JP4713738B2 - リンホトキシンβ経路の遮断によるウイルス誘導性全身性ショックおよび呼吸窮迫の逆転 - Google Patents

Description

【０００１】
（関連出願）
これは、１９９８年１０月９日に提出された、先の米国仮出願第６０／１０３，６６２号の一部の継続出願である。先に出願された仮特許出願の教示は本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、個体における抗ウイルス応答を誘導する方法に関する。特に、本発明は、個体におけるウイルス誘導性全身性ショックおよび呼吸窮迫を処置するための方法を提供する。この方法は、特定の「リンホトキシンβブロック剤」の投与を含む。
【０００３】
（発明の背景）
いくつかのウイルス（シンノンブル（Ｓｉｎ Ｎｏｍｂｒｅ）（ＳＮＶ）、エボラ、マールブルグ、ラッサおよびデング熱を含む）はすべて、以下の症状の多くを伴う急性疾患を引き起こす；迅速な発症、発熱、全身性ショックおよび肺窮迫（Ｌａｃｙら（１９９７）Ａｄｖ．Ｐｅｄ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１２：２１）。これらの感染の中の別の共通性は、ウイルス感染の全身分布、内皮細胞およびマクロファージを標的としていることである（Ｌａｃｙら（１９９７）Ａｄｖ．Ｐｅｄ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１２：２１）。ＳＮＶを除く、これらの顕現性ウイルスのほとんどは、何十年も前に初めて同定された。これらの発見から何年もして、これらの病原が世界中で大発生して再出現してきた。１９９８年６月現在で、シロアシネズミ（ｄｅｅｒ ｍｏｕｓｅ）集団の増加に起因して、米国南西部においてＳＮＶ（ハンタウイルス肺ショック症候群の原因因子）の確認された１８３の症例が存在する。これらの症例のうちわずか５５％が、感染後生き残った（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．ＭＭＷＲ．４７，４４９（１９９８））。現在、これらのウイルスの病因も、毎年全世界でウイルス誘導性全身性ショックおよび呼吸窮迫を患う何千人もの感染患者を有効に治療する方法についてもほとんど知られていない。
【０００４】
従って、個体におけるウイルス誘導性全身性ショックおよび呼吸窮迫を処置するための新規の方法を同定する必要が存在する。
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、上記で言及される問題を、薬学的組成物および個体におけるウイルス誘導性全身性ショックおよび呼吸窮迫を処置するための方法を提供することにより解決する。
【０００６】
本発明の方法および組成物は、特定の薬剤（本明細書中に、リンホトキシン−β（ＬＴ−Ｂ）ブロック剤として定義される）が個体におけるウイルス誘導性全身性ショックおよび呼吸窮迫を処置する際に使用され得るという発見を一部利用する。一つの実施態様において、ＬＴ−Ｂブロック剤は、リンホトキシン−βレセプター（ＬＴ−Ｂ−Ｒ）ブロック剤である。好ましい実施態様において、このＬＴ−Ｂ−Ｒは、リンホトキシン−Ｂレセプターまたは可溶性リンホトキシン−Ｂレセプターに対する抗体である。最も好ましい実施態様において、ＬＴ−Ｂ−Ｒブロック剤は、免疫グロブリン重鎖定常ドメインと融合されたＬＴ−Ｂ−Ｒ細胞外リガンド結合ドメインを有する組換えＬＴ−Ｂ−Ｒ融合タンパク質である。
【０００７】
本発明の前述および他の目的、特徴、局面および利点ならびに本発明それ自体が、以下の好ましい実施態様の記載からより十分に理解される。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
（定義）
より明確かつ簡潔に本願発明の主題を指摘するために、以下の記述および添付される特許請求の範囲において使用される特定の用語について以下の定義を提供する。
【０００９】
リンホトキシン−β（ＬＴ−β）は、ＴＮＦファミリーのリガンドのメンバーであり、これはまた、Ｆａｓ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＯＸ−４０および４−１ＢＢレセプターに対するリガンドを含む（Ｓｍｉｔｈら、Ｃｅｌｌ、７６、９５９〜６２頁（１９９４））。ＴＮＦ、ＬＴ−α、ＬＴ−βおよびＦａｓ−ｃａｎを含むＴＮＦファミリーのいくつかのメンバーによるシグナル伝達は、腫瘍細胞死を壊死またはアポトーシス（プログラム細胞死）により誘導する。非腫瘍形成細胞において、ＴＮＦおよび多くのＴＮＦファミリーリガンド−レセプター相互作用は、免疫系の発達および種々の免疫攻撃に対する応答に影響を及ぼす。
【００１０】
リンホトキシン−β（ｐ３３とも呼ばれる）は、Ｔリンパ球、Ｔ細胞株、Ｂ細胞株、およびリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞の表面上で同定された。ＬＴ−βは、１９９２年１月９日にＷＯ９２／００３２９として公開された出願人の同時系属中の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４５８８、；および１９９４年６月２３日にＷＯ９４／１３８０８として公開されたＰＣＴ／ＵＳ９３／１１６６９の主題であり、これらは本明細書中に参考として援用される。
【００１１】
ＬＴ―βレセプター（ＴＮＦファミリーのレセプターのメンバー）は、表面のＬＴリガンドに特異的に結合する。ＬＴ−β−ＲはＬＴヘテロマー複合体（主に、ＬＴ−α１／β２およびＬＴ−α２／β１）に結合するが、ＴＮＦにもＬＴ−αにも結合しない（Ｃｒｏｗｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６４、７０７〜１０頁（１９９４））。ＬＴ−β−Ｒによるシグナル伝達は、末梢のリンパ器官の発達および体液性免疫応答において役目を果たし得る。
【００１２】
ＬＴ−β−ＲのｍＲＮＡはヒト脾臓、胸腺および他の主要器官において見出される。ＬＴ−β−Ｒの発現パターンは、ＬＴ−β−Ｒは末梢血Ｔ細胞およびＴ細胞株上で欠損しているということを除いて、ｐ５５−ＴＮＦ−Ｒについて報告される発現パターンと類似している。
【００１３】
用語「ＬＴ−βブロック剤」とは、ＬＴ−βに対するリガンド結合、細胞表面ＬＴ−βクラスター形成もしくはＬＴ−βシグナル伝達を減少させ得るか、または細胞内でＬＴ−βシグナルがどのように解釈されるかについて影響を与え得る薬剤を言う。ＬＴ−βブロック剤の例としては、抗ＬＴ−β、可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｆｃ分子、および抗ＬＴ−α、抗ＬＴ−α／βおよび抗ＬＴ−β−Ｒ Ａｂが挙げられる。好ましくは、この抗体は、分泌形態のＬＴ−αと交差反応しない。
【００１４】
用語「ＬＴ−β−レセプターブロック剤」とは、ＬＴ−β−Ｒに対するリガンド結合、細胞表面ＬＴ−β−Ｒクラスター形成もしくはＬＴ−β−Ｒシグナル伝達を減少させ得るか、または細胞内でＬＴ−β−Ｒシグナルがどのように解釈されるかについて影響を与え得る薬剤を言う。ＬＴ−β−Ｒブロック剤の例としては、可溶性ＬＴ−β−Ｒ−Ｆｃ分子、および抗ＬＴ−β−Ｒ Ａｂが挙げられる。好ましくは、この抗体は、分泌形態のＬＴ−αと交差反応を起しない。
【００１５】
用語「抗ＬＴ−βレセプター抗体」とは、ＬＴ−βレセプターの少なくとも一つのエピトープに特異的に結合する任意の抗体を言う。
【００１６】
用語「抗ＬＴ抗体」とは、ＬＴ−α、ＬＴ−βまたはＬＴ−α／β複合体の少なくとも一つのエピトープに特異的に結合する任意の抗体を言う。
【００１７】
用語「ＬＴリガンド」とは、ＬＴ−βレセプターに特異的に結合し得るＬＴヘテロマー複合体またはその誘導体を言う。
【００１８】
用語「ＬＴ−β−Ｒシグナル伝達」とは、ＬＴ−β−Ｒ経路に関連する分子反応および引き続いてそこから生じる分子反応を言う。
【００１９】
用語「ＬＴ−β−Ｒリガンド結合ドメイン」とは、ＬＴリガンドの特異的認識およびＬＴリガンドとの相互作用に関与する、ＬＴ−β−Ｒの一部分を言う。
【００２０】
用語「ＬＴ−α／βヘテロマー複合体」および「ＬＴヘテロマー複合体」とは、
少なくとも一つのＬＴ−αと、一つ以上のＬＴ−βサブユニット（一つ以上のサブユニットの可溶性形態、変異体形態、改変形態、およびキメラ形態を含む）との間の安定な会合を言う。このサブユニットは、静電的相互作用、ファンデルワールス相互作用または共有結合相互作用を介して会合し得る。好ましくは、ＬＴ−α／６２ヘテロマー複合体は少なくとも２つの隣接するＬＴ−βサブユニットを有し、そして隣接するＬＴ−αサブユニットを欠損する。ＬＴ−α／βヘテロマー複合体が細胞増殖アッセイにおいてＬＴ−β−Ｒ活性化薬剤として役立つ場合、この複合体は好ましくは可溶性であり、そして化学量論的な（ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ）ＬＴ−α１／β２を有する。
【００２１】
可溶性ＬＴ−α／６２ヘテロマー複合体は、膜貫通ドメインを欠損し、そしてＬＴ−αおよび／またはＬＴ−βサブユニットを発現するように操作された適切な宿主細胞によって分泌され得る（Ｃｒｏｗｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、１６８、７９〜８９頁（１９９４））。
【００２２】
用語「表面ＬＴ−α／６２複合体」および「表面ＬＴ複合体」とは、細胞表面上に提示される、ＬＴ−αおよび膜結合ＬＴ−βサブユニット（一つ以上のサブユニットの変異体形態、改変形態およびキメラ形態を含む）を含む複合体を言う。「表面ＬＴリガンド」とは、ＬＴ−βレセプターと特異的に結合し得る表面ＬＴ複合体またはその誘導体を言う。
【００２３】
「有効量」は、有益または所望される臨床結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回以上の投与において投与され得る。本発明の目的のために、リンホトキシン−Ｂのレセプターへのリンホトキシン−Ｂの結合をブロックする薬剤の有効量は、ウイルス応答の発達を改善、安定化または遅延させるために十分な薬剤の量である。特に、ウイルス誘導性全身性ショックおよび呼吸窮迫の発達を改善、安定化または遅延させるために十分な薬剤。これらの有効性の指標の検出および測定は、当業者に公知である。
【００２４】
「個体」とは、脊椎動物、特に哺乳動物種のメンバーを言い、そして飼育動物、競技用動物およびヒトを含む霊長類を含むが、これらに限定されない。
【００２５】
アミノ酸残基の「機能的同等物」とは（ｉ）機能的同等物により置換されたアミノ酸残基と類似した反応特性を有するアミノ酸；（ｉｉ）本発明のアンタゴニストのアミノ酸であり、このアミノ酸は、機能的同等物により置換されたアミノ酸残基と類似する特性を有する；（ｉｉｉ）機能的同等物により置換されたアミノ酸残基と類似する特性を有する非アミノ酸分子。
【００２６】
本発明のタンパク質性アンタゴニストをコードする第１のポリヌクレオチドは、少なくとも一つの以下の条件を満足する場合、アンタゴニストタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドと比較して「機能的に同等」である。
【００２７】
（ａ）：「機能的同等物」は、標準的なハイブリダイゼーション条件下で第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、そして／または第１のポリヌクレオチド配列に対して縮重している第１のポリヌクレオチドである。最も好ましくは、機能的同等物は、インテグリンアンタゴニストタンパク質の活性を有する変異タンパク質をコードする。
【００２８】
（ｂ）「機能的同等物」は、第２のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列についての発現をコードする第１のポリヌクレオチドである。
【００２９】
アミノ酸残基の「機能的同等物」とは（ｉ）機能的同等物により置換されたアミノ酸残基と類似した反応特性を有するアミノ酸；（ｉｉ）本発明のアンタゴニストのアミノ酸であり、このアミノ酸は、機能的同等物により置換されたアミノ酸残基と類似する特性を有する；（ｉｉｉ）機能的同等物により置換されたアミノ酸残基と類似する特性を有する非アミノ酸分子。
【００３０】
本発明のタンパク質性アンタゴニストをコードする第１のポリヌクレオチドは、それが少なくとも一つの以下の条件を満足する場合、アンタゴニストタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドと比較して「機能的に同等」である。
【００３１】
（ａ）：「機能的同等物」は、標準的なハイブリダイゼーション条件下で第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、そして／または第１のポリヌクレオチド配列に対して縮重している、第１のポリヌクレオチドである。最も好ましくは、機能的同等物は、インテグリンアンタゴニストタンパク質の活性を有する変異タンパク質をコードする。
【００３２】
（ｂ）「機能的同等物」は、第２のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列についての発現をコードする第１のポリヌクレオチドである。
【００３３】
本発明において使用されるＬＴ−Ｂブロック剤は、本明細書中に列挙される薬剤ならびにそれらの機能的同等物を含むが、それらに限定されない。本明細書中で使用される場合、従って、用語「機能的同等物」とは、機能的同等物であると考えられる、レシピエント（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）に対して、ＬＴ−Ｂブロック剤と同じかもしくは改善された有益な効果を有するＬＴ−Ｂブロック剤またはＬＴ−Ｂブロック剤をコードするポリヌクレオチドを言う。当業者において理解されるように、機能的に同等なタンパク質は、例えば、「機能的に同等なＤＮＡ」を発現させることにより、組換え技術によって産生され得る。従って、本発明は、天然に存在するＤＮＡによりコードされるＬＴ−Ｂブロック剤ならびに天然に存在するＤＮＡによりコードされるものと同じタンパク質をコードする天然に存在しないＤＮＡによりコードされるＬＴ−Ｂブロック剤を含む。ヌクレオチドコード配列の縮重に起因して、他のポリヌクレオチドを使用して、ＬＴ−Ｂブロック剤をコードし得る。これらは、配列内の同じアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換により改変される上記の配列のすべてまたは一部を含み、従って、サイレントな変化を生じる。このような改変配列は、これらの配列の同等物とみなされる。例えば、Ｐｈｅ（Ｆ）は、２つのコドン（ＴＴＣまたはＴＴＴ）によりコードされており、Ｔｙｒ（Ｙ）は、ＴＡＣまたはＴＡＴによりコードされており、そしてＨｉｓ（Ｈ）は、ＣＡＣまたはＣＡＴによりコードされる。他方、Ｔｒｐ（Ｗ）は、一つのコドン（ＴＧＧ）によりコードされる。従って、特定のインテグリンをコードする所定のＤＮＡ配列に対して、そのインテグリンをコードする多くのＤＮＡ縮重配列が存在することが理解される。これらの縮重ＤＮＡ配列は、本発明の範囲内であると考えられる。
【００３４】
用語「融合物」または「融合タンパクシ質」とは、同一線上に並んだ（ｃｏ−ｌｉｎｅｒ）、個々のペプチド骨格を介して、最も好ましくは２つ以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子の遺伝子発現を介した、２つ以上のタンパク質またはそのフラグメントの共有結合物を言う。このタンパク質またはそのフラグメントは異なる供給源由来であることが好ましく、ゆえにこの型の融合タンパク質は「キメラ」分子と呼ばれる。従って、好ましい融合タンパク質は、ＬＴ−Ｂブロック剤ではない第２の部分と共有結合したＬＴ−Ｂブロック剤またはフラグメントを含むキメラタンパク質である。本発明の好ましい融合タンパク質は、抗原結合特異性を保持するインタクトな抗体の部分を含み得、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ｖ）フラグメント、重鎖の単量体または二量体、軽鎖の単量体または二量体、一つの重鎖および一つの軽鎖からなる二量体、などが挙げられる。
【００３５】
最も好ましい融合タンパク質は、キメラタンパク質であり、そして免疫グロブリン軽鎖、重鎖、またはその両方のヒンジ領域および定常領域の全てまたは一部分に融合したか、またはそうでなければそれと連結したＬＴ−Ｂブロック剤部分を含む。従って、本発明は、以下を含む分子を特徴とする：（１）ＬＴ−Ｂブロック剤部分、（２）第２のペプチド（例えば、ＬＴ−Ｂブロック剤部分の可溶性またはインビボ寿命を増加させるもの、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーまたはそのフラグメントもしくは一部分、例えば、ＩｇＧの一部分もしくはフラグメント、例えば、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域（例えば、ＣＨ２、ＣＨ３、およびヒンジ領域））。具体的には、「ＬＴ−ＢまたはＬＴ−Ｂ−Ｒ／Ｉｇ融合物」は本発明の生物学的に活性なＬＴ−Ｂブロックを含むタンパク質である（例えば、可溶性ＬＴ−Ｂ−Ｒ）か、または免疫グロブリンのＮ末端の一部がＬＴ−Ｂブロック剤と置き換わっている免疫グロブリン鎖のＮ末端に連結したその生物学的に活性なフラグメントである。ＬＴ−ＢまたはＬＴ−Ｂ−Ｒ／Ｉｇ融合物の種は、「ＬＴ−Ｂ−Ｒ／Ｆｃ融合物」であり、これは、免疫グロブリンの定常ドメインの少なくとも一部分に連結された、本発明のＬＴ−Ｂ−Ｒを含むタンパク質である。好ましいＦｃ融合物は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端ドメインを含む抗体のフラグメントに連結された、本発明のＬＴ−Ｂブロック剤を含む。
【００３６】
「標準的なハイブリダイゼーション条件」−塩および温度条件は、０．５×ＳＳＣ〜約５×ＳＳＣおよび６５℃（ハイブリダイゼーションおよび洗浄の両方について）に実質的に等価にする。従って、本明細書中で使用される場合、用語「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、操作上の規定であり、そしてハイブリダイゼーション条件の範囲を含む。より高いストリンジェンシー条件は、例えば、プラークスクリーン緩衝液（０．２％ ポリビニルピロリドン、０．２％ Ｆｉｃｏｌｌ ４００；０．２％ウシ血清アルブミン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）；１Ｍ ＮａＣｌ；０．１％ リン酸ナトリウム；１％ ＳＤＳ）；１０％ 硫酸デキストラン、および１００μｇ／ｍｌ 変性超音波処理サケ精子ＤＮＡと、６５℃で１２〜２０時間、ハイブリダイゼーションする工程、および７５ｍＭ ＮａＣｌ／７．５ｍＭ クエン酸ナトリウム（０．５×ＳＳＣ）／１％ ＳＤＳで、６５℃で洗浄する工程を包含し得る。より低いストリンジェンシー条件は、例えば、プラークスクリーン緩衝液、１０％ 硫酸デキストランおよび１１０μｇ／ｍｌ 変性超音波処理サケ精子ＤＮＡと、５５℃で１２〜２０時間ハイブリダイゼーションする工程、および３００ｍＭ ＮａＣｌ／３０ｍＭ クエン酸ナトリウム（２．０×ＳＳＣ）／１％ ＳＤＳで５５℃で洗浄する工程を包含し得る。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，６．３．１〜６．３．６節（１９８９）もまた参照のこと。
【００３７】
「治療的組成物」は、本明細書中で使用される場合、本発明のタンパク質および他の生物学的に適合性の成分を含むと規定される。この治療的組成物は、賦形剤（例えば、水、鉱物およびタンパク質のようなキャリア）を含み得る。
【００３８】
（ＩＩ．好適な実施態様の説明）
本発明は、ＬＴ−Ｂブロック剤が個体において抗ウイルス応答を誘発し得るという発見に一部依存する。ウイルスに感染した個体を処置することは、個体の生存率を大きく増大させ得ることが見出された。具体的には、ＬＣＭＶ−１３に感染したＮＺＢマウスをＬＴ−Ｂブロック剤（例えば、ＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質）で処置することは、彼らの生存率を７３％増大させることが示された。
【００３９】
本明細書中で言及される、エボラ、デング熱、ＳＮＶおよび他のウイルスについての現在の処置は、疾患の伝播に関して、教育を介して予防されている。これらの非常に病原性のウイルスに対するワクチンは、存在しない。リバビリン（グアニジンアナログ）は、これらの感染のいくつかに対する一般的抗ウイルス薬物として使用されてきたが、再生可能な成功は、その疾患に対して初期に使用された場合に、ラッサ熱の処置において記載されたにすぎなかった（Ｍ．Ｄ．ＬａｃｙおよびＲ．Ａ．Ｓｍｅｇｏ，Ａｄｖ．Ｐｅｄ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１２，２１（１９９７））。本発明者らのデータは、これらのウイルスに関連する病理のいくつかが、免疫媒介性であり得ることを示す。ＬＴ系の遮断は、ウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞数およびその機能性を一時的に低減させることによって、生存の機会を大きく増大させ得る。ＴＮＦα経路を遮断するいくつかの手段を用いる臨床試験は、いくつかの病気の処置のために既に施行されている（Ｈ．Ｉ．Ｐａｓｓ，Ｄ．Ｍｅｗ．Ｈ．Ａ．Ｐａｓｓら、Ｃｈｅｓｔ Ｓｕｒｇ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍｅｒ．５：７３（１９９５））。本発明者らは、ＬＴβＲ−Ｉｇ処置が、急性の、急速に進行するウイルス感染（ショックおよび／または肺窮迫を含む）を有する患者を含むヒト治験において実際に使用するために、動物モデルにおいてさらに試験することについて考慮されるべきであると考える。
【００４０】
（ＬＴ−Ｂブロック剤）
本発明の１つの実施態様において、ＬＴ−βブロック剤は、ＬＴ−βシグナル伝達を阻害するＬＴ−βに対する抗体（Ａｂ）を含む。好ましくは、抗ＬＴ−β−Ｒ Ａｂは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。阻害性抗ＬＴ−β Ａｂおよび他のＬＴ−βブロック剤は、１つ以上の薬剤が、ＬＴリガンドに結合する能力、または細胞に対するＬＴ−βシグナル伝達の効果を阻害する能力を検出するスクリーニング方法を用いて同定され得る。
【００４１】
本発明の別の実施態様において、ＬＴ−βブロック剤は、ＬＴ−βレセプター（ＬＴ−Ｂ−Ｒ）ブロック剤を含む。好ましい実施態様において、ＬＴ−Ｂ−Ｒブロック剤は、ＬＴ−β−Ｒシグナル伝達を阻害するＬＴ−β−Ｒに対する抗体（Ａｂ）である。好ましくは、抗ＬＴ−β−Ｒ Ａｂは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。１つのこのような阻害性の抗ＬＴ−β−ＲｍＡｂは、ＢＤＡ８ ｍＡｂである。阻害性の抗ＬＴ−β−ＲＡｂおよび他のＬＴ−β−Ｒブロック剤は、１つ以上の薬剤が、ＬＴ−β−ＲもしくはＬＴリガンドに結合するか、または細胞に対するＬＴ−β−Ｒシグナル伝達の効果を阻害するかのいずれかの能力を検出するスクリーニング法を用いて同定され得る。
【００４２】
１つのスクリーニング法は、ＬＴ−β−Ｒを有する腫瘍細胞に対するＬＴ−β−Ｒシグナル伝達の細胞傷害性効果を利用する。腫瘍細胞を１つ以上のＬＴ−β−Ｒ活性化薬剤に曝露して、ＬＴ−β−Ｒシグナル伝達を誘導する。ＬＴ−β−Ｒ活性化薬剤としては、ＩＦＮ−γの存在下でのＬＴ−α／６２ヘテロマー複合体（好ましくは、可溶性ＬＴ−α１／β２）、または抗ＬＴ−β−Ｒ Ａｂを活性化する薬剤が挙げられる（以下を参照のこと；出願人らの同時係属中の米国特許出願第０８／３７８，９６８号にも記載される）。
【００４３】
ＬＴ−β−Ｒシグナル伝達を遮断し得る抗体および他の薬剤は、以下のアッセイにおいて腫瘍細胞に対するＬＴ−β−Ｒシグナル伝達の細胞傷害性効果を阻害するそれらの能力に基づいて選択される：
１）腫瘍細胞（例えば、ＨＴ２９細胞）を、培地、および試験される薬剤の段階希釈物の存在下または非存在下で少なくとも１つのＬＴ−β−Ｒ活性化薬剤を含む一連の組織培養ウェルにおいて３〜４日間培養する；
２）ＭＴＴのようなミトコンドリア機能を測定する生存色素（ｖｉｔａｌ ｄｙｅ）染色を腫瘍細胞混合物に添加し、そして数時間反応させる；
３）各ウェルにおける混合物の光学密度を５５０ｎｍ波長の光（ＯＤ５５０）で定量する。ＯＤ５５０は、ＬＴ−β−Ｒ活性化薬剤および各ウェルにおける試験ＬＴ−β−Ｒブロック剤の存在下で残存する腫瘍細胞の数と比例する。ＬＴ−β−Ｒ活性化腫瘍細胞の細胞傷害性をこのアッセイにおいて少なくとも２０％低減し得る薬剤または薬剤の組み合わせは、本発明の範囲内のＬＴ−β−Ｒブロック剤である。
【００４４】
ＬＴ−β−Ｒシグナル伝達を活性化する薬剤または薬剤の組み合わせを上記のアッセイにおいて使用して、ＬＴ−β−Ｒブロック剤を同定し得る。ＬＴ−β−Ｒシグナル伝達を誘導するＬＴ−β−Ｒ活性化薬剤（例えば、抗ＬＴ−β−Ｒ ｍＡｂを活性化する）は、それらの能力単独、または上記の腫瘍細胞アッセイを用いて腫瘍細胞の細胞傷害性を増強する他の薬剤との組み合わせに基づいて選択され得る。
【００４５】
ＬＴ−β−Ｒブロック剤を選択する別の方法は、推定薬剤がＬＴリガンド−レセプター結合を直接妨害する能力をモニターすることである。リガンド−レセプター結合を少なくとも２０％遮断し得る薬剤または薬剤の組み合わせは、本発明の範囲内のＬＴ−β−Ｒブロック剤である。
【００４６】
リガンド−レセプター結合の強度を測定する、任意の多くのアッセイを用いて、推定ＬＴ−β−Ｒブロック剤を用いる競合アッセイを行い得る。レセプターとリガンドとの間の結合の強度は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いて測定され得る。特異的結合はまた、抗体−抗原複合体を蛍光標識すること、および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析を行うことにより、または他のこのような免疫検出法を行うことにより測定され得る。これらの全ては、当該分野で周知の技術である。
【００４７】
リガンド−レセプター結合相互作用はまた、プラスモン共鳴検出（Ｚｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，８１９３〜９８頁（１９９３）；ＦａｅｇｅｒｓｔｒａｍおよびＯ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ，「Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ」Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ａｆｆｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，２２９〜５２頁，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３））を利用するＢＩＡｃｏｒｅＴＭ機器（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）で測定され得る。
【００４８】
ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ技術は、金表面にレセプターを結合させ、そしてそれに対してリガンドを流動させることを可能にする。プラスモン共鳴検出は、リアルタイムで表面に結合した質量の直接的定量を与える。この技術は、オン速度およびオフ速度両方の定数をもたらし、従って、推定ＬＴ−β−Ｒブロック剤の存在下および非存在下で、リガンド−レセプター解離定数および親和性定数が直接決定され得る。
【００４９】
レセプター−リガンド相互作用を測定するための任意のこれらの技術または他の技術を用いると、ＬＴ−β−Ｒブロック剤が、単独でまたは他の薬剤との組み合わせで、表面もしくは可溶性のＬＴリガンドの、表面もしくは可溶性ＬＴ−β−Ｒ分子への結合を阻害する能力を評価し得る。やはりこのようなアッセイを用いて、ＬＴ−β−Ｒブロック剤またはこのような薬剤の誘導体（例えば、融合物、キメラ、変異体、および化学的に改変された形態）を、単独で、またはその改変された薬剤がＬＴ−β−Ｒ活性化を遮断する能力を最適化する組み合わせで試験し得る。
【００５０】
ＬＴ−β−Ｒブロック剤は、本発明の１つの実施態様において、可溶性ＬＴ−βレセプター分子を含む。ヒトＬＴ−β−Ｒの細胞外部分の配列（リガンド結合ドメインをコードする）は、米国特許第５，９２５，３５１号（本明細書中に参考として援用される）の図１に示される。米国特許第５，９２５，３５１号の図１における配列情報および当該分野で周知の組換えＤＮＡ技術を用いて、ＬＴ−β−Ｒリガンド結合ドメインをコードする機能的フラグメントをベクターにクローニングし得、そして適切な宿主において発現させて、可溶性ＬＴ−β−Ｒ分子を生成し得る。本明細書中に記載されるアッセイに従うＬＴリガンド結合についてネイティブなＬＴ−βレセプターと競合し得る可溶性ＬＴ−β−Ｒ分子は、ＬＴ−β−Ｒブロック剤として選択される。
【００５１】
米国特許第５，９２５，３５１号の図１に示される配列から選択されたアミノ酸配列を含む可溶性ＬＴ−βレセプターは、レセプター融合タンパク質のインビボ安定性を増大させるか、またはその生物学的活性もしくは位置を調節するために１つ以上の異種タンパク質ドメイン（融合ドメイン）に結合され得る。好ましくは、安定な血漿タンパク質（これは、代表的には、循環中で２０時間を超える半減期を有する）を用いて、レセプター融合タンパク質を構築する。このような血漿タンパク質としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：免疫グロブリン、血清アルブミン、リポタンパク質、アポリポタンパク質およびトランスフェリン。可溶性ＬＴ−β−Ｒ分子を特定の細胞もしくは組織型に標的化し得る配列はまた、ＬＴ−β−Ｒリガンド結合ドメインに結合して、具体的に位置決定された可溶性ＬＴ−β−Ｒ融合タンパク質を作製し得る。ＬＴ−β−Ｒリガンド結合ドメインを含むＬＴ−β−Ｒ細胞外領域の全てまたは機能的部分（米国特許第５，９２５，３５１号の図１）は、ヒトＩｇＧ１重鎖のＦｃドメインのような免疫グロブリン定常領域に融合され得る（Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４，３３〜４６頁（１９９５））。可溶性レセプター−ＩｇＧ融合タンパク質は、一般的な免疫試薬であり、そしてそれらの構築方法は、当該分野で公知である（例えば、米国特許第５，２２５，５３８号を参照のこと）。機能的ＬＴ−β−Ｒリガンド結合ドメインは、ＩｇＧ１以外の免疫グロブリンクラスまたはサブクラスに由来する免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃドメインに融合され得る。異なるＩｇクラスまたはサブクラスに属する抗体のＦｃドメインは、異なる二次的エフェクター機能を活性化し得る。このＦｃドメインがコグネイトＦｃレセプターによって結合される場合に活性化が生じる。二次的エフェクター機能としては、補体系を活性化する能力、胎盤を横切る能力および種々の微生物タンパク質を結合する能力が挙げられる。免疫グロブリンの種々のクラスおよびサブクラスの特性は、Ｒｏｉｔｔら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４．８頁（Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．，第３版、１９９３）に記載される。補体酵素カスケードは、抗原結合ＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＭ抗体のＦｃドメインにより活性化され得る。ＩｇＧ２のＦｃドメインは、あまり効果的でないようであり、そしてＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥのＦｃドメインは、補体を活性化するには非効率的である。従って、その関連する二次的エフェクター機能が特定の免疫応答またはＬＴ−β−Ｒ Ｆｃ融合タンパク質で処置される疾患のために所望されるか否かに基づいてＦｃドメインを選択し得る。ＬＴ−リガンド保有標的細胞を傷つけるかまたは殺傷するために有利であれば、ＬＴ−β−Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質を作製するために特に活性なＦｃドメイン（ＩｇＧ１）を選択し得る。あるいは、ＬＴ−β−Ｒ−Ｆｃ融合物を補体系を誘発することなく細胞に標的化することが所望される場合、不活性ＩｇＧ４ Ｆｃドメインが選択され得る。
【００５２】
Ｆｃレセプターへの結合および補体活性化を低減または排除するＦｃドメインにおける変異が記載された（Ｓ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０，２３９−６５頁（１９９２））。これらのまたは他の変異を単独でまたは組み合わせで使用して、ＬＴ−β−Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質を構築するために使用されるＦｃドメインの活性を最適化し得る。
【００５３】
ヒト免疫グロブリンＦｃドメインに融合されたリガンド結合配列を含む可溶性のヒトＬＴ−β−Ｒ融合タンパク質（ｈＬＴ−β−Ｒ−Ｆｃ）の生成は、米国特許第５，９２５，３５１号（本明細書中に参考として援用される）の実施例１に記載される。ｈＬＴ−β−Ｒ−Ｆｃを分泌する、実施例１に従って作製された１つのＣＨＯ株は、「ｈＬＴ−β；Ｒ−ｈＧ１ ＣＨＯ＃１４」とよばれる。この株のサンプルは、ブタペスト条約の規定に従って、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）に１９９５年７月２１日に寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１１９６５を割り当てられた。
【００５４】
可溶性のマウスＬＴ−β−Ｒ融合分子（ｍＬＴ−β−Ｒ−Ｆｃ）は、米国特許第５，９２５，３５１号（本明細書中に参考として援用される）の実施例２に記載される。ｍＬＴ−β−Ｒ−Ｆｃを分泌する、米国特許第５，９２５，３５１号の実施例２に従って作製されたＣＨＯ株は、「ｍＬＴβ；Ｒ−ｈＧ１ ＣＨＯ＃１．３．ＢＢ」とよばれる。この株のサンプルは、ブタペスト条約の規定に従って、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）に１９９５年７月２１日に寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１１９６４を割り当てられた。
【００５５】
レセプター−Ｉｇ融合タンパク質の接合点を形成する異なるアミノ酸残基は、可溶性ＬＴ−βレセプター融合タンパク質の構造、安定性および最終的な生物学的活性を変更させ得る。１つ以上のアミノ酸は、選択されたＬＴ−β−ＲフラグメントのＣ末端に付加されて、選択された融合ドメインを有する接合点を改変し得る。
【００５６】
ＬＴ−β−Ｒ融合タンパク質のＮ末端はまた、選択されたＬＴ−β−Ｒ ＤＮＡフラグメントが組換え発現ベクターへの挿入のためにその５’末端で切断される位置を変更することにより変化され得る。各ＬＴ−β−Ｒ融合タンパク質の安定性および活性は、慣用的な実験法および本明細書中に記載のＬＴ−β−Ｒブロック剤を選択するためのアッセイを用いて試験され得、そして最適化され得る。
【００５７】
図１に示される細胞外ドメイン内のＬＴ−β−Ｒリガンド結合ドメイン配列を使用すると、アミノ酸配列改変体がまた構築されて、ＬＴリガンドに対する可溶性ＬＴ−βレセプターまたは融合タンパク質の親和性を改変し得る。本発明の可溶性ＬＴ−β−Ｒ分子は、表面ＬＴリガンド結合に関して、内因性細胞表面ＬＴ−βレセプターと競合し得る。ＬＴリガンド結合に関して細胞表面ＬＴ−βレセプターと競合し得るＬＴ−β−Ｒリガンド結合ドメインを含む任意の可溶性分子は、本発明の範囲内に入るＬＴ−β−Ｒブロック剤であると想定される。
【００５８】
本発明の別の実施態様において、ヒトＬＴ−βレセプターに対する抗体（抗ＬＴ−β−Ｒ Ａｂ）は、個体（ヒトを含む）をウイルス誘導性全身性ショックおよび呼吸窮迫にあるか、またはその危険に置く状態を処置する際における使用のためのＬＴ−β−Ｒブロック剤として機能する。本発明の抗ＬＴ−β−Ｒ Ａｂは、ポリクローナルであっても、またはモノクローナル（ｍＡｂ）であってもよく、そしてＬＴ−β−Ｒシグナル伝達を遮断する能力、インビボでのそれらのバイオアベイラビリティー、安定性または他の所望の形質を最適化するように改変され得る。
【００５９】
ヒトＬＴ−βレセプターに対するポリクローナル抗体血清は、ヤギ、ウサギ、ラット、ハムスターまたはマウスのような動物に、完全フロイントアジュバント中のヒトＬＴ−βレセプター−Ｆｃ融合タンパク質（米国特許第５，９２５，３５１号の実施例１）を皮下注射し、次いで、不完全フロイントアジュバント中で腹腔内または皮下でブースター注射することによる従来の技術を用いて調製される。ＬＴ−βレセプターに対する所望の抗体を含むポリクローナル抗血清は、従来の免疫学的手順によってスクリーニングされる。
【００６０】
ヒトＬＴ−βレセプター−Ｆｃ融合タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、米国特許第５，９２５，３５１号の実施例５に記載されるように調製される。マウス抗ヒトＬＴ−β−Ｒ ｍＡｂ ＢＤＡ８を生成するハイブリドーマ細胞株（ＢＤ．Ａ８．ＡＢ９）は、ブタペスト条約の規定に従ってアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０−２２０９）に、１９９５年１月１２日に寄託し、そしてＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１７９８を割り当てられた。
【００６１】
抗ＬＴ−β−Ｒ抗体の種々の形態はまた、標準的な組換えＤＮＡ技術（ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３４９，２９３〜９９頁（１９９１））を用いて作製され得る。例えば、「キメラ」抗体が構築され得、ここでは、動物の抗体由来の抗原結合ドメインがヒト定常ドメインに連結される（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８１，６８５１〜５５頁（１９８４））。キメラ抗体は、ヒトの臨床処置において使用される場合に動物抗体により誘発される、観察される免疫原性応答を低減する。さらに、ＬＴ−β−Ｒを認識する組換え「ヒト化抗体」が合成され得る。ヒト化抗体は、大部分のヒトＩｇＧ配列を含むキメラであり、そこに、特異的抗原結合を担う領域が挿入される（例えば、ＷＯ９４／０４６７９）。動物を所望の抗原で免疫し、対応する抗体を単離し、そして特異的抗原結合を担う可変領域配列の一部を取り出す。次いで、動物由来の抗原結合領域をヒト抗体遺伝子の適切な位置にクローニングし、ここで、この抗原結合領域が欠失される。ヒト化抗体は、ヒト抗体中の異種（種間）配列の使用を最小にし、そして処置される被験体における免疫応答を惹起する可能性が低い。
【００６２】
異なるクラスの組換え抗ＬＴ−β−Ｒ抗体の構築はまた、抗ＬＴ−β−Ｒ可変ドメインおよび異なるクラスの免疫グロブリンから単離されたヒト定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を含むキメラ抗体またはヒト化抗体を作製することによって達成され得る。例えば、増大した抗原結合部位結合価を有する抗ＬＴ−β−Ｒ ＩｇＭ抗体は、ヒトμ鎖定常領域を有するベクターに抗原結合部位をクローニングすることにより組換え的に生成され得る（Ａｒｕｌａｎａｎｄａｍら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７７，１４３９〜５０頁（１９９３）；Ｌａｎｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２，２５７３〜７８頁（１９９３）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３９，６８〜７０頁（１９８９））。さらに、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて、抗原結合部位の付近のアミノ酸残基を改変することにより、組換え抗体とそれらの抗原との結合親和性を改変し得る。ヒト化抗体の抗原結合親和性は、分子モデリングに基づいた変異誘発により増大され得る（Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８６，１００２９〜３３頁（１９８９）；ＷＯ９４／０４６７９）。
【００６３】
標的とされる組織型または想定される特定の処置スケジュールに依存して、ＬＴ−β−Ｒに対する抗ＬＴ−β−Ｒ Ａｂの親和性を増大または減少させることが所望され得る。例えば、半予防的な処置のためにＬＴ−β経路を介してシグナル伝達する低減した能力を有する、一定レベルの抗ＬＴ−β−Ｒ Ａｂで患者を処置することは有利であり得る。同様に、ＬＴ−β−Ｒに対する増大した親和性を有する阻害性の抗ＬＴ−β−Ｒ Ａｂは、短期間の処置に関して有利であり得る。
【００６４】
ヒトＬＴ−βレセプターに対する他の抗体を試験することにより、ヒトにおいてＬＴ−β−Ｒブロック剤として機能する、さらなる抗ＬＴ−β−Ｒ抗体が、個体（ヒトを含む）をウイルス誘導性全身性ショックおよび呼吸窮迫にさせるか、またはその危険に置く状態を処置するために、本明細書中に記載の従来の実験法およびアッセイを用いて同定され得ることを予測する。
【００６５】
本発明の別の好ましい実施態様は、ＬＴ−β−Ｒブロック剤として機能するＬＴリガンドに対する抗体を含む組成物および方法を包含する。抗ＬＴ−β−Ｒ Ａｂに関して上記で記載されるように、ＬＴ−β−Ｒブロック剤として機能する抗ＬＴリガンド抗体は、ポリクローナルであっても、またはモノクローナルであってもよく、そしてそれらの抗原結合特性およびそれらの免疫原性を調節するために慣用的な手順に従って改変され得る。本発明の抗ＬＴ抗体は、２つのＬＴサブユニット個々の内のいずれか一方に対して惹起され得、これらのＬＴサブユニットとしては、可溶性形態、変異形態、改変形態およびキメラ形態のＬＴサブユニットが挙げられる。ＬＴサブユニットが抗原として使用される場合、好ましくは、それらは、ＬＴ−βサブユニットである。ＬＴ−αサブユニットが使用される場合、（米国特許第５，９２５，３５１号の実施例３に記載されるアッセイに従って）得られる抗ＬＴ−α抗体が表面ＬＴリガンドに結合し、そして分泌されたＬＴ−αと交差反応もせず、ＴＮＦ−Ｒ活性を調節もしないことが好ましい。
【００６６】
あるいは、１つ以上のＬＴサブユニットを含む、ホモマー（ＬＴ−β）またはヘテロマー（ＬＴ−α／６２）複合体に対する抗体が惹起され得、そしてＬＴ−β−Ｒブロック剤としての活性についてスクリーニングされ得る。好ましくは、ＬＴ−α１／β２複合体を抗原として用いる。上記で議論されるように、得られる抗ＬＴ−α１／β２抗体が、分泌されたＬＴ−αに結合することなく、かつＴＮＦ−Ｒ活性に影響を及ぼすことなく表面ＬＴリガンドに結合することが好ましい。
【００６７】
ポリクローナル抗ヒトＬＴα抗体の産生は、出願人らの同時係属中の出願（ＷＯ９４／１３８０８）において記載される。モノクローナル抗ＬＴα抗体およびモノクローナル抗ＬＴβ抗体もまた、記載される（Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｍｕｎｏｌ．，５４，３３〜４６頁（１９９５））。マウス抗ヒトＬＴβｍＡｂは、米国特許第５，９２５，３５１号の実施例６に記載されるように調製された。マウス抗ヒトＬＴβ−Ｒ ｍＡｂ Ｂ９を産生するハイブリドーマ細胞株（Ｂ９．Ｃ９．１）は、ブダペスト条約の規定に従って、１９９５年７月２１日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０−２２０９）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号１１９６２を割り当てられた。
【００６８】
モノクローナルハムスター抗マウスＬＴα／６２抗体は、米国特許第５，９２５，３５１号の実施例７に記載されるように調製された。ハムスター抗マウスＬＴα／６２ ｍＡｂ ＢＢ．Ｆ６を産生するハイブリドーマ細胞株（ＢＢ．Ｆ６．１）は、ブダペスト条約の規定に従って、１９９５年７月２１日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０−２２０９）に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＭＢ１１９６３を割り当てられた。
【００６９】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）アッセイが、米国特許第５，９２５，３５１号の実施例６および７において記載されるように、ＬＴβ−Ｒブロック剤として作用し得るＬＴサブユニットおよびＬＴ複合体に対して指向される抗体についてスクリーニングするために開発された。このアッセイにおいて、可溶性のヒトＬＴβ−Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質は、試験抗体の増加量の存在下で表面ＬＴ複合体（Ｂｒｏｗｎｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４，３３〜４６頁（１９９５））を発現する、ＰＭＡ活性化ＩＩ−２３細胞に添加される。ＬＴβレセプター−リガンド相互作用を少なくとも２０％阻害し得る抗体は、ＬＴβ−Ｒブロック剤として選択される。
【００７０】
動物を免疫するための抗原としてＬＴサブユニットではなくＬＴα／β複合体を使用することは、より効率的な免疫をもたらし得るか、または表面ＬＴリガンドについてのより高い親和性を有する抗体を生じ得る。ＬＴα／６２複合体を用いる免疫によって、ＬＴαサブユニットおよびＬＴβサブユニットの両方上のアミノ酸残基（例えば、ＬＴα／６２間隙を形成する残基）を認識する抗体が単離される得るということが考えられる。ヒトＬＴα／６２ヘテロマー複合体に対して指向される抗体を試験することによって、ヒトにおいてＬＴβ−Ｒブロック剤として機能するさらなる抗ＬＴ抗体が、慣用的な実験および本明細書中に記載されるアッセイを使用して同定され得る。
【００７１】
（投与）
本明細書中に記載される組成物は、個体におけるウイルス誘導性全身性ショックおよび呼吸窮迫を処置するための方法において有効用量で投与される。好ましい薬学的処方物および所定の適用のための治療的に有効な用量レジメの決定は、例えば、患者の状態および体重、所望の処置の程度、および処置についての患者の耐性を考慮に入れて、十分に当業者の範囲内である。可溶性ＬＴβ−Ｒの約１ｍｇ／ｋｇの用量が、最適の処置用量のための適切な開始点であると予想される。
【００７２】
治療的に有効な用量の決定はまた、標的細胞（ブロック剤に依存してＬＴβ−ＲまたはＬＴリガンド陽性細胞）を１〜１４日間コートするのに必要なＬＴβ−Ｒブロック剤の濃度を測定するインビトロ実験を実行することによって評価され得る。本明細書中に記載されるレセプター−リガンド結合アッセイが使用されて、細胞コート反応をモニターし得る。ＬＴβ−ＲまたはＬＴリガンド陽性細胞は、ＦＡＣＳを使用して活性化されたリンパ球集団から分離され得る。これらのインビトロ結合アッセイの結果に基づいて、適切なＬＴβ−Ｒブロック剤濃度の範囲は、本明細書中に記載されるアッセイに従って、動物において試験されるために選択され得る。
【００７３】
本発明の可溶性ＬＴβ−Ｒ分子、抗ＬＴリガンド、および抗ＬＴβ−Ｒ Ａｂの投与（単独でまたは組み合わせて、抗体もしくは複合体の単離されそして精製された形態、それらの塩またはその薬学的に受容可能な誘導体を含む）は、免疫抑制活性を示す薬剤の、従来的に受容されてきた投与の様式のいずれかを使用して達成され得る。
【００７４】
これらの療法において使用される薬学的組成物はまた、種々の形態にあり得る。これらには、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液体溶液もしくは懸濁剤、坐剤、ならびに注射可能な溶液および注入可能な溶液のような、固体、半固体、および液体投与量形態が含まれる。好ましい形態は、意図される投与の様式および治療的適用に依存する。
【００７５】
投与の様式は、経口、非経口、皮下、静脈内、病変内、または局所的投与を含み得る。本発明の可溶性ＬＴβ−Ｒ分子、抗ＬＴリガンド、および抗ＬＴβ−Ｒ Ａｂは、例えば、取り込みまたは安定性を刺激する補因子を伴うかまたは伴わない、滅菌の、等張性処方物中に配置され得る。その処方物は、好ましくは液体であるか、または凍結乾燥した粉末であり得る。例えば、本発明の可溶性ＬＴβ−Ｒ分子、抗ＬＴリガンド、および抗ＬＴβ−Ｒ Ａｂは、５．０ｍｇ／ｍｌ クエン酸一水和物、２．７ｍｇ／ｍｌ クエン酸三ナトリウム、４１ｍｇ／ｍｌ マンニトール、１ｍｇ／ｍｌ グリシン、および１ｍｇ／ｍｌ ポリソルベート２０を含む処方緩衝液を用いて希釈され得る。この溶液は、凍結乾燥され、冷蔵下で保存され、そして滅菌Ｗａｔｅｒ−Ｆｏｒ−Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（ＵＳＰ）を用いて、投与の前に再構築され得る。
【００７６】
この組成物はまた、好ましくは、当該分野で周知の従来的な薬学的に受容可能なキャリアを含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、１９８０、Ｍａｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと）。このような薬学的に受容可能なキャリアは、他の医薬的薬剤、キャリア、遺伝子キャリア、アジュバント、賦形剤など（例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物）を含み得る。この組成物は、好ましくは、単位用量の形態にあり、そして通常１日に１回以上投与される。
【００７７】
本発明の薬学的組成物はまた、罹患した組織または血流中に配置されるか、その近くに配置されるか、またはさもなくばそれと連絡するように配置される、ミクロスフェア、リポソーム、他の微小粒子送達系、または徐放性処方物を使用して投与され得る。徐放性キャリアの適切な例には、成型品（例えば、坐剤または微小カプセル）の形態にある半透性のポリマーマトリックスが含まれる。移植可能なまたは微小カプセルの徐放性マトリックスには、ポリアクチド（米国特許第３，７７３，３１９号；ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２，５４７〜５６頁（１９８５）；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはエチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５，１６７−２７７頁（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２，９８〜１０５頁（１９８２）））が含まれる。
【００７８】
本発明の可溶性ＬＴβ−Ｒ分子、抗ＬＴリガンド、および抗ＬＴβ−Ｒ Ａｂを含むリポソームは、単独でまたは組み合わせて、周知の方法によって調製され得る（例えば、ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，３６８８〜９２頁（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７，４０３０〜３４頁（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号を参照のこと）。通常、リポソームは小さな（約２００〜８００Å）単層型のものであり、ここで脂質含量は、約３０モル％コレステロールより多い。コレステロールの比率は、可溶性のＬＴβ−Ｒ分子、抗ＬＴリガンド、および抗ＬＴβ−Ｒ Ａｂ放出の最適な割合を制御するために選択される。
【００７９】
本発明の可溶性ＬＴβ−Ｒ分子、抗ＬＴリガンド、および抗ＬＴβ−Ｒ Ａｂはまた、ＬＴβ−Ｒブロッキング活性を調節するために、他のＬＴβ−Ｒブロック剤、免疫抑制剤、またはサイトカインを含むリポソームに結合され得る。ＬＴβ−Ｒ分子、抗ＬＴリガンド、および抗ＬＴβ−Ｒ Ａｂのリポソームへの結合は、毒素または化学療法剤を標的化された送達のために抗体にカップリングするために広範に使用されてきた任意の公知の架橋試薬（例えば、ヘテロ二官能性架橋剤）によって達成され得る。リポソームへの結合体化もまた、炭水化物指向性の架橋試薬４−（４−マレイニドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）（Ｄｕｚｇｕｎｅｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｂｓｔ．Ｓｕｐｐｌ．１６Ｅ７７（１９９２））を用いて達成され得る。
【００８０】
本発明の組成物および方法のＬＴβ−Ｒブロック剤は、処置される状態、障害、または疾患に依存して、ＬＴβ−Ｒシグナル伝達の所望のレベルを得るために改変され得る。ＬＴβ−Ｒシグナル伝達の絶対的なレベルは、それらのそれぞれの分子標的についてのＬＴβ−Ｒブロック剤の濃度および親和性を操作することによって、細かく調整され得ることが想定される。例えば、本発明の１つの実施態様において、可溶性ＬＴβ−Ｒ分子を含む組成物が、被験体に投与される。可溶性ＬＴβレセプターは、表面ＬＴリガンドを結合することについて、細胞表面ＬＴβレセプターと有効に競合し得る。表面ＬＴリガンドと競合する能力は、可溶性かつ細胞表面のＬＴβ−Ｒ分子の相対的濃度、およびリガンド結合についてのそれらの相対的親和性に依存する。
【００８１】
表面ＬＴリガンドとの変異体可溶性ＬＴβ−Ｒの結合親和性を増加または減少させる変異を有する可溶性ＬＴβ−Ｒ分子は、当業者に周知の標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して作製され得る。部位特異的変異またはランダムな変異を有する多くの分子は、本明細書中に記載される慣用的な実験および技術を使用して、ＬＴβ−Ｒブロック剤として機能するそれらの能力について試験され得る。同様に、本発明の別の実施態様において、抗体は、ＬＴβ−Ｒブロック剤としてのＬＴβレセプターまたは１つ以上のＬＴリガンドサブユニット機能のいずれかに対して指向された。ＬＴβレセプターシグナル伝達をブロックするこれらの抗体についての能力は、変異、化学修飾によって、または被験体に送達される抗体の有効な濃度または活性を変化させ得る他の方法によって改変させ得る。
【００８２】
（用途）
一般的な問題として、本発明の方法は、個体において抗ウイルス応答を誘導するために利用され得、これは、ＬＴ−Ｂブロック剤および薬学的に受容可能なキャリアの有効量を個体に投与する工程を包含する。処置されるウイルス応答は、かなり多数の公知のウイルスの任意の数によって引き起こされ得、これらには、シンノンブル（ＳＮＶ）、エボラ、マールブルグ、ラッサ、およびデング熱が含まれるがそれらに限定されない。
【００８３】
（等価物）
本発明は、その意図または本質的な性質から逸脱することなく、他の特定の形態において具体化され得る。従って、前述の実施態様は、本明細書中に開示された本発明に限定するのではなく、例示するすべての点において考慮される。従って、本発明の範囲は、前述の記載によるのではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、そして特許請求の範囲の意味の中でのすべての変更、およびその等価物の範囲は、そこに含まれることが意図される。
【００８４】
（実施例）
腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）は、ウイルス感染および他の免疫原に対する急性ショック応答を容易にする際に鍵となる役割を果たす（Ｋ．Ｃ．Ｆ．Ｓｈｅｅｈａｎ，Ｎ．Ｈ．Ｒｕｄｄｌｅ、およびＲ．Ｄ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２，３８８４（１９８９）；Ｇ．Ｗ．Ｈ．ＷｏｎｇおよびＤ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ Ｎａｔｕｒｅ ３２３，８１９（１９８６）；Ｂ．Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｉ．Ｗ．Ｍｉｌｓａｒｋ，Ａ．Ｃｅｒａｍｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９，８６９（１９８５）；Ｆ．Ｍａｃｋａｙ，Ｐ．Ｒ．Ｂｏｕｒｄｏｎ，Ｄ．Ａ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，３２９９（１９９７）；Ｐ．Ｄ．Ｃｒｏｗｅ，Ｔ．Ｌ．ＶａｎＡｒｓｄａｌｅ，Ｂ．Ｎ．Ｗａｌｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４，７０７（１９９４））。ショックを含むデング熱のエピソードの間、患者からの血清のＴＮＦαのレベルは、可溶性ＴＮＦＲ−７５のレベルと同様に上昇する（Ｄ．Ｈｏｂｅｒら、Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．，４８，３２４（１９９３）；Ｄ．Ｂ．Ｂｅｔｈｅｌｌ，Ｋ．Ｆｌｏｂｂｅ，Ｃ．Ｘ．Ｔ．Ｐｈｕｏｎｇら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７７，７７８（１９９８））。本発明者らは、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルスの改変体、ＬＣＭＶ、クローン１３（ＬＣＭＶ−１３）（ＨＨ，ＩＩ）で感染させたマウスの血清中のＴＮＦαレベルを測定した。ＬＣＭＶ−１３で感染させたマウスの血清中のＴＮＦαレベルを、感染後４日までアッセイについて検出のレベルの少し上にあることを見出した（血清ＴＮＦαレベルを、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，カタログ番号８０−２８０２−００）によって測定した）。５日目および６日目に、その疾患がそのピークにある場合、血清中の可溶性ＴＮＦαレベルは、正常の３〜６倍に増大した（データは示さず）。従って、本発明者らは、モノクローナル抗体、ＴＮ３−１９．１２を使用することによって、ＴＮＦα機能をブロックすることを選択した。この抗体は、分泌されたＴＮＦαの両方に結合することが公知であり、従って、ＥＬＩＳＡによって確認されるようなマウスからのその枯渇を引き起こす（Ｋ．Ｃ．Ｆ．Ｓｈｅｅｈａｎ，Ｎ．Ｈ．ＲｕｄｄｌｅおよびＲ．Ｄ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２，３８８４（１９８９）Ｇ．Ｗ．Ｈ．ＷｏｎｇおよびＤ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ Ｎａｔｕｒｅ ３２３，８１９（１９８６）；Ｂ．Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｉ．Ｗ．Ｍｉｌｓａｒｋ，Ａ．Ｃｅｒａｍｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９，８６９（１９８５）；Ｆ．Ｍａｃｋａｙ，Ｐ．Ｒ．Ｂｏｕｒｄｏｎ，Ｄ．Ａ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，３２２９（１９９７）；Ｐ．Ｄ．Ｃｒｏｗｅ，Ｔ．Ｌ．ＶａｎＡｒｓｄａｌｅ，Ｂ．Ｎ．Ｗａｌｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４，７０７（１９９４）；Ｄ．Ｈｏｂｅｒら、Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．，４８，３２４（１９９３）；Ｄ，Ｂ，Ｂｅｔｈｅｌｌ，Ｋ．Ｆｌｏｂｂｅ，Ｃ．Ｘ．Ｔ．Ｐｈｕｏｎｇら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７７，７７８（１９９８））。血清ＴＮＦαレベルを、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した（ＧｅｎｚｙｍｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，カタログ番号８０−２８０２−００）。ＮＺＢマウスに２．５×１０⁶ｐｆｕ Ｃｌ １３をｉ．ｖ．で与え、続いて感染後１日目および４日目に、エンドトキシンを含まないＰＢＳ（参考文献Ｓを参照のこと）中の２５０μｇのＴＮ３−１９．１２抗体を含む２回のｉ．ｐ．注射を行った。コントロールマウスには、同じ日に抗体を含まない同じ容量のＰＢＳを注射した。この処置（抗ＴＮＦ）は、これらのマウスの生存率にほとんど効果を有さなかった（図３）。リンホトキシンα（ＬＴα）（ＴＮＦβとしても知られるが、これは、同じレセプターおよびその生物学的効果の多くを、ＴＮＦαと共有する）は、この抗体によって認識されない（Ｆ．Ｍａｃｋａｙ，Ｐ．Ｒ．Ｂｏｕｒｄｏｎ，Ｄ．Ａ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，３２９９（１９９７））。ＴＮＦαおよびＬＴαの両方を標的化することが、生存率を増加させるために必要とされることがあり得る。この仮説を試験するために、本発明者らは、上記のＴＮ３−１９．１２ ｍＡｂおよびヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインにＴＮＦｐ５５レセプターの細胞外ドメインを融合させたレセプター融合タンパク質（ＴＮＦＲ５５−Ｉｇ）を使用した（Ｗ．Ｒ．Ｆｏｒｃｅ，Ｂ．Ｎ．Ｗａｌｔｅｒ，Ｃ．Ｈｅｓｓｉｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５，５２８０（１９９５）；Ｇ．Ｔ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｐ．Ｓ．Ｈｏｃｈｍａｎ，Ｗ．Ｍｅｉｅｒら、ＪＥＭ．，１７８，２１１（１９９３）；Ｊ．Ｌ．Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，Ｉ．Ｄｏｕｇａｓ，Ａ．Ｎｇａｍ−ｅｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４：３３（１９９５））。マウスを、参考文献Ｒに記載されるように処置した。三重で処置した群について、ＴＮＦＲ５５−Ｉｇタンパク質およびＬＴβＲ−Ｉｇタンパク質を、感染後０日目および３日目に、２００μｇ量で、ｉ．ｐ．で与えた。コントロールマウスには、同じ日に同じ量で、これらの融合タンパク質（ＡＹ１９４３−２９）の合成において使用されるヒト抗体を与えた。ＬＴβＲ−Ｉｇのみを受容したマウスを、ＴＮＦＲ５５−Ｉｇ注射が除外された以外は、同様に処置した。この処置はまた、ＬＣＭＶ−１３感染したＮＺＢマウスにおいて、生存率を有意に変化させなかった（抗ＴＮＦおよびＴＮＦＲ５５−Ｉｇ群を参照のこと）。膜型のリンホトキシン、ＬＴαのヘテロマー、およびＬＴβは、ＴＮＦＲ−７５またはＴＮＦＲ−５５を認識しなかったが、むしろＬＴβＲ（１５）と呼ばれる第３のレセプターに結合する。本発明者らは、ヒトＩｇＧ１（ＬＴβＲ−Ｉｇ）のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインにもまた結合している、ＬＴβＲ細胞外ドメインを含む融合タンパク質を使用することを選択した。抗ＴＮＦα ｍＡｂ、ＴＮＦＲ５５−ＩｇおよびＬＴβＲ−Ｉｇでのマウスの処置（三重処置またはＴＮＦＲ５５−ＩＧおよびＬＴβＲ−Ｉｇ）は、生存の劇的な増加を生じた（それぞれ、８０％および７０％まで）。対照的に、抗ＴＮＦα ｍＡｂおよびＴＮＦＲ５５−Ｉｇで処置したマウスの２０％のみが、感染で生存した。最近、ＬＴβＲについての第２のリガンド、ＬＩＧＨＴが同定された（Ｄ．Ｎ．Ｍａｕｒｉ，Ｒ．Ｅｂｎｅｒ，Ｒ．Ｉ．Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８，２１（１９９８）；Ｒ．Ｉ．Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｍ．Ｓ．Ｗａｒｎｅｒ，Ｂ．Ｌｕｍら、Ｃｅｌｌ ８７，４２７（１９９６））。ＬＩＧＨＴはまた、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）を結合することが示されており、これは、活性化されたＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞上で発現されるＴＮＦＲファミリーのメンバーと有意な相同性を有するＩ型膜貫通タンパク質である（Ｄ．Ｎ．Ｍａｕｒｉ，Ｒ．Ｅｂｎｅｒ，Ｒ．Ｉ．Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８，２１（１９９８）；Ｒ．Ｉ．Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｍ．Ｓ．Ｗａｒｎｅｒ，Ｂ．Ｌｕｍら、Ｃｅｌｌ ８７，４２７（１９９６））。本明細書に提供された結果に基づく、ＬＴβＲ−ＩｇによるＬＴβ₂α₁およびＬＩＨＧＴの結合による、ＬＴβＲシグナル伝達および潜在的なＨＶＥＭシグナル伝達の阻止は、三重処置群において見られる効果の大部分の原因であるようであった。本発明者らは、ＬＣＭＶ−１３感染ＮＸＢマウスをＬＴβＲ−Ｉｇ融合タンパク質で処置することによって、この仮説を確認した。この群のマウスの生存率（７３％）は、三重処置群とほぼ同じ高さであった（図３）。総合すれば、これらのデータは、ＬＴβＲおよび／またはＨＶＥＭシグナル伝達経路が、全身性ショックおよび呼吸窮迫を含む急性の致死性の疾患の統合に関与することの最初の実証を表す。
【００８５】
ＬＴβ遮断処理後の生存の機構を決定する目的において、ＮＰ１１８特異的Ｔ細胞についてのＣＤ８／テトラマーの両方の同時染色、ＮＺＢ Ｌ^DシステムにおけるドミナントＣＤ８エピトープ、およびＮＰ１１８ペプチドで刺激された脾臓細胞によって産生されるインターフェロンγについての細胞内染色を、コントロール抗体、ＬＴβＲ−Ｉｇ単独で、または三重処置した、ＬＣＭＶ−１３感染させたＮＺＢマウス由来のサンプル上で実行した。図４は、三重処置したマウスにおいて見られた最大の効果を有する、ＮＰ１１８特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数の減少を例証する。コントロール抗体で処置したマウスにおいて、１０％のテトラマー陽性細胞のみが活性にＩＮＦγを産生した。ＬＣＭＶ−１３感染の間のアネルギー性Ｔ細胞の出現は、以前に実証され、そしてこれはマウスにおける高いレベルのウイルス抗原に起因するようである（図１）。ＬＴβＲ−Ｉｇ処置マウスにおいてＮＰ１１８特異的細胞の数が減少しただけでなく、ＩＮＦγを産生する細胞の割合もまた減少した。この効果は、三重処置群においてなおさらに顕著であった。従って、ＣＤ８画分は、ＬＣＭＶ−１３感染へのこの致死的なＮＺＢ応答の供給源であり得る。活性化されたＣＤ８が、ＬＴβ₂α₁を提示することが既知であるという事実は、この仮説と一致する（Ｙ．Ａｂｅ，Ａ．Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，Ｙ．Ｏｓｕｋａら、Ｌｙｍｐｈ．Ｃｔｙｏｋ．Ｒｅｓ．，１１，１１５（１９９２）；Ｃ．Ｆ．Ｗａｒｅ，Ｐ．Ｄ．Ｃｒｏｗｅ，Ｍ．Ｈ．Ｇｒａｙｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４９，３８８１（１９９２）；Ｊ．Ｌ．Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，Ａ．Ｎｇａｍ−ｅｋ，Ｐ．Ｌａｗｔｏｎら、Ｃｅｌｌ，７２，８４７（１９９３））。この主張を支持するために、本発明者らは、感染したＮＺＢマウスで、インビボでＣＤ８陽性Ｔ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞を枯渇させた（雄性ＮＺＢマウスに２．５×１０⁶ｐｆｕ ＬＣＭＶ−１３をｉ．ｖ．で与え、続いて、抗Ｔ細胞抗体の５００μｌ ｉ．ｐ．注射を２回行った。ｍＡｂ Ｌｙｔ２．４３を使用して、ＣＤ８⁺Ｔ細胞を枯渇させた。一方、ＣＤ４⁺Ｔ細胞枯渇のためにＧＫ１．５（Ｍ１）抗体を使用した。両方の抗体を、ハイブリドーマ上清からの硫酸アンモニウム沈殿、続いてＰＢＳに対する透析によって調製した。ＦＡＣＳ分析を使用して、いくつかのマウスにおける枯渇を確認した。）。ＣＤ４ Ｔ細胞枯渇は、生存を増加させなかった。対照的に、ＣＤ８ Ｔ細胞の枯渇は、ＬＴβＲ−Ｉｇ処置マウスとは異なり、疾患症状の非存在下において１００％の生存を生じた（図５）。ＣＤ８枯渇マウスのいくつかの組織におけるウイルス力価は、処置していないマウスよりも高かったので、死は、ウイルス感染による組織の破壊からではなく、ＣＤ８ Ｔ細胞によって媒介される毒性の免疫応答から生じるようである。
【００８６】
本発明者らは、本明細書で、静脈投与の高用量のＬＣＭＶ−１３で感染させたＮＺＢマウスが、エボラ感染、マールブルグ感染、ラッサ感染、デング熱感染、およびシンノンブル感染といくつかの共通の特徴を共有する、急性の、迅速に進行する疾患を発症することを報告した。この病気の致死率は、活性化された場合に、ＴＮＦα、ＬＴα、およびＬＴβを発現することが知られているＣＤ８⁺Ｔ細胞の存在に依存した。これは、希望を与える知見であるが、ＣＤ８⁺Ｔ細胞の枯渇によるウイルス感染の処置は、的を得ていない。このような処置は、他の日和見感染に対して、患者を無防備なままにし得る。さらに、ウイルスのクリアランスは、ＣＴＬの非存在下においてではないようなので、ＣＤ８⁺画分の再構築の際のウイルスに対する患者の耐性のリスクは非常に現実的である。本発明者らは、ＬＴβＲ−Ｉｇの投与によるＬＴβＲ／ＨＶＥＭ経路の遮断は、一旦処置を停止した場合、ホメオスタシスへの迅速な回復を伴う、天然においては一過性の、強力な処置であることを示す（ＭａｃｋａｙおよびＢｒｏｗｎｉｎｇ、未公開）。この様式において処置した生存しているマウスは、最終的に、試験された組織からウイルスを取り除き（データは示さず）、そしてもはや疾患の徴候を示さない。
【００８７】
これらのデータは、ＬＴβＲがシグナル伝達が、抗ウイルス応答およびＣＤ８ Ｔ細胞機能において重要な役割を果たすことの最初の実証であることを表す。リンホトキシン系は、多分、Ｔ細胞およびＢ細胞組織を方向付けるいくつかのケモカインの発現の制御を介してリンパ系構造の組織と密接に関連している（Ｃｈａｐｌｉｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０，２８９（１９９８），Ｊ．Ｃｙｓｔｅｒ，印刷中）。濾胞性樹状細胞（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）の成熟機能状態は、定常的なＢ細胞シグナル伝達によって維持され、そしてこれらの細胞は、ＬＴβＲシグナル伝達の停止に際して１日以内に消失する。これらの細胞は、Ｂ細胞画分およびＴ細胞画分への抗原の提示のために決定的である。合理的な推測は、ＣＤ８細胞への抗原提示のいくつかの局面または成熟の間のケモカイン勾配におけるこれらの細胞の適切な配置（ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ）が、ＬＴβＲシグナル伝達の破壊によって妨害されることである。ＬＴ機能の以前の研究は、主としてＢ細胞の生物学に焦点を当てており、そしてＴ細胞機能における関与は予期されなかった。ＬＴはさらなる機能を有するか、またはこれらのデータは、新規なリガンドＬＩＧＨＴについての役割を反映するかのいずれかである。本明細書で実証した疾患の進行においてＨＶＥＭおよびＬＩＧＨＴが何の役割を果たし得るかは、現在のところわからない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＮＺＢマウスにクローン１３ＬＣＭＶが感染すると死に至ることを示す。ＬＣＭＶ−１３に感染したＮＺＢマウス（ｎ＝１４）の死亡率曲線およびＬＣＭＶ−１３に感染したマウスの感染後６日目の種々の組織（ｎ＝７）におけるウイルス力価。
【図２】 図２は、ＮＺＢマウスにおけるＬＣＭＶ−１３感染の組織学的プロフィールを示す。（Ａ）（１００×、Ｈ＋Ｅ）における正常肺、（Ｂ）感染後５日目の肺における単核細胞浸潤および肺胞壁肥厚を伴う間質性肺炎（１００×、Ｈ＋Ｅ）、（Ｃ）脾臓におけるリンパ枯渇、細胞壊死および小胞構造の閉塞（２５×、Ｈ＋Ｅ）（Ｄ）脾臓における細胞壊死および核崩壊砕片（ｋａｒｙｏｒｒｈｅｃｔｉｃ ｄｅｂｒｉｓ）を示すより高倍率の図（１５８、Ｈ＋Ｅ）、（Ｅ）肺におけるＬＣＭＶ−１３陽性内皮細胞（矢印）およびマクロファージ（白矢印）（１００×、ＩＨＣ）、（Ｆ）脾臓におけるＬＣＭＶ−１３陽性内皮細胞（矢印）および中皮細胞（矢じり）およびマクロファージ（白矢印）（５０×、ＩＨＣ）、（Ｇ）心臓におけるＬＣＭＶ−１３陽性内皮細胞（１００×、ＩＨＣ）、（Ｈ）肝臓におけるＬＣＭＶ−１３陽性クッパー細胞および洞様管壁細胞（１００×、ＩＨＣ）。
【図３】 図３は、ＬＴβＲシグナル伝達経路の遮断は、クローン１３感染ＮＺＢマウスの生存率を有意に改善することを示す。記載されるような処置をされたクローン１３感染ＮＺＢマウスについての死亡率曲線をここに提示する。ＮＺＢマウスには２．５×１０⁶ｐｆｕ Ｃｌ １３ ｉ．ｖ．が与えられ、次にエンドトキシンを含まないＰＢＳ（参考文献Ｓ参照）中に２５０μｇのＴＮ３−１９．１２抗体を含むｉ．ｐ．注入を感染後１日目および４日目の２回行った。コントロールマウスには、同じ日に抗体を含まない同じ容量のＰＢＳが注入された。マウスは、参考文献Ｒに記載されるように処置された。３重処置群に関して、ＴＮＦＲ５５−ＩｇおよびＬＴβＲ−Ｉｇタンパク質が感染後０および３日目に２００μｇ量でｉ．ｐ．で与えられた。コントロールマウスには、これらの融合タンパク質（ＡＹ１９４３−２９）の合成の際に使用されるヒト抗体が同じ日に同じ量で与えられた。ＬＴβＲ−Ｉｇのみを与えたマウスをＴＮＦＲ５５−Ｉｇ注入を省略したこと以外は、同様に処置した。データは、いくつかの実験（抗ＴＮＦ（ＴＮ３−１９．１２）単独）、ＬＴβＲ−Ｉｇ単独についてはｎ＝１６、３重処置群についてはｎ＝１０（３重処置群についてはｎ＝１０、ＬＴβＲ−Ｉｇ単独についてはｎ＝２２、ＬＴβＲ−Ｉｇ＋ＴＮＦＲ５５−Ｉｇ群についてはｎ＝１０、抗ＴＮＦおよびＴＮＦＲ５５−Ｉｇ処置群についてはｎ＝５、抗ＴＮＦ（ＴＮ３−１９．１２）単独についてはｎ＝６、およびコントロールについてはｎ＝２５）からまとめられた。
【図４】 図４は、ＬＴβＲ経路の遮断がＣＤ８ Ｔ細胞機能の減少を生じることを示す。異なる処置群におけるマウス由来の脾細胞を感染後６日目に収集し、以前に記載されたようにＮＰ１１８ ９マーペプチドを含むＬ^dテトラマーで染色した。生じた値を非特異的バックグランド染色について調整した。同じペプチドに応答したインターフェロンγ産生をモニターするために、細胞を、最終濃度０．１μｇ／ｍｌのＮＰ１１８およびＩＬ−２の存在下で３７℃５時間インキュベートした。ここで生じた値をペプチドの非存在下におけるバックグランドレベルについて調整した。コントロールヒトＩｇで処置された３匹のマウス由来の脾細胞を、２匹のＬＴβＲ−Ｉｇマウス（ＬＴβ＃２／３）由来の脾細胞と同じようにプールした。他のすべての結果は、個々のマウス由来である。
【図５】 図５は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞ではなく、ＣＤ８⁺Ｔ細胞の枯渇がＮＺＢマウスにおけるＬＣＭＶ−１３感染の致命的効果を逆転させることを示す。マウスをインビボの細胞集団の枯渇について記載されるように処置した。死亡率曲線は、処置された各々の群（ｎ＝４）について示されている。

Claims (18)

1. ウイルス誘導性全身性ショックおよび／またはウイルス誘導性肺窮迫に罹患する個体における抗ウイルス応答を誘導するための組成物であって、該組成物は、可溶性リンホトキシン−βレセプター（ＬＴ−β−Ｒ）の有効量および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
2. 個体におけるウイルス誘導性全身性ショックを低減するための組成物であって、該組成物は、可溶性リンホトキシン−βレセプター（ＬＴ−β−Ｒ）の有効量および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
3. ウイルス誘導性全身性ショックおよび／またはウイルス誘導性肺窮迫に罹患する個体におけるウイルス感染を減少させるための組成物であって、該組成物は、可溶性リンホトキシン−βレセプター（ＬＴ−β−Ｒ）の有効量および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
4. 個体におけるウイルス誘導性肺窮迫を低減させるための組成物であって、該組成物は、可溶性リンホトキシン−βレセプター（ＬＴ−β−Ｒ）の有効量および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
5. 前記可溶性ＬＴ−β−Ｒが、リンホトキシン−βレセプター／免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
6. 前記個体がシンノンブルウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ラッサウイルスまたはデング熱ウイルスに感染する、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
7. 可溶性リンホトキシン−βレセプター（ＬＴ−β−Ｒ）の有効量および薬学的に受容可能なキャリアの、ウイルス誘導性全身性ショックおよび／またはウイルス誘導性肺窮迫に罹患する個体における抗ウイルス応答を誘導するための薬学的組成物の調製のための使用であって、該薬学的組成物は、個体に投与される、使用。
8. 可溶性リンホトキシン−βレセプター（ＬＴ−β−Ｒ）の有効量および薬学的に受容可能なキャリアの、個体におけるウイルス誘導性全身性ショックを低減するための薬学的組成物の調製のための使用であって、該薬学的組成物は、個体に投与される、使用。
9. 可溶性リンホトキシン−βレセプター（ＬＴ−β−Ｒ）の有効量および薬学的に受容可能なキャリアの、ウイルス誘導性全身性ショックおよび／またはウイルス誘導性肺窮迫に罹患する個体におけるウイルス感染を減少させるための薬学的組成物の調製のための使用であって、該薬学的組成物は、個体に投与される、使用。
10. 可溶性リンホトキシン−βレセプター（ＬＴ−β−Ｒ）の有効量および薬学的に受容可能なキャリアの、個体におけるウイルス誘導性肺窮迫を低減させるための薬学的組成物の調製のための使用であって、該薬学的組成物は、個体に投与される、使用。
11. 前記可溶性ＬＴ−β−Ｒが、リンホトキシン−βレセプター／免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質である、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の使用。
12. 前記個体がシンノンブルウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ラッサウイルスまたはデング熱ウイルスに感染する、請求項７〜１１のいずれかに記載の使用。
13. 前記ウイルス誘導性全身性ショックおよび／またはウイルス誘導性肺窮迫が、ＣＤ８ Ｔ細胞によって媒介されるものである、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
14. 前記ウイルス誘導性全身性ショックが、ＣＤ８ Ｔ細胞によって媒介されるものである、請求項２に記載の組成物。
15. 前記ウイルス誘導性肺窮迫が、ＣＤ８ Ｔ細胞によって媒介されるものである、請求項４に記載の組成物。
16. 前記ウイルス誘導性全身性ショックおよび／またはウイルス誘導性肺窮迫が、ＣＤ８ Ｔ細胞によって媒介されるものである、請求項７〜９のいずれかに記載の使用。
17. 前記ウイルス誘導性全身性ショックが、ＣＤ８ Ｔ細胞によって媒介されるものである、請求項８に記載の使用。
18. 前記ウイルス誘導性肺窮迫が、ＣＤ８ Ｔ細胞によって媒介されるものである、請求項１０に記載の使用。

Images