LT5354B - Ląstelių linijų išskyrimo baltymų neturinčioje terpėje būdas ir šiuo būdu išskirtos ląstelių linijos - Google Patents
Ląstelių linijų išskyrimo baltymų neturinčioje terpėje būdas ir šiuo būdu išskirtos ląstelių linijos Download PDFInfo
- Publication number
- LT5354B LT5354B LT2005053A LT2005053A LT5354B LT 5354 B LT5354 B LT 5354B LT 2005053 A LT2005053 A LT 2005053A LT 2005053 A LT2005053 A LT 2005053A LT 5354 B LT5354 B LT 5354B
- Authority
- LT
- Lithuania
- Prior art keywords
- protein
- protein concentration
- cell line
- cells
- medium
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 114
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 114
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 97
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 52
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 20
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 14
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 claims description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 8
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims description 8
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 7
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 claims description 7
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 5
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 5
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 3
- 230000030833 cell death Effects 0.000 claims description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 abstract description 24
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 2
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- XPAOKCSHUNYPBS-XSBNNCSWSA-N [(2r,3s,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methyl [(2r,3r,5s)-3-(hydroxymethyl)-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl] hydrogen phosphate Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1O[C@H](OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H](C[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)[C@@H](CO)C1 XPAOKCSHUNYPBS-XSBNNCSWSA-N 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 1
- 229960000182 blood factors Drugs 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
- C12N5/0694—Cells of blood, e.g. leukemia cells, myeloma cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
- C12N2500/95—Protein-free medium and culture conditions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Šis išradimas susijęs su žinduolių ląstelių linijų, kurios yra prisitaikę augti serumo ir baltymų neturinčioje terpėje, gavimo būdu. Išradimo būdas apima procesą, susidedantį iš dviejų prisitaikymo pakopų, apimančių kritinės baltymų koncentracijos intervalą, kuriame ląstelės privalo išsiugdyti sugebėjimą išgyventi baltymų neturinčioje terpėje. Kiekvienai ląstelių linijai yra specifinis kritinės baltymų koncentracijos intervalas. Išradimas taip pat susijęs su žinduolių ląstelių linijomis, kuriosstabiliai auga serumo ir baltymų neturinčioje terpėje mažiausiai iki 40 generacijų. Išradimas, be to, susijęs su klonais, kurie ekspresuoja anti-CD6 T1hT ir EGF hR3 antireceptorių humanizuotus antikūnus ir anti-CD3 T3Q chimerinį antikūną, taip pat irminėtų antikūnų fragmentus.
Description
Išradimo sritis
Šis išradimas susijęs su biotechnologija, konkrečiai su būdu, siekiančiu stabilius ląstelių klonus pritaikyti terpei, neturinčiai serumo arba baltymų pagal dviejų stadijų prisitaikymo procesą.
Išradimo prielaida:
Žinduolių ląstelių auginimo in vitro vystymosi reikalavimas dideliu mastu priklauso nuo šių ląstelių daugumos gaminamų produktų diagnostinio ir terapinio potencialo. Šie naudingi agentai apima monokloninius antikūnus, žmogaus augimo hormonus, limfokinus, eritropoetiną, kraujo krešėjimo faktorius ir audinių plazminogeno aktyvatorius.
Rekombinantinių monokloninių antikūnų (rMab) panaudojimas įvairių ligų gydymui ir diagnozei in vivo daugumoje atvejų reiškia didelių dozių gydymą. Šis faktas daro būtiną didelių kiekių labai aukšto švarumo norimų rMab gamybą.
Kai kurie rekombinantiniai monokloniniai antikūnai, kurie potencialiai gali būti naudojami vėžio ir autoimuninių ligų gydymui bei diagnostikai buvo ekspresuojami Molekulinės imunologijos centre. US 5,891,996 aprašo išskyrimą chimerinių ir humanizuotų antikūnų prieš epidermio augimo faktoriaus receptorių (EGF-R), naudojamų diagnozei ir gydymui navikų, ekspresuojamų minėto receptoriaus. WO 97/19111 aprašo anti-CD6 monokloninius antikūnus, naudojamus diagnozavimui ir gydymui pacientų, kenčiančių nuo psoriazės. Gavilondo ir kt. Hibridoma 9, Nr.5, 1999 pristato anti-CD3 monoklononį antikūną pavadintą IOR-T3a.
Buvo sukurtos įvairios metodikos auginimui baltymų neturinčioje terpėje. Tokiu būdu, ypatingai išsiskiria pilnai neturinti baltymų terpė, kuri buvo sukurta kaip sudaranti sąlygas ląstelių augimui, nesant baltymų.
WO 91/05240 aprašo rekombinantinių baltymų ekspresiją tokiomis sąlygomis, kai nėra baltymų.
JP 2696001 aprašo baltymų neturinčios terpės panaudojimą VIII faktoriaus gavimui CHO ląstelėse, pridedant nejoninio paviršinio aktyvaus agento ciklodekstrino, kad būtų sumažintas ląstelių-šeimininkių produktyvumas. Kad būtų sumažintas šių priedų efektyvumas, rekomenduojama pridėti, pavyzdžiui, butirato ir ličio.
W0 96/26266 aprašo ląstelių auginimą terpėje, kuri turi baltymų hidrolizatą su gliutaminu, kurio laisvų aminorūgščių kiekis yra mažiau negu 15 % bendro baltymų svorio ir kurių peptidų molekulinis svoris yra mažesnis negu 44 kD. Pavyzdžiui, augimo terpė ląstelių kultūroms naudojama sintetinė minimali terpė kaip bazinė terpė, į kurią prie baltymų hidrolizato papildomai, be kita ko, pridedama fetalinio veršelių serumo, gentamicino ir merkaptoetanolio. Šios serumo turinčios terpės panaudojimas kraujo faktorių rekombinantiniam gavimui neminimas.
U.S. patentas No. 5,393,668 A aprašo specialų sintetinį paviršių, kuris leidžia augti adherentinėms ląstelėms, nesant baltymų.
Kad būtų stimuliuojama ląstelių proliferacija, CHO ląstelės, kurios superekspresuoja žmogaus insuliną, buvo išdaugintos dirbtiniame substrate, su kuriuo insulinas yra surištas kovalentiškai (Ito ir kt. 1996 PNAS U.S.A. 93:3598-3601).
Reiter ir kt. (1992. Cytotechnology 9:247-253) aprašo r-CHO ląstelių imobilizaciją, pirma užaugintų terpėje su serumu iki aukšto tankio ant nešėjo, ir vėlesnę imobilizuotų ląstelių perfuziją į baltymų neturinčią terpę, produkcijos fazės metu, kurioje buvo rastas nenutrūksramas baltymo atpalaidavimas į ląstelių kultūros supematantą. Taip ląstelės buvo palaikomos mažiau negu 10 generacijų baltymų neturinčioje terpėje.
Ląstelių kultūrų sėkmingo paruošimo dideliu mastu ankstesni metodai baltymų neturinčioje terpėje buvo aprašyti nenutrūkstamoms ląstelių linijoms; dalinai VERO ląstelėms (WO 96/15231). Taigi, ląstelės augo nuo pradinės ampulės iki didelio techninio masto 1200 litrų.
Pritaikyti ląstelės augti nuo sąlygų, kai yra serumo, prie baltymų neturinčios terpės, yra nepaprastai varginantis procesas, kuris paprastai reikalauja ilgo laiko; be to pakartotinai buvo randama, kad ekspresuojamo baltymo išeiga ir rekombinantinių CHO ląstelių produktyvumas žymiai krenta po prisitaikymo baltymų neturinčioje terpėje, palyginus su sąlygomis, kai terpėje yra serumo (Peterson ir kt. 1994. Appl. Microbiol. Biotechnol. 40:691-658). Tai yra rekombinantinių klonų nestabilumo arba sumažėjusio augimo dėl pasikeitusių augimo sąlygų padarinys. Nepaisant stabilių pradinių klonų naudojimo, dėl pasikeitusių fermentacijos sąlygų, pakartotinai didelė porcija ląstelių tapo ląstelėmis su sumažėjusią ekspresija arba netgi neproduktoriais, kurie perauga produkto gamintojus produkcijos metu, kada fermentatoriaus kultūra galiausiai žymia dalimi susideda iš neproduktoriaus arba iš ląstelių, turinčių žemą ekspresiją.
Šiame išradime mes sudarėme prielaidą sukurti stabilias ląstelių linijas, pritaikytas serumo ir baltymų neturinčiai terpei. Šiuo būdu baltymų neturinčioje terpėje buvo išskirta keletas klonų.
Detalus išradimo aprašymas
Ląstelių linijų dviejų pakopų prisitaikymas prie baltymų neturinčios terpės.
Si procedūra apima žinduolių ląstelių linijas, su kuriomis neįmanoma atlikti tiesioginės prisitaikymo procedūros iš terpės papildytos serumu arba neturinčios serumo terpės į baltymų neturinčią terpę.
Šio išradimo metodas susideda iš dviejų pakopų proceso, kurio metu ląstelių linijos prisitaiko prie baltymų neturinčios terpės (PFM).
Pirmoji pakopa, kuri manoma yra ne lemiama pakopa: baltymo kiekio mažėjimas vykstantis neprarandant ląstelės gyvybingumo ir tai yra nežymus sumažėjimas per populiacijos padvigubėjimo laiką kiekvienoje baltymų koncentracijos pakopoje. Nekritinė stadija stebima dažniausiai tarp 5 ir 0,5 mg/ml nuo bendros baltymų koncentracijos augimo terpėje ir kultūra dažniausiai rodo tą patį augimo greitį, kaip ir pradinėje augimo terpėje.
Ši pirmoji pakopa startuoja esant ląstelių gyvybingumui tarp 80 ir 100 % ir ląstelės auginamos augimo terpėje su nuosekliu baltymų koncentracijos mažėjimu iki kritinės baltymų koncentracijos, kuriai esant ląstelių gyvybingumas krenta iki 0 %. Ši baltymų koncentracija yra starto taškas sekančiai pakopai.
Antroji pakopa, kuri manoma yra kritinė: šioje pakopoje įvyksta ląstelių gyvybingumo.ir ląstelių populiacijos dvigubėjimo laiko mažėjimas ir reikia daugiau laiko prisitaikyti nuo vienos baltymų koncentracijos prie kitos. Egzistuoja kritinės baltymų koncentracijos auginimo terpėje, kurių negalima išvengti prisitaikymo proceso metu. Šios kritinės baltymų koncentracijos yra specifinės kiekvienai rekombinantinei ląstelių linijai, bet dažniausiai yra žemiau 0,6 mg/ml. Kai tik ląstelės atgauna pradinį gyvybingumą ir augimo greitį šiose kritinėse baltymų koncentracijose, galimas peršėjimas išplaukiančiomis sąlygomis su mažesne baltymų koncentracija.
Kai kritinė baltymų koncentracija nustatyta, tai yra beveik aukščiausia baltymų koncentracija, kuri palaiko ląstelių augimą ir laikoma ikikritine baltymų koncentracija. Pradedant nuo ikikritinės baltymų koncentracijos, ji lėtai mažinama iki ląstelės atgaus pradinį gyvybingumą ir augimo greitį.
Pasirinktas baltymų koncentracijos mažinimo iki kritinės stadijos pakopų derinys turėtų apspręsti bendrą prisitaikymo laiką šiame etape ir prisitaikymo koeficientą, kuris apskaičiuojamas kaip santykis:
Vadapt. = Abaltvmo koncentracija ATadapt.
Tačiau šios pakopos derinys neturi turėti įtakos laikui, kuris reikalingas prisitaikymui prie kiekvienos baltymų koncentracijos, įskaitant kritines koncentracijas.
Tam, kad būtų nustatyta nekritinės pakopos pabaiga ir kritinė baltymų koncentracija, yra būtina atlikti laipsnišką prisitaikymą, esant įprastiniam ląstelių kultūros praskiedimui terpėje be norimo baltymo, kiekvieną kartą mažinant baltymo koncentraciją du kartus (1 lentelė). Šis mažinimas gali būti atliekamas mažinant serumo koncentraciją arba papildant pagrindinę terpę skirtingu lygiu kokiu nors baltymais turtingu serumo pakaitalu.
lentelė: Baltymo koncentracijos laipsniškas mažinimas, siekiant nustatyti kritinę koncentraciją, pradedant nuo auginimo terpės, praturtintos 5mg/ml baltymo (10 % fetalinio veršelių serumo ekvivalentas).
| Pakopos numeris | Bendra baltymo koncentracija mg/ml | Ekvivalentiška FBS koncentracija* mg/ml |
| 1 | 5.000 | 10.00 |
| 2 | 2.500 | 5.00 |
| 3 | 1.250 | 2.50 |
| 4 | 0.625 | 1.25 |
| 5 | 0.312 | 0.60 |
| 6 | 0.156 | 0.30 |
| 7 | 0.000 | 0.00 |
Legenda: FBS - fetalinis veršelių serumas PFM - baltymų neturinti terpė SCM - terpė su serumu
Bendras baltymo kiekis fetaliniame veršelių serume laikomas apie 50 mg/ml.
Prieš pradedant prisitaikymo procedūrą, ląstelės turi būti palaikomos su daugiau negu 80 % gyvybingumu T formos induose standartinėje terpėje paprastai naudojamoje ląstelių auginimui.
Prisitaikymo procesas vykdomas pakopa po pakopos sekančiais, žemiau aprašytais etapais,
i. Užsėjama 3 šulinėliai šešių šulinėlių auginimo plokštelėje rekombinantine ląstelių linija, naudojant standartinę ląstelių auginimo terpę (esant pradinei baltymo koncentracijai). Ląstelių tankis turi būti diapazone nuo 1 iki 5x105 ląstelių/ml. Po 48 valandų pusė supematanto yra pakeičiama šviežia baltymų neturinčia terpe, tokiu būdu padarant galutinę baltymų koncentraciją kuri yra 50 % pradinės būklės.
ii. Kas 48 valandas supematantas yra pilnai pakeičiamas šviežia auginimo terpe, kurios baltymų koncentracija yra 50 % pradinės būklės.
iii. Ląstelės auginamos iki susiliejimo, esant šiai baltymų koncentracijai.
iv. Ląstelės iš iii pakopos išsėjamos mažiausiai 3 šulinėliuose iki tankio diapazono nuo 1 iki 5x105 ląstelių/ml augimo terpėje su baltymo koncentracija, kuri yra 50 % pradinės būklės. Po 48 valandų pusė superatanto pakeičiama šviežia baltymų neturinčia terpe, padarant galinę baltymų koncentraciją kuri yra 50 % ankstesnės būklės.
v. Kas 48 valandas supematantas yra pilnai pakeičiamas šviežia auginimo terpe, kurios baltymų koncentracija yra 50 % ankstesnės būklės.
vi. Ląstelės auginamos iki susiliejimo, esant šiai baltymų koncentracijai.
vii. Pakopos nuo (iv) iki (vi) kartojamos, kiekvieno ciklo metu baltymų koncentracija sumažinama iki 50 % praėjusio ciklo koncentracijos. Ši procedūra kartojama iki pasiekiama baltymų koncentracija, kuri sukelia ląstelių mirtį.
viii. Ląstelės išsėjamos iš 80 % gyvybingumo ląstelių kultūros tolimesniam auginimui ikikritinėje baltymų koncentracijoje, mažiausiai 3 šulinėliuose iki tankio diapazono nuo 2 iki 6x10s ląstelių/ml. Ląstelės auginamos ikikritinėje baltymų koncentracijoje ir po 48 valandų 25 % supematanto pakeičiama šviežia baltymų neturinčia terpe, tokiu būdu padarant galutinę baltymų koncentraciją kuri yra 75 % ikikritinės baltymų koncentracijos.
ix. Kas 48 valandas supematantas pilnai pakeičiamas šviežia auginimo terpe su 75 % ikikritinės baltymų koncentracijos.
x. Ląstelės auginamos iki susiliejimo esant šiai baltymų koncentracijai.
xi. Ląstelės iš (x) pakopos išsėjamos mažiausiai į 3 šulinėlius iki tankio diapazono nuo 2 iki 6x105 ląstelių/ml augimo terpėje, su baltymų koncentracija, kuri yra 75 % ikikritinės baltymų koncentracijos. Po 48 valandų 25 % supematanto pakeičiama šviežia terpe, padarant galinę baltymų koncentraciją kuri yra 75 % ankstesnės būklės.
xii. Kas 48 valandas supematantas pilnai pakeičiamas šviežia auginimo terpe su baltymų koncentracija, kuri yra 75 % koncentracijos, esančios (x) pakopoje.
xiv. Pakopos nuo (xi) iki (xiii) kartojamos, kiekvieno ciklo metu baltymų koncentracija yra sumažinama iki 75 % ankstesnio ciklo koncentracijos, paskui ši procedūra kartojama iki pasiekiama baltymų koncentracija, kuri nesukelia ląstelių gyvybingumo praradimo ir nesumažina populiacijos padvigubėjimo laiko. Jeigu ląstelės yra perkeliamos į terpę su maža baltymų koncentracija ir jos sugeba augti, neprarandant ląstelių gyvybingumo ir nesumažėjant populiacijos padvigubėjimo laikui iki pirmojo peršėjimo, mes galime manyti, kad ląstelės vėl pasiekę nekritinę stadiją ir išsėti jas tiesiogiai į baltymų neturinčią terpę (0 mg/ml baltymų koncentracija).
Šio išradimo metodikoje pradinė augimo terpė turi diapazone tarp 5 ir 10 % fetalinio veršelių serumo.
Žinduolių ląstelių linija pritaikyta augti baltymų neturinčioje terpėje yra mieloma, dalinai NSO ląstelės.
Šis išradimas gali būti naudingas, kai naudojama NSO ląstelių linija, transfekuota polipeptidu ar rekombinantinių baltymu, dalinai kai jos transfekuojamos seka, koduojančia rekombinantinį antikūną arba jo fragmentą. Žinduolių ląstelių linijos, modifikuotos šio išradimo metodika, auginant baltymų neturinčioje terpėje yra taip pat parodyta.
Kitame šio išradimo įgyvendinime parodyta bet kokia žinduolių ląstelių linija, ekspresuojanti humanizuotą arba chimerinį antikūną parinktą iš grupės, susidedančios iš anti-EGF hR3 receptoriaus, anti-CD6 TlhT, anti-CD3 T3Q antikūnų arba jų fragmentą auginamų baltymų neturinčioje terpėje, taigi antikūnai sekretuoti šios ląstelių linijos.
Ląstelių linijos išskirtos pagal šio išradimo metodiką auginamos baltymų neturinčioje terpėje pastoviai mažiausiai iki 40 generacijų.
Pavyzdžiai:
pavyzdys: hR3 rekombinantinės ląstelių linijos prisitaikymas prie baltymų neturinčios terpės.
HR3 rekombinantinė ląstelių linija buvo gauta transfekuojant mielomos NSO ląstelių liniją su vektoriaus konstrukcija, tam, kad ši linija ekspresuotų humanizuoto anti-EGF žmogaus hR3 receptoriaus monokloninio antikūno lengvąją ir sunkiąją grandines.
Šios ląstelių linijos pritaikymas prie baltymų neturinčios terpės buvo vykdomas pagal anksčiau aprašytą metodiką baltymų kiekį terpėje mažinant dviem etapais.
Šios ląstelės buvo auginamos RPMI-1640 terpėje, praturtintoje 10 % FBS. FBS buvo pakeista, pridedant baltymais praturtintą priedą NutridomaNS (Boheringer Manheinn) į RPMI-1640 baltymų neturinčią terpę, kad baltymų koncentracija būtų 0,15 mg/ml. Baltymo kiekio sumažinimas pradinėje terpėje buvo atliktas sėkmingai praskiedžiant baltymų neturinčia PFHM-II terpe (Gibco). Fig. 1 ir 2 atitinkamai rodo kritinės koncentracijos ir prisitaikymo santykio Vadapt skaičiavimo rezultatus.
pavyzdys: Rekombinantinės ląstelių linijos TlhT prisitaikymas prie baltymų neturinčios terpės.
Rekombinantinė ląstelių linija TlhT buvo gauta transfekuojant mielomos NSO ląstelių liniją vektoriaus konstrukcija, tam, kad ši linija ekspresuotų anti-žmonių CD6 monokloninių antikūną humanizuotų supresuojant epitopą T, lengvąją ir sunkiąją grandines.
Šios ląstelių linijos prisitaikymas prie terpės su/be baltymų buvo atliktas pagal metodiką, aprašytą 2 punkte, dviem etapais mažinant baltymų kiekį terpėje.
Pradžioje ląstelės buvo auginamos RPMI-1640 terpėje, praturtintoje 10 % FBS. Baltymų kiekio mažinimas buvo atliekamas sėkmingai praskiedžiant pradinę terpę baltymų neturinčia PFHM-II Gibco terpe.
Kritinės koncentracijos ir prisitaikymo santykio apskaičiavimo rezultatai parodyti atitinkamai 3 ir 4 figūrose.
pavyzdys: Rekombinantinės ląstelių linijos T3Q prisitaikymas prie baltymų neturinčios terpės.
Rekombinantinė ląstelių linija T3Q buvo gauta transfekuojant mieiomos NSO ląstelių liniją vektoriaus konstrukcija, tam, kad ši linija ekspresuotu humanizuoto monokloninio antikūno T3Q, kuris atpažįsta žmogaus limfocitų CD3 receptorių, lengvąją ir sunkiąją grandines.
Šios ląstelių linijos prisitaikymas prie terpės su/be baltymų buvo atliktas pagal metodiką, aprašytą 2 punkte, dviem etapais mažinant baltymo kiekį terpėje.
Pradžioje ląstelės buvo auginamos RPMI-1640 terpėje, praturtintoje 10 % FBS. Baltymų kiekio mažinimas buvo atliekamas sėkmingai praskiedžiant pradinę terpę PFHM-II Gibco terpe be baltymų.
Kritinės koncentracijos ir prisitaikymo santykio Vadapt. apskaičiavimo rezultatai parodyti atitinkamai 5 ir 6 figūrose.
TRUMPAS FIGŪRŲ APRAŠYMAS
Fig.l: Koreliacija laiko, reikalingo prisitaikyti hR3 ląstelėms prie kiekvienos baltymų koncentracijos (iki gyvybingumo ir padvigubėjimo laiko atstatymo) su natūriniu logaritmu atvirkštinės baltymų koncentracijos. Kritinės koncentracijos reikšmės h-R3 ląstelių linijai: - 0,32 ir 0,11 mg/ml nuo bendros baltymų koncentracijos.
Fig. 2: Koreliacija bendro laiko nuo adaptacijos procedūros pradžios su h-R3 ląstelių linijos atvirkštinės baltymų koncentracijos natūriniu logaritmu. Prisitaikymo greičio reikšmės h-R3 ląstelių linijai kritinio etapo metu - 0,0053 mg/d.
Fig. 3: Koreliacija laiko, reikalingo prisitaikyti TlhT ląstelėms prie kiekvienos baltymų koncentracijos (iki gyvybingumo ir padvigubėjimo laiko atstatymo) su natūriniu logaritmu atvirkštinės baltymų koncentracijos. Kritinės koncentracijos reikšmės TlhT ląstelių linijai: - 0,12 ir 0,01 mg/ml nuo bendros baltymų koncentracijos.
Fig. 4: Koreliacija bendro laiko nuo adaptacijos procedūros pradžios su TlhT ląstelių linijos atvirkštinės baltymo koncentracijos natūriniu logaritmu. Prisitaikymo greičio reikšmės ThlT ląstelių linijai - 0,0014 mg/d.
Fig. 5: Koreliacija laiko, reikalingo prisitaikyti T3Q ląstelėms prie kiekvienos baltymų koncentracijos (iki gyvybingumo ir padvigubėjimo laiko atstatymo) su natūriniu logaritmu atvirkštinės baltymų koncentracijos. Kritinės koncentracijos reikšmės T3Q ląstelių linijai: - 0,63 mg/ml bendros baltymų koncentracijos.
Fig. 6: Koreliacija bendro laiko nuo adaptacijos procedūros pradžios su T3Q ląstelių linijos atvirkštinės baltymų koncentracijos natūriniu logaritmu. Prisitaikymo greičio reikšmės T3Q ląstelių linijai-0,0172 mg/d.
Claims (20)
- Išradimo apibrėžtis1. Žinduolių ląstelių linijos, pritaikytos augti serumo ir baltymų neturinčioje terpėje, gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad apima du etapus:1. pirmąjį etapą, kuriame ląstelių linijos gyvybingumas yra tarp 80 ir 100 % ir ląstelės yra auginamos auginimo terpėje su nuosekliu baltymų koncentracijos mažinimu iki kritinės baltymų koncentracijos, kurioje ląstelių gyvybingumas krenta iki 0 %;II. antrąjį etapą, kuriame kai kritinė koncentracija buvo nustatyta iš anksto, tuomet ikikritinė koncentracija fiksuojama tokia baltymų koncentracija, kurioje ląstelių augimas yra galimas ir tai yra pradžios taškas lėtam baltymų koncentracijos mažinimui iki ląstelių kultūra pasieks pradinį ląstelių gyvybingumą ir populiacijos padvigubėjimo laiką.
- 2. Būdas pagal 1 punktą besiskiriantis tuo, kad pirmasis etapas sudarytas iš tokių pakopų:i. šešių šulinėlių auginimo plokštelėje užsėjami 3 šulinėliai rekombinantine ląstelių linija, naudojant standartinę ląstelių auginimo terpę (su pradine baltymų koncentracija); ląstelių tankis turi būti diapazone nuo 1 iki 5x105 ląstelių/ml; po 48 valandų pusė supernatanto pakeičiama šviežia baltymų neturinčia terpe, taip padarant galinę baltymų koncentraciją kuri yra 50 % pradinės būklės;ii. kas 48 valandas supernatantas pilnai pakeičiamas šviežia auginimo terpe, kurios baltymų koncentracija yra 50 % pradinės būklės;iii. esant šiai baltymų koncentracijai, ląstelės auginamos iki susiliejimo;iv. ląstelės iš pirmo etapo išsėjamos mažiausiai į 3 šulinėlius tankio diapazone nuo 1 iki 5x105 ląstelių/ml auginimo terpėje su baltymų koncentracija, kuri yra 50 % pradinės būklės; po 48 valandų pusė supernatanto pakeičiama šviežia baltymų neturinčia terpe, taip padarant galinę baltymų koncentraciją kuri yra 50 % buvusios būklės;v. kas 48 valandas supernatantas pilnai pakeičiamas šviežia auginimo terpe, kurios baltymų koncentracija yra 50 % buvusios būklės;vi. esant šiai baltymų koncentracijai, ląstelės auginamos iki susiliejimo;vii. pakopos nuo (iv) iki (vi) kartojamos, kiekvieno ciklo metu baltymų koncentracija sumažinama iki 50 % buvusio ciklo koncentracijos, ir ši procedūra kartojama, iki pasiekiama baltymų koncentracija, kuri iššaukia ląstelių mirtį.
- 3. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad antrasis etapas susideda iš šių pakopų:viii. ląstelės, išsėtos iš ląstelių kultūros, kurios gyvybingumas apie 80 % arba aukštesnis, auginamos ikikritinėje baltymų koncentracijoje mažiausiai 3 šulinėliuose, esant tankio diapazonui nuo 2 iki 6x105 ląstelių/ml; ląstelės auginamos ikikritinėje baltymų koncentracijoje ir po 48 valandų 25 % supernatanto pakeičiama šviežia neturinčia baltymų terpe, tokiu būdu padarant galutinę baltymų koncentraciją, kuri yra 75 % prieškritinės baltymų koncentracijos;ix. kas 48 valandas supernatantas pilnai pakeičiamas šviežia auginimo terpe su baltymų koncentracija, kuri yra 75 % prieškritinės baltymų koncentracijos;x. esant šiai baltymų koncentracijai, ląstelės auginamos iki susiliejimo;xi. ląstelės iš (x) etapo išsėjamos mažiausiai į 3 šulinėlius tankio diapazone nuo 2 iki 6x105 ląstelių/ml auginimo terpėje su baltymų koncentracija, kuri yra 75 % prieškritinės baltymų koncentracijos, ir po 48 valandų 25 % supernatanto pakeičiama šviežia baltymų neturinčia terpe, tokiu būdu padarant galutinę baltymų koncentraciją, kuri yra 75 % prieš tai buvusios pakopos baltymų koncentracijos;xii. kas 48 valandas supernatantas pilnai pakeičiamas šviežia auginimo terpe su baltymų koncentracija, kuri yra 75 % (x) pakopos koncentracijos;xiii. esant šiai baltymų koncentracijai, ląstelės auginamos iki susiliejimo;xiv. pakopos nuo (xi) iki (xiii) kartojamos, kiekvieno ciklo metu baltymų koncentracija sumažinama iki 75 % buvusio ciklo koncentracijos, po to ši procedūra kartojama iki pasiekiama baltymų koncentracija, kuri neiššaukia ląstelių mirties ir populiacijos padvigubėjimo laiko sumažėjimo; jeigu ląstelės yra perkeliamos į terpę su mažesne baltymų koncentracija ir jos sugeba augti neprarandant ląstelių gyvybingumo ir populiacijos padvigubėjimo laiko sumažėjimo prieš pirmąjį peršėjimą, galima laikyti, kad ląstelės pasiekė nekritinį etapą ir sėti jas tiesiog į baltymų neturinčią terpę (baltymų koncentracija 0 mg/ml).
- 4. Būdas pagal 1-3 punktus, besiskiriantis tuo, kad serumą ir baltymą turinti terpė, į kurią ląstelės pradžioje sėjamos, apima nuo 5 % iki 10 % fetalinio veršelių serumo.
- 5. Būdas pagal 1-4 punktus, besiskiriantis tuo, kad žinduolių ląstelių linija, prisitaikiusi augti terpėje, neturinčioje serumo ir baltymų, yra mieloma.
- 6. Būdas pagal 5 punktą, besiskiriantis tuo, kad mieloma yra NSO ląstelių linija.
- 7. Būdas pagal 6 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta NSO ląstelių linija turi seką, koduojančią rekombinantinį polipeptidąarba rekombinantinį baltymą.
- 8. Būdas pagal 7 punktą, besiskiriantis tuo, kad seka, koduojanti rekombinantinį polipeptidą arba rekombinantinį baltymą, koduoja rekombinantinį antikūną arba jo fragmentą.
- 9. Žinduolių ląstelių linija, gauta būdu pagal 1-8 punktus, kur minėta ląstelių linija yra prisitaikiusi augti terpėje, neturinčioje serumo ir baltymų.
- 10. Žinduolių ląstelių linija pagal 9 punktą, besiskirianti tuo, kad minėta ląstelių linija yra mieloma.
- 11. Žinduolių ląstelių linija pagal 10 punktą, besiskirianti tuo, kad minėta ląstelių linija yra NSO ląstelių linija.
- 12. Žinduolių ląstelių linija pagal 11 punktą, besiskirianti tuo, kad NSO ląstelių linija turi seką, koduojančią rekombinantinį polipeptidą arba rekombinantinį baltymą.
- 13. Žinduolių ląstelių linija pagal 12 punktą, besiskirianti tuo, kad seka, koduojanti rekombinantinį polipeptidą arba rekombinantinį baltymą, koduoja rekombinantinį antikūną arba j o fragmentą.
- 14. Žinduolių ląstelių linija pagal 13 punktą, besiskirianti tuo, kad seka koduoja humanizuotą rekombinantinį anti-EGF-R hR3 antikūną arba jo fragmentą.
- 15. Žinduolių ląstelių linija pagal 13 punktą, besiskirianti tuo, kad seka koduoja humanizuotą rekombinantinį anti-CD6 TlhT antikūną arba jo fragmentą.
- 16. Žinduolių ląstelių linija pagal 13 punktą, besiskirianti tuo, kad seka, koduoja chimerinį rekombinantinį anti-CD3 T3Q antikūną arba j o fragmentą.
- 17. Būdo pagal 1-8 punktus panaudojimas žinduolių ląstelių linijų, prisitaikiusių augti terpėje, neturinčioje serumo ir baltymų, gavimui.
- 18. Humanizuotas monokloninis antikūnas prieš EGF-R hR3 arba jo fragmentus, išskirtas ląstelių linijos, gautos būdu pagal 1-8 punktus.
- 19. Humanizuotas monokloninis antikūnas prieš CD6 TlhT antigeną arba jo fragmentą, išskirtas ląstelių linijos, gautos būdu pagal 1-8 punktus.
- 20. Chimerinis monokloninis antikūnas prieš CD3 T3Q antigeną arba jo fragmentą, išskirtas ląstelių linijos, gautos būdu pagal 1-8 punktus.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CU20020239A CU23097A1 (es) | 2002-10-23 | 2002-10-23 | Método para la obtención de líneas celulares en medio libre de proteína y líneas celulares obtenidas por este método |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| LT2005053A LT2005053A (lt) | 2006-04-25 |
| LT5354B true LT5354B (lt) | 2006-07-25 |
Family
ID=40134843
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| LT2005053A LT5354B (lt) | 2002-10-23 | 2005-05-19 | Ląstelių linijų išskyrimo baltymų neturinčioje terpėje būdas ir šiuo būdu išskirtos ląstelių linijos |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20060036082A1 (lt) |
| EP (2) | EP2363418B1 (lt) |
| JP (1) | JP4674087B2 (lt) |
| KR (1) | KR101186048B1 (lt) |
| CN (1) | CN1714147B (lt) |
| AR (1) | AR041645A1 (lt) |
| AT (1) | ATE502103T1 (lt) |
| AU (1) | AU2003273727B2 (lt) |
| CA (1) | CA2503315C (lt) |
| CU (1) | CU23097A1 (lt) |
| DE (1) | DE60336415D1 (lt) |
| DK (1) | DK1564285T3 (lt) |
| EA (1) | EA007465B1 (lt) |
| EC (1) | ECSP055740A (lt) |
| ES (2) | ES2360049T3 (lt) |
| GE (1) | GEP20084444B (lt) |
| HK (1) | HK1084414A1 (lt) |
| HR (1) | HRP20050760A2 (lt) |
| LT (1) | LT5354B (lt) |
| LV (1) | LV13361B (lt) |
| MY (1) | MY144088A (lt) |
| NZ (1) | NZ540171A (lt) |
| PE (1) | PE20040552A1 (lt) |
| PT (1) | PT1564285E (lt) |
| TN (1) | TNSN05116A1 (lt) |
| UY (1) | UY28037A1 (lt) |
| WO (1) | WO2004038010A1 (lt) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104651314B (zh) * | 2015-02-14 | 2018-06-19 | 百泰生物药业有限公司 | 获得高产稳定表达细胞克隆的方法及由此获得的抗体分子 |
| CN104673754B (zh) * | 2015-02-14 | 2018-03-02 | 百泰生物药业有限公司 | 重组骨髓瘤细胞克隆的筛选方法及由此获得的抗体分子 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991005240A1 (en) | 1989-09-29 | 1991-04-18 | Atomic Energy Of Canada Limited | Infrared-based gas detector |
| US5393668A (en) | 1991-09-11 | 1995-02-28 | Hans-Wilhelm Doerr | Cultivation of mammalian cells in a protein-free medium on a polyvinylformal and/or polyvinyl butyral surface |
| WO1996015231A2 (en) | 1994-11-10 | 1996-05-23 | Immuno Aktiengesellschaft | Method for producing biologicals in protein-free culture |
| WO1996026266A1 (en) | 1995-02-23 | 1996-08-29 | Quest International B.V. | Peptides for tissue and cell culture media |
| WO1997019111A2 (es) | 1995-11-17 | 1997-05-29 | Centro De Inmunologia Molecular (Cim) | Anticuerpos monoclonales anti-cd6 y sus utilizaciones |
| JP2696001B2 (ja) | 1991-04-15 | 1998-01-14 | 財団法人化学及血清療法研究所 | 組換え蛋白質産生用培地 |
| US5891996A (en) | 1972-09-17 | 1999-04-06 | Centro De Inmunologia Molecular | Humanized and chimeric monoclonal antibodies that recognize epidermal growth factor receptor (EGF-R); diagnostic and therapeutic use |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3694263A (en) * | 1970-10-23 | 1972-09-26 | Joseph J Korn Sr | Swimming pool cleaning methods and apparatus therefor |
| US3886616A (en) * | 1972-12-06 | 1975-06-03 | Fay A Hayes | Hand propelled swimming pool cleaner |
| US4275474A (en) * | 1979-04-30 | 1981-06-30 | Woodard Randle C | Vacuum head for swimming pool cleaning system |
| US4240174A (en) * | 1979-07-30 | 1980-12-23 | Scott Jeffrey L | Self-contained mobile pool cleaning apparatus |
| US4430214A (en) * | 1982-09-15 | 1984-02-07 | Baker Marvin E | Strainer mill for swimming pool pump intake |
| AU2986484A (en) * | 1983-06-27 | 1985-01-03 | Monash University | Leptospira strains grown in protein free medium |
| US4558479A (en) * | 1984-01-26 | 1985-12-17 | Alopex Industries, Inc. | Pool cleaner |
| US4683599A (en) * | 1984-03-30 | 1987-08-04 | Fahet Nv | Automatic pool cleaner fitting |
| US4581075A (en) * | 1985-03-15 | 1986-04-08 | Maxi-Sweep, Inc. | Self-propelled water borne pool cleaner |
| EP0784684B8 (en) * | 1994-09-16 | 2008-03-26 | Cancer Research Institute of Contra Costa | RECOMBINANT PEPTIDES DERIVED FROM THE Mc3 ANTI-BA46 ANTIBODY, METHODS OF USE THEREOF, AND METHODS OF HUMANIZING ANTIBODY PEPTIDES |
| AUPN442295A0 (en) | 1995-07-26 | 1995-08-17 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Regulated autocrine growth of mammalian cells |
| AT407255B (de) * | 1997-06-20 | 2001-02-26 | Immuno Ag | Rekombinanter zellklon mit erhöhter stabilität in serum- und proteinfreiem medium und verfahren zur gewinnung des stabilen zellklons |
-
2002
- 2002-10-23 CU CU20020239A patent/CU23097A1/es unknown
-
2003
- 2003-10-10 PE PE2003001035A patent/PE20040552A1/es not_active Application Discontinuation
- 2003-10-16 AR ARP030103776A patent/AR041645A1/es active IP Right Grant
- 2003-10-17 MY MYPI20033959A patent/MY144088A/en unknown
- 2003-10-22 WO PCT/CU2003/000012 patent/WO2004038010A1/es active IP Right Grant
- 2003-10-22 NZ NZ540171A patent/NZ540171A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-10-22 GE GEAP20038815A patent/GEP20084444B/en unknown
- 2003-10-22 EP EP11155076.0A patent/EP2363418B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-22 DK DK03757654.3T patent/DK1564285T3/da active
- 2003-10-22 JP JP2004545689A patent/JP4674087B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-22 ES ES03757654T patent/ES2360049T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-22 DE DE60336415T patent/DE60336415D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-22 AU AU2003273727A patent/AU2003273727B2/en not_active Expired
- 2003-10-22 US US10/532,269 patent/US20060036082A1/en not_active Abandoned
- 2003-10-22 CN CN2003801036918A patent/CN1714147B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-22 EP EP03757654A patent/EP1564285B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-22 PT PT03757654T patent/PT1564285E/pt unknown
- 2003-10-22 ES ES11155076.0T patent/ES2624279T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-22 CA CA2503315A patent/CA2503315C/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-22 KR KR1020057006995A patent/KR101186048B1/ko active IP Right Grant
- 2003-10-22 AT AT03757654T patent/ATE502103T1/de active
- 2003-10-22 EA EA200500695A patent/EA007465B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2003-10-23 UY UY28037A patent/UY28037A1/es not_active Application Discontinuation
-
2005
- 2005-04-22 TN TNP2005000116A patent/TNSN05116A1/en unknown
- 2005-04-22 EC EC2005005740A patent/ECSP055740A/es unknown
- 2005-05-19 LT LT2005053A patent/LT5354B/lt not_active IP Right Cessation
- 2005-05-23 LV LVP-05-61A patent/LV13361B/en unknown
- 2005-09-02 HR HR20050760A patent/HRP20050760A2/xx not_active Application Discontinuation
-
2006
- 2006-04-13 HK HK06104515.2A patent/HK1084414A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-04-13 US US12/759,208 patent/US20100197011A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5891996A (en) | 1972-09-17 | 1999-04-06 | Centro De Inmunologia Molecular | Humanized and chimeric monoclonal antibodies that recognize epidermal growth factor receptor (EGF-R); diagnostic and therapeutic use |
| WO1991005240A1 (en) | 1989-09-29 | 1991-04-18 | Atomic Energy Of Canada Limited | Infrared-based gas detector |
| JP2696001B2 (ja) | 1991-04-15 | 1998-01-14 | 財団法人化学及血清療法研究所 | 組換え蛋白質産生用培地 |
| US5393668A (en) | 1991-09-11 | 1995-02-28 | Hans-Wilhelm Doerr | Cultivation of mammalian cells in a protein-free medium on a polyvinylformal and/or polyvinyl butyral surface |
| WO1996015231A2 (en) | 1994-11-10 | 1996-05-23 | Immuno Aktiengesellschaft | Method for producing biologicals in protein-free culture |
| WO1996026266A1 (en) | 1995-02-23 | 1996-08-29 | Quest International B.V. | Peptides for tissue and cell culture media |
| WO1997019111A2 (es) | 1995-11-17 | 1997-05-29 | Centro De Inmunologia Molecular (Cim) | Anticuerpos monoclonales anti-cd6 y sus utilizaciones |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MATEO C. ET AL.: "Removal of amphipathic epitopes from genetically engineered antibodies: production of modified immunoglobulins with reduced immunogenicity", HYBRIDOMA, 2000, pages 463 - 471 |
| REITER M ET AL.: "Flow cytometry and two-dimensional electrophoresis (2-DE) for system evaluation of long term continuous perfused animal cell cultures in macroporous beads", CYTOTECHNOLOGY, 1992, pages 247 - 253 |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK169586B1 (da) | Histil ukendt rottemyelomacellelinie, hybridcellelinie afledt deraf, in vitro cellekultursystem og cellefusionssystem omfattende celler herfra, fremgangsmåde til fremstilling af en hybridcellelinie samt fremgangsmåde til fremstilling af monoklonale antistoffer | |
| AR011439A2 (es) | Procedimiento para producir quimeras de inmunoglobulina (ig) del receptor del factor de necrosis tumoral (tnfr), nuevas preparaciones igg1 del tnfr1 yuna composicion terapeutica que los contiene | |
| EP0043718A2 (en) | Improvements in or relating to cell lines | |
| AU2015211514A1 (en) | Method for modulating galactosylation of recombinant protein through optimization of culture medium | |
| JP2017516484A (ja) | タンパク質生産のための細胞培養工程 | |
| LT5354B (lt) | Ląstelių linijų išskyrimo baltymų neturinčioje terpėje būdas ir šiuo būdu išskirtos ląstelių linijos | |
| ES2908067T3 (es) | Métodos para modular los perfiles de galactosilación proteicos de proteínas recombinantes empleando peracetil galactosa | |
| EP0251106A2 (en) | Improved fusion method | |
| EP0251107A2 (en) | Improved fusion products | |
| BRPI0315565B1 (pt) | Método para se obter uma linhagem celular de mieloma nso que contém uma sequência que codifica um polipeptídeo recombinante ou uma proteína recombinante adaptada para crescer em meio livre de soro e proteína, e, uso do método | |
| US20230348850A1 (en) | Cell culture processes | |
| CN111373028B (zh) | 蛋白质的生产方法 | |
| JPS60204727A (ja) | 抗ヒトｖ型コラ−ゲン抗体 | |
| Ali et al. | Serum Free Culture of Human-Human Hybridoma Secreting Monoclonal Antibodies Against Stomach Cancer | |
| JPS61219381A (ja) | ヒト−ヒトハイブリド−マ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM9A | Lapsed patents |
Effective date: 20131022 |