ES2220972T3

ES2220972T3 - Complejos de linfotoxinas-alfa/beta y anticuerpos de los receptores de anti-linfotoxina-beta como agentes antitumorales.

Info

Publication number: ES2220972T3
Application number: ES96906260T
Authority: ES
Inventors: Jeffrey L. Browning; Werner Meier; Christopher D. Benjamin
Original assignee: Biogen Inc
Current assignee: Biogen Inc
Priority date: 1995-01-26
Filing date: 1996-01-26
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2016-01-26
Also published as: EP0809510B1; CZ236197A3; CA2211443A1; EE04453B1; MX9705629A; BG101855A; DE69632681D1; KR100470739B1; CN1177302A; ATE268604T1; WO1996022788A1; PL321758A1; HUP9801746A3; FI973118A0; AU4970496A; KR100475492B1; JP2007169296A; SK286497B6; NZ303405A; CN1146442C

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A COMPOSICIONES Y METODOS UTILES PARA ACTIVAR LA SEÑALIZACION DEL RECEPTOR LT VEZ, PRODUCE EFECTOS ANTIPROLIFERATIVOS POTENTES EN LAS CELULAS TUMORALES. MAS PARTICULARMENTE LA INVENCION SE REFIERE A COMPLEJOS HETEROMERICOS DE LINFOTOXINA FORMADOS ENTRE LA LINFOTOXINA NDUCEN EFECTOS CITOTOXICOS EN CELULAS TUMORALES EN PRESENCIA DE AGENTES ACTIVANTES DEL RECEPTOR DE LINFOTOXINA MO LA INVENCION SE REFIERE A ANTICUERPOS DIRIGIDOS CONTRA EL RECEPTOR DE LINFOTOXINA ES DEL RECEPTOR DE LINFOTOXINA ON OTROS AGENTES ACTIVANTES DEL RECEPTOR DE LINFOTOXINA TANTO EN PRESENCIA COMO EN AUSENCIA DE COMPLEJOS DE LINFOTOXINA HOS ANTICUERPOS. ESTA INVENCION SE REFIERE ASIMISMO A COMPOSICIONES Y METODOS QUE UTILIZAN ANTICUERPOS RETICULANTES ANTI-RECEPTOR DE LINFOTOXINA TROS AGENTES ACTIVANTES DEL RECEPTOR DE LINFOTOXINA

Description

Complejos de linfotoxinas-\alpha/\beta y anticuerpos de los receptores de anti-linfotoxina-\beta como agentes antitumorales.

Campo técnico de la invención

La invención se refiere a composiciones y al uso de dichas composiciones para activar la señal de los receptores de linfotoxina-\beta, que a su vez provoca potentes efectos anti-proliferantes en células tumorales. Más particularmente, esta invención se refiere a complejos heterómeros de linfotoxinas formados entre linfotoxina-\alpha y subunidades múltiples de linfotoxina-\beta, que inducen efectos citotóxicos sobre células tumorales en presencia de agentes activadores de los receptores de la linfotoxina-\beta. También están dentro del objeto de esta invención los anticuerpos dirigidos contra el receptor de la linfotoxina-\beta que actúan como agentes activadores de los receptores de la linfotoxina-\beta, solos o en combinación con otros agentes activadores de los receptores de la linfotoxina-\beta, ya sea en presencia o en ausencia de complejos de linfotoxina-\alpha/\beta. Se proporciona un método de búsqueda para seleccionar tales anticuerpos. También se refiere esta invención a composiciones y al uso de dichas composiciones utilizando anticuerpos de los receptores de anti-linfotoxina-\beta reticulado en presencia de otros agentes activadores de los receptores de la linfotoxina-\beta para potenciar la citotoxicidad de las células tumorales.

Antecedentes de la invención

La familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF, por sus siglas en inglés) tiene varios miembros cuya señal puede inducir la muerte de las células tumorales mediante necrosis o apoptosis (muerte celular programada). Los ligandos TNF y linfotoxina-\alpha (LT-\alpha; denominado anteriormente TNF-\beta) se unen a y activan a los receptores de TNF (p60 y p80; llamados aquí "TNF-R"). La señal de TNF-R inicia respuestas inmunes generales a la infección o al estrés en células normales, pero es citotóxica para células con fenotipos transformados o para células tumorales. La señal de TNF-R puede lisar selectivamente células tumorales y células infectadas con virus. Los efectos citotóxicos de la señal de TNF-R sobre las células tumorales se favorecen con interferón-\gamma (IFN-\gamma) y con diferentes agentes quimioterapéuticos convencionales.

Sería útil aprovecharse de las actividades antiproliferantes o citotóxicas inducidas mediante señal de TNF-R en células tumorales con propósitos terapéuticos. Sin embargo, la activación de TNF-R tiene efectos pleiotrópicos en diferentes respuestas inmunorreguladoras incluyendo la iniciación de cascadas pro-inflamatorias. Así, no ha sido posible dirigir los efectos citotóxicos de la señal de TNF-R a las células tumorales sin co-estimular las respuestas inflamatorias que llevan a la toxicidad general en humanos.

De forma similar, la estimulación de otro receptor relacionado con TNF llamado el receptor Fas (FasR) puede disparar la citotoxicidad mediante muerte celular programada en diferentes tipos de células tumorales y no tumorales. Sin embargo, se ha visto que la activación de FasR causa necrosis hepática rápida, excluyendo por tanto su aplicación terapéutica en seres humanos.

Recientemente, se ha identificado otro receptor en la familia de TNF llamado el receptor de LT-\beta (LT-\beta-R) (Crowe et al., Science, 264, páginas 707-710 (1994)). El LT-\beta-R se une a complejos heterómeros de linfotoxinas (LT-\alpha/\beta) que comprenden subunidades de LT-\alpha en asociación con otros polipéptidos relacionados con el TNF llamados linfotoxina \beta (LT-\beta). Estos complejos LT-\alpha/\beta están asociados a la membrana y la mayoría tienen una estequiometría LT-\alpha1/\beta2 (Browning et al., Cell, 72, páginas 847-56 (1993); Browning et al., J. Immunol., 154, páginas 33-46 (1995)).

Por analogía con TNF-R y otros receptores similares al TNF, se piensa que la activación de la señal de LT-\beta-R ocurre cuando múltiples receptores de la superficie celular se disponen muy próximos (Crowe et al., Science, 264, páginas 707-10 (1994)). Se denomina este proceso agrupamiento de receptores. Los ligandos de TNF y LT son complejos multivalentes que pueden unirse simultáneamente y agregarse de esta manera con más de un receptor. Está bien documentado el agrupamiento de receptores como un medio de activación de receptores en otros sistemas, especialmente para tirosinaquinasas de receptores (Ullrich y Schlessinger, Cell, 61, páginas 203-212 (1990); Kolanus et al., Cell, 74, páginas 171-83 (1993)). Por tanto, sería útil administrar ligandos de LT-\alpha1/\beta2 y/o agentes de activación de LT-\beta-R que pueden inducir el agrupamiento y la señalización hacia dentro de moléculas de LT-\beta-R sobre la superficie de células tumorales diana para estimular directamente la vía de LT-\beta-R en estas células.

La señalización mediante LT-\beta-R, como con TNF-R, puede activar vías que llevan a la citotoxicidad y a la muerte celular en células tumorales. De forma importante, los ligandos de LT-\alpha1/\beta2 no se unen a TNF-R con cualquier afinidad significativa. Por esta razón, la activación de LT-\beta-R dirigida a células tumorales desencadenaría la citotoxicidad en esas células sin estimular las vías inflamatorias asociadas con la activación de TNF-R. El tratamiento con LT-\alpha1/\beta2 y/u otros agentes activadores de LT-\beta-R sería de esta manera útil para tratar o reducir el avance, gravedad o efectos de células tumorales (neoplasia) mientras se que superarían los potentes problemas secundarios que se han encontrado cuando se ha tratado la activación de TNF-R o FasR como un tratamiento antitumoral.

Sumario de la invención

La presente invención resuelve los problemas anteriormente mencionados mediante la propuesta de composiciones farmacéuticas y su uso para tratar células tumorales mediante la estimulación de la señalización de LT-\beta-R sin co-estimular las respuestas inflamatorias asociadas con TNF-R. En una realización, se proporcionan complejos de linfotoxinas formados entre LT-\alpha y múltiples subunidades de LT-\beta (complejos heterómeros LT-\alpha/\beta) que inducen efectos citotóxicos en células que llevan el LT-\beta-R en la presencia de agente activador de LT-\beta-R. Las composiciones preferidas y el uso de esta realización comprenden complejos LT-\alpha1/\beta2 en presencia de un agente activador de LT-\beta-R. Más preferiblemente, los complejos LT-\alpha1/\beta2 están mejor en forma soluble que en forma unida a la membrana, y el agente activador de LT-\beta-R es TNF-\gamma.

En otra realización de la invención, se utiliza al menos un anticuerpo dirigido contra LT-\beta-R (Ab anti-LT-\beta-R) como un segundo agente activador de LT-\beta-R en unión con el complejo heterómero LT-\alpha/\beta. Se caracterizan las composiciones preferidas y el uso de esta realización por LT-\alpha1/\beta2 en presencia de IFN-\gamma como un primer agente activador, y al menos un Ab anti- LT-\beta-R como un segundo agente activador LT-\beta-R. Más preferiblemente, son solubles los complejos LT-\alpha1/\beta2 y el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal (mAb anti-LT-\beta-R).

En otra realización de la invención, se utiliza al menos un Ab anti-LT-\beta-R en presencia o ausencia de un segundo agente activador de LT-\beta-R sin un complejo heterómero LT-\alpha/\beta exógeno. Las composiciones preferidas y el uso de esta realización comprenden al menos dos anticuerpos monoclonales anti-LT-\beta-R (mAbs anti-LT-\beta-R) que reconocen epítopes que no se solapan de LT-\beta-R en combinación con IFN-\gamma.

En otra realización, esta invención se refiere a composiciones farmacéuticas y su uso para potenciar la toxicidad de las células tumorales caracterizadas por Abs anti-LT-\beta-R reticulados utilizados en unión con un segundo agente activador de LT-\beta-R. En una realización preferida, se inmovilizan Abs individuales anti-LT-\beta-R mediante su reticulación sobre una superficie. En otra realización preferida, se reticulan en solución los Abs anti-LT-\beta-R. Más preferiblemente, los Abs anti-LT-\beta-R son anticuerpos monoclonales y el segundo agente activador de LT-\beta-R es IFN-\gamma.

Esta invención proporciona también un nuevo proceso de búsqueda para seleccionar agentes activadores de LT-\beta-R, tales como Abs anti-LT-\beta-R, que funcionan en combinación con complejos heterómeros LT-\alpha/\beta para promover la muerte de células tumorales. El ensayo utiliza la sensibilidad aumentada de células de adenocarcinoma humano con respecto a complejos heterómeros de LT-\alpha/\beta en presencia de agentes activadores de LT-\beta-R en un ensayo de citotoxicidad. El procedimiento utilizado para ensayar agentes activadores de LT-\beta-R aparentes se ejemplifica para el caso de anticuerpos anti-LT-\beta-R, y comprende las siguientes etapas:

1) Se cultivan durante varios días células tumorales (p. ej., células HT29 de adenocarcinoma humano) en medios que contienen IFN-\gamma y LT-\alpha1/\beta2 purificados en presencia o ausencia del Ab anti- LT-\beta-R que está siendo ensayado;

2) Se tratan las células con una tinción que tiñe células vivas; y

3) Se cuantifica el número de células teñidas para determinar la fracción de células tumorales eliminadas en presencia del LT-\alpha1/\beta2, IFN-\gamma y el Ab de ensayo anti-LT-\beta-R en cada muestra. De manera alternativa, se puede determinar el número de células supervivientes por cualquiera de diferentes ensayos bien conocidos que miden la viabilidad celular, tales como incorporación de ^{3}H-timidina en DNA.

Un Ab anti-LT-\beta-R (o una combinación de Ab) que aumenta significativamente el porcentaje de células tumorales eliminadas en este ensayo es un agente activador de LT-\beta-R dentro del alcance de esta invención. Se puede adaptar este ensayo citolítico para identificar nuevos agentes activadores de LT-\beta-R que funcionan en combinación con complejos heterómeros LT-\alpha/\beta.

Breve descripción de las figuras

Figura 1A. Análisis de tamaño de formas de complejos heterómeros purificados LT-\alpha/\beta separados por cromatografía de inmunoafinidad de TNF-R y de LT-\beta-R. Se analizaron las proteínas purificadas en una resina de HPLC TSK 3000 en solución salina tamponada con fosfato. Se muestra la posición de diferentes marcadores de tamaño.

Figura 1B. Análisis de intercambio iónico de formas LT purificadas utilizando una columna de carboximetilo Poros (4,6 mm x 100 mm) en un instrumento BioCad (Perceptive Biosystems). Se cargaron 27 \mug de cada proteína de muestra en una columna y se eluyeron en un gradiente de NaCl 0 a 1M sobre 20 volúmenes de la columna a 5 ml/min en un tampón conteniendo Hepes 16,66 \muM, acetato de Na 16,66 \muM, y tampón de Mes 16,66 \muM (pH 6,5).

Figura 2A. Comparación de la actividad citotóxica de: receptor mAb CH-11 anti-Fas (-\bullet-); TNF (-\circ-); LT-\alpha (-\Box-); LT-\alpha1/\beta2 (-\sqbullet-) y LT-\alpha2/\beta1 (-\blacklozenge-) sobre células HT29 de adenocarcinoma humano, ya sea en presencia o en ausencia de 80 U/ml de IFN-\gamma.

Figura 2B. Comparación de la capacidad de 5 \mug/ml de IgG humana (-\bullet-), p60TNF-R-Fc soluble (-\circ-); y quimeras solubles receptor de LT-\beta-R-Fc-inmunoglobulina (-\Box-) de inhibir los efectos citotóxicos en la Fig. 2A en presencia de 80 U/ml de IFN-\gamma.

Figura 3. Los mAbs anti-LT-\beta-R potencian el efecto citotóxico de LT-\alpha1/\beta2 sobre células HT29 de adenocarcinoma humano. (A) Los efectos citolíticos de LT-\alpha1/\beta2 sobre células HT29 se potencian con la presencia del mAb CDH10 anti-LT-\beta-R. Se midieron los efectos de LT-\alpha1/\beta2 sin mAb (-\bullet-), y en presencia de 0,5 \mug/ml de IgG1 control (-\sqbullet-), 0,05 \mug/ml de CDH10 (-\circ-) y 0,5 \mug/ml de CDH10 (-\Box-). (B) Los efectos citolíticos de LT-\alpha1/\beta2 sobre células HT29 se inhiben con la presencia del mAb BDA8 anti-LT-\beta-R. Se midieron los efectos de LT-\alpha1/\beta2 en presencia de 2 \mug/ml de IgG1 de control (-\sqbullet-) o mAb BDA8 anti-LT-\beta-R (-\Box-). La diferencia entre el comportamiento de los mAbs CDH10 y BDA8 anti-LT-\beta-R en este ensayo es una indicación de que se dirigen a diferentes epítopes del LT-\beta-R.

Figura 4. Los mAbs anti-LT-\beta-R inmovilizados son citotóxicos para las células HT29 de adenocarcinoma humano. (A) Los mAbs anti-LT-\beta-R tienen un efecto citotóxico directo sobre las células HT29 cuando se inmovilizan sobre una superficie. Se revistieron las placas con IgG1 (-\bullet-), un mAb dirigido contra un antígeno HT29/26 no relacionado abundante en la superficie celular (-\sqbullet-), BDA8 (-\circ-) y CDH10 (-\Box-).(B) Los efectos de solamente mAbs anti-LT-\beta-R solubles sobre las células HT29. Los símbolos como en (A). Estos mAbs anti-LT-\beta-R en su forma soluble no tienen efectos citotóxicos significativos sobre las células HT29 cuando se administran individualmente.

Figura 5. Cuantificación representativa de la citotoxicidad aumentada con respecto a las células tumorales mediante el tratamiento con pares de mAbs anti-LT-\beta-R. (A) Los efectos citotóxicos sobre las células HT29 de la IgG1 control (100 ng/ml), mAb BHA10 anti-LT-\beta-R (100 ng/ml), mAb CBE 11 anti-LT-\beta-R (50 ng/ml), BHA10 (100 ng/ml) + IgG (100 ng/ml), y BHA10 (100 ng/ml) + CBE11 (50 ng/ml). IFN-\gamma estaba presente con 80 U/ml. (B) Los efectos citotóxicos sobre células HT29 de la IgG1 control (100 ng/ml), mAb CDH10 anti-LT-\beta-R (100 ng/ml), mAb CBE11 anti-LT-\beta-R (50 ng/ml), CDH10 (100 ng/ml) + IgG1 (100 ng/ml), y CDH10 (100 ng/ml) + CBE11 (50 ng/ml). IFN-\gamma estaba presente con 80 U/ml. (C) Los efectos sobre células HT29 de la IgG1 control (100 ng/ml), mAb CDH10 anti-LT-\beta-R (33 ng/ml), mAb AGH1 anti-LT-\beta-R (50 ng/ml), y CDH10 (33 ng/ml) + AGH1 (50 ng/ml), sobre células HT29. IFN-\gamma estaba presente con 80 U/ml. (D) Como en (C) excepto en que se utilizaron células WiDr de adenocarcinoma humano en el ensayo citolítico (Raitano y Korc, J. Biol. Chem., 265, páginas 10466-472 (1990)).

Figura 6. Tamaño de los tumores en ratones SCID tratados con un mAb anti-LT-\beta-R (A) Tamaño del tumor WiDr de adenocarcinoma humano en ratones SCID 30 días después de la inoculación con un co-tratamiento de anticuerpos. Se trataron los ratones en los días 1 y 2 con solución salina, solamente IFN-\gamma, un mAb anti-LT-\beta-R (CBE11) con y sin IFN-\gamma y un mAb LFA-3 anti-humano control (1E6) con IFN-\gamma. Se indica la media de cada grupo mediante una barra cruzada. Las medias, desviaciones típicas, y número de animales (en paréntesis) para los cinco grupos (izquierda a derecha) eran: 0,88 +/- 0,59 (14), 1,21 +/- 0,7 (21), 0,041 +/- 0,052 (16), 0,11 +/- 0,1 (12), y 0,98 +/- 1,16 (12). (B) Tamaño del tumor WiDr de adenocarcinoma humano en ratones SCID de 14 a 49 días después de la inoculación de células tumorales con un tratamiento de anticuerpos 15 días después de la inoculación. Los tumores crecieron hasta un diámetro medio de 0,53 cm (0,076 cm^{3}) sin ningún tratamiento y se empezaron las inyecciones intraperitoneales en el día 15 y se continuaron tal como se indica por las flechas. Se indican las medias y desviaciones típicas para un grupo de 12 animales tratados o solamente con IFN-\gamma (1 x 10^{6} U/inyección) (-\Box-), IFN-\gamma con 50 \mug de mAb 1E6 anti-LFA-3 (-\circ-),IFN-\gamma con 50 \mug de mAb CBE11 anti-LT-\beta-R (-\Delta-) o 50 \mug de mAb CBE11 anti-LT-\beta-R solamente (no mostrado).

Descripción detallada de la invención

Para que se pueda entender totalmente la invención que aquí se describe, se realiza la siguiente descripción detallada.

El término "actividad anti-tumoral" se refiere a la capacidad de una sustancia o composición de bloquear la proliferación, o de inducir la muerte de células tumorales que interactúan con esa sustancia o composición.

El término "apoptosis" se refiere a un proceso de muerte celular programada.

El término "actividad citotóxica" se refiere a la capacidad de una sustancia o composición para inducir la muerte de células que interactúan con esa sustancia o composición.

El término "epítope" (o determinante antígeno) se define como la parte de una molécula que se combina con un único lugar de unión de antígenos sobre una molécula de anticuerpo. Un único epítope se reconoce por un anticuerpo monoclonal (mAb). Múltiples epítopes son normalmente reconocidos por anticuerpos policlonales (Ab).

El "dominio Fc" de un anticuerpo se refiere a una parte de la molécula que comprende las regiones CH2, CH3 y bisagra, pero no tiene los lugares de unión de antígenos.

El término "agente inductor del interferón" se refiere a cualquier agente que sea capaz de estimular directa o indirectamente la producción endógena de o los interferones de tipo I (IFN-\alpha, IFN-\beta) o de tipo II (IFN-\gamma). Ejemplos de agentes inductores de interferones comprenden moléculas de RNA de cadena doble, y una variedad de compuestos de plantas o farmacéuticamente derivados.

Los términos "LT-\alpha muteína" y "LT-\beta muteína" se refieren a polipéptidos LT-\alpha o LT-\beta que tienen uno o más cambios de aminoácidos comparados con la secuencia de aminoácidos del correspondiente polipéptido primitivo.

El término "agente activador de LT-\beta-R" se refiere a cualquier agente que pueda aumentar la unión de ligandos a LT-\beta-R, agrupación de LT-\beta-R de la superficie celular o señal de LT-\beta-R, o que pueda influir cómo se interpreta la señal de LT-\beta-R dentro de la célula. Ejemplos de agentes activadores de LT-\beta-R comprenden IFN-\alpha, IFN-\gamma, TNF, agentes inductores de interferones, Abs anti-LT-\beta-R solubles, Abs anti-LT-\beta-R reticulados y Abs anti-LT-\beta-R multivalentes.

El término "señalización de LT-\beta-R" se refiere a todas las reacciones moleculares asociadas con la vía de LT-\beta-R y subsiguientes reacciones moleculares que resultan de ellas.

El término "anticuerpo anti-LT-\beta-receptor" ("Ab anti-LT-\beta-R") se refiere a cualquier anticuerpo que reconoce y se une con al menos un epítope del receptor de LT-\beta.

El término "anticuerpo monoclonal del receptor de anti-LT-\beta" ("mAb anti-LT-\beta-R") se refiere a cualquier anticuerpo monoclonal que reconoce y se une a un único epítope del LT-\beta-R.

El término "(m)Abs anti-LT-\beta-R reticulados" se refiere a anticuerpos dirigidos contra el LT-\beta-R que o que se han reticulado entre sí para formar aglomerados de anticuerpos en solución utilizando un agente reticulador de anticuerpos (Ab) o (mAb) anti-LT-\beta-R, o que se han inmovilizado en cercana proximidad entre sí sobre una superficie o matriz.

El término "agente reticulador de Ab (o mAb) anti-LT-\beta-R" se refiere a cualquier agente que pueda agregar de forma covalente o no covalente Abs anti-LT-\beta-R en solución de tal manera que los Abs se puedan unir y potenciar agrupamiento de receptores de LT-\beta de las superficie de las células diana. Tales agentes reticuladores comprenden, pero no están limitados, agentes reticuladores químicos, anticuerpos secundarios que reaccionan con partes de los Abs o mAbs anti-LT-\beta-R, y receptores Fc solubles o unidos a la superficie - ya sea endógenos o añadidos exógenamente - que se pueden unir a los Abs anti-LT-\beta-R.

Los términos "actividad biológica de LT-\alpha", "actividad biológica de LT-\beta", y "actividad biológica de LT-\alpha/\beta" se definen como : 1) reactividad inmunológica cruzada con un anticuerpo dirigido contra al menos un epítope de la correspondiente subunidad o complejo de subunidades nativas; o 2) la capacidad de la subunidad o complejos de subunidades LT para competir por lugares de unión de ligandos sobre un receptor específico de LT, tal como TNF-R o LT-\beta-R; o 3) que tiene la capacidad de estimular una respuesta reguladora inmune o actividad citotóxica cualitativamente en común con una subunidad o complejo LT nativo.

El término "complejo heterómero LT-\alpha/\beta" se refiere a una asociación estable entre al menos una subunidad LT-\alpha y más de una subunidad LT-\beta. Las subunidades se pueden asociar mediante interacciones electrostáticas, de van der Waals, o covalentes. Preferiblemente, el complejo heterómero LT-\alpha/\beta tiene al menos dos subunidades adyacentes LT-\beta y no tiene subunidades adyacentes LT-\alpha. Lo más preferible, es que el complejo tenga la estequiometría LT-\alpha1/\beta2.

El término "ligando multivalente" se refiere a una molécula o complejo que tiene más de un lugar de unión de receptor y que es capaz de unir simultáneamente y poner en proximidad cercana al menos dos moléculas de receptor.

Una "secuencia líder de tipo I" es una parte terminada en amino de una proteína eucariótica que sirve como una señal para dirigir la proteína a la membrana del retículo endoplasmático (ER) y a menudo a través de toda la vía de secreción. Generalmente la secuencia líder se separa mediante una peptidasa de señal en la membrana del ER.

Una "secuencia de señal" es el equivalente funcional de una secuencia líder de tipo I eucariótica en hospedadores procarióticos, y dirige la translocación de las proteínas en o a través de las membranas bicapa de lípidos de una bacteria.

Un "complejo heterómero LT-\alpha/\beta" soluble es un complejo heterómero LT-\alpha/\beta que comprende subunidades LT-\beta solubles, en las que se han suprimido o inactivado las secuencias de aminoácidos que localizan el polipéptido a la membrana, haciendo que la subunidad LT-\beta sea soluble. Se pueden segregar complejos heterómeros LT-\alpha/\beta solubles mediante una célula hospedadora apropiada que se ha transformado por ingeniería genética para expresar las dos subunidades.

Un "complejo superficial LT-\alpha/\beta" es un complejo que comprende subunidades LT-\alpha y subunidades LT-\beta unidas a la membrana que se expresa sobre la superficie celular.

Producción de complejos LT-\alpha/\beta unidos a la membrana

Se han caracterizado los complejos de linfotoxina de la superficie celular en células de hibridomas de células T CD4^{+} (II-23.D7) que expresan elevados niveles de LT (Browning et al., J. Immunol., 147, páginas 1230-37 (1991); Androlewicz et al., J. Biol. Chem. 267, páginas 2542-47 (1992)). El LT-\alpha maduro carece de un dominio transmembranal y se localiza en la superficie celular a través de la interacción con al menos una subunidad LT-\beta unida a la membrana. Los complejos heterómeros LT-\alpha/\beta unidos a la membrana (superficie) tienen predominantemente una estequiometría LT-\alpha1/\beta2.

LT-\beta como una proteína de membrana celular se une a LT-\alpha durante la síntesis, "apuntando" de esta manera la LT-\alpha a la membrana celular. En ausencia de LT-\beta , LT-\alpha se segrega al medio extracelular. Normalmente, las subunidades LT se unen dando complejos dentro de la célula antes de la exportación de proteínas dentro de la membrana. Una vez que las subunidades LT-\beta se han insertado en la membrana, no forman complejos estables con la LT-\alpha segregada. De esta manera, si se desea la forma unida a la membrana de un complejo heterómero LT-\alpha/\beta, es preferible co-expresar las subunidades LT-\alpha y LT-\beta deseadas dentro de la misma célula.

Se puede reconstruir el complejo heterómero LT-\alpha/\beta superficial por co-transfección de las células hospedadoras con los dos genes de LT-\alpha y LT-\beta. No se pueden observar los complejos LT superficiales en líneas celulares estables que expresan solamente cualquier gen de LT. Sin embargo, si la célula hospedadora produce normalmente grandes cantidades de LT-\alpha (p. ej. células RPMI 1788; véase más adelante), entonces debería ser suficiente la transfección con un gen LT-\beta que codifica el polipéptido deseado de LT-\beta para generar complejos LT-\alpha/\beta que comprenden subunidades LT-\alpha en toda su longitud.

La co-expresión de polipéptidos LT-\alpha y LT-\beta en un número de sistemas eucarióticos de expresión lleva a su ensamblaje y exportación como ligando activo (Crowe et al., J. Immunol. Methods, 168, 79-89 (1994)). Los sistemas hospedadores que se pueden utilizar comprenden, pero no se limitan, células CHO, células COS, células B incluyendo mielomas, células de insectos infectadas con baculovirus y levadura.

Se puede seleccionar la subunidad LT-\alpha de los complejos heterómeros LT-\alpha/\beta de esta invención de linfotoxina-\alpha, linfotoxina-\alpha humana o animal primitiva, linfotoxina-\alpha recombinante, linfotoxina-\alpha soluble, linfotoxina-\alpha segregada, muteínas de linfotoxina-\alpha teniendo actividad biológica de LT-\alpha, o fragmentos de linfotoxina-\alpha de cualquiera de las anteriores teniendo actividad biológica de LT-\alpha.

El polipéptido de LT-\alpha puede ser cualquier forma soluble de la molécula incluyendo sus fragmentos activos que se pueden producir en sistemas eucarióticos de expresión, en los que se separará la secuencia líder de LT-\alpha natural. De forma alternativa, se pueden utilizar fusiones de la secuencia de LT-\alpha madura con una secuencia de señal heteróloga para maximizar la secreción de LT-\alpha en otros sistemas hospedadores. Se eligen las señales en base a la célula hospedadora que se desea, y pueden comprender secuencias bacterianas, de levaduras, de mamíferos y virales. La señal primitiva, o la secuencia de señal de la molécula 1 de adhesión de célula vascular (VCAM-1) es apropiada para utilizarse en sistemas de expresión de mamíferos.

También se pueden fusionar los polipéptidos de LT-\alpha para dar polipéptidos que tienen una vida media plasmática prolongada, tales como cadenas de inmunoglobulina o sus fragmentos. Las proteínas plasmáticas que se pueden utilizar para favorecer la vida media plasmática comprenden seroalbúmina, inmunoglobulinas, apoliproteínas, y transferrrina. La unión con polietilenglicol (PEG) puede estabilizar el polipéptido y disminuir su inmunogenicidad. Preferiblemente, la proteína de fusión de LT-\alpha, en los usos según la reivindicación 3, no es significativamente inmunógena en el sujeto que se va a tratar y la proteína plasmática no causa efectos secundarios no deseados en sujetos, debido a su actividad biológica normal.

Se glicosila la LT-\alpha humana en los residuos de N y O, y dependiendo de la fuente, exhibe una considerable microheterogeneidad basada en los azúcares. La composición de oligosacáridos de la LT-\alpha particular elegida para formar el complejo de LT puede afectar las tasas de aclaramiento in vivo (Fukushima et al., Arch. Biochem. Biophys., 304, páginas 144-53 (1993)). Puesto que se pueden producir variantes de glicosilación mediante la expresión de diferentes células hospedadoras, esto es un factor que se debe considerar al seleccionar un origen de LT-\alpha.

Se puede purificar LT-\alpha de una línea linfoblastoide B RPMI 1788, que segrega constitutivamente LT-\alpha y que se puede inducir para segregar niveles m\alphas elevados mediante el tratamiento con el PMA éster forbol (Aggarwal et al., J. Biol. Chem. 259, páginas 686-91 (1984)). De forma alternativa, se puede utilizar el gen de LT-\alpha humano clonado para producir de manera recombinante polipéptidos de LT-\alpha en diferentes sistemas hospedadores incluyendo bacterias (Schoenfeld et al., J. Biol. Chem., 266, páginas 3863-69 (1991)); células de insectos infectadas con baculovirus (Crowe et al., J. Immunol. Methods, 168, 70-89 (1994)); y células de mamíferos (Browning y Ribolini, J. Immunol., 143, páginas 1859-67 (1989); (Fukushima et al., Arch. Biochem. Biophys., 304, páginas 144-53 (1993)).

Se pueden evaluar trozos del gen de LT-\alpha que codifican fragmentos de polipéptidos teniendo actividad biológica de LT-\alpha utilizando ensayos de búsqueda rutinarios. Los ensayos útiles de búsqueda de la actividad biológica de LT-\alpha comprenden ensayos de inhibición competitiva con LT-\alpha primitivo unido a TNF-R, o midiendo directa o indirectamente mediante inhibición la capacidad del LT-\alpha de inducir citotoxicidad de células tumorales en ensayos conocidos en la técnica. Preferiblemente, se ensamblan los fragmentos de LT-\alpha dando complejos heterómeros con LT-\beta y se ensayan en los complejos la actividad biológica de LT-\alpha/\beta mediante inhibición competitiva con LT \alpha/\beta unidos a LT-\beta-R, o su capacidad de inducir citotoxicidad de células tumorales en los ensayos aquí descritos.

Se ha identificado la linfotoxina-\beta, también denominada p33, sobre la superficie de linfocitos T, líneas celulares T, líneas celulares B y células asesinas activadas con linfoquina. LT-\beta es el objeto de las solicitudes internacionales pendientes de concesión del solicitante PCT/US91/04588, publicada el 9 de enero de 1992 como documento WO 92/00329; y PCT/US93/11669, publicada el 23 de junio de 1994 como documento WO 94/13808, que se incorporan aquí como referencia.

El gen de LT-\beta codifica un polipéptido de 240-244 aminoácidos (Browning et al., Cell, 72, páginas 847-56 (1993)). LT-\beta es una proteína de membrana de tipo II con un dominio citoplásmico terminado en N corto seguido de un dominio de anclaje a la membrana de 30 aminoácidos hidrófobos. Tiene un único lugar de glicosilación unido a N y tiene solamente un residuo de cisteína que no parece que esté implicado en la formación de enlaces disulfuro entre subunidades.

Se pueden seleccionar las subunidades LT-\beta comprendiendo los complejos heterómeros LT-\alpha/\beta de la presente invención de linfotoxina-\beta, linfotoxina-\beta humana o animal primitiva, linfotoxina-\beta recombinante, linfotoxina-\beta soluble, linfotoxina-\beta segregada, muteínas de linfotoxina-\beta teniendo actividad biológica de LT-\beta, o fragmentos de linfotoxina-\beta de cualquiera de las anteriores teniendo actividad biológica de LT-\beta.

Tal como se ha discutido anteriormente para el polipéptido de LT-\alpha, también se pueden modificar los polipéptidos de LT-\beta para aumentar su solubilidad o vida media plasmática utilizando los mismos métodos. Similarmente, se pueden evaluar trozos del gen de LT-\beta que codifican fragmentos de polipéptidos teniendo actividad biológica de LT-\beta utilizando ensayos de búsqueda rutinarios, tal como se ha discutido para LT-\alpha.

Producción de complejos solubles

Los complejos heterómeros LT-\alpha/\beta solubles (no unidos a la membrana) comprenden subunidades LT-\beta que se han cambiado de una forma unida a la membrana a una forma soluble. Se describen estos complejos en detalle en la solicitud internacional pendiente de concesión del solicitante (PCT/US93/11669, publicada el 9 de enero de 1992 como documento WO 94/13808). Se definen los péptidos de LT-\beta solubles por la secuencia de aminoácidos de la linfotoxina-\beta, en la que la secuencia se separa en cualquier punto entre el final de la región transmembranal (es decir, aproximadamente en el aminoácido 444) y la primera región de homología de TNF (es decir, en el aminoácido #88) según el sistema de numeración de Browning et al., Cell, 72, páginas 847-56 (1993).

Se pueden producir polipéptidos LT-\beta solubles mediante truncamiento del terminal en N de LT-\beta para eliminar la cola citoplásmica y la región transmembranal (Crowe et al., Science, 264, páginas 707-710 (1994)). De forma alternativa, se puede inactivar el dominio transmembranal por deleción, o mediante sustitución de los residuos de aminoácidos normalmente hidrófobos que comprende un dominio transmembranal con hidrófilos. En cualquier caso, se crea un perfil de hidropatía sustancialmente hidrófilo que reducirá la afinidad lipídica y aumentará la solubilidad acuosa. Se prefiere la deleción del dominio transmembranal a la sustitución con residuos de aminoácidos hidrófilos, porque evita introducir epítopes potencialmente inmunógenos.

Se puede reemplazar el dominio transmembranal eliminado o inactivado o unir a una secuencia líder de tipo I (p. ej. la líder VCAM-1) de tal manera que la proteína se segrega empezando por una secuencia en cualquier sitio entre val40 a pro88. Los polipéptidos LT-\beta solubles pueden incluir cualquier número de secuencias líder bien conocidas en el terminal en N. Tal secuencia permitiría que los péptidos se expresaran y llegaran a la vía de secreción en un sistema eucariótico. Véase, p. ej., Ernst et al., documento de patente de E.E.U.U. Nº 5.082.783 (1992).

Se pueden producir complejos heterómeros de LT-\alpha/\beta solubles mediante la co-transfección de una célula hospedadora apropiada con DNA que codifica LT-\alpha y LT-\beta soluble (Crowe et al., J. Immunol. Methods, 168, páginas 79-89 (1994)). La LT-\beta soluble segregada en ausencia de LT-\alpha está muy oligomerizada. Sin embargo, cuando se co-expresa con LT-\alpha, se forma una estructura similar a un trímero de 70 kDa que contiene las dos proteínas. Es también posible producir complejos heterómeros de LT-\alpha1/\beta2 solubles mediante la transfección de una línea celular que normalmente expresa sólo LT-\alpha (tales como las células RPMI 1788, que se han discutido anteriormente) con un gen que codifica un polipéptido de LT-\beta soluble.

Se pueden sintetizar por separado los polipéptidos de LT-\alpha y LT-\beta, desnaturalizarse utilizando detergentes suaves, mezclarse juntos y volver a naturalizarse eliminando el detergente para formar complejos heterómeros de LT mezclados, que se pueden separar (véase más adelante).

Purificación de complejos LT-\alpha1/\beta2

Se separan complejos heterómeros de LT-\alpha1/\beta2 solubles de complejos de co-expresión que comprenden una estequiometría de subunidad diferente mediante cromatografía utilizando receptores de TNF y de LT-\beta como reactivos de purificación de afinidad. Los receptores de TNF solamente se unen dentro de trozos de \alpha/\alpha de complejos de LT. El receptor de LT- \beta se une con elevada afinidad a trozos de \beta/\beta, y con baja afinidad a trozos de \alpha/\beta de complejos heterómeros de LT-\alpha/\beta. Por tanto, LT-\alpha3 y LT-\alpha2/\beta1 se unirán a TNF-R. El LT-\beta-R se puede unir también a trímeros de LT-\alpha2/\beta1 (dentro de los trozos de \alpha/\beta) pero no se pueden unir al LT-\alpha3. Además, el LT-\beta-R (pero no TNF-R) se une a LT-\alpha1/\beta2 y a LT-\betan (no se conoce la composición exacta de tal preparación, sin embargo, son grandes agregados).

Se pueden preparar los reactivos de afinidad con el receptor, ya sea como un dominio extracelular soluble (véase, por ejemplo, Loetscher et al., J. Biol. Chem., 266, páginas 18324-29 (1991)), ya sea como proteínas quiméricas con el dominio de unión de ligandos extracelulares unido a un dominio Fc de inmunoglobulina (Loetscher et al., J. Biol. Chem., 266, páginas 18324-29 (1991)); Crowe et al., Science, 264, páginas 707-710 (1994)). Los receptores se unen a matrices de afinidad mediante reticulación química utilizando procedimientos de rutina.

Existen dos esquemas mediante los cuales se puede purificar el ligando de LT-\alpha1/\beta2 utilizando receptores y cromatografía de inmunoafinidad. En el primer esquema, se pasa un sobrenadante procedente de un sistema de expresión apropiado que co-expresa tanto el LT-\alpha como la forma truncada de LT-\beta por una columna de TNF-R. El TNF-R se unirá a los trímeros de LT-\alpha3 y LT-\alpha2/\beta1. El caudal procedente de la columna de TNF-R contendrá LT-\beta(n) y LT-\alpha1/\beta2.

En el segundo esquema, se unen todas las formas conteniendo LT-\beta (LT-\beta(n), LT-\alpha1/\beta2 y LT-\alpha2/\beta1) y se eluyen de una columna LT-\beta-R utilizando métodos clásicos, tales como compuestos caotrofos o cambio de pH. (LT-\alpha3 fluye a través de esta columna). Se neutraliza el eluído o se elimina el compuesto caotrofo, y seguidamente se pasa el eluído sobre una columna de TNF-R, que se une solamente a los trímeros de LT-\alpha2/\beta1. El flujo de esta columna contendrá trímeros de LT-\beta(n) y LT-\alpha1/\beta2.

En ambos casos, se pueden separar trímeros de LT-\alpha1/\beta2 puros procedentes de LT-\beta mediante subsiguiente filtración con gel y/o procedimientos cromatográficos de intercambio iónico conocidos en la técnica.

De manera alternativa, se pueden separar diferentes formas de complejos heterómeros de LT-\alpha/\beta y purificar mediante una variedad de medios cromatográficos convencionales. Puede ser también preferible combinar una serie de esquemas de purificación convencionales con una de las etapas de purificación por inmunoafinidad descritas anteriormente.

Origen de los anticuerpos anti-LT-\beta-R

Se preparan sueros de anticuerpos policlonales contra el receptor de LT-\beta humano utilizando técnicas convencionales mediante la inyección a animales, tales como cabras, conejos o ratones, de manera subcutánea de una proteína de fusión humana de receptor-Fc de LT-\beta (Ejemplo 2) en coadyuvante de Freund completo, seguido de una inyección intraperitoneal o subcutánea reforzadora en Freunds completo. Se exploran mediante procedimientos convencionales los antisueros policlonales que contienen los anticuerpos deseados que se dirigen contra el receptor de LT-\beta.

Se preparan anticuerpos monoclonales de ratón (mAbs) dirigidos contra una proteína de fusión humana de receptor-Fc de LT-\beta mediante inmunización intraperitoneal de ratones RBF de manera repetitiva con una proteína de fusión recombinante de receptor-Fc de LT-\beta derivada de una célula CHO (LT-\beta-R-Fc) unidas a perlas de proteína A-sefarosa en ausencia de coadyuvante. Finalmente se refuerzan los animales con LT-\beta-R-Fc soluble (tanto i. p. como i. v.), se fusionan células del bazo utilizando protocolos clásicos, y se exploran los hibridomas mediante ELISA (Ling et al., J. Interferon and Cytokine Res., 15, páginas 53-59 (1995)). Se siguen explorando los hibridomas para buscar su capacidad de bloquear la unión de células de hibridomas de II-23 activadas - que expresan LT-\alpha1/\beta2 de superficie - a placas revestidas de LT-\beta-R-Fc en un ensayo total celular. Se preparan mAbs puros mediante purificación con proteína A-sefarosa de IgG procedentes de sobrenadantes de cultivo de hibridomas.

También se pueden hacer diferentes formas de anticuerpos anti- LT-\beta-R utilizando técnicas estándar de DNA recombinante (Winter y Milstein, Nature, 349, páginas 293-99 (1991)). Por ejemplo, se pueden construir anticuerpos "quiméricos" en los cuales el dominio de unión del antígeno de un anticuerpo animales esté unido a un dominio constante humano (p. ej. Cabilly et al., documento US 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, páginas 6851-55 (1984)). Los anticuerpos quiméricos reducen las respuestas inmunógenas observadas promovidas por anticuerpos animales cuando se usan en tratamientos clínicos humanos.

Además, se pueden sintetizar los "anticuerpos humanizados" recombinantes que reconocen el LT-\beta-R. Los anticuerpos humanizados son quimeras que comprenden principalmente secuencias de IgG humana en las cuales se han insertado las regiones responsables de la unión de antígenos específicos (p. ej. documento WO 94/04679). Se inmunizan los animales con el antígeno deseado, se aíslan los correspondientes anticuerpos, y se elimina la parte de las secuencias de la región variable responsables de la unión de antígenos específicos. Seguidamente se clonan las regiones las regiones de unión de antígenos derivadas de animales en la posición apropiada de genes de anticuerpos humanos en los cuales se han eliminado las regiones de unión de antígenos. Los anticuerpos humanizados minimizan el uso de secuencias heterólogas (entre especies) en anticuerpos humanos, y es menos probable que provoquen respuestas inmunes en el sujeto tratado.

Se puede realizar también la construcción de diferentes tipos de anticuerpos anti-LT-\beta-R recombinantes mediante la fabricación de anticuerpos quiméricos o humanizados que comprenden los dominios variables de anti-LT-\beta-R y dominios constantes humanos (CH1, CH2, CH3) aislados de diferentes tipos de inmunoglobulinas. Por ejemplo, se pueden producir de forma recombinante anticuerpos IgM anti-LT-\beta-R con valencias aumentadas de lugares de unión de antígenos mediante clonación del lugar de unión del antígeno en vectores que llevan las regiones constantes de cadena \mu humana (Arulanandam et al., J. Exp. Med., 177, páginas 1439-50 (1993); Lane et al., Eur. J. Immunol., 22, páginas 2573-78 (1993); Traunecker et al., Nature, 339, páginas 68-70 (1989)).

Además, se pueden utilizar técnicas estándar de DNA recombinante para cambiar las afinidades de unión de anticuerpos recombinantes con sus antígenos mediante la alteración de los residuos de aminoácidos en la vecindad de los lugares de unión de antígenos. Se puede aumentar la afinidad de unión de antígenos de un anticuerpo humanizado mediante mutagénesis basada en los modelos moleculares (Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, páginas 10029-33 (1989); documento WO 94/04679).

Puede ser deseable aumentar o disminuir la afinidad de Abs anti-LT-\beta-R para el LT-\beta-R dependiendo del tipo de tejido apuntado o del programado tratamiento previsto en particular. Por ejemplo, en los usos de la composiciones según las reivindicaciones 2-6 puede ser ventajoso tratar a un paciente con niveles constantes de Abs anti-LT-\beta-R con capacidad reducida a la señal a través de la vía para tratamientos semi-preventivos. Similarmente, Abs anti-LT-\beta-R con afinidad aumentada para el LT-\beta-R puede ser ventajoso para tratamientos dirigidos a tumores de corta duración.

Búsqueda en anticuerpos anti-LT-\beta-R de agentes activadores de LT-\beta-R

Los anticuerpos anti LT-\beta-R de esta invención pueden potenciar la actividad antitumoral de los complejos heterómeros de LT-\alpha/\beta (preferiblemente LT-\alpha1/\beta2) en presencia de un agente activador de LT-\beta-R, tal como IFN-\gamma. Estos anticuerpos anti-LT-\beta-R se denominan también aquí agentes activadores de LT-\beta-R. Los anticuerpos que actúan como agentes activadores de LT-\beta-R se seleccionan tal como sigue:

1) Se cultivan una serie de pocillos de cultivo tisular que contienen células tumorales, tales como células HT29 durante tres a cuatro días en medios conteniendo un agente activador de LT-\beta-R, tal como IFN-\gamma, y complejo heterómero de LT-\alpha/\beta purificado - preferiblemente LT-\alpha1/\beta2 - siendo investigado en presencia o ausencia de diluciones seriales del Ab anti-LT-\beta-R;

2) Se añade un colorante vital que mide la función mitocondrial, tal como MTT, a la mezcla celular y se deja reaccionar durante varias horas;

3) Se cuantifica la densidad óptica de la mezcla en cada pocillo a 550 nm de longitud de onda (DO 550). La OD 550 es inversamente proporcional al números de células tumorales eliminadas en presencia del complejo heterómero LT-\alpha/\beta, del agente activador de LT-\beta-R y del Ab anti-LT-\beta-R de ensayo en cada pocillo.

Los anticuerpos preferidos de esta invención que actúan individualmente como agentes activadores de LT-\beta-R en presencia de LT-\alpha1/\beta2 e IFN-\gamma comprenden los mAbs anti-LT-\beta-R BKA11, CDH10, BHA10 y BCG6 (Tabla 2, parte de abajo).

Anticuerpos anti-LT-\beta-R reticuladores

Los anticuerpos anti-LT-\beta-R reticulados de esta invención actúan individualmente como agentes activadores de LT-\beta-R sin complejos heterómeros de LT-\alpha/\beta exógenos en presencia de un segundo agente activador de LT-\beta-R, tal como IFN-\gamma. Abs anti-LT-\beta-R reticulados se unen aparentemente e inducen el agrupamiento de receptores de LT-\beta de la superficie celular activando la muerte de la célula diana mediada por el receptor de LT-\beta.

En una realización, se reticulan uno o más tipos de anticuerpos anti-LT-\beta-R mediante la inmovilización sobre una matriz o superficie insoluble en agua. Es útil una derivatización con un agente bifuncional para reticular los anticuerpos a la matriz o superficie de soporte insoluble en agua. Los agentes normalmente utilizados para efectuar la reticulación de anticuerpos a una matriz o superficie de soporte insoluble en agua comprenden 1,1-bis-(-diazoacetil)-2-feniletano, glutiraldehido, ésteres de N-hidroxisuccinamida, incluyendo los ésteres con el ácido 4-azidosalicílico, imidioésteres homobifuncionales incluyendo ésteres de disuccinimidilo, y maleimidas bifuncionales, tales como bis-N-maleimido-1,8-octano. Agentes de derivatización, tales como metil-3-[(p-azidofenil)-ditio)-propioimidato forman compuestos intermedios fotoactivables, que se pueden reticular de forma selectiva cuando se estimulan con luz. Se pueden utilizar también para inmovilización de proteínas y reticulación matrices insolubles en agua y reactivas, tales como carbohidratos activados con bromuro de cianógeno y los sustratos descritos en los documentos de patentes de los E.E.U.U. Nos. 3.959.080; 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; 4.055.635; y 4.330.440.

Las superficies a las cuales se unen los anticuerpos pueden ser polímeros no proteínicos, generalmente un polímero hidrófilo, ya sea de origen natural o sintético. Se pueden utilizar polímeros hidrófilos de polivinilo, tales como alcohol de polivinilo (PVA) y polivinilpirrolidona (PVP). Son también útiles los éteres de polialquileno, tales como polietilenglicol, polipropilenglicol, ésteres de polioxietileno o metoxipolietilenglicol, polioxialquilenos, tales como polioxietileno y polioxipropileno, y copolímeros en bloque de polioxietileno y polioxipropileno (Pluronics); polimetilmetacrilatos; carbómeros; polisacáridos ramificados y sin ramificar que comprenden los monómeros sacáridos D-manosa, D- y L-galactosa, fucosa, fructosa, D-xilosa, L-arabinosa, ácido D-glucurónico, ácido siálico, ácido D-galacturónico, ácido D-manurónico (p. ej. ácido poli-manurónico o ácido algínico), D-glucosamina, D-galactosamina, D-glucosa y ácido neuramínico, incluyendo homopolisacáridos y heteropolisacáridos, tales como lactosa, amilopectina, almidón, hidroxietil-almidón, amilosa, sulfato de dextrano, dextrano, dextrinas, glucógeno, o la subunidad de polisacárido de ácidos mucopoli-sacáridos, p. ej. ácido hialurónico; polímeros de alcoholes de sacáridos, tales como polisorbitol y polimanitol; y heparina o heparona.

El polímero antes de la reticulación es preferiblemente hidrosoluble y preferiblemente contiene solamente un único grupo químico reactivo para evitar sucesos múltiples de reticulación con el anticuerpo. En cualquier caso, se deben optimizar las condiciones de reacción para reducir la reticulación y para recuperar productos - ya sea directamente o mediante la subsiguiente filtración con gel o etapa cromatográfica - teniendo un intervalo de peso molecular sustancialmente homogéneo. Se determinará el peso molecular óptimo de la matriz del anticuerpo reticulado mediante experimentación rutinaria utilizando los ensayos de citotoxicidad y de unión del receptor aquí descritos.

El conjugado final después de la reticulación es preferiblemente soluble en fluidos fisiológicos, tales como la sangre. El polímero no debe ser altamente inmunógeno en la forma conjugada, y debe poseer una viscosidad compatible con la infusión o inyección intravenosa, si una cualquier de las dos es una ruta querida de administración.

El polímero puede ser también insoluble en agua. Los materiales que se pueden utilizar comprenden geles hidrófilos, u objetos moldeados teniendo superficies en las cuales se pueden inmovilizar los anticuerpos, tales como tubos quirúrgicos, catéteres, o conductos de drenaje. Es preferible utilizar materiales sólidos de soporte que sean biológicamente compatibles y sustancialmente inertes en ambientes fisiológicos. Un material es biológicamente compatible si no estimula de manera sustancial respuestas inmune incluyendo inflamación, o atrae células fibrilares cuando se colocan dentro del cuerpo de un sujeto.

Los Abs anti-LT-\beta-R pueden estar también inmovilizados sobre superficies que se han revestido de manera covalente o no covalente con anticuerpos secundarios que se unirán a los Abs anti-LT-\beta-R primarios (p. ej. anticuerpos de IgG anti-ratón de cabra; véase Ejemplo 7). Cada mAb anti-LT-\beta-R ensayado individualmente, cuando se inmoviliza sobre una superficie con anticuerpos secundarios, actúa como un agente activador de LT-\beta-R en presencia de IFN-\gamma (Figuras 4 y 7).

En una realización alternativa, los Abs anti-LT-\beta-R reticulados en solución actúan como agentes de activación de LT-\beta-R. Se pueden reticular Abs anti-LT-\beta-R por medio de un agente de reticulación de Ab anti-LT-\beta-R (o mAb). Un agente de reticulación de Ab anti-LT-\beta-R (o mAb) según esta invención es cualquier agente capaz de unirse de forma covalente, o agregar de forma no covalente los Abs anti-LT-\beta-R (o mAbs) en solución, de tal manera que los Abs (o mAbs) anti-LT-\beta-R reticulados se puedan unir y potenciar el agrupamiento de LT-\beta-R de la superficie de la célula diana. Tales agentes de reticulación de Ab (o mAb) anti-LT-\beta-R comprenden, pero no se limitan, a reactivos químicos de reticulación, que puedan reaccionar con los anticuerpos de una manera controlada, tal como se describe anteriormente. De manera alternativa, se pueden utilizar anticuerpos secundarios, sefarosa A, receptores de Fc, u otros agentes que se unirán y agregarán múltiples Abs anti-LT-\beta-R primarios sin bloquear su actividad para formar aglomerados de Abs anti-LT-\beta-R en solución.

Múltiples Abs anti-LT-\beta-R en solución actúan como agentes de activación de LT-\beta-R

Se proporcionan mediante esta invención las composiciones comprendiendo múltiples Abs anti-LT-\beta-R en solución que actúan como agentes de activación de LT-\beta-R mediante la potenciación del agrupamiento de LT-\beta-R de la superficie. Se pueden utilizar Abs policlonales anti-LT-\beta-R dirigidos contra diferentes epítopes del LT-\beta-R. Preferiblemente, los Abs anti-LT-\beta-R son Abs monoclonales dirigidos contra epítopes diferentes y que no se solapan del LT-\beta-R.

El ensayo combinado de mAb anti-LT-\beta-R con respecto a la activación del receptor de LT-\beta necesita combinar dos epítopes que no se solapen. Más aún, es probable que la agregación del receptor productivo solamente se consiga con ciertos epítopos. Hemos identificado la presencia de al menos cuatro epítopes únicos inmunorreactivos a LT-\beta-R. Se pueden identificar epítopes adicionales (tal como se definen mediante nuevos Abs) mediante la continuación de la fusión de las células esplénicas de ratón inmunizado, mediante la inmunización de diferentes tipos de animales, y utilizando diferentes rutas de inmunización.

Se pueden también localizar directamente los epítopes mediante la determinación de la capacidad de diferentes mAbs de competir entre sí para unirse al LT-\beta-R utilizando técnicas cromatográficas BIAcore (Pharmacia BIAtechnology Handbook, "Epitope Mapping", sección 6.3.2, (mayo 1994); véase también Johne et al., J. Immunol. Methods, 169, páginas 191-8 (1993)).

Se pueden agrupar mAbs individuales de LT-\beta-R en al menos cuatro clases según su capacidad para cooperar en combinación con otros mAbs de LT-\beta-R para eliminar células tumorales en ensayos citolíticos (Ejemplo 8; Tabla 1). Por ejemplo, el mAb BDA8 del Grupo I no actúa en combinación con el mAb AGH1 del Grupo I para promover la citotoxicidad de las células tumorales. Similarmente, los mAbs BKA11 y CDH10 del Grupo III no cooperan en un ensayo de citotoxicidad de células tumorales.

La Figura 5A-C muestra los efectos de administrar mAbs anti-LT-\beta-R representativos solos y en combinación en pares a las células tumorales en ensayos de citotoxicidad en presencia de IFN-\gamma como un agente de activación de LT-\beta-R. El mAb CBE11 anti-LT-\beta-R del Grupo IV utilizado solo tiene un ligero efecto citotóxico que se favorece en combinación con el mAb BHA10 del Grupo II (Figura 5A). CBE11 promueve un efecto similar con el mAb CDH10 del Grupo III (Figura 5B).

La citotoxicidad causada por la administración de una combinación de mAbs anti-LT-\beta-R en solución no es peculiar de la línea de células tumorales HT29. La Figura 5C muestra que el mAb AGH1 del Grupo I y el mAb CDH10 del Grupo III actúan de manera sinérgica para eliminar dos líneas diferentes de células tumorales (células HT29 y células WiDr) derivadas de tumores de adenocarcinoma humano.

Sumario de las características de los mAbs anti-LT-\beta-R

Todos los mAbs anti-LT-\beta-R de esta invención, cuando están reticulados mediante inmovilización, actúan como agentes activadores de LT-\beta-R en presencia de un segundo agente activador de LT-\beta-R, tal como IFN-\gamma. A menudo varía la capacidad de mAbs anti-LT-\beta-R de actuar como agentes activadores de LT-\beta-R en presencia o ausencia de
LT-\alpha1/\beta2 en solución según el estado de las células en el momento del ensayo. La Tabla 2, en la parte inferior, resume las propiedades de los mAbs anti-LT-\beta-R caracterizados por esta invención.

Los mAbs del Grupo I BDA8 y AGH1 no funcionan como agentes activadores de LT-\beta-R en solución con LT-\alpha1/\beta2. El mAb BDA8 bloquea realmente el efecto antitumoral de LT-\alpha1/\beta2 (Figura 3B y Tabla 2). Por el contrario, los mAbs BCG6 y BHA10 del Grupo I tienen efectos agonistas y antagonistas mezclados cuando se administran con LT-\alpha1/\beta2. Los mAbs anti-LT-\beta-R BKA11 y CDH10 del Grupo III son únicos en su capacidad de actuar como agentes activadores de LT-\beta-R que potencian efectos antitumorales en presencia de LT-\alpha1/\beta2 y un segundo agente activador de LT-\beta-R, tal como IFN-\gamma sin exhibir los efectos antagonistas vistos a menudo con los mAbs BCG6 y BHA10 del Grupo II.

Es importante recordar siempre que la clasificación de los mAbs anti-LT-\beta-R basados en su capacidad de cooperar en los ensayos citolíticos de células tumorales refleja que ellos interactúan con diferentes epítopes del LT-\beta-R. Sin embargo, los mAbs que comprenden un solo grupo no tienen necesariamente las mismas afinidades de unión para sus epítopes análogos. Así los resultados variables vistos, cuando se comparan los efectos de diferentes mAbs que pertenecen a los mismos y diferentes grupos, pueden representar diferencias en las afinidades de unión. Por ello, es posible que un mAb de Grupo I o de Grupo IV con una afinidad de unión más elevada para el LT-\beta-R se pudiera aislar, que funcionaría como los mAbs del Grupo III como un agente activador de LT-\beta-R en presencia de LT-\alpha1/\beta2.

Las líneas celulares de hibridomas o sus subclones que producen los mAbs anti-LT-\beta-R anteriormente descritos se depositaron el 12 de enero de 1995 en la American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) según los artículos del tratado de Budapest, y se les asignó los números de acceso ATCC designados a continuación:

			ATCC
	Línea celular	Nombre del mAb	Nº de acceso
a)	AG.H1.5.1	AGH!	HB 11796
b)	BD.A8.AB9	BDA8	HB 11798
c)	BC.G6.AF5	BCG6	HB 11794
d)	BH.A10	BHA10	HB 11795
e)	BK.A11.AC10	BKA11	HB 11799
f)	CB.E11.1	CBE11	HB 11793
g)	CD.H10.1	CDH10	HB 11797

Se eliminarán de forma irrevocable todas las restricciones de la disponibilidad para el público de los anteriores depósitos de la ATCC después de la concesión de una patente basada en esta solicitud.

Los anticuerpos monoclonales IgM anti-LT-\beta-R funcionan como agentes activadores de LT-\beta-R

Los mAbs anti-LT-\beta-R que comprenden más de los dos lugares normales de unión de antígenos de IgG funcionarán también en solución como agentes de reticulación de LT-\beta-R de la superficie celular, y caerán por tanto dentro de la definición de un agente activador de LT-\beta-R según esta invención. Se pueden transformar los lugares de unión de antígeno de un mAb anti-LT-\beta-R en moléculas de IgM - que tienen diez lugares de unión de antígeno - utilizando técnicas estándar de DNA recombinante y de hibridomas (Ejemplo 12).

De manera alternativa, uno puede recoger y enriquecer moléculas de IgM de ratón ileso (u otro animal) aisladas mediante técnicas de fusión de hibridomas después de una sola inmunización con antígeno. Una manera de enriquecer moléculas de IgM sería inmunizar ratones deficientes en señal de CD40 (Kawabe et al., Immunity, 1, páginas 167-78 (1994); Xu et al., Immunity, 1, páginas 423-31 (1994)). Estos ratones no pueden producir de forma efectiva IgGs y por tanto su respuesta al ataque por antígenos se enriquece para isotipos de IgM.

Los anticuerpos de IgM anti-LT-\beta-R, a causa de su valencia aumentada, pueden agregar de forma efectiva moléculas LT-\beta-R dentro del plano de la membrana, favoreciendo de esta manera la señal de LT-\beta-R, en comparación con sus copias de IgG que tienen dos lugares de unión de antígenos. Se ve un ejemplo dramático de la eficacia aumentada de anticuerpos multivalentes en agrupamientos de receptores con anticuerpos contra el receptor de Fas, donde la forma de IgM es muy potente y las IgGs bivalentes normales no son efectivas en solución (Yonihara y Yonihara, J. Exp. Med., 169, páginas 1747-56 (1989); Alderson et al., Int. Immunol., 6, páginas 1799-1806 (1994)).

Similarmente, el mAb apo-1 contra el receptor de Fas es un mAb IgG3. Este mAb es un potente agente citotóxico que se basa en únicas interacciones de Fc con respecto a subtipos de IgG3 para agregarse en formas polivalentes más grandes. La eliminación de la región de Fc crea una forma F(ab)_{2} que no se puede asociar en agregados mayores y que es inactiva (Dhein et al., J. Immunol., 149, páginas 3166-73 (1992)). Por tanto por analogía, se predice que las versiones de IgM de mAbs anti-LT-\beta-R serán potentes agentes antitumorales.

Los mAbs anti-LT-\beta-R inhiben el crecimiento de tumores en ratones

La capacidad de un agente activador de LT-\beta-R, tal como un mAb anti-LT-\beta-R, para inhibir el crecimiento de células tumorales humanas in vitro (Ejemplos 6-8 y 13) puede ser indicativo de su actividad antitumoral in vivo. Los experimentos realizados en ratones inmunodeficientes (SCID) demuestran que un mAb anti-LT-\beta-R (CBE11) puede bloquear eficazmente la formación de tumores por células WiDr de adenocarcinoma humano (Ejemplo 14; Figura 6). Los ratones inoculados subcutáneamente (s. c.) con células WiDr forman tumores que se pueden medir en dos semanas. Cuando se trataba a los ratones i. p. con el mAb CBE11 al mismo tiempo que se inoculaban las células WiDr s. c., se bloqueaba de forma dramática el crecimiento tumoral (Figura 6A). Se favorecía la acción antitumoral del mAb CBE11 anti-LT-\beta-R mediante la adición de IFN-\gamma; sin embargo CBE11 era efectivo, incluso sin IFN-\gamma exógeno. En el grupo de CBE11 + IFN-\gamma, no tuvieron nada de tumores 7 de 16 animales, mientras que los restantes animales tenían pequeños nódulos que no habían progresado en dos meses. Los ratones tratados solamente con CBE11 eran similares al grupo CBE11 + IFN-\gamma en 30 días. Sin embargo, los ratones tratados solamente con CBE11 desarrollaron eventualmente tumores de crecimiento lento. Había diferencias estadísticamente significativas entre los grupos CBE11 (+/- IFN-\gamma) y los grupos control (solución salina, solamente IFN-\gamma y mAb LFA-3 anti-humano (1E6) + IFN-\gamma control), pero no había diferencias significativas entre los grupos control. Los mAbs 1E6 y CBE11 son los dos anticuerpos de IgG1. El mAb 1E6 reviste de forma efectiva las células tumorales pero no bloquea el crecimiento tumoral. De esta manera los sucesos mediados por células de matadores naturales o complementarios no son la única base para la actividad antitumoral del mAb anti-LT-\beta-R CBE11.

La eficacia del mAb CBE11 para inhibir crecimiento tumoral in vivo en ausencia de IFN-\gamma exógeno era inesperada, puesto que había una dependencia de IFN-\gamma para efectoscitotóxicos que se pueden medir in vitro en base a LT-\beta-R. O hay algo de entrecruzamiento de IFN-\gamma de ratón sobre los receptores de IFN-\gamma humanos, o pueden estar implicados otros mecanismos in vivo.

También puede inhibir el mAb anti-LT-\beta-R CBE11 el crecimiento de un tumor establecido en ratones (Figura 6B). Se inocularon los ratones s. c. con célula WiDr de adenocarcinoma humano en el día 1 y se dejó que se desarrollaran los tumores durante 15 días (Ejemplo 14). Los tumores en animales tratados i. p. solamente con IFN-\gamma, o con el mAb LFA-3 (1E6 + IFN-\gamma) anti-humano control, continuaron aumentando en tamaño durante el transcurso del experimento de 7 semanas. Por el contrario, pararon de crecer los tumores tratados con el mAb CBE11 anti-LT-\beta-R (+ IFN-\gamma o solo), y después de tres inyecciones de anticuerpo CBE11 durante un periodo de tres semanas, paró el crecimiento tumoral hasta el día 49 después del inóculo, cuando había terminado el experimento (Figura 6B).

Estos experimentos demuestran que un mAb anti-LT-\beta-R que activa la señal de anti-LT-\beta-R puede inhibir de forma efectiva la formación tumoral en estados tempranos y puede también bloquear el crecimiento continuo de células tumorales en estados posteriores de la formación del tumor in vivo. Estos experimentos también demuestran que la administración de un solo agente activador de LT-\beta-R puede ser efectivo para tratar o reducir el avance, gravedad o efectos de neoplasia en un animal afectado.

Se pueden utilizar los procedimientos descritos en el Ejemplo 14 para identificar agentes activadores de LT-\beta-R según esta invención que funcionan solos o en combinación para inhibir in vivo crecimiento de células tumorales. Se prevé que otros agentes activadores de LT-\beta-R - comprendiendo, pero no limitando a los identificados utilizando ensayos de citotoxicidad de células tumorales in vitro - puedan tener efectos similares antitumorales in vivo, cuando se administren o solo o en combinación a animales o seres humanos.

El uso de IFN-\gamma y otros agentes activadores de LT-\beta-R

Se favorecen los efectos citotóxicos de complejos heterómeros LT-\alpha/\beta y de Abs anti-LT-\beta-R reticulados o múltiples sobre las células tumorales mediante la presencia de un agente activador de LT-\beta-R, particularmente IFN-\gamma. Se ha visto previamente que las células de adenocarcinoma humano de origen intestinal (células HT29) son sensibles a la señal de FasR (Yonehara y Yonehara, J. Exp. Med., 169, páginas 1747-56 (1989)), y a TNF y LT-\alpha en presencia de IFN-\gamma (Browning et al., J. Immunol., 143, páginas 1859-67 (1989)).

En los usos de las composiciones según las reivindicaciones 2-6 y 9, la cantidad de agente activador de LT-\beta-R necesaria para favorecer la actividad antitumoral de complejos heterómeros LT-\alpha/\beta, Abs anti-LT-\beta-R u otros agentes activadores de LT-\beta-R de esta invención dependerá del tipo de células o tejido que se está tratando, y también con el modo de tratamiento, y se puede determinar empíricamente utilizando procedimientos de rutina. Se puede proporcionar el agente activador de LT-\beta-R a una concentración o suministrarlo en una tasa determinada para que sea efectivo en unión con otros agentes activadores de LT-\beta-R administrados, tomando en consideración los factores citados anteriormente.

De forma alternativa, se puede confiar en agentes activadores, tales como interferones como IFN-\gamma, que se pueden producir por las células o tejido que rodea las células tumorales diana. El IFN-\gamma endógeno se produce normalmente después de la infección viral, y se halla también en la vecindad de tumores (Dinge et al., Immunity, 1, páginas 447-56 (1994)).

Cualquier agente que sea capaz de inducir interferones, preferiblemente IFN-\gamma, y que potencie los efectos citotóxicos de complejos heterómeros LT-\alpha/\beta y mAbs anti-LT-\beta-R en células tumorales cae dentro del grupo de agentes activadores de LT-\beta-R de esta invención. Mientras que normalmente la infección por virus induce la producción de IFN-\gamma, se pueden favorecer por otros agentes los niveles de IFN-\gamma endógeno (Ejemplo 10). Por ejemplo, experimentos clínicos han demostrado la inducción de interferón mediante tratamiento con RNA de cadena doble (dsRNA). Por tanto, son efectivos como inductores de interferón ácido polirriboguanílico/polirriboctidílico (poli-rG/rC) y otras formas de dsRNA (Juraskova et al., Eur. J. Pharmacol., 221, páginas 107-11 (1992)).

Se pueden utilizar también para reforzar los niveles de interferón endógeno el estimulador de interferón de Glycyrrhiza glabra (Acharya et al., Indian J. Med. Res., 98, páginas 69-74 (1993)), y agentes farmacéuticos, muchos de los cuales son administrables oralmente. Tales inductores de interferón comprenden: imiquimod (Bernstein et al., Antiviral Res., 20, páginas 45-55 (1994)); saparal (Paramova et al., Vopr. Virusol., 39, páginas 131-34 (1994)); aril-pirimidonas, tales como bropirimina (Onishi y Machida, Hinyokika Kiyo, 40, páginas 195-200 (1994)); ridostín (Cheknev et al., Vopr. Virusol., 39, páginas 125-28 (1994)).

Varios de estos agentes inductores de interferón se ha caracterizado como inductores de interferones de tipo I, tales como IFN-\alpha. Los interferones de tipo I pueden funcionar también como agentes activadores de LT-\beta-R, pero son menos potentes que IFN-\gamma.

Tratamientos utilizando complejos LT-\alpha/\beta y agentes activadores de LT-\beta-R

En los usos de las composiciones, las composiciones se administrarán en una dosis efectiva para tratar el estado clínico en particular de que se trate. La determinación de una formulación farmacéutica preferida y de un régimen de dosis terapéuticamente eficaz para una aplicación dada está bien dentro de la experiencia de la técnica tomando en consideración, por ejemplo, el estado y peso del paciente, la duración del tratamiento deseado y la tolerancia del paciente al tratamiento.

Típicamente, los seres humanos pueden tolerar hasta 100-200 \mug/m^{2} de TNF antes de que se manifieste una grave toxicidad (Schiller et al., Cancer Res., 51, páginas 1651-58 (1991)). En ratones, las dosis en el intervalo de 1-5 \mug/ratón/día dadas con 5 x 10^{4} unidades de IFN-\gamma recombinante humano causaban la regresión de tumores primarios humanos (Balkwill et al., CIBA Foundation Symposium (1987); Havell et al., J. Exp. Med., 167, páginas 1067-85 (1988)). En base a la efectividad relativa de TNF y LT-\alpha1/\beta2 en los ensayos citolíticos de HT29, aproximadamente de 5-25 \mug/ratón/día de LT-\alpha1/\beta2 proporcionarán un intervalo de dosis terapéutica. Extrapolando al ser humano, se espera que se necesitarán dosis de LT-\alpha1/\beta2 de al menos 1 mg/m^{2} en combinación con un agente activador de LT-\beta-R, tal como IFN-\gamma.

Históricamente, se ha realizado la terapia con IFN-\gamma, o con dosis máximas toleradas en el rango de 100-250 \mug/m^{2}, o en niveles "inmunomoduladores" en el rango de 10-25 \mug/m^{2} (véase p. ej. COP et al., J. Immunother., 13, páginas 181-90 (1993)). Se han utilizado terapias de combinación con dos interferones, 4 x 10^{6} unidades/m^{2} de IFN-\alpha y aproximadamente 250 \mug/m^{2} de IFN-\gamma (Niederle et al., Leuk. Lymphoma, 9, páginas 111-19 (1993)). Se espera que sean puntos de partida apropiados para optimizar dosis de tratamiento las dosis intermedias de aproximadamente 25-100 \mug/m^{2} de IFN-\gamma en combinación con los complejos heterómeros LT-\alpha/\beta o Abs anti-LT-\beta-R aquí descritos.

La administración de complejos heterómeros LT-\alpha/\beta o Abs anti-LT-\beta-R reticulados de esta invención, comprendiendo formas aisladas y purificadas de los anticuerpos o complejos, sus sales o sus compuestos derivados farmacéuticamente aceptables, se pueden obtener utilizando cualquiera de los modos convencionalmente aceptados de administración de agentes que exhiben actividad antitumoral.

Las composiciones farmacéuticas utilizadas en estas terapias pueden estar también en diferentes formas. Éstas comprenden, por ejemplo, formas de dosificación, sólidas, semisólidas y líquidas, tales como comprimidos, píldoras, polvos, soluciones líquidas o suspensiones, supositorios, y soluciones inyectables e infundibles. La forma preferida depende del modo de administración que se desee y de la aplicación terapéutica. Modos de administración pueden comprender administración oral, parenteral, subcutánea, intravenosa, dentro de la lesión o tópica.

Los complejos heterómeros LT-\alpha/\beta, IFN-\gamma, y Abs anti-LT-\beta-R pueden, por ejemplo, ser colocados en formulaciones isotónicas estériles con o sin cofactores que estimulan la toma o la estabilidad. La formulación es preferiblemente líquida, o puede ser polvo liofilizado. Por ejemplo, se pueden diluir los complejos LT y/o Abs anti-LT-\beta-R e IFN-\gamma con un tampón de formulación que comprende 5,0 mg/ml de monohidrato de ácido cítrico, 2,7 mg/ml de citrato trisódico, 41 mg/ml de manitol, 1 mg/ml de glicina y 1 mg/ml de polisorbato 20. Se puede liofilizar esta solución, almacenar en refrigeración y reconstituir antes de su administración con agua estéril para inyecciones (USP).

Las composiciones también incluirán preferiblemente vehículos convencionales farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica (véase por ejemplo Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, 1980, Mac Publishing Company). Tales vehículos farmacéuticamente aceptables comprenden otros agentes medicinales, portadores, portadores genéticos, coadyuvantes, excipientes, etc., tales como seroalbúmina humana o preparaciones plasmáticas. Las composiciones están preferiblemente en la forma de una dosis unitaria y se administrarán generalmente una o más veces al día.

Las composiciones farmacéuticas en su uso según las reivindicaciones 2-6 y 9, se pueden también administrar utilizando microesferas, liposomas, otros sistemas de suministro en micropartículas o formulaciones de liberación prolongada colocadas en, cerca, o de otra manera en comunicación con los tejidos afectados o con la corriente sanguínea. Ejemplos apropiados de soportes de liberación prolongada incluyen matrices poliméricas semipermeables. En forma de objetos moldeados, tales como supositorios o microcápsulas. Las matrices de liberación prolongada implantables o microcapsulares comprenden polilactidas (documento de patente de E.E.U.U. Nº 3.773.319; documento EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22, páginas 547-56 (1985)); poli(2-hidroxietil-metacrilato) o etilen-vinil-acetato (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15, páginas 167-277 (1981); Langer, Chem. Tech., 12, páginas 98-105 (1982)).

Se pueden preparar los liposomas conteniendo complejos heterómeros LT-\alpha1/\beta2 y/o Abs anti-LT-\beta-R e IFN-\gamma mediante métodos bien conocidos (véase, p. ej. documento DE 3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, páginas 3688-92 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, páginas (1980); documentos de patente de E.E.U.U. Nos. 4.485.045 y 4.544.545). Normalmente, los liposomas son del tipo unilaminar pequeño (aproximadamente 200-800 Angstroms), en los cuales el contenido lipídico es mayor de aproximadamente 30 mol % de colesterol. Se selecciona la proporción de colesterol para controlar la tasa óptima de liberación de complejo LT y/o Abs anti-LT-\beta-R e IFN-\gamma.

Los complejos heterómeros LT-\alpha/\beta y Abs anti-LT-\beta-R de esta invención pueden estar también unidos a liposomas que contienen otros agentes activadores de LT-\beta-R, agentes quimioterapéuticos o IFN-\gamma para complementar al IFN-\gamma que se encuentra típicamente en la región de los tumores. Se puede realizar la unión de los complejos LT y de los Abs anti-LT-\beta-R a los liposomas mediante cualquier agente reticulante conocido, tales como agentes reticulantes heterobifuncionales que se han utilizado ampliamente para unir toxinas o agentes quimioterapéuticos a anticuerpos para suministro dirigido. Se puede realizar también la conjugación a liposomas utilizando el reactivo reticulador dirigido a carbohidratos hidracida del ácido 4-(4-maleimidofenil)-butírico (MPBH, por sus siglas en inglés) (Duzgunes et al., J. Cell. Biochem., suplemento de resúmenes 16E 77 (1992)).

Ventajas de composiciones terapéuticas basadas en la activación de anti-LT-\beta-R

Tendría varias ventajas una terapia tumoral basada en la activación de LT-\beta-R. El LT-\beta-R se une a complejos heterómeros LT-\alpha/\beta con elevada afinidad en los trozos \beta/\beta, y con baja afinidad en los trozos \alpha/\beta creados en la interfaz entre subunidades adyacentes LT-\alpha y LT-\beta. Por el contrario, los receptores de TNF se unen a los complejos heterómeros LT-\alpha/\beta con elevada afinidad solamente en trozos \alpha/\alpha. Por tanto, los complejos purificados LT-\alpha1/\beta2 se unen con elevada afinidad con LT-\beta-R entre subunidades adyacentes LT-\beta-R, pero no tienen \alpha/\alpha y de esta manera no activan de forma cruzada la señalización a través de los receptores de TNF. Así, los complejos heterómeros LT-\alpha/\beta de esta invención no estimularán las respuestas inflamatorias asociadas al TNF.

El LT-\alpha1/\beta2 administrable en los usos de las composiciones según las reivindicaciones 2-6 y 9 no activa los cambios de las células endoteliales asociados con la respuesta inflamatoria, incluso con niveles relativamente elevados. Por esta razón, no deberían ser un problema los efectos secundarios debidos a la activación de las cascadas inflamatorias observadas con TNF, utilizando las composiciones farmacéuticas y métodos de tratamiento para activar el LT-\beta-R.

El LT-\alpha1/\beta2 humano se une al LT-\beta-R de ratón esencialmente así como la LT-\beta-R humano. No es letal la inyección de 100 \mug de LT-\alpha1/\beta2 humano por ratón (Ejemplo 11), sugiriendo que la estimulación de LT-\beta-R en todo el animal no tiene la toxicidad evidente vista cuando se realizaron experimentos similares con activación de FasR o de p60 TNF-R.

El uso de anticuerpos monoclonales específicos anti- LT-\beta-R o combinaciones de anticuerpos para disparar esta vía en seres humanos puede tener varias ventajas sobre el tratamiento con complejos heterómeros LT-\alpha/\beta. Una terapia de anticuerpos anti-receptor será más selectiva que el tratamiento con ligando. Aún más, sería más fácil hacer ingeniería y producir en gran escala formas recombinantes de mAbs anti-LT-\beta-R que los complejos heterómeros LT-\alpha/\beta.

Se prevé que los mAbs o los complejos heterómeros LT-\alpha/\beta en los usos de las composiciones según las reivindicaciones 2-6 y 9 serán administrables a personas con tumores en unión con una terapia antitumoral convencional (es decir radiación y quimioterapia). Un tratamiento combinado de activación de LT-\beta-R con quimioterapias convencionales puede proporcionar un factor extra de actividad eliminadora de tumores que sería más probable para eliminar a un paciente células tumorales que cuando se utiliza solamente terapia antitumoral convencional.

También es posible que esta acción tenga relativamente pocos efectos secundarios y por tanto se podía dar en un sentido semi-preventivo en casos de carcinomas que no se hayan metastatizado, o en pacientes de familias que muestran una predisposición genética para un cierto tipo de cáncer.

Los siguientes son ejemplos que ilustran los complejos heterómeros LT-\alpha/\beta y los mAbs anti-LT-\beta-R de esta invención y los métodos utilizados para caracterizarlos. No se deberían considerar estos ejemplos como limitantes: se incluyen los ejemplos con el propósito de aclaración y la presente invención está solamente limitada por las reivindicaciones.

Ejemplo 1 La generación de sobrenadantes de células de insectos infectadas con baculovirus conteniendo formas LT-\alpha/\beta

Se fabricaron tal como se describe baculovirus recombinantes codificando o LT-\alpha en toda su longitud o una forma segregada de LT-\beta (Crowe et al., Science, 264, páginas 707-710 (1994)). Se inocularon células de cinco insectos superiores (Invitrogen, San Diego, CA) con una densidad de 2 x 10^{5} células/ml en 7,2 litros de medio SF 900-II (Gibco) sin suero. El cultivo alcanzó 1,8 x 10^{6} células/ml 48 horas más tarde y se infectó con 150 ml (3 x 10^{8} PFU/ml) de LT-\beta y 300 ml de LT-\alpha de soluciones patrón de baculovirus. Dos días más tarde, se recogió el cultivo y se eliminó el residuo celular por centrifugación. Después de la adición de EDTA y PMSF (concentración final EDTA 1 mM y PMSF 150 \muM), se concentró el sobrenadante clarificado 10 veces por ultrafiltración utilizando un cartucho espiral S1YM10 (Amicon). Se dividió el concentrado en seis partes de 120 ml y se almacenaron las partes alícuotas a -70ºC antes de la purificación.

Ejemplo 2 Preparación de receptores solubles de LT-\beta como quimeras de Fc de inmunoglobulina

Se amplificó el dominio extracelular de LT-\beta-R hasta la región transmembranal mediante PCR a partir de un clon de cDNA utilizando cebadores que tienen incorporados los lugares de enzimas de restricción NotI y SalI en los extremos 5' y 3', respectivamente (Browning et al., J. Immunol., 154, páginas 33-46 (1995)). Se cortó el producto amplificado con NotI y SalI, se purificó y se ligó en vector pMDR901 linearizado con NotI junto con un fragmento SalI-NotI que codificaba la región de Fc de la IgG1 humana. El vector resultante contenía el gen de dihidrofolato-reductasa y la quimera LT-\beta-R-Fc realizada por diferentes promotores. Se electroporó el vector en células CHO dhfr^{-} y se aislaron clones resistentes al metotrexato mediante procedimientos estándar. Se segregó el LT-\beta-R-Fc en el medio y se utilizó un ensayo ELISA para seleccionar las líneas celulares que producían el nivel más elevado de la proteína quimérica. Se hizo crecer una línea celular de elevada producción hasta grandes cifras y se recogió en medio condicionado. Se aisló la proteína pura mediante cromatografía de afinidad de flujo rápido con proteína A-sefarosa.

Ejemplo 3 Purificación de afinidad de LT-\alpha1/\beta2 utilizando TNF-R y LT-\beta-R

Para preparar resinas para la purificación por afinidad del receptor de formas LT, se inmovilizaron preparaciones purificadas de LT-\beta-Fc-R (tal como se describe aquí en el Ejemplo 2) y de p60-Fc de TNF-R (Crowe et al., Science, 264, páginas 707-10 (1994)) sobre CNBr-sefarosa (Pharmacia) en 5 mg/ml de resina siguiendo esencialmente las instrucciones del fabricante. Antes de utilizarse, las resinas se pusieron a través de un ciclo de elución. Se pasó una parte (120 ml) del concentrado de S1Y10 sobre dos columnas secuenciales de TNF-R-Fc p60, que captan LT-\alpha y LT-\alpha2/\beta1. El flujo de paso, que contenía LT-\alpha1/\beta2 y LT-\beta, se pasó por una columna de LT-\beta-R-Fc. Se lavó la columna con 5 volúmenes, cada uno de PBS, PBS con NaCl 0,5 M y PBS, y seguidamente se eluyeron los complejos LT-\alpha y LT-\alpha2/\beta1 con fosfato sódico 25 mM, NaCl 100 mM, pH 3,5. Se neutralizaron inmediatamente las fracciones de elución con 1/20 en volumen de fosfato sódico 0,5 M, pH 8,6 y se almacenó en hielo. Se identificaron las fracciones conteniendo proteína mediante absorbancia a 280 nm, se juntaron las fracciones de los picos y se analizaron los conjuntos de elución de las columnas mediante SDS-PAGE teñido con azul brillante de coomassie. La elución, tal como se describe anteriormente, obtuvo más de 95% de LT-\alpha1/\beta2 puro.

Ejemplo 4 Caracterización de los ligandos purificados LT-\alpha1/\beta2

Se clasificaron por tamaños las fracciones del Ejemplo 3 mediante cromatografía de exclusión con gel para determinar si se formaban los trímeros y si había agregados presente. Se utilizó una columna TSK G3000 sw x2 con un caudal de 0,5 ml/min para separar por tamaños una proteína estándar mediante gel de filtración BioRad, y los tres diferentes trímeros LT, LT-\alpha3, LT-\alpha2/\beta1 y LT-\alpha1/\beta2. La Figura 1A muestra que muy poco, si es que es algo, de los trímeros LT-\alpha1/\beta2 se muestra como agregado de elevado peso molecular. La comparación con estándares de tamaño muestra que las tres formas son todas trímeras, es decir, de aproximadamente 50-60 kDa. Asumiendo el trímero, se evaluó la estequiometría de LT-\alpha a LT-\beta contenidos en las fracciones purificadas de LT-\alpha1/\beta2 y LT \alpha2/\beta1 o mediante densitometría de los geles teñidos con coomassie o mediante análisis de la altura de los picos de los dos picos después de la resolución sobre HPLC de fase inversa C4. Ambas medidas confirmaron la identidad de las fracciones eluidas de las columnas de afinidad, tal como se describe anteriormente.

Se siguió determinando la pureza de las preparaciones mediante cromatografía de intercambio iónico utilizando instrumentación BioCAD para correr mapas de pH de LT-\alpha1/\beta2 y LT-\alpha2/\beta1 sobre la resina de intercambio iónico débil bajo diferentes sistemas tampón. El método que mostró la capacidad mayor para retener limpiamente y separar los tres trímeros incorporaba una columna POROS CM (carboximetilo) funcionando a 5 ml/min con un tampón MES 16,66 mM, HEPES 16,66 mM, acetato de Na 16,66 mM pH 6,5 y eluyendo con un gradiente de NaCl 1 M por 20 volúmenes de columna. Se muestran en la Figura 1B los cromatogramas de BioCAD de los complejos LT-\alpha1/\beta2 y LT-\alpha2/\beta1. Cada trímero, LT-\alpha3, LT-\alpha2/\beta1 y LT-\alpha1/\beta2 se eluyeron con una diferente concentración de sal y no había evidencia de contaminación cruzada de más de 1-2% en las diferentes preparaciones.

Ejemplo 5 Eliminación de células HT29 de adenocarcinoma humano mediante complejos solubles LT-\alpha1/\beta2

Se ha descrito previamente el ensayo citolítico con HT29 (Browning y Ribolini, J, Immunol., 143, páginas 1859-67 (1989)). En un ensayo típico, se prepararon diluciones en serie de LT-\alpha1/\beta2 (y otras citoquinas si son aplicables) en 0,05 ml en placas de 96 pocillos y se añadieron 5000 células HT29-14 tripsinizadas en 0,05 ml de medio conteniendo 0 o 80 u/ml (unidades antivirales) de IFN-\gamma humano. Las células HT29-14 son de un subclon de la línea original HT29 derivada de la ATCC, que es más homogéneo. Se utilizaron células HT29-14 en los ensayos; se pueden observar también todos estos resultados utilizando la línea original HT29 derivada de la ATCC. Después de 3-4 días, se midió como sigue la reducción mitocondrial de la tinción MTT: se añadieron 10 l de MTT y después de 3 horas, se disolvió la tinción reducida con 0,09 ml de isopropanol con HCl 10 mM, y se midió la O. D. a 550 nm. Se añadieron formas solubles de receptor preparadas tal como aquí se describe, o IgG humana pura en 10 \mul antes de las células para dar una concentración final de 5 \mug/ml.

La Figura 2A muestra la eliminación de células HT29 mediante tratamiento con mAb CH-11 de receptor anti-Fas (que estimula la señal de FasR); ligandos de TNF, de LT-\alpha3, LT-\alpha1/\beta2 y LT-\alpha2/\beta1 en unión con IFN-\gamma. La inspección visual de las células tratadas con LT-\alpha1/\beta2 revela que este agente elimina células más que bloquear solamente la proliferación celular. En ausencia de IFN-\gamma, no se observan efectos, reflejando capacidad inusual de IFN-\gamma para influir cómo las células interpretan la señal de la familia de receptores de TNF. Los interferones \alpha y \beta eran 100 veces menos efectivos que IFN-\gamma cuantificándose en base a unidades de actividad antivirales.

La Figura 2B muestra la inhibición de la eliminación de LT-\alpha1/\beta2 mediante LT-\beta-R-Fc, pero no por p60-TNF-R-Fc, demostrando que la citotoxicidad es específica para LT-\alpha1/\beta2. La falta de inhibición por p60-TNF-R-Fc indica que el LT-\alpha contaminante (es sabido que es menos de 1%) no se puede tener en cuenta para la actividad citotóxica de LT-\alpha1/\beta2.

Ejemplo 6 MAbs anti-LT-\beta-R potencian la eliminación de células HT29 por complejos LT-\alpha1/\beta2

Se llevaron a cabo los ensayos citolíticos tal como se describe en el Ejemplo 5, excepto en que se añadieron IFN-\gamma y mAbs anti-LT-\beta-R (series de 0,01 - 1000 ng/ml) a las células con una concentración final de 2 x y seguidamente se añadieron 50 \mul de la solución celular a los pocillos conteniendo LT-\alpha1/\beta2 diluido. Se determinó el crecimiento tal como se describe en el Ejemplo 5. La Figura 3 muestra los efectos diferentes de los dos mAbs diferentes anti-LT-\beta-R en su capacidad de potenciar la actividad citotóxica de LT-\alpha1/\beta2. La Figura 3A muestra que el mAb CDH10 anti-LT-\beta-R potencia la actividad citotóxica de una manera dependiente de la dosis. La Figura 3B muestra los efectos de otro mAb anti-LT-\beta-R, BDA8, en el mismo ensayo. El mAb BDA8 inhibe la actividad citotóxica de LT-\alpha1/\beta2 más que potenciar la muerte de las células tumorales.

Ejemplo 7 MAbs inmovilizados anti-LT-\beta-R pueden eliminar células tumorales HT29

Para inmovilizar mAbs anti- LT-\beta-R sobre una superficie plástica, se revistieron placas de cultivo de tejido de 96 pocillos con 50 \mul de 10 \mul/ml de anticuerpo policlonal Fc anti-ratón de cabra (Jackson Immunoresearch), se lavaron y bloquearon con FCS al 5% en PBS, seguido de la captura del mAb indicado anti-LT-\beta-R y otro lavado. Se sembraron las células en pocillos revestidos con mAb, y se realizaron ensayos citolíticos como en el Ejemplo 5. La Figura 4A ilustra los efecto citotóxicos de mAbs anti-LT-\beta-R BDA8 y CDH10 inmovilizados sobre células HT29. Cada mAB individualmente provoca la citotoxicidad sobre células tumorales cuando se inmoviliza sobre una superficie. La Figura 4B muestra que los mismos mAbs anti-LT-\beta-R BDA8 y CDH10 ensayados individualmente en solución no son citotóxicos y así la actividad citolítica de un solo mAb anti-LT-\beta-R in vitro parece ser una función de su inmovilización.

Ejemplo 8 Una combinación de mAbs anti-LT-\beta-R en solución dirigidos contra distintos epítopes elimina células HT29

Se determinó el crecimiento de células HT29 tal como se describe en el Ejemplo 5, excepto en que uno o dos de mAbs anti-LT-\beta-R se incluyeron en el medio de crecimiento. La Tabla 1 muestra los efectos sobre las células HT29 observados cuando se incluyeron en solución varios mAbs anti-LT-\beta-R (es decir, no inmovilizados sobre plástico). Se pueden disponer los mAbs anti-LT-\beta-R en grupos I-IV basados en sus capacidades relativas para trabajar en combinación entre sí en un ensayo citolítico HT29. Los resultados de mAbs anti-LT-\beta-R generados en datos de unión de receptor en paralelo con ensayos citolíticos que sugieren que los mAbs reconocen en cada grupo diferente epítopes diferentes sobre el LT-\beta-R.

Tabla 1

Las combinaciones de mAbs solubles anti-LT-\beta-R son citotóxicos para células HT29 de adenocarcinoma humano. Los mAbs anti-LT-\beta-R se agrupan en Grupos I, II, III y IV basados en sus efectos en combinación entre sí en ensayos citolíticos de células HT29. Los signos + se refieren al nivel relativo de efectos citolíticos de la combinación de mAb sobre las células HT29 en presencia de 80 U/ml IFN-\gamma, nr = no relevante; nd = no determinado.

1

La Figura 5A-D cuantifica los efectos de incluir en el ensayo citolítico de HT29 combinaciones en parejas representativas de mAbs anti-LT-\beta-R que cooperan dirigidos contra diferentes epítopes de LT-\beta-R. La Figura 5A muestra los efectos citotóxicos de BHA10 y CBE11, la Figura 5B de CDH10 y CBE11, y la Figura 5C de CDH10 y AGH1, solos o en combinación. La Figura 5D muestra los efectos citotóxicos de la combinación de mAbs CDH10 y AGH1 en una diferente línea de células tumorales llamadas WiDr.

La Tabla 2 resume las características de los mAbs anti-LT-\beta-R representativos de esta invención

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(Tabla pasa a página siguiente)

2

Ejemplo 9 Fiabilidad de IFN-\gamma endógeno para el tratamiento de células tumorales

IFN-\gamma, un agente activador preferido de LT-\beta -R de la presente invención, es una citoquina que exhibe actividad antitumoral y que es tolerada en los seres humanos. El IFN-\gamma endógeno presente en el ambiente que rodea a un tumor puede estar en concentraciones lo suficientemente elevadas para funcionar como un agente activador de LT-\beta-R de esta invención sin añadir IFN-\gamma exógeno. Se puede confirmar la concentración de IFN-\gamma en la vecindad de un tumor utilizando técnicas inmunoquímicas estándar con muestras de tejido procedentes de la región del tumor. Si la concentración endógena de IFN-\gamma es lo suficientemente elevada para provocar actividad antitumoral en combinación con los complejos heterómeros LT-\alpha/\beta o mAbs anti-LT-\beta-R de esta invención (tal como se determina mediante los ensayos citolíticos aquí descritos), no se necesita administrar IFN-\gamma como un segundo agente activador de LT-\beta-R en las composiciones o sus usos según las reivindicaciones 5 y 6.

Ejemplo 10 Inducción de IFN-\gamma endógeno como agente activador de LT-\beta-R para el tratamiento de células tumorales

Los compuestos que puedan inducir la producción endógena de interferones tales como IFN-\gamma caen dentro del grupo de agentes activadores de LT-\beta-R de esta invención. Por ejemplo, se pueden inducir interferones mediante el tratamiento con moléculas de RNA de cadena doble, tales como ácidos polirriboguanílico/polirribocitidílico (poli-G/c).

Se pueden inyectar C57/b16 femeninos (6-8 semanas de edad) con 18 mg (600 mg/kg) de D-galactosamina que sensibiliza a los ratones a los efectos de TNF y de otros agentes antitumorales. Se añade una serie de concentraciones de poli-G/C (Juraskova et al., Eur. J. Pharmacol., 221, páginas 107-11 (1992)) en una solución salina neutra a LT-\alpha1/\beta2 purificados (10-100 \mug) y se administra la solución a ratones en forma de una inyección intraperitoneal (i. p.). Se favorecerá la actividad antitumoral de LT-\alpha1/\beta2 mediante la presencia de RNA de cadena doble poli-rG/rC.

De forma similar, se puede administrar el estimulador de interferones procedente de la planta Glycyrrhiza glabra (Acharya et al., Indian J. Med. Res., 98, páginas 69-74 (1993)) a seres humanos de forma intravenosa en dosis que van de 40-100 ml/día. Se puede determinar empíricamente la dosis óptima para la activación de LT-\beta-R en presencia de ya sea complejos heterómeros LT-\alpha/\beta o de Abs anti-LT-\beta-R y dependerá de factores tales como el tipo de tumor, modo de administración y programa de administración.

Se pueden también administrar como agentes activadores de LT-\beta-R imiquimod R-837 (Bernstein et al., Antiviral Res., 20, páginas 45-55 (1994)); saparal (Paramonova et al., Vopr. Virusol., 39; páginas 131-34 (1994)); bropirimín (Onishi y Machida, Hinyokika Kivo, 40, páginas 195-200 (1994)): o ridostín (Cheknev et al., Vopr. Virusol., 39; páginas 125-28 (1994)), en unión con complejos heterómeros LT-\alpha/\beta, Abs anti-LT-\beta-R, o sus combinaciones. En cada caso, se pueden determinar empíricamente las maneras preferidas de suministro y dosis óptimas utilizando los artículos publicados como puntos de partida para la optimización mediante procedimientos clínicos rutinarios.

Ejemplo 11 Los ratones toleran las inyecciones de LT-\alpha1/\beta2 humano

Se inyectaron i. p. hembras C57/b16 (de 6-8 semanas de edad) aclimatadas a la instalación durante varios días con 18 mg (600 mg/kg) de D-galactosamina, lo que sensibiliza los ratones a los efectos de TNF y de otros agentes antitumorales. Seguidamente se administró i. p. o TNF humano, LT-\alpha o LT-\alpha1/\beta2. La Tabla 3 muestra la supervivencia de los ratones tratados 24 horas después de la inyección.

TABLA 3

Agente	Dosis (\mug/animal)	Supervivencia
Solución salina	-	4/4
hu-TNF	0,2	0/6
hu-TNF	1,0	0/2
hu-TNF	10	0/4

hu-LT-\alpha	0,2	2/2
hu-LT-\alpha	1,0	2/2

hu-LT-\alpha1/\beta2	10	2/2
hu-LT-\alpha1/\beta2	100	2/2

Ejemplo 12 Construcción de un anticuerpo monoclonal IgM anti-LT-\beta-R recombinante

Utilizando los ensayos de citotoxicidad antitumoral descritos anteriormente unidos con modelos estándar de crecimiento tumoral en ratones inmunodeficientes, se puede seleccionar una IgG anti-LT-\beta-R con propiedades apropiadas. Se pueden utilizar cebadores universales que hibridan con cada uno de los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras de la IgG de la IgG anti-LT-\beta-R seleccionada para preparar DNA de dominio variable procedente de RNA aislado de la línea celular de hibridoma secretor utilizando metodologías estándar de transcriptasa inversa/PCR. Estos protocolos se han descrito (Arulanandam et al., J. Exp. Med., 177, páginas 1439-50 (1993): Lane et al., Eur. J. Immunol., 22, páginas 2573-78 (1993); Traunecker et al., Nature, 339, páginas 68-70 (1989)).

Seguidamente se ensamblan los productos amplificados en vectores conteniendo los dominios humanos de cadenas CH1, CH2 y CH3 \mu. La co-expresión de las dos cadenas en un solo hospedador permitirá el ensamblaje de las cadenas pesadas y ligeras en una molécula pentámera IgM. Esta molécula es una quimera compuesta de regiones variables de ratón unidas a regiones constantes humanas.

De forma alternativa, se puede utilizar un proceso utilizando PCR para amplificar el DNA que codifica solamente las regiones reales de unión de las regiones variables. Seguidamente, se inserta el DNA amplificado en vectores que contienen todas las secuencias de las IgG humanas, excepto las de los aminoácidos verdaderamente implicados en unirse al antígeno. Tales estructuras se llaman anticuerpos "humanizados" y son bien conocidos los métodos detallados para su producción (p. ej. documento WO 94/04679).

Ejemplo 13 Los anticuerpos monoclonales IgM anti-LT-\beta-R funcionan como agentes activadores de LT-\beta-R

Se pueden preparar los anticuerpos IgM anti-LT-\beta-R de una manera recombinante, tal como se describe en el Ejemplo 12. De forma alternativa, se pueden utilizar como una fuente de mAbs IgM anti-LT-\beta-R IgMs de ratón ileso aislados mediante técnicas de fusión de hibridomas utilizando inmunización primaria de ratones normales o inmunización extensiva de ratones deficientes en señal CD40 (Kawabe et al., Immunity, 1, páginas 167-78 (1994); Xu et al., Immunity, 1, páginas 423-31 (1994).

Los mAbs IgM anti-LT-\beta-R serán significativamente más potentes como agentes activadores de LT-\beta-R que sus copias de IgG bivalentes normales, tal como se mide mediante comparaciones de respuesta a la dosis en el ensayo citolítico de HT29 en presencia de IFN-\gamma. Los mAbs anti-LT-\beta-R funcionan como agentes activadores tanto como cuando están inmovilizados como cuando se administran en solución. Además, esperamos que aumentarán la actividad antitumoral de los complejos heterómeros LT-\alpha/\beta.

Ejemplo 14 Los anticuerpos monoclonales anti-LT-\beta-R inhiben el crecimiento de las células tumorales humanas en ratones SCID

Se inyectaron a ratones Balbc/ SCID (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) 1 x 10^{6} células WiDr de adenocarcinoma humano tripsinizadas y lavadas en un volumen de 0,2 ml de PBS de manera subcutánea (s. c.) en la espalda del animal. Las célula WiDr inyectadas forman tumores en los ratones, y se controló la capacidad de un mAb anti-LT-\beta-R para inhibir el crecimiento tumoral. En un conjunto de experimentos, se trataron los ratones con o sin el mAb anti-LT-\beta-R CBE11 - o con o sin IFN-\gamma humano (10^{6} unidades antivirales/ratón) - al mismo tiempo que se inoculaban las células WiDr s. c. (Figura 6A). Se administraron los anticuerpos y el IFN-\gamma solos o juntos mediante inyección i. p. en 0,2 ml. A los ratones control se les inyectó solamente solución salina, solamente IFN-\gamma, o un mAb control LFA-3 anti-ser humano (1E6) con IFN-\gamma. Se registró el tamaño de cada tumor resultante 30 días después de la inoculación. Se calculó el volumen del tumor (en cm^{3}) a partir del radio, tal como se determina mediante medidas con el calibre en dos dimensiones. Los animales tratados con los mAbs CBE11 o 1E6 recibieron 10 \mug/ratón o 50 \mug/ratón de anticuerpo (Figura 6A; círculos con puntos y círculos abiertos respectivamente).

En otro conjunto de experimentos, se inoculó a los ratones s. c. Las células WiDr y se dejó que los tumores crecieran durante 15 días antes de que se tratara a los ratones con el mAB anti-LT-\beta-R CBE11 (Figura 6B). En el día 15 (antes del tratamiento con el anticuerpo), el volumen medio del tumor era de 0,076 cm^{3} con un diámetro medio de 0,53 cm. Seguidamente se administraba el mAb anti-LT-\beta-R CBE11 (50 \mug) (50 \mug) - o con o sin IFN-\gamma humano (10^{6} unidades antivirales/ratón) - mediante inyección i. p. en 0,2 ml a un grupo de 12 animales. Se repitieron las inyecciones tres veces más durante un periodo de tres semanas. Se inyectó a grupos control IFN-\gamma solamente (10^{6} unidades antivirales/ratón) o 50 \mug de un mAb control LFA-3 anti-ser humano (1E6) + IFN-\gamma (10^{6} unidades antivirales/ratón). Se registró en el tiempo el crecimiento de los tumores presentes en el día 15, desde el día 15 al 49 después de la inoculación de células tumorales. Se determinaron los resultados mostrados en la Figura 6B en un formato ciego. Pararon de crecer los tumores tratados con mAb CBE11 ya fuera con o sin IFN-\gamma. Después de tres inyecciones del mAb CBE11 (+/-o IFN-\gamma) durante tres semanas, se paró el crecimiento el crecimiento tumoral durante al menos 7 semanas después de la inoculación, en cuyo momento se terminó el experimento.

Claims

1. Una composición farmacéutica que comprende al menos un agente activador de LT-\beta-R, en la que un agente activador de LT-\beta-R comprende un anticuerpo anti-LT-\beta-R.

2. Uso de al menos un agente activador de LT-\beta-R para la preparación de una composición farmacéutica para tratar o reducir el avance, gravedad o efectos de la neoplasia, en la que un agente activador de LT-\beta-R comprende un anticuerpo anti-LT-\beta-R.

3. Uso de un complejo heterómero LT-\alpha/\beta para la preparación de una composición farmacéutica diseñada para administrarse en presencia de al menos un agente activador de LT-\beta-R para el tratamiento o reducción del avance, gravedad o efectos de la neoplasia.

4. El uso según la reivindicación 3, en la que un agente activador de LT-\beta-R comprende un anticuerpo anti-LT-\beta-R y/o IFN-\gamma.

5. Uso de anticuerpos anti-LT-\beta-R reticulados como un primer agente activador de LT-\beta-R para la preparación de una composición farmacéutica diseñada para administrarse en presencia de un segundo agente activador de LT-\beta-R para el tratamiento o reducción del avance, gravedad o efectos de la neoplasia.

6. El uso según la reivindicación 5, en la que el segundo agente activador de LT-\beta-R comprende IFN-\gamma.

7. Un método para seleccionar un agente activador de LT-\beta-R que actúa en presencia de complejos heterómeros LT-\alpha/\beta que comprende las etapas de :

(a): cultivar células tumorales en presencia de complejos heterómeros LT-\alpha/\beta, un primer agente activador de LT-\beta-R y un segundo agente activador aparente de LT-\beta-R; y

(b): determinar si el segundo agente activador aparente de LT-\beta-R aumenta la actividad antitumoral del complejo heterómero LT-\alpha/\beta en presencia del primer agente activador de LT-\beta-R.

8. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-LT-\beta-R.

9. Uso de un anticuerpo anti-LT-\beta-R para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o reducción del avance, gravedad o efectos de la neoplasia.