CN1200733C - 阻断淋巴毒素β与其受体结合的物质在制备药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在个体中诱导抗病毒应答的方法，其包括给该患者施用有效量的LT-B阻断剂和药学上可接受的载体。特别地，本发明提供治疗病毒引起的系统休克和呼吸窘迫的方法。

Description

阻断淋巴毒素β与其受体结合的物质在制备药物中的应用
                      相关申请
本申请是1998年10月9日提交的美国临时申请60/103,662的部分继续。该早先提交的临时专利申请所授技术以参考文献并入本文。
                      发明领域
广义上，本发明涉及诱导个体抗病毒应答的方法。具体地，本发明提供在个体中治疗病毒引起的系统休克(systemic shock)和呼吸窘迫的方法。这些方法包括施用某些“淋巴毒素β阻断剂”。
                      发明背景
几种病毒包括Sin Nombre病毒(SNV)、埃博拉病毒(Ebola)、马尔堡病毒(Marburg)、拉沙病毒(Lassa)和登革病毒(Dengue)均引起具有如下症状的急性疾病：发病迅速、发烧、系统休克和肺窘迫(pulmonarydistress)(Lacy等(1997)Adv.Ped.Inf.Dis.12：21)。这些感染的另一个共同点是病毒感染的全身分布，并靶向内皮细胞和巨噬细胞(Lacy等(1997)Adv.Ped.Inf.Dis.12：21)。这些新出现的病毒除了SNV之外大多数是几十年前初次鉴定的。从它们被发现之后的这些年中，这些病原体又多次在全世界爆发。到1998年6月，已证实在美国西南部由于鹿、鼠(deer mouse)数量增加有183例已证实的SNV病例，SNV是汉坦病毒肺休克综合症(Hantavirus Pulmonary ShockSyndrome)的致病因子。这些病例中仅有55％感染后存活(疾病控制和预防中心(Centers for Disease Control and Prevention).MMWR.47，449(1998))。目前，对这些病毒的致病机理和如何有效治疗全球每年成千上万患有病毒引起的系统休克和呼吸窘迫的感染患者了解极少。
因此，有必要开发在个体中治疗病毒引起的系统休克和呼吸窘迫的新方法。
                         本发明概述
本发明通过提供在个体中治疗病毒引起的系统休克和呼吸窘迫的药物组合物和方法解决上述问题。
本发明的方法和组合物部分利用了如下发现：某些试剂，本文称为淋巴毒素β(LT-B)阻断剂，可用于在个体中治疗病毒引起的系统休克和呼吸窘迫。在一个实施方案中，LT-B阻断剂是淋巴毒素β受体(LT-B-R)阻断剂。在一个优选实施方案中，LT-B-R是抗淋巴毒素B受体或可溶性淋巴毒素B受体的抗体。在一个最优选的实施方案中，LT-B-R阻断剂是重组LT-B-R融合蛋白，该融合蛋白具有与免疫球蛋白恒定重链结构域融合的LT-B-R细胞外配体结合域。
通过下面优选实施方案的描述，本发明前述和其它目标、特征、方面和优点，以及本发明本身，将被更全面地理解。
                       附图简述
图1显示，NZB小鼠感染LCMV克隆13导致死亡。感染了LCMV-13的NZB小鼠的死亡曲线(n＝14)和感染后第6天LCMV-13感染小鼠各种器官的病毒滴度(n＝7)。
图2显示NZB小鼠中LCMV-13感染的组织学分布。(A)正常肺(100X，H+E)；(B)肺中有单核细胞浸润和肺泡壁增厚的间质性肺炎，感染后第5天(100X，H+E)；(C)脾中淋巴耗竭、细胞坏死和滤泡结构的堵塞(25X，H+E)；(D)更高的放大倍数，显示脾中细胞坏死和核破裂碎片(158X，H+E)；(E)肺中LCMV-13阳性内皮细胞(箭号)和巨噬细胞(白色箭号)(100X，H+E)；(F)脾中LCMV-13阳性内皮细胞(箭号)、间皮细胞(锲形符号)和巨噬细胞(白色箭号)(50X，IHC)；(G)心脏中LCMV-13阳性内皮细胞(100X，IHC)；(H)肝脏中LCMV-13阳性库普弗细胞和窦状隙衬细胞(100X，IHC)。
图3显示LTβR信号传导通路的阻断显著改善克隆13感染NZB小鼠的存活率。这里给出了按所述方式处理的克隆13感染NZB小鼠的死亡曲线。静脉内给NZB小鼠施用2.5×106pfu克隆13，然后在感染后第1天和第4天两次腹膜内注射250ug溶于无内毒素的PBS中的TN3-19.12抗体(见参考文献S)。对照小鼠在相同天数时注射相同体积的无抗体的PBS。小鼠按参考文献R中所述处理。对于三重处理组，在感染后第0天和第3天腹膜内注射200ug量的TNFR55-Ig和LTβR-Ig蛋白。对照小鼠在相同天数时注射相同量在合成这些融合蛋白中使用的人抗体(AY1943-29)。仅接受LTβR-Ig的小鼠处理相同，只是省略TNFR55-Ig注射。数据从如下几个实验收集：仅注射抗TNF(TN3-19.12)，仅注射LTβR-Ig(n＝16)，三重处理组(n＝10)(三重处理组(n＝10)，仅注射LTβR-Ig(n＝22)，LTβR-Ig+TNFR55-Ig组(n＝10)，抗TNF和TNFR55-Ig处理组(n＝5)，仅注射抗TNF(TN3-19.12)组(n＝6)和对照(n＝25))。
图4显示LTβR通路的阻断导致CD8T细胞功能降低。感染后第6天收集不同处理组的小鼠脾细胞，按前人所述用含有NP118九肽的Ld四聚物染色。所给出的值已对非特异背景染色校正。为监测对相同肽响应的γ干扰素的产生，在0.1ug/ml终浓度NP118和IL-2存在时将细胞在37℃孵育5小时。所给出的值已对无肽存在的背景水平校正。和两个LTβR-Ig小鼠的脾细胞(LTβ#2/3)一样，用对照人Ig处理的3个小鼠的脾细胞也合并起来。所有其它结果均来自单个小鼠。
图5显示CD8+T细胞而不是CD4+T细胞的耗竭逆转NZB小鼠中LCMV-13的致死效果。小鼠按体内耗竭细胞群的所述方法处理。每一个处理组均给出了死亡曲线(n＝4)。
                     本发明详述
定义
为了更加清楚而准确地阐明本发明的主题，给下面的描述和附及的权利要求中使用的特定术语提供下列定义。
淋巴毒素β(LT-β)是TNF配体家族的成员，TNF配体家族还包括Fas、CD27、CD30、CD40、OX-40和4-1BB受体的配体(Smith等，细胞(Cell)，76，第959-62(1994))。TNF家族的若干成员(包括TNF、LT-α、LT-β和Fas)的信号传导可诱导肿瘤细胞通过坏死或细胞凋亡(程序化细胞死亡)死亡。在非肿瘤发生细胞中，TNF和许多TNF家族配体-受体相互作用影响免疫系统发育和对各种免疫激发的应答。
淋巴毒素-β(也称p33)已在T淋巴细胞、T细胞系、B细胞系和淋巴因子激活杀伤(LAK)细胞的表面被鉴定。LT-β是本申请人共同未决国际申请PCT/US91/04588(1992年出版，WO92/00329)以及PCT/US93/11669(1994年出版，WO94/13808)的主题，上述申请以参考文献并入本文。
LT-β受体是TNF受体家族的成员，它特异地结合表面LT配体。LT-β-R结合LT异聚体复合物(主要是LT-α1/β2和LT-α2/β1)，但不结合TNF或LT-α(Crowe等，科学(Science)，264，第707-10页(1994))。LT-β-R的信号传导可能在外周淋巴器官发育和体液免疫应答中起作用。
LT-β-R mRNA存在于人脾、胸腺和其它主要器官中。LT-β-R的表达模式与报道的p55-TNF-R相似，只是LT-β-R在外周血T细胞和T细胞系中缺乏。
术语“LT-β阻断剂”是指能消除配体与LT-β结合、细胞表面LT-β聚集、或LT-β信号传导，或能影响LT-β信号如何在细胞内解释的试剂。LT-β阻断剂的例子包括抗LT-β、可溶性LT-β-R-Fc分子，和抗LT-α、抗LT-α/β和抗LT-β-R抗体。优选地，这些抗体不与分泌形式的LT-α交叉反应。
术语“LT-β受体阻断剂”是指能消除配体与LT-β-R结合、细胞表面LT-β-R聚集、或LT-β-R信号传导，或能影响LT-β-R信号传导如何在细胞内解释的试剂。LT-β-R阻断剂的例子包括可溶性LT-β-R-Fc分子和抗LT-β-R抗体。优选地，这些抗体不与分泌形式的LT-α交叉反应。
术语“抗LT-β受体抗体”是指任何特异结合该LT-β受体至少一个表位的抗体。
术语“抗LT抗体”是指任何特异结合LT-α、LT-β或LT-α/β复合物的至少一个表位的抗体。
术语“LT配体”是指能特异结合LT-β受体的LT异聚复合物或其衍生物。
术语“LT-β-R信号传导”是指与LT-β-R通路有关的分子反应以及由此产生的随后分子反应。
术语“LT-β-R配体结合域”是指LT-β-R参与LT配体特异识别和与LT配体相互作用的一个或多个部分。
术语“LT-α/β异聚复合物”和“LT异聚复合物”是指至少一个LT-α和一或多个LT-β亚基(包括一或多个这些亚基的可溶性、突变、改变或嵌合形式)之间的稳定结合。这些亚基可通过静电、范德华力或共价相互作用结合。优选地，LT-α/62异聚复合物具有至少两个相邻LT-β亚基并缺少相邻LT-α亚基。当LT-α/β异聚复合物充当细胞生长分析中的LT-β-R激活剂时，该复合物优选是可溶性的，并具有化学计量的LT-α1/β2。
可溶性LT-α/62异聚复合物缺少跨膜结构域，并可被已改造成表达LT-α和/或LT-β亚基的适当宿主细胞分泌(Crowe等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)，168，第79-89页(1994))。
术语“表面LT-α/62复合物”和“表面LT复合物”是指展示在细胞表面上的含有LT-α和膜结合LT-β亚基(包括突变、改变和嵌合形式的一或多个上述亚基)的复合物。“表面LT配体”是指可特异结合LT-β受体的表面LT复合物或其衍生物。
“有效量”是指足以实现有益或所期望临床结果的量。有效量可在一次或多次给药中施用。对于本发明，阻断淋巴毒素B结合其受体的试剂的有效量是足以改善、稳定或延迟病毒应答发展的试剂量。特别地，是足以改善、稳定或延迟病毒引起的系统休克和呼吸窘迫的发展的试剂量。这些效力指标的检测和测量是本领域技术人员熟知的。
“个体”是指脊椎动物，特别是哺乳动物物种的成员，包括但不限于家畜、体育用动物和灵长类，包括人类。
氨基酸残基的“功能等价物”是(i)与被功能等价物替代的氨基酸残基在反应特性上相似的氨基酸；(ii)本发明拮抗剂的氨基酸，该氨基酸与被该功能等价物替代的氨基酸残基具有相似特性；(iii)与被该功能等价物替代的氨基酸残基具有相似特性的非氨基酸分子。
如果满足下列条件中的至少一项，则编码本发明蛋白质性拮抗剂的第一多核苷酸与编码该拮抗剂蛋白质的第二多核苷酸相比是“功能等价物”：
(a)：该“功能等价物”是在标准杂交条件下与第二多核苷酸杂交的第一多核苷酸和/或是该第一多核苷酸序列的简并序列。最优选地，它编码具有整联蛋白拮抗剂蛋白活性的突变蛋白质；
(b)：该“功能等价物”是在表达时编码第二多核苷酸编码的氨基酸序列的第一多核苷酸。
氨基酸残基的“功能等价物”是(i)与被功能等价物替代的氨基酸残基在反应特性上相似的氨基酸；(ii)本发明拮抗剂的氨基酸，该氨基酸与被该功能等价物替代的氨基酸残基具有相似特性；(iii)与被该功能等价物替代的氨基酸残基具有相似特性的非氨基酸分子。
如果满足下列条件中的至少一项，则编码本发明蛋白质性拮抗剂的第一多核苷酸与编码该拮抗剂蛋白质的第二多核苷酸相比是“功能等价物”：
(a)：该“功能等价物”是在标准杂交条件下与第二多核苷酸杂交的第一多核苷酸和/或是该第一多核苷酸序列的简并序列。最优选地，它编码具有整联蛋白拮抗剂蛋白活性的突变蛋白质；
(b)：该“功能等价物”是在表达时编码第二多核苷酸编码的氨基酸序列的第一多核苷酸。
本发明使用的LT-B阻断剂包括但不限于本文所列试剂及其功能等价物。因此，本文所用术语“功能等价物”是一种LT-B阻断剂或编码该LT-B阻断剂的多核苷酸，其与判断功能等价物的基础LT-B阻断剂相比对接受者具有相同或改善的有益作用。正如本领域普通技术人员所能理解的，功能等价物蛋白质可通过重组技术如表达“功能上等价的DNA”来产生。因此，本发明包括天然存在DNA编码的LT-B阻断剂以及编码天然存在DNA编码的相同蛋白质的非天然存在DNA编码的LT-B阻断剂。由于核苷酸编码序列的简并性，其它多核苷酸也可用于编码LT-B阻断剂。这些多核苷酸包括通过在该序列中进行不同密码子的替代而改变的上述序列的全部或部分，这些不同密码子编码相同的氨基酸残基，因而产生沉默变换。这种改变的序列被认为是这些序列的等价物。例如Phe(F)由两个密码子TTC或TTT编码，Tye(Y)由TAC或TAT编码，而His(H)由CAC或CAT编码。另一方面，Trp(W)由单个密码子TGG编码。因此，应当理解，对于一个给定的编码特定整联蛋白的DNA序列，会有许多编码该蛋白的DNA简并序列。这些简并DNA序列均包括在本发明的范围之内。
术语“融合”或“融合蛋白”是指两个或多个蛋白质或其片段通过各自的肽主链共线性共价连接，最优选通过编码这些蛋白质的多核苷酸分子的基因表达来实现。优选这些蛋白质或其片段来自不同来源，因而这种类型的融合蛋白质称为“嵌合”分子。因此，优选的融合蛋白质是包括与非LT-B阻断剂的第二部分共价连接的LT-B阻断剂或片段的嵌合蛋白。本发明优选的融合蛋白可包括保留抗原结合特异性的完整抗体的部分，例如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、F(v)片段、重链单体或二聚体、轻链单体或二聚体、包含一条重链和一条轻链的二聚体等。
最优选的融合蛋白是嵌合蛋白，并包含与免疫球蛋白轻链、重链或两者的全部或部分铰链和恒定区融合或连接的LT-B阻断剂部分。因此，本发明的特征是包含如下部分的分子：(1)LT-B阻断剂部分，(2)第二肽，如增加LT-B阻断剂部分的可溶性或体内存留时间的肽，如免疫球蛋白超家族的成员或其片段或部分，如IgG的部分或片段，如人IgG1重链恒定区，如CH2、CH3和铰链区。具体地，“LT-B或LT-B-R/Ig融合蛋白”是包含与免疫球蛋白链N端相连的本发明生物学活性LT-B阻断剂(如可溶性LT-B-R)或其生物学活性片段的蛋白质，其中免疫球蛋白N端的一部分被LT-B阻断剂替代。一种LT-B或LT-B-R/Ig融合蛋白是“LT-B-R/Fc融合蛋白”，后者是包含与免疫球蛋白恒定区至少一部分相连的本发明LT-B-R的蛋白质。优选的Fc融合蛋白包含与其中含有免疫球蛋白重链C端结构域的抗体片段相连的本发明LT-B阻断剂。
“标准杂交条件”—用于杂交和洗膜的盐和温度条件，基本上相当于0.5×SSC至约5×SSC和65℃。因此，本文所用术语“标准杂交条件”是一个操作性定义，包括一个杂交条件范围。较高严紧性的杂交条件可包括例如用噬菌斑筛选缓冲液(0.2％聚乙烯吡咯烷酮，0.2％Ficoll 400；0.2％牛血清白蛋白，50mM Tris-HCl(pH7.5)；1M NaCl；0.1％焦磷酸钠；1％SDS)；10％硫酸葡聚糖和100ug/ml变性的超声处理鲑精DNA在65℃杂交12-20小时，再用75mM NaCl/7.5mM柠檬酸钠(0.5×SSC)/1％SDS在65℃洗膜。较低严紧性的杂交条件可包括例如用噬菌斑筛选缓冲液、10％硫酸葡聚糖和110ug/ml变性的超声处理鲑精DNA在55℃杂交12-20小时，再用300mM NaCl/30mM柠檬酸钠(2.0×SSC)/1％SDS在55℃洗膜。也见《当代分子生物学实验手册》(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons公司，纽约，第6.3.1-6.3.6部分，(1989)。
本文所用“治疗组合物”定义为包含本发明蛋白质和其它生物学相容成分。治疗组合物可包含赋形剂如水、矿物质和载体如蛋白质。
II. 优选实施方案的描述
本发明部分依赖于LT-B阻断剂可在个体中诱导抗病毒应答的发现。发现治疗感染了病毒的个体可极大地增加个体的存活率。特别地，我们显示，用LT-B阻断剂如LTβR-Ig融合蛋白治疗LCMV-13感染的NZB小鼠增加存活率73％。
当前，本文提到的埃博拉病毒、登革病毒、SNV和其它病毒的治疗是通过教育预防疾病的转播。对这些高病原性病毒还没有疫苗。病毒唑—一种胍类似物—已被用作几种上述感染的通用抗病毒药物，但文献仅记载在疾病早期使用时治疗拉沙热中可重复成功(M.D.Lacy和R.A.Smego，Adv.Ped.Inf.Dis.，12，21(1997))。我们的数据显示与这些病毒有关的一些致病机理可能是免疫介导的。LT系统的阻断可通过短暂降低病毒特异的CD8 T细胞数目和它们的功能极大地增加存活机会。采用若干阻断TNFα通路的方法来治疗几种疾病的临床实验已在进行之中(H.I.Pass，D.Mew，H.A.Pass等，Chest Surg.Clin.N.Amer.5，73(1995))。我们认为，要最终用于有关迅速发展的急性病毒感染包括休克和/或肺窘迫的患者的人体实验，LTβR-Ig治疗应当在动物模型中做进一步测试。
LT-B阻断剂
在本发明的一个实施方案中，LT-β阻断剂包括抗LT-β的抑制LT-β信号传导的抗体(Ab)。优选地，抗LT-βAb是单克隆抗体(mAb)。抑制性抗LT-βAb和其它LT-β阻断剂可采用检测一或多种试剂结合LT配体或抑制细胞中LT-β信号传导效应的能力的筛选方法来鉴定。
在本发明的另一个实施方案中，LT-β阻断剂包含LT-β受体(LT-B-R)阻断剂。在一个优选实施方案中，LT-B-R阻断剂是抑制LT-β-R信号传导的抗LT-β-R的抗体(Ab)。优选地，抗LT-β-R抗体是单克隆抗体(mAb)。一个这种抑制性抗LT-β-RmAb是BDA8mAb。抑制性抗LT-β-RAb和其它LT-β-R阻断剂可采用检测一或多种试剂结合LT-β-R或LT配体或抑制细胞中LT-β-R信号传导效应的能力的筛选方法来鉴定。
一种筛选方法利用LT-β-R信号传导对带有LT-β-R的肿瘤细胞的细胞毒性效应。肿瘤细胞暴露于一或多种LT-β-R激活剂中以诱导LT-β-R信号传导。LT-β-R激活剂包括IFN-γ存在下的LT-α/62异聚复合物(优选可溶性LT-α1/β2)或活化性抗LT-β-R Ab(见下；也描述于申请人的共同未决美国申请08/378,968)。
可阻断LT-β-R信号传导的抗体和其它试剂按如下方式根据其抑制LT-β-R信号传导对肿瘤细胞的细胞毒作用的能力来选择：
1)在有或无系列稀释的被测试剂存在时将肿瘤细胞如HT29细胞在一系列含有培养基和至少一种LT-β-R激活剂的组织培养孔中培养3-4天；
2)向肿瘤细胞混合物加入测量线粒体功能的活体染料如MTT，并反应数小时；
3)测定每孔混合物在550nm波长光处的光密度(OD550)。OD550与LT-β-R激活剂和被测LT-β-R阻断剂存在时每孔中剩余的肿瘤细胞数成正比。可降低LT-β-R激活的肿瘤细胞细胞毒性至少20％的试剂或试剂组合是本发明范围内的LT-β-R阻断剂。
任何激活LT-β-R信号传导的试剂或试剂组合都可用于上述鉴定LT-β-R阻断剂的分析。导致LT-β-R信号传导的LT-β-R激活剂(如激活性抗LT-β-RmAb)可使用上述肿瘤细胞分析根据其单独或联合其它试剂加强肿瘤细胞细胞毒性的能力来选择。
选择LT-β-R阻断剂的另一种方法是检测该推测试剂直接妨碍LT配体-受体结合的能力。能阻断配体-受体结合至少20％的试剂或试剂组合是本发明范围内的LT-β-R阻断剂。
可采用任何测量配体-受体结合强度的众多分析进行推测LT-β-R阻断剂的竞争实验。受体与配体之间的结合强度可采用酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA)来测量。特异结合也可用荧光标记抗体-抗原复合物并进行荧光激活细胞分类(FACS)分析或其它这类免疫检测方法来测量，所有这些方法均是本领域熟知技术。
配体-受体结合相互作用还可采用BIAcore TM仪(PharmaciaBiosensor)用胞质团共振检测法(plasmon resonance detection)来测量(Zhou等，生物化学(Biochemistry)，32，第8193-98页(1993)；Faegerstram和O’Shannessy，“亲合技术中的表面胞质团共振检测(Surface plasmon resonance detecton in affinitytechnologies)”，亲合层析手册(Handbook of AffinityChromatography)，第229-52页，Marcel Dekker公司，纽约(1993))。
BIAcore TM技术可允许受体与金表面结合并将配体流过该表面。胞质团共振检测实时直接检测与该表面结合的物质量。该技术既产生结合速度常数也产生解离速度常数，因此，配体-受体解离常数和亲合常数可在有或无推测的LT-β-R阻断剂存在时直接测定。
利用任何测定受体-配体相互作用的这些技术或其它技术，可评价LT-β-R阻断剂单独或联合其它试剂抑制表面或可溶性LT配体结合表面或可溶性LT-β-R分子的能力。这些分析也可用于单个地或组合地测试LT-β-R阻断剂或这些试剂的衍生物(如融合物、嵌合物、突变体和化学变化形式)，以优化该变化的试剂阻断LT-β-R激活的能力。
在本发明的一个实施方案中，LT-β-R阻断剂包含可溶性LT-β受体分子。编码配体结合域的人LT-β-R细胞外部分的序列显示于美国专利5,925,351的图1中，后者以参考文献并入本文。使用美国专利5,925,351图1中的序列信息和本领域熟知的重组DNA技术，可将编码该LT-β-R配体结合域的功能片段克隆至载体中，并在适当宿主中表达产生可溶性LT-β-R分子。选择根据本文描述的方法能与天然LT-β受体竞争结合LT配体的可溶性LT-β-R分子作为LT-β-R阻断剂。
包含选自美国专利5,925,351图1所示序列之氨基酸序列的可溶性LT-β受体可与一或多个异源蛋白结构域(“融合域”)结合以增加该受体融合蛋白的体内稳定性或调节其生物活性或定位。优选地，使用稳定血浆蛋白质(典型地，其在循环系统中半衰期大于20小时)构建受体融合蛋白。这种血浆蛋白包括但不限于：免疫球蛋白、血清白蛋白、脂蛋白、载脂蛋白和运铁蛋白。还可将能使可溶性LT-β-R分子导向特定细胞或组织类型的序列与该LT-β-R配体结合域结合，产生特异定位的可溶性LT-β-R融合蛋白。包含LT-β-R配体结合域的整个LT-β-R细胞外区域(美国专利5,925,351图1)或其功能部分可与免疫球蛋白恒定区如人IgG1重链Fc域融合(Browning等，免疫学杂志(J.Imunol.)，154，第33-46页(1995))。可溶性受体-IgG融合蛋白是普通免疫学试剂，它们的构建方法是本领域已知的(见如美国专利5,225,538)。功能性LT-β-R配体结合域可与IgG1以外的免疫球蛋白类或亚类的免疫球蛋白(Ig)Fc域融合。属于不同Ig类或亚类的抗体Fc域可激活不同次级效应子的功能。在Fc域被同源Fc受体结合时发生激活。次级效应子功能包括激活补体系统、通过胎盘和结合各种微生物蛋白质的能力。不同类和亚类免疫球蛋白的特性描述于Roitt等，免疫学(Immunology)，第4.8页(Mosby-Year Book Europe Ltd.，第3版，1993)。补体酶级联反应可被结合抗原的IgG1、IgG3和IgM抗体的Fc域激活。IgG2的Fc域似乎不太有效，而IgG4、IgA、IgD和IgE的Fc域对激活补体无效。因此，可根据对于用LT-β-R-Fc融合蛋白治疗的特定免疫应答或疾病而言是否期望该蛋白具有相关次级效应子功能来选择Fc域。如果损伤或杀死携带LT配体的靶细胞是有利的，则可选择特别有活性的Fc域(IgG1)构建LT-β-R-Fc融合蛋白。或者，如果期望将LT-β-R-Fc融合蛋白导向细胞而不触发补体系统，则可选择无活性的IgG4 Fc域。
前人已描述过降低或消除与Fc受体结合和补体激活的Fc域突变(S.Morrison，免疫学年评(Annu.Rev.Immunol.)，10，第239-65页(1992))。可单个或组合地利用这些突变或其它突变以优化用于构建LT-β-R-Fc融合蛋白的Fc域活性。
包含与人免疫球蛋白Fc域融合的配体结合序列的可溶性人LT-β-R融合蛋白(hLT-β-R-Fc)的生产描述于美国专利5,925,351的实施例1，该专利以参考文献并入本文。根据实施例1制备的分泌hLT-β-R-Fc的CHO细胞系称为“hLTβ；R-hG1 CHO#14”。该细胞系样品已按照布达佩斯条约的规定于1995年7月21日保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Cultrue Collection，ATCC)(Rockville，Md.)，并给予了ATCC保藏号CRL 11965。
可溶性鼠LT-β-R融合分子(mLT-β-R-Fc)的生产描述于美国专利5,925,351的实施例2，该专利以参考文献并入本文。根据美国专利5,925,351实施例2制备的分泌mLT-β-R-Fc的CHO细胞系称为“mLTβ；R-hG1 CHO#1.3.BB”。该细胞系样品已按照布达佩斯条约的规定于1995年7月21日保藏在美国典型培养物保藏中心(AmericanType Cultrue Collection，ATCC)(Rockville，Md.)，并给予了ATCC保藏号CRL 11964。
形成受体-Ig融合蛋白连接点的不同氨基酸残基可改变可溶性LT-β受体融合蛋白的结构、稳定性并最终改变其生物学活性。可向所选LT-β-R片段的C端加入一或多个氨基酸来修饰具有所选融合域的连接点。
LT-β-R融合蛋白N端也可通过改变所选LT-β-R DNA片段为插入重组表达载体在其5’端切割的位置来改变。每个LT-β-R融合蛋白的稳定性和活性可采用常规实验和本文所述用于筛选LT-β-R阻断剂的分析来测试和优化。
使用图1显示的细胞外结构域中的LT-β-R配体结合域序列，也可构建氨基酸序列变体以修饰可溶性LT-β受体或融合蛋白对LT配体的亲和性。本发明的可溶性LT-β-R分子能与内源细胞表面LT-β受体竞争结合表面LT配体。可以设想，任何包含可与细胞表面LT-β受体竞争结合LT配体的LT-β-R配体结合域的可溶性分子均是本发明范围内的LT-β-R阻断剂。
在本发明另一个实施方案中，抗人LT-β受体的抗体(抗LT-β-R Abs)充当LT-β-R阻断剂，用于治疗将个体包括人置于病毒引起的系统休克和呼吸窘迫境地或危险之中的疾病。本发明的抗LT-β-R Abs可是多克隆的或单克隆的，并可被修饰以优化其阻断LT-β-R信号传导的能力、其体内生物利用率、稳定性或其它期望特征。
抗人LT-β受体的多克隆抗体血清采用传统技术按如下步骤制备：用溶于完全弗氏佐剂的人LT-β受体-Fc融合蛋白(美国专利5,925,351的实施例1)皮下注射动物如山羊、兔、大鼠、仓鼠或小鼠，之后用溶于不完全弗氏佐剂的抗原进行腹膜内或皮下加强注射。含有抗LT-β受体的期望抗体的多克隆抗血清通过传统免疫学程序筛选。
抗人LT-β受体-Fc融合蛋白的鼠单克隆抗体(mAbs)按美国专利5,925,351的实施例5所述制备。产生鼠抗人LT-β-R mAb BDA8的杂交瘤细胞系(BD.A8.AB9)已根据布达佩斯条约的规定于1995年1月12日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801 UniversityBoulevard，Manassas，Va.20110-2209)，并给予ATCC保藏号HB11798。
也可采用标准重组DNA技术制备各种形式的抗LT-β-R抗体(Winter和Milstein，自然(Nature)，349，第293-99页(1991))。例如，可构建一个动物抗体的抗原结合域与一个人恒定区相连的“嵌合”抗体(如Cabilly等，美国专利4,816,567；Morrison等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，81，第6851-55页(1984))。嵌合抗体可降低动物抗体用于人临床治疗时引起的观察到的免疫原性应答。此外，可以合成识别LT-β-R的重组“人源化抗体”。人源化抗体是主要包含人IgG序列的嵌合物，在此IgG序列中插有负责特异抗原结合的区域(如WO 94/04679)。用所期望抗原免疫动物，分离相应抗体，并除去负责特异性抗原结合的可变区序列部分。然后将该动物来源的抗原结合区克隆至已缺失抗原结合区的人抗体基因的适当位置。人源化抗体使人抗体中最少使用异源(种间)序列，因而在治疗对象中引起免疫应答的可能性更小。
构建不同种类重组抗LT-β-R抗体也可通过制备含有抗LT-β-R可变区和从不同种类免疫球蛋白分离的人恒定区(CH1、CH2、CH3)的嵌合或人源化抗体来进行。例如，具有增加的抗原结合位点效价的抗LT-β-R IgM抗体可通过将该抗原结合位点克隆至携带人μ链恒定区的载体之中来重组产生(Arulanandam等，J.Exp.Med.，177，第1439-50页(1993)；Lane等，Eur.J.Immunol.，22，2573-78页(1993)；Traunecker等，自然，339，第68-70(1989))。此外可使用标准重组DNA技术通过改变抗原结合位点附近的氨基酸残基来改变重组抗体与其抗原的亲和性。人源化抗体的抗原结合亲和性可根据分子模拟通过诱变来提高(Queen等，美国国家科学院院刊，86，第10029-33页(1989)；WO 94/04679)。
根据所靶向组织类型或设想的特定治疗方案可能期望增加或降低低抗LT-β-R Ab对LT-β-R的亲和性。例如，对于半预防治疗，用通过LT-β通路发出信号的能力已降低的恒定水平抗LT-β-R Ab治疗患者是有利的。同样，对LT-β-R亲和性增加的抑制性抗LT-β-R Ab对于短期治疗可能是有利的。
通过测试其它抗人LT-β受体的抗体，可期望能利用常规实验和本文所述分析方法鉴定起LT-β-R阻断剂作用的其它抗LT-β-R抗体，用于治疗将个体包括人置于病毒引起的系统休克和呼吸窘迫境地或危险之中的疾病。
本发明另一个优选实施方案涉及包含起LT-β-R阻断剂作用的抗LT配体抗体的组合物和方法。正如上面关于抗LT-β-R Abs所述，起LT-β-R阻断剂作用的抗LT配体的抗体可以是多克隆的或单克隆的，并可按照常规程序修饰以改变其抗原结合特性和免疫原性。本发明的抗LT抗体可通过单独地抗两种LT亚基的任何一个，包括LT亚基的可溶性、突变、改变或嵌合形式来产生。如果使用LT亚基作为抗原，则优选它们是LT-β亚基。如果使用LT-α亚基，则优选获得的抗LT-α抗体结合表面LT配体，并且不与分泌的LT-α交叉反应或调节TNF-R活性(根据美国专利5,925,351实施例3中描述的分析方法)。
此外，可产生抗包含一或多个LT亚基的均聚(LT-β)或杂聚(LT-α/62)复合物的抗体，并根据其LT-β-R阻断剂活性来筛选。优选地，使用LT-α1/β2复合物作为抗原。如上所述，优选获得的抗LT-α1/β2抗体结合表面LT配体，并且不结合分泌的LT-α，也不影响TNF-R活性。
多克隆抗人LT-α抗体的产生描述于申请人共同未决申请(WO94/13808)中。单克隆抗LT-α抗体和抗LT-β抗体也有描述(Browning等，免疫学杂志，54，第33-46页(1995))。鼠抗人LT-βmAb按美国专利5,925,351的实施例6所述制备。产生鼠抗人LT-β-R mAbB9的杂交瘤细胞系(B9.C9.1)已根据布达佩斯条约的规定于1995年7月21日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801 UniversityBoulevard，Manassas，Va.20110-2209)，并给予ATCC保藏号11962。
单克隆仓鼠抗小鼠LT-α/62抗体按美国专利5,925,351的实施例7所述制备。产生仓鼠抗小鼠LT-α/62 mAb BB.F6的杂交瘤细胞系(BB.F6.1)已根据布达佩斯条约的规定于1995年7月21日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209)，并给予ATCC保藏号MB11963。
按美国专利5,925,351的实施例6和7所述，开发了一种荧光活化细胞分类(FACS)分析方法筛选抗LT亚基和LT复合物并能充当LT-β-R阻断剂的抗体。在该分析方法中，当存在递增量的测试抗体时向PMA激活的表达表面LT复合物的II-23细胞(Browning等，免疫学杂志，154，第33-46页(1995))加入可溶性人LT-β-R-Fc融合蛋白。选择能抑制LT-β受体-配体相互作用至少20％的抗体作为LT-β-R阻断剂。
使用LT-α/β复合物而不是LT亚基作为免疫动物的抗原可导致更有效的免疫，或者可产生与表面LT配体具有更高亲和性的抗体。可以想象，通过用LT-α/62复合物免疫，可分离识别LT-α和LT-β两亚基上的氨基酸残基(即形成LT-α/62裂缝的残基)的抗体。通过测试抗人LT-α/62异聚复合物的抗体，可期望能使用常规实验和本文所述分析方法鉴定起LT-β-R阻断剂功能的更多抗LT抗体。
给药方式
在治疗个体中病毒引起的系统休克和呼吸窘迫的方法中本文所述组合物以有效剂量给药。对于一个给定应用，考虑例如患者的状况和体重、期望治疗的程度和患者对治疗的耐受性，确定优选药物制剂形式和治疗有效剂量方案的方法是本领域所熟知的。优化治疗剂量的适合起始点预期是大约1mg/kg可溶性LT-β-R的剂量。
治疗有效剂量的确定也可通过进行如下体外实验来评价，该实验测定包被靶细胞(根据阻断剂不同，为LT-β-R或LT配体阳性细胞)1-14天所需要的LT-β-R阻断剂的浓度。可使用本文所述受体-配体结合分析监测细胞包被反应。LT-β-R或LT配体阳性细胞可采用FACS法从激活的淋巴细胞群体中分离。根据这些体外结合分析的结果，可选择-定范围的适当LT-β-R阻断剂浓度根据本文所述分析在动物中进行测试。
本发明的可溶性LT-β-R分子、抗LT配体和抗LT-β-R Ab，包括这些抗体或复合物的分离和纯化形式、它们的盐或其药物学上可接受的衍生物，可采用免疫抑制剂活性试剂的任何传统上可接受的施用形式来单独或联合给药。
这些治疗方法使用的药物组合物也可是多种形式。这些形式包括例如固体、半固体和液体剂量形式，如片剂、丸剂、粉剂、液体溶液或悬液、栓剂、和可注射和可输入溶液。优选的形式取决于期望的给药方式和治疗应用。
给药方式可包括口服、肠胃外、皮下、静脉内、损伤内或局部给药。例如，本发明的可溶性LT-β-R分子、抗LT配体和抗LT-β-R Ab可置于有或无刺激吸收或稳定性的辅因子的无菌等渗制剂之中。该制剂优选是液体，或可是冷冻干燥的粉剂。例如，本发明的可溶性LT-β-R分子、抗LT配体和抗LT-β-R Ab可用含有5.0mg/ml一水合柠檬酸、2.7mg/ml柠檬酸三钠、41mg/ml甘露醇、1mg/ml甘氨酸、1mg/ml聚山梨醇酯20的制剂缓冲液稀释。可将该溶液冻干并冷冻保存，施用前用无菌注射用水(USP)重新溶解。
所述组合物还优选包括本领域熟知的传统药学上可接受的载体(见例如Reminton’s Pharmaceutical Sciences，第16版，1980，MacPublishing Company)。这种药学上可接受的载体可包括其它医药试剂、载体、遗传载体、佐剂、赋形剂等，如人血清白蛋白或血浆制品。所述组合物优选采用单位剂量的形式，并通常按每天一或多次给药。
本发明的药物组合物也可采用置于感染组织或血流之中、附近或以其它方式与其相联系的微球体、脂质体、其它微粒递送系统或持续释放制剂来给药。持续释放载体的适当例子包括制成一定形状的半透性聚合基质如栓剂或微囊。可植入的或微囊化持续释放基质包括聚交酯(美国专利3,773,319；EP 58,481)、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物(Sidman等，Biopolymers，22，第547-56页(1985))；聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸)或乙烯乙酸乙烯酯(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.，15，第167-277页(1981)；Langer，Chem.Tech.，12，第98-105页(1982))。
含有单个或联合的本发明可溶性LT-β-R分子、抗LT配体和抗LT-β-R抗体的脂质体可通过熟知方法制备(见如DE 3,218,1211；Epstein等，美国国家科学院院刊，82，第3688-92页(1985)；Hwang等，美国国家科学院院刊，77，第4030-34页(1980)；美国专利4,485,045和4,544,545)。一般地，所述脂质体属于小的(约200-800埃)单层类型，其中脂质含量大于约30mol.％胆固醇。选择胆固醇的比例以控制可溶性LT-β-R分子、抗LT配体和抗LT-β-R抗体释放的最佳速率。
本发明的可溶性LT-β-R分子、抗LT配体和抗LT-β-R抗体还可与含有其它LT-β-R阻断剂、免疫抑制剂或细胞因子的脂质体连接以调节LT-β-R阻断活性。LT-β-R分子、抗LT配体和抗LT-β-R抗体与脂质体的连接可通过任何已知交联剂来完成，如广泛用于将毒素或化学治疗剂和抗体偶联以便定向递送的异双功能交联剂。与脂质体的连接还可采用针对碳水化合物的交联试剂4-(4-马来酰亚氨基苯基)丁酰肼(MPBH)来进行(Duzgunes，J.Cell.Biochem.Abst.Suppl.16E 77(1992))。
根据被治疗的病症、失调或疾病不同，可修饰本发明的组合物和方法的LT-β-R阻断剂以获得期望水平的LT-β-R信号传导。可以设想，通过操作这些LT-β-R阻断剂的浓度和其对各自的分子靶标的亲和性可精确调节LT-β-R信号传导的绝对水平。例如，在本发明的一个实施方案中，给被治疗者施用含有可溶性LT-β-R分子的组合物。该可溶性LT-β受体可与细胞表面LT-β受体有效竞争结合表面LT配体。竞争表面LT配体的能力取决于可溶性LT-β-R分子和细胞表面LT-β-R分子的相对浓度，并取决于它们结合配体的相对亲和力。
含有增加或降低突变可溶性LT-β-R与表面LT配体结合亲和力的突变的可溶性LT-β-R分子，可用本领域普通技术人员熟知的标准重组DNA技术来制备。可使用常规实验方法和本文所述技术测试具有定点或随机突变的大量分子充当LT-β-R阻断剂的能力。同样，在本发明的另一个实施方案中，抗LT-β受体或一或多个LT配体亚基的抗体起LT-β-R阻断剂作用。这些抗体阻断LT-β受体信号传导的能力可通过突变、化学修饰或其它可改变给受治疗者递送的抗体的有效浓度或活性的方法来进行修饰。
用途
通常，本发明的方法可用于在个体中诱导抗病毒应答，包括给该个体施用有效量的LT-B阻断剂和药物学上可接受载体。待治疗的病毒应答可以是任何几种已知病毒引起的，这些病毒包括但不限于SinNombre(SNV)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒和登革病毒。
                       等价物
本发明可以以其它具体形式实现而不脱离本发明的精神或关键特征。因此，前述实施方案在所有方面均被认为是本文所公开的本发明的举例说明，而不是对本发明的限制。因此，本发明的范围由附及的权利要求书而不是以上描述所指明，而且所有属于这些权利要求的意义和等同范围之内的变化均应包括在本发明权利要求之内。
                       实施例
肿瘤坏死因子(TNFα)在促使对病毒感染和其它免疫原的急性休克应答中起关键作用(K.C.F.Sheehan，N.H.Ruddle，和R.DSchreiber.，免疫学杂志，142，3884(1989)；G.W.H.Wong和D.V.Goeddel，自然323，819(1986)；B.Beutle，I.W.Milsark，A.Cerami，科学229，869(1985)；F.Mackay，P.R.Bourdon，D.A.Griffiths等，免疫学杂志159，3299(1997)；P.D.Crowe，T.L.VanArsdal，B.N.Walter等，科学264，707(1994))。在涉及休克的登革热的发病中，和可溶性TNFR-75水平一样，患者血清的TNFα水平也升高(D.Hober等，J.Trop Med.Hyg.，48，324(1993)；D.B.Bethell，K.Flobbe，C.X.T.Phuong等，J.Infect.Dis.，177，778(1998))。我们测量了感染淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)变体克隆13(LCMV-13)(HH，II)的小鼠血清中TNFα的水平。发现感染LCMV-13的小鼠血清中TNFα的水平直到感染后第4天才处于该分析的检测水平之上(血清TNFα水平用ELISA分析(Genzyme公司，目录号80-2802-00)测量)。在第5和6天，当疾病处于高峰时，血清中可溶性TNFα水平比正常增加3-6倍(数据未显示)。因此，我们选择用已知结合两种分泌TNFα的单克隆抗体TN3-19.12阻断TNFα的功能，从而耗尽小鼠的TNFα，这用ELISA得到证实(K.C.F.Sheehan，N.H.Ruddle，和R.D.Schreiber.，免疫学杂志，142，3884(1989)；G.W.H.Wong和D.V.Goeddel自然323，819(1986)；B.Beutler，I.W.Milsark，A.Cerami，科学229，869(1985)；F.Mackay，P.R.Bourdon，D.A.Griffiths等，免疫学杂志159，3299(1997)；P.D.Crowe，T.L.VanArsdale，B.N.Walter等，科学264，707(1994)；D.Hober等，J.Trop.Med.Hyg.，48，324(1993)；D.B.Bethell，K.F1obbe，C.X.T.Phuong等，J.Infect.Dis.，177，778(1998))。血清TNFα水平用ELISA分析(Genzyme公司，目录号80-2802-00)测量。NZB小鼠静脉内注射2.5×106pfu克隆13，之后在感染后第1和4天两次腹膜内注射250ug溶于无内毒素的PBS(见参考文献S)的TN3-19.12抗体。对照小鼠在相同日期注射相同体积的无抗体的PBS。该处理(抗TNF)对这些小鼠的存活率影响极小(图3)。淋巴毒素α(LTα)也称作TNFβ，尽管其与TNFα的受体和许多生物学效应相同，但它并不被该抗体识别(F.Mackay，P.R.Bourdon，D.A.Griffiths等，免疫学杂志159，3299(1997))。可能需要同时靶向TNFα和LTα来增加存活率。为了测试该假说，我们使用了上述TN3-19.12mAb和融合了TNF p55受体细胞外结构域和人IgG1(TNFR55-Ig)CH2和CH3结构域的受体融合蛋白(W.R.Force，B.N.Walter，C.Hession等，免疫学杂志，155，5280(1995)；G.T.Miller，P.S.Hochman，W.Meier等，JEM.，178，211(1993)；J.L.Browning，I.Dougas，A.Ngam-ek，等，免疫学杂志154：33(1995))。按参考文献R所述处理小鼠。对于三重处理组，在感染后第0天和第3天腹膜内给予200ug量的TNFR55-Ig和LTβR-Ig蛋白。对照小鼠在相同日期给予相同量在这些融合蛋白合成中使用的人抗体(AY1943-29)。仅接受LTβR-Ig的小鼠同样处理，只是未注射TNFR55-Ig。该处理也没有显著改变感染LCMV-13的NZB小鼠的存活率(见抗TNF和TNFR55-Ig组)。淋巴毒素的膜形式，LTα和LTβ的异聚体，不识别TNFR-75或TNFR-55，但结合第三种受体LTβR(15)。我们选择使用含有也与人IgG1的CH2和CH3域相连的该LTβR细胞外结构域的融合蛋白(LTβR-Ig)。用抗TNFα mAb、TNFR55-Ig和LTβR-Ig处理小鼠(三重处理或TNFR55-Ig和LTβR-Ig)导致存活急剧增加，分别达80％和70％。相反，用抗TNFαmAb和TNFR55-Ig处理的小鼠仅20％感染后存活。最近鉴定了LTβR的第二种配体LIGHT(D.N.Mauri，R.Ebner，R.I.Montgomery等，免疫(Immunity)8，21(1998)；R.I.Montgomery，M.S.Warner，B.Lum等，细胞(Cell)87，427(1996))。LIGHT也显示结合疱疹病毒进入介体(herpesvirus entry mediator，HVEM)，一种与激活的CD4和CD8 T细胞上表达的TNFR家族成员显著同源的I型跨膜蛋白(D.N.Mauri，R.Ebner，R.I.Montgomery等，免疫8，21(1998)；R.I.Montgomery，M.S.Warner，B.Lum等，细胞87，427(1996))。根据这里给出的结果，通过LTβR-Ig结合LTβ2α1和LIGHT阻断LTβR信号传导并潜在地阻断HVEM信号传导，可能是三重处理组中观察到的大多数效应的原因。我们通过只用LTβR-Ig融合蛋白处理LCMV-13感染的NZB小鼠证实了该假说。该组小鼠的存活率(73％)几乎和三重处理组一样高(图3)。总结起来，这些数据首次证实，LTβR和/或HVEM信号传导通路参与涉及系统休克和呼吸窘迫的急性致死疾病的发病。
为确定LTβ阻断处理背后的存活机制，对来自经对照抗体、仅仅LTβR-Ig处理或三重处理的LCMV-13感染NZB小鼠的样品进行如下实验：共染CD8/四聚体(NZB LD系统中主要的CD8表位)以显示NP118特异性T细胞，并进行细胞内染色显示NP118肽刺激的脾细胞的γ干扰素产生。图4说明NP118特异性CD8 T细胞数目的减少，在三重处理小鼠中观察到最大效果。在用对照抗体处理的小鼠中，仅10％四聚体阳性细胞活跃地产生INFγ。前人已记载在LCMV-13感染过程中出现无反应性T细胞，这可能是由于小鼠中高水平的病毒抗原引起的(图1)。不仅LTβR-Ig处理的小鼠中NP118特异性T细胞数目减少，而且产生INFγ的细胞的百分比也降低。这种效应在三重处理组中甚至更为显著。因此，CD8区室可能是这种对LCMV-13感染的致死NZB应答的原因。激活的CD8细胞已知表达LTβ2α1的事实与该假说相符(Y.Abe，A.Horiuchi，Y.Osuka等，Lymph Ctyok.Res.，11，115(1992)；C.F.Ware，P.D.Crowe，M.H.Grayson等，免疫学杂志(J.Immunol.)149，3881(1992)；J.L.Browning，A.Ngam-ek，P.Lawton等，细胞，72，847(1993))。为支持该论断，我们将感染的NZB小鼠的CD8或CD4阳性T细胞体内耗空(静脉内给予雄性NZB小鼠2.5×106pfu LCMV-13，之后两次腹膜内注射500ul抗T细胞抗体。采用mAb Lyt2.43消耗CD8+T细胞，而采用GK1.5(M1)抗体消耗CD4+T细胞。这两种抗体从杂交瘤上清液通过硫酸铵沉淀，之后用PBS进行透析来制备。使用FACS分析证实若干小鼠中的消耗。)。CD4 T细胞的消耗并不增加存活。相反，与LTβR-Ig处理的小鼠不同，CD8 T细胞的消耗导致100％的存活，并没有疾病症状(图5)。因为CD8消耗小鼠的若干组织的病毒滴度比未处理的高，所以死亡可能是由于CD8 T细胞介导的毒性免疫应答而不是由于病毒感染引起的组织破坏造成的。
我们在此报道了当用高剂量LCMV-13静脉内感染时，NZB小鼠出现与埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒、登革病毒、和Sin Nombre感染具有若干共同特征的急性、迅速发展的疾病。该疾病的致死率取决于已知激活时表达TNFα、LTα和LTβ的CD8+T细胞的存在。尽管这是一个鼓舞人心的发现，但通过CD8+T细胞消耗治疗病毒感染是不可取的。这种治疗可使病人易受到其它机会感染。而且，因为病毒清除在没有CTL时是不可能的，所以耐受病毒的患者重建CD8+区室的危险是非常实际的。我们证明通过施用LTβR-Ig阻断LTβR/HVEM通路是一种有用的治疗方法，该方法本质上是短暂的，一旦治疗停止即可迅速恢复内环境稳定(Mackay和Browning，未发表)。以该方法治疗的存活小鼠最终从被测组织中清除了病毒(数据未显示)，并且不再显示疾病症状。
这些数据首次证实LTβR信号传导在抗病毒应答和CD8 T细胞功能中起重要作用。该淋巴毒素系统很可能通过控制指导T和B细胞组织的若干趋化因子的表达，与淋巴结构的组织紧密相关(Chaplin等，Curr.Opin.Immuno1.10，289(1998)，J.Cyster，出版中)。滤泡树突细胞的成熟功能状态通过恒定的B细胞信号传导来维持，并且这些细胞在LTβR信号传导终止后一天内消失。这些细胞对于向B和T细胞区室呈递抗原是关键的。一个合理的推测是LTβR信号传导的中断阻止了抗原向CD8细胞呈递的某个方面或成熟过程中这些细胞在趋化因子梯度中的适当定位。对LT功能的研究以前主要集中在B细胞的生物学上，并未预见T细胞功能的参与。要么LT具有其它功能，要么这些数据反映了新配体LIGHT的作用。HVEM和LIGHT在本文所述疾病的进程中所起的作用目前还不清楚。

Claims (13)

1.阻断淋巴毒素β与其受体结合的物质在制备药物中的应用，该药物用于在患有病毒诱导的系统休克或呼吸窘迫的个体中诱导抗病毒应答。
2.权利要求1的应用，其中所述的物质是抗淋巴毒素β受体的抗体或可溶性淋巴毒素β受体。
3.权利要求2的应用，其中所述的物质是淋巴毒素β受体/免疫球蛋白的融合蛋白。
4.权利要求1的应用，其中所述的物质是可溶性淋巴毒素β受体或抗淋巴毒素B的抗体。
5.权利要求1-4任一项的应用，其中所述个体感染了Sin Nombre病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒或者登革病毒。
6.权利要求5的应用，其中所述的物质是淋巴毒素β受体/免疫球蛋白的融合蛋白。
7.阻断淋巴毒素β与其受体结合的物质以及可药用载体在制备用于治疗个体中病毒诱导的系统休克的药物中的应用。
8.权利要求7的应用，其中所述的物质是抗淋巴毒素β受体的抗体或可溶性淋巴毒素B受体。
9.权利要求8的应用，其中所述的物质是淋巴毒素β受体/免疫球蛋白的融合蛋白。
10.阻断淋巴毒素β与其受体结合的物质以及可药用载体在制备用于治疗个体中病毒诱导的呼吸窘迫的药物中的应用。
11.权利要求10的应用，其中所述的物质是抗淋巴毒素β受体的抗体或可溶性淋巴毒素β受体。
12.权利要求11的应用，其中所述的物质是淋巴毒素β受体/免疫球蛋白的融合蛋白。
13.权利要求7-12任一项的应用，其中所述个体感染了SinNombre病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒或者登革病毒。
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