KR20040102364A - 항종양제로서의 림프독소-α/β 복합체 및항-림프독소-β수용체 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 종양 세포에 대해 유력한 항증식 효과를 유도하는 LTp-β수용체 신호작용을 활성화하는 데에 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 림프독소-α와 림프독소-β의 다수 서브유닛 사이에 형성된 림프독소 헤테로머 복합체에 관한 것인데, 이것은 림프독소-β 수용체 활성화제의 존재하에 종양 세포 세포독성 효과를 유도한다. 또한 림프독소-α/β복합체의 존재 또는 부재하에 림프독소-β 수용체 활성화제로서 단독으로 또는 다른 림프독서-β 수용체 활성화제와 함께 작용하는 림프독소-β 수용체에 대해 유도된 항체도 본 발명의 범위내에 포함된다. 이러한 항체를 선별하는 검색 방법도 제공된다. 본 발명은 또한 종양 세포의 세포독성을 증진시키기 위해 다른 림프독소-β 수용체 활성화제의 존재하에 또는 단독으로 교차결합된 림프독소 수용체 항체를 사용하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

항종양제로서의 림프독소-α/β 복합체 및 항-림프독소-β수용체 항체{LYMPHOTOXIN-α/β COMPLEXES AND ANTI-LYMPHOTOXIN-β RECEPTOR ANTIBODIES AS ANTI-TUMOR AGENTS}
본 발명은 림프독소-β 수용체 신호작용을 활성화시켜서, 종양 세포상에 강력한 항-증식 효과를 유도하는 데에 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 말하자면, 본 발명은 림프독소-α와 림프독소-β의 다수의 서브유닛들 사이에서 형성된 림프독소 헤테로머 복합체에 관한 것으로, 그 복합체는 림프독소-β 수용체 활성화제의 존재하에서 종양 세포에 대해 세포독성 효과를 유도한다. 또한, 본 발명의 범위내에는 림프독소-β 수용체에 대해 유도된 항체도 포함되는데, 이 항체는 림프독소-α/β 복합체의 존재 또는 부재하에서, 단독으로 또는 그 밖의 다른 림프독소-β수용체 활성화제와 함께 림프독소-β수용체 활성화제로서 작용한다. 그러한 항체를 선택하는 검색 방법이 제공된다. 또한, 본 발명은 다른 림프독소-β수용체 활성화제의 존재하에서, 가교된 항-림프독소-β수용체 활성화제를 이용하여 종양 세포의 세포독성을 증진시키는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
종양 괴사 인자(TNF) 수용체 군은 괴사(necrosis) 또는 고사(apoptosis)(계획된 세포 사멸)에 의해 종양 세포 사멸을 유도할 수 있는 신호 작용을 갖는 여러 멤버를 갖는다. 리간드 TNF와 림프독소-α(LT-α; 종래 TNF-β로 불리던 것)는 TNF 수용체(p60 및 p80; 본원에서는 "TNF-R"이라고 명명함)에 결합하여 이것을 활성화시킨다. TNF-R의 신호작용은 정상 세포에서의 감염 또는 스트레스에 대한 일반 면역반응을 개시하지만, 형질전환된 표현형을 지닌 세포 또는 종양 세포에 세포 독성을 갖는다. TNF-R 신호작용은 종양 세포 및 비루스-감염된 세포를 선택적으로 용해시킬 수 있다. 종양 세포에 대한 TNF-R 신호작용의 세포독성 효과는 인터페론-γ(IFN-γ)와 다양한 통상의 화학요법제에 의해 강화된다.
치료 목적으로 종양세포에서의 TNF-R 신호작용에 의해 유도된 항-증식성 또는 세포 독성 활성을 이용하는 것이 유용할 것이다. 그러나, TNF-R 활성화는 전-염증성 다단계 반응의 개시를 포함하는 다양한 면역 조절 반응에 대해 다형질 발현 효과를 갖는다. 따라서, 사람에게 일반적인 독성을 일으키는 염증 반응을 동시에-자극하지 않고 종양 세포에 대한 TNF-R 신호작용의 세포독성 효과를 유도시킬 수 없었다.
유사하게, Fas 수용체(FasR)이라고 불리는 다른 TNF-계 수용체의 자극은 다양한 종양 또는 비-종양 세포 유형에서 계획된 세포 사멸에 의한 세포독성을 유도할 수 있다. 그러나, FasR 활성화는 신속한 간 괴사를 일으키는 것으로 알려졌기 때문에, 치료용으로 인체에 사용하는 것은 배제되어 왔다.
최근에, LT-β 수용체(LT-β-R)라고 명명된 TNF 군의 또 다른 수용체가 확인되었다(Crowe 등,Sience, 264, pp 707-10(1994)). LT-β-R은 림프독소-β(LT-β)로 명명된 또 다른 TNF-관련 폴리펩티드와 함께 LT-α 서브유닛을 포함하는 헤테로머 림프독소 복합체(LT-α/β)에 결합한다. 이러한 LT-α/β 복합체는 막결합성이고, 대부분이 LT-α1/β2 화학량론을 갖는다(Browning 등,Cell, 72, pp.847-56(1993); Browning 등,J. Immunol., 154, pp.33-46(1995)).
TNF-R 및 다른 TNF-유사 수용체와 유사하게, LT-β-R 신호작용의 활성화는 세포 표면상의 다수의 수용체가 상당히 근접할 때 발생한다고 생각된다(Crowe 등,Science, 264, pp. 707-10(1994)). 이 과정은 수용체 회합(receptor clustering)으로 언급한다. TNF와 LT 리간드는 1 개 이상의 수용체에 동시에 결합하여 이들을 회합할 수 있는 다가 복합체이다. 다른 계에서 수용체 활성화를 위한 수단으로서 수용체 회합은 널리 알려져 있는데, 특히 수용체 티로신 키나제에 대해 널리 알려져 있다( Ullrich 및 Schlessinger,Cell, 61, pp. 203-212(1990); Kolanus 등,Cell, 74, pp. 171-83(1993)). 따라서, 표적 종양 세포의 표면상에 LT-β-R 분자의 회합 및 하류 신호작용을 유도할 수 있는 LT-α1/β2 리간드 및/또는 LT-β-R 활성화제를 투여하는 것은 이들 세포에서 LT-β-R 경로를 직접적으로 자극시키는데 유용하다.
TNF-R과 마찬가지로 LT-β-R에 의한 신호작용은 종양 세포에서 세포독성 및 세포 사멸을 유도하는 경로를 활성화시킬 수 있다. 중요한 점은, LT-α1/β2 리간드가 현저한 친화성으로 TNF-R과 결합하지 않는다는 것이다. 이러한 이유로, 종양세포에서 유도된 LT-β-R 활성화는 TNF-R 활성화와 관련된 염증성 경로를 자극하지 않고 그러한 세포들에 세포독성을 유발하기 때문이다. 따라서, LT-α1/β2 및/또는 LT-β-R 활성화제를 사용한 치료는 TNF-R 또는 FasR 활성화가 항-종양 치료제로서 사용되어 오면서 직면하게 되는 유력한 부작용을 극복하면서, 종양생성 세포(종양)의 진행, 심화 또는 효과를 치료하거나 또는 경감시키는 데에 유용하다.
본 발명은 TNF-관련된 염증 반응을 동시에-자극시키지 않고 LT-β-R 신호작용을 자극시킴으로써 종양세포를 치료하는 약학 조성물 및 방법을 제공하여 상기의 문제점들을 해결하고자 한다. 한가지 양태에서는, LT-α와 다수의 LT-β 서브유닛 사이에서 형성된 림프독소 복합체가 제공되는데(LT-α/β 헤테로머 복합체), 이 복합체는 LT-β-R 활성화제의 존재하에서 LT-β-R을 보유하는 세포에 세포독성 효과를 유도한다. 이 양태의 바람직한 조성물 및 방법은 LT-β-R 활성화제의 존재하에서 LT-α1/β2 복합체를 포함한다. LT-α1/β2 복합체가 막-결합 형태보다는 가용성이고, LT-β-R 활성화제가 INF-γ인 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, LT-β-R에 대하여 유도된 1 개 이상의 항체(항-LT-β-R Ab)가 LT-α/β 헤테로머 복합체와 함께 제2의 LT-β-R 활성화제로서 사용된다. 이 양태의 바람직한 조성물 및 방법은 제1의 활성화제로서 IFN-γ 및 제2의 LT-β-R 활성화제로서 1 개 이상의 항-LT-β-R Ab의 존재하에서 LT-α1/β2를 포함하는 것을 특징으로 한다. LT-α1/β2 복합체는 가용성이고, 항체는 단일클론 항체(항-LT-β-R mAb)인 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 또 하나의 양태에서는, 제2 LT-β-R 활성화제의 존재 또는 부재하에서 1종 이상의 항-LT-β-R Ab가 외래의 LT-α/β 헤테로머 복합체 없이 사용된다. 이 양태의 바람직한 조성물 및 방법은 IFN-γ와 함께 LT-β-R의 비중첩성 에피토프(epitopes)를 인지하는 2종 이상의 항-LT-β-R 단일클론 항체(항-LT-β-R mAb)를 포함하는 것이 바람직하다.
또 다른 양태로, 본 발명은 제2의 LT-β-R 활성화제와 함께 사용되는 가교된 항-LT-β-R Abs를 특징으로 하여 종양 세포의 세포독성을 증진시키는 약학 조성물 및 방법을 제공한다. 바람직한 한 가지 양태에서는, 각각의 항-LT-β-R Abs는 이들은 표면상에 가교시킴으로써 고정화한다. 다른 바람직한 양태에서, 항-LT-β-R Abs는 용액 중에서 가교된다. 항-LT-β-R Abs는 단일클론 항체이고, 제2의 LT-β-R 활성화제는 IFN-γ이다.
본 발명은 항-LT-β-R Abs와 같은 LT-β-R 활성화제를 선택하는 신규한 검색 방법을 제공하는데, 상기 활성화제는 LT-α/β 헤테로머 복합체와 함께 기능하여 종양 세포 사멸을 촉진시킨다. 이 분석에서는 세포독성 분석에서 LT-β-R 활성화제의 존재하에서 LT-α/β 헤테로머 복합체에 대한 인체 선암 세포의 증가된 민감성을 이용한다. 추정 LT-β-R 활성화제를 시험하는데 사용되는 절차는 항-LT-β-R 항체의 경우로 예시하였고, 하기 단계 1), 2) 및 3)을 포함한다:
1) 종양 세포(예를 들면, HT29 인체 선암 세포)를, IFN-γ를 포함하는 배지에서 수일 동안 배양시키고, 분석하려는 특정 항-LT-β-R Ab의 존재 또는 부재하에서 LT-α1/β2를 정제하고;
2) 살아있는 세포를 염색하는 염료로 상기 세포를 처리하고; 그리고,
3) 각 샘플에 대해, 염색된 세포수를 정량분석하고, LT-α1/β2, IFN-γ 및 시험 항-LT-β-R Ab의 존재하에서 사멸된 종앙 세포의 분율을 측정한다. 한편, 살아 있는 세포의 수는 DNA 내로3H-티미딘을 혼입하는 것과 같이, 세포 생존성을 측정하는 공지된 다수의 분석시험에 의해 측정할 수 있다.
이러한 세포독성 분석 시험에서 사멸된 종양 세포의 백분율을 현저하게 증가시키는 항-LT-β-R Ab(또는 Ab 조합)는 본 발명의 범위 내에 있는 LT-β-R 활성화제이다. 이러한 세포 용해 분석은 LT-α/β 헤테로머 복합체와 함께 기능하는 신규한 LT-β-R 활성화제를 확인하기 위해 적용할 수 있다.
도 1a는 TNF-R 및 LT-β-R 면역친화성 크로마토그래피에 의해 분리되는 정제된 LT-α/β 헤테로머 복합체 형태의 크기 분석을 도시한 것이다. 정제된 단백질은 인산염-완충된 염수 중의 TSK 3000 HPLC 수지 상에서 분석한다. 다양한 크기의 마커의 위치가 나타나 있다.
도 1b는 BioCad 기기(퍼셉티브 바이오시스템스)상에 포로스(Poros) 카르복시메틸 칼럼(4.6mm×100mm)을 사용하여 정제된 LT 형태의 이온 교환 분석을 도시한 것이다. 각 샘플 단백질 27㎍을 칼럼상에 부가하고, 16.66 μM 헤페스(Hepes), 16.66 μM 나트륨 아세테이트 및 16.66 μM Mes 완충액(pH 6.5)을 함유하는 완충액 에서 5 ㎖/분으로 20 칼럼 부피에 걸쳐 0 내지 1M 염화나트륨의 구배에서 용출시켰다.
도 2a는 80 U/㎖ IFN-γ의 존재 또는 부재하에서 인체 선암 HT29 세포상의 항-Fas 수용체 mAb CH-11(-●-); TNF(-○-); LT-α(-□-); LT-α1/β2(-■-); 및 LT-α2/β1(-◆-)의 세포독성 활성도를 비교한 것이다.
도 2b는 80 U/㎖ IFN-γ의 존재하에서 도 2A의 세포 독성 효과를 억제하는,5㎍/㎖의 인체 IgG(-●-), 가용성 p60TNF-R-Fc(-○-) 및 가용성 LT-β-R-Fc 수용체-면역글로불린 키메라(-□-)의 능력을 비교한 것이다.
도 3은 항-LT-β-R mAb가 인체 선암 HT29 세포상에 LT-α1/β2의 세포독성 효과를 증진시키는 것을 도시한 것이다. (A) HT29 세포에 대한 LT-α1/β2 세포독성 효과는 항-LT-β-R mAb CDH10의 존재하에서 증진된다. LT-α1/β2 효과는 0.5 ㎍/㎖ 대조군 IgGl(-■-), 0.05 ㎍/㎖ CDH10(-○-) 및 0.5 ㎍/㎖ CDH10(-□-)의 존재하에서 mAb 없이(-●-) 측정한 것이다. (B) HT29 세포에 대한 LT-α1/β2 세포 용해 효과는 항-LT-β-R mAb BDA8의 존재에 의해 억제된다. LT-α1/β2의 효과는 2 ㎍/㎖ 대조군 IgGl(-■-) 또는 항-LT-β-R mAb BDA8(-□-)의 존재하에서 측정하였다. 이 분석에서 CDH10과 BDA8 항-LT-β-R mAb간의 거동의 차이점은 그것들이 LT-β-R의 상이한 에피토프에 대해 유도된다는 하나의 표시이다.
도 4는 고정화된 항-LT-β-R mAb가 인체 선암 HT29 세포에 대해 세포 독성을 나타냄을 도시한 것이다. (A) 항-LT-β-R mAb는 그들이 표면상에 고정될 때 HT29 세포에 대해 직접적인 세포독성 효과를 갖는다. 평판을, IgGl(-●-), 관계 없는 풍부한 세포 표면 항원 HT29/26에 대해서 유도된 mAb(-■-), BDA8(-○-) 및 CDH10(-□-)으로 코팅하였다. (B) HT29 세포의 성장에 대한 가용성 항-LT-β-R mAb의 효과. 기호는 (A)와 동일. 가용성 형태의 항-LT-β-R mAb는 별도로 투여되는 경우 HT29 세포에 현저한 세포독성 효과를 가진다.
도 5는 가용성 항-LT-β-R mAb의 여러 쌍으로 치료함으로써 종양 세포에 대해 증진된 세포 독성의 대표적인 정량분석 결과를 도시한 것이다. (A) 대조군IgGl(100 ng/㎖), 항-LT-β-R mAb BHA10(100 ng/㎖), 항-LT-β-R mAb CBE11(50 ng/㎖), BHA10(100 ng/㎖)+IgG(100 ng/㎖) 및 BHA10(100 ng/㎖)+CBE11(50 ng/㎖)의 HT29 세포에 대한 세포독성 효과. IFN-γ은 80 U/㎖로 존재하였다. (B) 대조군 IgGl(100 ng/㎖), 항-LT-β-R mAb CDH10(100 ng/㎖), 항-LT-β-R mAb CBE11(50 ng/㎖), CDH10(100 ng/㎖)+IgGl(100 ng/㎖) 및 CDH10(100 ng/㎖)+CBE11(50 ng/㎖)의 HT29 세포에 대한 세포독성 효과. IFN-γ은 80 U/㎖로 존재하였다. (C) 대조군 IgGl(100 ng/㎖), 항-LT-β-R mAb CDH10(33 ng/㎖), 항-LT-β-R mAb AGH1(50 ng/㎖) 및 CDH10(33 ng/㎖)+AGH1(50 ng/㎖)의 HT29 세포에 대한 세포독성 효과. IFN-γ은 80 U/㎖로 존재하였다. (D) WiDr 인체 선암 세포가 이 세포독성 분석[Raitano와 Korc,J. Biol. Chem., 265, pp. 10466-472(1990)]에 사용되었다는 것을 제외하고는 (C)와 동일함.
도 6은 항-LT-β-R mAb로 처리한 SCID 마우스의 종양 크기를 도시한 것이다. (A) 항체 동시 처리를 동반한 접종 후 30 일째의 SCID 마우스 내 인체 선암 WiDr 종양의 크기. 마우스를 염수, IFN-γ 단독, IFN-γ의 존재 및 부재하에서의 항-LT-β-R mAb(CBE11), IFN-γ 존재하에서의 대조군 항-인체 LFA-3 mAb(1E6)으로 1 및 2일째에 처리하였다. 각 군의 평균을 크로스바로 표시하였다. 5개 군(왼쪽에서 오른쪽까지)에 대한 평균, 표준 편차 및 동물의 수(괄호안)는 다음과 같았다: 0.88+/-0.59(14), 1.21+/-0.7(21), 0.041+/-0.052(16), 0.11+/-0.1(12) 및 0.98+/-1.16(12). (B) 접종후 15일 경과후 항체처리한 종양 세포를 접종하고 14 내지 49일 경과한 후 SCID 마우스 내 인체 선암 WiDr 종양의 크기. 종양은 어떠한 처리도 없는 경우 평균직경 0.53 ㎝(0.076 ㏄)까지 성장하였고, 복강내 주사는 15 일째에 시작하여 화살표로 나타낸 바와 같이 계속하였다. 12 마리 동물군에 대해서 평균 및 표준 편차를 표시하였는데, 그 동물들은, IFN-γ 단독(1×106U/주사액)(-□-), 50 μg 1E6 항-LFA-3 mAb를 가진 IFN-γ(-○-), 50 μg CBE11 항-LT-β-R mAb을 가진 IFN-γ(-△-) 또는 50 μg CBE11 항-LT-β-R mAb 단독(도시하지 않음)으로 처리하였다.
본 명세서에 기술된 본 발명을 충분히 이해할 수 있도록, 하기에 상세한 설명을 제시한다.
"항-종양 활성"이란 어떤 물질 또는 조성물이 이들과 상호작용하는 종양 세포의 증식을 차단하거나, 또는 종양 세포의 사멸을 유도하는 능력을 의미한다.
"고사"란 용어는 계획된 세포 사멸 과정을 의미한다.
"세포 독성 활성"이란 용어는 어떤 물질 또는 조성물이 이들과 상호작용하는 세포의 사멸을 유도하는 능력을 의미한다.
"에피토프"(또는 항원결정기)란 용어는 항체 분자상의 단일 항원 반응 부위와 결합하는 분자의 일부로서 정의된다. 모노클로날 항체(mAb)는 단일 에피토프를인지한다. 보통 폴리클로날 항체(Ab)는 복수 에피토프를 인지한다.
항체의 "Fc 영역(domain)"이란 CH2, CH3 및 힌지 영역을 포함하지만 항원 결합 부위를 결여한 분자의 일부를 의미한다.
"인터페론 유도제"란 용어는 Ⅰ형(IFN-α, IFN-β) 또는 Ⅱ형(IFN-γ) 인터페론의 내인성 생산을 직접적으로 또는 간접적으로 자극할 수 있는 임의의 작용제를 의미한다. 인터페론 유도제의 예로는 2본쇄 RNA 분자 및 다양한 식물 또는 약학적으로 유도된 화합물이 있다.
"LT-α 뮤테인(mutein)"과 "LT-β 뮤테인"이란 용어는 상응하는 천연 폴리펍티드의 아미노산 서열과 비교해서 1개 이상의 아미노산 변형을 갖는 LT-α 또는 LT-β 폴리펩티드를 의미한다.
"LT-β-R 활성화제"란 용어는 LT-β-R에 결합하는 리간드, 세포 표면 LT-β-R 회합체 형성 또는 LT-β-R 신호작용을 증가시키거나, LT-β-R 신호가 세포 내에서 해석되는 정도에 영향을 끼칠 수 있는 임의의 작용제를 의미한다. LT-β-R 활성화제의 예로는 IFN-α, IFN-γ, TNF, 인터페론 유도제, 가용성 항-LT-β-R Ab, 가교된 항-LT-β-R Ab 및 다가 항-LT-β-R Ab가 있다.
"항-LT-β-R 신호작용(signaling)"이란 용어는 LT-β-R 경로와 관련된 모든 분자 반응 및 그것으로부터 발생하는 후속 분자 반응을 의미한다.
"항-LT-β 수용체 항체"("항-LT-β-R Ab")란 용어는 LT-β 수용체의 1 이상의 에피토프를 인지하여 결합하는 임의의 항체를 의미한다.
"항-LT-β-R 수용체 모노클로날 항체"("항-LT-β-R mAb")란 용어는 LT-β-R의 단일 에피토프를 인지하여 결합하는 임의의 모노클로날 항체를 의미한다.
"가교된 항-LT-β-R (m)Ab"는 항-LT-β-R 항체 (Ab) 또는 (mAb) 가교제를 사용하여 용액 중에서 항체 회합체를 형성하도록 서로 가교되거나, 표면 또는 매트릭스상에 서로 매우 인접하게 고정되어 있는 LT-β-R에 대하여 유도되는 항체를 의미한다.
"항-LT-β-R Ab(또는 mAb) 가교제"란 용어는 항-LT-β-R Ab가 표적 세포 표면 LT-β 수용체에 결합하고, 회합체 형성을 증진시킬 수 있도록 용액 중에서 항-LT-β-R Ab를 공유결합으로 또는 비공유결합으로 회합시킬 수 있는 임의의 작용제를 의미한다. 이러한 가교제로는 화학적 가교제, 항-LT-β-R Ab 또는 mAb의 일부와 반응하는 2차 항체, 항-LT-β-R Ab와 결합할 수 있는 가용성 또는 표면-결합 Fc 수용체(내인성 또는 외인성)가 있으나, 이들에 국한되는 것은 아니다.
"LT-α 생물학적 활성", "LT-β 생물학적 활성" 및 "LT-α/β 생물학적 활성" 이란 용어들은 하기 1), 2) 및 3)으로 정의된다: 1) 상응하는 천연 서브유닛 또는 서브유닛 복합체의 1 이상의 에피토프에 대하여 유도되는 항체와의 면역학적 교차 반응성; 또는 2) LT 서브유닛 또는 서브유닛의 복합체가 TNF-R 또는 LT-β-R과 같은 LT-특이 수용체상의 리간드 결합 부위에 대해 경쟁하는 능력; 또는 3) 천연 LT 서브유닛 또는 복합체와 질적으로 공통하는 면역 조절 반응 또는 세포 독성 활성을 정량적으로 자극할 수 있는 능력.
"LT-α/β 헤테로머 복합체"라는 용어는 1 이상의 LT-α 서브유닛 및 1 이상의 LT-β 서브유닛 사이의 안정한 회합체를 의미한다. 서브유닛들은 정전기적 상호작용, 반데르 바알스 상호작용 또는 공유적 상호작용에 의해 회합할 수 있다. LT-α/β 헤테로머 복합체는 2 이상의 인접한 LT-β 서브유닛을 갖거나 인접한 LT-α 서브유닛을 결여하는 것이 바람직하다. 이 복합체는 LT-α1/β2의 화학량론을 갖는 것이 가장 바람직하다.
"다가 리간드"란 1 개 이상의 수용체 결합 부위를 갖고, 2 개 이상의 수용체 분자를 동시에 결합시켜 매우 밀접하게 근접시킬 수 있는 분자 또는 복합체를 의미한다.
"Ⅰ형 리더 서열"은 소포체(ER)막으로 단백질을 유도하고, 종종 전체 분비 경로를 통해 유도하는 신호로서 작용하는 진핵 단백질의 아미노-말단부이다. 이 리더 서열은 보통 ER 막의 신호 펩티다아제에 의해 절단된다.
"신호 서열"이란 용어는 원핵 숙주에서 진핵세포의 Ⅰ형 리더 서열의 기능적 등가물로서, 박테리아 지질 이중막 내로 또는 가로질러서 단백질의 전좌를 유도하는 서열을 의미한다.
"가용성 LT-α/β 헤테로머 복합체"는 가용성 LT-β 서브유닛을 포함하는 LT-α/β 헤테로머 복합체이고, 이 때 폴리펩티드를 막에 국부화시키는 아미노산 서열은 LT-β 서브유닛을 가용성으로 하면서, 제거되거나 불활성화된다. 가용성 LT-α/β 헤테로머 복합체는 두 서브유닛을 발현하도록 조작한 적절한 숙주 세포에 의해 분비될 수 있다.
"표면 LT-α/β 복합체"는 세포 표면에 나타나는 LT-α 및 막-결합된 LT-β 서브유닛을 포함하는 복합체이다.
막-결합된 LT-α/β 복합체의 제조
세포 표면 림프독소 복합체는 LT를 고농도로 발현시키는 CD4+T 세포 하이브리도마 세포(Ⅱ-23.D7)내에서 특징을 나타낸다. (Browning 등,J. Immunol., 147, pp.1230-37(1991); Androlewicz 등,J. Immunol. Chem., 267, pp. 2542-47(1192)). 성숙한 LT-α는 막투과 영역이 없으며, 1 개 이상의 막-결합된 LT-β 서브유닛과 상호작용을 통해 세포 표면에 국부화된다. 막-결합된(표면) LT-α/β 헤테로머 복합체는 압도적으로 LT-α1/β2 화학량론을 갖는다.
세포 막 단백질로서의 LT-β는 합성중에 LT-α와 결합하여 세포막으로 LT-α를 "표적화한다". LT-β가 없는 경우, LT-α는 세포외 배지내로 분비된다. LT 서브유닛은 보통 막내로 단백질을 배출하기 전에 세포 내부에서 복합체에 회합된다. 일단 LT-β 서브유닛이 막 내로 삽입되면, 서브유닛은 분비된 LT-α와 안정한 복합체를 형성하지 않는다. 따라서, 막결합형 LT-α/β 헤테로머 복합체를 의도한다면, 목적 LT-α 서부유닛 및 LT-β 서브유닛을 동일 세포내에서 동시에 발현시키는 것이 바람직하다.
표면 LT-α/β 헤테로머 복합체는 LT-α 및 LT-β 유전자 둘 다로 숙주 세포를 동시 형질감염시킴으로써 재구성할 수 있다. 표면 LT 복합체는 LT 유전자중 하나를 단독으로 발현시키는 안정한 세포주에서 관찰되지 않을 수도 있다. 그러나, 숙주 세포가 정상적으로 다량의 LT-α를 생성시킨다면(예를 들면, RPMI 1788 세포; 하기 참조), 목적 LT-β 폴리펩티드를 암호화하는 LT-β 유전자를 이용하는 형질감염은 전체-길이의 LT-α 서브유닛을 포함하는 LT-α/β 복합체를 생성시키기에 충분해야 한다.
다수의 진핵세포 발현 시스템에서 LT-α 및 LT-β 폴리펩티드의 동시-발현은 활성 리간드로서 이들의 조립 및 배출을 유도한다(Crowe 등,J. Immunol. Methods, 168, 79-89 (1994)). 사용할 수 있는 숙주 시스템을 CHO 세포, COS 세포 및 골수종을 포함하는 B 세포, 바쿨로비루스(baculovirus)-감염된 곤충 세포 및 효모를 포함할 수 있지만, 이에 국한된 것은 아니다.
본 발명의 LT-α/β 헤테로머 복합체의 LT-α 서브유닛은 림프독소-α, 천연의 인체 또는 동물 림프독소-α, 재조합 림프독소-α, 가용성 림프독소-α, 분비된 림프독소-α, LT-α 생물학적 활성을 갖는 림프독소-α 뮤테인, 또는 LT-α 생물학적 활성을 갖는 상기 림프독소-α중 어느 하나의 림프독소-α 단편들 중에서 선택할 수 있다.
LT-α 폴리펩티드는 천연의 LT-α 리더 서열이 절단된 진핵세포 발현 시스템에서 생성될 수 있는 이의 활성 단편들을 포함하는 가용성 분자 형태일 수 있다. 또한, 이종의 신호 서열과 성숙한 LT-α 서열의 융합물을 이용하여 다른 숙주 시스템에서 LT-α의 분비를 최대화할 수 있다. 신호는 의도한 숙주 세포를 기초로 선택하고, 박테리아, 효모, 포유류 및 비루스의 서열을 포함할 수 있다. 천연의 신호 또는 혈관 세포 부착 분자-1(VCAM-1) 신호 서열은 포유류 발현 시스템에 사용하기에 적합하다.
또한, LT-α 폴리펩티드는 면역글로불린쇄 또는 그것들의 단편과 같은 연장된 혈장 반감기를 갖는 폴리펩티드에 융합시킬 수도 있다. 혈장 반감기를 증가시키는 데에 사용할 수 있는 혈장 단백질로는 혈청 알부민, 면역글로불린, 아포리포단백질 및 트랜스페린을 들 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 부착은 폴리펩티드를 안정화시키고 그 면역원성을 감소시킬 수 있다. LT-α 융합 단백질은 치료 대상에게는 현저한 면역원성이 아니며, 혈장 단백질은 그 정상적 생물학적 활성으로 인해 치료대상에게 바람직하지 않은 부작용을 일으키지 않는 것이 바람직하다.
인체 LT-α는 N 및 O 잔기상에서 글리코실화되고, 그 공급원에 따라 상당한 당-기초한 미세이종성을 나타낸다. LT 복합체를 형성하도록 선택된 특정 LT-α의 올리고당 조성물은 생체내 제거속도에 영향을 끼칠 수 있다(Fukushima 등,Arch. Biochem. Biophys., 304, pp. 144-53 (1993)). 글리코실화 변형체가 상이한 숙주 세포에서의 발현에 의해 생성될 수 있고, 이것이 LT-α 공급원을 선택하는데 고려하여야 할 한가지 인자이다.
LT-α는 B 림프아세포주 RPMI 1788로부터 정제할 수 있는데, 이 세포주는 구성적으로 LT-α를 분비하며 포르볼 에스테르 PMA로 처리함으로써 고 농도를 분비하도록 유도시킬 수 있다(Aggarwal 등,J. Biol. Chem., 259, pp.686-91(1984)]. 한편, 클로닝된 인체 LT-α 유전자를 이용하여 박테리아[Schoenfeld 등,J. Biol. Chem., 266, pp. 3863-69 (1991)]; 바쿨로비루스-감염된 곤충 세포[Crowe 등,J. Immunol. Methods, 168, pp70-89 (1994)]; 및 포유류 세포[Browning 및 Ribolini,J. Immunol., 143, pp. 1859-67 (1989); Fukushima 등,Arch. Biochem. Biophys., 304, pp. 144-53 (1993)]를 포함하는 상이한 숙주 시스템에서 LT-α 폴리펩티드를재조합으로 생성할 수 있다.
LT-α 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드 단편들을 암호화하는 LT-α 유전자 부분들은 일반적인 검색 분석을 사용하여 평가할 수 있다. LT-α 생물학적 활성에 대한 유용한 검색 분석법으로는 TNF-R에 결합된 천연 LT-α를 사용하는 경쟁적 억제 분석법, 또는 당해 기술 분야에 공지된 분석에서 LT-α가 종양 세포의 세포독성을 유도할 수 있는 능력을 억제시킴으로써 직접적으로 또는 간접적으로 측정하는 방법이 있다. LT-α 단편들을 LT-β와의 헤테로머 복합체에 회합시키고, 그 복합체를 LT-β-R에 결합한 LT-α/β와의 경쟁적 억제에 의해 LT-α/β 생물학적 활성에 대해 분석하거나, 또는 본 명세서에 개시된 분석에서 종양 세포의 세포 독성을 유도하는 능력에 대해 분석하는 것이 바람직하다.
p33으로도 언급되는 림프독소-β는 T 림프구, T 세포주, B 세포주 및 림포카인-활성화된 킬러 세포의 표면에서 확인되었다. LT-β는 본 명세서에서 참고 인용되고, 동시 계류 중인 본원 출원인의 국제 출원 PCT/US91/04588 (1992. 1. 9, WO 92/00329로 공개됨) 및 PCT/US93/11669 (1994. 6. 23, WO 94/13808로 공개됨)의 주제이다.
LT-β 유전자는 240-244 아미노산의 폴리펩티드를 암호화한다[Browning 등,Cell, 72, pp. 847-56(1993)]. LT-β는 짧은 N-말단 세포질 영역과, 이어서 30 개의 소수성 아미노산의 막 고정 영역을 갖는 Ⅱ형 막 단백질이다. LT-β는 단일의 N-결합된 글리코실화 부위를 가지며, 서브유닛 간의 이황화 결합 형성에 관여하지 않는 것으로 보이는 시스테인 잔기를 단 1개 보유한다.
본 발명의 LT-α/β 헤테로머 복합체를 포함하는 LT-β 서브유닛은 림프독소-β, 천연의 인체 또는 동물 림프독소-β, 재조합 림프독소-β, 가용성 림프독소-β, 분비된 림프독소-β, LT-β 생물학적 활성을 갖는 림프독소-β 뮤테인 또는 LT-β 생물학적 활성을 갖는 상기 림프독소-β 중의 어느 하나의 림프독소-β 단편들로부터 선택할 수 있다.
LT-α 폴리펩티드에 대해 상기 기술한 바와 같이, LT-β 폴리펩티드도 동일한 방법을 사용하여 변형시켜 그들의 용해도 또는 혈장 반감기를 증가시킬 수 있다. 마찬가지로, LT-β 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드 단편들을 암호화하는 LT-β 유전자 부분은 LT-α에 대해 기술한 바와 같이 일반적인 검색 분석을 사용하여 평가할 수 있다.
가용성 복합체의 생성
가용성 (비-막-결합형) LT-α/β 헤테로머 복합체는 막-결합형에서 가용성 형태로 변화되는 LT-β 서브유닛을 포함한다. 이들 복합체는 본 출원인의 동시 계류 중인 국제 출원(PCT/US93/11669, WO 94/13808로 1992,1,9 에 공개됨)에 상세하게 기재되어 있다. 가용성 LT-β 펩티드는 브라우닝 등의 문헌[Cell, 72, p847-56 (1993)]의 번호 부여법에 따라서, 막 광통 부분의 말단(즉, 아미노산 #44 부근)과 최초의 TNF 상동성 부분(즉, 아미노산 #88) 사이의 어느 지점에서 절단되는 림프독소-β의 아미노산 서열에 의해 정해진다.
가용성 LT-β 폴리펩티드는 세포질의 미부 및 막 관통 부분을 제거하기 위해 LT-β의 N-말단을 절단하여 생성시킬 수 있다[Crowe 등,Science, 264, p707-710,(1994)]. 한편, 막 관통 영역은 친수성 영역과 함께 막 관통 영역을 구성하는 통상 소수성인 아미노산 잔기의 결실, 또는 치환에 의해 불활성화될 수 있다. 둘중 어느 한 가지 경우에, 실질적으로 친수성인 수치요법(hydropathy) 프로파일이 생성되고, 이것이 지질 친화도를 감소시키고 수용해도를 개선시킬 것이다. 친수성 아미노산 잔기로 치환시키는 것에 비해 막 관통 영역을 결실시키는 것이 바람직한데, 그 이유는 결실이 잠재적인 면역원성 에피토프의 유입을 피할 수 있도록 하기 때문이다.
결실된 또는 불활성화된 막 투과 영역은 I 형 리더 서열(예, VCAM-1 리더)로 대체하거나. 또는 I형 리더 서열에 연결될 수 있어서, 발린 40 과 프롤린 88 사이의 어떤 지점의 서열로 시작하여 단백질을 분비한다. 가용성 LT-β 폴리펩티드는 N-말단에 임의 수의 공지된 리더 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 펩티드를 발현시키며, 진핵 생물 시스템에서 분비 경로에 표적화 된다. 예를 들어, Ernst 등의 미국 특허 제5,082,783호 (1992) 참조.
가용성 LT-α/β 헤테로머 복합체는 LT-α 및 가용성 LT-β를 암호화하는 DNA로 적절한 숙주세포를 동시 형질감염시켜 생성할 수 있다[Crowe 등,J. Immunol. Methods, 168, p 79-89 (1994)]. LT-α가 없을 때 분비되는 가용성 LT-β는 고도로 올리고머화되어 있다. 그러나, LT-α와 함께 동시 발현될 때, 두 단백질을 모두 포함하는 70 kDa 삼량체형 구조물이 형성된다. 정상적으로 LT-α(예; 전술한 RPMI 1788 세포)만을 발현하는 세포주를 가용성 LT-β 폴리펩티드를 암호화하는 유전자로 형질감염시켜서 가용성 LT-α1/β2 헤테로머 복합체를 생성시킬 수 있다.
LT-α 및 LT-β 폴리펩티드는 별도로 합성하고, 부드러운 세정제로 변성시키고, 함께 혼합하고 세정제를 제거하여 재생시키므로써, 분리가능한 혼합된 LT 헤테로머 복합체를 형성할 수 있다(하기 참조).
LT-α1/β2 복합체의 정제
TNF 수용체 및 LT-β수용체를 친화도 정제 시약으로 사용하는 크로마토그래피에 의해 상이한 서브유닛 화학양론을 포함하는 동시 발현 복합체로부터 가용성 LT-α1/β2 헤테로머 복합체를 분리한다. TNF 수용체는 LT 복합체의 α/α 틈내에서만 결합한다. LT-β 수용체는 헤테로머 LT-α/β 복합체의 β/β 틈에는 높은 친화도로, α/β틈에는 낮은 친화도로 결합한다. 따라서, LT-α3 및 LT-α2/β1은 TNF-R에 결합할 것이다. 또한 LT-β-R은 LT-α2/β1 삼량체(α/β 틈내)에 결합할 수 있으나, LT-α3에는 결합할 수 없다. 또한, LT-β-R(TNF-R은 아님)은 LT-α1/β2 및 LT-βn에 결합한다(그러나, 이러한 제제의 정확한 조성은 알려지지 않았으며, 이들은 대형 회합체이다).
수용체 친화성 시약은 가용성 세포외 영역(예를들어, Loetscher 등,J. Biol. Chem., 266, p 18324-29 (1991) 참조), 또는 면역글로블린 Fc 영역에 연결된 세포외 리간드 결합 영역을 갖는 키메라 단백질(Loetscher 등,J. Biol. Chem., 266, p 18324-29(1991); Crowe 등,Science, 264, p707-710,(1994))로 제조할 수 있다. 수용체는 통상의 방법을 사용하여 화학적 가교에 의해 친화성 매트릭스에 연결시킨다.
수용체 및 면역-친화성 크로마토그래피를 사용하여 LT-α1/β2 리간드를 정제할 수 있는 두가지 방안이 있다. 제1 방안에서는, LT-α 및 끝을 절단한 LT-β형 둘 다를 동시 발현할 수 있는 적합한 발현 시스템으로부터 얻은 상청액을 TNF-R 칼럼으로 통과시킨다. TNF-R은 LT-α3 및 LT-α2/β1 삼량체에 결합할 것이다. TNF-R 칼럼으로부터의 유출액은 LT-β(n) 및 LT-α1/β2를 포함할 것이다.
제2 방안에서는, 모든 LT-β-함유 형태(LT-β(n), LT-α1/β2 및 LT-α2/β1)를 LT-β-R 칼럼에 결합시키고, 카오트로프 또는 pH 변화와 같은 고전적인 방법을 사용하여 상기 칼럼으로부터 용출시킨다(LT-α3는 이 칼럼을 통과한다). 용출물을 중화시키거나 또는 카오트로프를 제거하고, 이어서 용출물을 LT-α2/β1 삼량체에만 결합하는 TNF-R 칼럼에 통과시킨다. 이 칼럼의 유출액은 LT-β(n) 및 LT-α1/β2 삼량체를 한다.
양자의 경우에, 순수한 LT-α1/β2 삼량체는 당업계에 공지된, 겔 여과 및/또는 이온 교환 크로마토그래피와 같은 과정에 의해 LT-β로부터 분리할 수 있다.
또한, 상이한 형태의 LT-α/β 헤테로머 복합체는 다양한 통상의 크로마토그래피 방법을 사용하여 분리 및 정제할 수 있다. 또한, 전술한 면역친화성 정제 단계중 하나와 일련의 통상적인 정제 방법을 병용하는 것이 바람직하다.
항-LT-β-R 항체의 공급원
인간 LT-β 수용체에 대해 유도된 폴리클로날 항체 혈청은, 염소, 토끼 또는 마우스와 같은 동물에 완전 프로인트 보조액 중의 인간 LT-β 수용체-Fc 융합 단백질(실시예 2)을 피하 주사하고, 이어서 완전 프로인트 보조액 중의 복강내 또는 피하주사액으로 추가의 항원 자극을 주는 통상적인 기술을 사용하여 제조한다. LT-β 수용체에 대해 유도된 목적 항체를 포함하는 폴리클로날 항혈청은 통상적인 과정으로 검색한다.
인간 LT-β 수용체-Fc 융합 단백질에 대해 유도된 마우스 모노클로날 항체(mAb)는 보조액의 부재하에 단백질 A 세파로즈 비드에 부착된 CHO 세포-유래 재조합 LT-β 수용체-Fc 융합 단백질(LT-β-R-Fc)을 이용하는 RBF 마우스의 반복 복강내 면역화에 의해 제조한다. 최종적으로 동물에게 가용성 LT-β-R-Fc(복강내 및 정맥내)로 추가 항원 자극을 주고, 비장 세포를 고전적인 방법으로 융합시키고, 하이브리도마를 ELISA에 의해 검색한다(Ling등,J. Interferon and Cytokine Res., 15, p 53-59 (1995)). 또한, 세포 선별(panning) 분석에서 LT-β-R-Fc 코팅된 평판에 표면 LT-α1/β2를 발현시키는 활성화된 II-23 하이브리도마 세포의 결합을 차단할 수 있는 능력을 검색한다. 순수한 mAb는 하이브리도마 배양 상청액으로부터 IgG의 단백질 A 세파로즈 정제에 의해 제조된다.
또한 다양한 형태의 항-LT-β-R 항체는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조할 수 있다[Winter 및 Milstein,Nature, 349, p 293-99 (1991)]. 예를 들어, 동물 항체에서 유래한 항원 결합 영역이 인간의 불변 영역에 결합된 "키메라" 항체를 구성할 수 있다[예, Cabilly등, 미국 특허 제4,816,567호; Morrison등,Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 81, p 6851-55 (1984)]. 키메라 항체를 인간의 임상적인 치료에 사용할 때, 동물의 항체에 의해서 유발되는 관찰된 면역원성 반응을 감소시킨다.
또한, LT-β-R을 인식하는 재조합 "인간화 항체"를 합성할 수 있다. 인간화항체는 특이적으로 항원 결합에 기여하는 영역이 삽입되어 있는 인간 IgG 서열을주로 포함하는 키메라이다(예, WO 94/04679). 동물을 목적 항원으로 면역화하고, 해당 항체를 분리한 후, 특이적으로 항원 결합에 기여하는 가변 영역 서열의 일부분을 제거한다. 항원 결합 영역이 소실된 인간 항체 유전자의 적당한 위치에 동물에서 유도된 항원 결합 영역을 클로닝시킨다. 인간화 항체는 인간 항체내에 이종(종과 종 사이) 서열의 사용을 최소화시키고, 치료된 대상에서 면역 반응을 덜 유발하는 것 같다.
또한, 상이한 부류의 재조합 항-LT-β-R 항체는 상이한 부류의 면역글로블린에서 분리한 항-LT-β-R 가변 영역 및 인간의 불변 영역(CH1, CH2, CH3)을 포함하는 키메라 항체 또는 인간화 항체를 제조함으로써 구성할 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 부위 수가가 높은 항-LT-β-R IgM 항체는 인간의 μ쇄 불변 영역을 보유하는 벡터내로 항원 결합 부위를 클로닝하므로써 재조합에 의해 생성할 수 있다[Arulanandam 등,J. Exp. Med.177, p 1439-50 (1993); Lane등,Eur. J. Immunol., 22, p 2573-78 (1993); Traunecker등,Nature, 339, p68-70 (1989)].
또한, 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 항원 결합 부위 부근에서 아미노산 잔기를 변형시키므로써 이들의 항원에 대한 재조합 항체의 결합 친화성을 변경시킬 수 있다. 인간화 항체의 항원 결합 친화성은 분자 모델링을 기초로 한 변이 유발에 의해 증가할 수 있다[Queen등,Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 86, p 10029-33 (1989); WO 94/04679].
표적화 조직 유형 또는 구상한 특별 치료 계획에 따라, LT-β-R에 대한 항-LT-β-R Ab의 친화성을 증가 또는 감소시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 반 예방적인 치료를 위해서, LT-β 경로를 통해 신호할 수 있는 능력이 감소된 일정 수준의 항-LT-β-R Ab로 환자를 치료하는 것이 유용할 수 있다. 유사하게, LT-β-R 에 대한 친화성이 증가된 항-LT-β-R Ab는 단기간의 종양 표적 치료에 유용할 수 있다.
LT-β-R 활성화제에 대한 항-LT-β-R 항체 검색
본 발명의 항-LT-β-R 항체는 IFN-γ와 같은 LT-β-R 활성화제의 존재하에서 LT-α/β 헤테로머 복합체(바람직하게는 LT-α1/β2)의 항종양 활성을 증진시킬 수 있다. 본 명세서에서 이러한 항-LT-β-R 항체는 또한 LT-β-R 활성화제로 언급하기도 한다. LT-β-R 활성화제로서 작용하는 항체는 하기와 같이 선택된다:
1) HT29 세포와 같은 종양 세포를 포함하는 일련의 조직 배양 웰을 IFN-γ와 같은 LT-β-R 활성화제 및 정제 LT-α/β 헤테로머 복합체, 바람직하게는 LT-α1/β2 헤테로머 복합체를 포함하는 배지 중에서 시험할 일련의 항-LT-β-R Ab의 희석물의 존재 또는 부재하에서 3 내지 4일 동안 배양한다;
2) MTT와 같이 미토콘드리아 기능을 측정하는 생체 색소 염색제를 세포 혼합물에 첨가하고 몇 시간 동안 반응시킨다;
3) 각 웰내의 혼합물의 광학 밀도는 550nm 파장광에서 측정하였다(OD 550). OD 550 은 각 웰에서 LT-α/β 헤테로머 복합체, LT-β-R 활성화제 및 시험 항-LT-β-R Ab의 존재하에서 사멸된 종양 세포의 수에 반비례한다.
LT-α1/β2 및 IFN-γ의 존재하에서 LT-β-R 활성화제로 독자적으로 작용하는 본 발명의 바람직한 항체는 BKA11, CDH10, BHA10 및 BCG6 항-LT-β-R mAb를 포함한다(표 2, 하기 참조).
항-LT-β-R 항체의 가교
본 발명의 가교된 항-LT-β-R 항체는 IFN-γ와 같은 제2 LT-β-R 활성화제의 존재하에 외인성 LT-α/β 헤테로머 복합체 없이 독자적으로 LT-β-R 활성화제로 작용한다. 가교된 항-LT-β-R Ab는 세포 표면 LT-β 수용체들에 결합하고 이들의 회합을 유발함으로써, LT-β 수용체가 매개하는 표적 세포 사멸을 활성화한다.
일 양태에서는, 1종 이상의 항-LT-β-R 항체는 수불용성 매트릭스 또는 표면상에 고정시키므로써 가교시킨다. 2중 작용제를 사용한 유도는 수불용성 지지 매트릭스 또는 표면에 항체를 가교시키는 데에 유용하다. 수불용성 지지 매트릭스 또는 표면에 항체를 효과적으로 가교시키기 위해 일반적으로 사용되는 작용제는 1,1 비스(-디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, 4-아지도살리실산과의 에스테르를 포함하는 N-히드록시숙신아미드 에스테르, 디숙신이미딜 에스테르를 포함하는 동종 2 작용성 이미도에스테르, 및 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 2 작용성 말레이미드를 포함한다. 메틸-3-[(p-아지도페닐) 디티오]프로피오이미데이트와 같은 유도제는 광에 의한 자극시 선택적으로 가교 할 수 있는 광활성화 중간체를 형성한다. 또한 미국 특허 제3,959,080; 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; 4,055,635; 및 4,330,440호에 기재된 시아노겐 브로마이드-활성화된 탄수화물과 같은 반응성의 수불용성 매트릭스 및 그 기질을 단백질 고정화 또는 가교에 사용할 수 있다.
항체가 부착되는 표면은 비-단백질성 중합체일 수 있으며, 일반적으로 천연의 또는 합성시킨 친수성 중합체이다. 폴리비닐 알코올(PVA) 및 폴리비닐피롤리돈 (PVP)과 같은 친수성 폴리비닐 중합체를 사용할 수 있다. 또한, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 에스테르 또는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 에테르; 폴리옥시에틸렌 및 폴리옥시프로필렌과 같은 폴리옥시알킬렌; 및 폴리옥시에틸렌과 폴리옥시프로필렌의 블록 공중합체(플루로닉스); 폴리메타크릴레이트; 카르보머; 락토스, 아밀로펙틴, 전분, 히드록시에틸 전분, 아밀로스, 덱스트란 설페이트, 덱스트란, 덱스트린, 글리코겐, 또는 산 뮤코다당류(예; 히알유론산)의 다당류 서브유닛과 같은 동종 다당류 및 이종 다당류를 포함하여, 당의 단량체 D-만노스, D- 및 L- 갈락토스, 퓨코스, 과당, D-크실로스, L-아라비노스, D-글루쿠론산, 시알산, D-갈락튜론산, D-만뉴론산(예, 폴리-만뉴론산 또는 알긴산), D-글루코스아민, D-갈락토스아민, D-글루코스 및 뉴라민산을 포함하는 분지된 또는 비분지된 다당류; 폴리소르비톨 및 폴리만니톨과 같은 당 알코올의 중합체; 및 헤파린 또는 헤파론이 유용하다.
가교 이전에 중합체는 수용성인 것이 바람직하며, 항체와의 다중 가교가 일어나는 것을 피하기 위해서 단일 반응성의 화학기를 포함하는 것이 바람직하다. 어떤 경우에도, 가교를 줄이고 실질적으로 균등한 범위의 분자량을 갖는 생성물을 직접 또는 후속 겔 여과 또는 크로마토그래피 단계를 통하여 회수하기 위해서 반응 조건을 최적화하여야 한다. 가교된 항체 매트릭스의 최적 분자량은 본원에 개시된 세포 독성 분석 및 수용체 결합 분석을 사용하는 일상적인 실험에 의해서 측정할 수 있다.
가교 후의 최종 접합체는 혈액과 같은 생리적 유체에 가용성인 것이 바람직하다. 중합체는 접합체 형태로는 면역원성이 높지 않아야 하며, 의도한 투여 경로가 무엇이든지 정맥내 주입 또는 주사에 적합한 점도를 가져야 한다.
중합체는 또한 수불용성일 수 있다. 사용할 수 있는 재료로는 친수성 겔, 또는 외과용 튜브, 도뇨관, 또는 배액 도관과 같이 항체를 고정화시킬 수 있는 표면을 갖는 성형품이 있다. 생물학적으로 적합하며, 생리적 환경에서 실질적으로 불활성인 고체 지지 물질을 사용하는 것이 바람직하다. 염증을 포함하는 면역 반응을 실질적으로 자극하지 않거나, 또는 환자의 체내에 있는 섬유형성 세포를 유인하지 않는다면 생물학적으로 적합한 재료이다.
또한 항-LT-β-R Ab는 1차 항-LT-β-R Ab에 결합할 2차 항체(예, 염소의 항-마우스 IgG 항체; 실시예 7 참조)로 공유 결합 또는 비공유 결합으로 코팅된 표면상에 고정화시킬 수 있다. 2차 항체로 표면에 고정화시킬 때, 개별적으로 시험된 각각의 항-LT-β-R mAb는 IFN-γ의 존재하에서 LT-β-R 활성화제로서 작용한다(도 4 및 7).
또 다른 양태에서는, 용액 내의 가교된 항-LT-β-R Ab는 LT-β-R 활성화제로 작용한다. 항-LT-β-R Abs는 항-LT-β-R Ab(또는 mAb)가교제로 가교시킬 수 있다. 본 발명에 따른 항-LT-β-R Ab(또는 mAb) 가교제는 용액내에서 항-LT-β-R Abs (또는 mAb)를 공유적으로 연절하거나, 또는 비공유적으로 회합시킬 수 있는 임의의 작용제이어서, 가교된 항-LT-β-R Abs(또는 mAb)는 표적 세포 표면 LT-β-R 회합체에 결합할 수 있고, 그 화합체 형성을 증진시킬 수 있게 된다. 이러한 항-LT-β-R Ab(또는 mAb) 가교제로는 전술한 것과 같은 조절되는 방법으로 항체와 반응할 수 있는 화학 가교제가 있지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 대안적으로, 2차 항체, 세파로스 A, Fc 수용체, 또는 그들의 활성을 차단하지 않고 다수의 1 차 항-LT-β-R Ab에 결합 또는 회합하는 기타의 작용제를 사용하여 용액내에서 항-LT-β-R Abs 회합체를 형성할 수 있다.
용액중에서 다수의 항-LT-β-R Ab는 LT-β-R 활성화제로 작용한다.
본 발명에 따라, 표면 LT-β-R 회합체 형성을 증진시키므로써 LT-β-R 활성화제로 작용하는 용액중의 다수의 항-LT-β-R Ab를 포함하는 조성물이 제공된다. LT-β-R의 상이한 에피토프에 대해 유도된 폴리클로날 항-LT-β-R Ab를 사용할 수 있다. 항-LT-β-R Ab는 LT-β-R의 상이하고 중첩되지 않는 에피토프에 대해 유도된 모노클로날 Ab가 바람직하다.
LT-β 수용체 활성화에 대한 결합 항-LT-β-R mAb 접근법은 두 개의 중첩되지 않는 에피토프의 결합을 필요로 한다. 게다가, 유익한 수용체 집합은 특정 에피토프에 의해서만 이루어지는 것 같다. 본 발명자들은 4개 이상의 특이 LT-β-R 면역 반응성 에피토프가 존재한다는 것을 확인하였다. 추가의 에피토프(신규의 mAb로 정의)는 면역화 된 마우스의 비장 세포를 계속적으로 융합시키고, 상이한 종의 동물을 면역화하고, 상이한 경로의 면역화 방법을 사용하여 동정할 수 있다.
BIA 코어 크로마토그래피 기술을 사용하여 LT-β-R에 결합하기 위해서 서로 경쟁하는 상이한 mAb의 능력을 평가하므로써 직접 에피토프의 지도를 만들 수 있다[Pharmacia BIAtechnology Handbook, "Epitope Mapping", Section 6.3.2,(1994,5); Johne 등,J. Immunol. Methods, 160, p 191-8(1993)].
개개의 LT-β-R mAb는 세포 용해 분석에서 종양 세포를 사멸시킬 때 기타의 LT-β-R mAb와 함께 작용하는 능력에 따라 4 이상의 부류로 분류할 수 있다(실시예 8; 표 1). 예를 들어, 군 I의 BDA8 mAb는 종양 세포의 세포독성을 촉진시키기 위해서 군 I의 AGH1 mAb와 함께 작용하지 않는다. 유사하게, 군 III의 BKA11 및 CDH10 mAb도 종양 세포의 세포독성 분석에서 함께 작용하지 않는다.
도 5A-C는 세포 독성 분석에서 LT-β-R 활성화제로서 IFN-γ의 존재하에 대표적인 항-LT-β-R mAb를 단독으로 투여한 것과 종양 세포와 쌍을 이루어 투여한 것의 효과를 보여준다. 단독으로 사용된 군 IV의 항-LT-β-R mAb CBE11은 군 II의 mAb BHA10과 함께 다소 증가된 세포 독성 효과를 갖는다(도 5A). CBE11은 군 III의 mAb CDH10과 유사한 효과를 유발한다(도 5B).
용액중의 항-LT-β-R mAb의 조합물의 투여에 의해 초래되는 세포 독성은 HT29 종양 세포주에 특유한 것은 아니다. 도 5C는 군 I의 AGH1 mAb 및 군 III의 CDH10 mAb가 인간의 선암 종양에서 유도된 2개의 상이한 종양 세포주(HT29 세포 및 WiDr 세포)를 사멸시키는 데에 상승 작용을 한다는 것을 보여준다.
항-LT-β-R mAb의 특성 요약
고정화에 의한 가교시, 본 발명의 모든 항-LT-β-R mAb는, IFN-γ와 같은 제2 LT-β-R 활성화제의 존재하에 LT-β-R 활성화제로 작용한다. 용액내에서 LT-α1/β2의 존재 또는 부재하에 항-LT-β-R mAb가 LT-β-R 활성화제로 작용하는 능력은 종종 시험하는 시점에서 세포의 상태에 따라서 다양하다. 표 2(하기 참조)는 본 발명에 의해 특징지워지는 항-LT-β-R mAb의 특성을 요약하였다.
군 I의 mAb BDA8 및 AGH1은 LT-α1/β2와 함께 용액내에서 LT-β-R 활성화제로서 기능하지 않는다. BDA8 mAb 는 LT-α1/β2의 항 종양 효과를 실제로 차단한다(도 3B 및 표 2). 대조적으로, 군 II의 항-LT-β-R mAb BCG6 및 BHA10은 LT-α1/β2를 투여할 때 항진적인 효과와 길항적인 효과가 혼합된 효과를 나타낸다. 군 III의 항-LT-β-R mAb BKA11 및 CDH10은 군 II의 mAb BCG6 및 BHA10에서 종종 보여지는 길항 효과를 나타내지 않고, IFN-γ와 같은 제2 LT-β-R 활성화제 및 LT-α1/β2의 존재하에 항-종양 효과를 증진시키는 LT-β-R 활성화제로 작용하는 능력은 독특한 것이다.
종양 세포 용해 분석에서 함께 작용할 수 있는 능력을 기준으로 한 항-LT-β-R mAb의 분류는, 이들이 LT-β-R의 상이한 에피토프와 상호 작용하는 것을 반영하였다는 것을 염두에 두는 것이 중요하다. 그러나, 반드시 단일 군을 구성하는 mAb가 같은 기원의 에피토프에 대해 동일한 결합 친화성을 갖는 것은 아니다. 그러므로, 동일 또는 상이한 군에 속하는 다른 mAb의 효과를 비교할 때 나타나는 다양한 결과는 결합 친화성의 차이를 나타낼 수 있다. 따라서, LT-α1/β2의 존재하에 LT-β-R 활성화제로서 군 III의 mAb와 같이 작용하는, LT-β-R에 대하여 결합 친화성이 높은 군 I 또는 군 IV 의 mAb를 분리할 수 있다.
전술한 항-LT-β-R mAb를 생성하는 하이브리도마 세포주 또는 이들의 서브클론은 부다페스트 조약의 규정에 따라서 미국 모식균 배양 수집소에 1995,1,12에 기탁하였고, 하기와 같이 ATCC 수탁번호를 지정 받았다:
세포주 mAb 명칭 ATCC 수탁번호
a) AG.H1.5,1 AGH1 HB 11796
b) BD.A8.AB9 BDA8 HB 11798
c) BC.G6.AF5 BCG6 HB 11794
d) BH.A10 BHA10 HB 11795
e) BK.A11.AC10 BKA11 HB 11799
f) CB.E11.1 CBE11 HB 11793
g) CD.H10.1 CDH10 HB 11797
본 출원에 특허가 허여되면 상기 ATCC 기탁의 공공의 이용 가능성에 대한 모든 제한이 제거되는 것은 명백하다.
항-LT-β-R IgM 모노클로날 항체는 LT-β-R 활성화제로서 기능한다.
일반적인 2 개 이상의 IgG 항원 결합 부위를 포함하는 항-LT-β-R mAb는 용액내에서 세포 표면 LT-β-R 가교제로서 기능할 것이며, 따라서 이는 본 발명에 따른 LT-β-R 활성화제의 정의내에 포함되는 것이다. 항-LT-β-R mAb의 항원 결합 부위는 표준 재조합 DNA 및 하이브리도마 기술을 사용하여, 10개의 항원 결합 부위를 갖는, IgM 분자내에 구성할 수 있다(실시예 12).
또한, 항원으로 단일 면역화시킨 후에 하이브리도마 융합 기술에 의해 분리된 완전한 마우스(또는 기타 동물)의 IgM 분자를 수거 및 농축할 수 있다. IgM 분자를 농축시키는 방법은 CD40 신호작용-결핍 마우스를 면역화시키는 것이다[(Kawave 등,Immunity, 1, p 167-78 (1994); Xu 등,Immunity, 1. p 423-31 (1994)]. 이들 마우스는 IgG를 효과적으로 생성할 수 없으며, 따라서 항원 투여에 대한 이들의 반응은 IgM 아형(isotype)을 풍부하게 한다.
증가된 수가에 의해 항-LT-β-R IgM 항체는 막 평면 내에 LT-β-R 분자를 효과적으로 모을 수 있으므로, 두 개의 항원 결합 부위를 갖는 IgG 상대부와 비교할 때 LT-β-R 신호작용을 증진시킨다. 수용체 회합에서 다가 항체의 증가된 효능의극단적인 예가 Fas 수용체에 대한 항체에 나타나며, 여기서 IgM형태는 대단히 효능이 있고 정상적인 2가의 IgG는 용액내에서 효과가 없다[Yonihara and Yonihara,J. Exp. Med.169, p 1747-56 (1989); Alderson 등,Int. Immunol., 6, p 1799-1806 (1994)].
유사하게, Fas 수용체에 대한 apo-1 mAb는 IgG3 mAb이다. 이 mAb는 더 거대한 다가의 형태로 집합하는 IgG3 아형에 특유한 Fc 상호 작용에 의존하는 강력한 세포 독성제이다. Fc 영역을 제거하면 더 거대한 집합체로 회합되지 못하고 불활성인 F(ab)2형을 형성한다[Dhein 등,J. Immunol., 149, p 3166-73 (1992)]. 따라서, 항-LT-β-R mAb의 IgM 형태는 강력한 항종양제로 생각된다.
항-LT-β-R mAb는 마우스에서 종양 성장을 억제한다.
항-LT-β-R mAb와 같은 LT-β-R 활성화제가 시험관 내에서 인간의 종양 세포 성장을 억제하는 능력(실시예 6-8 및 13)이 생체내에서의 항-종양원 활성의 지표이다. 면역 결핍(SCID) 마우스에서 수행한 실험은 항-LT-β-R mAb (CBE11)가 인간의 선암 WiDr 세포에 의해서 종양 형성을 효과적으로 차단할 수 있다는 것을 입증한다(실시예 14; 도 6). WiDr 세포로 피하(s.c.) 접종한 마우스는 2 주 내에 측정 가능한 종양을 형성한다. WiDr 세포를 피하 접종함과 동시에 CBE11 mAb로 복강내 치료를 행한 마우스는 종양의 성장이 극단적으로 차단되었다(도 6A). CBE11 항-LT-β-R mAb의 항-종양 활성은 IFN-γ를 첨가하므로써 증가된다; 그러나, 외인성 IFN-γ가 없을 경우에도 CBE11은 효과적이다. CBE11 + IFN-γ 군에서, 16 마리의 동물중 7마리에서 완전하게 종양이 없었고, 반면 나머지 동물은 2 개월에서 진행되지 않은 작은 소결절을 갖고 있었다. CBE11 단독으로 치료한 마우스는 30일째에 CBE11 + IFN-γ 군과 유사하였다. 그러나, CBE11 단독으로 치료한 마우스는 결국 천천히 성장하는 종양을 발달시켰다. CBE11(+/- IFN-γ) 군과 대조군(염수, IFN-γ 단독 및 대조군 항-인간 LFA-3 mAb(1E6) + IFN-γ)사이에는 통계학적으로 중요한 차이가 있으나, 대조군들 사이에는 중요한 차이는 없었다. 1E6 및 CBE11 mAb는 들 다 IgG1 항체이다. 1E6 mAb는 종양 세포를 효과적으로 코팅하지만 종양의 성장을 차단하지는 않는다. 따라서 보체 또는 천연 킬러 세포-매개 현상이 CBE11 항-LT-β-R mAb의 항-종양 활성에 대한 유일한 근거는 아니다.
측정가능한 LT-β-R에 기초한 시험관 내 세포독성 효과는 IFN-γ에 의존하기 때문에, 외래 IFN-γ의 부재하에 생체내 종양 성장을 억제하는 데 있어서의 CBE11 mAb의 효능은 예기치 못한 것이었다. 인간의 IFN-γ 수용체에 대한 마우스 IFN-γ의 교차가 어느 정도 일어나거나, 또는 다른 메카니즘이 생체내에서 관여할 수 있다.
CBE11 항-LT-β-R mAb는 마우스에서 확립된 종양의 성장을 억제할 수도 있다(도 6B). 첫날에 WiDr 인간 선암 세포를 마우스에게 피하 접종하고 종양이 15일 동안 발달하게 하였다(실시예 14). IFN-γ 만으로 또는 대조군 항-인간 LFA-3 mAb(1E6) + IFN-γ로 복강내 처리한 동물의 종양은 7주의 실험 과정에 걸쳐 크기가 계속 증가하였다. 대조적으로, CBE11 및 항-LT-β-R mAb(+ IFN-γ 또는 단독으로)로 처리한 종양은 성장을 중지하였으며, CBE11 항체를 3주에 걸쳐 3회 주사한 후에는, 실험이 종료되는 접종 49일째에 종양 성장이 중지되었다(도 6B).
이들 실험은 LT-β-R 신호작용을 활성화하는 항-LT-β-R mAb가 생체 내에서 초기 단계에 종양 형성을 효과적으로 억제할 수 있고, 종양 발생의 후기 단계에서 계속되는 종양 세포 성장을 차단할 수도 있음을 입증한다. 이들 실험은 또한 단일의 LT-β-R 활성화제를 투여하는 것이 감염된 동물에서의 종양의 진행, 심화 또는 효과의 처치 또는 감소에 효과적일 수 있음을 입증한다.
실시예 14에 기술한 절차를 사용하여 생체내 종양 세포의 성장을 단독으로 또는 함께 억제하는 기능을 하는 본 발명에 따른 LT-β-R 활성화제를 동정할 수 있다. 기타 LT-β-R 활성화제는 예를 들면, 시험관내에서 종양 세포의 세포독성 분석법을 사용하여 동정된 것들을 포함하지만 이로 제한되는 것은 아니며, 단독으로 또는 함께 동물 또는 인간에 투여할 때 생체내에서 유사한 항종양 효과를 가질 수 있는 것으로 생각할 수 있다.
IFN-γ 및 기타 LT-β-R 활성화제의 용도
LT-α/β 헤테로머 복합체 및 가교된 또는 다수의 항-LT-β-R Ab의 종양 세포에 대한 세포독성 효과는 LT-β-R 활성화제, 특히 IFN-γ의 존재에 의해 증가된다. 장에서 기원한 인간 선암 세포(HT29 세포)는 FasR 신호작용[Yonehara and Yonehara,J. Exp. Med., 169, 1747-56면 (1989)] 및 IFN-γ의 존재하에 TNF 및 LT-α[Browning등,J. Immunol., 143, 1859-67면 (1989)]에 민감한 것으로 알려져 있다.
본 발명의 LT-α/β 헤테로머 복합체, 항-LT-β-R Ab 또는 기타 LT-β-R 활성화제의 항종양 활성을 증가시키는 데에 필요한 LT-β-R 활성화제의 양은 치료할 세포 또는 조직의 유형 및 치료 방식에 의해 좌우되고, 통상적인 절차를 사용하여 경험적으로 결정할 수 있다. LT-β-R 활성화제는 전술한 인자를 고려하여 기타 LT-β-R 활성화제와 함께 효과적인 것으로 측정된 속도로 전달하거나 그러한 농도로 투여할 수 있다.
한편, 표적 종양 세포를 둘러싸는 세포 또는 조직에 의해 생산될 수 있는 IFN-γ와 같은 인터페론 등의 내인성 LT-β-R 활성화제에 의해 좌우될 수 있다. 내인성 IFN-γ는 보통 비루스 감염시에 생산되며, 종양 근처에서 발견되기도 한다[Dinge등,Immunity, 1, 447-56면 (1994)].
인터페론, 바람직하게는 IFN-γ를 유도할 수 있고 종양 세포에 대한 LT-α/β 헤테로머 복합체 및 항-LT-β-R mAb의 세포독성 효과를 증가시키는 임의의 작용제는 본 발명의 LT-β-R 활성화제의 군내에 포함된다. 비루스 감염은 통상 IFN-γ 생산을 유도하는 반면에, 내인성 IFN-γ의 레벨은 기타 작용제에 의해 증가될 수 있다(실시예 10). 예를 들면, 임상 실험으로 2본쇄 RNA(dsRNA) 처리에 의한 인터페론 유도를 입증하였다. 따라서, 폴리리보구아닐산/폴리리보시티딜산(폴리-rG/rC) 및 기타 형태의 dsRNA는 인터페론 유도물질로서 유효하다[Juraskova등,Eur. J. Pharmacol., 221, 107-11면 (1992)].
글리시리자 글래브라( Glycyrrhiza glabra )에서 유래한 인터페론 자극물질[Acharya등,Indian J. Med. Res., 98, 69-74면 (1993)] 및 약제는 이들중 다수가 경구 투여가능한 것으로서, 내인성 인터페론 레벨을 증가시키는 데에 사용할 수도있다. 그러한 인터페론 유도물질로는 이미퀴모드[Bernstein등,Antiviral Res., 20, 45-55면 (1994)]; 사파랄[Paramonova등,Vopr. Virusol., 39, 131-34면 (1994)]; 브로피리민과 같은 아릴 피리미돈[Onishi and Machida,Hinyokika Kiyo, 40, 195-200면 (1994)]; 리도스틴[Cheknev등,Vopr. Virusol., 39, 125-28면 (1994)]이 있다.
이들 인터페론 유도제중 몇가지는 IFN-α와 같은 I형 인터페론의 유도물질로서 특성화되었다. I형 인터페론은 LT-β-R 활성화제로서 기능할 수도 있으나, IFN-γ보다는 효능이 더 적다.
LT-α/β 복합체 및 LT-β-R 활성화제를 사용한 치료
본 발명의 조성물은 처리되는 특정 임상 상태를 치료하기 위해 효과적인 용량으로 투여한다. 주어진 용도에 바람직한 약학 제제 및 치료학적 유효 용량의 결정은 환자의 상태 및 체중, 목적하는 치료의 정도 및 치료에 대한 환자의 인용도와 같은 것을 고려하여 당해 기술분야에는 널리 알려져 있다.
통상, 인간은 심각한 독성이 확인되기 전에 최대 100 내지 200 ㎍/㎡의 TNF를 인용할 수 있다[Schiller등,Cancer Res., 51, 1651-58면 (1991)]. 마우스에서는, 5×104유니트의 재조합 인간 IFN-γ가 제공된 1 내지 5 ㎍/마우스/일수의 투여량이 인간원발성 종양 회귀를 일으켰다[Balkwill등, CIBA Foundation Symposium (1987); Havell등, J. Exp. Med., 167, 1067-85면 (1988)]. HT29 세포 용해 분석에서의 TNF 및 LT-α1/β2의 상대적 효능에 근거하여, LT-α1/β2 약 5 내지 25 ㎍/마우스/일수의 치료학적 투여량 범위를 제공한다. 인간에게 적용시키면, 1 ㎎/㎡ 이상의 LT-α1/β2 용량이 IFN-γ와 같은 LT-β-R 활성화제와 함께 필요할 것으로 예상된다.
역사적으로, IFN-γ 요법은 100 내지 250 ㎍/㎡ 범위의 최대 허용 투여량으로, 또는 10 내지 25 ㎍/㎡ 범위의 "면역조절" 레벨로 시행되었다[참조예; Kopp등,J. Immunother., 13, 181-90 (1993)]. 두 개의 인터페론을 사용한 조합 요법은 4×106유니트/㎡의 IFN-α 및 약 250 ㎍/㎡의 IFN-γ를 사용하였다[Niederle등,Leuk. Lymphoma, 9, 111-19면 (1993)]. 본원에 기술한 LT-α/β 헤테로머 복합체 또는 정제된 LT-β-R Ab와 함께 약 25 내지 100 ㎍/㎡의 중간 투여량의 IFN-γ는 치료 투여량을 최적화하는 적합한 출발점으로 기대된다.
본 발명의 LT-α/β 헤테로머 복합체 및 가교된 항-LT-β-R Ab와, 이 항체 또는 복합체의 분리 및 정제된 형태, 그 염 또는 약학적 허용 유도체는 항종양 활성을 나타내는 작용제의 통상 허용되는 방식중 어느 것을 사용하여 투여할 수 있다.
상기 요법에 사용되는 약학 조성물은 다양한 형태일 수도 있다. 이들의 예로는 정제, 환제, 분말, 액체 용액 또는 현탁액, 좌약 및 주사용 및 주입용 용액과 같이 고형, 반고형 및 액체 투여 형태가 있다. 바람직한 형태는 의도한 투여 방식 및 치료목적에 따라 좌우된다. 투여 방식에는 경구, 비경구, 피하, 정맥내, 병변내 또는 국소 투여가 있다.
LT-α/β 헤테로머 복합체, IFN-γ 및 항-LT-β-R Ab는 예를 들면, 흡수 또는 안정성을 자극하는 보조인자의 유무에 관계없이 멸균된 등장성 제제내로 투입될 수 있다. 이 제제는 액체가 바람직하고, 동결건조된 분말일 수 있다. 예를 들면, LT 복합체 및/또는 항-LT-β-R Ab 및 IFN-γ는 5.0 ㎎/㎖의 시트르산 1수화물, 2.7 ㎎/㎖의 3나트륨 시트레이트, 41 ㎎/㎖의 만니톨, 1 ㎎/㎖의 글리신 및 1 ㎎/㎖의 폴리소르베이트 20을 함유하는 처방 완충제로 희석시킬 수 있다. 이 용액을 동결건조시키고, 냉장하에 보관하며, 투여하기 전에 멸균된 주사용 물에서 재구성할 수 있다.
상기 조성물은 또한 당해 분야에 널리 알려진 통상의 약학적 허용 담체를 함유하는 것이 바람직하다(참조문헌; Remington's Pharmaceutical Sciences, 16판, 1980, 맥 퍼블리싱 컴퍼니). 그러한 약학적 허용 담체로는 인간 혈청 알부민 또는 혈장 조제물과 같은 기타 의료용 약제, 담체, 유전가 담체, 보조제, 부형제등이 있다. 상기 조성물은 단위 투여 형태가 바람직하며, 통상 하루에 1회 이상 투여한다.
본 발명의 약학 조성물은 감염된 조직 또는 혈류와 연결된 근처 또는 기타 장소에 투여된 미소구, 리포좀, 기타 미립자 전달 시스템 또는 서방성 제제를 사용하여 투여할 수도 있다. 서방성 담체의 적합한 예로는 좌약 또는 미세캡슐과 같은 성형품 형태의 반투과성 중합체 매트릭스가 있다. 이식가능하거나 미세캡슐 형태의 서방성 매트릭스로는 폴리락타이드(미국 특허 제3,773,319호; EP 58,481호); L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체[Sidman등,Biopolymers, 22, 547-56면 (1985)]; 폴리(2-히드록시에틸-메티크릴레이트) 또는 에틸렌 비닐 아세테이트[Langer등,J. Biomed, Mater. Res., 15, 167-277면 (1981); Langer,Chem. Tech., 12, 98-105면 (1982)]가 있다.
LT-α/β 헤테로머 복합체 및/또는 항-LT-β-R Ab 및 IFN-γ을 함유하는 리포좀은 널리 알려진 방법으로 제조할 수 있다[참조문헌; DE 3,218,121호; Epstein등,Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 82, 3688-92면 (1985); Hwang등,Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 77, 4030-34면 (1985); 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호]. 통상 리포좀은 지질 함량이 약 30 몰% 이상의 콜레스테롤인 소형(약 200-800Å)의 단층 형태이다. 콜레스테롤의 비율은 LT 복합체 및/또는 항-LT-β-R Ab 및 IFN-γ의 최적방출 속도를 조절하도록 선택된다.
본 발명의 LT-α/β 헤테로머 복합체 및 항-LT-β-R Ab는 종양 부위에서 통상 발견되는 IFN-γ를 보충하기 위해 기타 LT-β-R 활성화제, 화학요법제 또는 IFN-γ를 함유하는 리포좀에 접합시킬 수도 있다. LT 복합체 및 항-LT-β-R Ab를 리포좀에 접합시키는 것은 독소 또는 화학요법제를 표적화용 항체에 결합시키는 데 널리 사용되어 온 이종 이중 작용성 가교제와 같은 임의의 공지된 가교제에 의해 수행할 수 있다. 리포좀에의 접합은 탄수화물 지향성 가교제인 4-(4-말레이미도페닐) 부티르산 히드라자이드(MPBH)를 사용하여 수행할 수도 있다[Duzgunes등,J. Cell. Biochem.Abt. Suppl. 16E 77 (1992)].
항-LT-β-R 활성화에 근거한 치료용 조성물의 장점
LT-β-R 활성화에 근거한 항종양 요법은 여러 가지 장점을 가진다. LT-β-R은 β/β 틈내에서는 높은 친화성으로 LT-α/β 헤테로머 복합체에 결합하지만, 인접 LT-α와 LT-β 서브유닛 사이의 경계에 형성된 α/β 틈내에서는 보다 낮은 친화성으로 결합한다. 대조적으로, INF 수용체는 α/α틈에만 높은 친화성으로 LT-γ/β 헤테로머 복합체에 결합한다. 따라서, 정제된 LT-α1/β2 복합체는 인접 LT-β 서브유닛 사이의 LT-β-R에 높은 친화성으로 결합하나 α/α 틈이 부족하기 때문에, TNF 수용체를 통한 신호작용을 교차활성화시키지 못한다. 따라서, 본 발명의 LT-α/β 헤테로머 복합체는 TNF-관련 염증 반응을 자극하지 않을 것이다.
LT-α1/β2 투여는 비교적 높은 레벨에서조차도 염증 반응과 관련된 내피 세포 변화를 활성화시키지 않는다. 이러한 이유로, LT-β-R을 활성화하기 위하여 약학 조성물 및 치료 방법을 사용하는 경우에도 TNF로 관찰한 염증의 다단계 활성화 반응으로 인한 부작용이 문제가 되어서는 아니된다.
인간 LT-α1/β2는 인간 LT-β-R에 대한 것과 마찬가지로 실질적으로 마우스 LT-β-R에 결합한다. 마우스 1 마리당 100 ㎍의 인간 LT-α1/β2의 주사는 치사량이 아니며(실시예 11), 이것은 전체 동물에서의 LT-β-R의 자극이, 유사한 실험을 FasR 또는 p60 TNF-R 활성화에 의해 시행할 경우에 나타나는 명백한 독성을 갖는 것이 아님을 암시한다.
인간에서 이 경로를 유도하기 위해 특이 항-LT-β-R mAb를 사용하는 것은 LT-α/β 헤테로머 복합체에 의한 치료에 비해 여러 가지 장점을 가질 수 있다. 항-수용체 항체 요법은 리간드로 치료하는 것보다 더 선택성이 있을 것이다. 더욱이, 재조합 형태의 항-LT-β-R mAb는 가용성 LT-α/β 헤테로머 복합체보다 조작 및 대량 제조에서 더 용이할 것이다.
mAb 또는 LT-α/β 헤테로머 복합체는 통상의 항-종양 요법(즉, 방사선 및 화학요법)과 함께 종양-보유자에게 투여하는 것을 생각할 수 있다. 통상의 화학요법과 LT-β-R 활성화의 병행 치료는 통상의 항-종양 요법만을 사용하는 경우보다 환자에게서 종양형성 세포를 제거하기가 더 쉬운 종양 사멸 활성을 보유하는 추가의 인자를 제공할 수 있다.
이 방법은 비교적 부작용이 없고, 따라서 전이되지 않았을 수도 있는 암종에서 또는 특정 암 유형에 대한 유전적 선청성을 나타내는 가족중의 환자에서 준예방적 차원으로 제공될 수 있다.
하기의 실시예는 본 발명의 LT-α/β 헤테로머 복합체 및 항-LT-β-R mAb와 이들의 특성규명에 사용된 방법들을 예시한다. 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니되며; 단지 예시의 목적으로 제시된 것이며; 본 발명은 특허 청구의 범위에 의해서만 한정된다.
[실시예]
실시예 1
LT-α/β 형태를 함유하는 바쿨로비루스-감염된 곤충 세포 상청액의 생성
전체 길이의 LT-α 또는 분비된 형태의 LT-β를 암호화하는 재조합 바쿨로비루스를 문헌에 기술된 대로 제조하였다[Crowe등,Science, 264, 707-710면 (1994)]. 5개의 고등 곤충 세포(인비트로겐, 캘리포니아 산디에고)를 무혈청 SF 900-II(지브코) 배지 7.2ℓ내로 2×105세포/㎖의 밀도로 접종하였다. 배양물은 48시간후에 1.8×106세포/㎖에 도달하였고, 150 ㎖(3×108PFU/㎖)의 LT-β 및 300 ㎖의 LT-α 바쿨로비루스 균주로 감염시켰다. 2일후에, 배양물을 수집하고, 원심분리 하여 세포 파편을 제거하였다. EDTA 및 PMSF(1 mM EDTA 및 150 μM PMSF 최종 농도)의 첨가후, S1YM10(아미콘) 나선형 카트리지를 사용하는 한외여과로 청정된 상청액을 10배로 농축시켰다. 농축물을 6개의 120 ㎖ 분획으로 분할하고, 정제전에 -70℃에서 보관하였다.
실시예 2
면역글로뷸린 Fc 키메라로서 가용성 LT-β 수용체의 제조
막 관통 영역까지의 LT-β-R의 세포외 영역은 각각 5' 및 3' 단부상에 NotI 및 SalI 제한효소 부위를 도입한 프라이머를 사용하여 cDNA 클론으로부터 PCR에 의해 증폭시켰다[Browning등,J. Immunol., 154, 33-46면 (1995)]. 증폭된 생성물은 NotI 및 SalI으로 절단하고, 정제하고, 인간 IgG1의 Fc 영역을 암호화하는 SalI-NotI 단편과 함께 NotI-선형화된 벡터 pMDR901내로 결찰시켰다. 생성된 벡터는 디히드로폴레이트 리덕타제 유전자 및 별도의 프로모터에 의해 구동되는 LT-β-R-Fc 키메라를 포함하였다. 이 벡터는 전기적 천공법으로 CHO dhfr-세포내로 도입하고, 메토트렉세이트-내성 클론을 표준 절차에 따라 분리하였다. 배지중에 LT-β-R-Fc를 분비시키고, ELISA 분석법을 사용하여 최고의 레벨로 키메라 단백질을 생산하는 세포주를 선별하였다. 고생산성 세포주를 대량으로 증식시키고, 조절한 배지를 회수하였다. 순수한 단백질을 단백질 A 세파로스 고속 유동 친화성 크로마토그래피에의해 분리하였다.
실시예 3
TNF-R 및 LT-β-R을 사용한 LT-α1/β2의 친화성 정제
LT 형태의 수용체 친화성 정제용 수지를 제조하기 위해, LT-β-R-Fc(상기 실시예 2에서 기술) 및 TNF-R p60-Fc[Crowe등,Science, 264, 707-10 (1994)]의 정제 조제물은 기본적으로 제품 설명에 따라 5 ㎎/㎖의 수지의 농도로 CNBr-세파로스(파마시아)상에 고정시켰다. 수지는 사용전에 하나의 용출 사이클에 적용시켰다. S1Y10 농축물의 일부(120 ㎖)를 LT-α 및 LT-α2/β1에 결합하는 두 개의 연속 p60 TNF-R-Fc 칼럼에 통과시켰다. LT-α1/β2 및 LT-β를 포함하는 유출액을 LT-β-R-Fc 칼럼에 통과시켰다. 그 칼럼을 각각 5 부피의 PBS, 0.5 M NaCl과 함께 PBS 및 PBS로 세척한 다음, LT-α 및 LT-α2/β1 복합체를 25 mM 인산나트륨, 100 mM NaCl(pH 3.5)로 용출시켰다. 용출 분획은 1/20 부피의 0.5 M 인산나트륨(pH 8.6)으로 즉시 중화시키고, 얼음상에 보관하였다. 단백질을 함유하는 분획은 280 ㎚의 흡광도로 확인하고, 피크 분획을 수집하고, 칼럼으로부터의 용출 푸울은 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색한 SDS-PAGE로 분석하였다. 상기한 용출에 의해 순도 95% 이상의 LT-α1/β2를 얻었다.
실시예 4
정제된 LT-α/β2 리간드의 특성규명
실시예 3의 분획은 겔 배제 크로마토그래피에 의해 크기에 따라 분리하여 삼량체가 형성되었는지 여부 및 집합체가 존재하는지 여부를 평가하였다. TSK G3000sw ×2 칼럼을 유속 0.5 ㎖/분으로 사용하여 바이오래드 겔 여과 단백질 표준물과 3개의 상이한 LT 삼량체인 LT-α3, LT-α2/β1 및 LT-α1/β2를 크기에 따라 분리하였다. 도 1A는 LT-α1/β2 삼량체가 고분자량의 집합체로서 거의 나타나지 않음을 보여준다. 크기 표준물과의 비교로 확인할 수 있는 바와 같이, 3가지 형태는 모두 삼량체, 즉 약 50 내지 60 kDa이었다. 삼량체로 가정하면, 정제된 LT-α1/β2 및 LT-α2/β1 분획에 포함된 LT-α 대 LT-β의 화학량론을 쿠마시 염색된 겔의 밀도 측정에 의해 또는 C4 역상 HPLC로 분리후 두 개의 피크의 피크 높이 분석으로 평가하였다. 두가지의 측정으로 전술한 친화성 칼럼으로부터 용출된 분획의 실체를 확인하였다.
조제물의 순도는 바이오캐드 기기를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피함으로써 추가로 평가하고, 여러 가지 상이한 완충제 시스템하의 약한 양이온 교환 수지상에서 LT-α1/β2 및 LT-α2/β1의 pH 지도를 제작하였다. 본 방법은 3개의 삼량체를 명백히 보유하고, 이를 분리하는 최대의 능력을 나타내는 것으로, 5 ㎖/분의 속도로 16.66 mM MES, 16.66 mM HEPES, 16.66 mM Na 아세테이트 완충액(pH6.5)을 통과시키고, 20이상의 칼럼 부피의 1 M NaCl 구배로 용출시키는 포로스(POROS) CM(카르복시메틸) 칼럼을 포함한다. LT-α1/β2 및 LT-α2/β1 복합체의 바이오캐드 크로마토그램은 도 1B에 도시한다. 각각의 삼량체 LT-α3, LT-α2/β1 및 LT-α1/β2는 상이한 염 농도에서 용출되었고, 다양한 조제물에서 1 내지 2% 이상의 교차 오염의 증거는 없었다.
실시예 5
가용성 LT-α1/β2 복합체에 의한 HT29 인간 선암 세포의 사멸
HT29 세포 용해 분석은 종래의 문헌[Browning and Ribolini,J. Immunol., 143, 1859-67면 (1989)]에 기술되어 있다. 통상의 분석에서, LT-α1/β2( 및 이용가능한 기타 사이토카인)의 일련의 희석액을 96웰 평판에서 0.5㎖ 제조하고, 5000개의 트립신 처리한 HT29-14 세포를 인간 IFN-γ의 0 또는 80 U/㎖(항 비루스 단위)를 함유하는 배지 0.05 ㎖에 첨가하였다. HT29-14 세포는 보다 균질한 본래의 ATCC-유래 HT29 세포주의 서브클론에서 유래한 것이다. HT29-14 세포를 본 분석에 사용하였는데; 이들 결과는 모두 본래의 ATCC-유래 HT29 세포주를 사용하여 관찰할 수도 있다. 3 내지 4일후, 염료 MTT의 미토콘드리아 감소는 다음과 같이 측정하였다: 10 ℓ의 MTT를 첨가하고, 3 시간후 감소된 염료를 10 mM의 HCl과 함께 0.09 ㎖의 이소프로판올로 용해시키고, 550 ㎚에서 O.D.를 측정하였다. 본 명세서에서 기술한 대로 제조한 가용성 수용체 형태 또는 순수한 인간의 IgG를 10 ㎕ 세포에 첨가하고 최종 농도를 5 ㎍/㎖로 하였다.
도 2A는 항-Fas 수용체 mAb CH-11(FasR 신호작용을 자극함); IFN-γ와 함께 TNF, LT-α3, LT-α1/β2 및 LT-α2/β1 리간드로 처리함으로써 HT29 세포를 사멸시킨 결과를 도시한 것이다. LT-α1/β2로 처리한 세포를 관찰한 결과, 이 작용제는 단지 세포 증식을 차단한다기보다는 세포를 사멸시키는 것을 확인하였다. IFN-γ의 부재하에서는, 세포가 TNF 수용체군으로부터의 신호작용을 처리하는 방법에 영향을 끼치는 IFN-γ의 특이한 능력을 반영하는 아무런 효과도 관찰되지 않았다. 인터페론 α 및 β는 항-비루스 활성 단위를 기준으로 정량분석할 때 IFN-γ보다효율이 100배 더 낮았다.
도 2B는 p60-TNF-R-Fc가 아닌 가용성 LT-β-R-Fc에 의한 LT-α1/β2 사멸의 억제를 나타내며, 세포독성은 LT-α1/β2에 특이적임을 입증하고 있다. p60-TNF-R-Fc에 의한 억제가 없다는 것은 오염성 LT-α(1% 미만으로 알려짐)가 LT-α1/β2의 세포독성 활성의 원인이 될 수 없음을 암시한다.
실시예 6
LT-α1/β2 복합체에 의한 HT29 세포의 사멸을 증진시키는 항-LT-β-R mAb
IFN-γ 및 항-LT-β-R mAb(0.01 내지 1000 ng/㎖ 시리즈)를 2× 최종 농도로 세포에 첨가한 다음, 50 ㎕의 세포 용액을 희석된 LT-α1/β2를 함유하는 웰에 첨가한 것을 제외하고는, 세포 용해 분석을 실시예 5에 기술한 대로 실시하였다. 실시예 5에 기술한 대로 성장을 평가하였다. 도 3은 LT-α1/β2 세포독성 활성을 증진시키는 그들의 능력에 두가지 상이한 항-LT-β-R mAb가 미치는 특이한 효과를 도시한다. 도 3A는 항-LT-β-R mAb CDH10이 용량-의존 방식으로 LT-α1/β2 세포독성 활성을 증진시키는 것을 도시한다. 도 3B는 동일한 분석에서 또다른 항-LT-β-R mAb인 BDA8의 효과를 도시한다. BDA8 mAb는 종양 세포 사멸을 증진시키기보다는 LT-α1/β2의 세포독성 활성을 억제한다.
실시예 7
HT29 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 고정화된 항-LT-β-R mAb
플라스틱 표면상에 항-LT-β-R mAb를 고정화하기 위해, 96-웰 조직 배양 평판을 10 ㎍/㎖의 염소 항-마우스 Fc 폴리클로날 항체(잭슨 이뮤노리서치) 50 ㎕로코팅하고, 세척하고, PBS중 5% FCS로 차단한 다음, 나타난 항-LT-β-R mAb를 포획하고, 다시 세척하였다. HT29 세포는 mAb-코팅된 웰내로 도말하고, 실시예 5와 같이 세포 용해 분석을 수행하였다. 도 4A는 HT29 세포에 미치는 고정화된 BDA8 및 CDH10 항-LT-β-R mAb의 세포독성 효과를 예시한다. 각각의 mAb는 표면에 고정화될 때 종양 세포에 대한 세포독성을 개별적으로 유발한다. 도 4B는 용액내에서 개별적으로 시험한 동일한 BDA8 및 CDH10 항-LT-β-R mAb는 세포독성이 없으며, 따라서 시험관 내에서 단일의 항-LT-β-R mAb의 세포 용해 활성은 그 고정화의 작용인 것 같다는 점을 나타낸다.
실시예 8
명확한 에피토프에 대해 용액내에 유도된 항-LT-β-R mAb의 조합물에 의한 HT29 세포의 사멸
하나 또는 두 개의 항-LT-β-R mAb가 성장 배지에 포함된다는 점을 제외하고는, HT29 세포의 성장은 실시예 5에 기술한 대로 평가하였다. 표 1에는 다양한 항-LT-β-R mAb가 용액내에 포함되는 경우(즉, 플라스틱상에 고정화되지 않음)에 관찰되는 HT29 세포에 대한 효과를 나타낸다. 항-LT-β-R mAb는 HT29 세포 용해 분석에서 상호 조합하여 작용하는 그들의 상대적 능력에 근거하여 군 I-IV로 정할 수 있다. 세포 용해 분석에서 얻은 항-LT-β-R mAb의 결과는 수용체 결합 데이터와 일치하는데, 이것은 상이한 각각의 군내의 mAb가 LT-β-R의 상이한 에피토프를 인지함을 암시하는 것이다.
가용성 항-LT-β-R mAb 조합물의 인간 선암 HT29 세포에 대한 세포독성
2차 mAb
군 1차 mAb I 군 II 군 III 군 IV 군
BDA8 AGH1 BCG6 BHA10 BKA11 CDH10 CBH11
I BDA8 nr - + ++ + nd nd
AGH1 - nr ++ +++ ++ nd nd
II BCG6 ++ ++ nr - +++ nd nd
BHA10 ++ +++ - nr + +++ ++++
III BKA11 + ++ +++ nd nr - nd
CDH10 ++ ++ ++ +++ - nr +++
IV CBE11 nd + + ++++ nd ++++ nr
항-LT-β-R mAb는 HT29 세포의 세포 용해 분석에서 상호 조합하여 작용하는 그 효과에 근거하여 I, II, III 및 IV 군으로 나누었다. 플러스(+)는 80 U/㎖의 IFN-γ의 존재하에 HT29 세포에 대한 mAb 조합물의 세포 용해 효과의 상대적 레벨을 의미한다. nr = 관련 없음(not relevant); nd = 측정하지 않음(not determined).
5A-D는 HT29 세포 용해 분석에 포함되는 LT-β-R의 상이한 에피토프에 대해 유도된 항-LT-β-R mAb와 동시작용하는 쌍을 이룬 대표적인 조합물의 효과를 정량분석한 것이다. 도 5A는 BHA10 및 CBE11의 세포독성 효과를 도시하며, 도 5B는 CDH10 및 CBE11의 세포독성 효과를 도시하며, 도 5C는 CDH10 및 AGH1의 단독 및 조합물의 세포독성 효과를 도시하며, 도 5D는 WiDr로 불리는 상이한 종양 세포주에서 CDH10 및 AGH1 mAb 조합물의 세포독성 효과를 도시한다.
표 2는 본 발명의 대표적인 항-LT-β-R mAb의 특성을 요약한 것이다.
마우스 항-인간 LT-β-R mAb HT29 세포독성의 요약
mAb 군 mAb 명칭 세포 염색a 수용체 결합의 차단b 플라스틱상에 고정된 mAbc 가용성 mAb 단독 가용성 mAb + LTα1β1
I BDA8 +++ +++ + +/-d 억제
I AGH1 +++ +++ +/- 억제
II BCG6 +++ ++ + +/- 혼합
II BHA10 +++ +++ + +/- 혼합
III BKA11 +++ +/- + - 증진
III CDH10 +++ +/- + +/- 증진
IV CBE11 +++ +++ + +/- 효과 없음
대조군 MOPC21 - - - - 효과 없음
HT29/26 - nd - - 효과 없음
TS 2/9e nd nd - - 효과 없음
a LT-β-R로 형질감염시킨 CHO 세포의 FACS 염색b 항체가 활성화된 T-세포 하이브리도마 II-23에 대한 가용성 수용체의 결합을 차단하는지 여부에 대한 분석. nd = 시행하지 않음(not done).c HT-29 세포는 본 방법에서 명시한 바와 같이 항-LT-β-R 코팅된 평판상의 IFN-γ로 증식시켰다.d 일부 분석에서는 가변적이고 부분적인 억제, 다른 분석에서는 효과 없음.e 항-인간 LFA-3, 마우스 IgG1.
실시예 9
종양 세포 치료용 내인성 IFN-γ의 신뢰성
본 발명의 바람직한 LT-β-R 활성화제는 항종양 활성을 나타내며 인간에서 내성을 보유하는 사이토카인이다. 종양 주위 환경에 존재하는 내인성 IFN-γ는 충분이 높은 농도로 존재하여 외인성 IFN-γ을 첨가하지 않고도 본 발명의 LT-β-R 활성화제로서 기능할 수 있다. 종양 부근의 IFN-γ의 농도는 종양 부위에서 취한 조직 샘플을 이용하는 표준 면역화학적 기술로 확인할 수 있다. IFN-γ의 내재 농도가 본 발명의 LT-α/β 헤테로머 복합체 또는 항-LT-β-R mAb와 함께 항종양 활성을 유도하기에 충분히 높으면(본원에 기술한 세포 용해 분석에 의해 측정함), IFN-γ는 본 발명의 조성물 또는 방법에서 제2의 LT-β-R 활성화제로서 투여할 필요는 없다.
실시예 10
종양 세포 치료용 LT-β-R 활성화제로서의 내인성 IFN-γ의 유도
IFN-γ과 같은 인터페론의 내인성 생산을 유도할 수 있는 화합물은 본 발명의 LT-β-R 활성화제의 군내에 포함된다. 예를 들면, 인터페론은 폴리리보구아닐산/폴리리보시티딜산(폴리-G/C)과 같은 2본쇄 RNA 분자로 처리하므로써 유도할 수 있다.
자성(female) C57/b16(6-8주령)에 TNF 및 기타 항종양제의 효과에 대해 마우스를 감작시키는 D-갈락토스아민 18 ㎎(600 ㎎/㎏)을 주사하였다. 중성의 염수 용액 상태의 일련의 농도의 폴리-G/C[Juraskova등,Eur. J. Pharmacol., 221, 107-11 (1992)]를 정제된 LT-α1/β2(10-100 ㎍)에 첨가하고, 마우스에게 그 용액을 복강내(i.p.) 주사하였다. LT-α1/β2의 항종양 활성은 폴리-rG/rC 2본쇄 RNA의 존재에 의해 증가될 수 있다.
유사하게, 식물인 글리시리자 글래브라[Acharya등,Indian J. Med. Res., 98, 69-74면 (1993)]에서 유래한 인터페론 자극 물질을 40 내지 100 ㎖/일 범위의 용량으로 인간의 정맥내로 투여할 수 있다. LT-α/β 헤테로머 복합체 또는 항-LT-β-R Ab의 존재하에 LT-β-R 활성화에 최적인 용량은 경험적으로 측정하며, 종양 유형, 전달 방식 및 전달 계획과 같은 요인에 따라 좌우될 것이다.
이미퀴모드 R-837[Bernstein등,Antiviral Res., 20, 45-55면 (1994)); 사파랄(Paramonova등,Vopr. Virusol., 39, 131-34면 (1994)); 브로피리민(Onishi and Machida,Hinyokika Kiyo, 40, 195-200면 (1994)); 또는 리도스틴(Cheknev등,Vopr. Virusol., 39, 125-28면 (1994)]을 LT-α/β 헤테로머 복합체, 항-LT-β-R Ab 또는 이들의 조합물과 함께 LT-β-R 활성화제로서 투여할 수도 있다. 각 경우에, 바람직한 전달 방식 및 최적 용량은 통상의 임상 절차에 의해 최적화의 출발점으로서 공개된 문헌을 사용하여 경험적으로 결정할 수 있다.
실시예 11
인간 LT-α1/β2 주사에 내성이 있는 마우스
수일 동안 설비에 순응시킨 자성 C57/b16(6-8주령)에게 TNF 및 기타 항종양제의 효과에 대해 마우스를 감작시키는 D-갈락토스아민 18 ㎎(600 ㎎/㎏)을 복강내로 주사하였다. 표 3에는 주사후 24 시간째에 처리된 마우스의 생존율을 나타낸다.
주사후 24 시간째에 처리된 마우스의 생존율
약제 용량(㎍/동물) 생존율
염수 - 4/4
hu-TNF 0.2 0/6
hu-TNF 1.0 0/2
hu-TNF 10 0/4
hu-LT-α 0.2 2/2
hu-LT-α 1.0 2/2
hu-LT-α1/β2 10 2/2
hu-LT-α1/β2 100 2/2
실시예 12
재조합 항-LT-β-R IgM 모노클로날 항체의 구성
면역결핍 마우스에서 표준 종양 성장 모델과 연계된 전술한 항종양 세포독성 분석법을 사용하여, 적합한 성질을 가진 항-LT-β-R IgG를 선택할 수 있다. 표준 역전사효소/PCR 방법을 사용하여 분비성 하이브리도마 세포주로부터 분리된 RNA로부터 가변 영역 DNA를 제조하는 데에, 선택된 항-LT-β-R mAb IgG의 IgG 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 각각에 혼성화하는 보편적인 프라이머를 사용할 수 있다. 이들 방법은 문헌에 기술되어 있다[Arulanandam등,J. Exp. Med., 177, 1439-50면 (1993); Lane등,Eur. J. Immunol., 22, 2573-78면 (1993); Traunecker등, Nature, 339, 68-70면 (1989)].
증폭된 생성물은 인간의 CH1, CH2 및 CH3 μ쇄 영역을 포함하는 벡터내로 조립한다. 단일 숙주내 두 개 쇄의 동시 발현은 5량체 IgM 분자내로의 중쇄 및 경쇄의 조립을 가능하게 한다. 이 분자는 인간 불변부에 결합된 마우스 가변부로 이루어진 키메라이다.
한편, 가변부중 실제 결합부 만을 암호화하는 DNA를 증폭시키기 위해 PCR을 사용하는 방법을 사용할 수 있다. 증폭된 DNA는 항원 결합에 관여하는 실제 아미노산을 제외하고는 인간 IgG 서열 전부를 포함하는 벡터내로 삽입한다. 그러한 구성물을 "인간화된" 항체로 부르고, 그 상세한 생산 방법은 널리 알려져 있다(참조문헌; WO 94/04679)
실시예 13
LT-β-R 활성화제로서의 항-LT-β-R IgM 모노클로날 항체의 기능
실시예 12에서 기술한 바와 같이 항-LT-β-R IgM 항체를 재조합 형태로 제조할 수 있다. 한편, 정상 마우스의 1차 면역화 또는 CD40 신호작용 결핍 마우스[Kawabe등,Immunity, 1, 167-78면 (1994); Xu등,Immunity, 1, 423-31면 (1994)]의 광범위한 면역화 방법을 사용하는 하이브리도마 융합 기술에 의해 분리된 완전한 마우스 IgM을 항-LT-β-R IgM mAb 공급원으로서 사용할 수 있다.
항-LT-β-R IgM mAb는 IFN-γ의 존재하의 H29 세포용해 분석에서 용량-반응 비교에 의해 측정되는 바와 같이, LT-β-R 활성화제로서 그 정상적인 2가 IgG 상대보다 상당히 더 효력이 있을 것이다. 항-LT-β-R IgM mAb는 고정화된 경우 및 용액 상태로 투여될 경우에 모두 LT-β-R 활성화제로서 기능한다. 또한, 본 발명자들은 항-LT-β-R IgM mAb가 LT-α/β 헤테로머 복합체의 항종양 활성을 증가시킬 것으로 예상한다.
실시예 14
SCID 마우스에서 인간 종양 세포의 성장을 억제하는 항-LT-β-R mAb
0.2 ㎖ 부피의 PBS중의 1×106트립신 처리하고 세척한 인간의 선암 WiDr 세포를 Balb/c SCID 마우스(잭슨 랩, 메인주 바 하버)의 등에 피하 주사하였다. 한 세트의 실험에서는, 마우스를 인간의 IFN-γ(106항비루스 단위/마우스)의 존재 또는 부재하에 CBE11 항-LT-β-R mAb로 처리하거나 또는 처리하지 않으며, 동시에 WiDr 세포를 피하 접종하였다(도 6A). 항체 및 IFN-γ를 단독으로 또는 함께 0.2 ㎖ 부피로 복강내 주사로 투여하였다. 대조군 마우스에게 염수 단독, IFN-γ 단독또는 대조군 항-인간 LFA-3 mAb(1E6) + IFN-γ를 주사하였다. 접종후 30일째에 각각의 생성 종양의 크기를 기록하였다. 종양의 부피(㏄)를 2차원 캘리퍼스로 측정한 반경으로부터 계산하였다. CBE11 또는 1E6 mAb로 처리한 동물은 10 ㎍/마우스 또는 50 ㎍/마우스의 항체를 투여하였다(도 6A; 각각 점이 있는 원과 빈 원).
또다른 세트의 실험에서는, 마우스에게 WiDr 세포를 피하 접종하고, 마우스를 CBE11 항-LT-β-R mAb로 처리하기 전에 종양을 15일 동안 성장시켰다(도 6B). 15일째에(항체 처리전), 평균 종양 부피는 0.076 ㏄이고, 평균 직경은 0.53 ㎝였다. 그 후 CBB11 항-LT-β-R mAb(50 ㎍)을 인간의 IFN-γ(106항비루스 단위/마우스)의 존재 또는 부재하에 12 마리의 동물군에게 0.2 ㎖의 부피로 복강내 주사로 투여하였다. 3주에 걸쳐 주사를 3회 더 반복하였다. 대조군(12 마리의 마우스/군)에게 IFN-γ(106항비루스 단위/마우스)만을 주사하거나 대조군 항-인간 LFA-3 mAb (1E6) 50 ㎍ + IFN-γ(106항비루스 유닛/마우스)를 주사하였다. 15일째에 존재하는 종양의 성장을 종양 세포 접종후 15일 내지 49일까지 시간에 따라 기록하였다. 도 6B에 도시한 결과는 맹검 형식으로 측정하였다. IFN-γ의 존재 또는 부재하에 CBE11 mAb로 처리한 종양은 성장을 중지하였다. 3주에 걸쳐 CBE11 mAb(+/- IFN-γ)를 3회 주사한 후에, 종양 성장은 접종후 적어도 7주 동안 정지하였는데, 이 때 실험을 종료하였다.
본 발명은 LT-β-R 활성화에 근거한 항종양 요법은 여러 가지 장점을 가진다. LT-β-R은 β/β 틈내에서는 높은 친화성으로 LT-α/β 헤테로머 복합체에 결합하지만, 인접 LT-α와 LT-β 서브유닛 사이의 경계에 형성된 α/β 틈내에서는 보다 낮은 친화성으로 결합한다. 대조적으로, INF 수용체는 α/α틈에만 높은 친화성으로 LT-γ/β 헤테로머 복합체에 결합한다. 따라서, 정제된 LT-α1/β2 복합체는 인접 LT-β 서브유닛 사이의 LT-β-R에 높은 친화성으로 결합하나 α/α 틈이 부족하기 때문에, TNF 수용체를 통한 신호작용을 교차활성화시키지 못한다. 따라서, 본 발명의 LT-α/β 헤테로머 복합체는 TNF-관련 염증 반응을 자극하지 않을 것이다.
LT-α1/β2 투여는 비교적 높은 레벨에서조차도 염증 반응과 관련된 내피 세포 변화를 활성화시키지 않는다. 이러한 이유로, LT-β-R을 활성화하기 위하여 약학 조성물 및 치료 방법을 사용하는 경우에도 TNF로 관찰한 염증의 다단계 활성화 반응으로 인한 부작용이 문제가 되어서는 아니된다.
인간 LT-α1/β2는 인간 LT-β-R에 대한 것과 마찬가지로 실질적으로 마우스 LT-β-R에 결합한다. 마우스 1 마리당 100 ㎍의 인간 LT-α1/β2의 주사는 치사량이 아니며(실시예 11), 이것은 전체 동물에서의 LT-β-R의 자극이, 유사한 실험을 FasR 또는 p60 TNF-R 활성화에 의해 시행할 경우에 나타나는 명백한 독성을 갖는 것이 아님을 암시한다.
인간에서 이 경로를 유도하기 위해 특이 항-LT-β-R mAb를 사용하는 것은 LT-α/β 헤테로머 복합체에 의한 치료에 비해 여러 가지 장점을 가질 수 있다. 항-수용체 항체 요법은 리간드로 치료하는 것보다 더 선택성이 있을 것이다. 더욱이,재조합 형태의 항-LT-β-R mAb는 가용성 LT-α/β 헤테로머 복합체보다 조작 및 대량 제조에서 더 용이할 것이다.
mAb 또는 LT-α/β 헤테로머 복합체는 통상의 항-종양 요법(즉, 방사선 및 화학요법)과 함께 종양-보유자에게 투여하는 것을 생각할 수 있다. 통상의 화학요법과 LT-β-R 활성화의 병행 치료는 통상의 항-종양 요법만을 사용하는 경우보다 환자에게서 종양형성 세포를 제거하기가 더 쉬운 종양 사멸 활성을 보유하는 추가의 인자를 제공할 수 있다.
이 방법은 비교적 부작용이 없고, 따라서 전이되지 않았을 수도 있는 암종에서 또는 특정 암 유형에 대한 유전적 선청성을 나타내는 가족중의 환자에서 준예방적 차원으로 제공될 수 있다.
하기의 실시예는 본 발명의 LT-α/β 헤테로머 복합체 및 항-LT-β-R mAb와 이들의 특성규명에 사용된 방법들을 예시한다. 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니되며; 단지 예시의 목적으로 제시된 것이며; 본 발명은 특허 청구의 범위에 의해서만 한정된다.

Claims (31)

  1. 치료학적 유효량의 LT-α/β 헤테로머 복합체와 치료 유효량의 1종 이상의 LT-β-R 활성화제를 포함하는 종양의 진행, 심화 또는 효과를 치료하거나 또는 경감시키는 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, LT-β-R 활성화제가 치료학적 유효량의 IFN-γ를 포함하는 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 제2의 LT-β-R 활성화제가 치료학적 유효량의 항-LT-β-R 항체를 포함하는 약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 항-LT-β-R 항체가 모노클로날 항체인 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 항-LT-β-R 모노클로날 항체가 항-LT-β-R mAb BKA11, CDH10, BCG6 및 BHA10으로 구성된 군에서 선택된 약학 조성물.
  6. 치료학적 유효량의 2종 이상의 LT-β-R 활성화제 및 약학적 허용 담체를 포함하는 종양의 진행, 심화 또는 효과를 치료하거나 또는 경감시키는 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 1종 이상의 LT-β-R 활성화제가 항-LT-β-R 항체를 포함하는 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 항-LT-β-R 항체가 CBE11인 약학 조성물.
  9. 제6항에 있어서, LT-β-R의 비중첩 에피토프에 대해 유도되는 2종 이상의 항-LT-β-R 모노클로날 항체를 포함하는 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 하나의 항-LT-β-R 모노클로날 항체가 AGH1 및 BDA8로 구성된 군에서 선택되고, 또 하나의 항-LT-β-R 모노클로날 항체는 BCG6, BHA10, BKA11, CDH10 및 CBE11로 구성된 군에서 선택되는 약학 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 하나의 항-LT-β-R 모노클로날 항체가 BCG6 및 BHA10으로 구성된 군에서 선택되고, 또 하나의 항-LT-β-R 모노클로날 항체는 AGH1, BDA8, BKA11, CDH10 및 CBE11로 구성된 군에서 선택되는 약학 조성물.
  12. 제9항에 있어서, 하나의 항-LT-β-R 모노클로날 항체가 BKA11 및 CDH10으로 구성된 군에서 선택되고, 또 하나의 항-LT-β-R 모노클로날 항체는 AGH1, BDA8, BCG6, BHA10 및 CBE11로 구성된 군에서 선택되는 약학 조성물.
  13. 제9항에 있어서, 하나의 항-LT-β-R 모노클로날 항체가 CBE11이고, 또 하나의 항-LT-β-R 모노클로날 항체는 AGH1, BDA8, BCG6, BHA10, BKA11, CDH10 및 CBE11로 구성된 군에서 선택되는 약학 조성물.
  14. 제9항에 있어서, 항-LT-β-R 모노클로날 항체가 CBE11 및 BHA10인 약학 조성물.
  15. 제9항에 있어서, 항-LT-β-R 모노클로날 항체가 CBE11 및 CDH10인 약학 조성물.
  16. 제9항에 있어서, 항-LT-β-R 모노클로날 항체가 AGH1 및 CDH10인 약학 조성물.
  17. 제6항 내지 제16항중 어느 한 항에 있어서, 하나의 LT-β-R 활성화제가 IFN-γ인 약학 조성물.
  18. 제2의 LT-β-R 활성화제의 존재하에 제1의 LT-β-R 활성화제로서 치료학적 유효량의 가교된 항-LT-β-R 항체 및 약학적 허용 담체를 포함하는 종양의 진행, 심화 또는 효과를 치료하거나 또는 경감시키는 약학 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 가교된 항-LT-β-R 항체가 표면에 비공유 결합에 의해 고정된 약학 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 가교된 항-LT-β-R 항체가 표면에 공유 결합에 의해 고정된 약학 조성물.
  21. 제18항에 있어서, 가교된 항-LT-β-R 항체가 항-LT-β-R 항체 가교제에 의해 용액내에 비공유 결합으로 회합된 약학 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 항-LT-β-R 항체 가교제가 항-LT-β-R 항체에 대해 유도된 2차 항체를 포함하는 약학 조성물.
  23. 제21항에 있어서, 항-LT-β-R 항체 가교제가 항-LT-β-R 항체에 결합하는 Fc 수용체를 포함하는 약학 조성물.
  24. 제18항에 있어서, 가교된 항-LT-β-R 항체가 화학적 항-LT-β-R 항체 가교제에 의해 용액내에 공유 결합으로 회합된 약학 조성물.
  25. 제18항 내지 제24항중 어느 한 항에 있어서, 제2의 LT-β-R 활성화제가 IFN-γ를 포함하는 약학 조성물.
  26. 치료학적 유효량의 1종 이상의 LT-β-R 활성화제 및 약학적 허용 담체를 포함하는 종양의 진행, 심화 또는 효과를 치료하거나 또는 경감시키는 약학 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 1종 이상의 LT-β-R 활성화제가 항-LT-β-R 항체를 포함하는 약학 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 항-LT-β-R 항체가 CBE11인 약학 조성물.
  29. a) LT-α/β 헤테로머 복합체, 유효량의 제1 LT-β-R 활성화제 및 제2의 추정 LT-β-R 활성화제의 존재하에 종양 세포를 배양하는 단계 ; 및
    b) 제2의 추정 LT-β-R 활성화제가 제1 LT-β-R 활성화제의 존재하에 LT-α/β 헤테로머 복합체의 항종양 활성을 증가시키는지를 측정하는 단계를 포함하여, LT-α/β 헤테로머 복합체의 존재하에 작용하는 LT-β-R 활성화제를 선별하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 제1 LT-β-R 활성화제가 IFN-γ인 방법.
  31. 제25항에 있어서, LT-α/β 헤테로머 복합체가 LT-α1/β2 화학량론을 갖는 방법.
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