RO118634B1

RO118634B1 - Compozitii farmaceutice pentru activitatea semnalizarii receptorului limfotoxina- beta

Info

Publication number: RO118634B1
Application number: RO97-01398A
Authority: RO
Inventors: Jeffrey L Browning; Werner Meier; Christopher D Benjamin
Original assignee: Biogen Inc
Priority date: 1995-01-26
Filing date: 1996-01-26
Publication date: 2003-08-29
Also published as: FI119359B; AU4970496A; DK0809510T3; KR20040102364A; EA000096B1; PL185364B1; NO973385D0; CN1177302A; JP2007169296A; EE9700255A; KR100470739B1; BR9606808A; CA2211443A1; PL321758A1; CZ298711B6; ES2220972T3; CN1589902A; DE69632681D1; FI973118A0; ATE268604T1

Abstract

Inventia se refera la compozitii pentru activarea semnalizarii receptorului limfotoxina-beta, care in schimb provoaca efecte antiproliferative potentiale asupra celulelor tumorale. Aceasta inventie se refera de asemenea, la complexe heteromerice limfotoxina formate intre limfotoxina-alfa si subunitati multiple ale limfotoxinei-beta, care induc efecte citotoxice asupra celulelor tumorale, in prezenta agentilor care activeaza receptorul limfotoxina-beta. Inventia prezinta anticorpi indreptati impotriva receptorului limfotoxina-beta, care actioneaza ca agenti de activare receptori limfotoxina-beta, singuri sau in combinatie cu alti agenti de activare receptor limfotoxina-beta, in prezenta sau absenta complexelor limfotoxina-alfa/beta.

Description

Invenția se referă la compoziții farmaceutice pentru activarea semnalizării receptorului limfotoxină-β.

Mai precis, această invenție se referă la complexe heteromerice limfotoxină, formate între limfotoxină-α și subunități multiple de limfotoxină-β, care induc efecte citotoxice asupra celulelor tumorale, în prezența agenților care activează receptorul limfotoxinei-β. De asemenea, în întinderea acestei invenții sunt anticorpi orientați împotriva receptorului limfotoxină-β, care acționează ca agenți de activare receptor limfotoxină-β, singuri sau în combinație cu alți agenți de activare receptor limfotoxină-β, fie în prezența, fie în absența complexelor limfotoxină-α/β.

De asemenea, această invenție se referă la compoziții care folosesc anticorpi anti-receptor limfotoxină-β, legați în prezența altor agenți de activare receptor limfotoxină-β, pentru a potența citotoxicitatea față de celula tumorală.

Familia receptor factor necroză tumorală(TNF) are câțiva membri a căror semnalizare poate induce moartea celulei tumorale prin necroză sau apoptoză (moarte celulară programată). Liganzii TNF și limfotoxină-α LT-a; numiți înainte TNF-β) se leagă la receptori TNF activați (p60 și p80; numiți aici “TNF-R”).

Semnalizarea TNF-R inițiază răspunsuri imune generale față de infecție sau stress în celule normale, dar este citotoxică pentru celule cu fenotipuri transformate sau pentru celule tumorale. Semnalizarea TNF-R asupra celulelor tumorale este intensificată prin interferon y(IFN) și printr-o diversitate de agenți chemoterapeutici convenționali.

Este util să se profite de activitățile antiproliferative sau citotoxice, induse prin semnalizarea TNF-R în celule tumorale pentru scopuri terapeutice. Activarea TNF-R are efecte pleiotropice asupra unei diversități de răspunsuri imunoregulatoare, inclusiv asupra inițierii cascadelor proinflamatoare. Astfel, nu a fost posibil să se dirijeze efectele citotoxice ale semnalizării TNF-R spre celule tumorale fără să se stimuleze în același timp răspunsuri inflamatoare, care duc la toxicitate generală la oameni.

în mod similar, stimularea altui receptor înrudit TNF, denumit receptor Fas(FasR), poate declanșa citotoxicitate prin moartea programată a celulelor într-o diversitate de tipuri de celule atât tumorale, cât și netumorale. Totuși, activitatea FasR s-a dovedit a cauza necroza rapidă a ficatului, ajungându-se astfel la concluzia aplicării lui terapeutice la oameni.

Recent, a fost identificat alt receptor din familia TNF, denumit receptorul Ι_Τ-β(Ι_Τ-βR) (Crowe etal., Science, 254, p.707-10(1994)). LT-βΉ leagă complexe heteromerice limfotoxină (LT-βΉ) care cuprind subunități LT-α în asociere cu altă polipeptidă înrudită TNF, denumită limfotoxină β(ίΤ-β). Aceste complexe LT-α/β sunt aociate membranei și majoritatea au o stoichiometrie LT-α/β (Browning et al., Cell, 72, p.847-56(1993); Browning et al., J. Immunol., 154, p.33-46(1995).

Prin analogie la TNF-R și alți receptori asemenea TNF, activarea ίΤ-β-R este considerată a avea loc când multipli receptori de pe suprafața celulei sunt aduși în vecinătatea imediată Crowe et al., Science, 264, p.707-10 (1994)). Acest proces este denumit ca grupare a receptorului. Liganzii TNF și LT sunt complexe multivalente care se pot lega simultan și astfel agregă mai mult decât un receptor. Gruparea receptorului ca un mijloc pentru activarea receptorului în alte sisteme a fost bine documentată, în special pentru receptorul tirozinkinazelor (Ullrich și Schlessinger, Cell, 61, p.302-212(1990); Kolanus et al., Cell, 74, p.171-83,(1993). în conformitate cu aceste studii, administrarea liganzilor ίΤ-α1/β2 și/sau agenților de activare LT-6-R, care poate induce gruparea și semnalizarea în aval a moleculelor LT-6-R pe suprafața celulelor tumorale țintă, ar fi utilă pentru stimularea directă a căii LT-6-R în aceste celule.

RO 118634 Β1 / La fel ca TNF-R, semnalizarea prin LT-p-R, poate activa căile care duc la citotoxicitate și la moartea celulei în celule tumorale. Important este faptul că liganzii LT-a1/p2 nu se leagă TNF-R cu vreo afinitate semnificativă. Pentru acest motiv, activitatea dirijată LT-p-R 50 în celulele tumorale va declanșa citotoxicitate în acele celule, fără stimularea căilor inflamatorii asociate, cu activitate TNF-R; tratamentul cu LT-a1/p2 și/sau cu alți agenți de activare LT-p-R ar fi astfel util pentru tratarea sau reducerea progresării, severității sau efectelor celulelor tumorigenice (neoplazii), depășind în același timp problemele efectului secundar potențial, care au apărut când s-a ales activarea TNF-R sau FasR, ca un tratament anti- 55 tumoral.

Compozițiile conform invenției constau în aceea că, cuprind un complex heterometric LT-α/β și cel puțin unul sau doi agenți de activare LT-p-R, precum și un purtător acceptabil farmaceutic.

Invenția prezintă următoarele avantaje: 60

- complexele heterometrice LT-α/β ale acestei invenții nu stimulează răspunsuri inflamatorii asociate TNF;

- administrarea LT-a1/p2 nu activează schimbări ale celulei endoteliale asociate cu răspunsul inflamator, chiar la niveluri ridicate;

- stimularea LT-p-R pentru animale nu depășește toxicitatea observată când s-au în- 65 cercat experimente similare cu activarea FasR sau p60 TNF-R;

- o terapie anticorp antireceptor va fi mai selectivă decât tratarea cu ligand;

- tratamentul combinat al activării LT-p-R cu chemoterapii convenționale asigură un factor suplimentar în curățarea pacientului de celule tumorale;

- terapia cu astfel de compoziții poate fi făcută într-un sens semiprofilactic, în cazuri 70 de carcinoame nemetastazate sau la pacienții din familii care prezintă o predispoziție genetică pentru un anumit tip de cancer.

Prezenta invenție rezolvă problemele menționate prin asigurarea compozițiilor farmaceutice și metodelor pentru tratarea celulelor tumorale prin stimularea semnalizării LT-P-R fără costimularea răspunsurilor inflamatorii asociate TNF-R. într-o realizare a invenției, sunt 75 asigurate complexe limfotoxină formate între LT-α și subunități multiple la LT-P(complexe heteromerice LT-a/p), care induc efecte citotoxice asupra celulelor care conțin LT-p-R în pre zența unui agent de activare LT-p-R. Mai preferat, complexele LT-a1/p2 sunt într-o formă mai degrabă solubilă decât legată la membrană, și agentul de activare LT-p-R este IFN-y.

în altă realizare a invenției, se folosește cel puțin un anticorp îndreptat împotriva LT- 80 p-R(anti-LT-p-R Ab) ca un al doilea agent de activare LT-P-R în legătură cu complexul LTa/p). Compozițiile și metodele preferate ale acestei realizări sunt caracterizate prin LT-a1/p2 în prezența IFN-γ ca un agent de activare și cel puțin un anti-LT-p-R Ab ca un al doilea agent de activare LT-p-R. Mai preferat, complexele LT-a1/p2 sunt solubile, și anticorpul este un anticorp monoclonal (anti-LT-p-R Ab). 85 în altă realizare a invenției, se folosște cel puțin un (anti-LT-p-R Ab) în prezența sau absența unui al doilea agent de activare LT-p-R, fără un complex heteromeric LT-a/p exogen. Compozițiile și metodele preferate ale acestei realizări cuprind cel puțin 2 anticorpi monoclonali (anti-LT-p-R mAbs) care recunosc epitopi nesuprapuși ai LT-p-R în combinație cu IFN-y. 90 într-o realizare suplimentară a invenției, se asigură compoziții farmaceutice și metode pentru potențarea citotoxicității celulei tumorale, caracterizate prin anti-LT-p-R Abs legați, folosiți în legătură cu un al doilea agent de activare LT-p-R.

într-o realizare preferată a invenției, anti-LT-p-R Abs sunt imobilizați individual prin legarea lor la o suprafață.

RO 118634 Β1

100

105

110

115

120 , 125

130

135

140 într-o altă realizare preferată a invenției, anti-LT-p-R Abs sunt legați în soluție. Mai preferat, anti-LT-P-R Abs sunt anticorpi monoclonali, și al doilea agent de activare LT-p-R este IFN-y. Această invenție asigură în plus un procedeu nou de căutare pentru selectarea agenților de activare LT-p-R, cum ar fi anti-LT-p-R Abs, care funcționează în combinație cu complexe heteromerice LT-α/β pentru a iniția moartea celulei tumorale. Testul face uz de sensiblitatea crescută a celulelor adenocarcinomice umane față de complexe heteromerice LT-α/ρ, în prezența agenților de activare LT-p-R într-un test de citotoxicitate. Procedura folosită pentru testarea agenților probabili de activare LT-p-R este exemplificată pentru cazul anticorpilor LT-p-R și cuprinde următoarele etape:

1) sunt cultivate celule tumorale (de exemplu, celule adenocarcinomice umane HT29) timp de câteva zile, în medii conținând IFN-γ și LT-a1/p2 purificată, în prezența sau absența de anti-LT-P-R Ab particular de testat;

2) celulele se testează cu un colorant care colorează celule vii; și

3) se cuantifică numărul celulelor colorate pentru determinarea fracției celulelor tumorale omorâte în prezența LT-a1/p2, IFN-γ și anti-LT-p-R Ab test din fiecare probă. Alternativ, numărul celulelor supraviețuitoare se poate determina prin oricare dintre numărul de analize binecunoscute, care măsoară viabilitatea celulară, cum ar fi încorporarea ³H-timinei în ADN.

Un anti-LT-p-R Ab (sau o combinație Ab) semnificativ procentul celulelor tumorale omorâte în activare LT-p-R din întinderea acestei invenții. Această analiză citolitică poate fi adaptată pentru identificarea de noi agenți de activare LT-p-R care funcționează în combinație cu complexele heteromerice LT-p-R.

în continuare se prezintă pe scurt fig.1...6, care însoțesc invenția.

Fig.1 A reprezintă analize de mărime a formelor complexe heteromerice LT-p-R purificate, separate de TNF-R și cromatografia de imunoafinitate LT-p-R. Proteinele de purificare s-au analizat pe o rășină TSK 3000 prin metoda HPLC în fosfat tamponat salin. Este prezentată poziția a diverși markeri de mărime.

Fig.1 B reprezintă analize de schimb ionic al formelor LT purificate folosind o coloană carboximetil Poros (4,6mmx100mm) pe un instrument BioCad(Perceptive Biosystems). S-au încărcat 25 pg din fiecare probă de proteină pe o coloană și s-a eluat într-un gradient de la 0 la 1M NaCI pe 20 voi coloană la 5 ml/min într-un tampon conținând 16,66 μΜ Hepes, 16,66 μΜ acetat de sodiu și 16,66 μΜ tampon Mes(pH 6,5).

Fig.2A reprezintă comparația activității citotoxice a: receptorului anti-Fas mAb CH11(-·-); TNF(-o-); LT-a(-D-); LT-a1/p2(-·-); și LT-a2/pi(-f -) asupra celulelor adenocarcinomice umane HT29 fie în prezența, fie în absența a 80 U/ml IFN-y.

Fig.2B reprezintă comparația capacității a 5 pg/ml de IgG uman(-·-); himerele de imunoglobulină solubilă p60TNF-R-Fc(-° ) și receptor LT-p-R-Fc( n-) de a inhiba efectele citotoxice din fig. 2A în prezența a 80 U/ml IFN-y.

Fig.3 prezintă cum anti-LT-p-R mAbs potențează efectul citotoxic al LT-a1/p2 asupra celulelor adenocarcinomice umane HT29.

(A) Efectele citolitice LT-a1/p2 asupra celulelor HT29 sunt potențate de prezența anti-LT-p-R mAb CDH10. Efectele LT-a1/p2 s-au măsurat fără mAb( « ) și în prezența a 0,5 pg/ml control lgG1(-·-), 0,05 pg/ml CDH10(-°~) și 0,5 pg/ml(-D-) CDH10.

(B) Efectele citolitice LT-a1/p2 asupra celulelor HT29 sunt inhibate de prezența antiLT-p-R mAb BDA8(-D-). Diferența dintre comportamentul CDH10 și BDA8 anti-LT-p-R mAbs în această analiză este o indicație că sunt îndreptați spre apitopi diferiți ai LT-p-R.

Fig.4 prezintă cum anti-LT-p-R mAbs imobilizați sunt citotoxici față de celulele adenocarcinomice umane HT29.

(A) Anti-LT-p-R mAbs au un efect citotoxic direct asupra celulelor HT29 când sunt imobilizați pe o suprafață. Plăcile s-au acoperit cu lgG1 (-·-), un mb orientat împotriva unui antigen abundent de suprafață neînrudit, HT29/26(-·-), BDA8(-°-) și CDHIO(-O-).

145

RO 118634 Β1 (B) Efectele anti-LT-p-R mAbs, singuri, asupra creșterii celulelor HT29. Simboluri ca în(A). Acești anti-LT-p-R mAbs în forma lor solubilă nu au efecte citotoxice semnificative asupra celulelor HT29 când se administrează individual.

Fig.5 reprezintă cuantificarea reprezentativă a citotoxicității sporite față de celulele tumorale prin tratare cu perechi de anti-LT-p-R mAbs solubili. 150 (A) Efectele citotoxice asupra celulelor HT29 a controlului lgG1 (100 ng/ml), anti-LTβ-R mAb BHA10(100 ng/ml), anti-LT-p-R mAb CBA11(50 ng/ml), BHA10(100 ng/ml) + lgG(100 ng/ml) și BHA10(100 ng/ml) + CBA10(50 ng/ml). A fost prezent IFN-λ la 80 U/ml.

(B) Efectele citotoxice asupra celulelor HT29 ale controlului IgGl (100 ng/ml), anti-LT- p-R mAb CDH10(100 ng/ml), anti-LT-p-R mAb CBE11(50 ng/ml), CDH10(100 ng/ml) + 155 lgG(100 ng/ml) și CDH10(100 ng/ml) + CBE11(50 ng/ml). IFN-Ă a fost prezent la 80 U/ml.

(C) Efectele citotoxice asupra celulelor HT29 ale controlului lgG1 (100 ng/ml), anti-LTp-R mAb CDH10(33ng/ml), anti-LT-p-R mAb AGH1(50ng/ml), CDH10(33ng/ml) + AGH1 (50ng/ml). IFN-λ a fost prezent la 80 U/ml.

(D) Ca în (C), cu excepția că s-au folosit în analiză citolitică celule adenocarcinomice 160 umane WiDr (Raitano și Korc, J.Biol.Chem., 265, p. 10466-472(1990)).

Fig.6 prezintă mărimea tumorii la șoareci SCID tratați cu un anti-LT-p-R mAb.

(A) prezintă mărimea tumorii adenocarcinomului uman WiDr la șoareci SCID după zile de la inoculare cu un cotratament anticorp. Șoarecii s-au tratat în zilele 1 și 2 cu soluție salină, numai IFN-γ și un control anti-uman LFA-3 mAb(1 E6) cu IFN-γ. 165

Media fiecărui grup este indicată printr-o bară transversală. Mediile, deviațiile standard și numărul animalelor (în paranteze) pentru cele 5 grupuri (stânga la dreapta) au fost: 0,88 ±0,59(14), 1,21±0,7(21), 0,042±0,052(16), 0,11 ±0,1 (12) și 0,98±1,16(12).

(B) prezintă mărimea tumorii adenocarcinomului uman WiDr la șoareci SCID de la la 49 zile după inocularea celulei tumorale cu un tratament de 15 zile postinoculare anti- 170 corp. Tumorile au crescut până la un diametru mediu de 0,53 cm(0,76 cc) fără vreun tratament și injecțiile i.p. au început în ziua 15 și au continuat cum s-a indicat prin săgeți.

Mediile și deviațiile standard sunt indicate pentru un grup de 12 animale tratate fie cu IFN-γ singur (1x10⁶ U/injecție) (-□-), fie IFN-γ cu 50 μ 1E6 anti-LFA-3 mAb(-<>-), fie IFNγ cu 50 μ anti-LT-p-R mAb(-A-), fie 50 pg CBE 11 anti-LT-p-R mAb singur (nu s-a 175 prezentat.

Pentru ca invenția descrisă aici să fie pe deplin înțeleasă, se prezintă semnificația termenilor folosiți.

Termenul “activitate antitumorală” se referă la capacitatea unei substanțe sau compoziții de a bloca proliferarea, sau de a induce moartea celulelor tumorale care interacțio- 180 nează cu substanța sau compoziția.

Termenul “apoptoză” se referă la un proces de moarte programată a celulelor. Termenul “activitate citotoxică” se referă la capacitatea unei substanțe sau compoziții de a induce moartea celulelor care interacționează cu acea substanță sau compoziție.

Termenul “epitop” (sau determinant antigenic) este definit ca parte a unei molecule 185 care se combină cu un singur sit de legare antigen, pe o moleculă anticorp. Un singur epitop este recunoscut de un anticorp monoclonal (mAb). Epitopi multipli sunt recunoscuți în mod normal de anticorpi policlonabili (Ab).

Termenul “domeniul Fc” al unui anticorp se referă la o parte a moleculei care cuprinde CH2, CH3 și regiunile principale, dar căruia îi lipsesc siturile de legare antigen. 190

Termenul “agent de inducere interferon” se referă la orice agent care este capabil de stimulare directă sau indirectă a producerii endogene a interferonilor fie de tip I (IFN-a), fie de tip II (IFN-γ). Exemple de agenți de inducere interferon includ molecule ARN dublu bandă și o diversitate de compuși derivați de la plantă sau farmaceutici.

RO 118634 Β1

Termenii “muteină LT-α” și “muteină LT-β” se referă la polipeptide LT-α sau LT-β, care au una sau mai multe schimbări aminoacide comparat la secvența aminoacidă a polipeptidei native corespondente.

Termenul “agent de activare LT-βΉ” se referă la orice agent care poate mări legarea ligandului LT-β-Η, gruparea LT-β-Η la suprafața celulei sau semnalizarea LT-βΉ, sau care poate influența cum semnalul LT-βΉ este interpretat în celulă. Exemple de agenți de activare LT-βΉ includ IFN-a, IFN-γ, TFN, agenți de inducere interferon, anti-LT-β-Η Abs solubili, anti-LT-β-Η Abs legați și anti-LT-β-Η Abs multivalenți.

Termenul “semnalizare LT-β-Η” se referă la toate reacțiile moleculare asociate cu calea LT-βΉ și reacțiile moleculare subsecvente care rezultă de la acestea.

Termenul “anticorp anti-receptor LT^”(anti-LT^-R Ab) se referă la orice anticorp care recunoaște și se leagă la cel puțin un epitop al receptorului LT-β.

Termenul “anticorp monoclonal anti-receptor LT^”(anti-LT^-R mAb) se referă la orice anticorp monoclonal care recunoaște și se leagă la un epitop al LT-β-Η.

Termenul “anti-LT^-R(m)Abs legați” se referă la anticorpi îndreptați împotriva LT-β-Η care au fost legați, fie la altul, pentru a forma aglomerate anticorp în soluție, folosind un anticorp anti-LT^-R(Ab) sau un agent de legare(mAb), fie care au fost imobilizați în imediata vecinătate la o suprafață sau matrice.

Termenul “agent de legare anti-LT-β-Η Abs(sau mAb)” se referă la orice agent care poate agrega covalent sau necovalent anti-LT-βΉ Abs în soluție, astfel că Abs se poate lega la și potența gruparea receptor LT-β țintă la suprafața celulei. Asemenea agenți de legare includ, dar nu se limitează la, agenți chimici de legare, anticorpi secundari care reacționează cu porțiuni de anti-LT-βΉ Abs sau mAbs și receptori Fc solubili sau legați la suprafață - fie endogen, fie adăugați exogen - care se pot lega la anti-LT-β-Η Abs.

Termenii “activitate biologică LT-α”, “activitate biologică LT-β” și “activitate biologică LT-α/β” sunt definiți ca:

1) reactivitate imunologică încrucișată cu un anticorp orientat împotriva a cel puțin unui epitop al subunității native corespondente sau complex de subunități;

2) capacitatea subunității LT sau complexului de subunități de a concura pentru situri de legare ligand pe un receptor LT-specific, cum ar fi TNF-R sau LT-β-Η;

3) capacitatea de a stimula un răspuns imun de reglare sau activitate citotoxică calitativă, în comun cu o unitate sau complex LT native.

Termenul “complex heteromeric LT-α/β” se referă la o asociere stabilă dintre cel puțin o subunitate LT-α și mai mult decât o subunitate LT-β. Subunitățile se pot asocia prin interacțiuni electrostatice, Van der Waals sau covalent. De preferință, complexul heteromeric LT-α/β are cel puțin LT-β adiacente și lipsa subunităților LT-α adiacente. Mai preferat, complexul are stoichiometrie ίΤ-α1/β2.

Termenul “ligand multivalent” se referă la o moleculă sau complex care are mai mult decât un sit de legare receptor și care este capabil să lege simultan și să aducă în imediată vecinătate cel puțin 2 molecule receptor.

O “secvență lider de tip I” este o porțiune aminoterminală a unei proteine eucariotice care servește ca un semnal pentru a dirija proteina spre membrana reticului endoplasmatic(ER) și adesea în întreaga cale de secreție. De obicei, secvența lider este îndreptată prin clivare printr-o peptidază semnal în membrana ER.

O “secvență semnal” este echivalentul funcțional al unei secvențe lider eucariotice de tipul I în gazde procariotice și dirijează translocarea proteinelor în sau prin membranele lipidice bistratificate, ale unei bacterii.

RO 118634 Β1

Un “complex heteromeric solubil LT-α/β” este un complex heteromeric LT-α/β care cuprinde subunități solubile LT-β, în care secvențele aminoacide care localizează polipeptidă la membrană s-au îndepărtat sau inactivat, atribuind subunității LT-β, calitatea de a fi solubilă. Complexele heteromerice LT-α/β solubile pot fi secretate de către o celulă gazdă corespunzătoare, care s-a prelucrat prin inginerie pentru a exprima ambele subunități.

Un “complex LT-α/β de suprafață” este un complex care cuprinde subunități LT-α și subunități LT-β legate la membrană care este prezentat pe suprafața celulei.

Producerea complexelor LT-α/β legate la membrană

Complexele limfotoxină la suprafața celulei s-au caractetizat prin celulă T CD4⁺, în celule hibridomice(ll-23.D7) care exprimă niveluri ridicate de LT(Browning et al., J.lmmunol., 147, p. 1230-37(1991); Androlewicz et al., J.Biol.Chem., 267, p. 2542-47(1992). LT-α matur pierde un domeniu transmembranar și este localizat la suprafața celulei prin interacțiune cu cel puțin o subunitate LT-β legată la membrană. Complexele heteromerice legate la membrană (suprafață) au permanent stoichiometrie ίΤ-α1/β2.

LT-β, ca o proteină de membrană celulară se leagă la LT-α în timpul sintezei, “țintind” astfel LT-α la membrana celulei. în absența LT-β, LT-α este secretat în mediu extracelular. în mod normal, subunități LT se asamblează în complexe în interiorul celulei, înaintea exportului proteinei în membrană. O dată ce subunități LT-β sunt inserate în membrană, ele nu formează complexe stabile cu LT-α secretat. Astfel, dacă se dorește să se obțină forma legată de membrană a unui complex heteromeric LT-α/β, este de preferat să se coexprime subunități dorite LT-α și LT-β în aceeași celulă. Complexul heteromeric de suprafață LT-α/β se poate reconstrui prin cotransfecția celulelor gazdă cu ambele gene LT-α și LT-β.

Complexe LT de suprafață nu pot fi observate pe linii celulare stabile care exprimă gena LT singură. Totuși, dacă celula gazdă produce în mod normal cantități mari de LT-a (de exemplu, celule RPM11788; vezi mai jos), atunci transfecția cu o genă LT-β care codifică polipeptidă LT-β dorită va fi suficientă pentru a genera complexe LT-α/β care cuprind subunități LT-α de lungime întreagă.

Coexpresia polipeptidelor LT-α și LT-β într-un număr de sisteme de expresie eucariotice duce la asamblarea și exportul lor ca ligand activ (Crowe et al., J. Immunol. Methods., 168, 79-89(1994)). Sistemele-gazdă care pot fi folosite includ dar nu sunt limitate la celule CHO, celule COS, celule B inclusiv mieloame, celule de insectă infectate baculovirus și drojdii.

Subunitatea LT-α a complexelor heteromerice LT-α/β ale acestei invenții poate fi selectată de la limfotoxina-α, limfotoxină-a nativă umană sau animală, limfotoxină-α recombinată, limfotoxină-α solubilă, limfotoxină-α secretată, muteine limfotoxină-α care au activitate biologică LT-α, sau fragmente limfotoxină-α ale oricărei substanțe de mai sus care are activitate biologică.

Polipeptidă LT-α poate fi orice formă solubilă a moleculei, care include fragmente active ale acesteia, ce se pot produce în sisteme de expresie eucariotice din care secvența lider LT-α naturală va fi îndepărtată prin clivare. Alternativ, se pot folosi fuziuni ale secvenței LT-α mature, cu o secvență heteroloagă semnal, pentru maximizarea secvenței LT-α în alte sisteme-gazdă. Semnalele sunt alese în funcție de gazda care se intenționează să fie folosită și pot include secvențe bacteriene, virale de drojdii, și mamifere. Secvența semnal nativă sau secvența semnal molecula-1, de aderență celulă vasculară (VCAM-1) este potrivită pentru utilizare în sisteme de expresie mamifere.

De asemenea, polipeptidele LT-α pot fi fuzionate la polipeptide care au un timp de înjumătățire plasmatică prelungit, cum ar fi catenele de imunoglobuline sau fragmente ale lor. Proteinele plasmatice care se pot folosi pentru sporirea duratei de înjumătățire plasmatică includ albumină serică, imunoglobuline, apolipoproteine și transferină. Atașarea polietilenglicolului (PEG) poate stabiliza polipeptidă și să scadă imunogenitatea sa.

245

250

255

260

265

270

275

280

285

290

RO 118634 Β1

De preferință, proteina de fuziune LT-α nu este imunogenică semnificativ în subiectul de tratat, și proteina plasmatică nu produce efecte secundare nedorite la subiecți, datorită activității sale biologice normale.

LT-α umană este glicozilată pe resturile N și O, depinzând de sursă, și prezintă microheterogenitate considerabilă, bazată pe zahăr. Compoziția oligozaharidică a LT-α particulare alese pentru formarea complexului LT poate afecta ratele de epurare in vivo (Fukushima et al., Arch. Biochem. Biophys., 304, p. 144-53(1993)). Deoarece glicozilarea variantelor se poate produce prin expresie în diferite celule gazdă, acest fapt constituie un factor care trebuie luat în considerare în alegerea unei surse de LT-a.

LT-α poate fi purificat de la o linie limfoblastoidă B RPMI 1788, care secretă constitutiv LT-α și care poate fi indusă să secrete niveluri mai crescute prin tratare cu esterul forbol PMA(Aggarwal et al., J. Biol. Chem., 266, p. 3863-69(1991)); celulă de insectă infectată baculovirus (Crowe et al., J. Immunol. Methods, 168, p. 70-89 (1994); și celule de mamifere (Browning și Ribolini, J. Immunol., 143, p. 1859-67 (1989); Fukushima et al., Arch. Biochem. Biophys., 304, p. 144-53 (1993)).

Porțiuni ale genei LT-α care codifică fragmentele polipeptidice ce au activitatea biologică LT-α se pot evalua folosind analize de căutare de rutină. Analizele de căutare utile pentru activitatea biologică a LT-α includ analize de inhibare competitivă cu LT-α nativă legată la TNF-R sau măsurare fie direct, fie indirect prin inhibiția capacității LT-α de a induce citotoxicitatea celulelor tumorale în analize cunoscute în domeniu.

De preferință, fragmentele LT-α sunt asamblate în complexe heteromerice cu LT-β și complexele sunt analizate pentru activitate biologică, LT-α/β prin inhibare competitivă cu LT-α/β legat la ίΤ-β-R sau capacitatea lor de a induce citotoxicitatea celulelor tumorale în analizele descrise aici.

Limfotoxina-β denumită de asemenea, p33, s-a identificat pe suprafața limfocitelor T, linii celulare T, linii celulare B și celule ucigașe activate limfotoxină. LT-β este subiectul cererilor internaționale în curs de rezolvare ale solicitantului PCT/US91/04588, publicată pe 9 ianuarie 1992 ca WO 92/00329; și PCT/US93/1169, publicată pe 23 iunie 1994 ca WO 94/13808 și care sunt încorporate aici ca referințe.

Gena LT-β codifică o polipeptidă de 240-244 aminoacizi (Browning et al., Cell, 72, p. 847-56 (1993)). LT-β este o proteină de membrană cu un domeniu citoplasmatic N-terminal scurt, urmată de un domeniu de ancorare la membrană de 30 aminoacizi hidrofobi. Are un singur sit de glicozilare N-legat și are numai un rest cisteină care nu pare a fi implicat în formarea punții difulfurice intersubunitate.

Subunitățile LT-β care cuprind complexele heteromerice LT-α/β ale prezentei invenții pot fi selectate de la limfotoxină-β, limfotoxină-β nativă umană sau animală, limfotoxină-β recombinantă, limfotoxină-β solubilă, limfotoxină-β secretată, muteine limfotoxină-β care au activitate biologică LT-β sau fragmente limfotoxină-β ale oricăreia de mai sus care au activitate biologică.

Așa cum s-a discutat mai sus pentru polipeptidă LT-β, polipeptidele LT-β pot fi, de asemenea, modificate, pentru creșterea solubilității sau duratei lor de înjumătățire plasmatică, folosind aceleași metode. în același mod, porțiuni ale genei LT-β, care codifică fragmente polipeptidice care au activitate biologică LT-β, pot fi evaluate folosind analize de căutare de rutină, cum s-a discutat pentru LT-β.

Producerea complexelor solubile

Complexele heteromerice LT-α/β solubile (nelegate la membrană) cuprind subunități

LT-β care s-au schimbat de la o formă legată la membrană la o formă solubilă. Aceste complexe sunt descrise în detaliu în cererea internațională a solicitantului (PCT/US93/11669,

RO 118634 Β1 publicată pe 9 ianuarie 1992 ca WO 94/13808). Peptidele LT-β solubile sunt definite prin secvența aminoacidă a limfotoxinei-β, în care secvența este clivată la orice punct dintre capătul regiunii transmembranare (adică la aproximativ aminoacidul # 44) și prima regiune de omologie TNF (adică la aminoacidul # 88) conform sistemului de numerotare al lui Browning et al., Cell, 72, p. 846-56 (1993).

Polipeptidele LT-β solubile pot fi produse prin scurtarea N-terminusului lui LT-β pentru îndepărtarea cozii citoplasmatice și regiunii transmembranare (Crowe et al., Science, 264, p. 707-710 (1994). Alternativ, domeniul transmembranar poate fi inactivat prin deleție sau prin substituția resturilor aminoacide normale hidrofobe care cuprind un domeniu transmembranar cu unul hidrofil. în oricare caz, se creează un profil hidropatic substanțial hidrofil, care va reduce afinitatea lipidică și va îmbunătăți solubilitatea apoasă. Deleția domeniului transmembranar este preferată față de substituția cu resturi aminoacide hidrofile, deoarece evită introducerea epitopilor potențial imunogenici.

Domeniul transmembranar, deletat sau inactivat, poate fi înlocuit cu, sau atașat la o secvență lider de tip I (de exemplu, liderul VCAM-1), astfel că proteina este secretată începând cu o secvență de oriunde dintre val140 la pro88. Polipeptidele LT-β solubile pot să includă la N-terminal oricare dintre numeroasele secvențe binecunoscute. O asemenea secvență va permite peptidelor să fie exprimate și îndreptate spre calea de expresie într-un sistem eucariot. Vezi, de exemplu, Ernst et al., brevet US 5082783 (1992).

Complexele heteromerice LT-α/β solubile pot fi produse prin co-transfectarea unei celule gazdă corespunzătoare cu ADN care codifică LT-α și LT-β solubilă (Crowe et al., J. Immunol. Methods, 168, p. 79-89 (1994). LT-β solubilă secretată în absența LT-α este puternic oligomerizată. Cu toate acestea, când se coexprimă cu LT-α se formează o structură de 70 kDa like-trimerică care conține ambele proteine.

De asemenea, este posibil să se producă complexe heteromerice ίΤ-α1/β2 solubile prin transfectarea unei linii celulare care, în mod normal, exprimă numai LT-α (cum ar fi celulele RPM 1788 discutate mai sus) cu o genă care codifică o polipeptidă LT-β solubilă.

Polipeptidele LT-α și LT-β se pot separa, sintetiza, denatura, folosind detergenți blânzi, amestecate împreună și renaturate prin îndepărtarea detergentului pentru a forma complexele heteromerice LT amestecate, care se pot separa (vezi mai jos).

Purificarea complexelor Ι_Τ-α1/β2

Complexele heteromerice ίΤ-α1/β2 solubile sunt separate de la complexele coexpresiei, care cuprind o subunitate diferită stoichiometric prin cromatografie, folosind receptori TNF și LT-β ca reactivi de purificare prin afinitate. Receptorii TNF se leagă numai în fantele α/α ale complexelor LT. Receptorul LT-β se leagă cu afinitate ridicată la fantele β/β și se leagă cu afinitatea mai redusă la fantele α/β ale complexelor heteromerice LT-α/β.

în conformitate, LT-a3 și ίΤ-α2/β1 se vor lega la TNF-R. De asemenea, LT-β-Ρ poate lega trimerii ίΤ-α2/β1 (în fantele α/β), dar nu leagă LT-a3. în plus, ίΤ-β-R (dar nu TNF-R) leagă ίΤ-α1/β2 și LT-βη (compoziția exactă a unui astfel de preparat este necunoscută, cu toate că ele sunt agregate mari).

Reactivii receptorului de afinitate se pot prepara fie ca un domeniu extracelular solubil (vezi de exemplu, Loetscher et al., J. Biol. Chem., 266, p.18324-29 (1991)), fie ca proteine himerice cu domeniul extracelular de legare ligand cuplat la un domeniu Fc imunoglobulină (Loetscher et al., J. Biol. Chem., 266, p.18324-29 (1991); Crowe et al., Science, 264, p. 707-710 (1994)). Receptorii sunt cuplați la matrici de afinitate prin legare chimică, folosind proceduri de rutină.

Există 2 scheme prin care ligandul ίΤ-α1/β2 se poate purifica folosind receptori și cromatografia de imunoafinitate.

340

345

350

355

360

365

370

375

380

385

RO 118634 Β1 în prima schemă, un supernatant de la un sistem de expresie corespunzător care coexprimă atât forma LT-α, cât și forma scurtată LT-β se trece pe o coloană TNF-R. TNF-R va lega LT-a3 și trimeri Ι_Τ-α2/β1. Ceea ce curge prin coloana TNF-R va conține Ι-Τ-β(η) și ίΤ-α1/β2.

în a doua schemă, toate formele care conțin LT-β (ίΤ-β(η), ίΤ-α1/β2 și ίΤ-α2/β1) sunt legate și sunt eluate dintr-o coloană LT-6-R folosind metode clasice, cum ar fi chaotropia sau schimbul de pH (LT-a3 curge prin această coloană). Eluatul se neutralizează sau se îndepărtează chaotropic și se trece apoi pe o coloană TNF-R, care leagă numai trimerii ίΤ-α2/β1. Curgerea prin această coloană va conține ίΤ-β(η) și trimeri LT-αΙ/βΙ.

în ambele cazuri, trimerii ίΤ-α1/β2 se pot separa de LT-β prin filtrare prin gel în continuare și/sau proceduri cromatografice de schimb ionic, cunoscute în domeniu.

Alternativ, diferite forme ale complexelor heteromerice LT-α/β se pot separa și purifica printr-o diversitate de mijloace cromatografice convenționale. De asemenea, poate fi de preferat să se combine o serie de scheme de purificare convenționale, cu una dintre etapele de purificare prin imunoafinitate, descrise mai sus.

Sursa de anticorpi anti-LT-fi-R

Serurile de anticorp policlonal îndreptate împotriva receptorului LT-β uman sunt preparate folosind tehnici convenționale, prin injectarea subcutanată a animalelor, cum ar fi capre, iepuri sau șoareci, cu proteina de fuziune receptor LT^-uman-Fc (exemplul 2) în adjuvant Freund complet, urmată de injectare rapel intraperitoneal sau subcutanat în Freund complet. Antiserurile policlonale care conțin anticorpii doriți și care sunt îndreptate împotriva receptorului LT-β sunt căutate prin proceduri convenționale.

Anticorpii monoclonali de șoarece (mAbs) îndreptați împotriva unei proteine de fuziune receptor LT-β uman-Fc sunt preparați prin imunizare intraperitoneală repetată a șoarecilor RBF cu o proteină de fuziune recombinantă receptor LT-6-Fc (LT^-R-Fc), derivată de la celulă CHO atașată la bile de proteină A sepharoză, în absența adjuvantului.

în final, animalele sunt rapelate cu LT-6-R-Fc (atât i.p., cât și i.v.), celulele splenice sunt folosite utilizând protocoale clasice, iar hibridoamele sunt cercetate prin ELISA (Ling et al., J. Interferon and Cytokine Res., 15, 53-59 (1995)). Hibridoamele sunt cercetate ulterior pentru capacitatea lor de a bloca legarea celulelor hibridomice II-23 activate, care exprimă ίΤ-α1/β2 de suprafață, la plăci acoperite LT-p-R-Fc într-o analiză de translatare celulară. mAbs puri sunt preparați prin purificarea de proteină A sepharoză a IgG din supernatante ale culturii de hibridomi.

Diverse forme ale anticorpilor anti-LT-p-R se pot obține de asemenea, folosind tehnici ADN recombinant standard (Winter și Milstein, Nature, 349, p.293-99 (1991)). Se pot constitui, de exemplu, anticorpi himerici'' în care domeniul de legare antigen, de la un anticorp animal se leagă la un domeniu uman constant (de exemplu, Cabilly et al., US 4816567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, p. 6851-55 (1984)). Anticorpii himerici reduc răspunsurile imunogenice observate, provocate de anticorpii animali care s-au folosit în tratamentele clinice umane.

Suplimentar, pot fi sintetizați anticorpi umanizați recombinanți, care recunosc LTβ-R. Anticorpii umanizați sunt himere care cuprind în majoritate secvențe IgG umane în care s-au inserat regiunile responsabile pentru legare antigen specifică (de exemplu, WO 94/04679).

Animalele sunt imunizate cu antigenul dorit, anticorpii corespondenți sunt izolați și porțiunea secvențelor regiunilor variabile, responabilă pentru legarea antigen specifică, se îndepărtează. Regiunile de legare antigen, derivate de la animal, sunt apoi donate în poziția corespunzătoare a genelor anticorp uman, în care regiunile de legare antigen au fost îndepărtate. Anticorpii umanizați reduc folosirea secvențelor heteroloage (inter-specii) în anticorpi umani și sunt mai puțin probabile să provoace răspunsuri imune la subiectul tratat.

R0118634 Β1

440

Construcția diferitelor clase de anticorpi recombinanți anti-LT-p-R și domeniile constante umane (CH1, CH2, CH3) sunt izolate de la diferite clase de imunoglobuline. De exemplu, anticorpi anti-LT-p-R IgM cu valențe crescute ale sitului de legare antigen pot fi produse recombinant, prin donarea sitului de legare antigen în vectori care conțin regiunile constante ale catenei μ umane (Arulanandam et al., J. Exp. Med., 177, p. 1439-50 (1993); Lane et al., Eur. J. Immunol., 22, p.2573-78 (1993); Traunecker et al., Nature, 339, p. 68-70 (1989)).

Suplimentar, tehnicile ADN recombinant standard se pot folosi pentru modificarea afinităților de legare a anticorpilor recombinanți cu antigenii lor, prin modificarea resturilor aminoacide din vecinătatea siturilor de legare antigen. Afinitatea de legare antigen a unui anticorp umanizat poate fi crescută prin mutageneză bazată 1pe modelare moleculară (Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, p.10029-33 (1989); WO 94/04679).

Poate fi de dorit să se crească sau să se descrească afinitatea anti-LT-p-R Abs pentru LT-Ș-R depinzând de tipul de țesut țintit sau schema particulară de tratament avută în vedere. De exemplu, poate fi avantajos să se trateze un pacient cu niveluri constante de antiLT-p-R Abs, pentru tratamente semiprofilactice. în mod asemănător, pot fi avantajoși antiLT-p-R Abs cu afinitate crescută LT-p-R pentru tratamente de scurtă durată, care țintesc tumora.

Căutarea anticorpilor anti-LT- β-R pentru agenți de activare Ι,Τ-β-R

Anticorpii anti-LT-β-R ai acestei invenții pot potența activitatea antitumorală a complexelor heteromerice LT-α/β (de preferință, LT-a1/p2) în prezența unui agent de activare, cum ar fi IFN-γ. Acești anticorpi anti-LT-p-R denumiți, de asemenea, până aici, ca agenți de activare LT-p-R, sunt selectați după cum urmează:

1) o serie de godeuri de cultură de țesut care conțin celule tumorale precum HT29 s-au cultivat 3 până la 4 zile în medii care conțin un agent de activare LT-p-R cum ar fi IFN-γ, și s-a purificat complexul heteromeric LT-α/β, de preferință LT-a1/p2, în prezența sau absența diluțiilor seriale ale anti-LT-p-R Ab de testat;

2) s-a adăugat la amestecul de celule și s-a reacționat câteva ore o colorație vitală cum ar fi MTT, care măsoară funcția mitocondrială;

3) densitatea optică a amestecului din fiecare godeu se cuantifică la lumină cu lungimi de undă 550 nm (OD 550). OD 550 este invers proporțională cu numărul de celule tumorale omorâte în prezența complexului heteromeric LT-α/β, agentului de activare LT-α/β și anti-LT-p-R Ab test din fiecare godeu.

Anticorpii preferați ai acestei invenții acționează individual ca agenți de activare LTβ-R în prezența LT-a1/p2 și IFN-γ includ BKA11, CDH10, BHA10 și BCG anti-LT-p-R mAbs (Tabel 1, intra).

Anticorpi legați anti-LT-B-R

Anticorpi legați anti-LT-p-R ai acestei invenții acționează individual ca agenți de activare LT-P-R fără complexe heteromerice LT-α/β exogene în prezența unui al doilea agent de activare LT-p-R, cum ar fi IFN-γ. Anti-LT-p-R Abs legați, aparent, se leagă la și induc gruparea receptorilor LT-β de suprafață celulară, prin aceasta activând moartea celulei țintite mediată receptor LT-p.

într-o realizare, unul sau mai multe tipuri de anticorpi anti-LT-p-R sunt legați prin imobilizare pe o matrice sau suprafață insolubilă în apă. Derivarea cu un agent bifuncțional este utilă pentru legarea anticorpilor la suportul matrice sau la suprafața insolubilă în apă.

Agenții folosiți obișnuit pentru a efectua legarea anticorpilor la suportul matrice sau suprafață insolubilă în apă includ 1,1b/s(-diazoacetil)-2-feniletan, glutaraldehidă, esteri N-hidroxisuccinamidă incluzând esteri cu acid 4-azidosalicilic, imidoesteri homofunctionali incluzând esteri disuccinimidil și maleimide bifuncționale ca b/s-N-maleimido-1,8-octanul. Agenți de derivatizare ca metil-3-[p-azidofenil)dizio]propioimidat formează intermediari foto

445

450

455

460

465

470

475

480

485

RO 118634 Β1 activabili, care pot fi legați selectiv când se stimulează cu lumină. De asemenea, se pot folosi pentru imobilizarea proteinei și legare, matrici reactive insolubile în apă cum ar fi carbohidrați activați, bromură de cianogen și substraturile descrise în brevetele US 3959080;

3969287; 3691016; 4195128; 4247642; 4229537; 4055635 și 4330420.

Suprafețele la care sunt atașați anticorpii pot fi polimeri neproteici, de obicei, un polimer hidrofil din surse fie naturale, fie sintetice. Se pot folosi polimeri hidrofili polivinilici ca alcool polivinilic (PVA), sau polivinilpirolidonă (PVP).

De asemenea, sunt utili eteri polialchilen cum ar fi polietilenglicol, polipropilenglicol, esteri polioxietilenă sau metoxipolietilenglicol, polioxialchilen ca polioxietilen și polioxipropilen și bloc copolimeri ai polioxietilenei și polioxipropilenei (Pluronics); polimetacrilați, carbomeri, polizaharide ramificate sau neramificate, care cuprind monomeri zaharidici D-manoză, Dși L-galactoză, fucoză, fructoză, D-xiloză, L-arabinoză, acid D-glucoronic, acid sialic, acid D-galacturonic, acid D-manuronic (de exemplu, acid poli-manuronic sau acid alginic), D-glucozamină, D-galactozamină, D-glucoză și acid neuraminic incluzând homopolizaharide și heteropolizaharide ca lactoză, amilopectină, amidon, amidon hidroxietil, amiloză, dextran sulfat, dextran, dextrine, glicogen sau subunitatea polizaharidică a acidului mucopolizaharic, de exemplu, acid hialuronic; polimeri ai zaharalcoolilor, ca polisorbitol și polimanitol și heparină sau heparon.

înaintea legării, polimerul este, de preferință, solubil în apă și, de preferință, conține numai o singură grupare chimică reactivă, pentru a evita evenimentele de legare multiplă cu anticorpul, în orice caz, condițiile de reacție vor fi optimizate pentru reducerea legării și pentru recuperarea produselor fie direct, fie printr-o etapă ulterioară de filtrare în gel sau cromatografică, având un domeniu de greutate moleculară substanțial omogen. Greutatea moleculară optimă a anticorpului legat la matrice se va determina prin experimentare de rutină folosind analizele de citotoxicitate și legare receptor, descrise aici.

Conjugatul final, după legare, este, de preferință, solubil în fluide fiziologice, cum ar fi sângele. Polimerul nu va fi puternic imunogenic în forma conjugată și va poseda o viscozitate comparabilă cu infuzarea sau injectarea intravenoasă, dacă aceasta este o cale intenționată de administrare.

De asemenea, polimerul poate fi insolubil în apă. Materialele care pot fi folosite includ geluri hidrofile sau articole formate, având suprafețe la care pot fi imobilizați anticorpii, cum ar fi tuburi chirurgicale, catetere sau conducte de dren. Este de preferat să se folosească materiale de suport solide, care sunt compatibile biologic și substanțial inerte în împrejurări fiziologice. Un material este compatibil biologic, dacă el nu stimulează răspunsuri imune substanțiale incluzând inflamația sau atracția celulelor fibrotice, când sunt plasate în interiorul corpului unui subiect.

De asemenea, anti-LT-p-R Abs pot fi imobilizați pe suprafețe care au fost acoperite covalent sau necovalent cu anticorpii secundari, care se vor lega la anti-LT-p-R Abs primari (de exemplu, anticorpi capră anti-șoarece IgG; vezi Exemplul 7). Fiecare anti-LT-p-R Ab testat individual, imobilizat pe o suprafață cu anticorpi secundari, acționează ca un agent de activare Ι-Τ-β-R în prezența IFN-γ (Figuri 4 și 7).

într-o realizare alternativă, anti-LT-p-R Abs legați în soluție, acționează ca agenți de activare. Anti-LT-p-R Abs pot fi legați prin intermediul unui agent de legare anti-LT-p-R Ab (sau mAb). Un agent de legare anti-LT-p-R Ab (sau mAb), conform acestei invenții, este orice agent capabil fie de legare covalentă, fie de agregarea necovalentă a anti-LT-p-R Abs (sau m Abs) în soluție, astfel că anti-LT-p-R Abs (sau mAbs) legat poate să se lege la și să potențeze gruparea LT-p-R țintă la suprafața celulei.

Astfel de agenți de legare anti-LT-(3-R Ab (sau mAb) includ, dar nu sunt limitați la, reactivi de legare chimică, care pot reacționa cu anticorpii într-un mod controlat, cum s-a descris mai sus.

RO 118634 Β1

Alternativ, pot fi folosiți pentru a forma aglomerate anti-LT-p-R Abs în soluție anti-LTβ-R Abs, anticorpi secundari, Sepharoză A, receptori Fc sau alți agenți care se vor lega la și vor agrega multipli anti-LT-p-R Abs primari fără blocarea activității lor.

Anti-LT-p-R Abs multipli în soluție acționează ca agenți de activare LT-p-R 540

Prin această invenție sunt asigurate compoziții care cuprind anti-LT-p-R Abs multipli în soluție, care acționează ca agenți de activare LT-p-R prin potențarea grupării LT-p-R de suprafață. Se pot folosi anti-LT-p-R Abs policlonali îndreptați împotriva a diferiți epitopi ai LTP-R. De preferință, anti-LT-p-R Abs sunt Abs monoclonali îndreptați împotriva a diferiți epitopi ai LT-p-R. 545

Abordarea combinată anti-LT-p-R mAb pentru activarea receptorului LT-p necesită combinarea a 2 epitopi nesuprapuși. Mai mult, este probabil ca agregarea productivă a receptorului să se obțină numai cu anumiți epitopi. S-a identificat prezența a cel puțin 4 epitopi mici imunoreactivi LT-p-R. Epitopii suplimentari (cum s-au definit prin noi Abs) se pot identifica prin continuarea fuzionării celulelor splenice de șoarece imunizate, prin imunizarea 550 a diferite specii de animale și prin folosirea diferitelor căi de imunizare.

De asemenea, epitopii pot fi configurați direct prin cercetarea capacității a diferiți mAbs de a concura fiecare cu altul pentru legare la LT-p-R folosind tehnici cromatografice BIAcore (Pharmacia BIAtechnology Handbook, “Epitop Mapping, Section 6.3.2., (Mai 1994); vezi, de asemenea, Johne et al., J. Immunol. Methods, 160, p. 191-8 (1993)). 555

LT-p-R mAbs individuali pot fi grupați în cel puțin 4 clase conform capacității lor de a coopera în combinație cu alți LT-p-R mAbs în omorârea celulelor tumorale în teste citolitice (Exemplul 8; Tabel 1). De exemplu, BDA8 din Grupul I nu acționează în combinație cu AGH1 mAb din Grupul I pentru a iniția citotoxicitatea celulei tumorale. La fel, Grupul III BKA11 și CDH10 mAbs nu cooperează într-un test de citotoxicitate al celulei tumorale. 560

Fig.5A-C prezintă efectele administrării reprezentative a anti-LT-p-R mAbs singuri și în combinația modului de împerechere față de celule tumorale în teste de citotoxicitate, în prezența IFN-γ ca un agent de activare LT-p-R. Grupul IV anti-LT-p-R mAbs CBE11 folosit singur are un efect citotoxic ușor, care este sporit în combinație cu Grupul II mAb BHA10 (Fig.5A). CBE11 provoacă un efect similar cu Grupul III mAb CDH10 (Fig.5B). 565

Citotoxicitatea produsă prin administrarea unei combinații a anti-LT-p-R mAbs nu este specifică pentru linia de celule tumorale HT29. Fig.5C arată că Grupul I AGH1 mAb și Grupul III CDH10 mAb acționează sinergie în omorârea a două linii de celule tumorale diferite (celule HT29 și celule WiDr), derivate de la tumori adenocarcinomice umane.

Rezumatul caracteristicilor anti-LT-p-R mAbs 570

Toți anti-LT-p-R mAbs ai acestei invenții, când s-au legat prin imobilizare, acționează ca agenți de activare LT-p-R în prezența unui al doilea agent de activare LT-P-R, cum ar fi IFN-γ. Capacitatea anti-LT-p-R mAbs de a acționa ca agenți de activare LT-p-R, în prezența sau absența LT-a1/p2 în soluție, variază adesea în conformitate cu starea celulelor la momentul testului. Tabelul 2, intra, rezumă proprietățile anti-LT-p-R mAbs caracterizați prin 575 această invenție.

J în grupul I, mAbs BDA8 și AGH1 nu funcționează ca agenți de activare LT-P-R în soluție cu LT-a1/p2. în prezent, BDA8 mAb blochează efectul antitumoral al LT-a1/p2 (Fig.3B și Tabel 2).

în contrast, în grupul II, anti-LT-p-R mAbs BCG6 și BHA10, au efecte amestecate, 580 agoniste și antagoniste, când se administrează cu LT-a1/p2.

în grupul III, anti-LT-P-R mAbs BKA11 și CDH10 sunt mici în capacitatea lor de a acționa ca agenți de activare LT-p-R care potențează efectele antitumorale în prezența LTa1/p2 fără să prezinte efectele antagoniste observate adesea cu Grupul II mAbs BCG6 și

BHA10. 585

RO 118634 Β1

Trebuie să se rețină că, respectiv, clasificarea anti-LT-p-R mAbs pe baza capacității lor de a coopera în teste citolitice ale celulei tumorale arată că ei interacționează cu epitopi distincți ai LT-p-R. Totuși, mAbs care cuprind un singur grup, nu au în mod necesar aceleași afinități de legare pentru epitopii lor înrudiți.

Astfel de rezultate variabile, observate când se compară efectele a diferiți mAbs aparținând aceluiași grup sau unor grupuri diferite, pot reprezenta diferențe în afinitățile de legare. Pentru conformitate, este posibil ca Grup I sau Grup IV mAb cu o afinitate de legare pentru LT-p-R să poată fi izolat, putând funcționa asemenea Grupului III mAbs ca agent de activare LT-p-R, în prezența LT-a1/p2.

Liniile de celule hibridomice, sau subclone ale lor care produc anti-LT-p-R mAbs descrise mai sus, s-au depozitat în 12 ianuarie 1995 la ATCC (Rockville, MD) conform prevederilor Tratatului Budapesta și li s-au atribuit numerele de acces ATCC după cum urmează.

Linie celulară

a) AG.H1.5.1

b) BD.A8.AB9

c) BC.G6.AF5

d) BH.A10

e) BK.A11.AC10

f) CB.E11.1

g) CD.H10.1

Nume mAb	Nr. acces ATCC
AGH1	HB 11796
BDA8	HB 11798
BCG6	HB 11794
BHA10	HB 11795
BKA11	HB 11799
CBE11	HB 11793
CDH10	HB 11797

Toate restricțiile asupra accesibilității pentru public, a depozitelor ATCC de mai sus vor fi îndepărtate irevocabil, după eliberarea unui brevet pentru această cerere.

Anticorpi monoclonali anti-LT-p-R IgM funcționează ca agenți de activare LT-p-R Anti-LT-p-R mAbs care cuprind mai mult decât cele 2 situri de legare antigen IgG funcționează, de asemenea, în soluție ca agenți LT-p-R la suprafața celulei și vor intra în conformitate în definiția unui agent de activare LT-p-R, conform acestei invenții. Siturile de legare antigen ale unui anti-LT-p-R mAb se pot construi în molecule IgM, care au 10 situri de legare antigen, folosind tehnici ADN recombinant și hibridomice standard (exemplul 12).

Alternativ, se pot colecta și îmbogăți molecule IgM complete de șoarece (sau alt animal), izolate prin tehnici de fuziune hibridom, după o singură imunizare cu antigen. Un mod de îmbogățire pentru molecule IgM ar fi să se imunizeze șoareci deficienți în semnalizare CD40 (Kawabe et al., Immunity, I, p. 167-78 (1994); Xu et al., Immunity, I, p. 423-32 (1994)). Acești șoareci nu pot produce efectiv IgGs și, prin urmare, răspunsul lor la provocare prin antigen este îmbogățit pentru izotipuri IgM.

Anticorpi anti-LT-p-R IgM, în virtutea valenței lor crescute pot agrega efectiv molecule LT-p-R în planul membranei, prin aceasta sporind semnalizarea LT-p-R comparativ cu echi valenții lor IgG care au 2 situri de legare antigen. Un exemplu de creștere a eficienței anticorpilor multivalenți în gruparea receptorului se observă cu anticorpi pentru receptorul Fas, unde forma IgM este foarte puternică și IgGs normali bivalenți nu sunt eficienți în soluție (Yonihara și Yonihara, J. Exp. Med., 169, p. 1747-56 (1989); Alderson et al., Int. Immunol.,

6, p. 1799-1806 (1994)).

în același mod, apo-1 mAb pentru receptorul Fas este un lgG3 mAb. Acest mAb este un agent citotoxic potențial, care se bazează pe interacțiuni Fc unice la subtipurile lgG3 pentru a agrega în forme polivalente mai mari. îndepărtarea regiunii Fc creează o formă F(ab)₂ care nu se asociază în agregate mai mari și care este inactivă (Dhein et al., J. Immunol.,

149, p. 3166-73 (1992)). Astfel, prin analogie, se prezice că versiuni IgM ale anti-LT-P-R mAbs vor fi agenți antitumorali potențiali.

RO 118634 Β1

Anti-LT-p-R mAbs inhibă creșterea tumorii la șoareci

Capacitatea unui anti-LT-p-R mAb de a inhiba creșterea celulei tumorale umane in vitro (Exemplele 6-8 și 13) poate fi indicatoare a activității antitumorigenice in vivo.

Experimentele realizate pe șoareci imunodeficienți (SCID) demonstrează că un antiLT-p-R mAb (CBE11) poate bloca eficient formarea tumorii de către celule adenocarcinomice umane WiDr (exemplul 14; fig.6).

Șoareci inoculați subcutanat (s.c.) cu celule WiDr formează tumori care se pot măsura în 2 săptămâni. Când șoarecii au fost tratați i.p. cu CBE11 la același moment în care s-au inoculat s.c. celule WiDr, dezvoltarea tumorii a fost puternic blocată (fig.6A).

Acțiunea antitumorală a CBE11 anti-LT-p-R mAb a fost intensificată prin adăugare de IFN-γ; CBE11 a fost eficient, totuși, chiar fără IFN-γ exogen. în grupul CBE11 + IFN-y, 7 din 16 animale au fost lipsite complet de tumori, în timp ce animalele rămase au avut noduli mici, care nu au progresat la 2 luni. Șoarecii tratați numai CBE11 au fost similari grupului CBE11 + IFN-γ la 30 zile. Totuși, șoarecii tratați numai CBE11, au dezvoltat eventual tumori cu creștere ușoară.

Au existat diferențe statistice semnificative între grupurile CBE11 (+ /- IFN-γ) și grupurile de control (soluție salină, numai IFN-γ și anti-uman LFA-3 mAb (1E6) + IFN-y), dar fără diferențe semnificative între grupurile de control. 1E6 și CBE11 mAbs sunt ambii anticorpi lgG1.1E6 mAb acoperă efectiv celule tumorale dar nu blochează creșterea tumorii. Astfel, evenimentele mediate celular, de omorâre complementară sau naturală, nu sunt baza numai pentru activitatea antitumorală a CBE11 anti-LT-p-R mAb.

Eficacitatea CBE11 mAb în inhibarea creșterii tumorii in vivoîn absența IFN-γ exogen a fost neașteptată, deoarece a existat o dependență de IFN-γ pentru efectele citotoxice bazate LT-p-R măsurabile in vitro. Există fie aceeași încrucișare a IFN-γ pe receptorii IFN-y umani, fie in vivo sunt implicate alte mecanisme.

De asemenea, CBE11 anti-LT-p-R mAb pot inhiba creșterea unor tumori stabilite la șoareci (fig.6B). Șoarecii au fost inoculați s.c. cu celule adenocarcinomice umane WiDr, în ziua 1, și tumorile s-au lăsat să se dezvolte timp de 15 zile (exemplul 14). Tumorile la animalele tratate i.p. numai cu IFN-γ sau control antiuman LFA-3 mAb (1E6) + IFN-γ au continuat să crească în mărime pe durata a 7 săptămâni de experiment.

în contrast, tumorile tratate cu CBE11 anti-LT-p-R mAb (+ IFN-γ sau singur) au stopat creșterea și după 3 injectări de anticorp CBE11 pe o perioadă de 3 săptămâni, creșterea tumorii s-a oprit până la 49 zile postinocul, când experimentul s-a terminat (fig.6B).

Aceste experimente demonstrează că un anti-LT-p-R mAb, care activează semnalizarea LT-p-R, poate inhiba efectiv formarea tumorii la stadiile timpurii și, de asemenea, poate bloca continuarea creșterii celulei tumorale la stadiile mai târzii ale tumorigenezei in vivo. De asemenea, aceste experimente demonstrează că administrarea doar a unui agent de activare LT-P-R poate fi eficientă pentru tratarea sau reducerea avansării severității sau efectelor neoplaziei la animal afectat.

Procedurile descrise în exemplul 14 pot fi folosite pentru identificarea agenților de activare LT-p-R conform acestei invenții, care funcționează singuri sau în combinație, pentru a inhiba creșterea celulei tumorale in vivo. Se are în vedere că alți agenți de activare LT-p-R, incluzând, dar fără să se limiteze la cei identificați, folosind analize ale citotoxicității celulei tumorale in vitro, pot avea efecte antitumorale similare in vivo când se administrează fie singuri, fie în combinație la animale sau oameni.

Utilizarea IFN-γ și altor agenți de activare LT-p-R

Efectele citotoxice ale complexelor heteromerice LT-α/β și anti-LT-p-R mAbs, legați sau multipli asupra celulelor tumorale, sunt intensificate prin prezența unui agent de activare LT-P-R, în special IFN-γ. Celule adenocarcinomice umane de origine intestinală (celule HT29) s-au dovedit anterior ca fiind sensibile la semnalizare FasR (Yonehara și Yonehara, J. Exp. Med., 169, p. 1747-56 (1989)); și la TNF și la LT-α în prezență de IFN-y (Browning et al., J. Immunol., 143, p. 1859-67 (1999)).

635

640

645

650

655

660

665

670

675

680

RO 118634 Β1

Cantitatea de agent de activare LT-p-R, necesară pentru sporirea activității antitumorale a complexelor heteromerice LT-α/β, anti-LT-p-R mAbs sau a altor agenți de activare ai acestei invenții, va depinde de celula sau de tipul de țesut ce trebuie tratat și, de asemenea, de modul de tratament, și se poate determina empiric folosind proceduri de rutină. Agentul de activare LT-p-R poate fi furnizat la o concentrație sau eliberat la o rată determinată ca efectivă, în legătură cu alți agenți de activare LT-Ș-R administrați, luând în considerare factorii listati mai sus.

>

Alternativ, se pot lua în considerare agenți de activare LT-p-R endogeni cum ar fi interferoni ca IFN-γ, care pot fi produși de către celulele sau țesutul care înconjoară celulele tumorale țintă. IFN-γ endogen este produs în mod normal la infecția virală și, de asemenea, se găsește în vecinătatea tumorii (Dinge et al., Immunity, I, p. 447-56 (1994)).

Orice agent care este capabil să inducă interferoni, de preferință IFN-γ, și care potențează efectele citotoxice ale complexelor heteromerice LT-α/β și anti-LT-p-R mAbs asupra celulelor tumorale, intră în grupul de agenți de activare LT-p-R ai acestei invenții. Cât timp infecția virală normală induce producția IFN-y, nivelurile endogene de IFN-γ pot fi sporite prin alți agenți (exemplul 10).

De exemplu, experimentele clinice au demonstrat inducerea de interferon prin tratament ARN dublu bandă (dsARN). în conformitate cu acestea, acidul poliriboguanilic/poliribocitidilic (poli-rG/rC) și alte forme ale dsARN sunt eficiente ca inductori de interferon (Juraskova et al., Eur. J. Pharmacol., 221, p. 107-11 (1992)).

Stimulatorul de interferon de la Glycyrrhiza glabra (Acharya et al., Indian J. Med. Res., 98, p. 69-74 (1993)), și agenți farmaceutici, din care mulți sunt administrabili oral, se pot, de asemenea, folosi pentru a provoca niveluri endogene de interferon. Astfel de inductori de interferon includ: imiquimod (Bernstein et al., Antiviral Res., 20, p. 45-55 (1994)); saparal (Paramonova et al., Vopr. Virusol., 39, p. 131-34 (1994)); arilpirimidone ca bropirimină (Onishi și Macjda, Hinyokika Kiyo, 40, p. 195-200 (1994)); Ridostin (Cheknev et al., Vopr. Virusol., 39, p. 125-28 (1994)).

Câțiva dintre acești agenți inductori de interferon s-au caracterizat ca inducători ai interferonilor de tip I ca IFN-α. Interferoni de tip I pot să funcționeze, de asemenea, ca agenți de activare LT-p-R dar sunt mai puțin puternici decât IFN-γ.

Tratamente care folosesc complexe LT-α/β și agenți de activare LT-fi-R

Compozițiile acestei invenții se vor administra la o doză eficientă pentru tratarea condiției clinice particulare căreia i se adresează. Determinarea unei formulări farmaceutice preferate și a unui regim de dozare eficient terapeutic pentru o aplicare dată este la îndemâna specialistului în domeniu, luând în considerare de exemplu, condiția și greutatea pacientului, durata tratamentului dorit și toleranța pacientului la tratament.

Tipic, oamenii pot tolera până la 100-200 ug/m² de TNF înainte să se manifeste toxicitate serioasă (SchiIler et al., Cancer Res., 51, p. 1651 -58 (1991)). La șoareci, dozaje în domeniul 1-5 pg/șoarece/zi date cu 5x10⁴ unități de IFN-γ recombinant uman produc regresia tumorii umane primare (Balkwill et al., CIBA Foundation Symposium (1987); Havell et al., J. Exp. Med., 167, p. 1067-85 (1988)). Bazat pe eficacitatea relativă a TNF și LT-α/β în analize citolitice HT29, aproximativ 5-25 pg/șoarece/zi de LT-a1/p2 vor asigura un domeniu de doză terapeutică. Extrapolând la om, este de așteptat ca dozaje LT-a1/p2 de cel puțin 1 mg/m²să fie necesare în combinație cu un agent de activare LT-p-R cum ar fi IFN-γ.

Istoric, terapia IFN-Y s-a utilizat fie la doze maxime tolerate în domeniul de 100250 pg/m², fie la niveluri imunomodulatoare în domeniul de 10-25 pg/m² (vezi, de exemplu

Kopp et al., J. Immunother., 13, p. 181-90 (1993)). Terapii combinate cu 2 interferoni au folosit 4x10⁶ unități/m² de IFN-γ și aproximativ 250 pg/m² de IFN-γ (Niederle et al., Leuk.

Lymhoma, 9, p. 111 -19 (1993)). Doze intermediare de circa 25-100 pg/m² de IFN-γ în combinație cu complexe heteromerice LT-α/β sau anti-LT-p-R mAbs purificați descriși aici sunt de așteptat să fie puncte de plecare corespunzătoare, pentru optimizarea dozelor de tratament.

RO 118634 Β1

Administrarea complexelor heteromerice LT-α/β și anti-LT-p-R mAbs legați ai acestei invenții, inclusiv forme izolate și purificate ale anticorpilor și complexelor, sărurilor lor sau derivaților acceptabili farmaceutic ai acestora, poate fi realizată folosind orice moduri acceptate convențional, de administrare a agenților care prezintă activitate antitumorală.

Compozițiile farmaceutice folosite în aceste terapii pot să fie, de asemenea, într-o diversitate de forme. Acestea includ, de exemplu, forme de dozaj solide, semisolide și lichide, cum ar fi tablete, pilule, pudre, soluții sau suspensii lichide, supozitoare și soluții injectabile și infuzabile. Forma preferată depinde de modul intenționat de administrare și de aplicarea terapeutică.

Modurile de administrare pot să includă: administrarea orală, parenterală, subcutanată, intravenoasă, intraleziune sau topică.

Complexele heteromerice LT-α/β, IFN-γ și anti-LT^-R mAbs, de exemplu, se pot plasa în formulări izotonice sterile cu sau fără cofactori care stimulează absorbția sau stabilitatea. Formularea este, de preferință, lichidă sau poate fi pudră liofilizată.

De exemplu, complexele LT și/sau anti-LT^-R mAbs și IFN-γ se pot dilua cu o formulare tampon care cuprinde 5,0 mg/ml acid citric monohidrat, 2,7 mg/ml citrat trisodic, 41 mg/ml manitol, 1 mg/ml glicină și 1 mg/ml polisorbat 20. Această soluție poate fi liofilizată, depozitată sub refrigerare și reconstituită înainte de administrare cu apă pentru injectare (USP).

De asemenea, de preferință, compozițiile vor include purtători convenționali, acceptabili farmaceutic, binecunoscuți în domeniu (vezi,de exemplu, Remington's Pharmaceuticals Sciences, ediția a 16-a, 1980, Mac Publishing Company). Astfel de purtători acceptabili farmaceutic pot să includă alți agenți medicinali purtători, purtători genetici, adjuvanți, excipienți etc., ca albumină serică umană sau preparate plasmatice. Compozițiile sunt, de preferință, sub formă de unitate dozată și se vor administra de obicei o dată sau de mai multe ori pe zi.

Compozițiile farmaceutice ale acestei invenții pot fi administrate, de asemenea, folosind microsfere, lipozomi, alte sisteme de eliberare microgranulate, sisteme sau formulări cu eliberare susținută plasate în, lângă, sau în alt fel în comunicare cu țesuturi afectate sau cu fluxul sanguin.

Exemplele adecvate de purtători cu eliberare susținută, includ matrici polimerice semipermeabile sub formă de articole formate ca supozitoare sau microcapsule. Matricile cu eliberare susținută, implantabile sau microcapsulare includ polilactide (brevet US 3773319; EP 58481), copolimeri ai acidului L-glutamic și gama etil-L-glutamat(Sidman et al., Biopolymers,22, p.547-56(1985)); poli(2-hidroxietil-metacrilat) sau acetat vinii etilena (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15, p. 167-277 (1981); Langer, Chem. Tech., 12, p. 98-105 (1982)).

Lipozomii care conțin complexe heteromerice LT-α/β și/sau anti-LT-Ș-R Abs și IFN-γ se pot prepara prin metode binecunoscute (vezi, de exemplu, DE 3 218 121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, p. 3688-92 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, p. 4030-34 (1980); brevete US 4485045 și 4544545).

Lipozomii obișnuiți sunt mici, de tip unilamelar (circa 200-800 Â), în care conținutul de lipide este mai mare decât circa 30 mol % colesterol. Proporția de colesterol este aleasă pentru a controla rata optimă de eliberare a complexului LT și/sau anti-LT^-R Abs și IFN-γ.

Complexele heteromerice LT-α/β și anti-LT-Ș-R Abs ale acestei invenții pot fi atașate, de asemenea, la lipozomii care conțin alți agenți de activare LT-3-R, agenți terapeutici sau

IFN-γ pentru a suplimenta IFN-γ găsit în mod obișnuit în regiunea tumorilor.

Atașarea complexelor LT și anti-LT^-R Abs la lipozomi poate fi realizată prin orice agent cunoscut de legare, cum ar fi agenți heterobifuncționali de legare, care s-au folosit pe larg pentru cuplarea toxinelor sau agenților chemoterapeutici la anticorpi pentru eliberare

740

745

750

755

760

765

770

775

780

RO 118634 Β1 țintită. Conjugarea la lipozomi poate fi, de asemenea, realizată folosind hidrazidă ca reactiv de reticulare orientată a carbohidraților acidului 4-(4-maleimidofenil)butiric (MPBH) (Duzgunes et al., J. Cell Biochem., Abst. Suppl. 16E 77 (1992)).

O terapie antitumorală bazată pe activarea LT-Ș-R ar avea câteva avantaje. LT-Ș-R se leagă la complexele heteromerice LT-α/β cu afinitate ridicată în fantele β/β și cu afinitate mai scăzută în fantele α/β, create la interfețele dintre subunitățile adiacente LT-α și LT-β. în contrast, receptorii TNF se leagă la complexele heteromerice LT-α/β cu afinitate ridicată numai în fantele α/α. în conformitate, complexele purificate Ι_Τ-α1/β2 se leagă cu afinitate ridicată la LT-β-Π între subunitățile adiacente LT-β, dar lipsesc fantele α/α și astfel nu semnalizează încrucișat prin receptorii TNF. Astfel, complexele heteromerice LT-α/β ale acestei invenții nu stimulează răspunsuri inflamatorii asociate TNF.

Administrarea ίΤ-α1/β2 nu activează schimbări ale celulei endoteliale asociate cu răspunsul inflamator chiar la niveluri relativ ridicate. Pentru acest motiv, efectele secundare datorate activării cascadei inflamatorii observate cu TNF nu vor fi o problemă folosind compozițiile farmaceutice.

ίΤ-α1/β2 se leagă la LT-β-Π de șoarece, precum și la LT-β-Π uman. Injectarea a 100 pg ίΤ-α1/β2 uman per șoarece nu este letală (exemplul 11). Stimularea LT-β-Π pentru animale nu depășește toxicitatea observată când s-au încercat experimente similare cu activarea FasH sau p60 TNF-H.

Utilizarea anticorpilor monoclonali anti-LT-β-Π, sau a combinațiilor anticorp, pentru declanșarea acestei căi la oameni, poate avea câteva avantaje față de tratamentul cu complexe heteromerice LT-α/β.

O terapie anticorp antireceptor va fi mai selectivă decât tratarea cu ligand. Mai mult, forme recombinante de anti-LT-β-Π Abs vor fi mai ușor de obținut prin inginerie și de produs pe scară mare, decât complexele heteromerice LT-α/β.

Se are în vedere că mAbs sau complexe heteromerice LT-α/β se vor administra la oameni care poartă tumori, în conjuncție cu o terapie antitumorală convențională (adică radiație și chemoterapie).

Un tratament combinat al activării LT-β-Η cu chemoterapii convenționale poate asigura un factor suplimentar al activității de omorâre a tumorii, care curăță mai bine pacientul de celulele tumorale, decât atunci când se folosește o singură terapie antitumorală convențională.

Este în plus posibil, ca această abordare să poată avea relativ puține efecte secundare și, prin urmare, ar putea fi dată într-un sens semiprofilactic, în cazuri de carcinoame care nu au făcut metastaze, sau la pacienții din familii care prezintă o predispoziție genetică pentru un anumit tip de cancer.

în continuare, se prezintă exemple care ilustrează complexele heteromerice LT-α/β și anti-LT-β-Π Abs ai acestei invenții, și metodele folosite pentru caracterizarea lor. Aceste exemple nu vor fi interpretate ca limitative; exemplele sunt incluse în vederea ilustrării prezentei invenții, care este limitată numai prin revendicări.

Exemplul 1. Generarea celulei de insectă infectată baculovirus. Supernatante care conțin forme LT-α/β

S-a obținut baculovirus recombinant, care codifică fie LT-α de lungime întreagă, fie o formă secretată a LT-β, așa cum se cunoaște (Crowe et al., Science, 264, p. 707-710 (1994)). S-au inoculat celule de insectă (Invitrogen, San Diego, CA) la o densitate de 2x10⁵ celule/ml în 7,21 de mediu SF 900-11 (Gibco) fără ser.

Cultura a atins 1,8x10® celule/ml 48 h mai târziu și s-au infectat 150 ml (3x10®

PFU/ml) de LT-β sau LT-α și 300 ml de stocuri baculovirus. Două zile mai târziu, cultura s-a recoltat și resturile celulare s-au îndepărtat prin centrifugare. După adăugarea de EDTA și

RO 118634 Β1

PMSF (1 mM EDTA și 150 μΜ PMSF concentrație finală), supematantul limpezit s-a concentrat de 10 ori prin ultrafiltrare, folosind un cartuș spiral S1YM10 (Amicon). Concentratul 835 s-a divizat în 6 porțiuni de 120 ml, și alicotele s-au depozitat la -70°C înaintea purificării.

Exemplul 2. Prepararea de receptori LT-β solubili ca himeră imunoglobulina Fc

Domeniul extracelular al ίΤ-β-R până la regiunea transmembranară s-a amplificat prin PCR de la o clonă cADN folosind primeri, care au siturile enzimatice de restricție Not I și Sal I pe capetele 5' și respectiv 3' (Browning et al., J. Immunol., 154, p. 33-46 (1995)). 840

Produsul amplificat s-a tăiat cu Not I și Sal I, s-a purificat și s-a legat în vectorul pMDR901 linearizat Notl împreună cu un fragment Sal l-Not I care codifică regiunea Fc a IgG 1 uman. Vectorul rezultant a conținut gena dihidrofolat reductază și himera LT-p-R-Fc conduse prin promotori separați. Vectorul a fost electroporat în celule CHO dhfr', iar clonele rezistente metotrexat s-au izolat prin proceduri standard. 845

LT-p-R-Fc este secretat în mediu și s-a folosit o tehnică ELISA pentru a selecta liniile celulare care produc cel mai ridicat nivel al proteinei himerice. S-a crescut o linie celulară înalt producătoare până la numere mari și s-a colectat mediul condiționat. Proteina pură s-a izolat prin cromatografie de afinitate Proteină A sepharoză curgere rapidă.

Exemplul 3. Purificarea prin afinitate a ΕΤ-α1/β2 folosind TNF-R și LT-fi-R 850

Pentru prepararea rășinilor pentru purificare de afinitate receptor a formelor LT, preparatele purificate ale ίΤ-β-R-Fc (cum s-a descris aici în exemplul 2) și TNF-R p60-Fc (Crowe et al., Science, 264, p. 707-10 (1994)) s-au imobilizat pe sepharoză CNBr (Pharmacia) la 5 mg/ml rășină, urmând în esență instrucțiunile producătorului.

Rășinile s-au pus la un ciclu de eluție înainte de folosire. O porțiune (12 ml) a con- 855 centratului S1Y10 s-a trecut pe două coloane secvențiale p60 TNF-R-Fc, care leagă LT-a și LT-a2/pi.Tot ceea ce a curs și care a conținut Ι_Τ-α1/β2 și LT-β, s-a trecut pe o coloană LT-Ș-R-Fc. Coloana s-a spălat cu 5 voi fiecare de PBS, PBS cu 0,5 M NaCI și PBS și apoi complexele LT-α și LT-a2/pi s-au eluat cu 25 mM fosfat de sodiu, 100 mM, pH 3,5. Eluația fracțiunilor s-a neutralizat cu 1/20 voi de 0,5 M fosfat de sodiu, pH 8,6 și depozitat pe 860 gheață. Fracțiunile care conțin proteina s-au identificat prin absorbanță la 280 nm, maximul fracțiunilor s-a colectat și depozitele eluției din coloane s-au analizat prin SDS-PAGE colorat, cu coomassie brilliant blue. Eluția așa cum s-a descris mai sus a dat ίΤ-α1/β2 mai mult de 95% pur.

Exemplul 4. Caracterizarea liganzilor LT-α 1/β2 purificați 865

Fracțiunile de la exemplul 3 s-au cromatografiat prin gel pentru excludere după mărime, pentru a analiza dacă s-au format trimeri și dacă au fost prezente agregate.

S-a folosit o coloană TSK G3000 sw x2 ia o rată de curgere de 0,5 ml/min, un standard de proteină pentru separare după mărime prin filtrare în gel BioRad și cei trei trimeri LT diferiți, LT-a3, ίΤ-α2/β1 și ίΤ-α1/β2. Fig.1 A arată foarte puțin, dacă vreunul dintre trimerii 870 ίΤ-α1/β2 are o greutate la fel de mare ca a agregatului. Comparația la standardele de mărime arată că cele trei forme sunt toate trimerice, adică circa 50-60 kDa.

Asumând trimerul, stoichiometria LT-α față de LT-β conținute în fracțiunile purificate ίΤ-α1/β2 și ίΤ-α2/β1 s-a evaluat fie prin densitometria gelurilor colorate coomassie, fie prin analiza înălțimii maxime a celor două maxime, care urmează rezoluției pe HPLC C4 fază in- 875 versă. Ambele măsurători au confirmat identitatea fracțiunilor eluate prin coloanele de afinitate, așa cum s-a descris mai sus.

Puritatea preparatelor s-a analizat în plus, prin cromatografie de schimb ionic, folosind instrumente BioCAD pentru a migra hărțile pH ale LT-a1/Ș2 și LT-a2/Ș1 pe rășină de schimb cationic slabă, în diferite sisteme de tampon. Metoda care a prezentat cea mai mare 880 capacitate de a reține curat și de a separa cei trei trimeri a încorporat o coloană POROS CM (carboximetil) migrată la 5 ml/min cu un tampon 16,66 mM MES, 16,66 mM HEPES,

RO 118634 Β1

16,66 mM acetat de sodiu pH 6,5 și eluare cu un gradient 1 M NaCI pe 20 volume coloană.

Cromatogramele BioCAD ale complexelor LT-a1/Ș2 și Ι_Τ-α2/β1 sunt prezentate în fig.1 B.

Fiecare trimer Ι_Τ-α3,Ι_Τ-α2/β1 și Ι_Τ-α1/β2 a eluat la diferite concentrații de sare și nu a existat nici o dovadă pentru contaminare încrucișată, a mai mult de 1 ...2% în diverse preparate.

Exemplul 5. Omorârea celulelor adenocarcinomice umane HT29 de către complexele solubile LT-al/32

Analiza citolitică HT29 a fost descrisă anterior (Browning și Ribolini, J. Immunol., 143, p. 1859-67 (1989)). într-o analiză tipică s-au preparat diluții seriale de Ι_Τ-α1/β2 (și alte citokine unde a fost aplicabil) în 0,05 ml în plăci cu 96 godeuri și s-au adăugat 5000 celule HT29 tripsinizate în 0,05 ml mediu, conținând 0 sau 80 U/ml (unități antivirale) de IFN-γ uman.

Celulele HT29-14 sunt de la o subclonă a liniei HT29 originale derivată ATCC care este mai omogenă. în analize s-au folosit celule HT29-14; toate aceste rezultate pot fi observate, de asemenea, folosind linia originală HT29 derivată ATCC.

După 3-4 zile s-a măsurat reducerea colorantului MTT după cum urmează: s-au adăugat 101 MTT și după 3 ore, colorantul s-a dizolvat cu 0,09 ml de izopropanol cu 10 mM HCI și s-a măsurat O.D. la 550 nm. Formele receptor solubile preparate cum s-a descris aici, sau IgG uman pur s-au adăugat în 10 pl, înainte la celule pentru a obține un volum final de 5 pg/ml.

Fig.2A arată omorârea celulelor HT29 prin tratare cu mAb receptor anti-Fas CH-11 (care stimulează semnalizarea FasR); TNF, LT-a3,1_Τ-α1/β2 și Ι_Τ-α2/β1 liganzi în conjuncție cu IFN-γ. Inspectarea vizuală a celulelor tratate cu Ι_Τ-α1/β2 arată că acest agent mai degrabă omoară celulele decât chiar blochează proliferarea celulară.

în absența IFN-γ nu s-a observat nici un efect, reflectând capacitatea neobișnuită a IFN-γ de a influența cum celulele interpretează semnalizarea, de la familia de receptori TNF. Interferonii a și β au fost de 100 ori mai puțin eficienți, așa cum s-a cuantificat pe baza unităților de activitate antivirală.

Fig.2B prezintă inhibarea Ι_Τ-α1/β2 care omoară prin LT-p-R-Fc nu prin p60-TNF-RFc, demonstrând că citotoxicitatea este specifică pentru Ι_Τ-α1/β2. Lipsa inhibiției prin p60TNF-R-Fc arată că, respectiv, contaminarea LT-α (cunoscută ca fiind mai mică decât 1%) nu poate conta pentru activitatea citotoxică a ίΤ-α1/β2.

Exemplul 6. Anti-LT-P-R mAbs potențează omorârea celulelor HT29 prin complexe LT-a1/p2

Testele citolitice s-au realizat cum s-au descris în exemplul 5, cu excepția că IFN-γ și anti-LT^-R mAbs (serii 0,01-1000 ng/ml) s-au adăugat la celule la o concentrație finală 2x și apoi s-au adăugat 50 μΙ soluție de celule, la godeurile care conțin LT-a1/Ș2. Creșterea s-a analizat așa cum s-a descris în exemplul 5.

Fig.3 arată efectele diferențiale a doi anti-LT-Ș-R mAbs diferiți, în capacitatea lor de a potența activitate citotoxică ίΤ-α1/β2. Figura 3A arată că anti-LT-Ș-R mAb CDH10 potențează activitatea citotoxică ίΤ-α1/β2 într-un mod dependent de doză, iar fig.3B arată efectele altui anti-LT^-R mAb, BDA8 în același test.

BDA8 mAb mai degrabă inhibă activitatea citotoxică ίΤ-α1/β2 decât să potențeze moartea celulei tumorale.

Exemplul 7. Anti-LT-p-R mAbs imobilizați pot omorî celule tumorale HT29

Pentru a imobiliza anti-LT-Ș-R mAbs pe o suprafață de plastic, plăci de cultură de țesut cu 96 godeuri s-au acoperit cu 50 μΙ de anticorp monoclonal a 10 μΙ/ml capră anti-șoarece Fc (Jackson ImmunoResearch), apoi s-au spălat și blocat cu 5% FCS în PBS, urmată de captura anti-LT-p-R mAb indicată și altă spălare. Celule HT29 s-au etalat în godeurile acoperite mAb și testele citolitice s-au dirijat ca în exemplul 5.

RO 118634 Β1

Fig.4A ilustrează efectele citotoxice ale anti-LT-p-R mAbs BDA8 și CDH10 imobilizați, asupra celulelor HT29. Fiecare mAb individual provoacă citotoxicitate asupra celulelor tumorale, când este imobilizat pe o suprafață.

Fig.4B arată că aceiași anti-LT-p-R mAbs BDA8 și CDH10, testați individual în soluție nu sunt citotoxici și astfel, activitatea citolitică a unui singur anti-LT-P-R mAb in vitro pare a fi o funcție a imobilizării sale.

Exemplul 8. O combinație de anti-LT-p-R mAbs în soluție dirijată împotriva epitopilor distincți omoară celule HT29

Creșterea celulelor HT29 s-a analizat cum s-a descris în exemplul 5, cu excepția faptului că în mediul de creștere s-a inclus fie unul, fie doi anti-LT-(3-R mAbs. Tabelul 1 prezintă efectele asupra celulelor HT29 observate când în soluție s-au inclus diverși anti-LT-p-R mAbs (adică, neimobilizați pe plastic). Anti-LT-p-R mAbs pot fi aranjați în grupuri l-IV pe baza capacităților lor relative de a lucra în combinație unul cu altul într-un test citolitic HT29.

Rezultatele anti-LT-p-R mAbs s-au generat în teste citolitice, în paralel cu datele de legare receptor, care sugerează că mAbs din fiecare grup diferit, recunoaște epitopi diferiți ai LT-p-R.

Tabelul 1. Combinații ale anti-LT-P-R mAbs solubili sunt citotoxice față de celule adenocarcinomice umane HT29. Anti-LT-p-R mAbs sunt grupați în Grupurile I, II, III și IV pe baza efectelor lor, în combinație unul cu altul, în teste citolitice celulă HT29. Plusurile se referă la nivelul relativ al efectelor citolitice al combinației mAb asupra celulelor HT29 în prezență de 80 U/ml IFN-γ, nr= nerelevant; nd= nedeterminat.

935

940

945

950

Tabelul 1

Grup	Primul mAb	Al doilea mAb
Grup I	Grup II	Grup III	Grup IV
BDA8	AGH1	BCG6	BHA10	BKA11	CDH10	CBE11
I	BDA8	nr	-	+	++	+	nd	nd
AGH1	-	nr	++	+++	++	nd	nd
II	BCG6	++	++	nr	-	+++	nd	nd
BHA10	++	+++	-	nr	+	+++	++++
III	BKA11	+	++	+++	nd	nr	-	nd
CDH10	++	++	++	+++	-	nr	+++
IV	CBE11	nd	+	+	++++	nd	++++	nr

955

960

Fig.5A-D cuantifică efectele includerii în testul citolitic HT29 a perechilor reprezentative ale combinațiilor anti-LT-p-R mAbs care cooperează, orientate împotriva epitopilor diferiți ai LT-p-R.

Fig.5A arată efectele citolitice ale BHA10 și CBE11, fig.5B, ale CDH10 și CBE 11, și fig.5C, ale CDH10 și AGH1, singuri și în combinație. Fig.5D arată efectele citotoxice ale combinației mAb CDH10 și AGH1 în diferite linii de celule tumorale denumite WiDr.

Tabelul 2 rezumă caracteristicile anti-LT-p-R mAbs reprezentativi ai acestei invenții.

965

970

RO 118634 Β1

Tabelul 2

Rezumatul citotoxicitații HT29 a LT-3-R mAbs șoarece anti-uman

Grup mAb	Nume mAb	Colorare celulă³	Blocare legare receptor⁰ .	mAb imobilizat pe plastic⁰	mAb solubil singur	mAb solubil cu ίίαϊβΐ
I	BDA8	+++	+++	+	+/-^d	inhibă
I	AGH1	+++	+++	+	+/-	inhibă
II	BCG6	+++	++	+	+/-	amestecat
II	BHA10	+++	+++	+	+/-	amestecat
III	BHA11	+++	+/-	+	-	potențează
III	CDH10	+++	+/-	+	+/-	potențează
IV	CBE11	+++	+++	+	+/-	fără efect
Controale
	MOPC21	-	-	-	-	fără efect
	HT29/26	-	nd	-	-	fără efect
	TS2/9^e	nd	nd	-	-	fără efect

“colorație FACS a celulelor CHO transfectate cu LT-p-R;

“analiza a cercetat dacă anticorpul blochează legarea receptorului solubil la celula T activată hibridom 11-23. nd= nu s-a făcut;

“celule HT29 s-au crescut cu IFN-γ pe plăci acoperite anti-LT-p-R; “variabil, inhibiție parțială în unele teste, fără efect în altele; ^eun lgG1 de șoarece anti-uman LFA-3.

Exemplul 9. IFN-γ endogen ca bază pentru tratamentul celulelor tumorale

IFN-γ, un agent de activare LT-Ș-R preferat al prezentei invenții este o citokină care prezintă activitate antitumorală și care este tolerat de oameni. IFN-γ endogen prezent în mediul înconjurător al unei tumori poate fi la concentrații suficient de ridicate pentru a funcționa ca un agent de activare LT-Ș-R al acestei invenții fără adăugare de IFN-γ exogen.

Concentrația de IFN-γ în vecinătatea unei tumori poate fi stabilită folosind tehnici imunochimice standard, cu probe de țesut din regiunea tumorii. Dacă concentrația IFN-γ endogen este ridicată astfel încât să producă activitate antitumorală în combinație cu complexele heteromerice LT-α/β sau anti-LT-Ș-R mAbs ai acestei invenții (cum s-a determinat prin testele citolitice descrise aici), atunci nu este nevoie ca IFN-γ să fie administrat ca un al doilea agent de activare ίΤ-β-R în compozițiile acestei invenții.

Exemplul 10. Inducerea de IFN-γ endogen ca un agent de activare LT-p-R pentru tratamentul celulelor tumorale

Compușii care pot induce producerea endogenă a interferonilor ca IFN-γ intră în grupul agenților de activare ίΤ-β-R ai acestei invenții. De exemplu, interferonii pot fi induși prin tratare cu molecule ARN dublu bandă, cum ar fi acid poliriboguanilic/poliribocitidilic (poliG/C).

Femelele C57/b16 (în vârstă de 6-8 săptămâni) pot fi injectate cu 18 mg (600 mg/kg) de D-galactozamină, care sensibilizează șoarecii față de efectele TNF și altor agenți antitumorali. S-au adaugat o serie de concentrații de poli-G/C (Juraskova et al., Eur.J.Pharmacol., 221, p. 107-111 (1992)) în soluție salină neutră la ίΤ-α1/β2 (10-100 pg) și soluția s-a administrat la șoareci ca o injecție intraperitoneală (i.p.), iar activitatea antitumorală a ίΤ-α1/β2 va fi sporită de prezența ARN dublu bandă poli-rG/rC.

RO 118634 Β1

Similar, stimulatorul de interferon din planta Glycyrrhiza glabra (Acharya et al., Indian J. Med. Res., 98, p. 69-74 (1993)) poate fi administrat intravenos la oameni, la doze în domeniul de la 40 la 100 ml/zi. Doza optimă pentru activarea LT-p-R în prezența fie a complexelor heteromerice LT-α/β, fie a anti-LT-p-R Abs poate fi determinată empiric și va depinde de factori cum ar fi tipul tumorii, modul de eliberare și schema de eliberare.

Imiquimod R-837 (Berstein et al., Antiviral Res., 20, p.45-55 (1994)); Saparal (Paramonova et al., Vopr. Virusol., 39, p. 131-34 (1994)); Bropirimină (Onishi și Machida, Hinyokika Kiyo, 40, p. 195-200 (1994)); sau Ridostin (Cheknev et al., Vopr. Virusol., 39, p. 125-28 (1994)), pot fi de asemenea administrați ca agenți de activare LT-p-R în conjucție cu complexe heteromerice LT-α/β, anti-LT-p-R Abs, sau o combinație a lor.

în fiecare caz, modurile preferate de eliberare și dozele optime se pot determina empiric, folosind lucrări publicate ca puncte de plecare pentru optimizare, prin proceduri clinice de rutină.

Exemplul 11. Șoarecii tolerează injecții de ί.Τ-α1/β2 uman

Femele C57/b16 (în vârstă de 6-8 săptămâni), aclimatizate timp de câteva zile, s-au injectat i.p. cu 18 mg (600 mg/kg) de D-galactozamină, care sensibilizează șoarecii la efectele TNF și altor agenți antitumorali. Apoi, s-a administrat i.p. fie TNF uman, fie LT-α, fie LTα1/β2.

Tabelul 3 arată supraviețuirea șoarecilor tratați la 24 h după injectare.

1020

1025

1030

1035

Tabelul 3

Agent	Doză (pg/animal)	Supraviețuire
soluție salină f	-	4/4
hu-TNF	0,2	0/6
hu-TNF	1,0	0/2
hu-TNF	10	0/4
hu-LT-a	0,2	2/2
hu-LT-a	1,0	2/2
hu-LT-a1/p2	10	2/2
hu-LT-a1/p2	100	2/2

1040

1045

Exemplul 12. Construcția unui anticorp monoclonal recotnbinant IgM anti-LT-fi-R

Folosind testele citotoxicității antitumorale descrise mai sus, cuplate cu modele de creștere tumorală standard la șoareci imunodeficienți, se poate selecta un anti-LT-p-R cu proprietăți corespunzătoare, pentru a prepara domeniul ADN variabil de la ARN izolat din linii celulare hibridomice secretoare folosind metodologiile standard transcriptază inversă/PCR cu primeri universali care hibridizează la fiecare dintre domeniile catenei grele și ușoare ale IgG. Aceste protocoale.au fost descrise (Arulanandam et al., J. Exp. Med., 177, p. 1439-50 (1993); Lane et al., Eur. J. Immunol., 22, p. 2573-78 (1993); Traunecker et al., Nature, 339, p.68-70 (1989)).

Apoi, produsele amplificate sunt asamblate în vectori care conțin domeniile catenei u CH1, CH2, și CH3. Coexpresia celor două catene într-o singură gazdă va permite asamblarea catenelor grea și ușoară într-o moleculă pentamerică IgM. Această moleculă este o himeră compusă din regiunile variabile de la șoarece, cuplate la regiuni constante umane.

1050

1055

1060

RO 118634 Β1

Alternativ, poate fi folosit un procedeu care folosește PCR pentru a amplifica ADN care codifică numai regiuni de legare prezente ale regiunilor variabile. ADN amplificate se inserează apoi în vectori care conțin toate secvențele IgG, cu excepția aminoacizilor prezenți, implicați în legarea antigenului. Astfel de construcții sunt numite anticorpi umanizați, și metodele detaliate pentru producerea lor sunt binecunoscute (de exemplu, WO 94/04679).

Exemplul 13. Funcția anticorpilor monoclonali IgM anti-LT-p-R ca agenți de activare LT-P-R

Anticorpi IgM anti-LT-3-R se pot prepara într-o formă recombinantă, așa cum s-a descris în exemplul 12. Alternativ, se pot folosi ca o sursă de anti-LT-p-R IgM mAbs, IgM complet, de șoarece izolat prin prin tehnici de fuziune hibridom, folosind imunizarea primară a șoarecilor normali sau imunizarea extensivă a șoarecilor deficienți semnalizare CD40 (Kawabe etal., Immunity, 1, p. 167-78 (1994); Xu etal., Immunity, 1, p.423-31 (1994)).

Anti-LT-p-R IgM mAbs vor fi semnificativ mai puternici ca agenți de activare LT-Ș-R, decât partenerii lor normali IgG bivalent, cum s-a măsurat prin comparații doză - răspuns, în testul citolitic HT29, în prezență de IFN-γ. Anti-LT-p-R IgM mAbs funcționează ca agenți de activare LT-Ș-R atât când ei sunt imobilizați, cât și când sunt administrați în soluție. Suplimentar, sperăm că ei vor spori activitatea antitumorală a complexelor heteromerice LT-α/β.

Exemplul 14. Anticorpi monoclonali anti-LT-p-R inhibă creșterea celulelor tumorale umane la șoareci SCID

Șoareci Balb/c SCID (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) s-au injectat subcutanat (s.c.) pe spatele animalului, cu celule adenocarcinomice umane WiDr tripsinizate și spălate, la 1x10⁶ într-un volum de 0,2 ml PBS. Celulele WiDr injectate formează tumori la șoareci și s-a urmărit capacitatea unui anti-LT-p-R mAb de a inhiba creșterea tumorii. într-un set de experimente, șoarecii s-au tratat cu sau fără CBE11 anti-LT-p-R mAb, cu sau fără IFN-γ uman (10⁵ unități antivirale/șoarece) la același moment cu inocularea s.c. a celulelor WiDr (fig.6A).

Anticorpii și IFN-γ s-au administrat singuri sau împreună prin injectare i.p. în 0,2 ml. Șoarecii de control s-au injectat numai cu soluție salină, IFN-γ singur sau un control antiuman LFA-3 mAb (1E6) cu IFN-γ. Mărimea fiecărei tumori rezultate a primit un scor la 30 zile după inoculare. Volumul tumorii (în cc) s-a calculat de la radius cum s-a determinat prin măsurători cu șublerul în 2 dimensiuni. Animalele tratate cu CBE11 sau 1E6 mAbs au primit 10 pg/șoarece sau 50 pg/șoarece anticorp (fig.6A; cercuri cu puncte și, respectiv, cercuri deschise).

în alt set de experimente, șoarecii s-au inoculat s.c. cu celule WiDr, și tumorile s-au lăsat să crească timp de 15 zile înainte ca șoarecii să fie tratați cu CBE11 anti-LT-p-R mAb (fig.6B). în ziua 15 (înainte de tratament anticorp) volumul mediu al tumorii a fost 0,076 cm cu un diametru mediu de 0,53 cm. Apoi, s-a administrat CBE11 anti-LT-p-R mAb (50 pg), cu sau fără IFN-γ (10⁶ unități antivirale/șoarece) prin injecție i.p. in 0,2 ml la un grup de 12 animale.

Injecțiile s-au repetat mai mult de 3 ori pe o perioadă de 3 săptămâni. Grupurile de control (12 șoareci/grup) s-au injectat cu IFN-γ singur (10⁶ unități antivirale/șoarece) sau cu 50 pg dintr-un control anti-uman LFA-3 mAb (1E6) + IFN-γ (10⁶ unități antivirale/șoarece). Creșterea tumorilor prezente la ziua 15 a primit scor în perioada de timp de la 15 la 49 zile, postinoculare celulă tumorală. Rezultatele prezentate în fig.6B s-au determinat într-un format în orb. Tumorile tratate cu CBE11 mAb cu sau fără IFN-γ au stopat creșterea. După 3 injecții de CBE11 mAb (+/-IFN-γ) timp de 3 săptămâni, creșterea tumorii s-a oprit timp de cel puțin 7 săptămâni după inoculare, moment la care experimentul s-a terminat.

Claims

Revendicări

1. Compoziții farmaceutice pentru activarea semnalizării receptorului limfotoxină-β, caracterizate prin aceea că, cuprind un complex heteromeric LT-α/β și cel puțin unul sau doi agenți de activare ίΤ-β-R, precum și un.purtător acceptabil farmaceutic.
2. Compoziții conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că agentul de activare cuprinde o cantitate eficientă terapeutic de IFN-γ sau un anticorp sau un anticorp antiLI>R.
3. Compoziții conform revendicării 2, caracterizate prin aceea că anticorpul ίΤ-β-Ρ este un anticorp monoclonal și este selectat din grupul ce constă din anti-LT^-R mAb BKA11, CDH10, BCG6 și BHA10.
4. Compoziții conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că anticorpul anti-LTβ-R este CBE11.
5. Compoziții, conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că, cuprind cel puțin doi anticorpi monoclonali anti-LT^-R care sunt dirijați împotriva epitopilor nesuprapuși ai LTβ-R.
6. Compoziții conform revendicării 5, caracterizate prin aceea că un anticorp monoclonal anti-LT^-R este selectat din grupul ce constă din AGH1 și BDA8, și alt anticorp monoclonal anti-LT^-R este selectat din grupul constând din BCG6, BH10, BKA11, CDH10 și CBE11.
7. Compoziții conform revendicării 5, caracterizate prin aceea că un anticorp monoclonal anti-LT-8-R este selectat din grupul care constă din BCG6 și BHA10 și alt anticorp monoclonal anti-LT^-R este selectat din grupul care constă din AGH1, BDA8, BKA11 și CBE11.
8. Compoziții conform revendicării 5, caracterizate prin aceea că un anticorp monoclonal anti-LT^-R este selectat din grupul care constă din BKA11 și CDH10 și alt anticorp monoclonal anti-LT^-R este selectat din grupul care constă din AGH1, BDA8, BCG6, BHAIOși CBE11.
9. Compoziții conform revendicării 5, caracterizate prin aceea că un anticorp monoclonal anti-LT^-R este CBE11 și alt anticorp monoclonal anti-LT^-R este selectat din grupul care constă din AGH1, BDA8, BCG6, BHA10, BKA11, CDH10 și CBE11.
10. Compoziții conform revendicării 5, caracterizate prin aceea că anticorpii monoclonali anti-LT-8-R sunt CBE11 și BH10.
11. Compoziții conform revendicării 5, caracterizate prin aceea că anticorpii monoclonali anti-LT^-R sunt CBE11 și CDA10.
12. Compoziții conform revendicării 5, caracterizate prin aceea că anticorpii monoclonali anti-LT^-R sunt AGH1 și CDH10.
13. Compoziții conform revendicării 5, caracterizate prin aceea că agentul de activare ίΤ-β-R este IFN-γ.
14. Compoziții conform revendicării 2, caracterizate prin aceea că, respectiv, cantitatea eficientă terapeutic a anticorpilor legați anti-LT^-R ca un prim agent de activare LTβ-Rse află în prezența unui al doilea agent de activare ίΤ-β-R și a unui purtător acceptabil farmaceutic.
15. Compoziții conform revendicării 14, caracterizate prin aceea că anticorpii legați anti-LT^-R sunt imobilizați necovalent pe o suprafață.
16. Compoziții conform revendicării 14, caracterizate prin aceea că anticorpi legați anti-LT^-R sunt imobilizați covalent pe o suprafață.

1110

1115

1120

1125

1130

1135

1140

1145

1150

RO 118634 Β1

1155

1160

1165
17. Compoziții conform revendicării 14, caracterizate prin aceea că anticorpii legați anti-LT-p-R sunt imobilizați necovalent, agregați în soluție prin intermediul unui agent de legare a unui anticorp anti-LT-p-R.
18. Compoziții conform revendicării 17, caracterizate prin aceea că agentul de legare anticorp anti-LT-p-R cuprinde un anticorp secundar îndreptat împotriva anticorpului anti -LT-p-R.
19. Compoziții conform revendicării 17, caracterizate prin aceea că agentul de legare anticorp anti-LT-p-R cuprinde un receptor Fc, care se leagă la anticorpul anti-LT-p-R.
20. Compoziții conform revendicării 14, caracterizate prin aceea că anticorpii antiL-p-R legați sunt agregați covalent în soluție, prin intermediul unui agent chimic de legare a unui anticorp anti-LT-p-R.
21. Compoziții conform revendicărilor 14...20, caracterizate prin aceea că al doilea agent de activare anti-LT-p-R cuprinde IFN-γ.
22. Compoziții conform revendicării 1, caracterizate prin aceea că, respectiv, complexul heterometric LT-α/ρ are o stoichiometrie LT-a1/p2.