SK286497B6 - Zmes LT-alfa/beta heteromérneho komplexu a/alebo najmenej jedného LT-beta-R aktivujúceho činidla, farmaceutický prostriedok, LT-beta-R aktivujúce činidlo a spôsob jeho výberu - Google Patents

Abstract

Je opísaná farmaceutická kompozícia obsahujúca aspoň jedno LT-beta-R aktivujúce činidlo, pričom jedno LT-beta-R činidlo zahrnuje protilátku anti-LT-beta-R, a jej použitie na liečenie alebo zmierneniepostupu, závažnosti alebo účinkov neoplázie. Ďalej je opísané použitie LT-alfa/beta heteromérneho komplexu na prípravu farmaceutickej kompozície na podanie v prítomnosti aspoň jedného LT-beta-R aktivujúceho činidla na liečenie alebo zmiernenie postupu, závažnosti alebo účinkov neoplázie. Predmetom vynálezu je tiež spôsob selekcie LT-beta-R aktivujúceho činidla.

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka farmaceutických kompozícií a použitia týchto kompozícií na aktiváciu signalizácie receptora lymfotoxínu-β, ktorá potom vyvoláva silné antiproliferatívne účinky na nádorové bunky. Predovšetkým sa vynález týka heteromémych lymfotoxínových komplexov vytvorených medzi lymfotoxínom-α a viacerými podjednotkami lymfotoxinu-β, ktoré indukujú cytotoxické účinky na národorové bunky za prítomnosti lymfotoxín-β receptor aktivujúcich činidiel. Do rozsahu vynálezu spadajú tiež protilátky zacielené proti lymfotoxín-β receptoru, ktoré pôsobia ako lymfotoxín-β receptor aktivujúce činidlá samy osebe alebo v kombinácii s inými lymfotoxín-β receptor aktivujúcimi činidlami buď za prítomnosti, alebo za neprítomnosti komplexov lymfotoxín-α/β. Predmetom vynálezu je tiež skríningová metóda na selekciu týchto protilátok. Vynález sa týka tiež kompozícií a použitia týchto kompozícií využívajúcich zosieťované protilátky antilymfokin-β receptora za prítomnosti iných lymfotoxín-β receptor aktivujúcich činidiel s cieľom potencovať cytotoxicitu rakovinových buniek.

Doterajší stav techniky

Rodina receptora faktora nekrotizujúceho nádory (TNF) má niekoľko členov, ktorých signalizácia môže vyvolať smrť bunky nekrózou alebo apoptózou (programovaná smrť bunky). Ligandy TNF a lymfotoxínu-a (LT-α, skôr nazývaný TNF-β sa viažu na a aktivujú TNF receptory (p60 a p80, tu nazývané „TNF-R“). Signalizácia TNF-R iniciuje všeobecné imunitné odpovede na infekcie alebo stres v normálnych bunkách, je ale cytotoxická na bunky s transformovanými fenotypmi alebo na nádorové bunky. TNF-R signalizácia môže spôsobiť selektívnu lýzu nádorových buniek a buniek infikovaných vírusmi. Cytotoxické účinky signalizácie TNF-R na nádorové bunky sa zväčšia mterferónom-r (IFN-τ) a rôznymi obvyklými chemoterapeutickými prostriedkami.

Bolo by užitočné využiť antiproliferatívnu alebo cytotoxickú aktivitu indukovanú TNF-R signalizáciou v nádorových bunkách na terapeutické účely. Aktivácia TNF-R však má pleiotropné účinky na množstvo imunoregulačných odpovedí vrátane iniciácie prezápalových kaskád. Nebolo teda možné zamieriť cytotoxické účinky signalizácie TNF-R na nádorové bunky bez súčasnej stimulácie zápalových odpovedí, ktoré vedú u ľudí k celkovej toxicite.

Obdobne môže stimulácia iného s TNF príbuzného receptora nazvaného Fas receptor (FasR) aktivovať cytotoxicitu programovaným úmrtím buniek pri rôznych typoch tak nádorových, ako nenádorových buniek. Bolo však preukázané, že aktivácia FasR spôsobuje rýchlu nekrózu pečene, čím znemožňuje jeho terapeutickú aplikáciu u ľudí.

Nedávno bol identifikovaný iný receptor v rodine TNF, nazývaný LT-β receptor (LT-P-R) (Crowe a spol., Science, 264, str. 707 až 710 (1994)). Lt-p-R viaže heteroméme lymfotoxínové komplexy (LT-α/β), ktoré obsahujú LT-α podjednotky v kombinácii s iným s TNF príbuzným polypeptidom zvaným lymfotoxín-β (LT-β). Tieto LT-α/β komplexy sú spojené membránou a väčšinou majú stechiometriu LT-αΙ/βζ (Browning a spol., Celí, 72, str. 847 až 856 (1993), Browning a spol., J. Immunol., 154, str. 33 až 46 (1995)).

Existuje názor, že analogicky s TNF-R a inými receptormi podobnými TNF dochádza k aktivácii signalizácie ΕΤ-β-R, keď je privedených viac receptorov na povrchu bunky do tesnej blízkosti (Crowe a spol., Science, 264, str. 707 až 710 (1994)). Tento proces je nazývaný kumulácia receptorov. Ligandy TNF a LT sú multivalentné komplexy, ktoré sa môžu súčasne viazať a tak tvoriť agregát viac ako s jedným receptorom. Kumulácia receptorov ako prostriedok na aktiváciu receptorov v iných systémoch bola dobre zdokumentovaná, predovšetkým pre receptor tyrozín kinázy (Ullrich a Schlesinger, Celí, 61, str. 203 až 212 (1990), Kolanus a spol., Celí, 74, str. 171 až 183 (1993)). Aplikácia ligandov ΚΓ-αΙ/βζ a/alebo LT-p-R aktivujúcich činidiel, ktorá môže indukovať na povrchu cieľových nádorových buniek kumuláciu a signalizáciu molekúl LT-β-R v smere expresie génu, by teda bola užitočná na priamu stimuláciu cesty LT-P-R v týchto bunkách.

Signalizácia pomocou LT-p-R, podobne ako TNF-R, môže aktivovať cesty, ktoré vedú k cytotoxicite a smrti bunky pri nádorových bunkách. Dôležité je, že ligandy LT-al/p2 sa neviažu na TNF-R žiadnou významnou afinitou. Z toho dôvodu riadená aktivácia LT-P-R v nádorových bunkách by vyvolala cytotoxicitu v týchto bunkách bez stimulácie zápalových ciest spojenej s aktiváciou TNF-R. Liečba s LT-al/p2 a/alebo s inými LT-P-R aktivujúcimi činidlami by teda bola užitočná na liečenie alebo obmedzenie pokračovania, závažnosti alebo účinkov nádorových buniek (neoplázie) za súčasného prekonania problémov so závažnými vedľajšími účinkami, ktoré sa vyskakovali, keď bola skúšaná aktivácia TNF-R alebo FasR ako protinádorová liečba.

Podstata vynálezu

Vynález rieši uvedené problémy tým, že poskytuje farmaceutické kompozície a ich použitia na liečbu nádorových buniek stimuláciou signalizácie LT-fi-R bez súčasnej stimulácie zápalových odpovedí spojených s TNF-R. Podľa jedného uskutočnenia sú poskytnuté komplexy lymfotoxínu vytvorené medzi LT-α a viacerými podjednotkami LT-β (LT-α/β heteroméme komplexy), ktoré indukujú cytotoxické účinky na bunky, ktoré nesú ΤΤ-β-R za prítomnosti ΤΤ-β-R aktivujúceho činidla. Výhodnými kompozíciami a použitím podľa tohto uskutočnenia sú komplexy υΤ-α1/β2 za prítomnosti LT-fi-R aktivačného činidla. Výhodnejšie sú LT-α1/β2 komplexy skôr v rozpustnej forme ako vo forme viazanej na membránu a ίΤ-β-R aktivačným činidlom je IFN-y.

Podľa iného uskutočnenia vynálezu je najmenej jedna protilátka zacielená proti LT-p-R (anti-LT-a-R protilátka), použitá ako druhé ΤΤ-β-R aktivujúce činidlo v spojení s heteromémym komplexom LT-α/β. Výhodné kompozície a použitie podľa tohto uskutočnenia sa vyznačujú LT-αΙ/βζ za prítomnosti IFN-γ ako prvého aktivujúceho činidla a najmenej jednej anti-LT-a-R protilátky ako druhého ΤΤ-β-R aktivujúceho činidla. Výhodnejšie sú ΤΤ-α1/β2 komplexy rozpustné a protilátka je monoklonálna protilátka (anti-LTYR mAb).

Podľa iného uskutočnenia je použitá najmenej jedna anti-LT^-R protilátka za prítomnosti alebo neprítomnosti druhého ΤΤ-β-R aktivujúceho činidla bez exogénneho LT-α/β heteromémeho komplexu. Výhodné kompozície a použitie podľa tohto uskutočnenia obsahujú najmenej dve anti-LTYR monoklonálne protilátky (anti-LT^-R mAbs), ktoré rozpoznávajú neprekrývajúce sa epitopy LT-β-R v kombinácii s IFN-γ.

Predmetom ďalšieho uskutočnenia vynálezu sú farmaceutické kompozície a použitie na potencovanie cytotoxicity pre nádorové bunky, ktoré sa vyznačujú tým, že sa používajú zosietené anti-LT^-R protilátky v spojení s druhým ΤΤ-β-R aktivačným činidlom. Podľa výhodného uskutočnenia sú jednotlivé anti-LT-P-R protilátky imobilizované zosietením na povrch. Podľa iného výhodného uskutočnenia sú anti-LT^-R protilátky zosietené v roztoku. Výhodnejšie sú anti-LT-D-R protilátky monoklonálne protilátky a druhým LT-D-R aktivujúcim činidlom je IFN-γ.

Predmetom vynálezu je ďalej nový skríningový proces na selekciu υΓ-β-R aktivujúcich činidiel, ako napríklad anti-LT^-R protilátok, ktoré pôsobia v kombinácii s LT-α/β heteromémymi komplexami k urýchleniu smrti nádorových buniek. Test využíva zvýšenú senzitivitu humánnych adenokarcinomatóznych buniek na LT-α/β heteroméme komplexy za prítomnosti ίΤ-β-R aktivujúcich činidiel v teste na cytotoxicitu. Postup použitý na testovanie predpokladaných ΤΤ-β-R aktivujúcich činidiel je opísaný na príklade protilátok anti-ΤΤ-β-R a pozostáva z nasledujúcich operácií:

(1) Nádorové bunky (napríklad ľudské adenokarcinomatózne bunky HT29) sa kultivujú niekoľko dní v médiu obsahujúcom IFN-7 a purifikovaný LT-αΙ/βζ za prítomnosti alebo neprítomnosti príslušnej testovanej anti-LT^-R protilátky.

(2) Na bunky sa pôsobí farbivom, ktoré zafarbí živé bunky.

(3) Spočítajú sa zafarbené bunky, aby sa stanovil podiel nádorových buniek usmrtených za prítomnosti LT-α1/β2, IFN-t a testovanej anti-LT^-R protilátky v každej vzorke. Alternatívne sa môže stanoviť počet prežívajúcich buniek ľubovoľným z množstva dobre známych testov, ktorými sa meria životaschopnosť buniek, ako napríklad inkorporáciou 3H-tymidínu do DNA.

Jednou z anti-LT-/3-R protilátok (alebo kombinácia protilátok), ktorá zvyšuje významne percento nádorových buniek usmrtených v tomto teste, je ΤΤ-β-R aktivujúce činidlo v rámci rozsahu tohto vynálezu. Tento cytolytický test môže byť prispôsobený na identifikáciu nových ΤΤ-β-R aktivujúcich činidiel, ktoré fungujú v kombinácii s LT-α/β heteromémymi komplexami.

Vynález je ilustrovaný na priložených výkresoch takto:

Obrázok IA

Triediace analýzy purifikovaných foriem LT-α/β heteromémeho komplexu rozdelených pomocou TNF-R a ΤΤ-β-R imunoafinitnej chromatografie.

Purifikované proteíny boli analyzované na živici TSK 3000 HPLC vo fyziologickom roztoku, pufrovanom fosfátom. Je znázornená poloha rôznych ukazovateľov veľkosti.

Obrázok IB

Ionomeničové analýzy purifikovaných LT foriem s použitím karboxymetylovej kolóny Poros (4,6 mm x x 100 mm) na prístroji Bio-Cad (Perceptive Biosystems).

pg každej vzorky proteínu sa nanieslo na kolónu a eluovalo sa v gradiente 0 až 1 M NaCl cez 20 objemov kolóny pri 5 ml/minúta v pufre obsahujúcom 16,66 pM Hepes, 16,66 pM octan sodný a 16,66 pM pufor Mes (pH 6,5).

Obrázok 2A

Porovnanie cytotoxickej aktivity Anti-Fas receptora mAb CH-11 (-·-), TNF (-o-), LT-a (-□-), LT-al//52 (--) a LT-a2//31 (-♦-) na humánne adenokarcinomatózne bunky HT29 tak za prítomnosti ako za neprítomnosti 80 U/ml IFN-γ.

Obrázok 2B

Porovnanie schopnosti 5 pg/ml humánneho IgG (-·-), rozpustného p60TNF-R-Fc (-o-) a rozpustných LT-p-R-Fcreceptor-imunoglobulínových chimér (-□-) inhibovať cytotoxické účinky na obr. 2A za prítomnosti 80 U/ml IFN-γ.

Obrázok 3

Anti-LT-/3-R monoklonálne protilátky potencujú cytotoxický účinok LT-al/p2 na humánne adenokarcinomatózne bunky HT29.

(A) Cytolytické účinky LT-al/p2 na bunky HT29 sú potcncované prítomnosťou anti-LT-P-R monoklonálnych protilátok CDH10.

Účinky LT-al/p2 boli zmerané bez monoklonálnej protilátky (-·-) a za prítomnosti 0,5 pg/ml kontrolného IgGl (--), 0,05 pg/ml CDH10 (-o-) a 0,5 pg/ml (-□-) CDH10.

(B) Cytolytické účinky LT-otl/p2 na bunky HT29 sú inhibované prítomnosťou anti-LT-P-R monoklonálnej protilátky BDA8.

Účinky LT-al/p2 boli zmerané za prítomnosti 2 pg/ml kontrolného IgGl (--) alebo anti-LT-P-R monoklonálnej protilátky BDA8 (-o-). Rozdiel medzi chovaním CDH10 a BDA8 anti-LT-P-R monoklonálnych protilátok v tomto teste je jedným z indikácií, že sú zacielené na rozdielne epitopy LT-P-R.

Obrázok 4

Imobilizované anti-LT-P-R protilátky sú cytotoxické na humánne adenokarcinomatózne bunky HT29.

(A) Anti-LT-/?-R monoklonálne protilátky majú priamy cytotoxický účinok na bunky HT29, keď sú imobilizované na povrchu.

Doštičky boli pokryté IgGl (-·-), monoklonálnou protilátkou zacielenou proti nepríbuznému mnohopočetnému antigénu bunkového povrchu HT29/26(-·-), BDA8 (-O-) a CDH10 (-□-).

(B) Účinky rozpustných anti-LT-P-R monoklonálnych protilátok samotných na rast buniek HT29.

Symboly ako v (A). Tieto anti-LT-0-R monoklonálne protilátky vo svojej rozpustnej forme nemajú významné cytotoxické účinky na bunky HT29, keď sú aplikované individuálne.

Obrázok 5

Reprezentatívna kvantifikácia zvýšenej cytoxicity na nádorové bunky pôsobením dvojíc rozpustných anti-LT-P-R monoklonálnych protilátok.

(A) Cytotoxické účinky kontrolného IgGl (100 ng/ml), anti-LT-p-R mAb BHA10 (100 ng/ml), anti-LT-β-R monoklonálnej protilátky CBE11 (50 ng/ml), BHA10 (100 ng/ml) + IgG (100 ng/ml) a BHA10 (100 ng/ml) + CBE11 (50 ng/ml) na bunky HT29. IFN-rbol prítomný s 80 U/ml.

(B) Cytotoxické účinky kontrolného IgGl (100 ng/ml), anti-LT-/3-R monoklonálnej protilátky CDH10 (100 ng/ml), anti-LT-/?-R monoklonálnej protilátky CBE11 (50 ng/ml), CDH10 (100 ng/ml) + IgGl (100 ng/ml) a CDH10 (100 ng/ml) + CBE11 (50 ng/ml) na bunky HT29. IFN-γbol prítomný s 80 U/ml.

(C) Cytotoxické účinky kontrolného IgGl (100 ng/ml), anti-LT-P-R monoklonálnej protilátky CDH10 (33 ng/ml), anti-LT-/3-R monoklonálnej protilátky AGH1 (50 ng/ml) a CDH10 (33 ng/ml) + AGH1 (50 ng/ml) na bunky HT29. IFN-t bol prítomný s 80 U/ml.

(D) Ako pri (C) s tým rozdielom, že v cytolytickom teste boli použité humánne adenokarcinomatózne WiDr bunky (Raitano a Korc, J. Biol. Chem., 265, str. 10466 až 10472 (1990)).

Obrázok 6

Veľkosť nádoru pri myšiach SCID liečených protilátkou anti-LT-/?-R (A) Veľkosť humánneho adenokarcinómu WiDr pri myšiach SCID 30 dní po inokulácii so súčasnou liečbou protilátkou

Myšiam bol aplikovaný 1. a 2. deň fyziologický roztok, samotný IFN-τ, anti-LT-P-R monoklonálna protilátka (CBE11) s a bez IFN-τ a kontrolná anti-humánna LFA-3 monoklonálna protilátka (1E6) s IFN-T. Priemer z každej skupiny je naznačený priečnou čiarou. Priemery, štandardné odchýlky a počet zvierat (v zátvor kách) pre päť skupín (zľava doprava) boli: 0,88 +/-0,59 (14), 1,21 +/- 0,7 (21), 0,041 +/- 0,052 (16), 0,11 +/-0,1 (12) a 0,98+/-1,16 (12).

(B) Veľkosť humánneho adenokarcinómu WiDr pri myšiach SCID od 14. do 49. dňa po inokulácii nádorových buniek s 15-týždennou postinokulačnou liečbou protilátkou.

Nádory sa nechali narásť do stredného priemeru 0,53 cm (0,076 cm³) bez akejkoľvek liečby a s i. p. injekciami sa začalo 15. deň a pokračovalo sa, ako je naznačené šípkami. Priemery a štandardné odchýlky sú naznačené pre skupinu 12 zvierat liečených buď samotným IFN-τ (1 x 10⁶ U/injekcia) (- -), IFN-τ s 50 pg 1E6 anti-LFA-3 monoklonálnej protilátky (- -), IFN-τ s 50 pg CBE11 anti-LT-P-R monoklonálnej protilátky (- -) alebo 50 pg CBE11 anti-LT-P-R monoklonálnej protilátky samotnej (neznázomené).

Aby bol tu opísaný vynález celkom zrozumiteľný, je ďalej uvedený nasledujúci detailný opis.

Výraz „protinádorová aktivita“ sa týka schopnosti substancie alebo prostriedku blokovať proliferáciu nádorových buniek alebo indukovať smrť nádorových buniek, pri ktorých dochádza k interakcii s uvedenou substanciou alebo prostriedkom.

Výraz „apoptóza“ sa týka procesu naprogramovanej smrti buniek.

Výraz „cytotoxická aktivita“ sa týka schopnosti substancie alebo prostriedku vyvolať smrť buniek, pri ktorých dochádza k interakcii s touto substanciou alebo prostriedkom.

Výraz „epitop“ (alebo antigénny determinant) znamená časť molekuly, ktorá sa spája s jediným miestom na molekule protilátky na viazanie antigénu. Jediný epitop sa rozpoznáva monoklonálnou protilátkou (mAb). Viac epitopov sa normálne rozpoznáva polyklonálnymi protilátkami (Ab).

„Fc doména“ protilátky sa týka časti molekuly obsahujúcej CH2, CH3 a pántové oblasti, ale nemajúcej väzbové miesta na antigén.

Výraz „činidlo indukujúce interferón“ sa týka ktoréhokoľvek činidla, ktoré je schopné priamo alebo nepriamo stimulovať endogénnu produkciu ľubovoľného interferónu typu I (IFN-a, IFN-β) alebo typu II (IFN-f). Príklady činidiel indukujúcich interferón zahŕňajú molekuly s dvojreťazcovou RNA a množstvo zlúčenín odvodených od rastlín alebo zlúčenín pripravených farmaceutický.

Výrazy „LT-α mutant“ a „LT-β mutant“ sa týkajú LT-α alebo LT-β polypeptidov, ktoré majú jednu alebo viac zmien aminokyselín v porovnaní so sekvenciou aminokyselín zodpovedajúceho natívneho polypeptidu.

Výraz „ΕΤ-β-R aktivujúci činidlo“ sa týka ľubovoľného činidla, ktoré môže zvýšiť väzbu ligandov na ΕΤ-β-R, kumuláciu ΕΤ-β-R na povrchu buniek alebo signalizáciu ΕΤ-β-R, alebo ktoré môže ovplyvniť, ako je signál ΕΤ-β-R interpretovaný vnútri bunky. Príklady ΕΤ-β-R aktivujúcich činidiel zahŕňajú IFN-a, IFN-β, TNF, interferón indukujúci činidlá, rozpustné anti-LT^-R protilátky, zosietené anti-LT-p-R protilátky a multivalentné anti-LT-P-R protilátky.

Výraz „ΕΤ-β-R signalizácia“ sa týka všetkých molekulárnych reakcií spojených s ΕΤ-β-R cestou a nasledujúcich molekulárnych reakcií, ktoré z nej vyplývajú.

Výraz „protilátka anti-LT-P-receptora“ („anti-LT-P-R Ab“) sa týka ľubovoľnej protilátky, ktorá rozpoznáva a viaže sa najmenej na jeden epitop LT-β receptora.

Výraz „monoklonálna protilátka anti-LT-β receptora“ („anti-LT-P-R“ mAb“) sa týka ľubovoľnej monoklonálnej protilátky, ktorá rozpoznáva a viaže sa na jediný epitop ΕΤ-β-R.

Výraz „zosietené anti-LT-β-R (m)Abs“ sa týka protilátok zacielených proti ΕΤ-β-R, ktoré buď boli zosietené vzájomne na aglomeráty protilátok v roztoku s použitím zosieťovacieho činidla anti-LT-β-Κ protilátky (Ab) alebo (mAb) alebo ktoré boli imobilizované vo vzájomnej tesnej blízkosti na povrchu alebo na matrici.

Výraz „zosieťovacie činidlo anti-LT-P-R protilátky (alebo monoklonálnej protilátky)“ sa týka ľubovoľného činidla, ktoré je schopné kovalentne alebo nekovalentne agregovať anti-LT-P-R protilátky v roztoku, takže sa protilátky môžu viazať na a potencovať kumuláciu LT-β receptorov na cieľovom bunkovom povrchu. Také zosieťovacie činidlá zahŕňajú, bez toho, aby sa na ne obmedzovali, chemické zosieťovacie činidlá, sekundárne protilátky, ktoré reagujú s časťami anti-LT-p-R protilátok alebo monoklonálnych protilátok, a rozpustné alebo na povrchu viazané Fc receptory — buď endogénne alebo pridané exogénne —, ktoré sú schopné viazať sa na anti-LT-P-R protilátky.

Výrazy „LT-α biologická aktivita“, „LT-α biologická aktivita“ a „LT-α/β biologická aktivita“ sú definované ako: (1) imunologická krížová reaktivita s protilátkou zacielenou proti najmenej jednému epitopu zodpovedajúcej natívnej podjednotky alebo komplexu podjednotiek alebo (2) schopnosť LT podjednotky alebo komplexu podjednotiek súťažiť o väzbové miesta pre ligandy na LT-špecifickom receptore, ako je TNF-R alebo ΕΤ-β-R, alebo (3) že sú schopné stimulovať imunitnú regulačnú odpoveď alebo cytotoxickú aktivitu kvalitatívne spoločnú s natívnou LT podjednotkou alebo komplexom.

Výraz „LT-α/β heteromémy komplex“ sa týka stabilného spojenia medzi najmenej jednou podjednotkou LT-α a viac ako jednou podjednotkou LT-β. Podjednotky sa môžu spájať elektrostatickými, van der Waalsovými alebo kovalentnými väzbami. Heteromémy komplex LT-α/β má výhodne najmenej dve susedné pod jednotky LT-β a neobsahuje žiadne susedné podjednotky LT-α. Najvýhodnejšie má komplex stechiometriu LT-al/p2.

Výraz „multivalentný ligand“ sa týka molekuly alebo komplexu, ktorý má viac ako jedno väzbové miesto na receptory a je schopný súčasne viazať a priviesť do tesnej blízkosti najmenej dve receptorové molekuly.

„Vedúce sekvencie typu I“ je amino-terminálna časť eukaryotického proteínu, ktorá slúži ako signál na nasmerovanie proteínu k endoplazmatickej retikulámej (ER) membráne a často celú sekrečnú cestu. Vedúca sekvencia sa obvykle odštepuje signálnou peptidázou v ER membráne.

„Signálna sekvencia“ je funkčný ekvivalent eukaryotického typu I a vedúcej sekvencie v prokaryotických hostiteľoch a riadi translokáciu proteinov do alebo cez lipidové dvojvrstvové membrány baktérie.

„Rozpustný LT-α/β heteromémy komplex“ je LT-α/β heteromémy komplex obsahujúci rozpustné podjednotky LT-β, v ktorých boli sekvencie aminokyselín, ktoré lokalizujú polypeptid k membráne, vypustené alebo inaktivované, čím sa LT-β jednotka stane rozpustnou. Rozpustné LT-α/β heteroméme komplexy môžu byť sekretované vhodnou hostiteľskou bunkou, ktorá bola zostrojená na expresiu obidvoch podjednotiek.

„Povrchový LT-α/β komplex“ je komplex obsahujúci podjednotky LT-α a LT-β, viazané na membránu, ktorá je upravená na povrchu buniek.

Produkcia LT-α/β komplexov, viazaných na membránu

Lymfotoxínové komplexy bunkového povrchu boli charakterizované v CD4+ T celulámych hybridómových bunkách (11-23. D7), ktoré exprimujú vysoké hladiny LT (Browning a spol., J. Immunol., 147, str. 1230 až 1237 (1991), Androlewicz a spol., J. Biol. Chem., 267, str. 2542 až 2547 (1992)). Zrelý LT-α neobsahuje transmembránovú doménu a je umiestnený k povrchu bunky interakciou najmenej s jednou k membráne viazanou LT-β podjednotkou. S membránou viazané (povrchovo) heteroméme komplexy majú prevažne LT-α1/β2 stechiometriu.

LT-β ako bunkový membránový proteín viaže LT-α v priebehu syntézy, teda „zameriava“ LT-α k bunkovej membráne. Za neprítomnosti LT-β je LT-α sekretovaný do extracelulámeho média. LT podjednotky sa normálne spájajú do komplexov vnútri bunky pred exportom proteínu do membrány. Len čo sú LT-β podjednotky vnesené do membrány, netvoria stabilné komplexy so sekretovaným LT-α. Ak je teda požadovaná forma LT-α/β heteromémeho komplexu viazaná na membránu, je výhodné spoločne exprimovať žiaduci LT-a a LT-β podjednotky vnútri tej istej bunky.

Povrchový LT-α/β heteromémy komplex môže byť rekonštruovaný kotransfekciou hostiteľských buniek s oboma LT-α a LT-β génmi. Povrchové LT komplexy nemôžu byť pozorované na stabilných bunkových líniách, ktoré exprimujú jeden alebo druhý LT gén samotný. Keď však hostiteľská bunka produkuje normálne veľké množstvá LT-α (napríklad bunky RPNI 1788, pozri neskôr), potom by transfekcia LT-G génom, ktorý kóduje požadovaný LT-β polypeptid, mala byť dostatočná na vytvorenie LT-α/β komplexov, obsahujúcich LT-α podjednotky plnej dĺžky.

Spoločná expresia LT-α a LT-β poplypetidov v množstve eukaryotických expresných systémov vedie k ich spojeniu a exportu ako aktívneho ligandu (Crowe a spol., J. Immunol. Methods, 168, 79 až 89 (1994)). K použiteľným hostiteľským systémom patria, bez toho, aby boli na ne obmedzované, CHO bunky, COS bunky, B bunky zahrnujúce myelómy, baculovírusom infikované hmyzie bunky a kvasinky.

LT-α podjednotka heteromémych komplexov LT-α/β podľa vynálezu môže byť selektovaná z lymfotoxínu-α, humánneho alebo zvieracieho lymfotoxínu-α, rekombinantného lymfotoxínu-α, rozpustného lymfotoxínu-a, sekretovaného lymfotoxínu-a, mutantov lymfotoxínu-a, ktoré majú LT-α biologickú aktivitu alebo fragmentov lymfotoxínu-α ktoréhokoľvek z uvedených s biologickou aktivitou LT-a.

LT-α polypeptid môže byť ktorákoľvek rozpustná forma molekuly vrátane ich aktívnych fragmentov, ktorá môže byť vytvorená v eukaryotických expresných systémoch, kde bude prírodný LT-α vedúca sekvencia odštiepená. Alternatívne môžu byť použité k maximalizácii sekrécie LT-α v iných hostiteľských systémoch fúzie zrelej LT-α sekvencie s heterologickou signálnou sekvenciou. Signály sú zvolené na báze predpokladanej hostiteľskej bunky a môžu zahŕňať bakteriálne, kvasinkové, cicavčie a vírusové sekvencie. Natívny signál alebo vaskuláma bunková molekulárna-1 (VCAM-1) signálna sekvencia sú vhodné na použitie v cicavčích expresných systémoch.

LT-α polypeptidy môžu byť tiež fuzované s polypeptidmi s predĺženým plazmatickým polčasom životnosti, ako sú imuno-globulínové reťazce alebo ich fragmenty. Plazmatické proteíny, ktoré môžu byť použité k zvýšeniu polčasu životnosti plazmy, zahŕňajú sérový albumín, imunoglobulíny, apolipoproteíny a transferín. Pripojenie polyetylénglykolu (PEG) môže stabilizovať polypeptid a znížiť jeho imunogenicitu. Výhodne nie je LT-α fúzny proteín významne imunogénny u jedinca, ktorý má byť liečený, a plazmatický proteín nespôsobuje u jedincov v dôsledku svojej normálnej biologickej aktivity nežiaduce vedľajšie účinky.

Humánny LT-α je glykozylovaný na N a 0 zvyškoch a v závislosti od zdroja sa vyznačuje značnou mikroheterogenitou založenou na cukre. Oligosacharidový prostriedok príslušného LT-α zvolený na vytvorenie

LT komplexu môže ovplyvniť in vivo rýchlosti clearancie (Fukushima a spol., Árch. Biochem. Biophys., 304, str. 144 až 153 (1993)). Pretože varianty glykozylácie môžu byť vytvorené expresiou v rôznych hostiteľských bunkách, je to jeden faktor, ktorý má byť uvážený pri selekcii zdroja LT-a.

LT-α môže byť purifikovaný od B lymfoblastoidnej línie RMPI 1788, ktorá konštitutívne sekrétuje LT-a a môže byť indukovaná k sekrécii vyšších hladín pôsobením forbolesteru PMA (Aggarwal a spol., J. Biol. Chem., 259, str. 686 až 691 (1984)). Alternatívne môže byť použitý klonovaný humánny LT-α gén, aby produkoval rekombinantne LT-α polypeptidy v rôznych hostiteľských systémoch vrátane baktérii (Schoenfeld a spol., J. Biol. Chem., 266, str. 3863 až 3869 (1991)), baculovirusom infikovaných hmyzích buniek (Crowe a spol., J. Immunol. Methods, 168, str. 70 až 89 (1994)) a cicavčích buniek (Browning a Ribolini, J. Immunol., 143, str. 1859 až 1867 (1989), Fukushima a spol., Árch. Biochem. Biophys., 304, str. 144 až 153 (1993)).

Časti LT-α génu, ktoré kódujú polypeptidové fragmenty s biologickou aktivitou LT-α, môžu byť vyhodnotené s použitím rutinných skríningových testov. K užitočným skríningovým testom na LT-α biologickú aktivitu patria kompetitívne inhibičné testy s natívnym LT-α viazaným na TNF-R alebo meranie priamej, alebo nepriamej inhibície schopnosti LT-α indukovať cytotoxicitu nádorových buniek v testoch osebe známych v odbore. LT-α fragmenty sa výhodne spoja do heteromémych komplexov s LT-β a komplexy sa testujú na LT-α/β biologickú aktivitu kompetitívnou inhibíciou s LT-α/β viazaným na ΤΤ-β-R alebo na ich schopnosť indukovať cytotoxicitu nádorových buniek v tu opísaných testoch.

Lymfotoxín-β, označovaný tiež ako p33, bol identifikovaný na povrchu T-lymfocytov, T-bunkových línií, B-bunkových línií a lymfokínmi aktivovaných smrtiacich bunkách. LT-β je predmetom súbežnej medzinárodnej prihlášky PCT/US91/04588 prihlasovateľov tejto patentovej prihlášky, zverejnenej 9. januára 1992 ako W092/00329 a medzinárodnej prihlášky PCT/US93/11669, zverejnenej 23. júna 1994 ako WO 94/13808.

LT-/3 gén kóduje polypeptid s 240 až 244 aminokyselinami (Browning a spol., Celí, 72, str. 847 až 856 (1993)). LT-β je membránový proteín typu II s krátkou N-terminálnou cytoplazmatickou doménou, po ktorej nasleduje doména zakotvujúca membránu s 30 hydrofóbnymi aminokyselinami. Má jediné glykozylačné miesto viazané na N a má len jeden cysteínový zvyšok, ktorý, ako sa zdá, sa nezúčastňuje tvorby disulfidovej väzby medzi podjednotkami.

LT-/3podjednotky obsahujúce LT-α/β heteroméme komplexy podľa vynálezu môžu byť zvolené z lymfotoxínu-β, natívneho humánneho alebo zvieracieho lymfotoxínu-β, rekombinantného lymfotoxínu-β, rozpustného lymfotoxínu-β, sekretovaného lymfotoxínu-β, zo zmutovaného lymfotoxínu-β s biologickou aktivitou LT-β alebo fragmentov lymfotoxínu-β ktoréhokoľvek z uvedených s biologickou aktivitou.

Ako je uvedené pre LT-α polypeptid, môžu byť tiež LT-β polypeptidy modifikované na zvýšenie ich rozpustnosti alebo polčasu životnosti plazmy s použitím rovnakých metód. Podobne môžu byť časti LT-β génu, ktoré kódujú polypeptidové fragmenty s biologickou aktivitou LT-0, vyhodnotené s použitím rutinných skríningových testov, ako je uvedené pre LT-a.

Produkcia rozpustných komplexov

Rozpustné (neviazané na membránu) LT-α/β heteroméme komplexy obsahujú LT-β podjednotky, ktoré boli zmenené z formy viazanej na membránu na rozpustnú formu. Tieto komplexy sú opísané detailne v súbežnej medzinárodnej prihláške prihlasovateľov (PCT/US93/11669, zverejnenej 9. januára 1992 ako WO 94/13808). Rozpustné LT-β peptidy sú definované sekvenciou aminokyselín lymfotoxínu-β, pričom sekvencia je rozštiepená v ľubovoľnom bode medzi koncom transmembránovej oblasti (t. j. asi pri aminokyseline č. 44) a prvej homologickej oblasti TNF (t. i. pri aminokyseline č. 88) podľa číslovacieho systému Browninga a spol., Celí, 72, str. 847 až 856 (1993).

Rozpustné LT-β polypeptidy môžu byť produkované oddelením N-konca LT-β na odstránenie cytoplazmatického konca a transmembránovej oblasti (Crowe a spol., Science, 264, str. 707 až 710 (1994)). Alternatívne môže byť transmembránová doména inaktivovaná vypustením alebo nahradením normálne hydrofóbnych zvyškov aminokyselín, ktoré obsahujú transmembránovú doménu, hydrofilnými zvyškami aminokyselín. V každom prípade sa vytvorí značne hydrofilný hydropatický profil, ktorý znižuje afinitu lipidov a zlepšuje rozpustnosť vo vode. Prednosť sa dáva odstráneniu transmembránovej domény pred náhradou hydrofilnými zvyškami aminokyselín, pretože sa tým zamedzuje zavedeniu potenciálne imunogénnych epitopov.

Odstránená alebo inaktivovaná transmembránová doména môže byť nahradená alebo pripojená k vedúcej sekvencií typu I (t. j. k vedúcej sekvencií VCAM-1) tak, že proteín je sekretovaný začínajúc kdekoľvek od medze vall40 do pro88. Rozpustné LT-β polypeptidy môžu obsahovať ľubovoľný počet dobre známych vedúcich sekvencií na N-konci. Taká sekvencia by dovolila, aby boli peptidy exprimované a zacielené k sekrečnej ceste v eukaryotickom systéme. Pozri napr. Emst a spol., US patent č. 5 082 783 (1992).

Rozpustné LT-α/β heteroméme komplexy môžu byť produkované kontransfekciou vhodnej hostiteľskej bunky s DNA kódujúcou LT-α a rozpustný LT-β (Crowe a spol., J. Immunol. Methods, 168, str. 79 až 89 (1994)). Rozpustný LT-β sekretovaný za neprítomnosti LT-α je vysoko oligomerizovaný. Ale keď je exprimovaný spoločne s LT-α, vytvorí sa 70 kD akoby triméma štruktúra, ktorá obsahuje oba proteíny. Je tiež možné produkovať rozpustné LT α1/β2 heteroméme komplexy transfekciou bunkovej línie, ktorá normálne exprimuje len LT-α (tak ako zmienené bunky RPMI 1788) genetickým kódovaním rozpustného LT-β polypeptidu.

LT-α a LT-/3 polypeptidy môžu byť syntetizované oddelene, denaturované použitím miernych detergentov, vzájomne zmiešané a renaturované odstránením detergentu, čím sa vytvoria zmiešané LT heteroméme komplexy, ktoré môžu byť rozdelené (pozri nižšie).

Purifikácia LT-αΙ/βΖ komplexov

Rozpustné LT-αΙ/βζ heteroméme komplexy sa oddelia od ko-expresných komplexov, obsahujúcich rôznu podjcdnotkovú stechiometriu, chromatografiou s použitím TNF a LT-β receptorov ako afinitných purifikačných činidiel. TNF receptory sa viažu len v α/α rozštepoch LT komplexov. LT-β receptor sa viaže s vysokou afinitou na β/β rozštepy a s nižšou afinitou na α/β rozštepy heteromémych LT-α/β komplexov. LT-a3 a ίΤ-α2/β1 sa teda budú viazať na TNF-R. ΤΤ-β-R môže tiež viazať triméry LT-a2/pl (v rozštepoch α/β), ale nemôže viazať LT-a3. Okrem toho LT-p-R (ale nie TNF-R) viaže ίΤ-α1/β2 a LT-β (n) (presné zloženie takéhoto prípravku nie je známe, sú to však veľké agregáty).

Reagencie s afinitou k receptoru môžu byť pripravené buď ako rozpustná extraceluláma doména (pozri napríklad Loetscher a spol., J. Biol. Chem., 266, str. 18324 až 18329, (1991)) alebo ako chimérické proteíny s extracelulámou doménou na väzbu ligandov pripojenou k doméne imunoglobulínu Fc (Lotscher a spol., J. Biol. Chem., 266, str. 18324 až 18329 (1991), Crowe a spol., Science, 264, str. 707 až 710 (1994)). Receptory sa pripájajú k afinitným matriciam chemickým zosieťovaním s použitím rutinných postupov.

Existujú dve schémy, ktorými LT-αΙ/βζ ligand môže byť purifikovaný s použitím receptorov a imunoafinitnej chromátografie. V prvej schéme sa vedie supematant z vhodného expresného systému, ktorý exprimuje spoločne tak LT-α formu, ako zrezanú LT-8 formu, cez TNF-R kolónu. TNF-R bude viazať LT-a3 a ίΤ-α2/β1 triméry. Prietok TNF-R kolónou bude obsahovať LT-β (n) a ίΤ-α1/β2.

V druhej schéme všetky formy obsahujúce LT-β (LT-G(n), LT-αΙ/βζ a LT-až/βΙ) sú viazané na a eluované z LT-p-R kolóny s použitím klasických metód, ako chaotropu alebo zmeny pH. (LT-a3 preteká touto kolónou.) Eluát je neutralizovaný alebo chaotrop odstránený a eluát sa potom vedie cez TNF-R kolónu, ktorá viaže len [.Τ-α.2/β1 triméry. Prietok touto kolónou bude obsahovať LT-β (n) a ίΤ-α1/β2 triméry.

V oboch prípadoch môžu byť čisté triméry oddelené od LT-β nasledujúcou gélovou filtráciou a/alebo osebe známymi postupmi ionomeničovej chromatografie.

Alternatívne môžu byť rôzne formy LT-α/β heteromémych komplexov oddelené a purifikované množstvom obvyklých chromátografických prostriedkov. Môže byť tiež výhodné kombinovať sériu obvyklých purifikačných schém s niektorou z opísaných imunoafinitných purifikačných operácií.

Zdroj anti-LT-p-R protilátok

Polyklonálne protilátkové séra zacielené proti ľudskému LT-β receptoru sa pripravujú použitím konvenčných metód tým, že sa zvieratám, ako kozám, králikom alebo myšiam, aplikuje subkutánnou injekciou humánny fuzny proteín medzi LT-β receptorom a Fc (príklad 2) v kompletnom Freundovom adjuvante, nasledovanou druhou intraperitoneálnou alebo subkutánnou injekciou v kompletnom Freunde. Polyklonálne antiséra obsahujúce požadované protilátky, ktoré sú zacielené na LT-β receptor, sa podrobia skríningu konvenčnými postupmi.

Myšie monoklonálne protilátky (mAbs) zacielené na humánny fúzny proteín medzi LT-β receptorom a Fc sa pripravujú intraperitoneálnou imunizáciou myší RBF opakovane pomocou od CHO bunky odvodeného rekombinantného fúzneho proteínu medzi LT-β receptorom a Fc (υΓ-β-R-Fc) viazaného na proteín A sefarózu za neprítomnosti adjuvantu. Nakoniec sa zvieratám aplikuje druhá injekcia rozpustného LT-P-R-Fc (tak i. p., ako i. v.), bunky sleziny sa fuzujú s použitím klasických protokolov a hybridómy sa podrobia sereeningu s použitím testu ELISA (Ling a spol., J. Interferon and Cytokine Res., 15, str. 53 až 59 (1995)). Hybridómy sa ďalej podrobia skríningu k zisteniu ich schopnosti blokovať viazanie aktivovaných hybridómových buniek 11-23 -, ktoré exprimujú povrchový ΗΓ-αΙ/βΣ - na doštičkách potiahnutých LT-P-R-Fc. Čisté monoklonálne protilátky sa pripravujú purifikáciou IgG zo supematantov kultúry hybridómu proteínom A sefarózou.

Je tiež možné pripraviť rôzne formy anti-LT-P-R protilátok použitím štandardných metód rekombinantnej DNA (Winter a Milstein, Náture, 349, str. 293 až 299 (1991)). Môžu byť napríklad zostrojené „chimérické“ protilátky, v ktorých je doména viažuca antigén zo zvieracej protilátky napojená na humánnu konštantnú doménu (napr. Cabilly a spol., US 4 816 567, Morrison s spol., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 81, str. 6851 až 6855 (1984)). Chimérické protilátky redukujú pozorované imunogénne odpovede vyvolané zvieracími protilátkami, keď sú použité pri klinickej liečbe ľudí.

Okrem toho môžu byť syntetizované rekombinantné „humanizované protilátky“, ktoré rozpoznávajú ΕΤ-β-R. Humánne protilátky sú chiméry obsahujúce väčšinou humánne IgG sekvencie, do ktorých boli vložené oblasti zodpovedajúce za špecifické viazanie antigénu (napr. WO 94/04679). Zvieratá sa imunizujú po žadovaným antigénom, príslušné protilátky sa izolujú a časť sekvencií variabilnej oblasti zodpovedajúcej za špecifické viazanie antigénu sa odstráni. Oblasti viažuce antigén odvodené od zvierat sa potom klonujú do zodpovedajúcej pozície génov humánnej protilátky, v ktorej boli odstránené oblasti na väzbu antigénu. Humanizované protilátky minimalizujú použitie heterologických (medzidruhových) sekvencií v humánnych protilátkach a menej pravdepodobne vyvolajú imunitné odpovede v liečenom jedincovi.

Konštrukcia rôznych tried rekombinantných anti-LT-p-R protilátok môže byť tiež uskutočnená vytvorením chimerických alebo humanizovaných protilátok obsahujúcich anti-LT-P-R variabilnej domény a humánnej konštantnej domény (CH1, CH2, CH3) izolované z rôznych tried imunoglobulínov. Napríklad anti-LT-β-R IgM protilátky so zvýšenými valenciami miesta na väzbu antigénu môžu byť rekombinantné produkované klonovaním miesta na väzbu antigénu do vektorov nesúcich konštantné oblasti humánneho μ reťazca (Arulanandam a spol., J. Exp. Med., 177, str. 1439 až 1450 (1993), Lane a spol., Eur. J. Immunol., 22, str. 2573 až 2578 (1993), Traunecker a spol., Náture, 339, str. 68 až 70 (1989)).

Okrem toho môžu byť štandardné techniky rekombinantnej DNA použité na zmenu väzbových afinít rekombinantných protilátok k ich antigénom zmenou zvyškov aminokyselín v blízkosti väzbových miest pre antigén. Väzbová afinita humanizovanej protilátky k antigénu môže byť zvýšená mutagenézou založenou na molekulárnom modelovaní (Queen a spol., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 86, str. 10029 až 10033 (1989), WO 94/04679).

Môže byť žiaduce zvýšiť alebo znížiť afinitu anti-LT-P-R protilátok k LT-P-R v závislosti od cieľového typu tkaniva alebo príslušného uvažovaného plánu liečby. Napríklad môže byť výhodné pre semiprofylaktické liečby liečiť pacienta konštantnými hladinami anti-LT-P-R protilátok so zníženou schopnosťou signalizovať LT-P cestou. Podobne môžu byť anti-LT-P-R protilátky so zvýšenou afinitou k LT-P-R výhodné pre krátkodobé liečby cielené proti nádoru.

Skríning anti-LT-/3-R protilátok na LT-P-R aktivujúce činidlá

Anti-LT-0-R protilátky podľa vynálezu môžu potencovať protinádorovú aktivitu LT-α/β heteromémych komplexov (výhodne LT-al/p2) za prítomnosti LT-P-R aktivujúceho činidla, ako je IFN-τ. Tieto anti-LT-β-R protilátky sú tu tiež uvádzané ako LT-P-R aktivujúce činidlá. Protilátky, ktoré pôsobia ako aktivujúce činidlá, sú selektované nasledovne:

(1) Série jamôk pre tkanivové kultúry obsahujúce nádorové bunky ako bunky HT29 sa kultivujú tri až štyri dni v médiu obsahujúcom LT-P-R aktivujúce činidlo, ako je IFN-7 a purifikovaný LT-α/ρ heteromémy komplex - výhodne LT-al/p2 - za prítomnosti alebo neprítomnosti postupných riedení testovanej anti-LT-P-R protilátky.

(2) K zmesi buniek sa pridá vitálne farbivo, ktoré meria mitochondriálnu funkciu ako MTT, a nechá sa reagovať niekoľko hodín.

(3) Kvantifikuje sa optická hustota (OD) zmesi v každej jamke pri vlnovej dĺžke svetla 550 nm (OD 550). OD 550 je nepriamo úmerné počtu nádorových buniek usmrtených za prítomnosti LT-α/β heteromémeho komplexu, LT-P-R aktivujúceho činidla a testovanej anti-LT-P-R protilátky v každej jamke.

Výhodné protilátky podľa vynálezu, ktoré pôsobia individuálne ako LT-P-R aktivujúce činidlá za prítomnosti LT-al/p2 a IFN-γ, zahŕňajú BKA11, CDH10, BHA10 a BCG6 anti-LT-P-R monoklonálne protilátky (tabuľka 2).

Zosieťovanie anti-LT-P-R protilátok

Zosietené anti-LT-P-R protilátky podľa vynálezu pôsobia individuálne ako LT-P-R aktivujúce činidla bez exogénnych LT-α/β heteromémych komplexov za prítomnosti druhého LT-P-R aktivujúceho činidla, ako je IFN-7. Zosietené anti-LT-P-R protilátky sa zrejme viažu na a indukujú kumuláciu LT-β receptorov bunkového povrchu, čím aktivujú LT-β receptorom sprostredkovanú cielenú smrť buniek.

Podľa jedného uskutočnenia je jeden alebo viac typov anti-P-R protilátok zosietených imobilizáciou na vo vode nerozpustnej matrici alebo povrchu. Derivatizácia s bifunkčným činidlom je užitočná na zosietenie protilátok na vo vode nerozpustnú nosnú matricu alebo povrch. Činidlá bežne používané k uskutočneniu zosietenia protilátok na vodou nerozpustnú nosnú matricu alebo povrch zahŕňajú l,l-bis-(diazoacetyl)-2-fenyletán, glutaraldehyd, estery N-hydroxysukcín-amidu vrátane esterov so 4-azidosalicylovou kyselinou, homobifunkčnými imido-estermi vrátane disukcínimidylesterov a bifunkčnými maleínimidmi ako napríklad bis-N-maleínimido-l,8-oktán. Derivatizačné činidlá ako metyl-3-((p-azidofenyl)ditio)propioimidát tvoria fotoaktivovateľné medziprodukty, ktoré môžu byť selektívne zosietené, keď sú stimulované svetlom. Reaktívne, vo vode nerozpustné matrice ako kyanogénbromidom aktivované sacharidy a substráty opísané v US patentoch č. 3 959 080, 3 969 287, 3 691 016, 4 195 128, 4 247 642, 4 229 537, 4 055 635 a 4 330 440, môžu byť tiež použité na imobilizáciu a zosietenie proteínov.

Povrchy, ku ktorým sú protilátky pripojené, môžu byť neproteínový polymér, obvykle hydrofilný polymér buď prírodného, alebo syntetického pôvodu. Môžu byť použité hydrofilné polyvinylové polyméry ako polyvinylalkohol (PVA) a polyvinylpyrolidón (PVP). Užitočné sú tiež polyetylénétery, ako polyetylénglykol, polypropylénglykol, polyoxyetylénestery alebo metoxypolyetylénglykol, polyoxyalkylény, ako polyoxyetylén a polyoxypropylén, a blokové kopolyméry polyoxyetylénu a polyoxypropylénu (Pluronics), polymetakryláty, karboméry, rozvetvené alebo nerozvetvené polysacharidy, ktoré zahŕňajú sacharidové monoméry D-manózu, D- a L-galaktózu, fukózu, fruktózu, D-xylózu, L-arabinózu, D-glukurónovú kyselinu, sialovú kyselinu, D-galaktourónovú kyselinu, D-manourónovú kyselinu (napr. polymanourónovú kyselinu alebo alginovú kyselinu), D-glukozamín, D-galaktózamín, D-glukózu a neuramínovú kyselinu vrátane homopolysacharidov a heteropolysacharidov ako laktózy, amylopektínu, škrobu, hydroxyetylškrobu, amylázy, dextránsulfátu, dextránu, dextrínov, glykogénu alebo polysacharidové podjednotky kyslých mukopolysacharidov, napr. hyalurónovej kyseliny, polymérov alkoholov cukrov, ako je polysorbitol a polymanitol, a heparín alebo heparón.

Pred zosietením je polymér výhodne rozpustný vo vode a výhodne obsahuje lenjedinú reaktívnu chemickú skupinu, aby sa zabránilo viacnásobnému zosieteniu s protilátkou. V každom prípade by mali byť reakčné podmienky optimalizované, aby sa obmedzilo zosietenie a aby sa izolovali produkty - - buď priamo, alebo nasledujúcou gélovou filtráciou alebo chromatografickou operáciou - - s v podstate homogénnym rozsahom molekulovej hmotnosti. Optimálna molekulová hmotnosť zosietenej protilátkovej matrice bude stanovená rutinným experimentovaním s použitím tu opísaných testov na cytotoxicitu a na viazanie receptora.

Výsledný konjugát po zosietení je výhodne rozpustný vo fyziologických kvapalinách, ako je krv. Polymér by nemal byť vysoko imunogénny vo forme konjugátu a mal by mať viskozitu kompatibilnú s intravenóznou infúziou alebo injekciou, pokiaľ niektorá z nich je uvažovanou cestou na aplikáciu.

Polymér môže byť tiež vo vode nerozpustný. K materiálom, ktoré môžu byť použité, patria hydrofilné gély alebo tvarované predmety s povrchmi, ku ktorým môžu byť protilátky imobilizované, ako chirurgické hadice, katétre alebo drény. Výhodne sa používajú pevné nosné materiály, ktoré sú biologicky kompatibilné a v podstate inertné vo fyziologickom okolí.

Materiál je biologicky kompatibilný, ak nestimuluje podstatne imunitné odpovede vrátane zápalu alebo nepriťahuje fibrotické bunky, keď je umiestnený vnútri tela pacienta.

Anti-LT-0-R protilátky môžu byť tiež imobilizované na povrchy, ktoré boli kovalentne alebo nekovalentne potiahnuté sekundárnymi protilátkami, ktoré sa budú viazať na primárne anti-LT-P-R protilátky (napr. kozie protimyšie IgG protilátky, pozri príklad 7). Každá individuálne testovaná anti-LT-P-R monoklonálna protilátka, keď bola imobilizovaná na povrch so sekundárnymi protilátkami, pôsobí ako LT-P-R aktivujúce činidlo za prítomnosti IFN-r (obrázky 4 a 7).

V alternatívnom uskutočnení môžu zosietené protilátky anti-LT-P-R v roztoku pôsobiť ako LT-p-R aktivujúce činidlá. Anti-LT-P-R protilátky môžu byť zosietené pomocou anti-LT-P-R Ab (alebo mAb) zosieťujúceho činidla. Anti-LT-P-R Ab (alebo mAb) zosieťujúce činidlo podľa vynálezu je akékoľvek činidlo schopné buď kovalentnej väzby, alebo nekovalentnej agregácie anti-LT-P-R protilátok (alebo monoklonálnych protilátok) v roztoku, takže zosietené anti-LT-P-R protilátky (alebo monoklonálne protilátky) sa môžu viazať na a potencovať povrchovú kumuláciu cieľových buniek LT-P-R. Také činidlá zosieťujúce anti-LT-P-R Ab (alebo mAb) zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na chemické zosieťovacie činidlá, ktoré môžu reagovať s protilátkami kontrolovaným spôsobom, ako je opísané. Alternatívne môžu byť použité na vytvorenie aglomerátov anti-LT-P-R protilátok v roztoku sekundárnej protilátky, Sefarosa A, Fc receptory alebo iné činidlá, ktoré sa viažu na a spájajú do zhlukov množstvo primárnych anti-LT-P-R protilátok, bez toho, aby blokovali ich aktivitu.

Početné anti-LT-P-R protilátky pôsobia v roztoku ako LT-p-R aktivujúce činidlá

Predmetom vynálezu sú prostriedky obsahujúce mnohé anti-LT-P-R protilátky v roztoku, ktoré pôsobia ako LT-P-R aktivujúce činidlá tým, že potenciujú povrchovú kumuláciu LT-P-R. Môžu byť použité polyklonálne anti-LT-P-R protilátky zacielené proti rôznym epitopom LT-P-R. Výhodne sú anti-LT-P-R protilátky monoklonálne protilátky zacielené na rôzne a neprekrývajúce sa epitopy LT-P-R.

Kombinovaný prístup anti-LT-P-R monoklonálnej protilátky k aktivácii LT-P receptora vyžaduje spojenie dvoch neprekrývajúcich sa epitopov. Okrem toho je pravdepodobné, že produktívna agregácia receptorov sa dosiahne len s určitými epitopmi. Bola identifikovaná prítomnosť najmenej štyroch špecifických LT-P-R imunoreaktivnych epitopov. Ďalšie epitopy (ako je definované novými monoklonálnymi protilátkami) môžu byť identifikované pokračovaním vo fúzii imunozovaných buniek myšej sleziny, imunizáciou rôznych druhov zvierat a použitím rôznych ciest imunizácie.

Epitopy môžu byť tiež priamo zmapované ohodnotením schopnosti rôznych monoklonálnych protilátok konkurovať si vzájomne vo väzbe na LT-P-R s použitím chromatografických techník BIA-core (Pharmacia BfAtechnology Handbook, „Epitope Mapping“, oddiel 6. 3. 2, (máj 1994), pozri tiež Johne a spol., J. Immunol. Methods, 160, str. 191 až 198 (1993)).

Jednotlivé LT-P-R monoklonálne protilátky môžu byť zoskupené najmenej do štyroch tried podľa ich schopnosti spolupracovať v kombinácii s inými LT-P-R monoklonálnymi protilátkami pri usmrcovaní nádorových buniek v cytolytických testoch (príklad 8, tabuľka 1). Napríklad BDA8 monoklonálna protilátka v skupine I nepôsobí v kombinácii s AGH1 monoklonálnou protilátkou v skupine I k podpore cytotoxicity nádorových buniek. Podobne monoklonálne protilátky BKA11 a CDH10 zo skupiny III nespolupracujú v teste na cytotoxicitu nádorových buniek.

Obrázok 5A-C znázorňuje účinky aplikácií typických anti-LT-0-R monoklonálnych protilátok samotných a v párovej kombinácii na nádorové bunky v testoch na cytotoxicitu za prítomnosti IFN-z ako LT-P-R aktivujúceho činidla. Anti-LT-P-R monoklonálna protilátka CBE11 zo skupiny IV použitá samotná má malý cytotoxický účinok, ktorý je zvýšený v kombinácii s monoklonálnou protilátkou BHA10 zo skupiny II (obrázok 5 A). CBE11 vyvoláva podobný účinok s monoklonálnou protilátkou CDH10 zo skupiny III (obrázok 5B).

Cytotoxicita spôsobená aplikáciou kombinácie monoklonálnych protilátok anti-LT-P-R v roztoku nie je proti nádorovej bunkovej línii HT29 mimoriadna. Obrázok 5C ukazuje, že monoklonálna protilátka AGH1 zo skupiny I a monoklonálna protilátka ODH10 zo skupiny III pôsobia synergicky pri usmrcovaní dvoch rôznych nádorových bunkových línií (buniek HT29 a buniek WiDr) odvodených od humánnych adenokarcinómov.

Súhrn vlastností monoklonálnych protilátok anti-LT-P-R

Všetky monoklonálne protilátky anti-LT-p-R podľa vynálezu, keď sú zosietené imobilizáciou, pôsobia ako LT-P-R aktivujúce činidlá za prítomnosti druhého LT-P-R aktivujúceho činidla, ako je IFN-7. Schopnosť anti-LT-P-R monoklonálnych protilátok pôsobiť ako LT-P-R aktivujúce činidlá za prítomnosti alebo neprítomnosti LT-otl/p2 v roztoku sa často mení podľa stavu buniek v čase testu. Tabuľka 2 (porzi nižšie) zhŕňa vlastnosti anti-LT-P-R monoklonálnych protilátok podľa vynálezu.

Monoklonálne protilátky BDA8 a AGH1 zo skupiny I nepôsobia ako LT-p-R aktivujúce činidlá v roztoku s LT-al/p2. Monoklonálna protilátka BDA8 dokonca blokuje protinádorový účinok LT-al/p2 (obrázok 3B a tabuľka 2). Oproti tomu anti-LT-P-R monoklonálne protilátky BCG6 a BHA10 majú zmiešané agonistické a antagonistické účinky, keď sú aplikované s LT-ctl/p2. Anti-LT-P-R monoklonálne protilátky BKA11 a CDH10 zo skupiny III sú jedinečné vo svojej schopnosti pôsobiť ako LT-P-R aktivujúce činidlá, ktoré potenciujú protinádorové účinky za prítomnosti LT-al/p2 a druhého LT-P-R aktivujúceho činidlá, ako je IFN-t, bez toho, aby mali antagonistické účinky, ako je možno často pozorovať pri monoklonálnych protilátkach BCGóaBHAlO zo skupiny II.

Je dôležité mať na pamäti, že klasifikácia anti-LT-P-R monoklonálnych protilátok založená na ich schopnosti kooperovať v cytolytických testoch na nádorových bunkách odráža skutočnosť, že spolupôsobia s určitými epitopmi LT-P-R. Monoklonálne protilátky obsahujúce jedinú skupinu však nemajú nutne rovnaké väzbové afinity k svojim príslušným epitopom. Variabilné výsledky, pozorované pri porovnávaní účinkov rôznych monoklonálnych protilátok prislúchajúcich k rovnakej skupine ako k rôznym skupinám, môžu teda predstavovať rozdiely vo väzbových afinitách. Je teda možné, že by mohla byť izolovaná monoklonálna protilátka zo skupiny I alebo zo skupiny IV s vyššou väzbovou afinitou pre LT-P-R, ktorá by fungovala podobne ako monoklonálne protilátky zo skupiny III ako LT-p-R aktivujúce činidlo za prítomnosti LT-al/p2.

Hybridómové bunkové línie alebo ich subklony, ktoré produkujú opísané anti-LT-p-R monoklonálne protilátky, boli uložené 12. januára 1995 v Američan Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) v zmysle ustanovenia Budapeštskej zmluvy a boli im pridelené nasledujúce čísla prírastku ATCC:

	bunkové línie	názov mAb	číslo prírastku ATCC
a)	AG.Hl.5.1	AGH1	HB	11796
b)	BD.A8.AB.9	BDA8	HB	11798
c)	BC.G6.AF5	BCG6	HB	11794
d)	BH.A10	BHA10	HB	11795
e)	BK.A11.AC1Q	BKA11	HB	11799
f)	CB.E11.1	CBE11	HB	11793
g)	CD.H10.1	CDH10	HB	11797

Všetky obmedzenia týkajúce sa dostupnosti uvedených depozít ATCC budú neodvolateľné odstránené po udelení patentu na túto prihlášku.

Funkcia anti-LT-/3-R IgM monoklonálnych protilátok ako LT-P-R aktivujúcich činidiel

Anti-LT-/3-R monoklonálne protilátky, ktoré obsahujú viac ako dve väzbové miesta pre antigén s IgG, budú tiež pôsobiť v roztoku ako LT-P-R zosieťujúce činidlá na bunkovom povrchu a budú preto spadať pod definíciu LT-P-R aktivujúceho činidla podľa vynálezu. Väzbové miesta monoklonálnej protilátky anti-LT*P-R pre antigén môžu byť vybudované do IgM molekúl -, ktoré majú desať väzbových miest pre antigén - s použitím štandardných techník rekombinantnej DNA a hybridômu (príklad 12).

Alternatívne je možné zobrať a obohatiť kompletný IgM molekuly myši (alebo iného zvieraťa) izolovanej metódou fúzie hybridômu po jedinej imunizácii antigénom. Jednou cestou obohatenia IgM molekúl by bola imunizácia myší CD40 s chýbajúcou signalizáciou (Kawabe a spol., Immunity, 1, str. 167 až 178 (1994), Xu a spol., Immunity, 1, str. 423 až 431 (1994)). Tieto myši nemôžu efektívne produkovať imunoglobulíny IgG a preto ich reakcia na stimuláciu antigénom je zvýšená pre IgM izotypy.

Anti-LT-/3-R IgM protilátky môžu v dôsledku svojej zvýšenej valencie účinne agregovať LT-P-R molekuly v rovine membrány, čím zvyšujú LT-P-R signalizáciu v porovnaní s ich IgG náprotivkami, ktoré majú dve väzbové miesta pre antigén. Dramatický príklad zvýšenej účinnosti multivalentných protilátok pri kumulácii receptorov je zrejmý pri protilátkach proti Fas receptoru, kde je IgM forma veľmi účinná a normálne bivalentné imunoglobulíny IgG nie sú účinné v roztoku (Yonihara a Yoniha-ra, J. Exp. Med., 169, str. 1747 až 1756 (1989), Alderson a spol., Int. Immunol., 6, str. 1799 až 1806 (1994)).

Podobne apo-1 monoklonálna protilátka proti Fas receptoru je typu IgG3. Táto monoklonálna protilátka je silné cytotoxické činidlo, ktoré závisí od Fc interakcií výhradne k IgG3 subtypom s cieľom agregácie na väčšie polyvalentné formy. Odstránenie Fc oblasti vytvára F(ab)2 formu, ktorá sa nemôže spojiť do väčších agregátov a ktorá je inaktívna (Dhein a spol., J. Immunol., 149, str. 3166 až 3173 (1992)). Analogicky sa teda predpokladá, že IgM verzie anti-LT-P-R monoklonálnych protilátok budú účinné protinádorové prostriedky.

Anti-LT-/3-R monoklonálne protilátky inhibujú rast nádorov pri myšiach

Schopnosť LT-P-R aktivujúceho činidla, ako je anti-LT-P-R monoklonálna protilátka, inhibovať rast humánnych nádorových buniek in vitro (príklady 6 až 8 a 13) môže svedčiť o protinádorovej účinnosti in vivo. Pokusy uskutočnené na imunodeficitných myšiach (SCID) ukazujú, že anti-P-R monoklonálna protilátka (CBE11) môže účinne blokovať tvorbu nádora humánnymi adenokarcinomatóznymi bunkami WiDr (príklad 14, obrázok 6). Pri myšiach inokulovaných subkutánne (s. c.) WiDr bunkami sa vytvoria v priebehu dvoch týždňov merateľné nádory. Keď sa myšiam aplikovala i. p. CBE11 monoklonálna protilátka v rovnakom čase, kedy boli inokulované bunky WiDr s. c., nádorový rast bol dramaticky blokovaný (obrázok 6A). Protinádorový účinok CBE11 anti-LT-P-R monoklonálnej protilátky sa zvýšil pridaním IFN-τ. CBE11 bol však účinný i bez exogénneho IFN-r. V skupine CBE11 + IFN-r bolo 7 zo 16 zvierat celkom bez nádorov, zatiaľ čo zvyšné zvieratá mali malé uzlíky, ktoré sa v priebehu dvoch mesiacov nezväčšili. Myši, ktorým bol aplikovaný samotný CBE11, boli 30. deň podobne ako skupina, ktorej bolo aplikované CBE11 + IFN-r. Pri myšiach, ktorým bol aplikovaný samotný CBE11, sa však nakoniec vyvinuli pomaly rastúce nádory. Medzi skupinami CBE11 (+/- IFN-r) a kontrolnými skupinami (fyziologický roztok, IFN-τ samotný a kontrolná antihumánna LFA-3 monoklonálna protilátka (1E6) + IFN-r) boli štatisticky významné rozdiely, ale medzi kontrolnými skupinami žiadne významné rozdiely neboli. Tak 1E6, ako CBE11 monoklonálne protilátky sú protilátky typu IgGl. 1E6 monoklonálna protilátka účinne pokrýva nádorové bunky, ale neblokuje rast nádorov. Komplementárne alebo NK (natural killer) bunkami ovplyvnené udalosti teda nie sú jediným podkladom na protinádorovú aktivitu CBE11 anti-LT-P-R monoklonálnej protilátky.

Účinnosť CBE11 monoklonálnej protilátky v inhibícii rastu nádorov in vivo za neprítomnosti exogénneho IFN-r je neočakávaná, pretože existovala závislosť od IFN-r pre merateľné cytotoxické účinky na báze LT-P-R in vivo. Buď dochádza k určitému crossing-over myšieho IFN-Τ na ľudské IFN-r receptory alebo môžu prebiehať in vivo iné mechanizmy.

CBE11 anti-LT-jS-R monoklonálna protilátka môže tiež inhibovať rast rozvinutého nádoru pri myšiach (obrázok 6B). Myši boli inokulované s. c. prvý deň humánnymi WiDr bunkami adenokarcinómu a nádory sa ponechali vyvíjať 15 dní (príklad 14). Nádory pri zvieratách, ktorým bol aplikovaný IFN-r samotný alebo s kontrolnou antihumánnou LFA-3 monoklonálnou protilátkou (1E6) + IFN-r, pokračovali vo zväčšovaní veľkosti v priebehu 7-týždňového pokusu. Naproti tomu sa rast nádorov, na ktoré sa pôsobilo CBEÍ1 anti-LT-P-R protilátkou (+ IFN-r alebo samotnou) zastavil a po nasledujúcich troch injekciách CBE11 protilátky v priebehu troch týždňov sa rast nádorov zastavil do 49 dní po inokulácii, kedy bol pokus ukončený (obrázok 6B).

Tieto pokusy preukazujú, že anti-LT-p-R monoklonálna protilátka, ktorá aktivuje LT-P-R signalizáciu, je schopná účinne inhibovať tvorbu nádoru v raných štádiách a môže tiež blokovať pokračujúci rast nádorových buniek v neskorších štádiách tumorogenézie in vivo. Tieto pokusy tiež preukazujú, že aplikácia jediného LT-P-R aktivujúceho činidla môže byť účinná na liečbu alebo obmedzenie pokračovania, závažnosti alebo účinkov neoplázie pri postihnutom živočíchovi.

Postupy opísané v príklade 14 môžu byť použité na identifikáciu LT-P-R aktivujúcich činidiel podľa vynálezu, ktoré pôsobia inhibične samostatne alebo v kombinácii na rast nádorových buniek in vivo. Je predpokladané, že iné LT-P-R aktivujúce činidlá — zahŕňajúce, ale neobmedzujúce sa na tie, ktoré boli identifikované v in vitro testoch na cytotoxicitu nádorových buniek -, môžu mať podobné protinádorové účinky in vivo, keby boli aplikované buď samotné, alebo v kombinácii zvieratám alebo ľuďom.

Použitie IFN-r a iných LT-P-R aktivujúcich činidiel

Cytotoxické účinky LT-α/β heteromémych komplexov a zosietených alebo viacnásobných anti-LT-β-protilátok na nádorové bunky sa zvyšujú prítomnosťou LT-P-R aktivujúceho činidla, predovšetkým IFN-r. O humánnych adenokarcinomatóznych bunkách črevného pôvodu (HT29 bunkách) bolo v minulosti preukázané, že sú senzitívne proti FasR signalizácii (Yonehara a Yonehara, J. Exp. Med., 169, str. 1747 až 1756 (1989)) a proti TNF a LT-α za prítomnosti IFN-τ (Browning a spol., J. Immunol., 143, str. 1856 až 1867 (1989)).

Množstvo LT-P-R aktivujúceho činidla, potrebného na zvýšenie protinádorovej účinnosti LT-α/β heteromérnych komplexov, anti-LT-P-R protilátok alebo iných LT-p-R aktivačných činidiel podľa vynálezu bude závisieť od typu bunky alebo tkaniva, na ktoré pôsobí, a tiež od spôsobu liečby a môže byť stanovené empiricky použitím rutinných metód. LT-P-R aktivujúce činidlo môže byť dodané v koncentrácii alebo aplikované pri rýchlej determinácii účinného spojenia s inými LT-P-R aktivujúcimi činidlami, pričom sa berú do úvahy uvedené faktory.

Alternatívne je možné zamerať sa na endogénne LT-P-R aktivujúce činidlá, napríklad na interferóny ako je IFN-τ, ktoré môžu byť vytvorené bunkami alebo tkanivami obklopujúcimi cieľové nádorové bunky. Endogénny IFN-rje normálne produkovaný po vírusovej infekcii aje tiež nachádzaný v blízkosti nádorov (Dinge a spol., Immunity, 1, str. 447 až 456 (1994)).

Do rozsahu skupiny LT-/3-R aktivujúcich činidiel podľa vynálezu spadá ktorékoľvek činidlo, ktoré je schopné indukovať interferóny výhodne IFN-τ, a ktoré potencuje cytotoxické účinky LT-α/ρ heteromémych komplexov a anti-LT-p-R monoklonálnych protilátok na nádorové bunky. Zatiaľ čo vírusová infekcia normálne indukuje tvorbu IFN-τ, hladiny endogénneho IFN-τ môžu byť zvýšené inými činidlami (príklad 10). Napríklad klinické pokusy preukázali indukciu interferónu účinkom dvojreťazcovej RNA (dsRNA). Účinné ako induktory interferónu sú teda v tomto ohľade polyriboguanylová kyselina/polyribocytidylová kyselina (poly-rG/rC) a iné formy dsRNA (Juraskova a spol., Eur. J. Pharmacol., 221, str. 107 až 111 (1992)).

Stimulátor interferónov z Glycyrrhiza glabra (Acharya a spol., Indián J. Med. Res., 98, str. 69 až 74 (1993)) a farmaceutické prostriedky, z ktorých mnohé je možné aplikovať orálne, môžu byť tiež použité na zvýšenie hladín interferónu. K takým induktorom interferónov patri: imikvimod (Bemstein a spol., Antiviral Res., 20„ str. 45 až 55 (1994), saparal (Paramononova a spol., Vopr. Virusol., 39, str. 131 až 134 (1994), arylpyrimidóny ako napríklad bropirimín (Onishi a Machida, Hinyokika Kivo, 40, str. 195 až 200 (1994), Ridostin (Cheknev a spol., Vopr. Virusol., 39, str. 125 až 128 (1994)).

Množstvo týchto činidiel indukujúcich interferóny bolo charakterizované ako induktory interferónov typu I ako IFN-α. Typ I interferónov môže tiež pôsobiť ako LT-P-R aktivujúci činidlá, ale menej účinne ako IFN-T.

Liečenie s použitím LT-α/β komplexov a LT-^-R aktivujúcich činidiel

Prostriedky podľa vynálezu budú aplikované v účinnej dávke na liečbu príslušného klinického stavu. Určenie výhodného farmaceutického prípravku a terapeuticky účinného dávkovania pre danú aplikáciu spadá do pôsobnosti odborníkov, pričom sa berie do úvahy napríklad stav a hmotnosť pacienta, rozsah požadovanej liečby a tolerancia pacienta na liečbu.

Obvykle ľudia môžu znášať až do 100 až 200 pg/m² TNF, skôr ako sa prejaví závažná toxicita (Schiller a spol., Cancer Res., 51, str. 1651 až 1658 (1991)). Pri myšiach spôsobili dávky v rozsahu 1 až 5 pg/myš/deň podávané v 5 x 10⁴ jednotkách rekombinantného ľudského IFN-τ regresiu primárneho nádoru (Balkwill a spol., CIBA Foundation Symposium (1987), Havell a spol., J. Exp. Med., 167, str. 1067 až 1085 (1988)). Na základe relatívnej účinnosti TNF a LT-αΙ/βζ v HT29 cytolytických testoch poskytne približne 5 až 25 pg/myš/deň LT-al/p2 terapeutické rozmedzie dávky. Extrapoláciou na človeka sa očakáva, že bude potrebné dávkovanie najmenej 1 mg/m^z LT-al/fl2 v kombinácii s LT-5-R aktivujúcim činidlom, napríklad IFN-r.

Historicky bola liečba pomocou IFN-τ uskutočňovaná buď s maximálnymi tolerovanými dávkami v rozmedzí 100 až 250 pg/m², alebo v imunomodulačných hladinách v rozmedzí 10 až 25 pg/m² (pozri napríklad Kopp a spol., J. Immunother., 13, str. 181 až 190 (1993)). Kombinačné terapie s dvoma interferónmi použili 4 x 10⁶ jednotiek/m² IFN-α a približne 250 pg/m² IFN-τ (Niederle a spol., Leuk. Lymphoma, 9, str. 111 až 119 (1993)). Očakáva sa, že stredné dávky asi 25 až 100 pg/m² IFN-τ v kombinácii s LT-α/ρ heteromémymi komplexmi alebo purifikovanými anti-LT-fi-R protilátkami tu opísanými budú vhodnými štartovacími bodmi na optimalizáciu liečebných dávok.

Aplikácia LT-α/β heteromémych komplexov a zosietených anti-LT-p-R protilátok podľa vynálezu vrátane izolovaných a puriftkovaných foriem protilátok alebo komplexov, ich solí alebo ich farmaceutický prijateľných derivátov môže byť uskutočnená s použitím ľubovoľných obvykle používaných metód aplikácie prostriedkov, ktoré sa vyznačujú protinádorovou účinnosťou.

Farmaceutické prostriedky používané pri týchto terapiách môžu mať tiež najrôznejšie formy. K tým patria napríklad pevné, polopevné a kvapalné dávkovacie formy, ako tabletky, piluly, prášky, kvapalné roztoky alebo suspenzie, čapíky a roztoky, ktoré je možné aplikovať injekčné alebo infúziou.

Výhodná forma závisí od predpokladaného spôsobu podania a terapeutickej aplikácie. Spôsoby podania môžu zahŕňať orálne, parenterálne, subkutánne, intravenózne alebo topické aplikácie, alebo aplikácie priamo do lézie.

LT-tx/β heteroméme komplexy, IFN-τ a anti-LT-p-R protilátky môžu byť napríklad uložené do sterilných izotonických prípravkov s alebo bez kofaktorov, ktoré stimulujú absorpciu alebo stabilitu. Prípravok je výhodne kvapalný alebo to môže byť lyofilizovaný prášok. Napríklad LT komplexy a/alebo anti-LT-P-R protilátky a IFN-r môžu byť zriedené pufrom prípravku pozostávajúcim z 5, 0 mg/ml monohydrátu kyseliny citrónovej, 2,7 mg/ml citrátu trojsodného, 41 mg/ml mannitolu, 1 mg/ml glycínu a 1 mg/ml polysorbátu 20. Tento roztok môže byť lyofilizovaný, uskladnený v chlade a rekonštituovaný pred aplikáciou sterilnou vodou pre injekciu.

Prostriedky budú výhodne tiež obsahovať obvyklé farmaceutický prijateľné nosiče dobre známe v odbore (pozri napríklad Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. vydanie, 1980, Mac Publishing Company). Takéto farmaceutický prijateľné nosiče môžu obsahovať iné medicinálne prostriedky, nosiče, genetické nosiče, adjuvanty, pomocné látky atď., ako humánny sérový albumín alebo plazmatické prípravky. Prostriedky sú výhodne vo forme dávkovacej jednotky a obvykle sa budú aplikovať raz alebo niekoľkokrát za deň.

Farmaceutické prostriedky podľa vynálezu sa môžu aplikovať tiež s použitím mikroguľôčok, lipozómov, iných aplikačných systémov s použitím mikročastíc alebo prostriedkov s retardovaným uvoľňovaním, umiestnených v, blízko alebo inak v kontakte s postihnutými tkanivami alebo krvným riečišťom. Vhodné príklady nosičov s retardovaným uvoľňovaním zahŕňajú semipermeabilné polyméme matrice vo forme tvarovaných predmetov, ako sú čapíky alebo mikrotobolky. Implantovateľné alebo mikrokapsulované matrice s retardovaným uvoľňovaním zahŕňajú polylaktidy (US. patent č. 3 773 319, EP 58. 481), kopolyméry L-glutamovej kyseliny a gama etyl-L-glutamatu (Sidman a spol., Biopolymers, 22, str. 547 až 556 (1985)), poly(2-hydroxyetylmetakrylát) alebo etylénvinylacetát (Langer a spol., J. Biomed. Mater. Res., 15, str. 167 až 277 (1981), Langer, Chem. Tech., 12, str. 98 až 105 (1982)).

Lipozómy obsahujúce LT-P-R heteromérne komplexy a/alebo anti-LT-P-R protilátky a IFN-τ môžu byť pripravené dobre známymi metódami (pozri napr. DE 3, 218. 121, Epstein a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 82, str. 3688 až 3692 (1985), Hwang a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 77, str. 4030 až 4034 (1980), US patenty č. 4 485 045 a č. 4 544 545). Obvykle ide o lipozómy malého (okolo 20 až 80 nm) unilamelámeho typu, v ktorom je obsah lipidov väčší ako asi 30 mol. % cholesterolu. Podiel cholesterolu je zvolený tak, aby reguloval optimálnu rýchlosť LT komplexu a/alebo anti-LT-p-R protilátok a IFN-r.

LT-α/β heteroméme komplexy a anti-P-R protilátky podľa vynálezu môžu byť tiež pripojené k lipozómom obsahujúcim iné LT-P-R aktivujúce činidlá, chemoterapeutické prostriedky alebo IFN-τ k doplneniu IFN-τ, ktorý sa obvykle nachádza v oblasti nádorov. Pripojenie LT komplexov a anti-LT-P-R protilátok k lipozómom môže byť dosiahnuté ľubovoľným známym zosieťujúcim činidlom, ako napríklad heterobifunkčnými zosieťujúcimi činidlami, ktoré boli v širokom rozsahu používané k spojeniu toxínov alebo chemoterapeutických prostriedkov s protilátkami pre cielenú aplikáciu. Konjugácia na lipozómy môže byť tiež uskutočnená použitím lipidom riadeného sieťujúceho činidla, hydrazidu 4-(4-maleimidofenyl)maslovej kyseliny (MPBH) (Duzgunes a spol., J. Celí. Biochem. Abst. Suppl. 16E 77 (1992)).

Výhody terapeutických prostriedkov na báze aktivácie anti-LT-P-R

Protinádorová terapia na báze LT-P-R aktivácie by mala množstvo výhod. LT-P-R sa viaže na LT-α/β heteromérne komplexy s vysokou afinitou v p/β rozštepoch a s nižšou afinitou v α/β rozštepoch, vytvorených na rozhraniach medzi susednými LT-α a LT-β podjednotkami. Naproti tomu TNF receptory sa viažu na LT-α/β heteroméme komplexy s vyššou afinitou len v α/α rozštepoch. Purifikované LT-αΙ/βζ komplexy sa teda viažu s vysokou afinitou na LT-p-R medzi susednými LT-β podjednotkami, ale postrádajú α/α rozštepy a teda neaktivujú križovo signalizáciu prostredníctvom TNF receptorov. LT-α/β heteroméme komplexy podľa vynálezu teda nebudú stimulovať zápalové odpovede spojené s TNF.

Aplikácia LT-αΙ/βζ neaktivuje zmeny endoteliálnych buniek spojené so zápalovou reakciou aj pri pomerne vysokých hladinách. Z tohto dôvodu by vedľajšie účinky spôsobené aktiváciou zápalových kaskád, pozorované pri TNF, nemalo spôsobovať problém pri použití farmaceutických prostriedkov a liečebných metód pre aktiváciu LT-P-R.

Ľudský ΣΤ-α1/β2 sa viaže na myší υΤ-β-R v podstate rovnako dobre ako na humánny υΓ-β-R. Injekcia 100 pg humánneho LT-ctl/p2 na myš nie je letálna (príklad 11), čo ukazuje na to, že stimulácia LT-p-R v celom zvierati nemá zrejmú zreteľnú toxicitu, keď boli uskutočnené podobné pokusy s FasR alebo p69 TNF-R aktiváciou.

Použitie špecifických monoklonálnych protilátok anti-LT-P-R alebo kombináciou protilátok k vyvolaniu tejto cesty u ľudí môže mať množstvo výhod oproti liečbe s LT-α/β heteromémymi komplexami. Liečba antireceptorovými protilátkami bude selektívnejšia ako liečba ligandom. Okrem toho bude jednoduchšie pripraviť a vyrobiť vo veľkom rekombinantné formy anti-LT-P-R monoklonálnych protilátok ako rozpustné LT-α/β heteroméme komplexy.

Uvažuje sa o tom, že monoklonálne protilátky alebo LT-α/β heteroméme komplexy sa budú aplikovať ľuďom s nádorom spoločne s obvyklou protinádorovou terapiou (t. j. ožarovaním a chemoterapiou). Kombinovaná liečba LT-P-R aktiváciou s obvyklými chemoterapiami môže poskytnúť ďalší faktor protinádorovej aktivity, ktorý by pravdepodobnejšie zbavil pacienta nádorových buniek, ako keď sa použije protinádorová terapia samotná.

Ďalej je možné, že by tento prístup mal pomerne málo vedľajších účinkov, a preto mohol byť aplikovaný v semiprofylaktickom zmysle v prípadoch rakovín, ktoré ešte nemuseli metastázovať, alebo u pacientov z rodín, v ktorých je genetická predispozícia pre určitý typ rakoviny.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nasledujú príklady, ktoré ilustrujú LT-α/β heteroméme komplexy a anti-LT-P-R monoklonálne protilátky podľa vynálezu a metódy použité k ich charakterizácii. Tieto príklady nemajú za cieľ obmedzovať rozsah vynálezu. Príklady sú uvedené s cieľom ilustrácie a vynález je obmedzený len patentovými nárokmi.

Príklad 1

Vytvorenie supematantov baculovirusom infikovaných hmyzích buniek obsahujúcich LT-α/β formy

Rekombinantné baculovírusy, kódujúce buď LT-α s plnou dĺžkou, alebo sekretovanú formu LT-β, boli pripravené, ako je opísané (Crowe a spol., Science, 264, str. 707 až 710 (1994)). Hmyzie bunky (Invitrogen, San Diego, CA.) boli inokulované s hustotou 2 x 10⁵ buniek/ml do 7,2 litrov média SF 900-11 (Gibco) bez séra. Po 48 hodinách dosiahla kultúra 1,8 x 10⁶ buniek/ml a bola infikovaná 150 ml (3 x 10⁸ PFU/ml) LT-β a 300 ml LT-α baculovírusových kultúr. Po dvoch dňoch sa kultúra odobrala a zvyšky buniek boli odstránené odstredenim. Po pridaní kyseliny etyléndiamíntetraoctovej (EDTA) a fenylmetyl-sulfonylfluoridu (PMSF) (1 mM EDTA a 150 μΜ PMSF konečnej koncentrácie) sa vyčírený supematant skoncentroval desaťnásobnou ultrafiltráciou s použitím špirálnej vložky SI YM10 (Amicon). Koncentrát sa rozdelil na šesť 120 ml podielov a alikvotné podiely sa skladovali pred purifikáciou pri -70 °C.

Príklad 2

Príprava rozpustných LT-β receptorov ako chiméry Fc a imunoglobulínu

Extracelulárna doména ΕΤ-β-R bola amplifikovaná až do transmembránnej oblasti polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) z cDNA klonu použitím primérov, ktoré inkorporovali Notl a Sali reštrikčné enzýmové miesta na 5' a 3' koncoch (Browning a spol., J. Immunol., 154, str. 33 až 46 (1995)). Amplifikovaný produkt bol netrávený enzýmami Notl a Sali, purifikovaný a ligovaný do vektora pMDR901 linearizovaného enzýmom Notl spoločne s fragmentom poštiepeným enzýmami Sall-NotI kódujúcim Fc oblasť humánneho IgGl. Výsledný vektor obsahoval gén reduktázy dihydrofolátu a ΤΤ-β-R-Fc chiméru ovládanej oddelenými promótormi. Vektor bol elektroporovaný do CHO dhfr - buniek a metotrexátrezistentné klony boli izolované štandardnými postupmi. υΓ-β-R-Fc je sekretovaný do média a test ELISA bol použitý na selekciu bunkových línií produkujúcich najvyššiu hladinu chimérického proteínu. Vysokoprodukčná bunková línia sa nechala narásť do vysokých počtov a kondicionované médium sa odobralo. Čistý proteín sa izoloval pomocou rýchle pretekajúcej afinitnej chromatografie s Proteín A sefarózou.

Príklad 3

Afinitná purifikácia ίΤ-α1/β2 s použitím TNF-R a LT-β-Κ

Na prípravu živíc pre afinitnú purifikáciu receptorov LT foriem boli imobilizované purifikované prípravky υΓ-β-R-Fc (ako je opísané tu v príklade 2) a TNF-R p60-Fc (Crowe a spol., Science, 264, str. 707 až 710 (1994)) na CNBr-sefaróze (Pharmacia) pri 5 mg/ml živice v podstate podľa návodu výrobcu. Živice prešli pred použitím jedným elučným cyklom. Časť (120 ml) S1Y10 koncentrátu prešla cez dve sekvenčné p60 TNF-R-Fc kolóny, ktoré viažu LT-α a LT-oc2/pi. Prietok, ktorý obsahoval LT-αΙ/βζ a LT-β, bol vedený cez ΤΤ-β-R-Fc kolónu. Kolóna sa premyla vždy 5 objemami PBS, PBS s 0,5 M NaCl a PBS a potom sa LT-α a LT-οώ/βΙ komplexy premyli 25 mM fosforečnanom sodným, 100 mM NaCl, pH 3,5. Elučné frakcie sa ihneď zneutralizovali 1/20 objemu 0, 50 M fosforečnanu sodného, pH 8,6 a uložili sa na ľad. Frakcie obsahujúce proteín sa identifikovali absorbanciou pri 280 nm, pikové frakcie sa spojili a spojené elúcie z kolón sa zanalyzovali pomocou SDS-PAGE zafarbenou jasnou modrou coomassi. Opísaná elúcia poskytla viac ako 95 % čistého ΗΓ-αΙ/'βζ.

Príklad 4

Charakterizácia purifikovaných ίΤ-α1/β2 ligandov

Frakcie z príkladu 3 boli rozdelené gélovou vylučovacou chromatografiou k zisteniu, či sa vytvorili triméry a či sú prítomné agregáty. Bola použitá kolóna TSK G3000 sw x2 pri prietokovej rýchlosti 0,5 ml/minúta, aby sa oddelil proteínový štandard BioRad z gélovej filtrácie a tri rôzne LT triméry, LT-a3, ΗΓ-α2/β1 a LT-α1/β2.

Obrázok IA ukazuje, že veľmi málo, pokiaľ vôbec niektorý, z ΕΤ-α1/β2 trimérov sa ukazuje byť agregátom s vysokou molekulovou hmotnosťou. Porovnávanie s veľkostnými štandardmi ukazuje, že všetky tri formy sú triméme, t. j. asi s 50 až 60 kDa. Stechiometria LT-α k LT-β obsiahnutých v purifikovaných frakciách LT-al/p2 a LT-02/βΙ bola vyhodnotená buď denzitimetriou gélov zafarbených pomocou coomassi, alebo pikovou výškovou analýzou dvoch píkov nasledujúcich po rozštiepení C4 vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou s obrátenými fázami. Obe merania potvrdili identitu frakcií eluovaných z opísaných afinitných chromatografických kolón.

Čistota prípravkov bola ďalej vyhodnotená ionexovou chromatografiou s použitím prístrojového vybavenia BioCAD k vytvoreniu charakteristických chromatogramov LT-αΙ/βζ a LT-až/βΙ na slabej katexovej živici pri niekoľkých rôznych pufŕových systémoch. Metóda, ktorá sa vyznačovala najväčšou schopnosťou čisto zadržať a oddeliť tie tri uvedené triméry, obsahovala POROS CM (karboxymetylovú) kolónu prevádzkovanú pri 5 ml/min. s 16,6 mM MES, 16,66 mM HEPES, 16,66 mM octanu sodného pH 6,5 pufra a premývanie s 1 M NaCl gradientom cez 20 objemov kolóny. BioCAD chromatogramy ΚΓ-α1/β2 a LT-02/βΙ komplexov sú znázornené na obrázku IB. Každý trimér, LT-a3, LT-a2/pl a Ι,Τ-α1/β2 bol eluovaný pri rôznych koncentráciách soli a nebola preukázaná pri rôznych prípravkoch krížová kontaminácia väčšia ako 1 až 2 %.

Príklad 5

Usmrcovanie humánnych adenokarcinomatóznych buniek HT29 rozpustnými LT-al/32 komplexmi

Cytolytický test s bunkami HT29 bol skôľ opísaný (Browning and Ribolini, J. Immunol., 143, str. 1859 až 1867 (1989)). V typickom teste bola pripravená séria riedení LT-αΙ/βΖ (a iných cytokínov, kde sú aplikovateľné) v 0,05 ml v doštičkách s 96 jamkami a pridalo sa 5000 trypsinizovaných buniek HT29-14 v 0,05 ml média obsahujúceho 0 alebo 80 U/ml (protivírusových jednotiek) humánneho IFN-τ. Bunky HT29-14 sú zo subklonu pôvodné, od ATCC odvodené HT29 línie, ktorá je homogénnejšia. V testoch boli použité bunky HT29-14. Všetky tieto výsledky môžu byť tiež pozorované pri použití pôvodnej HT29 línie odvodenej od ATCC. Po 3 až 4 dňoch bola zmeraná mitochondriálna redukcia farbiva MTT nasledovne: pridalo sa 10 1 MTT a po 3 hodinách sa redukované farbivo rozpustilo pomocou 0,09 ml izopropanolu s 10 mM HC1 a zmerala sa optická hustota pri 550 nm. K bunkám sa vopred pridali rozpustné receptorové formy, pripravené, ako tu bolo opísané, alebo čistý humánny IgG, aby sa dosiahlo konečnej koncentrácie 5 pg/ml.

Obrázok 2A ukazuje usmrcovanie buniek HT29 pôsobením anti-Fas receptora mAb CH-11 (ktorý stimuluje FasR signalizáciu), TNF, LT-a3, ΕΤ-α1/β2 a ΕΤ-α2/β1 ligandov v spojení s IFN-τ. Vizuálna prehliadka buniek, na ktoré bolo pôsobené LT-αΙ/βΣ, ukazuje, že toto činidlo bunky skôr usmrcuje ako aby len blokovalo ich proliferáciu. Za neprítomnosti IFN-τ nie sú pozorované žiadne účinky, čo odráža neobvyklú schopnosť IFN-τ ovplyvniť, ako bunky interpretujú signalizáciu od TFN rodiny receptorov. Interferóny a a β boli 100-krát menej účinné ako interferóny T, ako bolo kvantifikované na báze jednotiek protivírusovej aktivity.

Obrázok 2B ukazuje inhibíciu LT-al/p2 usmrcovania rozpustným ΕΤ-β-R-Fc, ale nie p60-TNF-R-Fc, čím demonštruje, že cytotoxicita je špecifická pre LT-al/p2. Nedostatok inhibície pir p60-TNF-P-Fc naznačuje, že kontaminácia LT-α (o ktorej je známe, že robí menej ako 1 %) nemôže byť zodpovedná za cytotoxickú aktivitu LT-cd/p2.

Príklad 6

Anti-LT-/?-R monoklonálne protilátky potencujú usmrcovanie buniek HT29 pomocou LT-αΙ/βΖ komplexov

Uskutočnili sa cytolytické testy, ako je opísané v príklade 5, s tým rozdielom, že interferóny τ a anti-LT-β-R monoklonálne protilátky (séria 0,01 až 1000 ng/ml) boli pridané k bunkám pri 2x výslednej koncentrácii a potom sa pridalo 50 μΐ roztoku buniek do jamôk obsahujúcich zriedený LT-al/p2. Rast bol vyhodnotený, ako je opísané v príklade 5. Obrázok 3 ukazuje rozdielne účinky dvoch rôznych anti-LTJ-R monoklonálnych protilátok v ich schopnosti potenciovať Ι>Τ-α1/β2 cytotoxickú aktivitu. Obrázok 3A ukazuje, že anti-LT-P-R monoklonálna protilátka CDH10 potencuje cytotoxickú aktivitu LT-al/p2 spôsobom závislým od dávkovania. Obrázok 3B ukazuje účinky inej anti-LTJ-R monoklonálnej protilátky BDA8 v rovnakom teste. Protilátka BDA8 inhibuje cytotoxickú aktivitu LT-αΙ/βζ skôr ako by potencovala usmrcovanie nádorových buniek.

Príklad 7

Imobilizované anti-LT-P-R monoklonálne protilátky môžu usmrcovať nádorové bunky HT29

S cieľom imobilizovať anti-LTJ-R monoklonálne protilátky na plastický povrch boli doštičky s 96 jamkami pre tkanivové kultúry pokryté 50 μΐ 10 pg/ml kozej protimyšej Fc polyklonálnej protilátky (Jackson ImmunoResearch), premyté a zablokované 5 % fetálnym telacím sérom (FCS) v PBS, po čom nasledovalo zachytenie uvedenej monoklonálnej anti-LT-p-R protilátky a ďalšie premytie. Do monoklonálnou protilátkou potiahnutých jamôk boli naočkované bunky HT29 a boli uskutočnené cytolytické testy ako napríklad v príklade 5. Obrázok 4A ilustruje cytotoxické účinky imobilizovaných anti-LT-P-R monoklonálnych protilátok BDA8 a CDH10 na bunky HT29. Každá monoklonálna protilátka vyvoláva individuálne cytotoxicitu na nádorové bunky, keď je imobilizovaná na povrch. Obrázok 4B ukazuje, že aj tie isté monoklonálne protilátky BDA8 a CDH10, pokiaľ sú testované individuálne v roztoku, nie sú cytotoxické, takže cytolytická aktivita jednotlivej anti-LT-P-R monoklonálnej protilátky in vitro sa javí byť funkciou jej imobilizácie.

Príklad 8

Kombinácia anti-LT-p-R monoklonálnych protilátok v roztoku, zameraná proti určitým epitopom, usmrcuje bunky HT29

Rast buniek HT29 bol vyhodnotený, ako je opísané v príklade 5, s tým rozdielom, že v rastovom médiu boli obsiahnuté jedna alebo dve anti-LT-P-R monoklonálne protilátky. Tabuľka 1 ukazuje účinky na bunky HT29, ktoré boli pozorované, keď boli do roztoku pridané rôzne anti-LT-P-R monoklonálne protilátky (t. j. neimobilizované na plaste). Anti-LT-P-R monoklonálne protilátky môžu byť usporiadané do skupín I až IV na báze ich relatívnych schopností pôsobiť vo vzájomnej kombinácii v cytolytickom teste na bunky HT29. Výsledky anti-LT-P-R monoklonálnych protilátok poskytli v cytolytických testoch paralelné údaje o väzbe na receptory, čo naznačuje, že monoklonálne protilátky v každej z rozdielnych skupín rozpoznávajú epitopy LT-P-R.

Tabuľka 1

Kombinácie rozpustných anti-LT-P-R monoklonálnych protilátok sú cytotoxické pre humánne adenokarcinomatózne bunky HT29. Anti-LT-P-R monoklonálne protilátky sú zoradené do skupín I, II, III a IV na báze ich účinkov vo vzájomnej kombinácii v cytolytických testoch s bunkami HT29. Plusy sa týkajú relatívnej hladiny cytolytických účinkov kombinácie monoklonálnych protilátok na bunky HT29 za prítomnosti 80U/ml interferónu t.

nr = nerelevantná, nd = nedeterminovaná

Druhá mAb

Prvá Skupina I Skupina II Skupina III Skupina IV

Skupina	mÄb	BDA8	AGH1	BCG6	BHA10	BKA1I	CDH10	CBE11
I	BDAB	nr	-	+	4 +	+	nd	nd
	AGH1	-	nr	++	4-4-4-	++	nd	nd
II	BCG6	++	+ +·	nr	-	++ +	nd	nd
	BHA10	++	+ 4· +	-	nr	+	4-4-4-	++++
III	BKA11	+	+ +	+++	nd	nr	-	nd
	CDH10	++	+ +	++	+++	-	nr	+++
IV	CBEI1	nd	+	+	++++	nd	++++	nr

Obrázok 5A až D kvantifikuje účinky začlenenia reprezentatívnych párových kombinácií spoluúčinkujú5 cich anti-LT-P-R monoklonálnych protilátok, zacielených proti rôznym epitopom LT-P-R, do HT29 cytolytického testu. Obrázok 5A znázorňuje cytotoxické účinky BHA10 a CBE11, obrázok 5B znázorňuje cytotoxické účinky CDH10 a CBE11 a obrázok 5C predstavuje cytotoxické účinky CDH10 a AGH1 samotných a v kombinácii. Obrázok 5D ukazuje cytotoxické účinky kombinácie monoklonálnych protilátok CDH10 a AGH1 pri inej línii nádorových buniek nazývanej WiDr.

Tabuľka 2 zahŕňa vlastnosti reprezentatívnych anti-LT-P-R monoklonálnych protilátok podľa vynálezu.

Súhrn myších antihumánnych LT-6-R monoklonálnych protilátok

HT29 cytotoxicita

mAB skupina	mAB názov	Farbenie buniek3	Blokáda väzby receptorov	mAb imobilizovaná na plastec	Rozpustná mAb samotná	Rozpustná mAb s LTal- 61
I	BDA8	+++	+ + +	+	+/-d	inhibuj e
I	AGH1	4-+ +	+++		+ /-	inhibuj e
II	BCGfi	++ +	+ +	+	M-	zmiešaná
II	BHA10	4-4·+	+++	+	+/-	zmiešaná
III	BKA11	+++	+/-	+	-	potencuje
III	CDH10	+ + +	+/-	+	+/-	potencuje
IV	CBE11	+ + +	+++	+	+/-	bez účinku

Kontroly

MOPC21 -	-	-	-	bez účinku
HT29/26 -	nd	-	-	bez účinku
TS 2/9e nd	nd	•	-	bez účinku

^aFACS farbenie CHO buniek, pri ktorých došlo k transfekcii s LT-P-R ^bTest vyhodnotený na to, ak protilátka blokuje väzbu rozpustného receptora na aktivovaný hybridom ΙΙ-23 T-bunky, nd = neuskutočnené

ΉΤ-29 bunky sa nechali rásť s IFN-τ na doštičkách pokrytých anti-LT-P-R, ako je definované v metódach ^dVariabilná, parciálna inhibícia v niektorých testoch, žiadne účinky v iných 'Antihumánna LFA-3, myší IgGl

Príklad 9

Spoľahnutie na endogénny IFN-rpre pôsobenie na nádorové bunky

IFN-τ, výhodné LT-P-R aktivujúce činidlo podľa vynálezu, je cytokín, ktorý sa vyznačuje protinádorovou účinnosťou a ktorý je tolerovaný ľuďmi. Endogénny IFN-τ, prítomný v okolí obklopujúcim nádor, môže byť prítomný v dostatočne vysokých koncentráciách, aby fungoval ako LT-P-R aktivujúce činidlo podľa vynálezu bez pridania exogénneho IFN-τ. Koncentrácia IFN-τ v blízkosti nádoru môže byť stanovená použitím štandardných imunotechnických metód na vzorkách tkanív z oblasti nádoru. Ak je endogénna koncentrácia IFN-τ dostatočne vysoká, aby vyvolala protinádorovú aktivitu v kombinácii s LT-α/ρ heteromémymi komplexami alebo anti-LT-P-R monoklonálnymi protilátkami podľa vynálezu (ako je stanovené cytolytickými testami tu opísanými), potom nemusí byť IFN-τ aplikovaný ako druhé LT-P-R aktivujúce činidlo v prostriedkoch alebo metódach podľa vynálezu.

Príklad 10

Indukcia endogénneho IFN-r ako LT-P-R aktivujúceho činidla pre pôsobenie na nádorové bunky

Zlúčeniny, ktoré môžu vyvolať endogénnu produkciu interferónov, ako je IFN-τ, spadajú do skupiny LT-P-R aktivujúcich činidiel podľa vynálezu. Napríklad môžu interferóny byť indukované pôsobením molekúl dvojreťazcovej RNA, ako polyriboguanylovej/polyribocytidylovej kyseliny (poly-G/C).

Samiciam C57/bl6 (starým 6 až 8 týždňov) môže byť aplikované injekčné 18 mg (600 mg/kg) D-galaktosamínu, ktorý senzitivuje myši na účinky TNF a iných protinádorových činidiel. K purifikovanému LT-al/p2 (10 až 100 pg) sa pridá séria koncentrácií poly-G/C (Juraskova a spol., Eur. J. Pharmacol., 221, str. 107 až 111 (1992)) v neutrálnom fyziologickom roztoku a roztok sa aplikuje myšiam vo forme intraperitoneálnej (i. p.) injekcie. Protinádorová účinnosť LT-al/p2 bude zvýšená prítomnosťou poly-rG/rC dvojreťazcovej RNA.

Podobne môže byť stimulátor interferónu z rastliny Glycyrrhiza glabra (Acharya a spol., Indián J. Med. Res., 98, str. 69 až 74 (1993)) aplikovaný ľuďom intravenózne v dávkach od 40 do 100 ml/deň. Optimálna dávka pre LT-P-R aktiváciu za prítomnosti buď LT-α/ρ heteromémych komplexov alebo anti-LT-P-R protilátok môže byť stanovená empiricky a bude závisieť od faktorov, ako je typ nádoru, spôsob aplikácie a program aplikácie.

Imiquimod R-837 (Bemstein a spol., Antiviral Res., 20, str. 45 až 55 (1994)), Saparal (Paramanova a spol., Vopr. Virusol., 39, str. 131 až 134 (1994)), Bropirimine (Onishi a Machida, Hinyokika Kiyo, 40, str. 195 až 200 (1994)) alebo Ridostin (Cheknev a spol., Vopr. Virusol., 39, str. 125 až 128 (1994)) môžu byť tiež aplikované ako LT-p-R aktivujúce činidlá v spojení s LT-α/β heteromémymi komplexami, anti-LT-p-R protilátkami alebo ich kombináciou. V každom prípade môžu byť výhodné spôsoby aplikácie a optimálne dávky stanovené empiricky s použitím publikovaných správ ako východiskových bodov na optimalizáciu rutinnými klinickými postupmi.

Príklad 11

Myši tolerujú injekcie humánneho LT-ccl/p2

Samiciam C57/b 16 (starým 6 až 8 týždňov), aklimatizovaným v ústave počas niekoľko dní, bolo aplikované injekčné i. p. 18 mg (600 mg/kg) D-galaktosaminu, ktorý senzitivuje myši na TNF a iné protinádorové prostriedky. Bol aplikovaný i. p. buď humánny TNF, LT-α, alebo LT-ctl/p2.

Tabuľka 3 dokumentuje prežitie myší 24 hodín po aplikovaní injekcii.

Činidlo	Dávka (gg/zviera)	Prežitie
fyziologický roztok	-	4/4
hu-TNF	0,2	0/6
hu-TNF	1,0	0/2
hu-TNF	10	0/4
hu-LT-a	0,2	2/2
hu-LT-a	1.0	2/2
hu-LT-al/B2	10	2/2
hu-LT-al/62	100	2/2

Príklad 12

Vytvorenie rekombinantnej anti-LT-P-R IgM monoklonálnej protilátky

Pri použití opísaných protinádorových cytotoxicitných testov v spojení so štandardnými modelmi rastu nádorov pri imunodeficitných myšiach môže byť zvolený anti-LT-P-R IgG s vhodnými vlastnosťami. Na prípravu variabilnej domény DNA z RNA izolovanej zo sekretujúcej hybridómovej bunkovej línie s použitím štandardných metodológií reverznej transkriptázy/PCR môžu byť použité univerzálne primáry, ktoré hybridizujú ku každej z variabilných domén IgG ťažkých a ľahkých reťazcov zvolených anti-LT-P-R. Tieto protokoly boli opísané (Arulanandam a spol., J. Exp. Med., 177, str. 1439 až 1450 (1993), Lane a spol., Eur. J. Immunol., 22, str. 2573 až 2578 (1993), Traunecker a spol., Náture, 339, str. 68 až 70 (1989)).

Amplifikované produkty sa potom zhromaždia do vektorov obsahujúcich humánny CH1, CH2 a CH3 μ reťazcovej domény. Koexpresia dvoch reťazcov v jedinom hostiteľovi umožni zhromaždiť ťažké a ľahké reťazce do pentamérnej IgM molekuly. Táto molekula je chimérou pozostávajúcej z myších variabilných oblastí pripojených k humánnym konštantným oblastiam.

Alternatívne môže byť použitý proces používajúci PCR k amplifikácii DNA kódujúcej len aktuálne väzbové oblasti variabilných oblasti. Amplifikovaná DNA je potom vložená do vektorov obsahujúcich všetky sekvencie humánneho IgG okrem aktuálnych aminokyselín zúčastňujúcich sa väzby na antigén. Také konštrukcie sa nazývajú „humanizované“ protilátky a detailné metódy na ich prípravu sú dobre známe (napr. WO 94/04679).

Príklad 13

Anti-LT-P-R IgM monoklonálne protilátky fungujú ako LT-P-R aktivujúce činidlá

Anti-LT-P-R IgM protilátky môžu byť pripravené v rekombinantnej forme, ako je opísané v príklade 12.

Alternatívne môžu byť použité ako zdroj anti-LT-P-R IgM monoklonálnych protilátok kompletné myšie imunoglobulíny triedy IgM izolované metódami fúzie hybridómu s použitím primárnej imunizácie normálnych myší alebo extenzívnej imunizácie myší CD40 postrádajúcich signalizáciu (Kawabe a spol., Immunity, 1, str. 167 až 178 (1994), Xu a spol., Immunity, 1, str. 423 až 431 (1994)).

Anti-LT-P-R IgM monoklonálne protilátky budú podstatne účinnejšie ako LT-p-R aktivujúce činidlá, ako ich normálne bivalentné IgG náprotivky, merané porovnanými odpoveďami na dávku v HT29 cytolytickom teste za prítomnosti IFN-7. Anti-LT-P-R IgM monoklonálne protilátky fungujú ako LT-P-R aktivujúce činidlá, ako keď sú imobilizované tiež tak, keď sú aplikované v roztoku. Okrem toho možno očakávať, že zväčšia protinádorovú účinnosť LT-α/ρ heteromémych komplexov.

Príklad 14

Anti-LT-P-R monoklonálne protilátky inhibujú rast humánnych nádorových buniek pri myšiach SCID

Balb/c SCID myšiam (Jackson Labas, Bar Harbor, ME) bolo aplikované injekčné subkutánne (s. c.) do zadnej partie zvieraťa 1 x 10⁶ trypsinizovaných a premytých humánnych adenokarcinomatóznych WiDr buniek v objeme 0,2 ml PBS. Injekčné vnesené WiDr bunky vytvoria v myšiach nádory a schopnosť anti-LT-P-R monoklonálnej protilátky inhibovať rast nádoru bol monitorovaný. V jednom súbore pokusov sa na myši pôsobilo s alebo bez CBE11 anti-LT-P-R monoklonálne] protilátky — buď s, alebo bez humánneho IFN-7 (10⁶ protivírusových jednotiek/'myš) — súčasne s inokuláciou WiDr buniek s. c. (obrázok 6A). Protilátky a IFN-t boli aplikované samotné alebo spoločne i. p. injekciou v 0,2 ml. Kontrolným myšiam bol aplikovaný injekčné samotný fyziologický roztok, IFN-τ samotný alebo kontrolná antihumánna LFA-3 monoklonálna protilátka (1E6) s IFN-τ. Veľkosť každého výsledného nádoru bola zmeraná 30 dní po inokulácii. Objem ná doru (v cm³) bol vypočítaný z polomeru zisteného meraním posuvným meradlom v dvoch smeroch. Zvieratá, ktorým boli aplikované CBE11 alebo 1E6 monoklonálne protilátky, dostali 10 pg/myš alebo 50 pg/myš protilátky (obrázok 6A, krúžky s bodkami a prázdne krúžky).

V inom súbore pokusov boli myši inokulované s. c. WiDr bunkami a nádory sa nechali rásť 15 dní, skôr ako sa myšiam aplikovala CBE11 anti-LT-P-R monoklonálna protilátka (obrázok 6B). 15. deň (pred aplikáciou protilátky) robil objem nádoru 0,076 cm³ pri strednom priemere 0,53 cm. Potom bola aplikovaná CBE11 anti-LT-p-R monoklonálna protilátka (50 pg) — buď s, alebo bez humánneho IFN-7 (10⁶ protovírusových jednotiek/myš) - i. p. injekciou v 0,2 ml skupine 12 zvierat. Injekcie sa opakovali trikrát alebo viackrát v priebehu obdobia troch týždňov. Kontrolným skupinám (12 myši/skupina) bol injekčné aplikovaný IFN-r samotný (10⁶ protivírusových jednotiek/myš) alebo s 50 pg kontrolnej antihumánnej LFA-3 monoklonálnej protilátky (1E6) + IFN-τ (10⁶ protivírusových jednotiek/myš). Rast nádorov prítomných 15. deň bol meraný v priebehu doby od 15. do 49. dňa po inokulácii nádorových buniek. Výsledky znázornené na obr. 6B boli zistené slepým spôsobom. Nádory, na ktoré sa pôsobilo monoklonálnou protilátkou CBE11 buď s, alebo bez IFN-r, prestali rásť. Po troch injekciách monoklonálnej protilátky CBE11 (+/- IFN-r) v priebehu troch týždňov sa rast nádorov zastavil najmenej na 7 týždňov po inokulácii, t. j. v čase, kedy pokus bol ukončený.

Claims (9)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Farmaceutická kompozícia obsahujúca aspoň jedno LT-P-R aktivujúce činidlo, pričom jedno LT-P-R aktivujúce činidlo zahrnuje protilátku anti-LT-P-R.
2. 2. Použitie aspoň jedného LT-P-R aktivujúceho činidla na prípravu farmaceutickej kompozície na liečenie alebo zmiernenie postupu, závažnosti alebo účinkov neoplázie, pričom jedno LT-P-R aktivujúce činidlo zahrnuje protilátku anti-LT-P-R.
3. 3. Použitie LT-α/β heteromérneho komplexu na prípravu farmaceutickej kompozície navrhnutej na podanie v prítomnosti aspoň jedného LT-P-R aktivujúceho činidla na liečenie alebo zmiernenie postupu, závažnosti alebo účinkov neoplázie.
4. 4. Použitie podľa nároku 3, kde jedno LT-P-R aktivujúce činidlo zahrnuje protilátku anti-LT-P-R a/alebo IFN-y.
5. 5. Použitie zosietených protilátok anti-LT-P-R ako prvého LT-P-R aktivujúceho činidla na prípravu farmaceutickej kompozície navrhnutej na podanie v prítomnosti druhého LT-P-R aktivujúceho činidla na liečenie alebo zmiernenie postupu, závažnosti alebo účinkov neoplázie.
6. 6. Použitie podľa nároku 5, kde druhé LT-p-R aktivujúce činidlo zahrnuje IFN-γ.
7. 7. Spôsob výberu LT-P-R aktivujúceho činidla, ktoré pôsobí v prítomnosti LT-α/β heteromémych komplexov, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje kroky a) kultivácie nádorových buniek v prítomnosti LT-α/β heteromémych komplexov, prvého LT-P-R aktivujúceho činidla a druhého predpokladaného LT-β-R aktivujúceho činidla; a b) stanovenie, či druhé predpokladané LT-P-R aktivujúce činidlo zvyšuje protinádorovú aktivitu LT-α/β heteromérneho komplexu v prítomnosti prvého LT-P-R aktivujúceho činidla.
8. 8. Farmaceutická kompozícia obsahujúca protilátku anti-LT-P-R.
9. 9. Použitie protilátky anti-LT-P-R na prípravu farmaceutickej kompozície na liečenie alebo zmiernenie postupu, závažnosti alebo účinkov neoplázie.