PL185364B1

PL185364B1 - Kompozycje farmaceutyczne do leczenia albo zmniejszenia zaawansowania, ciężkości albo skutków powstawania nowotworu

Info

Publication number: PL185364B1
Application number: PL96321758A
Authority: PL
Inventors: Jeffrey L. Browning; Werner Meier; Christopher D. Benjamin
Original assignee: Biogen
Priority date: 1995-01-26
Filing date: 1996-01-26
Publication date: 2003-04-30
Also published as: FI119359B; AU4970496A; DK0809510T3; KR20040102364A; EA000096B1; NO973385D0; CN1177302A; JP2007169296A; EE9700255A; KR100470739B1; BR9606808A; CA2211443A1; PL321758A1; CZ298711B6; ES2220972T3; CN1589902A; DE69632681D1; FI973118A0; ATE268604T1; PT809510E

Abstract

1. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia albo zmniejszenia zaawansowania, ciez- kosci albo skutków powstawania nowotworu, znamienna tym, ze obejmuje skuteczna terapeutycznie ilosc co najmniej jednego czynnika aktywujacego LT-ß-R oraz farmaceu- tyczne dopuszczalny nosnik, przy czym czynnik aktywujacy LT-ß-R jest przeciwcialem anty-LT-ß-R. 17. Kompozycja farmaceutyczna wedlug zastrz. 10, znamienna tym, ze przeciwcia- lami monoklonalnymi anty-LT-ß-R sa AGH 1 i CDH10, przy czym numery dostepu nadane przez ATCC dla linii komórek hybrydoma albo ich klonów wytwarzajacych mAb CDH10 i AGH1 wynosza odpowiednio HB 11797 oraz HB 11796. 19. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia albo zmniejszenia zaawansowania, ciezkosci albo skutków powstawania nowotworu, znamienna tym, ze jako czynnik akty- wujacy LT-ß-R obejmuje skuteczna terapeutycznie ilosc sieciowanych przeciwcial anty- LT-ß-R, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nosnik. PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są kompozycje farmaceutyczne do leczenia albo zmniejszenia zaawansowania, ciężkości albo skutków powstawania nowotworu.

W szczególności niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji przydatnych w aktywacji sygnalizacji przez receptory limfotoksyny p, które wywołują silny efekt antyproliferacyjny w komórkach nowotworowych. Przedmiotem wynalazku są zatem kompozycje obejmujące przeciwciała skierowane przeciwko receptorowi limfotoksyny β, które zarówno spełniają same rolę czynnika aktywującego receptor limfotoksyny β, jak i w kombinacji z innymi czynnikami aktywującymi receptor limfotoksyny β. Opisano również sposób badania przesiewowego do selekcji takich przeciwciał. W zakres wynalazku wchodzą również kompozycje obejmujące sieciowane przeciwciała przeciwko receptorowi dla limfotoksyny β w obecności lub w nieobecności innych czynników aktywujących receptor dla limfotoksyny β.

Rodzina receptorów czynnika martwicy nowotworu (TNF) obejmuje wiele receptorów, na które oddziaływanie może wywoływać śmierć komórki przez nekrozę lub apoptozę (programowana śmierć komórki). Ligandy TNF i limfotoksyny a (LT-α; dawniej nazywane TNF p) wiążą się z i aktywują receptory dla TNF (p60 i p80; zwane tutaj „TNF-R”). Przekazywanie sygnału poprzez TNF-R zapoczątkowuje ogólną odpowiedź immunologiczną na infekcje lub stres w normalnych komórkach, lecz jest cytotoksyczne dla komórek, których fenotyp uległ transformacji lub dla komórek nowotworowych. Sygnalizacja przez TNF-R może selektywnie niszczyć komórki nowotworowe i zakażone wirusem. Efekty cytotoksyczne sygnalizacji przez TNF-R na komórki nowotworowe wzmacniane są przez interferon-γ (IFN-y) oraz różne konwencjonalne środki chemioterapeutyczne.

Byłoby korzystne wykorzystanie aktywności antyproliferacyjnych albo cytotoksycznych wywołanych sygnalizacją przez TNF-R w komórkach nowotworowych, w celach terapeutycznych. Jednakże, aktywacja TNF-R wywiera plejotropowy wpływ na różne odpowiedzi regulacji odpowiedzi odpornościowej, w tym na aktywację kaskad zapalnych. Tak więc, nie było możliwe kierowanie efektów cytotoksycznych sygnalizacji przez tNf-R do komórek nowotworowych bez współpobudzenia reakcji zapalnych, co prowadzi do uogólnionej toksyczności u ludzi.

Podobnie, pobudzenie innego receptora pokrewnego TNF, zwanego receptorem Fas (FasR) może wyzwalać cytotoksyczność przez programowaną śmierć komórki w różnych rodzajach komórek zarówno nowotworowych jak i nie nowotworowych. Jednakże, wykazano że aktywacja FasR powoduje gwałtowną martwicę wątroby, wykluczając w ten sposób jego zastosowanie terapeutyczne u ludzi.

Ostatnio, zidentyfikowano inny receptor rodziny TNP zwany receptorem LT-β (LT-P-R) (Crowe i in., Science 264:707-10 (1994)). LT-(3-R wiąże heteromeryczne kompleksy limfotoksyny (LT-a/β), które obejmują podjednostki LT-α w połączeniu z innymi pokrewnymi TNF polipepitydami zwanymi limfotoksyną-β (LT-β). Te kompleksy LT-α/β są związane z błoną i większość wykazuje stechiometrię ΤΤ-α1/β2 (Browning i in.. Cell 72:847-56 (1993); Browning i in., J. Immunol., 154:33-46 (1995)).

Przez analogię do TNF-R i innych receptorów pokrewnych TNF, aktywacja sygnalizacji przez LT-z-R zachodzi gdy liczne receptory na powierzchni komórki są zbliżane do siebie (Cro_we i in., Science 264:707-10 (19994)). Proces ten określany jest jako grupowanie receptorów. Ligandy TNF i LT są multiwalentnymi kompleksami, które mogą wiązać się równocześnie z i w ten sposób grupować więcej niż jeden peeeptor. Grupowanie re_ceptorów jako sposób oktywaeji receptora w innych układach zostało dobrze udokumentowa^-)e, zwłaszcza dla receptorów działα-ąj^cch przez kinazy tyrozynowe (Ullrich i Schlsssieger, Cell 61:203-212 (1990); Ktjlamu i in.. Cel^p 74:17Ν83 (1993)^y Owiązując, pcdaeteligaedów υΤ-α1/β2 i/lub Czyneików aktywujących ΤΤ-β-R, które może powodować grupowanie i sygnaliści poniżib cząsteczek LT-P-R na powisczcłmi dccelowγ-h komóoek nowotworowych powinno być przydatne do bezpośredniego pobudzenia sriałau LT-P-R w tych komórkcch.

Scg_eal⁾Zacja^ec2ec L^p-R, taki jak TTNiF-R, może aktywować szlaki, które prowadzą do _cytotoksyczności i śmierci komórki w komórkach nowotworow^h. C_{o n}ąj_waż_ntejs2e, Ugandy LT-al ,φ2 nie w/iążą. TMP-R ze znαc2nγmpowieowαctwem. Z tego powodu kierowana aktywacja LT-p-R w komórkach nowotworowych po winna wyzwalać cγtotok_Syc2_ncść w tych

185 364 komórkach bez pobudzania szlaków zapalnych związanych z aktywacją TNF-R. Leczenie przy użyciu LT-a1/p2 i/lub innych czynników aktywujących LT-P-R powinno więc być przydatne do terapii albo zmniejszania postępu, ciężkości albo efektów komórek nowotworowych (nowotworzenie) przezwyciężając problemy związane z silnymi efektami ubocznymi, które napotyka się przy próbach leczenia przeciwnowotworowego aktywacją TNF-R albo FasR.

Niniejszy wynalazek rozwiązuje problemy związane z powyższym, przez dostarczenie kompozycji farmaceutycznych do leczenia albo zmniejszenia zaawansowania, ciężkości albo skutków powstawania nowotworu przez pobudzanie sygnalizacji przez LT-P-R, bez współpobudzania związanych z TNF-R reakcji zapalnych. Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna obejmująca skuteczną terapeutycznie ilość co najmniej jednego czynnika aktywującego LT-P-R będącego przeciwciałem anty-LT-P-R oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Korzystnie czynnik aktywujący LT-p-R jest przeciwciałem monoklonalnym (mAb). Korzystniej czynnik aktywujący LT-P-R jest przeciwciałem monoklonalnym antyLT-P-R wybranym z grupy składającej się z anty-LT-P-R mAb BKA11, CDH10, BCG6, BHA10, CBE11, AGH1 oraz BDA8. Najkorzystniej przeciwciałem monoklonalnym anty-LT-β-R jest CBE11. W korzystnym wykonaniu przeciwciało monoklonalne anty-LT-P-R jest przeciwciałem humanizowanym otrzymanym z przeciwciała wybranego z grupy składającej się z BKA11, CDH10, BCG6, BHA10, CBE11, AGHl oraz BDA8. Korzystniej przeciwciało monoklonalne anty-LT-P-R jest humanizowanym przeciwciałem otrzymanym z CBE11.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja obejmująca skuteczną terapeutycznie ilość co najmniej dwóch czynników aktywujących LT-P-R oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, przy czym co najmniej jeden czynnik aktywujący LT-P-R jest przeciwciałem antyLT-P-R. Korzystne przeciwciało anty-LT-P-R jest przeciwciałem monoklonalnym. Korzystniej , przeciwciałem monoklonalnym zawartym w kompozycji farmaceutycznej według wynalazku jest CBE11. Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku obejmuje co najmniej dwa czynniki aktywujące LT-P-R będące przeciwciałami monoklonalnymi anty-LTβ-R, skierowanymi przeciwko nie nakładającym się epitopom LT-P-R. Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku obejmuje jedno przeciwciało monoklonalne anty-LTβ-R wybranej grupy składającej się z AGH1 i BDA8, zaś drugie przeciwciało monoklonalne anty-LT-P-R jest wybranej z grupy składającej się z BCG6, BHA10, BKA11, CDH10 i CBE11. Korzystnie jedno przeciwciało monoklonalne anty-LT-P-R jest wybrane z grupy składającej się z BCG6 i BHA10, zaś drugie przeciwciało monoklonalne anty-LT-P-R jest wybrane z grupy składającej się z AGH1, BDA8, BKA11, CDH10 i CBE11. Korzystnie jedno przeciwciało monoklonalne anty-LT-P-R jest wybrane z grupy składającej się z BKA11 i CDH10, zaś drugie przeciwciało monoklonalne anty-LT-P-R jest wybrane z grupy składającej się z AGH1 i BDA8, BCG6, BHA1O, i CBE11. Korzystnie jedno przeciwciało monoklonalne anty-LT-P-R jest przeciwciałem CBE11, zaś drugie przeciwciało monoklonalne antyLT-P-R jest wybrane z grupy składającej się z AGH1, BDA8, BCG6, BHA10, BKA11, CDH10 i CBE11. Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku obejmuje przeciwciała monoklonalne anty-LT-P-R będące CBE11 i BHA10. Korzystnie przeciwciałami monoklonalnymi anty-LT-P-R sąCBE11 i CDH10. Korzystnie kompozycja farmaceutyczna według wynalazku obejmuje przeciwciała monoklonalne anty-LT-P-R, którymi są AGH1 i CDH10. Korzystniej gdy kompozycja farmaceutyczna według wynalazku obejmuje ponadto 1FN-y jako jeden z czynników aktywujących LT-P-R.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna do leczenia albo zmniejszenia zaawansowania, ciężkości albo skutków powstawania nowotworu obejmująca czynnik aktywujący LT-P-R będący skuteczną terapeutycznie ilością sieciowanych przeciwciał anty-LT-P-R, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Korzystnie sieciowano przeciwciała przeciwko LT-P-R są unieruchamiane kowalencyjnie albo niekowalencyjnie na powierzchni. Korzystnie sieciowane przeciwciała przeciwko LT-P-R są niekowalencynie agregowane w roztworze przy użyciu czynnika sieciującego przeciwciało anty-LT-P-R. Korzystniej czynnikiem sieciującym przeciwciało anty-LT-P-R jest przeciwciało wtórne skierowane przeciwko przeciwciału anty-LT-P-R. Korzystnie sieciowane przeciwciała przeciwko LT-P-R są kowalencynie agregowane w roztworze przy użyciu chemicznego czynnika sieciującego

185 364 przeciwciało anty-LT-P-R. W korzystnym wykonaniu kompozycja farmaceutyczna według wynalazku obejmuje IFN-γ jako drugi czynnik aktywujący lT-(-R.

Poniżej opisano również nowe sposoby przesiewowe do selekcjonowania czynników aktywujących LT-(-R, takich jak przeciwciała anty-LT-P-R, które działają w kombinacji z kompleksami heteromerycznymi LT-a/( wywołując śmierć komórki nowotworowej. Test wykorzystuje zwiększoną wrażliwość ludzkich komórek gruczolakoraka na kompleksy heteromeryczne LT-α/ρ w obecności czynników aktywujących LT-P-R w teście cytotoksyczności. Przykładowa procedura zastosowana do badania przypuszczalnych czynników aktywujących LT-P-R na przykładzie przeciwciał przeciwko LT-P-R obejmuje następujące etapy:

1) komórki nowotworowe (np. ludzkie komórki gruczolakoraka HT29) są hodowane przez kilka dni w pożywce zawierającej IFN-y i oczyszczone LT-al/p2 w obecności albo pod nieobecność konkretnych badanych Ab przeciwko LT-P-R;

2) komórki traktowane są barwnikiem barwiącym żywe komórki; i

3) obliczana jest liczba zabarwionych komórek w celu określenia frakcji komórek nowotworowych zabitych w obecności LT-a1/p2, IFN-y oraz badanego Ab przeciwko LT-P-R w każdej próbce. Alternatywnie, liczba komórek które przeżyły może być określona dowolnym spośród licznych dobrze znanych testów, które mierzą żywotność komórek, takich jak wbudowywanie ³H-tymidyny do dNa.

Przeciwciała anty-LT-P-R (albo ich kombinacja), które istotnie zwiększa procent komórek nowotworowych zabitych w tym teście, jest czynnikiem aktywującym LT-P-R znajdującym zastosowanie w kompozycjach farmaceutycznych według wynalazku. Ten test cytolityczny może być zaadaptowany w celu identyfikacji nowych czynników aktywujących LT-P-R, które działają w kombinacji z kompleksami heteromerycznymi LT-a/ β. Krótki opis rysunków

Figura 1A. Analiza wielkości oczyszczonych kompleksów heteromerycznych LT-a/P rozdzielonych przez chromatografię powinowactwa immunologicznego tNF-R i LT-P-R. Oczyszczone białka badano na żywicy TSK 3000 HPLC w roztworze soli buforowanym fosforanem. Pokazane jest położenie różnych znaczników wielkości.

Figura 1B. Analiza jonowymienna oczyszczonych postaci LT przy użyciu kolumny karboksymetylowej Poros (4,6 mm x 100 mm) na urządzeniu BioCad (Perceptive Biosystems) . 27 (ig każdej próbki białka wprowadzono do kolumny i eluowano w gradiencie od 0 do 1 M NaCl w 20 objętościach kolumny przy przepływie 5 ml/min w buforze zawierającym 16,66 (iM Hepes, 16,66 μΜ octanu sodu i 16,66 μΜ buforu Mes (pH 6,5).

Figura 2A. Porównanie aktywności cytotoksycznej: mAb CH-11 przeciwko receptorowi Fas (-·-); TNA (-<^-); LT_-a (-C-)_; i LF-^/CI (-♦^ _na koinórki lud_zki_e

Fruczolakoraka HT29 w obecności lub pod nieobecność 80 jedn./ml IFN)y.

Figura 2B. Porównanie zdolności 5 μg/ml ludzkiej IgG (-·-); rozpuszczalnego p60TNF-R-Fc (-©-)irozpuszezaldycnchim5r receolo^raLT-rjRIFc z immunoglobulinąl-El-) p6 haNowanic efek)Zwcμ-otμhμycsγy^chw Fer.2AwobeLności 80jedn./ml -FNlg, oowra 3. πrAbprhγciwkoLT-γ-R naoilają eWkicytsichs8Cznd LT-aI/p2 -wobec ludzkich ^mórek giFczolproraka ΗΤζΓ. (AR nfi^kly ąyroi-tycyneLT-(cl/'p2 wobec komórek. KTT29 -ąna-yFerbecnoμciąnyrbCHH(0 pAeeiwko cT-Pi^ESekty LT-α(Za2mjerzoFóbez ht(9 --•O i w obeono^óci 0,5 μ-/ηι1 Dantrohlych ^rgD 1 γ--)^, O,fP μί/ηΐ CD^w-// (jO-/ i 0^pP μ/ΑιΙ (-OHIO --ó/r/. cbc c0ą5/y oWoktycane LTiaa^-)β^L webec komórem ZCDH s^-hamowane o-oao noŚHiąmAb 13DA8 ριζι-πα^ LT·-^. Efekty LT-bP/βymiei·oμaw obeaFF)ai b pg/mł nochΌZloco IgD----•^i» mAb DBA8 jfe^ftyżwl^^ LT-( zR /□--. Rażniopwzazhzwaniu kmAbCDHIO i BDAZ p/zezi-ko DB-p-Rw tym-óŚLia s(£Rzwb wskRzówkę, w zaone skbesowwapcdciw0o róDcym rpijoaom LT-P-R.

Fż—zp 4.UnieruγhFm-onemAL pceRiwko LT-P-R są cytotoksyczne wobec ludzkich komórek gruczolakoraka HT29. (A) mAb przeciwko - LT-P-R wywierają bezpośredni wpływ cytoto0syó:yiy na komórkiHTb9 m-y sp zmna-chomione na powie)kcγhi. Płaty/pokóywanh -gGl (p· -), nμyb-yiekrwμaym przeciAOoniesaoyrBwaionema pawraec0pμn)u Pd-ygapowi hγwió·:chnibwsmuHT29/Zμa--),BDA8^^^u>i CFHSP -^□^-.

185 364 (B) Efekty samych rozpuszczalnych mAb przeciwko LT-P-R na wzrost komórek HT29. Symbole jak w (A). Te mAb przeciwko LT-P-R, w swej rozpuszczalnej postaci nie wykazują istotnego wpływu cytotoksycznego na komórki HT29 gdy podawane są osobno.

Figura 5. Reprezentatywne obliczenia wzmożonej cytotoksyczności wobec komórek nowotworowych przez traktowanie parami rozpuszczalnych mAb przeciwko LT-P-R. (A) Efekty cytotoksyczne wobec komórek HT29 kontrolnych IgGl (100 ng/ml), mAb BHA10 (100 ng/ml), mAb CBE11 (50 ng/ml), BHA10 (100 ng/ml) + IgG (100 ng/ml) i BHA10 (100 ng/ml) + CBE11 (50 ng/ml). IFN-y był obecny w stężeniu 80 jedn./ml. (B) Efekty cytotoksyczne wobec komórek HT29 kontrolnych IgGl (100 ng/ml), CDH10 (100 ng/ml), CBE11 (50 ng/ml), CDH10 (100 ng/ml) + IgGl (100 ng/ml) i CDH10 (100 ng/ml) + CBE11 (50 ng/ml). IFN-γ był obecny w stężeniu 80 jedn./ml. (C) Efekty cytotoksyczne wobec komórek HT29 kontrolnych IgGl (100 ng/ml), CDH10 (33 ng/ml), AGH1 (50 ng/ml), CDH10 (33 ng/ml) + AGH1 (50 ng/ml) na komórki HT29. IFN-y był obecny w stężeniu 80 jedn./ml. (D) Jak w (C) z takim wyjątkiem, że w teście cytolitycznym zastosowano ludzkie komórki gruczolakoraka WiDr (Raitano i Korc, J. Biol. Chem., 265:10466-472 (1990)).

Figura 6. Wielkość guza u myszy SCID leczonych mAb przeciwko LT-P-R. (A) Wielkość guzów ludzkiego gruczolakoraka WiDr u myszy SCID w 30 dni po zaszczepieniu, po leczeniu przeciwciałem. Myszy leczono w dniach 1 i 2 roztworem soli, samym IFN-y, mAb przeciwko LT-p-R (CBE11) z i/lub bez IFN-y i kontrolnym mAb przeciwko ludzkim LFA-3 (1E6) z IFN-y. Średnią dla każdej grupy zaznaczono kreską. Średnie, odchylania standardowe i liczba zwierząt (w nawiasach) dla pięciu grup od lewej do prawej wynosiły: 0,88±0,59 (14), 1,21±0,7 (21), 0,041±0,052 (16), 0,11±0,1 (12), 0,98±1,16 (12). (B) Wielkość guzów ludzkiego gruczolakoraka WiDr u myszy SCID od dnia 14 do 49 po wszczepieniu guza z leczeniem przeciwciałem w 15 dniu po wszczepieniu. Guzy hodowano do średniej wielkości 0,53 cm (0,076 cc) bez żadnego leczenia, po czym rozpoczęto wstrzyknięcia ip 15 dnia i kontynuowano jak zaznaczono strzałkami. Średnie i odchylenia standardowe są zaznaczone dla grup po 12 zwierząt leczonych samym IFN-y (1 x 10⁶jedn./wstrzyknięcie) (-□-); IFN-y i 50 pg mAb 1E6 przeciwko LFA-3 (-O-), IFN-y i 50 pg mAb CBE11 przeciwko LT-P-R (-Δ-) albo 50 pg mAb CBE11 przeciwko LT-P-R (nie pokazie).

W celu lepszego zrozumienia opisanego tu wynalazku, poniżej podano szczegółowy opis.

Określenie „aktywność przeciwnowotworowa” dotyczy zdolności substancji albo kompozycji do bukowania proliferacji albo do wywoływania śmierci komórek nowotworowych, które oddziaływają z tą sułjstanają albo kompozycją.

Określenie „apoptoza” dotyczy procesu programowanej śmierci komórki.

Określenie „aktywność cytOtoksyczna” dotyczy zdolności substancji albo kompozycji do wywoływania śmierci komórek, które oddziaływają z tą substancją albo kompozycją.

Określenie „epitop” (albo determinanta antygenowa) jest określone jako część cząsteczki, która wiąże się z pojedynczym miejscem w^tyzania antygenu na cząsteczce przeciwciała. Pojedynczy epitop jest rozpoznawany przez przeciwciało monoklonalne (mAb). Liczne epitopy sązwykle rozpoznawane przez przeciwciała poliZląnclne (Ab).

„Dymena Fc” przeciwciał oznacza część cząsteczki obe)mującą CH2, CH3 i region zawiasowy, ale pozbawioną miejsca wiązania antygenu.

Określenie „czynnik indukujący interferon” dotyczy dowolnego czynnika, który jest zdolny do bezpośredniego albo pośąedniego pcbudzoąⁱγ endogennego \pγtDarzania interferoniów typu I (UFN-c) IFN-P) atóo typu II (EFN-y). Przykłady czynników indukujących mterferon obejmują cząsteczki dDumctóDego RNA oraz liczne związki pocllodzenic roślinnego atóo farmaceutyząnego.

ORa^enia^uteina LT-α” oraz „muteina LT-β” dotyczą polipeptydów LT-α albo LTp posiadające^ j„dną )uó wiele ”miaz aminokwwe-pycdl w porąwnreąu o óekwencjamć aminolrwiaoavąjnjo Τ^^Αι^οΗ nnj'nwrlyr hdolipzptydów.

Oąrerlenic„czyndik hłat^jąc^ LT-P-R^otwczy dowolnego czynnika, który może wspomageó wiin^„jirliąίzldu y LT-c^, grppowćd-ieLT-β-Rąanowierkrąnt komórki ^lbe eygnaliaucje prązaLT-β-R,albo który moUeąąyawać we tP jak ay-ąpł LTch-R jost mterpre8

185 364 towany w komórce. Przykłady czynników aktywujących LT-P-R obejmują IFN-α, IFN-y, TNF, czynniki indukujące interferon, rozpuszczalne Ab przeciwko LT-P-R, sieciowane Ab przeciwko LT-P-R oraz multiwalentne Ab przeciwko LT-P-R.

Określenie „sygnalizacja przez LT-P-R” dotyczy wszystkich reakcji cząsteczkowych związanych ze szlakiem LT-P-R i następujących po nich reakcji cząsteczkowych, które z nich wynikają

Określenie „przeciwciało przeciwko receptorowi LT-P” (Ab przeciwko LT-P-R) dotyczy dowolnego przeciwciała, które rozpoznaje i wiąże się z przynajmniej jednym epitopem receptora LT-P-R.

Określenie „przeciwciało monoklonalne przeciwko receptorowi LT-P” (mAb przeciwko LT-P-R) dotyczy dowolnego przeciwciała monoklonalnego, które rozpoznaje i wiąże się z pojedynczym epitopem LT-P-R.

Określenie „sieciowane (m)Ab przeciwko LT-P-R” dotyczy przeciwciał skierowanych przeciwko LT-P-R, które sieciowano ze sobą w postaci aglomeratów przeciwciał w roztworze przy użyciu czynnika sieciującego przeciwciało (Ab) albo (mAb) przeciwko LT-P-R, albo które unieruchomiono w niewielkiej odległości jedne od drugiego na powierzchni albo matrycy.

Określenie „czynnik sieciujący Ab (albo mAb) przeciwko LT-P-R” dotyczy dowolnego czynnika, który może agregować kowalencyjnie albo nie kowalencyjnie Ab przeciwko LT-PR w roztworze, w taki sposób, że Ab mogą wiązać się z, albo nasilać grupowanie receptora LT-P na powierzchni komórki docelowej. Takie czynniki sieciujące obejmują, choć nie są ograniczone do czynników sieciujących chemicznie, przeciwciał wtórnych, które reagują z częściami Ab albo mAb przeciwko LT-P-R, oraz rozpuszczalne, albo związane z powierzchnią receptory Fc, endogenne albo dodane egzogennie, które mogą wiązać się z Ab przeciwko LT-P-R.

Określenia „aktywność biologiczna LT-α”, „aktywność biologiczna LT-P” i „aktywność biologiczna LT-a/P” są określone jako: 1) immunologiczna aktywność krzyżowa z przeciwciałem skierowanym przeciwko przynajmniej jednemu epitopowi natywnej podjednostki albo kompleksowi podjednostek; albo 2) zdolność podjednostki LT albo kompleksu podjednostek do współzawodnictwa o miejsca wiązania ligandu na receptorach swoistych wobec LT, taki jak TNF-R albo LT-P-R; albo 3) posiadanie zdolności do pobudzania ilościowego odpowiedzi regulującej odporność albo aktywności cytotoksycznej wspólnie z natywną podjednostką albo kompleksem LT.

Określenie „kompleks heteromeryczny LT-a/P” dotyczy stabilnego połączenia pomiędzy przynajmniej jednąpodjedtaostką LT-α oraz więcej niż jedną podjednostką LT-P. Podjednostki mogą się łączyć przez oddziaływanie elektrostatyczne, van der Waals'a albo kowalencyjne. Korzystnie kompleks heteromeryczny LT-a/P ma przynajmniej dwie sąsiadujące podjednostki LT-P i nie ma sąsiadujących podjednostek LT-α. Korzystniej, kompleks wykazuje stechiometrię LT-al/P2.

Określenie „ligand multiwalentny” dotyczy cząsteczki albo kompleksu, który ma więcej niż jedno miejsce wiązania receptora, i który jest zdolny do równoczesnego wiązania i zbliżania przynajmniej dwóch cząsteczek receptora.

„Sekwencja liderowa typu I” oznacza N-końcową część białka eukariotycznego, która służy jako sygnał kierujący białko do błony siateczki śródplazmatycznej (ER) oraz zwykle przez cały szlak wydzielniczy. Sekwencja liderowa jest zwykle odcinana przez peptydazę sygnałową w błonie ER.

„Sekwencja sygnałowa” stanowi funkcjonalny równoważnik eukariotycznej sekwencji liderowej typu I u gospodarza prokariotycznego i kieruje przenoszeniem białek do i przez błonę lipidową bakterii.

„Rozpuszczalny kompleks heteromeryczny LT-a/P” oznacza heteromeryczny kompleks LT-a/P obejmujący rozpuszczalne podjednostki LT-P, w których sekwencje aminokwasowe, które umiejscawiają polipeptyd w błonie zostały usunięte albo inaktywowane, czyniąc podjednostkę LT-a/P rozpuszczalną. Rozpuszczalne kompleksy heteromeryczne LT-a/P mogą być wydzielane przez odpowiednią komórkę gospodarza, która została zaprojektowana do ekspresji obu podjednostek.

185 364 „Powierzchniowy kompleks LT-α/ρ” oznacza kompleks obejmujący LT-α i podjednostki LT-P związane z błoną, który jest eksponowany na powierzchni komórki.

Wytwarzanie kompleksów LT-α/ρ związanych z błoną

Kompleksy limfotoksyny związane z powierzchnią komórki stwierdzono w komórkach hybrydoma CD4+ (1I-23.D7), które ekspresjonują znaczne ilości LT (Browning i in., J. Immunol., ”47:1230-37 (1991); Androlewicz i in., J. Biol. Chem., 267:2542-47 (1992)). Dojrzała LT-α pozbawiona jest domeny śródbłonowej i jest zlokalizowana na powierzchni komórki dzięki oddziaływaniu z przynajmniej jedną podjednostką LT-β związaną z błoną. Związane z błoną (powierzchniowe) kompleksy LT-α/ρ wykazuj ą przede wszystkim stechiometrię LT-al/p2.

LT-P jako białko związane z błoną wiąże LT-α podczas syntezy, ukierunkowując w ten sposób LT-α na błonę komórkową. Pod nieobecność LT-P, LT-α jest wydzielana do przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Podjednostki LT łączą się zwykle w kompleksy wewnątrz komórki przed eksportem do błony. Gdy podjednostki LT-P są umieszczone w błonie, nie tworzą stabilnych kompleksów z wydzielaną LT. Stąd, jeżeli pożądana jest postać heteromerycznych kompleksów LT-o/P związanych z błoną, korzystna jest równoczesna ekspresja podjednostek LT-α i LT-P w tej samej komórce.

Powierzchniowy kompleks heteromeryczny LT-o/P może być rekonstruowany przez równoczesną transfekcję komórek gospodarza genami LT-α i LT-P. Powierzchniowe kompleksy LT nie są obserwowane w stabilnych liniach komórkowych, które ekspres jonują któryś z genów LT. Jednakże, jeżeli komórka gospodarza wytwarza normalnie znaczne ilości LTa (np. RPMI 1788; patrz niżej), transfekcja genem LT-P, który koduje pożądany polipeptyd LT-P powinna wystarczyć do powstawania kompleksów LT-o/P obejmujących podjednostki LT-α pełnej długości.

Równoczesna ekspresja polipeptydów LT-α i LT-P w wielu eukariotycznych układach ekspresji prowadzi do ich łączenia się i eksportu jako aktywny ligand (Crowe i in., J. Immunol. Meth., 1618:79-89 (1994)). Układy gospodarza, które mogą być zastosowane ob ejmują, choć nie są ograniczone do komórek CHO, COS, limfocytów B w tym szpiczaków, komórek owadzich zakażonych bakulowirusem i drożdży.

Podjednostką LT-α kompleksów heteromerycznych LT-o/P może być wybraną spośród limfotoksyny a, natywnej ludzkiej albo zwierzęcej limfotoksyny a, rekombinowanej limfotoksyny a, rozpuszczalnej limfotoksyny a, wydzielanej limfotoksyny a, mutein limfotoksyny a wykazujących aktywność biologiczną LT-α albo fragmentów którejkolwiek z limfotoksyn a wymienionych wyżej wykazujących aktywność biologiczną LT-a.

Polipeptyd LT-α może być dowolną rozpuszczalną postacią cząsteczki, w tym jej aktywnymi fragmentami, które mogą być wytwarzane w eukariotycznych układach ekspresji, w których odcięto naturalną sekwencję liderową LT-α. Alternatywnie, mogą być zastosowane fuzje dojrzałej sekwencji LT-α z heterologiczną sekwencją sygnałową, w celu maksymalizacji wydzielania LT-α w innych układach gospodarza. Sekwencje sygnałowe wybierane są w oparciu o zamierzoną komórkę gospodarza i mogą obejmować sekwencje bakteryjne, drożdżowe, ssacze i wirusowe. Natywny sygnał albo sekwencja sygnałowa cząsteczki adhezyjnej komórek naczyniowych-1 (VCAM-1) jest przydatna do zastosowania w ssaczych układach ekspresji.

Polipeptydy LT-α mogą być również poddawane fuzji z polipeptydami o przedłużonym okresie półtrwania w osoczu, takimi jak łańcuchy immunoglobulin albo ich fragmenty. Białka osocza, które mogą być zastosowane do wydłużania okresu półtrwania w osoczu obejmują albuminę osocza, immunoglobuliny, apoliporoteiny i transferynę. Przyłączeni poliglikolu etylenowego (PEG) może stabilizować polipeptyd i zmniejszać jego immunogenność. Korzystnie białko fuzyjne LT-α nie jest w istotny sposób immunogenne dla leczonego osobnika zaś białko osoczowe nie wywołuje niepożądanych efektów ubocznych u osobnika z powodu swej normalnej aktywności biologicznej.

Ludzka LT-4 jest glikozylowana na resztach N i O, i zależnie od źródła wykazuje istotną mikroheterogenność spowodowaną cukrami. Kompozycja oligosacharydów konkretnej LT-α wybranej do tworzenia kompleksów LT może wpływać na wielkość klirensu in vivo

185 364 (Fukushima i in., Arch. Biochem. Biophys., 304:144-53 (1993)). Ponieważ odmiany glikozylacji mogą być spowodowane ekspresją w różnych komórkach gospodarza jest to jeden z czynników, które należy rozważyć przy wyborze źródła LT-a.

LT-α może być oczyszczona z linii limfoblastów B RPMI1788, które konstytutywnie wydzielają LT-α, i które można pobudzić do wydzielania znacznych ilości przez działanie estrem forbolu PMA (Aggarwal i in., J. Biol. Chem., 259:686-91 (1984)). Alternatywnie, klonowany gen ludzkiej LT-α może być zastosowany do rekombinacyjnego wytwarzania polipeptydów LT-α w różnych układach gospodarza, w tym bakterii (Schoenfeld i in., J. Biol. Chem., 266:3863-69 (1991)); komórek owadów zakażonych bakulowirusem (Crowe i in., J. Immunol. Meth., 168:79-89 (1994)) i komórek ssaków (Browning i Ribolini, J. Imunol., 143:1859-67 (1989); Fukushima i in., Arch. Biochem. Biophys., 304:144-53 (1993)).

Fragmenty genu LT-α, które kodują fragmenty polipeptydy wykazującego aktywność biologiczną LT-α mogą być badane przy użyciu rutynowych testów przesiewowych. Przydatne testy przesiewowe w kierunku aktywności biologicznej LT-α obejmująkompetycyjne testy zahamowania z natywną LT-α związaną TNF-R albo mierzenie bezpośrednie albo pośrednie przez zahamowanie zdolności LT-α. do wywoływania cytotoksyczności komórek nowotworowych w testach znanych w stanie techniki. Korzystnie, fragmenty LT-α są łączone w kompleksy heteromeryczne z LT-P, po czym kompleksy badane są na aktywność biologiczną LT-o/P przez kompetycyjne zahamowanie z LT-o/P związanym z LT-P-R, albo na ich zdolność do wywoływania cytotoksyczności w opisanych tu testach.

Limfotoksyna-p określana również jako p33 została stwierdzona na powierzchni limfocytów T, linii limfocytów T, linii limfocytów B i komórek niszczących aktywowanych limfokiną. LT-P jest przedmiotem równoległego zgłoszenia międzynarodowego PCTUS91/04588, opublikowanego 9.01.1992 jako WO 92/00329; oraz PCT/US93/11669, opublikowanego 23.06.1994 jako WO 94/13808, które zamieszczono tu jako odnośniki.

Gen LT-P koduje polipeptyd o 240-244 aminokwasach (Browning i in., Celi 72:847-56 (1993)). LT-P jest białkiem błonowym typu II o krótkiej cytoplazmatycznej domenie Nkońcowej, po której następuje domena kotwicząca w błonie o 30 aminokwasach hydrofobowych. Posiada ona pojedyncze miejsce N-glikozylacji i ma tylko jedną resztę cysternową, która nie wydaje się być związana z tworzeniem wiązania dwusiarczkowego pomiędzy podjednostkami.

Podjednostki LT-P tworzące kompleksy heteromeryczne LT-o/P mogą być wybrane spośród limfotoksyny P, natywnej ludzkiej albo zwierzęcej limfotoksyny p, rekombinowanej limfotoksyny p, rozpuszczalnej limfotoksyny p, wydzielanej limfotoksyny P, mutein limfotoksyny p wykazujących aktywność biologiczną LT-P albo fragmentów dowolnej z powyższych limfotoksyn p wykazujących aktywność biologiczną LT-P.

Jak to dyskutowano powyżej w przypadku polipeptydów LT-α, polipeptydy LT-P mogą być również modyfikowane w celu zwiększenia ich rozpuszczalności albo okresu półtrwania w osoczu, przy użyciu tych samych metod. Podobnie, fragmenty genu LT-P, które kodują fragmentu polipeptydu wykazujące aktywność biologiczną LT-P mogą być badane przy użyciu rutynowych testów przesiewowych jak to dyskutowano w przypadku LT-<o.

Wytwarzanie kompleksów rozpuszczalnych

Rozpuszczalne (nie związane z błoną) kompleksy heteromeryczne LT-o/P obejmują podjednostki LT-o/P, które zostały zmienione z postaci związanej z błoną w rozpuszczalne. Kompleksy te są opisane szczegółowo w równoległym zgłoszeniu międzynarodowym (PCT/US93/11669, opublikowane 9.01.1992 jako WO 94/13808). Rozpuszczalne peptydy LT-P określone są sekwencją aminokwasową limfotoksyny p, której sekwencja jest przecięta w dowolnym miejscu pomiędzy końcem regionu śródbłonowego (tj. około aminokwasu 44) i pierwszym regionem homologii z TNF (tj. około aminokwasu 88) w oparciu o układ numeracji (Browning i in., Celi 72:847-56 (1993)).

Rozpuszczalne polipeptydy LT-P mogą być wytwarzane przez skracanie końca N LT-P w celu usunięcia ogona cytoplazmatycznego i regionu śródbłonowego (Crowe i in., Science 264:707-710 (1994)). Alternatywnie, domena śródbłonowa może być inaktywowana przez usunięcie albo zastąpienie normalnych reszt aminokwasowych hydrofobowych tworzących

185 364 domenę śródbłonową, przez reszty hydrofitowe. W obu przypadkach tworzony jest istotnie hydrofilowy profil hydropatyczny, który zmniejsza powinowactwo lipidowe i zwiększa rozpuszczalność w wodzie. Usunięcie domeny śródbłonowej jest korzystniejsze niż zastąpienie hydrofilowymi resztami amino kwasowymi ponieważ zapobiega wprowadzaniu potencjalnie immunogennych epitopów.

Usunięta albo inaktywowana domena śródbłonową może być zastąpiona przez, albo przyłączona do sekwencji liderowej typu 1 (np. sekwencją liderową VCAM-1) w taki sposób, że wydzielane białko ma sekwencję rozpoczynającą się w dowolnym miejscu pomiędzy Val 40 a Pro 88. Rozpuszczalne polipeptydy LT-β mogą zawierać na końcu N dowolną liczbę spośród dobrze znanych sekwencji liderowych. Sekwencja taka powinna umożliwić ekspresję peptydów i skierowanie ich na szlak wydzielniczy w układzie eukariotycznym. Patrz np. Ernst i in., patent USA nr 5,082,783 (1992).

Rozpuszczalne kompleksy heteromeryczne LT-α/β mogą być wytwarzane przez równoczesną transfekcję odpowiedniej komórki gospodarza DNA kodującym LT-α i rozpuszczalną LT-β (Crowe i in., J. Immunol. Meth., 168:79-89 (1994)). Rozpuszczalna LT-β wydzielana pod nieobecność LT-α jest w znacznym stopniu oligomeryczna. Jednakże, podczas równoczesnej ekspresji z LT-α tworzone są trimeryczne struktury 70 kDa, które zwierają oba białka. Możliwe jest również wytwarzanie rozpuszczalnych kompleksów heteromerycznych LT-al/p2 przez transfekowanie linii komórkowej, która normalnie ekspresjonuje LT-α (takiej jak omawiana wyżej linia RPM1 1788) genem kodującym rozpuszczalny polipeptyd LT-β.

Polipeptydy LT-α i LT-β mogą być syntetyzowane osobno, denaturowane przy użyciu łagodnych detergentów, mieszane ze sobą i renaturowane przez usunięcie detergentu tworząc mieszane kompleksy heteromeryczne LT, które mogą być rozdzielane (patrz niżej).

Oczyszczanie kompleksów LT-α 1/(32

Rozpuszczalne kompleksy heteromeryczne LT-al/p2 są oddzielane od równocześnie ekspresjonowanych kompleksów wykazujących inną stechiometrię podjednostek przez chromatografię z użyciem receptorów TNF i LT-β jako reagentów oczyszczania przez powinowactwo. Receptory TNF wiążąjedynie połączenie a/a kompleksów LT. Receptor LT-β wiąże z wysokim powinowactwem połączenia β/β i z mniejszym powinowactwem połączenia a/β heteromerycznych kompleksów LT-α/β. Nawiązując, LT-a3 i LT-a2/pi wiążą -się z TNF-R. LT-P-R może również wiązać trimery LT-al/p2 (przez połączenia a/β) ale nie - może wiązać LT-a3. Oprócz tego LT-P-R (ale nie TNF-R) wiąże LT-al/p2 i LT-βn (nie jest znany dokładny skład takich preparatów, jednakże są one dużymi agregatami).

Reagenty powinowactwa z receptorem mogą być wytwarzane jako rozpuszczalna domena zewnątrzkomórkowa (Loetscher i in., J. Biol. Chem., 266:18324-29 (1991)) albo jako białka chimeryczne, w których zewnątrzkomórkową domena wiążąca ligand połączona jest z domenąFc immunoglobuliny (Loetscher i in., J. Biol. Chem., 266:18324-29 (1991); Crowe i in., Science 264:707-10 (1994)). Receptory są związane z matrycami powinowactwa sieciowaniem chemicznym przy użyciu rutynowych procedur.

Istnieją dwa schematy, w których ligand LT-al/p2 może być oczyszczony przy użyciu chromatografii powinowactwa immunologicznego i receptorowego. W pierwszym schemacie nadsącz z odpowiedniego układu ekspresyjnego równocześnie ekspresjonującego LT-a i okrojoną postać LT-β jest przepuszczany przez kolumnę TNF-R. TNF-R wiąże LT-a3 i trimery LT-a2/p1. Kolumnę tNf-R powinny opuszczać LT-P(n) i LT-(xl/p2.

W drugim schemacie wszystkie postaci zawierające LT-β (LT-P(n), LT-al/p2 i LT-a2/p1) są wiązane i eluowane z kolumny LT-P-R przy użyciu klasycznych metod takich jak zastosowanie substancji chaotropowej albo zmiany pH (kolumnę opuszcza LT-a3). Eluat jest neutralizowany albo substancja chaotropowa jest usuwana zaś eluat jest przepuszczany przez kolumnę TNF-R, która wiąże wyłącznie trimery LT-a2/p1. Kolumnę powinny opuszczać LT-P(n) i trimery LT-al/p2.

W obu przypadkach czyste trimery LT-al/(32 mogą być oddzielone od LT-β kolejną filtracją żelową i/lub chromatografią jonowymiennąznanąw stanie techniki.

Alternatywnie, różne postacie kompleksów heteromerycznych LT-α/β mogą być oddzielane i oczyszczane różnymi znanymi sposobami chromatografii. Może być również

185 364 kc(2γste- połączenie szeregu konwencjonalnych schematów oczyszczania z jednym etapem oczyszczania przez powinowactwo immunologiczne opisanym wyżej.

Źródło przeciwciał przeciwko LT-P-R

Surowice pcliklceαlne skierowane β(z-ctwkc ludzkiemu receptorowi LT-β wytwarzane są przy użyciu technik konwencjonalnych przez wstrzyknięcie podskórne zwierzętom takim jak kozy, króliki albo myszy, białka fuzyjnego ludzkiego receptora LT-p-Fc (przykład 2) w kompletnym aótuwanci- Freunda, a następnie przez dootrzewnowe albo podskórne wstrzyknięcie przypominające w kompletnym aóiuwαecte Freunda. Surowice poliklonalne zawierające pożądane przeciwciała, które są skierowane przeciwko receptorowi LT-β przesiewane są standardowymi procedurami.

Mysie przeciwciała monoklonalee (mAB) skierowane przeciwko białku fuzyjnemu ludzkiego receptora LT-p-Fc wytwarzane są przez powtarzaną immunizację dootrzewnową myszy RBF białkiem fuzyjnym receptora LT-p-Fc (LT-p-R-Fc) uzyskanym z rekcmbieowαnych komórek CHO, związanym z perełkami sepharozy-białka A bez dodatku adwentu. Zwierzętom podaje się końcową dawkę przypominającą rozpuszczalnego LT-p-R-Fc (ip i iv), splenocyty poddaje się fuzji stosując klasyczne protokoły po czym hybrydoma przesiewa się testem ELISA (Ling i in., J. Iete(feroe and Cytokine Res., 15:53-59 (1995)). Hybrydoma przesiewane są dalej pod kątem ich zdolności do blokowania wiązania aktywowanych komórek hybrydoma H-23, które ekspresjonują βcwi-rzchetowe LT-al/p2, z płytkami pokrytymi LT-P-R-Fc, w teście panningu komórek. Czyste mAb są wytwarzane przez oczyszczanie IgG z nadsączy hybrydoma na sepharozie-białku A.

Różne postaci przeciwciał przeciwko LT-p-R mogą być również wytwarzane przy użyciu standardowych technik rekombinacji DNA (Winter i Milstein, Nature 349:293-99 (1991)). Przykładowo, mogą być konstruowane przeciwciała „chimeryczne”, w których domena wiążąca antygen przeciwciała zwierzęcego połączona jest z ludzką domeną stałą (Cabilly i in., US 4,816,567; Morrison i in.. Proc. Natl. Acad. Aci. USA 81:6851-55 (1984)). Przeciwciała chimeryczne zmniejszają obserwowane reakcje odpornościowe wywołane przez przeciwciała zwierzęce zastosowane w badaniach klinicznych na ludziach.

Oprócz tego, mogą być wytwarzane (ekcmbiecwαee „przeciwciała humanizowane”, które rozpoznają LT-p-R. Przeciwciała humanizowane są chimerami obejmującymi większość sekwencji ludzkiej IgG, do której wprowadzono region odpowiedzialny za swoiste wiązanie z antygenem (np. WO 94/04679). Zwierzęta immunizuje się pożądanym antygenem, izoluje się odpowiednie przeciwciała, po czym usuwa się część sekwencji regionu zmiennego odpowiedzialnych za swoiste wiązanie antygenu. Następnie klonuje się uzyskane od zwierzęcia regiony wiążące antygen w odpowiednie położenie genów przeciwciała ludzkiego, w których usunięto regiony wiążące antygen. Przeciwciała humanizowane minimalizują zastosowanie sekwencji heterclcgicznyeh (międzygatunkowych) w przeciwciałach ludzkich i zmniejszają prawdopodobieństwo wywołania odpowiedzi odpornościowej u leczonych osobników. Konstruowanie różnych klas (ekombteowtnγch przeciwciał przeciwko LT-p-R może być również uzyskane przez wytwarzanie przeciwciał chimerycznych albo humanizowanych obejmujących domeny zmienne przeciwko LT-p-R i ludzkie domeny stałe (CHI, CH2, CH3) izolowane z różnych klas tmmuecglobulie.

Przykładowo, przeciwciała IgM p(z-eiwkc LT-p-R o zwiększonej liczbie miejsc wiążących antygen mogą być wytwarzane (ekombtnαcyjete przez klonowanie miejsca wiążącego antygen do wektorów niosących regiony stałe ludzkiego łańcucha μ. (Arulandama i in., J. Exp. Med., 177:1439-50 (1993); Lane i in., Eur. J. Immunol., 22:2573-78 (1993);

Traunecker i in., Nature 339:68-70 (1989)).

Oprócz tego, standardowe techniki rekombinacji DNA mogą być zastosowane w celu zmiany powinowactwa wiązanie rekombtecwaeych przeciwciał z ich antygenami przez zmianę reszt amtnokwascwγch w obrębie miejsca wiążącego antygen. Powinowactwo wiązania antygenu humanizowanego przeciwciała może być zwiększone przez mutagenezę opartą na modelowaniu cząsteczkowym (Queen i in.. Proc. Natl. Acad. Aci. USA 86:10029-33 (1989)).

Może być pożądane zwiększenie albo zmniejszenie powinowactwa Ab przeciwko LT-βR do LT-p-R zależnie od rodzaju dccelonęj tkanki albo przewidywanego schematu leczenia.

185 364

Przykładowo, może być korzystne leczenia pacjenta stałym poziomem Ab przeciwko LT-p-R o zmniejszonej zdolności do sygnalizacji szlakiem LT-β w leczeniu półprofilaktycznym.

Podobnie Ab przeciwko LT-f-R o zwiększonym powinowactwie do LT-p-R może być korzystne w krótkotrwałym leczeniu przeciwnowotworowym.

Przesiewanie przeciwciał przeciwko LT-P-R w kierunku czynników aktywujących LT^-R

Przeciwciała przeciwko LT^-R mogą nasilać aktywność przeciwnowotworową kompleksów heteromerycznych LT-a/β (korzystnie LT-al/^2) w obecności czynników aktywujących LT-P-R takich jak IFN-y. Przeciwciała te są również określane jako czynniki aktywujące LT-β-β.. Przeciwciała, które działają jako czynniki aktywujące LT-β-β wybrane są w następujący sposób:

1) w szeregu studzienek hodowlanych są hodowane komórki nowotworowe takie jak komórki HT29 przez 3-4 dni w pożywce zawierającej czynnik aktywujący υΓ-β-R taki jak IFN-y i czyszczone kompleksy heteromeryczne LT-a/β, korzystnie LT-al^2, w obecności lub pod nieobecność kolejnych rozcieńczeń badanych Ab przeciwko LT-(LR;

2) do mieszaniny komórek dodawany jest barwnik mierzący czynność mitochondrialną taki jak MTT i poddawane reakcji przez szereg godzin;

3) gęstość optyczną mieszaniny w każdej ze studzienek mierzy się przy długości fali 550 nm (OD 550). OD 550 jest odwrotnie proporcjonalna do liczby komórek nowotworowych zabitych w obecności kompleksów heteromerycznych LT-a/β, czynnika aktywującego LT^-R i badanego Ab przeciwko LT^-R w każdej studzience.

Korzystne przeciwciała, które działają indywidualnie jako czynniki aktywujące LT^-R w obecności LT-al^2 i IFN-y obejmują mAb BKA11, CDH10, BHA10 i BCG6 (tabela 2, niżej).

Sieciowanie przeciwciał przeciwko LT-P-R

Sieciowane przeciwciała przeciwko LT-l-R działają pojedynczo jako czynniki aktywujące LT-P-R bez egzogennych kompleksów heteromerycznych LT-a/β w obecności drugiego czynnika aktywującego LT^-R takiego jak INF-y. Sieciowane Ab przeciwko LT^-R wiążą i wywołują grupowanie powierzchniowych receptorów LT-β, aktywując w ten sposób ukierunkowaną śmierć komórki wywołaną receptorem LT-β.

W jednym wykonaniu, jeden lub wiele rodzajów przeciwciał przeciwko LT^-R jest sieciowanych przez unieruchomienie na matrycy nierozpuszczalnej w wodzie albo na powierzchni. Derywatyzacja czynnikiem bifunkcjonalnym jest przydatna do sieciowania przeciwciał z nierozpuszczalną w wodzie matrycą albo powierzchnią. Czynniki powszechnie stosowane do wywołania sieciowania przeciwciał z nierozpuszczalną w wodzie matrycą albo powierzchnią, obejmują i,1bis(-dijzocetylo)-2-fenyloetan, glutaraldehyd, estry N-hydroksysukcynamidu w tym estry z kwasem 4-azydosalicylowym, imidoestry homobifunkcjonalne obejmujące estry disukcynymidylowe i maleimidy bifunkcjonalne takie jak bis-N-maleimidoL8-ok.tan. Czynniki derywatyzujące takie jak metylo-3-[(p-azydofenylo)ditio]propioimidan tworzą fotoaktywowane związki pośrednie, które mogą być wybiórczo sieciowane po stymulacji światłem. W celu unieruchomienia i sieciowania białka mogą być również zastosowane aktywne nierozpuszczalne w wodzie matryce takie jak węglowodany aktywowane bromkiem cyjanu i substraty opisane w opisach patentowych USA nr 3,959,080; 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; 4,055,635; 4,330,440.

Powierzchnie, do których przyłączane są przeciwciała mogą być polimerem nie białkowym , zwykle hydrofitowym polimerem pochodzącym ze źródeł naturalnych albo syntetycznych. Mogą być zastosowane hydrofitowe polimery poliwinylowe takie jak polialkohol winylowy (PVA) i poliwinylopirolidon (PVP). Przydatne są również etery polialkilenowe takie jak poliglikol etylenowy, poliglikol propylenowy, poliester oksyetylenowy albo metoksypoliglikol etylenowy, polioksyalkileny takie jak polioksyetylen i polioksypropylen, oraz kopolimery blokowe polioksyetylenu i polioksypropylenu (plurony); polimetyloakrylany; karbomery; polisacharydy rozgałęzione i nie rozgałęzione obejmujące monomery sacharydowe D-mannozy, Di L-galaktozy, fukozy, fruktozy, D-ksylozy, L-arabinozy, kwasu D-glukuronowego, kwasu stalowego, kwasu D-galaktouronowego, D-mannuronowego (np. polikwas mannuronowy albo

185 364 alginowy), D-glukozaminy, D-galaktozaminy, D-glukozy i kwasu neuraminowego w tym homopolisacharydy i heteropolisacharydy takie jak laktoza, amylopektyna, skrobia, skrobia hydroksyetylowana, amyloza, siarczan dekstranu, dekstran, dekstryny, glikogen albo podjednostki polisacharydowe kwaśnych mukopolisacharydów, np. kwas hialuronowy; polimery alkoholi cukrów takie jak polisorbitol i polimannitol; oraz heparynę albo heparon.

Polimer przed sieciowaniem jest korzystnie rozpuszczalny w wodzie i korzystnie zawiera wyłącznie pojedyncze aktywne grupy chemiczne, w celu uniknięcia zjawiska wielokrotnego sieciowania z przeciwciałem. W każdym przypadku, warunki reakcji powinny być optymalizowane w celu zmniejszania sieciowania oraz odzyskiwania produktów, bezpośrednio albo przez kolejny etap filtracji żelowej albo chromatografii, zachowując zasadniczo homogenny zakres ciężaru cząsteczkowego. Optymalny ciężar cząsteczkowy przeciwciała sieciowanego z matrycą może być określony w rutynowych doświadczeniach z użyciem opisanych tu testów cytotoksyczności i wiązania receptora.

Koniugat końcowy po sieciowaniu jest korzystnie rozpuszczalny w płynach fizjologicznych takich jak krew. Polimer nie może być wysoce immunogenny w postaci koniugatu i powinien mieć lepkość dopuszczalną do wlewów albo wstrzyknięć dożylnych, jeżeli jest to zamierzona droga podawania.

Polimer może być również nie rozpuszczalny w wodzie. Substancje, które mogą być zastosowane obejmują żele hydrofilowe albo ukształtowane przedmioty posiadające powierzchnię, na których mogą być unieruchamiane przeciwciała, takie jak cewniki chirurgiczne, katetery albo dreny. Korzystne jest zastosowanie podłoży stałych, które są biokompatybilne i zasadniczo obojętne w środowisku fizjologicznym. Substancja jest biokompatybilna jeżeli nie wywołuje istotnej odpowiedzi odpornościowej obejmującej stan zapalny albo przyciąganie fiOro0lastów po umieszczeniu jej w ciele osobnika.

Przeciwciała anty-LT-P-R mogą być również unieruchamiane na podłożach, które zostały pokryte kowalencyjnie albo nie kowalencyjnie przeciwciałami wtórnymi, które wiążą pierwotne przeciwciało anty-LT-P-R (np. kozie przeciwciała przeciwko mysim IgG; patrz przykład 7). Każde mAb anty-LT-P-R badane pojedynczo po unieruchomieniu na powierzchni przez przeciwciała wtórne działa jako czynnik aktywujący LT-P-R w obecności IFN-y (figura 4 i 7).

W alternatywnym wykonaniu Ab anty-LT-P-R sieciowano w roztworze działają jako czynniki aktywujące LT-P-R. Ab przeciwko LT-P-R mogą być sieciowane przy użyciu środków sieciujących Ab (albo mAb) przeciwko LT-P-R. Czynnik sieciujący Ab (albo mAb) przeciwko LT-P-R jest dowolnym czynnikiem zdolnym do wiązania kowalencyjnego albo agregowania nie kowalencyjnego Ab (albo mAb) przeciwko LT-P-R w roztworze w taki sposób, że sieciowano Ab (albo mAb) przeciwko LT-P-R mogą wiązać i nasilać grupowanie powierzchniowych LT-P-R na komórce docelowej. Takie czynniki sieciujące Ab (albo mAb) przeciwko LT-P-R obejmują choć nie są ograniczone do reagentów sieciujących chemicznie, które mogą wchodzić w reakcję z przeciwciałami w sposób kontrolowany, jak to opisano wyżej. Alternatywnie, w celu wytworzenia w roztworze aglomeratów Ab przeciwko LT-P-R mogą być zastosowane przeciwciała wtórne, sepharoza A, receptory Fc albo inne czynniki, które wiążą i agregują liczne pierwotne Ab przeciwko LT-P-R bez blokowania ich aktywności. Liczne Ab przeciwko LT-P-R w roztworze dziakyąjako czynniki aktywujące LT-P-R.

Przedmiotem wynalazku są kompozycje obejmujące liczne Ab anty-LT-P-R w roztworze, które dziaiąjąjako czynniki aktywujące LT-P-R przez nasilanie grupowania powierzchniowych LT-P-R. Mogą być zastosowane poliklonalne Ab przeciwko LT-P-R skierowane przeciwko różnym epitopom LT-P-R. Korzystnie, Ab przeciwko LT-P-R są przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciwko różnym i nie nakładającym się epitopom LT-P-R.

Podejście do aktywacji receptora LT-P, polegające na skojarzeniu mAb przeciwko LT-P-R wymaga skojarzenia dwóch nie nakładających się epitopów. Ponadto wydaje się, że produktywna agregacja receptora uzyskiwana jest wyłącznie z użyciem konkretnych epitopów. Zidentyfikowano obecność przynajmniej czterech epitopów immunoreaktywnych LT-P-R. Dodatkowe epitopy (określone przez nowe mAb) mogą być zidentyfikowane przez dalsze

185 364 poddawanie fuzji splenocytów immunizowanych myszy, przez immunizowanie innych gatunków zwierząt oraz przez stosowanie innych dróg immunizacji.

Epitopy mogą być również bezpośrednio mapowane przez ocenę zdolności różnych mAb do współzawodnictwa ze sobą o wiązanie z LT-P-R przy użyciu techniki chromatograficznej BIAcore (Pharmacia BIAcore Handbook, „Epitope Mapping” Rozdz. 6.3.2, (Maj 1994); Jone i in., J. Immunol. Methods 160:191-8 (1993)) .

Pojedyncze mAb LT-P-R mogą być grupowane w przynajmniej 4 klasy według ich zdolności do kooperacji w kombinacji z innymi mAb LT-P-R w niszczeniu komórek nowotworowych w testach cytolitycznych (przykład 8; tablica 1). Przykładowo, mAb BDA8 w grupie I nie działa w kombinacji z mAb AGH1 w grupie I w wywoływaniu cytotoksyczności komórek nowotworowych. Podobnie, BKA11 i CDH10 z grupy III nie kooperują w teście cytotoksyczności komórek nowotworowych.

Figura 5A-C pokazuje wpływ podawania reprezentatywnego mAb przeciwko LT-P-R samego i' w kombinacji w teście cytotoksyczności komórek nowotworowych w obecności IFN-y jako czynnika aktywującego LT-P-R. CBE11 z grupy IV mAb przeciwko LT-P-R zastosowane same wykazuje słaby efekt cytotoksyczny, który jest nasilany w kombinacji z mAb BHA10 z grupy II (figura 5A). CBE11 wywołuje podobny efekt z mAb CDH10 z grupy III (figura 5B).

Cytotoksyczność spowodowana przez podanie kombinacji mAb przeciwko LT-P-R w roztworze wobec linii komórek nowotworowych HT29 nie jest wyjątkowa. Figura 5C pokazuje, że mAB AGH1 z grupy I z mAb CDH10 z grupy III działa synergistycznie w niszczeniu 2 różnych linii komórek nowotworowych (HT29 i WiDr) pochodzących z ludzkich guzów gruczolakoraka.

Streszczenie charakterystyk mAb przeciwko LT-P-R

Wszystkie spośród przeciwciał monoklonalnych anty-LT-P-R według niniejszego wynalazku, po sieciowaniu przez unieruchomienie, działają jako czynniki aktywujące LT-P-R w obecności drugiego czynnika aktywującego LT-P-R takiego jak IFN-y. Zdolność mAb przeciwko LT-P-R do działania jako czynnik aktywujący LT-P-R w obecności i pod nieobecność LT-al/P2 w roztworze różni się często w zależności od stanu komórki w czasie testu. Tabela 2 poniżej podsumowuje zdolności mAb przeciwko LT-P-R charakteryzowane przez niniejszy wynalazek.

mAb BDA8 i AGH1 z grupy I nie działająjako czynniki aktywujące LT-P-R w roztworze z LT-al/P2. mAb DBA8 właściwie blokuje wpływ przeciwnowotworowy LT-al/P2 (figura 3 i tabela 2). w przeciwieństwie, mAb BCG6 i BHA10 z grupy II wykazują mieszany wpływ agonistyczny i antagonistyczny przy podawaniu z LT-al/P2. mAb BKA11 i CDH10 z grupy III są unikalne pod względem działania jako czynniki aktywujące LT-P-R, które nasila wpływ przeciwnowotworowy w obecności LT-al/P2 i drugiego czynnika aktywującego LT-P-R takiego jak IFN-y bez wykazywania efektów antagonistycznych często obserwowanych w przypadku mAb BCG6 i BHA10 z grupy II.

Należy pamiętać, że klasyfikacja mAb anty-LT-P-R na podstawie ich zdolności do kooperacji w testach cytolitycznych komórek nowotworowych odzwierciedla fakt, że oddziaływają one z ważnymi epitopami LT-P-R. mAb wchodzące w skład pojedynczej grupy nie mają jednakże takich samych powinowactw wiązania z ich epitopami. Tak więc, obserwowane różne wyniki przy porównywaniu wpływów różnych mAb należących do tej samej albo różnych grup mogą odzwierciedlać różnice w powinowactwach wiązania. Nawiązując, możliwe jest że mogą być wyizolowane mAb grupy I albo grupy IV o wyższym powinowactwie wiązania z LT-P-R, które będą działały podobnie do mAb grupy III jako czynniki aktywujące LT-P-R w obecności LT-al/P2.

Linie komórek hybrydoma albo ich klony, które wytwarzają przeciwciała monoklonalne anty-LT-P-R opisane powyżej zdeponowano 12.01.1995r w the American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) według traktatu Budapeszteńskiego i przydzielono im numery ATCC opisane poniżej:

185 364

L1N1E KOMÓRKOWE	Nazwa mAb	ATCC nr
a) AG.H 1.5.1	AGH1	HB 11796
b) BD.A8.AB9	BDA8	HB 11798
c) BC.G6.AF5	BCG6	HB 11794
d) BH.A10	BHA10	HB 11795
e) BK.A11.AC 10	BKA11	HB 11799
f) CB.E11.1	CBE11	HB 11793
g) CD.H10.1	CDH10	HB 11797

Wszystkie ograniczenia dostępności publicznej powyższych depozytów ATCC zostaną niezwłocznie zniesione po przyznaniu patentu niniejszemu zgłoszeniu.

Monoklonalne przeciwciała 1gM anty-LT-P-R dziataąąjako czynniki aktywujące LT-P-R. mAb przeciwko LT-P-R, które obejmują więcej niż zwykłe dwa miejsca wiązania antygenu 1gG powinny również działać w roztworze jak czynniki sieciujące LT-P-R na powierzchni komórki oraz podpadają pod definicję czynnika aktywującego LT-P-R według niniejszego wynalazku. Miejsca wiążące antygen mAb przeciwko LT-P-R mogą być wbudowywane w cząsteczki 1gM, które posiadają 10 miejsc wiążących antygen, przy użyciu standardowych technik rekombinacji DNA i hybrydoma (przykład 12).

Alternatywnie, można zbierać i wzbogacać kompletne mysie (albo innego zwierzęcia) cząsteczki 1gM izolowane techniką fuzji hybrydoma po pojedynczej immunizacji antygenem. Jednym ze sposobów wzbogacania cząsteczek 1gM powinna być immunizacja myszy z uszkodzoną sygnalizacją przez CD40 (Kawabe i in., 1mmunity 1:167-78 (1994); Xu i in., 1mmunity 1:423-31 (1994)). Myszy te nie mogą skutecznie wytwarzać 1gG i stąd ich odpowiedź na ekspozycję na antygen wywołuje jedynie izotyp 1gM.

Przeciwciała 1gM przeciwko LT-P-R dzięki ich zwiększonej wartościowości mogą skutecznie agregować cząsteczki LT-P-R na powierzchni błony, wzmacniając w ten sposób sygnalizację przez LT-P-R w porównaniu z ich odpowiednikami 1gG, posiadającymi dwa miejsca wiązania antygenu. Dramatyczny przykład zwiększonej skuteczności przeciwciał multiwalentnych w grupowaniu receptora obserwowany jest w przypadku przeciwciał przeciwko receptorowi Fas, gdzie postać 1gM działa niezwykle silnie zaś normalne dwuwartościowe 1gG są nieskuteczne w roztworze (Yonihara i Yonihara, J. Exp. Med., 169:1747-56 (1989); Alderson i in., 1nt. 1mmunol., 6:1799-1806 (1994)).

Podobnie, mAb apo-1 przeciwko receptorowi Fas jest mAb klasy 1gG3. To mAb jest silnym czynnikiem cytotoksycznym, którego działanie polega na oddziaływaniu z Fc, unikalnym dla podtypu 1gG3, agregując w duże postaci poliwalentne. Usunięcie regionu Fc tworzy postać F(ab)2, która nie może łączyć się w agregaty, i która jest nieaktywna (Dhein i in., J. 1mmunol. 149:3166-73 (1992)). Stąd przez analogię, uważa się że odmiana 1gM mAb przeciwko LT-P-R powinna być silnym czynnikiem przeciwnowotworowym.

mAb przeciwko LT-P-R hamują wzrost nowotworu u myszy.

Zdolność czynników aktywujących LT-P-R takich jak mAb przeciwko LT-P-R do hamowania wzrostu ludzkich komórek nowotworowych in vitro (przykłady 6-8 i 13) mogą wskazywać na aktywność przeciwnowotworową in vivo. Eksperymenty wykonane na myszach z niedoborem odporności (SC1D) wykazały, że mAb przeciwko LT-P-R (CBE11) skutecznie blokuje tworzenie guza przez komórki ludzkiego gruczolakoraka WiDr (przykład 14; figura 6). Myszy, którym wstrzyknięto podskórnie (sc) komórki WiDr tworzą mierzalne guzy w ciągu dwóch tygodni. Gdy myszy leczono ip mAb CBE11 w czasie gdy wszczepiono sc komórki WiDr, wzrost guza był dramatycznie zatrzymany (figura 6A). Działanie przeciwnowotworowe mAb CBE11 przeciwko LT-P-R było wzmagane przez dodanie 1FN-y; jednakże CBE11 było skuteczne bez egzogennego EFN-γ . w grupie CBE11 + 1FN-y, 7 spośród 16 zwierząt było całkowicie pozbawionych guza, podczas gdy pozostałe zwierzęta miały niewielkie guzki, które nie powiększały się w ciągu dwóch miesięcy. Myszy leczone samym

185 364 ąolkscreate 20. Roztwór ten może być liotilirowank, ąrzechoDywaąy w zamrożeniu i rozjieńczaąk przed ącdaąiem sterylna. wodą do iąieZjji (USP).

Kompozycje według Dknalazku mogą kornysiąie obnjmcDać kc-wencjoąaląe nośątZi doąuszczaląe farmacnutkcz-ie dobrze ząare w siarie techniki (patrz na przykład Remt-gton's Pharmaceutical Scϊn-cns, 16th Editio-, Mac Publishiąu Company). Takie ncśąiZi dopuszczalne farmajeutkjnąie mogą obejmować inne środki lecznicze, —Ι-ϊΖϊ, nośniki genetyczne, adiuDaąik, zaróbki, itp., takie jak albumina suroDick ludzkiej albo preparaty osączac Kompozycje są Zorrystnin w postaci dawek jeOąostkowych i są zwykle pcdaDaąe raz lub kilka razy 0nieąnie.

Kompozycje farmaceutyczne według Dkąalazku mogą być rÓDąież pc0awaąe przy użyciu mikrosfer, lipąsomÓD i układów podawania drobnocZąstnczkoDkch albo fącmulacji do przedłużonego uwalniania umieszczonych .-. w pobliżu, albo w i-nym połącnn-ϊu z chorą tkanką albo krDicbingiem. Odpowiednie przykłady nośników do przedłużonego uwalniania obejmują ąółąrneąusrczalne matryce ąąlimeroDe w postaci uZsziałtąDanych ąrzeOmiciów takich jak czopki albo mikrokapsułki. Matryce wszczepialne albo mikrokapsułkcwe matryce do prznOłużc-ego uwalniania cbejmująpclilaktydk opis paientoDy USA nr 3,773,319; EP 58,481), kopąlimerk kwasu L-glutami-owego i gammaleiylOlLlgluiamiąoDego (SiOman i wsp., Biąpolkmecs, 22, str. 547-56 (1985)), ąąli(2-hy0roksyeiylo-meiaZtylaą) albo octan etylencwiąylu (Langer i wsp., J. Bicmnd. Mater. Res., 15, str. 167-277 (1981)).

Ltpcsomy raDiecającn kompleksy heieromerkjzne LT-e/P i/lub Ab pczeciDZo LT-P-R i UFN-y mogą być Dktwarnann dobrze ząaąkmi sposobami (patrz np. DE 3,218,121; Epsteii wsp., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82, stc. 3688-92 (1985); Hwa-g i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77, str. 4030-34 (1980); patent USA -c 4,485, 045 i 4,544,545). Wiposąmy są zwykle małymi (około 200-800 Angstromów) typu jedrobło-cwegc, w których zaDartość lipidu jest wyższa niż 30 mol% cholesterolu. Proącrcja cholesterolu jest dobrana tak by zapewniała optymalne tempo uwalnia-ia kompleksu LT i/lub Ab przeciwko LT-P-R i IRN-y.

Kompleksy heteromeryczne LT-e/P oraz Ab przeciwko LT-P-R mogą być również przyłączane do lipcscmÓD zawierających ϊ—-) jzyąąiki aktywujące LT-P-R, środki chemioterapeutkczne albo IRN-y w celu uzupełnienia iNF-y spoiγkaąeuc zwykle w ^Γ-ίη guza. Przyłącza-ie kompleksów LT i AB przeciwko LT-P-R do liąoscmów może być osiągnięte przy użyciu dowąląeuo z-a-ego czk-ątka sieciującego takiego jak sieciujące czynąiZt heteroeitą-kcjc-alne, którn są szeroko stosowa-e do Dianania toksyn i środków chemiąterapeutycznych z przeciwciałami w celu kierąDaąegą dostarczania. Koniugacja z liposomami może być rów-też uzyskana przy użyciu reagentu sieciującego kierowanego -a węgląwą0aąy, hydrazydu kwasu 4-(4-maleimidcfe-klo)masłowego (MPBH)(Duzgunes i wsp., J. Celi. Biochem. Abst. Supl. 16E 77 (1992)).

Zalety kompcrkjji terapeutycznych opartych na aktywacji LT-P-R

Terapia przeciD-cDątDorowa oparta -a aktywacji Lt-P-R ma kilka zalet. LT-P-R Diąże się z kompleksami heteromerkcznkmi LT-e/P z wysokim ąąDincwactDem w połącze-iach P/P zaś z mniejszym powiąowactDem w połącze-iach a/P utworzonych na styku pomiędzy sąsiadującymi pcdje0-cstkamϊ WT-e i WT-P. W przeciwieństwie, receptcrk TNF wiążą się z kompleksami heteromerkcr-kmi LT-e/P z Dksckim powinoDajtwem tylko w połącze-iach ct/a. Nawiązując, cjzksrczo-e kompleksy LT-al/P2 wiążą się z wysokim poDiąąwactwem z LT-P-R pomiędzy sąsiadującymi podjed-ostkami LT-P, ale nie posiadają połączeń cca, a więc nie aktywują krzyżowo sygnalizacji przez receptory TNF. Tak więc kompleksy heteromerycz-e LT-e/P -in wywołują zDiąrαąkch z TNF reakcji zapalnych.

Podawani) LT-al/P2 nie aktywuje zmian w komórkach śródeło-Za, związa-ych z reakcją zapal-ą -awet we względnie wysokich dawkach. Z tego pcwcdu, efekty uboczne spowo0oDa-e kaskadą zapalną oesecDODαąe w przypadku TNF, nie ącwinąk stanowić problemu ącnk stoscwaąiu kcmpczycjϊ farmaceutycznych i sposobów lecze-ia aZiγDująjych LT-P-R.

Ludzkie LTal/P2 Diążą się z mysimi LT-P-R zasad-tczo rÓDąte Ο^^) jak z ludzkimi LT-P-R. Wstrzyknięcie 100 mg ludzkiego LTel/PŹ -a mysz -te jest letalne (ąrzkkłαd 11), co sugeruje, że ąoeu0ze-ie LT-P-R w całym orga-izmie zwierzęcia -te wykazuje toksyczności obserwowanej gdy DykonkDa-o ącdcbne dcŚDiα0cze-ia z użyciem aktywacji FasR albo p60 TNF-R.

185 364

CBE11 zachowywały się podobnie jak grupa CBE11 + IFN-y w ciągu 30 dni. Jednakże myszy leczone samym CBE11 ewentualnie rozwijały powoli rosnące guzy. Istniała różnica istotna statystycznie pomiędzy grupami CBE11 (+/- IFN-y) i grupami kontrolnymi (roztwór soli, sam IFN-y i kontrolne mAb przeciwko ludzkiej LFA-3 (”E6) + IFN-y), ale nie było różnic pomiędzy grupami kontrolnymi. mAb 1E6 i CBE11 były przeciwciałami IgGl. mAb 1E6 skutecznie opłaszczało komórki nowotworowe, ale nie blokowało wzrostu guza. Tak więc, zjawiska zachodzące dzięki dopełniaczowi albo naturalnym komórkom niszczącym nie są jedyną podstawią aktywności przeciwnowotworowej mAb CBE11 przeciwko LT-0-R.

Skuteczność mAb CBE11 w hamowaniu wzrostu nowotworowego in vivo pod nieobecność egzogennego IFN-y była nieoczekiwana ponieważ istniał zależny od IFN-y efekt cytotoksyczny oparty na LT-P-R in vitro. Być może istnieje pewna skuteczność mysiego IFN-y wobec ludzkich receptorów IFN-y albo możliwe są inne mechanizmy in vivo.

mAb CBE11 przeciwko LT-P-R może również hamować wzrost ustalonych guzów u myszy (figura 6B) . Myszom wszczepiano sc komórki ludzkiego gruczolakoraka WiDr dnia 1, po czym guzom umożliwiano rozwój przez 15 dni (przykład 14). Guzy u zwierząt leczone ip samym IFN-y albo kontrolnym mAb przeciwko ludzkiej lAF-3 (1E6) + IFN-y rosły w trakcie 7 tygodni doświadczenia. W przeciwieństwie, guzy leczone mAb CBE11 (+ IFN-y albo samym) przestawały rosnąć, zaś po 3 wstrzyknięciach przeciwciała CBE11 w okresie 3 tygodni wzrost guza był zatrzymany do 49 dni po wstrzyknięciu, kiedy to doświadczenie zakończono (figura 6B).

Doświadczenia te wykazały, że mAb anty-LT-P-R, które aktywują sygnalizację LT-P-R mogą skutecznie hamować tworzenie guza na wczesnych etapach oraz mogą również blokować trwający wzrost guza na etapach późniejszych in vivo. Doświadczenia te wykazały również, że podawanie pojedynczego czynnika aktywującego LT-P-R może być skuteczne w leczeniu albo zmniejszaniu postępu, ciężkości oraz skutków nowotworu u chorych zwierząt.

Procedury opisane w przykładzie 14 mogą być zastosowane w celu identyfikacji czynników aktywujących LT-P-R według niniejszego wynalazku, które działają same albo w kombinacji hamując wzrost komórek nowotworowych in vivo. Uważa się, że inne czynniki aktywujące LT-P-R, obejmujące choć nie ograniczone do zidentyfikowanych przy użyciu testów cytotoksyczności komórek nowotworowych in vitro, mogą wywierać podobne efekty przeciwnowotworowe in vivo gdy są podawane same albo w kombinacji zwierzętom albo ludziom.

Zastosowanie IFN-y i innych czynników aktywujących LT-P-R

Efekt cytotoksyczny kompleksów heteromerycznych LT-ot/β oraz sieciowanych albo licznych przeciwciał anty-LT-P-R na komórki nowotworowe jest wzmagany przez obecność czynnika aktywującego LT-P-R, w szczególności IFN-γ. Wykazano uprzednio, że ludzkie komórki gruczolakoraka pochodzenia jelitowego (komórki HT29) są wrażliwe na sygnalizację przez FasR (Yonehara i Yonehara, J. Exp. Med., 16^:1747-56 (1989)) oraz na TNF i LT-α w obecności IFN-y (Browning i in., J. Immunol., 154:33-46 (1995)).

Ilość czynnika aktywującego LT-P-R wymaganego do wzmocnienia aktywności przeciwnowotworowej kompleksów heteromerycznych LT-o/P, Ab przeciwko LT-P-R albo innych czynników aktywujących LT-P-R zależy od rodzaju komórki albo tkanki leczonej, jak również sposobu leczenia i może być określona empirycznie przy użyciu rutynowych procedur. Czynnik aktywujący LT-P-R może być dostarczony w stężeniu albo dostarczany w tempie określonym jako skuteczne w połączeniu z innymi podawanymi czynnikami aktywującymi LT-P-R, wziąwszy pod uwagę wymienione wyżej czynniki.

Alternatywnie, można uwzględnić endogenne czynniki aktywujące LT-P-R takie jak interferony jak IFN-y, które mogą być wytwarzane przez komórki albo tkanki otaczające docelowe komórki nowotworowe. Endogenny IFN-y jest zwykle wytwarzany po zakażeniu wirusowym, ale spotyka się go również w pobliżu guzów (Dinge i in., Immunity 1:447-56 (1994)).

Dowolny czynnik, który jest zdolny do indukowania interferonów, korzystnie IFN-y i który nasila efekty cytotoksyczne kompleksów heteromerycznych LT-o/P oraz mAb antyLT-P-R na komórki nowotworowe należy do grupy czynników aktywujących LT-P-R zastosowanych w kompozycjach według wynalazku. O ile zakażenie wirusowe wywołuje wytwarzanie IFN-y, poziomy endogennego IFN-y mogą być podwyższane przez inne czynniki

185 364 (przykład 10). Przykładowo, doświadczenia kliniczne wykazały indukcje interferonu przez działanie ówuniciowego rNa (dsRNA). Nawiązując kwas pcliryboguaeylcnγ/pclirγbocytydylowy (poli-rG/rC) i inne postaci dsRNA są skuteczne jako induktory interferonu (Juraskowa i in., Eur. J. Pht(mtecl., 221:107-11 (1992)).

Czynnik pobudzający interferon z Glycyrrhiza glabra (Acharya i in., Indian J. M-ó. Res., 98:69-74 (1993)) oraz czynniki farmaceutyczne, z których wiele jest podawane doustnie mogą również być zastosowane do podwyższana poziomów endogennego interferonu. Takie induktory interferonu obejmują: imiquimod (Bernstein i in., Antiviral Res., 20, str 45-55 (1994)), saparal (Paramoeova i wsp., Vopr. Virusol., 39, str. 131-34 (1994)), pirymidony arylu takie jak brcpi(γmiea (Onishi i Machida, Hieγokika Kivo, 40, str. 195-200 (1994)), ridostin (Cheknev i wsp., Vopr. Virusol., 39, str. 125-28 (1994)).

Ni-któr- z tych czynników indukujących interferon scharakteryzowano jako induktory interferonu typu I takiego jak IFN-a. Interferony typu I mogą również działać jako czynniki aktywujące LT-p-R, ale są słabsze niż IFN-y. Leczenie przy użyciu kompleksów LT-α/β i czynników aktywujących LT-p-R

Kompozycje według wynalazku powinny być podawane w dawkach skutecznych w leczeniu konkretnych stanów klinicznych. Określenie korzystnej formulacji farmaceutycznej oraz skutecznego terapeutycznie schematu dawkowania dla danego zastosowania należy do stanu techniki, biorąc pod uwagę przykładowo stan kliniczny i wagę pacjenta, zakres pożądanego leczenia oraz tolerancję pacjenta na leczenie.

Zwykle, ludzie tolerują dawkę 100-200 pg/m² TNF przed wystąpieniem poważnych objawów toksycznych (Schiller i wsp., Cancer R-s., 51, str. 1651-58 (1991)). U myszy, dawki w zakresie 1-5 pg/myss/dzień podawane z 5 x 10⁴ jeón. rekombincwteegc ludzkiego IFN-y powodowały regresję pierwotnych guzów ludzkich (Balkwill i wsp., CIBA Foundation Symposium (1987); Hevell i wsp., J. Exp. Med., 167, str. 1067-85 (1988)). W oparciu o względną skuteczność TNF i LT-al/p2 w testach cytolitycznych HT29, skuteczny terapeutycznie zakres dawek powinno zapewnić około 5-25 pg/mysz/dzień LT-al/p2. Ekstrapolując na ludzi, oczekuje się, że dawkowanie przynajmniej 1 mg/m2 LT-al/p2 jest wymagane w kombinacji z czynnikiem aktywującym LT-p-R takim jak IFN-y.

Historycznie, leczenie IFN-y podejmowano albo w maksymalnych tolerowanych dawkach w zakresie 100-250 pg/m2 albo na poziomie „immunomodulacyjnym” w zakresie 10-25 gg/m2 (patrz Kopp i wsp., J. Immujnother., 13, str. 181-90 (1993)). W leczeniu skojarzonym dwoma interferonami stosowano 4 x a0⁶ledn./m2 IFN-α i około 250 gg/m2 IFN-y (Nieóerle i wsp., Leuk. Lymphoma, 9, str. 111-19 (1993)). Oczekuje się, że dawki pośrednie około 25-100 pg/m2 IFN-y w kombinacji z kompleksami heteromerycznymi LT-α/β albo opisanymi tu oczyszczonymi Ab przeciwko LT-p-R powinny być odpowiednim punktem wyjściowym do optymalizacji óawek leczniczych.

Podawanie kompleksów heteromerycznych LT-α/β i sieciowanych przeciwciał antyLT-p-R, w tym wyizolowanych i oczyszczonych postaci przeciwciał albo kompleksów, ich soli albo pochodnych dopuszczalnych farmaceutycznie może być osiągnięte przy użyciu przyjętych koewencjceαleie sposobów podawania czynników wykazujących aktywność przeciwnowctworcwą.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku zastosowane w tym leczeniu mogą również występować w różnych postaciach. Obejmują one przykładowo, postaci dawkowania stałe, półstałe i płynne takie jak tabletki, pigułki, proszki, roztwory płynne i zawiesiny, czopki i roztwory do wstrzyknięć i wlewów. Korzystna postać zależy od zamierzonej drogi podania i zastosowania klinicznego. Sposoby podawania obejmują podawanie doustne, pa-ent-ralne, podskórne, dożylne, dcguzcwe albo miejscowe.

Kompleksy heteromeryczne LT-α/β, IFN-y i przeciwciała anty-LT-p-R mogą być przykładowo umieszczane w sterylnych i izotonicznych fcrmultcjαch z dodatkiem lub bez czynników pobudzających wychwyt albo stabilność. Formulacja jest korzystnie płynna albo może być licfilizcwteym proszkiem. Przykładowo, kompleksy LT i/lub Ab przeciwko LT-p-R i IFN-y mogą być rozcieńczane w buforze zawierającym 5 mg/ml jednowoónego kwasu cytrynowego, 2,7 mg/ml cytrynianu ^sodowego, 41 mg/ml mteeitolu, 1 mg/ml glicyny i 1 mg/ml

185 364

Zastosowanie konkretnych przeciwciał monoklonalnych anty-LT-p-R albo kombinacji przeciwciał, w celu uczynnienia tego szlaku u ludzi może posiadać kilka zalet w porównaniu z leczeniem kompleksami heteromerycznymi LT-α/ρ. Leczenie przeciwciałami przeciwko receptorowi powinno być bardziej wybiórcze niż leczenie ligandem. Ponadto, rekombinowane postaci mAb przeciwko LT-p-R powinny być łatwiejsze do zaprojektowania i wytwarzania na wielką skalę, w porównaniu z rozpuszczalnymi kompleksami heteromerycznymi LT-a/p.

Przewiduje się, że mAb albo kompleksy heteromeryczne LT-α/ρ powinny być podawane ludziom z nowotworem w połączeniu z konwencjonalnym leczeniem przeciwnowotworowym (tj. radio- i chemioterapią). Skojarzone leczenie aktywacją LT-P-R z konwencjonalną chemioterapią może zapewnić dodatkowy czynnik aktywności przeciwnowotworowej, który może z większym prawdopodobieństwem usunąć komórki nowotworowe z organizmu pacjenta, w porównaniu z konwencjonalną terapią przeciwnowotworową.

Jest dalej możliwe, że podejście to może wykazywać względnie mniejsze efekty uboczne a więc może być podawane w układzie półprofilaktycznym w przypadkach raków, które mogły nie dać przerzutów, albo w rodzinach pacjentów wykazujących predyspozycje genetyczne do zachorowań na pewne rodzaje nowotworu.

Poniżej podano przykłady ilustrujące kompleksy heteromeryczne LT-α/ρ oraz mAb przeciwko LT-P-R, oraz sposoby zastosowane do ich charakteryzacji. Przykłady nie powinny być uważane za ograniczenia; zamieszczono je w celu ilustracji, zaś niniejszy wynalazek ograniczony wyłącznie przez zastrzeżenia.

Przykład 1

Wytwarzanie nadsączy komórek owadzich zakażonych bakulowirusem, zawierających postaci LT-a/p

Rekombinowanego bakulowirusa kodującego LT-α pełnej długości albo postać wydzielnicząLT-α wytworzono jak to opisano (Crowe i wsp. Science, 264, str. 707-710 (1994)). Komórki owadzie High five (Invitrogen, San Diego, CA) inokulowano w gęstości 2 χ 10⁵komórek/ml w 7,2 litra bezsurowiczej pożywki SF 900-H (Gibco). Hodowla osiągnęła gęstość 1,8 χ 10⁶ komórek/ml w 48 godzin później, po czym zakażono ją roztworem bakulowirusa 150 ml (3 χ 10⁸ pfu/ml) LT-P i 300 ml LT-α. Dwa dni później, hodowlę zebrano i usunięto resztki komórkowe przez odwirowanie. Po dodaniu EDTA i PMSF stężenia końcowe 1 mM EDTA i 150 μΜ PMSF), sklarowany nadsącz zatężono 10-krotnie przez ultrafiltrację z użyciem spiralnego wkładu SI YM10 (Amicon). Koncentrat podzielono na sześć porcji po 120 ml i przechowywano przed oczyszczaniem w -70°C.

Przykład 2

Preparowanie rozpuszczalnych receptorów LT-P jako chimery z Fc immunoglobuliny

Domenę zewnątrzkomórkową LT-P-R do regionu śródbłonowego amplifikowano przez PCR z klonu cDNA przy użyciu starterów zawierających miejsca restrykcyjne Notl i Sali na końcach 5' i 3' (Browning i wsp., J. Immunol., 154, str. 33-46 (1995)). Amplifikowane produkty cięto Notl i Sali, oczyszczano i poddawano ligacji z wektorem pMDR901 linearyzowanym Notl wraz z fragmentem Sall-Notl kodującym region Fc ludzkiej IgGl. Powstały wektor zawierał gen reduktazy dihydrofolianowej oraz chimerę LT-P-R-Fc napędzaną osobnym promotorem. Wektor wprowadzono przez elektroporację do komórek CHO dhfr i izolowano klony oporne na metotreksat według znanych procedur. LT-p-R-Fc jest wydzielana do pożywki, zaś w celu selekcjonowania linii komórkowych wytwarzających największe ilości białka chimerycznego zastosowano test ELISA. Linię wytwarzającą duże ilości hodowano w znacznej liczbie i zbierano nadsącz. Czyste białko izolowano przez chromatografię powinowactwa na sepharozie-białku A fast flow.

Przykład 3

Oczyszczanie przez powinowactwo LT-al/p2 przy użyciu TNF-R i LT-P-R.

W celu wytworzenia żywic do oczyszczania postaci LT przez powinowactwo, oczyszczone preparaty LT-P-R-Fc (jak to opisano w przykładzie 2) i TNF-R p60-Fc (Crowe i wsp., Science, 264, str. 707-10 (1994)) unieruchamiano na żywicy CNBr-sepharose (Pharmacia) przy 5 mg/ml, zasadniczo w oparciu o protokół producenta. Żywicę przed zastosowaniem przeprowadzono przez jeden cykl elucji. Porcję (120 ml) koncentratu z S1Y10 przepuszczono

185 364 przez dwir kmlejse kolumny p60 aN0-R-0c, które związały LT-α i LT-a2/pi. Frakcja opuszczająca kolumnę, która zawierała LT-al/βΕ i LT-(, została przepuszczona przez kolumnę LT-P-R-Fc. Kolumnę płókebo 5 oOjętościemi ·yluwby w PBS, PBS z 0,5 M NaCl i PBS, pm czym kompleksy LT-α i LT-a2/pi eluowyfó 25 mM fosfórabem sodu, 100 mM NaCl, pH 3,5. Frakcje eluetu natychmiast beutrahzówebó 120 óbjętóChi 0,5 M fosforanu sodu, pH 8,6 i p-μpchówγwebó na lodzir. Frakcje zawierające białko pulówebó i pule analizowano przez SDS-PAGE z berwiesirw błękitem Coowyssie. Opisana wyżej elucja dawała > 95% czystości LT-^l/pE.

Przykład 4

Charakteryzacja oczyszczonych ligendów LT-al/(2.

Frakcje z przykładu 3 rózdμielebó przez chromatografię żelową w celu oceny czy wytworzyły się Μοριυ oraz czy występują agregaty. Zastosowano kolumnę TSK G3000 sw x2 przy przepływie 0,5 ml minutę w celu rozdziału wzorca masowego białka BioRad oraz trzech różnych triwerów LT, LT-a3, LT-a2/'Zi i LT-a1β2. Figara - A poOuzpj e, żs riewiele, jeżeli w ogóle triwrry LT-al/-2 wykazują agregaty o wysokim ciężarze cząsteczkowym. Porównanie wzorca wielkości pokazuje że wszystkie trzy postaci są trimeiyczse, tj. około 50-60 kDa. Zakładając trimer, /adena była stechiometria LT-a do LT-P w ocoyszciosych yykhjach LT-al/pE i LT-a2/pl, przez dessytometrię żeli barwionych błękitem Coomassie albo przez enelizę wysokości szczytu dwóch szczytów po rozdziale na HPLC w odwróconej fazie. O/a pówiery potwierdziły tożsamość frakcji eluowasych z kolumn powinowactwa, jak to opisano wyżej.

Dalej bedesó czystość frakcji przez chrówatóFrafię jósówywiesną stosując urządzenie BioRad, wepując pH LT-al/β( i LT-aE/ei sa słabej żywicy kytiósówywiessej w kilku różnych układach bufora. Metoda wykazująca najwyższą zdolność do zatrμγmywybia i rozdzielybiy trzech triwerów obejmowała zastosowanie kolumny Poros CM ikar0óksγwetyló) przy prsepfywir 5 wl/wisutę w buforze 16^6 mM MES, 16,66 mM HIEPES, ^-6,66 Wm octas sody pH 6,5 i elucję F-ydiestew 1 M NaCl w objętości 20 objętości kolumny. ChrómytóFramy BioCAD komple^grów LTwl/βΕ i LT-a(^a-1 pokazano sa figurze IB. Każdy z triwerów, LTe3, LT-al βΕ i LT-aE^l, eluował przy isnym stężeniu soli i nie było dowodów na zasieczyszczenie większe niż 1-2% każdego z preparatów.

Przykład 5

Niszczenie ludzkich komórek gróhμólakó-eka HTE9 przez rozpuszczalse kompleksy LT_-a1/βΕ.

Test hytólityczny HT29 opisano uprzednio (Browning i Ribolini, J. Imwunol., 143, str. 1859-67 (1991)). W typowym teście, szeregowe rozcieńczenia LT-al/(2 (i innych cytokis gdy to kobiecose) wykonano w 0,05 ml w pfytkach 96-stódzie,-kóaaγch po czym dódywyi so po 5000 trypsynioowanych komórek HTE9-14 w 0,05 wl pożywki yowierającaj 0 el/o 80 jedn./ml (ednos&i pjzeciwwirósówμa ^1^-0 IFN-y. Kom^grki ^294 4 sąkkobem oryginal-ie/ linii uμγskase- z ATCC, któaa j est bwitóH homogesno. W teście zastosowabó kómórki HaΕ9-/4; wszystkie wyniki można również obserwować stosując oryginalną lisię HT29 uzyskysą O ATCC. Po 3-4 dbiach, wierzono w następujący sposób redukcję mitochonchralną /^wai-ćł EETT: dodawano po 10 1 MTT i po 3 godoisac^y z-edó^bowaby berwmk rozpusZCz_ebf w 0,09 ml izopropaesiu z 10 wM HC1, po crym wierzono OD przy ^/y0 sm. DodyWen0 roows^^toc o^ostaci receptora wytworzone jek to opisano, albo czyste IgG, w 10 μΐ przed kowiKkawi, otrzymując stężenie końcowe rósene 5 μg)mli

Fi-Fra 2A pokazuje siszczesie komóoek HTE9 przez trektowenie mAb przeciwko receptorowi Fas CH-n (które pobudzę sygnalizację przez FasR); ligeody TNF, LT-a^p, LT-cLCE i LT-ηΕ/β¹ » kom/inbr-i z I0Niγ^, Badanie oglądaniem komórek traktowanych LLa l/(^Ε wykazało, że czyi—ik tes raczej niszczy komórki zamiast tylko /lokować proliferaLę. Pod firobecsość IFN-y, nip obserwowyfo żadse-ó efektu, co odzwwrciedla sieowykłą cdo lność IFN/y do WpfyW^ynie, co jęki spor^fg komórki inear^-)re^jują sygnalizację z rodliny receptorów aN0_i Interferony a i β /yły 100-krotnie wsiej skuteczne siż IFN-y, jek ocesioso w opeociu o jednostki pPIeciwwirusowe.

Figura 2B pokazuje zahamowanie niszczenia przez LT-al/p2 przez rozpuszczalne LT-p-R-Fc zIe zip krzu pOe-DWC-R-Fe, wykzzujyc, że cy1ojokoypΕnβrZ zesIzwoizjo dle

185 364

LT-al/P2. Brak zahamowania przez p60-TNF-R-Fc wskazuje, że zanieczyszczające LT-α (stanowiące jak wiadomo mniej niż 1%) nie przyczyniają się do aktywności cytotoksycznej LT-α 1/p2.

Przykład 6 mAb przeciwko LT-P-R nasilają niszczenie komórek HT29 przez kompleksy LT-al/P2.

Testy cytolityczne wykonano, jak to opisano w przykładzie 5, z takim wyjątkiem, że do komórek dodano IFN-α i mAb przeciwko LT-P-R (szereg 0,01-1000 ng/ml) w 2x stężeniu końcowym, po czym 50 j_l nadsączu komórek dodano do studzienek zawierających rozcieńczone LT-al/P2. Wzrost oceniano jak to opisano w przykładzie 5.

Figura 3 pokazuje różnicujący wpływ dwóch różnych mAb przeciwko LT-P-R przez ich zdolność do nasilania aktywności cytotoksycznej LT-al/P2. Figura 3A pokazuje, że mAb przeciwko LT-P-R CDH11 nasila aktywność cytotoksyczną w sposób zależny od dawki. Figura 3B pokazuje wpływ innego mAb przeciwko LT-P-R, BDA8, w tym samym teście. mAb BDA8 raczej hamuje aktywność cytotoksyczną LT-al/P2 niż nasila niszczenie komórek nowotworowych.

Przykład 7

Unieruchomione mAb przeciwko LT-P-R potrafiąniszczyć komórki nowotworowe HT29.

W celu unieruchomienia mAb przeciwko LT-P-R na powierzchni plastikowej, płytki hodowlane 96-studzienkowe pokrywano 50 pił koziego przeciwciała poliklonalnego przeciwko mysim Fc 10 pg/ml (Jackson ImmunoReseeach), płukano i blokowano 5% FCS w PBS, a następnie wychwytywano wskazane mAb przeciwko LT-P-R, i ponownie przemywano. Komórki HT29 wysiano do studzienek opłaszczonych mAb, po czym prowadzono test cytolityczny jak w przykładzie 5. Figura 4A ilustruje wpływ cytolityczny unieruchomionych mAb BDA8 i CDH10 przeciwko LT-P-R na komórki HT29. Każde z przeciwciał samo wywołuje cytotoksyczność wobec komórek nowotworu po unieruchomieniu go na podłożu. Figura 4B pokazuje, że same mAb przeciwko LT-P-R B-DA8 i CDH10 badane osobno w roztworze nie są cytotoksyczne, stąd aktywność cytolityczna pojedynczych mAb przeciwko LT-P-R in vitro wydaje się wynikiem unieruchomienia.

Przykład 8

Kombinacja mAb przeciwko LT-P-R w roztworze, skierowanych przeciwko różnym epitopom niszczy komórki HT29.

Wzrost komórek HT29 był oceniany jak to opisano w przykładzie 5, z takim wyjątkiem do pożywki hodowlanej wprowadzono jedno albo dwa mAb przeciwko LT-P-R. Tabela 1 pokazuje wpływ na komórki HT29 obserwowany gdy do roztworu wprowadzano różne mAb przeciwko LT-P-R (tj. nie unieruchamiano na plastiku). mAb przeciwko LT-P-R mogą być zorganizowane w grupy I-IV w oparciu o ich względne zdolności do działania w kombinacji ze sobą w teście cytolitycznym HT29. Wyniki mAb przeciwko LT-P-R uzyskane w testach cytolitycznych są zbieżne z danymi z badania wiązania receptora, co sugeruje, że mAb w różnych grupach rozpoznają różne epitopy na LT-P-R.

185 364

Tabela 1

Kombinacje rozpuszczalnych mAb przeciwko LT-P-R są cytotoksyczne wobec ludzkich komórek gruczolakoraka HT29. mAb przeciwko LT-P-R podzielono na grupy 1, Π, ΠΙ i 1V, w oparciu o ich efekty w kombinacji ze sobą w testach cytolitycznych z komórkami HT29. Plusy oznaczają względny poziom efektów cytolitycznych kombinacji mAb na komórki HT29 w obecności 80 jedn./ml 1FN-y. nr = nie znaczące; nd = nie określono.

_Drugie mAb_

Grupa 1 Grupa 11 Grupa 111 Grupa 1V

Pierwsze

Grupa	mAb	BDA8	AGH1	BCG6	BHA10	BKA11	CDH10	CBE11
1	BDA8	nr	-	+	++	+	nd	nd
	AGH1	-	nr	++	+++	++	nd	nd
11	' BCG6	++	++	nr	-	+++	nd	nd
	BHA10	++	+++	-	nr	+	+++	+++
111	BKA11	+	++	+++	nd	nr	-	nd
	CDH10	++	++	++	+++	-	nr	+++
1V	CBE11	nd	++	+	++++	nd	++++	nr

Figura 5A-D określa efekty włączenia do testu cytolitycznego HT29 reprezentatywnych kombinacji par kooperujących mAb przeciwko LT-P-R skierowanych przeciwko różnym epitopom LT-P-R. Figura 5a pokazuje efekty cytotoksyczne BHA10 i CBE11, figura 5B CDH10 i CBE11, zaś figura 5C CDH10 i AGH1, same i w kombinacji. Figura 5D pokazuje efekty cytotoksyczne kombinacji mAb CDH10 i AGH1 wobec innej linii komórek nowotworowych zwanej WiDr.

Tabela podsumowuje charakterystyki reprezentatywnych mAb przeciwko LT-P-R według wynalazku.

T a b e1a 2

Podsumowanie cytotoksyczności mysich mAb przeciwko ludzkiemu LT-P-R HT29

mAb Grupa	mAb Nazwa	Barwienie komórekA	Blokowanie wiązanie receptora®	mAb unieruchamiane na podłożuO	Rozpuszczalne mAb	Rozpuszczalne mAb z LT-al/p2
1	BDA8	+++	+++	+	+/-^D	hamowanie
1	AGH1		+++	+	+/-	hamowanie
11	BCG6	+++	++	+	+/-	mieszany
π	BHA10	+++	+++	+	+/-	mieszany
111	BKA11	+++	+/-	+	-
111	CDH10	+++	+/-	+	+/-
1V	CBE11	-H-+	+++	+	+/-	brak efektu
Kontrola	MOPC21					brak efektu
	HT29/26	-	nd	-	-	brak efektu
	TS 2/9E	nd	nd			brak efektu

a - komórki CHO barwione FACS transfekowane LT-P-R ^B - test oceniający blokowanie wiązania rozpuszczalnego receptora z zaktywowanymi limfocytmi T hybrydomy 11-23. nd = nie wykonano c - komórki HT29 hodowane z 1FN-y na opłytkach pokrytych LT-P-R jak opisano w sposobie.

^D - zmienne, częściowe hamowanie w jednych testach brak efektu w innych.

^E - Mysie 1gGl przeciwko ludzkiemu LFA-3.

185 364

Przykład 9

Zależność od endogennego IFN-y leczenia komórek nowotworowych.

IFN-y, korzystny czynnik pobudzający LT-P-R według niniejszego wynalazku, jest cytokiną, która wykazuje aktywność przeciwnowotworową i jest tolerowana przez ludzi. Endogenny IFN-y znajdujący się w środowisku otaczającym nowotwór może występować w stężeniach wystarczająco wysokich do działania jako czynnik aktywujący LT-P-R według wynalazku, bez dodania egzogennego IFN-y. Stężenie IFN-y w pobliżu nowotworu może być ocenione standardowymi metodami immunochemicznymi w próbkach tkanki z regionu nowotworu. Jeżeli stężenie endogennego IFN-y jest wystarczająco wysokie do wywołania aktywności przeciwnowotworowej w kombinacji z kompleksami heteromerycznymi LT-α/β albo mAb przeciwko LT-P-R według wynalazku (jak określono opisanymi tu testami cytolitycznymi), wtedy nie ma konieczności podawania IFN-y jako drugiego czynnika aktywującego LT-P-R w kompozycjach albo sposobach według wynalazku.

Przykład 10

Indukcja endogennego IFN-y jako czynnika aktywującego LT-P-R do leczenia komórek nowotwdjowγch.

Związki, które są w stanie indukować endogenne wytwarzanie interferonów takich jak IFN-y, należą do grupy czynników aktywujących LT-P-R według wynalazku. Przykładowo, Interferony mogą być indukowane przez działanie dwuniciowymi cząsteczkami RNA takimi jak kwas poliryboguanylowy/polirybocytydylowy (poli-G/C).

Samice C57/bl6 (w wieku 6-8 tygodni) mogą być nastrzykiwaae 18 mg (600 mg/kg) Dgalaktozaminy, która uczula myszy na działanie TNF i innych czynników przeciwnowotworowych. Szereg stężeń poli-G/C (Juraskova i wsp., Eur. J. Pharamacol., 221, str. 107-11 (1992)) w neutralnym roztworze soli dodaje się do oczyszczonego L'T-icxl/.32 (10-100 pg), po czym roztwór podaje się myszom jako wstrzyknięcie dootrzewnowe (ip). Aktywność przeciwnowotworową LT-al/P2 może być wzmocniona przez obecność dwuniciowego RNA poli-^e<a/_rC.

Podobnie, stymulator interferonu z rośliny Glycyrrhiza glabra (Acharya i in., Indian J. Med. Res., ⁿ8:6 9©' 09°)imoźrbyć podawyny lydyrnmdoż^me w^wlcach w nakres^Je 40-100 ml/c⁹⁸e⁶.0ptym9lna dawke do ćdtywaa-i LT-PiR wobycnofoi ^dam^kje^ds^we^; teterce meiyczn^h LT-α/β t^ybo^/na .azernwko LT-fł-R mLżebyć 6^esoś]Όnacmp^juβcmri powmna za^-r^γcćodtakichcpynni^eów jpk. zeciwk eowoPayeo, scślć podewonia ^chrmzt podaweiia.

Imi.drk^ R-^ynn kBemstom i rn., ^tieira^- Rep., 2^o, sts^{- 6}5-^-/ i l^^sppda⁶/^-!/^monovuⁱW8^u..₎Vypr.V ί(BS^-(^alt-8^, sto 131-34 099^r-), bropiryreina/Chńshi i Maaddh, Hm^-ok^tao Kwe, ^p0, sto ^.95-20^o 0994,), ^bo ridosUn (ίΤε^ηεν i ws^- .,Vopr. νΐη^Ι., 3 H -T^-28 (1994)0 mo^rą^ncarówninⁿpodawRVl^Rro -zynmkektywupące Utop-R wpo^zemu z ^ηιρ^βϋπ ^uetoromeΓy2enym^t LT-e/β, Ab ^orzeT^-wko LT-6-R cdbL ich ^γρΚμφ-ιτ. W l^i^mp/^m wypadku, spLToby poAawame oek dLW^-i op tymolnc mog' b^-- okre.

ślonaem^oiryνzγiawop-LC⁾γ ta kpubl^leoγvβosraporty jr^a)o peektypv^yjśa^la cIo e^gt^toγahskcei p/oae n^uynrγvepk^oeeduβykl^-e^Lene.

IN-y^6-pd ^e1

M^v^^ tol/dj ąwstrzyknięcia ludzkich υΓ-α1/β2.

^MysK^e ^7° 6 ,w wtoku 6-Stygotbu) Ta&limatyzowane przez kilka dni do pomieszczenia,nos^dk:ykc⁷ęto ip^e 8 mg -600 mg/k^-- D)^α2^-a^htoaίτzm^²kt^βra uczuk mysz^- na mpfyw TOF ^- iaayrh^odków pozeoiwnowotworowych^jNatOępoto^ąo^kawano ψ hi^^iTN² , LT-e Tlbo LTaa-^2.

185 364

Tabela 3
Czynnik	Dawka (ąg/zwierzę)	Przeżycie
Sól fizjologiczna	-	4/4
hu-TNF	0,2	0/6
hu-TNF	1,0	0/2
hu-TNF	10	0/4
hu-Lt-α	0,2	2/2
hu-Lt-α	1,0	2/2
hu-Lt-al/β2	10	2/2
hu-Lt-α 1/ β2	100	2/2
Przykład 12

Konstruowanie rekombinowanego przeciwciała monoklonalnego IgM przeciwko LT-P-R.

Stosując opisane wyżej testy cytotoksyczności przeciwnowotworowej połączone ze standardowymi modelami wzrostu guza na myszach z niedoborem odporności, mogą być wybrane IgG przeciwko LT-P-R o odpowiednich właściwościach. W celu wytworzenia DNA domeny zmiennej z RNA wyizolowanego z wydzielającej linii komórkowej hybrydoma, przy użyciu standardowej metodyki odwrotnej transkryptazy/PCR, można zastosować uniwersalne startery hybrydyzujące z każdą z domen łańcucha ciężkiego i lekkiego wybranego IgG przeciwko LT-P-R. Protokoły te zostały opisane (Arulanandam i wsp., J. Exp. Med., 177, str. 1439-50 (1993); Lane i wsp. Eur. J Immunol., 22, str. 2573-78 (1993); Traunecker i wsp., Nature, 339, str. 68-70 (1989)).

Amplifikowane produkty są włączane do wektorów zawierających ludzkie domeny łańcucha (i CH1, CH2 i CH3. Równoczesna ekspresja dwóch łańcuchów w pojedynczym gospodarzu powinna umożliwić łączenie się łańcuchów ciężkich i lekkich w pentameryczną cząsteczką IgM. Ta cząsteczka jest chimerą zbudowaną z mysich regionów zmiennych połączonych z ludzkimi regionami stałymi.

Alternatywnie, może być zastosowany proces wykorzystujący PCR do amplifikacji DNA kodującego jedynie istotny region wiążący regionów zmiennych. Amplifikowany DNA jest następnie wprowadzany do wektorów zawierających całość sekwencji ludzkiej IgG, z wyjątkiem konkretnych aminokwasów związanych z wiązaniem antygenu. Konstrukty takie zwane są przeciwciałami „humanizowanymi” zaś szczegółowa metoda ich wytwarzania jest dobrze znana (np. WO 94/04679).

Przykład 13

Przeciwciała monoklonalne IgM przeciwko LT-P-R działaaąjako czynniki aktywujące LT-P-R.

Przeciwciała IgM przeciwko LT-P-R mogą być wytwarzane w postaci rekombinowanej jak to opisano w przykładzie 12. Alternatywnie, kompletne mysie IgM izolowane przez technikę fuzyjną hybrydoma, z użyciem pierwotnej immunizacji normalnych myszy albo intensywnej immunizacji myszy o uszkodzonej sygnalizacji przez CD40 (#24) można zastosować jako źródło mAb IgM przeciwko LT-P-R.

mAb IgM przeciwko LT-P-R powinny być znacznie silniejsze jako czynniki aktywujące LT-P-R w porównaniu z ich normalnymi dwuwartościowymi odpowiednikami IgG, jak zmierzono przez zależną od dawki odpowiedź w teście cytolitycznym HT29 w obecności IFN-y. mAb IgM przeciwko LT-P-R działaj^jako czynniki aktywujące LT-P-R zarówno gdy są unieruchomione jak i podawane w roztworze. Oprócz tego, oczekuje się, że powinny one wspomagać aktywność przeciwnowotworową. kompleksów heteromerycznych LT-a/P.

Przykład 14

Przeciwciała monoklonalne przeciwko LT-P-R hamują wzrost ludzkich komórek nowotworowych u myszy SCID.

Myszy Balb/c SCID (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) nastrzyknięto 1 x 10⁶ trypsynizowanych i płukanych ludzkich komórek gruczolakoraka WiDr w objętości 0,2 ml PBS, pod26

185 364 skórnie (sc) w grzbiet. Wstrzyknięte komórki WiDr tworzą guzy u myszy, zaś zdolność mAb przeciwko LT-p-R do hamowania wzrostu guza była badana. W jednym zestawie doświadczeń, myszy leczono lub nie mAb przeciwko LT-p-R CBE11, z lub bez ludzkiego IFN-y (10⁶jednostek przeciwwirusowych na mysz), w tym samym czasie góy wstrzyknięto komórki WiDr sc (figura 6A). Przeciwciała i IFN-y podawano same albo razem przez wstrzyknięcie ip w 0,2 ml. Myszom kontrolnym podawano sam roztwór soli, sam IFN-y albo kontrolne mAb przeciwko ludzkiej LFA-3 (1E6) z IFN-y. Wielkość każdego powstałego guza oceniano 30 dni po wszczepieniu. Objętość guza (w cc) obliczano na podstawie średnicy określonej przez pomiar mikrometrem w dwóch wymiarach. Zwierzęta leczone mAb CBE albo 1E6 otrzymywały 10 pg/mysz albo 50 pg/mysz przeciwciała (figura 6A; odpowiednio, kółka z kropkami i kółka puste).

W innym zestawie doświadczeń, myszy szczepiono komórkami WiDr, po czym pozostawiano je w celu rozwinięcia guza, na 15 dni, po czym mymzy lamzono mAb CBE 11 przeciwko LT-p-R (figura 6B). w dniu 15 (przed leczeniem przeciwciałem), średnia objętość guza wynosiła 0,076 cc, z przecięneą średn icą równą 0,53 cm. Następnie, podawano mAb przeciwko LT-β -R CBE 11 (50 pgn, z lub b ez ludzkiego IFN-y (^jednostek pszeeiwwirusowych/m^psz), przez wstrzyknięcie ip w 0,2 ml grupie 12 zwierząt. Wstrzykeięβ⁽α powtarzano trzykrotnie w ciągu trzech tygodni. Grupy kontrolne (12 myszy/grupę) otrzymywały sam IFNy (i^--jadeo-teU prreciww^tγusoęeych_//mγγz) albo 50 pg kontrolnego mAb przeeiwUc ludzkiej LFA-3 (1E6) + IFN-y (10₆ 1-05^-- β(zaciwwiru-cwγch/mysz). Wzrost guza t-tntejącegc w dniu 15 6caeiaeo w czasie, od 1^- óo 49 dni po wszczepieniu gWz. Wyniki poUtzane na ⁿgdeze 6B oceniano na ślepo. Guzy leczone mAb CBE1^c z hub baz IFN-y przeutawafy rosnąć. Po trzech wsteryUetęe^lteh mAb CBE^c 1 (+/- IFN-C) w ciągu trzech tygodni, wzrost guza ąatroymał się na co najmniej' 7 tygodni p1 wszczepⁱeetu, kiedy to do^jwiaóczeete zakończon.

185 364

Fig. 1A absorbancja przy 280nm

Q O Ω Q -JC 2

minuty

185 364

Fig. IB absorbancja przy 280 not

minuty

185 364

stężenie ng/ml stężenie ng/ml

Bpoueqjosqe

185 364 absorbancja absorbancja

Fig. 2B

185 364

Bpoucąjosąe

oo

185 364

CDH10 4 CBE11

185 364 to σ»

Ή iniekcja

rl

C φ

•Η &

Φ

Ν

Ο

Ν (0 ίε

Ο

Λ •rł ϋ

α

ΟΟΟ ΟΟΟ @ ο§ <φο sśSeP³³

Γ

ΙΛ «*>

Τ

CO

Τ-Γ

ΙΟ CM CM

Τ—“Τ

UJ τΤ to

Ο ®Ο

Oty szn§ oso^fcTM

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia albo zmniejszenia zaawansowania, ciężkości albo skutków powstawania nowotworu, znamienna tym, że obejmuje skuteczną terapeutycznie ilość co najmniej jednego czynnika aktywującego LT-P-R oraz farmaceutyczne dopuszczalny nośnik, przy czym czynnik aktywujący LT-P-R jest przeciwciałem anty-LT-P-R.
2. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że czynnikiem aktywującym LT-p-R jest przeciwciało monoklonalne.
3. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 2, znamienna tym, że przeciwciało monoklonalne anty-LT-p-R jest wybrane z grupy składającej się z anty-LT-p-R mAb BKA11, CDH10, BCG6, BHA10, CBE11, AGH1 oraz BDA8, przy czym numery dostępów nadane przez ATCC dla linii komórek hybrydoma albo ich klonów wytwarzających powyższe przeciwciała monoklonalne mAb wynoszą odpowiednio HB 11799, HB 11797, HB 11794, HB 11795, HB 11793, HB 11796 oraz HB 11798.
4. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 3, znamienna tym, że przeciwciało monoklonalne anty-LT-P-R jest CBE11.
5. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 2, znamienna tym, że przeciwciało monoklonalne anty-LT-P-R jest humanizowanym przeciwciałem otrzymanym z przeciwciała wybranego z grupy składającej się z BKA11, CDH10, BCG6, BELA. 10, CBE11, AGH1 oraz BDA8 wytworzonych z linii komórek hybrydoma albo ich klonów o numerach dostępów nadanych przez ATCC wynoszących odpowiednio HB 11799, HB 11797, HB 11794, HB 11795, HB 11793, HB 11796 oraz HB 11798.
6. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 5, znamienna tym, że przeciwciało monoklonalne anty-LT-P-R jest humanizowanym przeciwciałem otrzymanym z CBE11.
7. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia albo zmniejszenia zaawansowania, ciężkości albo skutków powstawania nowotworu, znamienna tym, że obejmuje skuteczną terapeutycznie ilość co najmniej dwóch czynników aktywujących LT-P-R oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, przy czym co najmniej jeden czynnik aktywujący LT-P-R stanowi przeciwciało anty-LT-P-R.
8. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 7, znamienna tym, że przeciwciało anty-LT-P-R jest przeciwciałem monoklonalnym.
9. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 8, znamienna tym, że przeciwciałem anty-LT-P-R jest CBE11, przy czym HB 11793 jest numerem dostępu nadanym przez ATCC dla linii komórek hybrydoma albo ich klonów wytwarzających CBE11.
10. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 7, znamienna tym, że co najmniej dwa czynniki aktywujące LT-P-R obejmują przeciwciała monoklonalne anty-LT-P-R, które są skierowane przeciwko nie nakładającym się epitopom LT-P-R.
11. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 10, znamienna tym, że jedno przeciwciało monoklonalne anty-LT-P-R jest wybrane z grupy składającej się z AGH1 i BDA8, zaś drugie przeciwciało monoklonalne anty-LT-P-R jest wybrane z grupy składającej się z BCG6, BHA10, BKA11, CDH10 i CBE11, przy czym numery dostępu nadane przez ATCC dla linii komórek hybrydoma albo ich klonów wytwarzających mAb BKA.11, CDH10, BCG6, BHA10, CBE11, AGH1 oraz BDA8 wynoszą odpowiednio HB 11799, HB 11797, HB 11794, HB 11795, HB 11793, HB 11796 oraz HB 11798.
12. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 10, znamienna tym, że jedno przeciwciało monoklonalne anty-LT-P-R jest wybrane z grupy składającej się z BCG6 i BHA10, .zaś drugie przeciwciało monoklonalne anty-LT-P-R jest wybrane z grupy składającej się z AGH1, BDA8, BKA11, CDH10 i CBE11, przy czym numery dostępu nadane przez ATCC dla linii komórek hybrydoma albo ich klonów wytwarzających mAb BKA11, CDH10, BCG6,

185 364

BHA10, CBE11, AGH1 oraz BDA8 wynoszą odpowiednio HB 11799, HB 11797, HB 11794, HB 11795, HB 11793, HB 11796 oraz HB 11798.
13. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 10, znamienna tym, że jedno przeciwciało monoklonalne anty-LT-P-R jest wybrane z grupy składającej się z BKA11 i CDH10, zaś drugie przeciwciało monoklonalne anty-LT-P-R jest wybrane z grupy składającej się z AGH1 i BDA8, BCG6, BHA10, i CBE11, przy czym numery dostępu nadane przez ATCC dla linii komórek hybrydoma albo ich klonów wytwarzających mAb BKA11, CDH10, BCG6, BHA10, CBE11, AGH1 oraz BDA8 wynoszą odpowiednio HB 11799, HB 11797, HB 11794, HB 11795, HB 11793, HB 11796 oraz HB 11798.
14. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 10, znamienna tym, że jedno przeciwciało monoklonalne anty-LT-P-R jest przeciwciałem CBE11, zaś drugie przeciwciało monoklonalne anty-LT-P-R jest wybrane z grupy składającej się z AGH1, BDA8, BCG6, BHA10, BKA11, CDH10 i CBE11, przy czym numery dostępu nadane przez ATCC dla linii komórek hybrydoma albo ich klonów wytwarzających mAb BkA1 1, CDH10, BCG6, BHA10, CBE11, AGH1 oraz BDA8 wynoszą odpowiednio HB 11799, HB 11797, HB 11794, HB 11795, HB 11793, HB 11796 oraz HB 11798.
15. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 10, znamienna tym, że przeciwciałami monoklonalnymi anty-LT-P-R są CBE11 i BHA10, przy czym numery dostępu nadane przez ATCC dla linii komórek hybrydoma albo ich klonów wytwarzających mAb BHA10 i CBE11 wynoszą odpowiednio HB 11795 oraz HB 11793.
16. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 10, znamienna tym, że przeciwciałami monoklonalnymi anty-LT-P-R są CBE11 i CDH10, przy czym numery dostępu nadane przez ATCC dla linii komórek hybrydoma albo ich klonów wytwarzających mAb CDH10 i CBE11 wynoszą odpowiednio HB 11797 oraz HB 11793.
17. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 10, znamienna tym, że przeciwciałami monoklonalnymi anty-LT-P-R są AGH 1 i CDH10, przy czym numery dostępu nadane przez ATCC dla linii komórek hybrydoma albo ich klonów wytwarzaj ących mAb CDH10 i AGH1 wynoszą odpowiednio HB 11797 oraz HB 11796.
18. Kompozycja farmaceutyczna, według zastrz. 10 albo 11 albo 12 albo 13 albo 14 albo 15 albo 16 albo 17, znamienna tym, że obejmuje jeszcze IFN-γ jako jeden z czynników aktywujących LT-P-R.
19. Kompozycja farmaceutyczna do leczenia albo zmniejszenia zaawansowania, ciężkości albo skutków powstawania nowotworu, znamienna tym, że jako czynnik aktywujący LTP-R obejmuje skuteczną terapeutycznie ilość sieciowanych przeciwciał anty-LT-P-R, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
20. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 19, znamienna tym, że sieciowane przeciwciała anty-LT-P-R są unieruchomione nie kowalencyjnie na powierzchni.
21. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 19, znamienna tym, że sieciowane przeciwciała anty-LT-P-R są unieruchomione kowalencyjnie na powierzchni.
22. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 19, znamienna tym, że sieciowane przeciwciała anty-LT-P-R są nie kowalencyjnie agregowane w roztworze przy użyciu czynnika sieciującego przeciwciało anty-LT-P-R.
23. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 22, znamienna tym, że czynnik sieciujący przeciwciało anty-LT-P-R obejmuje przeciwciało wtórne skierowane przeciwko przeciwciału anty-LT-P-R.
24. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 19, znamienna tym, że sieciowane przeciwciała anty-LT-P-R są kowalencyjnie agregowane w roztworze przy użyciu chemicznego czynnika sieciującego przeciwciało anty-LT-P-R.
25. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 19 albo 20, albo 21, albo 22, albo 23, albo 24, znamienna tym, że obejmuje jeszcze IFN-y jako drugi czynnik aktywujący LT-P-R.

185 364