BG62599B1 - Методи и фармацевтични средства за лечение на тумори - Google Patents

Description

Изобретението се отнася до препарати и методи, които могат да се използват за активиране предаването на сигнали чрез рецептора за лимфотоксин-β (LT-β), което оказва мощен антипролиферативен ефект върху туморните клетки. По-конкретно изобретението се отнася до лимфотоксинови хетеромерни комплекси, образувани между лимфотоксин-α и множество субединици на лимфотоксин-β, които индуцират цитотоксичен ефект върху туморните клетки в присъствието на вещества, активиращи рецептора за лимфотоксин-β. Изобретението се отнася и до антитела насочени срещу рецептора за лимфотоксин-β, които действат като вещества, активиращи рецептора за лимфотоксин-β сами или в комбинация с други вещества, активиращи рецептора за лимфотоксин-β, в присъствието или отсъствието на комплексите лимфотоксин-α. Представен е скриниращ метод за селекция на такива антитела. Изобретението се отнася и до препарати и методи за усилване на туморната клетъчна цитотоксичност, ползващи кръстосано свързани антитела срещу рецептора за лимфотоксин- в присъствието на други вещества, активиращи рецептора за лимфотоксин-β.

Предшестващо състояние на техниката

Фамилията рецептори за тумор некрозис фактор (TNF) има няколко члена, предаването на сигнали с които може да се индуцира смърт на туморните клетки чрез некроза или апопотоза (програмирана клетъчна смърт). Лигандите TNF и лимфотоксин-а (LT-а; преди наричан TNF-β) свързват и активират рецепторите за TNF (р60 и р80; тук наричани “TNF-R”). Предаването на сигнали чрез THF-R предизвиква имунни отговори от общ характер спрямо инфекции или стрес в нормални клетки, но има цитотоксичен ефект върху клетки с трансформиран фенотип или върху туморните клетки. Предаването на сигнали посредством TNF-R може избирателно да лизира туморните клетки и клетките, инфектирани с вирус. Цитотоксичните ефекти върху туморните клетки, предизвикани от предаването на сигнали чрез TNF-R, могат да се усилят чрез интерферон-γ (IFN-γ) и чрез разнообразие от традиционни химиотерапевтични вещества.

За целите на терапията би било изгодно да се извлече полза от антипролиферативните или цитотоксични активности, които се индуцират от предаването на сигнали чрез TNF-R в туморните клетки. Активирането на TNF-R 10 обаче има плейотропни ефекти върху редица имунорегулаторни отговори, в това число инициирането на провъзпалителните каскади. Поради това не беше възможно цитотоксичните ефекти, които предизвиква предаването на сиг15 нали посредством TNF-R да се насочат срещу туморните клетки без ко-стимулиращи възпалителни отговори, които при хората водят до токсичност от общ характер.

По подобен начин стимулирането на един друг TNF-родствен рецептор, наречен рецептор за Fas(FasR), може да предизвика цитотоксичност чрез програмирана клетъчна смърт в редица както ту морни, така и нетуморни типове клетки. Беше показано обаче, че акивирането 25 на FasR причинява бърза чернодробна некроза, което възпрепятства терапевтичното му приложение при хората.

Наскоро беше идентифициран друг рецептор от THF-фамилията, наречен рецептор 30 за LT-β (ΕΤ-β-R) (Crowe et al., Science, 264, pp. 707-10 (1994)). ΕΤ-β-R свързва хетеромерни лимфотоксинови комплекси (LT-α/β), които включват субединици на LT-α в асоциация с друг TNF-родствен полипептид, наречен лим35 фотоксин-бета (LT-β). Тези комплекси LT-α/β са мембранно свързани и повечето имат стехимометрията ΕΓ-α1/β2 (Browning et al., Cell, 72, pp. 847-56 (1993); Browning etal., J.lmmunol., 154, pp. 33-46 (1995)).

По аналогия c TNF-R и други TNF-подобни рецептори се смята, че активирането на сигнализирането чрез LT-β-R става, когато множество рецептори върху клетъчната повърхност се доведат в непосредствена близост (Crowe et al., Science, 264, pp. 707-10 (1994)). Този процес се означава като рецепторно струпване. Лигандите TNF и LT са мултивалентни комплекси, които могат едновременно да свържат и по този начин да агрегират повече от един рецеп50 тор. Рецепторното струпване като способ за рецепторно активиране в други системи е добре документирано, по-специално за тирозинкиназ ните рецептори (Ullrich and Schlessinger, Cell, 61, pp. 203-212 (1990; Koianus et al., Cell, 74, pp. 171-83 (1993)). В съгласие c това прилагането на лигандите ΕΤα1/β2 и/или на вещества, активиращи ΕΤ-β-R, които могат да индуцират струпването на молекулите ΕΤ-β-R върху повърхността на прицелните туморни клетки и по-нататъшното предаване на сигнала, би било полезно за директно стимулиране на ΕΤ-β-R пътя в тези клетки.

Сигнализирането посредством ΕΤ-β-R, подобно TNF-R, може да активира пътища, които водят до цитотоксичност и клетъчна смърт в туморните клетки. Важното е, че лигандите ΕΤ-α1/β2 не свързват TNF-R със значителен афинитет. Поради тази причина насоченото активиране на LT-β-R в туморните клетки ще предизвика цитотоксичност в тези клетки, без да стимулира възпалителните пътища, свързани с активирането на TNF-R. По тази причина прилагането на ΕΤ-α1/β2 и/ или на други вещества, активиращи ΕΤ-β-R, би било от полза за лечението или редуцирането на напредването, тежестта или ефектите на туморогенните клетки (неоплазия) като едновременно с това се избягват проблемите, свързани с мощните странични ефекти, които възникват, когато за противотуморно лечение се използва активирането на TNF-R или FasR.

Техническа същност на изобретението

Изобретението решава изтъкнатите проблеми чрез фармацевтични препарати и методи за третиране на туморни клетки посредством стимулиране предаването на сигнали чрез ΕΤβ-R без ко-стимулиране на възпалителните отговори, свързани с TNF-R. В едно от приложенията се обезпечават лимфотоксинови комплекси, образувани между LT-α и множествени субединици на LT-β (хетеромерни комплекси LT-α/β), които в присъствието на вещество, активиращо ΕΤ-β-R, индуцират цитотоксични ефекти върху клетки, носещи ΕΤ-β-R. Предпочитаните препарати и методи на това приложение включват комплексите ΕΤ-α1/β2 в присъствието на вещество, активиращо LT-βR. Повече се предпочита комплексите LT-al/ β2 да са в разтворима, отколкото в мембранно свързана форма, а веществото, активиращо LT-β, да бъде IFN-γ.

В друго приложение на изобретението като второ вещество, активиращо ΕΤ-β-R във връзка с хетеромерния комплекс LT-α/β, се използва поне едно антитяло, насочено срещу ΕΤ-β-R (aHTH-LT^-R Ab). Предпочитаните препарати и методи на това приложение се характеризират с ΕΤα1/β2 в присъствието на IFN-γ като първо активиращо вещество и поне едно aHTH-LT^-R Ab като второ вещество, активиращо ΕΤ-β-R. За предпочитане е комплексите LT-al/β2 да са разтворими, а антитялото да бъде моноклонално антитяло (антиίΤ-β-R mAb).

В друго приложение на изобретението се използва поне едно aHTH-LT^-R Ab в присъствието или отсъствието на второ вещество, активиращо ΕΤ-β-R, без екзогенен хетеромерен комплекс LT-α/β. Предпочитаните препарати и методи на това приложение включват в комбинация с IFN-γ поне две aHTH-LT^-R моноклонални антитела (aHTH-LT^-R mAbs), които разпознават неприпокриващи се епитопи в ΕΤβ-R.

В следващо приложение изобретението осигурява фармацевтични препарати и методи за предизвикване туморна клетъчна цитотоксичност, характеризиращи се с кръстосано свързани анти-LT-β-R Abs, използвани в комбинация с второ вещество, активиращо ΕΤ-β-R. В едно предпочетено приложение индивидуални aHTH-LT^-R Abs се имобилизират чрез кръстосаното им свързване върху повърхност. В друго предпочетено приложение анти-LT-β-R Abs са кръстосано свързани с разтвор. За предпочитане е aHTH-LT^-R Abs да са моноклонални антитела и второто вещество, активиращо ΕΤ-β-R, да бъде IFN-γ.

Изобретението представя и нови скринингови методи за селекция на вещества, активиращи ΕΤ-β-R, такива като анти ΕΤ-β-R Abs, които функционират в комбинация с хетеромерни комплекси LT-α/β. Методът използва в цитотоксичен тест повишената чувствителност на човешки аденокарциномни клетки към хетеромерните комплекси LT-α/β в присъствието на вещества, активиращи ΕΤ-β-R. Процедурата, използвана за тестиране на вещества, за които се предполага, че активират ΕΤ-β-R, е илюстрирана за случая с aHTO-LT^-R антитела и включва следните стъпки:

1) Туморни клетки (напр., човешки аденокарциномни клетки НТ29) се култивират няколко дни в среда, съдържаща IFN-γ и пре чистен LT-al/р2 в присъствието или отсъствието на конкретното анти-LT-P-R АЬ, което се тестира;

2) Клетките се обработват с багрило, което оцветява живите клетки;

3) Отчита се броят на оцветените клетки, за да се определи фракцията от туморни клетки, убити в присъствието на LT-al/p2, IFN-γ и тестираното анти-LT-P-R във всяка проба. Като алтернатива може да се определи броят на преживелите клетки, чрез който и да е от поредицата добре познати тестове, които измерват клетъчната преживяемост, такива като включването на Ή-тимидин в ДНК.

Анти-LT-P-R АЬ (или комбинация от АЬ), което значително повишава процента туморни клетки, убити в този тест, представлява вещество, активиращо LT-P-R, което попада в обсега на това изобретение. Този цитотоксичен тест може да се адаптира за идентифицирането на нови вещества, активиращи LT-p-R, които функционират в комбинация с хетеромерните комплекси LT-a/p.

Описание на приложените фигури

Фигура 1А. Анализи на големината на пречистените форми на хетеромерните комплекси LT-a/p, разделени чрез имуноафинитетната хроматография върху JNF-R и LT-P-R. Пречистените белтъци се анализират върху смола за HPLC (високоразделителна течна хроматография) TSK 3000 във физиологичен разтвор, буфериран с фосфат. Показано е мястото на маркерите с различна големина.

Фигура 1В. Йонообменни анализи на пречистени LT-форми при използването на карбоксиметилова колона Poros (4,6 mm х 100 mm) и апарат BioCad (Perceptive Biosystems). От всяка белтъчна проба върху колона се нанасят по 27 g и се елуират с градиент от 0 до 1 М NaCl с 20 обема на колоната при 5 ml/min в буфер, съдържащ 16,66 μΜ Hepes, 16,66 μΜ Na-ацетат и 16,66 μMes-бyφep (pH 6,5).

Фигура 2А. Сравняване на цитотоксичната активност на: mAb CH-11 срещу рецептора за Fas (->-); THF (-О-); LT- - (-□-); LT-al/ Р2 (--); и LT-a2/pi (-♦-) върху човешки аденокарциномни клетки НТ29 в присъствието или отсъствието на 80 E/ml IFN-γ.

Фигура 2В. Сравняване на способността на 5 pg/ml човешки IgG (-<-) и на разтворимите химери рецептор-имуноглобулин p60TNF-R-Fc (-О-) и LT-p-R-Fc (-□-) да инхибират цитотоксичните ефекти във фиг.2А в присъствието на 80 E/ml IFN-γ.

Фигура 3. Анти-LT-p-R mAbs усилват цитотоксичния ефект на LT-al/р2 върху човешки аденокарциномнии клетки НТ29. (А) Цитотоксичните ефекти на LT-al/β2 върху клетките НТ29 се усилват в присъствието на анти-LT-P-R mAb CDH10. Ефектите на LT-al/ р2 се измерват без mAb (-<-) и в присъствието на 0,5 pg/ml контролен IgGl (--), 0,05 pg/ml CDH10 (-О-) и 0,5 pg/ml (-□-) CDH10. (В) Цитотоксичните ефекти на LT-al/р2 върху клетките НТ29 се инхибират от присъствието на анти-LT-p-R mAb BDA8. Ефектите на LTal /р2 се измерват в присъствието на 2 pg/ml контролен IgGl (--) или анти-LT-P-R mAb BDA8 (-□-). Разликата в поведението на антиLT-P-R-mAbs CDH10 и BDA8 в този тест е показание за това, че те са насочени срещу различните епитопи на LT-β-R.

Фигура 4. Имобилизирани анти-LT-P-R mAbs са цитотоксични за човешки аденокарцномни клетки НТ29. (А) Анти-LT-P-R mAbs имат непосредствен цитотоксичен ефект върху клетките НТ29, когато са имобилизирани върху повърхност. Платките са покрити с IgGl (-<-), mAb насочено срещу непосредствен обилно представен клетъчен повърхностен антиген НТ29/26 (--), BDA8 (-О-) и CDH10 (-□-). (L) Ефектите само на разтворимите анти-LTp-R mAbs върху растежа на клетките НТ29. Символите са както в (А). Тези анти-LT-P-RmAbs в своята разтворима форма нямат значителни цитотоксични ефекти върху клетки НТ29, когато се прилагат индивидуално.

Фигура 5. Представително околичествяване на повишената цитотоксичност спрямо туморни клетки при обработка с двойки разтворими анти-LT-P-R mAbs. (А) Цитотоксичните ефекти върху клетки НТ29 на контролен IgGl (100 ng/ml), анти-LT-P-R mAb ВНА10 (100 ml/ml), анти-LT-P-R mAb CBE11 (50 ml/mg) BHA10 (100 ng 1) + IgG (100 ng/ml) и BHA10 (100 ng/ml) + CBE11 (50 ng/ml). IFN-γ присъства в концентрация 80 E/ml. (В) Цитотоксичните ефекти върху клетки НТ29 на контролен IgGl (100 ng/ml), анти-LT-P-R mAb CDH10 (100 ng/ml), анти-LT-p-R mAb CBE11 (50 ng/ml), CDH10 (100 ng/ml) + CBE11 (50 ng/ml), IFN-γ присъства в концентрация 80 Е/ ml. (C). Цитотоксичните ефекти върху клетки НТ29 на контролен IgGl (100 ng/ml), антиLT-P-R mAb CDH10 (33 ng/ml), анти-LT-P-R mAb AGH1 (50 ng/ml) и CDH10(33 ng/ml) +AGH1 (50 ng/ml). IFN-γ присъства в концентрация 80 E/ml. (D) Както в (C) c тази разлика, че в цитотоксичния тест се използват човешки аденокарциномни клетки WiDr (Raitano and Korc, J. Biol. Chem, 256, pp. 10466472 (1990)).

Фигура 6. Големина на туморите в мишки SCID, третирани с анти-LT-P-R mAb. (А) Големина на човешкия аденокарциномен тумор WiDr в мишки SCID 30 дни след инокулирането му съпроводено с третиране с антитяло. На първия и втория ден мишките се третират с физиологичен разтвор, само с IFN-γ, с анти-LT-p-R mAb (СВЕ11) със и без IFN-γ и с контролно античовешко LFA-3 mAb (1Е6) с IFN-γ. Средната стойност за всяка група е посочена с напречна черта. Средните стойности, стандартните отклонения и броят на животните (в скоби) за петте групи (отляво- надясно) са: 0,88 +/0,59 (14), 1,21 +/-0,7 (21),0,041 +-0,052 (16), 0,11 +/-0,1 (12) и 0,98 +/-1,16 (12). (В) Големина на човешкия аденокарциномен тумор WiDr в мишки SCID от 14-ия до 49-ия ден след иноклуирането на туморните клетки при третиране с антитялото 15 дни след инокулирането. Туморите нарастват до среден диаметър 0,53 cm (0,076 сс), без каквото и да е третиране, като интраперитонеалните инжекции (i.p.) започват на 15-ия ден и продължават, както е посочено със стрелките. Средните стойности на стандартните отклонения са посочени за група от 12 животни, третирани само с IFN-γ (1 х 10⁶ Е/инжекция) (-□-), IFN-γ с 50 pg 1Е6 антиLFA-3mAb (-О-), IFN-γ с 50 pg СВЕ11 антиLT-p-R mAb (-Δ-) или само с 50 pg CBE1I анти-LT-P-R mAb (не е показано).

Подробно описание на изобретението

Терминът “противотуморна активност” се отнася до способността на вещество или на препарат да блокира пролиферацията на, или да индуцира смъртта на туморни клетки, които взаимодействат с това вещество или препарат.

Терминът “апоптоза” се отнася до процеса на програмирана клетъчна смърт.

Терминът “цитотоксична активност” се отнася до способността на вещество или пре парат да индуцира смъртта на клетки, които взаимодействат с това вещество или препарат.

Терминът “епитоп” (или антигенна детерминантна) се дефинира като част от молекула, която се комбинира с единично антигенсвързващо място в молекулата на антитяло. Единичен епитоп се разпознава от моноклонално антитяло (mAb). Множествени епитопи обикновено се разпознават от поликлонални антитела (АЬ).

“Fc-доменът” на антитяло се отнася до част от молекулата, която включва СН2, СНЗ и шарнирните области, но не съдържа антигенсвърз вашите места.

Терминът “вещество, индуциращо интерферон” се отнася за всяко вещество, което е способно непосредствено или опосредствено да стимулира ендогенното производство на интерферони от тип I (IFN-a, IFN-β) или от тип II (IFN-γ). Примерите за вещества, индуциращи интерферони, включват молекули двойноверижна РНК, различни растителни или получени по фармацевтичен път съединения.

Терминът “мутеин LT-a“ и “мутеин LTР“ се отнасят за полипептиди LT-a или LT-β, които имат една или повече аминокиселинни промени в сравнение с аминокиселинната последователност на съответния нативен полипептид.

Терминът “вещество, активиращо LT-βR” се отнася за всяко вещество, което може да увеличи свързването на лиганди с LT-P-R, клетъчно повърхностното струпавне на LT-βR или предаването на сигнали посредством LTP-R, или което може да повлияе върху това, как сигналът от LT- R се интерпретира вътре в клетката. Примерите за вещества, активиращи LT-P-R, включват IFN-a, IFN-γ, TNF, вещества, индуцращи интерферони, разтворими антиLT-P-R-Abs, кръстосано свързани анти-LT-PR Abs и мултивалентни анти-LT-p-R Abs.

Терминът “предаване на сигнали посредством LT-P-R” се отнася за всички молекулни реакции, свързани с пътя на LT-p-R и следващите молекулни реакции, които произтичат от него.

Терминът “антитяло срещу рецептора за LT-p“ (“анти-LT-P-R Ab”) се отнася за всяко антитяло, което разпознава и свързва поне един епитоп от рецептора за LT-p.

Терминът “моноклонално антитяло срещу рецептора за LT-β“ (“анти-LT-P-R mAb”) се отнася за всяко моноклонално антитяло, което разпознава и свързва единичен епитоп в рецептора за LT-β.

Терминът “кръстосано свързани (съшити) анти-LT-P-R (m)Abs” се отнася за антитела, насочени срещу LT-p-R, които са или кръстосано свързани едно с друго чрез изполването на вещество за съшиване на антитела (АЬ) или (mAb) срещу LT-P-R, така че да образуват агломерати от антитела в разтвор, или които са имобилизирани в непосредствена близост едно до друго върху повърхност или матрикс.

Терминът “вещество за съшиване на антиLT-P-R-Ab (или mAb) ” се отнася за всяко вещество, което може ковалентно или нековалентно да агрегира анти-LT-p-R Abs в разтвор, така че Abs да могат да се свържат със и да предизвикват струпавне върху прицелната клетъчна повърхност на рецептори за LT-P-R. Подобни съшиващи вещества включват, но не са ограничени до химични съшиващи вещества, втори антитела, които реагират с участъци от анти-LT-P-R Abs или mAbs, както и разтворими или повърхностно свързани рецептори за Fc или ендогенни или екзогенно прибавени - които могат да се свържат с анти-LT-P-R Abs.

Термините “билогична активност на LTа“, “биологична активност на LT-р“ и “биологична активност на LT-α/β” се дефинират като: 1) способност за кръстосана имунологична реакция, с антитяло, насочено срещу поне един епитоп на съответната нативна субединица или комплекс от субединици; или 2) способността на субединицата LT или комплекс от субединици да се конкурира за местата на свързване с лиганди върху LT-специфичен рецептор, такъв като JNF-R или LR-P-R, или 3) способност за стимулиране на имунорегулаторен отговор или цитотоксична активност, качествено сходни с тези, които се стимулират от нативната субединица LT или комплекс.

Терминът “хетеромерен комплекс LT-a/ Р“ се отнася за стабилна групировка от поне една субединица LT-a и повече от една субединици LT-β. Субединиците могат да се свържат посредством електростатични, ван дер Валсови или ковалентни взаимодействия. Предпочита се хетеромерният комплекс LT-a/p да има поне две съединени субединици LT-β и да не съдържа съседни субединици LT-a. Най-предпочитаната стехиометрия на комплекса е LT-al/p2.

Терминът “мултивалентен лиганд” се отнася за молекула или комплекс, които имат повече от едно място за свързване с рецептор и които са способни едновременно да свързват и да привеждат в непосредствена близост поне две рецепторни молекули. “Водеща последователност тип I” представлява амино-терминален участък от еукариотен белтък, който служи като сигнал за насочване на белтъка към мембраната на едноплазматичния ретикулум (ER), а често и през целия секреторен път. Водещата последователност обикновено се отстранява от сигнална пептидаза в мембраната на ER.

“Сигналната последователност” представлява функционален еквивалент на еукариотна водеща последователност тип I в прокариотни гостоприемници и насочва транслокацията на белтъци във или през липидните бислойни мембрани на бактерията.

“Разтворим хетеромерен комплекс LTα/β“ представлява хетеромерен комплекс LTa/p, включващ разтворими субединици LT-β, в които са делетирани или инактивирани аминокиселинните последователности, които локализират полипептида в мембраната, така че субединицата LT-β да се превърне в разтворима. Разтворимите хетеромерни комплекси LT-α/β могат да се секретират от подходяща клетка-гостоприемник, която е конструирана така, че да експресира и двете субединиции.

“Повърхностен комплекс LT-α/β” представлява комплекс, включващ субединиците LT-a и мембранно свързана LT-β, която е разположена върху клетъчната повърхност.

Получаване на мембранно свързани комплекси LT-α/β

Клетъчно повърхностните лимфотоксинови комплекси са охарактеризирани в хибридомни клетки на CD4⁺Т-клетки (II-23.D7), които експресират големи количества LT (Browning et al., J. Immunol., 147, pp. 1230-37 (1991); Androlewicz et al., J.Biol. Chem., 267, pp. 2542-47 (1992)). Зрелият LT-α не съдържа трансмембранен домен и се локализира върху клетъчната повърхност посредством взаимодействие с поне една мембранно свързана субединица LT-β. Мембранно свързаните (повърхностни) хетеромерни комплекси LT-a/p имат стехимометрия предимно LT-al/p2.

LT-β белтък на клетъчната мембрана се свързва с LT-a по време на синтезата, като по този начин насочва LT-α към клетъчната мембрана. В отсъствие на LT-β, LT-a се секретира в извънклетъчната среда. Субединиците LT обикновено се свързват в комплекси вътре в клетката преди белтъчния експорт в мембраната. След като веднъж вече са включени в мембраната, субединиците LT-β не могат да образуват стабилни комплекси със секретиращите се LT-a. Така че, ако желае мембранно свързаната форма на хетеромерен комплекс LTα/β, за предпочитане е желаните субединици LT-a и LT-β да се ко-експресират в една и съща клетка.

Повърхностният хетеромерен комплекс LT-α/β може да се реконструира чрез котрансформация на гостоприемни клетки и с двата гена, за LT-a и LT-β. Повърхностни комплекси LT не могат да се наблюдават върху стабилни клетъчни линии, които експресират само един от гените за LT. Ако обаче гостоприемната клетка нормално произвежда големи количества LT-a (напр., клетки RPMI 1788; виж по-долу), тогава трансфекцията с ген за LT-β, който кодира желания полипептид LT-β, би била достатъчна за получаване на комплекси LT-α/β, включващи пълноразмерни субединици LT-a.

Ко-експресията на полипептидите LT-a и LT-β в редица еукариотни експресионни системи води до тяхното свързване и експорт под формата на активен лиганд (Crowe et. al., J.Immunol. Methods, 168, 79-89 (1994)). Системите от гостоприемници, които могат да се използват, включват, но не са ограничени до, СНО-клетки, COS-клетки, В-клетки, включително миеломни, клетки на насекоми, инфектирани с бакуловирус и дрожди.

Субединицата LT-a на хетеромерните комплекси LT-α/β на това изобретение могат да се изберат измежду лимфотоксин-a, нативен човешки или животински лимфотоксин-a, рекомбинантен лимфотоксин-a, разтворим лимфотоксин-a, секретиращ се лимфотоксин-а, мутиеини на лимфотоксин-a, които имат биологична активност на LT-a или фрагменти на който и да е от горните лимфотоксини-а, имащи биологична активност на LT-a.

Полипептид LT-a може да представлява всяка разтворима форма на молекулата, в това число и активни фрагменти от нея, които могат да се произведат в еукариотни експресионни системи, където ще се отстрани природната водеща последователност на LT-a. Като алтернатива могат да се използват сливания на последователността за зрелия LT-a с хетероложна, сигнална последователност, за да се постигне максимална секреция на LT-a в други системи гостоприемници. В експресионни системи от бозайници е подходящо да се използват нативният сигнал или сигналната последователност на васкуларно-клетъчната адхезивна молекула-1 (VCAM-1).

Полипептидите LT-a могат също така да се слеят с полипептиди, имащи продължителен плазмен полуживот, такива като имуноглобулинови вериги или фрагменти от тях. Плазмените белтъци, които могат да се използват, за да се продължи полуживота в плазмата, включват серумен албумин, имуноглобулини, аполипопротеини и трансферни. Присъединяването на полиетиленгликол (PEG) може да стабилизира полипептида и да понижи неговата имуногенност. Предпочита се слетият белтък LT-a да не бъде значително имуногенен в субекта, който ще се лекува, и плазменият белтък да не причинява нежелателни странични ефекти в субекта вследствие на нормалната си биологична активност.

Човешкият LT-a е гликолизиран при Nи О-остатъците и в зависимост от източника проявява значителна микрохетерогенност на основата на захарния остатък. Олигозахаридният състав определен LT-a, избран за образуване на комплекса LT, може да засегне скоростите на клирънс in vivo (Fukushima et al., Arch. Biochem. Biophys., 304, pp. 144-53 (1993). Доколкото при експресия в различни гостоприемни клетки могат да се получат варианти по гликолизирането, това е един фактор, който трябва да се вземе под внимание при избора на източник на LT-a.

LT-a може да се пречисти от В-лимфобластоидна линия RPMI 1788, която конститрутивно секретира LT-a и която чрез обработка с форболовия естер РМА може да се индуцира към секреция на по-високи равнища (Aggarwal et al., J. Biol.Chem., 259, pp. 686-91 (1984). Като алтернатива клонираният ген за човешки LT-α може да се използва за рекомбинантно производство на полипептиди LT-a в различни системи гостоприемници, в това число бактерии (Schoenfeld et al., J. Biol. Chem., 266, pp. 386369 (1991); клетки от насекоми, инфектирани с бакуловирус (Crowe et. al., J. Immunol. Methods,

168, pp.70-89 (1994)); и клетки от бозайници (Browning and Ribolini, J. Immunol., 143, pp. 1859-67 (1989); Fukushima et al., Arch. Biochem. Biophys., 304, pp. 144-53 (1993)).

Части от гена за LT-α, които кодират полипептидни фрагменти, могат да се оценят за биологична активност на LT-α, като се използват рутинни тестове за скрининг. Полезните тестове за скрининг на биологична активност на LT-a включват тестове на конкурентно инхибиране с нативен LT-a, свързан с TFN-R, или непосредствено или опосредствено измерване посредством инхибиране на способността на LT-a да индуцира цитотоксичност по отношение на туморни клетки в тестове, познати в областта на техниката. Предпочита се фрагментите от LT-a да се свържат в хетеромерни комплекси с LT-β и комплексите да се тестират за биологична активност на LT-α/β чрез конкурентно инхибиране с LT-α/β, свързан с ίΤ-β-R, или за тяхната способност да индуцират цитотоксичност по отношение на туморни клетки в представените тестове.

Лимфотоксин-β, означаван още като рЗЗ, е бил индентифициран върху повърхността на Т-лимфоцити, Т-клетъчни линии, В-клетъчни линии и клетки-убийци, активирани с лимфокини. LT-β е предмет на PCT/US91/04588A, WO 92/00329; и PCT/US993/11669А.

Генът за LT-β кодира полипептид от 240244 аимнокиселини (Browning er al., Cell, 72, pp.847-56 (1993)). LT-β представлява мембранен белтък от тип II с къс N-краен цитоплазмен домен, следван от закотвен в мембраната домен от 30 хидрофобни аминокиселини. Той има единично място за N-свързано гликолизиране и само един цистеинов остатък, който вероятно не участва в образуване на сулфидна връзка между субединиците.

Субединиците LT-β, включващи хетеромерните комплекси LT-α/β на изобретението могат да се изберат измежду лимфотоксин-β, нативен човешки или животински лимфотоксинβ, рекомбинантен лимфотоксин-β, разтворим лимфотоксин-β, секретиращ се лимфотоксин-β, мутеини на лимфотоксин-β, имащи биологична активност на LT-β или фрагменти на който и да е от горните лимφoτokcинβ, имащи биологична активност на LT-β.

Както беше споменато за полипептида LT-a, и полипептидите LT-β могат да бъдат модифицирани чрез същите методи, за да се повиши тяхната разтворимост или плазменият и полуживот. По подобен начин части от гена за LT-β, които кодират полипептидни фрагменти, могат да се оценят за биологична активност на LT-β, като се използват рутинните тестове за скрининг, както бе обсъдено за LT-a.

Получаване на разтворими комплекси

Разтворимите свързани немембранно хетеромерни комплекси LT-α/β включват субединици LT-a, чиято форма е променена от мембранно свързана в разтворима. Тези комплекси са описани подробно в PCT/US91/ 04588А и WO 92/00329. Разтворимите пептиди LT-β се дефинират чрез аминокиселинната последователност на лимфотоксин-β, при което последователността се разкъсва във всяка точка между края на трансмембранната област (т.е. около аминокиселина # 44) и първата област на хомология с TNF (т.е. при аминокиселина # 88) съгласно системата за номериране на Browning et al., Cell, 72, pp. 847-56 (1993).

Разтворими полипептиди LT-β могат да се получат чрез скъсяване на N-края на LT-β, за да се отстранят цитоплазмената опашка и трансмембранната област (Crowe et al., Science, 264, pp. 707-710 (1994). Като алтернатива трансмембранният домен може да се инактивира чрез делеция или чрез заместване на нормално хидрфобните аминокиселини остатъци, изграждащи трансмембранния домен, с хидрофилни такива. И в двата случая се получава съществено хидрофилен хидропатичен профил, който намалява афинитета към липидите и подобрява водоразтворимостта. Делецията на трансмембранния домен се предпочита пред заместването с хидрофилни аминокиселинни остатъци, тъй като се избягва въвеждането на потенциално имуногенни епитопи.

Делетираният или инактивиран трансмембранен домен може да се замести със или да се присъедини към водеща последователност тип I (напр., водещата последователност на VCAM-1), така че белтъкът да се секретира, започвайки с последователност някъде между vail40 и рго88.Разтворимите полипептиди LTβ могат да включват в N-края си която и да е от добре познатите водещи последователности. Подобна последователност би позволила на пептидите да се експресират и насочат към секреторния път в еукариотната система. Виж, напр. Ernst et al. US 5 082 783 (1992).

Разтворими хетеромерни комплекси LTα/β могат да се произвеждат чрез ко-трансфекция на подходяща клетка-гостоприемник с ДНК, кодираща LT-α и разтворим LT-β (Crowe et al., I. Immunol. Methods, 168, pp. 79-89 (1994). Разтворимият LT-β в отсъствието на LT-α силно олигомеризира. Когато обаче се ко-експресира с LT-α, се образува подобна на тример структура от 70 kDa, която съдържа и двата белтъка. Възможно е също така да се получи разтворим хетеромерен комплекс ίΤ-α1/β2 чрез трансфекция на клетъчна линия, която нормално експресира само LT-α, такава като обсъжданите по-горе клетки RPMI 1788) с ген, кодиращ разтворим полипептид LT-β.

Полипептидите LT-a и LT-β могат да се синтезират поотделно, да се денатурират, като се използват меки детергенти, да се смесят и да се ренатурират чрез отстраняване на детергента, така че да се образуват смесени хетеромерни компелкси LT, които могат да се разделят (виж по-долу).

Пречистване на комплексите LT-α,Ι /$2

Разтворимите хетеромерни комплекси LTα1/β2 се отделят от ко-експресираните комплекси с различна стехиометрия на субединиците чрез хроматография, използвайки рецепторите за TNF и LT-β, като реактиви за афинитетно пречистване. Рецепторите за TNF се свързват само с вдлъбнатини α/α върху комплексите LT. Рецепторът за LT-β свързва с висок афинитет вдлъбнатини β/β и с по-нисък афинитет вдлъбнатини α/β върху хетеромерните комплекси LT-α/β. Съответно на това LT-аЗ и υΓ-α2/β1 ще се свързват с TNF-R.LT^-R също може да свързва тримерите ίΤ-α2/β1 (във вдлъбнатината α/β), но не може да свързва LT-аЗ. Освен това ίΤ-β-R (но не и TNF-R) свързва ΕΤ-α1/β2 и LT-βη (точният състав на подобни препарати не е известен, но те представляват големи агрегати).

Реактивите от афинитетни рецептори могат да се получат или като разтворим извънклетъчен домен (за пример виж Loetscher et al., J. Biol.Chem. 266, pp. 18324-29 (1991)), или като химерни белтъци, в които извънклетъчният лиганд-свързващ домен е свързан с имноглобулинов Fc-домен (Loetscher et al., J. Biol. Chem.266, pp. 18324-29 (1991); Growe et al., Science, 264, pp. 707-710 (1994).Рецепторите се свързват c афинитетни матрикси чрез химично съшиване, като се използват рутинни процедури.

Съществуват две схеми, по които лигандът ίΤ-α1/β2 може да се пречисти чрез използване на рецептори и имуноафинитетна хроматография. В първата схема надстоящата течност (супернатанта) от съответната експресионна система, ко-експресираща LT-α и скъсената форма на LT-β, се пропуска през TNFR-колона. TNR-R ще свърже LT-аЗ и тримерите ίΤ-α2/β1. Това, което преминава през TNFR-колоната, без да се задържи, ще съдържа υΓ-β(η) и υΓ-α1/β2.

Във втората схема всички форми, съдържащи LT-β (LT-βίη), ίΤ-α1/β2 и ίΤ-α2/β1) се свързват и елуират от LT^-R-koaoHa чрез използване на класически методи, такива като промяна в хаотропността или pH. (LT-аЗ изтича през тази колона). Елуатът се неутрализира или се отстранява хаотропното вещество, след което елуатът се пропуска през TNF-R-колона, която свързва само тримерите LT-a2/pi. Това, което преминава през тази колона, ще съдържа ίΤ-β(η) и тримери υΓ-α1/β2.

И в двата случая чистите тримери LTα1/β2 могат да се отделят от LT-β чрез следващи процедури на гел-филтрация и/или йонообменна хроматография, известни в областта на техниката.

Като алтернатива различните форми на хетеромерните комплекси LT-α/β могат да се разделят и пречистят чрез различни традиционни хроматографски способи. Може да се окаже за предпочитане да се комбинира серия от схеми на традиционно пречистване с една от стъпките на имунафинитетно пречистване, описани по-горе.

Източник на aHmu-LT-fi-R-anmumena

Серуми с поликлонални антитела насочени срещу рецептора за човешки LT-β, се получават като се използват традиционни техники за подкожно инжектиране на животни, такива като кози, зайци или мишки със слят белтък рецептор за човешки LT-β- Fc (Пример 2) в пълен адювант на Freund, следвано от подсилваща (booster) интраперитонеална или подкожна инжекция в пълен адювант на Freund. Поликлоналните антисеруми, съдържащи желаните антитела които са насочени срещу рецептора за човешки LT-β, се скринират чрез традиционни процедури.

Миши моноклонални антитела (mAbs), насочени срещу слят белтък рецептор за човешки LT-P-Fc, се получават чрез интраперитонеална имунизация на мишки RFB съответно с рекомбинантен слят белтък рецептор за υΓ-β-Fc (LTβ-R-Fc), получен от СНО-клетки и присъединен към сефарозни перли с протеин-А в отсъствието на адювант. Накрая животните се инжектират за подсилване (booster) с разтворими LT-P-RFc (както интраперитонеално (i.p.), така и интравенозно (I.v.)), прави се сливане на далечните клетки чрез използване на класически протоколи и хибридомите се скринират чрез ELISA (ензимно-свързан имуносорбентен тест) (Ling et al., J.Interferon and Cytokine Res., 15, pp.53-59 (1995). Хибридомите допълнително ce скринират за способността им да блокират свързването на активирани хибридомни клетки 11-23 - които експресират повърхностен LT-al/ β2 - с покрити с ΕΤ-β-R-Fc плаки в тест на клетъчно прихващане (cell panning). Чисти mAbs се получават чрез пречистване на IgG от надстоящите течности на хирбидомните култури върху протеин-А-сефароза.

Различни форми на aHTH-LT^-R антитела могат да се направят също така и като се използват стандартни рекомбинатнти ДНК-техники (Winter and Milstein, Nature, 349, pp. 29399 (1991)). Например, могат да се конструират “химерни” антитела, в които антиген-свързващият домен от животинско антитяло се свързва с човешки константен домен (напр., Cabilly et al., US 4 816 567; Morrison et al., Proc, Natl. Acad. Sci. US, 81, pp.6851-455 (1984). Химерните антитела редуцират наблюдаваните имуногенни отговори, които се получават, когато животински антитела се използват за клинично лечение на хора.

Освен това могат да се синтезират рекомбинантни “хуманизирани антитела”, които разпознават LT-β-Κ. Хуманизираните антитела представляват химери, включващи предимно последователности на човешки IgG, в които са включени областите, отговорни за специфично свързване на антигена (напр., WO 94/04679). Животни се имунизират с желания антиген, съответните антитела се изолират като се отстранява участъкът от последователностите на вариабилните области, отговорен за специфичното свързване на антигена. Антиген-свързващите области с животински произход след това се клонират на съответното място в гените за човешки антитела, в които са делетирани антиген-свързващите области. Хуманизираните антитела свеждат до минимум използването на хетероложни (междувидови) последователности в човешките антитела и е по-малко вероятно да предизвикат имунни отговори в лекувания субект.

Може да се извърши също така конструиране на различни класове рекомбинантни анти-ЦГ^-И-антитела, като се направят химерни или хуманизирани антитела, включващи вариабилните области на aHTM-LT^-R и човешки константни домени (CHI, СН2, СНЗ), изолирани от различни класове имуноглобулини. Например, aHTH-LT^-R IgM антитела с повишени валентности на антиген-свързващото място могат да се произведат по рекомбинантен път чрез клониране на антиген-свързващото място във вектори, носещи константните области на човешки -вериги (Arulanandam et al.. J.Exp. Med., 177, pp.1439-50 (1993); Lake et al., Eur. J.Immunol., 22, pp. 2573-78 (1993); Traunecker et al., Nature, 339, pp. 68-70 (1989).

Освен това могат да се използват стандартни рекомбинантни ДНК-техники, за да се променят афинитетите на свързване на рекомбинантните антитела с техните антигени чрез промяна на аминокиселинните остатъци в областта на антиген-свързващите места. Антигенсвързващият афинитет на едно хуманизирано антитяло може да се повиши чрез мутагенеза на основата на молекулно моделиране (Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US., 86, pp. 1002933 (1989); WO 94/04679).

Може да бъде желателно афинитетът на анти-ЦГ^-И Abs за ίΤ-β-R да се повиши или намали в зависимост от типа на парицелната тъкан или от конкретната схема на лечение, която се визира. Например, предимства при полупрофилактично лечение може да има лечението на пациент с постоянни равнища на aHTH-LT^-R Abs с редуцирана способност да предават сигнали посредством пътя на LTβ. Също така aHTH-LT^-R Abs с повишен афинитет за υΓ-β-R могат да бъдат благоприятни за краткотрайни третирания, насочени срещу тумори.

Скриниране на aumu-LT-p-R антитела за вещества, активиращи LT-fi-R

Ahth-LT^-R антителата на това изо10 бретение могат да подсилват противотуморната активност на хетеромерните комплекси LT-α/β (за предпочитане на LT-αΐ/βΙ) в присъствието на вещество, активиращо LT-β-β, такова като IFN-у.Тези aHTH-LT^-R антитела тук се означават също като вещества, активиращи LT-βR. Антителата, които действат като вещества, активиращи ΕΤ-β-R, се селекционират както следва:

1) Серия от тъканнокултурални ямки, съдържащи туморни клетки такива като НТ29, се култивират три до четири дни в среда, съдържаща вещество, активиращо ίΤ-β-R, такова като IFN-y и пречистен хетеромерен комплекс LT-α/β- за предпочитане LT-αΐ/βΙ в присъствието или отсъствието на серийни разредки на aHTH-LT^-R Ab, което се тестира;

2) Към клетъчната смес се прибавя багрило за оцветяване на живите клетки, което установява минохондриална функция, такава като МТТ, и се оставя да реагира няколко часа;

3) Измерва се оптичната плътност на сместа във всяка ямка при дължина на вълната 550 nm (OD 550). OD 550 е обратнопропорционална на броя туморни клетки, убити в присъствието на хетеромерния комплекс LTα/β, на вещество, активиращо LT-β-Κ и на тестираното aHTH-LT^-R АВ във всяка ямка.

Предпочитаните антитла съгласно изобретението, които индивидуално действат като вещества, активиращи ίΤ-β-R в присъствието на ίΤ-α1/β2 и IFN-y, включват ВКА11, CDH10 и BCG6 amn-LT^-R mAbs (таблица 2, по-долу).

Кръстосано свързване на anmu-LT-p-Rантитела

Кръстосано свързаните aHTH-LT^-R антитела на това изобретение действат индивидуално като вещества, активиращи ίΤ-β-R без екзогенни хетеромерни комплекси LT-α/β в присъствието на второ вещество, активиращо LTβ-R, такова като IFN-y. Кръстосано свързаните aHTH-LT^-R Abs явно свързват и индуцират струпване на клетъчно-повърхностните рецептори за LT-β като по този начин активират целенасочено смъртта на клетките чрез рецептора за LT-β.

В едно приложение или повече типове aHTH-LT^-R антитела се свързват кръстосано чрез имобилиазция върху матрикс или повърхност, неразторими във вода. За кръстосано свързване (сшиване) на антителата с водонеразтворимата матриксна подложка или повърхност е приложима дериватизацията с бифункционално вещество. Повсеместно използваните вещества за осъществяване на кръстосано свързване на антителата с водонеразтворима матриксна подложка или повърхност включват 1,1 бис(-диазоацетил)-2-фенилетан, глутаралдехид, N-хидроксисукцинамиден естер, в това число естери с 4-азидосалициловата киселина, хомобифункционални имидоестери, включително дисукцинамидоестери и бифункционални малеимиди, такива като бис-М-малеимиди-1,8октан. Дериватизиращите агенти, такива като метил-3- [ (р-азидофенил) дитио] пропиоимиадат, образуват фотоактивируеми междинни продукти, които могат да се сшият избирателно при стимулиране със светлина. За имобилизиране на белтъците и кръстосано свързване могат да се използват също реактивоспособни водонеразтворими матрикси, такива като въглехидрати, активирани с бромциан, и субстратите, описани в US 3 959 080, US 3 969 2887, US 3 691 016, US 4 195 128, US 4 247 642, US 4 229 537, US 4 055 635 и US 4 330 440.

Повърхностите, към които се присъединяват антителата, могат да бъдат небелтъчни полимери, обикновено хидрофобни полимери от природни или синтетични източници. Могат да се използват хидрофобни поливинилови полимери такива като поливинилакохол (PVA) и поливинилпиролидон (PVP). Приложими са също така полиалкенови етери, такива като полиетиленгликол, полипропиленгликол, полиоксиетиленови естери или метоксиполиетиленгликол, полиоксиалкилени, такива като полиоксиетилен и полиоксипропилен и блокови кополимери на полиоксиетилен и полиоксипропилен (Pluronics); полиметакрилати; карбомери, разклонени или неразклонени полизахариди, които включват захаридните мономери D-маноза, D- и L-галктоза, фукоза, фруктоза, D-ксилоза, L-арабиноза, D-глюкоронова киселина, сиалова киселина, D-глактуронова киселина, D-мануронова киселина (напр., полиамануронова или алгинова киселина), Dглюкозамин, D-галактозамин, D-глюкоза и невраминова киселина, в това число хомополизахаради и хетерополизахариди, такива като лактоза, амилопектин, скорбяла, хидроксиетилскорбяла, амилоза, декстрансулфат, декстран, декстрини, гликоген или полизахаридните субединици на кисели мукополизахариди, например, хиалуронова киселина; полимери на захарни алкохоли, такива като полисорбитол и полиманитол и хепарин или хепарон.

Предпочита се преди образуването на сшивки полимерът да бъде водоразтворим и да съдържа само единична реактивоспособна химична група, за да се избегне образуването на множество сшивки с антитялото. Във всеки случай реакционните условия би трябвало да се оптимизират, за да се редуцира сшиването и да се отделят продуктите - или непосредствено, или чрез следваща гелфилтрация или хроматографска стъпка - имащи значително хомогенен набор от молекулни тегла. Оптималното молекулно тегло на сшитите антитяло-матрикс се определя чрез рутинно експериментиране, като се използват тестовете по цитотоксичност и рецепторно свързване, представени тук.

След сшиването крайният конюгат се предпочита да бъде разтворим във физиологични течности като кръв. Полимерът би трябвало да не е много имуногенен под формата на конюгат и би трябвало да притежава вискозитет, който е съвместим с интравенозно вливане или инжектиране, ако се предвиждат тези начини на приложение.

Полимерът може също да бъде и водонеразтворим. Веществата, които могат да се използват, включват хидрофилни гелове или артикули с определена форма, имащи повърхности, към които антителата могат да се имобилизират, такива като хирургични шлаухи, катетри или дренажни тръбички. Предпочита се използването на твърди подложки, които са биологично съвместими и съществено инертни във физиологично обкръжение. Едно вещество и биологично съвместимо, ако то не стимулира съществено имунологични отговори, включително възпаление и струпване на възпалителни клетки, когато попадне в тялото на даден субект.

Анти-LT-p-R Abs могат също така да се имобилизират върху повърхности, които са ковалентно или нековалентно свързани с второ антитяло, което ще се свърже с първите антиLT-P-R Abs (напр. този антимиши IgG антитела; виж пример 7). Всяко анти-LT-p-R mAb, тестиране индивидуално, когато се имобилизра върху повърхност с второ антитяло, действа като вещество, активиращо LT-P-R в присъствието на

IFN-γ (фиг. 4 и 7).

В едно алтернативно приложение като вещества, активиращи LT-P-R, действат кръстосаносвързани анти-LT-P-R Abs в разтвор. Анти-LT-P-R Abs могат да се свържат кръстосано с помощта на вещество за сшиване на анти-LT-P-R АЬ (или mAb). Съгласно това изобретение вещество за сшиване на анти-LT-PR АЬ (или mAb) е всяко вещество, което е в състояние ковалентно да свързва или нековалентно да агрегира анти-LT-P-R Abs (или mAbs) в разтвор, така че сшитите анти-LT-P-R Abs (или mAbs) да могат да се свържат и да предизвикват струпване на LT-P-R върху повърхността на прицелните клетки. Подобни вещества за сшиване на LT-P-R АЬ (или mAb) включват, но не са ограничени, до химични сшиващи реактиви, чиято реакция с антителата може да се контролира, както е описано погоре. Като алтернатива за образуването на агломерати от анти-LT-P-R Abs в разтвор могат да се използват втори антитела, Сефароза-А, Fc-рецептори или други вещества които ще свържат и агрегират множество първи антиLT-P-R Abs, без да блокират тяхната активност.

Множествени анти-LT-P-R Abs в разтвор действат като вещества, активиращи LT-P-R

Изобретението предоставя препарати, включващи множествени анти-LT-P-R Abs в разтвор, които действат като вещества, активиращи LT-P-R чрез стимулиране на повърхностно струпване на LT-P-R. Могат да се използват поликлонални антитела, насочени срещу различни епитопи на LT-P-R. Предпочита се, антиLT-p-R Abs да са моноклонални Abs, насочени срещу различни при това неприпокриващи се епитопи на LT-p-R.

Комбинираният подход с анти-LT-P-R mAbs за активиране на рецептора за LT-p изисква комбинирането на два неприпокриващи се епитопа. Освен това вероятно продуктивна рецепторна агрегация се постига само с определени епитопи. Ние идентифицирахме присъствието на най-малко четири уникални имунореактивоспособни епитопа върху LT-P-R. Допълнителни епитопи (дефинирани от нови mAbs) могат да се идентифицират като се продължи сливането на далачни клетки от имунизирани мишки, чрез имунизиране на различни видове животни и чрез използването на различни способи за имунизация.

Епитопите могат също така да се кар тират непосредствено чрез определяне способността на различни mAbs да се конкурират за свързване с ίΤ-β-R при използване на хроматографските техники BLAcore (Pharmacia BlAtechnology Handbook, “Epitope Mapping”, Section 6.3.2. (May 1994); виж също Johne et al., J. Immunol. Methods, 160, pp. 191-8 (1993)).

Индивидуалните LT-b-R mAbs могат да се групират в най-малко четири класа според тяхната способност да се кооперират в комбинация с други LT-P-R mAbs за убиване на туморните клетки в цитотоксичните тестове (пример 8; таблица 1). Например, mAb BDA8 от група I не действа в комбинация с mAb AGH1 от група I за предизвикване на цитотоксичност по отношение на туморни клетки. По подобен начин mAbs от група III ВКА11 и CDH10 не проявяват кооперативен ефект в тест на цитотоксичност по отношение на туморни клетки.

Фигури 5А-С показват ефектите от самостоятелното приложение на анти-LT-P-R mAbs и комбинирането им по двойки върху туморните клетки в тестовете по цитотоксичност в присъствието на IFN-y под формата на вещество, активиращо LT-P-R. Анти-LT-P-R mAb от група IV СВЕ11, използвано самостоятелно, има слаб цитотоксичен ефект, който се усилва в комбинация с mAb от група II ВНА10 (фигура 5А). СВЕ11 проявява сходен ефект с mAb от група III CDH10 (фигура 5В).

Цитотоксичността по отношение на туморната клетъчна линия НТ29, причинена от прилагането на комбинация от анти-LT-P-R mAbs, не е някакъв особен случай. Фигура 5С показва, че mAb от група I AGH1 и mAb от група III CDH10 действат синергично в убийството на две различни туморни клетъчни линии (НТ29-клетки и WiDr-клетки), произхождащи от човешки аденокарциномни тумори.

Обобщение на характеристиките на анти-LT-p-R mAbs

Всички анти-LT-P-R mAbs на това изобретение, когато се свържат кръстосано чрез имобилизация, действат като вещества, активиращи LT-P-R в присъствието на второ вещество, активиращо LT-P-R, такова като IFNу. Способността на анти-LT-P-R mAbs да действат като вещества, активиращи LT-p-R в присъствието или отсъствието на LT-al/p2 в разтвор често варира в съответствие със състоянието на клетките по време на теста. Таблица 2 обобщава свойствата на анти-LT-P-R mAbs, характеризирани от това изобретение.

mAbs от група I BDA8 и AGH1 не функционират като вещества, активиращи LTβ-R в разтвор с LT-al/p2. Всъщност mAb BDA8 блокира противотуморния ефект на LT-al/p2 (фигура ЗВ и таблица 2). За разлика от това анти-LT-P-R mAbs от група II BCG6 и ВНА10 имат смесени агонистични и антагонистични ефекти, когато се прилагат с LT-al/p2. АнтиLT-p-R mAbs от група III ВКА11 и CDH10 са уникални в своята способност да действат като вещества, активиращи LT-P-R, които подсилват противотуморните ефекти в присъствието на LT-al/p2 и на второ вещество, активиращо LTR, такова като IFN-y без да проявяват антагонистичните ефекти, които често се наблюдават с mAbs от група II BCG6 и ВНА10.

Важно е да се има предвид, че класификацията на анти-LT-P-R mAbs, основаваща се на тяхната способност да се кооперират в тестовете по цитолиза на туморни клетки, отразява факта, че те взаимодействат с различни епитопи от LT-P-R. mAbs от една и съща група обаче нямат задължително еднакви афинитета на свързване с родствените им епитопи. Ето защо вариращите резултати, които се наблюдават, когато се сравняват ефектите на различни mAbs, принадлежащи към една и съща група, могат да отразяват разликите в афинитетите на свързване. В съответствие с това е възможно да се окаже, че би могло да се изолира mAb от група I или група IV с повисок афинитет на свързване с LT-p-R, което ще функционира като вещество, активиращо LT-P-R в присъствието на LT-al/p2, подобно на mAbs от група III.

Хибридомните клетъчни линии или субклонове от тях, които произвеждат анти-LT-P* R mAbs, описани по-горе, са депозирани на 12 януари 1995 г. в Американската колекция на типовете култури (American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD), съгласно клаузите на Будапещенския международен договор и са отличени с АТСС-депозитни номера, обозначени както следва:

КЛЕТЪЧНА ЛИНИЯ наименование на mAb АТСС-депозитен номер

а)	AG.H1.5.1	AGH1	НВ	11796
Ь)	BD.A8.AB9	BDA8	нв	11798
с)	BC.G6.AF5	BCG6	НВ	11794
d)	ВН.А10	ВНА10	нв	11795
е)	ВК.А11.АС10	ВКА11	нв	11799
f)	СВ.Е11.1	СВЕ11	нв	11793
д)	CD.H10.1	CDH10	нв	11797

Всички ограничения на публичния достъп до горните депозити в АТСС ще бъдат неиз- 15 менно отстранени след издаването на патент на тази заявка.

Анти-LT-p-R lgM моноклоналните антитела функционират като вещества, активиращи LT-p-R 20

Анти-LT-P-R mAbs, които включват повече от обичайните две антиген-свързващи места в IgG, също ще функционират в разтвор като вещества за клетъчно-повърхностно сшиване на LT-P-R и съответно на това ще се вместят в 25 дефиницията за вещество, активиращо LT-P-R съгласно изобретението. Антиген-свързващите места на едно анти-LT-p-R mAb могат да се вградят в молекули lgM - които имат десет антиген-свързващи места - като се използват 30 стандартни рекомбинантни ДНК- и хибридомни техники.

Като алтернатива е възможно чрез техниките на хибридомно сливане след единична имунизация с антиген да се изолират препарати, 35 обогатени на цели миши (или от друго животно) молекули lgM. Един начин за набогатяване на молекули lgM би бил имунизацията на мишки с недостатъчност по сигнализирането посредством CD40 (Kawabe et al., Immunity, 1, pp. 167 - 78 40 (1994; Xu et al., Immunity, l,pp. 423-31 (1994)). Тези мишки не могат ефективно да произвеждат IgG-та и поради това техният отговор на имунизация с антиген е обогатен на изотипове lgM.

Анти-LT-P-R lgM антителата благодарение 45 на повишената си валентност могат ефективно да агрегират молекули LT-P-R в плоскостта на мембраната, като по този начин усилват предаването на сигнали посредством LT-P-R в сравнение със съответните им IgG, които имат две 50 антиген-свързващи места. Драстичен пример на повишената ефикасност на мултивалентните антитела в струпването на рецептори се наблюдава с антитела срещу рецептора за Fas, където формата lgM е много мощна, а нормалните бивалентни IgG-та в разтвор са неефективни (Yonihara and Yonihara, J. Exp. Med., 169, pp. 1747 - 56 (1989); Alderson et al., Int. Immunol., 6, pp. 1799 - 1806 1994)).

По подобен начин mAb apo-1 срещу рецептора за Fas представлява lgG3 mAb. Това mAb е мощно цитотоксично вещество, което агрегира в по-големи поливалентни форми посредством взаимодействия между Fc, уникални за субтиповете lgG3. Отстраняването на Fcобластта води до получаването на F(ab)₂форми, които не могат да се свързват в поголеми агрегати и които са неактивни (Dhein et al., J. Immunol., 149, pp. 3166 - 73 (1992)). Поради това по аналогия се предсказва, че lgM-версиите на анти-LT-P-R mAbs ще представляват мощни противотуморни вещества.

Анти-LR-P-R mAbs инхибират растежа на тумори в мишки

Способността на едно вещество, активиращо LT-p-R, такова като анти-LT-P-R mAb да инхибира растежа на човешки туморни клетки in vitro (пример 6 - 8 и 13) може да бъде показателна за in vivo противотуморогенна активност. Експерименти проведени с имунодефицитни мишки (SCID) показват, че mAb анти-LT-p-R (СВЕ11) може ефективно да блокира образуването на тумори от човешки аденокарциномни клетки WiDr (пример 14; фигура 6). Мишки, подкожно (s.c) инжектирани с клетки WiDr, образуват видими тумори в рамките на две седмици. Когато мишките се третират i.p. (интраперитонеално) с mAb СВ11 по същото време, когато подкожно се инжектират клетките WiDr, порастването на туморите се блокира драстично (фигура 6А). Проти вотуморното действие на анти-LT-P-R mAb СВЕ11 се усилва чрез прибавянето на IFN-g; СВЕ11 обаче, е ефективно и без екзогенен IFN-γ. В групата СВЕ11 + IFN-γ в 7 от 16 животни изобщо липсват тумори, докато останалите животни имат малки възли, които не се развиват до втория месец. Мишките, третирани само с СВЕ11, на 30-ия ден са сходни с групата СВЕ11 + IFN-γ. Мишките обаче, третирани само с СВЕ11, е възможно да развият бавнорастящи тумори. Съществуват статистически достоверни различия между групите СВЕ11 (+/- IFN-γ) и контролните групи (физиологичен разтвор, само IFN-γ и контролно анти-човешко LFA-3 mAb (1Е6) + IFN-γ), но не и достоверни различия между контролните групи. И двете mAbs 1Е6 и СВЕ 11 са lgGl -антитела. mAb 1Е6 се свързва ефективно с туморните клетки, но не блокира туморния растеж. Така че събитията, опосредствани от комплемента или от естествените клетки-убийци, не са единствената база за противотуморната активност на анти-LT-PR mAb СВЕ11.

Ефикасността на mAb СВЕ11 в инхибирането на туморен растеж in vivo в отсъствието на екзогенен IFN-γ е неочаквана дотолкова, доколкото за видими цитотоксични ефекти, основаващи се на LT-p-R, in vitro е налице зависимост от IFN-γ. Или съществува някакво крос-взаимодействие на миши IFN-γ с човешки рецептори за IFN-γ, или in vivo действат други механизми.

Анти-LT-P-R mAb СВЕ11 може също така да инхибира растежа на вече установен тумор в мишки (фигура 6В). Мишки се инжектират подкожно с човешки аденокарциномни клетки WiDr в първия ден и туморите се оставят да се развиват 15 дни (пример 14). Туморите в животни, третирани интраперитонеално само с IFN-γ или с контролното анти-човешко LFA-3 mAb (1Е6) + IFN-γ, продължават да нарастват на големина през периода на 7-седмичния експеримент. За разлика от това туморите, третирани с анти-LT-P-R mAb СВЕ11 (+ IFN-γ или самостоятелно), спират да растат, и след три инжектирания на антитялото СВЕ11 за период от три седмици туморите престават да растат до 49-тия ден след инокулума, когато се прекратява експеримента (фигура 6В).

Тези експерименти показват, че едно анти-LT-P-R mAb, което активира предаването на сигнали чрез LT-p-R, може да инхибира ефективно образуването на тумори в ранните стадии и също да блокира по-нататъшния растеж на туморните клетки в късните стадии на туморогенезата in vivo. Тези експерименти показват също, че прилагането на отделно вещество, активиращо LT-P-R, може да бъде ефективно за лечение или редуциране на напредването, тежестта или ефектите на неоплазия в засегнато животно.

Процедурите, описани в пример 14, могат да се използват за идентифициране на вещества, активиращи LT-P-R съгласно това изобретение, които функционират самостоятелно или в комбинация като инхибират растежа на туморни клетки in vivo. Има се предвид, че и други вещества, активиращи LT-p-R - включващи, но не ограничени до тези, идентифицирани чрез използването на тест за цитотоксичност in vitro по отношение на туморни клетки - могат да имат подобни противотуморни ефекти in vivo, когато се прилагат или самостоятелно, или в комбинация при животни или хора.

Използване на IFN-γ или на други вещества, активиращи LT-p-R

Цитотоксичните ефекти на хетеромерните комплекси LT-α/ρ и на кръстосано свързаните или множествени анти-LT-p-R Abs върху туморни клетки се усилват в присъствието на вещество, активиращо LT-p-R, в частност IFNγ. По-рано беше показано, че човешките аденокарциномни клетки с интестинален произход (НТ29-клетки) са чувствителни към предаването на сигнали посредством FasR (Yonehara and Yonehata, J. Exp. Med., 169, pp. 1747 - 56 (1989)) и към TNF и LT-a в присъствието на IFN- (Browning et al., J. Immunol., 143, pp. 1859 - 67 (1989)).

Количеството вещество, активиращо LTP-R, необходимо за усилване на противотуморната активност на хетеромерните комплекси LT-α/ρ, на анти-LT-b-R Abs или на други вещества, активиращи LT-b-R на това изобретение ще зависи от типа на клетките или тъканите, които се тестират, а също и от начина на третиране, и може да се определи емпирично чрез използване на рутинни процедури. Като се вземат под внимание факторите, изброени по-горе, веществото, активиращо LT-P-R, може да се приложи в концентрация или да се достави при скорост, определени като ефективни при комбинирано приложение с други вещества, активиращи LT-p-R.

Като алтернатива може да се разчита на ендогенни вещества, активиращи ίΤ-β-R, такива като интерферони подобно IFN-γ, които могат да се произведат от клетките или тъканта, заобикалящи прицелните туморни клетки. Ендогенен IFN-γ се произвежда нормално след вирусна инфекция и се открива също в областта на тумори (Dinge et al., Immunity, 1, pp. 447 56 (1994)).

Всяко вещество, което е в състояние да индуцира интерферони, предимно IFN-γ, и което усилва цитотоксичните ефекти на хетеромерните комплекси LT-α/β и на aHTH-LT^-R mAbs върху туморните клетки, попада в групата на веществата, активиращи ΕΤ-β-R на това изобретение. Докато инфекцията с вируси нормално индуцира производството на IFN-γ, то равнищата на ендогенния IFN-γ могат да се повишат от други агенти (пример 10). Например, клинични експерименти са показали индуцирането на интерферон при третиране двойноверижна РНК (dsRNA). В съгласие с това полирибогуанидилова/полирибоцитидилова киселина (poly-rG/ гС), както и други форми на dsRNA са ефективни като интерферонови индуктори (Juraskova et al., Eur. J. Pharmacol., 221, pp. 107 - 11 (1992)).

Интерфероновият стимулатор от Glycyrrhiza glabra (Acharya et al., Indian J. Med. Res., 98, pp. 69 - 74 (1993)), както и фармацевтични вещества, много от които са приложими орално, също могат да се използват за повишаване на ендогенните интерферонови равнища. Подобни интерферонови индуктори включват: имиквимод (Bernstein et al., Antiviral Res., 20, pp. 45 - 55 (1994)); сепарал (Paramonova et al., Vopr. Virusol., 39, pp. 131 - 34 (1994)); арилпиримидони, такива като бропиримин (Onishi and Machida, Hinyokika Kiyo, 40, pp. 195 - 200 (1994)); ридостин (Cheknev et al., Vopr. Virusol., 39, pp. 125 - 28 (1994)).

Някои от тези вещества, индуциращи интерферони, са охарактеризирани като индуктори на интерферони от тип I, такива като IFN0. Интерфероните от тип I също могат да функционират като вещества, индуциращи ΕΤ-β-R, но са по-малко ефективни от IFN-γ.

Приложение на комплекси LT-α/β и на вещества, активиращи ΠΓ-β Κ

Препаратите на това изобретение ще се прилагат в доза, ефективна за лечението на конкретното клинично състояние, за което са предназначени. Определянето на подходящата фармацевтична форма и на ефикасния за лечение дозов режим при дадено приложение е добре познато на специалистите и се прави като се вземат под внимание, например, състоянието и теглото на пациента, степента на желаното лечение и поносимостта на лечението от страна на пациента.

Хората обикновено могат да толерират до 100 - 200 pg/m² TNF, преди изявата на сериозна токсичност (Schiller et al., Cancer Res., 51, pp. 1651 - 58 (1991)). При мишки дозировки в границите от 1 - 5 pg/мишка/ден, прилагани с 5x10* единици рекомбинантен човешки IFNγ, причиняват регресия на първични човешки тумори (Balkwill et al., CIBA Foundation Symposium (1987); Havell et al., J. Exp. Med., 167, pp. 1067 - 85 (1988)). Ha основата на относителната ефективност на TNF и ίΤ-α1/β2 в тестовете по цитолиза на НТ29, терапевтичната дозова граница се оценява на приблизително 5 - 25 pg ЕТ-а1)^2/мишка/ден. При екстраполация към хората, се очаква, че ще са необходими дозировки на ΕΤ-α1/β2 от наймалко 1 mg/m² в комбинация с вещество, активиращо ΕΤ-β-R, такова като IFN-γ.

В исторически план лечението с IFN-γ се е провеждало или с максимално толерираните дози в обхвата от 100 - 250 pg/m², или с “имуномодулиращи” равнища в обхвата от 10-25 pg/m² (виж напр., Koop et al., J. Immunother., 13, pp. 181 - 90 (1993)). При комбинирано лечение с два интерферона са използвани 4х10⁶ единици/т² IFN-α и приблизително 250 pg/m² IFN-γ (Niederle et al., Leuk. Lymphoma, 9, pp. Ill - 19 (1993)). Очаква ce, че междинни дози от около 25 - 100 pg/m² IFN-g в комбинация с хетеромерните комплекси LT-α/β или с пречистените aHTH-LT^-R Abs, описани тук, ще бъдат подходящи изходни пунктове за оптимизиране на лечебните дози.

Приложението на хетеромерните комплекси LT-α/β и на кръстосано свързаните aHTH-LT^-R Abs на това изобретение, в това число на изолирани и пречистени форми на антителата или комплексите, на техни соли или на фармацевтично приемливи техни производни, може да се извърши като се използва някой от традиционно приетите начини на приложение на вещества, които проявяват противотуморна активност.

Фармацевтичните препарати, използвани в тези терапии, също могат да бъдат в различни форми. Тези форми включват, например, твърди, полутвърди или течни форми на дозировките, такива като таблетки, пилюли, прахове, водни разтвори или суспензии, супозитории, както и разтвори за инжектиране или вливане. Предпочитаните форми зависят от начина на приложение, който се предвижда и от терапевтичното предназначение. Начините на приложение могат да включват орално, парентерално, субкутанно, интравенозно, интралезионално или локално приложение.

Хетеромерните комплекси LT-α/β, IFNγ и aHTH-LT^-R Abs могат, например, да се поставят в стерилни изотонични препарати със или без кофактори, които стимулират усвояването или стабилността. Предпочита се препаратът да бъде течен или да бъде лиофилизиран прах. Например, лимфотоксиновите комплекси и/или aHTH-LT^-R Abs и IFN-γ могат да се разредят с буфер, съдържащ 5,0 mg/ml лимонена киселина монохидрат, 2,7 mg/ml тринатриев цитрат, 41 mg/ml манитол, 1 mg/ml глицин и 1 mg/ml полисорбат 20. Този разтвор може да се лиофилизира, да се съхранява в хладилник и да се реконституира преди употреба със стерилна вода за инжекции (UPS).

За предпочитане е също така препаратите да включват традиционни носители, приети във фармацевтиката, които са добре познати (виж за пример Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th Edition, 1980, Mac Publishing Company). Подобни фармацевтично приемливи носители могат да включват други лекарствени вещества, носители, генетични носители, адюванти, ексципиенти, и т.н., такива като човешки серумен албумин или плазмени препарати. Препаратите са предимно под формата на единична доза и обикновено се прилагат веднъж или повече пъти на ден.

Фармацевтичните препарати на това изобретение могат също така да се прилагат като се използват микросфери, липозоми, други системи за доставяне посредством микрочастици или препарати със забавено отделяне, които се поставят във, близо до, или по друг начин във връзка със засегнатите тъкани или кръвния поток. Подходящите примери на носители със забавено отделяне включват полупропускливи полимерни матрикси във вид на артикули с определена форма, такива като супозитории или микрокапсули. Имплантируемите или микрокапсулни матрикси за забавено отделяне включват полилактиди (US 3 773 319; ЕР 58 481), кополимери на L-глутаминовата киселина и гама етил-И-глутамат (Sidam et al., Biopolymers, 22, pp. 547 - 56 (1985)); поли(2-хидроксиетил-метакрилат) или етиленвинилацетат (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15, pp. 167 - 277 (1981); Langer, Chem. Tech., 12, pp. 98 - 105 (1982)).

Липозоми, съдържащи хетеромерни комплекси LT-α/β и/или aHTH-LT-P-R Abs и IFN-γ, могат да се приготвят чрез добре познати методи (виж, напр., DE3 281 12; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, pp. 3688 - 92 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77 pp. 4030 (1980); US 4 485 045 и US 4 544 545). Липозомите обикновено са от малък (около 200 - 800 А ) униламеларен тип, в които липидното съдържание е по-голямо от около 30 % мол. холестерол. Чрез пропорцията на холестерола се контролира оптималната скорост на отделяне на комплекса LT и/или на антиLT-β-R Abs и IFN-γ.

Хетеромерните комплекси LT-α/β и антиίΤ-β-R Abs на това изобретение могат също така да се присъединят към липозоми, съдържащи други вещества, активиращи υΤ-β-R, химиотерапевтични вещества или IFN-γ, за да се допълни IFN-γ, който обикновено се открива в областта на туморите. Присъединяването на комплексите LT и на aHTH-LT^-R Abs към липозомите може да се извърши чрез някое от познатите сшиващи вещества, такива като хетеробифункционални сшиващи вещества, които са широко използвани за свързване на токсини или химиотерапевтични вещества към антитела за целенасочено доставяне. Конюгирането с липозоми може също така да се извърши като се използва реактивът за сшиване на въглехидрати 4- (4-малеимидофенил) хидразид на бутировата киселина (МРВН) (Duzgunes et al., J. Cell. Biochem. Abst. Suppl. 16E 77 (1992)).

Предимства на терапевтичните препарати на основата на активиране посредством антиίΤ-β-R

Едно противотуморно лечение, основаващо се на активирането на ίΤ-β-R би имало някои предимства. ίΤ-β-R се свързва с хетеромерните комплекси LT-α/β с висок афинитет във вдлъбнатините β/β и с по-слаб афинитет с вдлъбнатините α/β, които възникват на гра ницата между съседни субединици LT-α и LT-β. За разлика от това рецепторите за TNF се свързват с хетеромерните комплекси LT-α/β с висок афинитет само във вдлъбнатините а/а. В съответствие с това пречистените комплекси LTα1/β2 свързват с висок афинитет ΕΤ-β-R между съседните субединици LT-β, но не съдържат вдлъбнатини α/α и по този начин не кросактивират предаването на сигнали посредством рецепторите за TNF. Ето защо хетеромерните комплекси LT-α/β на това изобретение няма да стимулират свързаните с TNF възпалителни отговори.

Приложението на LT-al/P2 не активира изменения в ендотелните клетки, свързани с възпалителен отговор, дори при сравнително високи равнища. Поради тази причина при използването на фармацевтичните препарати и методите за лечение чрез активиране на LTβ-R, страничните ефекти вследствие активирането на възпалителните каскади, наблюдавани с TNF, не биха представлявали проблем.

Човешки LT-al/p2 се свързва с миши ΕΤ-β-R също толкова добре, колкото с човешки ΕΤ-β-R. Инжектирането на 100 pg човешки LTαΐ /β2 на мишка не е летално (пример 11), което предполага че стимулирането на ΕΤ-β-R в цялото животно няма да има явната токсичност, наблюдавана в сходни експерименти, в които се опитва активирането на TNF-R с FasR или рбО.

Използването на специфични анти-LTβ-R моноклонални антитела или на комбинации от антитела за отключване на този път при хората може да има някои предимства пред лечението с хетеромерните комплекси LT-α/β. Едно лечение с антирецепторно антитяло ще бъде по-избирателно, отколкото лечението с лиганд. Освен това би било по-лесно да се конструират и произведат в големи количества рекомбинантни форми на aHTH-LT^-R mAbs, отколкото разтворими хетеромерни комплекси LT-α/β.

Взема се предвид, че mAbs или хетеромерните комплекси LT-α/β биха се прилагали на хора с тумори в комбинация с традиционно противотуморно лечение (т.е. облъчване или химиотерапия). Лечението, комбиниращо активиране на ΕΤ-β-R с традиционните химиотерапии, може да обезпечи един допълнителен фактор на противотуморна активност, който с по-голяма вероятност би прочистил пациента от туморогенните клетки, отколкото самостоятелното използване на традиционното противотуморно лечение.

Възможно е още този подход да има сравнително малко странични ефекти, поради което той би могъл да се прилага в полупрофилактичен смисъл при случаи на карциноми, които не са образували метастази, или при пациенти от фамилии, които показват генетично предразположение към определен тип рак.

Следват примерите, които илюстрират хетеромерните комплекси LT-α/β и анти-LTβ-R mAbs на това изобретение, както и методите, използвани за ©характеризирането им. Тези примери не би трябвало да се тълкуват като ограничителни; примерите са включени с илюстративна цел и изобретението се ограничава единствено от претенциите.

Примери за изпълнение на изобретението

Примери 1

Получаване на надстоящи течности, съдържащи форми на LT-α/β, от клетки на насекоми, инфектирани с бакуловирус

Рекомбинантни бакуловируси, кодиращи или пълноразмерната форма на LT-α, или секретиращата се форма на LT-β, се приготвят, както е описано (Crowe et al., Science, 264, pp. 707 - 710 (1994)). Клетки на насекоми (Invitrogen, San Diego, СА.) се инокулират при плътност 2х10⁵ клетки/ml в 7,2 1 среда SF 900II (Gibco) без серум. След 48 h културата достига 1,8х10⁶ клетки/ml и се инфектира със 150 ml (ЗхЮ⁸ PFU/ml) LT-β и 300 ml LT-α бакуловирусни проби. След два дни културата се събира и клетъчните отломки се отстраняват чрез центрофугиране. След прибавянето на EDTA и PMSF (1 mM EDTA и 150 μΜ PMSF крайна концентрация) избистрената надстояща течност се концентрира десет пъти чрез ултрафилтрация при използването на спирален филтър S1YM10 (Amicon). Концентратът се разделя на шест порции от по 120 ml и до пречистването аликвотите се съхраняват при -70°С.

Пример 2

Получаване на разтворими рецептори за LT-β под формата на имуноглобулинова Fcхимера

Извънклетъчният домен на LT-P-R до трансмембранната област се амплифицира чрез

ПВР (полимеразна верижна реакция) от клон кДНК като се използват зародиши, които въвеждат места за рестриктазните ензими Noti и Sali и в 5' и в 3' краищата, съответно (Browning et al., J. Immunol., 154, pp. 33 - 46 (1995)). Амплифицираният продукт се срязва с Noti и Sali, пречиства се и се лигира към вектора pMDR901, линеаризиран с Noti, успоредно с фрагмент Sali-Noti, кодиращ Fc-областта на човешки IgGl. Полученият вектор съдържа дехидрофолатредуктазния ген и химерата LTβ-R-Fc под контрола на различни промотори. Векторът се въвежда чрез електропорация в СНО-клетки dhfr и се изолират клонове, устойчиви на метотрексат, както при стандартните процедури. ΕΤ-β-R-Fc се секретира в средата като за отбор на клетъчни линии, произвеждащи най-големи количества от химерния белтък, се използва ELISA (ензимно-свързан имуносорбентен тест). Култивира се една високопродуктивна клетъчна линия и се събира кондиционираната среда. Чистият белтък се изолира чрез афинитетна хроматография върху протеин-А-сефароза.

Пример 3

Афинитетно пречистване на ίΤ-α1/β2 чрез използване на TNF-R и ίΤ-β-R

С цел получаването на смоли за рецепторно афинитетно пречистване на LT-форми, върху CNBr-сефароза (Pharmacia) се имобилизират пречистени препарати на ίΤ-β-R-Fc (описан тук в пример 2) и на TNF-R p60-Fc (Crowe etal., Science, 264, pp. 707 - 10 (1994)) при концентрация 5 mg/ml смола, следвайки стриктно спецификациите на производителя. Преди използване смолите се прогонват един еулационен цикъл. Порция (120 ml) от концентрата S1Y10 се пропуска през две последователни колони р60 TNF-R-Fc, които свързват LT-α и ίΤ-α1/β2. Преминалият през колоната материал, който съдържа ίΤ-α1/β2 и LT-β, се пропуска през колона LT^-R-Fc. Колоната се промива с 5 обема, всеки включващ PBS, PBS с 0,5 М NaCl и PBS, след което LT-α и комплексите ίΤ-α1/β2 се елуират с 25 тМ натриев фосфат, 100 mM NaCl, pH 3,5. Елуираните фракции веднага се неутрализират с 1/20 обема 0,5 М натриев фосфат, pH 8,6 и се съхраняват на лед. Фракциите, съдържащи белтък, се идентифицират чрез поглъщане при 280 пт, фракциите с максимално поглъщане се обединяват и обединените фракции от ко лоните се анализират чрез SDS-PAGE (електрофореза в денатуриращ полиакриламиден гел) и оцветяване с кумаси (брилянтно синьо). При елуирането, както е описано по-горе, се получават повече от 95 % чист ίΤ-α1/β2.

Пример 4

Характеризиране на пречистените лиганди ίΤ-α1/β2

Чрез гел-изключваща хроматография се анализира големината на белтъците във фракциите от пример 3, за да се определи дали са се образували тримери и дали присъстват агрегати. Използва се колона TSK G3000 sw х 2 при проточна скорост 0,5 ml/min за разделянето по големина на белтъчен стандарт за гел-филтрация на BioRad, както и на тримерите LT-аЗ, ίΤ-α2/β1 и ίΤ-α1/β2.

Фигура 1А показва, че много малко, ако въобще има такива, от тримерите ίΤ-α1/β2 са под формата на високомолекулни агрегати. Сравняването със стандартите за големина показва, че и трите форми са тримерни, т.е. около 50 - 60 kDa. Приемайки, че това са тримери, пространственото разположение (стехиометрията) на LT- спрямо LT- , съдържащи се в пречистените фракции ίΤ-α1/β2 и LTα2/β1, се оценява или чрез денситометрия на теловете, оцветени с кумаси, или чрез анализиране височината на двата пика след разделяне върху обратнофазова С4-колона чрез HPLC. И двете измервания потвърждават идентичността на фракциите, елуирани от афинитетните колони, както е описано по-горе.

Чистотата на препаратите по-нататък се определя чрез йонообменна хроматография, използвайки апаратура на BioCAD за получаване на pH-профилите на ίΤ-α1/β2 и LT-a2/ βΐ върху слаба катионообменна смола при няколко различни буферни системи. Методът, който показва най-голямата способност за пълно задържане и разделяне на трите тримера включва: колона POROS СМ (карбоксиметил), през която при проточна скорост 5 ml/min се пропускат 16,66 mM MES, 16,66 тМ HEPES,

16,66 тМ Na-ацетатен буфер с pH 6,5 и се елуира с 20 обема на колоната градиент на 1 М NaCl. BioCAD-хроматограмите на комплексите ίΤ-α1/β2 и ίΤ-α2/β1 са показани на фигура IB. Всеки тример, LT-аЗ, ίΤ-α2/β! и LT-al/ β2 се елуира при различна солева концентрация като няма данни за замърсяване на фракциите една с друга по-голямо от 1 - 2 % в различните препарати.

Пример 5

Умъртвяване на човешки аденокарциномни клетки НТ29 от разтворими комплекси LT-al/β2

Тестът за цитолиза на НТ29 е описан по-рано (Browning et al., J. Immunol., 143, pp. 1859 - 67 (1989)). Един типичен тест включва серийни разреждания на ίΤ-α1/β2 (и на други цитоксини, когато се прилагат), които се правят в 0,05 ml в 96-ямкови плаки и прибавяне на 5000 трипсинизирани клетки НТ29-14 в 0,05 ml среда, съдържаща от 0 до 80 E/ml (противовирусни единици) човешки IFN-γ. Клетките НТ29-14 са от субклон на оригиналната линия НТ29, получена от АТСС, който е по-хомогенен. В тестовете се използват клетките НТ2914; всички тези резултати могат да се наблюдават също и като се използва оригиналната линия на АТСС НТ29. След 3-4 дни се измерва митохондриалната редукция на багрилото МТТ както следва: прибавят се 10 μΐ МТТ и след 3 h редуцираното багрило се разтваря в 0,09 ml изопропанол с 10 mM НС1 и се измерва оптичната плътност (O.D) при 550 nm. Преди клетките се прибавят разтворими рецепторни форми, приготвени както е описано тук, за да се получи крайна концентрация от 5 pg/ml.

Фигура 2А показва умъртвяването на клетки НТ29 при обработка с mAb срещу рецептора за Fas СН-11 (което стимулира предаването на сигнали посредством FasR); лигандите TNF, LT-аЗ, LT-al/p2 и ίΤ-α1/β2 в комбинация с IFN-γ. Визуална проверка на клетките, обработени с ΕΤ-α1/β2 показва, че това вещество по-скоро убива клетките, отколкото само да блокира клетъчната пролиферация. В отсъствието на IFN-γ не се наблюдават ефекти, което отразява обичайната способност на IFN-γ да повлиява начина, по който клетките интерпретират предаването на сигнали посредством фамилията рецептори TNF. Интерфероните и са 100 пъти по-малко ефективни, отколкото IFN-γ, което се измерва чрез единици противовирусна активност.

Фигура 2В показва инхибирането на умъртвяването посредством LT-al/β2 от разтворима (химера) ΕΤ-β-R-Fc, но не и от р60TNF-R-Fc, което демонстрира, че цитотоксичността е специфична за ΕΤ-α1/β2. Липсата на инхибиране с рбО-TNF-R-Fc посочва, че цитотоксичната активност на ΕΤ-α1/β2 не може да се дължи на примеси от LT-a (за които се знае, че са по-малко от 1 %).

Пример 6

Ahth-LT^-R mAbs усилват умъртвяването на клетки НТ29 от комплексите LT-al/ β2

Цитолитичните тестове се провеждат, както е описано в пример 5 с тази разлика, че IFN-γ и aHTH-LT^-R mAbs (серия 0,01 - 1000 ng/ml) се прибавят към клетките в крайна концентрация 2х, след което към ямките, съдържащи разреден LT-al/β2 се добавят по 50 μΐ от клетъчния разтвор. Растежът се тестира, както е описано в пример 5.

Фигура 3 показва диференциалните ефекти на две awm-LT^-R mAbs, различаващи се по своята способност да усилват цитотоксичната активност на LT-al /β2.

Фигура ЗА показва, че aHro-LT^-R mAbs CDH10 усилва цитотоксичната активност на ίΤ-α1/β2 по начин, зависещ от дозата.

Фигура ЗВ показва ефектите на друго aHTH-LT^-R mAbs, BDA8, в същия тест. BDA8 по-скоро инхибира цитотоксичната активност на ίΤ-α1/β2, отколкото да ускорява смъртта на туморните клетки.

Пример 7

Имобилизирани aHTH-LT^-R mAbs могат да убиват туморните клетки НТ29

Анти-LT- -R mAbs се имобилизират върху пластмасова повърхност като 96-ямкови плаки за тъканни култури се покриват с 50 μΐ 10 mg/ ml козе анти-мише Fc поликлонално антитяло (Jackson ImmunoResearch), промиват се и се блокират с 5 % FCS (фетален телешки серум) в PBS. Следват нанасяне на посоченото антиίΤ-β-R mAb и друга промивка. В ямките, покрити с mAb, се посяват клетки НТ29 и цитолитичните тестове се провеждат, както в пример 5.

Фигура 4А илюстрира цитотоксичните ефекти на имобилизираните aHTH-LT^-R mAbs BDA8 и CDH10 върху клетките НТ29. Всяко mAb индивидуално проявява цитотоксичност спрямо туморните клетки, когато е имобилизирано върху повърхност.

Фигура 4В показва, че същите анти-LTβ-R mAbs, BDA8 и CDH10, тестирани индивидуално, в разтвор не са цитотоксични, поради което цитолитичната активност на отделно aHTH-LT^-R mAb in vitro изглежда е функция от неговата имобилизация.

Пример 8

Комбинирането в разтвор на анти-LT-pR mAbs, насочени срещу различни епитопи, убива клетките НТ29

Растежът на клетките НТ29 се тестира, 5 както е описано в пример 5 с тази разлика, че в растежната среда се инокулират или едно, или две анти-LT-P-R mAbs. Таблица 1 показва ефектите върху НТ29-клетки, когато в разтвор се инокулират различни ίΤ-β-R mAbs (т.е., не имобилизирани върху пластмаса). Анти-LT-pR mAbs могат да се подредят в групи I - IV върху основата на относителната им способност да действат в комбинация едно с друго в цитолитичния тест, ползващ клетките НТ29. Резултатите, получени с анти-LT-P-R mAbs в цитолитичните тестове, са паралелни с данните за рецепторното свързване, което предполага, че mAbs от всяка различна група разпознават различни епитопи на LT-P-R.

Таблица 1.

Комбинациите от разтворими анти-LTβ-R mAbs са цитотоксични за човешки аденокарциномни клетки НТ29. Анти-LT-p-R mAbs се групират в групи I, II, III и IV върху основата на техните ефекти в комбинация едно с друго в тестовете по цитолиза на клетки НТ29. Плюсовете се отнасят за относителното равнище на цитолитичните ефекти на комбинациите от mAb върху клетките НТ29 в присъствието на 80 E/ml IFN-γ. нп = непоказателно; нонеопределяно.

Второ mAb

Група	Първо шАЬ	Г рупа 1 BDA8 AGH1	Г рупа II BCG6 ВНА10	Група III ВКА11 CDH10	Г рупа IV СВЕ11
I	BDA8	НП	-	+	+ -I-	+	но	но
	AGH1	-	нп	+ +	+ + +	+ +	но	но
II	BCG6	+ +		нп	-	+ -Г +	но	но
	ВНА10	+ 4-	+++	-	нп	+	+++	++++
III	ВКА11	+- ·	+ +	+ 4—	но	нп	-	но
	CDH10	+ +	+ +	+ +	+ + +	-	нп	+ + +
IV	СВЕ11	но	4-	+	+f++	нп	++++	нп

Фигури 5А- D отразяват количествено ефектите от включването в теста по цитолиза на НТ29 на представителни комбинации от двойки анти-LT-p-R mAbs, насочени срещу различни епитопи на LT-P-R и имащи кооперативно действие.

Фигура 5А показва цитотоксичните ефекти на ВНА10 и СВЕ11, фигура 5В на

CDH10 и СВЕ11 и фигура 5С на CDH10 и AGH1, поотделно и в комбинация. Фигура 5D показва цитотоксичните ефекти на комбинацията от mAb CDH10 и AGH1 върху друга клетъчна линия, наречена WiDr.

Таблица 2 обобщава характеристиките на представителните анти-LT-p-R mAbs на това изобретение.

с\ co π S < Ю CO ΙОбобщение на цитотоксичността. предизвикана от миши анти-човешки LT-p-R mAbs s

-Q < £

co	CO	»-
CL CL	o	o			м
x	X	X	X	CO	co	w
\o	Ю	Φ	Φ	m	co	-Θ-
x	X	o	o	<	<	Φ
X	X	Φ	Φ	X	X	co
X	X	5	5	□	Q	Φ
X	X	o	Q			Ю

+ +- + +

+ + +· + + +

XI QJ < 5 £ S co c >. Q.

	o
+	+	+	-t-	-u	+	+	I	1	X
+	+	+	+	+	+	+
+	+	+	+	+	+	+
							<4	04	σ\
			o	,—1	o	Г—,	04	-Ч	—
CO	H	kO	r~4	r~f	r—1	r-4	o	CD	04
	X	e>			Ь	W	5- CU	04
Q		o	X	2	Q	m	5 o	H	СЛ
2Q		CQ	CQ	QQ	O	o	o £	X	H
							CL
							1-
					Hd		X
		Hd	н-Ч	t-4	M	>	o
►—1	t-i	ьч	r-d	нЧ	l-i

Пример 9

Оповаване на ендогенния IFN-γ за третиране на туморни клетки

IFN-γ, предпочетено вещество на настоящото изобретение за активиране на LT-p-R, представлява цитокин, който проявява противотуморна активност и който се толерира от хората. Ендогенният IFN-γ, присъстващ в околната среда на тумора, може да бъде в достатъчно висока концентрация, за да функционира като вещество за активиране на LT-p-R на изобретението без добавянето на екзогенен IFNγ. Концентрацията на IFN-γ в околността на тумора може да се повиши чрез използването на стандартни имунохимични техники с тъканни проби от областта на тумора. Ако ендогенната концентрация на IFN-γ е достатъчно висока за осъществяване на противотуморна активност в комбинация с хетеромерните комплекси LTα/р или с анти-LT-P-R mAbs на изобретението (което се определя чрез описаните цитолитични тестове), то в препаратите и методите съгласно изобретението не е необходимо да се прилага IFN-γ като второ вещество за активиране на LT-p-R.

Пример 10

Индукция на ендогенен IFN-γ като вещество, активиращо LT-P-R, за третирането на туморни клетки

Съединенията, които могат да индуцират ендогенното производство на интерферони, такива като IFN-γ попадат в групата на веществата за активиране на LT-p-R на това изобретение. Например, интерфероните могат да се индуцират чрез третиране с двойноверижни молекули РНК, такива като полирибогуанилова киселина/полирибоцитидилова киселина (поли-G/C).

Женски мишки С57Ь16 (на възраст 6-8 седмици) могат да се инжектират с 18 mg (600 mg/kg) D-галактозамин, който може да направи мишките чувствителни към TNF или други противотуморни вещества. Към пречистен LTа1/р2 (10 - 100 pg) се прибавя серия от концентрации на поли-G/C (Juraskova et al., Eur. J. Pharmacol., 221, pp. 107 - 11 (1992)) в не утрален физиологичен разтвор и разтворът се въвежда в мишките чрез интраперитонеална (i.p.) инжекция. Противотуморната активност на ίΤ-α1/β2 ще се усили в присъствието на двойноверижна РНК поли-rG/rC.

По подобен начин на хора интравенозно може да се приложи интерфероновият стимулатор от растението Glycyrrhiza glabra (Acharya et al., Indian J. Med. Res., 98, pp. 69 - 74 (1993)) в дози от 40 до 100 ml/ден. Оптималната доза за активиране на LT-P-R в присъствието на хетеромерните комплекси LT-а/ β или на антиLT-P-R Abs може да се определи емпирично и ще зависи от фактори, такива като типа на тумора, начина на приложение и схемата на приложение.

Като вещества за активиране на LT-p-R в присъствието на хетеромерните комплекси LTα/β, на анти-LT-P-R Abs или на комбинация от тях, могат също така да се приложат имиквимод (Bernstein et al., Antiviral Res., 20, pp. 45 55 (1994)); сапарал (Paramonova et al., Vopr. Virusol., 39, pp. 131 - 34 (1994)); бропиримин (Onishi and Machida, Hinyokika Kiyo, 40, pp. 195 - 200 (1994)); или ридостин (Cheknev et al., Vopr. Virusol., 39, pp. 125 - 28 (1994)). При всеки случай предпочитаните начини на приложение и оптималните дози могат да се определят емпирично като публикуваните съобщения се използват за изходни пунктове на оптимизиране чрез рутинни клинични процедури.

Пример 11

Мишките толерират инжектирания на човешки ίΤ-α1/β2

Женски мишки С57/Ь16 (на възраст 6 8 седмици) аклиматизирани за няколко дни към условията във вивариума се инжектират i.p. с 18 mg (600 pg/kg) D-галактозамин, който прави мишките чувствителни към ефектите на TNF и други противотуморни вещества. Интраперитонеално се въвеждат човешки TNF, LTα ίυΐΗΠΓ-α1/β2.

Таблица 3 документира преживяемостта на третираните мишки 24 h след инжекцията.

Таблица 3
Вещество физ. разтвор	Доза ( pg /животно) П	реживяем: 4/4
човешки TNF	0, 2	0/6
човешки TNF	1-0 5	0/2
човешки TNF	10	0, 4
човешки LT-a	0,2	2/2
човешки LT-a1/p2	1,0	2/2
човешки LT-a1/p2	ίσιο	2/2
човешки ίΤ-α1/β2	100	2/2

Пример 12

Конструиране на рекомбинантно анти-LTβ-R lgM моноклонално антитяло

Като се използват описаните по-горе противотуморни цитотоксични тестове в комбинация с модели за стандартен туморен растеж в имунодефицитни мишки може да се подбере aHTH-LT^-R с подходящи свойства. Могат да се използват универсални зародиши, които хибридизират с всеки от вариабилните домени на тежката и леката верига на избраното антиίΤ-β-R IgG, за да се получи ДНК на вариабилните домени от РНК, изолирана от секретиращата хибридомна клетъчна линия като се използва стандартната методология обратна транскриптаза/ПВР. Тези протоколи са описани (Arulanandam et al., J. Exp. Med., 177, pp. 1439 - 50 (1993); Lane et al., Eur. J. Immunol., 22, pp. 2573 - 78 (1993); Traunecker et al., Nature, 339, pp. 68 - 70 (1989)).

След това амплифицираните продукти се свързват във вектор, съдържащ домените на човешката μ-верига CHI, СН2 и СНЗ. Коекспресията на двете вериги в отделен гостоприемник ще позволи събирането на тежките и леките вериги в пентамерна молекула lgM. Тази молекула представлява химера, съставена от миши вариабилни области, свързани с човешки константни области.

Като алтернатива може да се приложи метод, ползващ ПВР, за амплифициране само на фактически свързващите участъци на вариабилните области. Амплифицираната ДНК след това се включва във вектори, съдържащи всички последователности на човешки IgG с изключение на аминокиселините, които реално участват в свързването на антигена. Такива конструкции се наричат “хуманизирани” анти тела и подробните методи за тяхното получаване са добре известни (напр.- WO 94/04679).

Пример 13

Ahth-LT^-R lgM моноклоналните антитела функционират като вещества, активиращи LT-3-R

Ahth-LT^-R lgM антитела могат да се приготвят в рекомбинантна форма, както е описано в пример 12. Алтернативно като източник на aHTH-LT^-R lgM mAbs могат да се използват цели миши lgMs, изолирани чрез техниката на хибридомно сливане, използвайки единично имунизиране на нормални мишки или продължително имунизиране на мишки с дефицит по предаването на сигнали посредством CD40 (Kawabe et al., Immunity, 1, pp. 167 - 78 (1994)); Xu et al., Immunity, 1, pp. 423 - 31 (1994)).

Ahth-LT^-R lgM mAbs ще са значително по-мощни като вещества, активиращи ΤΤ-β-R, отколкото техните нормални биваленти партньори IgG, както показва сравнителното измерване доза-отговор в теста по цитолиза на НТ29 в присъствието на IFN-γ. Ahth-LT^-R lgM mAbs функционират като вещества, активиращи LTβ-R, както когато са имобилизирани, така и когато се прилагат в разтвор. Освен това ние очакваме, че те ще усилват противотуморната активност на хетеромерните комплекси LT-α/β.

Пример 14

Ahtm-LT^-R моноклоналните антитела инхибират растежа на човешки туморни клетки в мишки SCID

Мишки Balb/c SCID (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) се инжектират c lxlO⁶ трипсинизирани и промити човешки аденокарциномни клетки WiDr в обем от 0,2 ml PBS подкожно (s.c.) в гърба на животното. Инжектираните клетки WiDr образуват тумори в мишките и се отчита способността на анти-LT-P-R mAb да инхибира туморния растеж. В една серия от експерименти мишките се третират със или без анти-LT-P-R mAb СВЕ11 - със или без човешки IFN-γ (10⁶ противовирусни единици/мишка) в същото време, когато s.c. се инокулират клетките WiDr (фигура 6А). Антителата и IFNγ се прилагат заедно чрез i.p. инжекция в 0,2 ml. Контролните мишки се инжектират само с физиологичен разтвор, само с IFN-γ или с контролно анти-човешко LFA-3 mAb (1Е6) с IFN-γ. Големината на всеки образуван тумор се измерва 30 дни след инокулацията. Туморният обем (в сс) се изчислява от радиуса, който се определя чрез измервания на две измерения. Мишките, третирани с СВЕ 11 или 1Е6 mAbs получават 10 pg/мишка или 50 pg/мишка от антитялото (фигура 6А; плътни кръгчета и отворени кръгчета, съответно).

В друга серия от експерименти, мишките се инокулират s.c. с клетки WiDr и туморите се оставят да растат 15 дни преди мишките да се третират с анти-LT-p-R mAb СВЕ11 (фигура 6В). На 15-ия ден (преди третирането с антитяло) средният обем на туморите е 0,076 сс със среден диаметър 0,50 cm. След това се въвежда анти-LT- -R mAb СВЕ11 (50 pg) - със или без IFN-γ (10⁶ противовирусни единици/мишка) чрез i.p. инжекция в 0,2 ml в група от 12 животни. Инжектиранията се повтарят повече от три пъти за период от три седмици. Контролните групи (12 мишки/група) се инжектират само с IFN-γ (10⁶ противовирусни единици/ мишка) или с 50 pg от контролното анти-човешко LFA-3 mAb (1Е6) + IFN-γ (10⁶ противовирусни единици/мишка). Растежът на туморите, присъстващи на 15-ия ден, се следи през цялото време от 15-ия до 49-ия ден след инокулирането на туморните клетки. Резултатите, показани във фигура 6В, са определени в сляп експеримент. Туморите, третирани с mAb СВЕ11, както със, така и без IFN-γ, спират да растат. След три инжекции на mAb СВЕ11 (+/- IFN-γ) за период от три седмици туморният растеж спира за наймалко 7 седмици след инокулума, по което време се прекратява експеримента.

Патентни претенции

Claims (24)

1. Метод за лечение на тумори, характеризиращ се с това, че включва етапа на въвеждане на терапевтично ефективно количество от лимфотоксинов хетеромерен комплекс LT-α/β, при което лимфотоксиновият хетеромерен комплекс LT-α/β се въвежда в присъствието на терапевтично ефективно количество от поне едно вещество, активиращо рецептора за лимфотоксин-β.

2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че лимфотоксиновият хетеромерен комплекс LT-α/β е със стехиометрия ίΤ-α1/β2.

3. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че лимфотоксиновият хетеромерен комплекс LT-α/β представлява разтворим лимфотоксинов хетеромерен комплекс LT-α/β.

4. Метод съгласно всяка една от претенции 1-3, характеризиращ се с това, че субединицата LT-α се избира от групата, състояща се от лимфотоксин-a, нативен човешки или животински лимфотоксин-a, рекомбинантен лимфотоксин-a, разтворим лимфотоксин-а, секретиращ се лимфотоксин-a, мутеини на лимфотоксин-a или активни а-лимфотоксинови фрагменти на всяка от гореизброените молекули.

5. Метод съгласно всяка една от претенции 1 - 3, характеризиращ се с това, че субединицата LT-β се избира от групата, състояща се от лимфотоксин-β, нативен човешки или животински лимфотоксин-β, рекомбинантен лимфотоксин-β, разтворим лимфотоксин-β, секретиращ се лимфотоксин-β, мутеини на лимфотоксин-β или активни β-лимфотоксинови фрагменти на всяка от гореизброените молекули.

6. Метод съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че субединицата LT-β се разкъсва между аминокиселини 44 и 88 и Nкрайният участък се замества с лидерна последователност от тип I.

7. Метод съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че лидерната последователност от тип I представлява лидерната последователност на васкуларно-клетъчната адхезивна молекула 1 (VCAM-1).

8. Метод съгласно всяка една от претенции 1-3, характеризиращ се с това, че лимфотоксиновият хетеромерен комплекс LTα/β се въвежда в присъствието на терапевтично ефективно количество от поне едно вещество, активиращо рецептора за лимфотоксин-β-(LT β-R).

9. Метод за лечение на тумори, характеризиращ се с това, че включва етапа на въвеждане на терапевтично ефективно количество от поне едно вещество, активиращо рецептора за лимфотоксин-β.

10. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че поне едно от веществата, активиращи рецептора за лимфотоксин-β включва терапевтично ефективно количество INF-χ.

11. Метод съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че второ вещество, активиращо рецептора за LT-β включва терапевтично ефективно количество от антитяло срещу рецептора за LT-β.

12. Метод съгласно претенция 11, характеризиращ се с това, че антитялото срещу рецептора за LT-β представлява моноклонално антитяло.

13. Метод съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че моноклоналното антитяло срещу рецептора за LT-β се избира от групата, състояща се от aHTH-LT^-R mAb BKAll, CDH10, BCG6 и BHA10.

14. Метод съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че моноклоналното антитяло срещу рецептора за LT-β е СВЕ11.

15. Метод съгласно претенция 11, характеризиращ се с това, че второто вещество, активиращо рецептора за LT-β включва наймалко две моноклонални антитела срещу рецептора за LT-β, които са насочени срещу неприпокриващи се епитопи на рецептора за LT-β.

16. Метод съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че едното моноклонално антитяло срещу рецептора за LT-β се избира от групата, състояща се от AGH1 и BDA8, а другото моноклонално антитяло срещу рецептора за LT-β се избира от групата, състояща се от BCG6, ВНА10, BKAll, CDH10 и СВЕ11.

17. Метод съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че едното моноклонално антитяло срещу рецептора за LT-β се избира от групата, състояща се от BCG6 и ВНА10, а другото моноклонално антитяло срещу рецептора за LT-β се избира от групата, състояща се от AGH1, BDA8, BKAll, CDH10 и СВЕ11.

18. Метод съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че едното моноклонално антитяло срещу рецептора за LT-β включва СВЕ11, а другото антитяло включва ВНА10.

19. Метод съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че едното моноклонално антитяло срещу рецептора за LT-β включва СВЕ11, а другото антитяло включва CDH10.

20. Метод за лечение на тумори, характеризиращ се с това, че включва етапа на въвеждане на терапевтично ефективно количество от кръстосано свързано антитяло срещу рецептора за LT-β като първо вещество, активиращо рецептора за LT-β в присъствието на второ вещество, активиращо рецептора за LTβ·

21. Фармацевтично средство, характеризиращо се с това, че съдържа терапевтично ефективно количество от поне едно вещество, активиращо рецептора за LT-β.

22. Фармацевтично средство, съгласно претенция 21, характеризиращо се с това, че веществото активиращо рецептора за LT-β, представлява антитяло срещу рецептора за LT-β.

23. Фармацевтично средство, характеризиращо се с това, че съдържа терапевтично ефективно количество от поне едно вещество, активиращо рецептора за LT-β в отсъствие на лимфотоксинов хетеромерен комплекс LT-a/ β·

24. Фармацевтично средство съгласно претенция 23, характеризиращо се с това, че веществото, активиращо рецептора за LT-β съдържа антитяло срещу рецептора за LT-β.