介するコンジュゲーション）、N-ヒドロキシスクシンイミド(リシン残基を介する)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2、またはR1N=C=NR(ここでRおよびR1は異なるアルキル基である)を用いて、コンジュゲートすることが有用であり得る。
動物(通常は非ヒト哺乳動物)は、例えば、(ウサギまたはマウスについてそれぞれ)100μgまたは5μgのタンパク質またはコンジュゲートを3倍容量のフロイント完全アジュバントと組み合わせてその溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体に対して免疫化される。1ヶ月後、複数部位に皮下注射することによって、最初の量の1/5～1/10の、フロイント完全アジュバント中のペプチドまたはコンジュゲートで該動物を追加免疫する。7～14日後、該動物から採血し、血清を抗体力価についてアッセイする。力価がプラトーに達するまで動物を追加免疫する。好ましくは、同一抗原であるが別のタンパク質にコンジュゲートされたおよび/または別の架橋試薬を介してコンジュゲートされたコンジュゲートを用いて、該動物を追加免疫する。コンジュゲートは、組み換え細胞培養物中でタンパク質融合体として調製することも可能である。また、免疫応答を増強するために、ミョウバンなどの凝集剤も好適に使用される。
モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られ、すなわち、該集団を構成する個々の抗体は、若干量存在しうる自然に生じる潜在的な突然変異および/または翻訳後修飾(例えば、異性化、アミド化)を除いて同一である。したがって、修飾語「モノクローナル」は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示している。
例えば、モノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature 256(5517):495-497 (1975)に最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製することができる。ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターを本明細書に上記したように免疫化して、免疫化に使用されたタンパク質に特異的に結合する抗体を製造するか製造する能力があるリンパ球を誘導する。あるいは、リンパ球をin vitroで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的には、抗原タンパク質またはその融合変異体を包含する。一般的に、ヒト起源の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(PBL)が使用され、非ヒト哺乳動物源が望まれる場合には脾臓細胞またはリンパ節細胞が使用される。その後、リンパ球は、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いて不死化細胞株と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), pp. 59-103)。
不死化細胞株は通常、形質転換された哺乳動物細胞、特に、げっ歯類、ウシおよびヒト起源のミエローマ細胞である。通常は、ラットまたはマウスのミエローマ細胞株が利用される。このようにして作製されたハイブリドーマ細胞を、未融合の親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する1種以上の物質を好ましくは含有する適切な培養培地中に播種して増殖させる。例えば、親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRTまたはHPRT)を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的には、HGPRT欠損細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン(HAT培地)を含むであろう。
好ましい不死化ミエローマ細胞とは、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの製造を補助し、かつHAT培地のような培地に対して感受性である、細胞である。これらの中でも、マウスミエローマ株、例えば、米国カリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerから入手できるMOPC-21およびMPC-11マウス腫瘍に由来するもの、ならびに米国バージニア州マナッサスのAmerican Type Culture Collectionから入手できるSP-2細胞(およびその誘導体、例えばX63-Ag8-653)が好ましい。ヒトモノクローナル抗体の製造について、ヒトミエローマ細胞株およびマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株もまた、記載されている(Kozbor et al., J Immunol. 133(6):3001-3005 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 51-63 (1987))。
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の製造についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により製造されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはin vitro結合測定法、例えば放射免疫測定法(RIA)もしくは酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によって決定される。このような技術および測定法は当技術分野で公知である。例えば、結合アフィニティは、Munson, Anal Biochem. 107(1):220-239 (1980)のスキャッチャード(Scatchard)解析によって求めることができる。
所望の特異性、アフィニティ、および/または活性の抗体を製造するハイブリドーマ細胞が特定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングして、標準的な方法(Goding、前掲)により増殖させることができる。この目的のための適切な培養培地としては、例えば、D-MEMまたはRPMI-1640培地が挙げられる。また、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物内の腫瘍としてin vivoで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、培養培地、腹水、または血清から、例えば、プロテインA-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製法によって、適切に分離される。
Ｃ．測定法（アッセイ）
本明細書で提供される抗C1S抗体は、当該技術分野において知られている種々の測定法によって、同定され、スクリーニングされ、または物理的/化学的特性および/または生物活性について明らかにされてもよい。
１．結合測定法およびその他の測定法
一局面において、本発明の抗体は、例えばELISA、ウエスタンブロット等の公知の方法によって、その抗原結合活性に関して試験される。
別の局面において、C1Sへの結合に関して、本明細書に記載されるいずれかの抗C1S抗体と競合する抗体を同定するために、競合アッセイが使用され得る。特定の態様において、そのような競合抗体が過剰に存在する場合、これは、C1Sに対する参照抗体の結合を少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、またはそれ以上阻止する（例えば低減させる）。特定の態様において、そのような競合抗体は、本明細書に記載されるいずれかの抗C1S抗体によって結合されるのと同じエピトープ（例えば、線状または立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングする、詳細な例示的方法は、Morris (1996), "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。特定の態様において、そのような競合アッセイを中性pH条件で実施することができる。
例示的な競合アッセイにおいて、固定化されたC1Sは、C1Sに結合する第1の標識された抗体（例えば、本明細書に記載されているもののうちの1つ）およびC1Sへの結合に関して第1の抗体と競合する能力に関して試験される第2の未標識の抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第2の抗体は、ハイブリドーマ上清に存在し得る。対照として、固定化されたC1Sが、第1の標識された抗体を含むが第2の未標識の抗体を含まない溶液中でインキュベートされる。第1の抗体のC1Sへの結合を許容する条件下でのインキュベーションの後、余分な未結合の抗体が除去され、固定化されたC1Sに結合した標識の量が測定される。固定化されたC1Sに結合した標識の量が対照サンプルと比較して試験サンプルにおいて実質的に減少している場合、それは第2の抗体がC1Sへの結合に関して第1の抗体と競合していることを示す。Harlow and Lane (1988), Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照のこと。
別の局面において、本明細書で提供される抗C1s抗体と同じエピトープに結合するまたは本明細書で提供される抗C1s抗体とC1sへの結合に関して競合する抗体は、サンドイッチアッセイを用いて同定され得る。サンドイッチアッセイは2つの抗体を使用することを含み、当該抗体はそれぞれ、検出したいタンパク質の異なる免疫原性部分またはエピトープに結合することができる。サンドイッチアッセイにおいて、固体支持体上に固定化された第1の抗体に試験サンプルアナライトが結合し、その後に第2の抗体がアナライトに結合し、それによって不溶性の3者複合体が形成される。David & Greene、米国特許第4,376,110号を参照のこと。第2の抗体は、それ自体が検出可能部分で標識されてもよい（直接サンドイッチアッセイ）し、検出可能部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定されてもよい（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの1つはELISAアッセイであり、この例において、検出可能部分は酵素である。本明細書で提供される抗C1s抗体と同時にC1sに結合する抗体は、当該抗C1s抗体と異なるエピトープに結合する抗体であると決定され得る。したがって、本明細書で提供される抗C1s抗体と同時にはC1sに結合しない抗体は、当該抗C1s抗体と同じエピトープに結合するまたは当該抗C1s抗体とC1sへの結合に関して競合する抗体であると決定され得る。
2. 活性アッセイ
一局面において、生物活性を有する抗C1s抗体を同定するためのアッセイが提供される。生物活性には、古典経路の活性化の阻止、および当該経路の活性化により生じる切断産物であるC2a、C2b、C3a、C3b、C4a、C4b、C5a、およびC5bの生成の阻止が含まれ得る。in vivoおよび/またはin vitroでそのような生物活性を有する抗体も提供される。
特定の態様において、本発明の抗体は、そのような生物活性について試験される。いくつかの態様において、本発明の抗体は、cRBC抗原に対する抗体によって感作されたニワトリ赤血球細胞（cRBC）の補体介在性の溶血を阻害するその能力について評価され得る。補体タンパク質の供給源としてヒト血清を用いると、放出されたヘモグロビンの量を分光光度法により測定することによって、本発明の抗体の活性を決定することができる。いくつかの態様において、本発明の抗体は、活性化C1sを介した精製C4（C2ではない）の切断を阻害するその能力について評価され得る。抗体のこの活性は、切断されたC4またはC2の量をゲル電気泳動法またはウェスタンブロット法により測定することによって決定される。切断されたC4またはC2は、その天然の非切断形態と比較して小さな分子量によって検出され得る。
3. 抗原（C1s）除去を評価するためのマウスPK試験
特定の態様において、本発明の抗体による抗原（例えば、ヒトC1s（hC1sとも称される））の除去の促進は、in vivoで（例えば、マウスにおいて）以下のようにして評価することができる。
高速液体クロマトグラフィー－エレクトロスプレータンデム質量分析（LC/ESI-MS/MS）によるマウス血漿中のC1s濃度の測定
マウス血漿中のhC1s（または抗C1s抗体）の濃度を、LC/ESI-MS/MSによって測定することができる。規定量のhC1s（または抗C1s抗体）をマウス血漿中で混合および希釈することによって、較正標準を調製する。較正標準および血漿サンプルを、例えば重炭酸アンモニウム中で尿素、ジチオトレイトールおよびリゾチーム（ニワトリ卵白）と混合し、インキュベートする。その後、ヨードアセトアミドを添加し、暗所でインキュベートする。次に、重炭酸アンモニウム中のトリプシンを添加し、インキュベートする。最後に、トリフルオロ酢酸を添加して残留トリプシンを不活性化させる。このサンプルを、LC/ESI-MS/MSによる分析に供する。ヒトC1s特異的ペプチド（例えば、LLEVPEGR）を、選択反応モニタリング（SRM）によりモニタリングする。SRMトランジションは、ヒトC1sの場合、[M+2H]2+（m/z 456.8）～y6イオン（m/z 686.4）であり得る。較正曲線は、濃度に対してプロットされたピーク面積を用いる加重（1/x2）線形回帰により作成され得る。この較正曲線からマウス血漿中の濃度を算出する。
マウスにおける抗C1s抗体の投与後の総hC1sの薬物動態の評価
hC1s、hC1q、または抗C1s抗体のin vivo薬物動態は、抗原を単独でまたは抗C1s抗体と共にマウスに投与した後に評価され得る。hC1s（等）を含む溶液/混合物をマウスに静脈内注射する。抗原溶液の投与後、同じ個体に同じ方法で抗C1s抗体溶液を直ちに投与する。用量設定は、ほぼすべてのhC1sが血中で結合形態になるよう適切に設計され得る。血液を経時的に、例えば、注射から5、30分、2、7時間、3、7、14、21および28日後に収集する。血液を直ちに遠心分離して、血漿サンプルを分離する。hC1s（等）の血漿中濃度を、各サンプル収集時点で、LC/ESI-MS/MSによって測定する。hC1s（等）のPKパラメータを、非コンパートメント解析によって概算する。例えば、抗C1s抗体について、hC1s CL（クリアランス）比を算出する。この比が高い場合、これは、hC1s除去がより促進され得ることを意味する。
Ｄ．イムノコンジュゲート
本発明はまた、1つまたは複数の細胞傷害剤（例えば化学療法剤または化学療法薬、増殖阻害剤、毒素（例えば細菌、真菌、植物もしくは動物起源のタンパク質毒素、酵素的に活性な毒素、もしくはそれらの断片）または放射性同位体）にコンジュゲートされた本明細書の抗C1S抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
一態様において、イムノコンジュゲートは、抗体が、これらに限定されるものではないが以下を含む1つまたは複数の薬剤にコンジュゲートされた、抗体－薬剤コンジュゲート (antibody-drug conjugate: ADC) である：メイタンシノイド（米国特許第5,208,020号、第5,416,064号、および欧州特許第0,425,235号B1参照）；例えばモノメチルオーリスタチン薬剤部分DEおよびDF（MMAEおよびMMAF）（米国特許第5,635,483号および第5,780,588号および第7,498,298号参照）などのオーリスタチン；ドラスタチン；カリケアマイシンまたはその誘導体（米国特許第5,712,374号、第5,714,586号、第5,739,116号、第5,767,285号、第5,770,701号、第5,770,710号、第5,773,001号、および第5,877,296号；Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)；ならびにLode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998) 参照）；ダウノマイシンまたはドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006)；Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006)；Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005)；Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000)；Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002)；King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)；および米国特許第6,630,579号参照）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、およびオルタタキセルなどのタキサン；トリコテセン；ならびにCC1065。
別の態様において、イムノコンジュゲートは、これらに限定されるものではないが以下を含む酵素的に活性な毒素またはその断片にコンジュゲートされた、本明細書に記載の抗体を含む：ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素A鎖（緑膿菌 (Pseudomonas aeruginosa) 由来）、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、アルファ-サルシン、シナアブラギリ (Aleurites fordii) タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ (Phytolacca americana) タンパク質（PAPI、PAPIIおよびPAP-S）、ツルレイシ (momordica charantia) 阻害剤、クルシン (curcin)、クロチン、サボンソウ (saponaria officinalis) 阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン (mitogellin)、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、ならびにトリコテセン。
別の態様において、イムノコンジュゲートは、放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートされた本明細書に記載の抗体を含む。様々な放射性同位体が放射性コンジュゲートの製造に利用可能である。例は、211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212Pb、およびLuの放射性同位体を含む。放射性コンジュゲートを検出のために使用する場合、放射性コンジュゲートは、シンチグラフィー検査用の放射性原子（例えばTc-99mもしくは123I）、または、核磁気共鳴 (NMR) イメージング（磁気共鳴イメージング、MRIとしても知られる）用のスピン標識（例えばここでもヨウ素-123、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガン、または鉄）を含み得る。
抗体および細胞傷害剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質連結剤を用いて作製され得る。例えばN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート (SPDP)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート (SMCC)、イミノチオラン (IT)、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルHCl）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス-アジド化合物（例えば、ビス（p-アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス-ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン2,6-ジイソシアネート）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン）である。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al., Science 238:1098 (1987) に記載されるようにして調製され得る。炭素-14標識された1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸 (MX-DTPA) は、抗体への放射性核種のコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。WO94/11026を参照のこと。リンカーは、細胞内での細胞傷害薬の放出を促進する「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)；米国特許第5,208,020号）が使用され得る。
本明細書のイムノコンジュゲートまたはADCは、（例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aから）市販されているBMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、およびスルホ-SMPB、ならびにSVSB（スクシンイミジル-(4-ビニルスルホン)ベンゾエート）を含むがこれらに限定されない架橋試薬を用いて調製されるコンジュゲートを明示的に考慮するが、これらに限定されない。
Ｅ．診断および検出のための方法および組成物
特定の態様において、本明細書で提供される抗C1S抗体のいずれも、生物学的サンプルにおけるC1Sの存在を検出するのに有用である。本明細書で用いられる用語「検出」は、定量的または定性的な検出を包含する。特定の態様において、生物学的サンプルは、細胞または組織、例えば、血清、全血、血漿、生検サンプル、組織サンプル、細胞懸濁物、唾液、痰、口腔液、脳脊髄液、羊水、腹水、母乳、初乳、乳腺分泌物、リンパ液、尿、汗、涙液、胃液、滑液、腹水、眼用レンズ液、または粘液を含む。
一態様において、診断方法または検出方法において使用するための抗C1S抗体が提供される。さらなる局面において、生物学的サンプル中のC1Sの存在を検出する方法が提供される。特定の態様において、この方法は、C1Sへの抗C1S抗体の結合が許容される条件下で本明細書に記載の抗C1S抗体と生物学的サンプルを接触させること、および抗C1S抗体とC1Sの間で複合体が形成されたかどうかを検出することを含む。そのような方法は、in vitroの方法またはin vivoの方法であり得る。一態様において、抗C1S抗体は、例えばC1Sが患者を選択するためのバイオマーカーである場合、抗C1S抗体を用いる治療に適合する被験体を選択するために使用される。
本発明の抗体を用いて診断され得る障害の例には、加齢性黄斑変性症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、アナフィラキシー、嗜銀顆粒性認知症、関節炎（例えば、関節リウマチ）、喘息、アテローム性動脈硬化症、非典型溶血性尿毒症症候群、自己免疫疾患、バラケル・シモンズ症候群（Barraquer-Simons syndrome）、ベーチェット病、英国型アミロイドアンギオパチー、水疱性類天疱瘡、バージャー病、C1q腎症、がん、劇症型抗リン脂質抗体症候群、脳アミロイドアンギオパチー、寒冷凝集素症、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、クローン病、クリオグロブリン血症性血管炎、拳闘家痴呆、レビー小体型認知症（DLB）、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、円板状エリテマトーデス、ダウン症候群、巣状分節性糸球体硬化症、形式的思考障害、前頭側頭型認知症（FTD）、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、ギラン・バレー症候群、ハラーホルデン・スパッツ症候群、溶血性尿毒症症候群、遺伝性血管浮腫、低ホスファターゼ症、特発性肺炎症候群、免疫複合体病、封入体筋炎、感染症（例えば、細菌（例えば、髄膜炎菌もしくはレンサ球菌）、ウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（HIV））または他の感染病原体によって引き起こされる疾患）、炎症疾患、虚血/再灌流障害、軽度認知障害、免疫性血小板減少性紫斑病（ITP）、モリブデン補因子欠損症（MoCD）A型、膜性増殖性糸球体腎炎（MPGN）I、膜性増殖性糸球体腎炎（MPGN）II（デンスデポジット病）、膜性腎炎、多発梗塞性認知症、ループス（全身性エリテマトーデス（SLE））、糸球体腎炎、川崎病、多巣性運動ニューロパチー、多発性硬化症、多系統萎縮症、重症筋無力症、心筋梗塞、筋強直性ジストロフィー、視神経脊髄炎、ニーマン・ピック病C型、神経原線維変化を呈する非グアム型運動ニューロン疾患、パーキンソン病、認知症を伴うパーキンソン病、発作性夜間血色素尿症、尋常性天疱瘡、ピック病、脳炎後パーキンソン病、多発筋炎、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺、乾癬、敗血症、志賀毒素産生性大腸菌（E.coli）（STEC）-HuS、脊髄性筋萎縮症、脳卒中、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維型認知症、移植片拒絶、血管炎（例えば、ANCA関連血管炎）、ヴェグナー肉芽腫症、鎌状赤血球症、クリオグロブリン血症、混合性クリオグロブリン血症、本態性混合性クリオグロブリン血症、II型混合性クリオグロブリン血症、III型混合性クリオグロブリン血症、腎炎、薬物性血小板減少症、ループス腎炎、水疱性類天疱瘡、後天性表皮水疱症、遅発性溶血性輸血反応、低補体血症性蕁麻疹様血管炎症候群、偽水晶体性水疱性角膜症、および血小板輸血不応状態が含まれるが、これらに限定されない。
特定の態様において、標識された抗C1S抗体が提供される。標識は、直接的に検出される標識または部分（例えば、蛍光標識、発色標識、高電子密度標識、化学発光標識、および放射性標識）ならびに、例えば酵素反応または分子間相互作用を通じて間接的に検出される部分（例えば酵素またはリガンド）を含むが、これらに限定されない。例示的な標識は、これらに限定されるものではないが、以下を含む：放射性同位体32P、14C、125I、3Hおよび131I、希土類キレートなどの発蛍光団またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第4,737,456号）などのルシフェラーゼ、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ (horseradish peroxidase: HRP)、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、単糖オキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ）、過酸化水素を用いて色素前駆体を酸化する酵素（例えばHRP、ラクトペルオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダーゼ）と連結されたもの、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなどの複素環オキシダーゼ、ビオチン/アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定なフリーラジカル類、ならびにこれらに類するもの。
Ｆ．薬学的製剤
本明細書に記載の抗C1S抗体の薬学的製剤は、所望の純度を有する抗体を、1つまたは複数の任意の薬学的に許容される担体 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、調製される。薬学的に許容される担体は、概して、用いられる際の用量および濃度ではレシピエントに対して非毒性であり、これらに限定されるものではないが、以下のものを含む：リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む、抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノール；およびm-クレゾールなど）；低分子（約10残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物；EDTAなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトールなどの、砂糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン類；金属錯体（例えば、Zn-タンパク質錯体）；および/またはポリエチレングリコール (PEG) などの非イオン系表面活性剤。本明細書の例示的な薬学的に許容される担体は、さらに、可溶性中性活性型ヒアルロニダーゼ糖タンパク質 (sHASEGP)（例えば、rHuPH20 (HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.) などのヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質）などの間質性薬剤分散剤を含む。特定の例示的sHASEGPおよびその使用方法は（rHuPH20を含む）、米国特許出願公開第2005/0260186号および第2006/0104968号に記載されている。一局面において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼなどの1つまたは複数の追加的なグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第6,267,958号に記載されている。水溶液抗体製剤は、米国特許第6,171,586号およびWO2006/044908に記載のものを含み、後者の製剤はヒスチジン－アセテート緩衝液を含んでいる。
本明細書の製剤は、治療される特定の適応症のために必要であれば1つより多くの有効成分を含んでもよい。互いに悪影響を与えあわない相補的な活性を伴うものが好ましい。例えば、併用療法に用いられる製剤をさらに提供することが望ましい場合がある。このような有効成分は、意図された目的のために有効である量で、好適に組み合わせられて存在する。
有効成分は、例えば液滴形成（コアセルベーション）手法によってまたは界面重合によって調製されたマイクロカプセル（それぞれ、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル）に取り込まれてもよいし、コロイド状薬剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）に取り込まれてもよいし、マクロエマルションに取り込まれてもよい。このような手法は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) に開示されている。
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含んだ固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスを含み、当該マトリクスは例えばフィルムまたはマイクロカプセルなどの造形品の形態である。
生体内 (in vivo) 投与のために使用される製剤は、通常無菌である。無菌状態は、例えば滅菌ろ過膜を通して濾過することなどにより、容易に達成される。
Ｇ．治療的方法および治療用組成物
本明細書で提供される抗C1S抗体のいずれも、治療的な方法において使用されてよい。
一局面において、医薬品としての使用のための、抗C1S抗体が提供される。さらなる局面において、補体介在性の疾患または障害の治療における使用のための、抗C1S抗体が提供される。特定の態様において、治療方法における使用のための、抗C1S抗体が提供される。特定の態様において、本発明は、補体介在性の疾患または障害を有する個体を治療する方法であって、当該個体に抗C1S抗体の有効量を投与する工程を含む方法における使用のための、抗C1S抗体を提供する。このような態様の1つにおいて、方法は、当該個体に少なくとも1つの追加治療剤の有効量を投与する工程を、さらに含む。上記態様の任意のものによる「個体」は、好適にはヒトである。
さらなる態様において、本発明は、補体介在性の疾患または障害の治療に使用するための抗C1s抗体を提供する。さらなる態様において、本発明の抗C1s抗体は、血漿からのC1sのクリアランスの増強に使用するためのものであり得る。さらなる態様において、本発明の抗C1s抗体は、血漿からのC1q、C1rおよびC1sの複合体のクリアランスの増強に使用するためのものであり得る。さらなる態様において、本発明の抗C1s抗体は、補体成分C4の切断の阻害に使用するためのものであり得、ここで該抗体は補体成分C2の切断を阻害しない。いくつかの例において、当該抗体は古典的補体経路の成分を阻害し、いくつかの例において、古典的補体経路の成分はC1sである。特定の態様において、本発明は、補体介在性の疾患または障害の治療方法において使用するための抗C1s抗体を提供する。特定の態様において、本発明は、血漿からのC1sのクリアランスを増強する方法において使用するための抗C1s抗体を提供する。特定の態様において、本発明は、血漿からのC1q、C1r、およびC1sの複合体のクリアランスを増強する方法において使用するための抗C1s抗体を提供する。特定の態様において、本発明は、補体成分C4の切断を阻害する方法において使用するための抗C1s抗体であって、補体成分C2の切断を阻害しない、抗体を提供する。特定の態様において、本発明は、古典的補体経路の成分を阻害する方法において使用するための抗C1s抗体を提供し、いくつかの例において、古典的補体経路の成分はC1sである。上述の態様の任意のものにおいて、「個体」は好ましくはヒトである。
一局面において、本開示は、補体活性化を調整する方法を提供する。いくつかの態様において、この方法は、例えばC4b2aの産生を減少させるよう、補体の活性化を阻害する。いくつかの態様において、本開示は、補体介在性の疾患または障害を有する個体において補体の活性化を調整する方法であって、本開示の抗C1s抗体または本開示の薬学的組成物を個体に投与する工程を含み、薬学的組成物が本開示の抗C1s抗体を含む、方法を提供する。いくつかの態様において、そのような方法は、補体活性化を阻害する。いくつかの態様において、個体は哺乳動物である。いくつかの態様において、個体はヒトである。投与は、本明細書で開示されるものを含む、当業者に公知の任意の経路によるものであり得る。いくつかの態様において、投与は静脈内投与または皮下投与である。いくつかの態様において、投与は髄腔内投与である。
補体介在性の疾患または障害は、個体の細胞、組織、または体液における異常な量の補体C1sまたは異常なレベルの補体C1sタンパク質分解活性によって特徴づけられる障害である。
いくつかの例において、補体介在性の疾患または障害は、細胞、組織、または体液における増加した（通常より多い）量のC1sまたは上昇したレベルの補体C1s活性の存在によって特徴づけられる。例えば、いくつかの例において、補体介在性の疾患または障害は、脳組織および/または脳脊髄液における増加した量のC1sおよび/または上昇した活性のC1sの存在によって特徴づけられる。細胞、組織、または体液における「通常より多い」量のC1sは、その細胞、組織、または体液中のC1sの量が通常の対照レベルよりも多い、例えば、同じ年齢グループの個体または個体集団の通常の対照レベルよりも多いことを示す。細胞、組織、または体液における「通常よりも高い」レベルのC1s活性は、その細胞、組織、または体液においてC1sによりもたらされるタンパク質分解切断が通常の対照レベルよりも高い、例えば、同じ年齢グループの個体または個体集団の通常の対照レベルよりも高いことを示す。いくつかの例において、補体介在性の疾患または障害を有する個体は、そのような疾患または障害の1つまたは複数のさらなる症状を示す。
他の例において、補体介在性の疾患または障害は、細胞、組織、または体液における通常よりも少ない量のC1sまたは低いレベルの補体C1s活性の存在によって特徴づけられる。例えば、いくつかの例において、補体介在性の疾患または障害は、脳組織および/または脳脊髄液における少ない量のC1sおよび/または低い活性のC1sの存在によって特徴づけられる。細胞、組織、または体液における「通常よりも少ない」量のC1sは、その細胞、組織、または体液におけるC1sの量が通常の対照レベルよりも少ない、例えば、同じ年齢グループの個体または個体集団の通常の対照レベルよりも少ないことを示す。細胞、組織、または体液における「通常よりも低い」レベルのC1s活性は、その細胞、組織、または体液においてC1sによりもたらされるタンパク質分解切断が通常の対照レベルよりも低い、例えば、同じ年齢グループの個体または個体集団の通常の対照レベルよりも低いことを示す。いくつかの例において、補体介在性の疾患または障害を有する個体は、そのような疾患または障害の1つまたは複数のさらなる症状を示す。
補体介在性の疾患または障害は、補体C1sの量または活性が個体において疾患または障害を引き起こす程度のものである疾患または障害である。いくつかの態様において、補体介在性の疾患または障害は、自己免疫疾患、がん、血液疾患、感染症、炎症疾患、虚血・再灌流障害、神経変性疾患、神経変性障害、眼疾患、腎臓疾患、移植片拒絶、血管疾患、および血管炎疾患からなる群より選択される。いくつかの態様において、補体介在性の疾患または障害は、自己免疫疾患である。いくつかの態様において、補体介在性の疾患または障害は、がんである。いくつかの態様において、補体介在性の疾患または障害は、感染疾患である。いくつかの態様において、補体介在性の疾患または障害は、炎症疾患である。いくつかの態様において、補体介在性の疾患または障害は、血液疾患である。いくつかの態様において、補体介在性の疾患または障害は、虚血・再灌流疾患である。いくつかの態様において、補体介在性の疾患または障害は、眼疾患である。いくつかの態様において、補体介在性の疾患または障害は、腎臓疾患である。いくつかの態様において、補体介在性の疾患または障害は、移植片拒絶である。いくつかの態様において、補体介在性の疾患または障害は、抗体による移植片拒絶である。いくつかの態様において、補体介在性の疾患または障害は、血管疾患である。いくつかの態様において、補体介在性の疾患または障害は、血管炎疾患である。いくつかの態様において、補体介在性の疾患または障害は、神経変性疾患または障害である。いくつかの態様において、補体介在性の疾患は、神経変性疾患である。いくつかの態様において、補体介在性の障害は、神経変性障害である。いくつかの態様において、補体介在性の疾患または障害は、タウロパチーである。
補体介在性の疾患または障害の例には、加齢性黄斑変性症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、アナフィラキシー、嗜銀顆粒性認知症、関節炎（例えば、関節リウマチ）、喘息、アテローム性動脈硬化症、非典型溶血性尿毒症症候群、自己免疫疾患、バラケル・シモンズ症候群（Barraquer-Simons syndrome）、ベーチェット病、英国型アミロイドアンギオパチー、水疱性類天疱瘡、バージャー病、C1q腎症、がん、劇症型抗リン脂質抗体症候群、脳アミロイドアンギオパチー、寒冷凝集素症、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、クローン病、クリオグロブリン血症性血管炎、拳闘家痴呆、レビー小体型認知症（DLB）、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、円板状エリテマトーデス、ダウン症候群、巣状分節性糸球体硬化症、形式的思考障害、前頭側頭型認知症（FTD）、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、ギラン・バレー症候群、ハラーホルデン・スパッツ症候群、溶血性尿毒症症候群、遺伝性血管浮腫、低ホスファターゼ症、特発性肺炎症候群、免疫複合体病、封入体筋炎、感染症（例えば、細菌（例えば、髄膜炎菌もしくはレンサ球菌）、ウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（HIV））または他の感染病原体によって引き起こされる疾患）、炎症疾患、虚血/再灌流障害、軽度認知障害、免疫性血小板減少性紫斑病（ITP）、モリブデン補因子欠損症（MoCD）A型、膜性増殖性糸球体腎炎（MPGN）I、膜性増殖性糸球体腎炎（MPGN）II（デンスデポジット病）、膜性腎炎、多発梗塞性認知症、ループス（全身性エリテマトーデス（SLE））、糸球体腎炎、川崎病、多巣性運動ニューロパチー、多発性硬化症、多系統萎縮症、重症筋無力症、心筋梗塞、筋強直性ジストロフィー、視神経脊髄炎、ニーマン・ピック病C型、神経原線維変化を呈する非グアム型運動ニューロン疾患、パーキンソン病、認知症を伴うパーキンソン病、発作性夜間血色素尿症、尋常性天疱瘡、ピック病、脳炎後パーキンソン病、多発筋炎、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺、乾癬、敗血症、志賀毒素産生性大腸菌（E.coli）（STEC）-HuS、脊髄性筋萎縮症、脳卒中、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維型認知症、移植片拒絶、血管炎（例えば、ANCA関連血管炎）、ヴェグナー肉芽腫症、鎌状赤血球症、クリオグロブリン血症、混合性クリオグロブリン血症、本態性混合性クリオグロブリン血症、II型混合性クリオグロブリン血症、III型混合性クリオグロブリン血症、腎炎、薬物性血小板減少症、ループス腎炎、水疱性類天疱瘡、後天性表皮水疱症、遅発性溶血性輸血反応、低補体血症性蕁麻疹様血管炎症候群、偽水晶体性水疱性角膜症、および血小板輸血不応状態が含まれるが、これらに限定されない。
アルツハイマー病および特定の形態の前頭側頭型認知症（ピック病、散発性前頭側頭型認知症、および17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症）は、最も一般的な形態のタウロパチーである。したがって、本発明は、タウロパチーがアルツハイマー病、ピック病、散発性前頭側頭型認知症、および17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症である上記の任意の方法に関連する。他のタウロパチーには、進行性核上性麻痺（PSP）、大脳皮質基底核変性症（CBD）、および亜急性硬化性全脳炎が含まれるが、これらに限定されない。
神経変性タウロパチーには、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症/パーキンソン認知症複合、嗜銀顆粒性認知症、英国型アミロイドアンギオパチー、脳アミロイドアンギオパチー、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、拳闘家痴呆、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、前頭側頭型認知症、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、ハラーホルデン・スパッツ症候群、封入体筋炎、多系統萎縮症、筋強直性ジストロフィー、ニーマン・ピック病C型、神経原線維変化を呈する非グアム型運動ニューロン疾患、ピック病、脳炎後パーキンソン病、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維型認知症、多発梗塞性認知症、虚血性脳卒中、慢性外傷性脳症（CTE）、外傷性脳損傷（TBI）、および脳卒中が含まれる。
本開示はまた、シヌクレイノパチー、例えば、パーキンソン病（PD）；レビー小体型認知症（DLB）；多系統萎縮症（MSA）等を治療する方法を提供する。例えば、認知症を伴うPD（PDD）が、本開示の方法を用いて治療され得る。
いくつかの態様において、補体介在性の疾患または障害は、アルツハイマー病を含む。いくつかの態様において、補体介在性の疾患または障害は、パーキンソン病を含む。いくつかの態様において、補体介在性の疾患または障害は、移植片拒絶を含む、いくつかの態様において、補体介在性の疾患または障害は、抗体による移植片拒絶である。
いくつかの態様において、本開示の抗C1s抗体は、個体において補体介在性の疾患または障害の少なくとも1つの症状の発症を防ぐまたは遅らせる。いくつかの態様において、本開示の抗C1s抗体は、個体において補体介在性の疾患または障害の少なくとも1つの症状を軽減するまたは除去する。症状の例には、自己免疫疾患、がん、血液疾患、感染疾患、炎症疾患、虚血・再灌流疾患、神経変性疾患、神経変性障害、腎臓疾患、移植片拒絶、眼疾患、血管疾患または血管炎疾患に関連する症状が含まれるが、これらに限定されない。症状は、神経学的症状、例えば、認知機能障害、記憶障害、運動機能喪失等であり得る。症状はまた、個体の細胞、組織、または体液中のC1sタンパク質の活性であり得る。症状はまた、個体の細胞、組織、または体液中での補体活性化の程度であり得る。
いくつかの態様において、個体への本開示の抗C1s抗体の投与は、個体の細胞、組織、または体液において補体活性化を調整する。いくつかの態様において、個体への本開示の抗C1s抗体の投与は、個体の細胞、組織、または体液において補体活性化を阻害する。例えば、いくつかの態様において、本開示の抗C1s抗体は、補体介在性の疾患または障害を有する個体に単独療法としてまたは併用療法において1つまたは複数の用量で投与された場合、抗C1s抗体を用いた処置の前の個体における補体活性化と比較して、個体における補体活性化を少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、または90％超阻害する。
いくつかの態様において、本開示の抗C1s抗体は、赤血球へのC3沈着を減少させる、例えば、いくつかの態様において、本開示の抗C1s抗体は、RBCへのC3b、iC3b等の沈着を減少させる。いくつかの態様において、本開示の抗C1s抗体は、補体介在性の赤血球溶解を阻害する。
いくつかの態様において、本開示の抗C1s抗体は、血小板へのC3の沈着を減少させる。例えば、いくつかの態様において、本開示の抗C1s抗体は、血小板へのC3b、iC3b等の沈着を減少させる。
いくつかの態様において、本開示の抗C1s抗体の投与は、以下からなる群より選択されるアウトカムをもたらす：（a）補体活性化の低減、（b）認知機能の改善、（c）ニューロン喪失の低減、（d）ニューロンにおけるリン酸化Tauレベルの低下、（e）グリア細胞活性化の低減、（f）リンパ球浸潤の低減、（g）マクロファージ浸潤の低減、（h）抗体沈着の減少、（i）グリア細胞喪失の低減、（j）オリゴデンドロサイト喪失の低減、（k）樹状細胞浸潤の低減、（l）好中球浸潤の低減、（m）赤血球溶解の低減、（n）赤血球食作用の低減、（o）血小板食作用の低減、（p）血小板溶解の低減、（q）移植片生存の改善、（r）マクロファージにより媒介される食作用の低減、（s）視力の改善、（t）運動制御の改善、（u）血栓形成の改善、（v）凝固の改善、（w）腎臓機能の改善、（x）抗体により媒介される補体活性化の低減、（y）自己抗体により媒介される補体活性化の低減、（z）貧血の改善、（aa）脱髄の低減、（ab）好酸球増加の低減、（ac）赤血球細胞へのC3沈着の減少（例えば、RBCへのC3b、iC3b等の沈着の減少）、および（ad）血小板へのC3沈着の減少（例えば、血小板へのC3b、iC3b等の沈着の減少）、および（ae）アナフィラトキシン産生の低減、（af）自己抗体により媒介される水疱形成の低減、（ag）自己抗体により誘導される掻痒の低減、（ah）自己抗体により誘導されるエリテマトーデスの低減、（ai）自己抗体により媒介される皮膚びらんの低減、（aj）輸血反応に起因する赤血球破壊の低減、（ak）同種抗体に起因する赤血球溶解の低減、（al）輸血反応に起因する溶血の低減、（am）同種抗体により媒介される血小板溶解の低減、（an）輸血反応に起因する血小板溶解の低減、（ao）マスト細胞活性化の低減、（ap）マスト細胞ヒスタミン放出の低減、（aq）血管透過性の低減、（ar）浮腫の低減、（as）移植片内皮への補体沈着の減少、（at）移植片内皮におけるアナフィラトキシン生成の低減、（au）真皮表皮接合部の分離の低減、（av）真皮表皮接合部におけるアナフィラトキシン生成の低減、（aw）移植片内皮における同種抗体により媒介される補体活性化の低減、（ax）抗体により媒介される神経筋接合部の喪失の低減、（ay）神経筋接合部における補体活性化の低減、（az）神経筋接合部におけるアナフィラトキシン生成の低減、（ba）神経筋接合部における補体沈着の減少、（bb）麻痺の低減、（be）しびれの低減、（bd）膀胱制御の向上、（be）排便管理の向上、（bf）自己抗体に関連する死の減少、ならびに(bg)自己抗体に関連する病的状態の低減。
いくつかの態様において、本開示の抗C1s抗体は、補体介在性の疾患または障害を有する個体に単独療法としてまたは併用療法において1つまたは複数の用量で投与された場合、以下のアウトカム：（a）補体活性化；（b）認知機能の低下；（c）ニューロンの喪失；（d）ニューロンにおけるリン酸化Tauレベル；（e）グリア細胞活性化；（f）リンパ球浸潤；（g）マクロファージ浸潤；（h）抗体沈着；（i）グリア細胞の喪失；（j）オリゴデンドロサイトの喪失；（k）樹状細胞浸潤；（l）好中球浸潤；（m）赤血球溶解；（n）赤血球食作用；（o）血小板食作用；（p）血小板溶解；（q）移植片拒絶；（r）マクロファージにより媒介される食作用；（s）視力低下；（t）抗体により媒介される補体活性化；（u）自己抗体により媒介される補体活性化；（v）脱髄；（w）好酸球増加のうちの1つまたは複数を、抗C1s抗体を用いた処置の前の個体におけるアウトカムのレベルまたは程度と比較して、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、または90％超、低減するのに有効である。
いくつかの態様において、本開示の抗C1s抗体は、補体介在性の疾患または障害を有する個体に単独療法としてまたは併用療法において1つまたは複数の用量で投与された場合、以下のアウトカム：a）認知機能；b）移植片生存；c）視力；d）運動制御；e）血栓形成；f）凝固；g）腎臓機能、およびh）ヘマトクリット（赤血球数）のうちの1つまたは複数を、抗C1s抗体を用いた処置の前の個体におけるアウトカムのレベルまたは程度と比較して、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、または90％超、改善するのに有効である。
いくつかの態様において、個体への本開示の抗C1s抗体の投与は、個体における補体活性化を低減する。例えば、いくつかの態様において、本開示の抗C1s抗体は、補体介在性の疾患または障害を有する個体に単独療法としてまたは併用療法において1つまたは複数の用量で投与された場合、個体における補体活性化を、抗C1s抗体を用いた処置の前の個体における補体活性化と比較して、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、または90％超、低減する。
いくつかの態様において、本開示の抗C1s抗体の投与は、個体における認知機能を改善する。例えば、いくつかの態様において、本開示の抗C1s抗体は、補体介在性の疾患または障害を有する個体に単独療法としてまたは併用療法において1つまたは複数の用量で投与された場合、個体における認知機能を、抗C1s抗体を用いた処置の前の個体における認知機能と比較して、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、または90％超、改善する。
いくつかの態様において、本開示の抗C1s抗体の投与は、個体における認知機能の低下率を低下させる。例えば、いくつかの態様において、本開示の抗C1s抗体は、補体介在性の疾患または障害を有する個体に単独療法としてまたは併用療法において1つまたは複数の用量で投与された場合、個体における認知機能の低下率を、抗C1s抗体を用いた処置の前の個体における認知機能の低下率と比較して、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、または90％超、低下させる。
いくつかの態様において、個体への本開示の抗C1s抗体の投与は、個体におけるニューロン喪失を低減する。例えば、いくつかの態様において、本開示の抗C1s抗体は、補体介在性の疾患または障害を有する個体に単独療法としてまたは併用療法において1つまたは複数の用量で投与された場合、個体におけるニューロン喪失を、抗C1s抗体を用いた処置の前の個体におけるニューロン喪失と比較して、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、または90％超、低減する。
いくつかの態様において、個体への本開示の抗C1s抗体の投与は、個体におけるリン酸化Tauレベルを低下させる。例えば、いくつかの態様において、本開示の抗C1s抗体は、補体介在性の疾患または障害を有する個体に単独療法としてまたは併用療法において1つまたは複数の用量で投与された場合、個体におけるリン酸化Tauを、抗C1s抗体を用いた処置の前の個体におけるリン酸化Tauレベルと比較して、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、または90％超、減少させる。
いくつかの態様において、個体への本開示の抗C1s抗体の投与は、個体におけるグリア細胞活性化を低減する。例えば、いくつかの態様において、本開示の抗C1s抗体は、補体介在性の疾患または障害を有する個体に単独療法としてまたは併用療法において1つまたは複数の用量で投与された場合、個体におけるグリア活性化を、抗C1s抗体を用いた処置の前の個体におけるグリア細胞活性化と比較して、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、または90％超、低減する。いくつかの態様において、グリア細胞は、アストロサイトまたはミクログリアである。
いくつかの態様において、個体への本開示の抗C1s抗体の投与は、個体におけるリンパ球浸潤を低減する。例えば、いくつかの態様において、本開示の抗C1s抗体は、補体介在性の疾患または障害を有する個体に単独療法としてまたは併用療法において1つまたは複数の用量で投与された場合、個体におけるリンパ球浸潤を、抗C1s抗体を用いた処置の前の個体におけるリンパ球浸潤と比較して、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、または90％超、低減する。
いくつかの態様において、個体への本開示の抗C1s抗体の投与は、個体におけるマクロファージ浸潤を低減する。例えば、いくつかの態様において、本開示の抗C1s抗体は、補体介在性の疾患または障害を有する個体に単独療法としてまたは併用療法において1つまたは複数の用量で投与された場合、個体におけるマクロファージ浸潤を、抗C1s抗体を用いた処置の前の個体におけるマクロファージ浸潤と比較して、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、または90％超、低減する。
いくつかの態様において、個体への本開示の抗C1s抗体の投与は、個体における抗体沈着を減少させる。例えば、いくつかの態様において、本開示の抗C1s抗体は、補体介在性の疾患または障害を有する個体に単独療法としてまたは併用療法において1つまたは複数の用量で投与された場合、個体における抗体沈着を、抗C1s抗体を用いた処置の前の個体における抗体沈着と比較して、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、または90％超、減少させる。
いくつかの態様において、個体への本開示の抗C1s抗体の投与は、個体におけるアナフィラトキシン（例えば、C3a、C4a、C5a）産生を減少させる。例えば、いくつかの態様において、本開示の抗C1s抗体は、補体介在性の疾患または障害を有する個体に単独療法としてまたは併用療法において1つまたは複数の用量で投与された場合、個体におけるアナフィラトキシン産生を、抗C1s抗体を用いた処置の前の個体におけるアナフィラトキシン産生レベルと比較して、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、または90％超、減少させる。
いくつかの態様において、本開示は、補体介在性の疾患または障害を有する個体を治療するための、本開示の抗C1s抗体または本開示の抗C1s抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物の使用を提供する。いくつかの態様において、本開示は、補体介在性の疾患または障害を有する個体を治療するための、本開示の抗C1s抗体の使用を提供する。いくつかの態様において、本開示は、補体介在性の疾患または障害を有する個体を治療するための、本開示の抗C1s抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物の使用を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、補体介在性の疾患または障害を有する個体を治療するための医薬品の製造における、本開示の抗C1s抗体の使用を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、補体活性化を阻害するための、本開示の抗C1s抗体または本開示の抗C1s抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物の使用を提供する。いくつかの態様において、本開示は、補体介在性の疾患または障害を有する個体において補体活性化を阻害するための、本開示の抗C1s抗体または本開示の抗C1s抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物の使用を提供する。いくつかの態様において、本開示は、補体介在性の疾患または障害を有する個体において補体活性化を阻害するための、本開示の抗C1s抗体の使用を提供する。いくつかの態様において、本開示は、補体介在性の疾患または障害を有する個体において補体活性化を阻害するための、本開示の抗C1s抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物の使用を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、補体活性化を調整するための医薬品の製造における、本開示の抗C1s抗体の使用を提供する。いくつかの態様において、該医薬品は、補体活性化を阻害する。いくつかの態様において、該医薬品は、補体介在性の疾患または障害を有する個体において補体活性化を阻害する。
いくつかの態様において、本開示は、薬物療法において使用するための、本開示の抗C1s抗体または本開示の抗C1s抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、本開示は、薬物療法において使用するための、本開示の抗C1s抗体を提供する。いくつかの態様において、本開示は、薬物療法において使用するための、本開示の抗C1s抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、補体介在性の疾患または障害を有する個体を治療するための、本開示の抗C1s抗体または本開示の抗C1s抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、本開示は、補体介在性の疾患または障害を有する個体を治療するための、本開示の抗C1s抗体を提供する。いくつかの態様において、本開示は、補体介在性の疾患または障害を有する個体を治療するための、本開示の抗C1s抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。
いくつかの態様において、本開示は、補体活性化を調整するための、本開示の抗C1s抗体または本開示の抗C1s抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、本開示は、補体活性化を調整するための、本開示の抗C1s抗体を提供する。いくつかの態様において、本開示は、補体活性化を調整するための、本開示の抗C1s抗体および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、抗C1s抗体は、補体活性化を阻害する。
さらなる局面において、本発明は、医薬品の製造または調製における抗C1s抗体の使用を提供する。一態様において、医薬品は、補体介在性の疾患または障害の治療のためのものである。さらなる態様において、医薬品は、補体介在性の疾患または障害を有する個体に有効量の該医薬品を投与する工程を含む補体介在性の疾患または障害の治療方法において使用するためのものである。1つのそのような態様において、該方法はさらに、有効量の少なくとも1つのさらなる治療剤（例えば以下に記載されるもの）を個体に投与する工程を含む。さらなる態様において、医薬品は、血漿からのC1sのクリアランス（または除去）の増強に使用するためのものである。さらなる態様において、医薬品は、血漿からのC1q、C1r、およびC1sの複合体のクリアランス（または除去）の増強に使用するためのものである。さらなる態様において、医薬品は、補体成分C4の切断の阻害において使用するためのものであり、ここで抗体は補体成分C2の切断を阻害しない。さらなる態様において、医薬品は、古典的補体経路の成分の阻害において使用するためのものであり、いくつかの例において、古典的補体経路の成分はC1sである。
さらなる態様において、医薬品は、有効量の該医薬品を個体に投与する工程を含む、補体介在性の疾患または障害を有する個体の治療方法において使用するためのものである。上述の態様の任意のものにおいて、「個体」はヒトであり得る。
さらなる態様において、本発明は、補体介在性の疾患または障害を治療する方法を提供する。一態様において、該方法は、そのような補体介在性の疾患または障害を有する個体に有効量の抗C1s抗体を投与する工程を含む。1つのそのような態様において、該方法はさらに、有効量の少なくとも1つのさらなる治療剤（後述されるもの）を個体に投与する工程を含む。上述の態様の任意のものにおいて、「個体」はヒトであり得る。
さらなる局面において、本発明は、個体における血漿からのC1sのクリアランス（または除去）を増強する方法を提供する。さらなる局面において、本発明は、個体における血漿からのC1q、C1r、およびC1sの複合体のクリアランス（または除去）を増強する方法を提供する。いくつかの態様において、本発明の抗C1s抗体は、当該抗体が個体において補体成分C2の切断を阻害せずに、補体成分C4の切断を阻害する方法を提供する。いくつかの例において、本発明は、個体において古典的補体経路の成分を阻害する方法を提供し、いくつかの例において、古典的補体経路の成分はC1sである。一態様において、「個体」はヒトである。
さらなる局面において、本発明は、例えば上記の治療方法のいずれかにおいて使用するための、本明細書で提供される抗C1s抗体のいずれかを含む薬学的製剤を提供する。一態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗C1s抗体のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗C1s抗体のいずれかと、少なくとも1つのさらなる治療剤（例えば後述されるもの）とを含む。
本発明の抗体は、療法において、単独または他の剤との組み合わせのどちらでも使用され得る。例えば、本発明の抗体は、少なくとも1つの追加の治療剤と同時投与されてもよい。
上述したような併用療法は、併用投与（2つ以上の治療剤が、同じまたは別々の製剤に含まれる）、および個別投与を包含し、個別投与の場合、本発明の抗体の投与が追加治療剤の投与に先立って、と同時に、および/または、続いて、行われ得る。一態様において、抗C1S抗体の投与および追加治療剤の投与は、互いに、約1か月以内、または約1、2、または3週間以内、または約1、2、3、4、5、または6日以内に行われる。本発明の抗体は、放射線療法と組み合わせて用いることができる。
本発明の抗体（および、任意の追加治療剤）は、非経口投与、肺内投与、および経鼻投与、また局所的処置のために望まれる場合は病巣内投与を含む、任意の好適な手段によって投与され得る。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与を含む。投与は、投与が短期か長期かに一部応じて、例えば、静脈内注射または皮下注射などの注射によるなど、任意の好適な経路によってなされ得る。これらに限定されるものではないが、単回投与または種々の時点にわたる反復投与、ボーラス投与、および、パルス注入を含む、種々の投与スケジュールが本明細書の考慮の内である。
本発明の抗体は、優良医療規範 (good medical practice) に一致したやり方で、製剤化され、投与され、また投与される。この観点から考慮されるべきファクターは、治療されているその特定の障害、治療されているその特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、障害の原因、剤を送達する部位、投与方法、投与のスケジュール、および医療従事者に公知の他のファクターを含む。抗体は、必ずしもそうでなくてもよいが、任意で、問題の障害を予防するまたは治療するために現に使用されている1つまたは複数の剤とともに、製剤化される。そのような他の剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害または治療のタイプ、および上で論じた他のファクターに依存する。これらは通常、本明細書で述べたのと同じ用量および投与経路で、または本明細書で述べた用量の約1から99%で、または経験的/臨床的に適切と判断される任意の用量および任意の経路で、使用される。
疾患の予防または治療のために、本発明の抗体の適切な用量（単独で用いられるときまたは1つまたは複数の他の追加治療剤とともに用いられるとき）は、治療される疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度および経過、抗体が予防的目的で投与されるのか治療的目的で投与されるのか、薬歴、患者の臨床歴および抗体に対する応答、ならびに、主治医の裁量に依存するだろう。抗体は、患者に対して、1回で、または一連の処置にわたって、好適に投与される。疾患のタイプおよび重症度に応じて、例えば、1回または複数回の別々の投与によるにしても連続注入によるにしても、約1μg/kgから15 mg/kg（例えば、0.1mg/kg～10mg/kg）の抗体が、患者に対する投与のための最初の候補用量とされ得る。1つの典型的な1日用量は、上述したファクターに依存して、約1μg/kgから100mg/kg以上まで、幅があってもよい。数日またはより長くにわたる繰り返しの投与の場合、状況に応じて、治療は通常疾患症状の所望の抑制が起きるまで維持される。抗体の1つの例示的な用量は、約0.05mg/kg から約 10mg/kgの範囲内である。よって、約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、もしくは 10mg/kgの1つまたは複数の用量（またはこれらの任意の組み合わせ）が、患者に投与されてもよい。このような用量は、断続的に、例えば1週間毎にまたは3週間毎に（例えば、患者が約2から約20、または例えば約6用量の抗体を受けるように）、投与されてもよい。高い初回負荷用量の後に、1回または複数回の低用量が投与されてもよい。しかしながら、他の投与レジメンが有用な場合もある。この療法の経過は、従来の手法および測定法によって、容易にモニタリングされる。
上述の製剤または治療的方法のいずれについても、抗C1S抗体の代わりにまたはそれに追加して、本発明のイムノコンジュゲートを用いて実施してもよいことが、理解されよう。
Ｈ．製品
本発明の別の局面において、上述の障害の治療、予防、および/または診断に有用な器材を含んだ製品が、提供される。製品は、容器、および当該容器上のラベルまたは当該容器に付属する添付文書を含む。好ましい容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグなどが含まれる。容器類は、ガラスやプラスチックなどの、様々な材料から形成されていてよい。容器は組成物を単体で保持してもよいし、症状の治療、予防、および/または診断のために有効な別の組成物と組み合わせて保持してもよく、また、無菌的なアクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、皮下注射針によって突き通すことのできるストッパーを有する静脈内投与用溶液バッグまたはバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも1つの有効成分は、本発明の抗体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が選ばれた症状を治療するために使用されるものであることを示す。さらに製品は、(a)第一の容器であって、その中に収められた本発明の抗体を含む組成物を伴う、第一の容器；および、(b)第二の容器であって、その中に収められたさらなる細胞傷害剤またはそれ以外で治療的な剤を含む組成物を伴う、第二の容器を含んでもよい。本発明のこの態様における製品は、さらに、組成物が特定の症状を治療するために使用され得ることを示す、添付文書を含んでもよい。あるいはまたは加えて、製品はさらに、注射用制菌水 (BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液などの、薬学的に許容される緩衝液を含む、第二の（または第三の）容器を含んでもよい。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジなどの、他の商業的観点またはユーザの立場から望ましい器材をさらに含んでもよい。
上述の製品のいずれについても、抗C1S抗体の代わりにまたはそれに追加して、本発明のイムノコンジュゲートを含んでもよいことが、理解されよう。
ＩＩＩ．実施例
以下は、本発明の方法および組成物の実施例である。上述の一般的な記載に照らし、種々の他の態様が実施され得ることが、理解されるであろう。
前述の発明は、明確な理解を助ける目的のもと、実例および例示を用いて詳細に記載したが、本明細書における記載および例示は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書で引用したすべての特許文献および科学文献の開示は、その全体にわたって、参照により明示的に本明細書に組み入れられる。
実施例1：ヒトC1sの発現および精製
C末端にFlagタグを有する組み換えヒトC1s（SEQ ID NO:1）（hC1s-Flag）を、FreeStyle293-F細胞株（Thermo Fisher, Carlsbad, CA, USA）を用いて一過的に発現させた。ヒト組み換えhC1s-Flagを発現する培養上清を、抗Flag M2アフィニティ樹脂（Sigma）を充填したカラムに供し、Flagペプチド（Sigma）を用いて溶出させた。hC1s-Flagを含む画分を収集し、続いてSuperdex 200ゲルろ過カラム（GE healthcare Uppsala, Sweden）に供した。次いでhC1s-Flagを含む画分を収集し、濃縮し、摂氏-80度（℃）で保管した。
カルボキシル末端に8×ヒスチジンタグを有する組み換えC1s（SEQ ID NO:1）（hC1s-His）を、FreeStyle293-F細胞株（Thermo Fisher, Carlsbad, CA, USA）を用いて一過的に発現させた。hC1s-Hisを含有する培養上清を、HisTrapエクセルカラム（GE healthcare, Uppsala, Sweden）に供し、イミダゾールを用いて溶出させた。hC1s-Hisを含む画分を収集し、Superdex 200ゲルろ過カラム（GE healthcare, Uppsala, Sweden）に供した。hC1s-Hisを含む画分を収集し、濃縮し、-80℃で保管した。
実施例2：抗C1s抗体の調製
抗C1s抗体の重および軽鎖可変領域のポリヌクレオチドである（WO2016164358に記載されている）IPN009VH2（SEQ ID NO: 13）およびIPN009VK3（SEQ ID NO: 14）が、GenScript Incにより合成された。この重および軽鎖可変領域を、それぞれ重鎖定常領域SG4GK（SEQ ID NO: 15）および軽鎖定常領域SK1（SEQ ID NO: 16）を含む発現ベクターにクローニングした。FreeStyle FS293-F細胞および293fectin（Life technologies）を製造元の説明書にしたがって用いて、抗C1s抗体C1_IPN009VH2-SG4GK/IPN009VK3-SK1（IPN009VH2/IPN009VK3）を一過的に発現させた。組み換え抗体を、プロテインA（GE Healthcare）を用いて精製し、D-PBS、Tris緩衝化生理食塩水（TBS）またはHis緩衝液（20mM ヒスチジン、150mM NaCl、 pH6.0）中に溶出させた。必要に応じて、高分子量成分および/または低分子量成分を除去するために、サイズ排除クロマトグラフィーをさらに行った。
IPN009VH2/IPN009VK3のCDRおよびFR内の特定位置においてヒスチジンスキャンを行った。変異体における変異の位置を表2に示す（上部分、4列目および6列目）。表3-1～6も同様である。In-Fusion HD Cloning Kit（Clontech Inc.またはTakara Bio Company）を製造元の説明書にしたがって用いて、各アミノ酸を個別にヒスチジンに変異させた。すべての変異体を、上記方法により一過的に発現させ、精製した。pH 7.4およびpH 5.8における各ヒスチジン置換変異体の結合アフィニティを、Biacore T200機器（GE Healthcare）を用いて37℃で決定した。組み換えプロテインA/G（Pierce）を、アミンカップリングキット（GE Healthcare）を用いてCM4センサーチップのすべてのフローセル上に固定化した。抗体およびアナライトを、7(+)緩衝液（20 mM ACES、150 mM NaCl、1.2 mM CaCl2、0.05% Tween 20、0.005% NaN3、pH 7.4）、5(+)緩衝液（20 mM ACES、150 mM NaCl、1.2 mM CaCl2、0.05% Tween 20、0.005% NaN3、pH 5.8）または5(-)緩衝液（20 mM ACES、150 mM NaCl、3μM CaCl2、0.05% Tween 20、0.005% NaN3、pH 5.8）で調製した。各抗体を、プロテインA/Gによってセンサー表面上に捕捉した。抗体捕捉量は、200共鳴単位（RU）を目標にした。血清由来ヒトC1s（CompTech）または実施例1で調製した組み換えC1sを、50 nMで注入し、その後に解離させた。サイクル毎に、10 mMグリシン-HCl、pH 1.5を用いてセンサー表面を再生した。Biacore T200 Evaluationソフトウェア、バージョン2.0（GE Healthcare）を用いてデータを処理し1：1結合モデルにフィッティングさせることによって、結合アフィニティを決定した。シングルヒスチジン置換体のいくつかは、5(+)緩衝液におけるKD（「KD 5.8+」）および/または5(-)緩衝液におけるKD（「KD 5.8-」）が、7(+)緩衝液におけるKD（「KD 7.4+」）と比較して大きかった。KD 7.4+に対するKD 5.8+の比（「KD 5+/7+」）およびKD 7.4+に対するKD5.8-の比（「KD 5-/7+」）を計算した。変異体のKD 5+/7+またはKD 5-/7+が親抗体IPN009VH2-SG4GK/IPN009VK3-SK1のそれよりも大きい場合、その変異体は、それぞれ「pH」依存的または「pHおよびCa」依存的であるとみなされる。5(+)緩衝液および/または5(-)緩衝液中での変異体の結合反応性がIPN009VH2/IPN009VK3のそれよりもずっと低い場合、その変異体もまた、「pH」依存的ならびに/または「pHおよびCa」依存的であるとみなされる。したがって、そのような変異は、「pH」依存的抗体ならびに/または「pHおよびCa」依存的抗体を生成するのに有効である。Biacoreアッセイの結果を表2に示す。その結合反応性がIPN009VH2/IPN009VK3の結合反応性よりもずっと低い場合、表中に「低い」と示している。「pH」依存性ならびに/または「pHおよびCa」依存性をさらに増強するため、ヒスチジン変異の組み合わせを行った。ヒスチジン変異の組み合わせを有する抗体を、上記方法によりBiacoreを用いて評価した。Biacoreアッセイの結果を表3-1および3-2に示す。多くの変異体が、IPN009VH2/IPN009VK3と比較してずっと優れた「pH」依存性ならびに「pHおよびCa」依存性を示した。
Figure 2023116744000002
Figure 2023116744000003
Figure 2023116744000004
実施例3：抗C1s抗体の「pH」依存性ならびに/または「pHおよびCa」依存性のさらなる最適化
C1_IPN92H0033(SEQ ID NO: 17)-SG4GK/ IPN93L0024(SEQ ID NO: 18)-SK1 (IPN92H0033/IPN93L0024)を、さらなる最適化のために選択した。IPN92H0033/IPN93L0024のCDRおよびFRの特定位置についてヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびグルタミンスキャンを行った。上記方法により、変異を有する変異体を生成および精製し、Biacoreを用いて評価した。すべての変異体を、上記のようにBiacoreを用いて評価した。「pH」依存性ならびに/または「pHおよびCa」依存性が改善された変異体を、組み合わせのために選択した。7(+)におけるKDが改善された変異体も、組み合わせのために選択した。数回の組み合わせの後、複数の変異を有する変異体が、有意な「pH」依存性ならびに/または「pHおよびCa」依存性を獲得した。Biacoreの結果を、表4-1および4-2に示す。
表4-1および4-2に示されるように、驚くべきことに、ヒスチジン残基をすでに有していた抗体への荷電残基（アルギニン、リジン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸）の導入は、抗体-抗原相互作用のpH依存性を有意に改善した。
Figure 2023116744000005
Figure 2023116744000006
特定の理論に縛られるわけではないが、抗体内のヒスチジン残基は、その抗体内のヒスチジン残基の周囲の様々な残基と相互作用し得る。そのような相互作用は、抗体の構造またはCDRの立体構造に影響を及ぼし得る。ヒスチジンは、酸性pHにおいてプロトン化し、正に荷電する。ヒスチジンの周囲の位置における正荷電残基（例えばアルギニンまたはリジン）の導入は、酸性pHにおいて正荷電残基とプロトン化したヒスチジンとの間の反発を引き起こし得、それによってその抗体またはCDRの構造または立体構造の変化が誘導され得る。同様に、ヒスチジンの周囲の位置における負荷電残基（例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸）の導入は、酸性pHにおいて負荷電残基とプロトン化したヒスチジンとの間の相互作用を引き起こし得、それによってその抗体またはCDRの構造または立体構造の変化が誘導され得る。酸性pHにおいて起こる抗体またはCDRのこれらの構造または立体構造の変化は、抗体の抗原結合に影響を及ぼし得、酸性pHでの抗体の抗原への結合アフィニティを低下させ得る。まとめると、抗体内のヒスチジン残基の周囲の位置における荷電残基（例えば、アルギニン、リジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸）の導入は、酸性pHでの抗体の抗原への結合アフィニティを低下させ得、それによって独特のメカニズムで抗体-抗原相互作用のpH依存性を改善し得る。
実施例4：非特異的結合性の低減
非特異的結合性は、抗体の薬物動態を予測する上で重要な要素の1つである（MABS 2017, VOL. 9, NO. 5, 756-766）。高い非特異的結合性は、抗体の迅速なクリアランスを引き起こし、乏しい抗体の薬物動態をもたらすため、高い非特異的結合性を有する抗体は、治療用抗体の開発に望ましくない。細胞外マトリクス結合アッセイ（ECM結合アッセイ）は、非特異的結合性を予測するアッセイ法の1つである（WO 2012/093704）。
「pH」依存的抗体ならびに「pHおよびCa」依存的抗体を、ECM結合アッセイのために選択した。ECM結合アッセイは、Meso Scale Discovery（MSD）技術と電気化学発光（ECL）を組み込んだものである。最初に、Multi-Array High Bind 96ウェルプレート（MSD）の表面を、4℃で一晩、ECM（BD Matrigel）でコーティングした。次いで、ECMでコーティングされたプレートを、pH 7.4（0.05% Tween 20および0.5% BSAを含む、20mM ACES、150mM NaCl、1.2mM CaCl2、pH7.4）またはpH 5.8（0.05% Tween 20および0.5% BSAを含む、20mM ACES、150mM NaCl、1.2mM CaCl2、pH5.8）のいずれかにおいて、30℃で2時間、ECLブロッキング緩衝液でブロッキングした。次いで、選択した変異体およびアッセイ対照を、pH 7.4（0.01% Tween 20および0.1% BSAを含む20mM ACES、150mM NaCl、1.2mM CaCl2、pH7.4）またはpH 5.8（0.01% Tween 20および0.1% BSAを含む20mM ACES, 150mM NaCl, 1.2mM CaCl2、pH5.8）のいずれかにおいて希釈緩衝液で希釈した。希釈したサンプルおよびアッセイ対照を、600 rpm、30℃で1時間、プレート上でインキュベートし、続いて室温で10分間、0.25％グルタルアルデヒド（Sigma）と共にインキュベートした。次いでこのプレートを1×PBST（Sigma）を用いて洗浄し、600 rpm、30℃で1時間、スルホタグ標識ヤギ抗ヒトIgG（Invitrogen）と共にインキュベートした。このプレートを1×PBSTを用いて再度洗浄し、界面活性剤を含むRead Buffer T（2×）（MSD）を各ウェルに添加した。このプレートを、MESO SECTOR S 600を用いて読み取った。ECM結合アッセイの結果を表5に示す。選択した変異体のpH 5.8でのECMへの結合性は、IPN009VH2/IPN009VK3のそれよりも高い。抗体の薬物動態を改善するために、ECMへの結合を減少させるさらなる最適化を行った。選択した変異体に負荷電残基を導入した。結合アフィニティおよびECM結合を、それぞれ、上記のようにBiacoreおよびECM結合アッセイを用いて評価した。「pH」依存性ならびに/または「pHおよびCa」依存性を維持または増強しつつECM結合を減少させるいくつかの残基を同定した。これらの同定した変異を組み合わせることにより、3つの抗体、C1_IPN92H0288(SEQ ID NO: 19)-SG4GK/IPN93L0211(SEQ ID NO: 20)-SK1、C1_IPN92H0288-SG4GK/IPN93L0058(SEQ ID NO: 21)-SK1、およびC1_IPN92H0307(SEQ ID NO: 22)-SG4GK/IPN93L0058-SK1を作成することに成功した。これら3つの変異体は、pH 7.4およびpH 5.8の両方におけるより低いECM結合性と共に、優れた「pH」依存性ならびに「pHおよびCa」依存性を示した。これら3つの変異体のBiacoreおよびECM結合アッセイの結果を表6に示す。
Figure 2023116744000007
Figure 2023116744000008
実施例5：アフィニティの測定
pH 7.4およびpH 5.8におけるすべてのヒスチジン置換変異体の結合アフィニティを、37℃でBiacore T200機器（GE Healthcare）を用いて決定した。組み換えプロテインA/G（Pierce）を、アミンカップリングキット（GE Healthcare）を用いてCM4センサーチップのすべてのフローセル上に固定化した。抗体およびアナライトを、7(+)緩衝液（20 mM ACES、150 mM NaCl、1.2 mM CaCl2、0.05% Tween 20、0.005% NaN3、pH 7.4）または5(+)緩衝液（20 mM ACES、150 mM NaCl、1.2 mM CaCl2、0.05% Tween 20、0.005% NaN3、pH 5.8）で調製した。各抗体を、プロテインA/Gによってセンサー上に捕捉した。抗体捕捉量は、200共鳴単位（RU）を目標にした。血清由来ヒトC1sを、pH 7.4の場合は12.5、50 nMで注入し、pH 5.8の場合は、IPN92H0281/IPN93L0024-SG136およびIPN92H0286/IPN93L0205-SG136を除くすべてのサンプルについては50、200 nMで、IPN92H0281/IPN93L0024-SG136およびIPN92H0286/IPN93L0205-SG136については200および800 nMで注入し、その後に解離させた。サイクル毎に、10 mMグリシン-HCl、pH 1.5を用いてセンサー表面を再生した。Biacore T200 Evaluationソフトウェア、バージョン2.0（GE Healthcare）を用いてデータを処理し1：1結合モデルにフィッティングさせることによって、結合アフィニティを決定した（表7）。pH 7.4における解離領域の直後に、pH 5.8におけるさらなる解離領域を組み込んだ。5(+)緩衝液中でのこの解離速度は、Scrubber 2.0（BioLogic Software）曲線フィッティングソフトウェアを用いてデータを処理しフィッティングさせることによって決定した。pH 5.8でのアフィニティ値におけるアスタリスク記号は、結合反応性が低いためにアフィニティの測定値を正確に決定できなかったことを示している。
Figure 2023116744000009
実施例6：pHおよび/またはCa依存的抗C1s抗体を用いたマウスPK試験
高速液体クロマトグラフィー・エレクトロスプレータンデム質量分析（LC/ESI-MS/MS）による血漿中の抗C1s抗体および総hC1s濃度の測定
マウス血漿中の抗C1s抗体およびヒトC1sの濃度を、LC/ESI-MS/MSによって測定した。較正標準は、12.5、25、50、100、200、400および800マイクログラム（μg）/mLの抗C1s濃度、ならびに0.977、1.95、3.91、7.81、15.6、31.3、62.5マイクロ/mLのヒトC1s濃度となるように、それぞれ規定量の抗C1s抗体およびヒトC1sをマウス血漿中で混合および希釈することによって調製した。2μLの較正標準および血漿サンプルを、25μLの、50 mmol/L重炭酸アンモニウム中6.8 mol/L尿素、9.1 mmol/Lジチオトレイトールおよび0.45μg/mLリゾチーム（ニワトリ卵白）と混合し、56℃で45分間インキュベートした。その後、2μLの500 mmol/Lヨードアセトアミドを添加し、37℃で30分間、暗所でインキュベートした。次に、160μLの、50 mmol/L重炭酸アンモニウム中0.5μg/mL配列決定等級修飾トリプシン（Promega）を添加し、37℃で一晩インキュベートした。最後に、残留トリプシンを不活性化させるために、5μLの10％トリフルオロ酢酸を添加した。50μLの消化サンプルを、LC/ESI-MS/MSによる分析に供した。LC/ESI-MS/MSは、2D I-class UPLC（Waters）を備えるXevo TQ-Sトリプル四重極機器（Waters）を用いて行った。抗C1s抗体特異的ペプチドGLPSSIEKおよびヒトC1s特異的ペプチドLLEVPEGRを、選択反応モニタリング（SRM）によりモニタリングした。SRMトランジションは、抗C1s抗体の場合は[M+2H]2+（m/z 415.7）からy6イオン（m/z 660.3）、ヒトC1sの場合は[M+2H]2+（m/z 456.8）からy6イオン（m/z 686.3）とした。濃度に対してプロットされたピーク面積を用いる加重（1/x2）線形回帰により、較正曲線を作成した。分析用ソフトウェアMasslynxバージョン4.1（Waters）を用いて、この較正曲線からマウス血漿中の濃度を算出した。
マウスにおける総hC1sならびにpHおよび/またはCa依存的抗C1s抗体の薬物動態の評価
hC1s（実施例1に記載されるようにして調製したヒト補体成分1s）ならびに実施例2において調製したpHおよび/またはCa依存的抗体のin vivo薬物動態を、hC1s単独または抗C1s抗体との組み合わせでマウス（CB17/Icr-Prkdcscid/CrlCrlj: Charles River Japan）に投与した後に評価した。3匹のマウスを各投与グループに割り当てた。hC1s溶液（0.23 mg/mL）またはhC1sおよび抗C1s抗体を含む混合物の溶液（それぞれ、0.23および2.5 mg/mL）を、10 mL/kgの用量で1回、マウスに静脈内注射した。
本試験中、C1sに対して抗C1s抗体の濃度が過剰になるように用量を設定し、そのため血中では、ほぼすべてのC1sが結合形態になると推定された。
注射から5分後、30分後、2時間後、7時間後、3日後、7日後、14日後、21日後、および28日後に血液を収集した。これらの血液を直ちに遠心分離し、血漿サンプルを分離した。各サンプル収集時点で、抗C1s抗体、hC1sの血漿中濃度を、LC/ESI-MS/MSによって測定した。抗C1s抗体およびhC1sのPKパラメータを、非コンパートメント解析によって概算した（Phoenix WinNonlinバージョン8.0、Certara）。抗C1s抗体として以下の抗体をマウスに投与した：
1. IPN009VH2/IPN009VK3-SG136、
2. IPN92H0033/IPN009VK3-SG136、
3. IPN009VH2/IPN93L0021-SG136、
4. IPN009VH2/IPN93L0023-SG136、
5. IPN009VH2/IPN93L0024-SG136、
6. IPN92H0038/IPN93L0024-SG136、
7. IPN92H0033/IPN93L0024-SG136、
8. IPN92H0281/IPN93L0024-SG136、
9. IPN92H0286/IPN93L0205-SG136、
10. IPN92H0288/IPN93L0211-SG136、
11. IPN92H0288/IPN93L0058-SG136、
12. IPN92H0307/IPN93L0058-SG136。
血漿中抗体経時的濃度変化によると、IPN92H0286/IPN93L0205-SG136は速やかに血中から消失した。最も高いECM結合性が、この迅速な消失に寄与していると考えられた。他のpHおよび/またはCa依存的抗C1s抗体も、同様の血漿中経時的濃度変化を示した。IPN92H0286/IPN93L0205-SG136のCLは56.5 mL/日/kgであり、他の抗C1s抗体のCLは2倍範囲内（4.8～8.1 mL/日/kg）であった。この結果は、pHおよび/またはCa依存性が血漿中の抗体の薬物動態に影響しないことを示している。
pHおよび/またはCa依存的抗C1s抗体の血漿中hC1s経時的濃度変化は、非pH/Ca依存的抗C1s抗体であるIPN009VH2/IPN009VK3-SG136と比較して迅速な消失を示した。pH/Ca依存的抗C1s抗体下でのhC1sのCLは、CaまたはpHのいずれかに依存的な抗C1s抗体の場合よりも大きい傾向があった。これらの現象は、pHおよびCa依存的結合特性またはこれらの組み合わせが生体内でのC1s除去の促進に有用であることを示している。
ヒトC1Sおよび抗体の混合物を同時注射したマウスの薬物動態パラメータならびに抗体変異体のアフィニティ値
各抗体のスイーピング指標は、血中から抗原を除去する抗体変異体の能力を表す。それは、抗原クリアランス速度を抗体クリアランス速度で割ることによって計算された（表8）。スイーピング指標の改善は、親抗体と比較し、血中から抗原を除去する抗体変異体の能力を相対値として表す。それは、各抗体変異体のスイーピング指標を親抗体のスイーピング指標で割ることで計算され、そのため親抗体のスイーピング指標は１となる。koff (5.8+ of 775+)は、pH 7.4での解離領域の直後のpH 5.8でのさらなる解離領域におけるC1sの解離速度を表す。「+」は、pH 7.4およびpH 5.8の両領域における1.2 mM CaCl2の存在を示す。koff (5.8+ of 775+)/koff (7.4)の列は、775+アッセイにおけるpH 7.4での解離速度に対するpH 5.8での解離速度の比を示す。KD (5.8+)/KD (7.4+)の列は、pH 7.4におけるアフィニティに対するpH 5.8における抗体のアフィニティの比を示す。「+」は、pH 5.8およびpH 7.4におけるアフィニティ測定中の1.2 mM CaCl2の存在を示す。pH 5.8でのアフィニティ値についてのアスタリスク記号は、結合反応性が低いためにアフィニティの測定値を正確に決定できなかったことを示している。
Figure 2023116744000010
スイーピング指数の改善とKD (5.8+)/KD (7.4+)比との間の相関関係を、すべての抗体についてプロットした（図1）。ただし、抗体IPN92H0286/IPN93L0205-SG136は、おそらく高いECM結合性に起因して迅速なクリアランスを示した（表5）ため、プロットから除いた。点線は、線形回帰を用いたベストフィットの直線を示し、R二乗値は適合度を示す。KD (5.8+)/KD (7.4+)の値は、pH 7.4におけるアフィニティに対するpH 5.8における抗体アフィニティの比を示す。「+」は、pH 5.8およびpH 7.4におけるアフィニティ測定における1.2 mM CaCl2の存在を示す。
スイーピング指数の改善とkoff (5.8+ of 775+)/koff (7.4+)比との間の相関関係を、すべての抗体についてプロットした（図2）。ただし、抗体IPN92H0286/IPN93L0205-SG136は、おそらく高いECM結合性に起因して迅速なクリアランスを示した（表5）ため、プロットから除いた。点線は、線形回帰を用いたベストフィットの直線を示し、R二乗値は適合度を示す。koff (5.8+ of 775+)/koff (7.4+)の値は、775+アッセイにおけるpH 7.4の解離速度に対するpH 5.8の解離速度の比を示す。「+」は、pH 5.8およびpH 7.4の両領域における1.2 mM CaCl2の存在を示す。
実施例7
ヒスチジン置換変異体IPN93L0026およびIPN92H0012（表9）は、1つのヒスチジン置換（例えば、Kabatナンバリングシステムでの位置で、それぞれ、軽鎖の96位における置換であるI96H、および重鎖の51位における置換であるI51H）を有する可変領域を含む。pH 7.4およびpH 5.8におけるすべてのヒスチジン置換変異体の結合アフィニティを、37℃でBiacore T200機器（GE Healthcare）を用いて決定した。組み換えプロテインA/G（Pierce）を、アミンカップリングキット（GE Healthcare）を用いてCM4センサーチップのすべてのフローセル上に固定化した。抗体およびアナライトを、7(+)緩衝液（20 mM ACES、150 mM NaCl、1.2 mM CaCl2、0.05% Tween 20、0.005% NaN3、pH 7.4）または5(+)緩衝液（20 mM ACES、150 mM NaCl、1.2 mM CaCl2、0.05% Tween 20、0.005% NaN3、pH 5.8）で調製した。各抗体を、プロテインA/Gによってセンサー表面上に捕捉した。抗体捕捉量は、200共鳴単位（RU）を目標にした。血清由来ヒトC1sを、50 nMで注射し、その後に解離させた。サイクル毎に、10 mMグリシン-HCl、pH 1.5を用いてセンサー表面を再生した。Biacore T200 Evaluationソフトウェア、バージョン2.0（GE Healthcare）を用いてデータを処理し1：1結合モデルにフィッティングさせることによって、結合アフィニティを決定した。pH 7.4における解離領域の直後に、pH 5.8におけるさらなる解離領域を組み込んだ。5(+)緩衝液中でのこの解離速度は、Scrubber 2.0（BioLogic Software）曲線フィッティングソフトウェアを用いてデータを処理しフィッティングさせることによって決定した（表9）。
表9に示されるように、シングルヒスチジン置換変異体であるIPN93L0026およびIPN92H0012は、koff (5.8+ of 775+)/koff (7.4+)の比の向上を示した。スイーピング指数の改善とkoff (5.8+ of 775+)/koff (7.4+)比との間の相関関係（表8）を参照すると、これらの置換は、単独でまたは他の置換との組み合わせのいずれにおいても、スイーピング指数の改善を増強する能力を有している。
Figure 2023116744000011
実施例8：CCP1-CCP2-SP結合体を用いたマウスPK試験
高速液体クロマトグラフィー・エレクトロスプレータンデム質量分析（LC/ESI-MS/MS）によるマウス血漿中の総ヒトC1s濃度の測定
マウス血漿中のヒトC1sの総濃度を、LC/ESI-MS/MSによって測定した。較正標準は、ヒトC1s濃度が0.477、0.954、1.91、3.82、7.64、15.3、30.5μg/mLとなるように規定量のヒトC1sをマウス血漿中で混合および希釈することによって調製した。2μLの較正標準および血漿サンプルを、25μLの、50 mmol/L重炭酸アンモニウム中7.5 mol/L尿素、8 mmol/Lジチオトレイトールおよび1μg/mLリゾチーム（ニワトリ卵白）と混合し、56℃で45分間インキュベートした。その後、2μLの500 mmol/Lヨードアセトアミドを添加し、37℃で30分間、暗所でインキュベートした。次に、160μLの50 mmol/L重炭酸アンモニウム中0.5μg/mL配列決定等級修飾トリプシン（Promega）を添加し、37℃で一晩インキュベートした。最後に、残留トリプシンを不活性化させるために、5μLの10％トリフルオロ酢酸を添加した。40μLの消化サンプルを、LC/ESI-MS/MSによる分析に供した。LC/ESI-MS/MSは、2D I-class UPLC（Waters）を備えたXevo TQ-Sトリプル四重極機器（Waters）を用いて行った。ヒトC1s特異的ペプチドLLEVPEGRを、選択反応モニタリング（SRM）によりモニタリングした。SRMトランジションは、ヒトC1sについて[M+2H]2+（m/z 456.8）からy6イオン（m/z 686.4）とした。濃度に対してプロットされたピーク面積を用いる加重（1/x2）線形回帰により、較正曲線を作成した。分析用ソフトウェアMasslynxバージョン4.1（Waters）を用いて、この較正曲線からマウス血漿中の濃度を算出した。
マウスにおける抗C1s抗体投与後の総hC1sの薬物動態の評価
抗原を単独で（hC1qおよびrC1r2s2の混合物）または抗C1s抗体と共にマウス（CB17/Icr-Prkdcscid/CrlCrlj: Charles River Japan）に投与した後に、hC1sおよび抗C1s抗体のin vivo薬物動態を評価した。3匹のマウスを各投与グループに割り当てた。
最初に、hC1qおよびrC1r2s2を含む混合物の溶液（それぞれ、0.84および0.47 mg/mL）を、10 mL/kgの用量でマウスに静脈内注射した。抗原溶液の投与後、抗C1s抗体溶液（2.5 mg/mL）を直ちに、同じ個体に同じ方法で投与した。
C1qおよびrC1r2s2の用量設定は、投与直後にヒト血漿中で生理学的濃度となるように設定した。この試験の間、両方の抗原に対して抗C1s抗体の濃度が過剰となるように抗C1s抗体の用量を調節し、そのため血中では、ほぼすべてのhC1sが結合形態になると推定された。
注射から5分後、30分後、2時間後、7時間後、3日後、7日後、14日後、21日後、および28日後に血液を収集した。これらの血液を直ちに遠心分離し、血漿サンプルを分離した。各サンプル収集時点で、hC1sの血漿中濃度を、LC/ESI-MS/MSによって測定した。hC1sのPKパラメータを、非コンパートメント解析によって概算した（Phoenix WinNonlinバージョン8.0、Certara）。抗C1s抗体として以下の抗体をマウスに投与した（表10）：
1. COS0098bb-SG1148/SG136
2. COS0112gg-SG1148/SG136
3. COS0127bb-SG1148/SG136
4. COS0158ee-SG1148/SG136
5. COS0182hh-SG1148/SG136。
SG136 Fcは、C1qおよびFcガンマ受容体の両方の結合性を低減する変異を含む。SG1148 Fcは、Fcガンマ受容体の結合性を維持しつつC1qの結合性を低減する変異を含む。hC1sのPKパラメータを表11に示す。5つのCCP1-CCP2-SP結合体（COS0098bb、COS0112gg、COS0127bb、COS0158eeおよびCOS0182hh）のhC1s CL比（SG1148/SG136）は、それぞれ、9.2、6.9、5.6、3.8および6.6であった。この値は、hC1s除去を促進する能力を示す。
Figure 2023116744000012
 定常領域の名称：SG1148（CH: SEQ ID NO: 86およびCL: SEQ ID NO: 88）、SG136（CH: SEQ ID NO: 87およびCL: SEQ ID NO: 88）
Figure 2023116744000013

Claims (14)

  1. C1sに結合する単離された抗体であって、以下の（i）または（ii）に記載されるように、酸性pHよりも中性pHにおいて高いアフィニティでC1sに結合する、抗体：
    （i）中性pHおよび酸性pHの両方において高カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのC1s結合活性のKD値に対する酸性pHでのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）が2以上である、
    （ii）中性pHおよび酸性pHの両方において高カルシウム濃度下で測定された場合、中性pHでのC1s結合活性のkoff値に対する酸性pHでのC1s結合活性のkoff値の比（koff(酸性pH)/koff(中性pH)）が2以上である。
  2. 以下のKabatナンバリングシステムでの位置：
    重鎖：H51、H65、およびH99；ならびに
    軽鎖：L92、L94、L95、およびL96
    のうちの1つまたは複数にヒスチジン残基を含む、請求項1記載の抗体。
  3. 以下のKabatナンバリングシステムでの位置：
    重鎖：H51、H65、およびH99；ならびに
    軽鎖：L92、L94、L95、およびL96
    のうちの1つまたは複数において、少なくとも1つのアミノ酸がヒスチジンで置換されている、請求項1または2記載の抗体。
  4. 中性pH条件下で、C1sへの結合に関して、
    （a）SEQ ID NO:23のHVR-H1配列、SEQ ID NO:24のHVR-H2配列、SEQ ID NO:25のHVR-H3配列、SEQ ID NO:26のHVR-L1配列、SEQ ID NO:27のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:28のHVR-L3配列を含む抗体、
    （b）SEQ ID NO:29のHVR-H1配列、SEQ ID NO:30のHVR-H2配列、SEQ ID NO:31のHVR-H3配列、SEQ ID NO:32のHVR-L1配列、SEQ ID NO:33のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:34のHVR-L3配列を含む抗体、
    （c）ヒトモノクローナル抗C1s抗体M241、
    （d）SEQ ID NO:56のHVR-H1配列、SEQ ID NO:57のHVR-H2配列、SEQ ID NO:58のHVR-H3配列、SEQ ID NO:71のHVR-L1配列、SEQ ID NO:72のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:73のHVR-L3配列を含む抗体、
    （e）SEQ ID NO:59のHVR-H1配列、SEQ ID NO:60のHVR-H2配列、SEQ ID NO:61のHVR-H3配列、SEQ ID NO:74のHVR-L1配列、SEQ ID NO:75のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:76のHVR-L3配列を含む抗体、
    （f）SEQ ID NO:62のHVR-H1配列、SEQ ID NO:63のHVR-H2配列、SEQ ID NO:64のHVR-H3配列、SEQ ID NO:77のHVR-L1配列、SEQ ID NO:78のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:79のHVR-L3配列を含む抗体、
    （g）SEQ ID NO:65のHVR-H1配列、SEQ ID NO:66のHVR-H2配列、SEQ ID NO:67のHVR-H3配列、SEQ ID NO:80のHVR-L1配列、SEQ ID NO:81のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:82のHVR-L3配列を含む抗体、ならびに
    （h）SEQ ID NO:68のHVR-H1配列、SEQ ID NO:69のHVR-H2配列、SEQ ID NO:70のHVR-H3配列、SEQ ID NO:83のHVR-L1配列、SEQ ID NO:84のHVR-L2配列、およびSEQ ID NO:85のHVR-L3配列を含む抗体
    からなる群より選択される抗体と競合する、請求項1～3のいずれか一項記載の抗体。
  5. 可変領域の少なくとも1つのアミノ酸が、以下のKabatナンバリングシステムでの位置：
    重鎖：H51、H65、およびH99；ならびに
    軽鎖：L92、L94、L95、およびL96
    のうちの1つまたは複数においてヒスチジンで置換されている、SEQ ID NO:35もしくは36のVH配列および/またはSEQ ID NO:37もしくは38のVL配列を含む、請求項1～4のいずれか一項記載の抗体。
  6. さらに、可変領域の少なくとも1つのアミノ酸が、
    1）前記抗体の酸性pHでの非特異的結合活性が低下するように、または
    2）中性pHでのC1s結合活性のKD値に対する酸性pHでのC1s結合活性のKD値の比（KD(酸性pH)/KD(中性pH)）が大きくなるように
    D、E、K、RおよびQからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている、請求項1～5のいずれか一項記載の抗体。
  7. C1sに結合する単離された抗体であって、（a）SEQ ID NO:39のアミノ酸配列を含むHVR-H1、（b）SEQ ID NO:40のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および（c）SEQ ID NO:41のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み、ヒト由来または霊長類由来のフレームワーク領域を含む、抗体。
  8. C1sに結合する単離された抗体であって、（a）SEQ ID NO:42または45のアミノ酸配列を含むHVR-L1、（b）SEQ ID NO:43のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および（c）SEQ ID NO:44のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含み、ヒト由来または霊長類由来のフレームワーク領域を含む、抗体。
  9. （a）SEQ ID NO:19、17もしくは22のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列；（b）SEQ ID NO:20、18もしくは21のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列；または（c）（a）のVH配列および（b）のVL配列を含む、請求項1～8のいずれか一項記載の抗体。
  10. SEQ ID NO:19、17または22のVH配列を含む、請求項9記載の抗体。
  11. SEQ ID NO:20、18または21のVL配列を含む、請求項9記載の抗体。
  12. SEQ ID NO:19のVH配列およびSEQ ID NO:20のVL配列を含む、抗体。
  13. 請求項1～12のいずれか一項記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む、薬学的製剤。
  14. 補体介在性の疾患または障害を有する個体を治療する方法であって、請求項1～12のいずれか一項記載の抗体を個体に有効量投与する工程を含む、方法。
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