CZ236197A3 - Komplexy alfa/beta-lymfotoxinu a protilátky anti-lymfotoxin-beta-receptoru jako protinádorová činidla - Google Patents
Komplexy alfa/beta-lymfotoxinu a protilátky anti-lymfotoxin-beta-receptoru jako protinádorová činidla Download PDFInfo
- Publication number
- CZ236197A3 CZ236197A3 CZ972361A CZ236197A CZ236197A3 CZ 236197 A3 CZ236197 A3 CZ 236197A3 CZ 972361 A CZ972361 A CZ 972361A CZ 236197 A CZ236197 A CZ 236197A CZ 236197 A3 CZ236197 A3 CZ 236197A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- beta
- antibody
- alpha
- antibodies
- monoclonal
- Prior art date
Links
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 title description 7
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 claims abstract description 146
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims abstract description 93
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 63
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 31
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 claims abstract description 6
- 102100026238 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 claims description 135
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 97
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 81
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 28
- 102100024158 Cadherin-10 Human genes 0.000 claims description 23
- 101000762229 Homo sapiens Cadherin-10 Proteins 0.000 claims description 23
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 21
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 11
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 claims 3
- 101100063431 Arabidopsis thaliana DIM gene Proteins 0.000 claims 1
- 101000702734 Homo sapiens Spermatid-specific manchette-related protein 1 Proteins 0.000 claims 1
- 241000234435 Lilium Species 0.000 claims 1
- 241001471435 Narcine Species 0.000 claims 1
- 108010019477 S-adenosyl-L-methionine-dependent N-methyltransferase Proteins 0.000 claims 1
- 102100030920 Spermatid-specific manchette-related protein 1 Human genes 0.000 claims 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 claims 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 claims 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 claims 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 claims 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 49
- 102100026894 Lymphotoxin-beta Human genes 0.000 abstract description 14
- 108090000362 Lymphotoxin-beta Proteins 0.000 abstract description 13
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 abstract description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 105
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 78
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 78
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 36
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 36
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 32
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 28
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 23
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 22
- 102100033732 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Human genes 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 101000801228 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 description 20
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 20
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 20
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 20
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 20
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 18
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 17
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 17
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 17
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 15
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 14
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 14
- 238000011266 cytolytic assay Methods 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 12
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 12
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 12
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 12
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 11
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 11
- -1 bis-N-maleimido-1 Chemical class 0.000 description 10
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 9
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 7
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 7
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 7
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 7
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 6
- 108010084313 CD58 Antigens Proteins 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 239000002799 interferon inducing agent Substances 0.000 description 6
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 6
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 description 5
- 101000764535 Homo sapiens Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 5
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 4
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 4
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 4
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 4
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- DOUYETYNHWVLEO-UHFFFAOYSA-N imiquimod Chemical compound C1=CC=CC2=C3N(CC(C)C)C=NC3=C(N)N=C21 DOUYETYNHWVLEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 3
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 3
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 3
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 3
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZMRMMAOBSFSXLN-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)phenyl]butanehydrazide Chemical compound C1=CC(CCCC(=O)NN)=CC=C1N1C(=O)C=CC1=O ZMRMMAOBSFSXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000303040 Glycyrrhiza glabra Species 0.000 description 2
- 235000006200 Glycyrrhiza glabra Nutrition 0.000 description 2
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 description 2
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactopyranuronic acid Natural products OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1O AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 108010052621 fas Receptor Proteins 0.000 description 2
- 102000018823 fas Receptor Human genes 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 229960002751 imiquimod Drugs 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- XMQUEQJCYRFIQS-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-amino-5-ethoxy-5-oxopentanoic acid Chemical compound CCOC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O XMQUEQJCYRFIQS-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- YOSRLTNUOCHBEA-ATLBLLJHSA-N (2s,3s,4s,5r)-6-[[(3s,4ar,6ar,6bs,8as,12as,14ar,14br)-4,4,6a,6b,11,11,14b-heptamethyl-8a-[(3s,4r,5r,6s)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxycarbonyl-1,2,3,4a,5,6,7,8,9,10,12,12a,14,14a-tetradecahydropicen-3-yl]oxy]-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carbo Chemical compound O([C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2C1(C)C)C)(C)CC[C@]1(CCC(C[C@H]14)(C)C)C(=O)OC1[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1)O)C1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O YOSRLTNUOCHBEA-ATLBLLJHSA-N 0.000 description 1
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 description 1
- NLPWSMKACWGINL-UHFFFAOYSA-N 4-azido-2-hydroxybenzoic acid Chemical class OC(=O)C1=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C1O NLPWSMKACWGINL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000945 Amylopectin Polymers 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- CIUUIPMOFZIWIZ-UHFFFAOYSA-N Bropirimine Chemical compound NC1=NC(O)=C(Br)C(C=2C=CC=CC=2)=N1 CIUUIPMOFZIWIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N Citric acid monohydrate Chemical compound O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-DTEWXJGMSA-N D-Galacturonic acid Natural products O[C@@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-DTEWXJGMSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101150064015 FAS gene Proteins 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000764294 Homo sapiens Lymphotoxin-beta Proteins 0.000 description 1
- 229920000869 Homopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-Glutamic acid Natural products OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-DHVFOXMCSA-N L-galactose Chemical compound OC[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108010091221 Lymphotoxin beta Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000018170 Lymphotoxin beta Receptor Human genes 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 101001044384 Mus musculus Interferon gamma Proteins 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100269369 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) AGE1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 101710187743 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 description 1
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- IAJILQKETJEXLJ-RSJOWCBRSA-N aldehydo-D-galacturonic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-RSJOWCBRSA-N 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N alpha-D-glucuronic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 1
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N beta-D-glucosamine Chemical compound N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 229950009494 bropirimine Drugs 0.000 description 1
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229960002303 citric acid monohydrate Drugs 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000011970 concomitant therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000011254 conventional chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-YBSDWZGDSA-N d-mannuronic acid Chemical compound O[C@@H]1O[C@@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-YBSDWZGDSA-N 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000011037 discontinuous sequential dilution Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000012537 formulation buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 206010019692 hepatic necrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002463 imidates Chemical class 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003960 inflammatory cascade Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- BQINXKOTJQCISL-GRCPKETISA-N keto-neuraminic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)C[C@H](O)[C@@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO BQINXKOTJQCISL-GRCPKETISA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 102000003835 leukotriene receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000146 leukotriene receptors Proteins 0.000 description 1
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000008297 liquid dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 231100000149 liver necrosis Toxicity 0.000 description 1
- 210000003810 lymphokine-activated killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 231100000682 maximum tolerated dose Toxicity 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- HOGDNTQCSIKEEV-UHFFFAOYSA-N n'-hydroxybutanediamide Chemical class NC(=O)CCC(=O)NO HOGDNTQCSIKEEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N neuraminic acid Natural products NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 210000004882 non-tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002338 polyhydroxyethylmethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000007114 proinflammatory cascade Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N propionamide Chemical group CCC(N)=O QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 1
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 1
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000009664 saparal Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000008299 semisolid dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 231100000004 severe toxicity Toxicity 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007909 solid dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000008227 sterile water for injection Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Chemical class 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012608 weak cation exchange resin Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/191—Tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin [LT], i.e. TNF-beta
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/74—Inducing cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Způsob léčby nebo omezení pokračováni, závažnosti nebo účinků neoplazie, jakož i způsob volby LT-beta-R aktivujícího činidla, farmaceutický prostředek a LT-beta-R aktivující činidlo
Oblast techniky
Vynález se týká prostředků a způsobu použitelných pro aktivaci signalizace receptoru lymfotoxinu-beta, která pak vyvolává silné ant i proi i ferat i vn í účinky na nádorové buňky. Zejména se vynález týká heteromerních iymfotoxinových komplexů vytvořených mezi i ymfo toxi ne m — a i f a a více pod j e dnotkám i lymfotoxinu-beta, které indukují cytotoxické účinky na nádorová buňky za přítomnosti i ymf o t o x i n—beta rscsctor aktivačních činidel. Do rozsahu vynálezu spadají též protilátky zaprofl· 1 y ΪΗ £ CC QX I b 6 13, rzCS^tOtU, která pŮSObí JcikO i y iBLO t GX i n~ be 13, rSCSOÍOb 3kfÍVUjlCÍ G 1 η Ϊ d i 3 S3mQfná ficbo v kombineci s i i n y m i 1 yíh f o to x i nu— b s ts. receptor aktivujícími činidly bud v přítomnosti nebo v nepřítomnosti komplexů iymfotoxinu-aifa/beta. Předmětem vynálezu je též screeningová metoda pro selekci těchto protilátek. Vynález se také týká prostředků a způsobů používajících zesítěných protilátek ant i-±ymf oto:· z i ri - n a i pritomnosti mycn rymrotoxin-neta receptor ant ivujicicn cimaei za uceiem potencování cytotoxicity buněk.
Dosavadní stav techniky
Rodina receptoru faktoru nekrotizujicího nádory (THF) má několik členů, jejichž signalizace může vyvolat smrt buňky nekrózou nebo apoptózou (programovaná smrt buňky). Ligandy TNF a lymfotoxinu-aifa (LT-aifa, dříve nazývaný TNF-beta) se váží na a aktivují TNF
| TNF receptory | (p 6 0 a | p80, zde nazývané |
| Τ NF~~R iniciuj | e obecné | imunitní odpovědi |
| v normálních | buňkách, | je ale cytotoxic- |
| nsformovánými | fenotypy | nebo vůči nádoro- |
TNF-R signál izace může způsobit selektivní lyží vým nunkac —· .2 • · · · • · · · · · • · · • · · · · · nádorových buněk a buněk infikovaných viry. Cytotoxické účinky signalizace TNF-R na nádorové buňky se zvětší interferonem-gama (IFN-gama) a různými obvyklými chemoterapeutickými prostředky.
Bylo by užitečné využít antiproliferativní nebo cytotoxické aktivity indukované TNF-R signalizací v nádorových buňkách pro terapeutické účely. Aktivace TNF-R však má pleiotropní účinky na řadu imunoreguiačních odpovědí včetně iniciace prozánět1ivých kaskád. Nebylo tedy možné zaměřit cytotoxické účinky signalizace TNF-R na nádorové buňky bez současné stimulace zánětiivých odpovědí, které vedou u lidí k celkové toxicitě.
Podob US může stimulace receptorů nazvaného Fas receptor tu programovaným úmrtím buněk u tak nenádorových buněk. Bylo vša způsobuje rychlou nekrózu jater, utickou aplikaci u lidí.
jiného s TNF příbuzného (FasR) aktivovat cytotoxicirůzných typů jal: n á d o r o v ý c h \ Prokázáno žs skfciVHCe FhsE. čímž znemožňuje jeho terepeNedávno byl identifikován jiný receptor v rodině TNF, nazývaný LT-beta receptor (LT-beta—R) (Crowe a spoi., Science, 254, str. 707 až 710 (1994)). LT-beta-R váže heteromerní lymfotoxinové komplexy (LT-alfa/beta), které obsahují LT-alfa podjednotky v kombinaci s jiným s TNF příbuzným polypeptidem zvaným lymfotoxin-beta (LT-beta). Tyto LT-aifa/beta komplexy jsou spojeny membránou a většinou maj
LT-alfal/beta2 (Browning a spoi.. Cell, 72, str (1993), Browning a spoi., J. Immunol., 154, (1995) ) .
stechiometri i 847 až 856 str. s.
až 46
Má se za to, že analogicky s TNF-R a jinými receptory podobnými TNF dochází k aktivaci signalizace LT-beta-R, když je přivedeno více receptorů na povrchu buňky do těsné blízkosti (Crowe a spoi, Science, 264, str. 707 až 710 (1994)). Tento proces je nazýván kumulace receptorů. Ligandy TNF a LT jsou multivalentní komplexy, které mohou současně vázat a tak r·?.' tvořit agregát více než s jedním recectorem. Kumulace receptářů jako prostředek pro aktivaci receptorú v jiných systémech byla dobře dokumentována, zejména pro receptor tyrosin kinasy (Ullrich a Schlesinger, Cell, 61, str. 203 až 212 (1990), Kolanus a spol., Cell, 74, str. 171 až 133 (1993)). Aplikace ligandů LT-alfal/beta2 nebo/a LT-beta-R aktivujících činidel, která může indukovat na povrchu cílových nádorových buněk kumulaci a signalizaci molekul LT-beta-R ve směru exprese genu, by tedy byla užitečná pro přímou stimulaci cesty LT-beta-R v těchto buňkách.
Signalizace pomocí LT-beta-R, podobně jako TNF-R, může aktivovat cesty, které vedou k cytotoxicitě a smrti buňky u nádorových buněk. Důležité je, že ligandy LT-alfal/beta2 se nevážou na TNF —R žádnou významnou afinitou. Z toho důvodu řízená aktivace LT-beta-R v nádorových buňkách by vyvolala cytotCXÍCifcU V těchto buňkách b6Z CtímUlSCS záilětlivych CčSt spojené s sktivscí TNF-R,. Léčbs. s LT — 3.1 tsl/beteZ neboZs s ji — nými LT—bets—R. aktivujícími činidly by tedy byla užitečná pro léčení nebo omezení pokračování, závažnosti nebo účinků nádorových buněk (neoplazie) za závažnými vedlejšími účinky, zkoušena aktivace TNF—R nebo současného překonání problémů se
FasR jako vyskytovaly, kdys byla n r o t i n á d o r o v á léčba.
Podstata vynálezu
Vynález řeší shora uvedené problémy tím, že poskytuje farmaceutické prostředky a způsoby pro léčbu nádorových buněk stimulací signalizace LT-beta-R bez současné stimulace zánětlivých odpovědí spojených s TNF-R. Podle jednoho provedení jsou poskytnuty komplexy lymfotoxinu vytvořené mezi LT-alfa a více podjednotkami LT-beta (LT-alfa/beta heteromerní komplexy), které indukují cytotoxické účinky na buňky, které nesou LT-beta-R v přítomnosti LT-beta-R aktivujícího činidla. Výhodnými prostředky a způsoby podle tohoto provedení jsou komplexy LT-alfal/beta2 v přítomnosti LT-beta-R aktivaččinidla. Výhodněji jsou LT-alfal/beta2 komplexy v rozpustné formě spíše než ve formě vázané na membránu a LT-beta-R akti• · —••4 »· • · ·
vačním činidlem je IFN-gama.
Podle jiného provedení vynálezu je nejméně jedna protilátka, zaměřená proti LT-beta-R (anti-LT-beta-R protilátka), použita jako druhé LT-beta-R aktivující činidlo ve spojení s heteromerním komplexem LT-alfa/beta. Výhodné prostředky a způsoby podle tohoto provedení se vyznačují LT-alfal/beta2 v přítomnosti IFN-gama jako prvního aktivujícího činidla a nejméně jedné anti-LT-beta-R protilátky jako druhého LT-beta-R aktivujícího činidla. Výhodněji jsou LT-alfal/beta2 komplexy rozpustné a protilátka je monoklonální protilátka (anti-LT-beta-R mAb).
Podle jiného provedení je použita nejméně jedna anti-LT-beta-R protilátka v přítomnosti nebo nepřítomnosti druhého LT-beta-R aktivujícího činidla bez excgenního
LT-alfa/beta heteromerního komplexu. Výhodné prostředky a způsoby podle tohoto provedení obsahují nejméně dvě anti-LT-beta-R monoklonální protilátky (anti-LT-beta-R mAbs), které rozpoznávají nepřekrývající se epitopy LT-beta-R v kombinaci s IFN-gama.
Předmětem dalšího provedení vynálezu jsou farmaceutické prostředky a způsoby pro potencování cytototoxicity pro nádorové buňky, které se vyznačují tím, že se používají zesítěné anti-LT-beta-R protilátky ve spojení s druhým LT-beta-R aktivačním činidlem. Podle výhodného provedení jsou jednotlivé antí-LT-beta-R protilátky imobi 1 izovány zesítěním na povrch. Podle jiného výhodného provedení jsou anti-LT-beta-R protilátky zesítěny v roztoku. Výhodněji jsou anti-LT-beta-R protilátky monoklonální protilátky a druhým LT-beta-R aktivujícím činidlem je IFN-gama.
Předmětem vynálezu je dále nový screeningový proces pro selekci LT-beta-R aktivujících činidel, jako například anti-LT-beta-R protilátek, které působí v kombinaci s LT-alfa/beta heteromerními komplexy k urychlení smrti nádorových buněk. Test využívá zvýšené senzitivity humánních ade— · ·5 nokarcinomatózních buněk vůči lexům v přítomnosti LT-beta-R cytotoxicitu. Postup použitý LT-beta-R aktivujících činidel tek anti-LT-beta-R a sestává z
LT-alfa/beta heteromemím kompakt i vuj íc ích činidel v testu na k testovaní předpokládaných je popsán na příkladu protilánás leduj í c ích operací:
1) Nádorové buňky (například lidské adenokarcinomatózní buňky HT29) se kultivují několik dní v médiu obsahujícím IFN-gama a purifikovaný LT-alfal/beta2 v přítomnosti nebo nepřítomnosti příslušné testované anti-LT-beta-R protilátky.
2) Na buňky se působí barvivém buňky.
které obar’
3) Spočítají se obarvené buňky, aby se stanovil podíl nádorových buněk usmrcených za přítomnosti LT-alfal/beta2, IFN-gama a testované anti-LT-beta-R protilátky v každém vzorku. Alternativně se může stanovit počet přežívájících buněk libovolným z řady dobře známých testů, kterými se měří životaschopnost buněk, jako například inkorporací 3H-thimidiau do DNA.
Jednou z antí-LT-beta-R protilátek (nebo kombinace protilátek), která zvyšuje významně procento nádorových buněk usmrcených v tomto testu, je LT-beta-R aktivující činidlo v rámci rozsahu tohoto vynálezu. Tento cytolytický test může být přizpůsoben pro identifikaci nových LT-beta-R aktivujících činidel, která fungují v kombinaci s LT-alfa/beta heteromerními komplexy.
Vynález je Ilustrován na přiložených výkresech takto:
Obrázek 1A
Třídící analýzy purifikovaných forem LT-alfa/beta heteromerního komplexu rozdělených pomocí TNF-R a LT-beta-R imunoafini tni chromatograf ie
- 6 Purifikované proteiny byly analyzovány na pryskyřici TSK 3000 HPLiC ve fyziologickém roztoku, pufrovaném fosfátem. Je znázorněna poloha různých ukazatelů velikosti.
Obrázek 1B lontoměničcvé analýzy purifikovaných LT forem za použití karboxymethylové kolony Poros (4,6 mm x 100 mm) na přístroji BioCad (Perceptive Biosystems) pg každého vzorku proteinu se vneslo na kolonu a eluovalo se v gradientu 0 až 1 M NaCl přes 20 objemů kolony při 5 mi/minuta v pufru obsahujícím 16,66 pM Hepes, 16,66 pM octanu sodného a 16,66 pM pufru Mes (pH 6,5).
Obrázek 2A
Srovnání cvtotoxické aktivity Anti-Fas receptcru mAb CH-11 ( —>-) , TN? <-£?-}, LT-alfa (-□-). LT-alfal/betaB (-®-) a LT-alfa2/betal (—$—) na humánní adenokarcinomatózní buňky HT29 jak v přítomnosti tak v nepřítomností 80 U/mí IFN—gama.
Obrázek 2B
Srovnání schopnosti 5 pg/ml humánního IgG (—·—), rozpustného p60TNF-R-Fc (—-O-) a rozpustných LT-beta-R-Fc receptor-imunoglobul·lnových chimér (— D -) inhibovat cytotoxické účinky v obr. 2A za přítomnosti 80 U/ml IFN-gama.
Obrázek 3
Anti-LT-beta-R monoklonální protilátky potencnjí cytotoxický účinek LT-alfal/beta2 na humánní adenokarcinomatózní buňky HT29 .
(A) Cytolytické účinky LT-alfal/beta2 na buňky HT29 jsou potencovány přítomností anti-LT-beta-R monoklonálních protilátek CDH10.
-..7 ·»· « · ·
Účinky LT-alfal/beta2 byly změřeny bez monokionáiní protilátky (—# —) a v přítomnosti 0,5 pg/ml kontrolního IgGl
0,05 pg/ml CDH10 (-O-) a 0,5 ug/ml (-□-) CDH1Q.
(B) Cytolytické účinky LT-alfal/beta2 na buňky HT29 jsou inhibovány přítomností anti-LT-beta-P. monokionáiní protilátky BDA8 .
Účinky LT-alfal/beta2 byly změřeny za přítomnosti 2 pg/ml kontrolního IgGl (-ft —) nebo anti-LT-beta-R mc-noklonální protilátky BDA8 (—O—). Rozdíl mezi chováním CDH1Q a BDAtí anti-LT-beta-R monokionáiních protilátek v tomto testu je jednou z indikací, že jsou zaměřeny na rozdílné epitopy LT-beta-R.
Obrázek 4
Imobilizované anti-LT-beta-R protilátky jsou cytotoxické vůči humánním adenokarcinomatózním buňkám HT29 .
(A) Anti-LT-beta-R monokionáiní protilátky mají přímý cytotoxický účinek na buňky HT29, když jsou imobi1izovány na povrchu .
Destičky byly pokryty IgGl (-·-), monokionáiní protilátkou zaměřenou proti nepřibuznému hojnému antígenu buněčného povrchu HT29/26 BDA8 (-O-) a CDH10 (-Π-).
(B) Účinky rozpustných anti-LT-beta-R monokionáiních protilátek samotných na růst buněk HT29.
Symboly jako v (A). Tyto anti-LT-beta-R monokionáiní protilátky v své rozpustné formě nemají významné cytotoxické účinky na buňky HT29, když jsou aplikovány individuálně.
- .8 • ·
Obrázek 5
Reprezentativní kvantifikace zvýšené cytotoxicity vůči nádorovým buňkám působením dvojic rozpustných anti —LT—beta—R mo— noklonálních protilátek.
(A) Cytotoxické účinky kontrolního IgGl (100 ng/ml), anti-LT-beta-R mAb BHA10 (100 ng/ml), anti-LT-beta-R monoklonální protilátky CEE11 (50 ng/ml), BHA10 (100 ng/ml) + IgG (100 ng/ml) a BEA10 (100 ng/ml) + CBE11 (50 ng/ml)na buňky HT29. IFN-gama byl přítomen s 80 U/ml.
(B) Cytotoxické účinky kontrolního IgGl anti—LT—beta—R monoklonální protilátky CDS10 anti-LT-beta-R monoklonální protilátky CBE11 CDH1Q (100 nc/mi) + IgGl Í1QQ ng/ml) a CDE10 CBE11 (50 ng/ml) na buňky ST29. IFN—gama byl (100 ng/ml) , (100 ng/ml), (50 ng/ml), (100 ng/ml + přítomen s 80
U/n ng/ml), ng/ml), ng/ml) IFN-gama (C) Cytotoxické účinky kontrolního IgGl (100 ant i-LT-beta-R monoklonální proti látky CDE10 (33 anti-LT-beta-R monoklonální protilátky AGH1 (50 a C DE10 (33 ng/ml) + AGEl (50 ng/ml) na buňky HT2 9 . byl přítomen s 80 U/ml.
(D) Jako u (C) s tím rozdílem, že v cytoLytickém testu byly použity humánní adenokarcinomatozní WiDr buňky (Raitano a Korc, J. Bioi. Chen., 265, str. 10466 až 10472 (1990)).
Obrázek 6
Velikost nádoru u myší SCID léčených protilátkou anti-LT-beta-R (A) Velikost humánního adenokarcinomu WiDr u myší SCID 30 dní po inokulaci se současnou léčbou protilátkou
Myším byl aplikován 1. a 2. den fyziologický roztok, samotný IFN-gama, anti-LT-beta-R monoklonální protilátka (CBE11) s a bez IFN-gama a kontrolní anti-humánní LFA-3 monoklonální protilátka (1E6) s IFN-gama. Průměr z každé skupiny je naznačen příčnou čarou. Průměry, standardní odchylky a počet zvířat (v závorkách) pro pět skupin (odleva doprava) byly: 0,88 + /- 0,59 (14), 1,21 + /- 0,7 (21), 0,041 +/- 0,052 (16), 0,11 +/- 0,1 (12) a 0,98 +/- 1,16 (12).
(B) Velikost humánního adenokarcinomu WiDr u myší SCID od 14. do 49. dne po inokulaci nádorových buněk s 15-tidenní postinokulační léčbou protilátkou
Nádory se nechaly narůst do středního průměru 0,53 cm (0,076 cm3) bez jakékoliv léčby a s i.p. injekcemi se započalo 15. den a pokračovalo se, jak naznačeno šipkami. Průměry a standardní odchylky jsou naznačeny pro skupinu 12 zvířat léčených buď samotným IFN-gama (1 x 106 U/injekce) (- -),
IFN-gama s 50 pg 1E6 anti-LFA-3 monoklonální protilátky (- -), IFN-gama s 50 pg CBE11 anti-LT-beta-R monoklonální protilátky (- -) nebo 50 pg CBE11 anti-LT-beta-R monoklonáiní protilátky samotné (neznázorněno).
Aby byl zde popsaný vynález zcela srozumitelný, je dále uveden následující detailní popis.
Výraz ”protinádorová aktivita” se týká schopnosti substance nebo prostředku blokovat proliferaci nádorových buněk nebo indukovat smrt nádorových buněk, u nichž dochází k interakci s uvedenou substancí nebo prostředkem.
Výraz ”apoptóza” se týká procesu naprogramované smrti buněk.
Výraz ”cytotoxická aktivita” se týká schopnosti substance nebo prostředku vyvolat smrt buněk, u nichž dochází k interakci s touto substancí nebo prostředkem.
Výraz ”epitop” (nebo antigenní determinanta) znamená .10
I · · část molekuly, která se spojuje s jediným místem na molekule protilátky pro vázání antigenu. Jediný epitop se rozpoznává monoklonální protilátkou (mAb). Více epitopů se normálně rozpoznává polyklonálními protilátkami (Abj.
Fc doména protilátky se týká části molekuly obsahující CH2, CHa a pantové oblasti, ale postrádající vazebná místa pro antigen.
Výraz činidlo indukující interferon se týká kteréhokoliv činidla, které je schopno přímo nebo nepřímo stimulovat endogenní produkci libovolného interferonu typu I (IFN-alfa, IFN-beta) nebo typu II (IFN-gama). Příklady činidel indukujících interferon zahrnují molekuly s dvouřetězcovou RNA. a řadu sloučenin odvozených od rostlin nebo sloučenin připravených farmaceuticky.
Výrazy LT-alfa mutein” a LT-alfa nebo LT-beta polypeptidú, změn aminokyselin ve srovnání odpovídajícího nativního polypept
LT-beta mutein se týkají které mají jednu nebo více se sekvencí aminokyselin ri 11
Výraz LT-beta-R aktivující činidlo” se týká libovolného činidla, které může zvýšit vazbu ligandu na LT-beta-R, kumulaci LT-beta-R na povrchu buněk nebo signalizací LT-beta-R nebo které může ovlivnit, jak je signál LT-beta-R interpretován uvnitř buňky. Příklady LT-beta-R aktivujících činidel zahrnují IFN-alfa, IFN-gama, TNF, interferon indukující činidla, rozpustné anti-LT-beta-R protilátky, zesítěné anti-LT-beta-R protilátky a muitivalentní anti-LT-beta-R protilátky .
Výraz LT-beta-R signalizace se týká všech molekulárních reakcí spojených s LT-beta-R cestou a následujících molekulárních reakcí, které z ní vyplývají.
Výraz protilátka anti-LT-beta-receptoru (anti-LT-be-ta-R Ab) se týká libovolné protilátky, která rozpoznává
a váže se nejméně na jeden epitop LT-beta receptoru.
Výraz monoklonální protilátka anti-LT-beta receptoru” (anti-LT-beta-R mAb) se týká libovolné monoklonální protilátky, která rozpoznává a váže se na jediný epitop LT-beta-R.
Výraz ”zesítěné anti-LT-beta-R (m)Abs” se týká protilátek zaměřených proti LT-beta-R, které buď byly zesíteny vzájemně na aglomeráty protilátek v roztoku za použití zesíťovacího činidla anti-LT-beta-R protilátky (Ab) nebo (mAb) nebo které byly imobilizovány ve vzájemné těsné blízkosti na povrchu nebo na matrici.
(nebo k t s r* é 3.ZI á 1 — ilQ Li v
Vé-Ti
Výraz ”zesítovací činidlo anti-LT-beta-R protilátky monoklonální protilátky) se týká libovolného činidla, je schopno kovalentně nebo nekovalentně agregovat LT~beprotilátky v roztoku, tskžs se ρχΌti látky iuq ázat na a potencovat kumulaci LT-beta receptorů na cílobuněčném povrchu. Taková zesítovací činidla zahrnují.
aniž by se na ně omezovala, chemická zesítovací činidla, sekundární protilátky, které reagují s částmi anti-LT-beta-R protilátek nebo monoklonálních protilátek, a rozpustné nebo na povrch vázané Fc receptory — buď endogenní nebo přidané exogenně — které jsou schopny se vázat na anti-LT-beta-R proti látky.
Výrazy ”LT~al£a biologická aktivita, ”LT-beta biologická aktivita a LT-alfa/beta biologická aktivita jsou definovány jako: 1) imunologická křížová reaktivita s protilátkou zaměřenou proti nejméně jednomu epitopu odpovídající nativní podjednotky nebo komplexu podjednotek nebo 2) schopnost LT podjednotky nebo komplexu podjednotek soutěžit o vazebná místa pro ligandy na LT-specifickém receptoru jako je TNF-R nebo LT-beta-R nebo 3) že jsou schopny stimulovat imunní regulační odpověď nebo cytotoxickou aktivitu kvalitativně společnou s nativní LT podjednotkou nebo komplexem.
Výraz ”LT-alfa/beta heteromerní komplex” se týká
Ί2 • · • · · ·
LT — 3.1 f S 2.
se mohou kovalents výhodou uje žádné t· θ r* p 2, — stabilního spojení mezi nejméně jednou podjednotkou více než jednou podjednotkou LT-beta. Podjednotky spojovat elektrostatickými, van der Waalsovými nebo nimi vazbami. Heteromerní komplex LT-aifa/beta má nejméně dvě sousední podjednotky LT-beta a necbsah sousední podjednotky LT-alfa. Nejvýhodněji má komple ometrii LT-alfal/beta2.
nebo koffireceptory kosti π s j ~
Výraz multivalentní ligand se týká molekuly plexu, který má více než jedno vazebné místo pro a je schopen současně vázat a přivést do těsné biíz méně dvě receptářové molekuly.
| Vedoucí sekvence typu I” je | amin | o-termináíní část eu- |
| karyotického proteinu, která slouží | ialrrs j — — — | signál k řízení pro- |
| teínu k endoplazmatické retikulární | (SR) | memhráiiš h často es- |
| lou sekreční cestou. Vedoucí sekv | e nc e | se obvykle odštěpuje |
signální peptidázou v ER memhiráne.
ho a
Signální sekvence je £ typu I vedoucí sekvence řídí translokaci proteinů do uakční ekvivalent eukaryotic v pirokairyotiokyoh hostitel nebo přes lipidové dvouvrs icn tvé membrány bakterie.
Rozpustný LT-al£a/heta heteromerní komplex je LT-alfa/beta heteromerní komplex obsahující rozpustné podjednotky LT-beta, ve kterých byly sekvence aminokyselin, které lokalizují polypeptid k membráně, vypuštěny nebo ínaktivovány, čímž se LT-beta jednotka stane rozpustnou. Rozpustné LT-alfa/beta heteromerní komplexy mohou být sekretovány vhodnou hostitelskou buňkou, která byla sestrojena pro expresi obou podjednotek.
Povrchový LT-alfa/beta komplex” je komplex obsahující podjednotky LT-alfa a LT-beta, vázané na membránu, která je upravena na povrchu buněk.
v.·
Produkce LT-alfa/beta komplexů, vázaných na membránu
Lymfotoxinové komplexy buněčného povrchu byly charakterizovány v CD4* T celulárních hybridomových buňkách (11-23.D7), které exprimují vysoké hladiny LT (Browning a spo1., J.Immuno1., 147, str. 1230 až 1237 (1991), Androlewicz a spal., J. Biol. Chem., 267, str. 2542 as 2547 (1992)). Zralý LT-alfa postrádá transmembrální doménu a je umístěn k povrchu buňky interakcí nejméně s jednou k membráně vázanou LT-beta podjednotkou. S membránou vázané (povrchově) heteromerní komplexy mají převážně LT-alfal/beta2 stechiometr i i .
LT-beta jako buněčný membránový protein váže LT-alfa během syntézy, tedy zaměřuje” LT—alfa k buněčné membráně. V nepřítomnosti LT-beta je LT-alfa sekretován do extracelulárního média. LT podjednotky se normálně spojují do komplexů uvnitř buňky před exportem proteinu do membrány. Jakmile jsou LT-beta podjednotky vneseny do membrány, netvoří stabilní komplexy se sekretovaným LT-alfa. Je-li tedy požadována forma LT-aifa/beta heteromerního komplexu vázaná na membránu, je výhodné společně exprimovat žádoucí LT-alfa a LT-beta podjedn nr k v 11 v n í ř ř· r p £ o Hn ň 1? v
Povrchový LT-alfa/beta heteromerní komplex může být rekonstruován kotransfekcí hostitelských buněk s oběma LT-alfa a LT-beta geny. Povrchové LT komplexy nemohou být pozorovány na stabilních buněčných liniích, které exprimují jeden nebo druhý LT gen samotný. Když však hostitelská buňka produkuje normálně velká množství LT-alfa (například buňky RPMI 1788, viz níže), pak by transfekce LT-beta genem, který kóduje požadovaný LT-beta polypeptid, měla být dostatečná k vytvoření LT-alfa/beta komplexů, obsahujících LT-alfa podjednotky plné délky.
Společná exprese LT-alfa a LT-beta polypeptidů v řadě eukaryotických expresních systémů vede k jejich spojení a exportu jako aktivního ligandu (Crowe a spol., J. Immunol.
« • · · • · * » · ·· · · ·· t··» • * · · • * · ·> · · • · · « · »
Methods, 168, 79 až 89 (1994)). K použitelným hostitelským systémům patří, aniž by na ně byly omezeny, CHO buňky, COS buňky, B buňky zahrnující myelomy, hakulovirem infikované hmizí buňky a kvasinky.
LT-alfa podjednotka heteromernich komplexů
LT-alfa/beta podle vynálezu může být seleketována z lymfotoxinu-alfa, humánního nebo zvířecího lymfotoxinu-alfa, rekombinantního lymfotoxinu-alfa, rozpustného lymfotoxinu-alfa, sekretovaného lymfotoxinu-alfa, muteinů lymfotoxinu-alfa, které mají LT-alfa biologickou aktivitu, nebo fragmentů lymfotoxinu-alfa kteréhokoliv ze shora uvedených s biologickou aktivitou LT-alfa.
LT-alfa polypeptid může být kterákoliv rozpustná forma molekuly včetně jejích aktivních fragmentů, která může být vytvořena v eukaryotických expresních systémech, kde bude přijsodiií LT“SÍfs. vedoucí sekvence odskepens. Altemefcivne n-c — hou být použity k maximalizaci sekrece LT-aifa v jiných hostitelských systémech fůze zralé LT-alfa sekvence s heterologíckou signální sekvencí. Signály jsou zvoleny na bázi předpokládané hostitelské buňky a mohou zahrnovat bakteriální, kvasinkové, savčí a virové sekvence. Nativní signál nebo vaskulární buněčná molekulární-1 (VCáM-1) signální sekvence jsou vhodné k použití v savčích expresních systémech.
LT-alfa polypeptidy mohou být též fúzovány s pclypeptidy s prodlouženým plazmatickým poločasem životnosti, jako jsou imunoglobulinové řetězce nebo jejich fragmenty. Plazmatické proteiny, které mohou být použity ke zvýšení poločasu životnosti plazmy, zahrnují sérový albumin, imunoglobuliny, apolipoproteiny a transferrin. Připojení polyethylenglykolu (PEG) může stabilizovat polypeptid a snížit jeho imunogenecitu. S výhodou není LT-alfa fúzní protein významně imunogenní v jedinci, který má být léčen, a plazmatický protein nezpůsobuje u jedinců v důsledku své normální biologické aktivity nežádoucí vedlejší účinky.
• · • ·
Humánní LT-alfa je glykozylován na N a 0 zbytcích a v závislosti na zdroji se vyznačuje značnou mikroheterogenitou založenou na cukru. 01igosacharidový prostředek příslušného LT-aifa zvolený k vytvoření LT komplexu může ovlivnit in vivo rychlosti ciearance (Fukushima a spol., Arch. Biochem. Biophys., 304, str. 144 až 153 (1993)). Protože varianty glykozylace mohou být vytvořeny expresí v různých hostitelských buňkách, je to jeden faktor, který má být zvážen při selekci zdroje LT — alfa.
LT-aifa může být purifikován od B lymfoblastoidní linie RMFI 1783, která konstitutivně sekretuje LT-alfa a může být indukována k sekreci vyšší cín hladin působením forbolesteru PMA (Aggarwal a spol., J. Biol. Chem., 259, str. 686 až 691 (1984)). Alternativně může být použit klonovaný humánní LT —alfa gen., aby produkoval rekombinantně LT—alfa polypeptidy v různých hostitelských systémech včetně bakterií (Schoenfeld a spol., J.Biol.Chem., 266, str. 3863 až 3869 (1991)), bakulovirem infikovaných hmyzích buněk (Crows a spol., J. Immunol. Methods, 168, str.70 až 89 (1994)) a savčích buněk (Browning a Ribolini, J. Immunol., 143, str. 1859 až 1867 (1989), Fukushima a spol., Arch. Biochem. Biophys., 304, str. 144 až 153 (1993 ) ) .
Části LT-alfa genu, které kódují polypeptidové fragmenty s biologickou aktivitou LT-alfa, mohou být vyhodnoceny za použití rutinních screeningových testů. K užitečným screeningovým testům na LT-alfa biologickou aktivitu patří kompetitivní inhibiční testy s nativním LT-alfa vázaným na TRF-R nebo měření přímé nebo nepřímé inhibící schopnosti LT-alfa indukovat cytotoxíc i tu nádorových buněk v testech o sobě známých v oboru. LT-alfa fragmenty se s výhodou spojí do heteromerních komplexů s LT-beta a komplexy se testují na LT-alfa/beta biologickou aktivitu kompetitivní inhibicí s LT-alfa/beta vázaným na LT-beta-R nebo na jejich schopnost indukovat cytotoxicitu nádorových buněk v zde popsaných testech.
• ·
Lymfotoxin-beta, označovaný též jako p33, byl identifikován na povrchu T lymfocytů, T buněčných linií, B buněčných linií a lymfokíny aktivovaných smrtících buněk. LT-beta je předmětem souběžné mezinárodní přihlášky PCT/US91/04583 přihlašovatelů této patentové přihlášky, zveřejněné 9. ledna 1992 jako W092/00329 a mezinárodní přihlášky PCT/US93/11669, zveřejněné 23. června 1994 jako WO 94/13808.
LT-beta gen kóduje polypeptid o 240 až 244 aminokyselinách (Browning a spol., Cell, 72, str. 847 až 856 (1993)). LT-beta je membránový protein typu II s krátkou N-teraináiní cytoplazmatickou doménou, následovanou doménou zakotvující membránu s 30 hydrofóbními aminokyselinami. Má jediné glykozylační místo vázané na N a má pouze jeden cysteinový zbytek, který, jak se zdá, se nezúčastňuje tvorby disulfidové vazby mezi podjednotkami.
LT-beta podjednotky obsahující LT-al£a/heta heteromerní komplexy podle vynálezu mohou být svoleny z iymfotoxinu-heta, nativního humánního nebo zvířecího lymfotoxinu-heta, rekomhinantního lymfotoxinu-beta, rozpustného lymfotoxinu-heta, sekretovaného lymfotoxinu-beta, muteinů lymfotoxinu-heta s biologickou aktivitou LT-beta nebo fragmentů lymfotoxinu-heta kteréhokoliv ze shora uvedených s biologickou aktivitou LT-beta.
Jak shora uvdeno pro LT-alfa polypeptid, mohou být též LT-beta polypeptídy modifikovány ke zvýšení jejich rozpustností nebo poločasu životnosti plazmy za použití stejných metod. Podobně mohou být části LT-beta genu, které kódují polypeptidové fragmenty s biologickou aktivitou LT-beta, vyhodnoceny za použití rutinních screeningových testů, jak uvedeno pro LT-alfa.
Produkce rozpustných komplexů
Rozpustné (nevázané na membránu) LT-alfa/heta hetero17 • · • · • · měrní komplexy obsahují LT-beta podjednotky, které byly změněny z formy vázané na membránu na rozpustnou formu. Tyto komplexy jsou popsány detailně v souběžné mezinárodní přihlášce přihlašovatelů (FCT/US93/11669, zveřejněné 9. ledna 1992 jako NO 94/13803). Rozpustné LT-beta peptidy jsou definovány sekvencí aminokyselin lymfotoxinu-beta, přičemž sekvence je rozštěpena v libovolném bode mezi koncem transmembrální oblasti (tj. asi u aminokyseliny č. 44) a první homologní oblastí TNE (tj. u aminokyseliny č. 88) podle číslovacího systému Browninga a spol., Cell, 72, str. 847 až 856 (1993 ) ) .
Rozpustné LT-beta polypeptidy mohou být produkovány oddělením N—konce LT—beta k odstranění cytoplazmatíckého konce a transmembrální oblastí (Crowe a spol., Science, 264, str. 707 až 710 (1994)). Alternativně může být transmembrální doména inaktivována vypuštěním nebo nahrazením normálně hydrobobnícb zbytků 3.21 i ho ky s β i i π ktejrs obs3.bu~ií fc 2Γ3.Π s sis mb 1 Π í doménu, hydrofilními zbytky aminokyselin. V každém případě se vytvoří značně hydrofilní hydrooathický profil, který snižuje afinitu lipidů a zlepšuje rozpustnost ve vodě. Přednost se dává odstranění transmembrální domény před náhradou hydrofilními zbytky aminokyselin, protože se tím zamezuje zavedení potenciálně imunogenních epitopů.
Odstraněná nebo inaktivovaná transmembrální doména může být nahrazena nebo připojena k vedoucí sekvenci typu I (tj. k vedoucí sekvenci VCAM-1) tak, čínaje kdekoliv od mezi vall4Q polypeptidy mohou obsahovat libovolný počet dobře známých vedoucích sekvencí na N-konci. Taková sekvence by dovolila, aby peptidy byly exprimovány a zacíleny ryotickém systému. Viz např. Ernst a spol., US 082.783 (1992).
že protein je sekretován podo pro88. Rozpustné LT-beta k sekreční cestě v eukapatent č. 5,
Rozpustné LT-alfa/beta heteromerní komplexy mohou být produkovány kotransfekcí vhodné hostitelské buňky s DNA kódující LT-alfa a rozpustný LT-beta (Crowe a spol., J.Immunol.
• · • · • · · · • · · · · 4
Methods, 168, str. 79 až 89 (1994)). Rozpustný LT-beta sekretovaný v nepřítomnosti LT-alfa je vysoce oligomerizován. Avšak když je exprimován společně s LT-alfa, vytvoří se 70 kD jakoby trimerní struktura, která obsahuje oba proteiny. Je též možno produkovat rozpustné LT alfal/betak heteromerní komplexy transfekcí buněčné linie, která normálně exprimuje pouze LT-alfa (tak jako shora zmíněné buňky RPMI 1788) genetickým kódováním rozpustného LT-beta polypeptidu.
LT-alfa a LT-beta polypeptidy mohou být syntetizovány odděleně, denaturovány použitím mírných detergentů, vzájemně smíšeny a renaturovány odstraněním detergemtu, Čímž se vytvoří smíšené LT heteromerní komplexy, které mohou být rozděleny (viz níže).
Puriflkace LT-alfal/beta2 komplexů
Rozpustné LT-alfal/beta2 heteromerní komplexy se oddělí od koexpresních komplexů, obsahujících různou podjednotkovou stechiometri i, chromatografií za použití TNF a LT-beta receptářů jako afinitních purifikačních činidel. TNF receptory se váží pouze v alfa/alfa rozštěpech LT komplexů. LT-beta receptor se váze s vysokou afinitou na beta/beta rozštěpy a s nižší afinitou na alfa/beta rozštěpy heteromerních LT-alfa/beta komplexů. LT-alfa3 a LT-alfa2/betal se tedy budou vázat' na TNP-R. LT-beta-R může též vázat trimery (v rozštěpech alfa/beta), ale nemůže toho LT-beta-R (ale ne TNF-R) a LT-beta(n) (přesné složení takovéhoto přípravku není známo, jsou to však velké agregáty).
LT-alfa2/betal vázat LT-alfa3. Kromě váže LT-alfal/beta2
Reagencie s afinitou k receptoru mohou být připraveny bud jako rozpustná extracelulární doména (viz například Loetscher a spol.,
Biol. Chem., 266, str. 18324 až 18329 (1991)) nebo jako chimérické proteiny s extracelulární doménou pro vazbu ligandů připojenou k doméně imunoglobulinu Fc (Loetscher e spol., J. Biol. Chem., 266, str. 18324 až 18329 (1991), Crowe a spol., Science, 264, str.
707
3. Z
710 • · · · · · · (1994)). Receptory se připojují k kým zesítěním za použití rutinních afinitníiH nis.hiricííB. chemic~ postupů.
Existují dvě schémata. kterými LT-alfal/beta2 ligand může být purifíkován za použití receptářů a imunoafinitni chromatografie. V prvním schématu se vede supernatant z vhodného expresního systému, který exprimuje společně jak LT-alfa formu, tak seříznutou LT-beta formu, přes TNF-R kolonu. TNF-R bude vázat LT-aifa3 a LT-alfa2/betal trimery. Průtok TNF-R kolonou bude obsahovat LT-beta(n) a LT-alfal/beta2.
Ve druhém schématu všechny formy obsahující LT-heta (LT-beta(n), LT-alfal/beta2 a LT-alfa2/betal) jsou vázány na a eluovány z LT-beta-R kolony za použití klasických metod, jako chaotropu nebo změny pH. (LT-alfa3 protéká touto kolonou). Eluát je neutralizován nebo chaotrop odstraněn a eluát se pak vede přes TNF-R kolonu, která váže pouze LT-alfa2/betal trimery. Průtok touto kolonou bude obsahovat LT-beta(n) a LT-alfal/beta2 trimery.
V
LT-heta postupy obou případech mohou být čisté trimery oddě následující gelovou filtrací nebo/a o sobě iontoměničové chromatografie.
eny od známými
Alternativně mohou být různé formy LT-alfa/beta heteromerních komplexů odděleny a purifikovány řadou obvyklých chromatografických prostředků. Může být též výhodné kombinovat sérii obvyklých purifikačních schémat s některým z imunoafinitních purifikačních operací popsaných shora.
Zdroj ant i-LT-beta-R. protilátek
Polyklonální protilátková séra zaměřená proti lidskému LT-beta receptoru se připravují použitím konvenčních metod tím, že se zvířatům, jako kozám, králíkům nebo myším, aplikuje subkutánní injekc íhumánní fúzní protein mezi LT-beta receptorem a Fc (příklad 2) v kompletním Freundově adjuvantu, následované druhou intraperitoneální nebo subkutánní injekcí v kompletním. Freundu. Polyklonální antiséra obsahující požadované protilátky, které jsou zaměřeny proti LT-beta receptoru se podrobí screeningu konvenčními postupy.
Myší monoklonální protilátky (mAbs) zaměřené proti humánnímu fúznímu proteinu mezi LT-beta receptářem a Fc se připravují intraperitoneální imunizací myší RBF opakovaně pomocí od CEO buňky odvozeného rekombinantního fúzního proteinu mezi LT-beta receptorem a Fc (LT-beta-R-Fc) vázaného na protein A sefarózu v nepřítomnosti adjuvantu. Nakonec se zvířatům aplikuje druhá injekce rozpustného LT-heta-R-Fc (jak i.p., tak i.v.) , slezinné buňky se fúzují za použití klasick y c h pro tokolů a hybridomy se podrobí screeningu za použití testu SLISA (Ling a spol., J. Interferon and Cytokine Res., 15, str. 53 až 59 (1995)). Hybridomy se dále podrobí screeningu ke zjištění jejich schopnosti blokovat vázání aktivovaných hybridomových buněk 11-23 -- které exprimují povrchový LT-alfal/beta2 — na destičky potažené LT-beta-R-Fc, Čisté monoklonální protilátky se připravují purifikací IgG ze supernatantú kultury hybridomu proteinem A sefarosou.
Je též možno připravit různé formy anti-LT-beta-R protilátek použitím standardních metod rekombinantní DNA (Winter a Milstein, Nátuře, 349, str, 293 například sestrojeny chimérické až 299 (1991)). Mohou být protilátky, ve kterých je doména vázající antigen ze zvířecí protilátky napojena na humánní konstantní doménu
Cabilly a spol., US Acad. Sci. U.S.A., (např.
816.567, Morrison a spol., Proč. Nati str. 6851 až 6855 (1984)). Chimérické protilátky redukují pozorované imunogenní odpovědi vyvolané zvířecími protilátkami, když jsou použity při klinické léčbě lidí.
4,
81,
Kromě toho mohou být syntetizovány rekombinantní humanizované protilátky, které rozpoznávají LT-beta-R. Humánní protilátky jsou chiméry obsahující většinou humánní IgG sekvence, do kterých byly vloženy oblasti odpovídající za specifické vázání antigenu (např. WO 94/04679). Zvířata se imunizují požadovaným antigenem, příslušné protilátky se iso21 ···· · · ··· · ·· ·· · lují a část sekvencí variabilní oblasti odpovídající za specifické vázání antigenu se odstraní. Oblasti vázající antigen odvozené od zvířat se pak klonují do odpovídající pozice genů humánní protilátky, ve které byly odstraněny oblasti pro vazbu antigenu. Humanizované protilátky minimalizují použití heterologních (mezidruhových) sekvencí v humánních protilátkách a méně pravděpodobně vyvolají imunitní odpovědi v léčeném jedinci .
Konstrukce různých tříd rekcmbinantních anti-LT-beta-R protilátek může být též provedena vytvořením chimérických nebo humanizovaných protilátek obsahujících anti-LT-beta-R variabilní domény a humánní konstantní domény (CH1, CH2, CH3) izolované z různých tříd imunoclobulinů. Například anti-LT-beta-R IgM protilátky se zvýšenými valencemi místa pro vazbu antigenu mohou být rekombinantně produkovány klonováním místa pro vazbu antigenu do vektorů nesoucích konstantní oh 1 3s t i humánního p řehšzcβ í Ά ir u 13 n 3 n d 3 m 3 3£·o i Med., 177, str. 1439 až 1450 (1993), Lané a spol.,
Immunol., 22, str. 2573 až 2578 (1993), Traunecker a Nátuře, 339, str. 68 až 70 (1989)), j . Exp. Eur. J.
Mimo to mohou být standardní techniky rekombinantní DNA použity ke změně vazebných afinit rekombinantních protilátek k jejich antigenům změnou zbytků aminokyselin v blízkosti vazebných míst pro antigen. Vazebná afinita humanizované protilátky k antigenu může být zvýšena mutagenezí založenou na molekulárním modelování (Queen a spol.. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86, str. 10029 až 10033 (1989), WO 94/04679).
Může být žádoucí zvýšit nebe snížit afinitu anti-LT-beta-R protilátek k LT-beta-R v závislosti na cílovém typu tkáně nebo příslušném uvažovaném plánu léčby. Například může být výhodné pro semiprofylaktické léčby léčit pacienta konstantními hladinami anti-LT-beta-R protilátek se sníženou schopností signalizovat LT-beta cestou. Podobně mohou být anti-LT-beta-R protilátky se zvýšenou afinitou k LT-beta-R výhodné pro krátkodobé léčby cílené proti nádoru.
• · anti-LT-beta-R protilátek na LT-beta-R aktivující činidla
Anti-LT-beta-R protilátky podle vynálezu mohou potencovat protinádorovou aktivitu LT-alfa/beta heteromerních komplexů (s výhodou LT-alfal/beta2) za přítomnosti LT-beta-R aktivujícího činidla jako je IFN-gama. Tyto anti-LT-beta-R protilátky jsou zde také uváděny jako LT-beta-R aktivující činidla. Protilátky, které působí jako aktivující činidla, jsou selektovány následovně:
1) Série jamek pro tkáňově kultury obsahující nádorové buňky jako buňky HT29 se kultivují tři až čtyři dny v médiu obsahujícím LT-beta-R aktivující činidlo, jako je IFN-gama a purifikovaný LT-alfa/beta heteromerní komplex — s výhodou LT-aifaI/beta2 -- v přítomnosti nebo nepřítomnosti postupných ředění testované anti-LT-beta-R protilátky.
2) Ke směsi buněk se přidá vitální barvivo, které měří mítochondriální funkci jako MTT, hodin.
a nechá se reagovat několik
3) Kvantifikuje se optická hustota (OD) směsi v každé jamce při vlnové délce světla 550 nm (OD 550). OD 550 je nepřímo úměrná počtu nádorových buněk usmrcených v přítomnosti LT-alfa/beta heteromerního komplexu, LT-beta-R aktivujícího činidla a testované antí-LT-beta-R protilátky v každé jamce.
Výhodné protilátky podle vynálezu, které působí individuálně jako LT-beta-R aktivující činidla v přítomnosti LT-alfal/beta2 a IFN-gama, zahrnují BKA11, CDH10, BHA10 a BCG6 anti-LT-beta-R monoklonální protilátky (Tabulka 2, viz níže).
• · • · · · · «
Zesítění anti-LT-beta-R protilátek
Zesítěné anti-LT-beta-R protilátky podle vynálezu působí individuálně jako LT-beta-R aktivující činidla bez exogen nich LT-alfa/beta heteromerních komplexů v přítomnosti druhého LT-beta-R aktivujícího činidla, anti-LT-beta-R protilátky se zřejmě láci LT-beta receptorů buněčného jako je IF N -gama. Zesítěn váží na a indukují kumupovrchu, čímž aktivují
LT-beta receptorem zprostředkovanou cílenou smrt buněk.
Podle jednoho provedení je jeden n anti-beta-R protilátek zesítěno imohilizací na ve vodě nerozpustné matrici nebo povrchu. Derivatizace s hifunkčním činidlem je užitečná pro zesítění protilátek na ve vodě nerozpustCinidia běžní . i vana nou nosnou matrici nebo povrch, k provedení zesítění protilátek na vodou nerozpustnou nosnou matrici nebo povrch zahrnují 1,1—bisídiazoacstyl)—2—fenyle— than, glutaraldehyd, estery N-hydroxysukcinamidu včetně esterů s 4-azidosalicylovou kyselinou, homobifunkční imidoestery včetně disukcÍnimidylesterú a bifunkční maleinimidy jako například bis-N-maleinimido-1,8-oktan. Derivatizační činidla jako methyl-3-((p-azidofenyl)dithio)propioimidát tvoří fotoaktívovatelné meziprodukty, které mohou být selektivně zesítěny, když jsou stimulovány světlem. Reaktivní, ve vodě nerozpustné matrice jako kyanogenbromidem aktivované sacharidy a substráty popsané v US patentech č. 3,959.080, 3,959.287, 3,591.016, 4,195.128, 4,247.642, 4,229.537, 4,055.635 a 4,330.440 mohou být též použity pro imohilizací a zesítění proteinů.
Povrchy, ke kterým jsou protilátky připojeny, mohou být neproteinový polymer, obvykle hydrofilní polymer buď přírodního nebo syntetického původu. Mohou být použity hydrofilní polyvinylové polymery jako polyvinylaikohol fPVA) a polyvinylpyrrolidon (PVP). Užitečné jsou též polyethylenethery, jako polyethylenglykol, polypropylenglykol, polyoxyethylenestery nebo methoxypolyethyienglykol, polyoxyalkyleny, jako polyoxyethylen a polyoxypropylen, a blokové kopolymery • · · » · · · » · · • * · « • f 4 • · « » · · · 1 « polyoxyethy1snu a polyoxypropylénu (Pluronics), polymethakryláty, karbomery, rozvětvené nebo nerozvětvené polysacharidy, které zahrnují sacharidové monomery D-mannosu, Da L-galaktosu, fukosu,
D-glukuronovou kyselinu.
fruktosu, D-xylosu, L-arabinosu, sialovou kyselinu, D-galakturonovou kyselinu, D-mannuronovou kyselinu (např. polymannuronovou kyselinu nebo aiginovou kyselinu), D-glukosamin, D-galaktosamin, D-giukosu a neuraminovou kyselinu včetně homopolysacharidů a heteropolysacharidů jako laktosy, amylopektinu, škrobu, hydroxyethyiskrobu, amylosy, dextransulfátu, dextranu, dextrinů, glykogenu nebo polysacharidové podjednotky kyselých mukopolysacharidů, např hyaluronové kyseliny, polymerů alkoholů cukrů, jako je polysorbitol a polymannitol, a heparin b a n<3.270
Před zesítěním je polymer s výhodou rozpustný ve vodě a s výhodou obsahuje pouze jedinou reaktivní chemickou skupinu, aby se zabránilo vícenásobému zesítění s protilátkou. V každém případě by měly být reakční podmínky optimalizovány, aby se omezilo zesítění a aby se izolovaly produkty — bud přímo nebo následující gelovou filtrací nebo chromatografickou operací -- s v podstatě homogenním rozsahem molekulové hmotnosti. Optimální molekulová hmotnost zesítěné protilátkové matrice bude stanovena rutinním experimentováním za použití zde popsaných testů na cytotoxicitu a na vázání receptoru.
Finální konjugát po zesítění je s výhodou rozpustný ve fyziologických kapalinách jako je krev. Polymer by neměl být vysoce imunogenní ve formě konjugátu a měl by mít viskozitu kompatibilní s intravenózní infuzí nebo injekcí, pokud některá z nich je uvažovanou cestou pro aplikaci.
Polymer může být též ve vodě nerozpustný. K materiálům, které mohou být použity, patří hydrofilní gely nebo tvarované předměty s povrchy, ke kterým mohou být protilátky imobilizovány, jako chirurgické hadice, katétry nebo drény. S výhodou se používají pevné nosné materiály, které jsou biologicky kompatibilní a v podstatě inertní ve fyziologickém okolí.
• · · · • · · • · · · · · · · • i · · · · 9 · ř· t 9 9 9 * * ·
H*· *· ·«« ··· ·· ·
Materiál je biologicky kompatibilní, jestliže nestimuluje podstatně imunitní odpovědi včetně zánětu nebo nepřitahuje fibrotické buňky, když je umístěn uvnitř těla pacienta.
Anti-LT-beta-R protilátky mohou být též imobilizovány na povrchy, které byly kovalentně nebo nekovalentně potaženy sekundárními protilátkami, které se budou vázat na primární anti-LT-beta-R protilátky (např. kozí protimyší IgG protilátky, viz příklad 7). Každá individuálně testovaná anti-LT-beta-R monoklonální protilátka, když byla zmobilizovaná na povrch se sekundárními protilátkami, působí jako LT-beta-R aktivující činidlo v přítomnosti IFN-gama (obrázky 4 a 7) .
V alternativním provedení mohou zesítěné protilátky anti-LT-beta-R v roztoku působit jako LT-beta-R aktivující činidla. Anti-LT-beta-R protilátky mohou být zesítěny pomocí anti-LT-beta-R Ab (nebo mAb) zesítujícího činidla. Anti-LT-beta-R Ab (nebo mAb) zesítující činidlo podle vynálezu je jakékoliv činidlo schopné buď kovaientní vazby nebo nekovalentní agregace anti-LT-beta-R protilátek (nebo monokionálních protilátek) v roztoku , takže zesítěné antí-LT-beta-R protilátky (nebo monoklonální protilátky) se mohou vázat na a potencovat povrchovou kumulaci cílových buněk LT-beta-R. Taková činidla zesítující anti-LT-beta-R Ab (nebo mAb) zahrnují, avšak nejsou omezeny na chemická zesíťovací činidla, která mohou reagovat s protilátkami kontrolovaným způsobem, jak shora popsáno. Alternativně mohou být použity k vytvoření aglomerátů anti-LT-beta-R protilátek v roztoku sekundární protilátky, Sefarosa A, Fc receptory nebo jiná činidla, která se váží na a spojují ve shluky řadu primárních anti-LT-beta-R protilátek, aniž blokují jejich aktivitu.
Četné anti-LT-beta-R protilátky působí v roztoku jako LT-beta-R aktivující činidla
Předmětem vynálezu jsou prostředky obsahující četné anti-LT-beta-R protilátky v roztoku, které působí jako • · * • · · · • · · • · · · • · · · » · · • · · · « ·
LT-beta-R aktivující činidla tím, že potencují povrchovou kumulaci LT-beta-R. Mohou být použity polyklonální antí-LT-beta-R protilátky zaměřené proti různým epitopům LT-beta-R. S výhodou jsou anti-LT-beta-R protilátky monoklonální protilátky zaměřené proti různým a nepřekrývajícím se epitopům LT-beta-R.
Kombinovaný přístup anti-LT-beta-R monokionáiní protilátky k aktivaci LT-beta receptoru vyžaduje spojení dvou nepřekrývajících se epitopů. Mimo to je pravděpodobné, že produktivní agregace receptářů se dosáhne pouze s určitými epitopy. Byla identifikována přítomnost nejméně čtyř specifických LT-beta-R ímunoreaktivních epitopů. Další epitopy (jak definováno novými monokionáiními protilátkami) mohou být identifikovány pokračováním ve fúzi imunizovaných buněk myší sleziny, imunizací různých druhů zvířat a použitím různých cest imunizace.
Epitopy mohou být také přímo zmapovány ohodnocením schopnosti různých monokionáiních protilátek konkurovat si vzájemně ve vazbě na LT-beta-R za použití chromatografických technik BIAcore (Pharmacia BIAtechnology Handbook, Epitope Mapping”, oddíl 6.3.2, (květen 1994), viz též Johne a spol., J. Immunol. Methods, 150, str. 191 až 198 (1993)).
Jednotlivé LT-beta-R monokionáiní protilátky mohou být seskupeny nejméně do čtyř tříd podle jejich schopnosti spolupracovat v kombinaci s jinými LT-beta-R monokionáiními protilátkami pří usmrcování nádorových buněk v cytolytických testech (přiklad 8, tabulka 1). Například BDA8 monokionáiní protilátka ve skupině I nepůsobí v kombinaci s AGH1 monoklonální protilátkou ve skupině I k podpoře cytotoxicity nádorových buněk. Podobně monokionáiní protilátky BKA11 a CDH10 ze skupiny III nespolupracují v testu na cytotoxicitu nádorových buněk.
Obrázek 5A-C znázorňuje účinky aplikací typických anti-LT-beta-R monokionáiních protilátek samotných a v párové • · · · · · kombinaci na nádorové buňky v testech na cytotoxicitu za přítomnosti IFN-gama jako LT-beta-R aktivujícího činidla. Anti-LT-beta-R monoklonální protilátka CBE11 ze skupiny IV použitá samotná má malý cytotoxický účinek, který je zvýšen v kombinaci s monoklonální protilátkou BHA10 ze skupiny II (obrázek 5A). CBE11 vyvolává podobný účinek s monoklonální protilátkou CDH10 ze skupiny III (obrázek 5B).
Cytotoxicita způsobená aplikací kombinace monoklonálních protilátek anti-LT-beta-R v roztoku není vůči nádorové buněčné linii HT29 mimořádná. Obrázek 50 ukazuje, že monoklonální protilátka AGH1 ze skupiny I a monoklonální protilátka CDH10 ze skupiny III působí synergicky při usmrcování dvou různých nádorových buněčných linií (buněk HT29 a buněk WiBr) odvozených od humánních adenokarcinomů.
Souhrn vlastností monoklonálních protilátek ant I-LT-beta-2.
Všechny monoklonální protilátky anti-LT-beta-R podle vynálezu, když jsou zesítěny Imobilizací, působí jako LT-beta-R aktivující činidla v přítomnosti druhého LT-beta-R aktivujícího činidla, jako je IFN-gama. Schopnost anti-LT-beta-R monoklonálních protilátek působit jako LT-beta-R aktivující činidla v přítomnosti nebo nepřítomnosti LT-alfal/beta2 v roztoku se často mění podle stavu buněk v době testu. Tabulka 2 (viz níže) shrnuje vlastnosti anti-LT-beta-R monoklonálních protilátek podle vynálezu.
Monoklonální protilátky BDAS a AGH1 ze skupiny I nepůsobí jako LT-beta-R aktivující činidla v roztoku s LT-alfal/beta2. Monoklonální protilátka BDAS dokonce blokuje protinádorový účinek LT-alfal/beta2 (obrázek 3E a tabulka 2). Naproti tomu anti-LT-beta-R monoklonální protilátky BCG6 a BHA10 mají smíšené agonistické a antagonistické účinky, když jsou aplikovány s LT-alfal/beta2. Anti-LT-beta-R monoklonální protilátky BKA11 a CDH10 ze skupiny III jsou jedinečné ve své schopnosti působit jako LT-beta-R aktivující činidla, která potencují protinádorové účinky v přítomnosti
LT-alfal/beta2 a druhého' LT-beta-R aktivujícího činidla jako je IFN-gama, aniž mají antagonistické účinky, jaké je možno často pozorovat u monoklonálních protilátek BCG6 a BHA10 ze skupiny II.
Je důLežité mít na paměti, že klasifikace anti-LT-heta-R monoklonálních protilátek založená na jejich schopnosti kooperovat v cytolytických testech na nádorových buňkách odráží skutečnost, že spolupůsobí s určitými epitopy LT-beta-R. Monoklonální protilátky obsahující jedinou skupinu vsak nemají nutně stejné vazebné afinity ke svým příslušným epitopům. Variabilní výsledky, pozorované při srovnávání účinků různých monoklonálních protilátek náležejících ke stejné skupině nebo k různým skupinám, mohou tedy představovat rozdíly ve vazebných afinitách. Je tedy možné, že by mohla být izolována monoklonální protilátka ze skupiny I nebo ze skupiny IV s vyšší vazebnou afinitou pro LT-beta-R, která by fungovala podobně jako monoklonální protilátky ze skupiny III jako LT-beta-R aktivující činidlo za přítomnosti LT-alfal/beta2.
Hybridomové buněčné Linie nebo jejich subklony, které produkují anti-LT-beta-R monoklonální protilátky, popsané shora, byly uloženy 12. ledna 1995 v American Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) ve smyslu ustanovení Budapešťské úmluvy a byla jim přidělena následující čísla přírůstku ATCC:
buněčná linie název mAb číslo přírůstku
| a) | AG.H1.5.1 | AGH1 | HB | ATCC 11796 |
| b) | BD.A8.AB.9 | BDA8 | HB | 11798 |
| c) | BC.G6.AF5 | BCG6 | HB | 11794 |
| d) | BH.A10 | BHA10 | HB | 11795 |
| e) | BK.A11.AC10 | BKA11 | HB | 11799 |
| f) | CB.Eli . 1 | CBE11 | HB | 11793 |
| g) | CD.H10.1 | CDH10 | HB | 11797 |
Všechna omezení týkající se dostupnosti shora uvedených • · • · · · • · « depozit ATCC budou neodvolatelně odstraněna po udělení patentu na tuto přihlášku.
Funkce anti-LT-beta-R IgM monoklonálních protilátek jako LT-beta-R aktivujících činidel
Anti-LT-beta-R monoklonální protilátky, které obsahují více než dvě vazebná místa pro antigen s IgG, budou také působit v roztoku jako LT-beta-R zesíťující činidla na buněčném povrchu a budou proto spadat pod definici LT-beta-R aktivujíVazebná místa monoklonální proantigen mohou být vybudována do
IgM molekul — které mají deset vazebných míst pro antigen -za použití standardních technik rekombinantní DNA a hybridomu (příklad 12).
čího činidla podle vynálezu, tilátky anti-LT-beta-R pro
Alternativně je možno sebrat a obohatit kompletní IgM molekuly myši (nebo jiného zvířete) izolované metodou fúze hybridomu po jediné imunizaci antigenem. Jednou cestou obohacení IgM molekul by byla imunizace myší CD40 s chybějící signalizací (Kawabe a spoi., Immunity, 1, str. 167 až 178 (1994), Xu a spoi., Immunity, 1, str. 423 až 431 (1994)). Tyto myši nemohou efektivně produkovat imunoglobuliny IgG a proto jejich reakce na stimulaci antigenem je zvýšena pro IgM isotypy.
Anti-LT-beta-R. IgM protilátky mohou v důsledku své zvýšené valence účinně agregovat LT-beta-R molekuly v rovině membrány, čímž zvyšují LT-beta-R signalizaci ve srování s jejích IgG protějšky, které mají dvě vazebná místa pro antigen. Dramatický příklad zvýšené účinnosti multívalentních protilátek při kumulaci receptorů je patrný u protilátek vůči Fas receptorů, kde je IgM forma velmi účinná a normální bivalentní imunoglobuliny IgG nejsou účinné v roztoku (Yonihara a Yonihara, J. Exp. Med., 169, str. 1747 až 1756 (1989), Alderson a spoi., Int. Immunol., 6, str. 1799 až 1806 (1994)).
Podobně apo-1 monoklonální protilátka proti Fas recep30 • ·
• · « « • · • · · toru je typu IgG3. Tato monoklonální protilátka je silné cytotoxické činidlo, které závisí na Fc interakcích výhradně k IgG3 suhtypům za účelem agregace na větší polyvalentní formy. Odstranění Fc oblasti vytváří F(ab)2 formu, která se nemůže spojit do větších agregátů a která je inaktivní (Dhein a spol., J. Immunol., 149, str. 3166 až 3173 (1992)). Analogicky se tedy předpokládá, že IgM verze anti-LT-beta-R monoklonálních protilátek budou účinné protinádorové prostředky.
Anti-LT-beta-R monoklonální protilátky inhihují růst nádorů u myš i
Schopnost LT-beta-R aktivujícího činidla, jako je anti-LT-beta-R monoklonální protilátka, inhihovat růst humánních nádorových buněk in vitro (příklady 6 až 8 a 13) může svědčit o protinádorové účinnosti in vivo. Pokusy provedené na imunodeficitních myších (SCID) ukazují, že anti-beta-R monoklonální protilátka (CBE11) může účinně blokovat tvorbu nádoru humánními adenokarcinomatózními buňkami WiDr (příklad 14, obrázek 6). U myší inokulovanýcn suhkutánně (s.c.) WiDr buňkami se vytvoří během dvou týdnů měřitelné nádory. Když se myším aplikovala i.p. CBE11 monoklonální protilátka ve stejnou dobu, kdy byly inokulovány buňky WiDr s.c., nádorový růst byl dramaticky blokován (obrázek 6A). Protinádorový účinek CBE11 anti-LT-beta-R monoklonální protilátky se zvýšil přidáním IFN-gama. CBE11 byl však účinný i bez exogenního IFN-gama. Ve skupině CBE11 + IFN-gama bylo 7 ze 16 zvířat zcela bez nádorů, zatímco zbývající zvířata měla malé uzlíky, které se během 2 měsíců nezvětšily. Myši, kterým byl aplikován samotný CBE11, byly 30. den podobné jako skupina, které bylo aplikováno CBE11 + IFN-gama. U myší, kterým byl aplikován samotný CBE11, se však nakonec vyvinuly pomalu rostoucí nádory. Mezi skupinami CBE11 (+/- IFN-gama) a kontrolními skupinami (fyziologický roztok, IFN-gama samotný a kontrolní antihumánní LFA-3 monoklonální protilátka (1E6) + IFN-gama) byly statisticky významné rozdíly, ale mezi kontrolními skupinami žádné významné rozdíly nebyly. Jak 1E6, tak CBE11 monoklonální protilátky jsou protilátky typu IgGl. 1E6 monoklo31 • · · nální protilátka účinně pokrývá nádorové buňky, ale neblokuje růst nádorů. Komplementární nebo NK (natural killer) buňkami ovlivněné události tedy nejsou jediným podkladem pro protinádorovou aktivitu CBE11 anti-LT-beta-R monoklonální protilátky.
Účinnost CB11 monoklonální protilátky v inhibici růstu nádorů in vivo v nepřítomnosti exogenního IFN-gama je neočekávána, protože existovala závislost na IFN-gama pro měřitelné cytotoxické účinky na bázi LT-beta-R in vivo. Bud dochází k určitému crossing-over myšího IFN-gama na lidské IFN-gama receptory nebo mohou probíhat in vivo jiné mechanizmy .
CBE11 anti-LT-beta-R monoklonální protilátka může také inhibovat růst rozvinutého nádoru u myší (obrázek 6B). Myši byly inokulovány s.c. 1. den humánními WiDr buňkami adenokarcinomu a nádory se ponechaly vyvíjet 15 dní (příklad 14). Nádory u zvířat, kterým byl aplikován IFN-gama samotný nebo s kontrolní antihumánní LFA-3 monoklonální protilátkou (1E6) + IFN-gama, pokračovaly ve zvětšování velikosti v průběhu 7-týdenního pokusu. Naproti tomu se růst nádorů, na které se působilo CBE11 anti-LT-beta-R protilátkou (+ IFN-gama nebo samotnou) zastavil a po následujících třech injekcích CBE11 protilátky během tří týdnů se růst nádorů zastavil do 49 dnů po inokulaci, kdy byl pokus ukončen (obrázek 6B).
Tyto pokusy prokazují, že anti-LT-beta-R. monoklonální protilátka, která aktivuje LT-beta-R signalizaci, je schopna účinně inhibovat tvorbu nádoru v ranných stádiích a může též blokovat pokračující růst nádorových buněk v pozdějších stádiích tumorígeneze in vivo. Tyto pokusy též prokazují, že aplikace jediného LT-beta-R aktivujícího činidla může být účinná pro léčbu nebo omezení pokračování, závažnosti nebo účinků neoplazie u postiženého živočicha.
Postupy popsané v příkladu 14 mohou být použity k identifikaci LT-beta-R aktivujících činidel podle vynálezu, které působí inhibičně samostatně nebo v kombinaci na růst nádorových buněk in vívo. Je předpokládáno, že jiná LT-beta-R aktivující činidla -- zahrnující, ale neomezující se na ta, která byla identifikována v in vitro testech na cytotoxicitu nádorových buněk -- mohou mít podobné proti nádorové účinky in vivo, kdyby byly aplikovány bud samotné nebo v kombinací zvířatům nebo lidem.
Použití IFN-gama a jiných LT-beta-R aktivujících činidel
Cytotoxické účinky LT-alfa/beta heteromerních komplexů a zesítěných nebo vícenásobných ant i-LT-beta-proti látek na nádorové buňky se zvyšuje přítomností LT-beta-R aktivujícího činidla, zejména IFN-gama. 0 humánních adenokarcinomatózních buňkách střevního původu (HT29 buňkách) bylo v minulosti pro-
| kázáno, že | jsou senzitivní | vůči FasR signalizaci | (Yonehara | |
| a | Yonehara, | J» Exp. Me a. , | 169, str. 1747 až 1756 | (1989) ) , |
| a | vůči TNF | a. LT-alrs, ze | přítomnosti IFN-gama | (Browning |
| a | spol., J. | Immunol.t 143 t s | tr, 1856 až 1867 (1989)) |
Množství LT-beta-R aktivujícího činidla, potřebného ke zvýšení protinádorové účinnosti LT-alfa/beta heteromerních komplexů, anti-LT-beta-R protilátek nebo jiných LT-beta-R aktivačních činidel podle vynálezu bude záviset na typu buňky nebo tkáně, na které se působí, a také na způsobu léčby a může být stanoveno empiricky použitím rutinních metod. LT-beta-R aktivující činidlo může být dodáno v koncentraci nebo aplikováno rychlostí zjištěnou, že je účinná ve spojení s jinými LT-beta-R aktivujícími činidly, přičemž se berou v úvahu shora uvedené faktory.
Alternativně je možno se zaměřit na endogenní LT-beta-R aktivující činidla, například na interferony jako je IFN-gama, které mohou být vytvořeny buňkami nebo tkáněmi obklopujícími cílové nádorové buňky. Endogenní IFN-gama je normálně produkován po virové infekci a je též nalézán v blízkosti nádorů (Dinge a spol., Immunity, 1, str. 447 až 456 (1994)).
• · · · • · • · · · • * · · » · ·
I · · · * ·
Do rozsahu skupiny LT-beta-R aktivujících činidel podle vynálezu spadá kterékoliv činidlo, které je schopné indukovat interferony, s výhodou INF-gama, a které potencuje cytotoxické účinky LT-alfa/beta heteromerních komplexů a anti-LT-beta-R monoklonálních protilátek na nádorové buňky. Zatímco virová infekce normálně indukuje tvorbu IFN-gama, hladiny endogenního IFN-gama mohou být zvýšeny jinými činidly (příklad 10). Například klinické pokusy prokázaly indukci interferonu účinkem dvouřetězcové RNA (dsRNA). Účinné jako induktory interferonu jsou tedy tomto ohledu polyriboguanylová kyselina/polyribocytidylová kyselina (poly-rG/rC) a jiné formy dsRNA (Juraskova a spol 107 až 111 (1992) ) .
Eur. J. Pharmacol., 221, str.
Stimulátor interferonu z spol., Indián J. Med. Res.,
Glycyrrhiza glabra (Acharya a 98, str. 69 až 74 (1993)) a farmaceutické prostředky, z nichž mnohé je možno aplikovat orálně, mohou být též použity ke zvýšení hladin interferonu. K takovým induktorúm interferonů a spol., Antiviral Res., 20, str.
(Paramononova a spol., Vopr. Virusol patří: imikvimod (Bernstein 45 až 55 (1994), saparal
39, str. 131 až 134 (1994)), arylpyrimidony jako například a Machida, Hinyokika Kívo, 40, str. 195 dostin (Cheknev a spol., Vopr.
(1994)).
bropirimin (Onishi až 200 (1994)), RiVirusol., 39, str. 125 až 128
Řada těchto činidel indukujících interferony byla charakterizována jako induktury interferonu typu I jako IFN-alfa. Typ I interferonů může též působit jako LT-beta-R aktivující činidla, ale méně účinná než IFN-gama.
Léčení za použití LT-alfa/beta komplexů a LT-beta-R aktivujících činidel
Prostředky podle vynálezu budou aplikovány v účinné dávce pro léčbu příslušného klinického stavu. Určení výhodného farmaceutického přípravku a terapeuticky účinného dávková34 ní pro danou aplikaci spadá do působnosti odborníků, přičemž se bere v úvahu například stav a hmotnost pacienta, rozsah požadované léčby a tolerance pacienta na léčbu.
Obvykle lidé mohou snášet až do 100 až 200 pg/m2 TNF, dříve než se projeví závažná toxicita (Schiller a spol., Cancer Res., 51, str. 1651 až 1658 (1991)). U myší způsobily dávky v rozsahu 1 až 5 pg/mys/den podávané v 5xl04 jednotkách rekombinantního lidského IFN-gama regresi primárního nádoru (Balkwill a spol, CIBA Foundation Symposium (1987), Havell a spol., J. Exp. Med., 167, str. 1067 až 1085 (1988)). Na základě relativní účinnosti TNF a LT-alfal/beta2 v HT29 cytolytických testech poskytne přibližně 5 až 25 pg/myš/den LT-alfal/beta2 terapeutické rozmezí dávky. Extrapolací na člověka se očekává, že bude zapotřebí dávkování nejméně 1 mg/m2 LT-alfal/beta2 v kombinaci s LT-beta-R aktivujícím činidlem, například IFN-gama.
Historicky byla léčba pomocí IFN-gama prováděna bud s maximálními tolerovanými dávkami v rozmezí 100 až 250 pg/m2 nebo v ’’imunomodulačních hladinách v rozmezí 10 až 25 pg/m2 (viz například Kopp a spol., J. Immunother., 13, str. 181 až 190 (1993)). Kombinační terapie se dvěma interferony použily 4 x 106 jednotek/m2 IFN-alfa a přibližně 250 pg/m2 IFN-gama (Niederle a spol., Leuk. Lymphoma, 9, str. 111 až 119 (1993)). Očekává se, že střední dávky asi 25 až 100 pg/m2 IFN-gama v kombinaci s LT-alfa/beta heteromerními komplexy nebo puriflkávanými anti-LT-beta-R protilátkami zde popsanými budou vhodnými startovacími hody pro optimalizaci léčebných dávek.
Aplikace LT-alfa/beta heteromerních. komplexů a zesítěných anti-LT-beta-R protilátek podle vynálezu včetně izolovaných a purifikovaných forem protilátek nebo komplexů, jejích solí nebo jejich farmaceuticky přijatelných derivátů může být provedena za použití libovolných obvykle používaných metod aplikace prostředků, které se vyznačují protinádorovou účinností.
Farmaceutické prostředky používané při těchto terapiích mohou mít též nejrůznější formy. K těm patří například pevné, polopevné a kapalné dávkovači formy, jako tablety, pilulky, prášky, kapalné roztoky nebo suspenze, čípky a roztoky, které je možno aplikovat injekčně nebo infuzí. Výhodná forma závisí na předpokládaném způsobu podání a terapeutické aplikace. Způsoby podání mohou zahrnovat orální, parenterální , subkutánní, intravenózní nebo topické aplikace nebo aplikaci přímo do leze.
LT-alfa/heta heteromerní komplexy, IFN-gama a anti-LT-heta-R protilátky mohou být například uloženy do sterilních, izotonických přípravků s nebo bez kofaktorů, které stimulují absorpci nebo stabilitu. Přípravek je s výhodou kapalný nebo to může být lyofilizovaný prášek. Například LT komplexy neho/a anti-LT-beta-R protilátky a IFN-gama mohou být zředěny pufrem přípravku sestávajícím z 5,0 mg/ml monohydrátu kyseliny citrónové, 2,7 mg/ml citrátu trojsodného, 41 mg/ml mannitolu, 1 mg/ml glycinu a 1 mg/ml polysorhátu 20. Tento roztok může být lyofi 1 izován, uskladněn za chlazení a rekonstituován před aplikací sterilní vodou pro injekce.
Prostředky budou s výhodou též obsahovat obvyklé farmaceuticky přijatelné nosiče dobře známé v oboru (viz například Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. vydání, 1980, Mac Publishing Company). Takové farmaceuticky přijatelné nosiče mohou obsahovat jiné medicinální prostředky, nosiče, genetické nosiče, adjuvanty, pomocné látky atd., jako humánní sérový albumin nebo plazmatické přípravky. Prostředky jsou s výhodou ve formě dávkovači jednotky a obvykle se budou aplikovat jednou nebo několikrát za den.
Farmaceutické prostředky podle vynálezu se mohou aplikovat též za použití míkrokulíček, liposomů, jiných aplikačních systémů za použití mikročástic nebo prostředků s retardovaným uvolňováním, umístěných v, blízko nebo jinak v kontaktu s postiženými tkáněmi nebo krevním řečištěm. Vhodné
příklady nosičů s retardovaným uvolňováním zahrnují semipermeabilní polymerní matrice ve formě tvarovaných předmětů jako jsou čípky nebo mikrotobolky. Implantovatelné nebo mikrotobolkové matrice s retardovaným uvolňováním zahrnují polylaktidy (US. patent č. L-glutamové kyseliny a spol., Biopolymers,
3,773.319, EP 58.481), kopolymery a gama-ethy1-L-glutamátu (Sidman 22, str. 547 až 556 (1985)), póly(2-hydroxyethylmethakrylát) nebo ethylenvinylacetát (Langer a spol., J. Biomed. (1981), Langer, Chem. Tech
Mater. Res., 15, str. 167 až 277 . , 12, str. 98 až 105 (1982)).
Liposomy obsahující LT-beta-R heteromerní komplexy nebo/a anti-LT-beta-R protilátky a IFN-gama mohou být připraveny dobře známými metodami (víz např DE 3,218.121, Epstein a spol., Proč. Nati. Acad. Sci.
3692 (1985), Hwang a spol., Proč str. 4030 až 4034 (1980), US patenty č. 4,485,045 a č. 4,544.545). Obvykle se jedná o liposomy malého (kolem 20 až 80 nm) unilamělárního typu, ve než asi 30 mol. % cholesterolu tak, aby reguloval optimální rychlost uvolňování LT komplexu nebo/a anti-LT-beta-R protilátek a IFN-gama.
U.S.A., 82, str. 3688 až Nati.Acad. Sci.U.S.A., 77, kterém, je obsah lipidů větší Podíl cholesterolu je zvolen
LT-alfa/beta heteromerní komplexy a anti-beta-R protilátky podle vynálezu mohou být také připojeny k liposomům obsahujícím jiná LT-beta-R aktivující činidla, chemoterapeutické prostředky nebo IFN-gama k doplnění IFN-gama, který se obvykle nalézá v oblasti nádorů. Připojení LT komplexů a antí-LT-beta-R protilátek k liposomům může být dosaženo libovolným známým zesítujícím činidlem, jako například heterobifunkčnímí zesítujícími činidly, která byla v širokém rozsahu používána ke spojení toxinů nebo chemoterapeutických prostředků s protilátkami pro cílenou aplikaci. Konjugace na liposomy může být též provedena použitím lipidem řízeného síťujícího činidla, hydrazidu 4-(4-maleimidofenyl)máselné kyseliny (MPBH) (Duzgunes a spol., J. Cell. Biochem. Abst. Suppl. 16E 77 (1992)).
• 9
Výhody terapeutických prostředků na bázi aktivace anti-LT-beta-R
Protinádorová terapie na bázi LT-beta-R aktivace by měla řadu výhod. LT-beta-R se váže na LT-alfa/beta heteromerní komplexy s vysokou afinitou v beta/beta rozštěpech a s nižší afinitou v alfa/beta rozštěpech, vytvořených na rozhraních mezi sousedními LT-alfa a LT-beta podjednotkami. Naproti tomu TNF receptory se váží na LT-alfa/beta heteromerní komplexy s vyšší afinitou pouze v alfa/alfa rozšt+ěpech. Purifikované LT-alfal/heta2 komplexy se tedy váží s vysokou afinitou na LT-beta-R mezi sousedními LT-beta podjednotkami, ale postrádají alfa/alfa rozštěpy a tedy neaktivují křížově signalizaci prostřednictvím TNF receptorů. LT-alfa/beta heteromerní komplexy podle vynálezu tedy nebudou stimulovat zánětlivé odpovědi spojené s TNF.
Aplikace LT-alfal/heta2 neaktivuje změny endotheliálních buněk spojené se zánětlivou reakcí i při poměrně vysokých hladinách. Z tohoto důvodu by vedlejší účinky způsobené aktivací zánětlívých kaskád, pozorované u TNF, nemělo způsobovat prahlém při použití farmaceutických prostředků a léčebných metod pro aktivaci LT-heta-R.
Lidský LT-al£al/beta2 se váže na myší LT-heta-R v podstatě stejně dobře jako na humánní LT-heta-R. Injekce 100 pg humánního LT-alfal/beta2 na myš není letální (příklad 11), což ukazuje na to, že stimulace LT-heta-R v celém zvířeti nemá zřetelnou toxicitu patrnou, když byly provedeny podobné pokusy s FasR nebo p60 TNF-R aktivací.
Použití specifických monoklonálních protilátek anti-LT-beta-R nebo kombinací protilátek k vyvolání této cestu u lidí může mít řadu výhod oproti léčbě s LT-alfa/beta heteromerními komplexy. Léčba antireceptorovými protilátkami bude selektivnější než léčba ligandem. Kromě toho bude jednodušší připravit a vyrobit ve velkém rekombinantní formy anti-LT-LT-beta-R monoklonálních protilátek než rozpustné
LT-alfa/beta heteromerní komplexy.
Uvažuje se o tom, že monoklonální protilátky nebo LT-alfa/beta heteromerní komplexy se budou aplikovat lidem s nádorem společně s obvyklou protinádorovou terapií (tj ozařováním a chemoterapií). Kombinovaná léčba LT-beta-R aktivací s obvyklými chemoterapiemi muže poskytnout další faktor proti nádorové aktivity, který by pravděpodobněj i zbaví 1 pacienta nádorových buněk, než když se použije protinádorová terapie samotná.
Dále je možné, že by tento přístup měl poměrně málo vedlejších účinku a proto by mohl být aplikován v semiprofylaktickém smyslu v případech rakovin, které ještě nemusely metastazovat, nebo u pacientů z rodin, u kterých je genetická predispozice pro určitý typ rakoviny.
Příklady provedení vynálezu
Následují příklady, které ilustrují LT-alfa/beta heteromerní komplexy a anti-LT-beta-R monoklonální protilátky podle vynálezu a metody použité k jejich charakterizaci. Tyto příklady nemají za účel omezovat rozsah vynálezu. Příklady jsou uvedeny za účelem ilustrace a vynález je omezen pouze patentovými nároky.
Příklad 1
Vytvoření supernatantů haculovirem infikovaných hmyzích buněk obsahujících LT-alfa/beta formy
Rekombinantní baculoviry, kódující bud LT-alfa o plné délce nebo sekretovanou formu LT-beta, byly připraveny, jak popsáno (Crowe a spol., Science, 264, str. 707 až 710 (1994)). Hmyzí buňky (Invitrogen, San Diego, CA.) byly inoku1ovány o hustotě 2x1O5 buněk/ml do 7,2 litrů média SF 900-11 (Gibco) bez séra. Po 48 hodinách dosáhla kultura l,8xl06 buněk/ml a byla infikována 150 ml (3xl08 PFU/ml) LT-beta • · • · · · • · · • · · »· · · · · • · · » * * · • · · a 300 ml LT-alfa bac ilovirových kultur. Po dvou dnech se kultura odebrala a zbytky buněk byly odstraněny odstředěním. Po přidání kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) a fenylmethylsulfonylfluoridu (PMSF) (1 mM EDTA a 150 μΜ PMSF konečné koncentrace) se vyčeřený supernatant zkoncentroval 10ti násobnou ultrafi 1traci za použití spirální vložky S1YM10 (Amicon) . Koncentrát se rozdělil na šest 120 ml podílů a alikvótní podíly se skladovaly před purifikací při -70 °C.
Příklad 2
Příprava rozpustných LT-beta receptorů jako chiméry Pc a imunoglobulinu
Extracelulární doména LT-beta-R byla amplifikována až do transmembránní oblasti polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) z cDNA klonu použitím primérů, které inkorporovaly Notl a Sáli restríkční enzymová místa na 5' a 3' koncích (Browning a spoi., J. Immunol., 154, str. 33 až 46 (1995)). Amplifikovaný produkt byl natráven enzymy Notl a Sall, purifikován a ligován do vektoru pMDR901 1inearizovaného enzymem Notl společně s fragmentem enzymů Sall-Notl kódujícím Fc oblast humánního IgGl. Výsledný vektor obsahoval gen reduktásy dihydrofolátu a LT-beta-R-Fc chiméru ovládané oddělenými promotory. Vektor byl elektroporátován do CHO dhfr- buněk a methotrexátrezistentní klony byly izolovány standardními postupy, LT-beta-R-Fc je sekretován do média a test ELISA byl použit k selekci buněčných linií produkujících nejvyšší hladinu chimérického proteinu. Vysokoprodukční buněčná linie se nechala narůst do vysokých počtů a kondicionované médium se odebralo. Čistý protein se izoloval pomocí na rychle protékající afínitní chromatografie s Protein A sefarosou.
• · · «
Příklad 3
Afinitní purifikace LT-alfal/beta2 za použití TNF-R a LT-beta-R
Pro přípravu pryskyřic k afinitní purifikaci receptorú LT forem byly imobi1 izovány purifikované přípravky LT-beta-R-Fc (jak popsáno zde v příkladu 2) a TNF-R p60-Fc (Crowe a spol.. Science, 264, str. 707 až 710 (1994)) na CNBr-sefarose (Pharmacia) při 5 mg/ml pryskyřice v podstatě podle návodu výrobce. Pyskyřice prošly před použitím jedním elučním cyklem. Část (120 ml) S1Y10 koncentrátu prošla přes dvě sekvenční p60 TNF-R-Fc kolony, které váží LT-alfa a LT-alfa2/betal. Průtok, který obsahoval LT-alfal/beta2 a LT-beta, byl veden přes LT-beta-R-Fc kolonu. Kolona se promyla vždy 5 objemy PBS, PBS s 0,5 M NaCl a PBS a pak se LT-alfa a LT-alfa2/betal komplexy promyly 25 mM fosforečnanem sodným, 100 mM NaCl, pH 3,5. Eiuční frakce se ihned zneutralizovaly 1/20 objemu 0,5 M fosforečnanu sodného, pH 8,6 a uložily se na led. Frakce obsahující protein se identifikovaly absorbancí při 280 nm, píkové frakce se spojily a spojené eluce z kolon se zanaiyzovaly pomocí SDS-PAGE obarvené jasnou modří coomassie. Shora popsaná eluce poskytla více než 95 % čistého LT-alfal/beta2.
Příklad 4
Charakterizace purifikovaných LT-alfal/beta2 ligandů
Frakce z příkladu 3 byly rozděleny gelovou vylučovací chromatografií ke zjištění, zda se vytvořily trimery a zda jsou přítomny agregáty. Byla použita kolona TSK G3000 sw x2 při průtokové rychlosti 0,5 ml/minuta, aby se oddělil proteinový standard BioRad z gelové filtrace a tři různé LT trimery, LT-alfa3, LT-alfa2/betal a LT-alfal/beta2.
Obrázek 1A ukazuje, že velmi málo, pokud vůbec někte41 • · « rý , z LT-alfal/beta2 trimerů se ukazuje být agregátem o vysoké molekulové hmotnosti. Srovnání s velikostními standardy ukazuje, že všechny tři formy jsou trimerní, tj. asi o 50 až 60 kDa. Stechiometrie LT-alfa k LT-beta obsažených v purifikovaných frakcích LT-alfal/beta2 a LT-alfa2/betal byla vyhodnocena buď denzitimetrií gelů zbarvených pomocí coomassie nebo píkovou výškovou analýzou dvou píku následujících po rozštěpení C4 vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s obrácenými fázemi. Obě měření potvrdila identitu frakcí eluovaných z afinitních chromatografických kolon, popsaných shora.
Čistota přípravků byla dále vyhodnocena ionexovou chromatografií za použití přístrojového vybavení BioCAD k vytvoření charakteristických chromatogramů LT-alfal/beta2 a LT-alfa2/betal na slabé katexové pryskyřici při několika různých pufrových systémech. Metoda, která se vyznačovala největší schopností čistě zadržet a oddělit ty uvedené tři trimery, obsahovala POROS CM (karboxymethylovou) kolonu provozovanou při 5 ml/min s 16,6 mM MES, 16,66 mM HEPES, 16,66 mM octanu sodného pH 6,5 pufru a promývání s 1 M NaCl gradiobjemů kolony. BioCAD
LT-alfa2/betal komplexů jsou
Každý trimer, LT-alfa3, eluován při různých koncentracích solí různých přípravků křížová kontaminace entem přes 20 LT-alfal/beta2 a chromatogramy znázorněny na LT-alfa2/betal a LT-alfal/beta2 byl a nebyla prokázána u větší než 1 až 2 %.
Příklad 5
Usmrcování humánních adenokarcinomatózních buněk HT29 rozpustnými LT-alfal/beta2 komplexy
Cytolytický test s buňkami HT29 byl dříve popsán (Browning and Ribolini, J. Immunol., 143, str. 1859 až 1867 (1989)). V typickém testu byla připravena série ředění LT-alfal/beta2 (a jiných cytokinů, kde jsou apli kováte1né) v 0,05 ml v destičkách s 96 jamkami a přidalo se 5000 trypsini42 ·· ·· • » · zovaných buněk HT29-14 v 0,05 ml média obsahujícího 0 nebo 80 U/ml (protivirových jednotek) humánního IFN-gama. Buňky HT29-14 jsou ze subklonu původní, od ATCC odvozené HT29 linie, která je homogenější. V testech byly použity buňky HT29-14. Všechny tyto výsledky mohou být též pozorovány při použití původní HT29 linie odvozené od ATCC. Po 3 až 4 dnech byla změřena mitochondriální redukce barviva MTT následovně: přidalo se 10 1 MTT a po 3 hodinách se redukované barvivo rozpustilo pomocí 0,09 ml isopropanolu s 10 mM HC1 a změřila se optická hustota při 550 nm. K buňkám se předem přidaly rozpustné receptorové formy, připravené, jak zde bylo popsáno, nebo čistý humánní IgG, aby se dosáhlo konečné koncentrace 5 pg/ml.
Obrázek 2A ukazuje usmrcování buněk HT29 působením anti-Fas receptoru mAb CH-11 (který stimuluje FasR signalizaci), TNF, LT-alfa3, LT-alfal/beta2 a LT-alfa2/betal ligandů ve spojení s IFN-gama. Vizuální prohlídka buněk, na které bylo působeno LT-alfal/beta2, ukazuje, že toto činidlo buňky spíše usmrcuje než aby pouze blokovalo jejich proliferaci. V nepřítomnosti IFN-gama nejsou pozorovány žádné účinky, což odráží neobyklou schopnost IFN-gama ovlivnit, jak buňky interpretují signalizaci od TFN rodiny receptářů. Interferony alfa a beta byly 100-krát méně účinné než interferony gama, jak bylo kvantifikováno na bázi jednotek protivirové aktivity.
Obrázek 2B ukazuje inhibíci LT-alfal/heta2 usmrcování rozpustným LT-beta-R-Fc ale ne p60-TNF-R-Fc, čímž demonstruje, že cytotoxicita je specifická pro LT-alfal/beta2. Nedostatek inhibice u p60-TNF-R-Fc naznačuje, že kontaminace LT-alfa (o níž je známo, že činí méně než 1 %) nemůže být zodpovědná za cytotoxickou aktivitu LT-alfal/beta2.
·· ·· • » »
Příklad 6
Anti-LT-beta-R monokionáiní protilátky potencují usmrcování buněk HT29 pomocí LT-alfalbetaZ komplexů
Byly provedeny cytolytické testy, jak popsáno v příkladu 5 s tím rozdílem, že interferony gama a anti-LT-beta-R monoklonální protilátky (série 0,01 až 1000 ng/ml) byly přidány k buňkám při 2x finální koncentraci a pak se přidalo 50 μΐ roztoku buněk do jamek obsahujících zředěný LT-alfal/beta2. Růst byl vyhodnocen, jak popsáno v příkladu 5. Obrázek 3 ukazuje rozdílné účinky dvou různých anti-LT-beta-R monoklonálních protilátek v jejich schopnosti potencovat LT-alfal/beta2 cytotoxickou aktivitu. Obrázek 3A ukazuje, že anti-LT-beta-R monokionáiní protilátka CDH10 potencuje cytotoxickou aktivitu LT-alfal/beta2 způsobem závislým na dávkování. Obrázek 33 ukazuje účinky jiné anti-LT-beta-R monoklonální protilátky, BDA8 , ve stejném testu. Protilátka BDA8 inhibuje cytotoxickou aktivitu LT-alfal/beta2 spíše než by potencovala usmrcování nádorových buněk.
Příklad 7
Imobilizované anti-LT-beta-R monokionáiní protilátky mohou usmrcovat nádorové buňky HT29
Za účelem imobilizace anti-LT-beta-R monokionáiních protilátek na plastický povrch byly destičky s 96 jamkami pro tkáňové kultury pokryty 50 μΐ 10 μς/πιΐ kozí protimyší Fc polyklonální protilátky (Jackson ImmunoResearch), promyty a zablokovány 5% fetálním telecím sérem (FCS) v PBS, po čemž následovalo zachycení uvedené monokionáiní anti-LT-beta-R protilátky a další promytí. Do monokionáiní protilátkou povlečených jamek byly naočkovány buňky HT29 a byly provedeny cytolytické testy jako v příkladu 5. Obrázek 4A ilustruje cytotoxické účinky imobilizovaných anti-LT-beta-R monoklonálních protilátek BDA8 a CDH10 na buňky HT29. Každá monoklonál44 « · • » • · · · ní protilátka vyvolává individuálně cytotoxicitu na nádorové buňky, když je imobi1izována na povrch. Obrázek 4B ukazuje, že tytéž monoklonální protilátky BDA8 a CDH10, pokud jsou testovány individuálně v roztoku, nejsou cytotoxické, takže cytolytická aktivita jednotlivé anti-LT-beta-R monoklonální protilátky in vitro se jeví být funkcí její imobilizace.
Příklad 8
Kombinace anti-LT-beta-R monoklonálních protilátek v roztoku, zaměřená proti určitým epitopům, usmrcuje buňky HT29
Růst buněk HT29 byl vyhodnocen, jak popsáno v příkladu 5, s tím rozdílem, že v růstovém médiu byla obsažena jedna nebo dvě anti-LT-beta-R monoklonální protilátky. Tabulka 1 ukazuje účinky na buňky HT29, které byly pozorované, když byly do roztoku přidány různé anti-LT-beta-R monoklonální protilátky (tj. neimobilizované na plastu). Anti-LT-beta-R monoklonální protilátky mohou být uspořádány do skupin I až IV na bázi jejich relativních schopností působit ve vzájemné kombinaci v cytolytickém testu na buňky HT29. Výsledky anti-LT-beta-R monoklonálních protilátek poskytly v cytolytických testech paralelní údaje o vazbě na receptory, což naznačuje, že monoklonální protilátky v každé z rozdílných skupin rozpoznávají epitopy LT-beta-R.
Tabulka 1
Kombinace rozpustných antí-LT-beta-R monoklonálních protilátek jsou cytotoxické pro humánní adenokarcinomatozní buňky HT29. Anti-LT-beta-R monoklonální protilátky jsou seřazeny do skupin I, II, III a IV na bázi jejich účinků ve vzájemné kombinaci v cytolytických testech s buňkami HT29. Plusy se týkají relativní hladiny cytolytických účinků kombinace monoklonálních protilátek na buňky HT29 v přítomnosti 8 OU/ml interferonu gama.
nr = nerelevantní, nd = nedeterminovaná
Druhá mAb
| První | Skupina I | Skupina II | Skupina III | Skupina | ||||
| Skupina | mAb | BDA8 | AGH1 | BCG6 | BHA10 | BKA11 | CDH10 | CBE11 |
| I | BDAS | nr | - | + | ++ | + | nd | nd |
| AGH1 | - | nr | ++ | + + + | ++ | nd | nd | |
| II | BCG6 | + + | + + | nr | - | +++ | nd | nd |
| BHA10 | ++ | +++ | - | nr | + | +++ | ++++ | |
| III | BKA11 | + | ++ | +++ | nd | nr | - | nd |
| CDH10 | ++ | ++ | ++ | +++ | - | nr | +++ | |
| IV | CBE11 | nd | + | + | ++++ | nd | ++++ | nr |
Obrázek 5A až D kvantifikuje účinky začlenění reprezentativních párových kombinací spoluúčinkujících anti-LT-beta-R monoklonálních protilátek, zaměřených proti různým epitopům LT-beta-R, do HT29 cytolytického testu . Obrázek 5A znázorňuje cytotoxické účinky BHA10 a CBE11, obrázek 5B znázorňuje cytotoxické účinky CDH10 a CBE11 a obrázek 5C představuje cytotoxické účinky CDH10 a AGH1 samotných a v kombinaci. Obrázek 5D ukazuje cytotoxické účinky kombinace monoklonálních protilátek CDH10 a AGH1 u jiné linie nádorových buněk zvané WiDr.
Tabulka 2 shrnuje vlastností reprezentativních anti-LT-beta-R monoklonálních protilátek podle vynálezu.
• · • · • · · ·
Tabulka 2
Souhrn myších antíhumánních LT-beta-R monoklonálních protilátek
HT29 cytotoxicita
| mAB | mAB | Barvení | Blokace mAb | Rozpustná | Rozpustná | |
| skupina | název | buněk3 | vazby recep torůb | imobili- zovaná na plastu0 | mAb samotná | mAb s LTalfal- betal |
| I | BDA8 | +++ | +++ | + | + /_d | inhibuj e |
| I | AGH1 | +++ | +++ | + /- | inhibuje | |
| II | BCG6 | ++ + | ++ | + | + /- | smíšená |
| II | EHA10 | +++ | +++ | + | +/- | smíšená |
| III | BKA11 | ++ + | +/- | + | - | potencuje |
| III | CDH10 | ++ + | +/- | + | +/- | potencuje |
| IV | CBE11 | + + + | +++ | + | + /- | bez účinku |
Kontroly
| M0PC21 - | - | - | - | bez | účinku |
| HT29/26 - | nd | - | - | bez | účinku |
| TS 2/9e nd | nd | - | - | bez | účinku |
3FACS barvení CHO buněk, u nichž došlo k transfekci s LT-beta-R bTest vyhodnocen na to, jestli protilátka blokuje vazbu rozpustného receptoru na aktivovaný hybridom 11-23 T-buňky, nd = neprovedeno cHT-29 buňky se nechaly růst s IFN-gama na destičkách pokrytých anti-LT-beta-R, jak definováno v metodách.
dVariabilní, parciální inhibice v některých testech, žádné účinky v jiných.
cAntihumánní LFA-3, myší IgGl • ·
Přiklad 9
Spolehnutí na endogenní IFN-gama pro působení na nádorové buňky
IFN-gama, výhodné LT-beta-R aktivující činidlo podle vynálezu, je cytokin, který se vyznačuje protinádorovou účinností a který je tolerován lidmi. Endogenní IFN-gama, přítomný v okolí obklopujícím nádor, může být přítomen v dostatečně vysokých koncentracích, aby fungoval jako LT-beta-R aktivující činidlo podle vynálezu bez přidání exogenního IFN-gama. Koncentrace IFN-gama v blízkosti nádoru může být stanovena použitím standardních imunotechnických metod na vzorcích tkání z oblasti nádoru. Jestliže je endogenní koncentrace IFN-gama dostatečně vysoká, aby vyvolala protinádorovou aktivitu v kombinaci s LT-alfa/beta heteromerními komplexy nebo anti-LT-beta-R monoklonálními protilátkami podle vynálezu (jak stanoveno cytolytickými testy zde popsanými), pak nemusí být IFN-gama aplikován jako druhé LT-beta-R aktivující činidlo v prostředcích nebo metodách podle vynálezu.
Příklad 10
Indukce endogenního IFN-gama jako LT-beta-R aktivujícího činidla pro působení na nádorové buňky
Sloučeniny, které mohou vyvolat endogenní produkcí interferonů, jako je IFN-gama, spadají do skupiny LT-beta-R aktivujících činidel podle vynálezu. Například mohou interferony být indukovány působením molekul dvouřetězcové RNA, jako polyrihoguanylové/polyrihocytidylové kyseliny (poly-G/C).
Samicím C57/bl6 (starým 6 až 8 týdnů) může být aplikováno injekčně 18 mg (600 mg/kg) D-galaktosaminu, který senzitivuje myši na účinky TNF a jiných protinádorových činidel.
K purifikovanému LT-alfal/beta2 (10 až 100 pg) se přidá série koncentrací poly-G/C (Juraskova a spol., Eur. J. Pharmacol., 221, str. 107 až 111 (1992)) v neutrálním fyziologickém roz- 48 • · · · · · • · toku a roztok se aplikuje myším ve formě intraperitoneální (i.p.) injekce. Protinádorová účinnost LT-alfal/beta2 bude zvýšena přítomností poly-rG/rC dvouřetězcové RNA.
Podobně může být stimulátor ínterferonu z rostliny GLycyrrhiza glabra (Acharya a spol., Indián J. Med. Res., 98, str. 69 až 74 (1993)) aplikován lidem intravenózně v dávkách od 40 do 100 ml/den. Optimální dávka pro LT-beta-R aktivaci za přítomnosti buď LT-alfa/beta heteromerních komplexů nebo anti-LT-beta-R protilátek může být stanovena empiricky a bude záviset na faktorech jako je typ nádoru, způsob aplikace a program aplikace.
Imiquimod R-837 (Bernstein a spol., Antiviral Res., 20, str. 45 až 55 (1994)), Saparal (Paramanova a spol., Vopr. Virusol., 39, str. 131 až 134 (1994)), Bropirimine (Onishi a Machida, Hinyokika Kiyo, 40, str. 195 až 200 (1994)) nebo Ridostin (Cheknev a spol., Vopr. Virusol., 39, str. 125 až 128 (1994)) mohou být též aplikovány jako LT-beta-R aktivující činidla ve spojení s LT-alfa/beta heteromerními komplexy, anti-LT-beta-R protilátkami nebo jejich kombinací. V každém případě mohou být výhodné způsoby aplikace a optimální dávky stanoveny empiricky za použití publikovaných zpráv jako výchozích bodů pro optimalizaci rutinními klinickými postupy.
Příklad 11
Myší tolerují injekce humánního LT-alfal/beta2
Samicím C57/bl6 (starým 6 až 8 týdnů), aklimatizovaným v ústavu po dobu několika dnů, bylo aplikováno injekčně i.p. 18 mg (600 mg/kg) D-galaktosaminu, který senzitivuje myši na TNF a jiné protinádorové prostředky. Byl aplikován i.p. buď humánní TNF, LT-alfa nebo LT-alfal/beta2.
Tabulka 3 dokumentuje přežití myší 24 hodin po aplikované injekci.
- 49 • · · · · ·
Tabulka 3
| Činidlo | Dávka (pg/zvíře) | Přež: |
| fyziologický roztok | - | 4/4 |
| hu-TNF | 0,2 | 0/6 |
| hu-TNF | 1,0 | 0/2 |
| hu-TNF | 10 | 0/4 |
| hu-LT-alfa | 0.2 | 2/2 |
| hu-LT-aifa | 1,0 | 2/2 |
| hu-LT-alfal/beta2 | 10 | 2/2 |
| hu-LT-alfal/beta2 | 100 | 2/2 |
Příklad 12
Vytvoření rekombinantní anti-LT-beta-R IgM monoklonální protilátky
Při použití shora popsaných protinádorových cytotoxícitních testů ve spojení se standardními modely růstu nádorů u imunodeficitních myší může být zvolen anti-LT-beta-R IgG s vhodnými vlastnostmi. Pro přípravu variabilní domény DNA z RNA izolované ze sekretující hyhridomové buněčné linie za použití standardních metodologií reverzní transkriptásy/PCR může být použito univerzálních primérů, které hyhridují ke každé z variabilních domén IgG těžkých a lehkých řetězců zvolených anti-LT-beta-R. Tyto protokoly byly popsány (Arulanandam a spol., J. Exp. Med., 177, str. 1439 až 1450 (1993), Lané a spol., Eur. J. Immunol, 22, str. 2573 až 2578 (1993), Traunecker a spol., Nátuře, 339, str. 68 až 70 (1989)).
Amplifikované produkty se pak shromáždí do vektorů obsahujících humánní CH1, CH2 a CH3 μ řetězcové domény. Koexprese dvou řetězců v jediném hostiteli umožní shromáždit těžké • · • · · · a lehké řetězce do pentamerní IgM molekuly. Tato molekula je chimérou sestávající z myších variabilních oblastí připojených k humánním konstantním oblastem.
Alternativně může být použit proces používající PCR k ampl ifikaci DNA kódující pouze aktuální vazebné oblasti variabilních oblastí. Amplifikovaná DNA je pak vložena do vektorů obsahujících všechny sekvence humánního IgG kromě aktuálních aminokyselin účastnících se vazby na antigen. Takové konstrukce se nazývají humanizované protilátky a detailní metody pro jejich přípravu jsou dobře známé (např. WO 94/04679).
Příklad 13
Anti-LT-beta-R IgM monoklonální protilátky fungují jako LT-beta-R aktivující činidla
Ant i-LT-beta-R IgM. protilátky mohou být připraveny v rekombinantní formě, jak popsáno v příkladu 12.
Alternativně mohou být použity jako zdroj anti-LT-beta-R IgM monoklonálních protilátek kompletní myší imunoglobuliny třídy IgM izolované metodami fúze hybridomu za použití primární imunizace normálních myší nebo extenzivní imunizace myší CD40 postrádajících signalizaci (Kawabe a spol., Immunity, 1, str. 167 až 178 (1994), Xu a spol. Immunity, 1, str. 423 až 431 (1994)).
Anti-LT-beta-R IgM monoklonální protilátky budou podstatně účinnější jako LT-beta-R aktivující činidla než jejich normální bivalentní IgG protějšky, měřeno srovnáními odpovědi na dávku v HT29 cytolytickém testu za přítomnosti IFN-gama. Anti-LT-beta-R IgM monoklonální protilátky fungují jako LT-beta-R aktivující činidla jak když jsou imobilizovány, tak také, když jsou aplikovány v roztoku. Kromě toho lze očekávat , že zvětší protinádorovou účinnost LT-alfa/beta heteromerních komplexů.
Příklad 14
Anti-LT-beta-R monoklonální protilátky inhibují růst humánních nádorových buněk u myší SCID
Balb/c SCID myším (Jackson Labas, Bar Harhor, ME) bylo aplikováno injekčně subkutánně (s.c.) do zadní partie zvířete 1 x 106 trypsinizovaných a promytých humánních adenokarcinomatózních WiDr buněk v objemu 0,2 ml PBS. Injekčně vpravené WiDr buňky vytvoří v myších nádory a schopnost anti-LT-beta-R monoklonální protilátky inhibovat růst nádoru byl monitorován . V jedné sadě pokusů se na myši působilo s nebo bez CBE11 anti-LT-beta-R monoklonální protilátky — buď s nebo bez humánního IFN-gama (106 protivirových jednotek/myš) -- současně s inokulací WiDr buněk s.c. (obrázek 6A) . Protilátky a IFN-gama byly aplikovány samotné nebo společně i.p. injekcí v 0,2 ml. Kontrolním myším byl aplikován injekčně samotný fyziologický roztok, IFN-gama samotný nebo kontrolní antihumánní LFA-3 monoklonální protilátka (1E6) s IFN-gama. Velikost každého výsledného nádoru byla změřena 30 dní po inokulací. Objem nádoru (v cm3 byl) vypočten z poloměru zjištěného měřením posuvným měřítkem ve dvou směrech. Zvířata, kterým byly aplikovány CBE11 nebo 1E6 monoklonální protilátky, dostaly 10 pg/myš nebo 50 pg/myš protilátky (obrázek 6A, kroužky s tečkami a prázdné kroužky).
V jíně sadě pokusů, byly myši ínokulovány s.c. WiDr buňkami a nádory se nechaly růst 15 dní, dříve než se myším aplikovala CBE11 anti-LT-beta-R monoklonální protilátka (obrázek 6B) . 15. den (před aplikací protilátky) činil objem nádoru 0,076 cm3 při středním průměru 0,53 cm. Pak byla aplikována CBE11 anti-LT-beta-R monoklonální protilátka (50 pg) -buď s nebo bez humánního IFN-gama (106 protivirových jednotek/myš) — i.p. injekcí v 0,2 ml skupině 12 zvířat. Injekce se opakovaly třikrát nebo vícekrát během období tří týdnů. Kontrolním skupinám (12 myší/skupina) byl injekčně aplikován IFN-gama samotný (106 protivirových jednotek/myš) ne- 52 bo s 50 pg kontrolní antihumánní LFA-3 monoklonální protilátky (1E6) + IFN-gama (IQ6 protivirových jednotek/myš). Růst nádorů přítomných 15. den byl měřen během doby od 15. do 49. dne po inokulaci nádorových buněk. Výsledky znázorněné na obr. 6B byly zjištěny zaslepeným způsobem. Nádory, na které se působilo monoklonální protilátkou CBE11 bud s nebo bez IFN-gama, přestaly růst. Po třech injekcích monoklonální protilátky CBE11 (+/- IFN-gama) během tří týdnů se růst nádorů zastavil nejméně na 7 týdnů po inokulaci, to jest v době, kdy pokus byl ukončen.
Claims (4)
1. Způsob léčby nebo omezení pokračování, závažnosti nebo účinků neopiazie, ticky účinného množství vyznačuj i c i onsanujici operaci apiixace terapeuLT-aifa/beta heteromerního komplexu, s e t i m , že alfa/beta heteromerní komplex se aplikuje za přítomnosti terapeuticky účinného množství nejméně jednoto LT-nete.-R aktivujícího činidle.
u i iil . Způsob podle nároku 1, vyznačující se se jedním ZT-teta-*?» aktivujícím činidlem je tera^eu ticky účinné množství i^N-^ama.
- i m , oe orunym 1/ narcnu Z, v y _ _ _ _ _ _ :ta-R aktivujícím činidlem je tera~
4. Způsob naroK'
- η η r. n 1 ΐ r n á i r: n r n ř i —
Způsob podle nároku 4, vyznačující se že monoklonální protilátka anti—LT—beta—R je zvolena nv zahrnující anti-LT-beta-R monoklonální protilátku
6. Způsob léčby nebo omezení pokračováni, nebo účinků neopiazie, vyznačující ~ že obsahuje operaci aplikace terapeuticky účinného množství nejméně (dvou) jednoho LT-beta-R aktivujícího činidla (aktivujících činidel) a farmaceuticky přijatelného nosiče.
závaznosti i m .
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že nejméně jedno LT-beta-R aktivující činidlo je anti-LT-beta-R protilátka.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačuj i t i m , že protilátka anti-beta-R je CBSil.
(substitute-sheet
-54• · · · i ·
Způsob podle nároku 6, v y z n a č u j že zahrnuje nejméně dvě monoklonální proriíarny anti-LT-beta-R, které jsoi epitopům LT-beta-R.
zamereny proti neprexryvajicis se jiná monoklonální skupiny zahrnující
10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že jedna monoklonální protilátka anti-LT-beta-R je zvolena ze skupiny zahrnující AGHi a BDA8 a protilátka anti-LT-beta-R je zvolena ze BCG6, BHA.10, BKAlí, CDHIO a CBBli.
11. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že jedna monoklonální protilátka ant1-LT-beta-R je zvolena ze skupiny zahrnující ECGo a BHAiO a jiná monckionái— ní protilátka anti-LT-beta R je zvolena ze
AGHi, BDA8 , BK A.i i, CDHiO a CBBli.
i
2 . 2 Ό ϋ S O n : í m , že jedna — v o 1 e n a ze rn o η o z i o n a λ n i s k u ρ i n v z a ?. r n u jící B Ά1 '' ‘T-beta-R je zvorena ze suupiny zanrnuj í c í AGHi a BD A.8 , BCG€ ΒΉΑ10 a CΞz. 1 i
13. Způsob podle nároku 9, v yznačující se tím, že jedna monoklonální protilátka anti—LT—beta—R je CBBil a jiná monoklonální protilátka anti-LT-beta-R je zvolena Ze skUD1 n v 7a'nrnuiírí ΐ í p 7Ί 5 « P, C “ B, P, 5 P ” 2» ” CDHiO a CBBil.
14. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že monok1onainími pnotiiátkaai ant ί—ΒΤ —teta-B. jsou CBBli a ΒΗΆΙ0.
15. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že monokionáiními protilátkami anti-LT-beta-R jsou CBBil a CDHIO.
SUBSTITUTE SHEET
J s e je
u.
rori e
L.
24. Zpiisoh pudle nároku 18, vyznačující se , se sesirene protiistsy an— i—l/í'-se —e~x jsou xc-vaientne ι Γ * WIW .1 Ji— ·ΒΙ 11 —RwewI I -----—- SUBSTITUTE SHEEI • · · ·
3. €[ 27 G G Y 3. ΓΪ y V ITCZUOKU pCSCCi C Π e tu 1 C rie 70 p2TCSC27uL Í2G piTGv 113íKu 3.2Ί G I*— iu i J)6 tS* zl
Způsob puuie íiciruků 13 áz 24, v yz n a č n j i c m , 26 uruay-s li^lSíh^k Hf.íivu j ic im cimciem ]s
IíR-gama.
Způsub leoby nebo omezeni ponracovani^ to CL '* CL to nu c sb.
1 e DG cCifif.u HvOP;
y ώ i; cl u
26 ODScfiUje Gp6273CI £píi;'.6C .μ-'τ tib.“.; ulíu.;
jmene jecnoriG n
n r i vs τ — ? n «=> * n :u LÍLÍ.J y! X J CL te to :;uc;cc , ú / . npuSOb pOníe IíclITuKiI ne .« */ y z li cl C u. j i C
CL - - b b V
4u.óU*J iioÍj_Uj. U Z.
to Xx <. j. * to . cl , η u tx i. e
1! C .'t Γ·. 1
v y z n a c u 3 i c i *_ x * C< to· x 11 Gi to to x. to .ereromerΙ,υχμ X =.·.
Li-csra-K cimaxa a arunsno
!.'r-seta-K asnvujicino cini-aia a
D i zjištěni, zna arune predpoKíadctně LT' — cata-5. ϋΚΐΐ'.'ΐιjící činidlo zvyšuje protinádorovou aktivitu heteromerního komplexu LT-alřa/beta v přítomnosti prvního LT-be jícího činidla.
30. Způsob podle nároku 29, vyznačující se t í m , že prvním LT-beta-R aktivujícím činidlem je IFN-gama.
SUBSTITUTE SLIB =— —r • · « • · <
» · · · ·· r·. η i p nároku 29, v y z n a c u 3 i c 1 se komplex LT-alfa/beta má stechic-metr i i . r—aifal/betaz
3 u. Farmaceuticky prostředek podle uoltoku 1 ct z 31, v y znač u jící se tím , že obsahuje dále terapeuticky účinné množství nejméně jednoho LT-beta-R aktivující ho činidia.
prostředek podle nároku 32, e tím , že jedním LT-beta-R
33. Farmaceutreky v y z n a č u j ící aktivujícím činidlem je IFN-gama.
«.ueUtruKy 5 í r' í podie naroxu 32, , že jedním LT-beta-R míi-LT-beta-R.
íie naronu ch,
Γ. t r> v r\ t
Buricny ρ r u s u r e o e κ pocia nároku zo, ící se tím , že n-onokionaí ní pronťi-LT-heta-R je zvolena ze skupiny zahrnující ta-R monokionáiní protilátku ΒΚΆ11, CDHIO, BCG6
37, Farmaceutický prostředek, vyznačující 3t t í m , že obsahuje terapeuticky účinné množství nejméně dvou LT-beta-R aktivujících činidel bez exogenníno heteromermho komdexu LT-alfa/beta a farmaceuticky přijatelný nosič.
33. Farmaceutický prostředek podle nároku 37, vyznačující se tím , že nejméně jedním LT-beta-R aktivujícím činidlem je protilátka anti-LT-beta-R.
39. Farmaceutický prostředek podle nároku 33, vyznačující se tím , že anti-LT-beta-R
SUBSTITUTE SHEET
-58• « · · · · • · · · ·
IIM ·· ·· · ··· jrotiiátka je monoklonální proči latka .
nároku 39,
40. Farmaceutický prostředek podle vyznačující se tím , že monoklonální protilátka anti-LT-beta-R je CBEli.
41. Farmaceutický vyznačuj í c í prostředek mim rsofí ! p , ze nároku nejméně
37 , dvě i_,y—oeta-k aktivující cinidia jsou monokionami prouiia-k^ anti-LT-beta-R, které jsou zaměřeny proti nepřekrývajícím se epitopúm LT—beta—R.
42. Farmaceuticky prostředek vyznačující se tím protilátka anti-LT-beta-R je zvolena AGH1 a ΒυΆ6 3 jiná monoklonální c^ctij svoiena ze skupiny zahrnující BCG6, podle nároku 41, Že e d n a monoklonální ; e skupin y zahrnuj í c i
BBÁIC. P-ííAíI. CDHlu
4J . rarmaceut lcky prostředek vyznačující se z i m protilátka anti-LT-heta-R je zvolena laroKu r c b o a r η a 10 zvolena ze a CBEli.
d J · iici li; LJ ii —i zanrnujici skupiny zanrnujic:
B D A 5 - B B A1 ? r o ~ 11 a m a anti—ni’ — n* cum
44. farmaceuticky prostředek podle nároku 41., v y z n a č u j í c í s e t í m , že jedna monoklonální protilátka anti-LT-beta-R je zvolena ze skupiny zahrnující Bří AI i a CDH10 a jiná monoklonální protilátka anti—LT — beta—R je zvoiena ze skupiny zanrnujici a CBEli.
AGHi, aDAS, 3CG5 , BhAIO
45. Farmaceutický vyznačuj í c í prostředek se tím podle nároku 41, že jedna monoklonální protilátka anti-LT-beta-R je CBtlI a jiná manekionaini protilátka anti—LT—beta—R je zvolena ze skupiny zahrnující AGHi, BĎAS , BCG6, BHA10, BKAII, CDHlu a CBEli.
SUBSTITUTE SHEET
46. Farmaceutický vyznačující s proti látkami anti—LT—beta
47. Farmaceutický vyznačující s protilátkami anti-LT-beta
48. Farmaceutický vyznačující s protilátkami anti-LT-beta
49. Farmaceutický ρ vyznačující s prostředek e tím R jsou ř.GHI a CDHIO.
ostředek podle nároků 41 až 48, e tím , že dále obsahuje eta-R aktivujících činidel trmai .ck’
-K jsou nek prostředek podle nároku 50. e tím , že zesítěné protiiátQV3í6l,Íl6 í ΓΓιΟΌ 1 i 1 ZO VSíiy Π3 pGvTCiiU
52. Farmaceutický v y z n a č u j i c í ky anti-LT-beta-R jsou prostře se ti ovalentně ek podle nároku 50, m , že zesítěné protiiáíimobil izovány na povrchu.
53. Farmaceutický vyznačující ky anti-LT-beta-R jsou mocí činidla zesíťujíc
54. Farmaceutický vyznačující cim protilátku anti — LT prostředek se tím beta-R je sek podle nároku 53, , že činidlem zesíťujíundární protilátka zaměSUBSTITUTE SHEET
-60• · I · · · • · · · • * · « « · · • » « · » · · • · · · · · rena proti protilátce anti-u-seta-K.
55. Farmaceutický prostředek podle nároku 50, vyznačující se tím , že zesítěné protilátky anti-LT-beta-R jsou kovalentně agregovány v roztoku pomocí chemického činidla zesítujícího protilátku anti-LT-beta-R.
56. Farmaceutický prostředek podle nároků 50 až 55, vyznačující se tím , že dále obsahuje IFN-gama jako druhé LT-beta-R aktivující činidlo.
57. Farmaceutický prostředek, vyznačuj í c í se tím , že obsahuje terapeuticky účinné množství nejméně jednoho LT—beta—R. aktivujícího činidla bez exooenního he· teromerního komplexu LT-aifa/beta a farmaceuticky přijatelný nosič
58. FaraaceuticK; v y z n a č u j ící L r - o e - a - x a x — i v u j í c í m orostreuex n i rt ! « σι naroKu 5/ :rorrlarra ano i-nr-oeza-R
59. Farmaceutický vyznačující protilátkou je CEFli.
naroxu 5;
anti-LT-beta60. LT-beta-R aktivující činidlo zvolené způsobem podle nároku 29.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US37896895A | 1995-01-26 | 1995-01-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ236197A3 true CZ236197A3 (cs) | 1998-02-18 |
| CZ298711B6 CZ298711B6 (cs) | 2008-01-02 |
Family
ID=23495285
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ0236197A CZ298711B6 (cs) | 1995-01-26 | 1996-01-26 | Farmaceutické prostredky aktivující LT-beta receptor pro lécení nebo omezení pokracování, závažnosti nebo úcinku neoplazie, zpusob selekce LT-beta receptor aktivujícího cinidla a protilátky proti LT-beta receptoru |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP1407781A1 (cs) |
| JP (2) | JPH10513161A (cs) |
| KR (2) | KR100470739B1 (cs) |
| CN (3) | CN1589902A (cs) |
| AT (1) | ATE268604T1 (cs) |
| AU (1) | AU725351B2 (cs) |
| BG (1) | BG62599B1 (cs) |
| BR (1) | BR9606808A (cs) |
| CA (1) | CA2211443A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ298711B6 (cs) |
| DE (1) | DE69632681T2 (cs) |
| DK (1) | DK0809510T3 (cs) |
| EA (1) | EA000096B1 (cs) |
| EE (1) | EE04453B1 (cs) |
| ES (1) | ES2220972T3 (cs) |
| FI (1) | FI119359B (cs) |
| HK (1) | HK1006356A1 (cs) |
| HU (1) | HUP9801746A3 (cs) |
| NO (1) | NO322744B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ303405A (cs) |
| PL (1) | PL185364B1 (cs) |
| PT (1) | PT809510E (cs) |
| RO (1) | RO118634B1 (cs) |
| SK (1) | SK286497B6 (cs) |
| WO (1) | WO1996022788A1 (cs) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5925351A (en) | 1995-07-21 | 1999-07-20 | Biogen, Inc. | Soluble lymphotoxin-β receptors and anti-lymphotoxin receptor and ligand antibodies as therapeutic agents for the treatment of immunological disease |
| US6140467A (en) * | 1997-07-07 | 2000-10-31 | La Jolla Institute For Allergy And Immunology | Ligand for herpes simplex virus entry mediator and methods of use |
| US7118742B2 (en) * | 1997-07-07 | 2006-10-10 | La Jolla Institute For Allergy And Immunology | Ligand for herpes simplex virus entry mediator and methods of use |
| US7060667B1 (en) | 1998-01-30 | 2006-06-13 | Biogen Idec Ma, Inc. | Treatment of follicular lymphomas using inhibitors of the LT pathway |
| AU777492C (en) | 1998-10-09 | 2005-05-26 | Biogen Ma Inc. | Reversal of viral-induced systemic shock and respiratory distress by blockade of the lymphotoxin beta pathway |
| CA2425809A1 (en) | 2000-10-13 | 2002-04-18 | Biogen, Inc. | Humanized anti-lt-.beta.-r antibodies |
| EP1539793A4 (en) * | 2002-07-01 | 2006-02-01 | HUMANIZED ANTIBODIES AGAINST THE RECEPTOR OF LYMPHOTOXIN BETA | |
| PL377611A1 (pl) * | 2002-12-20 | 2006-02-06 | Biogen Idec Ma Inc. | Czynniki dla receptora limfotoksyny beta w połączeniu z czynnikami chemioterapeutycznymi |
| CA2511013A1 (en) * | 2002-12-20 | 2004-07-15 | Biogen Idec Ma Inc. | Multivalent lymphotoxin beta receptor agonists and therapeutic uses thereof |
| US20050163782A1 (en) | 2003-06-27 | 2005-07-28 | Biogen Idec Ma Inc. | Modified binding molecules comprising connecting peptides |
| WO2005092927A1 (en) | 2004-03-23 | 2005-10-06 | Biogen Idec Ma Inc. | Receptor coupling agents and therapeutic uses thereof |
| WO2006074399A2 (en) | 2005-01-05 | 2006-07-13 | Biogen Idec Ma Inc. | Multispecific binding molecules comprising connecting peptides |
| EP1764371A1 (de) * | 2005-04-25 | 2007-03-21 | Xantos Biomedicine AG | Agonistische Antikörper, welche an den LT-Beta-Rezeptor binden und dadurch Adipositas assoziierte Phänotypen modulieren, und deren Verwendung in der Therapie |
| CN101073665B (zh) * | 2006-05-17 | 2014-11-26 | 上海复旦张江生物医药股份有限公司 | 淋巴毒素在制备增加化疗药物敏感性的药物中的应用 |
| WO2008042436A2 (en) | 2006-10-03 | 2008-04-10 | Biogen Idec Ma Inc. | Biomarkers and assays for the treatment of cancer |
| US8338376B2 (en) | 2006-10-20 | 2012-12-25 | Biogen Idec Ma Inc. | Compositions comprising variant LT-B-R-IG fusion proteins |
| EP2073833A2 (en) | 2006-10-20 | 2009-07-01 | Biogen Idec MA Inc. | Treatment of demyelinating disorders with soluble lymphotoxin-beta-receptor |
| EP2335071A1 (en) * | 2008-09-30 | 2011-06-22 | F. Hoffmann-La Roche AG | Biological markers predictive of rheumatoid arthritis response to lymphotoxin antagonists |
| WO2013085925A1 (en) * | 2011-12-05 | 2013-06-13 | Igenica, Inc. | Antibody-drug conjugates and related compounds, compositions, and methods |
| AU2016209324B2 (en) | 2015-01-20 | 2020-02-27 | Igm Biosciences, Inc. | Tumor necrosis factor (TNF) superfamily receptor binding molecules and uses thereof |
| EP4255929A2 (en) | 2020-12-02 | 2023-10-11 | Vib Vzw | An ltbr agonist in combination therapy against cancer |
| WO2022117569A1 (en) | 2020-12-02 | 2022-06-09 | Oncurious Nv | A ccr8 antagonist antibody in combination with a lymphotoxin beta receptor agonist antibody in therapy against cancer |
| WO2023198848A1 (en) | 2022-04-13 | 2023-10-19 | Vib Vzw | An ltbr agonist in combination therapy against cancer |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6124599A (ja) * | 1984-07-11 | 1986-02-03 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 新規ヒトインタ−フエロン−ｒポリペプチド誘導体 |
| JPS61277628A (ja) * | 1985-06-04 | 1986-12-08 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 癌治療用白血球刺激材 |
| US4770995A (en) * | 1985-08-29 | 1988-09-13 | New York Blood Center, Inc | Detection of the sensitivity of cells to the effects of tumor necrosis factor and lymphotoxin |
| CA2086264C (en) * | 1990-06-27 | 2002-12-24 | Jeffrey L. Browning | Surface complexed lymphotoxin |
| DE69334224D1 (de) * | 1992-12-04 | 2008-07-17 | Biogen Idec Inc | Lymphotoxin-beta, lymphotoxin-beta komplexe, pharmazeutische zubereitungen und therapeutische verwendungen davon |
-
1996
- 1996-01-26 EP EP20030022584 patent/EP1407781A1/en not_active Withdrawn
- 1996-01-26 KR KR1019970705213A patent/KR100470739B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-01-26 AU AU49704/96A patent/AU725351B2/en not_active Ceased
- 1996-01-26 EP EP96906260A patent/EP0809510B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-26 HU HU9801746A patent/HUP9801746A3/hu unknown
- 1996-01-26 RO RO97-01398A patent/RO118634B1/ro unknown
- 1996-01-26 KR KR10-2004-7015796A patent/KR100475492B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-01-26 EE EE9700255A patent/EE04453B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-01-26 BR BR9606808A patent/BR9606808A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-01-26 NZ NZ303405A patent/NZ303405A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-01-26 DK DK96906260T patent/DK0809510T3/da active
- 1996-01-26 PT PT96906260T patent/PT809510E/pt unknown
- 1996-01-26 ES ES96906260T patent/ES2220972T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-01-26 SK SK986-97A patent/SK286497B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1996-01-26 CZ CZ0236197A patent/CZ298711B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-01-26 CA CA002211443A patent/CA2211443A1/en not_active Abandoned
- 1996-01-26 WO PCT/US1996/001386 patent/WO1996022788A1/en active IP Right Grant
- 1996-01-26 PL PL96321758A patent/PL185364B1/pl unknown
- 1996-01-26 CN CNA2004100070585A patent/CN1589902A/zh active Pending
- 1996-01-26 CN CNA2006101007130A patent/CN1900116A/zh active Pending
- 1996-01-26 DE DE69632681T patent/DE69632681T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1996-01-26 EA EA199700144A patent/EA000096B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-01-26 JP JP8523078A patent/JPH10513161A/ja not_active Withdrawn
- 1996-01-26 AT AT96906260T patent/ATE268604T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-01-26 CN CNB961922710A patent/CN1146442C/zh not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-07-22 NO NO19973385A patent/NO322744B1/no not_active IP Right Cessation
- 1997-07-25 FI FI973118A patent/FI119359B/fi active IP Right Grant
- 1997-08-26 BG BG101855A patent/BG62599B1/bg unknown
-
1998
- 1998-06-02 HK HK98104772A patent/HK1006356A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-03-12 JP JP2007062695A patent/JP2007169296A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7459537B2 (en) | Anti-lymphotoxin-β receptor antibodies as anti-tumor agents | |
| CZ236197A3 (cs) | Komplexy alfa/beta-lymfotoxinu a protilátky anti-lymfotoxin-beta-receptoru jako protinádorová činidla | |
| JP5379107B2 (ja) | 免疫調節因子であるｂａｆｆレセプター（ｂｃｍａ） | |
| US20030059427A1 (en) | Isolation and characterization of highly active anti-CD40 antibody | |
| JP2002531416A (ja) | Ｃｔｌａ−４遮断薬を用いる自己抗原に対するｔ細胞の刺激 | |
| NZ275711A (en) | Monoclonal antibodies and binding proteins which bind to human fas antigen (nerve growth factor/tumour necrosis factor receptor type) | |
| US6015559A (en) | Fas antagonists | |
| CZ458899A3 (cs) | Použití činidla rušícího vazbu CD40:CD154 pro přípravu léku ke zmírnění syndromů způsobených inhibicí exogenního proteinu | |
| HU226044B1 (en) | Use of inhibitors of the lymhotoxin (lt) pathway to prepare pharmaceutical compositions for treatment of follicular lymphomas | |
| US20230416386A1 (en) | Use of anti-ox40 antibody in treatment of tumor or cancer | |
| US20230203164A1 (en) | Anti-ctla-4 monoclonal antibody, preparation method therefor, and application thereof | |
| WO2023001118A1 (zh) | 抗ox40抗体在联合用药中的应用 | |
| MXPA97005629A (en) | Linfotoxin-alpha / beta complexes and anti-tetration antibodies of lymphotoxin beta as agents anti-tu |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20100126 |