FI119359B

FI119359B - Lymfotoksiini-alfa/beta-komplekseja ja anti-lymfotoksiini-beta-reseptor ivasta-aineita kasvaintenvastaisina aineina

Info

Publication number: FI119359B
Application number: FI973118A
Authority: FI
Inventors: Jeffrey L Browning; Christopher D Benjamin; Werner Meier
Original assignee: Biogen Idec Inc
Priority date: 1995-01-26
Filing date: 1997-07-25
Publication date: 2008-10-31
Also published as: FI973118A0; HUP9801746A3; KR100475492B1; CA2211443A1; CN1177302A; DE69632681T2; CN1900116A; HK1006356A1; AU4970496A; JPH10513161A; EA000096B1; SK286497B6; PL321758A1; EA199700144A1; WO1996022788A1; EE04453B1; FI973118A7; ATE268604T1; EP0809510A1; NO973385D0

Description

119359

Lymfotoksiini-a/fi-komplekseja ja anti-lymfotoksiini-fi-re-septorivasta-aineita kasvaintenvastaisina aineina

Keksinnön tekninen alue 5 Tämä keksintö koskee koostumuksia ja menetelmiä, jotka ovat käyttökelpoisia lymfotoksiini-S-reseptorivies-tityksen aktivoinnissa, joka puolestaan saa aikaan voimakkaita kasvainsoluihin kohdistuvia antiproliferatiivisia vaikutuksia. Tämä keksintö koskee tarkemmin esitettynä 10 heteromeerisiä lymfotoksiinikomplekseja, joita muodostuu lymfotoksiini-a:n ja useiden lymfotoksiini-fi-alayksiköiden välille ja jotka indusoivat kasvainsoluihin kohdistuvia sytotoksisia vaikutuksia lymfotoksiini-fi-reseptoreja aktivoivien aineiden läsnä ollessa. Tämän keksinnön suoja-alan 15 piiriin kuuluvat myös lymfotoksiini-fi-reseptorin vastaiset vasta-aineet, jotka toimivat lymfotoksiini-S-reseptoreja aktivoivina aineina yksinään tai yhdessä muiden lymfotok-siini-fi-reseptoreja aktivoivien aineiden kanssa lymfotok-siini-a/S-kompleksien läsnä tai poissa ollessa. Käyttöön 2 0 tarjotaan seulontamääritysmenetelmä mainitunlaisten vasta- aineiden valikoimiseksi. Tämä keksintö koskee myös koostu-V/ muksia ja menetelmiä, joissa käytetään ristisidottuja an- ·:··; ti-lymfotoksiini-beeta-reseptorivasta-aineita muiden lym- ···*· fotoksiini-fi-reseptoreja aktivoivien aineiden läsnä olles- 25 sa kasvainsoluihin kohdistuvan sytotoksisuuden voimistami- • « :*. seksi.

• · * *··. Keksinnön tausta • · · • · ·

Tuumorinektoositekijä (TNF) -reseptorien ryhmään . , kuuluu muutamia jäseniä, joiden lähettämät signaalit voi- • · · *·]·' 3 0 vat indusoida kasvainsolun kuoleman nekroosin tai apoptoo- *··.* sin (ohjelmoidun solukuoleman) kautta. Ligandit TNF ja lymfotoksiini-α (LT-a; aiemmin käytetty nimitystä TNF-β) sitoutuvat TNF-reseptoreihin (p60 ja p80; tässä käytetään

• M

.·. nimitystä "TNF-R") ja aktivoivat niitä. TNF-R-viestitys • * · *·*·’ 35 käynnistää yleisiä immuunireaktioita infektioon tai stres- • · * • «· • · 2 119359 siin normaaleissa soluissa, mutta on sytotoksista soluille, joiden fenotyyppi on muuntunut, tai kasvainsoluille. TNF-R-viestitys voi lysoida selektiivisesti kasvainsoluja ja viruksen infektoimia soluja. THF-R-viestityksen syto-5 toksisia vaikutuksia kasvainsoluihin edistävät interfero ni -γ (IFN-7) ja joukko erilaisia tavanomaisia kemotera-peuttisia aineita.

Olisi käyttökelpoista hyödyntää terapeuttisiin tarkoituksiin antiproliferatiivisia tai sytotoksisia aktiivi-10 suuksia, joita TNF-R-viestitys indusoi kasvainsoluissa. TNF-R:ien aktivoitumisella on kuitenkin pleiotrooppisia vaikutuksia joukkoon erilaisia immuunisäätelyvasteita, mukaan luettuna tulehdusta edeltävien tapahtumasarjojen käynnistyminen. Niinpä ei ole ollut mahdollista suunnata 15 TNF-R-viestytyksen sytotoksisia vaikutuksia kasvainsolui hin stimuloimatta samalla tulehdusreaktioita, jotka johtavat yleiseen toksisuuteen ihmisissä.

Vastaavasti yhden toisen TNF-sukuisen, Fas-resepto-riksi (FasR) kutsutun reseptorin stimulaatio voi laukaista 20 sytotoksisuuden ohjelmoidun solukuoleman kautta joukossa erilaisia sekä kasvain- että ei-kasvainsolutyyppejä.

* · V.: FasR:ien aktivaation on kuitenkin osoitettu aiheuttavan *:1·: nopean maksanekroosin, mikä estää sen terapeuttisen käytön ····· ihmisissä.

25 Jokin aika sitten on identifioitu yksi muu TNF-ryh- • t1 ;·. män reseptori, jota kutsutaan LT-S-reseptoriksi (LT-fi-R)

• M

[Crowe et ai., Science 264 (1994) 707 - 710] . ΙιΤ-β-R sitoo • ♦ « ’ heteromeerisiä lymfotoksiinikomplekseja (LT-οί/β) , jotka käsittävät LT-a-alayksiköitä liittyneinä toiseen TNF-su- • · 1 **V 30 kuiseen polypeptidiin, jota kutsutaan lymfotoksiini-fi:ksi (LT-β) . Nämä LT-a/fi-kompleksit ovat kalvoon liittyviä, ja ·1·.. useimmissa niistä vallitsee LT-al/fi2-stoikiometria [Brow- .···. ning et ai., Cell 72 (1993) 847 - 856; Browning et ai., J.

Immunol. 154 (1995) 33 - 46].

• · · • · · « · • · ♦ · ♦ • · 3 119359

Analogisesti kuin TNF-R:n ja muiden TNF:n kaltaisten reseptorien ollessa kyseessä LT-fi-R-viestitystä ajatellaan tapahtuvan, kun useita solun pinnalla olevia reseptoreja saatetaan hyvin lähelle toisiaan [Crowe et ai., 5 Science 264 (1994) 707 - 710] . Tätä prosessia kutsutaan reseptorien yhteenkerääntymiseksi. TNF- ja LT-ligandit ovat multivalenttisia komplekseja, jotka voivat sitoutua samanaikaisesti useampaan kuin yhteen reseptoriin ja siten aggregoida niitä. Reseptorien yhteenkerääntymisestä resep-10 torien aktivaatiokeinona muissa järjestelmissä on olemassa runsaasti dokumentoitua tietoa, erityisesti reseptorityro-siinikinaasien suhteen [Ullrich ja Schlessinger, Cell 61 (1990) 203 - 212; Kolanus et ai., Cell 74 (1992) 171 - 183] . Niinpä sellaisten LT-al/S2-ligandien ja/tai LT-β-15 R:eja aktivoivien aineiden antamista, jotka pystyvät indusoimaan LT-fi-R-molekyylien yhteenkerääntymisen ja eteen-päinviestityksen kohteena olevien kasvainsolujen pinnalla, voitaisiin käyttää LT-fi-R-tapahtumasarjan suoraan stimulointiin näissä soluissa.

20 LT-S-R:ien, samoin kuin TNF-R:ien, lähettämät sig naalit voivat aktivoida tapahtumasarjoja, jotka johtavat • · ϊ,ί,ί sytotoksisuuteen ja solukuolemaan kasvainsoluissa. Tärkeää ·;··: on, etteivät LT-al/S2-ligandit sitoudu TNF-R:iin merkittä- ····· väliä affiniteetilla. Tästä syystä suunnattu LT-E-R:ien 25 aktivaatio kasvainsoluissa laukaisisi sytotoksisuuden * · :·. näissä soluissa stimuloimatta TNF-R:n aktivaatioon liitty- • · · *... viä tulehduksellisia tapahtumasarjoja. Hoito, jossa käyte- a i · * tään LT-al/fi2:a ja/tai muita LT-fi-R:eja aktivoivia aineita, olisi käyttökelpoista tumorigeenisten solujen lisään- • · · ’1!2 30 tymisen, vakavuuden tai vaikutusten (neoplasia) hoidossa *...· tai vähentämisessä voittaen samalla vakavat sivuvaikutus- ongelmat, joita on esiintynyt kokeiltaessa TNF-R: ien tai FasR:ien aktivointia kasvaintenvastaisena hoitona.

• · • · · • 1 1 t · 1 • · · I I · • ·« 2 • · 4 119359

Yhteenveto keksinnöstä Tämä keksintö ratkaisee edellä mainitut ongelmat tarjoamalla käyttöön farmaseuttisia koostumuksia ja menetelmiä kasvainsolujen käsittelemiseksi stimuloimalla LT-β-5 R-viestitystä, ilman että TNF-R:ihin liittyvät tulehdusreaktiot tulevat samalla stimuloiduiksi. Yhdessä suoritusmuodossa tarjotaan käyttöön LT-a:n ja useiden LT-fi-alayk-siköiden kesken muodostettuja lymfotoksiinikomplekseja (heteromeerisia LT-a/fi-komplekseja), jotka indusoivat LT-10 fi-R:eja pinnallaan sisältäviin soluihin kohdistuvia syto-toksisia vaikutuksia LT-S-R:eja aktivoivan aineen läsnä ollessa. Tämän suoritusmuodon mukaiset edulliset koostumukset ja menetelmät käsittävät LT-a/S-komplekseja LT-β-R:eja aktivoivan aineen läsnä ollessa. LT-a/B-kompleksit 15 ovat edullisemmin liukoisessa kuin kalvoon sitoutuneessa muodossa, ja LT-fi-R:eja aktivoiva aine on IFN-γ.

Keksinnön yhdessä toisessa suoritusmuodossa käytetään vähintään yhtä LT-fi-R:n vastaista vasta-ainetta (anti -LT-fi-R-Ab) toisena LT-fi-R:eja aktivoivana aineena hete-20 romeerisen LT-a/fi-kompleksin yhteydessä. Tämän suoritusmuodon mukaisille edullisille koostumuksille ja menetel- • · mille on tunnusmerkillistä LT-οί/β ensimmäisenä aktivoivana *:··| aineena toimivan IFN-γ:n ja toisena LT-fi-R:eja aktivoivana *:··· aineena toimivan vähintään yhden anti-LT-fi-R-Ab:n läsnä 25 ollessa. LT-α/β-kompleksit ovat edullisemmin liukoisia ja • · 1 ··. vasta-aine on monoklonaalinen vasta-aine (anti-LT-fi-R-

• M

mAb) .

• · · • · · * Keksinnön yhdessä toisessa suoritusmuodossa käytetään vähintään yhtä anti-LT-fi-R-Ab:a toisen LT-fi-R:eja * · · '·'·1 3 0 aktivoivan aineen läsnä tai poissa ollessa ilman ulkopuo- lista heteromeerista LT-α/β-kompleksia. Tämän suoritusmuo- Σ1· don mukaiset edulliset koostumukset ja menetelmät käsittä- • · · -1 .··1. vät vähintään kaksi monoklonaalista anti-LT-fi-R-vasta-ai- * · netta (anti-LT-S-R-mAb), jotka tunnistavat kokonaan eri * · · • · · • · ♦ • ♦ · • ·« • · 5 119359 kohdissa sijaitsevia LT-fi-R:n epitooppeja, yhdessä ΙΡΝ-γ:η kanssa.

Yhdessä lisäsuoritusmuodossa tämä keksintö tarjoaa käyttöön farmaseuttisia koostumuksia ja menetelmiä kas-5 vainsolusytotoksisuuden voimistamiseksi, joille on tunnusmerkillistä ristisidottujen anti-LT-S-R-Ab:iden käyttö yhdessä toisen LT-S-R:eja aktivoivan aineen kanssa. Yhdessä edullisessa suoritusmuodossa immobilisoidaan yksittäisiä anti-LT-S-R-Ab:itä ristisitomalla niitä pinnalle. Yh-10 dessä toisessa edullisessa suoritusmuodossa anti-LT-fi-R-Ab:t ristisidotaan liuoksessa. Anti-LT-fi-R-Ab:t ovat edullisemmin monoklonaalisia vasta-aineita, ja toinen LT-β-R:eja aktivoiva aine on IFN-γ.

Tämä keksintö tarjoaa lisäksi käyttöön uudenlaisen 15 seulontamääritysmenetelmän sellaisten LT-S-R:eja aktivoi vien aineiden, kuten anti-LT-S-R-Ab:iden, valikoimiseksi, jotka toimivat yhdessä heteromeeristen LT-a/S-kompleksien kanssa kasvainsolujen kuolemaa edistävällä tavalla. Tässä määrityksessä käytetään hyväksi ihmisen adenokarsinoomaso-20 lujen lisääntynyttä herkkyyttä heteromeerisille LT-α/β- komplekseille LT-fi-R:eja aktivoivien aineiden läsnä olles- · :,V sa sytotoksisuusmäärityksessä. Menettelystä, jota käyte- *:*·: tään otaksuttujen LT-fi-R:eja aktivoivien aineiden testaa- ·:*·· miseen, esitetään anti-LT-fi-R-Ab-vasta-aineita koskeva 25 esimerkki, ja se käsittää seuraavat vaiheet: ♦ · 1) Kasvainsoluja (esimerkiksi ihmisen adenokarsi- • ·· .·... noomasoluja HT2 9) viljellään muutamia päiviä IFN-γ:aa ja • · · puhdistettua LT-o;l/fi2:a sisältävässä alustassa kulloinkin , , tutkittavan anti-LT-fi-R-Ab:n läsnä tai poissa ollessa; • a · '·[** 3 0 2) solut käsitellään elävät solut värjäävällä väri- • · *···* aineella; 3) määritetään värjäytyneiden solujen lukumäärä, φ .***. jotta saadaan määritetyksi, mikä osa kasvainsoluista on kuollut LT-al/fi2:n, IFN-γ:n ja testattavan anti-LT-fi-R- • · « *·’·* 35 Ab:n läsnä ollessa kussakin näytteessä. Elävien solujen • * · • ·· • * , 119359 6 lukumäärä voidaan vaihtoehtoisesti määrittää millä tahansa monista hyvin tunnetuista määrityksistä, joilla mitataan solujen elävyyttä, kuten 3H-tymidiinin sisällytyksellä DNA:hän.

5 Piirustusten lyhyt kuvaus

Kuvio IA TNF-R- ja LT-i5-R-immuuniaffiniteettikro-matografiällä erotettujen puhdistettujen heteromeeristen LT-a/6-kompleksimuotojen kokoanalyysejä. Puhdistetut proteiinit analysoitiin TSK 3000 HPLC -hartsilla fosfaatti-10 puskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa. Eri koko-markkerien sijainti esitetään kuvassa.

Kuvio IB puhdistettujen LT-muotojen ioninvaihtoana-lyysejä, joissa on käytetty Poros-karboksimetyylikolonnia (4,6 mm x 100 mm) BioCad-laitteessa (Perceptive Biosys-15 tems). 27 μg kutakin näyteproteiinia syötettiin kolonnille ja eluoitiin nopeudella 5 ml/min gradientilla 0 -» 1 mol/1 NaCl:a 20 kolonnin tilavuuden aikana puskurissa, joka sisälsi 16,66 μπιο1/1 Hepesiä, 16,66 μιηοΐ/ΐ natriumasetaattia ja 16,66 μιϊΐοΐ/ΐ Mes-puskuria (pH 6,5).

20 Kuvio 2A vertailu, joka koskee anti-Fas-reseptori- mAb :n CH-11 (-·-); TNF: n (-0-) ; LT-ο;: n (-□-); LT-al/152:n • · V,: (--) ja LT-a2/βΐ:n (-♦-) sytotoksista aktiivisuutta ihmi- *!*‘i sen adenokarsinoomasoluilla HT29 IFN-7:n (80 yksikköä/ml) ·;··: läsnä tai poissa ollessa.

·*·*. 25 Kuvio 2B vertailu, joka koskee ihmisen IgG:n (-·-) , ;·. liukoisen p60TNF-T-Fc:n (-o-) ja liukoisten LT-fi-R-Fc-re- .···. septori-immunoglobuliinikimeerojen (-□-) (kaikkia 5 μg/ml) • t · kykyä inhiboida kuviossa 2A esitettyjä sytotoksisia vaiku- , . tuksia IFN-γ.'η (80 yksikköä/ml) läsnä ollessa.

• « · *^·* 30 Kuvio 3 anti-LT-fi-R-mAb:t vahvistavat LT-al/S2:n * · *·;·* sytotoksista vaikutusta ihmisen adenokarsinoomasoluihin ·**., HT29. (A) Anti-LT-fi-R-mAb:n CDH10 läsnäolo vahvistaa LT- ·***· ai/£2 :n sytolyyttisiä vaikutuksia. LT-oil/fi2:n vaikutukset · * mitattiin ilman mAb:a (-·-) ja vertailu-IgGl:n (0,5 μg/ml) • · · 35 (-O-), CDH10: n (0,05 μg/ml) (-o-) ja CDH10:n (0,5 μg/ml) • · · • ·· • · 7 119359 (-□-) läsnä ollessa. (B) Anti-LT-fi-R-mAb:n BDA8 läsnäolo inhiboi LT-o;l/S2:n sytolyyttisiä vaikutuksia HT29-solui-hin. LT-ail/fö2:n vaikutukset mitattiin vertailu-IgGl:n (--) tai anti-LT-fi-R-mAb:n BDA8 (-□-) läsnä ollessa 5 (2 μg/ml). Anti-LT-fi-R-mAb:iden CDH10 ja BDA8 erilainen käyttäytyminen tässä määrityksessä on yksi osoitus siitä, että ne suuntautuvat LT-fi-R:n eri epitooppeihin.

Kuvio 4 immobilisoidut anti-LT-fi-R-mAb:t ovat sy-totoksisia ihmisen adensokarsinoomasoluille HT29. (A) An- 10 ti-LT-fi-R-mAb:illa on suora sytotoksinen vaikutus HT29-soluihin, kun ne immobilisoidaan pinnalle. Maljoja päällystettiin IgGl:llä (-·-), yhden solupinnalla runsaasti esiintyvän ei-sukulaisantigeenin, HT29/26:n, vastaisella mAb:11a (--), BDA8:lla (-O-) jaCDH10:llä (-□-). (B) Liu-15 koisten anti-LT-fi-R-mAb:iden vaikutuksen yksinään käytettyinä HT29-solujen kasvuun. Symbolit ovat samat kuin kuvassa A. Näillä anti-LT-6-R-mAb:illa ei liukoisessa muodossaan yksittäin annettuina ole merkittäviä sytotoksisia vaikutuksia HT29-soluihin.

20 Kuvio 5 edustava esimerkki kvantitatiivisesta mää rityksestä, joka koskee kasvainsoluihin kohdistuvaa paran-tunutta sytotoksisuutta tehtäessä käsittely pareilla liu-;·*: koisia anti-LT-£-R-mAb:ita. (A) Vertailu IgGl:n (100 ng/ ml), anti-LT-fi-R-mAb:n BHA10 (100 ng/ml) , anti-LT-S-R-!·.*. 25 mAb:n CBE11 (50 ng/ml), BHA10 :n (100 ng/ml) + IgG:n ··, (100 ng/ml) ja BHA10:n (100 ng/ml) + CBEllin (50 ng/ml) • ·· \.· sytotoksiset vaikutukset HT29-soluihin. IFN-7:aa oli läsnä * 10 yksikköä/ml. (B) Vertailu IgGl:n (100 ng/ml), anti-LT- 6-R-mAb:n CDH10 (100 ng/ml), anti-LT-S-R-mAb:n CBE11 *·*·* 30 (50 ng/ml), CDH10:n (100 ng/ml) + IgGl:n (100 ng/ml) ja ··· :...s CDH10 :n (100 ng/ml) + CBEll:n (50 ng/ml) sytotoksiset vai- kutukset HT29-soluihin. IFN-7:aa oli läsnä 10 yksikköä/ml. ,*·*. (C) Vertailu IgGl:n (100 ng/ml), anti-LT-fi-R-mAb:n CDH10 (33 ng/ml), anti-LT-fi-R-mAb:n AGH1 (50 ng/ml) ja CDH10:n • · « *·*·* 35 (33 ng/ml) + AGH1:n (50 ng/ml) sytotoksiset vaikutukset • · • · · • ·· • · 8 119359 HT29-soluihin. IFN-7:aa oli läsnä 10 yksikköä/ml. (D) Kuten kohta C, paitsi että sytolyysimäärityksessä käytetään ihmisen adenokarsinoomasoluja WiDr [Raitano ja Korc, J. Biol. Chem. 265 (1990) 10466 - 10472].

5 Kuvio 6 kasvaimen koko anti-LT-G-R-mAb:11a hoide tuissa SCID-hiirissä. (A) Ihmisen adenokarsinoomakasvaimen WiDr koko SCID-hiirissä 30 päivän kuluttua inokuloinnista annettaessa samalla vasta-ainehoitoa. Hiiriä käsiteltiin päivänä 1 ja 2 fysiologisella suolaliuoksella, pelkällä 10 IFN-γ:11a, anti-LT-fö-R-mAb:11a (CBE11) yhdessä ΙΡΝ-γ:η kanssa ja ilman sitä ja anti-ihmis-LFA-3-mAb-vertailunäyt-teellä (1E6) yhdessä IFN-γιη kanssa. Kunkin ryhmän keskiarvo osoitetaan poikkijanalla. Keskiarvot, standardipoik-keamat ja eläinten lukumäärä (suluissa) olivat näillä vii-15 dellä ryhmällä (vasemmalta oikealle) seuraavat: 0,88 ± 0,59 (14), 1,21 ± 0,7 (21), 0,041 ± 0,052 (16), 0,11 ± 0,1 (12) ja 0,98 ± 1,16 (12). (B) Ihmisen adenokarsinoomakas vaimen WiDr koko SCID-hiirissä 14 - 49 päivää kasvainsolu-inokuloinnin jälkeen aloitettaessa vasta-ainehoito 15 päi-20 vän kuluttua inokuloinnista. Kasvainten annettiin kasvaa keskimääräiseen läpimittaan 0,53 cm (0,076 cm2) ilman hoi- • · V,' toa, aloitettiin intraperitoneaaliset injektiot päivänä 15 ’!**: ja jatkettiin niitä nuolten osoittamalla tavalla. Keskiar- ·;··· vot ja standardipoikkeamt esitetään 12 eläimen ryhmälle, iV. 25 jota hoidettiin joko pelkällä IFN-7:lla (1-106 yksikköä/ • ·* ϊ·, ruiske) (-□-), IFN-yilla ja anti-LFA-3-mAb: 11a 1E6 (50 μ$) [···, (-0-), IFN-γ.-11a ja anti-LT-S-R-mAb: 11a CBE11 (50 μg) • · t (-Δ-) tai pelkällä anti-LT-S-R-mAb:11a CBE11 (50 μg) (ei . , esitetä).

• · * **]*' 30 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus e * *··*' Tässä kuvatun keksinnön täydellisemmän ymmärtämisen j\. mahdollistamiseksi esitetään seuraava yksityiskohtainen ·***. kuvaus.

• «

• M

.·. Termi "kasvaintenvastainen aktiivisuus" tarkoittaa 9 · · *·*·* 35 aineen tai koostumuksen kykyä estää kyseisen aineen tai • e · ·. ·: 9 119359 koostumuksen kanssa vuorovaikutuksessa olevien kasvainso-lujen proliferäätio tai indusoida niiden kuolema.

Termi "apoptoosi" tarkoittaa ohjelmoitua solukuole-maprosessia.

5 Termi "sutotoksinen aktiivisuus" tarkoittaa aineen tai koostumuksen kykyä indusoida kyseisen aineen tai koostumuksen kanssa vuorovaikutuksessa olevien solujen kuolema .

Termi "epitooppi" (eli antigeenideterminantti) mää-10 ritellään molekyylin osaksi, joka liittyy vasta-ainemole-kyylillä olevaan yhteen antigeenisitoutumiskohtaan. Mono-klonaalinen vasta-aine (mAb) tunnistaa yhden epitoopin. Polyklonaaliset vasta-aineet (Ab) tunnistavat normaalisti useita epitooppeja.

15 Vasta-aineen "Fc-domeeni" tarkoittaa molekyylin osaa, joka käsittää CH2-, CH3- ja nivelalueita muttei an-tigeenisitoutumiskohtia.

Termi "interferonia indusoiva aine" tarkoittaa mitä tahansa ainetta, jolla on kyky stimuloida suoraan tai epä-20 suorasti joko tyypin I (IFN-a, IFN-β) tai tyypin II (IFN-7) interferonien endogeenista tuotantoa. Esimerkkeihin • * !.V interferonia indusoivista aineista kuuluvat kaksisaikeiset RNA-molekyylitja joukko erilaisia kasviperäisiä tai far-····· maseuttisesti valmistettuja yhdisteitä.

•V. 25 Termit "LT-a-muteiini" ja "LT-fi-muteiini" tarkoit- • · Ϊ*. tavat LT-α- tai LT-fi-polypeptidejä, joissa esiintyy yksi i ** ,···. tai useampi aminohappomuutos verrattuna vastaavan luontai- • · · sen polypeptidin aminohapposekvenssiin.

, , Termi "LT-S-R:a aktivoiva aine" tarkoittaa mitä » · · **]·* 3 0 tahansa ainetta, joka voi edistää ligandin sitoutumista 0 » *·*·’ LT-S-R:iin, solupinnan LT-fi-R:ien yhteenkerääntymistä tai LT-£-R-viestitystä tai vaikuttaa siihen, miten LT-fi-R:n • ;***. lähettämä signaali tulkitaan solussa. Esimerkkeihin LT-β- *·· ,·, R:a aktivoivista aineista kuuluvat IFN-a, IFN-y, TNF, in- • · · '·**! 35 terferonia indusoivat aineet, liukoiset anti-LT-E-R-Ab:t, • · · *. '! 10 119359 ristisidotut anti-LT-S-R-Ab:t ja multivalenttiset anti-LT-β-R-Ab:t.

Termi "LT-fi-R-viestitys" tarkoittaa kaikkia kaikkia molekulaarisia reaktioita, jotka liittyvät ΐ/Γ-β-R-tapahtu-5 masarjaan, ja myöhempiä molekulaarisia reaktioita, joita tapahtuu sen seurauksena.

Termi "anti-LT-fi-reseptorivasta-aine" ("anti-LT-β-R-Ab") tarkoittaa mitä tahansa vasta-ainetta, joka tunnistaa LT-fi-reseptorin vähintään yhden epitoopin ja sitoutuu 10 siihen.

Termi "monoklonaalinen anti-LT-fi-reseptorivasta-aine" ("anti-LT-fi-R-mAb") tarkoittaa mitä tahansa monoklo-naalista vasta-ainetta, joka tunnistaa LT-fi-reseptorin yhden epitoopin ja sitoutuu siihen.

15 Termi "ristisidotut anti-LT-fi-R-(m)Ab:t" tarkoittaa LT-fi-R:n vastaisia vasta-aineita, jotka on joko ristisi-dottu keskenään liuoksessa, niin että muodostuu vasta-ai-neagglomeraatteja, käyttämällä anti-LT-fi-R-vasta-ainetta (Ab tai mAb) ristisitovaa ainetta tai jotka on immobili-20 soitu hyvin lähelle toisiaan pinnalle tai matriksille.

Termi "anti-LT-fi-R-Ab:a (tai mAb:a) ristisitova • · !,V aine" tarkoittaa mitä tahansa ainetta, joka pystyy kova- ♦Ϊ**: lenttisesti tai ei-kovalenttisesti aggregoimaan anti-LT-β- ·:··· R-Ab:ita liuoksessa, niin että kyseiset Ab:t pystyvät si- !'·*. 25 toutumaan kohdesolun pinnan LT-β-reseptoreihin ja tehos- * · ' Γ, tamaan niiden yhteenkerääntymistä. Mainitunlaisiin risti- • Il ,···, sitoviin aineisiin kuuluu, mainittuihin kuitenkaan rajoit- • · · tumatta, kemiallisia ristisitovia aineita, sekundaarisia ,, vasta-aineita, jotka reagoivat anti-LT-fi-R-Ab:iden tai • · * 30 -mAb:iden osien kanssa, ja liukoisia tai pintaan sitoutu- • ' · *···* neita - joko endogeenisia tai ulkoapäin lisättyjä - Fc- ·*·,. reseptoreja, jotka pystyvät sitoutumaan anti-LT-fi-R- .***. Ab:isiin.

• » ··· .*, Termit "biologinen LT-α-aktiivisuus", "biologinen «Il *·*·* 35 LT-fi-aktiivisuus" ja "biologinen LT-a/fi-aktiivisuus" mää- • · « ·. ·: 11 119359 ritellään 1) immunologiseksi ristireaktiivisuudeksi vastaavan luontaisen alayksikön tai alayksiköiden kompleksin vastaisen vasta-aineen vähintään yhden epitoopin kanssa, 2) LT-alayksikön tai alayksiköiden kompleksin kyvyksi kil-5 pailla LT-spesifisellä reseptorilla, kuten TNF-R:llä tai LT-S-R:llä, olevista ligandinsitoutumiskohdista tai 3) kyvyksi stimuloida immuunisäätelyreaktiota tai sytotoksis-ta aktiivisuutta kvalitatiivisesti luontaista LT-alayksik-köä tai niiden kompleksia vastaavalla tavalla.

10 Termi "heteromeerinen LT-a/S-kompleksi" tarkoittaa vähintään yhden LT-a-alayksikön ja useamman kuin yhden LT-β-alayksikön stabiilia yhteenliittymää. Nämä alayksiköt voivat liittyä yhteen sähköstaattisten, van der Waalsin tai kovalenttisten vuorovaikutusten kautta. Heteromeeri-15 sessa LT-a/fi-kompleksissa on edullisesti vähintään kaksi rinnakkaista LT-fi-alayksikköä, ja siitä puuttuvat rinnakkaiset LT-a-alayksiköt. Kompleksin stoikiometria on edullisimmin LT-al/fi2.

Termi "multivalenttinen ligandi" tarkoittaa mole-20 kyyliä tai kompleksia, jossa on useampi kuin yksi resepto-risitoutumiskohta ja jolla on kyky sitoutua samanaikaises- • · *,V ti vähintään kahteen reseptorimolekyyliin ja saattaa ne "*'· toistensa välittömään läheisyyteen.

•r*S "Tyypin I esisekvenssi" on eukaryoottisen proteii- ;*·*· 25 nin aminoterminaalinen osa, joka toimii signaalina prote- • · iinin ohjaamiseksi endoplasman retikulaariseen (ER-) kai- S ** ,··*, voon ja usein läpi koko eritystapahtumasarjan. Signaali- • · « peptidaasi tavallisesti lohkaisee esijakson pois ER-kal- , . vossa.

i · « *j]·* 30 "Signaalisekvenssi" on eukaryoottien tyypin I esi- *···* sekvenssin vastine prokaryootti-isännissä ja ohjaa prote- iinin siirtymistä bakteerin lipidikaksoiskerroskalvoihin ·***; tai niiden poikki.

• •f ,·, "Liukoinen heteromeerinen LT-a/fö-kompleksi" on he- • t · *·*·] 35 teromeerinen LT-a/fi-kompleksi, joka käsittää liukoisia LT- « · » • ·· • · 10 1 1 9359 12 β-alayksiköitä, joista on poistettu tai inaktivoitu aminohapposekvenssit, jotka sijoittavat polypeptidin paikalleen kalvoon, mikä tekee LT-fi-alayksiköstä liukenevan. Sopiva isäntäsolu, joka on käsitelty ilmentämään kumpaakin alayk-5 sikköä, pystyy erittämään liukoisia heteromeerisia LT-α/β-kompleksej a.

"Pinnan LT-a/fi-kompleksi" on kompleksi, joka käsittää LT-a-alayksiköitä ja kalvoon sitoutuneita LT-fi-alayk-siköitä ja esiintyy solun pinnalla.

10 Kalvoon sitoutuneiden ΙιΤ-α/β-kompleksien tuottami nen

Solupinnan lymfotoksiinikomplekseja on karakterisoitu CD4+-T-soluhybridoomasoluissa(11-23.D7), joilla esiintyy suuria LT-pitoisuuksia [Browning et ai., J. 15 Immunol. 147 (1991) 1230 - 1237; Androlewicz et ai., J.

Biol. chem. 267 (1992) 2542 - 2547]. Kypsästä LT-a:sta puuttuu kalvon läpäisevä domeeni ja se sijoittuu solupin-taan vähintään yhden kalvoon sitoutuneen LT-fi-alayksikön kanssa tapahtuvan vuorovaikutuksen kautta. Kalvoon sitou-20 tuneissa (pinnan) heteromeerisissa LT-a/B-komplekseissa vallitsee pääosin LT-al/fi2-stoikiometria.

• e V.· LT-β sitoutuu solukalvon proteiinina LT-a:aan syn- S'*! teesin aikana ja "kohdistaa" siten LT-a:n solukalvoon. LT- *:*·; β:η poissa ollessa LT-οί erittyy solunulkoiseen väliainee- 25 seen. LT-alayksiköt kerääntyvät normaalisti komplekseiksi • · ί*.^ solun sisällä ennen proteiinin kuljetusta kalvoon. Kun LT- • * ,···, β-alayksiköt ovat sijoittuneet kalvoon, ne eivät muodosta • · · stabiileja komplekseja erittyneen LT-a:n kanssa. Niinpä . . toivottaessa heteromeerisen LT-a/fi-kompleksin kalvoon si- • · · lii 3 0 toutunutta muotoa on edullista ilmentää toivottuja LT-a- • ' ψ *···' ja LT-fi-alayksiköitä samassa solussa.

j*·.. Pinnan heteromeerinen LT-a/fi-kompleksi voidaan re- #"*; konstruoida kotransfektoimalla isäntäsolut sekä LT-α- että

• M

LT-fi-geeneillä. Pinnan LT-komplekseja ei ole havaittavissa • · · • \ 35 stabiileissa solulinjoissa, jotka ilmentävät vain jompaa • · · \ ·: 13 119359 kumpaa LT-geeniä. Jos isäntäsolu kuitenkin tuottaa normaalisti suuria määriä LT-ataa (esimerkiksi RPMI 1788 -solut; katso jäljempänä), pitäisi toivottua LT-fi-polypeptidiä koodaavalla LT-fi-geenillä tehtävän transfektoinnin riittää 5 saamaan aikaan LT-a/fi-komplekseja, jotka käsittävät täys-pituisia LT-a-alayksiköitä.

LT-αί- ja LT-fi-polypeptidien rinnakkais ilmentyminen johtaa joukossa eukaryoottisia ilmentämisjärjestelmiä po-lypeptidien yhteenliittymiseen ja kuljetukseen ulos aktii-10 visena ligandina [Crowe et ai., J. Immunol. Methods 168 (1994) 79 - 89]. Isäntäjärjestelmiin, joita voidaan käyttää, kuuluvat CHO-solut, COS-solut, B-solut myeloomasolut mukaan luettuina, bakuloviruksella infektoidut hyönteisso-lut ja hiivasolut, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta. 15 Tämän keksinnön mukaisten heteromeeristen LT-α/β- kompleksien LT-a-alayksikkönä tulevat kyseeseen lymfotok-siini-α, luontainen ihmisen tai eläimen lymf o toksiini-ot, rekombinanttilymfotoksiini-a, liukoinen lymfotoksiini-a, erittynyt lymfotoksiini-a, lymfotoksiini-a-muteiinit, 20 joilla on biologinen LT-a-aktiivisuus tai minkä tahansa mainitun polypeptidin lymfotoksiini-a-fragmentit, joilla • · V,· on biologinen LT-a-aktiivisuus.

*ϊ1ί LT-a-polypeptidi voi olla molekyylin mikä tahansa ♦:··· liukoinen muoto, mukaan luettuina sen aktiiviset fragmen- ·1·1. 25 tit, joita voi syntyä eukaryoottisissa ilmentymisjärjes- J·. telmissä, jolloin luontainen LT-a-esisekvenssi tulee loh- ♦ ·· .··♦, kaistuksi pois. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää kypsän • · t LT-οί-sekvenssin fuusioita heterologisen signaalisekvenssin . . kanssa LT-a:n erityksen maksimoimiseksi muissa isäntäjär- • f 1 *·]·1 30 jestelmissä. Signaalit valitaan aiotun isäntäsolun mukaan, • · *···1 ja niihin voi kuulua bakteeri-, hiiva-, nisäkäs- ja virus- ·1·., sekvenssejä. Luontainen signaali eli veri suoni solun adhee- siomolekyyli-1:n (VCAM-1) signaalisekvenssi soveltuu käy- ··· ,·. tettäväksi nisäkäsilmentämisjärjestelmissä.

♦ · · • · · • · · • · · • ·· * · 14 119359 LT-a-polypeptidejä voidaan fuusioida myös polypep-tideihin, joilla on pidentynyt puoliintumisaika plasmassa, kuten immunoglobuliiniketjuihin tai niiden fragmentteihin. Plasmaproteiineihin, joita voidaan käyttää puoliintumis-5 ajan pidentämiseksi plasmassa, kuuluvat seerumialbumiini, immunoglobuliinit, apolipoproteiinit ja transferriini. Liittäminen polyeteeniglykoliin (PEG) voi stabiloida poly-peptidin ja vähentää sen immunogeenisyyttä. LT-a-fuusio-proteiini ei mielellään ole merkittävästi immunogeeninen 10 hoidettavassa kohteessa, eikä plasmaproteiini aiheuta epätoivottavia sivuvaikutuksia kohteissa normaalin biologisen aktiivisuutensa vuoksi.

Ihmisen LT-α on glykosyloitunut N- ja O-ryhmistään, ja siinä esiintyy lähteen mukaan huomattavaa sokeripoh-15 jäistä mikroheterogeenisyyttä. LT-kompleksin muodostamiseen kulloinkin valitun LT-a:n oligosakkaridikoostumus voi vaikuttaa poistumisnopeuteen in vivo [Fukushima et ai., Arch. Biochem. Biophys. 304 (1993) 144 - 153]. Koska il mentyminen erilaisissa isäntäsoluissa voi tuottaa glykosy-20 laatiovariantteja, tämä on yksi huomioon otettava tekijä valittaessa LT-a:n lähdettä.

• · V,1 LT-α voidaan puhdistaa B-lymfoblastoidilinjasta *!2'! RPMI 1788, joka erittää konstitutiivisesti LT-aiaa ja on ·;··· indusoitavissa erittämään suurempia määriä käsittelemällä !1.2. 25 forboliesterillä PMA [Aggarwal et ai., J. Biol. Chem. 259 « · (1984) 686 - 691]. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää kloo-

S M

,···, nattua ihmisen LT-a-geeniä LT-a-polypeptidien tuottamiseen « · i yhdistelmä-DNA-menetelmin eri isäntäjärjestelmissä, mukaan , , luettuina bakteerit [Schoenfeld et ai., J. Biol. Chem. 266 • · » 30 (1991) 3863 - 3869]; bakuloviruksella infektoidut hyön- • · *···' teissolut [Crowe et ai., J. Immunol. Methods 168 (1994) » ·1·.. 79 - 89] ja nisäkässolut [Browning ja Ribolini, J. Immu- .3. nol. 143 (1989) 1859 - 1867; Fukushima et ai., Arch. Bio- ,·, chem. Biophys. 304 (1993) 144 - 153].

» · « * · « • · · 2 • · t 3 • ·· m 1 15 119359 LT-a-geenin osia, jotka koodaavat polypeptidifragmentteja, joilla on biologinen LT-a-aktiivisuus, voidaan tutkia käyttämällä rutiininomaisia seulontamäärityksiä. Käyttökelpoisiin seulontamäärityksiin biologisen LT-a-ak-5 tiivisuuden toteamiseksi kuuluvat kompetitiiviset inhibi- tiomääritykset, joissa käytetään TNF-R:iin sidottua luontaista LT-Q!:aa, tai määritykset, joissa mitataan joko suoraa tai epäsuorasti inhibition kautta LT-a:n kyky indusoida kasvainsolusytotoksisuus alalla tunnetuin määrityksin. 10 LT-a-fragmentteja yhdistetään edullisesti heteromeerisiksi komplekseiksi LT-β:n kanssa ja tutkitaan komplekseista biologinen LT-a/fi-aktiivisuus kompetitiivisella inhibi-tiolla käyttämällä LT-fi-R:iin sidottua LT-a/fi:aa tai kyky indusoida kasvainsolusytotoksisuus tässä kuvatuin määri-15 tykein.

Lymfotoksiini-β, josta käytetään myös merkintää p33, on identifioitu T-lymfosyyttien, T-solulinjojen, B-solulinjojen ja lymfokiinillä aktivoitujen tappajasoluen pinnalta. LT-β on kohteena tämän hakemuksen jättäjän sa-20 manaikaisesti käsiteltävinä olevissa kansainvälisissä pa tenttihakemuksissa PCT/US91/04 588, julkaistu 9. tammikuu- • · !.V ta 1992 numerolla W0 92/00 329, ja PCT/US93/11 669, jul- *ϊ*'ϊ kaistu 23. kesäkuuta 1994 numerolla WO 94/130 808, jotka ·:··! mainitaan tässä viitteinä.

;*·*· 25 LT-fi-geeni koodaa 240 - 244 aminohaposta koostuvaa • · 1*,^ polypeptidiä [Browning et ai., Cell 72 (1993) 847 - 856].

m LT-β on tyypin II kalvoproteiinit, jossa on lyhyt N-termi- • · · naalinen domeeni, jota seuraa 30 hydrofobisesta aminoha- .. posta koostuva kalvoon kiinnyttävä domeeni. Siinä on yksi • · · 30 N-kytkeytynyt glykosylaatiokohta ja vain yksi kysteiini- • · *«·* ryhmä, joka ei näytä osallistuvan alayksiköiden välisen disulfidisidoksen muodostukseen.

• ·***· LT-fi-alayksiköinä, jotka muodostavat tämän keksin- Λ nön mukaisia heteromeerisia LT-ce/S-komplekseja, tulevat • · ♦ •**| 35 kyseeseen lymfotoksiini-β, luontainen ihmisen tai eläimen • · · • ·· t · 16 119359 lymfotoksiini-fi, rekombinanttilymfotoksiini-β, liukoinen lymfotoksiini-β, erittynyt lymfotoksiini-β, lymfotoksiini-β-muteiinit, joilla on biologinen LT-β-aktiivisuus tai minkä tahansa mainitun polypeptidin lymfotoksiini-β-frag-5 mentit, joilla on biologinen LT-β-aktiivisuus.

Kuten edellä käsiteltiin LT-a-polypeptidien yhteydessä, voidaan myös LT-fi-polypeptidejä muuntaa niiden liukoisuuden parantamiseksi tai puoliintumisajan pidentämiseksi plasmassa käyttämällä samoja menetelmiä. Samoin LT-10 β-geenin osia, jotka koodaavat polypeptidifragmentteja, joilla on biologinen LT-β-aktiivisuus, voidaan tutkia käyttämällä rutiininomaisia seulontamäärityksiä, joita käsiteltiin LT-am yhteydessä.

Liukoisten kompleksien tuottaminen 15 Liukoiset (kalvoon sitoutumattomat) heteromeeriset LT-a/fi-kompleksit käsittävät LT-fi-alayksiköitä, jotka on muutettu kalvoon sitoutuvasta muodosta liukoiseen muotoon. Näitä komplekseja kuvataan yksityiskohtaisesti tämän hakemuksen jättäjän samanaikaisesti käsiteltävänä olevassa 20 kansainvälisessä patenttihakemuksessa (PCT/US93/11 669, julkaistu 9. tammikuuta 1992 numerolla WO 94/130 808).

• · · *.*.· Liukoisille LT-fi-peptideille on ominaista lymfotoksiin!- β:η aminohapposekvenssi, joka on katkennut mistä tahansa *!*" kohdasta kalvon läpäisevän alueen pään (suunnilleen amino- 2 5 hapon #44 kohdalla) ja ensimmäisen TNF-homologia-alueen (aminohapon #88 kohdalla) välistä noudatettaessa Brown- • ingin et ai. [Cell 72 (1993) 847 - 856] numerointijärjes-telmää.

m-m*m Liukoisia LT-fi-polypeptidejä voidaan tuottaa typis- • * * 3 0 tämällä LT-fi:n N-päätä, niin että sytoplasmahäntä ja kai- • * *;** von läpäisevä alue poistuvat [Crowe et ai., Science 2 64 ·· : *.. (1994) 707 - 710] . Kalvon läpäisevä domeeni voidaan vaih- :***; toehtoisesti inaktivoida deletoimalla kalvon läpäisevän • · · osan muodostavat, normaalisti hydrofobiset aminohapporyh- • · · I *. 35 mät tai korvaamalla ne hydrofiilisillä ryhmillä. Kummassa- • · · • ·· · 17 119359 kin tapauksessa syntyy olennaisesti hydrofiilinen hydropa-tiaprofiili, joka vähentää lipidiaffiniteettia ja parantaa vesiliukoisuutta. Kalvon läpäisevän domeenin deletointi on edullisempaa kuin korvaaminen hydrofiilisillä aminohappo-5 ryhmillä, koska siten vältetään potentiaalisesti immuno-geenisten epitooppien tuominen molekyyliin.

Deletoitu tai inaktivoitu kalvon läpäisevä domeeni voidaan korvata tyypin I esisekvenssillä (esimerkiksi VCAM-l-esisekvenssillä) tai liittää siihen, niin että 10 erittyvä proteiini alkaa sekvenssillä, joka on missä tahansa ryhmien val40 ja pro88 välissä. Liukoiset LT-E-poly-peptidit voivat sisältää minkä tahansa määrän tunnettuja esisekvenssejä N-päässä. Mainitunlainen sekvenssi mahdollistaisi peptidien erittymisen ja kohdentumisen eritysta-15 pahtumasarj aan eukaryoottijärjestelmässä. Katso esimerkik si Ernst et ai., US-patenttijulkaisu 5 082 783 (1992).

Liukoisia heteromeerisiä LT-a/fi-komplekseja voidaan tuottaa kotransfektoimalla sopiva isäntäsolu DNA:11a, joka koodaa LT-otiaa ja liukoista LT-15:aa [Crowe et ai., J. 20 Immunol. Methods 168 (1994) 79 - 89]. LT-a:n poissa ollessa erittynyt LT-β on voimakkaasti oligomeroitunut. Kun *.·.1 tapahtuu rinnakkais ilmentyminen LT-a:n kanssa, muodostuu kuintenkin 70 kDa:n trimeerimäinen rakenne, joka sisältää "2: kumpaakin proteiinia. On myös mahdollista tuottaa liukoi- :3: 25 siä heteromeerisiä LT-a/fö-komplekseja transfektoimalla • · •\t solulinja, joka normaalisti ilmentää vain LT-a:aa (kuten edellä käsitellyt RPMI 1788 -solut) , liukoista LT-6-poly-peptidiä koodaavalla geenillä.

LT-α- ja LT-6-polypeptidit voidaan syntetisoida • · · M 30 erikseen, denaturoida miedoilla detergenteillä, sekoittaa * · *"1 yhteen ja renaturoida poistamalla detergentti, jolloin • · : 1.. muodostuu heteromeeristen LT-kompleksien seoksia, joille voidaan tehdä erotus (katso jäljempänä) .

* 1 φ • · • · · • · · • · · * · · 2 • ·· 3 • 1 18 119359 LT-a/fi-kompleksien puhdistus

Liukoiset heteromeeriset LT-a/fi-kompleksit erotetaan ohella ilmentyneistä komplekseista, joiden alayksik-köstoikiometria on erilainen, kromatografisesti käyttämäl-5 lä TNF- ja LT-fi-reseptoreja affiniteettipuhdistusreagens-seina. TNF-reseptorit sitoutuvat vain LT-kompleksien a/a -väleihin. LT-lS-reseptori sitoutuu suurella affiniteetilla heteromeeristen LT-a/S-kompleksien β/β-väleihin ja pienemmällä affiniteetilla α/β-väleihin. Niinpä LT-a3 ja LT-10 α2/β1 sitoutuvat TNF-R:iin. ΚΓ-β-R voi sitoa myös LT-a- 2/fil-trimeerejä (α/β-välien alueella), muttei pysty sitomaan LT-0i3:a. Lisäksi LT-S-R (muttei TNF-R) sitoo LT-al/ β2:η ja LT-fin:n (mainitunlaisen valmisteen tarkka koostumus on tuntematon; ne ovat kuitenkin suuria aggregaatte-15 ja) .

Reseptoriaffiniteettireagensseja voidaan valmistaa joko liukoisena solunulkoisena domeenina [katso esimerkiksi Loetscher et ai., J. Biol. Chem. 266 (1991) 18324 - 18329] tai kimeeraproteiineina, joissa on solunulkoinen 20 ligandin sitova domeeni kytkettynä immunoglobuliinin Fc-domeeniin [Loetscher et ai., J. Biol. Chem. 266 (1991) « · V.· 18324 - 18329; Crowe et ai., Science 264 (1994) 707 - "**ί 710] . Reseptoreja kytketään af f initeetimatrikseihin kerni- *:**: allisella ristisitomisella käyttämällä rutiinimenettelyjä.

·*·*; 25 On olemassa kaksi järjestelyä, joilla LT-al/fi2-li- • « gandi voidaan puhdistaa käyttämällä reseptoreja ja immuu-niaffiniteettikromatografiaa. Ensimmäisessä järjestelyssä • · i johdetaan TNF-R-kolonnin läpi supernatantti, joka on pe-. . räisin asianmukaisesta ilmentämisjärjestelmästä, joka il- • · m 30 mentää samanaikaisesti sekä LT-a:aa että LT-fi:n typistet- • · *···* tyä muotoa. TNF-R sitoo LT-a3- ja LT-of2/fil-trimeerit. TNF- R-kolonnin läpi virranut tuote sisältää LT-fi(n) :ää ja LT- :***: al/B2:a.

• · · .*. Toisessa järjestelyssä kaikki LT-fi:aa sisältävät • · · 35 muodot [LT-fi(n), LT-o;l/fi2 ja LT-a2/fil] sidotaan LT-fi-R- · · • n

• I

19 119359 kolonniin ja eluoidaan siitä käyttämällä klassisia menetelmiä, kuten kaotrooppia tai pH:n muuttamista. (LT-ck3 virtaa tämän kolonnin läpi.) Eluaatti neutraloidaan tai kaotrooppi poistetaan ja eluaatti johdetaan sitten TNF-R-5 kolonnin läpi, joka sitoo vain LT-a2/fil-trimeerit. Tämän kolonnin läpi virranut tuote sisältää LT-S(n):ää ja LT-al/£2-trimeerejä.

Kummassakin tapauksessa puhtaat LT-0!l/S2-trimeerit voidaan erottaa LT-S:sta myöhemmällä geelisuodatuksella 10 ja/tai alalla tunnetuilla ioninvaihtokromatografiamenette-lyillä.

Heteromeeristen LT-a/fi-kompleksien eri muotoja voidaan vaihtoehtoisesti erottaa ja puhdistaa erilaisin tavanomaisin kromatografisin keinoin. Voi myös olla edullis-15 ta yhdistää sarja tavanomaisia puhdistusmenettelyjä yhteen edellä kuvatuista immuuniaffiniteettipuhdistustoimenpiteistä .

Anti-LT-fö-R-vasta-aineiden lähde

Ihmisen LT-LT-a/fi-reseptorin vastaisia polyklonaa-20 lisiä vasta-aineseerumeja valmistetaan tavanomaisin menetelmin injektoimalla eläimiin, kuten vuohiin, kaniineihin • · \V tai hiiriin ihonalaisesti ihmisen LT-fi-reseptori-Fc-fuu- ***** sioproteiinia (esimerkki 2) täydellisessä Freundin apuai- ·:**: neessa, mitä seuraa intraperitoneaalinen tai ihonalainen ·*·'; 25 tehosteinjektio täydellisessä Freundin apuaineessa. Poly- • · i*.t> klonaalisia, toivottuja, LT-fi-reseptorin vastaisia vasta- aineita sisältäviä antiseerumeja etsitään tavanomaisin • · · menettelyin.

. . Ihmisen LT-£-reseptori-Fc-fuusioproteiinin vastai- S S * 30 siä hiiren monoklonaalisia vasta-aineita (mAh) valmiste- • · *·;·* taan immunisoimalla RBF-hiiriä useaan kertaan intraperito- neaalisesti CHO-soluperäisellä rekombinantti-LT-fö-resepto- ·***; ri-Fc-fuusioproteiinilla (LT-fi-R-Fc) , joka on sidottu pro- • · · ,*. teiini A -Sepharose-helmiin, apuaineen poissa ollessa.

• · * *;**! 35 Eläimille annetaan lopuksi tehosteeksi liukoista LT-fi-R- • · · • ·· « i 20 119359

Fc:tä (sekä i.p. että i.v.), fuusioidaan pernasolut käyttämällä klassisia menettelyjä ja tutkitaan hybridoomat ELISA:lla [Ling et ai., J. Interferon and Cytokine Res. 15 (1995) 53 - 59]. Hybridoomista tutkitaan lisäksi niiden 5 kyky estää aktivoitujen - pinnan LT-al/iS2:a ilmentävien -II-23-hybridoomasolujen sitoutuminen LT-S-R-Fc:llä päällystettyihin maljoihin solupanorointimäärityksessä. Puhtaita mAb:ita valmistetaan IgG:n proteiini A -Sepharose-puhdistuksella hybridoomavi1je1mäsupernatanteista.

10 Erilaisia anti-LT-E-R-vasta-ainemuotoja voidaan valmistaa myös käyttämällä tavanomaisia yhdistelmä-DNA-menetelmiä [Winter ja Milstein, Nature 349 (1991) 293 - 299]. Voidaan esimerkiksi konstruoida "kimeerisiä" vasta-aineita, joissa on eläimen vasta-aineesta peräisin oleva 15 antigeenisitoutumisdomeeni kytkettynä ihmisen vakioaluee- seen [esimerkiksi Cabilly et ai., US-patenttijulkaisu 4 816 567; Morrison et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984) 6851 - 6855]. Kimeeriset vasta-aineet vähentävät havaittuja immunogeenisiä reaktioita, joita eläinten vas-20 ta-aineet aiheuttavat käytettyinä ihmisten hoidossa.

Lisäksi voidaan syntetisoida "humanisoituja rekom-*.V binanttivasta-aineita", jotka tunnistavat LT-S-R:n. Huma- φ ***** nisoidut vasta-aineet ovat kimeeroja, jotka käsittävät *ϊ**ϊ pääasiassa ihmisen IgG-sekvenssejä ja joihin on insertoitu j*·*: 25 spesifisestä antigeenisitoutumisesta vastuussa olevia alu- ·** eitä (esimerkiksi julkaisu WO 94/04 679) . Eläimet immuni- • βΦ soidaan toivotulla antigeenillä, eristetään vastaavat vas- ta-aineet ja poistetaan vaihtelevan alueen sekvenssien se . . osa, joka on vastuussa spesifisestä antigeenisitoutumises- • · · 30 ta. Eläinperäiset antigeenisitoutumisalueet kloonataan • · ·;·* sitten sopivaan kohtaan ihmisen vasta-ainegeeneihin, jois- • · • *.. ta on deletoitu antigeenisitoutumisalueet. Humanisoidut :***: vasta-aineet minimoivat heterologisten (lajien välisten) ··» sekvenssien käytön ihmisen vasta-aineissa ja aiheuttavat • · · 9 9 1 · • · · • ·· • · 21 119359 vähemmän todennäköisesti immuunireaktioita hoidon kohteessa.

Eri rekombinantti-anti-LT-B-R-vasta-aineryhmien konstruointi voidaan toteuttaa myös valmistamalla kimeeri-5 siä tai humanisoituja vasta-aineita, jotka käsittävät anti -LT-B-R:n vaihtelevia alueita ja ihmisen vakioalueita (CHI, CH2, CH3) , jotka on eristetty eri immunoglobulUniryhmistä. Voidaan esimerkiksi tuottaa anti-LT-B-R-IgM-vas-ta-aineita, joissa antigeenisitoutumisvalenssien määrää on 10 lisätty, yhdistelmä-DNA-menetelmin kloonaamalla antigeeni- sitoutumiskohta vektoreihin, jotka sisältävät ihmisen μ-ketjun vakioalueet [Arulanandam et ai., J. Exp. Med. 177 (1993) 1439 - 1450; Lane et ai., Eur. J. Immunol. 22 (1993) 2573 - 2578; Traunecker et ai.. Nature 339 (1989) 15 68 - 70].

Lisäksi voidaan käyttää tavanomaisia yhdistelmä-DNA-menetelmiä muuttamaan rekombinanttivasta-aineiden si-toutumisaffiniteetia antigeeneihinsa muuttamalla aminohap-poryhmiä antigeenisitoutumiskohtien läheisyydessä. Humani-20 soidun vasta-aineen antigeenisitoutumisaffiniteettia voi daan suurentaa molekyylimalleihin perustuvalla mutagenee- • 1 *,V silla [Queen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) "1! 10029 - 10033; WO 94/04 679].

"2: Voi olla toivottavaa suurentaa tai pienentää anti- ·1·1; 25 LT-B-R-Ab:iden affiniteettia LT-B~R:ään kohteena olevasta • 1 kudostyypistä tai kulloinkin ajateltavasta hoito-ohjelmas- ,···. ta riippuen. Semiprofylaktisten hoitojen yhteydessä voi • · » esimerkiksi olla edullista hoitaa potilasta vakiopitoi-.. suuksilla anti-LT-LT-a/B-R-Ab:itä, joilla heikennetty kyky • ti ;.2 30 lähettää LT-B-tapahtumasarjan läpi kulkevia viestejä. Vas- • · *·;·1 taavasti anti-LT-B-R-Ab:t, joilla on suurennettu affini- teetti LT-B-R:iin, voivat olla edullisia lyhytaikaisessa, ·2'; kasvaimeen kohdennettavissa hoidoissa.

··1 • · • · · • ♦ · · • · · • ·· 2 • · 22 119359

Anti-LT-fi-R-vasta-aineiden tutkiminen LT-fi-R:eja aktivoivien aineiden löytämiseksi Tämän keksinnön mukaiset anti-LT-fi-R-vasta-aineet voivat vahvistaa heteromeeristen LT-a/fi-kompleksien (edul-5 lisesti LT-al/fi2-kompleksien) kasvaintenvastaista aktiivisuutta LT-fi-R:eja aktivoivan aineen, kuten IFN-7:n, läsnä ollessa. Näitä anti-LT-fi-R-vasta-aineita kutsutaan tässä myös LT-S-R:eja aktivoiviksi aineiksi. Vasta-aineita, jotka toimivat LT-£-R:eja aktivoivina aineina, valikoidaan 10 seuraavasti: 1) Sarjaa kasvainsoluja, kuten HT29-soluja, sisältäviä kudosviljelysyvennyksiä, kasvatetaan 3-4 päivää alustassa, joka sisältää LT-S-R:eja aktivoivaa ainetta, kuten IFN-7:aa, ja puhdistettua heteromeerista LT-α/β- 15 kompleksia - edullisesti LT-al/fi2:a - testattavasta anti- LT-fi-R-Ab:sta valmistetun laimennussarjan läsnä tai poissa ollessa; 2) lisätään soluseokseen eläviä soluja värjäävää, mitokondrioiden toimintaa mittaavaa ainetta, kuten MTT:tä 20 ja annetaan reagoida muutamia tunteja; 3) kussakin syvennyksessä olevan seoksen optinen • · · ’·'·* tiheys mitataan aallonpituudella 550 nm (OD 550) . OD 550 » *** · on käänteisesti verrannollinen heteromeerisen LT-a/S-komp- "**· leksin, LT-fi-R:eja aktivoivan aineen ja testattavan anti- 25 LT-fi-R-Ab:n läsnä ollessa kuolleiden kasvainsolujen luku- ·**.. määrään kussakin syvennyksessä.

·*:*. Edullisiin tämän keksinnön mukaisiin vasta-ainei- • · · siin, jotka toimivat yksinään LT-fi-R:eja aktivoivina ai- neina LT-οί/β-.η ja IFN-7*.n läsnä ollessa, kuuluvat anti-LT- M 30 fi-R-mAb:t BKA11, CDH10, BHA10 ja BCG6 (taulukko 2, infra).

• · • · *** Anti-LT-fi-R-vasta-aineiden ristisitominen «f • *·· Tämän keksinnön mukaiset ristisidotut anti-LT-fi-R- vasta-aineet toimivat yksinään LT-fi-R:eja aktivoivina ai-neina ilman ulkopuolisia heteromeerisia LT-a/fi-komplekseja • · t ! 35 toisen LT-fi-R:eja aktivoivan aineen, kuten IFN-7:n, läsnä • ·* • · 23 119359 ollessa. Ristisidotut anti-LT-15-R-Ab:t sitoutuvat ilmeisesti solupinnan LT-S-reseptoreihin ja indusoivat niiden yhteenkerääntymisen ja aktivoivat siten LT-6-reseptorivä-litteisen kohdennetun solukuoleman.

5 Yhdessä suoritusmuodossa ristisidotaan yhtä tai useampaa anti-LT-fi-R-vasta-ainetyyppiä immobilisoimalla ne veteen liukenemattomalle matriksille tai pinnalle. Deriva-tisointi bifunktionaalisella aineella on käyttökelpoinen keino vasta-aineiden ristisitomiseksi veteen liukenemat-10 tomaan matriksiin tai pintaan. Aineisiin, joita käytetään yleisesti saamaan aikaan vasta-aineiden sitoutuminen veteen liukenemattomaan matriksiin tai pintaan, kuuluvat l,1-bis-(diatsoasetyyli)-2-fenyylietaani, glutyyrialdehy-di, N-hydroksisuksinamidiesterit, mukaan luettuina 4-atsi-15 dosalisyylihapon kanssa muodostetut esterit, homodifunk-tionaaliset imidoesterit, mukaan luettuina disuksinimidyy-liesterit, ja bifunktionaaliset maleimidit, kuten bis-N-maleimido-1,8-oktaani. Sellaiset derivatisointiaineet kuin metyyli-3-[(p-atsidofenyyli)ditio]propioimidaatti,muodos-20 tavat valolla aktivoitavissa olevia välituotteita, joita voidaan ristisitoa selektiivisesti valolla stimuloituina.

• 4 • « t *·*·* Reaktiivisia veteen liukenemattomia matrikseja, kuten sya- * *!"· nogeenibromidilla aktivoituja hiilihydraatteja ja US-pa- **'" tenttijulkaisuissa 3 959 080; 3' 969 287; 3 691 016; 25 4 195 128; 4 247 642; 4 229 537; 4 055 635 ja 4 330 440 kuvattuja substraatteja voidaan myös käyttää proteiinien immobi li sointi in ja ristisitomiseen.

9

Pinnat, joihin vasta-aineet liitetään, voivat olla t*t*m ei-proteiinipolymeeriä, tavallisesti hydrofiilistä luon- • 4 · I.; 30 non- tai synteettistä polymeeriä. Hydrofiilisiä vinyylipo- ”·* lymeerejä, kuten polyvinyylialkoholia (PVAL) ja polyvinyy- ·· • *.· lipyrrolidonia (PVP) voidaan käyttää. Käyttökelpoisia ovat myös polyalkeenieetterit, kuten polyeteeniglykoli, poly-propeeniglykoli, poluoksieteeniesterit tai metoksipoly- • · · \ 35 eteeniglykoli, polyoksialkeenit, kuten polyoksieteeni ja • · t • #· « § 24 119359 polyoksipropeeni, ja oksieteenin ja oksipropeenin lohkopo-lymeerit (Pluronics); polymetakrylaatit; karbomeerit, haarautuneet tai suoraketjuiset polysakkaridit, jotka käsittävät sakkaridimonomeereina D-mannoosia, D- ja L-galaktoo-5 siä, fukoosia, fruktoosia, D-ksyloosia, L-arabinoosia, D-glukuronihappoa, sialiinihappoa, D-galakturonihappoa, D-mannuronihappoa (esimerkiksi polymannuronihappoa tai al-giinihappoa), D-glukosamiinia, D-galaktosamiinia, D-glu-koosia ja neuramiinihappoa, mukaan luettuina homopolysak-10 karidit ja heteropolysakkaridit, kuten laktoosin amylopek-tiini, tärkkelys, hydroksietyylitärkkelys, amyloosi, deks-traanisulfaatti, dekstraani, dekstriinit, glykogeeni tai happamien mukopolysakkaridien, esimerkiksi hyaluronihapon, polysakkaridialayksikkö; sokerialkoholien polymeerit, ku-15 ten polysorbitoli ja polymannitoli; hepariini tai heparo-ni .

Polymeeri on ennen ristisitomista edullisesti vesiliukoinen ja sisältää edullisesti vain yhden yksinään reagoivan kemiallisen ryhmän, jotta vältetään useat ristiti-20 toutumistapahtumat vasta-aineen kanssa. Reaktio-olosuhteet tulisi joka tapauksessa optimoida ristisitoutumisen vähen- • · ♦ *·1.1 tämiseksi ja sellaisten tuotteiden saamiseksi talteen, m ’·"· joko suoraan tai myöhemmän geelisuodatus- tai kromatogra- *·"· fiatoimenpiteen kautta, joiden molekyylimassa-alue on :1·1! 25 olennaisen homogeeninen. Ristisidotun vasta-ainematriksin ·1·.. optimaalinen molekyylimassa määritetään rutiinikokein käy- .1#1. ttämällä tässä esitettyjä sytotoksisuus- ja reseptorisi- toutumismäärityksiä.

Lopullinen konjugaatti on ristisitomisen jälkeen • ♦ · Σ.1 30 edullisesti fysiologisiin nesteisiin, kuten vereen, liuke- • · • · "1 neva. Polymeeri ei saisi olla voimakkaasti immunogeeninen *· • '·· konjugaattimuodossa, ja sillä tulisi olla laskimonsisäisen !1": infusoinnin tai injektoinnin kannalta sopiva viskositeet- ti, jos jompi kumpi näistä on aiottu antotapa.

* · « • · · • · · • ·♦ • · 25 119359

Polymeeri voi olla myös veteen liukenematon. Materiaaleihin, joita voidaan käyttää, kuuluvat hydrofiiliset geelit tai muotokappaleet, joissa on pintoja, joihin vasta-aineet voidaan immobilisoida, kuten kirurgiset letkut, 5 katetrit tai poistokanavat. On edullista käyttää kiinteitä tukimateriaaleja, jotka ovat biologisesti yhteensopivia ja olennaisen inerttejä fysiologisessa ympäristössä. Materiaali on biologisesti yhteensopiva, ellei se stimuloi olennaisesti immuunireaktioita, mukaan luettuna tulehdus, tai 10 vedä puoleensa fibroottisia soluja kohteen elimistöön sijoitettuna.

Anti-LT-fi-R-Ab:itä voidaan immobilisoida myös pinnoille, jotka on päällystetty kovalenttisesti tai ei-kova-lenttisesti sekundaarisilla vasta-aineilla, jotka sitoutu-15 vat primaarisiin anti-LT-fi-R-Ab:isiin (esimerkiksi vuohen anti-hiiri-IgG-vasta-aineet; katso esimerkki 7) . Kukin yksittäin testattu anti-LT-fi-R-mAb toimii sekundaarisia vasta-aineita sisältävälle pinnalle immobilisoituna LT-fi-R:eja aktivoivana aineena IFN-7:n läsnä ollessa (kuviot 4 20 ja 7) .

Yhdessä vaihtoehtoisessa suoritusmuodossa liuokses- • t \V sa olevat ristisidotut anti-LT-fi-R-Ab:t toimivat LT-β- "**J R:eja aktivoivina aineina. Anti-LT-fi-R-Ab:itä voidaan ris- *ί**ϊ tisitoa anti-LT-fi-R-Ab: itä (tai -mAbrita) ristisitovalla j*·*; 25 aineella. Tämän keksinnön mukainen anti-LT-fi-R-Ab:itä (tai • · * -mAb:ita) ristisitova aine on mikä tahansa aine, jolla on kyky joko kytkeä kovalenttisesti tai aggregoida ei-kova- * lenttisesti anti-LT-fi-R-Ab:itä (tai -mAb:ita) liuoksessa, .. niin että ristisidotut anti-LT-fi-R-Ab:t (tai -mAb:t) voi- • * t • · t 3 0 vat sitoutua kohdesolun pinnan LT-fi-reseptoreihin ja edis- • ♦ ’·;·* tää niiden yhteenkerääntymistä. Mainitunlaisiin anti-LT-fi- j ·.. R-Ab:ita (tai -mAbtita) ristisitoviin aineisiin kuuluvat, j*"· mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, kemialliset risti- sitomisaineet, jotka voidaan edellä kuvatulla tavalla • · # •*. 35 saattaa kontrolloidusti reagoimaan vasta-aineiden kanssa.

• · ♦ • ·♦ • · 26 119359

Anti-LT-S-R-Ab-agglomeraattien muodostamiseen liuoksessa voidaan vaihtoehtoisesti käyttää sekundaarisia vasta-aineita, Sepharose A:ta, Fc-reseptoreja tai muita aineita, jotka sitoutuvat useisiin primaarisiin anti-LT-S-R-5 Ab:isiin ja aggregoivat niitä aktiivisuutta estämättä.

Liuoksessa olevat useat anti-LT-B-R-Ab:t toimivat LT-fi-R:eja aktivoivina aineina Tämä keksintö tarjoaa käyttöön koostumuksia, jotka käsittävät useita anti-LT-fi-R-Ab:itä liuoksessa ja toimi-10 vat LT~£-R:eja aktivoivina aineina tehostamalla pinnan LT-S-R:ien yhteenkerääntymistä. Polyklonaalisia anti-LT-lS-R-Ab:ita, jotka ovat LT-fi-R:n eri epitooppien vastaisia, voidaan käyttää. Anti-LT-fi-R-Ab:t ovat edullisesti mono-klonaalisia Ab:itä, joiden kohteena ovat LT-iS-R:n eri epi-15 toopit, jotka eivät ole päällekkäisiä.

Ratkaisu, jossa käytetään anti-LT-fi-R-mAb-yhdistel-mää LT-fi-reseptorien aktivointiin, vaatii kahden ei-pääl-lekkäisen epitoopin yhdistymistä. Lisäksi on todennäköistä, että tuloksiin johtava reseptorien aggregaatio saavu-20 tetaan vain tietyillä epitoopeilla. Olemme todenneet ainakin neljän ainutlaatuisen immuunireaktiivisen LT-6-R-epi-\V toopin läsnäolon. Lisää epitooppeja (uusien mAb:iden avul- *·**· la määritettäviä) saatetaan identifioida jatkettaessa im- * *ϊ"ί munisoidun hiiren pernasolujen fuusiointia, immunisoimalla 25 eri eläinlajeja ja käyttämällä erilaisia immunisointitapo- ϊ*. ja.

«

Epitooppeja voidaan kartoittaa myös suoraan tutki-maila erilaisten mAb:iden kykyä kilpailla keskenään sitou-S· tumisesta LT-fi-R:iin käyttämällä Biacore-kromatografiame- * · Φ l.l 30 netelmiä [Pharmacia BIAtechnology Handbook, Epitope m ' ·

Mapping, toukokuu 1994, osa 6.3.2; katso myös Johne et : ai., J. Immunol. Methods 160 (1993) 191 - 198], Γ": Yksittäiset LT-S-R-mAb:t voidaan luokitella ainakin

• M

neljään ryhmään sen perusteella, millainen kyky niillä on • · · I *. 35 toimia yhdessä muiden LT-S-R-mAb:iden kanssa kasvainsolu- • · « • ·· • · 27 1 1 9359 jen tappamiseksi sytolyysimäärityksissä (esimerkki 8; taulukko 1). Esimerkiksi ryhmään I kuuluva mAb BDA8 ei toimi yhdessä ryhmän I mAb:n AGH1 kanssa kasvainsolusytotoksi-suutta edistävällä tavalla. Samoin ryhmän III mAb:t BKA11 5 ja CDH10 eivät toimi yhteistyössä kasvainsolusytotoksi-suusmäärityksessä.

Kuvio 5A - 5C esittää vaikutuksia, joita saatiin antamalla anti-LT-fi-R-mAb:iden edustajia yksinään ja pareittain yhdistettyinä kasvainsoluille sytotoksisuusmääri-10 tyksissä ΙΡΝ-γ:η ollessa läsnä LT-£-R:eja aktivoinava aineena. Ryhmän IV anti-LT-S-R-mAb:11a CBE li oli yksinään käytettynä lievä sytotoksinen vaikutus, jotka voimistui käytettäessä ainetta yhdessä ryhmän II mAb:n BHA10 kanssa (kuvio 5A). CBE11 saa aikaan vastaavan vaikutuksen yhdessä 15 ryhmän III mAb:n CDH10 kanssa (kuvio 5B).

Sytotoksisuus, jonka aiheuttaa liuoksessa olevan anti-LT-fi-R-mAb:iden yhdistelmän antaminen, ei ole ominaista vain kasvainsolulinjalle HT29. Kuvio 5C osoittaa, että ryhmän I mAb AGH1 ja ryhmän III mAb CDH10 toimivat 20 synergistisesti kahden erilaisen, ihmisen adenokarsinooma-kasvaimista peräisin olevan kasvainsolulinjan (HT29- ja • · · .*.* WiDr-solut) tappamisessa.

*** * Yhteenveto anti-LT-fi-R-mAb:iden ominaispiirteistä

Kaikki tämän keksinnön mukaiset anti-LT-6-R-mAb: t Jv: 25 toimivat immobilisäätiöila ristisidottuina LT-6-R:eja ak- **·.. tivoivina aineina toisen LT-fi-R:eja aktivoivan aineen, a kuten IFN-γ:n, läsnä ollessa. Anti-LT-6-R-mAb:iden kyky toimia LT-fi-R:eja aktivoivina aineina liuoksessa LT-#·#·# α1/β2:η läsnä tai poissa ollessa vaihtelee usein sen mu- • f » 1,1 30 kaan, missä tilassa solut ovat testaushetkellä. Taulukossa • · • · "· 2, infra, esitetään yhteenveto tämän keksinnön yhteydessä • e • *·· karakterisoitujen anti-LT-fi-R-mAb:iden ominaisuuksista.

Ryhmän I mAb:t BDA8 ja AGH1 eivät toimi LT-S-R:eja aktivoivina aineina LT-al/fi2:a sisältävässä liuoksessa.

• t · 1*. 35 Itse asiassa mAb BDA8 estää LT-al/fi2:n kasvaintenvastaista « · · • H • « 1 1 9359 28 vaikutusta (kuvio 3B ja taulukko 2). Sen sijaan ryhmän II anti-LT-S-R-mAb:ilia BCG6 ja ΒΗΆ10 on agonistis-antagonis-tisia sekavaikutuksia annettuina yhdessä LT-al/S2:n kanssa. Ryhmän III anti-LT-fi-R-mAb:t BKA11 ja CDH10 ovat ai-5 nutlaatuisia siinä suhteessa, että niillä on kyky toimia LT-£-R:eja aktivoivina aineina, jotka voimistavat kasvain-tenvastaisia vaikutuksia LT-al/fi2:n ja toisen LT-J3-R:eja aktivoivan aineen, kuten IFN-7:n, läsnä ollessa, ilman että niillä on ryhmän II mAb:iden BCG6 ja BHA10 yhteydessä 10 usein havaittuja antagonistisia vaikutuksia.

On tärkeää pitää mielessä, että anti-LT-fi-R-mAb:iden luokittelu, joka perustuu niiden kykyyn toimia yhdessä kasvainsolusytolyysimäärityksissä, heijastaa sitä, että ne ovat vuorovaikutuksessa LT-S-R:n eri epitooppien 15 kanssa. Yhden ryhmän muodostavilla mAb:illa ei kuitenkaan ole välttämättä samaa sitoutumisaffiniteettia sukulaisepi-tooppeihinsa. Niinpä vaihtelevat tulokset, joita havaitaan verrattessa samaan ryhmään tai eri ryhmiin kuuluvien eri mAb:iden vaikutuksia, saattavat edustaa eroja sitoutumis-20 affiniteeteissa. Niinpä on mahdollista että voitaisiin eristää ryhmän I tai ryhmän IV mAb, jolla on suurempi si- » f ·

’·1.1 toutumisaffmiteetti LT-fi-R:iin ja joka toimisi ryhmän III

"1 5 mAb:iden tavoin LT-S-R:eja aktivoivana aineena ΙιΤ-0!ΐ/β2:η *"1! läsnä ollessa.

|2|: 25 Hybridoomasolulinjat tai niiden alakloonit, jotka tuottavat edellä kuvattuja anti-LT-fi-R-mAb:itä, on talle- • .1!1, tettu 12. tammikuuta 1995 the American Type Culture ' ·

Collectioniin (ATCC) (Rockville, MD) Budapestin sopimuksen • · • t t • « » • · ··· • 1 I · ' f · · • « • · • ·· * • · · • · • · • · * · • f ·

» t I

• · · • · · • ·· 2 • · 29 119359 ehtojen nukaisesti ja niille on annettu seuraavat ATOC-saantinumerot: Solulinja mAb:n nimi ATCC-saantimumero a) AG.Hl.5.1 AGH1 HB 11796 b) BD.A8.AB9 BDA8 HB 11798 5 C) BC.G6.AF5 BCG6 HB 11794 d) BH.A10 BHA10 HB 11795 e) BK.A11.AC10 BKA11 HB 11799 f) CB.E11.1 CBE11 HB 11793 g) CD.HIO.11 CDH10 HB 11797 10

Kaikki rajoitukset, jotka koskevat edellä mainittujen ATCC-tallenteiden yleistä saatavuutta, poistuvat peruuttamattomasti, kun tämän hakemuksen perusteella myönnetään patentti.

15 Monoklonaaliset anti-LT-H-R-IgM-vasta-aineet toimi vat LT-fi-R:eja aktivoivina aineina

Anti-LT-S-R-mAb:t, jotka käsittävät useamman kuin tavanomaiset kaksi IgG-antigeenisitoutumiskohtaa, toimivat myös liuoksessa solupinnan LT-S-R:eja ristisitovina ainei- 20 na ja kuuluvat siten tämän keksinnön mukaisen LT-fi-R:eja aktivoivan aineen määritelmän piiriin. Anti-LT-S-R-mAb:n • · c • * · *·*·* antigeenisitoutumiskohdat voidaan sijoittaa IgM-molekyy- leihin, joissa on 10 antigeenisitoutumiskohtaa, käyttämäl- lä tavanomaisia yhdistelmä-DNA- ja hybridoomamenetelmiä ί *t: 25 (esimerkki 12) .

·*·,. Vaihtoehtoisesti voidaan ottaa talteen kokonaisia • hiiren (tai muun eläimen) IgM-molekyylejä ja rikastaa nii-tä hybridoomafuusiomenetelmin yhden antigeenillä tehdyn immunisoinnin jälkeen. Yksi tapa tehdä rikastus IgM-mole- f t * 30 kyylien suhteen olisi immunisoida hiiriä, joilta puuttuu *" CD40-viestitys [Kawabe et ai., Immunity 1 (1994) 167 - • *·· 178; Xu et ai., Immunity 1 (1994) 423 - 431] . Nämä hiiret :[[[: eivät pysty tuottamaaan tehokkaasti IgG:itä, ja siksi nii- #*)·4 den antigeenivasteessa esiintyy suhteessa runsaammin IgM- • · · I *, 35 isotyyppejä.

• ·ί • · 30 119359

Anti-LT-fi-R-IgM-vasta-aineet pystyvät suuremman valenttisuutensa ansiosta tehokkaasti aggregoimaan LT-fi-R-molekyylejä kalvon tasossa ja tehostamaan siten LT-S-R-viestitystä verrattuna IgG-vastineisiinsa, joissa on kaksi 5 antigeenisitoutumiskohtaa. Dramaattinen esimerkki multiva-lenttisten vasta-aineiden suuremmasta tehosta reseptorien yhteenkerääntymisen suhteen ovat Fas-reseptorin vasta-aineet, joiden yhteydessä IgM-muoto on hyvin tehokas ja normaaleilla bivalenttisilla IgG:illä ei ole vaikutusta liu-10 oksessa [Yonihara ja Yonihara, J. Exp. Med. 169 (1989) 1747 - 1756; Alderson et ai., Int. Immunol. 6 (1994) 1799 - 1806].

Fas-reseptorin vastainen mAb apo-1 on vastaavasti IgG3-mAb. Tämä mAb on voimakas sytotoksinen aine, jonka 15 aggregoituminen suuremmiksi polyvalenttisiksi muodoiksi perustuu vain IgG3-alatyypeissä havaittaviin Fc-vuorovai-kutuksiin. Fc-alueen poistaminen johtaa F (ab) 2-muotoon, joka ei pysty liittymään suuremmiksi aggregaateiksi ja on inaktiivinen [Dhein et ai., J. Immunol. 149 (1992) 3166 -20 3173] . Niinpä ennustetaan analogisesti, että anti-LT-£-R- mAb:iden IgM-versiot ovat tehokkaita kasvaintenvastaisia • · » *·*.· aineita.

Anti-LT-fi-R-mAb:t inhiboivat kasvainten kasvua hii- rissa S \i 25 LT-£-R:eja ajtivoivan aineen, kuten anti-LT-fi-R- mAb:n, kyky inhiboida ihmisen kasvainsolujen kasvua in ·*!'· vitro (esimerkit 6 - 8 ja 13) voi olla osoitus antitumori- • · · mj f geenisestä aktiivisuudesta in vivo. Immuunikato (SCID) -hiirillä tehdyt kokeet osoittavat, että anti-LT-£-R-mAb ♦ · ♦ ··* 30 (CBE11) voi tehokkaasti estää ihmisen adenokarsinoomasolu- e e **· ja WiDr muodostamasta kasvainta (esimerkki 14, kuvio 6) .

• e • *·· WiDr-soluilla ihonalaisesti (s.c.) inokuloiduissa hiirissä t***! muodostuu mitattavissa olevia kasvaimia kahdessa viikossa.

···

Kun hiiriä hoidettiin i.p. mAb:11a CBE11 samanaikaisesti • · · I *. 35 s.c. tehdyn WiDr-soluinokuloinnin kanssa, kasvaimen kasvu I » · • f· « * 31 119359 estyi dramaattisesti (kuvio 6A) . Anti-LT-6-R-mAb:n CBE11 kasvaintenvastaista vaikutusta edisti IFN-Y:n lisääminen; CBE11 oli kuitenkin tehokasta jopa ilman ulkopuolista IFN-Y:aa. CBEll:ä + IFN-γ:aa saaneessa ryhmässä 7 eläintä 5 16:sta oli täysin kasvaimettornia, kun taas lopuissa eläimissä oli pieniä kyhmyjä, jotka eivät olleet edenneet 2 kuukauden kuluttua. Pelkällä CBEll:llä hoidetut hiiret olivat samanlaisia kuin ryhmän CBE11 + IFN-γ hiiret 30 päivän kuluttua. Pelkällä CBEllrllä hoidetuissa hiirissä 10 kehittyi kuitenkin lopulta hitaasti kasvavia kasvaimia. Tilastollisesti merkitseviä eroja havaittiin CBE11 (+/-IFN-γ) -ryhmien ja vertailuryhmien (fysiologinen suolaliuos, pelkkä IFN-γ ja vertailuvasta-aine anti-ihmis-LFA-3-mAb (1E6) + IFN-γ) välillä muttei vertailuryhmien kesken. 15 mAb:t 1E6 ja CBE11 ovat molemmat IgGl-vasta-aineita. mAb 1R6 peittää tehokkaasti kasvainsolut, muttei estä kasvaimen kasvua. Komplementtivälitteiset tai luontaisten tappa-solujen välittämät tapahtumat eivät siten ole ainoa pohja anti-LT-fö-R-mAb:n CBE11 kasvaintenvastaiselle aktiivisuu-20 delle.

mAb:n CBE11 tehokkuus kasvain kasvun inhiboinnissa • · ϊ.ϊ.ΐ in vivo ulkopuolisen IFN-γ:n poissa ollessa oli odottama- *:·*: tonta, sillä mitattavissa olevat LT-fi-R-pohjaiset sytotok- ····· siset vaikutukset olivat in vitro riippuvaisia IFN-γ:sta.

25 In vivo joko tapahtuu jonkin verran hiiren IFN-γ:n siirty- * · :·. mistä ihmisen IFN-Y-reseptoreille tai vaikuttamassa voi • · · .... olla muita mekanismeja.

• · *

Anti-LT-S-R-mAb CBE11 voi myös inhiboida hiiressä . . jo olevan kasvaimen kasvua (kuvio 6B) . Hiiriä inokuloitiin • · * '·*·* 30 s.c. ihmisen adenokarsinoomasoluilla WiDr päivänä 1 ja • · *.··* kasvainten annettiin kehittyä 15 päivää (esimerkki 14) .

·*·., Eläimissä, joita oli hoidettu i.p. pelkällä IFN-y:lla tai .***. vertailuvasta-aineella anti-ihmis~LFA-3-mAb (1E6) + IFN- • · • · · Y:lla, kasvainten koko jatkoi kasvuaan 7 viikkoa kestäneen * · *·*·* 35 kokeen ajan. Sen sijaan kasvaimet, joita hoidettiin anti- * · · • M • · 32 119359 LT-fi-R-mAb:11a CBEll (+ IFN-Y:lla tai yksinään), lakkasivat kasvamasta, ja kun oli annettu kolme CBE-vasta-ainein-jektiota kolmen viikon aikana, kasvainten kasvu oli pysähdyksissä vielä 49 päivän kuluttua inokuloinnista, jolloin 5 koe lopetettiin (kuvio 6B).

Nämä kokeet osoittavat, että anti-LT-iS-R-mAb, joka aktoivoi LT-S-R-viestitystä, voi estää tehokkaasti kasvaimen muodostumista varhaisvaiheissa ja myös estää myös kas-vainsolujen kasvun jatkumisen tumorigeneesin myöhemmissä 10 vaiheissa in vivo. Nämä kokeet osoittavat myös, että yhden LT-JS-R:eja aktivoivan aineen anto voi olla tehokasta kasvainten hoitamiseksi tai niiden etenemisen, vakavuuden tai vaikutusten vähentämiseksi sairastuneessa eläimessä.

Esimerkissä 14 kuvattuja menettelyjä voidaan käyt-15 tää sellaisten tämän keksinnön mukaisten LT-fi-R:eja aktivoivien aineiden identifiointiin, jotka toimivat yksinään tai yhdistelminä kasvainsolujen kasvua estävällä tavalla in vivo. Pidetään mahdollisena, että muilla LT-S-R:eja aktivoivilla aineilla - mukaan luettuina kasvainsolusyto-20 toksisuusmäärityksissä in vitro identifioidut aineet, niihin kuitenkaan rajoittumatta - voi olla samankaltaisia » · kasvaintenvastaisia vaikutuksia in vivo annettuina joko yksinään tai yhdistelminä eläimille tai ihmisille.

*:**: IFN-7:n ja muiden LT-fi-Rteja aktivoivien aineiden ·*·*: 2 5 käyttö • · ;*.φ> LT~fi-R:eja aktivoivan aineen, erityisesti IFN-γιη, läsnäolo edistää heteromeeristen LT-a/fi-kompleksien ja • · · ristisidottujen tai useiden anti-LT-fi-R-Ab:iden sytotoksi- . . siä vaikutuksia kasvainsoluihin. Ihmisen suolistoperäisten • · * • · · 3 0 adenokarsinoomasolujen (HT29-solujen) on aiemmin osoitettu '···* olevan herkkiä FasR-viestitykselle [Yonehara ja Yonehara, J. Exp. Med. 169 (1989)] ja TNF: lie ja LT-ceille IFN-7:n läsnä ollessa [Browning et ai., J. Immunol. 143 (1989) « · · 1859 - 1867] .

• · · • · * • · « · • • ·· • · 33 1 1 9359 LT-S-R:eja aktivoivan aineen määrä, joka tarvitaan edistämään heteromeeristen LT-a/fi-kompleksien, anti-LT-β-R-Ab:iden tai muiden tämän keksinnön mukaisten LT-fi-R:eja aktivoivien aineiden kasvaintenvastaista aktiivisuutta, 5 riippuu hoidon kohteena olevasta solu- tai kudostyypistä ja myös hoitotavasta, ja se voidaan määrittää empiirisesti rutiinimenettelyin. LT-S-R-.eja aktivoivaa ainetta voidaan antaa sellaiseksi pitoisuudeksi tai sellaisella nopeudella, jonka on määritetty olevan tehokas annettujen muiden 10 LT-fö-R:eja aktivoivien aineiden yhteydessä, ottaen huomioon edellä luetellut tekijät.

Vaihtoehtoisesti voidaan turvautua endogeenisiin LT-β-R:eja aktivoiviin aineisiin, kuten IFN-y:n kaltaisiin interferoneihin, joita kohteena olevia kasvainsoluja ympä-15 röivät solut tai kudokset saattavat tuottaa. Endogeenista IFN-y:aa syntyy normaalisti virusinfektion yhteydessä, ja sitä esiintyy myös kasvainten läheisyydessä [Dinge et ai., Immunity 1 (1994) 447 - 456].

Mikä tahansa aine, jolla on kyky indusoida interfe-20 roneja, edullisesti IFN-7:aa, ja joka vahvistaa heteromeeristen LT-a/fi-kompleksien ja anti-LT-fi-R-mAb:iden sytotok- • * S,V sisia vaikutuksia kasvainsoluihin, kuuluu tämän keksinnön ·:**: mukaisten LT-fi-R:eja aktivoivien aineiden joukkoon. Samal- ·;··· la kun virusinfektio indusoi normaalisti IFN-y-tuotannon, 25 voivat muut tekijät suurentaa endogeenisia IFN-y-pitoi- • · :·. suuksia (esimerkki 10) . Kliiniset kokeet ovat osoittaneet • ** .···. esimerkiksi käsittelyn kaksisäikeisellä RNA: 11a (sdRNA) • · · indusoivan interferoneja. Niinpä polyriboguanyyli/polyri- , . bosytidyylihappo (poly-rG/rC) ja muut cdRNA-muodot ovat • · · 30 tehokkaita interferonien indusoijina [Juraskova et ai.,

Eur. J. Pharmacol. 221 (1992) 107 - 111].

**·.. Glycyrrhiza glabra -peräistä interferonistimulaat- .*··. toria [Acharaya et ai., Indian. J. Med. Res. 98 (1993) ··· 69 - 74] ja farmaseuttisia aineita, joista monet ovat an- • · · *·*·* 35 nettavissa suun kautta, voidaan myös käyttää endogeenisten * ♦ ♦ • ·· • · 34 1 1 9359 interferonipa, toisuuksien suurentamiseen. Mainitunlaisiin interferoni-indusoijiin kuuluvat Imiquimod [Bernstein et ai.. Antiviral Res. 20 (1994) 45 - 55]; saparaali [Paramo-nova et ai., Vopr. Virusol. 39 (1994) 131 - 134]; aryyli-5 pyrimidonit, kuten bropirimiini [Onishi ja Machida, Hinyo-kika Kiyo 40 (1994) 195 - 200], ja ridostiini [Cheknev et ai., Vopr. Virusol. 39 (1994) 125 - 128].

Muutamia näistä interferonia indusoivista aineista on karakterisoitu tyypin I interferonien kuten IFN-a:n 10 indusoijiksi. Tyypin I interferonit voivat myös toimia LT-S-R:eja aktivoivina aineina, mutta ovat vähemmän tehokkaita kuin ΙΡΝ-γ.

Hoidot, joissa käytetään LT-a/fi-komplekseja ja LT-fi-R:eja aktivoivia aineita 15 Tämän keksinnön mukaisia koostumuksia annetaan vai kuttavana annoksena kulloisenkin kliinisen tilan hoitamiseksi. Ammattimiehen taitoihin kuuluu edullisen farmaseuttisen formulan ja terapeuttisesti vaikuttavan annostelun määrittäminen johonkin tiettyyn käyttöön ottaen huomioon 20 esimerkiksi potilaan kunto ja paino, toivotun hoidon kesto ja potilaan kyky sietää hoitoa.

• · ;,V Ihmiset pystyvät tyypillisesti kestämään korkein- *:**: taan 100 - 200 Mg/m2 TNF:a ennen vakavan toksisuuden ilme- ·:·*· nemistä [Schiller et ai., Cancer Res. 51 (1991) 1651 - j*.*. 25 1658] . Hiirissä alueella 1-5 ^g/hiiri olevat vuorokausi- • * Γ. annokset annettuina 5-104 yksikön kera ihmisen rekombinant- • «· * ti-IFN-y:aa aiheuttivat ihmisen primaarisen kasvaimen • · · taantumisen [Balkwill et ai., CIBA Foundation Symposium 1987; Havel1 et ai., J. Exp. Med. 167 (1988) 1067 - 1085].

• · · *;)·* 30 Käytettäessä perusteena TNF:n ja LT-a/fi:n suhteellista • ♦ *·*·* tehokkuutta HT29-sytolyysimäärityksissä on terapeuttinen annosalue noin 5-25 μg/hiiri vuorokaudessa LT-a/S:aa.

•**'j Tehtäessä ekstrapolointi ihmismittakaavaan odotetaan, että ·♦· tarvitaan LT-a/iS-annostuksia, jotka ovat vähintään 1 mg/m2, • « · ***·) 35 LT-E-R:eja aktivoivien aineiden, kuten IFN~7:n yhteydessä.

· · • ·♦ • · 35 119359 ΙΡΝ-γ-hoito on historiallisesti toteutettu joko käyttämällä suurimpia siedettäviä annoksia, jotka ovat alueella 100 - 250 μg/m2, tai "immuunimoduloivia" pitoisuuksia, jotka ovat alueella 10 - 25 μg/m2 [katso esimer-5 kiksi Kopp et ai., J. Immunother. 13 (1993) 181 - 190].

Yhdistelmähoidoissa, joissa käytetään kahta interferonia, on käytetty 4-106 yksikköä/m2 IFN-a:aa ja noin 250 ^g/m2 IFN-γ:aa [Niederle et ai., Leuk. Lymphoma 9 (1993) 111 -119] . Välialueella olevien IFN-7-annosten, noin 25 - 100 10 ^g/m2, yhdistettyinä tässä kuvattuihin heteromeerisiin LT- α/β-komplekseihin tai puhdistettuihin anti-LT-fi-R-Ab:isiin odotetaan olevan sopivia lähtökohtia hoitoannosten optimoimiseksi .

Tämän keksinnön mukaisten heteromeeristen LT-α/β-15 kompleksien ja ristisidottujen anti-LT-fi-R-Ab:iden anto, mukaan luettuina vasta-aineiden tai kompleksien eristetyt ja puhdistetut muodot, niiden suolat tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät johdokset, voidaan toteuttaa käyttämällä mitä tahansa perinteisesti hyväksyttyjä tapoja kas-20 vaintenvastaisesti vaikuttavien aineiden antamiseksi.

Näissä hoidoissa käytettävät farmaseuttiset koostu- • · *.V mukset voivat myös olla monissa eri muodoissa. Niihin kuu- *ϊ'*ϊ luvat kiinteät, puolikiinteät ja nestemäisten annostelu- *:**: muodot, kuten tabletit, pillerit, pulverit, nestemäiset ·*·*· 25 liuokset tai suspensiot, peräpuikot ja injektio- ja infuu- • · j\tt sioliuokset. Edullinen muoto riippuu aiotusta antotavasta ja terapeuttisesta käyttötarkoituksesta. Antotapoihin voi- • · · vat kuulua oraalinen, parenteraalinen, ihonalainen, laski- . . monsisäinen, leesionsisäinen tai paikallinen anto.

• · · • · · 30 Heteromeeriset LT-oyfi-kompleksit, IFN-γ ja anti-LT- • » *···* β-R-Ab:t voidaan laittaa esimerkiksi steriileihin isotoni- siin formuloihin yhdessä vastaanottoa tai stabiiliutta ;***; parantavien kofaktorien kanssa tai ilman niitä. Formula on ··« edullisesti nestemäinen tai mahdollisesti kylmäkuivattu • · · 35 jauhe. LT-kompleksit ja/tai anti-LT-fi-R-Ab:t ja IFN-γ voi- • · ·

M

* · ,Ä 1 1 9359 36 daan esimerkiksi laimentaa formulointipuskurilla, joka käsittää 5,0 mg/ml sitruunahappomonohydraattia, 2,7 mg/ml trinatriumsitraattia, 41 mg/ml mannitolia, 1 mg/ml glysii-niä ja 1 mg/ml polysorbaatti 20:ä. Tämä liuos voidaan kyl-5 mäkuivata, säilyttää kylmässä ja sekoittaa ennen antoa steriiliin injektioveteen (Water-For-Injection, USP).

Koostumukset sisältävät edullisesti myös alalla hyvin tunnettuja tavanomaisia farmaseuttisesti hyväksyttäviä kantajia (katso esimerkiksi Remington's Pharmaceutical 10 Sciences, 16. p., Mac Publishing Company 1980). Mainitunlaisiin farmaseuttisesti hyväksyttäviin kantajiin voi kuulua muita lääkeaineita, kantajia, geneettisiä kantajia, apuaineita, täyteaineita jne., kuten ihmisen seerumialbu-miini tai plasmavalmisteet. Koostumukset ovat edullisesti 15 yksikköannoksen muodossa, ja niitä annetaan tavallisesti kerran tai useampia kertoja vuorokaudessa.

Tämän keksinnön mukaisia farmaseuttisia koostumuksia voidaan antaa myös käyttämällä mikrohelmiä, liposome-ja, muita mikrohiukkasantojärjestelmiä tai pitkitetysti 20 vapauttavia formuloita, jotka sijoitetaan sairauden kohteena olevaan kudokseen tai verenkiertoon, niiden lähelle • · :.V tai muuten yhteyteen niiden kanssa. Soveltuvia esimerkkejä *!**: pitkitetysti vapauttavista kantajista kuuluvat puoliläpäi- ·;·*: sevät polymeerimatriksit, jotka ovat muotokappaleiden, ·*·*. 25 kuten peräpuikkojen tai mikrokapseleiden, muodossa. Istu- • * tettavissa oleviin tai mikrokapseleiksi soveltuviin pitki- • * ,···. tetysti vaapauttaviin matrikseihin kuuluvat polylaktidit • t · (US-patenttijulkaisu 3 773 319; EP-hakemusjulkaisu , , 58 481), L-glutamiinihapon ja gamma-etyyli-L-glutamaatin · · **]·' 30 kopolymeerit [Sidman et ai., Biopolymers 22 (1985) 547 - • · *···* 556] , poly-2-hydroksietyylimetakrylaatti tai eteenivinyy- liasetatti [Langer et ai., J. Biomed. Mater. Res. 15 * ;···. (1981) 167 - 277; Langer, Chem. Tech. 12 (1982) 98 - 105] .

«·· ,*, Liposomeja, jotka sisältävät heteromeerisia LT-α/β- • * * *j*·* 35 komplekseja ja/tai anti-LT-fi-R-Ab: itä ja IFN~7:aa, voidaan • · · • ·· * · 37 119359 valmistaa hyvin tunnetuin menetelmin [katso esimerkiksi DE-hakemusjulkaisu 3 218 121; Epstein et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82 (1985) 3688 - 3692; Hwang et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77 (1980) 4030 - 4034; US-patentti-5 julkaisut 4 485 045 ja 4 544 545] . Liposomit ovat tavallisesti pientä [noin 20 - 80 nm (200 - 800 Ä)] unilamellaa-rista tyyppiä, jossa lipidisisällöstä yli noin 30 mol-% on kolesterolia. Kolesterolin osuus valitaan siten, että LT-kompleksin ja/tai anti-LT-S-R-Ab:iden ja ΙΡΝ-γ:η vapautu-10 misnopeus on optimaalinen.

Tämän keksinnön mukaisia heteromeerisia LT-α/β-komplekseja ja anti-LT-S-R-Ab:itä voidaan liittää myös liposomeihin, jotka sisältävät muita LT-S-R:eja aktivoivia aineita, kemoterapeuttisia aineita tai IFN-ytaa kasvainten 15 alueella tyypillisesti esiintyvän IFN-y:n täydennykseksi.

LT-a/fi-kompleksien ja anti-ΚΓ-β-R-Ab:iden liittäminen liposomeihin voidaan toteuttaa millä tahansa tunnetulla ris-tisitomisaineella, kuten heterobifunktionaalisilla risti-sitomisaineilla, joita on käytetty laajasti toksiinien tai 20 kemoterapeuttisten aineiden kytkemiseen vasta-aineisiin kohdennettua antoa varten. Kytkeminen liposomeihin voidaan • · ·,·.· tehdä myös käyttämällä hiilihydraattiohjautuvaa ristisito- ’!*'! misreagenssia 4-(4-maleimidofenyyli) voihappohydratsidi

·;··; (MPBH) [Duzgunes et ai., J. Cell. Biochem. Abst. Suppl 16E

25 (1992) 77] .

• · ' ' * • «

Anti-LT-B-R-aktivaatioon perustuvien terapeuttisten • * (·;·( koostumusten edut • · · LT-fi-R:ien aktivaatioon perustuvasta kasvaintenvas- , , täisestä hoidosta olisi muutamia etuja. LT-fi-R sitoutuu • · · *·]** 3 0 heteromeerisiin LT-a/fi-komplekseihin suurella affinitee- • · *···' tiliä β/β-välien kohdalla ja pienemmällä affiniteetilla θί/β-välien kohdalla, joita syntyy rinnakkaisten LT-a- ja LR-fi-alayksiköiden välisiin rajakohtiin. TNF-reseptorit ··· ,*, sen sijaan sitoutuvat heteromeerisiin LT-a/B-komplekseihin • · · Y*] 35 suurella affiniteetilla vain α/α-välien kohdalla. Niinpä • · · • · • · 38 1 1 9359 puhdistetut LT-al/£2-kompleksit sitoutuvat suurella affiniteetilla LT-fi-R:ihin rinnakkaisten LT-fi-alayksiköiden välistä, mutta niistä puuttuvat α/α-välit eivätkä ne siten ristiaktivoi TNF-reseptorien kautta tapahtuvaa viestitys-5 tä. Tämän keksinnön mukaiset heteromeeriset LT-a/S-komp-leksit eivät siten stimuloi TNF:iin liittyviä tulehdusreaktioita .

LT-a/fi:n anto ei aktivoi tulehdusreaktioon liittyviä endoteelisolumuutoksia suhteellisen suurinakaan pitoi-10 suuksina. Tästä syystä TNF:n yhteydessä havaittavien tu-lehdustapahtumasarjojen aktivoitumisen aiheuttamien sivuvaikutusten ei pitäisi olla ongelma käytettäessä näitä farmaseuttisia koostumuksia ja hoitomenetelmiä LT-fi-R:ien aktivointiin.

15 Ihmisen LT-al/fi2 sitoutuu hiiren LT-6-R:ihin suurin piirtein yhtä hyvin kuin ihmisen LT-fi-R:ihin. Injektoitu annos 100 /^g ihmisen LT-a/fi-:aa hiirtä kohden ei ole tappava (esimerkki 11), mikä viittaa siihen, että LT-B-R:ien stimulointi koko eläimessä ei johda näkyvään toksisuuteen, 20 joka havaittiin tehtäessä samanlaisia kokeita, joissa aktivaatio tehtiin FasR:ille tai TNF-R:ille p60.

• ♦ *,V Spesifisten monoklonaalisten anti-LT-£-R-vasta-ai- "**! neiden tai vasta-aineyhdistelmien käytöstä tämän tapahtu- ·;**: masarjan laukaisemiseen ihmisissä saattaa olla muutamia "·*· 25 etuja heteromeerisilla LT-a/S-komplekseilla tehtyyn hoi- • « toon nöhden. Antireseptorivasta-ainehoito on selektiivi-sempää kuin ligandihoito. Lisäksi anti-LT-S-R-mAb: iden • · · rekombinanttimuotoja olisi helpompi konstruoida ja tuottaa . , laajassa mitassa kuin liukoisia heteromeerisia LT-α/β- * * · *·|·* 30 komplekseja.

• · '···' Ajatellaan, että näitä mAbrita tai heteromeerisia LT-a/fi-komplekseja annettaisiin ihmisille, joilla on kas-vaimia, tavanomaisen kasvaintenvastaisen hoidon (ts. säde- ·*· hoidon ja kemoterapian) yhteydessä. Hoito, jossa yhdiste- • · · *;*·[ 35 tään LT-fi-R-aktivaatio tavanomaiseen kemoterapiaan, saat- • » i • M • · 39 119359 taa tarjota käyttöön kasvaintentappamisaktiivisuuslisäte-kijän, joka poistaisi tumorigeeniset solut potilaasta todennäköisemmin kuin tavanomainen kasvaintenvastainen hoito yksinään käytettynä.

5 Lisäksi on mahdollista, että tämä lähestymistapa aiheuttaa suhteellisen vähän sivuvaikutuksia ja sitä voitaisiin siten käyttää semiprofylaktisesti karsinoomata-pauksissa, jotka eivät ehkä ole muodostaneet etäpesäkkeitä, tai sellaisiin sukuihin kuuluville potilaille, jotka 10 ovat periytyvästi alttiita tietyntyyppiselle syövälle.

Seuraavaksi esitetään esimerkkejä, jotka valaisevat tämän keksinnön mukaisia heteromeerisia LT-a/6~komplekseja ja anti-LT-fi-R-mAb:itä ja niiden karakterisointiin käytettyjä menetelmiä. Näitä esimerkkejä ei tulisi ymmärtää ra-15 joittaviksi; esimerkit sisällytetään tähän asian valaisemiseksi, ja vain patenttivaatimukset rajoittavat tätä keksintöä .

Esimerkki 1

Bakuloviruksella infektoitujen hyönteissolujen LT-20 α/β-muotoja sisältävien supematanttien muodostami nen • · V,· Valmistettiin rekombinanttibakulovirus, joka kooda- *'*'ί si joko täyspitkää LT-aiaa tai LT-S:n erittynyttä muotoa, ·:··; kuvatulla tavalla [Crowe et ai., Science 264 (1994) 707 - ·*·*· 25 710] . Seerumiton SF 900-11 -alusta (Gibco) (7,2 1) inoku- • * loitiin high five -hyönteissoluilla (Invitrogen, San Diego, CA) , joita käytettiin 2-105 solua/ml. Viljelmän so- • · · lutiheys oli 48 tunnin kuluttua 1,8·106 solua/ml, ja se .. infektoitiin LT-fi:lla (150 ml; 3-108 PFU/ml) ja LT-a-baku- • · · • · · 30 lovirusvarastoviljelmillä (300 ml) . Viljelmälle tehtiin • ' · **j·* talteenotto kahden päivän kuluttua ja solu jät teet poistet- J %. tiin sentrifugoimalla. EDTA- ja PMSF-lisäyksen (loppupi- ;***; toisuudet 1 mmol/1 EDTAa ja 150 μιηοΐ/ΐ PMSF:ää) jälkeen «n selkeytetty supernatantti konsentroitiin 10-kertaiseen \\ 35 väkevyyteen ultrasuodatuksella, jossa käytettiin kierre-

• · J

• ·· • · 40 119359 patruunaa S1YM10 (Amicon). Konsentraatti jaettiin kuudeksi 120 ml:n annokseksi ja ne säilytettiin lämpötilassa -70 °C ennen puhdistusta.

Esimerkki 2 5 Liukoisten LT-fi-reseptorien valmistus immunoglobu- liini-Fc-kimeerana

Monistettiin LT-S-R:n solunulkoista domeenia kalvon läpäisevään alueeseen asti PCR:lla cDNA-kloonista lähtien käyttämällä alukkeita, jotka toivat NotI- ja Sall-restrik-10 tioentsyymikohdan 5'- ja vastaavasti 3'-päähän [Browning et ai., J. Immunol. 154 (1995) 33 - 46]. Amplifikaatiotuo-te pilkottiin NotI:llä ja Sallrllä, puhdistettiin ja liga-toitiin Notlrllä linearisoituun vektoriin pMDR901 yhdessä ihmisen IgGl:n Fc-aluetta koodaavan Sali-NotI-fragmentin 15 kanssa. Tuloksena oleva vektori sisälsi dihydrofolaatti-reduktaasigeenin ja LT-fi-R-Fc-kimeeran eri promoottorien ohjauksessa. Vektori siirrettiin elektroporaatiolla CHO dhfr -soluihin ja eristettiin metotreksaattiresistenttejä klooneja tavanomaisin menettelyin. LT-£-R-Fc erittyy alus-20 taan, ja kimeeristä proteiinia suurimpana pitoisuutena tuottavien solulinjojen valikointiin käytettiin ELISA-mää- • · *.V ritystä. Voimakkaasti tuottava solulinja kasvatettiin suu- *ί**ϊ rilukuiseksi ja otettiin talteen käsitelty alusta. Puhdas •j··: proteiini eristettiin Protein A Sepharose Fast Flow -affi- •Vj 25 niteettikromatografiällä.

!*. Esimerkki 3 t ·· LT-al/£2:n af f initeettipuhdistus käyttämällä TNF- f · · R:eja ja LT-£-R:eja . , Hartsien valmistamiseksi LT-muotojen reseptoriaffi- • « · **!♦* 30 niteettipuhdistusta varten immobilisoitiin puhdistettuja • · *···* LT-fi-R-Fc-valmisteita (kuvattu edellä esimerkissä 2) ja 9 j\. (TNF-R p60)-Fc-valmisteita [Crowe et ai., Science 264 ·**. (1994) 707 - 710] CNBr-Sepharoselle (Pharmacia) pitoisuu- ··» deksi 5 mg/ml hartsia noudattamalla olennaisilta osiltaan t t · *·’·[ 35 valmistajan ohjeita. Hartseilla tehtiin yksi eluointisykli • · · • «« 9 9 41 119359 ennen käyttöä. Annos (120 ml) SlYlO-konsentraattia johdettiin kahden peräkkäisen (TNF-R p60)-Fc-kolonnin läpi, jotka sitovat LT-oi:n ja LT-a2/fil:n. Läpi virrannut liuos, joka sisälsi LT-al/S2:a ja LT-£:aa, johdettiin LT-fi-R-Fc-5 kolonnin läpi. Kolonni huuhdottiin PBS:lla, 0,5 mol/1 NaCl:a sisältävällä PBS:lla ja PBS:lla (kutakin 5 kertaa kolonnin tilavuus) ja LT-a ja LT-a2/fil-kompleksit eluoi-tiin sitten liuoksella, joka sisälsi 25 mmol/1 natriumfos-faattia ja 100 mmol/1 NaCl:a, pH 3,5. Eluaattifraktiot 10 neutraloitiin välittömästi 1/20-kertaisella tilavuudella natriumfosfaattiliuosta (0,5 mol/1, pH 8,6) ja säilytettiin jäähauteella. Proteiinia sisältävät fraktiot identifioitiin absorbanssilla aallonpituudella 280 nm, huippuja vastaavat fraktiot yhdistettiin ja kolonneista saatujen 15 eluaattien yhdistelmät analysoitiin SDS-PAGE:lla tehden värjäys Coomassie Brilliant -sinisellä. Edellä kuvatun kaltainen eluointi antoi tulokseksi LT-a;l/fö2 :n, jonka puhtausaste oli yli 95 %.

Esimerkki 4 20 Puhdistettujen LT-al/£2-ligandien karakterisointi

Esimerkin 3 fraktioille tehtiin kokomääritys geeli- • · '.V eksluusiokromatografiällä sen määrittämiseksi, oliko muo- dostunut trimeerejä ja oliko läsnä aggregaatteja. BioRadin ·!··: geelisuodatusproteiinistandardin ja kolmen eri LT-trimee- ”·*· 25 rin, LT-of3:n, LT-ai261:n ja LT~oil£2:n, kokoerotteluun käy- e · J·.^ tettiin TSK G3000 sw x2 -kolonnia virtausnopeudella 0,5 ml/min. Kuvio IA osoittaa, että hyvin vähän, jos oi-lenkaan, LT-al/62-trimeerejä esiintyy molekyylimassaltaan . . suurina aggregaatteina. Vertaaminen kokostandardeihin

• S S

;.· 30 osoittaa, että kyseiset kolme muotoa ovat kaikki trimeeri- * · siä, ts. kooltaan noin 50 - 60 kDa. Olettaen tuotteen ole- Γ*.. van trimeeri puhdistetuissa LT-al/S2- ja LT-a2/6l-frakti- ·***· oissa vallitseva LT-a:n ja LT-fi:n välinen stoikiometria ··· määritettiin joko mittaamalla densitometrisesti Comaas- • · s 35 siellä värjätyt geelit tai tekemällä piikinkorkeusanalyysi • · · • ♦♦ • s 42 119359 saaduille kahdelle huipulle C4~käänteisfaasi-HPLC:llä tehdyn erotuksen jälkeen. Kumpikin mittaus vahvisti edellä kuvatuista affiniteettikolonneista eluoituneiden fraktioiden identiteetin.

5 Valmisteiden puhtaus määritettiin tarkemmin ionin- vaihtokromatografiällä käyttämällä BioCAD-laitteistoa LT-0fl/fi2:n ja LT-a2/fil:n pH-karttojen tekemiseen heikolla kationinvaihtohartsilla muutamilla eri puskurijärjestelmillä. Menetelmässä, jolla pystyttiin parhaiten pidättä-10 mään ja erottamaan nämä kolme trimeeriä puhtaina, käytettiin POROS CM (karboksimetyyli) -kolonnia virtausnopeudella 5 ml/min, puskuria, joka sisälsi 16,66 mmol/1 Mesiä, 16,66 mmol/1 Hepesiä ja 16,66 mmol/1 natriumasetaattia (pH 6,5), ja eluointia NaCl-gradientilia (1 mol/1) 20 ko-15 lonnin tilavuuden aikana. Kuvio IB esittää LT-al/fi2- ja LT-a2/fil-kompleksien BioCAD-kromatogrammeja. Kukin trimee-ri LT-0(3, LT-a2/fil ja LT-al/S2, eluoitui eri suolapitoisuudessa, eikä eri valmisteissa havaittu merkkejä risti-kontaminaatiosta, joka olisi suuruusluokaltaan yli 1 -20 2 %.

Esimerkki 5 • · V.* Ihmisen adenokarsinoomasolujen HT29 tappaminen liu- *ί' ί koisilla LT-al/lS2-komplekseilla ·:··: HT29-sytolyysimääritystä on kuvattu aiemmin [Brow- ·*·*. 25 ning ja Ribolini, J. Immunol. 143 (1989) 1859 - 1867].

!\## Tyypillisessä määrityksessä valmistettiin laimennussarja #*:\ LT-al/fi2:sta (ja soveltuvin osin muista sytokiineistä) ♦ · · tilavuuteen 0,05 ml 96-syvennyksiin maljoihin ja lisättiin .. 5000 trypsiinikäsiteltyä HT29-14-solua 0,05 ml:aan alus- • · · ♦ · · 30 taa, joka sisälsi 0 tai 80 yksikköä/ml (antiviraalista • s **j·* yksikköä) ihmisen IFN-y:aa. HT20-14-solut ovat peräisin j**.. alkuperäisen ATCC:stä saadun HT29-linjan homogeenisemmasta alakloonista. Määrityksissä käytettiin HT29-14-soluja;

• M

/, kaikki nämä tulokset on havaittavissa myös käytettäessä 35 alkuperäistä ATCC:stä saatua HT29-linjaa. Mitattiin 3-4 • · · • ·· • · 43 1 1 9359 päivän kuluttua MTT-värin pelkistyminen mitokondrioissa seuraavasti: Lisättiin 10 1 MTT:tä, liuotettiin 3 tunnin kuluttua pelkistynyt väri 0,09 mlraan isopropanolia, joka sisälsi 10 mmol/1 HCl:a, ja mitattiin OD aallonpituudella 5 550 nm. Tässä kuvatulla tavalla valmistettuja liukoisia reseptorimuotoja tai puhdasta ihmis-IgG:tä lisättiin tilavuuteen 10 μΐ ennen soluja, niin että loppupitoisuudeksi tuli 5 μ9/τη1.

Kuvio 2A esittää HT29-solujen kuolemista tehtäessä 10 käsittely anti-Fas-reseptori-mAb:11a ch-11 (joka stimuloi FasR-viestitystä); TNF:llä, LT-a3:llä, LT-al/£2- ja LT-a2/lfi-ligandeilla lFN-y:aan yhdistettyinä. LT-al/S2:lla käsiteltyjen solujen visuaalinen tarkastelu osoittaa, että tämä aine tappaa soluja eikä pelkästään estä solujen pro-15 liferaatiota. IFN-ym poissa ollessa ei havaita vaikutuksia, mikä heijastaa IFN-y:n epätavallista kykyä vaikuttaa siihen, miten solut tulkitsevat TNF-reseptoriryhmästä tulevia signaaleja. Interferonien a ja S teho oli sadasosa IFN~7:n tehosta antiviraalisina aktiivisuusyksiköinä mi-20 tattuna.

Kuvio 2B osoittaa, että liukoinen LT-6-R-Fc, muttei

• I

\V p60-TNF-R-Fc, inhiboi LT-orl/S2 :n tappavaa vaikutusta, mikä "*'! on osoitus siitä, että sytotoksisuus on LT-al/S2-spesifis- *:**: ta. p60-TNF-R-Fc:n inhiboimattomuus osoittaa, että epäpuh- ;*’** 25 tautena oleva LT-α (jota tiedetään olevan alle 1 %) ei voi * *' ·*. olla syynä LT-al/£2:n sytotoksiseen aktiivisuuteen.

*

Esimerkki 6 • · *

Anti-LT-fi-R-mAb: t tehostavat HT2 9-solujen tappamia- . ta LT-αΐ/β2-komplekseilla * · * 30 Tehtiin sytolyysimäärityksiä esimerkissä 5 kuvatul- { · *;·* la tavalla, paitsi että IFN-7:aa ja anti-LT-fi-R-mAb:itä j *.· (sarka 0,01 - 1 000 ng/ml) lisättiin soluihin kaksinker- täiseksi pitoisuudeksi lopulliseen nähden ja lisättiin ··· sitten 50 μΐ soluliuosta laimennettua LT-al/S2:a sisältä- • · · I*, 35 viin syvennyksiin. Kasvu määritettiin esimerkissä 5 kuva- • « « • M • · 44 1 1 9359 tulla tavalla. Kuvio 3 esittää kahden eri anti-LT-fö-R-mAb:n erilaista kykyä vahvistaa LT-al/fi2:n sytotoksista aktiivisuutta. Kuvio 3A osoittaa, että anti-LT-fi-R-mAb CDH10 vahvistaa LT-al/£2:n sytotoksista aktiivisuutta an-5 noksesta riippuvalla tavalla. Kuvio 3B esittää toisen an-ti-LT-S-R-mAbm, BDA8:n, vaikutukset samassa määrityksessä. mAb BDA8 inhiboi Ι/Γ-αΐ/β2:η sytotoksista aktiivisuutta kasvainsolukuoleman voimistamisen sijasta.

Esimerkki 7 10 Immobi li soidut anti-LT-g-R-mAb: t pystyvät tappamaan HT29-kasvainsoluj a

Anti-LT-fi-R-mAb:iden immobilisoimiseksi muovipinnalle päällystettiin 96-syvennyksiset kudosviljelymaljät 50 μ1:1ΐ3 seosta, joka sisälsi 10 μg/ml vuohen polyklonaa-15 lista anti-hiiri-Fc-vasta-ainetta (Jakcson ImmunoRese-arch), pestiin ja suojattiin seoksella, joka sisälsi 5 % FCS:a PBSrssa, minkä jälkeen seurasi asianomaisen anti-LT-fi-R-mAb:n sitominen ja toinen pesu. HT29-soluja siirros-tettiin mAb-päällystettyihin syvennyksiin ja tehtiin syto-20 lyysimäärityksiä esimerkissä 5 kuvatulla tavalla. Kuvio 4A valaisee immobilisoitujen anti-LT-fi-R-mAb:iden BDA8 ja * * V,: CDH10 sytotoksisia vaikutuksia HT29-soluihin. Kukin mAb *:*'! saa yksinään aikaan kasvainsolusytotoksisuuden pinnalle *:··· immobi li soituna. Kuvio 4B osoittaa, että samat anti-LT-β- ·’·*; 25 R-mAb:t BDA8 ja CDH10 testattuina yksinään liuoksessa ei- * · ϊ*. vät ole sytotoksia ja yksittäisen anti-LT-S-R-mAb:n syto- • * ,···, lyyttinen aktiivisuus in vitro näyttää olevan riippuvainen t · · sen immobilisoinnista.

. , Esimerkki 8 • · » 30 Liuoksessa olevien, eri epitooppien vastaisten an- • e **♦·' ti-LT-fi-R-mAbsiden yhdistelmä tappaa HT29-soluja :*·„ Tutkittiin HT29-solujen kasvua esimerkissä 5 kuva- ·“*; tulla tavalla, paitsi että kasvualustaan sisällytettiin ·«· joko yhtä tai kahta anti-LT-6-R-mAb:a. Taulukossa 1 esite- • s e *·*·* 35 tään havaitut vaikutukset HT29-soluihin, kun erilaisia • f ' • · t • ·· e e „ 119359 45 anti-LT-S-R-mAb:itä sisällytettiin liuokseen (ts. niitä ei immobilisoitu muoville). Anti-LT-6-R-mAb:t voidaan jakaa ryhmiin I - IV sen perusteella, millainen on niiden suhteellinen kyky toimia yhdessä toistensa kanssa HT29-syto-5 lyysimäarityksessä. Sytolyysimäärityksissä anti-LT-fi-R-mAbtille saadut tulokset ovat samansuuntaisia kuin resep-torisitoutumistulokset, mikä viittaa siihen, että kunkin eri ryhmän mAb:t tunnistavat LT~fi-R:ien eri epitooppeja.

10 Taulukko 1

Liukoisten anti-LT-S-R-mAb:iden yhdistelmät ovat sytotok-sisia ihmisen adenokarsoomasoluille HT29. Anti-LT-fi-R-mAb:t jaetaan ryhmiiin I, II, III ja IV sen perusteella, millaisia niiden vaikutukset ovat keskenään yhdistettyinä 15 HT29-solusytolyysimäärityksissä. Plussat osoittavat mAb- yhdistelmän HT29-soluihin kohdistuvien sytolyyttisten vaikutusten suhteellisen tason ΙΡΝ-γ:η (80 yksikköä/ml) läsnä ollessa, nr = ei merkitsevä; nd = ei määritetty

Toinen mAb

2 0 Ryhmä Ensimmäinen Ryhmä I Ryhmä II Ryhmä III Ryhmä IV

mAb BDA8 AGH1 BCG6 BHA10 BKA11 CDH10 CBE11 ·***. I BDA8 nr + ++ + nd nd • a · *. AGHl - nr ++ +++ ++ nd nd * II BCG6 ++ ++ nr - +++ nd nd t *”1ϊ 25 BHA10 ++ +++ - nr + +++ ++++ ·1»1· III BKA11 + ++ +++ nd nr - nd a · ·· CDH10 ++ ++ ++ +++ - nr +++ • · • · 2 IV CBE11 nd + + ++++ nd ++++ nr a·· 2 a a a a a a a 30 Kuviossa 5A - 5D esitetään kvantitatiivisesti vai- iV: kutukset, joita saadaan sisällyttämällä HT29-sytolyysimää- i***· ritykseen edustavina pareina yhteistyössä olevia anti-LT- a··

S-R-mAb:ita, jotka suuntautuvat LT-6-R:ien eri epitooppeja vastaan. Kuvio 5A esittää BHA10:n ja CBEll:n, kuvio 5B

• · '·;·1 3 5 CDH10;n ja CBEll:n ja kuvio 5C CDH10:n ja AGHl:n sytotok- :Vi sisia vaikutuksia yksinään ja yhdistelmänä. Kuvio 5D esit- tää mAb:iden CDH10 ja AGHl yhdistelmän sytotoksisia vaiku- 46 119359 tuksia eri kasvainsolulinjssa, josta käytetään nimitystä WiDr.

Taulukossa 2 esitetään yhteenveto tämän keksinnön mukaisten edustavien anti-LT-S-R-mAb:iden ominaisuuksista. 5

Taulukko 2

Yhteenveto hiiren anti-ihmis-LT-β-R-mAb:iden HT29-sytotok-sisuudesta mAk:n mAb: n Solujen Reseptori- Muoville Liukoi- Liukoi-10 ryhmä nimi värjäy- sitoutumi- immobili- nen mAb nen mAb tyminen1 sen estob soitu mAb' yksinään + LTalBl I BDA1 +++ +++ + +/-d estää I AGH1 +++ +++ +/- estää II BCG6 +++ ++ + +/- sekava!- 15 kutus II BHA10 +++ +++ + +/- sekavai- kutus III BKA11 +++ +/- + - vahvistaa III CDH10 +++ +/- + +/- vahvistaa 2 0 IV CBE11 +++ +++ + +/- ei vaiku tusta

Vertailunäytteet M0PC21 - - - ei vaiku- • · \V tusta *:·1: 25 HT29/26 - nd - ei vaiku- tusta • e ·· · TS 2/9e nd nd - ei vaiku- • e e * ·1 tusta e e ί " aLT-fi-R-transfektoitujen CHO-solujen FACS-värjäys e · e ·.1 · 30 ‘’Määrityksessä todettiin, estääkö vasta-aine liukoisen re septorin sitoutumisen aktivoituun T-soluhybridoomaan II-V.: 23; nd = ei tehty.

cHT-29-soluja kasvatettiin IFN-y;n läsnä ollessa menetel-mien yhteydessä määritellyillä, anti-LT-S-R-päällystetyil- e · · *... 35 lä maljoilla.

e 1 ·;2 dVaihteleva, joissakin määrityksissä osittainen inhibitio, • · ϊ.ϊ.ϊ joissakin ei vaikutuksia.

Anti-ihmis-LFA-3, hiiren IgGl.

2 f · 47 119359

Esimerkki 9

Turvautuminen endogeeniseen IFN-γ:aan kasvainsolu-jen käsittelyssä IFN-γ, yksi tämän keksinnön mukainen edullinen LT-5 15-R:eja aktivoiva aine, on sytokiini, jolla on kasvainten-vastainen aktiivisuus ja jota ihmiset sietävät. Kasvaimen ympäristössä saattaa olla endogeenista IFN-γ:aa niin suurina pitoisuuksina, että se toimii tämän keksinnön mukaisena LT-S-R:eja aktivoivana aineena ilman ulkopuolisen 10 IFN-γ:n lisäämistä. Kasvaimen läheisyydessä vallitseva IFN-y-pitoisuus voidaan mitata kasvaimen alueelta otetuista kudosnäytteistä käyttämällä tavanomaisia immuunikemial-lisia menetelmiä. Jos endogeeninen IFN-y-pitoisuus on riittävä suuri kasvaintenvastaisen aktiivisuuden aikaan-15 saamiseksi yhdessä tämän keksinnön mukaisten heteromeeris- ten LT-a/fi-kompleksien tai anti-LT-6-R-mAb:iden kanssa (määritettynä tässä kuvatuin sytolyysimäärityksin), ei IFN-γ:aa tarvitse antaa toisena LT-S-R:eja aktivoivana aineena tämän keksinnön mukaisissa koostumuksissa tai me-20 netelmissä.

Esimerkki 10 • · ·.·.· LT-S-R:eja aktivoivana aineena toimivan endogeeni- sen IFN-γ:n indusointi kasvainsolujen käsittelyssä ·;·*; Yhdisteet, jotka pystyvät indusoimaan interferoni- ·*·’; 25 en, kuten IFN-γ:n, endogeenisen tuotannon, kuuluvat tämän • m keksinnön mukaisten LT-S-R:eja aktivoivien aineiden jouk- • · * -* -1 koon. Interferoneja voidaan indusoida esimerkiksi käsitte- • · · lemällä kaksisäikeisillä RNA-molekyyleillä, kuten polyri-boguanyyli/polyribosytidyylihapolla (poly-G/C) .

*,; 30 C57/bl6-naarashiiriin (ikä 6-8 viikkoa) voidaan m · *·;·* injektoida 18 mg (600 mg/kg) D-galaktosamiinia, joka her- kistää hiiret TNF:n ja muiden kasvaintenvastaisten ainei- • :***; den vaikutuksille. Lisätään sarja eri poly-G/C-pitoisuuk- • « · .*. siä [Juraskova et ai., Eur. J. Pharmacol. 221 (1992) 107 - • * * *;*·, 35 111] neutraalissa fysiologisessa suolaliuoksessa puhdis- • · · • ·· • · 48 119359 tettuuun LT-al/fi2:een (10 - 100 μg) ja liuos annetaan hiirille itraperitoneaalisen injektiona (i.p.). Kaksisäikei-sen RNA:n poly-rG/rC läsnäolo lisää LT-al/fi2:n kasvainten-vastaista aktiivisuutta.

5 Samalla tavalla ihmisille voidaan antaa Glycyrrhiza glabra -kasvista peräisin olevaa interferonistimulaattoria [Acharaya et ai,, Indian. J. Med. Res. 98 (1993) 69 - 74] laskimonsisäisesti annoksina 40 - 100 ml/vuorokausi. Optimaalinen annos LT-fi-R:ien aktivoimiseksi joko heteromee-10 risten LT-a/fi-kompleksien tai anti-LT-S-R-Ab:iden läsnä ollessa voidaan määrittää empiirisesti, ja se riippuu sellaisista tekijöistä kuin kasvaimen tyyppi, antotapa ja annto-ohjelma.

Imiquimod R-837:ää [Bernstein et ai., Antiviral 15 Res. 20 (1994) 45 - 55]; saparaalia [Paramonova et ai.,

Vopr. Virusol. 39 (1994) 131 - 134]; bropirimiiniä [Onishi ja Machida, Hinyokika Kiyo 40 (1994) 195 - 200] tai ridos-tiiniä [Cheknev et ai., Vopr. Virusol, 39 (1994) 125 - 128] voidaan myös antaa LT-fi-R:eja aktivoiviksi aineiksi 20 heteromeeristen LT-a/S-kompleksien, anti-Ι/Γ-β-R-Ab: iden tai niiden yhdistelmän yhteydessä. Edulliset antotavat ja Φ m ·.·.1 optimaaliset annokset voidaan kussakin tapauksessa määrit- tää empiirisesti käyttämällä julkaistuja raportteja lähtö-·:·2: kohtana kliinisin rutiinimenettelyin tehtävälle optimoin- 25 nille.

• · :1. Esimerkki 11 • ·

Hiiret sietävät injektioina annettua ihmisen LT-ofl/fi2sa . . C57/bl6-naarashiiriin (ikä 6-8 viikkoa), joita • · 2 - , 30 oli totutettu laitokseen muutamia päiviä, injektoitiin • 1 *"·2 i.p. 18 mg (600 mg/kg) D-galaktosamiinia, joka herkistää j 1»» hiiret TNFrn ja muiden kasvaintenvastaisten aineiden vai- ;3: kutuksille. Sitten annettiin i.p. joko ihmisen TNF:ää, LT- ··· a:aa tai LT-Oil/152:a. Taulukossa 3 annetaan tiedot hoidet- • · · • · « • · e • · · 2

• M

3 • · 49 1 1 9359 tujen hiirten hengissäolosta 24 tunnin kuluttua injektoin-nista.

Taulukko 3 5 Aine Annos (/ig/eläin) Hengissäolo

Fysiologinen suolaliuos - 4/4 hu-TNF 0,2 0/6 hu-TNF 1,0 0/2 hu-TNF 10 0/4 10 hu-LT-a 0,2 2/2 hu-LT-a 1,0 2/2 hu-LT-al/fi2 10 2/2 hu-LT-al/62 100 2/2 15 Esimerkki 12

Monoklonaalisen rekombinantti-anti-LT-fi-R-IgM-vasta- aineen konstruointi Käyttämällä edellä kuvattuja kasvainsytotoksisuus-määrityksiä yhdistettyinä tavanomaisiin kasvaimen kasvu 20 immuunikatohiirissä -malleihin voidaan valikoida ominaisuuksiltaan sopiva anti-LT-fi-R-IgG. Yleisalukkeita, jotka • ♦ *,V hybridisoituvat valitun anti-LT-S-R-IgG:n raskaan ja ke- *:**: vyen ketjun kuhunkin vaihtelevaan domeeniin, voidaan käyt- »···* tää vaihtelevan domeenin DNA:n valmistamiseen RNA;sta, 25 joka on eristetty erittävästä hybridoomasolulinjasta, • « :·. käyttämällä tavanomaisia käänteistranskriptaasi/PCR-mene- I*:·. telmiä. Näitä menettelyjä on kuvattu kirjallisuudessa [Arulanandam et ai., J. Exp. Med. 177 (1993) 1439 - 1450; .. Lane et ai., Eur. J. Immunol. 22 (1993) 2573 - 2578; • · · *·.· 30 Traunecker et ai., Nature 339 (1989) 68 - 70] .

• · ’·;·* Amplifikaatiotuotteita sijoitetaan sitten vektorei- ·**.. hin, jotka sisältävät ihmisen μ-ketjun CH1-, CH2- ja CH3- • domeeneja. Näiden kahden ketjun rinnakkaisilmentäminen • ·ι yhdessä isännässä mahdollistaa raskaiden ja kevyiden ket- t · i 35 jujen kokoamisen pentameeriseksi IgM-molekyyliksi. Tämä 9 · · • 9 9 9 9 bo 1 1 9359 molekyyli on kimeera, joka koostuu hiiren vaihtelevista alueista kytkettyinä ihmisen vakioalueisiin.

Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää menetelmää, jossa PCR:llä monistetaan DNA:ta, joka koodaa vain vaihtelevien 5 alueiden varsinaisia sitoutumisalueita. Monistettu DNA insertoidaan sitten vektoreihin, jotka sisältävät kaikki ihmisen IgG-sekvenssit lukuun ottamatta varsinaisia anti-geenisitoutumiseen osallistuvia aminohappoja. Mainitunlaisia konstruktioita kutsutaan "humanisoiduiksi" vasta-ai-10 neiksi, yksityiskohtaiset menetelmät niiden valmistamiseksi ovat hyvin tunnettuja (esimerkiksi W0 94/04679) . Esimerkki 13

Monoklonaaliset anti-LT-fi-R-IgM-vasta-aineet toimivat LT-fi-R:eja aktivoivina aineina 15 Anti-LT-6-R-IgM-vasta-aineita voidaan valmistaa rekombinanttimuodossa esimerkissä 12 kuvatulla tavalla. Anti-LT-S-R-IgM-mAb: iden lähteenä voidaan vaihtoehtoisesti käyttää hiiren kokonais-IgM:iä, joita on eristetty hybri-doomafuusiomenetelmin käyttämällä normaalien hiirten pri-20 määri-immunisointia tai sellaisten hiirten laajaa immuni sointia, joilta puuttuu CD-viestitys [Kawabe et ai., ί,ϊ,ϊ Immunity 1 (1994) 167 - 178; Xu et ai., Immunity 1 (1994) ·:·*ί 423 - 431] .

·:··* Anti-LT-S-R-IgM-mAb:t ovat merkittävästi vahvempia 25 LT-fi-R:eja aktivoivina aineina kuin normaalit bivalentti- $ · ;·. set IgG-vastineensa mitattuna annos-vastevertailuin HT29- » ·* .·;·. sytolyysimäärityksessä IFN-ym läsnä ollessa. Anti-LT-fi-R- • * ·

IgM-mAb:t toimivat LT-E-R:eja aktivoivina aineina sekä , , immobilisoituina että annettuina liuoksessa. Lisäksi odo- • · · *·|·* 30 tamme, että ne edistävät heteromeeristen LT-a/fö-komplek- • · ’···* sien kasvaintenvastaista aktiivisuutta.

«« • ♦ • ♦· ··· • · • · ··» ♦ • · • · · • · · • * t · i * · • »· « · 51 1 1 9359

Esimerkki 14

Monoklonaaliset anti-LT-fi-R-IgM-vasta-aineet inhiboivat ihmisen kasvainsolujen kasvua SCID-hiirissä

Balb/c-SCID-hiiriin (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) 5 injektoitiin 1·Ι06 trypsiinikäsiteltyä ja pestyä ihmisen adenokarsinoomasolia WiDr 0,2 ml:ssa PBS:a ihonalaisesti (s.c.) eläimen selkään. Injektoidut WiDr-solut muodostavat kasvaimia hiirissä, ja seurattiin anti-LT-iä-R-mAb:n kykyä inhiboida kasvainten kasvua. Yhdessä koesarjassa hiiriä 10 hoidettiin käyttämällä tai käyttämättä anti-LT-S-R-mAb:a CBE 11 - joko yhdessä ihmisen IFN-7:n kanssa (1O6 antivi-raalista yksikköä/hiiri) tai ilman sitä - samanaikaisesti WiDr-soluilla s.c. tehdyn inokuloinnin kanssa (kuvio 6A). Vasta-aineita ja IFN~7:aa annettiin yksinään tai yhdessä 15 injektoimalla i.p. tilavuudessa 0,2 ml. Vertailuhiiriin injektoitiin pelkkää fysiologista suolaliuosta, pelkkää IFN-7:aa tai anti-ihmis-LFA-3-mAb-vertailuvasta-ainetta (1E6) IFN-7:n kera. Kunkin tuloksena olevan kasvaimen koko arvsteltiin 30 päivän kuluttua inokuloinnista. Kasvaimen 20 tilavuus (cm3) laskettiin säteestä, joka määritettiin tekemällä mittaus työntötulkilla kahdessa suunnassa. Eläimet, • · V.* joita hoidettiin mAbtiliä CBE11 tai 1E1, saivat vasta-ai- netta 10 ^g/hiiri tai 50 /ag/hiiri (kuvio 6A, pisteellä *"*: varustetut ympyrät ja vastaavasti avoimet ympyrät).

25 Toisessa koesarjassa hiiret inokuloitiin s.c. WiDr- • · soluilla ja kasvainten annettiin kasvaa 15 päivää, ennen • * kuin hiirille annettiin anti-LT-fi-R-mAb: a CBE11 (kuvio • · a 6B) . Päivänä 15 (ennen vasta-ainehoitoa) kasvaimen keski-määräinen tilavuus oli 0,076 cm3 ja keskimääräinen läpimit- • · · I.I 30 ta 0,53 cm. Sitten annettiin anti-LT-S-R-mAb:a CBE11 • a (50 μg) - joko yhdessä ihmisen IFN-7:n kanssa (10® antivi- aa J *·· raalista yksikköä/hiiri) tai ilman sitä - i .p.-injektiona tilavuudessa 0,2 ml 12 eläimen ryhmälle. Injektoinnit β·|·4 toistettiin vielä kolmesti 3 viikon aikana. Vertailuryh- • · a l \ 35 miin (12 hiirtä/ryhmä) injektoitiin pelkkää IFN~7:aa (10ö :Λ: 52 119359 antiviraalista yksikköä/hiiri) tai 50 /ig anti-ihmis-LFA-3-mAb-vertailuvasta-ainetta (1E6) ynnä IFN-7:aa (106 antiviraalista yksikköä/hiiri) . Arvioitiin päivänä 15 läsnä olevien kasvainten kasvu ajan funktiona aikavälillä 15 - 49 5 päivää kasvainsoluilla tehdyn inokuloinnin jälkeen. Kuviossa 6B esitetyt tulokset määritettiin sokkokokeena. Kasvaimet, joita käsiteltiin mAb:lla CBE11 IFN-γιη kera tai ilman sitä, lakkasivat kasvamasta. Kun kolmen viikon aikana oli injektoitu kolmesti mAb:a CBE11 (+/- IFN-γ), kas-10 vainten kasvu pysähtyi vähintään 7 viikoksi inokuloinnin jälkeen, minkä ajan kuluttua koe lopetettiin.

• 1 · • · t • · • · • 1 ·· · • · • · • · *· • · » 2 ·2 • · · * · · • · • 1 1 * · 1 • · • 1 1 • · • ·

• O

· • 1 • ·· ·♦1 • · • · ··· • « • · · • · 1 » · • · · • ·· 2 • · 119359 53

Applicants or »gents file a, 0- rT_ l International application No.

reierencenumber 018 3 Llr PLi I

INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM

(PCT Rule 13bd) Λ. The inotcauona mau ockiw relate to uie microorganism reterrati to in the description on page 2 8 , line S 18 2 6 — B. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Further ifcpaiu aw identified on an itMiiiwial sheet {ΓΙ Name ol depnaiiary institution

American Type Culture Collection

Address ol deposuarv iHMiiui«an ιμιμ^ηκ panet code mod cwwnn 12301 Parklawn Drive Rockville, Maryland 20852

United States of America '

Identification Reference by Depositor: Hvbridoma. CB.F11.1

Dale ol uepetu Acosuon Number 12 January 1995 (12.01.95) HB 11793 C. ADDITIONAL INDICATIONS lAamrnWifiwrappliMWirl This information is continued on an iiMMmial shear

In respect of the designation of the EPO,. samples of the deposited microorganisms will be made available until the publication of the mention of the grant of the European patent or until the date on which the application is refused or withdrawn or is deemed to be withdrawn, as provided in Rule 28(3) of the ..... Implementing Regulations under the EPC only bv the issue of a ·,·.· ^amDle^to^an^xoert^jTominate^bj^eaueste^J^ji^^J^JjjJjgj^^^ ···»· D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE fifthfmir) 0

*”*· EPO

00 · • · · 0 · • 0 00 • · V * E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS </«·* Mint «far nppfaaMri

Thn iaataimns luted below will be submitted lo the Imcmaitoasl Burau later |peo|yilu|tt«i eamrt^rteiedUu—ep. 'itnnm Nombtr of Dtf·ul 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Φ00 0 0 0 t 000 0 00 . - . ......

0 4 ^ ί ** r^——For receiving Office tu only ~ · For International Bureau uuualy — . * * * . Q This sheet wis rec*tved with the mtemauoiul application This staeat was received by the ImmauoaaJ Burau on; • 0· 0 0 I I _ - - —UM·.— tusiioiq m —

Authorized officer Authorized officer 0 0 • t 0*0 0 «0 0 0 _____ _ .

54 119359

Applicant a or agem i tile I International application No.

INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule Uitu) A. Tlie inatcatioiu nuoc ocutw rent· to me microorpnisni ict'enetl to in Uie tteacnpnon >n page _ . line S JL_8^2j^_^^__^^__^——_ .

B. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Further depoaua are nknuiicd on an additional thorn [X~] Name ol dcpouury initnuuun

American Type Culture Collection

Addrcutit aepoanarv mtutuiion i melodiat potut toit tod cauuryi 12301 Parklawn Drive Rockville, Maryland 20852 United States of America

Identification Reference by Depositor: Hybridoma, BC.G6.AF5

Date »I liepeen Acnaamn Number 12 January 1995 (12.01.95) HB 11794_ ati^^^^^ C. ADDITIONAL INDICATIONS lltaoooitattfoutppiittUtl Thia iaftwnalion g ennunaed on an ariditirutil abaet fifl

In respect of the designation of the EPO,. samples of the deposited microorganisms will be made available until the publication of the mention of the grant of the European patent or until the date on which the application is refused or withdrawn or is deemed to be withdrawn, as provided in Rule 28(3) of the , , Implementing Regulations under the EPC only bv the issue of a ! ! : <samole^oi^n_ie>igertBjiorninate^b^i^eoueste^^£yi(J(^^^^||j££M<fc^ . D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE Gfϋο iadiraaaat tnao for tU faa>i··! Jfiwl # # _ . . . ___________ _ — _—- ' ΓΜ - _ ·:**: epo ·· t • · · • · • 1 ♦ · • · • ·· ··· ...

! ί 1 E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS lleana blank if aatppHttbU

• ___ _

The indicmoiu luted below will ba lubmiltcii to the Inlamaliöääi Bureau later liputfflkagtowoiaaurtafjiaimhraouoop. ‘Atamtm Hooter of Oepam'\ • · • · · • · · • 1 ··· • ' · • ·

• II

• 1___'__ J For receiving OiTie1 we only - f—Far 010¾11 u»«only ———

• **i I I Thift sheet was received wtib the lAicmaUoiul ippticiuoa □ This sheet was r«c««ved by the tatenuuonsi Bureau on: I

J · ···

Authorized officer Auibonaed officer • · 1 • · · • · • ·· 1 1 9359 55

Applicant s or «gems file Diac ar>m ; IniemniuiuiippiiouonNo.

referencenmnoer_Bi-HS IIP g<-T_1 INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule libis) Λ. 'Die meicalioM nunc tcnw reiaie io me microorganism referred to m (be description nn page 28 . line 8 18 — 26 .

0. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Further deposits are identified on an addition»! »haet

Nam1 oi depositary insiiiunon

American Type Culture Collection

Address oi ucpoiiiarv iiuiuuuon imcuMiar penal reuMecevai»; 12301 Parklawn Drive Rockville, Maryland 20852 United States of America

Identification Reference by Depositor; Hybridoma, BH.A10_

Date m deposit Accession Number 12 January 1995 (12.01.95) HB 11795 C. ADDITIONAL INDICATIONS UanmaMifiiamppiinUct This infortnalion ia cnniinued on an additional ahant Ixl

In respect of the designation of the EPO, samples of the deposited microorganisms will be made available until the publication of the mention of the grant of the European patent or until the date on which the application is refused or withdrawn or is deemed to be withdrawn, as provided in Rule 28(3) of the implementing Regulations under the EPC only by the issue of a ·'·2· ^jmDlj^tt^ar^^xger^nominatedMa^recruestei^^gjjlJ^^^^^^g^^^^ D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE fifth» iirfiMaa»» are i^fr«adMpwHdflaii.t • ♦ »in - a·! n«. — I. Il 1 — nil

····· EPO

·· « • · e t · • 1 ·· 0 0 • ··

;2·1; E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS (leave hiMii/«oi2flror»hW

0 _ _______ _____—

Tb« iodiotioQi luted below will be ratnuud lo ibe IpkimmomI Bueesu liwtliyiofrrtcfiwui Mnw«»i

Nam+tr of Dep3 1) · ♦ · · • · · 2 • · 3 • · • ♦ *«· 0 ___· ‘ _____ ______ I ',· 11 Fpr receiving Office um only — "| r-1“ For intcnuuonal Bureau use only

□ This shoal was received with (he ipcernaugnaJ application) j j | This aheer was received by rbe JmernaucnaJ Bureau on; I

s · **· 0 ^^____ - - -

Authorized officer AuUonzed officer • 1 · • · • 0 0 0 0 • ____________ 119359 56

Applicant > or agent s file , lnlemaiionaiippi.cai.ouNo.

ret'CTmct numner 0103 t-lr I

INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCTRule 13i»u) Λ. The moicalioni nue Deiuw male to uie imaoorganum rciefrcd io in the dmaipuon ne page 28 , line S 18—26 .

0. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Further liepoua ire Kieuuficd oa <n additional «hast 5Π

Name oi (kpauury iniiitutivn

American Type Culture Collection

Addresi ul depositary institution m*imd$**poaiMeeä*4*ä cwmtryp 12301 Parklawn Orive Rockville, Maryland 20852 United States of America

Identification Reference by Depositor: Hybridoma, AG.HI.5.1

Dale m depotii I Aeeeaamn Number I

12 January 1995 (12.01.95) HB 11796 C. ADDITIONAL INDICATIONS tU***nkmkifmaiepft>tMK> Thia information a continued on an tJdilianal «beet fifl

In respect of the designation of the EPO, samples of the deposited microorganisms will be made available until the publication of the mention of the grant of the European patent or until the date on which the application is refused or withdrawn or is deemed to be withdrawn, as provided in Rule 28(3) of the . . Implementing Regulations under the EPC only bv the issue of a isam£leM>to_^n(«c£er^jioniinated_b^jreoueste]jr>^i^^^^^£^£g£^e ····; D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE fifthrinfeerinm err «»[brail Impi nrf Tint

*!**· EPO

V* · • ♦ · t ' · • · 9* • · • ·· %· * E* SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS (tmbiMkifmiippikM* 1b· indications toted betow wilt be submitted to the iMemattonil Bumu later mmm*ofd*iuii mmm i gm itmaiii • ·

III

• t · • f ··· 9 t • ♦ ' 9·· 9 • ·· - For receiving Oflica uie only —““^“"1 I-“For Lniemaiionil Bumau uae only — ' .***· Π Thu iheet»» received nth Uie iniernauomi application (~~| Thit ihtti wti toaaivcd by the latent» uoaai Bureau on: ··· e ·*·*· Authonzcd officer ' Aulbonwd officer • • · • 9 9 m ·· 57 119359

AppHcaiusoragtitutilc ... __ _ I International appi teat too No.

releranct number 0X0 3 Cl-r rt-T 1 _______ _ __

INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM

(PCTRule Dliti) Λ. 'Πια mateittani miuc btutw rente to im Riicroorpaum feietied « m ita dtisipuoa on page 28 . imeS 18*"26 — _ _ .

B. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Further depaatuare tdenuiiedoa inadditional$bee* Γ5Π Name ol dapeanary mttituuun

American Type Culture Collection

Addieia oi uepotnifv institution nmm4t»bfoiiueötutiiätaiuiin$ 12301 Parklawn Drive Rockville, Maryland 20852 United States of America

Identification Reference by Depositor; Hybridoma, CD.HlO.l

Due ol deposit Agnaiimr Number 12 January 1995 (12.01.95) HB 11797

C. ADDITIONAL INDICATIONS (lew»luiVue· ypitctUri Theiaianniuoa ti eonuauedonaa additionalabaci Q

In respect of the designation of the EPO, samples of the deposited microorganisms will be made available until the publication of the mention of the grant of the European patent or until the date on which the application is refused or withdrawn or is deemed to be withdrawn, as provided in Rule 28(3) of the * . Implementing Regulations under the EPC only by the issue of a *e*#! ^amgl^to^r^exger^jiomjnatet^jj^reaviestei^^^^^^^y^jji^^^^ ....I D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE 6film mAtmmimmiftrta impmti ftaft *:··: EPo M · • · « • · • · ·· • · • ·· »

ϊ ί : E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS ilmrmbUmkifm* tffbnkM

Tte md Kationi luted below will be submitted to lb· ioMmauoDal gmu later (ryafrteefgci iasw^theiidimnaaeef. 'tooaa Number uf Ocpeuu '1 a · • · · • * · t » #·· • * ♦ ♦ • a# * ' __ * *·· — — For meeivmg Offia me only ' η i — For lataniatwnal Bureau uh only ' (**\ P] Tfai· abaci was revived wnb the inlanuuooal application Π Hi*abeel wm received by the leteaaueoal Bureau etu a ·

Ml • . _ _ ***** AuiAonied officer Auiftonzed officer • · · t • · • · · • #· _____ » · II. MU - —n— ......

119359 58

Applicant a or agent i file ala- nrTl Dr.m i International appiteuonNo.

teterence number 0103 dr rd_1 INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM <PCT Rule libit) A. The indicationi mine Puiow relate la uie microorpmuni reierred ie ® il* deaeipuce on page 28 . line S 18 — 26 .

aa—Bsaaa^·—M—g B. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Furtbtr depoaits arc identified an an additinnal abed Π3 Name ol depoaiury maniuiun

American Type Culture Collection

Address 01 depositary msiuulum imcmeoie patui cat···· temmryt 12301 Parklawn Drive Rockville, Maryland 20852 United States of America

Identification Reference by Depositor: Hybridoma, BD.A8.AB9

Date »I deposit Accession Number 12 January 1995 (12.01.95) HB 11798 C. ADDITIONAL INDICATIONS Queue idea* if ant appticattrt This mionnauoa n coauaued on an addilinnat abed [2

In respect of the designation of the £POt samples of the deposited microorganisms will be made available until the publication of the mention of the grant of the European patent or until the date on which the application is refused or withdrawn or is deemed to be withdrawn, as provided in Rule 28(3) of the •V. Implementing Regulations under the EPC only by the issue of a *·*. ^amglee^<^ar^jc£ertij2omyiatedBj2\^j£ecyieste^Jjj£ii(^^y^(J<ti£E£1j1^^ D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE fyilm imdintimt mmm fir,U rfwipm* ft—r)

* * EPO

• I · • · · • · • · ·· • · • ♦ · *

'· E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS (fewM»*kifmai tpfiinM

The wdicatuma liaud below will be aubmined to the ituenuliooil Bureau later (ape^y <*(«* eem»·^***··*""·· · *· * . S—bw«/Dapeaul • · · ft I · e · #·· • · • · ··· ·* ' " |. π — —. For receiving Office ute only ' " ——For lnieraai«n»iBureeo use only - • Q Tbia abcet waa received with tbe iniernauonsi application | 1 This abcet was received by the Utldnauonal Bureau on: • · ^*1 *,*.* Atubcnaed officer Authorised officer • e • · * • · » · ___ 119359 59

Applicant» on gem i file .... _ , ImOTuiiunaiippuanonNo.

murenet numper ax03 Clr FL·! I

INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCX Rule 13b,t) Λ. The inaicaiioru mwe ociow rente to tne microorgatuim Rtaietl 10 in the description D. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Further tlcpasiti ire nienufieii on in additional »heet |~[

Name ol'depositary tnimutiun

American Type Culture Collection

Addreu at ucpotitarv mmiiuihui iwiiAm potut toit omi tmurn 12301 Parklawn Drive Rockville, Maryland 20852 United States of America

Identification Reference bv Depositor; Hvbridoma. BK.A11.AC1Q

Daw ol Jc paiil Acceinoo Number 12 January 1995 (12.01.95) HB 11799 C. ADDITIONAL INDICATIONS IlcntoUmkifiuttppiiabltt Thta «forma boo ia continued on an nMHimil iheet Γχΐ

In respect of the designation of the EPO, samples of the deposited microorganisms will be made available until the publication of the mention of the grant of the European patent or until the date on which the application is ref used or withdrawn or is deemed to be withdrawn, as provided in Rule 28(3) of the Implementing Regulations under the EPC only by the issue of a *.1.1 samplet^anex^r^nomi^iatedMb\^^eaueste£—j|igj5j|^e-^^^££^^^— *:1 i D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADECtftlituiictnamtttuifarsllim^m^ front

EPO

·· · • « 1 e « • · ·· • · • ·· ·♦· . — --- ------------ • · e

V 1 E- SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS UentUutkifttttppIktbU

The «Pianona iuud below will be submitted lo the I me mailana! Sumu tsterUptafrl/ttfotrtliuiitrtiifuttiitmrimimtf, Uiiwiw Nmmktr ofDepam1) • · · « · · e a • · 1 • · • a • a1 « »· 2 —I Far weaving Otnee uae only For International Bureau uie only " ·· • ! J j This ibcci wn received witb the inicnu uonai application [ | Thi1 ibcet was received by the itucnuuooAi Btuoti on: 9 __________ . ^^^—

Authorized officer Authorized officer • · • # · * ·· 2 • 4 119359 60

Applicant s or agent«lllc __ .|merna.iuoiiapp.ica«i«ioNo.

reicTcncc numocr axo3 Uir rH 1 INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule I3bis) A. The uuiunona nunc nciuw rciaic to uic microorganism retcnuu to m inn description

•m page 2 8 , Ime S

B. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Further depoans are Kknufied on an adduiimai (deal g] Name oi ijcposiurv insniuiion

American Type Culture Collection

Address in uenosnarv iiuiiiuiion unci»nine pngei cnee nee reewiyt 12301 Parklawn Drive Rockville, Maryland 20852 United States of America

Identification Reference by Depositor: Hybridoma, CB.E11.1

Dale m licpasn Across um Number 12 January 1995 (12.01.95) HB 11793 C. ADDITIONAL IN DICATIONS I Mm Aleak ι/κιι epplieaUd This infofltuiran is continued on an additional sheet ej

In respect of the designation of Finland, until the application has been laid open to public inspection by the Finnish Patent Office, or has been finally decided upon by the Finnish Patent Office without having been laid open to ( public inspection, samples of the deposited microorganisms ;1· i will be made available only to an expert in the art.

• · _ _ __________ _____ **'1: D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE fifth1 mdk2 3mMmre2f~§Admjrnid ftttl *:2i Finland ·· · * 1 · • · • · ·· I · • ·· ft

*.1 E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS IlmUtmkifieieppBtäbU

The induaiiaiu llaied below will be suommed 10 Hie liucmational Bureau laicr |iya/y uwfosww minrwofU^ ini mu— t g. Ά iiiaan· Hembtr of Dipnoi') ft · ft ft · ttt • ft ft·· ♦ · • ft ··· · _____ ___ • ft L- ———^1 ^1 • 1 p- I ' For receiving Orflci usx only - |—For Imaruational Bureau uaa only

If· 2 S l f I This Meet was received wnb the international application II TbU sheet was received by the Intmatioaal Bureau ons 3 ^ ♦ • · _ — - ·%·β· Authonzcd officer Auinonxed officer a « • ft · » ft· • · _________ 61 119359

Applicant1 at igems iHc j InlenuuonauppiKamwiNo.

reicrencgnumocr B185 CIP PCT

INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13iiu) Λ- The indications msec nvtow relate to me miauorpiuin reterreu to in uw description on page 28 . line S _1_8"26 .

D. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Funber depoens ire identifiedonse addfrimmtihrrt tx~[

Nine oi depositary iniiiiwtujn

American Type Culture Collection

Address oi depositary muumion imcmniny perut cede neeeentm 12301 Parklawn Drive RocJcville, Maryland 20852 United States of America

Identification Reference by Depositor: Hvbridoma. BC.G6.AF5

Date ui depos·· Acwuw Number 12 January 1995 (12.01.95) HB 11794 C. ADDITIONAL INDICATIONS This inibnnmon a ooaimutd on »n ildMnul «beet Γχ|

In respect of the designation of Finland, until the application has been laid open to public inspection by the Finnish Patent Office, or has been finally decided upon by the Finnish Patent Office without having been laid open to public inspection, samples of the deposited microorganisms ;1·1: will be made available only to an expert in the art.

·;··; D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE a[U2dkMiu»t1n»mftrtUiidpmtiStmi) *

Finland M · • · · • · • · M • · • ··

*.1 1 E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS liemi1 ekuk if eel eppUeaM

The indications luted below will be submitted to the Inienuiioiul Bureau laimtapamy ibepmoeiasiw1^ikuMnwif. Vtniun NmthrtfDcpoa i1) • · • · · • · Φ • · • · · • · ··· ·1 ___ _ __ —---—-- J 2 — For receiving Office use only t I—— For inlsTTMlional Bureau use only ' " .3· I ‘ I Thu iheet was received with the intcmauanal application |_J Tbit sheet wu received by the Inurnauonsl Bureau q«

· ___ . - ------- «——w—I ! I

; : : Authorized officer Autnonzed officer • · 2 • · • · · • ·· 3 « ·_______ 119359 62

Applicant s or agent s tile ilntcniaiiunaiippiiaunaNo,

reference ninnBer B185 CIP PCT

INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule ISbis) Λ. The inuiuationa made (wuw rente to tne rntctuorsinum reteneu to m uw ueacnplion 28 .-.s 18-26 _ B. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Further ilepaeii» ere identified on an additional sheet ΕΠ Name of depositary institution

American Type Culture Collection

Aditress oi depositary inimulion in*uuumi puw cm* tad umiiini 12301 Parklawn Drive Rockville, Maryland 20852 United States of America

Identification Reference by Depositor: Hybridoma, BH.A10

Date ot deposit Accession Number 12 January 1995 (12.01.95) HB 11795

C. ADDITIONAL INDICATIONS (U*·*rtt*i t(net tppHcmbki This inform*upn is continued on an eddirional sheet Q

In respect of the designation of Finland, until the application has been laid open to public inspection by the Finnish Patent Office, or has been finally decided upon by the Finnish Patent Office without having been laid open to public inspection, samples of the deposited microorganisms will be made available only to an expert in the art.

....: D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE fifth» imirttttKtmnxeifartU &|Μ·Ι ····· Finland • e · • · * · • · • · ·· • · • ·♦ v * E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS olamk if met

The Hidtationa lisied below will be submitted to the Iniemsiiohal Bureau later «p^y t*egmtr»i«teme^iAei*iimeem*.g, Home Nmmbm ef Dtpam") • · « · · I · I • « »·· * · « · ··* • r-'— For receiving Office use only — For International B«h. us* only ......

. * * * . Q This sheet wt* received with the internauooal spplicstion 0 This sheet was received by the lateraanooat Bureau on: ·#· ^Authonaed officer “ AuUwroed officer » a • · • « * • · · 63 119359

Applicant a or ag«nl i file i International application No.

reference numoer B185 CIP PCT 1

INDICA TIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM

(PCT Rule I3bu) Λ1 'Hie iiidhHiioni maue ociow rcuie to me miooergumn referred 10 in toe ucscnpuon B. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Further deposits arc identified M raadditionalafaect fX| Name oi depositary institution

American Type Culture Collection

Address nt depositary muumion witBiriy tamMrvt 12301 Parklawn Drive Rockville, Maryland 20852 United States of America

Identification Reference by Depositor; Hybridoma, AG.Hi»5.1

Date til Ucpotn Acoeaiion Number 12 January 1995 (12.01.95) HB 11796

C. ADDITIONAL INDICATIONS (k—eabut if mol opplittUil Thia infonuanon II continued on an additional »hoet Q

In respect of the designation of Finland, until the application has been laid open to public inspection by the Finnish Patent Office, or has been finally decided upon by the Finnish Patent Office without having been laid open to • . public inspection, samples of the deposited microorganisms ·,·,· will be made available only to an expert in the art.

***** D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE CtfthoumitMOomior· mm for oil imiymwi flam) * 1 Finland ·1 · · · • · • · ·· · • ·1 ·2

* E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS IIm oltnk if mm mpptialM

Tbs indications listed below will be auomiltad to the International Bureau laicrfapcn/ytlw point ·οκ«4<Ariadne»a.f. Viemän

. . Ntmitr of Dtptm V

• · · • · 1 • · • · · • · « · • · · · 2 • · _ __________ • · · m·Μ^^ *,.. For receiving Office me only " —.....1 For International Bureau uaoonly - 1. . . ‘ ΓΊ Tili! jpoot WH received with the interosuonal application Q This ibeet was received by the International Bureau on: • I · • · ___ ___ _______ _ ______ *.1.1 Autbanzeo officer Authorised officer • · • · · • · · • · 119359 64

Applicant a or imi s Ills _ l International application No.

reterencenumber B185 CIP PCT '____ INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule IjJ/u) Λ. Πμι muicanon» mauc km relate io utc micruorpiusra reiemui to in tnc ucienpuoa on page 28 . line S 18 — aa—^ 0. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Further depceia are ideniilied on an addition! abac1 (xl

Name oi depoaitary ituiiiuuon

American Type Culture Collection

Addreaa m uepoauarv iniinunon n—iwunr pouet cot1 ,1u coimwvi 12301 Parklawn Drive Rockville, Maryland 20852 United States of America

Identification Reference by Depositor; Hybridoma, CD.H10.1

Dale «I depoiii FÄcviiai Number 12 January 1995 (12.01.95)) HB 11797 C. ADDITIONAL INDICATIONS (Ivaiwnlanlii/iwiipplimNcI Thia information ia eommueti on an arlitilional rtm j_x]

In respect of the designation of Finland, until the application has been laid open to public inspection by the Finnish Patent Office, or has been finally decided upon by the Finnish Patent Office without having been laid open to , . public inspection, samples of the deposited microorganisms ::: will be made available only to an expert in the art.

*;2! D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE Gfdmjmummnmnimfraimpm1 Simtt) e *ϊ2ί Finland M e • · · » · • e ·· • 1 • ·· *·1 1 E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS (lent ifm tppliabid

The mdiaiiona luted below will be auomiued to the International Bureau latertepeofritepmwinanire^'rteiadii·—ag. Minin ·ι N—1~efD1peta-) • e • · · • it • · e · · • 1 • · • · · e *· — For receiving Office me only —^ >» For imemaimnal Bureau uae only - — • «I g— • · I I This sheet was received with the international application | j ThU «beet wea received by the tAtmuoael Bureau oiu * 1 1 1 • · ___ ___ .... ____ ____ • Λ t 1 Authorized officer Autoreized officer • · 2 • e e • ·· * · __ 119359 65

AppiKami or innn tile _, _ ilnicmaiiuiiaiappiiaiiMNo.

retmflee number B185 CIP PCT I

INDICA TIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule IjImx) Λ. The inuuaiiou nuiu nviiiw reuie 10 uie nutruorgamsni reieneu la in uw Uucnpuoa on _ . Ime S. -JJLz2£- 0. IDENTIFICATION OF DEPOSIT PunierdepmeMeidewifiedeeweddilwlifcw (X~|

Namu oi depouurv insiituiMin

American Type Culture Collection

Addres1 ill depositary msuiwlion ιι«νμμ« paatti too1 λλλ ctmotryi 12301 Parklav/n Drive Rockville, Maryland 20652 United States of America

Identification Reference by Depositor; Hybridoma, BD.A8.AB9

Dm ui ikpnu I Acemiun Number 12 January 1995 (12.01.95) HB 11798 ____!_ - —W—i C. ADDITIONAL INDICATIONS Ucm hankit km »ffikthki Tbit infornuiKM! u aontipucd on «e iddilicwl »beel [χ|

• · · ____ .__ ....I D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE (if Atrniemaa-tnm»fmrtä impimti Sima) ....: Finland • · ee · e e e • · • e ee • · e ·· # ::: E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS flawulMty·» iwifeiMrl e _____________

Thu ladieuuan1 IiiM below will be luomme·) to the Iniemauooal Bureau IW|yui|gpUrpiMiuMi( ibtiaäimiUMif, Mn.ia.i W—1U afOtpamt") • e • e · • I I e e • M e e • # • ee : 1». — For receiving OOlca use only - p^—For Inienuuorul Bureau Ilia only — .·2. I I Tbii »heel wa1 iwkivcU wiita ibe imcmaiional application [_| TWa abeet waa itaiwd by tha laimuaboaai Bureau on: eee1 e _ _ __ ***** AudMRiftd officer Authomed efficet « · · • · · • e « 2 • if 119359 66

Applicant * or agent s tile i InternationalappnatioaNo.

reterenne numPtr B185 CXP PCT I

INDICA TIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM

(PCT Rule 136ti) Λ. Πμ inibcauona now oeiow mate to me nucroorga fulfil rcterreu to in in· description nn page _ . 28 . line S 18—2 , B. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Funner dtpoeus are identified on an iddirinnsl ahem Q Ninie ot depositary institution

American Type Culture Collection

Address til ucpositarv msiiiunon nacumuiepostal cedeana catmni 12301 Parklawn Drive Rockville, Maryland 20652 United States of America

Identification Reference by Depositor; Hvbridoma. bk.aii.ac10

Dale oi deposit I Arnniinn Number 12 January 1995 (12.01.95^ HB 11799

C. ADDITIONAL INDICATIONS Ucavr nUni if tta a^pheaUti TTlis information is continued m» — rdiiirinnsl shaat Q

In respect of the designation of Finland, until the application has been laid open to public inspection by the Finnish Patent Office, or has been finally decided upon by the Finnish Patent Office without having been laid open to public inspection, samples of the deposited microorganisms Mill be made available only to an expert in the art.

.···; D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE Ct(iUmd*jgmiutMifareäiwnpimei Tent ·;··; Finland ·· · • · * • 4 • * ♦ * • 4 • ··

V : E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS Oovbhttifmet apptiuM

The indications luted below will be submitted to the international Bureau later lipnnfrifogmweinetiire^ifoi· iuwim«.g. »Arimrua HirnktrofOtpom') $ m · * t 4 4 • · ♦ #* • · » 4 ·*· 4* ______ __ ___—-------- • φ ***i*«fo^ i i— For receiving Office me only — ' -i p — — For International Bureau uae ooiy —' — • * * * ; Q This sheet was received with the inieRitlionsI spplieaiion Q This sheet was reaived by the inlanaiknul Bureau on: • · · 4 ·*;*: Authorized officer ' Authorized officer 4 · • · • 4 · I ·· 67 119359

Applicants Of agent1 file n)flr ... _ __ : InlenuiwniiippnauouNo.

ret'gftneg numour QXB3 CXr PCT 1 INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCX Rule I3toi) Λ. The imnciiiaiu ensue oeuiw reille to im niaimpiuia feietreu m m me uetenpuan •inpsge 28 .line S 18 — 26 .

B. IDENTIFICATION «Γ DEIOSIT Funburdupcuii»2uidunMliudonuouddWo«libo1 jx]

Nimt Ol depositary msuiuiion

American Type Culture Collection A^drait ol uepoiitarv imiiiuIiod paatti (ms Mi ceMeyi 12301 Parklav/n Drive Rockville, Maryland 20652 United States of America

Identification Reference bv Depositor? Hybridoma, CB.E11.1 L)ll« til deposit Awwun Number 12 January 1995 (12.01.95) HB 11793 C. ADDITIONAL INDICATIONS (WeoU»k tfurn tppiicoUol This iafownenon a eouuuued on »a niHitii··! sbuut

Applicant is) hereby give notice of my/our intention that samples of the above-identified culture shall be available only to experts in accordance with paragraph 3 of the Fourth Schedule to the Patents Rules 1995.

• · · • · • ·1 ' · ___________________ _______ . D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE fifdm mdictaomi on mm for oUirm^moi limn) .. . Singapore • · • · • t • · • a· ··1 • · · • · · _ _____ E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS (hmuhrnkifreooppätM^ • · Thu indication1 luted below will b1 luomitted lo the Imenulionil Bureau inaUptoffOmtammoiMnofiU i ii'iamac. 'Annum • ! ! Number of Ooporu’) •

• M

• · • · *·· «· • · • «a :2’: Γ——— For «waiving QfRc1 me only ' For InierutKÄUl Bunau lu. only --.

e · e m1· • I I This sheet was received with the intmaboosi application Q This sheet was received by the lahnatwil Btwcan on: · · • a · • · ^^--: __ 2 .·, I Authored officer Auibreiaed officer • ·· • · 68 119359

Applicants ori gent 1 file nioc nTn nr»p I ImernaiiunatappiicniooNo.

reltTcnct numoer 0103 P*-1 !

INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM

(PCTRulc 13bu) Λ. 'Πιβ nauiMM nwc ocuiw rcittc to we roicroorganiira rclcrmi to in we orscnpuoe on page 2 8 . line S 18—26 ___ _ .

B. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Furtherdepositsare identified oamsdddicml«beet |}H Name oi depouurv instiiuiion

American Type Culture Collection

Address m uepoiiurv instiiuiion uaiuma* pwticaietMtemuyi 12301 Parklavm Drive Rockville, Maryland 20852 United States of America

Identification Reference by Depositor: Hybridoma, BC.G6.AF5

Uaic oi deposit Accession Number 12 January 1995 (12.01.95) HB 11794 ^^—I—— C. ADDITIONAL INDICATIONS spptiuHrt Thisadorraitioa a contraacdoasaaddiski—lshees fyl

Applicant(s) hereby give notice of my/our intention that samples of the above-identified culture shall be available only to experts in accordance with paragraph 3 of the Fourth Schedule to the Patents Rules 1995.

• · • •ft*# • D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE m*crn*immnm*formU4m?mwd Ummi ·····

ft · 0^^^»^ι···ι··ι>^—I

··.·. Singapore • · • · ·· • · • ·· ··· • · · • · · E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS ffcew Uni if mu spplicsNri • · The tadiaiioiu listed below will be submitted to We Iniemnionil Bureau l*i*Tlrp*i/yih1esmi*eiiifeiifi*ei«in«ee· sg. 'Acme·

Si! Urmätr ef Dtfotn Ί ft ft ··· ft · ft ft ··· ft ft ft ft ft ft ·· — For receiving Office use only — — For tatenuuoiul Bureau useoajy

ft ft ft MM

* I I ThU ibect wit received wnb the imcrniuoml application TTib sheet *M waived by Itac Inianauoail Bufae om ·*· · • · · • · ._ _ _ ____________ /, * Authorized officer Authorized officer • ·· • · 119359 69

Applicant (or 1 genii tile Cjp pCT | InlenuuoojUppliCiiioeNo.

numocr_ _* _____ INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13to) A. The inwcauora nuue nuiow rente to ine micraorgiiuani rrterrru to m ute description

unpege 28 line S

B. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Further depoeiu ire identified on in additional ahaat PH Name oi deposturv inaiituiion

American Type Culture Collection

Addicts oi ocpoanarv mtiiiulidn umhmmwpoint coä*toumryt 12301 Parklav/n Drive Rockville, Maryland 20852 United States of America

Identification Reference by Depositor: Hybridoma, BH.A10_

Date oi ilepon Acceiwon Number 12 January 1995 (12.01.95) HB 11795

C. ADDITIONAL INDICATIONS nltuä if·* mpplittMe) Thia iniomution ia continued on aa additionalaha* Q

Applicant(s) hereby give notice of my/our intention that samples of the above-identified culture shall be available only to experts rn accordance with paragraph 3 of the Fourth Schedule to the Patents Rules 1995.

» · · • · . O. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE Ctfitm imiirtimt—frsrt • m mum—— II —w— ·ι·ϋΐι··ι ' ^^ ·*β*β Singapore • · • · »«

• I

• ·· • I* • · · *·* *

E* SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS ft» oUt* if mm MppikM

• * The indications hated below wttl be »«omitted to the international Bureau Uuf(ipBj^N|ewnMiiin^iHrfiniMic|, 'Amur tjt i Nwmk*t of faptmi*) ··· • · • · *·· 1 2 • · • ·· 2 " ' ' ""- - - · mw· _ - i I p——— For receiving Office use only " -i - For inttnuiimial Bumau uae enly ———t ··· M.

• I I This sheet was fecsived with the international application | | This sheet was received by the fawn»·™·1 B|W"" "»· 0 ·*· • ♦ * • · ___ ^ «*· I Ambon re a officer Autboneed officer • ·* • · 70 119359

Applicant * or agam*file Rioe -Tp ppm IInienuumuuppiuaiionNo. ' I

retewnoe numocr DXOv vl* ^^ INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCTRule I jbix) Λ· The iRUHiiduu made nciow reille to we nudoorgmuni reieired 10 in toe ueaenpuen on page 28 , hue S 18^26 _________.

B. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Fuwberdepoeittaie.idawIiedooaoaddM—lahatr ΠΠ Nunc ol depoatury intimnuin

American Type Culture Collection

Address ol depositary institution imkjuumi# pouti <ολ* enä ceernvyl 12301 Parklavm Drive Rockville, Maryland 20852

United States of America ~

Identification Reference by Depositor: Hybridoma, AG.Hi.5.1

Ual* ni licpoiii Acoeuion Number 12 January 1995 (12.01.95) HB 11796 C. ADDITIONAL INDICATIONS itityk if net tpplictUei Hue iaCMraanOB 1» continued on an additional aba« Ixl

Applicant(s) hereby give notice of my/our intention that '* samples of the above-identified culture shall be available '· only to experts in accordance with paragraph 3 of the ^ t«t*t Fourth Schedule to the Patents Rules 1995. £ • · · • * ·*··· _____ - - - ------^ · • D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE Of** inrfiffiwii vtMäfmmä imjmed Kami ····*__' .

* * mn m n m 1

Singapore • ♦ * · «e • · • ·· *·· • · ·

E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS lian0fr«*if ma tppiiribM

. , Tha indications Imed below will be aunmuted to lha International Bureau liter lipia/yiktt«m»tunafiiitimäiwimm « f, 'Arrmpn • : ; HwmttrefD*peart • t ·«· • • ♦ ·*· 1« • · * ·· • - ____—_ {**; |- ... For receiving Office use only ............ i For International Bureau uu only — * * * ΓΠ This >b eel waa received wnb the international application Tbia ah eel waa received by Ibt International Bureau am • · ^ f * * • e^· ·, · Auibomed officer Auttaorwed officer • ·· • t 119359 71

Applicant a or agent's lilc qioc ΓΤΌ crT (niemi minai appnetionNo. I

reference number QXQJ Ul1 _ I

INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM

(PCTRule 130«) Λ. 11)6 indication* mauc nciow rciate to tnc miouofpattm rttetreu to in tne description

on page 28 . IrneS

B. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Funher depoeue arc identified oa an aridllifel alM [xj Nam· oi depositary institution

American Type Culture Collection

Address ot uepositarv institution ιι·κ«ΜΜν pone· comaMcamr*· 12301 Parklawn Drive Rockville, Maryland 20852 United States of America

Identification Reference by Depositor: Hvbridoma. CD.H10.1

Dai· ui ilepoan Aeoauoa Number 12 January 1995 (12.01.95) HB 11797

C. ADDITIONAL INDICATIONS «/»«»ate·*/m» <pplira*lri Thia information ta conlmyd on an iiliUHnual ahum Q

Applicant(s) hereby give notice of my/our intention that samples of the above-identified culture shall be available only to experts in accordance with paragraph 3 of the •V. Fourth Schedule to the Patents Rules 1995.

'· ♦ ♦··-· _ (tttJ D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE lifdmmirtiwn-mftrtM l-pi Iitfflmnl ' · · --- - —— ··,·# Singapore • · * ·' ·· e · • ·β ··· • · e • · · E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS (icmmbUmkifMiMppiUäbi^ # * The indication* luted below will be submitted to the international Bureau if, Μη«·ιι 111 Nnmker tfDwpont’) • * ··· ·* · • · ··* «> · • · • ·· Ϊ : - For receiving Office uae only I——For International Bureau uaa tmiy *·· _ • This sheet was received with the iniernational application [_J TbU ibeti was received by the Intcnxnonal Borne on: • * t ·.·.* ___ _;_;_ { Authorized officer Authorized officer • a* • * 72 1 1 9359-

Applicants or agent* tile βίος ΓΤΌ ΌΓ'Γ j ImernaiionaiappmaiionNO.

reference numocr OJ-aJ ΓΊ-ί ! INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13 to) Λ. The inuieaiiona mauc nemw rcuic to we πιιααοιριιιπι reteneu to in we ueacnpuon on page ^_ . line S 18~26 .

D. IDENTIFICATION OF DEPOSIT - Funherdepoaus are ideolifiedoe an additional ahoa* (X}

Name of dapoaiurv uuiiiunon

American Type Culture Collection

Address m Depositary institution fincmuiae point roseana cOHMiyi 12301 Parklawn Drive Rockville, Maryland 20852 United States of America

Identification Reference by Depositor: Hybridoma, BD.A8.AB9

Dale oi Deposit Accession Number 12 January 1995 (12.01.95) HB 11798 C. ADDITIONAL INDICATIONS Urn»» «*»*./<·<» This informs non is continued on an tddiuial ifiit h

Applicant(s) hereby give notice of my/our intention that samples of the above-identified culture shall be available , . only to experts in accordance with paragraph 3 of the j Fourth Schedule to the Patents Rules 1995.

**· - i • · __ _ _ ····« D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE Of dm iWirinmi are net frr alt dmipwrf fwrrl ·’·*· Singapore 99 9 · • 1« a

• M

9 * t 9 9 9 ' 0

E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS IktMBltukifMitppIktbU

• * · * · The tnoicaiions lisied below will be submitted 10 the International Bureau liielipeiynniiaiismu^dnidoamsi, 'Accsan··

HambtrefDtpem·) 999 • 9 9 9 *99 9 99 9 9 9 99 9 t***f ______ ^sm— — For receiving Office use only ............... For inianuuanal Bureau use only 1

.V. □ This sheet was received with the inienuuonai application I □ Tbii iheet wu received by the lAtemtttttal Bmn αν I

• 9 · • 9 ! 'st Authorizedofficer Auitwrwedofficer 9 9 119359 73

Applicant s or ifcnt i file I lintnuiwiutippnatmNo.

numoer_B185 CIP PCT 1-- INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCTRulc lj/ιύ) Λ. Pie inansatiuns nuac nciow rente to ute mM-Tuofganum nticireu to *n uw description D. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Fmk» dtpoMi are tdauM on w additional tint (~~|

Name ol depositary institution

American Type Culture Collection Λddrcii m depositary institution limiuMKf poim cm< and cs»<on>i 12301 Parklawn Drive Rockville, Maryland 20652 United States of America

Identification Reference by Depositor: Hvbridoma. BK.All .AC10

Due oi liepeen I Awawa Number 12 January 1995 (12.01.95)( HB 11799

C· ADDITIONAL INDICATIONS l/irarania·* ifnetapprteaWel Thia information a continued on an additional sheet Q

• t • · t • · · » · ! D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE CfAtidit»»—muim/hrdldmpfi tirnmt ’ * Singapore ·« t • · ·

• I

• · • a • · • ♦· t a«e «ta ^^aaaaa a a a —

* E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS tUnrUukifim rppfirrW

The indicutona listed below will be mummed to die liucmatioiial Bureau late |ipc^d»io»«i wereef lAetediaoemnf. ‘dcwaai t , NamtorafD*pent*! a a a a a a a ' a aaa a a a a aaa ·.

• a a a _ __ _ a a ^^—1mm—+ *... r——For receiving Office use only — — ' Foe Intemaiionjl Bureau use only ’ [ I This ibeel was received with the international application I I Thia sheet was remived by the International Burma on: a • a • a a - _ _____ _ . _____—_ '·*·' Authorized officer Authorized officer a a aaa a «« a a

Claims

119359 74

1. Farmaseuttinen koostumus, joka käsittää vähintään yhtä LT-p-R:eja aktivoivaa ainetta, tunnettu sii- 5 tä, että yksi LT-p-R:eja aktivoiva aine käsittää anti-LT-β-R -vasta-ainetta.

2. Vähintään yhden LT-p-R:eja aktivoivan aineen käyttö valmistettaessa farmaseuttista koostumusta, joka on tarkoitettu käytettäväksi neoplasian lisääntymisen, vaka- 10 vuuden tai vaikutusten hoidossa tai vähentämisessä, tunnettu siitä, että yksi LT-p-R:eja aktivoiva aine käsittää anti-LT-p-R -vasta-ainetta.

3. LT-a/p-heteromeerisen kompleksin käyttö valmistettaessa farmaseuttista koostumusta, joka on suunniteltu 15 annettavaksi vähintään yhden LT-p-R:eja aktivoivan aineen läsnä ollessa ja joka koostumus on tarkoitettu käytettäväksi neoplasian lisääntymisen, vakavuuden tai vaikutusten hoidossa tai vähentämisessä.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen käyttö, tun- 20 nettu siitä, että yksi LT-p-R:eja aktivoiva aine käsit- ·*·*· tää anti-LT-p-R -vasta-ainetta ja/tai IFN-y:a.

• · ... ; 5. Ristisidottujen anti-LT-p-R -vasta-aineiden käyttö ensimmäisenä LT-p-R:eja aktivoivana aineena valmis- • · .·4·4 tettaessa farmaseuttista koostumusta, joka on suunniteltu • · I. * 25 annettavaksi toisen LT-p-R:eja aktivoivan aineen läsnä oi- • · lessa ja joka koostumus on tarkoitettu käytettäväksi neo- « « i plasian lisääntymisen, vakavuuden tai vaikutusten hoidossa tai vähentämisessä.

• « *.·.· 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen käyttö, tun- ♦ ·* *...* 30 nettu siitä, että toinen LT-p-R:eja aktivoiva aine kä- sittää IFN-y.a. 9 ·· .···.

7. Menetelmä heteromeeristen LT-α/β -kompleksien • · *” läsnä ollessa toimivan LT-p-R:eja aktivoivan aineen väli- ·.*.* koimiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää • · V*i 35 seuraavat vaiheet: 119359 75 a) viljellään kasvainsoluja heteromeeristen LT- α/β -kompleksien, ensimmäisen LT^-R:eja aktivoivan aineen ja toisen oletetun LT-p~R:eja aktivoivan aineen läsnä ollessa; ja 5 b) määritetään, suurentaako toinen oletettu LT-β- R:eja aktivoiva aine heteromeeristen LT-α/β -kompleksien kasvaintenvastaista aktiivisuutta ensimmäisen LT^-R:eja aktivoivan aineen läsnä ollessa.

8. Farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, 10 että se käsittää anti-LT-p-R -vasta-ainetta.

9. Anti-LT^-R -vasta-aineen käyttö valmistettaessa farmaseuttista koostumusta, joka on tarkoitettu käytettäväksi neoplasian lisääntymisen, vakavuuden tai vaikutusten hoidossa tai vähentämisessä. • · « · · • 1 · • · m · · 1 · * · «Ml· • · ·· m • · · • · • · M • » • M m ··· • · I » · · • · • · t • · I • · • M • · • · • M • · • · • M * ·1« • ♦ • 1 ··· • · « I « • I · • 1 · • · · • ·· • · 119359 76